KR101292961B1 - 아폽토시스-유도 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시키는데 관련된 약제 및 방법 - Google Patents

아폽토시스-유도 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시키는데 관련된 약제 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지를 선별하는 방법 및 상기 내성을 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명은 표적 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하는 방법, 및 본원에 제공되는 조성물을 투여함을 포함하는, 암, 자가 면역 질환 또는 염증 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CARD 함유 단백질을 조절하는 약제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Figure 112007063744274-pct00015
사멸 수용체 작용제, 아폽토시스 유도, CARD 함유 단백질.

Description

아폽토시스-유도 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시키는데 관련된 약제 및 방법{AGENTS AND METHODS RELATED TO REDUCING RESISTANCE TO APOPTOSIS-INDUCING DEATH RECEPTOR AGONISTS}
본 발명은 일반적으로 사멸 수용체의 아폽토시스-유도 작용제에 대한 내성을 억제하는 약제 및 암 및 자가면역 질환 또는 염증 질환을 치료하는데 있어서의 이들 약제 및 작용제 및 생물표지(biomarker)의 용도에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 가출원 제 60/649437 호(2005년 2월 2일 출원)에 기초한 우선권을 주장한다.
연방 지원 연구에 대한 진술
본 발명은 국립 보건원(NIH)에 의해 부여되는 인가 번호 P50CA83591, P50CA89019 및 U19AI056542 하에 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
TNF 패밀리의 구성원인 TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드(TRAIL)는 암 세포에 대해 강력한 아폽토시스-유도 활성을 가진다[와일리(Wiley, S.R.) 등, 1995. Immunity 3:673-682]. TNF-α 및 Fas 리간드 같은 TNF 패밀리의 다른 사멸-유도 리간드와는 달리, TRAIL은 정상 세포에 대해서는 효과를 거의 또는 전혀 나타내지 않으면서 종양 세포의 아폽토시스를 우선적으로 유도하기 때문에 암 요법의 개발에서 특히 흥미를 끌어 왔다[월작(Walczak, H.) 등. 1999. Nat Med 5:157-163]. TRAIL에 대한 5가지 이상의 수용체가 확인되었는데, 그중 2가지, 즉 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)는 아폽토시스 신호를 변환시킬 수 있는[월작 등. 1997. Embo J 16:5386-5397; 팬(Pan, G.) 등. 1997. Science 276:111-113; 쇼더리(Chaudhary, P.M.) 등. 1997. Immunity 7:821-830] 반면, 나머지 3가지(TRAIL-R3, -R4 및 OPG)는 미끼 수용체(decoy receptor)로서 작용하여 TRAIL-매개되는 아폽토시스를 차단한다[팬 등. 1997. Science 277:815-818; 마스터즈(Marsters, S.A.) 등. 1997. Curr Biol 7:1003-1006; 에머리(Emery, J.G.) 등. 1998. J Biol Chem 273:14363-14367]. Fas 및 TNFR1과 같이, DR4 및 DR5의 세포내 분절은 사멸 도메인을 함유하고, FADD- 및 카스파제 8-의존성 경로를 통해 아폽토시스 신호를 변환시킨다[월작 등. 1997. Embo J 16:5386-5397; 쇼더리 등. 1997. Immunity 7:821-830; 쿠앙(Kuang, A.A.) 등. 2000. J Biol Chem 275:25065-25068]. 마우스 및 영장류를 비롯한 실험용 동물에 TRAIL의 재조합 가용성 형태를 투여하면 전신 독성 없이 종양이 상당히 퇴행된다(월작 등. 1999. Nat Med 5:157-163). 그러나, TRAIL이 인간에서 간 독성 같은 부작용을 야기하는 것으로 밝혀졌기 때문에, TRAIL 수용체의 다른 작용제가 개발되었다.
독특한 작용제성 단클론 항-DR5 항체, TRA-8 및 그의 인체에 적응되는 버전 또는 인간용 버전으로 DR5를 선택적으로 표적화시키면, 종양 세포의 아폽토시스를 효과적으로 또한 선택적으로 유도할 수 있다. 모든 TRAIL-민감성(sensitive) 암 세포는 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대해 감수성(susceptible)인 것으로 밝혀졌다. 화학요법 약제는 시험관 내에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 종양 세포의 TRAIL-매개되는 아폽토시스를 상승작용적으로 향상시킬 수 있다. 예를 들어, TRA-8과 아드리아마이신의 조합 요법은 어느 한 약제를 단독으로 사용하는 경우보다 상당히 더 높은 종양의 완전한 퇴행을 나타내었다[부흐스바움(Buchsbaum, D.J.) 등. 2003. Clin Cancer Res 9:3731-3741]. 이러한 결과는 화학요법 약제가 아폽토시스를 유도하는데 요구되는 DR5의 신호 변환 또는 신호 전달의 역치를 조절함을 암시한다. TRA-8은 그의 효능 및 안전성에 기초하여 암 요법으로서의 개발을 위한 후보로서 선택되었다. 임상전 연구는 TRA-8이 특히 화학요법과 조합되어 인간 암의 이종이식 모델에서 매우 강력한 항암 효능을 가짐을 나타낸다(부흐스바움 등. 2003. Clin Cancer Res 9:3731-3741). 원숭이가 TRA-8의 전신 투여를 잘 견뎌낸다는 것도 나타낸다. TRA-8의 원숭이 DR5로의 결합은 인간 DR5의 결합과 유사하고, 원숭이는 48mg/kg의 높은 투여량을 견뎌내었다.
그러나, 표적 세포에 의한 사멸 수용체의 발현은 세포를 수용체용 리간드에 의한 아폽토시스의 유도에 대해 감수성으로 만드는데 반드시 충분하지는 않다. 예로서, 대부분의 암 세포가 높은 수준의 DR5를 발현하지만, 이들은 DR5에 대해 특이적이고 미끼 수용체와 반응하지 않는 TRA-8에 의해 유도되는 아폽토시스에 반드시 감수성이지는 않다. 뿐만 아니라, 암 세포 같은 표적 세포는 TRA-8 또는 사멸 수용체(예: DR4 또는 DR5)를 통해 아폽토시스를 유도하는 다른 약제에 대해 내성을 나타낼 수 있다. 당해 분야에서 필요로 하는 것은, TRA-8 같은 사멸 수용체의 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 예측하는 생물표지 및 상기 내성을 감소시키는 수단이다.
발명의 개요
본 발명의 목적(들)에 따라, 본원에서 구체화되고 광범위하게 기재되는 바와 같이, 본 발명은 한 요지에서 CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제(modulator)와 표적 세포를 접촉시킴을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 방법에 관한 것이며, 이때 조절제는 작용제에 대한 내성을 역전 또는 방지한다.
본원에 제공되는 것은 세포를 전체 DDX3에 대해 분석(assay)함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포 또는 그의 동족체를 선별(screening)하는 방법이며, 이때 높은 수준은 작용제에 대한 내성을 의미한다.
본원에 제공되는 것은 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합(association)을 분석함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법이며, 이때 높은 회합 수준은 작용제에 대한 내성을 뜻한다.
a) 세포를 사멸 수용체 작용제와 접촉시키고, b) 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 분별 회합을 모니터링함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법이 본원에 제공되는데, 이때 회합은 작용제에 대한 내성을 나타낸다.
또한, 카스파제 또는 카스파제의 조절제(예: cIAP1, cIAP2, XIAP, 서바이빈)와 CARD 함유 단백질의 회합을 모니터링하고, 공지의 내성 또는 비-내성 대조용 세포로부터의 샘플과 회합 수준을 비교함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법이 제공되며, 이때 내성 세포의 회합 수준과 유사한 수준의 IAP와 CARD 함유 단백질의 회합은 작용제에 대한 내성을 의미한다. 임의적으로는, 선별되는 세포를 사멸 수용체 작용제(예컨대, 작용제성 항체)와 미리 접촉시킨다.
본원에 제공되는 것은 (a) 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, (b) 샘플의 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합을 검출함을 포함하는, 개체에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 방법이며, 이때 회합은 내성을 나타낸다.
또한, (a) 개체로부터 생물학적 샘플을 수득하고, (b) 샘플에서 카스파제 또는 카스파제의 조절제와 CARD 함유 단백질의 회합을 검출함을 포함하는, 개체에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 방법이 제공되며, 이때 회합은 내성을 나타낸다.
(a) 사멸 수용체를 발현하는 표적 세포를 사멸 수용체와 특이적으로 결합하는 치료량의 사멸 수용체 작용제와 접촉시키는 단계, 및 (b) CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제를 상기 표적 세포에 치료량 투여하는 단계를 포함하는, 사멸 수용체를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하는 방법도 제공된다.
치료량의 (a) 사멸 수용체 작용제 및 (b) CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제를 개체에 투여함을 포함하는, 암을 앓는 개체의 치료 방법이 제공되며, 이때 조절제는 세포 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시킨다.
또한, 치료량의 (a) 사멸 수용체 작용제 및 (b) CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성을 조절하는 약제를 개체에 투여함을 포함하는, 염증 질환 또는 자가 면역 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법도 제공되며, 이때 조절제는 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시킨다.
본원에는 (a) 사멸 수용체 작용제 및 (b) CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성을 조절하는 약제를 포함하는 조성물이 제공되며, 이때 조절제는 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시킨다.
CARD 함유 단백질의 발현을 억제하는 shRNA를 포함하는 단리된 핵산도 제공된다.
또한, 사멸 수용체의 CARD 함유 단백질 결합 영역을 코딩하는 단리된 폴리펩타이드도 제공되며, 이때 상기 폴리펩타이드는 25개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다.
추가로, CARD 함유 단백질의 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴 리펩타이드도 제공된다.
개시된 방법 및 조성물의 추가적인 이점은 하기 상세한 설명에 부분적으로 기재되고 상세한 설명으로부터 부분적으로 이해되거나, 또는 개시된 방법 및 조성물을 실행함으로써 학습될 수 있다. 첨부된 청구의 범위에 구체적으로 기재된 요소 및 조합에 의해, 개시된 방법 및 조성물의 이점을 달성 및 획득한다. 상기 개략적인 설명 및 하기 상세한 설명은 둘 다 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 청구되는 본 발명을 제한하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 포함되어 있고 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은, 개시된 방법 및 조성물의 수가지 실시양태를 설명과 함께 예시하고, 개시된 방법 및 조성물의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대한 종양 세포 내성의 유도를 도시한다. 패널(A)은 TRAIL-R1 및 TRAIL-R2의 세포 표면 발현의 유동 세포 분석을 보여준다. 인간의 유방암 세포주 MDA-231 및 인간의 난소암 세포주 UL-3C를 사이크롬(CyChrome)-공액 항-TRAIL-R1(2E12) 및 PE-공액 항-TRAIL-R2(2B4)로 염색하고, FACScan 유동 세포 분석법에 의해 분석하였다. 패널(B)은 TRA-8, 2E12 또는 TRAIL-매개되는 아폽토시스에 대한 MDA-231 및 UL-3C 세포의 감수성을 나타낸다. 세포를 96개-웰 플레이트에서 웰 1개당 1,000개의 세포로 배양하였으며(웰 3개씩 1조), 표시된 농도의 각 아폽토시스-유도제를 사용하여 배양하였다. 2E12-유도되는 아폽토시스의 경우에는 2㎍/ml의 염소 항-마우스 IgG1을 첨가하였고, TRAIL-유도되는 아폽토시스의 경우에는 항-Flag 항체를 가교결합제로서 첨가하였다. 하룻밤동안 배양한 후 ATPLITE 분석법에 의해 세포 생존율을 결정하였다. 배지 대조용의 계수에 대한 처리된 웰의 계수의 백분율에 의해 세포 생존율을 결정하였다. 각 점수는 3개 1조의 평균이고, 셋 이상의 독립적인 실험을 대표한다. 패널(C)은 TRA-8 내성 유도 동안 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대한 종양 세포의 감수성을 나타낸다. TRA-8 1ng/ml로 세포를 2일간 처리함으로써 TRA-8 내성의 유도를 개시하였다. 2,000ng/ml가 될 때까지 TRA-8 투여량을 매 2일마다 2배로 만들었다. 매 투여 사이클마다, 각각의 상응하는 투여량을 사용한 처리하에 유도되지 않은 세포 및 유도된 세포의 세포 생존율을 ATPLITE 분석법에 의해 결정하였다. 데이터는 3개 배양액의 평균으로서 제공된다.
도 2는 MDA-231 및 UL-3C 세포에서 유도된 TRA-8 내성의 선택성을 도시한다. 패널(A)은 MDA-231 및 UL-3C 세포에서 TRAIL-R2-유도되는 아폽토시스를 나타낸다. MDA231 및 UL-3C 모세포(parental cell), 및 MDA231 및 UL-3C 내성 세포를 표시된 농도의 TRA-8로 처리하였다. 패널(B)은 MDA-231 및 UL-3C 세포에서 TRAIL-R1-유도되는 아폽토시스를 나타낸다. MDA231 및 UL-3C 모세포, 및 MDA231 및 UL-3C 내성 세포를 표시된 농도의 2E12로 처리하였다. 패널(C)은 MDA-231 및 UL-3C 세포에서 TRAIL-유도되는 아폽토시스를 나타낸다. MDA231 및 UL-3C 모세포, 및 MDA231 및 UL-3C 내성 세포를 표시된 농도의 재조합 가용성 TRAIL로 처리하였다. 상기 기재된 바와 같이 하룻밤동안 배양한 후 ATPLITE 분석법에 의해 세포 생존율을 결정하였다. 패널(D)은 TRA-8 내성의 유지를 보여준다. TRA-8 내성을 유도한 후, TRA-8을 회수하였다. TRA-8을 회수한 후 매주마다 TRA-8 내성의 유지를 결정하였다. 세포를 1,000ng/ml의 TRA-8로 하룻밤동안 처리하고, ATPLITE 분석법에 의해 세포 생존율을 결정하였다.
도 3은 TRA-8 내성 세포에서 TRAIL-R2 및 관련 아폽토시스 조절 발현을 도시한다. 패널(A)은 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 전체 세포 용해물을 SDS-PAGE에서 분리하고 웨스턴 블롯팅하였다. 1㎍/ml의 1차 항체를 프로브로 사용하여 하룻밤동안, 이어 HRP-공액 2차 항체를 프로브로 사용하여 블롯을 검사하였다. ECL 화학발광에 의해 단백질을 드러내었다. 패널(B)은 MDA 231 모세포 및 내성 세포의 cDNA 어레이 분석을 나타낸다. 인간의 아폽토시스의 패널(상부 패널) 및 세포 신호 전달 관련 유전자의 패널(하부 패널)의 멤브레인 cDNA 어레이를 슈퍼어레이, 인코포레이티드(SuperArray, Inc.)에서 구입하였다. MDA 231 모세포 및 내성 세포의 전체 RNA로부터 32P 라벨링된 cDNA 프로브를 제조하고, 블롯 상에서 cDNA 어레이와 하이브리드 형성시켰다. 사이클론 포스포르-이미저(CyClone Phosphor-Imager)로 유전자 발현 프로파일을 분석하였다.
도 4는 TRA-8 내성 세포에서 카스파제 경로 및 JNK/p38 키나제 경로의 활성화를 도시한다. 패널(A)은 TRAIL-R1 및 -R2-촉발되는 카스파제 활성화를 나타낸다. MDA231 모세포 및 내성 세포를 표시된 시간동안 1,000ng/ml의 TRA-8(좌측 패널) 또는 2E12(우측 패널)로 처리하였다. 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을, 다 클론 항-카스파제 8(상부 패널), 항-카스파제 3(중간 패널) 또는 항-PARP(하부 패널)를 프로브로 사용하여 검사하였다. 화살표는 전체-길이 단백질 및 절단된 단백질을 나타낸다. 패널(B)은 JNK/p38 키나제 경로의 활성화를 나타낸다. 상기 기재된 것과 동일한 방식으로 세포를 처리하였다. 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을, 다클론 항-포스포릴화 JNK(상부 패널) 또는 항-포스포릴화 p38(하부 패널)을 프로브로 사용하여 검사하였다. 화살표는 포스포릴화 단백질을 나타낸다.
도 5는 TRA-8 내성 세포에서 변화된 DISC 형성을 도시한다. 패널(A)은 DISC 형성의 동시-면역침전 분석을 나타낸다. MDA231 모세포 및 내성 세포를 표시된 시간동안 1,000ng/ml의 TRA-8(좌측 패널) 또는 2E12(우측 패널)로 처리하였다. TRAIL-R1 및 TRAIL-R2를 2E12 또는 2B4-공액 세파로즈 4B로 면역침전시켰다. 동시-면역침전된 단백질 및 전체 세포 단백질의 웨스턴 블롯을, 다클론 항-FADD(상부 패널) 또는 항-카스파제 8 항체(중간 패널) 또는 항-cFLIP 항체(하부 패널)를 프로브로 사용하여 검사하였다. 패널(B 내지 E)은 TRA-8 내성 세포의 TRAIL-R2-회합된 단백질의 2차원 프로테옴(proteomic) 프로파일을 나타낸다. MDA 231 모세포 및 내성 세포를 1,000ng/ml의 TRA-8로 4시간동안 처리하거나, 또는 대조용으로서 처리되지 않은 상태로 유지하였다. 2B4-공액 세파로즈 4B로 TRAIL-R2 면역침전시킨 후, 용리된 단백질을 2차원 전기영동에 의해 분리하고 사이프로(SYPRO) 루비 염색 완충액으로 염색하였다. 동그라미가 그려진, 상이하게 발현된 단백질 반점(spot)을 PDQuest 소프트웨어에 의해 확인하였다. 재현성있는 결과를 위해 3회 이상 실험을 반복하였다.
도 6은 화학요법 약제에 의한 TRA-8 내성의 제거를 보여준다. 패널(A)은 화학요법 약제의 존재하에 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 TRA-8 내성 세포의 감수성을 나타낸다. MDA231 및 UL-3C 내성 세포를 0.1CM 탁솔, 1VM 아드리아마이신, 100VM 시스프라틴 또는 5VM BisVIII의 존재 또는 부재하에 가변적인 투여량의 TRA-8로 처리하였다. 하룻밤동안 배양한 후 ATPLITE 분석에 의해 세포 생존율을 결정하였다. 패널(B)은 아드리아마이신에 의한 TRA-8 내성 세포에서의 카스파제 활성화 캐스케이드(cascade)를 도시한다. MDA231 내성 세포를 배지 대조용(레인)에서 배양하거나 또는 1,000ng/ml의 TRA-8 및 1nM 아드리아마이신으로 1시간동안(레인 2) 또는 4시간동안(레인 3), 또는 1VM 아드리아마이신 단독으로 또는 1,000ng/ml의 TRA-8 단독으로(레인 5) 처리하였다. 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을, 단클론 항-인간 카스파제 항체를 프로브로 사용하여 검사하였다. 패널(C)은 TRA-8 내성 세포에서 FADD의 TRAIL-R2 동원을 나타낸다. 상기 나타낸 바와 같이 상이하게 처리된 MDA231 내성 세포로부터의 TRAIL-R2를 2B4 세파로즈 4B로 면역침전시켰다. TRAIL-R2와 FADD의 동시-면역침전을 항-FADD 항체로 조사하는 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다.
도 7은 TRAIL-R2의 DDX3 회합을 도시한다. MDA231 모세포 및 내성 세포를 전체-길이의 재조합 DDX3으로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 500ng/ml의 TRA-8로 표시된 시간동안 처리하였다. 단클론 항-His 항체를 프로브로 사용하여 전체 세포 단백질을 검사하였다(상부 패널). β-액틴을 로딩 대조용으로서 사용하였다. 항-His 항체를 사용하여, TRAIL-R2와 회합된 재조합 DDX3의 동시- 면역침전 분석을 결정하였다(하부 패널). TRAIL과 회합된 내인성 DDX3을 분석하기 위하여, MDA231 모세포 및 내성 세포를 500ng/ml의 TRA-8로 표시된 시간동안 처리하였다. TRA-R2를 2B4-공액 세파로즈 4B로 면역침전시켰다. 단클론 항-DDX3 항체, 3E2 및 5A6를 프로브로 사용하여 전체 세포 단백질을 검사하였다(상부 패널). 단클론 항-DDX3 항체, 3E2 및 5A6을 프로브로 사용하여 동시-면역침전된 내인성 DDX3을 검사하였다(하부 패널). 모세포 및 내성 세포의 TRAIL-R2를 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 결정하였다.
도 8은 DDX3 및 TRAIL-R2의 상호작용 영역의 맵핑을 도시한다. 도 8A는 삭제된 DDX3의 구조체를 나타낸다. 전체-길이 DDX3 및 표시된 바와 같이 삭제된 DDX3을 코딩하는 cDNA를 pcDNA3.1-HisA 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 293개의 세포를 N-말단, C-말단 삭제된 DDX3, 및 야생형 DDX3으로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 항-His 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 재조합 DDX3 발현을 검출하였다(상부 패널). 항-His 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 TRAIL-R2-동시-면역침전된 재조합 DDX3을 결정하였다(중간 패널). 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 TRAIL-R2를 결정하였다(하부 패널). 레인 1: 비-형질감염. 레인 2-5: N-말단 DDX3의 Δ2-5. 레인 6-9: C-말단 DDX3의 Δ3-6. 레인 10: 전체-길이 DDX3. 도 8B는 TRAIL-R2와 DDX3의 상호작용이 사멸 도메인과는 독립적임을 보여준다. 전체-길이 TRAIL-R2 및 나타낸 바와 같이 삭제된 TRAIL-R2를 코딩하는 cDNA를 셔틀-CMV 벡터 내로 클로닝시켰다. 쥣과의 3T3 세포를 야생형 또는 돌연변이 TRAIL-R2 및 DDX3으로 동시-형질감염시켰다. 24시간 후에, TRA-8 및 PE-공액 항-mIgG1을 사용하는 유동 세포 분석법에 의해 세포 표면 발현을 시험하였다. 동시-형질감염시킨지 48시간 후, 세포 용해물을 TRA-8로 면역침전시켰다. 항-His 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해, 전체 DDX3(상부 패널) 및 TRAIL-R2 회합된 DDX3(중간 패널)을 시험하였다. 레인 1: 비-형질감염; 레인 2: DDX3 단독; 레인 3: 야생형 TRAIL-R2 및 DDX3; 레인 4-9: TRAIL-R2 및 DDX3의 Δ1-6. 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 TRAIL-R2를 결정하였다(하부 패널). 도 8C는 전체-길이 TRAIL-R2 및 표시된 바와 같이 절단된(truncated) TRAIL-R2를 코딩하는 cDNA를 리포터 단백질로서 GFP를 가진 이중-프로모터 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 쥣과의 3T3 세포를 야생형 또는 돌연변이 TRAIL-R2 및 DDX3으로 동시-형질감염시켰다. 24시간 후, TRA-8 및 PE-공액 항-mIgG1을 사용하는 유동 세포 분석법에 의해 세포 표면 발현을 시험하였다. 동시-형질감염시킨지 48시간 후, 세포 용해물을 TRA-8로 면역침전시켰다. 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 TRAIL-R2를 결정하였다(상부 패널). 항-His 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 전체 DDX3(하부 패널) 및 TRAIL-R2 회합된 DDX3(중간 패널)을 시험하였다. 레인 1: DDX3 단독; 레인 2: ΔTRAIL-R2-300-330 및 DDX3; 레인 3: ΔD330 및 DDX3; 레인 4: ΔD340 및 DDX3; 레인 5: 야생형 TRAIL-R2 및 DDX3. 도 8D는 DcR2 및 DR4와 TRAIL-R2의 DDX3 결합 영역의 아미노산 정렬을 나타낸다. 도 8E는 DDX3이 TRAIL-R2와 cIAP1의 사이에서 연결자로서 작용함을 보여준다. MDA231 모세포 및 MDA231-내성 세포를 500ng/ml의 TRA-8로 표시된 시간동안 처리하였다. TRAIL-R2를 2B4-공액 세파로즈 4B로 면역침전시켰다. 3E4-공액 세파로즈 4B로 DDX3을 면역침전시켰다. 3E4, 단클론 항-DDX3 항체 및 1C12, 단클론 항-cIAP1 항체를 프로브로 사용하여 전체 DDX3, cIAP1(상부 패널), TRAIL-R2 동시-면역침전된 DDX3, cIAP1(중간 패널), DDX3 동시-면역침전된 DDX3, cIAP1(하부 패널)의 웨스턴 블롯을 검사하였다. 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 TRAIL-R2를 결정하였다(중간 패널).
도 9는 DDX3의 하향 조절(down-regulation)이 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 내성을 제거함을 보여준다. 도 9A는 선택된 효과적인 sRNAi-DDX3을 도시한다. MDA231 모세포를 표적 sRNAi-DDX3을 코딩하는 U6-엔트리 벡터(Entry vector)로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 DDX3 발현을 결정하였다. β-액틴을 로딩 대조용으로서 사용하였다. 도 9B는 MDA231-내성 세포를 GFP 발현 벡터 및 sRNAi-DDX3으로 동시-형질감염시켰음을 보여준다. 형질감염시킨지 24시간 후, 세포 분석법에 의해 GFP-양성 세포를 분류해내고 다양한 농도의 TRA-8을 사용하여 하룻밤동안 배양하였다. 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 DDX3 발현을 검출하였다(상부 패널). 2B4-공액 세파로즈 4B를 사용하여 TRAIL-R2를 면역침전시켰다. TRAIL-R2 회합된 DDX3을, 3E4, 단클론 항-DDX3 항체(중간 패널)를 프로브로 사용하여 검사하였다. 형질감염시킨지 24시간 후, 세포를 다양한 농도의 TRA-8로 하룻밤동안 처리하였다. TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 형질감염된 세포의 감수성을 ATPLite 분석법에 의해 결정하였다. 도 9D는 TUNEL 염색에 의해 아폽토시스하는 형질감염된 세포를 결정하였음을 나타낸다. 도 9E는 암 세포의 패널을 대조용 또는 DDX3 sRNAi 올리고로 형질감염시켰음을 보여준다. 형질감염시킨지 48시간 후, 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 DDX3의 감소된 발현을 검출하였다. β-액틴을 로딩 대조용으로서 사용하였다. 도 9F는 형질감염시킨지 24시간 후, 세포를 다양한 농도의 TRA-8로 하룻밤동안 처리하였음을 보여준다. 형질감염된 세포의 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 감수성을 ATPLite 분석법에 의해 결정하였다.
도 10은 DDX3 결합 모티프가 결여된 TRAIL-R2가 순-아폽토시스성(pro-apoptotic)임을 도시한다. 쥣과의 3T3 세포를 ΔD340-TRAIL-R2 및 DDX3, 야생형 TRAIL-R2 및 DDX3, ΔT300-330-TRAIL-R2 및 DDX3으로 동시-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간 후에, 세포를 500ng/ml의 TRA-8로 하룻밤동안 처리하였다. 유동 세포 분석법을 이용하여 GFP-양성 세포에서 PE-공액 항-TRAIL-R2 항체, 바이오틴-공액 아넥신 V에 의해 아폽토시스성 세포를 결정하였다. 아폽토시스성 세포를 칼럼 막대 그래프로 도시하였다.
도 11은 DDX3이 cIAP1을 TRAIL-R2에 연결시키는 어댑터 단백질로서 작용함을 도시한다. 도 11A는 cIAP1을 CARD에 결합시키는 DDX3의 맵핑을 나타낸다. 293개의 세포를 일련의 표시된 바와 같이 삭제된 DDX3으로, 즉 N-말단 aa 1-aa 50 삭제된 DDX3(레인 1), N-말단 aa 1-aa 100 삭제된 DDX3(레인 2), N-말단 aa 1-aa 150 삭제된 DDX3(레인 3) 및 C-말단 aa 350-aa 662 삭제된 DDX3(레인 4) 및 전체-길이 DDX3(레인 5)으로 형질감염시켰다(상부 패널). 형질감염시킨지 48시간 후, 재조합 DDX3을 니켈 비이드로 면역침전시켰다. 항-cIAP1 단클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 전체 cIAP1(중간 패널) 및 동시-면역침전된 cIAP1을 결정하였다(하부 패널). 도 11B는 CARD가 결여된 DDX3이 TRA-8 내성을 제거함을 보여준다. TRA-8-내성 종양 세포의 4개 세포주를, 전체-길이 DDX3(DDX3-FL) 또는 CARD-절단된 DDX3(ΔCARD-DDX3)을 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포 용해물을 TRA-8로 면역침전시킨 후, 동시-면역침전된 DDX3(상부 패널) 및 cIAP1(중간 패널)의 웨스턴 블롯 분석을 행하였다. 항-TRAIL-R2 다클론 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 TRAIL-R2를 결정하였다(하부 패널). 도 11C는 ATPLite 분석법에 의해 결정된 세포 생존율을 도시한다. 형질감염된 세포를 500ng/ml의 TRA-8과 하룻밤동안 배양하였다.
도 12는 TRA-8-내성 세포에서의 TRAIL-R2/DDX3/cIAP1 단백질 착체 차단 카스파제-8 활성화 및 DDX3 절단을 도시한다. 도 12A는 TRA-8-민감성 및 -내성 세포에서 TRAIL-R2/DDX3/cIAP1 단백질 착체를 도시한다. MDA231 모세포(MDA231p) 및 유도된 내성(MDA231r) 세포, UL-3C 모세포(UL-3Cp) 및 유도된 내성(UL-3Cr) 세포를 500ng/ml의 TRA-8로 8시간동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 2B4 항-TRAIL-R2 항체-공액 세파로즈 4B로 면역침전시키고, 글라이신-HCl pH 2.0으로 용리시키며, 즉시 1M 트리스(Tris) 완충액으로 중화시켰다. ELISA 플레이트를 2B4 항-TRAIL-R2 항체로 코팅하고 3% BSA PBS로 차단하였다. TRAIL-R2 co-IP로부터의 단백질 착체를 사용하여 배양한 후, 바이오틴-공액 다클론 항-TRAIL-R2 항체에 의해, 이어 HRP-공액 스트렙타바이딘에 의해 TRAIL-R2를 검출하였다. 도 12B는 바이오틴-공액 3E2, 항-DDX3 항체에 의해, 이어 HRP-공액 스트렙타바이딘에 의해 DDX3을 검출하였음을 보여준다. 도 12C는 바이오틴-공액 1C12, 항-cIAP1 항체에 의해, 이어 HRP- 공액 스트렙타바이딘에 의해 cIAP1을 검출하였음을 보여준다. 도 12D는 카스파제-매개되는 절단에 대한 DDX3의 상이한 감수성을 나타낸다. 2B4 항-TRAIL-R2 항체-공액 세파로즈 4B를 사용하여 면역침전시킴으로써 표시된 세포로부터 DDX3을 단리하고, 37℃에서 4시간동안 표시된 카스파제-2 또는 카스파제-8을 사용하여 배양하였다. 도 12E는 캡쳐(capture)로서 5A6을 사용하고 검출 항체로서 3E2를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 DDX3의 양을 측정하였음을 보여준다. 결과는 절단되지 않은 대조용에 대한 절단 후 DDX3의 백분율로서 제공된다. 도 12F는 카스파제 8 활성에 대한 DDX3/cIAP1 착체의 효과를 도시한다. 2B4 항-TRAIL-R2 항체-공액 세파로즈 4B를 사용하여 면역침전시킴으로써, 표시된 세포로부터 DDX3을 단리하고, 카스파제-8의 형광 기질, 즉 Ac-IETD-AMC의 존재하에 2시간동안 재조합 활성 인간 카스파제-8을 사용하여 배양하였다. 형광 강도의 감소에 의해 카스파제 8의 저해를 측정하였다. 결과는 대조용 웰에서의 최대 활성의 백분율로서 제공된다.
도 13은 회합 및 절단 조절에 있어서의 DDX3의 세린이 풍부한 도메인의 역할을 도시한다. 패널(A)은 GSK3 기질의 보존된 도메인을 도시한다. 패널(B)은 GSK3α에 의해 동시-면역침전된 DDX3을 나타낸다(상부). TRA-8 민감성 MDA231 세포를 리튬의 존재 또는 부재하에 TRA-8로 2시간동안 처리하였다. 전체 세포 용해물을 항-GSK3α 비이드로 면역침전시켰다. 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴-블롯에 의해 GSK3α를 가진 단백질을 분석하였다. GSK3은 DDX3을 포스포릴화시킨다(B, 하부). PKA의 존재 또는 부재하에 GSK를 사용하여 1시간동안 배양시킨 기질로서 재조합 DDX3 및 타우(tau)를 사용하였다. 혼입된 32P를 계수하고 cpm으로 나타내었다. (C) GSK3은 Ser90 돌연변이 DDX3을 포스포릴화시키지 못한다. (D) MDA231 세포를 야생형 DDX3 및 Ser90 돌연변이 DDX3으로 형질감염시켰다. TRA-8 처리 후, DR5로부터의 DDX3의 분리 및 DDX3의 절단을 결정하였다.
본원에 포함된 특정 실시양태 및 실시예에 대한 하기 상세한 설명 및 도면과 이들에 대한 상기 및 하기 설명을 참조함으로써, 개시된 방법 및 조성물을 더욱 용이하게 이해할 수 있다.
종양 세포의 사멸 수용체-매개되는 아폽토시스의 유도는 암 요법의 매우 전도유망한 접근법이다. 대부분의(전부는 아니더라도) 요법에서 일부 표적 세포가 내성이기 때문이다. 예로서, 독특한 작용제성 단클론 항-DR5 항체인 TRA-8은 간세포 세포독성 없이 인간의 암 세포의 아폽토시스를 유도하고[이치카와(Ichikawa, K.) 등. 2001. Nat Med 7:954-960], 동물 모델에서 강력한 항암 효능을 나타내며[부흐스바움 등. 2003. Clin Cancer Res 9:3731-3741), 인간이 아닌 연장류에서의 독성 연구에서 안전성이 입증되었다. 그러므로, 본원에서는 TRA-8을 예로서 사용하지만, 사멸 수용체(예컨대, DR4 또는 DR5) 활성화를 통해 아폽토시스를 유도하는 다른 약제를 본원에 교시되는 방법에 사용할 수 있다. TRA-8 및 그의 인간에 적용되는 버전 및 인간용 버전이 항암 요법으로서 임상 개발중이기는 하지만, 일부 종양 세포주는 합당한 DR5 발현 수준에도 불구하고 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대해 내성이다. 이러한 관찰 결과는 내성이 수용체 발현에 관련된 것이 아니라 오히려 DR5-개시되는 신호 전달 메카니즘에 관련되어 있음을 암시한다. 명백하게도, DR5-매개되는 아폽토시스는 통상적인 화학요법 약제에 의해 크게 향상될 수 있다[오츠카(Ohtsuka, T.) 및 조우(T. Zhou). 2002. J Biol Chem 277:29294-29303; 오츠카 등. 2003. Oncogene 22:2034-2044]. 사멸 수용체에 결합하고 카스파제 활성화를 억제하는 CARD 함유 단백질 부류를 표적화시킴으로써 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 억제하는 조성물 및 방법이 개시된다.
달리 규정되지 않는 한, 개시된 방법 및 조성물이 특정 합성 방법, 특정 분석 기법 또는 특정 시약으로 한정되지 않고 그 자체로 변할 수 있음을 알아야 한다. 또한, 본원에 사용되는 용어는 특정 실시양태를 기재하기 위한 것일 뿐 한정하고자 하지 않음을 알아야 한다.
개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있거나, 이들 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있거나, 이들의 제조에 사용될 수 있거나, 이들의 생성물인 물질, 조성물 및 성분이 개시된다. 이들 물질 및 다른 물질은 본원에 개시되며, 이들 물질의 조합, 부분집합, 상호작용물, 군 등이 개시되는 경우에는 이들 화합물의 각각의 다양한 개별 및 집단 조합 및 변경이 명시적으로 개시되지 않아도 각각이 본원에 구체적으로 고려 및 기재되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 벡터가 개시 및 논의되고 프로모터를 비롯한 다수의 벡터 성분이 논의되면, 구체적으로 달리 표시되지 않는 한, 프로모터 및 다른 벡터 성분의 각각의 모든 조합 및 변경 및 가능한 변형이 구체적으로 고려되는 것이다. 그러므로, 분자 A, B 및 C의 부류, 및 분자 D, E 및 F의 부류, 및 예컨대 조합 분자 A-D가 개시되면, 각각이 개별적으로 인용되지 않더라도, 각각이 개별적으로 또한 집단적으로 고려된다. 그러므로, 이 예에서는, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E 및 C-F 각각이 구체적으로 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 마찬가지로, 이들의 임의의 부분집합 또는 조합도 구체적으로 고려되고 개시된다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F 및 C-E의 아군이 구체적으로 고려되고, A, B 및 C; D, E 및 F; 및 예시적인 조합 A-D의 개시내용으로부터 개시된 것으로 간주되어야 한다. 이러한 개념은 개시된 조성물을 제조 및 사용하는 방법의 단계를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 본원의 모든 요지에 적용된다. 그러므로, 수행될 수 있는 다양한 추가 단계가 존재하는 경우에는, 이들 추가 단계 각각을 개시된 방법의 임의의 구체적인 실시양태 또는 개시된 방법의 실시양태의 조합으로 수행할 수 있고, 이러한 조합 각각이 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함을 알아야 한다.
다양한 서열이 본원에 제공되며, 이들 및 다른 서열은 'www.pubmed.gov'의 젠뱅크(Genbank)에서 찾아볼 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 서열 불일치 및 차이를 해소하는 방법, 및 특정 서열에 관한 조성물 및 방법을 다른 관련 서열에 대해 조정하는 방법을 알고 있다. 본원에 개시되고 당해 분야에 공지되어 있는 정보가 있으면 임의의 서열에 대한 프라이머 및/또는 프로브를 디자인할 수 있다.
CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제와 표적 세포를 접촉시킴을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 방법이 제공되며, 이때 조절제는 작용제에 대한 내성을 제거하거나 방지한다. 이 방법은 아폽토시스 신호 전달 연구 및 암, 자가면역 질환 및 염증 질환 같은 질환의 치료에 이용된다. 따라서, 이 방법의 접촉 단계는 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다.
본원 전체에 사용되는 "제거한다" 또는 "제거하는"은 질환의 경과를 악화로부터 호전으로 변화시키는 것과 같이 반대 위치, 방향 또는 경과로의 변화를 의미한다. 예를 들어, 사열 수용체 내성의 경우, 사열 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하는 것은 세포를 상기 작용제에 대해 덜 내성으로 만드는 것이다. 따라서, 예를 들어 100% 내성인 표적 세포의 내성을 제거하면, 상기 표적 세포가 사멸 수용체 작용제에 대해 90% 내지 0% 내성(90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 및 0% 내성 포함)이 될 수 있다.
본원 전체에 사용되는 "방지하는"은 특히 사전 계획 또는 작용에 의해 어떤 일이 일어나는 것을 배제하거나, 피하거나, 없애거나, 방해하거나, 중지시키거나 또는 훼방놓음을 의미한다. 예를 들면, 사멸 수용체 내성의 경우, 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 방지하는 것은 세포가 상기 작용제에 대해 내성이 될 가능성을 적게 만드는 것이다. 그러므로, 예컨대 표적 세포에서의 100% 내성을 방지하면, 상기 표적 세포가 사멸 수용체 작용제에 대해 0% 내지 90%만 내성(0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 및 90% 내성 포함)일 수 있다.
"제거하는" 또는 "방지하는"은 크기의 변화 또는 크기의 임의의 변화의 지체를 일컫는다. 그러므로, 사멸 수용체 내성의 경우, "제거하는" 또는 "방지하는"은 내성 증가의 경과를 감소시키거나 내성 증가를 지연시킴을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구의 범위에 사용되는 단수형은 문맥상 명백하게 달리 해석되지 않는 한 복수 인용물을 포함함에 주목해야 한다. 따라서, 예컨대 "폴리펩타이드"는 복수개의 이러한 폴리펩타이드를 포함하고, "폴리펩타이드"를 인용하면 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 하나 이상의 폴리펩타이드 및 그의 등가물 등을 인용하는 것이다.
"임의적인" 또는 "임의적으로"는 후속 기재된 사건, 상황 또는 물질이 일어나거나 존재할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 이러한 기재가 상기 사건, 상황 또는 물질이 일어나거나 존재하는 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 의미이다.
범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 다른 하나의 특정 값까지로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표시되면, 문맥상 구체적으로 달리 표시되지 않는 한 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지의 범위가 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 생각된다. 유사하게, 선행하는 "약"의 사용에 의해 값이 어림값으로서 표현되는 경우, 특정 값은 문맥상 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 개시된 것으로 간주되어야 하는 다른 하나의 구체적으로 고려되는 실시양태를 구성하는 것으로 생각된다. 또한, 문맥상 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 각 범위의 종결점이 다른 종결점과 관련하여 또한 다른 종결점과는 독립적으로 둘 다 유의함을 알아야 한다. 마지막으로, 명시적으로 개시된 범위 내에 포함되는 모든 개별 값 및 보다 작은 값의 범위도 문맥상 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 구체적으로 고려되고 개시된 것으로 간주되어야 함을 알아야 한다. 상기 내용은 특정 경우에 이들 실시양태중 일부 또는 전부가 명시적으로 개시되어 있는지의 여부와 무관하게 적용된다.
본원 전체에 사용되는 "표적 세포"는 예를 들어 DR5 또는 DR4를 발현하는 세포를 비롯한 표적화된 사멸 수용체를 가진 세포를 의미하고, 유두종 및 사마귀; 유방암, 결장암, 간암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 골수종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 두경부 암, 갑상선암, 자궁암, 별아교세포종 같은 뇌종양, 활성화된 면역 세포(예컨대, 활성화된 림프구, 림프 세포 및 골수 세포), 염증 세포, 류마티스성 관절염 윤활 세포 및 바이러스에 감염된 세포 같은 비정상적으로 성장하는 세포 및 종양 세포를 예로서 포함한다. 생체 내에서, 표적 세포는 암 및 류마티스성 관절염 같이 세포 증식이 비정상적이거나 조절 곤란한 병리학적 상태를 비롯한 병리학적 상태를 가진 개인의 세포이다. 표적 세포는 인간, 인간이 아닌 영장류, 고양이, 개, 래트, 마우스, 기니아 피그, 토끼, 염소, 양, 젖소, 말, 닭, 돼지, 명주원숭이 및 흰족제비의 세포, 또는 다양한 세포주의 세포[예: 저캣(Jurkat) 세포]를 포함한다.
"사멸 수용체"는 리간드에 의해 결합되면 세포 자멸사를 유도하는 수용체를 의미한다. 사멸 수용체는 예컨대 사멸 도메인을 가진 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 구성원(예: TNFRI, Fas, DR3, 4, 5, 6) 및 사멸 도메인을 갖지 않는 TNF 수용체 패밀리의 구성원(예: LTbetaR, CD40, CD27, HVEM)을 포함한다.
예컨대 DR5를 통한 신호 변환은 DR5-매개되는 아폽토시스의 제어에 있어서 핵심적인 메카니즘이다. TNFR 패밀리의 사멸 수용체의 통상적인 특징은 이들 모두가 세포질 꼬리에 보존된 "사멸 도메인"을 갖고 있다는 것이다[조우(Zhou, T.) 등. 2002. Immunol Res 26:323-336]. DR5-매개되는 아폽토시스가 사멸 도메인에서 개시된다는 것은 널리 확립된 사실이다. TRAIL 또는 작용제성 항-DR5 항체에 의해 세포 표면에서 DR5를 가교결합시키면 DR5가 올리고머화되고, 그 직후 DR5의 사멸 도메인에 FADD가 동원된다[보드머(Bodmer, J.L.) 등. 2000. Nat Cell Biol 2:241-243; 쇼더리 등. 1997. Immunity 7:821-830; 쿠앙 등. 2000. J Biol Chem 275:25065-25068; 슈나이더(Schneider, P.) 등. 1997. Immunity 7:831-836; 스프릭(Sprick, M.R.) 등. 2000. Immunity 12:599-609]. 사멸-도메인에 결합된 FADD는 개시제인 프로카스파제 8 및/또는 프로카스파제 10을 추가로 동원하여, 친동종(homophilic) DD 상호작용을 통해 DISC를 생성시킨다[크래머(Krammer, P.H.). 2000. Nature 407:789-795]. 활성화된 카스파제 8 및 10은 카스파제 3을 직접 활성화시킬 수 있거나, 또는 BH3-함유 단백질 Bid를 절단하여 사이토크롬(cytochrome) C의 방출 및 카스파제 9 활성화를 통한 미토콘드리아-의존성 아폽토시스 경로를 활성화시킬 수 있다[데사거(Desagher, S.) 및 마티뉴(J.C. Martinou). 2000. Trends Cell Biol 10:369-377; 스카피디(Scaffidi, C.) 등. 1998. Embo J 17:1675-1687]. 사멸 도메인 착체의 형성 후에는, 카스파제, NF-κB 및 JNK/p38 같은 수개의 신호 변환 경로가 활성화된다. 이들 신호 전달 경로의 활성화에 의해, 단백질의 Bcl-2 및 IAP 부류를 통해 사멸 수용체-매개되는 아폽토시스가 조절된다.
"작용제"란 세포 상에서 수용체(예: 사멸 수용체)와 결합하고 내인성 리간드의 결합에 의해 전형적으로 생성되는 반응 또는 활성(예: 아폽토시스)을 개시할 수 있는 성분(분자, 약물, 단백질 등)을 의미한다. 본 방법의 작용제는 사멸 수용체 리간드일 수 있다. 그러므로, 작용제는 TNF, Fas 리간드 또는 TRAIL일 수 있다. 작용제는 또한 단편이 사멸 수용체와 결합하고 사멸 수용체를 활성화시킬 수 있도록 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하는 이들 리간드의 단편일 수도 있다. 작용제는 추가로 융합 단백질이 사멸 수용체와 결합하고 사멸 수용체를 활성화시킬 수 있도록 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수도 있다. 작용제는 또한 동족체가 사멸 수용체와 결합하여 그를 활성화시킬 수 있도록 TNF, Fas 또는 TRAIL과 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드일 수도 있다.
작용제는 추가로 사멸 수용체와 결합하는 아폽토시스-유도 항체일 수도 있다. "항체"는 단클론, 다클론, 키메라, 단일 쇄, 인간에 적응되는, 완전히 인간의 항체, 또는 그의 임의의 Fab 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. "아폽토시스-유도 항체"는 본원에 제공되는 방법을 이용하는 활성화 전후에 프로그래밍된 세포 사멸을 야기하는 항체를 의미한다. 그러므로, 본 방법의 작용제는 항체가 사멸 수용체를 활성화시킬 수 있도록 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 사멸 수용체에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 작용제는 DR4 또는 DR5에 특이적인 항체일 수 있다. 작용제는 ATCC 수납 번호 PTA-1428(예: TRA-8 항체), ATCC 수납 번호 PTA-1741(예: TRA-1 항체), ATCC 수납 번호 PTA-1742(예: TRA-10 항체)를 가진 마우스-마우스 하이브리도마와 동일한 에피토프 특이성을 갖거나 상기 하이브리도마에 의해 분비되는 DR5 항체일 수 있다. 작용제는 ATCC 수납 번호 PTA-3798을 가진 하이브리도마와 동일한 에피토프 특이성을 갖거나 또는 상기 하이브리도마에 의해 분비되는 항체(예: 2E12 항체)일 수 있다.
본 방법의 항체에 의해 표적화되는 TRAIL 수용체는 DR4 또는 DR5일 수 있다. 이러한 수용체는 공개된 특허원 WO99/03992 호, WO98/35986 호, WO98/41629 호, WO98/32856 호, WO00/66156 호, WO98/46642 호, WO98/5173 호, WO99/02653 호, WO99/09165 호, WO99/11791 호, WO99/12963 호 및 미국 특허 제 6,313,269 호(이들은 모두 그에 교시된 수용체에 대해 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있다. 이들 수용체에 특이적인 단클론 항체는 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 이들 방법에 대해 본원에 참고로 인용된 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 문헌[Nature, 256:495-497 (1975) 및 Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)]을 참조한다. 또한, 본원에 참고로 인용된 공개된 특허원 WO01/83560 호에 교시된 방법도 참조한다.
본 방법의 항체는 예를 들어 ATCC 수납 번호 PTA-1428(예: TRA-8 항체), ATCC 수납 번호 PTA-1741(예: TRA-1 항체), ATCC 수납 번호 PTA-1742(예: TRA-10 항체)를 가진 마우스-마우스 하이브리도마와 동일한 에피토프 특이성을 갖거나 상기 하이브리도마에 의해 분비되는 DR5 항체를 비롯한, 당해 분야에 공지되어 있는 항체일 수 있다. 다른 예는 ATCC 수납 번호 PTA-3798을 가진 하이브리도마와 동일한 에피토프 특이성을 갖거나 상기 하이브리도마에 의해 분비되는 항체(예: 2E12 항체)를 포함한다.
"CARD 함유 단백질"이란, 카스파제-관련 동원 도메인(CARD)을 함유하고 사멸 수용체와 결합(이때, 결합은 임의적으로 사멸 도메인의 외부임)하는 능력을 그 특징으로 하며 상기 사멸 수용체의 사멸 도메인에 의한 아폽토시스의 활성화를 조절하는 단백질 부류를 의미한다. DDX3이 이 부류의 대표적인 구성원이다. CARD 함유 단백질은 DEAD(서열 번호: 21) 박스 단백질 부류의 RNA 헬리카제를 포함한다. 개시된 CARD 함유 단백질은 예를 들어 DDX3(서열 번호: 25, 수납 번호 gi:13514816), mda-5(수납 번호 gi:11344593) 또는 RIG-1(수납 번호 gi:6048564)일 수 있다. CARD 함유 단백질은 또한 DDX3, mda-5 또는 RIG-1에 대해 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드일 수도 있다.
DEAD-박스 단백질 부류의 RNA 헬리카제는 세균으로부터 포유동물까지 고도로 보존되어 있으며, RNA를 포함하는 다양한 대사 과정에 관여하며, 세포 생존에 중요하다[하인라인(Heinlein, U.A.). 1998. J Pathol 184:345-347]. 이 단백질 부류의 모든 구성원은 특징적인 아미노산 서열 D-E-A-D(Asp-Glu-Ala-Asp, 서열 번호: 21)(이는 이 부류의 명칭이 됨)로 구성된 ATP아제 모티프를 가진다. 일반적으로 DEAD(서열 번호: 21) 박스 단백질은 리보핵산 결합 단백질로서 번역 개시, RNA 스플라이싱, 리보좀 조립, RNA 열화, mRNA 안정성 및 RNA 편집에 요구되는 RNA 헬리카제이다. 이들 RNA 헬리카제중 일부가 특수 전사 인자의 번역에 결정적인 역할을 하기는 하지만, 일부의 과발현은 발암에 관련된다. DDX1은 신경아세포종에서 N-myc와 동시-증폭된다[조지(George, R.E.) 등. 1996. Oncogene 12:1583-1587; 갓버트(Godbout, R.) 등. 1998. J Biol Chem 273:21161-21168]. RNA 헬리카제 p68은 매치되는 정상 조직에 비해 종양에서 일관되게 과발현된다. 축적된 p68은 다중으로 도처에 존재하는 것으로 보여서, 이들 종양에서의 프로테아좀-매개되는 열화에서의 가능한 결함을 암시하며[코세빅(Causevic, M.) 등. 2001. Oncogene 20:7734-7743], p68 발현의 조절 곤란이 종양 발생 동안 초기에 발생됨을 암시한다. DEAD(서열 번호: 21) 박스 단백질/RNA 헬리카제 부류의 rck/p54는 c-myc 단백질의 합성 증가에 의해 번역 수준에서의 인간의 결장 종양 발생시 세포 증식 및 발암에 기여할 수 있다[하시모토(Hashimoto, K.) 등. 2001. Carcinogenesis 22:1965-1970]. DDX3의 RNA 헬리카제 기능은 알려져 있지 않지만, DDX3은 이 부류의 구성원이다[후(Fu, J.J.) 등. 2002. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao(상하이) 34:655-661]. DDX3은 HCV 코어 단백질과 상호작용하고 HCV 바이러스 단백질의 번역을 조절하는 것으로 보고되었다[오시앙카(Owsianka, A.M.) 및 페이틀(A.H. Patel). 1999. Virology 257:330-3400].
RNA 헬리카제중 일부는 보존된 CARD(카스파제 동원 도메인)를 함유한다[요네야마(Yoneyama, M.) 등. 2004. Nat Immunol 5:730-737; 캉(Kang, D.C.) 등. 2004. Oncogene 23:1789-1800; 캉 등. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99:637-642]. 삭감 하이브리드 형성은 분화, 암 제거 및 프로그래밍된 세포 사멸(아폽토시스) 동안 유도되는 유전자로서 흑색종 분화-관련 유전자-5(mda-5)를 확인하였다. 이 유전자는 카스파제 동원 도메인 및 추정 DExH 기 RNA 헬리카제 도메인을 둘 다 함유한다. mda-5는 IFN-유도되는 성장 억제 및/또는 아폽토시스의 매개자로서의 기능을 할 수 있다(캉 등. 2002. Proc Natl Acad Sci USA 99:637-642). 더욱 최근의 연구는 mda-5 mRNA 수준이 정상적인 조직에서 낮은 반면 정상 세포 및 암 세포의 스펙트럼에서 IFN-베타에 의해 발현이 유도됨을 나타낸다. 복제 부적격 아데노바이러스인 Ad.mda-5에 의해 mda-5를 발현시키면, 형태학적, 생화학적 및 분자 분석법에 의해 확인되는 바와 같이 HO-1 세포에서 아폽토시스가 유도된다(캉 등. 2004. Oncogene 23:1789-1800). 카스파제 동원 도메인을 함유하는 DExD/H 박스 RNA 헬리카제를 코딩하는 레티노산 유도성 유전자 1(RIG-1)은 기능적 선별 및 분석법에 의해 평가되는 바와 같이 dsRNA-유도되는 신호 전달의 필수적인 조절자이다. 완전한 ATP아제 활성을 나타내는 헬리카제 도메인은 dsRNA-매개되는 신호 전달을 담당하였다. 카스파제 동원 도메인은 '하류(downstream)' 신호를 전달하여, 전사 인자 NF-κB 및 IRF-3을 활성화시켰다. 이들 인자에 의한 후속 유전자 활성화는 유형 I 인터페론 생성을 비롯한 항바이러스 기능을 유도하였다(요네야먀 등. 2004. Nat Immunol 5:730-737).
CARD를 함유하는 단백질은 세포 사멸의 핵심적인 조절자로서 확립되어 있다. CARD는 특정 카스파제의 프로-도메인의 N-말단에서 발견되는 보존된 알파-나선 다발로 이루어진다. CARD는 또한 다양한 다른 단백질에서도 발견될 수 있다. 사멸 도메인 단백질과 유사하게, CARD는 CARD/CARD 상호작용을 통한 단백질의 소통을 허용하는 동형(homotypic) 단백질 상호작용 모티프로서의 기능을 한다. CARD를 가진 단백질은 순-아폽토시스성 또는 항-아폽토시스성일 수 있다. 순-아폽토시스성 CARD 단백질은 아폽토시스의 개시에 중요한 역할을 하는 카스파제 2, 4 및 9 같은 특정 카스파제, 및 Apaf1을 포함한다. 대표적인 항-아폽토시스성 CARD 단백질은 카스파제의 CARD와 상호작용하고 이들의 BIR 도메인을 거쳐 카스파제 활성화를 억제하는 cIAP1 및 cIAP2를 포함한다. 이 부류의 단백질의 기능의 다수의 요지는 암 치료에서의 신규 약물 표적으로서의 이들의 잠재적인 효용으로 집중된다. 수개의 CARD 함유 단백질은 조절이 곤란할 때 종양 발생을 촉진시키고 화학요법에 대한 종양 내성에 우세하게 기여하는 보존된 세포 사멸 조직의 결정적인 성분이다. 순-아폽토시스성 단백질 Apaf1(이는 일부 암에서 불활성화됨)은 미토콘드리아-유도되는 아폽토시스에 필수불가결한 CARD 단백질이다. IAP 부류의 단백질 같은 다른 항-아폽토시스성 CARD 단백질은 세포 사멸 자극으로부터 종양을 보호하고 특정 형태의 암에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, CARD 단백질을 활성화시키거나 억제하는 치료제를, 통상적인 화학요법과 함께 사용할 때, 약품-감작화제로서 또는 아폽토시스의 조절제로서 사용할 수 있다.
사멸 수용체 작용제에 대한 내성은 개시된 CARD 함유 단백질의 활성에 기인할 수 있다. 따라서, 본 방법은 CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성을 조절하여 상기 내성을 방지하는 조성물을 제공한다. "조절한다"란, 형태 또는 기능에서의 상향 조절, 하향 조절, 활성화, 길항작용 또는 다른 변화를 의미한다. 단백질의 "활성"은 예컨대 전사, 번역, 세포내 전좌, 분비, 키나제에 의한 포스포릴화, 프로테아제에 의한 절단, 다른 단백질로의 친동종 및 친이종 결합, 유비퀴틴화를 포함한다. CARD 함유 단백질의 활성이 부분적으로는 사멸 수용체 결합 아미노산에서의 또는 그 부근에서의 포스포릴화에 기인하기 때문에, 제공되는 조절제는 CARD 함유 단백질 포스포릴화의 억제제일 수 있다. 그러므로, 조절제는 키나제 또는 포스파타제의 저해제일 수 있다. 예로서, 조절제는 글라이코겐 신타제 키나제-3(GSK-3) 활성의 저해제일 수 있다.
GSK-3은 포유동물을 비롯한 다양한 생물체에서 발견되는 단백질 키나제이다. 거의 동일한 두 형태의 GSK-3, 즉 GSK-3α 및 GSK-3β가 존재한다. 저해제는 임의의 공지 GSK-3 저해제 또는 새로 발견된 GSK-3 저해제일 수 있다. 최적으로는, 제공되는 방법의 GSK-3 저해제는 적어도 GSK-3β를 저해한다. 인간의 GSK-3β의 아미노산 서열은 젠뱅크 수납 번호 P49841로 입수할 수 있으며, 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 수납 번호 NM_002093으로 입수할 수 있다. 실험 및 선별을 위하여, 동물 모델을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 젠뱅크 수납 번호 P18266으로 래트 GSK-3β 서열을 입수할 수 있고, 젠뱅크 수납 번호 AAD39258로 마우스 GSK-3β 서열을 입수할 수 있다.
본원에 사용되는 GSK-3 저해제는 경쟁적 또는 비-경쟁적 효소 저해에 의해; 예컨대 표적화된 유전자 교란, GSK-3 유전자의 전사 감소, 단백질 불안정성 증가 등에 의해 단백질 수준을 감소시킴으로써, 세포에서 GSK-3 활성 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 감소시키는 화합물이다. 저해제는 작은 유기 또는 무기 분자, 안티-센스(anti-sense) 핵산, 항체 또는 그로부터 유도되는 단편 등일 수 있다. GSK-3의 다른 저해제는 GSK-3 활성 저해용 선별 조합 또는 다른 화학적 라이브러리를 통해 발견할 수 있다.
GSK-3 단백질의 직접적인 저해제의 예는 리튬(Li+)[클라인(Klein) 등, 1996]을 포함하며, 이는 GSK-3β 활성을 강력하게 저해하지만(Ki=2mM) 다른 단백질 키나제의 일반적인 저해제는 아니다. 베릴륨 이온(Be2 +)은 GSK-3의 보다 강력한 저해제로서, 마이크로몰 범위에서 저해한다. 그러나, 낮은 투여량에서 CDK1도 저해하기 때문에 이 저해 효과는 리튬만큼 선택적이지는 않다.
GSK-3 저해제는 또한 알로이신, 알로이신 A, 켄파울론도 포함한다. 알로이신(7-n-뷰틸-6-(4-메톡시페닐)[5H]피롤로[2,3-b]피라진)은 Cdk1/B(IC50=700nM), Cdk5/p35(IC50=1.5uM) 및 GSK-3(IC50=920nM)의 강력하고 선택적이며 세포-투과성이고 ATP-경쟁적인 저해제이다[이 분자의 교시내용에 대해 본원에 참고로 인용된 메티(Mettey Y) 등의 문헌 (2003) J Med Chem. 46(2):222-36]. 알로이신 A(7-n-뷰틸-6-(4-하이드록시페닐)[5H]피롤로[2,3-b]피라진)는 사이클린 의존성 키나제, c-Jun N-말단 키나제(JNK) 및 글라이코겐 신타제 키나제-3(GSK-3)(GSK-3 알파, IC50=500nM; GSK-3 베타, IC50=1.5uM)의 강력하고 선택적이며 가역적이고 ATP-경쟁적인 저해제로서 작용하는 세포-투과성 화합물이다[이 분자에 관한 교시내용에 대해 본원에 참고로 인용된 메티 등의 문헌 (2003) J Med Chem. 46(2):222-36]. 켄파울론(9-브로모-7,12-다이하이드로인돌로[3,2-d][1]벤즈아제핀-6(5H)-온)은 글라이코겐 신타제 키나제-3b(GSK3b, IC50=230nM), Lck 및 사이클린-의존성 키나제(Cdks)의 강력한 세포-투과성 저해제이다[이 분자에 관한 교시내용에 대해 본원에 참고로 인용된 문헌 슐츠(Schults C) 등. (1999) J. Med. Chem. 42(15):2909-19; 자하레비츠(Zaharevitz DW) 등. (1999) Cancer Res. 59(11):2566-9; 쿠닉(Kunick C) 등. (2004) J. Med. Chem. 47(1):22-36].
다수의 다른 화합물이 GSK-3을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 대다수는 ATP-결합 부위와의 상호작용을 통해 키나제 활성을 저해한다. 이들은 비스인돌- 및 아닐리노 말레이미드, 알디신 알칼로이드, 폴론, 인디루빈 및 피랄로퀸옥살린을 포함한다. 예를 들어, 폴론 및 GSK-3 저해시 이들의 용도는 예컨대 폴론의 개시내용에 대하여 본원에 참고로 인용된 쿠닉(Kunick C) 등의 문헌[J Med Chem. 2004년 1월 1일; 47(1):22-36]에 기재되어 있다. 이들 화합물은 시험관 내에서는 나노몰 농도에서 효과적이고, 생체 내에서는 낮은 마이크로몰 농도에서 효과적이다. 또다시, 다수의 화합물이 강력한 것으로 밝혀졌지만, 이들은 GSK-3에 대해 매우 특이적이지않고 관련 CDK를 유사한 수준으로 통상적으로 저해한다. 그러나, 두 가지의 구조 면에서 상이한 말레이미드(SB216763 및 SB415286)는 강력하고 GSK-3에 대해 높은 특이성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들은 세포 연구에서 GSK-3 저해제로서 리튬을 효과적으로 대체할 수 있다. 그래뉼라티마이드 또는 다이뎀니마이드로 불리는 화합물 부류의 구성원도 GSK-3 저해제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다(이들 화합물의 교시에 대해 본원에 참고로 인용된 국제 특허원 WO 99/47522 호).
GSK-3의 몇몇 간접적인 저해제는 단백질 키나제 B를 활성화시켜 GSK-3을 포스포릴화시키고 저해하는 워트만닌을 포함한다. 주로 베타3-아드레날린 수용체를 통해 작용하는 아이소프로테렌올은 인슐린과 비슷한 한도(약 50%)까지 GSK-3 활성을 감소시킨다[뮬(Moule) 등. 1997]. p70 S6 키나제 및 p90rsk-1도 GSK-3β를 포스포릴화시켜 그를 저해한다.
GSK-3-특이적 펩타이드를 사용하여 GSK-3을 또한 선택적으로 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 진행된 T-세포 림프종 1(FRAT1)에서 흔히 재배열되는 것은 GSK3-결합 단백질(GBP)의 포유동물 동족체이다. FRAT타이드(FRAT1의 잔기 188 내지 226에 상응하는 펩타이드)는 GSK3에 결합하고 GSK3-촉진되는 엑신 및 베타-카테닌의 포스포릴화를 차단한다[토마스(Thomas GM) 등. FEBS Lett. 1999년 9월 17일; 458(2):247-51].
제공되는 방법의 GSK-3 저해제는 또한 기능성 핵산일 수도 있다. 기능성 핵산은 표적 분자와 결합하거나 특수 반응을 촉진시키는 것과 같은 특수 기능을 가진 핵산 분자이다. 기능성 핵산 분자는 아래 카테고리로 나뉘어질 수 있으나 한정하는 의미는 아니다. 예를 들어, 기능성 핵산은 안티센스 분자, 압타머(aptamer), 리보자임, 트리플렉스 형성 분자, RNAi 및 외부 가이드 서열을 포함한다. 기능성 핵산 분자는 표적 분자가 나타내는 특이적인 활성의 어펙터(affector), 저해제, 조절제 및 자극제로서 작용할 수 있거나, 또는 기능성 핵산 분자는 임의의 다른 분자와 무관한 새로운 활성을 가질 수 있다.
CARD 함유 단백질이 사멸 수용체-유도되는 아폽토시스 동안 절단될 수 있기 때문에, 본 방법의 조절제는 CARD 함유 단백질의 절단을 촉진시킴으로써 작용할 수 있다. 예로서, TRA-8-유도되는 아폽토시스 동안 FADD가 동원됨(도 9E)과 동시에 DDX3이 DR5로부터 분리되고 절단된다(도 9A 및 C). DDX3의 절단 부위중 하나는 아미노산 잔기 132 내지 135 사이의 비교적 보존된 DEDD(서열 번호: 7) 모티프이며, 이는 카스파제 2, 3, 7 또는 10에 의해 절단될 수 있다. 따라서, 조절제는 CARD 함유 단백질(예: DDX3)을 절단하는 카스파제 또는 카스파제의 유도체일 수 있다.
CARD 함유 단백질의 활성이 사멸 수용체에 대한 그의 결합에 따라 달라지기 때문에, 본 방법의 조절제는 CARD 함유 단백질과 사멸 수용체 사이의 상호작용의 억제제일 수 있다. 한 예에서, 조절제는 사멸 수용체-결합 부위에서 CARD 함유 단백질과 결합하는 성분(약물, 분자, 폴리펩타이드 등)이다. 따라서, 조절제는 CARD 함유 단백질의 결합 부위에 상응하는 사멸 수용체의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 조절제는 DR5(서열 번호: 22, 수납 번호 gi:3721878)의 아미노산 250 내지 340을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 그러므로, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 23)을 포함할 수 있다. 조절제는 또한 아미노산 서열(서열 번호: 23)의 단편을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있으며, 이 단편은 DDX3과 결합할 수 있다. 예로서, 조절제는 DR5(서열 번호: 22, 수납 번호 gi:3721878)의 아미노산 280 내지 310을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 따라서, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 24)을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 조절제는 DR5(서열 번호: 22, 수납 번호 gi:3721878)의 아미노산 300 내지 330을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 따라서, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 36)을 포함할 수 있다.
다르게는, 조절제는 아폽토시스를 억제하지 않으면서 사멸 수용체의 CARD 함유 단백질 결합 부위와 결합하는 성분(약물, 분자, 폴리펩타이드 등)일 수 있다. 조절제는 CARD 함유 단백질의 사멸 수용체-결합 부위에 상응하는 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 방법의 조절제는 카스파제-의존성 아폽토시스의 활성화를 방지하는 CARD 함유 단백질의 능력에 영향을 줄 수 있다. CARD 함유 단백질의 CARD 도메인은 바이러스 감염 동안 숙주 세포에서 아폽토시스를 억제하는 아폽토시스의 억제제(IAP)의 동원에 관련된다[크룩(Crook, N.E.) 등. 1993. J Virol 67:2168-2174]. IAP 부류는 성숙 카스파제와 상호작용하고 성숙 카스파제의 효소 활성을 저해함으로써 세포 사멸을 길항시킨다. XIAP, c-IAP1, c-IAP2 및 ML-IAP/Livin을 비롯한 8가지의 상이한 포유동물 IAP가 확인되었다[예를 들어, 이들 IAP 분자와 관련하여 본원에 참고로 인용된 애쉬합(Ashhap, Y.) 등. 2001. FEBS Lett 495:56-60; 카소프(Kasof, G.M.) 및 곰즈(B.C. Gomes. 2001. J Biol Chem 276:3238-3246; 부식(Vucic, D.) 등. 2000. Curr Biol 10:1359-1366 참조]. 모든 IAP는 1 내지 3개의 바쿨로바이러스 IAP 반복(BIR) 도메인을 함유하고, 상동 서열(CX2CX16HX6C)을 가진다. BIR 도메인을 통해, IAP 분자는 카스파제와 결합하고 직접 저해한다[모두 IAP와 카스파제의 상호작용과 관련하여 본원에 참고로 인용된 데베룩스(Deveraux, Q.L.) 및 리드(J.C. Reed). 1999. Genes Dev 13:239-252; 데베룩스 등. 1997. Nature 388:300-304; 데베룩스 및 리드. 1999. Genes Dev 13:239-252]. 미토콘드리아 단백질 Smac/DIABLO는 IAP에 결합하고 이를 길항시켜[스즈키(Suzuki, Y.) 등. 2001, J Biol Chem 276:27058-27063] IAP 기능을 억제한다[위랜드(Wieland, L.) 등. 2000. Oncol Res 12:491-500](인용된 참조문헌은 모두 IAP의 저해와 관련하여 본원에 참고로 인용된다). 따라서, 본 방법의 조절제는 CARD-의존성 결합의 억제제일 수 있다. 조절제는 카스파제 또는 카스파제의 조절제(예: IAP)를 동원하는 CARD 함유 단백질의 능력에 영향을 끼칠 수 있다. 조절제는 CARD 함유 단백질이 감소된 IAP 결합 및 동원 능력을 갖도록 CARD 함유 단백질과 결합하는 성분(약물, 분자, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 항체, 항체 단편 등)일 수 있다. 조절제는 예컨대 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5, cIAP1, cIAP2, XIAP 또는 서바이빈의 CARD 함유 단백질-결합 단편일 수 있다.
조절제는 또한 표적 세포에서의 IAP 또는 CARD 함유 단백질 유전자 발현의 억제제일 수 있다. 트리플렉스 형성 분자, 리보자임, 외부 가이드 서열, 안티센스 분자 및 RNAi 분자를 비롯하여 세포에서 단백질 발현을 억제하는 다양한 공지 방법이 존재한다.
안티센스 분자는 정규 또는 비-정규 염기 쌍 형성을 통해 표적 핵산 분자와 상호작용하도록 디자인된다. 안티센스 분자와 표적 분자의 상호작용은 예를 들어 RNAseH 매개되는 RNA-DNA 하이브리드 열화를 통해 표적 분자의 파괴를 촉진하도록 디자인된다. 다르게는, 안티센스 분자는 전사 또는 복제 같은, 표적 분자 상에서 통상적으로 이루어지는 프로세싱 기능을 방해하도록 디자인된다. 안티센스 분자는 표적 분자의 서열에 기초하여 디자인될 수 있다. 표적 분자의 가장 접근가능한 영역을 발견함으로써 안티센스 효율을 최적화시키는 다수의 방법이 존재한다. 예시적인 방법은 DMS 및 DEPC를 사용하는 시험관내 선택 실험 및 DNA 변형 연구이다. 안티센스 분자가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 이하의 해리 상수(Kd)로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 안티센스 분자의 디자인 및 사용에 도움이 되는 방법 및 기법의 대표적인 샘플은 안티센스 분자와 관련한 방법 및 기법에 대해 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,135,917 호, 제 5,294,533 호, 제 5,627,158 호, 제 5,641,754 호, 제 5,691,317 호, 제 5,780,607 호, 제 5,786,138 호, 제 5,849,903 호, 제 5,856,103 호, 제 5,919,772 호, 제 5,955,590 호, 제 5,990,088 호, 제 5,994,320 호, 제 5,998,602 호, 제 6,005,095 호, 제 6,007,995 호, 제 6,013,522 호, 제 6,017,898 호, 제 6,018,042 호, 제 6,025,198 호, 제 6,033,910 호, 제 6,040,296 호, 제 6,046,004 호, 제 6,046,319 호 및 제 6,057,437 호에서 찾아볼 수 있다.
압타머는 표적 분자와 바람직하게는 특이적인 방식으로 상호작용하는 분자이다. 전형적으로, 압타머는 한정된 2차 및 3차 구조체(예: 스템-루프 또는 G-쿼텟)로 절첩되는 염기 15 내지 50개에 이르는 길이를 가진 작은 핵산이다. 압타머는 ATP(미국 특허 제 5,631,146 호) 및 테오필린(미국 특허 제 5,580,737 호) 같은 작은 분자, 및 역전사효소(미국 특허 제 5,786,462 호) 및 트롬빈(미국 특허 제 5,543,293 호) 같은 큰 분자와 결합할 수 있다. 압타머는 10-12M 미만의 표적 분자로부터의 Kd로 매우 단단하게 결합할 수 있다. 압타머가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 압타머는 매우 높은 특이성으로 표적 분자와 결합할 수 있다. 예를 들어, 표적 분자 및 분자상의 하나의 위치에서만 상이한 다른 분자 사이의 결합 친화력 차이가 10,000배보다 더 큰 압타머가 단리되었다(미국 특허 제 5,543,293 호). 압타머가 기본(background) 결합 분자와의 Kd보다 10배 이상, 100배 이상, 1000배 이상, 10,000배 이상 또는 100,000배 이상 더 낮은 표적 분자와의 Kd를 나타내는 것이 바람직하다. 예컨대 폴리펩타이드에 대해 비교할 때 기본 분자가 상이한 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 다양한 상이한 표적 분자에 결합하는 압타머의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 압타머와 관련된 방법 및 기법에 대해 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,476,766 호, 제 5,503,978 호, 제 5,631,146 호, 제 5,731,424 호, 제 5,780,228 호, 제 5,792,613 호, 제 5,795,721 호, 제 5,846,713 호, 제 5,858,660 호, 제 5,861,254 호, 제 5,864,026 호, 제 5,869,641 호, 제 5,958,691 호, 제 6,001,988 호, 제 6,011,020 호, 제 6,013,443 호, 제 6,020,130 호, 제 6,028,186 호, 제 6,030,776 호 및 제 6,051,698 호에서 찾아볼 수 있다.
리보자임은 분자 내에서 또는 분자 간에서 화학 반응을 촉진시킬 수 있는 핵산 분자이다. 따라서, 리보자임은 촉매 성격의 핵산이다. 리보자임이 분자간 반응을 촉진시키는 것이 바람직하다. 해머헤드(hammerhead) 리보자임[미국 특허 제 5,334,711 호, 제 5,436,330 호, 제 5,616,466 호, 제 5,633,133 호, 제 5,646,020 호, 제 5,652,094 호, 제 5,712,384 호, 제 5,770,715 호, 제 5,856,463 호, 제 5,861,288 호, 제 5,891,683 호, 제 5,891,684 호, 제 5,985,621 호, 제 5,989,908 호, 제 5,998,193 호, 제 5,998,203 호; 루드빅(Ludwig) 및 스프로트(Sproat)의 국제 특허원 WO 9858058 호, 루드빅 및 스프로트의 WO 9858057 호, 및 루드빅 및 스프로트의 WO 9718312 호], 헤어핀(hairpin) 리보자임(예컨대, 미국 특허 제 5,631,115 호, 제 5,646,031 호, 제 5,683,902 호, 제 5,712,384 호, 제 5,856,188 호, 제 5,866,701 호, 제 5,869,339 호 및 제 6,022,962 호) 및 테트라히메나(tetrahymena) 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제 5,595,873 호 및 제 5,652,107 호) 같은 천연 시스템에서 발견되는 리보자임에 기초하는, 뉴클레아제 또는 핵산 폴리머라제 유형의 반응을 촉진시키는 다수의 상이한 유형의 리보자임이 존재한다. 또한, 천연 시스템에서는 발견되지 않지만 새롭게 특수한 반응을 촉진시키도록 처리된 다수의 리보자임도 존재한다(예를 들어, 미국 특허 제 5,580,967 호, 제 5,688,670 호, 제 5,807,718 호 및 제 5,910,408 호). 바람직한 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단하고, 더욱 바람직하게는 RNA 기질을 절단한다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식과 결합 및 후속 절단을 통해 핵산 기질을 절단한다. 이 인식은 흔히 주로 정규 또는 비-정규 염기 쌍 상호작용에 기초한다. 표적 기질의 인식이 표적 기질 서열에 기초하기 때문에, 이 특성으로 인해 리보자임은 핵산의 표적 특이적 절단을 위한 특히 우수한 후보가 된다. 다양한 상이한 반응을 촉진시키는 리보자임의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 제 5,646,042 호, 제 5,693,535 호, 제 5,731,295 호, 제 5,811,300 호, 제 5,837,855 호, 제 5,869,253 호, 제 5,877,021 호, 제 5,877,022 호, 제 5,972,699 호, 제 5,972,704 호, 제 5,989,906 호 및 제 6,017,756 호에서 발견할 수 있다.
트리플렉스 형성 기능성 핵산 분자는 이중-가닥 또는 단일-가닥 핵산과 상호작용할 수 있는 분자이다. 트리플렉스 분자가 표적 영역과 상호작용하는 경우, 트리플렉스라고 불리는 구조체가 생성되는데, 여기에는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 및 후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍 형성 둘 다에 의존하는 착체를 형성하는 DNA 가닥이 3개 존재한다. 트리플렉스 분자는 높은 친화력 및 특이성으로 표적 영역과 결합할 수 있기 때문에 바람직하다. 트리플렉스 형성 분자가 10-6, 10-8, 10-10 또는 10-12 미만의 Kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 다양한 상이한 표적 분자와 결합하는 트리플렉스 형성 분자의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 제 5,176,996 호, 제 5,645,985 호, 제 5,650,316 호, 제 5,683,874 호, 제 5,693,773 호, 제 5,834,185 호, 제 5,869,246 호, 제 5,874,566 호 및 제 5,962,426 호에서 찾아볼 수 있다.
외부 가이드 서열(EGS)은 착체를 형성하는 표적 핵산 분자와 결합하는 분자이고, 이 착체는 표적 분자를 절단하는 RNaseP에 의해 인식된다. EGS는 선택된 RNA 분자를 특이적으로 표적화하도록 디자인될 수 있다. RNAse P는 세포 내에서 운반 RNA(tRNA)를 처리하는데 도움이 된다. 세균의 RNase P는 표적 RNA:EGS 착체가 천연 tRNA 기질을 모방하도록 하는 EGS를 사용함으로써 본질적으로 임의의 RNA 서열을 절단하도록 동원될 수 있다. [예일(Yale)의 WO 92/03566 호, 및 포스터(Forster) 및 앨트맨(Altman), Science 238:407-409 (1990)].
유사하게, RNA의 진핵세포 EGS/RNAse P-유도되는 절단을 이용하여 진핵세포 내에서 목적하는 표적을 절단할 수 있다. [유안(Yuan) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 (1992); 예일의 WO 93/22434 호; 예일의 WO 95/24489 호; 유안 및 앨트맨, EMBO J 14:159-168 (1995) 및 캐러러(Carrara) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:2627-2631 (1995)]. 다양한 상이한 표적 분자의 절단을 용이하게 하는 EGS 분자의 제조 및 사용 방법의 대표적인 예는 미국 특허 제 5,168,053 호, 제 5,624,824 호, 제 5,683,873 호, 제 5,728,521 호, 제 5,869,248 호 및 제 5,877,162 호에서 찾아볼 수 있다.
또한 RNA 간섭(RNAi)을 통해 매우 특이적인 방식으로 유전자 발현을 효과적으로 침묵시킬 수 있다. 이 침묵 현상은 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 첨가시 최초로 관찰되었다[파이어(Fire, A.) 등. (1998) Nature, 391:806-11; 나폴리(Napoli, C.) 등. (1990) Plant Cell 2:279-89; 해넌(Hannon, G.J.) (2002) Nature, 418:244-51]. dsRNA가 세포에 들어가면, 이는 RNase III-유사 효소인 다이서(Dicer)에 의해 이중 가닥의 작은 간섭 RNA(siRNA)(이는 3' 말단에 2개의 뉴클레오타이드 오버행(overhang)을 함유하는 뉴클레오타이드 21 내지 23개의 길이를 가짐)로 절단된다[엘바셔(Elbashir, S.M.) 등. (2001) Genes Dev., 15:188-200; 번스타인(Bernstein, E.) 등 (2001) Nature, 409:363-6; 해몬드(Hammond, S.M.) 등. (2000) Nature, 404:293-6]. ATP 의존성 단계에서는, siRNA가 다수개의 아단위를 가진 단백질 착체[통상 RNAi 유도되는 침묵 착체(RISC)라고 알려짐, 이는 siRNA를 표적 RNA 서열로 안내함]로 통합되기 시작한다[니카넨(Nykanen, A.) 등. (2001) Cell, 107:309-21]. 일부 지점에서는 siRNA 듀플렉스가 감겨지지 않고, 안티센스 가닥이 RISC에 결합된 채로 유지되고 엔도 및 엑소뉴클레아제의 조합에 의해 상보적인 mRNA 서열의 열화를 유도하는 것으로 보인다[마르티네즈(Martinez, J.) 등. (2002) Cell, 110:563-74]. 그러나, iRNA 또는 siRNA의 효과 또는 이들의 용도는 임의의 유형의 메카니즘으로 한정되지 않는다.
짧은 간섭 RNA(siRNA)는 서열-특이적 전사후 유전자 침묵을 야기함으로써 유전자 발현을 감소시키거나 심지어는 억제할 수 있는 이중-가닥 RNA이다. 한 예에서, siRNA는 siRNA와 표적 RNA 사이에서 서열이 동일한 영역 내에서 mRNA 같은 상동 RNA 분자의 특이적인 열화를 촉발시킨다. 예를 들어, 이들 siRNA의 제조 방법과 관련하여 본원에 참고로 인용된 WO 02/44321 호는 3' 돌출 말단과 염기 쌍 형성할 때 표적 mRNA를 서열-특이적으로 열화시킬 수 있는 siRNA를 개시한다. 효소 다이서에 의해 생성되는 siRNA를 모방하는 짧은 합성 이중-가닥 RNA를 사용하여 포유동물 세포에서 서열 특이적 유전자 침묵을 달성할 수 있다[엘바셔 등. (2001) Nature, 411:494-498][위-테이(Ui-Tei, K.) 등. (2000) FEBS Lett 479:79-82]. siRNA는 화학적으로 또는 시험관 내에서 합성될 수 있거나, 또는 세포 내에서 처리되어 siRNA로 되는 짧은 이중-가닥 헤어핀-유사 RNA(shRNA)의 결과일 수 있다. 합성 siRNA는 일반적으로 연산 및 통상적인 DNA/RNA 합성기를 사용하여 디자인된다. 공급업체는 앰비온(Ambion)(텍사스주 오스틴), 켐젠즈(ChemGenes)(메사추세츠주 애쉴랜드), 다마콘(Dharmacon)(콜로라도주 라페예트), 글렌 리써치(Glen Research)(버지니아주 스털링), 엠더블유비 바이오테크(MWB Biotech)(독일 에스버스버그), 프롤리고(Proligo)(콜로라도주 불더), 및 퀴아젠(Qiagen)(네덜란드 벤토)을 포함한다. 앰비온의 사일런서(SILENCER; 등록상표) siRNA 구축 키트 같은 키트를 사용하여 시험관 내에서 siRNA를 합성할 수도 있다. 본원에는 c-Kit 또는 SCF에 대한 서열에 기초하여 상기 기재된 바와 같이 디자인된 임의의 siRNA가 개시되어 있다. 예를 들어, c-Kit의 유전자 발현을 침묵시키기 위한 siRNA는 시판되고 있다[수퍼사일런싱(SUPERSILENCING™) 인간 c-Kit siRNA; 자이메드 래보러토리즈(Zymed Laboratories), 캘리포니아주 샌프란시스코].
더욱 통상적으로 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 전사를 통해 벡터로부터 siRNA를 생성시킨다. shRNA를 포함하는 벡터를 제조하기 위한 키트는 예를 들어 임제넥스(Imgenex)의 젠서프레서(GENESUPPRESSOR™) 구축 키트 및 인비트로젠의 블록-잇(BLOCK-IT™) 유도성 RNAi 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터 같이 시판되고 있다. 본원에 개시된 염증 매개체에 대한 서열에 기초하여 상기 기재된 바와 같이 디자인된 임의의 shRNA가 본원에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명의 조절제는 siRNA 또는 shRNA를 포함할 수 있다. 조절제는 cIAP1(수납 번호 gi:41349435), cIAP2(수납 번호 gi:33946283), XIAP(수납 번호 gi:1184319), 서바이빈(수납 번호 gi:2315862), DDX3(서열 번호: 25, 수납 번호 gi:13514816), mda-5(수납 번호 gi:11344593), 또는 RIG-1(수납 번호 gi:6048564) 유전자 발현의 억제제일 수 있다. 그러므로, 조절제는 DDX3의 핵산 서열(서열 번호: 25, 수납 번호 gi:13514816)로부터 유도되는 shRNA를 포함할 수 있다. 예로서, 조절제는 서열 번호: 10, 12, 14 또는 16의 핵산 서열에 의해 코딩되는 shRNA를 포함할 수 있다.
siRNA를 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있는 몇 가지의 형질감염 시약, 예를 들어 인비트로젠의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000, 마이러스(Mirus)의 TransIT-TKO 및 노바젠(Novagen)의 리보쥬스(RiboJuice) siRNA 형질감염 시약이 있다. 그러나, 형질 감염 시약은 일반적으로 생체 내에서 작용하지 않는다. 나상(naked) siRNA를 개체의 맥관계 내로 직접 전달할 수 있으며, 이는 다른 단백질이 전달되거나 발현되지 않는다는 이점(이는 핵산이 면역성이 아니기 때문에 중요함)을 가진다. 또한, 상피세포를 파괴하는 몇몇 에너지 형태를 사용하여 피부 같은 상피 차단벽을 가로질러 핵산을 전달하는 방법, 예컨대 초음파 치료도 존재한다(피부를 통한 화합물의 전달을 매개하는 초음파의 교시내용과 관련하여 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,421,816 호, 제 5,618,275 호, 제 6,712,805 호 및 제 6,487,447 호).
전체 DDX3 또는 그의 동족체에 대해 세포를 분석함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대해 세포를 선별하는 방법이 제공된다. 또한, 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합을 분석함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법도 제공되는데, 여기에서 높은 수준의 회합은 작용제에 대한 내성을 의미한다. 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질 사이의 회합은 작용제에 대한 내성을 나타낸다. 임의적으로는, 선별될 세포를 미리 사멸 수용체 작용제(예컨대, 작용제성 항체)와 미리 접촉시킨다. 따라서, 세포를 사멸 수용체 작용제와 접촉시키고 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합을 모니터링함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법이 제공되며, 이때 회합은 작용제에 대한 내성을 의미한다. 임의적으로는, 회합을 검출함을 포함하는 다양한 방법에서는, 해리를 측정하고, 해리된 양을 총계로부터 빼서 회합된 양을 계산할 수 있다.
생체 내에서 또는 시험관 내에서 본 방법의 접촉 단계를 수행할 수 있다. 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질 사이의 회합의 모니터링은 특이적인 항체를 사용하여(예컨대, 면역침전에 의해) 세포(들)로부터 단백질 단편(예: 사멸 수용체)을 단리함을 포함할 수 있다. 이 방법은 웨스턴 블롯, 방사성 면역 분석법(RIA) 또는 ELISA 같은 표준 면역 검출 방법에 의해 회합된 단백질(예: DDX3)의 단백질 단편을 분석함을 추가로 포함할 수 있다. 이들 항체에 기초한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 각각의 사멸 수용체, CARD 함유 단백질, 카스파제 및 해당 카스파제의 조절제에 대해 용이하게 맞추어진다. 예로서, 본 방법은 개체로부터의 세포를 TRA-8 항체로 처리하고, 세포 용해물로부터 단백질을 단리하며, DR5 단백질을 면역침전시키고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(환원성 또는 비-환원성 조건)에 의해 DR5를 분리시키고, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하며, 표준 웨스턴 블롯 기법을 이용하여 DR5와 회합된 DDX3을 검출함을 포함할 수 있으며, 이때 회합은 그 세포 내에서의 TRA-8 내성의 증거이다.
또한, 카스파제 또는 카스파제의 조절제(예: cIAP1, cIAP2, XIAP, 서바이빈)를 CARD 함유 단백질과 회합시키고, 공지의 내성 또는 비-내성 대조용 세포로부터의 샘플과 회합 수준을 비교함을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 생물표지에 대하여 세포를 선별하는 방법도 제공된다. 내성 세포와 유사한 수준의 IAP와 CARD 함유 단백질의 회합은 작용제에 대한 내성을 의미한다. 임의적으로는, 선별할 세포를 미리 사멸 수용체 작용제(예: 작용제성 항체)와 접촉시킨다.
예로서, 본 방법은 개체로부터의 세포를 TRA-8 항체로 처리하고, 세포 용해물로부터 단백질을 단리하며, DDX3 단백질을 면역침전시키고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(환원성 또는 비-환원성 조건)에 의해 DDX3을 분리하며, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하며, 표준 웨스턴 기법을 이용하여 DDX3과 회합된 카스파제(예: 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4, 카스파제-5) 및 IAP(예: cIAP1, cIAP2, XIAP, 서바이빈)를 검출함을 포함할 수 있으며, 이때 DDX3과 회합된 IAP의 검출은 그 세포에서의 TRA-8 내성의 증거이다. 회합의 수준을 대조용 수준과 비교할 수 있다. 대조용 수준은 비-내성 세포에 기초할 수 있다. 시험 수준이 비-내성 대조용 세포보다 더 높은 경우, 내성을 나타낸다. 대조용 수준은 시험 수준과 대조용 수준 사이의 유사성이 내성을 나타내도록 내성 세포에 기초할 수 있다.
또한, CARD 함유 단백질의 조절제를 선별하는 방법이 제공된다. 특히, 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 조절제를 선별하는 방법이 본원에 제공된다. 선별 방법의 단계는 CARD 함유 단백질을 후보 약제와 접촉시키고, 후보 약제의 부재시와 비교하여 후보 약제의 존재하에서 CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성 변화(예: 감소)를 검출함을 포함하며, 이때 활성 또는 활성들은 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성과 상호관련되어 있다. CARD 함유 단백질의 활성 또는 활성들의 감소는 후보 약제가 CARD 함유 단백질을 조절함을 나타낸다. 예를 들어 천연적으로 발생되는 변형 또는 비-천연적 방법으로 발생되는 변형을 비롯한 변형된 CARD 함유 단백질을 사용하도록 이 방법을 변형시킬 수 있다. 이러한 변형은 절단, 돌연변이, 키메라 단백질 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, DDX3의 핵산 서열은 서열 번호: 25에 기재되어 있다. DDX3 돌연변이의 예는 서열 번호: 25의 위치 1842 및 2493에서 아데노신이 구아노신으로 대체됨을 포함한다.
본원에 기재된 선별 방법에서 CARD 함유 단백질의 임의의 수의 활성을 평가할 수 있다. 예를 들어, CARD 함유 단백질의 활성은 예컨대 사멸 수용체 결합 아미노산에서의 또는 그 부근에서의 포스포릴화를 비롯한 포스포릴화일 수 있다. 그러므로, 본 방법은 CARD 함유 단백질의 포스포릴화를 검출함을 포함할 수 있다. 단백질의 포스포릴화를 검출하기 위한 세포에 기초한 분석법 및 세포를 함유하지 않는 분석법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예컨대 항-포스포세린[케미콘(Chemicon; 등록상표) AB1603](케미콘, 캘리포니아주 테메큘라), 항-포스포트레오닌[케미콘(등록상표) AB1607] 및 항-포스포티로신[케미콘(등록상표) AB1599]을 비롯한 항체의 사용을 포함한다. DDX-3의 포스포릴화된 형태에 특이적인 부위-특이적 항체도 생성시킬 수 있다. 상기 항체를 생성시키고 사용하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본원에 기재된 선별 방법에서 평가될 수 있는 다른 CARD 함유 단백질 활성은 결합 활성이다. 예를 들어, CARD 함유 단백질의 활성은 사멸 수용체로의 결합일 수 있다. 그러므로, 본 방법은 CARD 함유 단백질과 사멸 수용체 사이의 상호작용을 검출함을 포함할 수 있다. CARD 함유 단백질의 활성은 CARD-의존성 결합일 수 있다. 따라서, 본 방법은 예컨대 cIAP1, cIAP2, XIAP 또는 서바이빈으로의 CARD-의존성 결합을 검출함을 포함할 수 있다. 단백질 결합의 검출 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA) 또는 웨스턴 블롯팅과 조합된 동시-면역침전을 포함한다. 다른 예에서는, 제 1 항체가 사멸 수용체를 포획하고 제 2 항체가 CARD 함유 단백질을 검출하는 샌드위치 분석법을 이용할 수 있다. 또 다른 예에서는, 제 1 항체가 CARD 함유 단백질을 포획하고 제 2 항체가 사멸 수용체를 검출하는 샌드위치 분석법을 이용할 수 있다.
CARD 함유 단백질의 평가되는 활성이 예를 들어 사멸 수용체-유도되는 아폽토시스 동안 발생되는 절단을 비롯한 절단인 선별 방법도 본원에 추가로 제공된다. 따라서, 선별 방법은 CARD 함유 단백질의 절단을 검출함을 포함할 수 있다. 단백질 절단의 검출 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예컨대 웨스턴 블롯팅을 포함한다.
선별 방법의 접촉 단계를 생체 내에서 또는 시험관 내에서 수행할 수 있다. 선별 방법은 세포에 기초할 수 있거나 세포를 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 한 요지에서는, CARD 함유 단백질이 표적 세포이다. CARD 함유 단백질은 세포 내에서 자연적으로 발생될 수 있거나, 또는 CARD 함유 단백질을 생성시키도록 유전자 조작될 수 있다. 세포를 함유하지 않는 방법에서는, CARD 함유 단백질을 기질에 부착되도록 또는 키메라 단백질을 형성하도록 개질시킬 수 있다.
임의적으로는, 선별 방법은 사멸 수용체를 포함하는 표적 세포 또는 비-세포 시스템을 사멸 수용체 작용제와 1회 이상 접촉시키고, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 수준을 검출함을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대 아폽토시스를 측정함으로써 사멸 수용체 작용제에 대한 내성의 수준을 검출할 수 있으며, 사멸 수용체 작용제에 반복 노출시킬 때 아폽토시스가 감소하면 내성 증가를 나타낸다. 아폽토시스의 검출 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 아넥신 V에 의해 말단 dUTP 닉(nick)-말단 라벨링(TUNEL), 활성-카스파제 3, 세포 표면 인지질 포스파티딜세린(PS)을 검출하는 시약을 포함한다. 아폽토시스를 검출하기 위한 이들 방법 및 다른 방법에서의 시약은 시판되고 있다.
일반적으로, 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 따라 천연 생성물 또는 합성(또는 반합성) 추출물의 큰 라이브러리 또는 화학약품 라이브러리로부터 후보 시약을 확인할 수 있다. 약물 개발 분야의 숙련자는 시험 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원이 본 발명의 선별 절차(들)에 중요하지 않음을 알 것이다. 따라서, 본원에 기재된 예시적인 방법을 이용하여 본질적으로 임의의 수의 펩타이드, 화학적 추출물 또는 화합물을 선별할 수 있다. 이러한 펩타이드, 추출물 또는 화합물의 예는 식물-, 진균-, 원핵생물- 또는 동물에 기초한 추출물, 발효액 및 합성 화합물, 및 기존 화합물의 변형을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 사카라이드-, 지질-, 펩타이드-, 폴리펩타이드- 및 핵산-계 화합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 임의의 수의 화합물의 무작위적이거나 유도되는 합성(예컨대, 반합성 또는 완전 합성)을 이끌어내는데 다수의 방법을 이용할 수 있다. 합성 화합물 라이브러리는 예를 들어 브랜던 어쏘시에이츠(Brandon Associates)(뉴햄프셔주 메리맥) 및 알드리치 케미칼(Aldrich Chemical)(위스콘신주 밀워키)로부터 구입할 수 있다. 다르게는, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리를 바이오틱스(Biotics)(영국 서섹스), 제노바(Xenova)(영국 슬로우), 하버 브랜치 오션그래픽스 인스티튜트(Harbor Branch Oceangraphics Institute)(플로리다주 에프티. 피어스) 및 파마마, 유.에스.에이.(PharmaMar, U.S.A.)(매사추세츠주 캠브리지)를 비롯한 다수의 공급처로부터 구입한다. 또한, 요구되는 경우, 당해 분야에 공지되어 있는 방법, 예를 들어 표준 추출 및 분별 방법에 의해, 천연에서 또한 합성에 의해 생성되는 라이브러리를 생성시킨다. 뿐만 아니라, 요구되는 경우, 표준 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 이용하여 임의의 라이브러리 또는 화합물을 용이하게 변형시킨다. 또한, 약물 개발 분야의 숙련자는 CARD 함유 단백질의 활성에 대한 효과가 이미 공지되어 있는 물질의 복제물 또는 복사물의 탈복제(예컨대, 분류학상의 탈복제, 생물학적 탈복제 및 화학적 탈복제, 또는 이들의 임의의 조합) 또는 제거 방법을 가능하다면 이용해야 함을 알 것이다.
조질 추출물이 목적하는 활성을 나타내는 것으로 밝혀지면, 관찰된 효과를 담당하는 화학적 구성성분을 단리하기 위하여 양성 납 추출물의 추가적인 분별이 필요하다. 따라서, 추출, 분별 및 정제 공정의 목적은 CARD 함유 단백질의 활성을 자극 또는 억제하는 활성을 나타내는 조질 추출물 내에서 화학적 물질의 특징을 조심스럽게 결정하고 화학적 물질을 확인해내는 것이다. 화합물의 혼합물에서의 활성을 검출하기 위해 본원에 기재된 동일한 분석법을 이용하여 활성 성분을 정제하고 그의 유도체를 시험할 수 있다. 이러한 이질 추출물의 분별 및 정제 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 요구되는 경우, 유용한 치료제인 것으로 보이는 화합물을 당해 분야에 공지되어 있는 방법에 따라 화학적으로 개질시킨다. 치료 가치를 가진 것으로 확인된 화합물을, CARD 함유 단백질의 활성을 조절하거나 모방하는 것이 바람직한 질환 또는 질병에 대한 동물 모델을 사용하여 후속 분석할 수 있다.
개체로부터 생물학적 샘플을 획득하고, 샘플중 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합을 검출함을 포함하는, 개체에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 방법이 제공되며, 이때 회합은 내성을 나타낸다. 상기 기재된 바와 같이, 회합 수준을 대조용 수준과 비교할 수 있다.
예로서, 본 방법은 치료용 항-DR5 항체(예컨대, TRA-8)로 처리된 개체로부터 생물학적 샘플을 단리하고, 생물학적 샘플로부터 단백질을 단리하며, DR5 단백질을 면적 침전시키며, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(환원성 또는 비-환원성 조건)에 의해 DR5를 분리하며, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하고, DDX3 및 표준 웨스턴 블롯 기법에 항체를 사용하여 DR5와 회합된 DDX3을 검출함을 포함할 수 있으며, 여기에서 회합은 이 세포에서의 TRA-8 내성의 증거이다.
개체로부터 생물학적 샘플을 획득하고 샘플중 CARD 함유 단백질과 카스파제 또는 카스파제의 조절제와의 회합을 검출함을 포함하는, 개체에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 방법이 제공되며, 여기에서 회합은 내성을 나타낸다.
예로서, 본 방법은 치료용 항-DR5 항체(예컨대, TRA-8)로 처리된 개체로부터 생물학적 샘플을 단리하고, 생물학적 샘플로부터 단백질을 단리하며, DDX-3 단백질을 면역침전시키고, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)(환원성 또는 비-환원성 조건)에 의해 DDX-3을 분리하며, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하고, 표준 웨스턴 기법을 이용하여 DDX3과 회합된 카스파제(예: 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4, 카스파제-5) 및 IAP(예: cIAP1, cIAP2, XIAP, 서바이빈)를 검출함을 포함할 수 있으며, 여기에서 예컨대 DDX3과 회합된 cIAP1의 검출은 이 세포에서 TRA-8 내성의 증거이다.
개체로부터 생물학적 샘플을 획득하고 DDX3의 포스포릴화를 검출함을 포함하는, 개체에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 방법이 제공된다. 단백질의 포스포릴화를 검출하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 항-포스포세린[케미콘(등록상표) AB1603], 항-포스포트레오닌[케미콘(등록상표) AB1607] 및 항-포스포티로신[케미콘(등록상표) AB1599]을 비롯한 항체의 사용을 포함한다. DDX-3의 포스포릴화된 형태에 특이적인 부위-특이적 항체도 생성시킬 수 있다. 상기 항체를 생성시키고 사용하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
사멸 수용체와 특이적으로 결합하는 사멸 수용체 작용제 치료량과 표적 세포를 접촉시키는 단계 및 CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제 치료량을 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 사멸 수용체를 발현하는 표적 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하는 방법이 제공된다.
인간 백혈병 세포주 저캣(미국 종균 협회 번호 TIB-152) 및 성상세포종 세포주 1321N1 같은 세포를 시험 샘플이 첨가된 배지에서 배양시킴으로써, 아폽토시스를 유도하는 작용제 및 CARD 함유 단백질 조절제의 능력을 확인할 수 있다. 예를 들어 ATPLITE 분석법을 이용함으로써 생존율을 결정할 수 있다.
암 또는 염증 질환 및 자가 면역 질환에서 아폽토시스 시스템의 조절 곤란에 기인할 수 있는 것을 비롯하여 세포의 부적절한 생존 또는 증식에 수반되는 질환을 치료하는데, 본원에 제공된 방법 및 조성물을 사용할 수 있다. 염증 질환 및 자가 면역 질환은 예시적으로 전신 홍반 루푸스, 하시모토(Hashimoto's)병, 류마티스성 관절염, 이식편 대 숙주 질환, 스조그렌(Sjogren's) 증후군, 악성 빈혈, 애디슨(Addison)병, 피부 경화증, 굿패스츄어(Goodpasture's) 증후군, 크론(Crohn's)병, 자가 면역 용혈 빈혈, 불임, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 베이스도우(Basedow's)병, 저혈소판 자색반, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 알러지, 천식, 아토피성 질환, 동맥경화증, 심근염, 심근병증, 사구체 신염, 저형성 빈혈, 기관 이식 후 거부반응을 포함한다. 암은 폐, 전립선, 간, 난소, 결장, 자궁경부, 림프관 및 유방 조직의 다수의 악성 종양을 포함한다. 따라서, 표적화된 세포가 특이적인 사멸 수용체(즉, DR4 또는 DR5)를 발현하거나 발현하도록 만들 수 있기만 하다면, 활성화된 림프구, 림프계 세포, 골수 세포 및 류마티스 윤활 세포(염증성 윤활막세포, 대식세포-유사 윤활막세포, 섬유모세포-유사 윤활막세포)를 비롯한 활성화된 면역 세포 및 바이러스에 감염된 세포(예컨대 HIV로 감염된 세포 포함)에서 아폽토시스를 표적화하고 선택적으로 유도하는데, 제공되는 조성물 및 방법을 추가로 사용할 수 있다.
치료량의 사멸 수용체 작용제 및 CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성의 조절제를 암 또는 자가 면역 질환 또는 염증 질환을 앓는 개체에 투여함을 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 이때 조절제는 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시킨다.
본원에 사용되는 사멸 수용체 작용제 및/또는 CARD 함유 단백질의 조절제의 "치료량"은 표적 세포에서 아폽토시스를 야기하기에 충분한 양이다. 본원에 사용되는 용어 "치료량" 및 "약학적으로 효과적인 양"은 동의어이다. 당해 분야의 숙련자는 적절한 치료량을 용이하게 결정할 수 있다.
질환, 예컨대 암, 자가면역 질환 및 염증 질환을 치료함에 있어서는 치료의 조합도 이용할 수 있다. 예를 들어, 제공되는 방법 및 조성물의 작용제 및 CARD 함유 단백질의 조절제를 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 본원에 사용되는 "치료제"는 병리학적 상태를 경감시키는데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 방사선 요법을 또한 다른 치료제와 조합할 수 있거나 조합하지 않을 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 방사선 요법의 형태를 질환에 적합화시킬 수 있다.
치료제의 예는 화학요법 약제, 소염제, 질병 조절 항류마티스제(DMARD), 항체, TNF 부류의 구성원, 항-바이러스 약제, 항-기회감염 약제, 항생제, 면역억제제, 면역글로불린, 항-말라리아 약제, 항-류마티스성 관절염 약제, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 항암 화합물을 포함한다. 항암 화합물은 비정상적으로 성장하는 세포의 성장을 억제하거나 저지하는데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 항암 화합물의 예시적인 예는 블레오마이신, 카보플라틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 콜키친, 사이클로포스파마이드, 다우노루비신, 닥티노마이신, 다이에틸스틸베스트롤 독소루비신, 에토포사이드, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 마이토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포사이드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 항암 화합물 및 치료제의 추가적인 예는 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 제15판, 버코우 등 편집, 1987, 뉴저지주 라웨이; 및 슬라덱(Sladek) 등. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, 포위스 등 편집, Taylor and Francis, 뉴욕주 뉴역]에 기재되어 있다.
PKC 저해제인 비스인돌릴말레이미드 VIII(BisVIII)은 Fas-매개되는 아폽토시스를 크게 촉진시킨다[조(Zhou, T.) 등. 1999. Nat Med 5:42-48]. JNK/p38 경로의 상승작용적인 활성화가 중요한 역할을 하고[오츠카(Ohtsuka, T.) 및 조(T. Zhou). 2002. J Biol Chem 277:29294-29303], 3가지 통상적인 화학요법 약제에 의한 DR5-매개되는 아폽토시스의 향상이 유사한 메카니즘을 통해 일어나는 것으로 보임이 밝혀졌다(오츠카 등. 2003. Oncogene 22:2034-2044]. 따라서, 제공되는 방법은 비스인돌릴말레이미드 VIII(BisVIII) 같은 아폽토시스-유도 화합물 또는 SN-50 또는 LY294002 같은 다른 감작화제를 사용함을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 제공되는 방법 및 조성물의 작용제 및 CARD 함유 단백질의 조절제를 BisVIII과 조합할 수 있다. 제공되는 방법 및 조성물의 작용제 및 CARD 함유 단백질의 조절제를 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID)(예: 설린닥 설파이드 또는 다른 COX-1 또는 COX-2 저해제)과 추가로 조합할 수 있다.
제공되는 방법 및 조성물의 작용제를 사용하는 요법을 또한 다른 작용제를 사용하는 요법과 조합할 수 있다. 예를 들면, DR4에 대한 항체의 투여와 함께, 투여 전에 또는 투여 후에, DR5에 대한 항체를 이를 필요로 하는 개체에 투여할 수 있다. 이러한 조합된 항체 요법을, 본원에 제공되는 CARD 함유 단백질의 조절제중 하나 이상의 투여와 추가로 조합할 수 있고, 다른 치료제와 추가로 조합할 수 있다.
CARD 함유 단백질의 하나 이상의 활성을 조절하는 약제 및 사멸 수용체 작용제를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기에서 조절제는 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시킨다. 제공되는 조성물은 화학요법 약제, TNF 부류의 구성원, 항-바이러스 약제, 소염제, 항-기회감염 약제, 항생제, 면역 억제제, 면역글로불린, 항-말라리아 약제, 항-류마티스성 관절염 약제, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "단백질", "펩타이드", "폴리펩타이드" 또는 "펩타이드 부분"은 본원에서 호환가능하게 사용되며, 본원에서 펩타이드 결합에 의해 연결된 둘 이상의 아미노산을 의미하는 것으로 널리 사용된다. 용어 "단편"은 본원에서 전체-길이 폴리펩타이드 또는 단백질의 일부(이는 폴리펩타이드 상에서의 단백질 분해 반응에 의해 생성될 수 있음), 즉 폴리펩타이드의 펩타이드 결합의 절단시 생성되는 펩타이드를 일컫는데 사용된다. 단편이 반드시 단백질 분해 반응에 의해 생성되어야 하는 것은 아니며, 합성 폴리펩타이드를 생성시키기 위한 화학적 합성 방법 또는 재조합 DNA 기술 방법을 이용하여 생성될 수도 있음을 알아야 한다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"가 본원에서 분자를 구성하는 특정 크기 또는 수의 아미노산을 암시하는데 사용되지 않으며, 본 발명의 펩타이드가 수개 이하의 아미노산 잔기 또는 그 이상을 함유할 수 있음을 알아야 한다.
"단리된" 또는 "정제된"은 천연적으로 조성물에 통상적으로 수반되는 물질을 비롯한 다른 물질을 실질적으로 함유하지 않는 조성물(예컨대, 폴리펩타이드 또는 핵산)을 의미한다. 예를 들어 천연 공급원(예: 파지)으로부터 추출함으로써, 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산을 발현시킴으로써(예컨대, 세포 내에서 또는 세포를 함유하지 않는 번역 시스템 내에서), 또는 폴리펩타이드를 화학적으로 합성함으로써, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이들의 단편을 수득할 수 있다. 또한, 이들 방법중 임의의 방법에 의해, 또는 전체 길이 폴리펩타이드를 절단함으로써, 폴리펩타이드 단편을 수득할 수 있다. 기준 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편은 기준 단백질/폴리펩타이드의 연속적인 아미노산만을 포함하고, 기준 서열보다 더 짧은 하나 이상의 아미노산이다.
본원에서 구체적인 단백질이 언급되는 경우에는, 변형체, 유도체 및 단편이 고려된다. 당해 분야의 숙련자는 단백질 변형체 및 유도체를 잘 알며, 이들 변형체 및 유도체는 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 전형적으로 세 가지 부류, 즉 치환 변형체, 삽입 변형체 또는 결실 변형체중 하나 이상에 속한다. 삽입은 단일 아미노산 잔기 또는 복수개의 아미노산 잔기의 아미노 및/또는 카복실 말단 융합 및 서열내 삽입을 포함한다. 삽입부는 통상 1 내지 4개의 잔기 수준으로, 아미노 또는 카복실 말단 융합 삽입부보다는 더 작은 삽입부이다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거됨을 특징으로 한다. 전형적으로, 단백질 분자 내에서 임의의 하나의 부위에서 약 2 내지 6개의 잔기가 결실되지만, 결실부가 1 내지 30개의 잔기에 이를 수도 있다. 이들 변형체는 통상적으로 단백질을 코딩하는 DNA의 뉴클레오타이드의 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 변형체를 코딩하는 DNA를 생성시킨 후 재조합 세포 배양액에서 DNA를 발현시킴으로써 제조된다. 공지 서열을 가진 DNA의 소정 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 기법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이 생성 및 PCR 돌연변이 생성을 포함한다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기이지만, 다수의 상이한 위치에서 한꺼번에 이루어질 수 있으며; 삽입은 통상 약 1 내지 10개의 아미노산 잔기 수준이다. 결실 또는 삽입은 바람직하게는 인접한 쌍에서 이루어진다(즉, 2개 잔기의 결실 또는 2개 잔기의 삽입). 최종 구조체에 도달하기 위하여 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합을 조합할 수 있다. 돌연변이는 서열이 판독 프레임으로부터 벗어나서는 안되고, 바람직하게는 mRNA의 2차 구조에서의 변화가 요구되지 않는 한 2차 mRNA 구조체를 생성시킬 수 있는 상보적인 영역을 생성시키지 않는다. 치환 변형체는 하나 이상의 잔기가 제거되고 상이한 잔기가 그 자리에 삽입된 것이다. 이러한 치환은 일반적으로 하기 표 1에 따라 이루어지며, 보존적인 치환으로 일컬어진다.
Figure 112007063744274-pct00001
표 1의 치환보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써, 즉 (a) 치환 구역에서 폴리펩타이드 주쇄의 구조를 예컨대 시트 또는 나선형 구조로서 유지시키거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지시키거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지시킴에 대한 이들의 효과 면에서 더욱 상당히 상이한 잔기를 선택함으로써, 기능 또는 면역학적 정체성을 상당히 변화시킨다. 일반적으로 단백질 특성 면에서 가장 큰 변화를 생성시킬 것으로 예측되는 치환은 (a) 친수성 잔기(예: 세릴 또는 트레오닐)가 소수성 잔기(예: 류실, 아이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐)를 치환하고(또는 소수성 잔기에 의해 치환되고); (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 치환하고(또는 다른 잔기에 의해 치환되고); (c) 양전성 측쇄를 가진 잔기(예: 리실, 아르기닐 또는 히스티딜)가 음전성 잔기(예: 글루타밀 또는 아스파틸)를 치환하고(또는 음전성 잔기에 의해 치환되고); 또는 (d) 벌키 측쇄를 가진 잔기(예: 페닐알라닌)가 측쇄를 갖지 않는 잔기(예: 글라이신)를 치환하는(또는 측쇄를 갖지 않는 잔기에 의해 치환되는) 치환이며, (e) 황산화 및/또는 글라이코실화 부위의 수를 증가시킴에 의한 치환이다.
예를 들어, 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 다른 아미노산 잔기로 대체시키는 것은 보존적인 치환으로서 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적인 치환은 하나의 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로, 또는 하나의 극성 잔기를 다른 극성 잔기로 대체시키는 것이다. 치환은 표 1에 기재된 조합을 포함한다. 각각의 명시적으로 개시된 서열의 보존적으로 치환된 변형체는 본원에 제공되는 폴리펩타이드 내에 포함된다.
전형적으로, 보존적인 치환은 생성되는 폴리펩타이드의 생물학적 활성에 영향을 거의 또는 전혀 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 보존적인 치환은 펩타이드의 생물학적 기능에 실질적으로 영향을 끼치지 않는 펩타이드에서의 아미노산 치환이다. 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 2 내지 10개의 보존적인 치환, 2 내지 5개의 보존적인 치환, 4 내지 9개의 보존적인 치환(예컨대, 2, 5 또는 10개의 보존적인 치환)을 포함할 수 있다.
예를 들어 부위-지향성 돌연변이 유발 또는 PCR 같은 표준 절차를 이용하여 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 조작함으로써 하나 이상의 보존적인 치환을 함유하도록 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 다르게는, 표준 펩타이드 합성 방법을 사용함으로써 하나 이상의 보존적인 치환을 함유하도록 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 알라닌 스캔을 이용하여, 단백질중의 아미노산 잔기가 아미노산 치환을 견딜 수 있는지를 확인할 수 있다. 한 예에서는, 하나 이상의 천연 아미노산이 알라닌 또는 다른 보존적인 아미노산(예컨대, 아래 나열되는 것)에 의해 치환될 때, 단백질의 생물학적 활성은 25% 이상, 예를 들어 20% 이상, 예컨대 10% 이상 감소되지 않는다.
보존적인 치환에 대한 추가적인 정보는 다른 문헌 중에서도, 벤-바삿(Ben-Bassat) 등의 문헌[J. Bacteriol. 169:751-7, 1987), 오레건(O'Regan) 등의 문헌[Gene 77:237-51, 1989], 사힌-토트(Sahin-Toth) 등의 문헌[Protein Sci. 3:240-7, 1994], 호철리(Hochuli) 등의 문헌[Bio/Technology 6:1321-5, 1988] 및 유전공학 및 분자 생물학의 표준 참고서에서 찾아볼 수 있다.
치환 또는 결실 돌연변이 유발을 이용하여 N-글라이코실화 부위(Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-글라이코실화 부위(Ser 또는 Thr)를 삽입할 수 있다. 시스테인 또는 다른 불안정성 잔기의 결실도 또한 바람직할 수 있다. 예를 들어 염기성 잔기중 하나를 결실시키거나 또는 글루타민일 또는 히스티딜 잔기로 치환시킴으로써, 잠재적인 단백질 분해 부위, 예컨대 Arg의 결실 또는 치환을 달성할 수 있다.
특정한 번역후 유도화는 발현된 폴리펩타이드 상에서의 재조합 숙주 세포의 작용의 결과이다. 글루타민일 및 아스파라긴일 잔기는 흔히 번역후 탈아마이드화되어 상응하는 글루타밀 및 아스파릴 잔기가 된다. 다르게는, 이들 잔기는 온화한 산성 조건하에서 탈아마이드화된다. 다른 번역후 변형은 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 o-아미노기의 메틸화[크레이턴(T.E. Creighton), Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., 샌프란시스코 pp 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 일부 경우에는 C-말단 카복실의 아마이드화를 포함한다.
개시된 조성물 내로 다수의 아미노산 및 펩타이드 유사체를 혼입시킬 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어, 다수의 D 아미노산 또는 표 1에 기재된 아미노산과는 상이한 작용성 치환기를 가진 아미노산이 존재한다. 천연 발생 펩타이드의 반대 입체 이성질체, 및 펩타이드 유사체의 입체 이성질체가 개시되어 있다. 선택된 아미노산으로 tRNA 분자를 하전시키고, 부위 특이적인 방식으로 펩타이드 쇄 내로 유사체 아미노산을 삽입시키기 위하여 예컨대 엠버 코돈을 사용하는 유전자 구조체를 조작함으로써, 이들 아미노산을 폴리펩타이드 쇄 내로 용이하게 혼입시킬 수 있다[적어도 아미노산 유사체에 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 인용된 톨슨(Thorson) 등, Methods in Molec. Biol. 77:43-73 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 (1992); 이바(Ibba), Biotechnology & Genetic Engineering Reviews 13:197-216 (1995); 카힐(Cahill) 등, TIBS, 14(10):400-403 (1989); 베너(Benner), TIB Tech, 12:158-163 (1994); 이바 및 헤네케(Hennecke), Bio/technology, 12:678-682 (1994)].
폴리펩타이드와 유사하지만 천연 펩타이드 결합을 통해 연결되지 않는 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 아미노산 또는 아미노산 유사체의 결합은 CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- 및 --CHH2SO--를 포함할 수 있다. 이들 및 다른 결합은 스파톨라(Spatola, A.F.)의 문헌[Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, 바인스타인 편집, Marcel Dekker, 뉴욕, p. 267 (1983)]; 스파톨라의 문헌[Vega Data (1983년 3월), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications](일반적인 개요); 몰리(Morley)의 문헌[Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468]; 허드슨(Hudson, D.) 등, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979)](--CH2NH--, CH2CH2--); 스파톨라 등의 문헌[Life Sci 38:1243-1249 (1986)](--CHH2--S); 한(Hann)의 문헌[J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982)](--CH--CH--, 시스 및 트랜스); 암퀴스트(Almquist) 등의 문헌[J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980)](--COCH2--); 제닝스-화이트(Jennings-White) 등의 문헌[Tetrahedron Lett 23:2533 (1982)](--COCH2--); 젤케(Szelke) 등의 문헌[유럽 특허원 EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982)](--CH(OH)CH2--); 홀러데이(Holladay) 등의 문헌[Tetrahedron Lett 24:4401-4404 (1983)](--C(OH)CH2--); 및 흐루비(Hruby)의 문헌[Life Sci 31:189-199 (1982)](--CH2--S--)에서 찾아볼 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 참고로 인용된다. 특히 바람직한 비-펩타이드 결합은 --CH2NH--이다. 펩타이드 유사체는 결합 원자 사이에 하나보다 많은 원자를 가질 수 있는 것으로 생각된다(예컨대, b-알라닌, g-아미노뷰티르산 등).
아미노산 유사체 및 펩타이드 유사체는 흔히 더욱 경제적인 제조, 더 큰 화학적 안정성, 향상된 약리학적 특성(반감기, 흡수, 효능, 효험 등), 변화된 특이성(예컨대, 생물학적 활성의 넓은 스펙트럼), 감소된 항원성 등과 같은 향상되거나 바람직한 특성을 나타낸다.
D-아미노산을 사용하여 더욱 안정한 펩타이드를 생성시킬 수 있는데, D-아미노산은 펩티다제 등에 의해 인식되지 않기 때문이다. 콘센서스 서열의 하나 이상의 아미노산을 동일한 유형의 D-아미노산으로 체계적으로 치환시킴(예컨대, L-리신 대신 D-리신)을 이용하여 더욱 안정한 펩타이드를 생성시킬 수 있다. 시스테인 잔기를 사용하여 둘 이상의 펩타이드를 환화시키거나 함께 부착할 수 있다. 이는 펩타이드를 특정 구조로 제한하는데 유리할 수 있다. [리조(Rizo) 및 기라쉬(Gierasch) Ann . Rev . Biochem . 61:387 (1992), 본원에 참고로 인용됨].
본원에서 개시되는 유전자 및 단백질의 임의의 변형체, 개질체 또는 유도체를 정의하는 한 방식은 특이적인 공지 서열에 대한 상동성 면에서 변형체, 개질체 또는 유도체를 정의하는 것이다. 구체적으로 개시된 것은, 언급되거나 공지된 서열에 대해 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성을 나타내는 본원에 개시된 핵산 및 폴리펩타이드의 변형체이다. 당해 분야의 숙련자는 두 단백질 또는 핵산의 상동성을 결정하는 방법을 잘 안다. 예를 들어, 상동성이 최고 수준이 되도록 두 서열을 정렬시킨 후 상동성을 계산할 수 있다.
공개된 연산에 의해 상동성을 계산하는 다른 방법을 수행할 수 있다. 스미스(Smith) 및 워터맨(Waterman)[Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국부적인 상동성 연산에 의해, 니들맨(Needleman) 및 운쉬(Wunsch)[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 연산에 의해, 피어슨(Pearson) 및 립맨(Lipman)[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444 (1988)]의 유사성 방법의 연구에 의해, 이들 연산의 전산화된 수행[위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지의 GAP, GESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575]에 의해, 또는 검사에 의해, 비교하기 위한 서열의 최적 정렬을 수행할 수 있다. 이들 참조문헌은 상동성 계산 방법과 관련하여 본원에 참고로 인용된다.
예를 들어 적어도 핵산 정렬과 관련된 물질에 대해 본원에 참고로 인용된 주커(Zuker, M.)의 문헌[Science 244:48-52, 1989], 재거(Jaeger) 등의 문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86:7706-7710, 1989], 재거 등의 문헌[Methods Enzymol. 183:281-306, 1989]에 개시되어 있는 연산에 의해 핵산의 동일한 유형의 상동성을 수득할 수 있다.
경구, 직장, 저장기내, 심실내, 두개내, 경막내, 관절내, 질내, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 국부(분말, 연고 또는 점적약), 복강내 주사에 의해, 경피, 흡입에 의해 또는 볼 또는 비강 스프레이로서, 제공되는 조성물을 투여할 수 있다. 요구되는 항체 또는 치료제의 정확한 양은 개체의 연령, 체중 및 전반적인 상태, 치료되는 질환의 심각성, 종양의 위치 및 크기, 사용되는 특정 화합물, 투여 방식 등에 따라 개체별로 달라진다. 본원의 교시내용에 주어진 통상적인 실험을 이용하여 당해 분야의 숙련자가 적절한 양을 결정할 수 있다. 항체의 전형적인 단일 투여량은 0.1 내지 10,000㎍, 바람직하게는 1 내지 100㎍이다. 담체중 전형적인 항체 농도는 전달되는 1밀리리터당 0.2 내지 2000ng이다. 관절 내로의 주사의 경우, 항체 및 담체의 부피는 관절에 따라 달라지지만, 약 0.5 내지 10ml, 바람직하게는 1 내지 5ml를 인간의 무릎 내로 주사하고, 약 0.1 내지 5ml, 바람직하게는 1 내지 2ml를 인간의 발목 내로 주사한다.
조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한"이란, 생물학적으로나 다른 면에서 바람직하고 상당한 바람직하지 못한 생물학적 효과를 야기하거나 약학 조성물의 다른 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 선택된 기질과 함께 개인에게 투여될 수 있는 물질을 함유함을 의미한다.
의도되는 투여 방식에 따라, 항체 또는 치료제는 예컨대 정제, 좌약, 환제, 캡슐, 분말, 액체 또는 현탁액 같은 고체, 반고체 또는 액체 투여형의 형태로, 바람직하게는 정밀한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여 형태로 약학 조성물에 존재할 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 효과적인 양의 선택된 기질을 포함하고, 또한 다른 의약품, 약제, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 비경구 주사에 적합한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 및 주사가능한 멸균 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비-수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글라이콜, 폴리에틸렌글라이콜, 글라이세롤 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예: 올리브유) 및 주사가능한 유기 에스터(예: 에틸 올리에이트)를 포함한다. 예를 들어 레시틴 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 또한 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제 같은 보조제도 함유할 수 있다. 다양한 항균 및 항진균 약제, 예컨대 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 미생물의 작용을 확실히 방지할 수 있다. 등장성 시약, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것도 바람직할 수 있다. 흡수를 지연시키는 시약, 예컨대 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴을 사용함으로써, 주사가능한 약제 형태의 흡수를 지연시킬 수 있다.
경구 투여용 고체 투여형은 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여형에서는, 활성 화합물을 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 같은 하나 이상의 통상적인 불활성 부형제(또는 담체) 또는 (a) 예컨대 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨 및 규산 같은 충전제 또는 증량제, (b) 예컨대 카복시메틸셀룰로즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로즈 및 아라비아 검 같은 결합제, (c) 예를 들어 글라이세롤 같은 보습제, (d) 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 복합 실리케이트 및 탄산나트륨 같은 붕해제, (e) 예컨대 파라핀 같은 용해 지연제, (f) 예를 들어 4급 암모늄 화합물 같은 흡수 가속화제, (g) 예를 들어 세틸 알콜 및 글라이세롤 모노스테아레이트 같은 습윤제, (h) 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 같은 흡착제, 및 (i) 예컨대 활석, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글라이콜, 소듐 라우릴 설페이트 또는 이들의 혼합물 같은 윤활제와 혼합한다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여형은 또한 완충제도 포함할 수 있다.
락토즈 또는 유당 및 고분자량 폴리에틸렌글라이콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐의 충전제로서 유사한 유형의 고체 조성물을 사용할 수 있다.
장용성 코팅 및 당해 분야에 널리 공지되어 있는 다른 코팅 같은 코팅 및 쉘(shell)을 사용하여 정제, 당의정, 캡슐, 환제 및 과립 같은 고체 투여형을 제조할 수 있다. 이들은 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 화합물 또는 화합물들을 위장관의 특정 부분에 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수도 있다. 사용될 수 있는 매립 조성물의 예는 중합체 성분 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적절한 경우 상기 언급된 하나 이상의 부형제를 가진 미소캡슐화된 형태일 수도 있다.
경구 투여용 액체 투여형은 약학적으로 허용가능한 유화액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물에 덧붙여, 액체 투여형은 물, 또는 예컨대 에틸 알콜, 아이소프로필 알콜, 에틸 카본에이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글라이콜, 1,3-뷰틸렌글라이콜, 다이메틸폼아마이드, 오일(구체적으로는, 면실유, 땅콩유, 옥수수배아유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글라이세롤, 테트라하이드로퓨르퓨릴 알콜, 폴리에틸렌글라이콜 및 솔비탄의 지방산 에스터, 또는 이들 성분의 혼합물 등과 같은 다른 용매, 가용화제 및 유화제 등의 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유할 수 있다.
이러한 불활성 희석제 외에, 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 향미제 및 향료 같은 보조제도 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 덧붙여 예를 들어 에톡실화 아이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스터, 미정질 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트 또는 이들 성분의 혼합물 등과 같은 현탁제를 함유할 수 있다.
직장 투여용 조성물은 바람직하게는 통상적인 온도에서는 고체이지만 체온에서는 액체여서 직장 또는 질강 내에서 용융되어 활성 성분을 방출하는 적합한 비자극성 부형제 또는 담체(예: 코코아 버터, 폴리에틸렌글라이콜 또는 좌약용 왁스)와 본 발명의 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약이다.
본 발명의 화합물의 국부 투여용 투여형은 연고, 분말, 스프레이 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분을 멸균 조건하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합한다. 안과용 제제, 연고, 분말 및 용액도 본 발명의 영역에 속하는 것으로 고려된다.
본원에 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염, 에스터, 아마이드 및 전구약물"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 부당한 독성, 자극, 알러지 반응 등이 없이 환자의 조직과 접촉시켜 사용하기에 적합하고 합당한 이점/위험 비에 적합하며 의도된 용도에 효과적인 본 발명의 화합물의 카복실레이트 염, 아미노산 부가 염, 에스터, 아마이드 및 전구약물, 및 본 발명의 화합물의 양쪽성 이온 형태(가능한 경우)를 일컫는다. 용어 "염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성인 무기 및 유기 산부가염을 말한다. 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 동일 반응계 내에서, 또는 유리 염기 형태의 정제된 화합물을 적합한 유기 또는 무기 산과 별도로 반응시키고 이렇게 생성된 염을 단리함으로써, 이들 염을 제조할 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 바이설페이트, 나이트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발레레이트, 올리에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말리에이트, 퓨마레이트, 석신에이트, 타르트레이트, 나프틸레이트 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토바이오네이트, 메테인 설폰에이트 및 라우릴설폰에이트 염 등을 포함한다. 이들은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등과 같은 알칼리금속 및 알칼리토금속에 기초한 양이온, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 비독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온을 포함할 수 있다. [예를 들어, 본원에 참고로 인용된 바지(S.M. Barge) 등, "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19 참조].
RNA 간섭(RNAi)에 사용하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. dsRNA는 짧은 간섭 RNA(siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다. 그러므로, shRNA를 포함하는 단리된 핵산이 제공되며, 이때 shRNA는 CARD 함유 단백질의 발현을 억제한다. shRNA는 핵산 서열(서열 번호: 10, 12, 14 또는 16)에 의해 코딩될 수 있다.
개시된 핵산은 예컨대 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 뉴클레오타이드 치환체로 제조된다. 이들 및 다른 분자의 비한정적인 예가 본원에서 논의된다. 예를 들어 벡터가 세포에서 발현되는 경우, 발현되는 mRNA는 전형적으로 A, C, G 및 U로 제조되는 것으로 이해된다. 마찬가지로, 예컨대 안티센스 분자가 세포 내로 도입되거나 예컨대 외인성 전달을 통해 세포 환경 내로 도입되면, 안티센스 분자가 세포 환경에서 안티센스 분자의 열화를 감소시키는 뉴클레오타이드 유사체로 제조되는 것이 유리한 것으로 생각된다.
"단리된 핵산" 또는 "정제된 핵산"이란, 본 발명의 DNA가 유도되는 생물체의 천연-발생 게놈에서 유전자에 접하는 유전자를 함유하지 않는 DNA를 의미한다. 따라서, 이 용어는 예를 들어 자발적으로 복제되는 플라스미드 또는 바이러스 같은 벡터 내로 혼입되거나, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 혼입되거나(예컨대, 형질전환 유전자), 또는 별도의 분자(예를 들어, PCR, 제한 엔도뉴클레아제 소화 또는 화학적 또는 시험관내 합성에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 또는 cDNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 추가적인 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA도 포함한다. 용어 "단리된 핵산"은 또한 RNA, 예컨대 단리된 DNA 분자에 의해 코딩되거나 또는 화학적으로 합성되거나 또는 적어도 일부 세포 성분(예컨대, 다른 유형의 RNA 분자 또는 폴리펩타이드 분자)로부터 분리되거나 이들 성분을 실질적으로 함유하지 않는 mRNA 분자도 나타낸다.
본원에는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본원에 제공된 임의의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 전사를 제어하는 바람직한 프로모터는 다양한 공급원으로부터, 예를 들어 폴리오마, 시미안 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 가장 바람직하게는 사이토메갈로바이러스 같은 바이러스의 게놈으로부터, 또는 이종 포유동물 프로모터, 예컨대 베타 액틴 프로모터 또는 EF1 프로모터로부터, 또는 하이브리드 또는 키메라 프로모터(예컨대, 베타 액틴 프로모터에 융합된 사이토메갈로바이러스 프로모터)로부터 수득될 수 있다. SV40의 초기 및 최근의 프로모터는 SV40 바이러스 복제 개시점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다[피어스(Fiers) 등, Nature, 273:113 (1978)]. 인간의 사이토메갈로바이러스의 바로 전 프로모터는 HIndIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다[그린웨이(Greenway, P.J.) 등, Gene 18: 355-360 (1982)]. 물론, 숙주 세포 또는 관련 종으로부터의 프로모터도 본원에서 유용하다.
"증강자(enhancer)"는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 작용하고, 전사 단위에 대해 5'[레이민스(Laimins, L.) 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)] 또는 3'[러스키(Lusky, M.L.) 등, Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)]일 수 있는 DNA의 서열을 일컫는다. 뿐만 아니라, 증강자는 인트론 내에[배너지(Banerji, J.L.) 등, Cell 33: 729 (1983)] 또한 코딩 서열 자체 내에[오스본(Osborne, T.F.) 등, Mol. Cell Biol 4: 1293 (1984)] 존재할 수 있다. 이들은 통상 길이가 10 내지 300bp이고, 이들은 시스로 작용한다. 증강자는 부근의 프로모터로부터의 전사를 증가시키는 기능을 한다. 증강자는 또한 흔히 전사의 조절을 매개하는 응답 요소도 함유한다. 프로모터는 또한 전사의 조절을 매개하는 응답 요소도 함유할 수 있다. 증강자는 흔히 유전자 발현의 조절을 결정한다. 다수의 증강자 서열이 현재 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아 단백질 및 인슐린)로부터 알려져 있지만, 전형적으로는 일반적인 발현의 경우 진핵생물 세포 바이러스로부터의 증강자를 사용한다. 바람직한 예는 복제 개시점의 끝 쪽에 있는 SV40 증강자(bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 증강자, 복제 개시점의 끝 쪽에 있는 폴리오마 증강자 및 아데노바이러스 증강자이다.
광 또는 프로모터 및/또는 증강자의 기능을 촉발시키는 특이적인 화학 반응에 의해 프로모터 및/또는 증강자를 특이적으로 활성화시킬 수 있다. 테트라사이클린 및 덱사메타손 같은 시약, 합성 전사 인자, 지향성 RNA 자가-절단[옌(Yen L.) 등, 2004, Nature 431:471-476] 및 다른 방법에 의해 시스템을 조절할 수 있다. 또한, 감마선 같은 선 또는 알킬화 화학요법 약물에 노출시킴으로써 바이러스 벡터 유전자 발현을 증강시키는 방법도 있다.
프로모터 및/또는 증강자 영역은 전사되는 전사 단위의 영역의 발현을 최대화시키기 위하여 구성 프로모터 및/또는 증강자로서 작용할 수 있다. 특정 구조체에서, 프로모터 및/또는 증강자 영역은 특정 시간에 특정 유형의 세포에서만 발현됨에도 불구하고 모든 진핵생물 세포 유형에서 활성이다. 이 유형의 바람직한 프로모터는 CMV 프로모터(650개 염기)이다. 다른 바람직한 프로모터는 SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스(및 연결된 인트론 서열), 베타-액틴, 신장 인자-1(EF-1) 및 레트로바이러스 벡터 LTR이다.
흑색종 세포 같은 특이적인 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 발현 벡터를 구성하는데 모든 특이적인 조절 요소를 클로닝 및 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 아교 섬유 아세트산 단백질(GFAP) 프로모터를 사용하여 아교(성상세포) 기원의 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시켰다. HLA-DR, CD11c, Fascin 및 CD68 프로모터를 모두 사용하여 대식세포 및 수지상 세포를 비롯한 항원-제공 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시켰으며[브록커(Brocker, T.) 등. 1997. J Exp Med 185:541-550; 고우(Gough P.J.) 및 레인즈(Raines, E.W.) 2003. Blood 101:485-491; 퀴(Cui, Y.) 등. 2002. Blood 99:399-408; 수도위(Sudowe, S.) 등. 2003. Mol Ther 8:567-575], 수지상 세포-특이적인 유전자(예컨대, CD83)로부터의 프로모터 요소도 이와 관련하여 유용한 것으로 입증될 수 있다[버흐톨드(Berchtold S.) 등. 2002. Immunobiology 205:231-246].
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 핵 형성된 세포)에 유용한 발현 벡터는 또한 mRNA 발현에 영향을 끼칠 수 있는 전사의 종결에 필요한 서열도 함유할 수 있다. 이들 영역은 조직 인자 단백질을 코딩하는 mRNA의 미번역 부분에서 폴리아데닐화된 분절로서 전사된다. 3' 미번역 영역은 또한 전사 종결 부위도 포함한다. 전사 단위가 또한 폴리아데닐화 영역을 함유하는 것이 바람직하다. 이 영역의 한 이점은 전사된 단위가 mRNA 같이 처리 및 수송될 가능성을 증가시킨다는 것이다. 발현 구조체에서의 폴리아데닐화 신호의 확인 및 사용은 널리 확립되어 있다. 동종 폴리아데닐화 신호를 형질전환 유전자 구조체에 사용하는 것이 바람직하다. 특정 전사 단위에서, 폴리아데닐화 영역은 SV40 초기 폴리아데닐화 신호로부터 유도되고, 약 400개의 염기로 구성된다. 또한, 전사된 단위가 다른 표준 서열을 단독으로 또는 구조체로부터의 발현을 개선시키거나 구조체의 안정성을 개선시키는 상기 서열과 함께 함유하는 것이 바람직하다.
바이러스 벡터는 마커 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 마커 생성물을 사용하여 유전자가 세포로 전달되었는지 또한 전달된 후 발현되었는지를 결정한다. 바람직한 마커 유전자는 β 갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 루시퍼라제를 코딩하는 이. 콜라이(E. coli) lacZ 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 마커는 선택가능한 마커일 수 있다. 포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 티미딘 키나제, 네오마이신, 네오마이신 유사체 G418, 하이그로마이신 및 퓨로마이신이다. 이러한 선택가능한 마커가 포유동물 숙주 세포 내로 성공적으로 전달되는 경우, 형질전환된 포유동물 숙주 세포는 선택적인 압력하에 놓일 때 생존할 수 있다. 두 가지 널리 이용되는 선택적인 양식의 별개의 카테고리가 있다. 제 1 카테고리는 세포의 대사 및 보충된 배지와는 상관없이 성장하는 능력이 결여된 돌연변이 세포주의 사용에 기초한다. 2가지의 예, 즉 CHO DHFR 세포 및 마우스 LTK 세포가 있다. 이들 세포는 티미딘 또는 하이포잔틴 같은 영양소를 첨가하지 않고서 성장하는 능력을 결여하고 있다. 이들 세포가 완전한 뉴클레오타이드 합성 경로에 필요한 특정 유전자를 결여하고 있기 때문에, 이들은 결여된 뉴클레오타이드가 보충된 배지에 제공되지 않으면 생존할 수 없다. 배지를 보충하는 다른 방법은 개별적인 유전자를 결여하는 세포 내로 완전한 DHFR 또는 TK 유전자를 도입하여 이들의 성장 조건을 변화시키는 것이다. DHFR 또는 TK 유전자로 형질전환되지 않은 개별적인 세포는 보충되지 않은 배지에서 생존할 수 없다.
제 2 카테고리는 임의의 세포 유형에서 사용되는 선택 계획을 나타내고 돌연변이 세포주의 사용을 필요로 하지 않는 우세한 선택이다. 이들 계획은 전형적으로 숙주 세포의 성장을 저지하는 약물을 사용한다. 새로운 유전자를 가진 세포는 단백질 운송 약물 내성을 나타내고 선택에서 생존한다. 이러한 우세한 선택의 예는 약물 네오마이신[서던(Southern P.) 및 버그(Berg, P.), J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)], 마이코페놀산[뮬리건(Mulligan, R.C.) 및 버그, Science 209: 1422 (1980)] 또는 하이그로마이신[서전(Sugden, B.) 등, Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)]을 사용한다. 이들 세 가지 예는 진핵생물 제어하에 세균 유전자를 사용하여 각각 적절한 약물 G418 또는 네오마이신(제네티신), xgpt(마이코페놀산) 또는 하이그로마이신에 대한 내성을 전달한다. 다른 약물은 네오마이신 유사체 G418 및 퓨로마이신을 포함한다.
본원에 제공되는 임의의 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. 개시되는 세포는 본원에 제공되는 벡터를 클로닝하거나 전파하는데 사용되는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 세포는 임의의 일차 세포(primary cell) 배양액 또는 확립된 세포주로부터 수득될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 벡터의 선택 및 목적하는 용도에 기초하여 세포 유형을 선택할 수 있다.
사멸 수용체의 CARD 함유 단백질 결합 영역을 포함하는 단리된 폴리펩타이드가 제공되며, 이때 폴리펩타이드는 25개 미만의 아미노산 잔기를 포함한다.
그러므로, 제공되는 폴리펩타이드는 TFNR1(수납 번호 gi:23312372)의 CARD 함유 단백질 결합 영역일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 Fas 수용체(수납 번호 gi:119833)의 CARD 함유 단백질 결합 영역일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 TRAIL 수용체의 CARD 함유 단백질 결합 영역일 수 있다. 따라서, 제공되는 폴리펩타이드는 DR4(수납 번호 gi:21264525)의 CARD 함유 단백질 결합 영역일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 DR5(수납 번호 gi:3721878)의 CARD 함유 단백질 결합 영역일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 아미노산 서열(서열 번호: 22)의 단편일 수 있으며, 이때 이 단편은 본원에 개시된 CARD 함유 단백질에 결합한다. 예시적인 예로서, 제공되는 폴리펩타이드는 DR5의 아미노산 250 내지 340을 포함할 수 있다. 그러므로, 폴리펩타이드는 아미노산 서열(서열 번호: 23)을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 단편이 DDX3에 결합할 수 있도록 아미노산 서열(서열 번호: 23)의 단편을 추가로 포함할 수 있다. 예로서, 조절제는 DR5의 아미노산 280 내지 310을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 그러므로, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 24)을 포함할 수 있다. 다른 예로서, 조절제는 DR5의 아미노산 300 내지 330을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 따라서, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 36)을 포함할 수 있다.
"결합하다"란, 폴리펩타이드가 표준 생화학적 방법으로 검출될 수 있기에 충분한 친화력으로 CARD 함유 단백질과 비-공유 결합(예컨대, 수소 결합)을 형성함을 의미한다. 한 요지에서, 제공되는 폴리펩타이드는 그가 유도되는 사멸 수용체의 친화력 이상의 친화력으로 CARD 함유 단백질과 결합한다.
사멸 수용체의 CARD 함유 단백질 결합 영역은 CARD 함유 단백질 결합을 경쟁적으로 억제하기 위한 가용성 수용체로서 사용된다. 그러므로, 본원에 개시된 바와 같은 사멸 수용체의 생존 영역을 코딩하는 폴리펩타이드 또는 결합을 차단하는 그의 단편과 세포를 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 사멸 수용체에 대한 CARD 함유 단백질의 결합을 차단하는 방법이 제공된다. 또한, 세포를 폴리펩타이드와 접촉시킴을 포함하는, 세포에서 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하는 방법이 제공된다.
CARD 함유 단백질의 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩타이드가 제공된다. 제공되는 폴리펩타이드는 DDX3(서열 번호: 25, 수납 번호 gi:13514816)의 사멸 수용체 결합 도메인일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 아미노산 서열(서열 번호: 25)의 단편(이는 본원에 개시된 사멸 수용체에 결합함)일 수 있다. DDX3은 대략 아미노산 200 내지 250 및 350 내지 400에서 DR5와 결합한다. 따라서, 조절제는 DDX3의 아미노산 200 내지 250을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 단편일 수 있다. 그러므로, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 37)을 포함할 수 있다. 따라서, 조절제는 DDX3의 아미노산 350 내지 400을 포함하는 폴리펩타이드 또는 그의 단편일 수 있다. 그러므로, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 38)을 포함할 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 mda-5(수납 번호 gi:11344593)의 사멸 수용체 결합 도메인일 수 있다. 제공되는 폴리펩타이드는 RIG-1(수납 번호 gi:6048564)의 사멸 수용체 결합 도메인일 수 있다.
폴리펩타이드가 사멸 수용체-유도되는 아폽토시스를 억제할 수 없는 경우, CARD 함유 단백질의 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를, CARD 함유 단백질에 의한 사멸 수용체 결합의 우세한 부정적인 억제제로서 사용할 수 있다. 따라서, 한 요지에서, 단리된 폴리펩타이드는 카스파제 또는 IAP와 결합할 수 없다. DDX3의 IAP 결합을 담당하는 CARD 모티프는 약 아미노산 50 내지 100이다. 그러므로, 제공되는 폴리펩타이드는 DDX3의 사멸 수용체 결합 도메인을 포함할 수 있지만 DDX3의 아미노산 50 내지 100을 포함하지 않는다. 따라서, 조절제는 DDX3의 아미노산 200 내지 250 및/또는 아미노산 350 내지 400을 포함하지만 DDX3의 아미노산 50 내지 100을 포함하지 않는 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, DDX3의 아미노산 151 내지 662로 이루어진 폴리펩타이드가 제공된다. 따라서, 조절제는 아미노산 서열(서열 번호: 39)로 이루어진 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
추가적인 요지에서, 폴리펩타이드는 사멸 수용체와 내인성 CARD 함유 단백질의 회합을 차단할 수 있다. 추가의 요지에서, 폴리펩타이드는 IAP의 사멸 수용체로의 동원을 방지할 수 있다. 다른 요지에서, 폴리펩타이드는 사멸 수용체로의 FADD의 동원을 억제할 수 없다. 이들 요지의 임의의 조합이 고려된다.
사멸 수용체-유도되는 세포사멸사를 억제하는 DDX3 같은 CARD 함유 단백질의 능력은 적어도 부분적으로는 CARD 함유 단백질의 CARD 도메인에 의한 IAP의 사멸 수용체로의 동원에 기인한다. 따라서, 세포를 개시된 폴리펩타이드와 접촉시킴을 포함하는, IAP와 사멸 수용체의 회합을 차단하는 방법이 제공된다. 또한, 개시된 폴리펩타이드와 세포를 접촉시킴을 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하는 방법이 제공된다.
달리 구체적으로 표시되지 않는 한 특정 시약 및 화합물에 대해 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여, 본원에 개시된 조성물 및 개시된 방법을 수행하는데 필요한 조성물을 제조할 수 있다.
예를 들어, 핵산을 표준 화학적 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있거나, 또는 효소에 의한 방법 또는 임의의 다른 공지 방법을 이용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 방법은 표준 효소에 의한 소화 및 후속 뉴클레오타이드 단편 단리[예컨대 샘브룩(Sambrook) 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버, 1989 참조]로부터, 예컨대 밀리겐(Milligen) 또는 벡크맨 시스템(Beckman System) 1Plus DNA 합성기[예를 들어, 밀리겐-바이오써치(Milligen-Biosearch)의 모델 8700 자동화 합성기, 매사추세츠주 벌링톤 또는 ABI Model 380B]를 사용하는 사이아노에틸 포스포르아미다이트 방법에 의한 순수한 합성 방법에 이른다. 올리고뉴클레오타이드를 제조하는데 유용한 합성 방법은 또한 이쿠타(Ikuta) 등의 문헌[Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984)](포스포트라이에스터 및 포스파이트-트라이에스터 방법) 및 나랑(Narang) 등의 문헌[Methods Enzymol., 65:610-620 (1980)](포스포트라이에스터 방법)에도 기재되어 있다. 닐센(Nielsen) 등의 문헌[Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)]에 기재되어 있는 것과 같은 공지 방법을 이용하여 단백질 핵산 분자를 제조할 수 있다.
개시된 폴리펩타이드를 제조하는 한 방법은 단백질 화학 기법에 의해 둘 이상의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 함께 연결시키는 것이다. 예를 들어, Fmoc(9-플루오렌일메틸옥시카본일) 또는 Boc(3급-뷰틸옥시카본일) 화학을 이용하는 현재 입수가능한 실험실 설비를 사용하여 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 화학적으로 합성할 수 있다. [어플라이드 바이오시스템즈, 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.), 캘리포니아주 포스터 시티]. 당해 분야의 숙련자는 표준 화학 반응에 의해 개시된 단백질에 상응하는 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성할 수 있음을 용이하게 알 수 있다. 예를 들어, 하나의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성할 수 있고 그의 합성 수지로부터 절단할 수 없는 반면, 펩타이드 또는 단백질의 다른 단편을 합성한 후 수지로부터 절단할 수 있음으로써 다른 단편 상에 기능적으로 차단된 말단 기를 노출시킬 수 있다. 펩타이드 축합 반응에 의해, 각각 카복실 말단 및 아미노 말단에서의 펩타이드 결합을 통해 두 단편을 공유 결합시켜 항체 또는 그의 단편을 형성시킬 수 있다[적어도 펩타이드 합성 관련 물질에 대하여 본원에 참고로 인용된 그랜트(Grant GA) (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., 뉴욕 (1992); 보단스키 및 트로스트 편집. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., 뉴욕]. 다르게는, 본원에 기재된 바와 같이 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 생체 내에서 독립적으로 합성한다. 단리시킨 후, 이들 독립적인 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 연결하여 유사한 펩타이드 축합 반응을 통해 펩타이드 또는 그의 단편을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 클로닝된 또는 합성 펩타이드 분절의 효소에 의한 결찰은, 연결되어 보다 큰 펩타이드 단편, 폴리펩타이드 또는 전체 단백질 도메인을 생성시키는 비교쩍 짧은 단편을 생성시킨다[아브람슨(Abrahmsen L) 등, Biochemistry, 30:4151 (1991)]. 다르게는, 합성 펩타이드의 천연 화학적 결찰을 이용하여 보다 짧은 펩타이드 단편으로부터 큰 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 합성에 의해 구축할 수 있다. 이 방법은 두 단계의 화학 반응으로 이루어진다[도슨(Dawson) 등. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:766-779 (1994)]. 제 1 단계는 보호되지 않은 합성 펩타이드-티오에스터와 아미노-말단 Cys 잔기를 함유하는 다른 보호되지 않은 펩타이드 분절을 화학 선택적 반응시켜 초기 공유 생성물로서 티오에스터-연결된 중간체를 제공하는 것이다. 반응 조건을 변화시키지 않고, 중간체를 자발적이고 신속한 분자내 반응시켜, 결찰 부위에서 천연 펩타이드 결합을 생성시킨다[바기올리니(Baggiolini M) 등. (1992) FEBS Lett. 307:97-101; 클라크-루이스(Clark-Lewis I) 등, J. Biol. Chem., 269:16075 (1994); 클라크-루이스 등, Biochemistry, 30:3128 (1991); 라자라트남(Rajarathnam K) 등, Biochemistry 33:6623-30 (1994)].
다르게는, 보호되지 않은 펩타이드 분절을 화학적으로 연결시키는데, 화학적 결찰의 결과로서 펩타이드 분절 사이에 형성되는 결합은 천연적이지 않은(비-펩타이드) 결합이다[슈놀저(Schnolzer, M) 등. Science, 256:221 (1992)]. 이 기법을 이용하여 단백질 도메인의 유사체 및 다량의 전체 생물학적 활성을 나타내는 비교적 순수한 단백질을 합성하였다[드리슬 밀턴(deLisle Milton RC) 등, Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, 뉴욕, pp. 257-267 (1992)].
본 발명에 따른 방법 및 결과를 예시하기 위하여 하기 실시예를 아래에 기재한다. 이들 실시예는 본 발명의 모든 요지를 포괄하고자 하지 않으며, 오히려 대표적인 방법 및 결과를 예시한다. 이들 실시예는 당해 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명의 등가물 및 변형을 배제하고자 하지 않는다.
실시예 1: 사멸 도메인 기능을 차단시킴에 의한, TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에 대한 종양 세포의 유도가능한 내성
물질 및 방법
세포주, 항체 및 시약: 인간의 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 미국 종균 협회(ATCC)(버지니아주 마나사스)에서 구입하였다. 인간의 난소암 세포주인 UL-3C를 수득하였다. 10% 열-불활성화된 FCS, 50㎍/ml 스트렙토마이신 및 50U/ml 페니실린으로 보충된 DMEM 또는 RPMI1640[셀그로, 메디아텍, 인코포레이티드(Cellgro, Mediatec, Inc.), 버지니아주 헌돈]에 세포를 유지시켰다. 항-인간 TRAIL-R1(클론: 2E12) 및 항-인간 TRAIL-R2(클론: TRA-8) 단클론 항체는 이미 기재된 바 있다[이치카와(Ichikawa) 등, 2003; 이치카와 등, 2001]. 유동 세포 분석 및 면역침전 분석을 위한 항-인간 TRAIL-R2(클론: 2B4)를 개발하였다. 재조합 가용성 TRAIL을 알렉시스 바이오케미칼즈(Alexis Biochemicals)(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 다클론 항-카스파제 3 및 항-카스파제 8 항체를 비디 파민겐(BD PharMingen)(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 단클론 항-인간 카스파제 2, 3, 8, 9 및 10 항체, 및 단클론 항-인간 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cIAP-1, cIAP-2, XIAP 및 서바이빈 항체를 제조하였다. 다클론 항-포스포-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185), 항-포스포-p38 MAPK(Thr180/Tyr182), 항-PARP 항체를 셀 시그널링 테크놀로지, 인코포레이티드(Cell Signaling Technology, Inc.)(매사추세츠주 베벌리)에서 구입하였다. 항-β-액틴 항체를 시그마(Sigma)(미주리주 세인트 루이스)에서 구입하였다. 항-FADD를 트랜스덕션 래보러토리즈(Transduction Laboratories)(켄터키주 렉싱턴)에서 구입하였다. 항-FLIP를 프로사이 인코포레이티드(ProSci Inc.)(캘리포니아주 포웨이)에서 구입하였다. 모든 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-공액 2차 시약을 서던 바이오테크놀로지 어쏘시에이츠, 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates, Inc.)(앨라배마주 버밍험)에서 구입하였다.
TRAIL-R1 및 -R2의 세포 표면 발현의 유동 세포 분석: 106개의 세포를 바이오틴일화 2E12 1㎍/ml 및 PE-공액 2B4 1㎍/ml와 얼음상에서 30분동안 배양하였다. FACS 완충액(5% FBS 및 0.01% NaN3를 함유하는 PBS)으로 2회 세척한 후, 세포를 스트렙토아비딘-사이크롬과 함께 배양하였다. FACScan 유동 세포 분석계(비디, 캘리포니아주)에 의해 10,000개의 생존 세포가 분석되었다.
TRA-8, 2E12 및 TRAIL-매개되는 아폽토시스에 대한 종양 세포 감수성의 세포독성 분석: 8개 농도(1000ng/ml로부터 2배씩 연속 희석시킴)의 TRA-8, 2E12 또는 TRAIL을 함유하는 96개-웰 플레이트에 세포(웰 1개당 1,000개의 세포)를 접종하였다(웰 3개씩 1조). 제조업체의 지시[팩커드 인스트루먼츠(Packard Instruments), 코네티컷주 메리덴]에 따라 ATPLITE 분석법을 이용하여 하룻밤동안 배양한 후 세포 생존율을 결정하였다. 결과는 배지 대조용 웰과 비교한 처리된 웰에서의 생존 세포의 백분율로서 제공된다.
TRAIL - R2 에 대한 종양 세포 내성의 유도: 1ng/ml TRA-8의 출발 투여량으로 세포(5×105개/ml)를 2일동안 배양하였다. 새로운 배지로 세포를 분할하고, TRA-8 투여량이 2,000ng/ml에 도달할 때까지 매 2일마다 TRA-8의 투여량을 2배로 하여 배양하였다. 각 처리 사이클에서, 유도되지 않은 세포(모세포) 및 TRA-8의 유도 투여량으로 처리된 유도된 세포의 세포 생존율을 ATPLITE 분석법에 의해 결정하였다.
TRAIL - R2 의 클로닝 및 서열 결정: 백금 DNA 프루프리딩(proofreading) 폴리머라제(인비트로젠)를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 TRAIL-R2의 전체-길이 cDNA를 수득하였다. cDNA를 pCR2.1-TOPO 벡터(인비트로젠) 내로 클로닝하였다. 서열을 결정하기 위해 5개 이상의 독립적인 클론을 선택하였다.
아폽토시스-관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석: 종양 세포(3×106개)를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM EGTA, 0.1% SDS, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 및 프로테아제 저해제의 혼합물(1mM 페닐메틸설폰일 플루오라이드, 1㎍/ml 펩스타틴 A, 2㎍/ml 아프로티닌)을 함유하는 용해 완충액 300㎕로 용해시켰다. 용해물을 10초간 초음파처리하고, 12,000g에서 20분간 원심분리하였다. 동량의 전체 단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE 샘플 완충액과 함께 5분간 비등시켰다. 전체 세포 용해물을 8%, 10% 또는 12% SDS-PAGE에서 분리시키고, 전기 영동에 의해 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하였다. TBST 완충액(20mM Tris-HCl(pH 7.4), 500mM NaCl 및 0.1% Tween 20)중 5% 탈지 드라이 밀크로 블롯을 차단하고, 차단 완충액중에서 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 블롯을 TBST로 3회 세척하고, 실온에서 1시간동안 HRP-공액 2차 항체를 프로브로 사용하여 검사하였다. TBST로 4회 세척한 후, 제조업체의 지시에 따라 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템[애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences), 뉴저지주 피스카타웨이]을 이용하여 검사된 단백질을 가시화시켰다.
아폽토시스- 및 세포 신호 전달-관련 유전자의 전사 조절의 cDNA 어레이 분석: 인간의 아폽토시스 유전자 어레이(HS-002) 및 인간의 신호 변환 경로 파인더(finder) 유전자 어레이(HS-008)를 수퍼어레이, 인코포레이티드(SuperArray, Inc.)(메릴랜드주 프레데릭)에서 구입하였다. 트리졸(TRIZOL; 등록상표) 프로토콜(인비트로젠, 캘리포니아주 칼스바드)을 이용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 32P-dCTP를 사용하여 cDNA 프로브를 합성하였다. 막 블롯 상의 cDNA를 32P-dCTP 라벨링된 프로브와 60℃에서 하룻밤동안 하이브리드 형성시켰다. 사이클론 포스포리마거(CYCLONE PHOSPHORIMAGER™)(팩커드 인스트루먼츠, 코네티컷주 메리디엔)를 이용하여 유전자 발현 프로파일을 분석하였다.
TRAIL - R1 및 TRAIL - R2 의 동시-면역침전: 107개의 세포를 빙냉 PBS로 세척하고, 용해 완충액(1% Triton X-100, 150mM NaCl, 10% 글라이세롤, 20mM Tris-HCl[pH 7.5], 2mM EDTA, 0.57mM PMSF 및 프로테아제 저해제 칵테일)으로 얼음 상에서 15분 동안 용해시켰다. 이어, 용해물을 4℃에서 16,000g에서 10분간 원심분리시킴으로써 2회 맑게 만들었다. 가용성 분획을 30㎕ TRA-8 또는 2B4 공액 세파로즈 4B와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 용해 완충액으로 7회, 10mM Tris로 3회 세척한 후, SDS-PAGE 로딩 완충액에서 3분간 비등시킴으로써 결합된 단백질을 용리시키고 SDS-PAGE에서 분리시켰다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 카스파제 8 및 FADD의 존재를 결정하였다.
2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동: 2B4-세파로즈 4B와 동시-면역침전시킨 후, 단백질을 용리시키고 아세톤으로 탈염시킨 다음, IEF 샘플 완충액[바이오-라드(Bio-Rad), 캘리포니아주 헤르큘레스] 중에서 다시 용액으로 만들었다. 전체 단백질 160㎍을 실온에서 하룻밤동안 IPG 스트립(바이오-라드)에 로딩한 다음, PROTEAN IEF™ 셀(Cell)(바이오-라드)에서 분리시켰다. 단백질 스트립을 레디프레프(ReadyPrep) 평형화 완충액(바이오-라드)으로 평형화시킨 다음, 10% SDS-PAGE 겔에서 추가로 분리하였다. 종결된 후, 10% 메탄올 및 7% 아세트산을 함유하는 완충액으로 겔을 고착시키고 사이프로(SYPRO™) 루비 염색 완충액(바이오-라드)으로 염색하였다. 버사독(VERSADOC™) 디지털 이미징 시스템(바이오-라드)을 이용하여 겔을 이미지화시키고 PDQUEST™ 소프트웨어(바이오-라드)로 분석하였다.
결과
TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에 대한 선택적인 내성의 유도. 인간의 유방암 세포주인 MDA-231 및 인간의 난소압 세포주인 UL-3C를 TRAIL-R2 내성 유도를 위해 선택하였다(항-TRAIL-R1(2E12) 및 항-TRAIL-R2(2B4) 항체를 사용하는 2색 유동 세포 분석법에 의해 결정할 때 이들이 높은 수준의 세포 표면 TRAIL-R1 및 -R2를 동시-발현시키기 때문에)(도 1A). 두 종양 세포주는 시험관내 세포독성 분석에 의해 결정할 때 작용제성 항-TRAIL 수용체 항체인 2E12 및 TRA-8, 및 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스에 대해 감수성이어서(도 1B), TRAIL의 두 수용체가 두 종양 세포주에서 작용성임을 나타내었다. 이들 종양 세포가 처리 후 TRA-8에 대한 아폽토시스 내성을 발생시키는지를 결정하기 위하여, TRA-8의 비-아폽토시스 투여량(1ng/ml)으로 2일간 처리하는 것으로부터 시작하여 TRA-8을 회수하기 전에 2,000ng/ml가 될 때까지 매 2일마다 투여량을 2배로 하여 세포를 처리하였다. 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포에 대해 각각의 투여량에서 세포 생존율을 측정하였다. 10ng/ml보다 낮은 TRA-8 투여량에서는, 처리된 세포 및 처리되지 않은 세포 둘 다에서 상당한 세포 사멸이 없었다. TRA-8 투여량이 50ng/ml 이상으로 증가되었을 때, 처리되지 않은 세포에서 TRA-8 투여량-의존성 세포 생존율의 감소가 관찰되었다. 대조적으로, 처리된 세포에서는 2000ng/ml까지 상당한 세포 사멸이 없었다(도 1C). 이들 결과는, TRA-8의 낮은 아폽토시스-비유도 투여량으로 종양 세포를 반복 처리한 결과 아폽토시스 내성이 유도되었고, 유도된 내성이 아폽토시스 민감성 세포를 제거함에 의한 선택 과정에 기인하지 않음을 나타낸다.
TRA-8을 회수한지 4주 후에, 두 모세포(MDA-231P, UL-3CP) 및 처리된 세포(MDA-231R, UL-3CR)를 TRA-8, 2E12 또는 TRAIL에 의해 유도되는 아폽토시스에 대한 감수성에 대해 시험하였다. 1,000ng/ml의 TRA-8로 처리한 후 모세포에서 거의 100%의 세포가 사멸한 것과는 대조적으로, 광범위한 농도의 TRA-8을 사용한 MDA-231R 및 UL-3CR 세포에서는 상당한 세포 사멸이 유도되지 않아서(도 2A), 세포가 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대해 고도로 내성이 되었음을 나타내었다. 대조적으로, 2E12-유도되는 아폽토시스에 대한 TRA-8 내성 종양 세포의 감수성은 변하지 않고 유지되었다(도 2B). 감수성이 감소됨에도 불구하고, 유도되는 TRA-8 내성 세포는 TRAIL-매개되는 아폽토시스에 대해 여전히 감수성이었다(도 2C). 이들 결과는 TRA-8-유도되는 아폽토시스 내성이 TRAIL-R2에 대해 선택적임을 나타낸다. TRA-8의 회수 후, 세포는 3개월 이상동안 TRA-8 내성 상태로 유지되었고, 그 후 4개월까지 감수성이 모세포의 약 30% 수준까지 서서히 회복되어(도 2D), TRA-8에 대한 유도된 내성이 장시간 지속되나 부분적으로 가역적임을 나타내었다.
유도되는 TRAIL-R2 내성은 TRAIL-R2의 변화된 세포 표면 발현 또는 돌연변이 또는 내재적인 아폽토시스 결함에 기인하지 않는다. TRA-8-유도되는 아폽토시스 내성이 TRAIL-R2에 대해 선택적이라는 것은 TRA-8 내성을 유도한 후 TRAIL-R2의 발현이 선택적으로 감소될 수 있거나 TRAIL-R2의 돌연변이가 발생할 수 있음을 나타낸다. 이러한 가능성을 제외시키기 위하여, TRAIL-R2의 세포 표면 발현을 시험하였으며, 모세포에 비해 두 TRA-8 내성 세포에서 TRAIL-R2의 발현 수준이 변화하지 않은 것으로 결정되었다(도 3A). 이 결과는 TRAIL-R2 단백질의 두 아이소형이 모세포 및 내성 세포에서 동일하게 발현됨(도 3A)을 보여주는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 추가로 확인되었다. 두 TRA-8 내성 세포주로부터 단리된 TRAIL-R2의 전체-길이 cDNA 클론의 서열을 결정하였고, 돌연변이는 확인되지 않았다. 이들 결과는, TRAIL-R2에 대한 유도된 선택적인 내성이 TRAIL-R2 자체의 변화에 기인한 것이 아님을 나타내었다.
아폽토시스의 억제제(IAP) 부류[박(Park) 등. 2002; 엔지(Ng) 등. 2002; 로아(Roa) 등. 2003; 큐민스(Cummins) 등. 2004; 리(Li) 등. 2004; 복브래더(Bockbrader) 등. 2005] 및 Bcl-2 부류[힌즈(Hinz) 등. 2000; 로클린(Rokhlin) 등. 2001; 펄다(Fulda) 등. 2002; 카티(Carthy) 등. 2003; 촐라-사카(Chawla-Sarkar) 등. 2004; 시니크로프(Sinicrope) 등. 2004] 같은 다수의 아폽토시스 조절 단백질에 의해 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스를 조절할 수 있다. 새롭게 개발된 단클론 항체의 패널을 프로브로 사용하여, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 cIAP1, cIAP2, XIAP, 서바이빈, Bcl-2, Bcl-xL 및 Bax의 발현의 단백질 수준을 검사하였다. MDA231 및 UL-3C가 이들 단백질을 가변적인 수준으로 발현하였지만, 모세포와 내성 세포 사이에 상당한 차이가 존재하지 않아(도 3A), 이들 단백질의 발현 수준이 TRA-8의 유도에 관련되지 않음을 나타내었다. 200개보다 많은 널리 공지되어 있는 아폽토시스-관련 유전자(도 3B, 상부 패널) 및 세포 신호 전달 유전자(도 3B, 하부 패널)를 포함하는 막 cDNA 어레이(수퍼어레이, 메릴랜드주 프레데릭)를 사용하여, 아폽토시스- 및 세포 신호 전달-관련 유전자의 패널 사이에서의 가능한 전사 변화에 대해 더욱 폭넓은 선별을 수행하였다. MDA 231 모세포와 내성 세포를 나란히 비교한 결과, TRA-8-내성 유도 후 이들 유전자의 발현 프로파일에는 상당한 변화가 없었음을 나타내었다.
TRA-8 내성 종양 세포에서 TRAIL-R2 아폽토시스 신호 변환의 선택적인 차단. 상류 카스파제 8 및 하류 카스파제 3의 연속적인 활성화는 TRAIL-R2 아폽토시스 신호 변환의 핵심적인 사건이다. 따라서, 이들 두 카스파제의 시간-의존성 활성화를 검사하였다. 앞서 나타낸 바와 같이, TRA-8로 TRA-8 민감성 MDA231 모세포를 처리하면, TRA-8 처리 후 카스파제의 절단된 단편의 발생에 의해 나타나는 바와 같이 카스파제 8(도 4A, 상부 패널) 및 카스파제 3(도 4A, 중간 패널)의 활성화가 유도되었다. 카스파제 활성화의 매우 민감한 마커로서, PARP가 신속하게 절단되었다(도 4A, 하부 패널). 그러나, 카스파제 8, 카스파제 3의 활성화 및 PARP의 후속 절단은 TRA-8 처리 후 내성 세포에서는 발생하지 않았다. 카스파제 활성화 캐스케이드의 실패는, 2E12-촉발된 TRAIL-R1 카스파제 활성화 캐스케이드가 TRA-8 내성 세포에서 손상되지 않았기(도 4A, 좌측 패널) 때문에, 카스파제 경로에서의 내재적인 결함에 기인하지 않는다. 이들 결과는 TRAIL-R2-관련 카스파제 캐스케이드가 TRA-8 내성의 유도 후 상류 카스파제 8의 수준에서 선택적으로 차단됨을 나타낸다.
JNK/p38 키나제 경로의 카스파제 8-의존성 활성화는 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에 중요한 상승작용성 역할을 한다[오츠카(Ohtsuka) 등. 2003; 오츠카 등. 2002]. TRA-8 처리 동안 JNK/p38 키나제의 포스포릴화의 웨스턴 블롯 분석에 의해 JNK/p38 키나제의 활성화를 측정하였다. 카스파제 8 활성화에 상응하게, JNK(도 4B, 상부 패널) 및 p38(도 4B, 하부 패널)이 시간-의존 방식으로 신속하게 포스포릴화되었다. 그러나, TRA-8 내성 세포에서는, 2E12만이 JNK/p38의 포스포릴화를 유도할 수 있고 TRA-8은 그렇지 못했던 바, JNK/p38 키나제 경로가 TRA-8-내성 세포에서 또한 선택적으로 억제됨을 나타내었다.
TRA-8-내성 종양 세포에서 TRAIL-R2 사멸 도메인 기능의 선택적인 차단. FADD 및 카스파제 8이 TRAIL-R2의 사멸 도메인에 동원되고 DISC의 주요 성분이기 때문에, TRAIL-R1 및 TRAIL-R2에서 DISC를 형성하는 능력을 동시-면역침전 분석법에 의해 모세포 및 내성 세포 둘 다에서 시험하였다. MDA231 모세포에서는, TRA-8 또는 2E12로 처리한 후, FADD(도 5A, 상부 패널) 및 카스파제 8(도 5A, 중간 패널)의 시간-의존적인 증가가 있었으며, 이들 둘을 각각 TRAIL-R2(도 5A, 좌측 패널) 또는 TRAIL-R1(도 5A, 우측 패널)과 동시-면역침전시켰다. TRA-8 내성 세포에서는, TRA-8-매개되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R2 동시-면역침전된 FADD 및 카스파제 8이 없었으나, 2E12 처리 후 TRAIL-R1과 FADD 및 카스파제 8의 동시-면역침전은 영향을 받지 않았다. 또한, 사멸 도메인에 대해 카스파제 8의 억제 경쟁자인 cFLIP가 DISC 형성의 차단에 일익을 담당하는지의 여부를 결정하기 위하여, TRAIL-R1 및 TRAIL-R2와 cFLIP의 동시-면역침전도 검사하였다. 유사한 시간-의존적인 패턴으로, cFLIP가 모세포에서는 TRA-8-매개되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R2와 동시-면역침전되었으나 내성 세포에서는 그러지 않았다(도 5A, 하부 패널). 2E12-매개되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R1과 cFLIP의 동시-면역침전은 모세포와 TRA-8 내성 세포 사이에서 상이하지 않았다. FADD, 카스파제 8 및 cFLIP의 전체 단백질 발현의 수준이 유사하기 때문에, 이들 사멸 도메인-회합된 단백질의 동원 실패는 이들 단백질의 발현 결함 때문이 아니다. 이들 결과는, 유도되는 TRA-8 내성이 TRA-8 처리 후 DISC의 생성에서 FADD 및 카스파제 8을 동원하는 TRAIL-R2의 선택적인 결함에 기인할 수 있음을 나타낸다.
TRA-8 내성 세포의 TRAIL-R2의 사멸 도메인에서 DISC의 어셈블리 실패는 TRAIL-R2 단백질 착체의 기능 및 조성이 변화됨을 나타내는데, 새롭게 발생되거나 기능이 변화된 단백질은 TRAIL-R2와 회합할 수 있고 TRAIL-R2의 사멸 도메인으로의 FADD 및 카스파제 8의 동원을 방지할 수 있다. 따라서, TRAIL-R2-회합된 단백질의 프로테옴 프로파일을 2차원 프로테옴 분석법 및 질량 분광분석법에 의해 TRA-8 처리 전후의 TRA-8-민감성 모세포 및 TRA-8-내성 MDA231 세포에서 비교하였다. TRAIL-R2와 동시-면역침전된 차이나게 발현된 단백질을 PDQuest 소프트웨어에 의해 분석한 결과, TRA-8-매개되는 아폽토시스 동안 모세포와 내성 세포 사이에서 변화된 3개의 반점에 초점이 맞춰졌다(도 5B). 각각 50kDa 또는 20kDa의 분자량을 가진 단백질 덩어리를 나타내는 반점 1 및 2는 TRA-8 처리 후 MAD-231 모세포에서만 나타났고, 처리되지 않은 세포 및 TRA-8-처리된 내성 세포에서는 나타나지 않아서, 이들 단백질이 TRA-8-매개되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R2에 동원될 수 있음을 나타내었다. 이들의 분자량 및 등전점에 기초하여, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 반점 1의 단백질은 카스파제 8인 것으로 확인되었고(도 5C), 반점 2는 FADD인 것으로 확인되었다(도 5D). 반점 3의 단백질은, TRAIL-R2와 일정하게 회합하고 TRA-8-매개되는 아폽토시스동안 보다 높은 분자량의 단백질로부터 더 낮은 분자량의 단백질로의 이동이 일어났기 때문에 흥미로웠다(도 5E). 이러한 전환은 TRA-8-처리된 MDA231 모세포에서만 관찰되고 내성 세포에서는 관찰되지 않았기 때문에 유도되는 TRA-8 내성에 관련된 것으로 보였다. 뿐만 아니라, 질량 분광분석법에 의해 두 반점이 DEAD-박스 RNA 헬리카제 부류의 구성원인 DDX3으로부터 유도되었음을 확인하였다. DDX3으로부터의 보다 높은 분자량이 TRA-8 내성 세포에서 TRAIL-R2와 일정하게 회합하였기 때문에, 이것이 TRAIL-R2의 사멸 도메인으로의 FADD 및 카스파제 8의 동원을 방지하는 인자일 수 있다.
화학요법 약제에 의한 TRA-8 내성의 제거. 화학요법 약제는 특히 TRA-8 내성 세포에서 시험관 및 생체 내에서 TRA-8-매개되는 아폽토시스를 상승작용적으로 향상시킨다(오츠카 등. 2003; 오츠카 등. 2002; 부흐스바움 등. 2003). 화학요법 약제가 유도된 TRA-8 내성을 제거할 수 있는지의 여부를 결정하기 위하여, 일군의 화학요법 약제, 즉 아드리아마이신, 텍솔, 시스플라틴 및 비스인돌릴말레이미드 VIII(Bis VIII)의 효과를 유도된 내성 세포의 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대해 시험하였다. 표시된 농도의 화학요법 약제의 존재하에서는 TRA-8 내성 MDA-231 및 UL-3C 세포에서 TRA-8 투여량-의존성 반응이 복원되어(도 6A), 모든 화학요법 약제가 TRA-8-유도되는 내성을 제거할 수 있음을 나타내었다. 아드리아마이신 및 TRA-8을 사용한 조합 처리 후 MAD-231 내성 세포에서 카스파제 활성화 캐스케이드를, 단클론 항-카스파제 항체의 패널을 사용하여 시험하였다. 항-카스파제 8(클론: 2F4) 및 항-카스파제 2(클론: 2A3)만이 각각 카스파제 8 및 2의 전구체를 인식하기 때문에, 절단으로 인해 감소된 양의 전구체에 의해 카스파제 8 및 2의 활성화를 입증하였다. 항-카스파제 9(클론: 4B4) 및 항-카스파제 3(클론: 1H6)은 각각 카스파제 9 및 3의 전구체 및 절단된 형태 둘 다를 인식하기 때문에, 카스파제 9 및 3의 절단된 단편의 존재에 의해 이들의 활성화를 볼 수 있었다. 4시간째에서 TRA-8(도 6B, 레인 5) 또는 아드리아마이신(도 6B, 레인 4)만을 사용한 단일 시약 처리는 처리되지 않은 대조용에 비해 모든 처리된 카스파제의 상당한 활성화를 유도하지 못하였다(도 6B, 레인 1). 대조적으로, 아드리아마이신 및 TRA-8을 사용한 조합 처리 후 1시간 정도로 빨리 카스파제 2, 9 및 3의 활성화가 유도되었으며(도 6B, 레인 2), 이는 4시간째에 더욱 향상되었다(도 6B, 레인 3). 카스파제 8의 활성화는 조합 처리 후 4시간째에 명백하였다. 이들 결과는 아드리아마이신을 사용한 처리에 의해 TRA-8 내성 세포에서 TRAIL-R2-관련 카스파제 캐스케이드가 복원되었음을 나타낸다. 아드리아마이신의 존재하에서, TRA-8은 FADD의 TRAIL-R2로의 동원을 촉발시킬 수 있었으며(도 6C, 레인 2 및 3), 아드리아마이신 처리에 의해 TRAIL-R2의 동원 기능이 회복되었다.
실시예 2: TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에서의 DDX3의 역할
물질 및 방법
세포주, 항체 및 시약. 인간의 유방암 세포주인 MDA-MB-231을 미국 종균 협회(ATCC)(버지니아주 마나사스)에서 구입하였다. 인간의 난소암 세포주인 UL-3C를 수득하였다. 10% 열-불활성화된 FCS, 50㎍/ml 스트렙토마이신 및 50U/mL 페니실린으로 보충된 DMEM 또는 RPMI1640(셀그로, 메디아텍, 인코포레이티드; 버지니아주 헌돈)에 세포를 유지시켰다. 항-인간 TRAIL-R1(클론: 2E12) 및 항-인간 TRAIL-R2(클론: TRA-8) 단클론 항체는 이미 기재된 바 있다(이치카와 등, 2003; 이치카와 등, 2001). 유동 세포 분석 및 면역침전 분석을 위한 항-인간 TRAIL-R2(클론: 2B4)를 개발하였다. 재조합 가용성 TRAIL을 알렉시스 바이오케미칼즈(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 다클론 항-카스파제 3 및 항-카스파제 8 항체를 비디 파민겐(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 단클론 항-인간 카스파제 2, 3, 8, 9 및 10 항체, 및 단클론 항-인간 Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cIAP-1, cIAP-2, XIAP 및 서바이빈 항체를 제조하였다. 항-PARP 항체를 셀 시그널링 테크놀로지, 인코포레이티드(매사추세츠주 베벌리)에서 구입하였다. 항-β-액틴 항체를 시그마에서 구입하였다. 항-FADD를 트랜스덕션 래보러토리즈(켄터키주 렉싱턴)에서 구입하였다. 모든 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-공액 2차 시약을 서던 바이오테크놀로지 어쏘시에이츠, 인코포레이티드(앨라배마주 버밍험)에서 구입하였다. 활성 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-10을 이엠디 바이오사이언시즈, 인코포레이티드(EMD Biosciences, Inc.)(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 형광 발생 펩타이드 유도체 Ac-Val-Asp-Val-Asp-AMC(Ac-VDVAD-AMC, 260060M001, 서열 번호: 40), Ac-Asp-Glu-Val-Asp-아미노-4-메틸쿠마린(Ac-DEVD-AMC, 260031M001, 서열 번호: 41) 및 Ac-카본일-Ile-Glu-Thr-Asp-7-아미도-4-메틸쿠마린(Z-IETD-AMC, 260042M001, 서열 번호: 42)을 알렉시스 바이오케미칼즈(캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. 카스파제-2, -3, -8, -10 저해제(FMKSP01)를 알앤드디 시스템즈, 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.)에서 구입하였다.
TRA-8, 2E12 및 TRAIL-매개되는 아폽토시스에 대한 종양 세포 감수성의 세포독성 분석: 8개 농도(1000ng/ml로부터 2배씩 연속 희석시킴)의 TRA-8, 2E12 또는 TRAIL을 함유하는 96개-웰 플레이트에 세포(웰 1개당 1,000개의 세포)를 접종하였다(웰 3개씩 1조). 제조업체의 지시(팩커드 인스트루먼츠, 코네티컷주 메리덴)에 따라 ATPLITE™ 분석법을 이용하여 하룻밤동안 배양한 후 세포 생존율을 결정하였다. 결과는 배지 대조용 웰과 비교한 처리된 웰에서의 생존 세포의 백분율로서 제공된다.
유동 세포 분석. 106개의 세포를 PBS로 1회 세척하고, 1차 항체(TRA-8 1㎍/ml)를 함유하는 차가운 FACS 완충액(5% FBS 및 0.01% NaN3를 함유하는 PBS) 1ml에 재현탁시켰다. 세포를 60분간 얼음 상에서 염색한 다음 차가운 FACS 완충액 3ml로 세척하고, 2차 항체(PE-공액 염소 항-마우스 IgG의 1:100 희석액)와 함께 4℃에서 60분간 암소에서 배양하였다. FACS 완충액 3ml로 추가로 세척한 후, FACSCAN 유동 세포 분석계(비디 바이오사이언시즈, 캘리포니아주 산호세)에 의해 샘플당 10,000개의 세포를 분석하였다.
아폽토시스-관련 단백질의 웨스턴 블롯 분석: 종양 세포(3×106개)를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 10mM Tris-HCl(pH 7.6), 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM EGTA, 0.1% SDS, 1mM 소듐 오르토바나데이트, 및 프로테아제 저해제의 혼합물(1mM 페닐메틸설폰일 플루오라이드, 1㎍/ml 펩스타틴 A, 2㎍/ml 아프로티닌)을 함유하는 용해 완충액 300㎕로 용해시켰다. 세포 용해물을 10초간 초음파처리하고, 12,000g에서 20분간 원심분리하였다. 동량의 전체 단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE 샘플 완충액과 함께 5분간 비등시켰다. 전체 세포 용해물을 8%, 10% 또는 12% SDS-PAGE에서 분리시키고, 전기 영동에 의해 나이트로셀룰로즈 막으로 전달하였다. TBST 완충액(20mM Tris-HCl(pH 7.4), 500mM NaCl 및 0.1% Tween 20)중 5% 탈지 드라이 밀크로 블롯을 차단하고, 차단 완충액중에서 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 블롯을 TBST로 3회 세척하고, HRP-공액 2차 항체를 프로브로 사용하여 실온에서 1시간동안 검사하였다. TBST로 4회 세척한 후, 제조업체의 지시에 따라 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템(애머샴 바이오사이언시즈)을 이용하여 검사된 단백질을 가시화시켰다.
DDX3의 저발현. 디자인 RNAi: 온라인 디자인 도구 BLOOK-iT RNAi 디자이너(인비트로젠)를 사용하여 DDX3에 대한 RNAi 표적을 확인하였다. 10개의 가장 높은 등급을 가진 RNAi 표적으로부터 5개의 표적화된 shRNA 서열을 선택하였다(표 2 참조).
Figure 112007063744274-pct00002
이어, 이들을 BLOCK-iT U6 엔트리 벡터 내로 클로닝하였다. U6 프로모터에 의해 shRNA를 구동시키고, 가장 분할되거나 분할되지 않은 포유동물 세포 유형에 일시적으로 발현시킬 수 있다. RNAi 응답을 위해 RNAi 사용된 리포펙타민(LIPOFECTAMINE) 2000(인비트로젠)으로 내성 세포를 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 36시간 후에 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 감소된 DDX3 발현이 결정되었다. 감소된 DDX3 발현이 달성된 후, siRNA 올리고를 합성하고[표적 서열: GGAGAAATTATCATGGGAAAC(서열 번호: 27): 센스 RNA 5'-Fl-GGAGAAATTATCATGGGAAAC(Fl-서열 번호: 27)(Fl=형광); 안티-센스 RNA 5'-GUUUCCCAUGAUAAUUUCUCC-3'(서열 번호: 28)], RNAi 대조용 올리고(RI-010-DP)를 몰레큘라(Molecula)(메릴랜드주 콜럼비아)에서 구입하였다.
발현 벡터의 생성. DDX-3의 N-말단에서 His 택을 가진 pcDNA3.1 플라스미드(인비트로젠) 내로 전체-길이 DDX3을 클로닝하였다. 하기 프라미어 쌍을 사용하여 MDA231 세포로부터 추출된 전체 RNA를 사용하여 수행되는 리버스 트랜스크립타제 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 DDX3 및 TRAIL-R2 cDNA를 생성시켰다: BamHI를 가진 DDX31 전진 프라이머: 5'-acggatccaaatgagtcatgtggcagtgga-3'(서열 번호: 29); XhoI를 가진 DDX3662 역전사 프라이머: 5'-ctctcgagcaaagcaggctcagttaccc-3'(서열 번호: 30). KpnI를 가진 TRAIL-R21 전진 프라이머: 5'-aaaggtaccagccatggaacaacggggacag-3'(서열 번호: 31); EcoV를 가진 TRAIL-R2441 역전사 프라이머: 5'-aaagatatcttaggacatggcagagtctgcatt-3'(서열 번호: 32); DDX3의 단리된 폴리머라제 연쇄 반응 단편을 pcDNA3.1-His 벡터(인비트로젠) 내로 짜맞추었다. TRAIL-R2 cDNA를 pshutter-CMV 벡터 내로 클로닝하였다. DNA 서열 결정에 의해 올바른 서열을 확인하였다.
BamHI 및 XhoI 부위 사이에서 DDX3 서열을 결실시킴으로써, DDX3/pcDNA3.1-His 발현 플라스미드를 생성시켰다. 하기 프라이머를 사용하여 TRAIL-R2 서열을 결실시킴으로써, BamHI를 가진 DDX3151 전진 프라미어: 5'-acggatccaaatgttttctggaggcaacactggg-3'(서열 번호: 33); TRAIL-R2/pshutter-CMV 발현 플라스미드를 생성시켰다: EcoRV를 가진 TRAIL-R2340 역전사 프라미어; 5'-aaagatatcttactgtctcagagtctcagtgggatc-3'(서열 번호: 34); EcoRV 및 XhoI를 가진 TRAIL-R2330 역전사 프라이머: 5'-aaagatatcctcgagatttgctggaaccagcagcct-3'(서열 번호: 35).
세균에서 DDX3 용 발현 플라스미드의 구축. DDX3 또는 cIAP1 단편을 TOPO100 벡터(인비트로젠) 내로 삽입하였다. 대수기까지 LB 배지에서 성장시키고 0.4mM 아이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노사이드로 3시간동안 유도시킨 이. 콜라이(E. coli) 균주 BL21(DE3) 내로 생성된 플라스미드를 변형시켰다. 세포를 펠렛화시키고, 용해 완충액(30mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1mM NaCl, 1mM DTT, 0.1mM EDTA, 1% 노니뎃 P-40 및 20㎍/ml PMSF)에 재현탁시킨 다음 초음파 처리하였다. 14,000×g에서 15분간 원심분리시킨 후의 상청액을 Ni 칼럼에 의해 정제시켰다. BCA 분석법[피어스(Pierce), 일리노이주 록포드]에 의해 단백질 농도를 결정하고, 분취량을 80℃에서 저장하였다.
293 또는 3 T3 세포의 일시적인 형질감염. 리포펙타민(LIPOFECTAMINE™) 2000(인비트로젠, 인코포레이티드)을 사용하여 293 또는 3T3 세포를 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 24시간 후, 개별적인 단클론 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석법에 의해 단백질 발현을 결정하였다. 동시-면역침전 분석을 위해, 프로테아제 저해제 칵테일을 함유하는 면역침전-용해 완충액으로 세포를 용해시켰다.
동시-면역침전 분석법. 항-DDX3 또는 항-TRAIL-R2 항체를 세파로즈 비이드(시그마)에 공액시켰다. 다음과 같이 TRAIL-R2 DISC의 조성을 결정하였다. 5×106개의 세포(달리 표시되지 않는 한)를 37℃에서 표시된 시간동안 TRA-8 500ng/ml로 처리한 다음, 면역침전-용해 완충액(20mM Tris-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 0.2% NONIDET P40 및 10% 글라이세롤, 및 완전 프로테아제 저해제 칵테일)에서 용해시키거나 또는 처리하지 않고(자극되지 않은 상태) 용해시켰다. 이어, 비이드 30㎕를 사용하여 4℃에서 하룻밤동안 TRAIL-R2 DISC를 침전시켰다. 면역침전 후, 비이드를 용해 완충액으로 4회 세척하였다. 이어, 비이드를 10mM Tris 완충액으로 5회 세척하고 SDS-PAGE 및 면역 블롯팅 분석법을 위해 로딩 완충액에 재현탁시켰다.
시험관내 카스파제 활성의 분석. 형광 측정 분석법을 96개-웰 투명 바닥 플레이트에서 수행하고, 모든 측정을 웰 3개씩 1조로 수행하였다. 분석 완충액(10mM HEPES pH 7.0, 50mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM EDTA 및 1mM DTT) 100㎕를 첨가하였다. 활성 카스파제-8 및 펩타이드 기질(Ac-IETD-AMC)을 각 웰에 100ng/㎕의 최종 농도로 첨가하였다. 동시 면역침전 용리된 분획을 첨가하여 반응을 개시시켰다. 분석 완충액, 기질 및 세포 용해물이 없는 용해 완충액을 함유하는 웰에서 기본 형광을 측정하였다. 분석 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 355nm 여기 및 440nm 방출로 설정된 형광 플레이트 판독기[바이오-텍(Bio-Tek), 버몬트주 위누스키] 상에서 형광을 측정하였다.
시험관내 카스파제 절단 분석. 시험관내 분석법에서 DDX3을 절단하는 카스파제의 능력을 시험하였다. TRAIL-R2 co-IP로부터의 용리된 분획 10ul, 반응 완충액(10mM HEPES [pH 7.0], 50mM NaCl, 2mM MgCl2, 5mM EGTA, 1mM DTT, 2mM ATP) 10ul 및 카스파제의 재조합 활성형 5ul(0.1U/㎕)를 포함시켜 37℃에서 30분동안 절단 반응을 수행하였다. 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 절단을 결정하였다.
결과
내성 세포에서 TRAIL-R2의 사멸 도메인의 차단을 야기하는, 후보 단백질 DDX3의 프로테옴 분석. 사멸 수용체를 표적화시키는 치료제, TRAIL 및 작용제성 항체에 대한 자발적으로 발생되거나 유도되는 아폽토시스 내성은 이들 약제를 사용하여 암을 효과적으로 치료하는데 있어서의 중요한 장애를 제공한다. 내성 세포에서 TRAIL-R2 사멸 도메인의 다른 조성물이 착화되는지의 여부를 결정하기 위하여, 기존 TRAIL-R2-회합된 단백질의 프로테옴 프로파일을 2차원 프로테옴 분석법 및 질량 분광분석법에 의해 TRA-8 처리 전 후에 TRA-8-민감성 모세포 및 TRA-8-내성 MDA 231 세포에서 비교하였다. 사이프로(SYPRO™) 루비(몰레큘라 프로브즈, 오리건주 유진)로 염색된 2차원 겔의 시험시, 약 80kDa 이하의 단백질 반점을 발견하였다. 이 단백질과 TRAIL-R2의 회합은 TRAIL-R2 DISC의 형성을 차단함으로써 TRA-8 내성을 야기한다. 80kd 이하의 단백질을 SDS-PAGE로부터 절제하고 트립신으로 소화시키고, 질량 분광분석법에 의해 펩타이드 서열을 분석하였다. 6개의 소화된 단편으로부터의 단백질 아미노산 서열은 인간의 DDX3의 젠뱅크 서열(표 3)과 100% 동일하여, TRA-8-유도되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R2로부터 유리된 DDX3이 DISC 생성과 상호관련되어 있음을 나타내었다. 이 단백질이 TRAIL-R2-회합된 단백질 착체와 회합된 상태로 유지되면, 이는 FADD 동원을 방지하고 DISC 형성의 실패를 야기할 수 있다.
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DDX3은 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에서의 신규의 TRAIL-R2-회합된 단백질이다. DDX3이 실제로 TRAIL-R2와 회합하는지의 여부를 결정하기 위하여, DDX3의 전체-길이(aa1-662), N-말단 단편(aa1-316) 및 C-말단 단편(aa310-662)을 N-말단에서 6-His 택을 가진 PCDNAIII3.1 내로 클로닝시켰다. 이들 발현 벡터를 MDA231 모세포 내로 형질감염시켜, DDX3의 재조합 전체-길이 및 결실 돌연변이의 과발현을 달성하였다. 그러나, DDX3의 N-말단 및 C-말단 결실 돌연변이가 아닌 전체-길이 DDX3만이, 동시-면역침전 분석 및 항-6-His 항체를 사용하는 후속 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 바와 같이(도 8A) TRAIL-R2와 회합하였다. 이들 결과는, TRAIL-R2와 회합된 DDX3 및 TRAIL-R2에 대한 그의 결합이 전체-길이 의존성임을 확인시켜 주었다. DDX3을 MDA231 세포에서 항-TRAIL-R2로 면역침전시켰다.
DDX3의 TRAIL-R2와의 회합을 추가로 확인하기 위하여, DDX3의 N-말단, C-말단 단편 및 전체-길이 버전을 이. 콜라이(E. coli)에서 발현시켰다. 단백질을 정제시키고 항원으로서 사용하여 DDX3에 대한 다클론 및 단클론 항체의 패널을 생성시켰다. 마우스 항-DDX3 단클론 항체를 사용하는 동시-면역침전 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 TRAIL-R2-회합된 DDX3을 검출하였다. 결과는, DDX3이 비-아폽토시스성 모세포 및 내성 세포 둘 다에서 TRAIL-R2와 동시-면역침전되었음을 나타내었다(도 7). 아폽토시스 동안 TRA-8-민감성 세포에서는 DDX3의 시간-의존성 감소가 있었으나, TRA-8-내성 세포에서는 아니었다. 또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해, TRA-8-유도되는 아폽토시스 동안 TRAIL-R2-회합된 DDX3의 급속한 감소 및 절단이 관찰되었다. 이는, DDX3의 절단이 카스파제-의존성임을 나타내었다. 이러한 결과에 기초하여, N-말단에서 가능한 절단 부위에 대하여 DDX3 서열을 세밀히 검사하였고, 아미노산 129-135에서 비교적 보존된 카스파제 절단 모티프 DKSDEDD(서열 번호: 46)를 발견하였다. 절단이 DISC 상에서 발생하고 그 결과 DDX3의 중요한 기능성 요소가 TRAIL-R2로부터 방출됨이 명백하다. 데이터는 뒤의 모델과 양립가능하였으며, 이는 개시된 카스파제가 TRAIL-R2에 신속하게 동원되어 DDX3을 용이하게 절단함을 암시한다. 또한, FADD 및 카스파제-8은 TRAIL-R2와 회합하고 TRAIL-R2에 동원되어 DISC를 형성하며, 이는 다시 카스파제 캐스케이드 활성화를 TRAIL-R2-회합된 DDX3 절단과 상호관련시키는데, 이는 특정 상황에서 DDX3이 아폽토시스 프로그램에 필수적임을 나타내고, TRAIL-R2와 회합하는 DDX3이 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스 내성에 관련됨을 보여준다.
TRAIL - R2 와 DDX3 의 상호작용 영역의 맵핑 . TRAIL-R2-매개되는 신호 변환에서 DDX3의 조절을 더욱 잘 이해하기 위하여, DDX3의 결실 돌연변이를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293A 세포를 사용하여, TRAIL-R2와 결합하는데 필요한 대략적인 DDX3 영역을 결정하였다(도 8A). TRA-8을 사용하는 동시-면역침전에 의해 재조합 DDX3 및 TRAIL-R2의 상호작용을 결정하였다. 전체-길이 DDX3, DDX3Δ201-662 또는 DDX3Δ1-400이 TRAIL-R2와 결합하였다. 그러나, DDX3Δ251-662 및 DDX3Δ1-350은 TRAIL-R2와 결합할 수 없으며(도 8A), 이는 DDX3이 TRAIL-R2에서 2개의 결합 모티프를 가짐을 나타낸다. 하나는 N-말단(aa200-250)에 위치하고; 다른 하나는 aa350-400에 인접해 있다. 동일한 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 상당한 양의 야생형 DDX3 및 DDX3의 결실 단편의 생성을 확인시켜 주는데, 이는 이러한 결과에 대한 설명으로서 단백질 발현의 차이를 배제한다.
DDX3은 TRAIL-R2와 영구적으로 회합하고, TRA-8-내성 세포에서 FADD 동원의 차단에 상호관련되어, TRAIL-R2-회합된 DDX3이 FADD의 동원을 방지함을 나타낸다. DDX3과 FADD는 TRAIL-R2를 통해 연결될 수 있다. DDX3과 FADD가 TRAIL-R2의 사멸 도메인에서 공통되는 결합 모티프를 공유하여 미리 결합된 DDX3이 FADD의 동원을 방해하는지 또는 두 결합 모티프가 서로 가까워서 미리 결합된 DDX3이 FADD의 동원을 방해하는지의 여부를 시험하기 위하여, TRAIL-R2에서의 DDX3-결합 도메인의 위치를 결정하였다. 전체-길이 TRAIL-R2, 및 사멸 도메인의 완전 결실을 비롯한 TRAIL-R2의 일련의 아미노-말단 도메인 결실을 코딩하는 벡터를 구축하였다(도 8B). DDX3의 기능을 평가하고 외인성 인간 TRAIL-R2를 배제하는 유사한 방법에서는, 쥣과의 섬유모세포 세포주인 NIH3T3을 인간의 TRAIL-R2 및 DDX3의 동시-발현을 위한 숙주 세포로서 선택하였다. 3T3 세포를 His-택을 가진 DDX3 및 전체-길이 TRAIL-R2, DDX3 및 TRAIL-R2의 일련의 결실 돌연변이, 및 DDX3 단독을 코딩하는 플라스미드로 동시-형질감염시켰다. TRA-8 염색을 이용하여 유동 세포 분석법에 의해 세포 표면 TRAIL-R2 발현을 검사하였다. 모든 형질감염된 세포가 유사한 수준의 세포 표면 TRAIL-R2를 나타내어(도 8B), 세포내 도메인의 결실이 세포 표면 TRAIL-R2를 변화시키지 않았음을 나타내었다. 또한, 모든 형질 감염된 세포는, 항-6-his 항체를 사용하는 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 바와 같이 유사한 수준의 재조합 DDX3을 발현시켰다. TRA-8과의 동시-면역침전 및 항-6-His 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 재조합 DDX3과 TRAIL-R2의 결실 돌연변이의 회합을 검사하였다(도 8B). TRAIL-R2와 DDX3의 상호작용은 TRAIL-R2의 사멸 도메인과 독립적이다. TRAIL-R2 결합 모티프를 더욱 정확하게 한정하기 위하여, TRAIL-R2의 추가적인 결실 돌연변이, D330 및 TRAIL-R2의 절단체(T300-330)를 구축하고(도 8C), DDX3을 사용하여 3T3 세포 내로 동시-형질감염시키며, 이들의 상호작용에 대해 분석하였다. 결과는, DDX3이 TRAIL-R2 사멸 도메인과 결합하지 않고 오히려 사멸 도메인(aa340-aa420)에 가까운 막 근접 영역(aa300-330)에 결합하였음을 나타내었다. 이는 DDX3이 TRAIL-R2 신호 전달에서 이미 알려진 사멸 도메인-회합된 단백질과는 상이한 역할을 함을 나타낸다. 또한, 이 영역은 TRAIL-R1 및 DcR2와 고도로 상동성이다(도 8D). 이들 데이터는 DDX3이 사멸 수용체 부류의 구성원과 회합되는 공통적인 어댑터 단백질임을 나타낸다.
DDX3은 CARD를 함유한다. 다음에는, DDX3의 구체적인 특성을 분석함으로써 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에서의 DDX3의 기능면에서의 중요성을 연구하였다. CARD를 함유하는 DEAD 박스 단백질 부류의 둘 이상의 RNA 헬리카제가 최근 확인되었다. 이들 RNA 헬리카제의 CARD는 아폽토시스의 조절제로서 작용한다. DDX3이 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스의 조절에서 중요한 역할을 하기 때문에, DEAD 박스 단백질 부류의 헬리카제의 구성원인 DDX3도 CARD를 가질 수 있으며, DDX3의 아폽토시스 억제 기능은 CARD에 직접적으로 의존할 수 있다. 따라서, DDX3이 CARD 단백질일 가능성을 시험하였다. 아미노산 정렬 분석은 MDA5 및 RIGI가 그러하듯이 DDX3이 aa50-aa150에서 보존된 작용 모티프를 함유함을 나타낸다. CARD는 동형 상호작용 모티프이다. CARD 함유 단백질은 이 도메인을 통해 서로 상호작용할 수 있다. DDX3이 신규의 고도로 보존된 CARD-함유 헬리카제이기 때문에, 이는 다른 CARD 단백질과 상호작용할 수 있다. CARD-함유 단백질인 cIAP1도 카스파제의 저해제로서 널리 간주되어 왔으며, TNFRI 및 TNFRII에 동원되어 TNTRI-매개되는 아폽토시스를 조절한다. 동시-면역침전 실험에서 항-DDX3 또는 항-TRAIL-R2 항체를 사용하여 DDX3이 cIAP1과 상호작용할 수 있는지의 여부를 시험하였다. TRA-8 미처리 모세포 및 내성 세포 둘 다에서 TRAIL-R2 동시 침전되고 DDX3 동시-면역침전되는 것에 의해 분석되는 바와 같이, cIAP1이 DDX3 및 TRAIL-R2 착체와 용이하게 동시-면역침전될 수 있는 것으로 결정되었다(도 8E). 그러나, cIAP1은 TRAIL-R2-DDX3 착체로부터 용이하게 방출되고, 이는 모세포에서 DDX3 절단과 상호관련되어 있다. 대조적으로, cIAP1 수준은 TRA-8 처리 후에 내성 세포에서 TRAIL-R2-DDX3 착체에서 증가하였다(도 8E). 이들 결과는 DDX3이 TRAIL-R2와 CIAP 1 사이의 연결자로서의 역할을 할 수 있음을 나타낸다.
넉다운 DDX3에 의한 내성 제거. TRAIL-R2 신호 전달에서의 DDX3의 역할을 연구하기 위하여, TRA8-유도되는 아폽토시스에서의 내인성 DDX3의 중요성을 시험하였다. DDX3이 TRA-8-유도되는 아폽토시스 동안 내성 세포에서 감소되지 않았기 때문에, 암 세포가 아폽토시스에 대해 감수성이 되도록 하는 데에는 감소된 DDX3 발현 수준이 요구될 수 있다. RNAi 방법을 이용하여 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에 대한 내성에서의 DDX3의 역할을 결정하였다. 온라인 디자인 도구인 블록-잇(BLOCK-IT™) RNAi 디자이너(인비트로젠)를 사용하여 DDX3에 대한 RNAi 표적을 확인하였다. 가장 높은 등급을 가진 10개의 RNAi 표적으로부터 5개의 표적화된 shRNA 서열을 선택하고 블록-잇(BLOCK-IT™) U6 엔트리 벡터 내로 클로닝하였다. TRA-8-내성 MDA231 세포를 5개의 RNAi 구조체로 형질감염시키고, 형질감염시킨지 48시간 후에 단클론 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 DDX3의 단백질 발현 수준을 결정하였다. 5개의 시험된 RNAi 구조체중 4개는 형질감염되지 않거나 GFP-형질감염된 대조용에 비해 DDX3 발현의 매우 효과적인(50% 이상 감소) 억제제였다(도 9A). 이들 구조체중 가장 효과적인 #2를, TRA-8-매개되는 아폽토시스에서 DDX3 넉다운의 효과를 분석하기 위해 선택하였다. 넉다운 DDX3 발현이 TRA-8-내성 세포에서 TRA-8 감수성을 제거하는지의 여부를 결정하기 위하여, TRA-8-내성 MDA231 세포를 형질감염된 세포의 표지자로서의 RNAi 벡터(구조체 #2) 및 GFP 발현 벡터로 동시-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후에, DDX3을 TRAIL-R2와 동시-면역침전시키고 항-DDX3 항체를 프로브로 사용하여 검사하였다. 예측된 바와 마찬가지로, DDX3의 발현이 대조용 세포에 비해 현저하게 감소하였다(도 9B). GFP-양성 세포를 분류해내고 다양한 농도의 TRA-8과 함께 하룻밤동안 배양하였다. ATPLITE 분석법을 이용한 결과, GFP 및 대조용 벡터로 형질감염된 MDA231 세포는 TRA-8 처리 후 아폽토시스를 일으키지 않아, 세포가 TRA-8에 대한 내성을 보유함을 나타내었다. 그러나, DDX3 RNAi 및 GFP로 동시-형질감염된 세포는 TRA-8 투여량-의존성 세포 사멸을 나타내었다(도 9C). TUNEL 염색을 이용하여, 상당수의 DDX3 넉다운 세포가 아폽토시스됨을 발견하였다(도 9D). 이들 결과는 DDX3 발현의 하향 조절이 TRA-8 내성을 제거함을 나타낸다. TRAIL-R2에 의해 매개되는 아폽토시스에서 DDX3의 인과 역할을 추가로 결정하기 위하여, 종양 세포의 패널에서 DDX3 발현을 감소시켰고, TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 이들의 감수성을 분석하였다. DDX3 RNAi는 외인성 DDX3의 양을 감소시켰고, 종양 세포의 패널(일부 자발적인 내성 세포 포함)에서 TRA-8-유도되는 아폽토시스를 향상시켰다(도 9E-F). 대조적으로, 대조용 올리고뉴클레오타이드로 형질감염된 세포는 통상적인 DDX3 발현을 나타내었고, TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 내성을 유지하였다(도 9E-F). 따라서, DDX3은 TRAIL-R2 신호 변환 장치의 중요한 성분이고, TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스에 대한 내성에 필수적이다.
DDX3 결합 영역이 없는 TRAIL-R2는 순-아폽토시스성이다. DDX3 결합 모티프가 TRAIL-R2의 사멸 도메인 기능을 조절하는 신규의 부정적인 조절 도메인을 나타내는지의 여부를 시험하기 위하여, 돌연변이 TRAIL-R2의 아폽토시스-유도 기능을 야생형 TRAIL-R2와 비교하였다. 사멸 도메인이 없는 TRAIL-R2로 형질감염된 세포는 TRA-8 처리에 응답하지 않는 것으로 나타났지만, 절단된 DDX3 결합 도메인을 가진 TRAIL-R2로 형질감염된 세포는 순-아폽토시스성인 것으로 나타났으며, 야생형 TRAIL-R2-형질감염된 세포에 비해 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대해 더욱 감수성이었다(도 10). TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스를 억제할 수 있는 DDX3의 억제 효과가 현저하였다. 이들 발견은 DDX3이 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스의 억제 조절자임을 나타낸다.
DDX3은 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스를 조절하는 CARD 단백질이다. TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 신호 변환을 자세히 조사하기 위하여, cIAP1으로의 결합에 필요한 영역을 평가하였다. CARD가 DDX3의 N 말단에 있고 cIAP1과 상호작용하는 것으로 추정되기 때문에, 이 영역은 cIAP1과의 결합을 담당할 수 있다. His-택을 가진 전체-길이 DDX3, DDX3Δ51-662, DDX3Δ101-662, DDX3Δ151-662 또는 DDX3Δ1-350을 코딩하는 플라스미드로 HEK293A 세포를 형질감염시켰다. 전체-길이 DDX3 및 C-말단 결실된 DDX3은 둘 다 cIAP1을 동시-면역침전시킬 수 있고, 처음 100개의 aa가 결실된 DDX3은 cIAP1을 동시-면역침전시킬 수 없었다(도 11A). 이들 결과는 DDX3의 N-말단 CARD가 cIAP1의 TRAIL-R2 착체로의 동원을 담당함을 확인시켜준다. 또한, cIAP1 결합 모티프가 절단 부위 앞에서 DDX3의 aa 50-100, aa129-135(DKSDEDD; 서열 번호: 46)에 위치함을 나타내었다. DDX3이 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스 동안 절단되면, cIAP1과의 DDX3 조합의 N-말단 단편이 TRAIL-R2 착체로부터 분리됨으로써, cIAP1의 억제를 경감시켜 사멸 신호를 전달한다. 따라서, DDX3은 cIAP1과 사멸 수용체를 커플링시켜 아폽토시스 내성을 야기하기 위한 후보이다.
이러한 개념을 더욱 입증하기 위하여, aa 1-150을 갖지 않는 우세한 부정적인 돌연변이 DDX3을 사용하였다. 이 돌연변이 DDX3ΔCARD(DDX3Δ151-662)는 cIAP1과 상호작용하지 못하지만, 여전히 TRAIL-R2와 결합할 수 있다(도 11B). 그러므로, DDX3Δ151-662가 TRAIL-R2와 결합하는 야생형 DDX3와 경쟁함으로써 내재적인 DDX3의 우세한 부정적인 억제제일 수 있는지의 여부를 평가하였다. 4가지 유형의 세포를 DDX3ΔCARD로 형질감염시켰다. 도 5B에 도시된 바와 같이, DDX3ΔCARD-형질감염된 세포는 내인성 전체-길이 DDX3과 비교하여 DDX3ΔCARD의 발현 수준이 더 높은 바, 절단된 DDX3이 TRAIL-R2 결합에 대해 내재적인 DDX3과 경쟁할 수 있음을 암시한다. 도 11B에 도시된 바와 같이, cIAP1은 항-DDX3 및 항-cIAP1 항체를 프로브로서 사용하여 검사된 TRAIL-R2-co-IP 및 웨스턴 블롯팅에 의해 분석된 바와 같이 전체-길이 DDX3과 동시-면역침전되었으나 DDX3ΔCARD와는 아니었다. 또한, ATPLITE 분석에 의해 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대한 형질감염된 세포의 감수성을 검사하였다. 전체-길이 재조합 DDX3의 발현은 모든 처리된 세포가 TRA-8 처리 후에 내성으로 유지되었기 때문에 TRA-8-매개되는 아폽토시스에 대한 감수성을 변화시키지 않았다. 그러나, 높은 수준의 DDX3ΔCARD를 발현시킨 TRA-8-내성 종양 세포는 TRAIL-R2 회합된 cIAP1을 하향 조절한 후 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 감수성을 다시 획득하였다. 이들 데이터는, TRA-8-유도되는-아폽토시스에 대한 cIAP1의 억제가 DDX3의 완전한 CARD에 의해 매개됨을 나타낸다. N-말단 CARD를 갖지 않는 DDX3은 TRA-8 내성을 부분적으로 제거하는 우세한 부정적인 억제제로서 작용할 수 있다. TRAIL-R2 회합된 착체 상의 DDX3 및 cIAP1의 수준에 의해 TRA-8-유도되는 아폽토시스에 대한 암 세포의 잠재적인 감수성을 조절할 수 있다.
TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 착체는 카스파제-8 활성화를 억제한다. 어느 수준의 DDX3이 카스파제-8 동원과 상호관련되어 있고 TRAIL-R2 DISC에서 처리되는 세포에 존재하는지를 시험하기 위하여 DDX3을 정량하였다. MDA231 및 UL-3C 모세포 및 내성 세포를 TRA-8로 4시간동안 처리하고, TRA-8과는 상이한 TRAIL-R2 에피토프를 인식하는 새로운 항-TRAIL-R2 단클론 항체(클론: 2B4)로 TRAIL-R2를 면역침전시켰다. TRAIL-R2/DDX3/cIAP1 착체를 비이드로부터 방출시켰고, TRAIL-R2-회합된 DDX3 및 cIAP1에 대하여 면역 블롯팅 및 항-DDX3 및 항-cIAP1 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA 분석을 수행하였다. ELISA 플레이트를 2B4 항-TRAIL-R2 항체로 코팅하여 면역침전된 TRAIL-R2를 포획하고, DDX3 (3E2) 및 cIAP1에 대한 특이적인 단클론 항체에 의해 DDX3 및 cIAP1을 측정하였다. 민감성 모세포 또는 유도된-내성 종양 세포를 TRA-8로 처리하면 TRAIL-R2 단백질 수준이 변화되지 않았다(도 12A). 그러나, TRAIL-R2-회합된 DDX3 수준은 민감성 세포 및 내성 세포 둘 다에서 TRA-8 처리에 의해 크게 변화되었다. 먼저, 처리되지 않은 내성 세포는 3E2 항-DDX3 항체에 의해 검출되는 바와같이 처리되지 않은 민감성 세포에 비해 더 높은 수준의 TRAIL-R2-회합된 DDX3을 발현하였다(도 12B). 중요하게는, TRA-8 처리 후, TRAIL-R2-회합된 DDX3은 TRA-8-내성 세포에서 크게 증가하였지만, 감수성 세포에서는 현저한 감소를 나타내었다. TRAIL-R2 착체중 cIAP1의 수준도 DDX3과 동일한 패턴으로 변화하였다(도 12C). 이들 결과는, DDX3의 CARD 도메인이 절단에 의한 아폽토시스 동안 TRA-8-민감성 세포에서 TRAIL-R2 착체로부터 절단됨으로써 방출되는데 반해, DDX3 및 cIAP1이 실제로는 민감성 세포보다는 내성 세포에서 TRA-8 자극시 TRAIL-R2로 더욱 효율적으로 동원됨을 암시한다.
기능성 DISC를 생성시키기 위하여, 암 세포가 TRAIL-R2 착체로부터 cIAP1을 방출시켜 TRA-8-유도되는 아폽토시스 동안 카스파제의 억제를 감소시키는 것이 필수적이다. 이 과정은 DDX3의 절단을 필요로 하여, 이 단계가 공급물-전진 아폽토시스 증폭 루프를 개시하는데 중요함을 나타낸다. 절단에 대한 TRAIL-R2-회합된 DDX3의 내성이 내성 세포에서 DISC 생성 실패와 관련있기 때문에, TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 착체에서의 DDX3 절단 감수성은 모세포와 내성 세포에서 상이하다. 상이한 카스파제에 의한 TRAIL-R2-회합된 DDX3 절단 가능성을 두 세포에서 분석하였다. TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 착체를 항-TRAIL-R2 항체와 동시 면역침전시켰다. 비이드로부터 용리된 분획을 황성 카스파제-2 및 -8과 함께 배양하였다. 항-DDX3 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 DDX3의 절단을 검출하였다. ELISA 분석(도 12E)과 함께 이들 결과는, 카스파제-2가 두 세포 모두에서 유사한 프로테아제 잠재력을 나타냄에도 불구하고 내성 세포에서 카스파제-8에 의한 DDX3 절단이 민감성 세포에 비해 상당히 약해졌음을 나타내었다. 이들 결과는, TRA-8-민감성 세포 및 -내성 세포 사이에 DDX3 착체의 기능 차이가 있음을 나타낸다. 또한, 사멸 수용체-회합된 초기 카스파제에 의한 DDX3의 절단 실패가 TRA-8 내성의 개발에 핵심적인 단계임도 나타낸다.
유도된 내성 세포에서 DDX3의 절단이 억제되기 때문에, DDX3이 TRAIL-R2-매개되는 아폽토시스를 억제하는 아폽토시스 신호 전달에서의 단계를 결정하는 연구가 앞당겨졌다. DDX3/cIAP1 착체는 카스파제-8 활성화를 억제할 것으로 예측되었으며; 따라서 수용체 촉발 후 최초의 검출가능한 현상중 하나로서 TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 착체에서의 카스파제-8의 활성화를 시험하였다. 카스파제-8 활성화에 대한 TRAIL-R2-DDX3-cIAP1 착체의 효과를 평가하기 위하여, 민감성 모세포 또는 유도된 내성 세포로부터의 활성 카스파제-8 및 DDX3 co-IP 용리된 분획과 함께 배양된 플루오로페닉(fluorofenic) 기질 Ac-IETD-AMC를 사용하여 카스파제 활성을 측정하였다. 민감성 세포에 비해 내성 세포로부터의 TRAIL-R2 co-IP 용리된 분획에서의 광범위한 희석에 걸쳐 카스파제-8 활성의 투여랑-의존성 억제가 관찰되었다. 또한, 정제된 cIAP1도 카스파제-8 프로테아제 활성을 완전히 억제하였다(도 12F). DDX3-회합된 cIAP1이 카스파제-8의 초기 활성화의 억제제이고, 이에 의해 DDX3의 절단을 방지할 수 있다. 따라서, 이들 데이터는 DDX3-cIAP1이 카스파제-8 활성을 조절할 수 있고 DDX3-cIAP1이 TRAIL-R2에 의해 결합되는 카스파제-8의 특이적인 조절자라는 직접적인 증거를 제공하였다.
카스파제 분석에 의한 DDX3의 절단과 함께 cIAP1-저해되는 카스파제-8의 직접적인 분석에 의해, 카스파제-8 활성에 대한 TRAIL-R2-DDX3-cIAP1의 효과를 시험하였고, DDX3-cIAP1이 또한 카스파제 저해제의 신규 유형으로서 작용함을 보여주었다. DDX3-cIAP1 착체는 카스파제-8의 활성화를 억제함으로써 사멸 수용체 순-아폽토시스성 신호를 저지할 수 있으며, 이에 의해 초기 카스파제에 의한 TRAIL-R2-회합된 DDX3의 절단을 억제할 수 있다. 이 모델은 DDX3이 cIAP1의 동원을 통한 TRA-8-유도되는 아폽토시스로부터 세포를 보호하고 암 세포에서 사멸 신호 전달 경로의 차단에 기여함을 보여준다.
실시예 3: N-말단 영역에서 세린 포스포릴화에 의한 DDX3 의 DR5 로의 결합의 조절
바이오인포매틱스(bioinformatics) 연구는 GSK3의 가능한 기질에 대해 보존된 DDX3의 세린-풍부 도메인(서열 번호: 26의 아미노산 70 내지 90에 상응하는 서열 번호: 20)을 확인하기에 이르렀다(도 13A). GSK-3의 가장 우수한 두 기질인 β-카테닌 및 글라이코겐 신테타제에 비해, DDX3은 개시 부위에 5개의 연속적인 세린 N-말단을 가진다. DDX3이 GSK3에 대한 기질임을 뒷받침하는 몇 가지 계열의 증거가 있다: (1) DDX3은 GSK3α와 DDX3의 동시-면역침전에 의해 입증되는 바와 같이 GSK3α와 직접 회합하고, GSK3은 DDX3을 포스포릴화시킬 수 있음(도 13B); (2) GSK3은 Ser90에서의 점 돌연변이를 가진 DDX3을 포스포릴화시키지 못함(도 13C); (3) Ser90 돌연변이 DDX3은 TRA-8-매개되는 아폽토시스 동안 DR5로부터의 해리 및 절단이 증가됨(도 13D). 이들 결과는 DDX3의 N-말단에서의 세린-풍부 도메인이 DR5와의 DDX3 회합에 조절 역할을 함을 보여준다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 개시된 방법 및 조성물이 속하는 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 그에 상응하는 임의의 방법 및 물질을 본 방법 및 조성물의 실행 또는 시험에 사용할 수 있기는 하지만, 특히 유용한 방법, 장치 및 물질은 기재된 바와 같다. 본원에 인용된 문헌 및 이들이 인용하는 물질은 본원에 참고로 인용된다. 본 발명에서는 종래 기술의 발명에 의한 이러한 개시내용이 본 발명에 선행함을 인정하는 것으로 간주되어서는 안된다. 참조문헌의 논의는 그 저자가 주장한 것을 언급한 것이며, 본 출원인은 인용된 문헌의 정확성 및 타당성에 도전할 권리를 가진다. 다수의 문헌이 본원에 인용되어 있으나, 이들 참조문헌에 의해 이들 문헌중 임의의 것이 당해 분야의 통상적인 상식의 일부를 구성함이 인정되는 것은 아님을 명백히 알 것이다.
본 명세서의 상세한 설명 및 청구의 범위 전체에서, 용어 "포함하다" 및 "포함하는" 및 "포함한" 같은 이 용어의 변형은 "포함하지만 한정되지는 않는"의 의미이고, 예컨대 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하고자 하지는 않는다.
당해 분야의 숙련자는 통상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 실시양태에 대한 다수의 등가물을 알 것이고 또한 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 첨부된 청구의 범위에 의해 포괄하고자 한다.
참조문헌
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SEQUENCE LISTING <110> THE UAB RESEARCH FOUNDATION ZHOU, Tong KIMBERLY, Robert P. <120> AGENTS AND METHODS RELATED TO REDUCING RESISTANCE TO APOPTOSIS-INDUCING DEATH RECEPTOR AGONISTS <130> 21085.0132P1 <160> 46 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 1 His Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr Val His 1 5 10 15 Arg <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 2 Asp Phe Leu Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 3 Asp Leu Leu Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 4 Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; 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note = synthetic construct <400> 16 caccgctgat cggatgttgg atatgcgaac atatccaaca tccgatcagc 50 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 17 aaaagctgat cggatgttgg atatgttcgc atatccaaca tccgatcagc 50 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 18 Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 19 Ser Val Pro Pro Ser Pro Ser Gly Ser Gln Ala Ser Ser Pro Gln Ser 1 5 10 15 Ser <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 20 Ser Ser Phe Gly Ser Arg Ser Asp Ser Arg Gly Lys Ser Ser Phe Phe 1 5 10 15 Ser Asp Arg Gly Ser 20 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 21 Asp Glu Ala Asp 1 <210> 22 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 22 Met Glu Gln Arg Gly Gln Asn Ala Pro Ala Ala Ser Gly Ala Arg Lys 1 5 10 15 Arg His Gly Pro Gly Pro Arg Glu Ala Arg Gly Ala Arg Pro Gly Leu 20 25 30 Arg Val Pro Lys Thr Leu Val Leu Val Val Ala Ala Val Leu Leu Leu 35 40 45 Val Ser Ala Glu Ser Ala Leu Ile Thr Gln Gln Asp Leu Ala Pro Gln 50 55 60 Gln Arg Val Ala Pro Gln Gln Lys Arg Ser Ser Pro Ser Glu Gly Leu 65 70 75 80 Cys Pro Pro Gly His His Ile Ser Glu Asp Gly Arg Asp Cys Ile Ser 85 90 95 Cys Lys Tyr Gly Gln Asp Tyr Ser Thr His Trp Asn Asp Leu Leu Phe 100 105 110 Cys Leu Arg Cys Thr Arg Cys Asp Ser Gly Glu Val Glu Leu Ser Pro 115 120 125 Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Val Cys Gln Cys Glu Glu Gly Thr Phe 130 135 140 Arg Glu Glu Asp Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Arg Thr Gly Cys 145 150 155 160 Pro Arg Gly Met Val Lys Val Gly Asp Cys Thr Pro Trp Ser Asp Ile 165 170 175 Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Thr Lys His Ser Gly Glu Ala Pro 180 185 190 Ala Val Glu Glu Thr Val Thr Ser Ser Pro Gly Thr Pro Ala Ser Pro 195 200 205 Cys Ser Leu Ser Gly Ile Ile Ile Gly Val Thr Val Ala Ala Val Val 210 215 220 Leu Ile Val Ala Val Phe Val Cys Lys Ser Leu Leu Trp Lys Lys Val 225 230 235 240 Leu Pro Tyr Leu Lys Gly Ile Cys Ser Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu 245 250 255 Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu 260 265 270 Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser 290 295 300 Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser 305 310 315 320 Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn Glu Gly Asp Pro Thr Glu 325 330 335 Thr Leu Arg Gln Cys Phe Asp Asp Phe Ala Asp Leu Val Pro Phe Asp 340 345 350 Ser Trp Glu Pro Leu Met Arg Lys Leu Gly Leu Met Asp Asn Glu Ile 355 360 365 Lys Val Ala Lys Ala Glu Ala Ala Gly His Arg Asp Thr Leu Tyr Thr 370 375 380 Met Leu Ile Lys Trp Val Asn Lys Thr Gly Arg Asp Ala Ser Val His 385 390 395 400 Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Thr Leu Gly Glu Arg Leu Ala Lys Gln 405 410 415 Lys Ile Glu Asp His Leu Leu Ser Ser Gly Lys Phe Met Tyr Leu Glu 420 425 430 Gly Asn Ala Asp Ser Ala Met Ser 435 440 <210> 23 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 23 Gly Gly Gly Gly Asp Pro Glu Arg Val Asp Arg Ser Ser Gln Arg Pro 1 5 10 15 Gly Ala Glu Asp Asn Val Leu Asn Glu Ile Val Ser Ile Leu Gln Pro 20 25 30 Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala Glu Pro 35 40 45 Thr Gly Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu 50 55 60 Pro Ala Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala 65 70 75 80 Asn Gly Asp Pro Thr Glu Thr Leu Arg Gln 85 90 <210> 24 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 24 Gln Pro Thr Gln Val Pro Glu Gln Glu Met Glu Val Gln Glu Pro Ala 1 5 10 15 Glu Pro Thr Gly Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu 20 25 30 <210> 25 <211> 3408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 25 ctttcccctt actccgctcc cctcttttcc ctccctctcc tccccttccc tctgttctct 60 cctcctcttc ccctcccctc ccccgtccgg ggcactctat attcaagcca ccgtttcctg 120 cttcacaaaa tggccaccgc acgcgacacc tacggtcacg tggcctgccg ccctctcagt 180 ttcgggaatc tgcctagctc ccactaaggg gaggctaccc gcggaagagc gagggcagat 240 tagaccggag aaatcccacc acatctccaa gcccgggaac tgagagagga agaagagtga 300 aggccagtgt taggaaaaaa aaaaacaaaa acaaaaaaaa cgaaaaacga aagctgagtg 360 catagagttg gaaaggggag cgaatgcgta aggttggaaa ggggggcgaa gaggcctagg 420 ttaacatttt caggcgtctt agccggtgga aagcgggaga cgcaagttct cgcgagatct 480 cgagaactcc gaggctgaga ctagggtttt agcggagagc acgggaagtg tagctcgaga 540 gaactgggac agcatttcgc accctaagct ccaaggcagg actgctaggg gcgacaggac 600 taagtaggaa atcccttgag cttagacctg agggagcgcg cagtagccgg gcagaagtcg 660 ccgcgacagg gaattgcggt gtgagaggga gggcacacgt tgtacgtgct gacgtagccg 720 gctttccagc gggtatatta gatccgtggc cgcgcggtgc gctccagagc cgcagttctc 780 ccgtgagagg gccttcgcgg tggaacaaac actcgcttag cagcggaaga ctccgagttc 840 tcggtactct tcagggatga gtcatgtggc agtggaaaat gcgctcgggc tggaccagca 900 gtttgctggc ctagacctga actcttcaga taatcagagt ggaggaagta cagccagcaa 960 agggcgctat attcctcctc atttaaggaa ccgagaagct actagaggtt tctacgataa 1020 agacagttca gggtggagtt ctagcaaaga taaggatgcg tatagcagtt ttggatctcg 1080 tagtgattca agagggaagt ctagcttctt cagtgatcgt ggaagtggat caaggggaag 1140 gtttgatgat cgtggacgga gtgattacga tggcattggc agccgtggtg acagaagtgg 1200 ctttggcaaa tttgaacgtg gtggaaacag tcgctggtgt gacaaatcag atgaagatga 1260 ttggtcaaaa ccactcccac caagtgaacg cttggaacag gaactctttt ctggaggcaa 1320 cactgggatt aattttgaga aatacgatga cattccagtt gaggcaacag gcaacaactg 1380 tcctccacat attgaaagtt tcagtgatgt tgagatggga gaaattatca tgggaaacat 1440 tgagcttact cgttatactc gcccaactcc agtgcaaaag catgctattc ctattatcaa 1500 agagaaaaga gacttgatgg cttgtgccca aacagggtct ggaaaaactg cagcatttct 1560 gttgcccatc ttgagtcaga tttattcaga tggtccaggc gaggctttga gggccatgaa 1620 ggaaaatgga aggtatgggc gccgcaaaca atacccaatc tccttggtat tagcaccaac 1680 gagagagttg gcagtacaga tctacgaaga agccagaaaa ttttcatacc gatctagagt 1740 tcgtccttgc gtggtttatg gtggtgccga tattggtcag cagattcgag acttggaacg 1800 tggatgccat ttgttagtag ccactccagg acgtctagtg gatatgatgg aaagaggaaa 1860 gattggatta gacttttgca aatacttggt gttagatgaa gctgatcgga tgttggatat 1920 ggggtttgag cctcagattc gtagaatagt cgaacaagat actatgcctc caaagggtgt 1980 ccgccacact atgatgttta gtgctacttt tcctaaggaa atacagatgc tggctcgtga 2040 tttcttagat gaatatatct tcttggctgt aggaagagtt ggctctacct ctgaaaacat 2100 cacacagaaa gtagtttggg tggaagaatc agacaaacgg tcatttctgc ttgacctcct 2160 aaatgcaaca ggcaaggatt cactgacctt agtgtttgtg gagaccaaaa agggtgcaga 2220 ttctctggag gatttcttat accatgaagg atacgcatgt accagcatcc atggagaccg 2280 ttctcagagg gatagagaag aggcccttca ccagttccgc tcaggaaaaa gcccaatttt 2340 agtggctaca gcagtagcag caagaggact ggacatttca aatgtgaaac atgttatcaa 2400 ttttgacttg ccaagtgata ttgaagaata tgtacatcgt attggtcgta cgggacgtgt 2460 aggaaacctt ggcctggcaa cctcattctt taacgagagg aacataaata ttactaagga 2520 tttgttggat cttcttgttg aagctaaaca agaagtgccg tcttggttag aaaacatggc 2580 ttatgaacac cactacaagg gtagcagtcg tggacgttct aagagtagca gatttagtgg 2640 agggtttggt gccagagact accgacaaag tagcggtgcc agcagttcca gcttcagcag 2700 cagccgcgca agcagcagcc gcagtggcgg aggtggccac ggtagcagca gaggatttgg 2760 tggaggtggc tatggaggct tttacaacag tgatggatat ggaggaaatt ataactccca 2820 gggggttgac tggtggggta actgagcctg ctttgcagta ggtcaccctg ccaaacaagc 2880 taatatggaa accacatgta acttagccag actatacctt gtgtagtttc aagaactcgc 2940 agtacattac cagctgtgat tctccactga aatttttttt ttaagggagc tcaaggtcac 3000 aagaagaaat gaaaggaaca atcagcagcc ctgttcagaa ggatcatgct catctgtgga 3060 gcaagtgccc ccatgaaatg ccatattttg tgaagaaagt gcatgcagga atattcaggg 3120 agtccagcat gtagtcatgg cagccttagg tatttgagac cgaccaaccc tcctgatgaa 3180 gacaaccata actcatgcag aacttggagc gtgatgccca gaagtgtgtg aactggtctg 3240 tgaccacaaa gatgagaacc gcatgctgag attggtggaa tggagatttc agtgagccta 3300 catgcagatg acatggtgac acccgtgccc agcctgagct gttttcttct ggccctctta 3360 ttacatgaga aaaataaaca cctatgcacc ttggcctcaa aaaaaaaa 3408 <210> 26 <211> 662 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 26 Met Ser His Val Ala Val Glu Asn Ala Leu Gly Leu Asp Gln Gln Phe 1 5 10 15 Ala Gly Leu Asp Leu Asn Ser Ser Asp Asn Gln Ser Gly Gly Ser Thr 20 25 30 Ala Ser Lys Gly Arg Tyr Ile Pro Pro His Leu Arg Asn Arg Glu Ala 35 40 45 Thr Arg Gly Phe Tyr Asp Lys Asp Ser Ser Gly Trp Ser Ser Ser Lys 50 55 60 Asp Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Phe Gly Ser Arg Ser Asp Ser Arg Gly 65 70 75 80 Lys Ser Ser Phe Phe Ser Asp Arg Gly Ser Gly Ser Arg Gly Arg Phe 85 90 95 Asp Asp Arg Gly Arg Ser Asp Tyr Asp Gly Ile Gly Ser Arg Gly Asp 100 105 110 Arg Ser Gly Phe Gly Lys Phe Glu Arg Gly Gly Asn Ser Arg Trp Cys 115 120 125 Asp Lys Ser Asp Glu Asp Asp Trp Ser Lys Pro Leu Pro Pro Ser Glu 130 135 140 Arg Leu Glu Gln Glu Leu Phe Ser Gly Gly Asn Thr Gly Ile Asn Phe 145 150 155 160 Glu Lys Tyr Asp Asp Ile Pro Val Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro 165 170 175 Pro His Ile Glu Ser Phe Ser Asp Val Glu Met Gly Glu Ile Ile Met 180 185 190 Gly Asn Ile Glu Leu Thr Arg Tyr Thr Arg Pro Thr Pro Val Gln Lys 195 200 205 His Ala Ile Pro Ile Ile Lys Glu Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala 210 215 220 Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Ser 225 230 235 240 Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys Glu 245 250 255 Asn Gly Arg Tyr Gly Arg Arg Lys Gln Tyr Pro Ile Ser Leu Val Leu 260 265 270 Ala Pro Thr Arg Glu Leu Ala Val Gln Ile Tyr Glu Glu Ala Arg Lys 275 280 285 Phe Ser Tyr Arg Ser Arg Val Arg Pro Cys Val Val Tyr Gly Gly Ala 290 295 300 Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cys His Leu Leu 305 310 315 320 Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met Glu Arg Gly Lys Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met 340 345 350 Leu Asp Met Gly Phe Glu Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val Glu Gln Asp 355 360 365 Thr Met Pro Pro Lys Gly Val Arg His Thr Met Met Phe Ser Ala Thr 370 375 380 Phe Pro Lys Glu Ile Gln Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr 385 390 395 400 Ile Phe Leu Ala Val Gly Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu Asn Ile Thr 405 410 415 Gln Lys Val Val Trp Val Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu 420 425 430 Asp Leu Leu Asn Ala Thr Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Phe Val 435 440 445 Glu Thr Lys Lys Gly Ala Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu 450 455 460 Gly Tyr Ala Cys Thr Ser Ile His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg 465 470 475 480 Glu Glu Ala Leu His Gln Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ile Leu Val 485 490 495 Ala Thr Ala Val Ala Ala Arg Gly Leu Asp Ile Ser Asn Val Lys His 500 505 510 Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr Val His Arg 515 520 525 Ile Gly Arg Thr Gly Arg Val Gly Asn Leu Gly Leu Ala Thr Ser Phe 530 535 540 Phe Asn Glu Arg Asn Ile Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu Asp Leu Leu 545 550 555 560 Val Glu Ala Lys Gln Glu Val Pro Ser Trp Leu Glu Asn Met Ala Tyr 565 570 575 Glu His His Tyr Lys Gly Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ser Ser Arg 580 585 590 Phe Ser Gly Gly Phe Gly Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala 595 600 605 Ser Ser Ser Ser Phe Ser Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly 610 615 620 Gly Gly Gly His Gly Ser Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly 625 630 635 640 Gly Phe Tyr Asn Ser Asp Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly 645 650 655 Val Asp Trp Trp Gly Asn 660 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 27 ggagaaatta tcatgggaaa c 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 28 guuucccaug auaauuucuc c 21 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 29 acggatccaa atgagtcatg tggcagtgga 30 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 30 ctctcgagca aagcaggctc agttaccc 28 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 31 aaaggtacca gccatggaac aacggggaca g 31 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 32 aaagatatct taggacatgg cagagtctgc att 33 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 33 acggatccaa atgttttctg gaggcaacac tggg 34 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 34 aaagatatct tactgtctca gagtctcagt gggatc 36 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 35 aaagatatcc tcgagatttg ctggaaccag cagcct 36 <210> 36 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 36 Val Asn Met Leu Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala 1 5 10 15 Glu Ala Glu Arg Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 20 25 30 <210> 37 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 37 Tyr Thr Arg Pro Thr Pro Val Gln Lys His Ala Ile Pro Ile Ile Lys 1 5 10 15 Glu Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr 20 25 30 Ala Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Ile Tyr Ser Asp Gly Pro 35 40 45 Gly Glu Ala 50 <210> 38 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 38 Val Tyr Gly Gly Ala Asp Ile Gly Gln Gln Ile Arg Asp Leu Glu Arg 1 5 10 15 Gly Cys His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg Leu Val Asp Met Met 20 25 30 Glu Arg Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys Tyr Leu Val Leu Asp 35 40 45 Glu Ala Asp 50 <210> 39 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 39 Phe Ser Gly Gly Asn Thr Gly Ile Asn Phe Glu Lys Tyr Asp Asp Ile 1 5 10 15 Pro Val Glu Ala Thr Gly Asn Asn Cys Pro Pro His Ile Glu Ser Phe 20 25 30 Ser Asp Val Glu Met Gly Glu Ile Ile Met Gly Asn Ile Glu Leu Thr 35 40 45 Arg Tyr Thr Arg Pro Thr Pro Val Gln Lys His Ala Ile Pro Ile Ile 50 55 60 Lys Glu Lys Arg Asp Leu Met Ala Cys Ala Gln Thr Gly Ser Gly Lys 65 70 75 80 Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Ile Leu Ser Gln Ile Tyr Ser Asp Gly 85 90 95 Pro Gly Glu Ala Leu Arg Ala Met Lys Glu Asn Gly Arg Tyr Gly Arg 100 105 110 Arg Lys Gln Tyr Pro Ile Ser Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu 115 120 125 Ala Val Gln Ile Tyr Glu Glu Ala Arg Lys Phe Ser Tyr Arg Ser Arg 130 135 140 Val Arg Pro Cys Val Val Tyr Gly Gly Ala Asp Ile Gly Gln Gln Ile 145 150 155 160 Arg Asp Leu Glu Arg Gly Cys His Leu Leu Val Ala Thr Pro Gly Arg 165 170 175 Leu Val Asp Met Met Glu Arg Gly Lys Ile Gly Leu Asp Phe Cys Lys 180 185 190 Tyr Leu Val Leu Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp Met Gly Phe Glu 195 200 205 Pro Gln Ile Arg Arg Ile Val Glu Gln Asp Thr Met Pro Pro Lys Gly 210 215 220 Val Arg His Thr Met Met Phe Ser Ala Thr Phe Pro Lys Glu Ile Gln 225 230 235 240 Met Leu Ala Arg Asp Phe Leu Asp Glu Tyr Ile Phe Leu Ala Val Gly 245 250 255 Arg Val Gly Ser Thr Ser Glu Asn Ile Thr Gln Lys Val Val Trp Val 260 265 270 Glu Glu Ser Asp Lys Arg Ser Phe Leu Leu Asp Leu Leu Asn Ala Thr 275 280 285 Gly Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Phe Val Glu Thr Lys Lys Gly Ala 290 295 300 Asp Ser Leu Glu Asp Phe Leu Tyr His Glu Gly Tyr Ala Cys Thr Ser 305 310 315 320 Ile His Gly Asp Arg Ser Gln Arg Asp Arg Glu Glu Ala Leu His Gln 325 330 335 Phe Arg Ser Gly Lys Ser Pro Ile Leu Val Ala Thr Ala Val Ala Ala 340 345 350 Arg Gly Leu Asp Ile Ser Asn Val Lys His Val Ile Asn Phe Asp Leu 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Glu Glu Tyr Val His Arg Ile Gly Arg Thr Gly Arg 370 375 380 Val Gly Asn Leu Gly Leu Ala Thr Ser Phe Phe Asn Glu Arg Asn Ile 385 390 395 400 Asn Ile Thr Lys Asp Leu Leu Asp Leu Leu Val Glu Ala Lys Gln Glu 405 410 415 Val Pro Ser Trp Leu Glu Asn Met Ala Tyr Glu His His Tyr Lys Gly 420 425 430 Ser Ser Arg Gly Arg Ser Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Gly Phe Gly 435 440 445 Ala Arg Asp Tyr Arg Gln Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ser Ser Phe Ser 450 455 460 Ser Ser Arg Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Gly Gly Gly His Gly Ser 465 470 475 480 Ser Arg Gly Phe Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Gly Phe Tyr Asn Ser Asp 485 490 495 Gly Tyr Gly Gly Asn Tyr Asn Ser Gln Gly Val Asp Trp Trp Gly Asn 500 505 510 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 40 Val Asp Val Ala Asp 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 41 Asp Glu Val Asp 1 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 42 Ile Glu Thr Asp 1 <210> 43 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 43 Ser Pro Gly Glu Ser Glu His Leu Leu Glu Pro Ala Glu Ala Glu Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 20 25 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 44 Ser Pro Glu Glu Pro Gln Arg Leu Leu Glu Gln Ala Glu Ala Glu Gly 1 5 10 15 Cys Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Val Asn 20 25 <210> 45 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 45 Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly 1 5 10 15 Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu Val Pro Ala Asn 20 25 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence; note = synthetic construct <400> 46 Asp Lys Ser Asp Glu Asp Asp 1 5 ATTORNEY DOCKET NO. 21085.0132P1

Claims (94)

  1. 세포 내에서 카스파제(caspase) 또는 카스파제의 조절제와 DDX3(DEAD/H BOX 3)의 회합(association)을 검출하는 단계를 포함하는, 상기 세포 내에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 상기 회합이 내성을 표시하고, 상기 카스파제의 조절제가 IAP(아폽토시스 억제제 단백질)인 시험관내 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이고, 상기 카스파제의 조절제가 cIAP1(세포내 아폽토시스 억제제 단백질 1), cIAP2(세포내 아폽토시스 억제제 단백질 2), XIAP(X-결합된 아폽토시스 억제제 단백질) 및 서바이빈(survivin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP인, 시험관내 방법.
  3. 세포 내에서 CARD(카스파제-관련 동원 도메인) 함유 단백질과 사멸 수용체의 회합 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 상기 세포 내에서 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 모니터링하는 시험관내 방법으로서, 내성 세포의 회합 수준과 유사한 회합 수준이 내성을 나타내고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체가 Fas, TNFR1(종양 괴사 인자 수용체 1) 또는 TRAIL 수용체(TNF-관련 아폽토시스-유도 리간드)이고, 상기 TRAIL 수용체가 임의적으로 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 시험관내 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    IAP와 CARD 함유 단백질의 회합 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함하고, 내성 세포의 IAP와 CARD 함유 단백질의 회합 수준과 유사한 IAP와 CARD 함유 단백질의 회합 수준이 내성을 나타내는, 시험관내 방법.
  5. 사멸 수용체와 CARD 함유 단백질의 회합을 모니터링하는 단계, 또는 카스파제 또는 카스파제의 조절제(IAP)와 CARD 함유 단백질의 회합을 모니터링하는 단계, 및 임의적으로 세포와 사멸 수용체 작용제를 미리 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 상기 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 나타내는 생물표지(biomarker)에 대해 세포를 선별하는 시험관내 방법으로서, 상기 회합이 상기 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 의미하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 상기 TRAIL 수용체가 임의적으로 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 시험관내 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이거나, 카스파제의 조절제가 cIAP1, cIAP2, XIAP 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP인, 시험관내 방법.
  7. a) CARD 함유 단백질을 후보 약제와 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 후보 약제의 부재와 비교할 때 상기 후보 약제의 존재하에 CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성 감소를 검출하는 단계
    를 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 CARD 함유 단백질의 조절제를 선별하는 시험관내 방법으로서, 상기 활성이 사멸 수용체 작용제에 대한 표적 세포의 내성과 상호관련되어 있고, 상기 CARD 함유 단백질의 활성 감소는, 상기 후보 약제가 상기 CARD 함유 단백질을 조절함을 나타내고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시험관내 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    CARD 함유 단백질이 세포 내에 존재하고, 상기 세포가 사멸 수용체 작용제와 1회 이상 추가로 접촉하고, 사멸 수용체 작용제에 대한 내성 수준이 검출되고, 임의적으로 사멸 수용체 작용제에 대한 내성 수준이 세포 사멸(apoptosis)의 측정에 의해 검출되는, 시험관내 방법.
  9. 표적 세포를 CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성의 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하거나 방지하는 시험관내 방법으로서, 상기 조절이 상기 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 제거하거나 방지하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조절제가 키나제 억제제, DDX3 절단의 촉진제, CARD 의존성 결합의 억제제, IAP의 억제제 또는 DDX3 발현의 억제제이고, 상기 DDX3 발현의 억제제가 임의적으로 RNAi, siRNA 또는 shRNA인, 시험관내 방법.
  10. 표적 세포를 CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성의 조절제와 접촉시켜 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하거나 방지하기 위해 사용되는, CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성의 조절제로서, 상기 조절이 상기 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 제거하거나 방지하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조절제가 키나제 억제제, DDX3 절단의 촉진제, CARD 의존성 결합의 억제제, IAP의 억제제 또는 DDX3 발현의 억제제이고, 상기 DDX3 발현의 억제제가 임의적으로 RNAi, siRNA 또는 shRNA인, 조절제.
  11. 제9항에 있어서,
    사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 임의적으로 상기 TRAIL 수용체가 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 상기 사멸 수용체의 결합을 억제하거나, 또는 상기 조절제가 CARD 함유 단백질과 카스파제 또는 카스파제의 조절제(IAP)의 결합을 증가시키거나 감소시키고, 임의적으로 상기 카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이고, 임의적으로 카스파제의 조절제가 cIAP1, cIAP2, XIAP 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP인, 시험관내 방법.
  12. a) 사멸 수용체를 발현하는 표적 세포를, 사멸 수용체에 특이적으로 결합하여 세포 사멸을 유도하는 치료량의 사멸 수용체 작용제와 시험관 내에서 접촉시키는 단계; 및
    b) CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성의 조절제의 치료량을 상기 표적 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 사멸 수용체를 발현하는 표적 세포에서 세포 사멸을 선택적으로 유도하는 시험관내 방법으로서,
    상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL수용체이고, 상기 TRAIL 수용체가 임의적으로 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조절제가 키나제 억제제, DDX3 절단의 촉진제, CARD 의존성 결합의 억제제, IAP의 억제제 또는 DDX3 발현의 억제제이고, 상기 DDX3 발현의 억제제가 임의적으로 RNAi, siRNA 또는 shRNA인, 시험관내 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 임의적으로 상기 TRAIL 수용체가 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 상기 사멸 수용체의 결합을 억제하거나, 또는 상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 카스파제 또는 카스파제의 조절제(IAP)의 결합에 영향을 미치고, 임의적으로 상기 카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이고, 임의적으로 상기 카스파제의 조절제가 cIAP1, cIAP2, XIAP 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP인, 시험관내 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    표적 세포가 암세포, 류마티스성 관절염 윤활 세포, 활성화된 림프구 또는 바이러스에 감염된 세포인, 시험관내 방법.
  15. 제10항에 있어서,
    사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 임의적으로 상기 TRAIL 수용체가 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 상기 사멸 수용체의 결합을 억제하거나, 또는 상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 카스파제 또는 카스파제의 조절제(IAP)의 결합을 증가시키거나 감소시키고, 임의적으로 상기 카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이고, 임의적으로 상기 카스파제의 조절제가 cIAP1, cIAP2, XIAP 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP인, 조절제.
  16. (a) 사멸 수용체 작용제 및 (b) CARD 함유 단백질의 1종 이상의 활성의 조절제를 포함하는, 암, 염증 또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 조성물로서, 상기 조절제가 상기 사멸 수용체 작용제에 대한 내성을 감소시키고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1으로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 조절제가 키나제 억제제, DDX3 절단의 촉진제, CARD 의존성 결합의 억제제, IAP의 억제제 또는 DDX3 발현의 억제제이고, 상기 DDX3 발현의 억제제가 임의적으로 RNAi, siRNA 또는 shRNA인 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 임의적으로 상기 TRAIL 수용체가 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 조절제가 상기 CARD 함유 단백질과 상기 사멸 수용체의 결합을 억제하거나, 또는 상기 조절제가 CARD 함유 단백질과 카스파제 또는 카스파제의 조절제(IAP)의 결합을 증가시키거나 감소시키고, 임의적으로 상기 카스파제가 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-4 또는 카스파제-5이고, 임의적으로 상기 카스파제의 조절제가 cIAP1, cIAP2, XIAP 및 서바이빈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 IAP이고,
    화학요법 약제, 항체, TNF 패밀리의 구성원, 항-바이러스 약제, 소염제, 항-기회감염 약제, 항생제, 면역억제제, 면역글로불린, 항-말라리아 약제, 항-류마티스성 관절염 약제, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  19. 짧은 헤어핀(hairpin) RNA(shRNA)를 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 shRNA가 CARD 함유 단백질의 발현을 억제하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1로 이루어진 군으로부터 선택되거나, DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 단리된 핵산.
  20. 제19항에 있어서,
    shRNA가 서열 번호: 1, 2, 3 또는 4를 포함하는, 단리된 핵산.
  21. 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제19항의 단리된 핵산을 포함하는 벡터 또는 이를 포함하는 세포.
  22. 사멸 수용체의 생존 영역을 코딩하는 단리된 폴리펩티드로서, 25개 미만의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 상기 TRAIL 수용체가 임의적으로 DR4 또는 DR5이며, 상기 생존 영역이 CARD 함유 단백질 결합 도메인이고, 상기 사멸 수용체가 임의적으로 DR5의 DDX3 결합 도메인이거나 DR4의 DDX3 결합 도메인인, 단리된 폴리펩티드.
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  24. 세포 내에서 CARD 함유 단백질과 사멸 수용체의 결합을 차단하는 시험관내 방법으로서,세포를 제22항의 단리된 폴리펩티드 또는 상기 결합을 차단하는 상기 단리된 폴리펩티드의 단편과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1로 이루어진 군으로부터 선택되거나, DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이고, 상기 사멸 수용체가 Fas, TNFR1 또는 TRAIL 수용체이고, 상기 TRAIL 수용체가 임의적으로 DR4 및 DR5로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시험관내 방법.
  25. 세포를 제22항의 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 내에서 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하는 시험관내 방법으로서, 상기 사멸 수용체 작용제가 DR5 항체, DR4 항체, Fas, TNF 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택되는, 시험관내 방법.
  26. CARD 함유 단백질의 사멸 수용체 결합 도메인을 포함하고, 상기 CARD 함유 단백질이 DDX-3, mda-5 및 RIG-1로 이루어진 군으로부터 선택되거나, DDX-3, mda-5 또는 RIG-1에 대한 85% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 단리된 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 폴리펩티드가 카스파제 또는 IAP에 결합하지 않고 IAP와 사멸 수용체의 회합을 차단하고 FADD(사멸 도메인을 가진 Fas-관련 단백질)와 사멸 수용체의 결합을 방해하지 않는 단리된 폴리펩티드.
  28. 세포를 제26항의 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, IAP와 사멸 수용체의 회합을 차단하는 시험관내 방법.
  29. 세포를 제26항의 단리된 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 사멸 수용체 작용제에 대한 세포의 내성을 제거하는 시험관내 방법.
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