KR20060127415A - 천식의 치료방법 - Google Patents

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마리온 카사이안
카라 윌리암스
수잔나 마루직
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Abstract

본원에서는 천식을 치료하는데 유용한 제제의 동정 방법이 기술된다. 당해 방법은 PKC-θ 단백질의 생산을 억제하는 제제 뿐만 아니라 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 억제하는 제제를 스크리닝함을 포함하고, 이때 이러한 제제는 천식의 치료에 유용하다. 당해 방법은 또한 PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 서열에 의해 암호화되는 리포터 유전자 산물의 생산을 억제하는 제제를 스크리닝함을 포함한다. 또한, 기능적 PKC-θ 단백질의 생산 또는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 억제하는 제제를 투여함을 포함하는, 천식의 치료 방법이 기술된다. 또한, 내인성 PKC-θ의 발현이 결여된 분리된 비만세포가 기술된다.
천식, PKC-θ 단백질, 기능적 단편, 비만세포, 키나제 활성, 인산화, 자가인산화

Description

천식의 치료방법{Methods of treating asthma}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2003년 12월 24일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/532,525호 및 2004년 7월 20일자로 출원된 미국 가특허 출원 제60/589,415호를 우선권으로 주장이며, 이들 각각의 전문은 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명은 생물학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 천식 및 천식의 치료 방법에 관한 것이다.
천식은 가역성 기도 폐색의 재발성 에피소드 및 기도 과민반응(AHR)을 특징으로 기도의 만성 염증 질환이다. 천식 환자의 기도는 빈번하게 민감성이며 염증이 일어난다. 천식 환자가 알레르겐 또는 기도를 자극하는 임의 물질과 접촉되는 경우, 기도는 수축(즉, 기도 벽 주변의 근육이 팽팽해짐)되어 환자는 호흡이 곤란해진다. 기도의 내층에서는 염증이 일어나서 점액질 생산 및 알레르기의 기타 임상적 징후가 유발된다. 천식의 기타 임상적 징후로는 생명에 위협적이거나 일부 경우에서는 치명적일 수 있는 기급(氣急), 천명, 기침 및 흉부 압박감이 포함된다.
기존의 치료법은 증상성 기관지연축 및 폐 염증을 감소시키는데 초점을 두고 있지만, 천식 환자의 가속화된 폐 손상에서 장기간의 기도 리모델링(remodeling)의 역할에 대한 인식이 점차 고양되고 있다. 기도 리모델링은 상피 평활근 및 근육섬유모세포 증식증 및/또는 화생, 상피하 섬유증 및 매트릭스 분해를 포함하는 수많은 병리학적 특징을 의미한다. 이러한 과정은 치명적 천식 사례에서는 총체적으로 최대 약 300%의 기도 비대를 유발한다. 천식의 병태생리의 해명이 상당히 진전된되었음에도 불구하고, 당해 질환의 유병율, 이환율 및 사망율은 지난 20년간 증가하였다. 최신의 유효 데이타는 미국의 약 2천만명의 사람들 및 전세계의 1억 5천만명을 넘는 사람들이 천식을 앓고 있음을 나타낸다. 2000년대 초반에, 미국에서만 년간 대략 190만의 응급실 내원환자, 454,000명의 입원환자 및 4,000명 이상의 사망 환자가 직접적으로 천식에 기인하였다.
알레르기성 천식은 공기 알레르긴에 대한 부적절한 염증 반응에 의해 개시된다고 일반적으로 인정되고 있다. 천식환자의 폐는 림프구, 비만세포 및 특히 호산구의 강한 침윤을 나타낸다.
최근의 조사로 천식환자에서 관찰되는 염증에 기여하는 일부 복합적 세포 및 분자 상호작용이 밝혀졌으나, 현저한 지식의 보완점이 여전히 존재한다.
천식 원인에 관한 조사의 결과로서, 광범위한 약물이 천식의 증식을 치료하는데 사용되게 되었다. 그러나, 많은 약물들은 천식 치료에 부적합하게 만드는 다양한 단점을 갖고 있다. 예를 들어, 에피네프린 및 이소프로테레놀과 같은 많은 약물들은 오직 단기간 동안에만 천식의 증상을 완화시킨다. 다른 치료제들은 일정 기간 동안 사용된 후에 그 효과를 상실한다. 게다가, 코르티코스테로이드와 같은 일부 약물들은 만성적 사용을 제한하는 심각한 부작용을 갖고 있다. 근본적 이해의 증가가 요구될 뿐만 아니라, 유용한 천식 치료제가 명백히 요구된다. 본 발명은 이러한 요구들에 초점을 맞추고 있다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로, 단백질 키나제 C 세타(PKC-θ)가 천식을 포함하는 호흡기 질환 상태에 관여한다는 본 발명자들의 발견에 근거한다. 따라서, 본 발명은 천식의 치료에 유용한 제제의 동정 방법, 천식 또는 천식-유사 증상을 앓는 환자의 치료방법 및 내인성 PKC-θ 단백질 발현이 결여된 분리된 비만세포를 제공한다.
따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 단백질의 조절제를 동정하는 방법을 제공한다. 당해 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제와 접촉시키고; 상기 시험 제제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 조절하는지를 결정함을 포함하고, 이때 상기 시험 제제의 존재하에서의 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성의 변화는 PKC-θ 단백질의 조절제의 지표가 된다. 특정한 양태에서, 결정 단계는 시험 제제의 키나제 활성을 시험 제제의 부재하에서의 키나제 활성에 대해 비교함을 포함한다.
일부 양태에서, 키나제 활성을 감소시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 억제제이다. 일부 양태에서, 키나제 활성을 증가시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 활성화제이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능 적 단편의 키나제 활성을 2배 이상 감소시킨다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질은 전체길이 PKC-θ 단백질이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질은 전체길이 PKC-θ 단백질의 기능적 변이체이다. 특정 양태에서, 기능적 단편은 PKC-θ 키나제 도메인이다.
일부 양태에서, 접촉 단계는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편과 시험 제제의 반응 혼합물을 제공함으로써 수행한다. 특정한 양태에서, 반응 혼합물은 50mM 내지 100mM, 100 내지 150mM, 150 내지 200mM, 200 내지 250mM, 및 250 내지 300mM로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도의 NaCl을 포함하는 완충액 중에 있다. 특정 양태에서, NaCl의 농도는 250mM이다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 사람과 같은 포유동물의 천식을 치료하는데 유용하다. 일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 시험 제제의 효능을 평가함을 추가로 포함하며, 이때 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제에 비해서 증가된 효능을 나타내는 시험 제제는 천식 치료에 유용한 것으로 동정된다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 단편은 세균 세포(예: 이. 콜라이(E. coli))와 같은 진핵성 세포로부터 수득된다.
일부 양태에서, 접촉 단계는 세포내에서 수행된다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화는 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔 기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어난다 특정 양태에서, 자가인산화는 서열번호 1의 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 일어난다.
일부 양태에서, 당해 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제 뿐만 아니라 PKC-θ 기질과 접촉시킴을 포함한다. 특정한 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성은 PKC-θ 기질의 자가인산화이다. 일부 양태에서, PKC-θ 기질은 R-X-X-S 모티프 또는 R-X-X-T 모티프(여기서, R은 아르기닌이고, X는 미지의 아미노산일 수 있거나 임의의 아미노산일 수 있고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다)를 포함한다. 예를 들면, PKC-θ 기질은 KKRFSFKKSFK(서열번호 5), FARKGSLRQKN(서열번호 6), FARKGSLRQ(서열번호 15), KKRFSFKKSFK(서열번호 16), QKRPSQRSKYL(서열번호 17), KIQASFRGHMA(서열번호 18), LSRTLSVAAKK(서열번호 19), AKIQASFRGHM(서열번호 20), VAKRESRGLKS(서열번호 21), KAFRDTFRLLL(서열번호 22), PKRPGSVHRTP(서열번호 23), ATFKKTFKHLL(서열번호 24), SPLRHSFQKQQ(서열번호 25), KFRTPSFLKKS(서열번호 26), IYRASYYRKGG(서열번호 27), KTRRLSAFQQG(서열번호 28), RGRSRSAPPNL(서열번호 29), MYRRSYVFQT(서열번호 30), QAWSKTTPRRI(서열번호 31), RGFLRSASLGR(서열번호 32), ETKKQSFKQTG(서열번호 33), DIKRLTPRFTL(서열번호 34), APKRGSILSKP(서열번호 35), MYHNSSQKRH(서열번호 36), MRRSKSPADSA(서열번호 37), TRSKGTLRYMS(서열번호 38), LMRRNSVTPLA(서열번호 39), ITRKRSGEAAV(서열번호 40), EEPVLTLVDEA(서열번호 41), SQKRPSQRHGS(서열번호 42), KPFKLSGLSFK(서열번호 43), AFRRTSLAGGG(서열번호 44), ALGKRTAKYRW(서열번호 45), VVRTDSLKGRR(서열번호 46), KRRQISIRGIV(서열번호 47), WPWQVSLRTRF(서열번호 48), GTFRSSIRRLS(서열번호 49), RVVGGSLRGAQ(서열번호 50), LRQLRSPRRTQ(서열번호 51), KTRKISQSAQT(서열번호 52), NKRRATLPHPG(서열번호 53), SYTRFSLARQV(서열번호 54), NSRRPSRATWL(서열번호 55), RLRRLTAREAA(서열번호 56), NKRRGSVPILR(서열번호 57), GKRRPSRLVAL(서열번호 58), QKKRVSMILQS(서열번호 59) 및 RLRRLTAREAA(서열번호 60)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열(일반적인 단일문자 아미노산 코드에 근거함)을 가질 수 있다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편은 비만세포 또는 CD4+ T 세포와 같은 세포내에 존재한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 상기 세포내의 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 세포내 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 감소시키는 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 조절제로서 동정되는, PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법을 제공한다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 사람과 같은 포유동물의 천식을 치료하는데 유용하다. 일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 시험 제제의 효능을 평가함을 추가로 포함하며, 이때 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제에 비해서 증가된 효능을 나타내는 시험 제제는 천식 치료에 유용한 것으로 동정된다.
일부 양태에서, 당해 제제는 세포내에서 기능적 PKC-θ 단백질을 암호하는 핵산 분자의 발현을 감소시킨다. 특정 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 일부 양태에서, 포유동물은 사람이다. 특정한 양태에서, 기능적 PKC-θ 단백질은 비만세포 또는 CD4+ T세포(예: TH2 T 세포)와 같은 세포내에 존재한다.
특정한 양태에서, 당해 제제는 기능적 PKC-θ 단백질을 암호화하는 RNA의 양을 감소시킨다. 일부 양태에서, 당해 제제는 기능적 PKC-θ 단백질을 암호화하는 RNA의 해독을 억제한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 시험 제제와 접촉시키고, 상기 제제가 리포터 유전자 산물의 생산을 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 리포터 유전자 산물의 생산을 감소시키는 제제는 천식 치료에 유용한 제제로 동정되는, 포유동물의 천식을 치료하는데 유용한 제제의 동정 방법을 제공한다.
특정한 양태에서, PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 산물을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포(예: 비만세포 또는 CD4+ T세포)내에 존재한다. 일부 양태에서, 비만세포는 내인성 PKC-θ 단백질의 발현이 결여되어 있다. 특정한 양태에서, 리포터 유전자 산물은 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아실트랜스퍼라제, β-글루쿠로니다제, 알칼리성 포스파타제 또는 녹색 형광 단백질이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법을 제공한다. 당해 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 상기 세포내 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능 적 단편의 자가인산화를 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 이때 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화를 감소시키는 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 조절제로서 동정된다. 일부 양태에서, 결정 단계는 시험 제제의 키나제 활성을 시험 제제의 부재하의 키나제 활성에 대해 비교함을 포함한다.
일부 양태에서, 키나제 활성을 감소시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 억제제이다. 일부 양태에서, 키나제 활성을 증가시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 활성화제이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 2배 이상 감소시킨다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질은 전체길이 PKC-θ 단백질이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질은 전체길이 PKC-θ 단백질의 기능적 변이체이다. 특정 양태에서, 기능적 단편은 PKC-θ 키나제 도메인이다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 사람과 같은 포유동물의 천식을 치료하는데 유용하다. 일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 시험 제제의 효능을 평가함을 추가로 포함하며, 이때 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제에 비해서 증가된 효능을 나타내는 시험 제제는 천식 치료에 유용한 것으로 동정된다.
일부 양태에서, 세포는 세균 세포(예: 이. 콜라이)와 같은 진핵성 세포이다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화는 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오 닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어난다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 천식을 앓거나 천식 증상을 앓는 포유동물에게 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 감소시키거나 기능적 PKC-θ 단백질의 생산을 감소시키는 제제를 투여함을 포함하는, 천식의 치료 방법을 특징으로 한다. 일부 양태에서, 제제는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여된다. 일부 양태에서, 담체는 에어로졸의 형태로 존재한다.
본 발명의 방법의 특정한 양태에서, 제제는 정맥내, 경구, 경피 및/또는 근육내 경로를 통해 투여된다. 특정 양태에서, 제제는 흡입에 의해 투여된다. 일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 일부 양태에서, 제제는 β-아드레날린성 제제, 테오필린 화합물, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항히스타민제, 칼슘 채널 차단제, 크로몰린 나트륨 또는 이들의 배합물일 수 있는 약물과 공동 투여된다. 특정 양태에서, 제제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 일부 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 양태에서, 시험 제제는 핵산 분자이다. 특정한 양태에서, 핵산 분자는 리보핵산 분자이다. 일부 양태에서, 리보핵산 분자는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 일부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화이다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화는 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어난다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성은 PKC-θ 기질의 인산화이다. 일부 양태에서, PKC-θ 기질은 R-X-X-S 모티프 또는 R-X-X-T 모티프(여기서, R은 아르기닌이고, X는 미지의 또는 임의의 공지된 아미노산이고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다)를 포함한다. 예를 들어, PKC-θ 기질은 KKRFSFKKSFK(서열번호 5), FARKGSLRQKN(서열번호 6), FARKGSLRQ(서열번호 15), KKRFSFKKSFK(서열번호 16), QKRPSQRSKYL(서열번호 17), KIQASFRGHMA(서열번호 18), LSRTLSVAAKK(서열번호 19), AKIQASFRGHM(서열번호 20), VAKRESRGLKS(서열번호 21), KAFRDTFRLLL(서열번호 22), PKRPGSVHRTP(서열번호 23), ATFKKTFKHLL(서열번호 24), SPLRHSFQKQQ(서열번호 25), KFRTPSFLKKS(서열번호 26), IYRASYYRKGG(서열번호 27), KTRRLSAFQQG(서열번호 28), RGRSRSAPPNL(서열번호 29), MYRRSYVFQT(서열번호 30), QAWSKTTPRRI(서열번호 31), RGFLRSASLGR(서열번호 32), ETKKQSFKQTG(서열번호 33), DIKRLTPRFTL(서열번호 34), APKRGSILSKP(서열번호 35), MYHNSSQKRH(서열번호 36), MRRSKSPADSA(서열번호 37), TRSKGTLRYMS(서열번호 38), LMRRNSVTPLA(서열번호 39), ITRKRSGEAAV(서열번호 40), EEPVLTLVDEA(서열번호 41), SQKRPSQRHGS(서열번호 42), KPFKLSGLSFK(서열번호 43), AFRRTSLAGGG(서열번호 44), ALGKRTAKYRW(서열번호 45), VVRTDSLKGRR(서열번호 46), KRRQISIRGIV(서열번호 47), WPWQVSLRTRF(서열번호 48), GTFRSSIRRLS(서열번호 49), RVVGGSLRGAQ(서열번호 50), LRQLRSPRRTQ(서열번호 51), KTRKISQSAQT(서열번호 52), NKRRATLPHPG(서열번호 53), SYTRFSLARQV(서열번호 54), NSRRPSRATWL(서열번호 55), RLRRLTAREAA(서열번호 56), NKRRGSVPILR(서열번호 57), GKRRPSRLVAL(서열번호 58), QKKRVSMILQS(서열번호 59) 및 RLRRLTAREAA(서열번호 60)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열(일반적인 단일문자 아미노산 코드에 근거함)을 가질 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 내인성 PKC-θ 단백질의 발현이 결여된 분리된 비만세포를 제공한다. 일부 양태에서, 당해 세포는 외인성 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편을 발현한다.
본 발명의 이러한 및 기타 측면, 양태 및 이점은 본원의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1A 내지 1C는 사람 T 세포의 TCR 공동 자극시 PKC-θ 막 전위 및 유도성 활성화 루프 인산화를 도시하는 웨스턴 블롯팅 분석의 사진 도식이다.
도 2A 내지 2C는 PKC-θ 활성화 루프의 자가인산화가 세포내 키나제 활성을 위해 요구됨을 나타내는 사진(도 2A 및 2C) 및 그래프(도 2B) 도식이다.
도 3A 내지 3D는 PKC-θ 키나제 도메인(PKC-θ KD) 자가인산화(도 3A) 및 질량 분광분석법으로 측정된, m/z 705.52에서의 NFpSFMNPGMER(서열번호 64; 여기서, "pS"는 세린이 인산화됨을 나타낸다; 위치 693번 내지 703번에 걸쳐있음)의 생성물 이온 스펙트럼(도 3B), m/z 760.48에서의 ALINpSMDQNMFR(서열번호 65; 위치 681번 내지 692번에 걸쳐있음)의 생성물 이온 스펙트럼(도 3C) 및 m/z 1159.71에서의 TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(서열번호 66; 위치 536번 내지 555번에 걸쳐있음)의 생성물 이온 스펙트럼(도 3D)을 나타내는 도식이다. 도 3D에서 요오도아세트아미드로 알킬화된 시스테인은 #로 표시되어 있음을 주지한다.
도 4A 내지 4C는 명시한 PKC-θ KD 단백질 및 돌연변이의 이. 콜라이 용해물의 웨스턴 블롯팅 분석으로서, 항-pT538 PKC-θ을 이용한 면역블롯팅(도 4A) 및 동등한 발현을 확인하기 위한 항-His을 이용한 면역블롯팅(도 4B) 및 명시한 PKC-θ KD 단백질 및 돌연변이의 시험관내 용해물 활성을 나타내는 그래프(도 4C)이다.
도 5A 내지 5D는 100mM NaCl에서의 1/[펩타이드1]에 대한 절편 리플롯(도 5A); 100mM NaCl에서의 1/[펩타이드1]에 대한 기울기 리플롯(도 5B); 625mM NaCl에서의 1/[펩타이드1]에 대한 절편 리플롯(도 5C); 및 625 NaCl에서의 1/[펩타이드1]에 대한 기울기 리플롯(도 5D)을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 6A 내지 6C는 PKC-θ KD가 반응속도론적으로 거동할 수 있게 하는 다양한 기작을 나타내는 일련의 도식이다. 도 6A는 ADP가 방출된 최종 생성물인 순차적 순서 기작(sequential ordered mechanism)을 도시한 것이다. 도 6B는 ADP가 방출된 최종 생성물인 반응속도론 기작을 도시한 것이다. 도 6C는 랜덤 기작을 도시한 것이다. 도 6A 내지 6C에서, "E"는 효소를 의미하고, "A"는 기질 A를 의미하고, "B"는 기질 B를 의미하고, "P"는 생성물 P를 의미하고, "Q"는 생성물 Q를 의미한다.
도 7A 내지 7D는 PKC-θ KD의 kcat(도 7A and 7C) 및 kcat/Km(도 7B and 7D)에 대한 용매 점도 효과를 도시한 것이다. 도 7A는 다양한 펩타이드 1과 2.0mM로 유지된 ATP에서의 kcat 효과를 도시한 것이다. 도 7B는 펩타이드 1과 0.125mM로 유지된 ATP에 대한 kcat/Km 를 도시한 것이다. 도 7C는 다양한 펩타이드 3과 2.0mM로 유지된 ATP에서의 kcat 효과를 도시한 것이다. 도 7D는 펩타이드 3과 2.0mM로 유지된 ATP에 대한 kcat/Km를 도시한 것이다. 흰색 원 기호(○)는 증가되는 슈크로즈 중의 100mM NaCl을 나타내고; 흰색 역삼각형 기호(▽)는 증가되는 슈크로즈 중의 250mM NaCl을 나타내고; 검은색 원 기호(●)는 증가되는 Ficoll 400 중의 100mM NaCl를 나타내고; 검은색 역삼각형 기호(▼)는 증가되는 Ficoll 400 중의 250mM NaCl를 나타낸다. 도 7A 내지 7D에서 파선은 기울기 1을 나타낸다.
도 8은 억제성 기질이 PKC-θ KD 촉매 활성을 간섭하는 상이한 기작을 나타내는 도식이다. 도 8에서 "E"는 효소를 의미하고, "A"는 기질 A를 의미하고, "B"는 기질 B를 의미하고, "P"는 생성물 P를 의미하고, "Q"는 생성물 Q를 의미한다.
도 9A 및 9B는 PKC-θ(도 9A) 및 PKC-θ에 의해 인산화되는 것으로 동정된 펩타이드(도 9B)를 동정하는 펩타이드 어레이 스캔의 도식이다.
도 10A 및 10B는 PKC-θ 활성화 루프가 골수 유래의 비만세포(BMMC)상의 IgE 수용체가 가교결합되면 유도적으로 인산화됨을 나타내는 웨스턴 블롯팅 분석의 사진이다.
도 11A 내지 11C는 IgE 수용체-자극된 BMMC에서의 PKC-θ 막 전위를 증명하 는, IgE 수용체-가교결합된 BMMC로부터 막 분획(도 11A), 세제 불용성 분획(DI)(도 11B) 및 전세포 추출물(WCE)(도 11C)의 웨스턴 블롯팅 분석의 사진 도식이다.
도 12A 및 12B는 PKC-δ(도 12A) 및 PKC-β(도 12B) 분포가 BMMC상의 IgE 수용체가 가교결합시 유의적으로 변경되지 않음을 입증하는 웨스턴 블롯팅 분석의 사진이다.
도 13A 및 13B는 PKC-θ 넉아웃(knockout) 마우스의 BMMC가 야생형 마우스의 BMMC보다 적은 수의 과립을 함유함을 예시하는 조직학적(도 13A) 및 그래프(도 13B) 도식이다. 도 13B의 데이타는 시간의 함수로서의 또는 DNP-BSA 농도의 함수로서의 세포의 평균 형광 강도(MFI)를 나타낸다.
도 14A 및 14B는 PKC-θ 넉아웃 마우스의 복막 비만세포가 세포 표면 IgE의 수준은 야생형 마우스의 세포보다 낮지만(도 14A), 세포 표면 ckit의 수준은 유사함(도 14B)을 입증하는 그래프 도식이다. p 값은 t-검정으로 결정하였다.
도 15A 내지 15C는 PKC-θ 넉아웃 마우스에서 혈청 IgE(도 15A) 및 IgG1(도 15B)의 수준이 야생형 마우스보다 감소되었지만, IgA의 수준(도 15C)은 증가되었음을 나타내는 그래프 도식이다. p 값은 t-검정으로 결정하였다.
도 16A 내지 16C는 IgE 수용체 가교결합 후에 PKC-θ 넉아웃 마우스 유래의 BMMC가 사이토킨 TNF-α(도 16A), IL-13(도 16B) 및 IL-6(도 16C)의 생산에 결함이 있음을 나타내는 그래프 도식이다.
도 17A 및 17B는 PKC-θ 넉아웃 마우스로부터의 휴지기 CD4+ T 세포, TH1 세포 및 TH2 세포가 IL-2의 부재하 및 0.5 mg/ml 항-CD3의 존재하에 배양된 후에 감 소된 수준의 IL-4(도 17A) 및 IL-5(도 17B)을 나타냈음을 도시하는 그래프 도식이다.
도18은 PKC-θ 넉아웃 마우스가 항-IgE에 반응하여 하기 실시예 7에 기술한 수동 피부 아나필락시스(PCA) 모델에서 귀 부종이 증가되지 않았음을 증명하는 그래프 도식이다. 귀 부종은 기준선으로부터의 델타 변화량으로서 표현하였다. 비-쌍체 스튜던트 t-검정(students unpaired t test)을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 나타낸 P 값은 PKC-θ 넉아웃 동물에 대해 야생형 동물을 비교한 것이다.
도 19는 PKC-θ 넉아웃 마우스가 외인성 IgE의 존재하에 하기하는 수동 피부 아나필락시스(PCA) 모델에서 귀 부종이 증가되지 않았음을 증명하는 그래프 도식이다. 귀 부종은 기준선으로부터의 델타 변화량으로서 표현하였다. 비-쌍체 스튜던트 t-검정을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 나타낸 P 값은 PKC-θ 넉아웃 동물에 대해 야생형 동물을 비교한 것이다.
도 20A 내지 20D는 PKC-θ 넉아웃 마우스의 TH1 및 TH2 T 세포 둘다가 PKC-θ 야생형 마우스의 TH1 및 TH2 T 세포 둘다보다 감소된, 항-CD3 자극(0.5㎍/ml)에 대한 분화를 나타냄을 도시하는 막대 그래프 도식이다. PKC-θ 야생형 마우스(연회색 막대) 또는 PKC-θ 넉아웃 마우스(진회색 막대)의 TH0, TH1 또는 TH2 세포가 항-CD28(도 20A), 항-CD28과 IL-2(도 20B), 항-CD28 부재 및 IL-2 부재(도 20C) 및 항-CD28 부재하의 IL-2(도 20D)에 의해 추가로 자극되었다.
도 21A 내지 21D는 PKC-θ 넉아웃 마우스의 TH1 및 TH2 T 세포 둘다가 PKC- θ 야생형 마우스의 TH1 및 TH2 T 세포 둘다보다 감소된, 항-CD3 자극(0.05㎍/ml)에 대한 분화를 나타냄을 도시하는 막대 그래프 도식이다. PKC-θ 야생형 마우스(연회색 막대) 또는 PKC-θ 넉아웃 마우스(진회색 막대)의 TH0, TH1 또는 TH2 세포가 항-CD28(도 20A), 항-CD28과 IL-2(도 20B), 항-CD28 부재 및 IL-2 부재(도 20C) 및 항-CD28(도 20D) 부재하의 IL-2에 의해 추가로 자극되었다.
본 발명은 단백질 키나제 C 세타(PKC-θ)를 조절하는 제제 또는 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 조절하는 제제가 천식을 치료하는데 유용하다는 발견에 근거한다. 본원에서 제시된 이러한 새로운 발견은 알레르기 및 천식에서 비만세포를 치료하기 위한 제제로서의, PKC-θ 촉매 활성을 감소시키거나 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 감소시키는 제제의 사용을 뒷받침한다.
본 발명의 원리의 이해를 촉진시키고자 하는 목적으로, 이제 바람직한 양태가 언급될 것이며 이를 기술하기 위해 특정한 용어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 범주는 이로써 제한되지 않으며, 본원에서 예시하는 본 발명의 변경 및 추가의 변형, 및 본 발명의 원리의 추가 적용은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가들이 일반적으로 고려하는 바와 같이 고려될 것이다.
본원에서 언급되는 특허 및 과학 문헌은 당해 분야의 숙련가들이 입수가능한 지식을 입증한다. 본원에서 인용되는, 허여된 미국 특허, 허용된 출원, 공개된 출원(미국 및 국외) 및 참조(GenBank 데이타베이스 서열 포함)는 각각이 구체적이고 개별적으로 참조로 인용된 것으로 암시된다면 동일한 정도로 참조로 인용된다.
PKC-θ는 Ca+2 독립적인 신규한 PKC 부류의 구성원이다. 이는 T 세포 및 근육에서 고도로 발현된다. 본원에서 기술하는 바와 같이 PKC-θ 단백질은 천식과 같은 호흡기 질환에 관여하고 예를 들어, IgE 매개성 천식을 포함하는 아토피성 천식; 비아토피성 천식, 직업성 천식 및 약물 유도성 천식을 포함하는 천식과 관련된 증상 및/또는 합병증의 유도와 연루된다는 것이 발견되었다. 본원에서 제시하는 발견에 근거하여, 본 발명은 천식을 치료하기 위한 제제를 동정하는 방법을 제공하며, PKC-θ 생산 및/또는 키나제 활성을 (예를 들어, 억제 또는 증진시킴으로써)조절하는 제제의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하여 천식을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 내인성 PKC-θ 단백질 발현이 결여된 비만세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법을 제공한다. 당해 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 억제하는지를 결정함을 포함한다. PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 조절하는 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 조절제로서 동정된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "시험 제제"는 화학물질(예를 들어, 유기 또는 무기), 소분자 화합물, 핵산 분자, 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 호르몬, 항체 및/또는 이의 일부분이다. "PKC-θ 단백질의 조절제"란, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 증가 또는 감소시킴으로 조절할 수 있거나 (예를 들어, 전사 또는 해독을 통해서) 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 조절할 수 있는 제제를 의미한다. 일부 양태에서, 키나제 활성을 감소시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 억제제이다. 일부 양태에서, 키나제 활성을 증가시키는 PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 활성화제이다.
본 발명의 한 형태에서, PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제와 접촉시키고, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화의 변화(예를 들어, 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기의 인산화의 변화)를 검출함을 포함한다. 대안적 형태에서, 당해 방법은 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제 및 PKC-θ의 기질과 접촉시키고, PKC-θ 기질의 인산화의 변화를 검출함을 포함한다. 시험 제제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성 또는 기능적 PKC-θ 단백질의 양(예를 들어, 기능적 PKC-θ 단백질을 암호화하는 RNA 또는 DNA의 양을 변화시킴으로써)을 조절(즉, 억제 또는 증가)하는데 효과적인 것으로 사료되는 제제이다. 특정한 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 2배 이상 감소시킨다. 일부 양태에서, 당해 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 4배 이상 또는 10배 이상 감소시킨다. 일부 양태에서, 당해 조절제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 소멸시킨다. PKC-θ 단백질 키나제 활성은 예를 들어, 하기하는 시험관내 키나제 분석법과 같은 표준 기법을 사용하여 정량할 수 있다.
본 발명의 다른 비제한적 양태에서, 기능적 PKC-θ 단백질의 양은 PKC-θ 단백질의 조절제에 의해 감소된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "기능적"은 정상적으로 기능하는(예를 들어, 야생형 PKC-θ 단백질과 동일한 키나제 활성을 갖는) PKC-θ 단백질 또는 이의 단편을 의미한다. PKC-θ 단백질 또는 이의 단편이 기능적인지의 여부는 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 해당 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편이 기능적인지를 결정하는 한가지 비제한적 방법은 해당 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편을 표준 단백질 키나제 분석법[참조: Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, New York (1995, plus subsequent updates until 2003)] 및 하기 실시예에서 기술하는 키나제 분석법으로 야생형 PKC-θ 단백질 또는 또는 야생형 PKC-θ 단편과 비교하는 것이다.
PKC-θ 단백질의 기능적 단편의 한가지 비제한적 예는 PKC-θ 키나제 도메인이다. 하기 실시예(특히 실시예3)에서 기술하는 바와 같이, PKC-θ 단백질의 키나제 도메인(또한, "PKC-θ 키나제 도메인" 또는 단순히 "PKC-θ KD"라 지칭됨)은 놀랍게도 자가인산화될 수 있다. 이의 부류의 다른 효소들이 자가인산화되지 않는다는 것을 고려할 때 이는 놀라운 것이다. 사용되는 바와 같이, "PKC-θ키나제 도메인"이란 용어는 아미노산 잔기 약 362번 내지 아미노산 잔기 약 706번에 걸쳐있는 단백질의 일부분을 포함하는 PKC-θ의 키나제 도메인을 의미한다. 일부 양태에서, 본 발명의 PKC-θ KD는 서열번호 61에 제공된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 양태에서, 본 발명의 PKC-θ KD는 서열번호 62에 제공된 아미노산 서열을 갖는다(서열번호 62의 처음 2개의 N-말단 아미노산 잔기인 메티오닌과 글리신은 PKC-θ KD 단편의 발현에 적절하지만, 전체길이 PKC-θ 단백질에서는 발생하지 않는다는 것을 주지한다).
일부 양태에서, 본 발명의 PKC-θ 키나제 도메인은 세균(예: 이. 콜라이)과 같은 진핵성 세포에서 발현된다. 일부 양태에서, PKC-θ 키나제 도메인은 서열번호 1의 695번 위치 세린 잔기, 685번 위치 세린 잔기, 538번 위치 트레오닌 잔기 및 536번 위치 트레오닌 잔기 중 하나 이상의 잔기에서 인산화된다(예를 들어, 자가인산화에 의해).
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 2배 이상 감소시킨다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 4배 이상 감소시킨다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 10배 이상 감소시킨다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 기능적 PKC-θ 단백질의 양을 소멸시킨다. 기능적 PKC-θ 단백질의 수준은 예를 들어, 하기하는 웨스턴 블롯팅 분석과 같은 표준 기법을 사용하여 정량할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 기능적 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 상기 세포내 기능적 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 양을 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 세포내 기능적 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 양을 감소시키는 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 조절제로서 동정되는, PKC-θ 단백질의 조절제의 또 다른 동정 방법을 제공한다. 이러한 PKC-θ 단백질의 조절제는 예를 들어, 전사 또는 해독 수준에서 작용할 수 있다.
특정한 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 사람과 같은 포유동물의 호흡기 질환을 치료하는데 유용하다. 호흡기 질환에는, 제한됨이 없이, 천식(알레르기성 및 비알레르기성 천식); 기관지염(예: 만성 기관지염); 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)(예: 폐기종); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과도한 점액 생성이 관여하는 상태, 예를 들어, 낭성 섬유증, 폐 섬유증 및 알레르기성 비염이 포함된다.
일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 아토피성 질환을 치료하는데 유용하다. "아토피성"은 흔히 알레르기 반응을 발달시키는 유전적 경향이 있는 질환 그룹을 지칭한다. 아토피성 질환의 비제한적 예로는 알레르기, 알레르기성 비염(증상에는 건초열, 가려움, 콧물, 재채기 또는 코막힘 및 안구 가려움이 포함된다), 아토피성 피부염(습진으로서 공지되어 있음; 피부에 발생하는 만성 질환), 천식 및 건초열이 포함된다.
특정 양태에서, PKC-θ 단백질의 조절제는 사람과 같은 포유동물의 천식을 치료하는데 유용하다. 본원에서 사용되는 "천식"은 천명, 흉부의 압박감 및 흔히 기침 또는 경련의 발작을 동반하는 지속적 또는 발작적 호흡곤란을 특징으로 하는 상태이다. 이러한 증상 중 어느 하나 또는 모두는 "천식 증상"으로서 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "천식"에는 비알레르기성 천식(내인성 또는 비아토피성 천식으로도 지칭됨), 알레르기성 천식(외인성 또는 아토피성 천식으로도 지칭됨), 비알레르기성 천식과 알레르기성 천식의 조합, 운동 유발성 천식(혼합형 천식으로도 지칭됨), 약물 유발성 천식, 직업성 천식 및 후기 천식이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 외인성 또는 알레르기성 천식은 예를 들어, 꽃가루, 포자, 목초 또는 잡초, 애완동물의 비듬, 먼지, 진드기 등과 같은 알레르겐에 의해 유발되거나 이와 관련되는 에피소드를 포함한다. 알레르겐 및 기타 자극제는 그 자체로 수년에 걸쳐 다양한 시점에 존재하기 때문에, 이러한 유형의 에피소드는 계절적 천식으로도 지칭된다. 외인성 천식 그룹에는 또한 기관지 천식 및 알레르기성 기관지 폐 아스페르길루스증이 포함된다.
천식은 예를 들어, 기관지 과민반응 및 가역성 기류 폐색과 같은 간헐적 호흡기 질환 증상과 연루된, 표현형상 이질적인 질병이다.
천식의 면역조직화학적 특징에는 예를 들어, 기도 상피의 박피, 기저막 아래의 콜라겐 침착; 부종; 비만세포 활성화; 및 염증성 세포 침윤(예를 들어, 호중구, 호산구 및 림프구에 의한)이 포함된다. 기도 염증은 또한 기도 과민반응, 기류제한, 급성 기관지수축, 점액전(mucus plug) 형성, 기도 벽 리모델링 및 기타 호흡기 질환 증상에도 기여할 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료 또는 완화될 수 있는 천식은 바이러스(예: 감기 및 독감 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), 파라믹소바이러스, 리노바이러스 및 인플루에자 바이러스)와 같은 감염성 인자에 의해 유발되는 천식을 포함한다. RSV, 리노바이러스 및 인플루엔자 바이러스 감염은 아동에서 흔한 것이며 영아 및 유아에서 호흡기도 질병의 주된 원인중 하나이다. 바이러스성 세기관지염을 앓는 아동에서는 만성 천명 및 천식이 발생할 수 있으며, 이는 본 발명의 방법으로 치료될 수 있다. 또한 운동 및/또는 찬 공기에 의해 일부 천식 환자에서 발생할 수 있는 천식 상태가 포함된다. 본 발명의 방법은 연기 노출(예: 담배에 의해 유도된 및 산업상 연기), 및 산업상 및 직업상 노출, 예를 들어, 페인트, 플라스틱, 폴리우레탄, 니스 등, 목재, 식물 또는 기타 유기 분진 등으로부터의 이소시아네이트를 포함하는 연기, 오존, 유해 가스, 이산화황, 산화질소, 매연과 연루된 천식에 유용하다. 당해 방법은 또한 식품 첨가제, 방부제 또는 약리학적 제제와 연루된 천식 에피소드에도 유용하다. 본 발명의 방법은 또한 침묵성 천식(silent asthma) 또는 기침 이형 천식(cough variant asthma)으로 지칭되는 천식 유형을 치료, 억제 또는 경감시키는데 유용하다.
또한, 본 발명의 방법은 기관지수축을 자극할 수 있는 위식도 역류(GERD)와 연루된 천식의 치료 및 경감에 유용하다.
일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다. 특정 양태에서, 당해 방법은 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 시험 제제의 효능을 평가함을 추가로 포함하고, 이때 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제와 비교하여 증가된 효능을 나타내는 시험 제제는 천식 치료에 유용한 것으로 동정된다.
각종 천식 모델은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Soler et al., J. Appl. Physiol. 70(2):617-23 (1991) and Long et al., J.　Appl. Physiol. 69(2):584-590 (1990)]에는 양의 기관지수축 모델이 기재되어 있다. 양은 천연적으로 회충 아스카리스 섬(Ascaris suum)에 민감하다. 아스카리스 섬 항원으로 흡입 챌린지(challenge) 후, 동물은 민감화 알레르겐에 노출시 천식 환자의 반응과 유사한 초기 및 후기 기관지 수축 반응을 나타낸다. 아스카리스 챌린지는 또한 양에서 기도 과민반응을 유도하는데, 이는 콜린성 효능제인 카바콜로 유발반응 챌린지한 후에 폐 저항성의 증가로서 측정한다. 소정의 반응을 유도하는데 요구되는 카바콜의 용량은 아스카리스 챌린지한지 24시간 후에 감소하며, 기도 과민반응의 징후가 된다.
문헌[참조: Bischof et al. (Clin. Exp. Allergy 33(3): 367-75 (2003)]에는 양의 알레르기성 천식 모델이 기재되어 있으며, 여기서는 가용화된 집먼지 진드기 추출물로 피하 면역화된 양에서 후속적으로 집먼지진드기로 단일 기관지 챌린지를 실시한다. 상기 모델에서, 유세포분석을 위해 기관지폐포 세척(bronchoalveolar lavage; BAL) 및 말초혈 백혈구를 집먼지진드기로 기관지 챌린지하기 전과 후에 수거하고, 조직 샘플을 조직학 및 면역조직화학 분석을 위해 챌린지 48시간 후에 채취하였다[참조: Bischof et al., supra]. PKC-θ 단백질의 조절제로 사료되는 시험 제제, 특히 PKC-θ 단백질의 억제제로 사료되는 시험 제제를 양에게 투여함으로써, 본 발명의 시험 제제가 투여되지 않은 양의 BAL 백혈구의 수와 비교하여 챌린지 후에 BAL 백혈구의 수를 감소시키는 능력을 평가할 수 있다.
또 다른 익히 공지된 천식 모델은 아스카리스 유도성 기도 염증의 비-사람 영장류 모델이다[참조: Gundel et al., Clin. Exp. Allergy 22(1): 51-57 (1992)]. 시아노몰구스 원숭이는 강력한 IgE 반응을 유도함으로써 알레르겐으로서 작용할 수 있는 회충인 아스카리스 섬에 천연적으로 민감하다. 항원으로 기관내 챌린지시, 동물은 주로 호산구로 이루어진 기도 염증을 나타낸다. 이는 폐 분절 알레르겐 챌린지 24시간 후에 기관지폐포 세척액내로 유입된 백혈구를 계수하여 측정할 수 있다.
또 다른 비제한적 천식 모델은 마우스의 오브알부민(OVA) 유도성 기도 과민반응이다[참조: Kips et al., Eur. Respir. J. 22(2): 374-382 (2003); Taube et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 135(2):173-186 (2004); and Reader et al., Am. J. Pathol. 162(6): 2069-2078 (2003)]. 상기 모델에서, 마우스를 백반 보조제 중의 오브알부민(OVA)으로 면역화시키고, 부스트(boost)한 다음, OVA으로 에어로졸 챌린지를 실시한다. 챌린지시, 동물은 증가된 기도 저항성 및 기관계폐포 세척(BAL)액내로의 백혈구 침윤을 나타낸다. 또한, 혈청 사이토킨 수준이 증가하고, 폐 조직학은 조직 염증과 점액 생성을 나타낸다.
당해 분야에 공지된 다른 비제한적 천식 모델로는 개 및 원숭이의 아스카리스 섬 항원 유도성 천식 모델[참조: Hirshman et al., J. Appl. Physiol. 49: 953-957 (1980); Mauser et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 152(2): 467-472 (1995)]이 포함된다.
시험관내 천식 모델도 또한 생물학 분야의 숙련가들에게 공되어 있다. 예를 들어, T 세포-표적화된 치료요법의 경우, 한가지 비제한적 예는 TH2 세포에 의한 사이토킨 생산의 억제이다. TCR-매개성 활성화를 모사하기 위해 T 세포를 시험관내에서 CD3 및 CD28에 대한 항체로 자극할 수 있다. 이는 사이토킨 생산을 유도할 것이며, 이러한 사이토킨 생산은 48시간이 지난 상청액에서 분석할 수 있다. 주요 사이토킨은 IL-4 및 IL-13이다.　 특히, IL-13은 동물 모델에서 천식 발병기전의 주요한 유도인자이다[참조: Wills-Karp M., Immunol Rev. 202:175-190 (2004)].
　천식에 대한 PKC-θ 단백질 조절의 효과를 평가하기 위한 또 다른 비제한적 시험관내 방법은 T 세포 증식을 억제하거나, 항-CD3 및 항-CD28에 대해 반응하여 NFAT의 핵 전사 인자 NF-kB를 유도하는 것이다. T 세포 증식은 예를 들어, 3H-티미딘 흡수[참조: Ausubel et al., supra]로 분석할 수 있다.　 T-세포 활성화에 대한 반응으로서 NFAT 또는 NF-kB가 활성화 및 핵 전위되면, 이를 세포 용해물로부터 웨스턴 블롯으로 분석할 수 있다.
PKC-θ 단백질 억제제는 또한 오브알부민-면역화된 마우스에서 TH2 반응을 감소시키는데, 이는 오브알부민-특이적 IgG1 또는 전체 IgE의 감소된 생산으로서 분석할 수 있다. 이들 항체의 수준은 마우스의 혈청으로부터 ELISA로 분석할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 PKC-θ 단백질은 사람으로부터 유래될 수 있으며, 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열(GenBank 승인번호: NM_006257)을 가질 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 PKC-θ 단백질은 마우스로부터 유래될 수 잇으며, 서열번호 2에 제시한 아미노산 서열(GenBank 승인번호: NM_008859)을 가질 수 있다. 본 발명에서 유용한 PKC-θ 단백질은 또한 서열번호 3(사람)(GenBank 승인번호: NM_006257) 또는 서열번호 4(쥐)(GenBank 승인번호: NM_008859)에 제시한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 추가의 PKC-θ 단백질의 서열 및 이러한 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 GenBank 승인번호: NM_178075[참조: Niino et al., J. Biol. Chem. 276 (39): 36711-36717 (2001);(마우스)]; GenBank 승인번호. AF473820[참조: Nonneman and Rohrer, Anim. Genet. 34 (1): 42-46 (2003); 돼지]에서 입수할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열은 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오시드 및 이들의 유도체의 천연 또는 합성 선형 및 순차적 배열을 지칭한다. "암호화(encoding 또는 conding)"란 용어는 전사 및 해독 기작을 통해서 뉴클레오타이드 서열이 세포에 정보를 제공하도록 하는 과정으로서, 이로부터 일련의 아미노산이 특정한 아미노산 서열로 조립되어 폴리펩타이드를 생성할 수 있는 과정을 지칭한다. 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 과정은, 암호화된 아미노산의 변화를 유발하지 않거나 하나 이상의 아미노산을 변경할 수 있지만 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 기능적 특성을 제거하지 않는 염기 변화를 포함하는 하나 이상의 염기 변화(즉, 삽입, 결실, 치환)를 갖는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
PKC-θ가 천식의 증상 및/또는 합병증의 유도와 연루된다는 발견은 본 발명의 제제 동정 방법에서 PKC-θ의 서열이 유용하게 만든다. 이러한 방법은 잠재적 인자를 PKC-θ 키나제 활성을 조절하는(즉, 억제 또는 증진시키는) 능력에 대해 분석함을 포함한다. 본 발명의 분석법에서 유용한 PKC-θ 핵산 분자(예: PKC-θ 프로모터 서열) 및 단백질은 본원에서 개시하는 유전자 및 암호화된 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 야생형 유전자 및 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 변이체도 포함한다. 본원에서 사용되는 "변이체"는, 당해 변이체가 야생형 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 한, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드와 관련하여, 결실 변이체는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 폴리펩타이드 부분이 결실된 단편을 포함하고, 삽입 변이체는 야생형 폴리펩타이드 또는 이의 단편이 다른 폴리펩타이드에 융합된 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
따라서, 특정한 양태에서, 본 발명의 PKC-θ 단백질은 전체길이 PKC-θ 단백질의 기능적 변이체이다. 따라서, PKC-θ 단백질이 서열번호 3 또는 서열번호 4에 제시한 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 단백질로 제한되지 않는다는 것이 이해된다. 예를 들어, 상기 논의한 변이체 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 PKC-θ을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 범주내에 있다. PKC-θ 단백질의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 "침묵(silent)" 변화를 유발하는 서열의 결실, 삽입 또는 치환과 같은 서열 변형이 명백하게 본원에서 의도된다. 예를 들어, 유전자 코돈의 축퇴성을 반영하거나 소정의 부위에서 화학적 등가 아미노산의 생성을 초래하는 뉴클레오타이드 서열의 변경이 의도된다는 것이 이해된다. 따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 글리신과 같은 다른 덜 소수성인 잔기 또는 발린, 류신 또는 이소류신과 같은 보다 소수성인 잔기를 암호하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 1개의 음으로 하전된 잔기의 다른 잔기로의 치환, 예를 들어, 아스파르트산의 글루탐산으로의 치환 또는 1개의 양으로 하전된 잔기의 다른 잔기로의 치환, 예를 들어, 라이신의 아르기닌으로의 치환을 초래하는 변화도 또한 생물학적으로 등가인 PKC-θ 단백질을 생성할 것으로 예상될 수 있다.
본원에서 기술하는 분석법에서 사용하기 위해, PKC-θ 단백질은 판베라(Panvera, 위스콘신주 매디슨 소재)와 같은 각종 공급원으로부터 상업적으로 구입할 수 있거나, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 유전자 공학 및 단백질 정제법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 PKC-θ 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 목적하는 숙주 세포에 도입시키고, 배양하고, 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 먼저 적절한 또는 그 밖의 바람직한 재조합 발현 벡터로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 포유동물 PKC-θ 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이 pcDNA3 발현 벡터로 서브클로닝하여 사람 293 세포에서 발현시킬 수 있다. 진핵성 세포에서의 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인의 발현이 또한 의도된다. 예를 들어, 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인을 pET16b(예를 들어, 시판원: EMD Biosciences/Merck Biosciences. 캘리포니아주 샌디에고 소재)와 같은 세균성 발현 벡터로 서브클로닝하여 세균 세포에서 발현시킬 수 있다. "벡터"는 본원에서 사용되고 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 표적화된 세포의 형질전환을 지시하도록 고안된 유전 물질을 포함하는 작제물을 지칭한다. 벡터는 핵산 카셋트내 핵산이 전사되고, 필요에 따라 형질전환된 세포에서 해독될 수 있도록 위치적으로 및 순차적으로 배향된, 즉 다른 필수적 또는 바람직한 요소와 작동적으로 연결된 다수의 유전 요소를 함유할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 상기 언급한 뉴클레오타이드 서열을 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법에 따라서, 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 2nd ed., Cold Springs Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 벡터로 혼입시켜 작제할 수 있다. 분자생물학 및 재조합 DNA 기법을 기술하는 다른 참조는 예를 들어, 규칙적이고 정기적으로 갱신되는 문헌[참조: DNA Cloning 1: Core Techniques, (D. N. Glover et al., eds., IRL Press, 1995); DNA Cloning 2: Expression Systems, (B. D. Hames et al., eds., IRL Press, 1995); DNA Cloning 3: A Practical Approach, (D. N. Glover et al., eds., IRL Press, 1995); DNA Cloning 4: Mammalian Systems, (D. N. Glover et al., eds., IRL Press, 1995); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., IRL Press,1992); Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, (S. J. Higgins and B. D. Hames, eds., IRL Press, 1991); Transcription and Translation: A Practical Approach, (S. J. Higgins & B. D. Hames, eds., IRL Press, 1996); R. I. Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition (Wiley-Liss, 1986); and B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 2 nd Edition, (John Wiley & Sons,1988); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons)]에 추가 설명되어 있다.
본 발명에서 사용된 광범위한 벡터는 공지되어 있다. 적합한 벡터로는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터[참조: Miller et al., Methods of Enzymology 217:581-599 (1993)], 아데노바이러스 벡터[참조; Erzurum et al. Nucleic Acids Res. 21:1607-1612 (1993); Zabner et al., Nature Genetics 6:75-83 (1994); 및 Davidson et al., Nature Genetics 3:219-223 (1993)], 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터[참조: Flotte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10613-10617 (1993)] 및 헤르페스 바이러스 벡터[참조: Anderson et al., Cell Mol. Neurobiol. 13:503-515 (1993)]를 포함하는 바이러스 벡터가 포함된다. 벡터는 조절성 요소를 포함하여 특수화된 숙주 세포에서 핵산의 효율적 발현을 위해 필수적인 또는 바람직한 다른 공지된 유전 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 유전자의 전사를 달성하기 위해 프로모터 및 이러한 프로모터와 협력하는 임의의 필수적 인핸서 서열을 포함할 수 있다. "인핸서"란 진핵성 숙주 세포와 같은 세포에서 프로모터 활성을 자극할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 요소를 의미한다.
본원에서 정의된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열은 또 다른 뉴클레오타이드 서열과 기능상 연관성이 있게 배치된다면 또 다른 뉴클레오타이드 서열에 "작동적으로 연결"된 것이다. 예를 들어, 암호화 서열이 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 있는 경우, 이는 일반적으로 프로모터가 이러한 암호화 서열의 전사를 촉진할 수 있음을 의미한다. 작동적으로 연결된이란, 연결되는 DNA 서열들이 통상 연속적이고, 필요에 따라 2개의 단백질 암호화 영역들이 연속적으로 판독 프레임(reading frame)내에서 결합됨을 의미한다. 그러나, 인핸서가 프로모터로부터 수 kb만큼 떨어져 있는 경우에 작용할 수 있고 인트론 서열의 길이가 가변적일 수 있기 때문에, 일부 뉴클레오타이드 서열은 작동적으로 연결되지만, 연속적이지 않을 수 있다.
PKC-θ 단백질을 암호화하고 재조합 발현 벡터에 포함될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포로 도입하기 위해 당해 분야에 공지된 수많은 방법들을 사용할 수 있다. 이러한 방법으로는 제한됨이 없이, 기계적 방법, 화학적 방법, 친유성 방법 및 전기천공이 포함된다. 예시적 기계적 방법으로는 예를 들어, 마이크로인젝션(microinjection) 및 예를 들어, 도입하고자 하는 DNA에 대한 금 입자 물질을 사용한 유전자 총(gene gun)의 사용이 포함된다. 예시적 화학적 방법에는 예를 들어, 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란의 사용이 포함된다. 예시적 친유성 방법에는 지질 매개성 형질감염을 위한 리포좀과 다른 양이온성 제제의 사용이 포함된다. 이러한 방법들이 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 이러한 방법들 중 다수는 예를 들어, 규칙적이고 정기적으로 갱신되는 문헌[참조: Gene Transfer Methods: Introducing DNA into Living Cells and Organisms, (P.A. Norton and L.F. Steel, eds., Biotechniques Press, 2000); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons]에 기술되어 있다.
예를 들어, 본원에서 기술하는 스크리닝 분석법에서 사용하기 위한 목적하는 양의 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 생산하기 위해 광범위한 숙주 세포를 본 발명에서 사용할 수 있다. 이러한 세포에는 당해 분야에 공지된 포유동물 및 세균 세포를 포함하는 진핵성 및 원핵성 세포가 포함된다. 수많은 숙주 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, 버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수될 수 있다.
PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편은 크로마토그래피, 전기영동 및 원심분리 기법을 포함하여 당해 분야의 숙련가에 익히 공지된 기법으로 분리 및 정제할 수 있다. 이러한 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Current Protocols in Protein Science, J. Wiley and Sons, New York, NY, Coligan et al. (Eds.) (2002); and Harris, E.L.V., and S. Angal in Protein Purification Applications: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY (1990)]에서 찾아볼 수 있다.
재조합에 의해 생산된 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 정제 및 검출을 보조하기 위해, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 "태그(tagged)"되도록 조작할 수 있다. 하기 몇몇 실시예에서, PKC-θ 단백질 및 PKC-θ 키나제 도메인(PKC-θ 단백질의 기능적 단편의 비제한 예)은 히스티딘 태그로 태그된다. 이로써 his-태그된 단백질을 니켈-NTA에 결합시켜 정제할 수 있다. 하기의 다른 실시예에서, PKC-θ 단백질은 헤마글루티닌(HA) 태그로 태그되고 293 세포에서 발현된다. PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)의 정제 및/또는 검출을 보조하는데 사용될 수 있는 시판되는 다른 비제한적 태그에는 제한됨이 없이, myc 태그(항-myc 태그 항체에 결합함), GST 태그(글루타티온-세파로스에 결합함) 및 flu 태그(항-flu 태그 항체에 결합함)가 포함된다.
시험 제제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 억제하는지를 결정하기 위해, 사용될 수 있는 한가지 비제한적 분석법은 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)을 PKC-θ 단백질의 키나제 활성을 억제하기에 충분한 시간 동안 시험 제제와 접촉시키는 것이다. 이러한 시간은 선택된, 억제제 및 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 성질에 따라 달라질 수 있다. 당해 분야의 숙련가라면 과도한 실험 없이도 이러한 시간을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, PKC-θ의 기질에 결함으로써 PKC-θ를 억제하거나 몇몇 다른 기작에 의해 PKC-θ의 키나제 활성을 억제하는 시험 제제도 고려되지만, 본 발명의 비제한적 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 키나제 활성(또는 이의 기능적 단편)의 키나제 활성을 감소시키는 제제이다.
하기하는 바와 같이, PKC-θ는 IgE 수용체 가교결합시 BMMC내의 다음 잔기 중 하나 이상에서 유도적으로 인산화된다: 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 또는 536번 위치의 트레오닌 잔기. 따라서, 특정한 양태에서, 시험 제제는 PKC-θ 단백질의 자가인산화를 억제하는 이의 능력을 이용하여 PKC-θ의 키나제 활성을 억제할 수 있는 제제인지가 결정될 수 있다. 일부 양태에서, PKC-θ 단백질의 활성화 루프의 아미노산 잔기의 자가인산화가 억제된다.
시험 제제가 PKC-θ 단백질의 키나제 활성을 억제하는지를 결정하기 위해 수많은 분석법이 사용될 수 있다. PKC-θ 단백질이 키나제이기 때문에, 이러한 분석법은 아데노신 트리포스페이트(ATP)와 같은 포스페이트 형태 또는 PKC-θ 기질로 전달될 수 있는 다른 포스페이트 형태의 존재하에 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 스스로 자가인산화되는 PKC-θ의 능력에 미치는 시험 제제의 효과를 측정함을 포함한다. 유사하게, 이러한 분석법으로 포스페이트 형태의 존재하에 PKC-θ 기질을 인산화하는 PKC-θ의 능력에 미치는 시험 제제의 효과를 측정할 수 있다. 형광성-기반 분석법을 포함하는 방사성-기반 분석법 및 비-방사성-기반 분석법을 사용할 수 있다. 방사성-기반 분석법은 예를 들어, PKC-θ 기질로의 [ν-32P]-ATP의 혼입의 측정 및 액체 신틸레이션 계수에 의한 측정을 포함한다. 시험관내 인산화 및 항체 기반 비색 검출 또는 다른 검출방법을 사용하는 다른 분석법은 프로메가(Promega, Madison, WI; 카탈로그 번호 V7470 및 V5330), 칼바이오켐(Calbiochem, San Diego, CA; 카탈로그 번호 539484, 539490, 539491), 판베라디스커버리 스크리닝(Panvera Discovery Screening, Madison, WI; 카탈로그 번호 P2747 및 P2748; 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 자회사)를 포함하는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 용이하게 입수할 수 있다. R-X-X-S/T 컨센서스 모티프를 갖는 기질을 인산화시키고 형광 편극에 의해 인산화된 기질의 측정함을 포함하는 비-방사성 분석법은 판베라(위스콘신주 메디슨 소재)가 독점 시판하고 있다.
한가지 비제한적 예로서, 시험 제제에 노출된 BMMC 및 32P-ATP를 항-IgE 수용체 항체로 자극하여 IgE 수용체를 가교결합시킬 수 있다. 가교결합 15분 후, 세포를 용해시킬 수 있다. 그 다음, 내인성 PKC-θ를 시판되는 항체(예: 하기 실시예에서 기술하는 항-PKC-θ 항체(시판원: Santa Cruz Biotechnology, 캘리포니아주 산타 크루즈 소재))와 면역침전시키고 SDS-PAGE 분석으로 분해시킬 수 있다. PKC-θ 자가인산화를 억제하는 시험 제제로 처리된 BMMC로부터의 PKC-θ는 미처리된 세포로부터의 PKC-θ와 비교하여 감소된 인산화(즉, 감소된 32P-ATP 혼입)를 나타낼 것이다.
상기 예의 대안으로서, BMMC를 32P-ATP의 부재하에 시험 제제에 노출시킨다. 항-IgE 수용체 가교결합 15분 후에, 세포를 용해시키고, 내인성 PKC-θ를 면역침전시키고 SDS-PAGE로 분해시킨다. 이어서, SDS-PAGE 겔을 항-포스포트레오닌 항체(예를 들어, 시판원: Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석한다. PKC-θ 자가인산화를 억제하는 시험 제제로 처리된 BMMC로부터의 PKC-θ는 미처리된 세포로부터의 PKC-θ와 비교하여 감소된 인산화(즉, 감소된 32P-ATP 혼입)를 나타낼 것이다.
PKC-θ 키나제 활성은 또한 기질을 인산화하는 이의 능력으로 측정할 수도 있다. 따라서, 광범위한 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 분석법에서 사용하여 PKC-θ 키나제 활성을 측정할 수 있다. 본 발명에서 유용한 펩타이드는 컨센서스 R-X-X-S/T 모티프(여기서, R은 아르기닌이고, X는 미지의 또는 임의의 공지된 아미노산이고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다)를 지닌다. 다른 단백질 기질에는 제한됨이 없이, 미리스토일화 알라닌-풍부 C-키나제 기질(MARCKS) (아미노산 서열 KKRFSFKKSFK(서열번호 5), 여기서 밑줄친 세린 잔기가 인산화된다), PKC-α 가성-기질(아미노산 서열 FARKGSLRQKN(서열번호 6), 여기서 밑줄친 세린 잔기가 인산화된다)가 포함된다. 펩타이드 어레이 기법을 사용하여, PKC-θ의 생리학적 기질 고유의 서열을 함유할 수 있고 PKC-θ과 동일하게 적용하는 경우 치료학적 표적이 될 수 있는 PKC-θ의 몇가지 가능한 기질을 동정하였다(도 9B 및 하기 실시예 4 참조). 기질이 PKC-θ에 의해 촉매된 반응에서 참여하는 한 당해 기질은 다양한 변형을 가질 수 있다.
PKC-θ의 키나제 활성을 측정하는 또 다른 방법은 자가인산화하는 PKC-θ의 능력을 측정하는 것이다. 하기하는 실시예에서, PKC-θ의 키나제 도메인은 놀랍게도 세균 세포에서 발현되는 경우에 인산화된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 인산화는 세균 세포가 단백질을 인산화하지 않기 때문에 자가인산화에 기인한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)을 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 상기 세포내 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)의 자가인산화를 감소시키는지를 결정함으로써 포유동물의 면역 질환을 치료하는데 유용한 제제를 동정하는 방법을 제공하고, 이때 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)의 자가인산화를 감소시키는 시험 제제는 면역 질환의 치료에 유용한 제제로서 동정된다. 일부 양태에서, 세포는 세균 세포(예: 이. 콜라이)이다. 일부 양태에서, 면역 질환은 천식이다.
본 발명에 따라서, 세포에 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 도입하여 세포가 당해 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 발현하도록 할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, 당해 뉴클레오타이드 서열은 세포가 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)을 발현하도록 하는 조절 서열(예: 프로모터 서열 및 인핸서)에 작동적으로 연결된다. 당해 분야의 숙련가라면 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 성취하는데 요구되는 조절 서열의 유형이 PKC-θ 단백질(또는 이의 기능적 단편)을 암호화하는 뉴클레오타이드가 도입되어진 세포의 유형에 따라 달라질 수 있음을 이해할 수 있다. 예를 들어, 세포가 세균 세포인 경우, 세균 세포로부터의 조절 서열이 사용되는 것이 바람직하다. 수많은 상이한 유형의 세포(예: 곤충, 포유동물 및 세균)로부터의 조절 서열은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 이는 규칙적이고 정기적으로 갱신된다].
또 다른 측면에서, 본 발명은 기능적 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인을 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 기능적 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인의 자가인산화를 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 기능적 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인의 자가인산화를 감소시키는 시험 제제가 천식과 같은 면역 질환의 치료에 유용한 제제로서 동정되는, 천식과 같은 면역 질환의 치료에 유용한 제제의 동정 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 접촉은 시험관내에서 이루어진다.
일부 양태에서, 기능적 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인과 시험 제제의 접촉은 완충액 중에서 이루어진다. 일부 양태에서, 완충액의 전체 이온 강도는 세포 내부에서 확인되는 이온 강도(약 100mM NaCl)에 비해 높다. 예를 들어, 일부 양태에서, 완충액의 이온 강도는 100mM 이상이다. 일부 양태에서, 완충액의 이온 강도는 200mM 이상 또는 250mM 이상이다.
특정한 양태에서, 기능적 PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 키나제 도메인이 시험 제제와 접촉되는 완충액은 NaCl을 함유한다. 예를 들어, 완충액은 50mM 이상의 NaCl를 함유할 수 있다(추가의 염(즉 NaCl 이외의 염)이 완충액 중에 존재할 수 있음을 주지한다). 일부 양태에서, 완충액은 100mM 이상의 NaCl 또는 150mM 이상의 NaCl 또는 200mM 이상의 NaCl을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 완충액은 250mM 이상의 NaCl을 함유한다. 물론, 당해 분야의 숙련가라면 NaCl 이외의 염을 사용하여 이온 강도가 높은 완충액을 수득할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 염의 일부 비제한적 예로는 암모늄 아세테이트, 나트륨 아세테이트 및 염화칼륨이 포함된다.
본 발명에 따라서, "면역 질환"은 면역계의 세포(예: T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 비만세포, 호중구 및 대식세포)가 정상적으로 기능하지 않는 질환을 의미한다. 일부 양태에서, 면역 질환은 천식이다. 다른 면역 질환에는 제한됨이 없이, 면역 세포가 관여하는, 자가면역 질환(예: I형 진성 당뇨병 및 류마티스 관절염), 이식편 거부, 및 알레르기와 같은 호흡기 질환이 포함된다.
따라서, 본 발명은 기능적 PKC-θ 단백질의 수준을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 제제 또는 PKC-θ 키나제 활성을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 제제를 동정하여 천식과 같은 면역 질환의 치료에서 유용한 제제를 동정하는 방법을 제공한다. 기능적 PKC-θ 단백질의 생산 또는 PKC-θ 키나제 활성을 조절하는(예를 들어, 감소시키는) 제제에는 제한됨이 없이, 소분자 화합물, 화학물질, 핵산 분자, 펩타이드, 및 호르몬 및 항체와 같은 단백질이 포함된다. 당해 제제에는 또한 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 안티센스 리보핵산 및 소형 간섭 RNA(siRNA)가 포함될 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드 서열 및 siRNA는 전형적으로 표적 뉴클레오타이드 서열의 일부분에 상보적이거나 또는 이와 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 하나의 비제한적 예로서, 안티센스 뉴클레오타이드 서열 및/또는 siRNA는 T538 자가인산화를 위해 요구되는 695번 위치의 세린 잔기를 함유하는 아미노산 잔기 688번 내지 699번에 상응하는 아미노산 서열 QNMFRNFSFMNP(서열번호 8)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 CAGAATATGTTCAGGAACTTTTCCTTCATGAACCCCG(서열번호 7)에 하이브리드화한다. 다른 비제한적 예로서, 안티센스 RNA 및/또는 siRNA는 536번 및 538번 위치의 트레오닌 잔기(이중 적어도 하나는 키나제 활성을 위해 요구된다)를 함유하는 아미노산 잔기 532번 내지 543번에 상응하는 아미노산 서열 GDAKTNTFCGTP(서열번호 10)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 GGAGATGCCAAGACGAATACCTTCTGTGGGACACCT(서열번호 9)에 하이브리드화한다(도 2B 및 2C 참조). 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 길이가 20개의 뉴클레오타이드일 수 있지만, 길이가 약 20개 내지 약 200개 뉴클레오타이드의 범위일 수 있거나 전체길이의 유전자 표적일 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 당해 분야에 공지된, 예를 들어, 문헌[참조: Methods in Enzymology, Antisense Technology, Parts A and B (Volumes 313 and 314) (M. Phillips, ed., Academic Press, 1999)]에 기술된 바와 같은 표준 공정을 사용하여 목적하는 치료 효과를 수득하기에 적절한 표적 및 적절한 길이의 안티센스 핵산을 선택할 수 있다. 본 발명에서 유용한 안티센스 분자의 비제한적 예는 문헌[참조: Bennett et al., 미국 특허 제6,190,869호(2001년 2월 20일자로 허여); 이는 본원에서 참조로 인용된다]에 기술되어 있다.
RNA 간섭은 침묵된 유전자 표적에 상동인 소형의 간섭성 이본쇄 RNA 단편에 의해 야기된 서열-특이적인, 전사후 유전자 침묵화를 말한다[참조: Lee, N. S. et al., Nature Biotech. 19:500-505 (2002)]. 이들 siRNA는 천연 mRNA 분자를 특이적으로 표적화하여 제거할 수 있다. siRNA를 사용한 단백질 생산의 억제 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, PCT 국제 공개공보 제WO 01/75164호; 제WO 00/63364호; 제WO 01/92513호; 제WO 00/44895호; 및 제WO 99/32619호에 기술되어 있다.
기능적 PKC-θ 단백질의 생산 또는 PKC-θ 키나제 활성을 조절하는데(예를 들어, 감소시키는데) 사용할 수 있는 다른 제제에는 제한됨이 없이, 세포 표면 막으로의 PKC-θ의 전위를 차단하는 제제가 포함된다. 사용될 수 있는 다른 제제에는 본원에서 기술하는 스크리닝 분석법에서 발견된 제제들이 포함된다.
추가의 제제, 또는 PKC-θ의 억제제 또는 길항제에는 예를 들어, PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 단백질의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체 및 소분자가 포함된다. "특이적으로 결합한다"란, 본 발명의 항체가 PKC-θ 단백질(또는 이의 일부분)을 인식하여 10-5 M 이상의 해리 상수(KD) 또는 10-6M 이상, 10-7 M, 10-8M 이상 또는 10-10M 이상의 KD로 결합함을 의미한다. 결합 및 결합 친화성을 측정하는 표준 방법은 익히 공지되어 있다. 따라서, PKC-θ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 PKC-θ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체에는 제한됨이 없이, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 사람화 항체, 유전자 조작된 항체, 이특이성 항체, 항체 단편("Fv" "F(ab)"2, "F(ab)" 및 "Dab"를 포함하나 이에 제한되지 않음) 및 항체의 반응성 부분을 대표하는 단일 쇄가 포함된다. 상기한 항체 형태 각각의 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
예를 들어, 폴리클로날 항체는, 정제된 포유동물 PKC-θ 단백질을 다양한 동물에게 주사하고, 혈청에서 생성된 항체를 분리함으로써 수득할 수 있으며, 이는 예를 들어 문헌[참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 이는 규칙적이고 정기적으로 갱신된다]에 보다 충분히 기술되어 있다. 항체는 모노클로날 항체일 수 있으며, 이의 제조방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
특이적 모노클로날 항체는 시판되는 것을 입수하거나 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976)]의 기법, 및 이를 개선 또는 변형시킨 기법으로 수득할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이러한 방법은 목적하는 항체를 생산할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 불멸 세포주는 선택된 항원을 마우스와 같은 동물에게 주사하고, 상기 동물의 비장으로부터 B 항원을 수거하고, 세포를 골수종과 융합시켜 하이브리도마를 형성시켜 제조할 수 있다. 단일 콜로니를 목적하는 에피토프에 대한 고치환성 항체를 분비하는 능력에 대해 선별하고 당해 분야에서 통상적인 과정으로 시험할 수 있다.
또는, 항체는 당해 분야에 공지된 각종 방법을 사용하여 발현 라이브러리로부터 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, cDNA를 바람직하게는 목적하는 항원이 주사된 동물로부터의 림프구, 바람직하게는 B 림프구로부터 분리된 리보핵산(RNA)으로부터 제조할 수 있다. 각종 면역글로불린 유전자를 암호화하는 cDNA와 같은 cDNA를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키고 파아지 디스플레이 벡터와 같은 적절한 벡터로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터를 세균 현탁액, 바람직하게는 이. 콜라 및 박테리오파아지를 현탁액에 첨가할 수 있거나, 파아지 입자의 표면에 연결된 상응하는 항체 단편을 표시하는 파아지 입자를 제조할 수 있다. 목적하는 항체를 포함하는 파아지 입자를 예를 들어, 패닝(pannin)과 같은 친화성 정제 기법을 포함하는 당해 분야에 공지된 방법으로 스크리닝하여 서브라이브러리를 작제할 수 있다. 이어서, 서브라이브러리를 사용하여 세균 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포와 같은 목적하는 세포 유형으로부터 항체를 분리할 수 있다. 본원에서 기술하는 재조합 항체의 제조 방법 및 이의 변형은 예를 들어, 문헌[참조: Griffiths, W.G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994); Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Winter, G. and Milstein, C., Nature 349:293-299 (1991); Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위해, PKC-θ 단백질은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있고 앞서 논의한 기법으로 항체를 제조하는데 사용하기 전에 먼저 정제할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 시험 제제를 사전 스크리닝함으로써 시험 제제의 수를 감소시키기 위한 비제한적 방법을 제공한다. 예를 들어, PKC-θ 단백질 또는 PKC-θ 유전자 발현을 지시하는 프로모터에 결합하는 능력을 갖는 시험 제제만을 본 발명의 기능적 분석법에서 사용할 수 있다.
시험 제제를 먼저 PKC-θ 단백질에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하는 비제한적 예에서는, 정제된 PKC-θ 단백질을 분리하고 시험 제제를 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 정제된 PKC-θ 단백질을 고체상 표면(예: 세파로스 비이드 또는 플라스틱)에 고정시키고, 시험 제제를 정제된, 고정된 PKC-θ 단백질과 접촉되도록 할 수 있다. 대안적 예로서, PKC-θ 단백질을 시험 제제에 노출시킨 후, PKC-θ 단백질에 대해 지시된 항체를 첨가하고 이를 사용하여 PKC-θ 단백질을 면역침전시킴으로써, 시험 제제가 PKC-θ 단백질과 함께 공동 면역침전되는지를 결정할 수 있다. PKC-θ 단백질에 결합할 수 있는 시험 제제만이 이후에 시험 제제가 PKC-θ 키나제 활성을 조절하거나(예를 들어, 감소시키거나) 비만세포 또는 T 세포(예: TH1 또는 TH2 헬퍼 T 세포(helper T cell))와 같은 세포내의 기능적 PKC-θ 단백질의 양의 조절(예를 들어, 감소)할 수 있는지를 결정하기 위해 기능적 분석법에서 사용될 수 있다.
시험 제제를 먼저 PKC-θ 단백질 프로모터에 결합하는 능력에 대해 스크리닝하는 비제한적 예에서는, 정제된 PKC-θ 프로모터 서열을 DNA 마이크로칩 어레이에서와 같이 고정시킬 수 있다. 이어서, 상이한 시험 제제를 당해 프로모터에 결합하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. PKC-θ 프로모터에 결합할 수 있는 시험 제제만이 이후에 시험 제제가 비만세포 또는 T 세포(예: TH2 T 세포)와 같은 세포내의 기능적 PKC-θ 단백질의 양의 조절(예를 들어, 감소)할 수 있는지를 결정하기 위해 기능적 분석법에서 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 산물을 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 시험 제제와 접촉시키고, 상기 시험 제제가 상기 리포터 유전자 산물의 생산을 감소시키는지를 결정함을 포함하고, 리포터 유전자 산물의 생산을 감소시키는 제제가 천식의 치료에 유용한 제제로서 동정되는, 포유동물(예: 사람)의 천식을 치료하는데 유용한 제제의 동정 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 산물을 암호하는 뉴클레오타이드 서열은 세포(예: 비만세포, 또는 TH1 또는 TH2 헬퍼 T 세포와 같은 T 세포)내에 존재한다.
PKC-θ 프로모터의 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 인정된 방법으로 결정된다. 이러한 방법의 한가지 비제한적 예는 프로브로서 PKC-θ의 뉴클레오타이드 서열을 사용한 다음, 5' 위치에 프로브가 결합된 뉴클레오타이드 서열을 분리하여 관심대상의 프로모터 서열에 대한 게놈 라이브러리(예: YAC 사람 게놈 라이브러리)를 스크리닝하는 것이다. 적절한 프로모터 서열을 결정하는 방법의 또 다른 비제한적 예는 전기영동적으로 분해된 사람 게놈 DNA를 프로브(예: 사람 PKC-θ 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브)를 이용하여 프로빙(probing)한 다음, cDNA 프로브가 어느 곳에 하이브리드화하는지를 결정하여 사람 게놈 DNA의 서던 블롯팅 분석을 수행하는 것이다. 프로브가 하이브리드화하는 밴드가 결정되면, 이 밴드를 분리시키고(예를 들어, 겔을 절단해내어) 서열분석한다. 이로써 5'에 뉴클레오타이드 ATG(즉, 전사 개시 부위)가 있는 뉴클레오타이드 단편이 검출된다. 상기 뉴클레오타이드 단편은 PKC-θ의 프로모터이며 서열분석할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 단편은 길이가 약 500개 내지 1000개 뉴클레오타이일 수 있다. 이러한 서열과 약 70% 이상, 약 80% 이상 또는 약 90% 이상의 동일성을 갖고 프로모터로서 작용하는, 예를 들어, 본원에서 기술하는 PKC-θ 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시하는 뉴클레오타이드 서열도 본 발명에 포함된다.
광범위한 리포터 유전자가 상기한 PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, β-글루쿠로니다제, 알칼리성 포스파타제 및 녹색 형광 단백질 또는 당해 분야에 공지된 기타 리포터 유전자 산물을 암호화할 수 있다.
본 발명의 한 형태에서, PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결되는 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 숙주 세포로 도입된다. 상기 논의한 바와 같이, 본 발명에서 수많은 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열을 먼저 적절한 또는 앞서 기술한 그 밖의 목적하는 재조합 발현 벡터에 삽입시킬 수 있다.
이러한 본 발명의 형태에서의 벡터는 포유동물 세포에서 PKC-θ 프로모터로부터 리포터 유전자가 발현하기 위해 필수적인 또는 바람직한 기타 공지된 유전 요소를 포함할 수 있으며, 이러한 요소는 조절 요소를 포함한다. 예를 들어, 벡터는 예를 들어, 리포터 유전자의 생체내 전사를 달성하기 위해 생체내에서 프로모터와 협력하는 임의의 필수적 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포로 도입하는 방법은 PKC-θ 단백질의 생산과 관련해 앞서 기술한 바와 같다.
PKC-θ 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 시험 제제와 접촉시킨 후, 상기 시험 제제가 리포터 유전자 산물의 생산을 억제하는지를 결정한다. 이러한 최종 시점은 리포터 유전자 산물의 양 또는 활성을 정량하여 결정할 수 있다. 정량 방법은 사용되는 리포터 유전자에 따라 좌우될 수 있지만, 리포터 유전자 산물에 대한 항체를 이용한 효소 연계된 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)의 이용을 포함한다. 추가로, 당해 분석법은 화학발광, 형광, 방사성 붕괴 등을 측정할 수 있다. 시험 제제가 리포터 유전자 산물의 생산을 억제하는 경우, 이는 천식 치료용 제제로서 분류된다.
본원에서 기술하는 리포터 유전자 산물의 활성 또는 양을 측정하는 분석법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 규칙적이고 정기적으로 갱신되는 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons]에 논의되어 있다. 본원에서 논의되는 리포터 유전자 산물에 대한 분석법의 추가 설명은 예를 들어, 다음 간행물에서 찾아볼 수 있다: 루시페라제에 대해, 문헌[참조: Nguyen, V.T. et al., Anal. Biochem. 171:404-408 (1988)]; β-갈락토시다제에 대해 문헌[참조: Martin, C.S. et al., Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons pp. 525-528 (J.W. Hastings et al., eds., John Wiley & Sons,1997); Jain, V.K. and Magrath, I.T., Anal. Biochem. 199:119-124 (1991)]; β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 및 알칼리성 포스파타제에 대해 문헌[참조: Bronstein, I. et al. Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects, pp. 20-23, (A.K. Campbell et al., eds., John Wiley & Sons, 1994)]; 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제에 대해 문헌[참조: Cullen, B., Methods. Enzymol. 152:684 (1987); Gorman, C. et al. Mol. Cell. Biol. 2:1044 (1982); Miner, J.N. et al., J. Virol. 62:297-304 (1988); Sleigh, M.J., Anal. Biochem. 156:251-256 (1986); Hruby, D.E. and Wilson, E.M., Methods Enzymol. 216: 369-376 (1992)].
PKC-θ 활성을 선택적으로 억제하는 소분자도 또한 천식 치료시 치료제가 된다. 선택성은 다른 PKC 동종형보다 약 20배 큰 IC50으로 PKC-θ을 억제하는 것으로 정의될 수 있다(IC50은 억제제 표적의 50% 활성을 초래하는 억제제의 농도로서 정의된다).
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 천식을 앓거나 천식 증상을 앓는 환자에게 PKC-θ 단백질의 촉매 활성을 감소시키거나 기능적 PKC-θ 단백질의 생산을 감소시키는 제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 천식의 치료 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 포유동물은 사람이다. 일부 양태에서, 천식은 IgE 매개성 천식이다.
본원에서 사용되는 "치료법", "치료하다" 또는 "치료된"은 천식의 증상 또는 합병증 하나 이상을 예방, 감소 또는 제거함을 의미한다. "치료학적 유효량"은 기능적 PKC-θ 단백질의 생산을 억제 또는 감소시킬 수 있거나 PKC-θ 단백질의 키나제 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있는 제제의 양을 의미한다. 임상적으로 유의적인 반응에는 제한됨이 없이, 치료된 상태 또는 상태의 예방의 개선이 포함된다. 물론, 본 발명에 따라 투여되는 제제의 특정 용량은 투여되는 제제, 치료되는 특정 천식 및 유사한 상태를 포함하는 해당 사례의 특정 상황에 의해 결정될 것이다. 천식은 예를 들어, 기도 과민반응을 감소시키거나, 점액 과생산을 감소시키거나, 혈청 IgE 수준을 감소시키거나, 기도 호산구를 감소시킴으로써 치료된다.
당해 제제는 장내, 비경구 및 국소 경로를 포함하는 광범위한 경로를 통해서 포유동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 당해 제제는 경구, 비내, 흡입에 의해, 근육내, 피하, 복강내, 혈관내, 정맥내, 진피내, 피하 투여하거나 이들 경로를 임의로 조합하여 투여할 수 있다.
당해 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및 이의 제형화는 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[참조: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th Edition, ed. A. Gennaro (ed.), Lippincott, Williams & Wilkins, 2000)]에 기술되어 있다. 일부 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체는 에어로졸 형태이다. 당해 분야에 공지된 모든 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 사용할 수 있다. 담체는 고체, 액체 또는 고체와 액체의 혼합물일 수 있다. 액체 또는 고체와 액체의 혼합물로서 존재하는 경우, 당해 제제를 효율적으로 가용화하는 담체가 바람직하다. 담체는 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 로젠지제, 현탁제, 에멀젼 또는 시럽제의 형태 또는 기타 공지된 형태를 취할 수 있다. 담체는 풍미제, 윤활제, 가용화제, 현탁화제, 결합제, 안정화제, 정제 붕해제 및 캡슐화 물질로서 작용하는 물질을 포함할 수 있다. 고체 또는 액체 담체는 예를 들어, 제제 흡입용 분무기에서 사용되는 경우에 제제를 목적하는 위치로 전달하는 에어로졸의 형태를 취할 수 있다.
전신계적 경구 투여용 정제는 당해 분야에 공지된 부형제, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 당(예: 락토즈, 슈크로즈, 만니톨, 소르비톨), 셀룰로즈(예: 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈), 검(예: 아라비아 검, 트라가칸트 검)와 함께 붕해제(예: 옥수수, 전분 또는 알긴산), 결합제(예: 젤라틴, 콜라겐 또는 아카시아) 및 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크)를 포함할 수 있다. 산제에서, 담체는 유효량의 미분된 억제제와 혼합되는 미분된 고체이다.
액제, 현탁제 또는 시럽제에서, 유효량의 억제제는 멸균수, 염수 또는 유기 용매(예: 수성 프로필렌 글리콜)와 같은 담체에 용해 또는 현탁된다. 수성 전분 또는 나트륨 카복시메틸 셀룰로즈 용액 또는 당해 분야에 공지된 적합한 오일에 억제제를 분산시켜 기타 조성물을 제조할 수 있다.
제제는 치료학적 유효량으로 포유동물에게 투여된다. 이러한 양은 천식을 치료하거나 천식 증상을 감소시키는데 유효하다. 상기 양은 임의의 다른 항천식제가 공동 투여되는지와 관계없이 사용되는 제제의 활성, 이러한 항천식제의 성질, 천식의 성질 및 환자의 건강에 따라 달라질 수 있다. 당해 분야의 숙련가가 이러한 양을 결정할 수 있지만, 전형적인 치료학적 유효량은 약 10 mg/kg/일 내지 약100 mg/kg/을 포함한다. 물론, 구체적 사례에 따라서 보다 낮거나 높은 용량이 필요할 수 있다. 제제가 담체와 배합되는 경우, 당해 제제는 약 1중량% 내지 약 99중량%로 존재할 수 있으며, 나머지 양은 약제학적으로 허용되는 담체로 구성될 수 있다.
특정한 양태에서, 제제 또는 PKC-θ생산 또는 촉매 활성의 억제제는 예를 들어, 하나 이상의 항천식제를 포함하는 조성물로서 공동 투여될 수 있다. 이러한 항천식제는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 이소프로테레놀, 에피네프린, 메타프로테레놀 및 테르부탈린을 포함하는 β-아드레날린성 제제; 테오필린, 아미노필린 및 옥트리필린을 포함하는 메틸크산틴; 베클로메타손, 베타메타손, 하이드로코르티손 및 프레드니손을 포함하는 코르티코스테로이드; 아트로핀 및 이프라트로퓸 브로마이드를 포함하는 항콜린제; 테르페나딘 및 아스테미졸을 포함하는 항히스타민제; 베라파밀, 니페디핀을 포함하는 칼슘 채널 차단제; 및 크로몰린 나트륨 및 네도크로밀 나트륨을 포함하는 비만세포 안정화제를 포함한다.
일부 양태에서, 당해 제제는 핵산 분자이다. 특정한 양태에서, 핵산 분자는 리보핵산 분자이다. 일부 양태에서, 리보핵산 분자는 서열번호 3에 제시한 뉴클레오타이드 서열의 일부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정한 양태에서, 당해 제제는 PKC-θ 단백질을 암호화하는 RNA의 양을 감소시킨다. 일부 양태에서, 당해 제제는 PKC-θ 단백질을 암호화하는 RNA의 해독을 감소시킨다. 특정 양태에서, 당해 제제는 PKC-θ 단백질 또는 이의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체(예: 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 사람화 항체 또는 키메라 항체)이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 내인성 PKC-θ의 발현이 결여된 세포를 특징으로 한다. 특정한 양태에서, 당해 세포는 비만세포이다. 이러한 세포는 예를 들어, 하기하는 PKC-θ 넉아웃 마우스[참조: Sun et al., Nature 404:402-407 (2000)]로부터 분리될 수 있다. 비만세포를 분리하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들어, 하기하는 방법 참조). 이렇게 내인성 PKC-θ 단백질의 발현이 결여된 세포는 또한 PKC-θ를 암호화하는 유전자가 결실되었거나 돌연변이되어서 더이상 내인성 PKC-θ를 발현하지 않게 된 사람 세포일 수 있다.
내인성 PKC-θ 단백질의 발현이 결여된 비만세포는 예를 들어, 시험 제제가 천식의 치료에 유용한 제제인지를 시험하는데 유용하다. 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, 헤마글루티닌(HA)-태그된 PKC-θ를 293 세포에서 발현시켰다. HA-태그된 PKC-θ는 비만세포에서 발현될 수 있으며, HA-태그된 PKC-θ 단백질의 활성 및/또는 양을 시험 제제의 존재하에 이들 세포에서 측정하였다. 그러나, 비만세포가 내인성 PKC-θ를 발현하기 때문에, 일부 시험 제제는 내인성 PKC-θ 단백질에 영향을 줌으로써 HA-태그된 단백질에 미치는 이의 효과를 소거(muting)하였다. 이러한 소거는 PKC-θ 단백질 발현이 결여되어 있고 HA-태그된 PKC-θ 단백질을 발현하는 비만세포에서는 일어나지 않을 것이다. 게다가, 이러한 세포는 야생형 PKC-θ에 영향을 주는 것과 다른 방식으로 HA-태그된 PKC-θ에 영향을 주는 시험 제제를 스크리닝하는데 유용하다.
일부 양태에서, 당해 세포는 외인성 PKC-θ 또는 이의 단편을 발현한다. 이제 상기한 조성물 및 방법을 예시하여 구체적 실시예를 설명할 것이다. 당해 실시예는 바람직한 양태를 예시하기 위해 제공되며 이로써 본 발명의 범주를 제한하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
실시예 1
사람 T 세포의 TCR 공동 자극시 PKC-θ 막 전위 및 활성화 루프 인산화
PKC-θ 널(null)(즉, PKC-θ 넉아웃) 마우스는 생존성이지만, 성숙한 T-세포는 증식, IL-2 생산 및 NF-kB의 활성화에 결함이 있다[참조: Sun et al., Nature 404:402-407 (2000)]. 사람의 배양된 비만세포(HCMC)에서 PKC 키나제 활성은 IgE 수용체 가교결합 후 막으로 신속하게(5분 미만) 국소화된다는 것이 입증되었다[참조: Kimata et al., BBRC 3:895-900 (1999)]. PKC-θ가 TCR 매개성 신호전달에 관여하고 랫트 호염기 백혈병 세포주인 RBL-2H3 세포에서 작용하는 것으로 입증되었기 때문에[참조: Liu et al., J. Leukocyte Biol. 69:831-840 (2001)], BMMC, 복막 비만세포 및 T 세포에서의 PKC-θ의 활성 및 기능을 검사하였다.
TCR 자극 후, PKC-θ는 초분자 활성화 복합체의 중심 영역으로 신속하게 전위되며, 여기서 최대 4시간 동안 체류한다[참조: Huang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9369-9373 (2002)]. 이러한 전위가 PKC-θ 단백질의 인산화의 변화에 상응하는지를 결정하기 위해, 사람 T 세포를 정제하고, PKC-θ전위 및 자가인산화를 분석하였다.
T 세포를 정제하기 위해, 단핵구 제제를 바이올로지칼 스페셜티 스(Biological Specialties, 펜실베니아주 콜마 소재)로부터 입수하였다. 세포를 Ficoll-Histopaque(시판원: 예를 들어, Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트 루이스 소재)상에 적층시키고, 연층을 원심분리 후에 수거하였다. 세포를 PBS로 수회 세척하고, RPMI/10% FCS에서 106/ml의 밀도로 배양하였다. T 세포를 음성 선별법(negative selection)(Dynal Biotech, Oslo, Norway)으로 정제하였다. 정제된 T 세포를 0, 2, 10, 45 및 60분 동안 가용성 항-CD3ε(5㎍/㎖, 10㎍/㎖ 항-mIgG와 가교결합됨) 및 가용성 항-CD28(5㎍/㎖)로 자극하였다(항-CD3ε및 항-CD28은 둘다 BD 바이오사이언스(BD Biosciences, 캘리포니아주 산 호세 소재)로부터 시판되고 있다).
분석을 위해, 자극된 세포를 원심분리하여 수거하고 빙냉 PBS로 1회 세척한다. 세포 펠렛을 저장성 용해 완충액 100㎕[20mM Tris-HCl, pH 7.5, 2mM EDTA, 5mM 에틸렌 글리콜-비스((B-아미노-에틸-에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), mL당 류펩틴 및 아프로티닌 각각 10g, 프로테아제 칵테일 및 포스파타제 억제제]에 재현탁시켜 전세포 용해물을 제조하였다. 25게이지 바늘에 30회 통과시켜 세포 현탁액을 전단한 다음, 280 x g에서 7분 동안 원심분리하여 핵을 침전시켰다. 전세포 추출물을 분석용 분취액을 확보한 후 고속 원심분리(16,000 x g)하여 청정화시켰다. 세포질 추출물을 수거하고, 막 펠렛을 고장성 용해 완충액으로 1회 세척한 다음, 빙상에서 30분 동안 용해시키기 위해 1% NP-40 세제가 첨가된 동일한 완충액에 재현탁시켰다. 세제 가용성 막 분획을 다른 고속 원심분리 단계에 의해 수득하였는데, 나머지 미립자 분획은 막 마이크로도메인을 함유하는 세제 불용성 막 분 획(DI 분획)이었다. 상기 DI 분획을 분석용 SDS-PAGE 샘플 완충액에서 비등시켰다. 아세포 단백질 분획을 4-20% SDS-PAGE로 분석하고, 니트로셀룰로즈로 옮기고, 항-포스포 T538 PKC-θ 특이적 항체(시판원: Cell Signalling Technology, Inc., 매사추세츠주 비벌리 소재)를 이용하여 5% 블롯/TBS-Tween 05%에서 면역블롯팅하였다(도 1A 참조).
이어서, 니트로셀룰로즈 블롯을 스트립하고 항-PKC-θE7(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)로 재프로빙하였다(도 1B 참조). 마지막으로, 도 1C에 도시한 바와 같이, 모든 레인에서의 동일한 부하량을 보장하기 위해, 블롯을 다시 스트립한 다음, 항-액틴(시판원: Santa Cruz Biotechnology, Inc.)으로 재프로빙하였다.
도 1A에 도시된 바와 같이, PKC-θ는 (CD3 및 CD28 자극을 통해) TCR 자극 후에 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 키나제 루프가 활성화되면 자가인산화된다. 자가인산화 사건은 초분자 활성화 복합체의 중심 영역으로의 PKC-θ의 전위와 동시에 일어난다(도 1B 참조). 도 1C에 도시된 바와 같이, 대략 동량의 액틴이 모든 시점의 처리군에서 발견되었다.
따라서, 이러한 결과는 초분자 활성화 복합체의 중심 영역으로의 PKC-θ의 전위가 538번 위치의 트레오닌 아미노산 잔기에서의 키나제의 활성화 루프의 부수적 유도성 인산화와 상응하였음을 나타냈다.
실시예 2
PKC-θ 활성화 루프 자가인산화는 키나제 활성을 위해 요구된다
실시예 1에서 기술한 바와 같이, PKC-θ 막 전위는 사람 T 세포의 T 세포 수용체 공동 자극시 538번 위치의 아미노산 트레오닌에서의 키나제의 활성화 루프의 부수적 유도성 인산화와 상응하였다. 이러한 활성화 루프 인산화는 키나제 기능을 위해서 요구되는 것으로 보고된 바 있다[참조: Liu et al., Biochemical Journal, 2002, 361-255-265]. 이러한 보고를 확인하기 위해, PKC-θ 전체길이 cDNA를 C-말단 헤마글루티닌(HA) 에피토프 태그를 이용하여 플라스미드 pcDNA3(시판원: Invitrogen)로 서브클로닝하여 C-말단 HA 에피토프 태그된 전체길이(WT) PKC-θ(서열번호 11의 뉴클레오타이드; 서열번호 12의 아미노산 서열)을 제조하였다. 아미노산 위치 409번의 라이신을 트립토판으로 돌연변이시켜 HA-태그된, 키나제 활성이 소실된(kinase-dead) PKC-θ를 또한 제조하였다. 이러한 키나제 활성이 소실된 K409W 돌연변이는 PCR 산물을 서브클로닝하여 제조하고, 서열분석하여 확인하였으며(서열번호 13의 뉴클레오타이드 서열; 서열번호 14의 아미노산 서열), pcDNA3 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 사람 배아 신장 293 세포(입수원: 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 버지니아주 마나사스 소재)를 지질을 이용하여(Mirus TransIT-LT1 시약(시판원: Mirus Corporation, 위스콘신주 매디슨 소재)을 이용하여) 이들 발현 작제물로 일시적으로 이중으로 형질감염시켰다. 세포를 웨스턴 블롯 분석 및 활성을 위해 24시간 또는 72시간 후에 수거하였다.
수거된 세포를 고장성 용해 조건에서 용해시키고 핵을 침전시켰다(보다 자세 한 방법은 실시예 1을 참조). 1개의 복제물로부터의 실험 추출물을 SDS-PAGE에 전개시키고 니트로셀룰로즈로 옮기고, 먼저 항-포스포 T538 PKC-θ 특이적 항체(시판원: Cell Signalling Technology, Inc.)를 이용하여 프로빙한 다음, 스트립하고, 항-HA 항체(Santa Cruz)로 재프로빙하였다. 도 2A에 도시한 바와 같이, 키나제 활성이 소실된 전체길이 PKC-θ 단백질이 존재하였지만(항-HA 항체로의 염색에 의해 측정된 바에 따르면), 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 인산화되지 않았다(항-p T538 PKC-θ항체의 염색 결여로 측정된 바에 따르면). 따라서, 도 2A의 형질감염 실험에서 나타난 바와 같이, 야생형 키나제 활성화 루프는 효과적으로 인산화된 반면에, 키나제 활성이 소실된 형태(단백질내 409번 위치의 촉매적 라이신을 트립토판으로 돌여변이시켜 제조함, 따라서, K409W으로 명명함)는 인산화되지 않았다. 다른 PKC 동종형으로부터의 증거가 다른 PKC 동종형으로부터의 증거에 근거할 때 활성화 루프에서의 인산화(즉, 538번 위치에서의 트레오닌)가 PDK-1 키나제에 기인하였음을 보여준다 해도, 본원에서 제시하는 결과는 사람 배아 293 신장 세포에 존재하는 내인성 PDK-1은 PKC-θ 활성화 루프를 인산화하지 않음을 보여준다. 활성화 루프 자가인산화는 세균에서 발현되는 활성 키나제 도메인의 포스포 블롯 분석 및 정제된 키나제 도메인의 분석(데이타는 제시하지 않음)에 의해서도 입증되었다.
그 다음, 동일한 복제물(즉, 도 2A에서 사용된 것)로부터의 세포질 추출물을 펩타이드 기질을 사용하여 시험관내 키나제 활성에 대해 분석하였다. 세포질 추출물은 실온에서 30분 동안 각각 5㎍ 단백질과 함께 최종 용적 30㎕의 ADBII 완충 액(20mM MOPS pH 7.2, 25mM β-글리세로알데히드, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 1mM DTT, 1mM CaCl2) 중의 최종 농도 83μ의 바이오티닐화 펩타이드(아미노산 서열FARKGSLRQ; 서열번호 15), 166mM ATP, 0.5ml의 P33 ATP(특이적 활성 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 84ng/ml 포스파티딜세린, 8.4ng/ml 디아실글리세롤을 이용하여 분석하였다. EDTA를 함유하는 완충액으로 키나제 분석법을 중단하고 세척 및 플레이트 판독기에서의 방사성 검출을 위해 스트렙타비딘 피복된 신티플레이트(scintiplate)로 옮겼다. 단독의 펩타이드 반응 및 단독의 키나제 반응은 배경값으로서 최종 계수로부터 공제하였다.
도 2B에 도시한 바와 같이, 키나제 활성이 소실된 전체길이 PKC-θ 단백질은 사람 배아 신장 293 세포로 형질감염된지 24시간 후 및 72시간 후에 야새형 PKC-θ단백질과 비교해 급격하게 낮은 키나제 활성을 지녔다. 마지막으로, 야생형 PKC-θ 및 키나제 활성이 소실된 전체길이 PKC-θ를 내인성 기질인 IKK(IκBα 키나제)를 인산화하는 능력에 대해 측정하였다. 이를 위해, 이중 세트로부터의 세포를 1% NP-40 용해 완충액에서 용해시키고, 세제 불용성 막 분획을 니트로셀룰로즈로 옮겼다. 니트로셀룰로즈 블롯을 먼저 항-pIKK α/β로 프로빙한 다음, 스트립하고, 항-IKKα로 재프로빙하고, 마지막으로 스트립하고, 항-IKKβ로 재프로빙하였다(모든 항체는 Cell Signaling Technology로부터 입수함). 도 2C에 도시한 바와 같이, 키나제 활성이 소실된 PKC-θ를 제외한 야생형 PKC-θ는 IKK-β를 인산화시켰다.
도 2B 및 2C에 도시한 결과는 합성 기질을 이용한 시험관내 세포 용해물 키 나제 활성(도 2B) 및 내인성 IKK의 인산화(도 2C)로 나타난 바와 같이 활성화 루프 자가인산화(즉, 위치 538번 위치의 트레오닌에서)가 PKC-θ 활성화 및 신호전달을 위해 요구됨을 입증한다. 이러한 결과들은 야생형 키나제가 IKK 인산화를 유도하는 반면에, 키나제 활성이 소실된 형태는 유도하지 못함을 나타낸다. 이러한 결과들은 PKC-θ 활성화 루프 자가인산화가 독특하고 신규한 치료학적 조절 기작임을 확인시켜준다.
실시예 3
PKC-θ 키나제 도메인의 촉매 기작
그 다음, 신규한 인산화된 PKC-θ 키나제 도메인(PKC-θ KD)의 촉매 기작을 해명하기 위해 연구를 착수하였다. 이를 위해, 촉매적 활성 PKC-θ KD를 발현시키고, 인산화 분위의 분석을 위해 정제하였다. 당해 연구를 위해, PKC-θ의 키나제 도메인(PKC-θ KD; 아미노산 잔기 362 내지 706)를 먼저 발현시키고 정제하엿다. 이를 위해, PKC-θ KD(아미노산 잔기 362 내지 706)를 pET16b 발현 벡터로 서브클로닝하여 헥사-히스티딘 태그를 C-말단에 도입하였다. his-태그된 PKC-θ KD의 아미노산 서열은 서열번호 63에 제공한다(서열번호 63의 N-말단 메티오닌 및 글리신 잔기는 전체길이 PKC-θ에서 발생하지 않음을 주지한다). 당해 플라스미드를 이용하여 과발현용 이. 콜라이 균주 BL21-DE3를 형질전환시켰다. 흡광도 0.4의 37℃에서의 10ℓ 세포 배양물을, 이를 수거하고 완충액(25mM Tris pH 8.0, 25mM NaCl, 5mM 2-머캅토에탄올, 5mM 이미다졸, 50μM ATP 및 프로테아제 억제제)에 재현탁시키기 전에 25℃에서 3시간 동안 0.1mM IPTG로 유도하고 미세유동화기를 사용하여 용해시켰다.
용해물을 4℃에서 1시간 동안 니켈-NTA 수지 20mL에 적용하였다. 이어서 상기 수지를 크로마토그래피 컬럼에 붓고 25mM 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액으로 집중적으로 세척하였다. 상기 수지에 결합한 단백질을 200mM 이미다졸 완충액으로 용출시켰다. 이 단백질을 즉시 음이온 교환체 HQ에 부하하고, 25mM 내지 500mM NaCl의 선형 구배를 적용하여 분해시키기 전에 컬럼을 25mM Tris pH 8.0, 25mM NaCl, 5mM DTT, 50μM ATP로 세척하였다. PKC-θ KD를 함유하는 분획을 SDS-PAGE로 선별하고 모아서 25mM Tris pH 8.0, 5mM DTT로 2배 희석시키고, 헤파린 크로마토그래피 컬럼에 부하였다. 통류물을 즉시 하이드록시-아파타이트 컬럼에 적용하고 25mM Tris pH 8.0, 50mM NaCl, 5mM DTT로 집중적으로 세척하였다. 0 내지 100mM의 인산나트륨 선형 구배로 표적 단백질을 용출시켰다. 이어서, 당해 단백질을 Superdex 200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼상에서 단량체로서 크기별로 분류하고, 25mM Tris pH 8.0, 50mM NaCl, 5mM DTT에 대해 밤새 투석하고 농축시켰다.
그 다음, 질량분광 분석을 수행하였다. 이를 위해서, PKC-θ KD(50mM Hepes pH 7.5, 5mM MgCl2, 5mM DTT, 10% 글리세롤 및 0.0025% Brij-35 at 0.25㎍/㎕ 중)를 10% Tricine 겔(Invitrogen)에 전개시키고 쿠마시 블루로 염색하였다. 밴드를 절단해내고 ProGest Investigator 로봇(제조원: Genomics Solutions, Ann Arbor, MI) 트립신(Promega, Madison, WI)을 이용하여 내부 겔 분해(in-gel digestion)하였다. 샘플 용적을 SpeedVac로 감소시키고 0.1M 아세트산으로 최종 용적 약 30㎕이 되도 록 재구성하였다. 이어서, 펩타이드를 나노LC/MS/MS 분석에 적용하였다. 간략하게 언급하면, 샘플을 10㎛ C18 비이드(YMC, Wilmington, NC)로 충전된 75㎛×10cm IntegraFrit 컬럼(제조원: New Objectives, Woburn, MA)에 주입하였다. HPLC구배를 45분에 걸쳐서 250nL/분의 유속으로 4%로부터 60%의 용매 B(용매 A, 0.1M 아세트산/1% ACN; 용매 B, 0.1M 아세트산/90% ACN)로 선형적으로 증가시켰다. 질량 스펙트럼을 LCQ DECA XP 이온 트랩 질량 분광분석계(ThermoFinnigan, San Jose, CA)를 사용하여 수거하였다. Sequest 알고리듬(ThermoFinnigan, San Jose, CA)을 이용하여 PKC-θ와 대조하면서 MS/MS 데이타를 세린, 트레오닌 및 티로신에서의 상이한 인산화 변형에 대해 고찰하였다.
PKC-θ KD에 의한 촉매 기작의 분석을 보조하기 위해, 부위-지시된 돌연변이유발법(키트(시판원: Stratagene, La Jolla, CA)를 이용함)을 이용하여 PKC-θ KD에 다양한 돌연변이를 유발하였다. 이들 돌연변이의 서열은 서열분석으로 확인하였다. 야생형 PKC-θ KD의 발현을 위해 상기한 바와 같이 작제물을 발현시키고, Bradford 분석법(시판원: BioRad, Hercules, CA)으로 단백질을 평가한 후 동량의 이. 콜라이 용해물을 면역블롯 및 키나제 분석법으로 분석하였다. 간략하게 언급하면, 용해물을 4 내지 20% SDS-PAGE로 분석하고, 니트로셀룰로즈로 옮기고, 5% 블롯/TBS-Tween 0.05%에서 항-pT538 PKC-θ 항체(시판원: Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 또는 항-His 항체(시판원: Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 면역블롯팅하였다.
질량분광분석 연구로, PKC-θ KD가 인산화된다는 것이 밝혀졌다. PKC-θ KD 발현이 세린-트레오닌 키나제가 없는 이. 콜라이에서 수행되었기 때문에, 질량분광분석적 발견은 발현된 키나제의 자가인산화의 결과이다. 아미노산 서열에 근거하여 예측된 질량은 41,615달톤이지만, ESI-MS로 측정한 분자량은 42,092달톤 및 42,173 달톤(50% 각각의 종)이었으며, 이는 이. 콜라이에서 5개 또는 6개 아미노산이 자가인산화되었음을 나타낸다. 도 3A 내지 3D은 PKC-θ KD 자가인산화의 특성화를 나타내는 도식이다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 신규한 C2 도메인은 단백질의 아미노산 말단에 위치하며, 뒤디어 2개의 보조인자 결합 C1 도메인 및 이어서 카복시-말단 키나제 도메인이 존재한다. 보존된 인산화 부위(즉, 538번 위치의 트레오닌, 676번 위치의 세린, 685번 위치의 세린 및 695번 위치의 세린)은 도 3A의 도식 위에 표시하며, PKC-θ KD N-말단 및 C-말단 아미노산 잔기(각각 362번 위치 및 706번 위치)는 상기 도식 아래에 표시한다.
질량 분광분석에서, m/z 비는 펩타이드의 질량/전하 비이고, z(전하)는 1이다. 따라서, m/z 비는 펩타이드 단편의 질량을 제공한다. 질량 분광분석법 생성물 이온 스펙트럼 분석은 Ser695가 인산화 부위임을 나타냈다.
따라서, 도 3B는 Ser695가 인산화 부위임을 확인시켜 주는, m/z 705.52에서의 펩타이드 NFpSFMNPGMER(693번 위치 내지 703번 위치에 걸쳐있음)의 생성물 이온 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 3C는 Ser685가 인산화 부위임을 나타내는, m/z 760.48에서의 펩타이드의 ALINpSMDQNMFR(681번 위치 내지 692번 위치에 걸쳐있음)의 생성물 이온 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 3D는 m/z 1159.71에서의 펩타이드 TNTFCGTPDYIAPEILLGQK(536번 위치 내지 555번 위치에 걸쳐있음)의 이온 생성물 스펙트럼을 도시한 것이다. 도 3D의 생성물 이온 스펙트럼은 당해 펩타이드상에 1개의 포스페이트가 있으며 또한 인산화 부위는 Thr536 또는 Thr538임을 나타냈다. 540번 위치의 시스테인 잔기(도 3D에 #로 표시함)가 요오도아세트아미드에 의해 알킬화되어 있음을 주지한다.
따라서, 소수성 모티프 Ser695 및 턴(turn) 모티프 Ser685가 자가인산화 부위로 동정되었다(각각 도 3B 및 3C 참조). 질량 분광분석법으로는 어떠한 Ser662 및 Ser657 턴모티프 잔기도 검출되지 않았다. 다른 PKC 턴 모티프와의 상동성에 근거하면, Ser676은 자가인산화될 가능성이 있지만, Ser676이 트립신 분해 펩타이드에서 검출되지 않았기 때문에 이러한 사실이 본 연구에서는 명백하지 않다.
당해 연구로 활성화 루프내 Thr536 또는 Thr538이 또한 자가인산화된다는 것이 밝혀졌다(도 3D 참조). 세균에서 발현된 PKC-θ KD의 X-선 구조 측정으로 Thr538 잔기가 인산화된다는 것이 확인되었다[참조: Xu et al., J. Biol. Chem. 279(48): 50401-50409 (2004)]. 이러한 결과는 활성화 루프가 PDK-1에 의해 인산화된다는 기존의 안과 대조적이라는 점을 고려하면 놀라운 것이다[참조: Balendran et al., FEBS Lett. 484: 217-223 (2000); LeGood et al., Science 281: 2042-2045 (1998)]. 게다가, 키나제 활성이 소실된 전체길이 PKC-θ 돌연변이체 K409W에 관한 이전의 연구는 이러한 분자가 Thr538에서 인산화되지 않음을 제시하였다[참조: Liu et al., Biochem. J. 361: 255-265 (2002)]. 상기 실시예 2에서 기술한 HEK293 세포 이종 발현 시스템을 사용한 경우, 이 세포에서는 K409W PKC-θ 돌연변이체의 Thr538 인산화가 결여되었음이 또한 관찰되었다(데이타는 제시하지 않음). 이러한 발견은 K409W 키나제 돌연변이체의 자가인산화 불능으로 인해서 Thr538 인산화가 결여되었음을 내포한다. 게다가, K409W PKC-θ 분자의 소실된 Thr538 인산화는 시험관내 세포 용해물 키나제 활성의 결여 및 내인성 IKKα/β인산화(데이타는 제시하지 않음) 둘다와 상관관계가 있다.
PKC-θ 활성화 루프가 PDK-1에 의해 인산화된다는 것이 이미 제시된 바 있기 때문에[참조: Balendran et al., FEBS Lett. 484: 217-223 (2000); LeGood et al., Science 281: 2042-2045 (1998)], 세균에서 발현된 PKC-θ KD의 Thr536 또는 Thr538이 자가인산화됨을 나타내는 질량 분광분석 결과는 놀라운 것이다(도 3B 내지 3D참조). 이는 부분적으로, 수소 결합내 인산화된 Thr538가 선행하는 Thr536의 단일 쇄와 상호작용함을 보여주는 x-선 구조로 설명된다[참조: Xu et al., J. Biol. Chem. 279(48): 50401-50409 (2004)]. 이러한 상호작용은 활성화 루프 및 αC-나선내 상호작용을 추가로 안정화시킬 수 있으며, 이들 두 상호작용은 모두 촉매작용과 관련이 있다[참조: Johnson et al., Cell 85: 149-158 (1996)].
이전의 연구들은 활성화 루프가 지속적으로 인산화되는 PKC-θ에 대한 촉매 적격성 입체형태(catalytic competent conformation)를 제시하였다[참조: Newton, A. C., Biochemical Journal. 370: 361-371 (2003)]. PDK-1은 소수성 모티프 및 턴 모티프상의 보존된 부위에서 일어나는 자가인산화에 선행하여 일어나는 요구되는 변형으로서 키나제 도메인 활성화 루프에서 PKC 및 다른 AGC 계열 키나제를 인산화시킨다[참조: Newton, A. C., Biochemical Journal. 370: 361-371 (2003); Balendran et al., FEBS Lett. 484: 217-223 (2000)]. 본원에서 제시하는 결과는 기존의 가설과 대조적으로, PKC-θ가 고유하게 자가인산화할 수 있음을 보여준다. PKC-θ KD의 특성화에 관한 본원에서 제시하는 발견은 키나제 도메인내 소수성 모티프 및 턴 모티프 이외에 활성화 루프도 자가인산화됨을 뒷받침하는 증거를 제시한다(도 3B 내지 3D 참조). 당해 연구는 세포내에서 PDK-1가 PKC-θ 활성화 루프를 인산화시킬 수 있다는 가능성을 배제하지 않는다. 그러나, 세균에서 발현된 PKC-θ[참조: Smith et al., J. Biol. Chem. 277: 45866-45873 (2002)]와 대조적으로, 당해 실시예에 제시된 발견은 PKC-θ KD가 PKC-θ활성화 루프에서 자가인산화할 수 있고 따라서 필수적 PDK-1 인산화 요건이 됨을 보여준다.
질량 분광분석 데이타는 세균에서 발현된 PKC-θ가 5개 또는 6개의 아미노산 잔기에서 자가인산화됨을 나타낸다. 당해 실험에서 동정된 인산화 부위는 소수성 모티프 Ser695, 턴 모티프 Ser685 및 활성화 루프 Thr538 또는 Thr536를 포함한다. 서열 상동성에 근거하면 인산화될 기능성이 있지만, 턴 모티프 Ser676은 트립신 분해 펩타이드에서 검출되지 않았다. Ser685는 턴 모티프에서 새로이 동정된 자가인산화 부위이다. 마지막으로, 상기 동정된 인산화 부위 이외에, 2개 이상의 추가의 아미노산 잔기가 자가인산화되지만, 이들 기법으로는 검출되지 않았다.
활성화 루프내 아미노산 잔기 Thr538은 키나제 활성을 위해 요구된다[참조: Liu et al., Biochem . J. 361: 255-265 (2002)]. 따라서, 키나제 도메인내 몇가지 인산화 부위 점 돌연변이를 활성화 루프 Thr538 자가인산화에 미치는 이의 효과에 대해 검사하였다. 이를 위해서, PKC-θ KD 단백질의 이. 콜라이 용해물 및 각종 돌연변이를 항-pT538 PKC-θ 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 분석으로 분석하였다. 도 4A에 도시한 바와 같이, 시험된 야생형 PKC-θ KD 단백질 및 3개의 돌연변이 단편만이 538번 위치의 티로신에서 인산화되었다. 블롯을 스트립하고 항-His 항체로 염색하여 재프로빙함으로써 동일한 부하량의 레인을 측정하였다(도 4B 참조). 또한, 이들 이. 콜라이 용해물의 분핵을 용해물 키나제 분석에 적용하였다. 이러한 키나제 분석법은 실온에서 30분 동안 30㎕ 중의 20mM MOPS pH 7.2, 25mM β-글리세로알데히드, 1mM 나트륨 오르토바나데이트, 1mM DTT, 1mM CaCl2 중의 최종 농도 83μ의 바이오티닐화 펩타이드 기질(아미노산 서열 FARKGSLFQ), 166mM ATP, 0.5ml의 P33 ATP(특이적 활성 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 84ng/ml 포스파티딜세린, 8.4ng/ml 디아실글리세롤을 사용하여 수행하였다. 반응물 5 내지 10㎕를 포스포셀룰로즈 종이로 스폿팅하고, 이어서 이 종이를 0.75% 인산으로 3회 세척하고 아세톤으로 1회 세척하였다. 신틸레이션 칵테일을 상기 포스포셀룰로즈 종이에 첨가하고, 결합된 방사성을 신틸레이션 계수기로 검출하였다. 도 4C에 도시한 바와 같이, 시험된 다양한 PKC-θ KD 돌연변이체 중에서, 538번 위치의 트레오닌에서 인산화된 야생형 PKC-θ KD 단백질 및 시험된 3개의 돌연변이 단편만이 시험관내 용해물 키나제 활성 분석법에서 활성을 나타냈다. 게다가, 용해물 키나제 활성은 발현된 돌연변이체 각각에 대해 용해물중에서 검출된 인산화된 538번 위치의 트레오닌(pThr538)의 정도와 상관관계가 있었다(도 4A 및 4C 참조).
항-pT538 웨스턴 블롯 패널에서 현저하게 감소된 신호로 입증된 바에 따르면 PKC-θ KD의 C-말단 소수성 모티프내 695번 위치의 세린(Ser695)도 최적의 활성화 루프 자가인산화를 위해 요구된다(도 4A의 S695A 돌연변이체(즉, 695번 위치의 세린의 알라닌으로의 돌연변이됨) 참조). 따라서, 각각 불활성 및 키나제 활성이 소실된 돌연변이 T538A 및 K409W(도 4A 및 4C 참조)과 매우 유사하게 S695A 돌연변이체(도 4C의 S695A 돌연변이체 참조)의 키나제 활성이 결여되었음으로 입증된 바에 따르면 695번 위치의 세린은 PKC-θ KD 키나제 활성을 위해 필수적이다. 대조적으로, 턴 모티프 잔기 Ser662는 활성 및 Thr538 자가인산화를 위해 중요하지 않은 반면에(도 4A의 S662A 돌연변이체 참조), 턴 모티프 잔기 Ser676 및 Ser685는 부분적으로 영향을 준다(도 4A의 S676A 및 S685A 돌연변이체 참조).
따라서, 돌연변이 분석은 보존된 턴 모티프내 Ser676 및 Ser685이 둘다 PKC-θ KD의 키나제 기능에 부분적으로 영향을 준다는 것을 입증한다(도 4A 및 4C 참조). 전체길이 키나제에서의 S676A 돌연변이는 키나제 활성에 영향을 주지 않는 반면에 전체길이 분자에서의 S695A 돌연변이는 키나제 활성을 80%을 감소시켰다고 이전에 보고된 바 있다[참조: Liu et al., Biochem. J. 361: 255-265 (2002)]. 전체길이 PKC-θ에서 보고된 S695A의 잔류 활성은 키나제 도메인 범주내에서 S695A에 대해 본 발명에서 관찰된 소량의 포스포-Thr538 신호와 일치한다(도 4C의 S695A 돌연변이체 참조). 이는 Ser695 돌연변이가 최적의 Thr538 자가인산화의 손실을 초래함으로써 키나제 활성을 감쇠시킴을 제시한다. 이러한 특징은 또한 다른 PKC 동종형 중에서 PKC-θ에 고유한 것이다. PKC-θ의 경우에, Ser695 및 Thr538 자가인산화는 다소 독립적일 수 있다. 활성화 루프에서 인산화된 PKC 분자는 보조인자 결합, 자가인산화 및 기질 촉매 단계 전에 존재하는 "촉매 적격성 입체형태"라 기술된다[참조: Newton, A. C., Biochemical Journal. 370: 361-371 (2003)]. 최적의 PKC-θ KD 키나제 기능을 위해서, 활성화 루프 및 소수성 모티프 둘다가 PKC-θ"촉매 적격성 입체형태" 기여할 수 있다.
발현된 활성 PKC-θ KD의 인산화 부위 관련성이 확립되었기 때문에, 후속적으로 효소 기작 연구를 수행하여 키나제 촉매 반응을 검사하였다. PKC-θ의 반응속도론적 기작을 결정하는데 사용하기 위해 조사된 펩타이드 기질은 하기 표 1에 제시한다.
Figure 112006044705909-PCT00001
펩타이드 1 및 펩타이드 2는 PKC-α로부터 유래된 기질이다. 펩타이드 3 및 펩타이드 4는 각각 혈청 반응 인자의 인산화 부위[참조: Heidenreich et al., J. Biol. Chem. 274: 14434-14443 (1999)] 및 림프구-특이적 단백질 1내의 인산화 부위[참조; Huang et al., J. Biol. Chem. 272: 17-19 (1997)]로부터 유래된다.
효소 반응속도론 분석을 위해서, ATP, ATPγS, Ficoll-400, 슈크로즈, ATP, ADP, 포스포에놀피루베이트(PEP), NADH, 피루베이트 키나제(PK), 락테이트 데하이드로게나제(LDH), AMP-PNP, 아세토니트릴 및 완충액 HEPES를 시그마 케미칼사(Sigma Chemical Co., 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. 펩타이드 기질, 억제제 및 인산화된 기질 펩타이드는 AnaSpec(캘리포니아주 산 호세 소재), SynPep(캘리포니아주 더블린 소재) 또는 Open Biosystems(알라바마주 헌츠빌 소재)로부터 구입하였다. 효소 활성을 25℃에서 커플링된 PK/ LDH 분석법을 사용한 다음, Molecular Devices 플레이트리더상에서 340nm에서 분광계를 사용하여 측정하였다. 표준 반응은 달리 언급하는 경우를 제외하고는 최종 용적 0.080mL의 25mM HEPES pH 7.5, 10mM MgCl2, 2mM DTT, 0.008% TritonX100, 100mM NaCl, 20단위 PK, 30단위 LDH, 0.25mM NADH 및 2mM PEP에서 수행하였다. PKC-θ KD 농도는 0.156㎍/ml 내지 0.312㎍/ml로 변화시켰다.
이어서, 용매 점도 연구를 수행하였다. 항정상태 반응속도론 파라메터를 다양한 슈크로즈(0 내지 35%) 또는 Ficoll 400 (0 내지 8%)를 함유하는, 효소 반응속도론 분석법에 대해 상기 기술한 완충액 중에서 측정하였다. 25℃에서 Ostwald 점도계를 사용하여 상대적 용매 점도(h rel )를 25mM HEPES pH 7.5, 10mM MgCl2, 2mM DTT and 100mM NaCl에 대해 삼중으로 측정하였다. 비스코겐(viscogen)을 함유하지 않는 완충액은 윗첨자 0으로 표시한다. 커플링 효소 시스템은 이러한 비스코겐에 의해 영향을 받지 않았다. ATPγS을 이용한 티오 효과 연구 및 ADP를 이용한 생성물 억제 연구를 Phenomenex Auga 5 m C18 124 A0 50 mm X 4.60mM 컬럼(00B-4299-E0)을 사용하여 Hewlett Packard 시리즈 1100 HPLC에서 분석하였다. 인산화된 펩타이드를 0% 내지 100% 20mM 포스페이트(pH 8.8)/아세토니트릴(50/50) 구배를 사용하여 비-인산화된 펩타이드로부터 분리하였다. 플루오레세인-표지된 펩타이드를 485nm에서 여기 및 530nm에서의 형광 방출을 모니터링하여 검출하였다.
이어서, 기질 반응속도론을 측정하였다. 이를 위해, 데이타를 표준 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 반응속도론에 대한 수학식 1 또는 기질 억제에 대한 수학식 2에 대입하였다.
Figure 112006044705909-PCT00002
Figure 112006044705909-PCT00003
상기 수학식에서, S는 기질이고, Vmax는 최대 효소 속도이고, Km은 미하엘리스 상수이고, K i 는 기질 억제에 대한 억제 상수이다[참조: Adams, J. A., Biochemistry 42: 601-607 (2003)]. 펩타이드 및 ATP의 다양한 고정 농도에서 수득된 초기 속도를 하기 열거한 수학식에 대입하였다.
Figure 112006044705909-PCT00004
Figure 112006044705909-PCT00005
상기 수학식에서, [A] 및 [B]는 각각 ATP 및 펩타이드의 농도이고, Ka 및 Kb는 각각 ATP 및 펩타이드에 대한 Km이고, Kia는 EA 복합체로부터 A의 해리 상수 이다.
초기 반응 속도를 생성물 억제의 함수(ADP 또는 포스포펩타이드) 또는 교착 억제(dead-end inhibition)의 함수(AMP-PNP)로서 수득하였다. 당해 연구에서, 1개의 기질은 일정하게 유지되는 반면, 나머지 기질은 억제제의 농도가 증가함에 따라 변화된다. 생성물 억제의 경우, 비-변화 기질은 포화 또는 비-포화 수준에서 유지되는 반면, 교착 억제에서 비-변화 기질은 포화 수준에서 유지된다. 데이타를 경쟁적 억제 모델(수학식 5), 무경쟁적 억제 모델(수학식 6) 또는 비경쟁적 억제 모델(수학식 7)에 대입하였다.
Figure 112006044705909-PCT00006
Figure 112006044705909-PCT00007
Figure 112006044705909-PCT00008
상기 수학식에서, K ii 및 K is 는 절편(截片) 및 기울기 억제 상수이다. 데이타를 시그마 플롯 2000 효소 반응속도론 모듈(제조원: SPSS Science, Richmond, CA)을 사용하여 분석하였다.
표 II는 펩타이드 1 내지 4, ATP, 및 펩타이드 부재하의 ATP에 대한 항정상태 반응속도론 파라메타의 개요를 제공한다.
Figure 112006044705909-PCT00009
a 펩타이드 1 및 펩타이드 2는 수학식 2에 대입하고; 펩타이드 3, 펩타이드 4 및 ATP는 수학식 1에 대입한다
b당해 분석법에는 펩타이드 1이 존재한다.
c 당해 분석법에는 펩타이드가 존재하지 않는다.
표 II에 제시한 바와 같이, 펩타이드의 기질의 부재하에, PKC-θ KD는 ATP 펩타이드가 존재하는 경우(18초-1)보다 110배 느리게(0.16초-1) 가수분해시킨다. ATP에 대한 K m 59mM(펩타이드 부재) 및 49mM(포화 펩타이드 1에서)는 펩타이드 기질의 존재하에 ATP의 결합에 유의차가 없음을 보여준다. 포화 ATP에서의 PKC-θ에 대한 항정상태 반응속도론 파라메터는 표 II에 열거한다. 펩타이드 3 및 펩타이드 4는 각각 420mM 및 240mM의 값으로서 PKC-θ 대한 최고치의 K m 를 나타낸다. 대조적으로, 펩타이드 1 및 펩타이드 2는 K m 값이 각각 6.5mM 및 4.3mM이며, 고농도에서 효소의 억제를 유발한다(표 II). 보다 염기성인 펩타이드 1 및 2의 낮은 K m 값은 PKC-θ에 대한 염기성 아미노산 기질 펩타이드 선호성을 내포한다.
흥미롭게도, 보다 긴 염기성 펩타이드 2로 수득된 기질 억제는 보다 짧은 펩타이드 1로 수득된 기질 억제보다 명백하였다(표 II). 따라서, PKC-θ에 대한 반응속도론 파라메터(펩타이드 1 및 ATP)를 NaCl 농도를 증가시키면서 검사하였다. 당해 연구의 결과는 하기 표 III에 제시한다.
Figure 112006044705909-PCT00010
표 III에 제시한 바와 같이, NaCl의 농도가 증가함에 따라 ATP에 대한 K m 및 효소의 증가율 둘다 증가한 반면, 펩타이드 1에 대한 K m 은 상대적으로 일정한 상태를 유지한다. 또한, 기질이 비-생산성 또는 교착 복합체내에서 효소와 조합되는 경우에 일어나는 기질 억제에 대한 NaCl 효과를 검사하여 PKC-θ에 대한 이온 강도 효과를 조사하였다. 기질 억제는 선호되는 염기성 펩타이드 1 및 2에서는 관찰되었지만, 덜 최적의 펩타이드 3 및 4에서는 관찰되지 않았다(표 II 참조). 게다가, 기질 억제는 완충액의 이온 강도에 의존적인 것으로 또한 밝혀졌다. 펩타이드 1에 의한 기질 억제는 NaCl 농도가 250mM로 증가함에 따라 감소한다(표 III 참조)/
따라서, 표 III은 완충액 NaCl 농도가 증가함에 따라 ATP에 대한 PKC-θ KD K m 및 효소 전환율이 증가하였음을 나타낸다. 펩타이드 1 기질 억제에 대한 이온 강도 효과도 또한 관찰되었다. NaCl 농도가 증가함에 따라, 펩타이드 1에서 관찰된 기질 억제는 감소되었다(표 III 참조). 염(NaCl)의 성질 및 이온-쌍 형성에 대한 이의 효과는 이러한 관찰결과에 대한 식견을 제공할 수 있다. 호프마이스터 계열의 양이온 및 음이온에 따르면, NaCl은 코스모트로프와 카오트로프의 중간점에 해당된다[참조: Cacace et al., Quarterly Reviews of Biophysics 30: 241-277, 1997]. 따라서, NaCl은 효소를 석출시키지도 않고 효소를 변성시키지도 않는다. 그러나, 완충액의 이온 강도의 증가는 이온-쌍의 형성에 효과를 미칠수 있다[참조: Park C. R. R., J. Am. Chem. Soc. 123: 11472-11479 (2001)]. 티로신 키나제 Csk와 관련하여, 50mM NaCl의 효과는 음으로 하전된 기질인 기질 폴리(Gly, Tyr)에 대한 K m 를 증가시키는 효과를 갖고 있지만, ATP에 대한 K m 또는 효소의 전환율에는 효과를 미치지 않는다[참조: Cole et al., J. Biol. Chem. 269: 30880-30887, 1994]. PKC-θ KD의 경우, ATP에 대한 K m 의 증가는 다음의 두가지 가능성의 결과일 수 있다: 250mM NaCl에서는 효소-ATP 이성분 복합체에 대한 펩타이드 1의 보다 생산성 결합이 있으며, 관찰된 K m 는 ATP에 대한 실제 K m 를 반영한다; 또는 2) 이온 강도의 증가는 하전된 기질인 ATP에 펩타이드 1과 동일한 방식으로 효과를 미친다. 관찰된 K m 의 증가는 상기한 두가지 가능성이 조합된 결과일 수 있다. 펩타이드 1 기질과 관련하여, 이온-쌍 형성(컬럼비아 상호작용(Columbic interactions))은 이러한 기질이 효소에 결합하는데 있어 중요할 수 있다. pH 7.5에서 펩타이드 1과 같은 염기성 펩타이드는 순 양성 전하를 가질 수 있다. 따라서, NaCl 농도의 증가는 이온-쌍 형성에 덜 유리한 환경을 초래할 것이다[참조: Park C, R. R., J. Am. Chem. Soc. 123: 11472-11479 (2001))]. 이온-쌍 형성이 펩타이드 1의 억제에 기여한다면, NaCl 증가에 의한 기질 억제의 감소는 컬럼비아 상호작용의 약화와 일치한다.
PKC-θ의 반응속론 기작을 결정하는데 있어, 다양한 ATP와의 초기 반응 속도를 100mM NaCl에서 펩타이드의 기질의 고정된 다양한 농도와 대비하여 측정하였다. 그러나, 먼저 펩타이드 1로 분석법을 수행한 결과, 라인웨버-버크(Lineweaver-Burk) 플롯은 펩타이드 1 기질 억제로 인해서 해석하기가 어려웠다(데이타는 제시하지 않음). 그 다음, 라인웨버-버크 플롯의 절편 및 기울기(데이타는 제시하지 않음)를 펩타이드 1에 대해 리플롯팅하였다.
도 5A 및 5B에 도시한 바와 같이, 100mM NaCl에서 펩타이드 1에 대한 절편 및 기울기의 리플롯은 각각 비-직선형이었다. 또한, 동일한 조건하에 펩타이드 3을 사용하여 초기 속도 분석법을 수행하였다. 고정된 다양한 펩타이드 3 농도와 대비한 다양한 ATP 농도는 순차적 반응속도론 기작을 나타내는 라인웨버-버크 플롯(데이타는 제시하지 않음)에서 교차 패턴을 산출하였다. ATP에 대한 Kia 값은 61 + 22μM였으며, ATP에 대한 Ka는 118 + 17μM였다. 이어서, 증가된 염 농도가 펩타이드 1에 대한 기질 억제를 감소시키기 때문에 펩타이드 1에서의 초기 속도 패턴을 625mM NaCl에서 측정하였다(표 III 참조). 수득된 라인웨버-버트 플롯은 펩타이드 1이 기질인 경우에 순차적 반응속도론 기작과 일치하는 교차 패턴(데이타는 제시하지 않음)도 또한 산출하였다. 높은 NaCl 농도에서, 펩타이드 1에 대한 라인웨버-버크 플롯(데이타는 제시하지 않음)의 절편 및 기울기 리플롯은 직선형이었다(도 5C 및 5D 참조). 높은 NaCl에서 수득된 ATP에 대한 Kia 값 66 + 32μM은 100mM NaCl에서 펩타이드 3 경우의 ATP에 대한 Kia 값 61 + 22μM과 유사한 것으로 확인되었다. 이는 증가된 이온 강도는 효소-ATP 복합체로부터의 ATP의 해리 상수에는 영향을 주지 않음을 나타낸다. 625mM NaCl에서 수득된 ATP에 대한 Ka는 100mM NaCl에서 수득된 ATP에 대한 Ka 118 + 17μM와 대조적으로 321 + 19μM이었다. 이는 이온 강도가 증가함에 따라 ATP에 대한 Km가 증가하는 것과 일치한다(표 III).
교착 억제 연구로 ATP가 PKC-θ KD에 결합하는 제1 기질임이 확인되었다. 따라서, 후속적으로 순차적 촉매 기작에서의 기질 결합 순서를 검사하였다. ATP의 비-가수분해성 유사체인 AMP-PNP, 및 펩타이드 1의 세린이 알라닌으로 변화된 펩타이드 5(표 I 참조)를 억제 연구를 위해 사용하였다. 당해 억제 연구의 결과는 표 IV에 제시한다.
Figure 112006044705909-PCT00011
표 IV에 제시한 바와 같이, AMP-PNP는 K i 값이 228μM인 ATP의 경쟁적 억제제임이 확인되었다. 포화 ATP에서 펩타이드와 대비한 AMP-PNP에서는 억제가 관찰되지 않았다. 펩타이드 억제제인 펩타이드 5는 펩타이드 1 뿐만 아니라 펩타이드 3에 대한 경쟁적 억제제인 것으로 나타났으며, K is 값은 각각 10μM 및 4.4μM이다(표 IV 참조). 펩타이드 5는 추가로 K ii 값이 1100μM인, ATP에 대한 비경쟁적 억제제인 것으로 나타났다(표 IV 참조). 이러한 결과들은 PKC-θ에 대한 기질의 순서있는 순차적 첨가와 일치하며, 이때 ATP는 효소와 먼저 결합한 다음에 펩타이드와 결합한다.
PK/LDH 커플링된 키나제 분석법은 촉매적 산물 ADP를 소비하기 때문에, HPLC 분석법을 사용하여 ADP 경우의 억제 패턴을 결정하였다(표 IV 참조). ADP는 K is 가 291μM로서 포화 펩타이드 1에서 ATP에 대한 경쟁적 억제제인 것으로 밝혀졌다. ADP를 포화 ATP에서 펩타이드 1에 대해 분석한 경우에 억제는 관찰되지 않았다. 비-포화 ATP(0.1mM)에서 당해 분석법을 수행한 경우, 494μM의 K is 및 200μM의 K ii 와 함께 비경쟁적 패턴이 관찰되었다(표 IV 참조). ATP에서의 이러한 결과들은 도 6C에 도표로서 도시한 바와 같이 랜덤 기작을 배제하지 않지만, 순차적 순서 반응속도론 기작(도 6A으로서 도시함) 또는 테오렐- 챤스(Theorell-Chance) 반응속도론 기작(도 6B로서 도시함)(여기서, ADP는 방출된 최종 생성물이다)과 일치한다. 반응속도론 기작을 추가로 해명하기 위해, 포스포펩타이드 1을 이용한 생성물 억제 분석법을 수행하였다. 펩타이드 1에서 관찰된 기질 억제로 인해서, 펩타이드 3을 이용하여 생성물 억제 분석법을 수행하였다. 포스포펩타이드 1은 펩타이드 3의 비경쟁적 억제제로서, 포화 ATP 농도에서 K is 가 1700μM이고 K ii 가 1200μM이다(표 IV). 비-포화 ATP에서, 무경쟁적 패턴이 관찰되었며, K ii 는 2000μM이다. 포스포펩타이드 1은 비-포화 펩타이드 3(0.5mM)에서 길항제 ATP의 무경쟁적 억제제로서 K ii 가 1600μM이다. 상기 결과들은 ADP가 방출된 최종 생성물인 순차적 순서 Bi-Bi 기작과 보다 일치한다(도 6A 참조).
촉매작용에서 포스포-전달 단계의 속도를 ATP의 티오 유사체인 ATPγS를 사용하여 조사하였으며, 당해 연구의 결과는 하기 표 V에 제시한다.
Figure 112006044705909-PCT00012
표 V에 나타난 바와 같이, ATP가 ATPγS로 치환됨으로써 반응의 k cat 가 크게 변화되었다. ATP 반응과 비교한 ATPγS 반응은 각각 100mM NaCl 및 250mM NaCl에서 112배 및 146배 느렸다. 그러나, HPLC로 수득된 ATP 및 ATPγS에 대한 K m 는 단지 2배만 차이가 있다(표 V).
화학적 단계가 반응 속도에 대한 단독 기여인자인지를 결정하기 위해, PKC-θ에 대한 항정상태 반응속도론 파라메터에 대한 용매 점도의 효과를 측정하였다. 2가지 유형의 비스코겐, 즉 마이크로비스코겐 슈크로즈 및 마크로비스코겐 Ficoll-400을 당해 연구에서 사용하였다. 마이크로비스코겐은 소분자의 분포에 직접적으로 영향을 주는 동시에 점도계로 수득된 점도 효과를 유발한다[참조: Blacklow et al., Biochemistry 27: 1158-1167 (1988)]. 마크로비스코겐은 점도계로 관찰된 점도 효과를 유발하지만, 소분자의 분포율에 유의적으로 영향을 주지 않아서 당해 분석법에서 관찰된 미세점도 효과의 대조군으로서 사용하였다[참조: Cole et al., J. Biol. Chem. 269: 30880-30887 (1994)]. 펩타이드 1, 펩타이드 3 및 ATP를 2가지 상이한 이온 강도에서 용매 점도를 증가시키면서 측정하였다. 반응속도론 파라메터 k cat 및 k cat /K m 에 대한 용매 점도의 상대적 효과를 완충액의 상대 점도에 대해 플롯팅하고 선형회귀분석에 대입하였다.
도 7A 내지 7D는 PKC-θ KD에 대한 kcat 및 kcat/Km 에 미치는 용매 점도 효과를 도시한 것이다. 도 7A는 다양한 펩타이드 1과 2.0mM로 유지된 ATP에서의 kcat 효과를 도시한 것이다. 도 7B는 0.125mM 펩타이드 1에서 ATP에 대한 kcat/Km을 도시한 것이다. 도 7C는 다양한 펩타이드 3과 2.0mM로 유지된 ATP에서의 kcat 효과를 도시한 것이다. 도 7D는 2.0mM ATP에서 펩타이드 3에 대한 kcat/Km을 도시한 것이다. 도 7A 내지 7D에서, 흰색 원 기호(○)는 증가되는 슈크로즈 중의 100mM NaCl을 나타내고; 흰색 역삼각형 기호(▽)는 증가되는 슈크로즈 중의 250mM NaCl을 나타내고; 검은색 원 기호(●)는 증가되는 Ficoll 400 중의 100mM NaCl를 나타내고; 검은색 역삼각형 기호(▼)는 증가되는 Ficoll 400 중의 250mM NaCl를 나타낸다. 도 7A 내지 7D에서 파선은 기울기 1을 나타낸다. 1의 기울기는 반응속도론 파라메터에 미치는 마이크로비스코겐의 최대 효과를 나타낸다. 마크로비스코겐의 존재하에 효소 속도에 대한 효과는 거의 없었다. 용매의 미세점도가 증가함에 따라 (k cat )η 값에 대한 중간 정도의 효과가 관찰되었다. 이는 100mM NaCl 및 250mM NaCl에서 연구된 모든 세 기질과 관찰된 효소의 속도에서의 선형 감소로서 관찰되었다. 모든 조건하에 수득된 기울기 [(k cat )η]는 0.38 내지 0.54로 다양하였으며, 이는 생성물 방출이 부분적으로 속도-제한적임을 내포한다(도 7A 및 7C). 0.8 내지 1의 값은 생성물 방출이 촉매적 속도-제한 단계임을 나타낸다[참조: Adams, J. A., Biochemistry 42: 601-607 (2003)].
기질의 점착성은 점도 분석으로 측정할 수 있다. 간략하게 언급하면, 점착성 기질의 경우, 생성물 형성 속도는 기질 해리 속도보다 빠른 반면, 비-점착성 기질을 생성물 형성 속도보다 빠르게 효소로부터 해리될 것이다[참조: Cleland, W. W. (1986) Investigations of Rates and Mechanisms of Reactions, Vol. 6, Wiley-Interscience Publications, John Wiley & Sons, New York, NY]. k cat /K m 에 미치는 증가된 용매 미세점도의 상대적 효과를 상대적 용매 점도에 대해 플롯팅하였다(도 7B 및 7D). 미세점도의 효과를 펩타이드 1에 대한 상대적 용매 점도에 대해 플롯팅한 경우, 기울기는 250mM NaCl에서 0.86의 (k cat /K m )η 값이었다(데이타는 제시하지 않음). 데이타는 낮은 이온 강도에서 관찰된 기질 억제로 인해서 100mM NaCl에서 펩타이드 1에 대해서는 수득되지 않았다. 반면에, 펩타이드 3은 어떠한 이온 강도에서도 용매 점도 효과를 나타내지 않았다(도 7D). 당해 연구는 펩타이드 1이 점착성 기질이며 펩타이드 3은 점착성이 아님을 내포한다.
몇몇 키나제에 대한 반응속도론 기작은 보고되었다[참조: Wu et al., Biochemistry 41: 1129 - 1139 (2003); Trauger et al., Biochemistry 41: 8948-8953 (2003); Chen et al., Biochemistry 39: 2079- 2087 (2000)]. 높은 및 낮은 이온 강도에서 두 펩타이드 기질 모두를 이용한 PKC-θ KD 초기 속도 플롯으로 종좌표 좌측 및 아래에서 교차하는 선을 갖는 그래프가 수득되었다. 패턴은 완충액 이온 강도에 의해 영향을 받지 않는 상태를 유지하는 순차적 기작의 명백한 지표가 된다. 또한, 100mM NaCl에서 펩타이드 3에 대한 ATP K ia 값 61μM 및 625mM NaCl에서 펩타이드 1에 대한 ATP K ia 값 66μM에 있어 차이는 없었으며, 이는 효소-ATP 복합체로부터의 ATP의 해리가 이온 강도에 의해 영향을 받지 않음을 추가로 나타낸다. 두 조건 모두에서, K ia 값은 각각 118μM 및 321μM의 K a 값보다 작은 것으로 확인되어 신속-평형 기작을 배제하였다.
교착 억제 및 생성물 억제 연구(표 IV 참조)는 ATP가 제1 결합 기질인 순차적 순서 기작과 일치한다. 펩타이드 억제제(표 I의 펩타이드 5)는 두 펩타이드 기질 모두에 대해 경쟁적이며 ATP에 대해 무경쟁적이다. ATP 유사체 AMP-PNP는 ATP에 대해 경쟁적인 것으로 확인되었지만, 포화 ATP에서 펩타이드 1의 경우 2.0mM AMP-PNP에 대한 억제는 관찰되지 않았다. 경쟁적 패턴은 ATP가 ADP에 대해 변화되는 경우에 관찰되었으며, 펩타이드 1이 포화 ATP에서 ADP에 대해 변화되는 경우에 억제는 관찰되지 않았다. 비경쟁적 패턴은 펩타이드 1이 비-포화 ATP에서 ADP에 대해 변화되는 경우에 관찰된다. 이러한 억제 연구는 PKC-θ KD에 대한 랜덤 기작을 배제시키며 ADP가 도 6A에 도시한 바와 같이 방출된 최종 생성물임을 입증한다.
100mM NaCl에서 펩타이드 1을 이용한 초기 속도 실험은 관찰된 기질 억제의 유형에 대한 약간의 식견을 제공한다. 간략하게 언급하면, 도 8에 도시한 바와 같이 순서있는 2반응물 시스템에서 3가지 유형의 기질 억제가 관찰된다[참조: Segel, I. H. Enzyme Kinetics: Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, Whiely-Interscience, 1975]. 2개는 기질 B가 교착 EB 복합체를 형성하거나 기질 A가 EAA 교착 복합체를 형성하는 기질 억제이다. 세번째는 B가 EBQ 교착 복합체를 형성하는 기질 억제이다. 결합하는 첫번째 기질이 ATP이고 ATP에 의한 기질 억제가 관찰되지 않기 때문에 EAA 교착 복합체의 형성은 배제된다. 도 5A 내지 5D는 100mM NaCl 및 625mM NaCl에서의 펩타이드 1에 대한 초기 속도 데이타의 리플롯을 도시한 것이다. 도 5A 및 5B에 도시된 바와 같이, 억제의 효과는 100mM NaCl에서 기울기 및 절편 리플롯 둘다에서 나타났다(즉, 리플롯은 직선형이 아니다). 그러나, 625mM NaCl에서는(도 5C 및 5D에 도시된 바와 같이), 리플롯은 직선형이 되며, 이는 억제가 높은 이온 강도에서 0.5mM 이하의 펩타이드 1로 소멸됨을 나타낸다. 기울기 및 절편 리플롯 둘다에 대한 기질 억제의 효과는 비경쟁적 기질 억제와 일치한다[참조: Cleland, W. W., Methods Enzymol. 63: 500-513 (1979)]. 관찰된 순서 순차적 기작에서의 비경쟁적 기질 억제는 다음 유형의 비생산성 효소 복합체의 형성을 시사한다. 도 8에 2개의 복합체 EB 및 EBQ 복합체를 나타낸다. 세번째 가능성은 비생산성 EAB 복합체일 수 있다. 이것은, 0mM NaCl에서 기질 억제가 강력하고(0.129mM) ATP 농도가 약 80 x K m (0mM NaCl에서 0.025mM)이기 때문에 명백한 가능성이다. ATP가 가장 먼저 결합하는 순차적 순서 기작에서 EB 교착 복합체를 형성하는 유리 효소는 거의 존재하지 않을 것이다.
포스포로티오에티트를 사용하여 상이한 유형의 효소적 포스포전달 반응을 연구하였다. Csk 키나제의 경우에 ATPγS 반응 속도는 ATP 반응보다 15배 내지 20배 느리게 일어난다[참조: Cole et al., J. Biol. Chem. 269: 30880-30887 (1994)]. 유사하게, 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PLC)의 효소적 기작 연구에서, 반응은 비가교 산소가 황으로 치환된 경우에 105배 느렸다[참조: Kravchuk et al., Biochemistry 40: 5433-5439 (2001)]. ATP 유사체가 사용되는지의 여부와 관계없이, ATP 또는 ATPγS, 생성물 ADP는 동일하다. 따라서, 세포질 속도는 생성물 방출에 의해 영향을 받지 않는 상태를 유지할 것이다. PKC-θ KD에 대해 관찰된 티오 효과는 효소 반응의 전체 속도에 포스포-전달 화학이 기여함을 내포한다. 또한, PKC-θ 로 관찰된 큰 티오 효과는 도 6B에 도시한 테오렐-챤스 순서 순차적 반응속도론 기작을 반박한다[참조: McKay et al., Biochemistry 35: 8680-8685 (1996)]. 테오렐- 챤스 반응속도론 기작에 있어, 3원 복합체는 수명이 짧고, 따라서 화학적 단계가 매우 신속함을 내포한다.
용매 속도의 효과는 효소 반응에서 속도-제한 단계를 결정하는 경우에 매우 유용한 도구이다. 증가된 용매 점도의 효과는 효소로부터 생성물의 확산 및 효소 활성 부위로의 기질의 확산과 같은 비-화학적 단계에서 보여진다[참조: Blacklow et al., Biochemistry 27, 1158-1167 (1988)), and not on a unimolecular step such as the phosphotransfer step (Adams, J. A., Biochemistry 42: 601-607 (2003)]. 본원에서 보고된 PKC-θ 용매 점도 효과 연구는 생성물 방출이 촉매작용에서 부분적 속도-제한 단계임을 나타낸다.
본원에서 제시하는 연구는 PKC 동종형 및/또는 PKC와 높은 유사성을 갖는 AGC 계열 키나제에 대한 식견을 제공하는 PKC 효소 촉매작용 특징 및 반응속도론 기작을 예시한다. 제시된 결과들은 ATP가 먼저 결합하고 ADP가 마지막에 방출되는 순차적 순서 기작과 일치한다. 포스포펩타이드는 방출 및 포스포-전달은 속도 제한 단계에 기여한다. 중요한 점은, 잠재적으로 PKC-θ에 고유한 특징은 본원에서 제시하는 키나제 도메인의 인산화 연구에서 밝혀졌다는 점이다. PKC-θ의 구조적 특징[참조: Xu et al., J. Biol. Chem. 279(48): 50401-50409 (2004)]과 종합하면, 이러한 발견들은 질환 치료법을 위한 당해 키나제의 선택적 표적화를 향상시키는 것과 상당한 연관성이 있다.
실시예 4
PKC-θ 기질의 동정
이어서, 펩타이드 스캐닝 어레이를 수행하여 PKC-θ에 대한 펩타이드 기질을 동정하였다. 이를 위해, 실시예 3에 기술한 바와 같이, 잔기 362번 내지 706번의 PKC-θ의 촉매적 키나제 도메인을 pET-16b 발현 벡터에서 클로닝하였다. 상기 벡터를 사용하여 프레임내에서 C-말단 헥사-히스티딘 태그를 발현 클론에 도입시켰다. 과발현을 위해 플라스미드를 BL21-DE3 이. 콜라이 균주로 형질전환시켰다. 세포 배양물 10ℓ를 초기에 37℃에서 0.4 이하의 O.D.로 성장시킨 다음, 0.1mM IPTG로 발현을 유도하기 전에 온도를 25℃로 강하시켰다. 상기 세포를 수거하기 전에 추가로 3시간 동안 성장시켰다.
상기 세포를 Tris 25mM pH 8.0, NaCl 25mM, 2-머캅토에탄올 5mM, 이미다졸 5mM, ATP 50μM 및 프로테아제 억제제 중에서 미세유동화기를 사용하여 재현탁시키고 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 1시간 동안 뱃치 방법으로 니켈-NTA 수지 20ml(베드)에 적용하였다. 이어서, 수지를 크로마토그래피 컬럼에 붓고 이미다졸을 25mM로 증가시킨 동일한 완충액으로 집중적으로 세척하였다. 200mM 이미다졸 완충액을 이용하여 단계적 용출을 수행하였다. 이어서, 단백질을 음이온 교환체 HQ에 즉시 부하하고, 500mM까지의 NaCl 선형 구배를 적용하여 분해시키기 전에 컬럼을 Tris 25mM pH 8.0, NaCl 25mM, DTT 5mM, ATP 50μM로 세척하였다. SDS-PAGE 선별된 분획을 모으고 Tris 25mM pH 8.0, DTT 5mM으로 2배 희석하고 헤파린 크로마토그래피 컬럼에 부하하였다. 단백질 분획 통류물을 즉시 하이드록시아파타이트 컬럼에 적용하고 Tris 25mM pH 8.0, NaCl 50mM, DTT 5mM으로 집중적으로 세척하였다. 0 내지 100mM의 인산나트륨의 선형 구배로 표적 단백질을 용출시켰다. 이어서, 단백질을 슈퍼덱스 200 크기 배제 크로마토그래피로 단량체로서 크기별로 분류하고, Tris 25mM pH 8.0, NaCl 50mM, DTT 5mM에 대해 밤새 투석하고 농축시켰다.
펩타이드 스폿 합성을 위해, 폴리에틸렌 글리콜 및 Fmoc-보호된 아미노산으로 변형시킨 셀룰로즈 막을 Intavis로부터 구입하였다. Fmoc-보호된-알라닌을 Chem-Impex(Wood Dale, IL)로부터 구입하였다. β-알라닌 스페이서 및 펩타이드를 커플링시켜 막상에 어레이를 규정하고, 문헌[참조: Molina et al., Peptide Research 9: 151-155 (1996); 및 Frank, R., Tetrahedron 48: 9217-9232 (1992)]에 이미 기술되어 있는 표준 DIC/HOBt(디이소프로필카보디이미드/ 하이드록시벤조트리아졸) 커플링 화학을 사용하여 펩타이드를 합성하였다. 활성화된 아미노산을 Abimed ASP 222 로봇을 이용하여 스폿팅하였다. 수동으로 세척 및 탈보호를 수행하고, 최종 합성 사이클 후 펩타이드를 N-말단에서 아세틸화시켰다.
펩타이드 합성 및 측쇄 탈보호 후, 키나제 분석법을 수행하였다. 당해 분석법을 위해, 막을 10분 동안 메탄올로 세척하고 분석 완충액(20mM HEPES pH = 7.5, 10mM MgCl2, 2mM DTT, 100mM NaCl 및 20μM ATP)로 10분 동안 세척하였다. 이어서, 막을 50nM PKC-θ(C-말단 His-태그된 키나제 도메인 아미노산 잔기 362번 내지 706번, 이. 콜라이에서 발현되고 정제됨)과 함께 0.33 Ci/mMol γ-32P-ATP를 함유하는 분석 완충액 중에서 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 막을 0.1 % Triton-X 및 100mM 차가운 ATP를 함유하는 200mM 인산나트륨으로 5회 세척하고, 에탄올로 3회 세척하였다. 이어서, 막을 건조시키고 Biorad Fx를 사용하여 영상화하였다.
이러한 방법들을 사용하여, 384개 펩타이드 서열을 시험하였다. 이들 펩타이드의 인산화는 도 9A에 도시되어 있다. 이들 384 펩타이드 서열 중에서, 다음 서열들이 PKC-θ의 기질인 것으로 나타났다:
FARKGSLRQKN(서열번호 6)
KKRFSFKKSFK(서열번호 16)
QKRPSQRSKYL(서열번호 17)
KIQASFRGHMA(서열번호 18)
LSRTLSVAAKK(서열번호 19)
AKIQASFRGHM(서열번호 20)
VAKRESRGLKS(서열번호 21)
KAFRDTFRLLL(서열번호 22)
PKRPGSVHRTP(서열번호 23)
ATFKKTFKHLL(서열번호 24)
SPLRHSFQKQQ(서열번호 25)
KFRTPSFLKKS(서열번호 26)
IYRASYYRKGG(서열번호 27)
KTRRLSAFQQG(서열번호 28)
RGRSRSAPPNL(서열번호 29)
MYRRSYVFQT(서열번호 30)
QAWSKTTPRRI(서열번호 31)
RGFLRSASLGR(서열번호 32)
ETKKQSFKQTG(서열번호 33)
DIKRLTPRFTL(서열번호 34)
APKRGSILSKP(서열번호 35)
MYHNSSQKRH(서열번호 36)
MRRSKSPADSA(서열번호 37)
TRSKGTLRYMS(서열번호 38)
LMRRNSVTPLA(서열번호 39)
ITRKRSGEAAV(서열번호 40)
EEPVLTLVDEA(서열번호 41)
SQKRPSQRHGS(서열번호 42)
KPFKLSGLSFK(서열번호 43)
AFRRTSLAGGG(서열번호 44)
ALGKRTAKYRW(서열번호 45)
VVRTDSLKGRR(서열번호 46)
KRRQISIRGIV(서열번호 47)
WPWQVSLRTRF(서열번호 48)
GTFRSSIRRLS(서열번호 49)
RVVGGSLRGAQ(서열번호 50)
LRQLRSPRRTQ(서열번호 51)
KTRKISQSAQT(서열번호 52)
NKRRATLPHPG(서열번호 53)
SYTRFSLARQV(서열번호 54)
NSRRPSRATWL(서열번호 55)
RLRRLTAREAA(서열번호 56)
NKRRGSVPILR(서열번호 57)
GKRRPSRLVAL(서열번호 58)
QKKRVSMILQS(서열번호 59)
RLRRLTAREAA(서열번호 60)
이들 펩타이드 중 일부는 도 9B에 도시하며, 여기서 PKC-θ에 의해 인산화된 세린은 볼드체로 표시되어 있다.
PKC-θ에 의해 인산화된 이들 펩타이드 서열은 PKC-θ의 생리학적 기질(들)내에 함유될 수 있으며 그 자체로 세포내 또는 생체내 기질 인산화의 억제를 시험하여 억제제의 생리학적 활성을 시험하는 방법이 될 수 있다. 게다가, 이들 아미노산 잔기 중 어느 하나를 함유하는 생리학적 기질(들)은 PKC-θ 신호전달 경로의 기작이기 때문에 천식의 치료시 억제 또는 조절을 위한 잠재적 치료학적 표적이 될 수 있다.
실시예 5
BMMC에서 IgE 수용체가 가교결합되면 PKC-θ 활성화 루프는 유도적으로 인산화되며 PKC-θ 막 전위가 일어난다
천식 및 알레르기 반응에 있어 활성화 루프(즉, 트레오닌 538)에서의 PKC-θ의 자가인산화의 효과를 고찰하기 위해, 활성화 루프내 PKC-θ의 자가인산화를 BMMC에서의 IgE 수용체 가교결합 후에 측정하였다. 당해 연구를 위해, BMMC를 분리시켰다. 이를 위해, 골수를 C57 Bl/6J 마우스(시판원: The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)의 골(대퇴골 및 경골)로부터 추출한 다음, DMEM 중의 10% HI FCS + PS/gln 및 50μM βME + 20 ng/ml 재조합 쥐 IL-3 및 50 ng/ml 재조합 쥐 SCF(시판원: R&D Systems, Minneapolis, MN)에 5 X105개 세포/ml로 플레이팅하였다. 세포를 3 내지 7일마다 계대배양하였다. 4주 후, 배양물은 95% 초과의 비만세포(IgE 수용체 발현 및 c-kit 발현으로 측정함)였다. 이 시점에서, 세포를 상기 배지에서 오직 쥐 IL-3와 함께 50ng/ml로 배양하였다.
분리된 BMMC를 배양물 중에서 항-DNA(디니트로페닐) IgE로 밤새(약 16시간) 처리하였다. 다음날, 0, 2, 5, 30 및 90분 동안 DNA-BSA를 배양물에 첨가하여 IgE 수용체 가교결합을 유발하였다. 이어서, 처리된 BMMC를 1% NP-40 용해 완충액에서 용해시키고, 세포질 추출물(실시예 1에서 기술한 바와 같이 제조함)을 SDS-PAGE에서 전개시키고 니트로셀루롤즈로 옮겼다. 니트로셀룰로즈 블롯을 먼저 항-포스포T538 PKC-θ 특이적 항체(Cell Signaling Technology)로 프로빙하고, 스트립하고 항-PKC-θ(시판원: Santa Cruz)로 재프로빙하였다.
도 10A에 도시된 바와 같이, 알레르기 및 천식에서의 비만세포 이펙터 기능의 범주에서, PKC-θ는 골수 유래의 점막 비만세포의 IgE 수용체 가교결합되면 트레오닌 538에서 신속하게 인산화되는 것으로 밝혀졌다(도 9A). 처리 섭생과 관계 없이 모든 BMMC는 거의 동등한 양의 PKC-θ을 발현하였다(도 10B 참조). T-세포에서 관찰된 지속된 인산화(도 1A 내지 1C 참조)와 달리, 비만세포에서 상기 부위에서의 인산화는 신속하고 일시적인 것으로 밝혀졌다(도 10A). 도 10A에 도시된 바와 같이, 활성화 루프 인산화는 IgE-수용체 가교결합 후 2분만에 조속히 일어나고 가교결합 30분 후에는 기저 수준으로 복구되는 것으로 밝혀졌다.
PKC-θ 막 전위가 IgE 수용체 가교결합시 발생하는지를 결정하기 위해, BMMC (상기한 바와 같이 분리됨)를 항-DNP IgE로 밤새 처리하고 0분, 2분, 5분 또는 30분 동안 DNP-BSA를 첨가하여 자극시켰다. 이어서, 세포를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 용해시키고 분획화하였다. 막 분획, 세제 불용성 분획(DI) 및 전세포 추출물(WCE)을 SDS-PAGE로 분해시키고 이어서 니트로셀룰로즈로 옮겼다. 이어서, 니트로셀룰로즈 블롯을 먼저 항-PKC-θ(Santa Cruz)로 프로빙한 다음, 스트립하고, 막 및 DI 분획에 대해서는 항-FcεRIγ로 재프로빙하고, WCE에 대해서는 항-액틴(Santa Cruz)으로 재프로빙하여 막 및 DI 분획에서 IgE 수용체(즉, FcεRIγ)의 동등한 발현량을 확인하고 WCE에서 세포성 단백질인 액틴의 동등한 양을 확인하였다. 도 11A에 도시된 바와 같이, PKC-θ는 IgE 수용체가 가교결합한지 2분 후에 BMMC의 막 분획에서 발견될 수 있으며 30분간의 가교결합후에 분명히 명백하다. 마찬가지로, 도 11B에 도시된 바와 같이, PKC-θ가 미자극된 BMMC의 DI 분획(즉, 도 11B의 0분)에서 낮은 수준으로 관찰될 수 있다 해도 IgE 수용체 가교결합 후에 존재하는 단백질의 양은 증가한다. 동등한 양의 IgE 수용체가 도 11A 및 11B에 도시한 모든 세포 레인에 존재하였음을 주지한다.
따라서, T 세포에서의 신호전달과 유사하게 PKC-θ는 비만세포에서 IgE 수용체 가교결합시 막의 불용성 분획으로 신속하게 전위하는 것으로 밝혀졌다. 도 11C는 이러한 결과가 단지 상이한 레인내 PKC-θ 양의 차이 때문이 아니었음을 확인해주는데, 그 이유는 BMMC의 모든 레인은 전세포 추출물 중에 동등한 양의 PKC-θ를 지녔기 때문이다.
실시예 6
PKC-δ 및 PKC-β 분포는 BMMC에서 IgE 수용체 가교결합을 유의적으로 변경시키지 않는다
2개의 추가적 PKC 계열 구성원인 PKC-δ 및 PKC-β는 IgE 수용체 가교결합 후에 비만세포 작용을 매개하는데 연루되었다[참조: Nechushtan et al., Blood 95:1752-1757 (2000); Kalesnikoff et al., J. Immunol. 168: 4737-4746 (2002)]. 다른 PKC 계열 구성원이 BMMC에서 IgE 수용체 가교결합 후에 막으로 전위하였는지를 결정하기 위해서, 그 결과가 도 11A 내지 11C에 제시되어 있는 실시예 5에 기술된 실험으로부터의 분획(즉, 막, DI 및 WCE 분획)을, 블롯을 항-PKC-δ(도 12A) 및 항-PKC-β(도 12B)(둘다 제조원 Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하여 PKC-δ 및 PKC-β(PKC-θ대신에)에 대해 프로빙함으로써 웨스턴 블롯팅 분석하였다. 도 12A 및 12B에 도시된 바와 같이, 유도성 막 전위는 PKC-β(도 12A) 및 PKC-δ(도 12B)의 경우에 검출되지 않았으며, 이들 둘다 자극(즉, IgE 수용체의 가교결합) 전과 후에 세포질, 막 및 세제 불용성 분획 중에 동등한 양으로 존재하였다. 이러한 결과들은 비만세포내 IgE 수용체 신호전달에 있어 PKC-β 및 PKC-δ 둘다와 PKC-θ 조절과의 중요한 차이를 입증한다.
실시예 7
PKC-θ 넉아웃 마우스의 비만세포는 야생형 마우스의 비만세포와 상이하다
PKC-θ 넉아웃 마우스의 연구는 PKC-θ가 TCR-매개성 T 세포 활성화에 필수적임을 제시하였다[참조: Sun et al., Nature 404:402-407 (2000)]. PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC가 야생형 마우스의 BMMC와 상이한지를 결정하였다. 이를 위해, PKC-θ 넉아웃 마우스를 수득하고, 문헌[참조: Sun et al., Nature 404:402-407 (2000)]에 기술된 방법에 따라서 T 세포 증식 결함을 확인하였다(데이타는 제시하지 않음). PKC-θ 결핍의 효과를 점막 비만세포(MMC) 및 연결조직 비만세포(CTMC) 둘다에서 검사하였다. 이러한 개개의 비만세포 표현형은 과립의 조성과 매개체 함량 및 이의 해부학적 분포가 상이하다[참조: Beil et al., Histol Histopathol. 15:937-946 (2000)]. MMC는 폐 및 장의 점막에서 발견되며 고 수준의 프로테아제 트립타제를 함유한다. 이의 과립은 프로테오글리칸 콘드로이틴 설페이트가 풍부하여 세포가 알시안 블루로 염색될 수 있게 한다. 대조적으로, 위, 피부 및 복강에서 발견되는 CTMC는고 수준의 트립타제와 키마제를 발현하며 MMC보다 비교적 높은 수준의 히스타민을 발현한다. 이의 과립은 프로테오글리칸 헤파린 설페이트를 함유하여 세포가 알시안 블루가 아니라 톨루이딘 블루로 염색되게 할 수 있다. 이들 표현형상 구별되는 2가지 비만세포 서브세트는 생체내 기능 및 조절이 상이할 수 있지만[참조: Miller and Pemberton, Immunology 105:375-90 (2002)], 이러한 차이의 정확한 성질은 아직 조사중에 있다. 비만세포에 대한 PKC-θ의 효과를 충분히 조사하기 위해서, 각각의 비만세포 서브세트를 PKC-θ 넉아웃 마우스에서 검사하였다. MMC를 골수 전구세포로부터의 시험관내에서 유도하였다. 대조적으로, CTMC는 마우스의 복강으로부터의 성숙한 형태로 회수할 수 있있었다.
먼저, 야생형 및 PKC-θ 넉아웃 마우스로부터의 CTMC 및 BMMC를 표현형에 따라 비교하였다. 이를 위해서, CTMC를 복강 세척법(peritoneal lavage)으로 분리하고, 사이토스핀을 사용하여 현미경 슬라이드에 도말하고 톨루이딘 블루로 염색한 다음, 사프라닌으로 대조-염색하였다. 대안으로서, 세포를 라이츠-게임사(Wright's-Geimsa)로 염색하였다. 염색 프로토콜은 비만세포 과립을 동정해줄 것이다. 복막 비만세포의 수 또는 비율, 또는 과립 밀도 또는 세포당 분포에서 야생형 마우스와 PKC-θ 넉아웃 마우스 간에 명백한 차이는 없었다(데이타는 제시하지 않음). 야생형 마우스 및 PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC를 실시예 5에 기술된 바와 같이 분리하고 사이토스핀을 사용하여 현미경 슬라이드에 도말한 다음, 3% 아세트산 중의 1% 알시안 블루로 5분 동안로 염색하여 과립을 염색시켰다. 세포를 사프라닌으로 대조-염색하였다. 도 13A에 도시된 바와 같이, 야생형 마우스의 BMMC는 PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC보다 많은 과립을 나타냈다.
이어서, IgE 수용체 가교결합 후 BMMC내 과립화의 차이를 정량하기 위해서, 세포 표면 아넥신 염색을 사용하였다. 세포 표면 아넥신 염색은 과립 막 융합 및 원형질 막상의 포스파티딜세린 노출에 따라서 탈과립화됨에 따라 증가한다. 세포 표면 아넥신 발현의 분석을 위해서, 0.2 mg/ml IgE 항-DNP로 밤새 처리함으로써 야생형 또는 PKC-θ 넉아웃 마우스 유래의 BMMC에 IgE 항-DNP를 부하하였다. 다음날, 세포를 수거하고 PACM 완충액으로 세척하였다. FITC-아넥신을 첨가하고 37℃에서 3분 동안 세포와 함께 항온처리하였다. 시간-기반 데이타 획득을 37℃ 샘플 챔버가 장착된 FACScan에서 개시하고, DNP-BSA의 명시된 농도의 첨가를 차단하여 탈과립화를 유도한 다음, 샘플당 10분 동안 재개하였다. 따라서, 세포는 FITC-표지된 아넥신의 존재하에 탈과립화되도록 유도되었다. 세포 표면에서의 아넥신의 발현은 탈과립화시 세포 막과의 과립 막 융합의 지표이다. 평균 형광 강도를 시간의 함수로서 플로팅하였다(도 13B).
도 13B에 도시된 바와 같이, 야생형과 비교하여 PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC는 탈과립화시 세포 표면이 아넥신 염색되었음을 나타냈으며, 이는 알시안 블루 염색에 의한 이의 낮은 과립 함량과 일치한다(도 13A 참조).
실시예 8
PKC-θ 넉아웃 마우스는 감소된 IgE 수준을 갖는다
이어서, 야생형 마우스 및 PKC-θ 넉아웃 마우스의 CTMC상의 IgE 수용체를 비교하였다. 이를 위해, 야생형 마우스 및 PKC-θ 넉아웃 마우스의 복강을 PIPES-EDTA 완충액으로 세척하였다. 개개 마우스로부터의 미분획화된 복막 세척액의 세포를 1% BSA를 함유하는 PBS(PBS-BSA)로 세척하고, 빙상에서 5mg/ml IgE 항-DNP와 함께 또는 항체 없이 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS-BSA로 세척한 다음, FITC-표지된 항-마우스 IgE 및 PE-표지된 항-ckit(제조원: BD-Pharmingen)로 염색하였다. 평균 형광 강도를 유세포분석법으로 정량하였다. 도 14A에 도시된 바와 같이, 야생형과 비교하여, PKC-θ 넉아웃 마우스는 CTMC 표면에 결합된 IgE의 수준이 유의적으로 감소되었다. 대조적으로, ckit의 발현 수준에서는 차이가 없었다(도 14B). CTMC의 표면 IgE 수용체에 결합된 IgE의 수준은 동물의 순환 IgE 수준과 관계가 있다. CTMC상에서 감소된 비만세포-결합된 IgE는 PKC-θ 넉아웃 마우스가 낮은 수준의 혈청 IgE를 가질 수 있음을 시사한다.
또한, 야생형 마우스와 PKC-θ 넉아웃 마우스의 혈청 항체 수준 간에 유의차가 관찰되었다. 당해 연구를 위해서, 야생형 및 PKC-θ 넉아웃 마우스로부터의 혈청 샘플을 IgE, IgG1 및 IgA의 함량에 대해 분석하였다. 이를 위해서, Maxi-Sorp ELISA 플레이트(시판원: Nunc, Rochester, NY)를 항-마우스 IgE(시판원: Pharmingen, San Diego, CA), IgA에 대해 항-마우스 카파 경쇄(시판원: Sigma, St. Louis, MO) 또는 IgG1에 대해 항-마우스 IgG(Fab-specific; Sigma)로 피복하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20을 함유한 PBS(PBS-Tween)로 세척한 다음, 실온에서 PBS 중의 0.5% 젤라틴으로 2시간 동안 차단시켰다. 혈청 희석액을 PBS-Tween에 첨가하고 실온에서 2 내지 6시간 동안 항온처리하였다. 마우스 IgE 또는 IgA에 대해 지시된 특이적 바이오티닐화 항체(시판원: Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) 또는 IgG1(제조원: Pharmingen)를 사용하고 이어서 HRP-스트렙타비딘(Southern Biotechnology Associates) 및 Sure-Blue 퍼옥시다제 기질(시판원: Kirkegaard and Perry Labs)을 사용하여 결합을 검출하였다. Ig 수준을 적절한 동종형의 정제된 표준물(Pharmingen)을 사용하여 정량하였다 .
따라서, 개개 마우스로부터의 혈청 샘플을 특수한 ELISA를 사용하여 적절한 항체 이소타입의 수준에 대해 분석하고, 정제된 표준물과 비교하여 정량하였다. 도 15A에 도시된 바와 같이, IgE 수준은 PKC-θ 넉아웃 마우스에서 유의적으로 감소되었다. 흔히 IgE와 대등하게 조절되는 IgG1도 또한 감소되었다(도 15B). 대조적으로, IgA 수준은 야생형에 비해서 PKC-θ 넉아웃 마우스에서 높았다(도 15C).
실제로, PKC-θ 넉아웃 마우스의 CTMC는 항-IgE를 사용한 경우 시험관내에서 덜 과립화된 것으로 밝혀졌으며(데이타는 제시하지 않음), 이는 감소된 순환 IgE 수준 및 감소된 비만세포-결합된 IgE와 일치한다(도 14A 및 15A 참조).
PKC-θ 넉아웃 마우스에서 보고된 T 세포 활성화 결함과 달리, PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC에서 유의적 시험관내 비만세포 기능 결함은 관찰되지 않았다(데이타는 제시하지 않음). BMMC 세포는 시험관내에서 골수의 전구체로부터 유도되었기 때문에, 생체내에서 IgE의 수준에 의해 영향을 받지 않으며 시험관내에서 내인성 IgE 항-DNP가 부하될 수 있다. 이어서, DNP-BSA와 IgE 수용체가 가교결합시, PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC가 탈과립화되고 류코트리엔을 생성하고 야생형 마우스의 BMMC에 의해 생산된 수준과 유사한 수준에서 사이토킨을 생산하였는를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 당해 연구를 위해서, 다음 방법에 따라서 비만세포를 DMEM중의 10% HI FCS + PS/gln 및 50μM βME + 50 ng/ml 재조합 쥐 IL-3 + 0.1 mg/ml 항-DNP-IgE(Sigma)에 밤새 플레이팅하였다. 세포를 PACM(110mM NaCl, 5mM KCl, 5mM CaCl2, 2mM MgCl2 및 0.05% BSA를 함유하는 25mM PIPES(pH 7.2))로 세척하고 2.5 X 105개 세포/ml의 최종 농도로 DNP-BSA의 역가측정(시판원: Calbiochem, San Diego, CA)에 플레이팅하여 IgE 수용체 또는 이노마이신을 가교결합시켰다.
히스타민, B-헥소시미니다제 및 류코트리엔 생산 연구를 위해서, 세포를 DNP-BSA 또는 이노마이신의 존재하에 37℃에서 30분 동안 배양하고 이어서 상청액을 수거하고 즉시 시험하거나 동결시켰다. 탈과립화 및 류코트리엔 생산 실험의 결과는 PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC가 탈과립화 및 류코트리엔 생산의 수준이 정상이었음을 나타냈다(데이타는 제시하지 않음). 세포 분취액을 0.1% Triton X-100으로 용해시켜 최대 탈과립화를 측정하였다. 베타-헥소사미니다제의 경우, 상청액을 37℃에서 0.08M 나트륨 시트레이트(pH 4.5) 중의 p-니트로페닐 N-아세틸 B-D 글루코사미니드(Sigma)와 함께 밤새 항온처리하였다. 12 내지 18시간 후, 1N NaOH을 첨가하여 반응을 중단시키고, 405nm에서의 흡수를 분광광도계로 판독하여 베타-헥소사미니다제를 정량하였다. 최대 탈과립화시 유의차는 관찰되지 않았다(데이타는 제시하지 않음).
사이토킨 생산 분석법을 위해서, 항-DNP-IgE에서 밤새 배양한 세포를 상청액을 수거하기 전에 DNP-BSA와 함께 항온처리하여 6시간 동안 IgE 수용체 가교결합을 유발하였다. 상청액을 류코트리엔에 대해서는 LT(C4/D4/E4)(시판원: ALPCO (Windham, NH))용의 특수한 ELISA를 사용하거나 IL-6, IL-13 또는 GM-CSF에 대해서는 특수한 ELISA 분석법(R&D Systems, Minneapolis, MN)을 사용하여 분석하였다. 도 16A 내지 16C에 도시된 바와 같이, PKC-θ 넉아웃 마우스의 BMMC는 야생형 마우스의 BMMC보다 낮은 수준의 사이토킨 TNF-α(도 16A), IL-13(도 16B) 및 IL-6(도 16C)를 지속적으로 생산하였다.
이어서, C57BL/6 마우스(제조원: The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)로부터의 비장을 단일 세포 현탁액으로 만들고, CD4+ 세포를 제조업자의 지침에 따라서 항-CD4 마그네틱 비이드에 이어서 Detach-A-비이드(Dynal Biotech)를 사용하여 분리시켰다. 상기 세포를 휴지기 T 세포인지 또는 활성화되어 이펙터 세포를 생성하는지를 분석하였다. 10% FCS, 2mM L-글루타민, 5x10-5M 2-머캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산(모두 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 자회사인 지브코 라이프 테크놀로지스(Gibco Life Technologies)로부터 입수함)가 보충된 DMEM 배지 중에서 6x105개 CD4+ 세포/ml를 1mg/ml 항-CD3 및 4mg/ml 항-CD28 항체가 피복된 24-웰 플레이트로 플레이팅하여 이펙터 세포를 제조하였다. Th1-편중된 T 세포(Th1-shewed T cell)를 30ng/ml rmIL-12(제조원: Wyeth, Cambridge, MA), 10U/ml rhIL-2(제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 5 mg/ml 항-마우스 IL-4 항체의 존재하에 배양하였다. TH-2 편중된 T 세포를 40ng/ml rmIL-4(제조원: R&D Systems, Minneapolis, MN), 10U/ml rhIL-2(제조원: Invitrogen) 및 5 mg/ml 항-마우스 IFN-g 항체의 존재하에 배양하였다. 3일간 자극 후, 세포를 IL-2(5 U/ml)의 부재하에 추가로 3 내지 4일 동안 확장시켰다. 휴지기 CD4+ T 세포 또는 Th1 또는 Th2 이펙터 세포를 0.5mg/ml의 항-CD3 (2C11)이 피복된 96-웰 평저 플레이트에 1 x 105개 세포/웰로 플레이팅하였다. 모든 항체는 B-D 파밍겐(B-D PharMinger, San Jose, CA)으로부터 입수하였다. 3일 후, 세포 배양 상처액을 수거하고 사이토킨 비이드 분석법(FACS)에 의해 IL-4 및 IL-5에 대해 분석하였다.
도 17A 및 17B에 도시된 바와 같이, PKC-θ 넉아웃 마우스의 T 세포 사이토킨 데이타는 이들 마우스가 이들 두 사이토킨 모두를 감소된 수준으로 생산하였음을 나타냈다.
비감작(naive) PKC-θ 넉아웃 마우스가 순환 IgE 및 IgG1 수준에 결함이 있음을 보여주는 이러한 결과들은 생체내 IL-4의 항상성 수준을 유지하는데 있어 PKC-θ의 역활과 일치한다. IL-4는 Ig(면역글로부린) 유전자 스위칭에 관여하여 IgE 및 IgG1 합성을 야기하는 Th2 사이토킨이다[참조: Bacharier and Geha, J. Allergy Clin. Immunol. 105(2 Pt 2):S547-58 (2000); 및 Bergstedt-Lindqvist et al., Eur. J. Immunol. 18:1073-1077 (1988)]. 우성 음성 유전자 작제물의 T 세포 발현은 PKC-θ가 GDP/GTP 변환 인자 Vav와 공동작용하여 IL-4 유전자 전사를 활성화시킴을 입증하였다[참조: Hehner et al., J. Immunol. 164:3829-3836 (2000)].
실시예 9
PKC-θ 넉아웃 마우스는 내인성 IgE의 존재하에 PCA 모델에서 항-IgE에 반응하여 귀 부종을 증가시켰다
PKC-θ가 IgE 매개성 비만세포 활성화에 관여하는지를 결정하기 위해, PKC-θ 넉아웃 마우스를 수동 피부 아나필락시스(PCA)로 조사하여 호흡기 질환 마우스 모델에서 평가하였다. 따라서, PKC-θ가 IgE 매개성 비만세포 활성화에 관여하는지를 결정하기 위해, PKC-θ -/-(즉, PKC-θ 넉아웃) 마우스 및 C57BL/6 야생형 대조군을 좌측 귀에 항-IgE(Pharmingen; PBS 20ml 중의 0.5mg/kg)로 진피내 챌린지하였다. 대조군으로서, 동물에게 반대쪽 우측 귀에 PBS 20ml를 투여하였다. 항-IgE 챌린저 전에, 0.0001''까지 측정하는 공학 마이크로미터인 Upright Dial Gauge(시판원: Mitutoyo, 일본 소재)를 사용하여 기준선 귀 두께를 측정하였다. 챌린지 후, 귀 두께 측정치를 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간째에 수집하여 기준선 판독치 이상의 증가율로서 표현하였다.
도 18에 도시된 바와 같이, PKC-θ 넉아웃 마우스는 항-IgE에 대해 반응하여 귀 부종이 증가하지 않았다. 실제로, 항-IgE 챌린지 후, 귀 부종은 PKC-θ넉아웃 동물과 비교하여 1시간 시점에서 약 2.5배 더 컸다(도 18). 이들 마우스에서 귀 감소된 부종 반응은 세포 표면 및 순환 IgE 수준과 일치한다. 상기한 바와 같이, PKC-θ 결핍은 보다 적은 수의 비만세포 과립(도 13A 및 13B) 및 보다 낮은 IgE 수준(도 14A)을 야기한다. 이러한 효과는 부분적으로 비만세포 기능을 변경하는데 있어 감쇠된 T 세포 의존적 효과에 기인할 수 있다[참조: Boyce, J. Allergy Clin. Immunol. 111: 24-32 (2003)].
PKC-θ가 IgE 매개성 비만세포 신호전달에 관여하는지를 결정하기 위해, 비만세포-결핍 Kit W / Kit W-v 마우스(시판원: Jackson Laboratory)의 비만세포 결핍을 PKC-θ 넉아웃 마우스 또는 야생형 마우스 유래의 비만세포를 이용하여 선별적으로 복구시켰다. 달리 언급하면, PKC-θ 넉아웃 마우스 또는 정상의 야생형 마우스로부터의 비만세포를 Kit W / Kit W-v 마우스로 전달시켰다(이러한 입양 전달 기법은 문헌[참조: Galli and Lantz, Allergy. In Fundamental Immunology, W.E. Paul (ed.), pp. 1137-1184, Lippincott-Raven Press, Philadelphia PA 1999; and William and Galli, J. Allergy Clin. Immunol. 105(5): 847-859 (2000)]에 검토되어 있다). 간략하게 언급하면, PKC-θ넉아웃 또는 야생형 마우스로부터의 1 x 106개 BMMC를 DMEM 20ml에 재현탁시키고, 7주령의 비만세포-결핍 Kit W / Kit W-v 마우스(10마리 동물/그룹)의 좌측 및 우측 귀 둘다에 주사하였다(1 x 106개 BMCMC/귀) 12주(입양 전달에 의해 전달된 비만세포가 연결 조직내에서 성숙할 수 있기에 충분한 기간) 후에, 마우스를 좌측 귀에 IgE 항-DNP (5㎍/kg)를 진피내 주사하여 감작시켰다. 대조군으로서, 동물에게 0.9% 염수를 우측 귀에 주사하였다. 24시간 후, 동물을 DNP-HSA(10 mg/kg)로 정맥내 챌린지하였다. 기준선 귀 측정치를 챌린지 전 및 챌린지 후 1시간, 2시간, 4시간 및 6시간째에 수집하였다.
당해 결과는 PKC-θ가 결여된 비만세포로 재구성된 Kit W / Kit W-v 마우스가 야생형 비만세포로 재구성된 동일하게 처리된 Kit W / Kit W-v 마우스와 비교하여 귀 부종의 측면에서 차이가 없었음을 나타냈다(데이타는 제시하지 않음). 이러한 결과는PKC-θ 마우스의 귀 부종 결핍이 다른 면역세포 유형에 직접적으로 및/또는 간적접으로 작용하는 T 세포 의존적 이펙터 때문일 가능성이 크다는 것을 시사한다. 면역세포 기능을 억제하고 이에 영향을 주는 일부 T 세포 사이토킨에는 IL-4, IL-5, TNF-α가 포함된다(도 17A, 17B 참조, 데이타는 제시하지 않음).
그러나, 비만세포 데이타는 PKC-θ의 억제가 비만세포 반응을 직접적으로 조절할 수 있음을 시사한다. 상기 논의된 바와 같이, PKC-θ는 IgE 수용체 가교결합시 활성화 루프에서 신속하게 인산화되는 것으로 밝혀졌다(도 10A 및 10B 참조). PKC-δ 또는 PKC-βI/βII가 아닌 PKC-θ의 아세포 분포가 IgE 수용체 가교결합시 변경된다(도 11A 내지 12B 참조). 보다 중요한 점은 IgE에 대해 반응하여 PKC-θ 넉아웃 BMMC에 의한 사이토킨 생산이 감쇠된다는 점이다(도 16A 내지 16C). 이들 세포는 시험관내에서 골수의 전구세포로부터 유도되어 IgE의 생체내 수준에 의해 영향을 받지 않는다.
다른 실험에서는, PKC-θ 넉아웃(즉, PKC-θ -/-) 마우스 및 C57BL/6 야생형 대조군을 챌린지 24시간 전에 좌측 귀에 모노클로날 IgE 항-DNP(Sigma; 0.9% 염수 20㎕중의 5㎍/kg)를 진피내 주사하여 수동적으로 감작화시켰다. 대조군으로서 동물에게 반대쪽 우측 귀에 0.9% 염수 20㎕를 주사하였다. 24시간 후, 기준선 귀 측정치를 수집한 다음, 동물을 DNP-HSA(0.9% 염수 100㎕ 중의 10mg/kg)로 정맥내 챌린지하였다. 다음 6시간에 걸쳐(즉, 챌린지 후 1시간째, 2시간째, 4시간째 및 5시간째에 판독) 귀 두께 측정치를 상기한 바와 같이 수집하였다.
도 19에 도시된 바와 같이, PKC-θ 넉아웃 마우스는 동일하게 처리된 야생형 대응체와 비교하여 귀 부종이 유의적으로 덜하였다. 이러한 PCA 연구의 결과(도 18 및 19)는 동물 질환 모델의 알레르기 및 천식에서의 PKC-θ 소분자 길항제의 용도를 뒷받침한다.
실시예 10
PKC-θ넉아웃 마우스의 TH1 및 TH2 T 세포는 자극에 대한 반응으로서 PKC-θ야생형 마우스와 비교하여 감소된 증식을 나타낸다
PKC-θ 넉아웃 마우스로부터의 분화된 T 세포가 자극에 대해 반응하는 능력이 정상적이였는지를 결정하기 위해서, 야생형 및 PKC-θ 넉아웃 마우스의 비장 세포를 시험관내에서 TH1 또는 TH2 집단으로 분화시켜, PKC-θ 발현의 부재하에 세포의 T 세포 보조 서브세트의 증식 결함을 규명하였다. 당해 실험을 위해서, 항원 비노출 T 세포(naive T cell)를 분리시키고, TH1 및 TH2 이펙터 세포를 생성시켰다. 이를 위해서, C57/B6 마우스(시판원: Taconic, Germantown, NY)의 비장을 단일 세포 현탁액으로 만들었다. 적혈구(RBC)를 RBC 용해 완충액(0.0M Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 중의 0.3g/L 염화암모늄)으로 용해시키고 2회 세척하였다. CD4+ 세포를 항-CD4 마그네틱 입자에 이어서 제조업자의 지침(Dynal Biotech, Oslo, Norway)에 따라서 Detach-A-비이드(Dynal)를 사용하여 분리시켰다. 상기 세포를 항원 비노출 T 세포인지 또는 활성화되어 이펙터 세포를 생성하는지를 분석하였다.
10% FCS, 2mM L-글루타민, 5x10-5M 2-머캅토에탄올, 페니실린, 스트렙토마이신, 나트륨 피루베이트 및 비필수 아미노산(모두 인비트로겐(Invitrogen, Carlsbad, CA)의 자회사인 지브코 라이프 테크놀로지스(Gibco Life Technologies)로부터 입수함)가 보충된 DMEM 배지 중에서 6x105개 CD4+ 분리체/ml를 1㎍/ml 항-CD3 및 4㎍/ml 항-CD28 항체가 피복된 24-웰 플레이트에 플레이팅하여 항원 비노출 T 세포를 활성화시킴으로써 이펙터 세포를 제조하였다. Th1-편중된 T 세포(즉, TH1 세포의 대다수를 차지하는 T 세포 집단)를 30ng/ml rmIL-12(제조원: Wyeth, Cambridge, MA), 10 U/ml rhIL-2(제조원: Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 5㎍/ml 항-마우스 IL-4 항체의 존재하에 3일 동안 배양하여 제조하였다. TH-2 편중된 T 세포를 40ng/ml 재조합 쥐 IL-4(제조원: R&D Systems, Minneapolis, MN), 10U/ml 재조합 사람 IL-2(제조원: Invitrogen) 및 5㎍/ml 항-마우스 IL4의 존재하에 3일 동안 배양하여 제조하였다. 모든 항체는 B-D 파밍겐(B-D PharMinger, 캘리포니아주 산 호세 소재)으로부터 입수하였다.
증식 분석법을 위해서, TH1- 또는 TH2-이펙터 세포를 명시한 바와 같은 5㎍/ml의 항-CD28(클론 37.51) 및/또는 10U/ml 재조합 사람 IL-2의 존재 또는 부재하에 다양한 농도의 항-CD3(2C11)가 피복된 96웰 평저 플레이트에 1 x 105개 세포/0.2 ml/웰로 플레이팅하였다. 2일째에, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘(제조원: Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)로 펄스하고 6 내지 8시간 후에 96웰 플레이트 수거기를 사용하여 필터로 수거하였다. 혼입된 방사성을 액체 신틸레이션 계수기(제조원: Wallac, Gaithersburg, MD)을 사용하여 측정하였다. 모든 항체는 B-D 파밍겐(캘리포니아주 산 호세 소재)으로부터 입수하였다.
도 20 및 21에 도시된 바와 같이, PKC-θ 넉아웃 마우스의 TH1 및 TH2 세포는 최적(0.5㎍/ml) 및 최적 이하(0.05㎍/ml) 항-CD3 신호 강도(각각 도 20C 및 도 21C) 둘다에서의 TCR 자극시 및 TCR/CD28 공동 자극시(각각 도 20A 및 도 21A) 증식 반응이 현저하게 감소되었다. PKC-θ 독립적 경로에 의한 T 세포 증식을 보조하기 위한 내인성 IL-2의 첨가는 오직 최적의 0.5㎍/ml 항-CD3 신호(도 20B, 항-CD28의 존재하 및 도 20D 항-CD28 부재하)에서의 TCR/CD28 공동 자극과 협력할 때만 PKC-θ 넉아웃 마우스의 항원 비노출 TH0, TH1 및 TH2 세포의 감소된 증식 반응을 부분적으로 극복하였다. 최적 이하의 0.05㎍/ml 항-CD3, CD28 공동 자극은 PKC-θ 넉아웃 마우스의 세포의 거의 완전한 증식 결여를 극복하지 못했다(도 21A). 이러한 조건하에 내인성 IL-2(도 21B 및 21D)의 매우 적당한 효과가 있으며, PKC-θ 넉아웃 마우스의 TH2 세포의 증식은 야생형 마우스의 TH2 세포의 증식의 약 30%를 유지한다.
이러한 결과들은 PKC-θ 넉아웃 T 세포에 의한 IL-2 생산의 억제[참조: Sun et al., Nature 404:402-407 (2000)]와 함께, PKC-θ활성이 H0, TH1 및 TH2 세포에서 억제된다면 TCR 자극-유도된 증식은 이러한 세포들에 의해 유지될 수 없음을 시사한다. 따라서, 감소된 TH2 사이토킨 생산과 관련하여, 이들 T 헬퍼 세포는 천식 및 알레르기 질환 생리에서 T-세포 의존적 경로를 매개하는 최적의 이펙터 세포로서 작용하지 않을 것이다. 이러한 발견으로부터, 본 발명의 추가 측면은 TH2 T 세포에서 PKC-θ를 표적화하는 것이다. 따라서, 본 발명은 TH2 T 세포에서 PKC-θ를 표적화함으로써 천식의 증상을 예방 및/또는 경감시키기 위한 치료학적 중재를 제공한다.
본 발명을 도면 및 상기 설명으로 상세히 예시하고 기술하였지만, 예시적이고 특징을 제한하지 않는 것으로 고려될 것이며, 단지 바람직한 양태만이 제시되고 기술되었으며 본 발명의 범주내에 속하는 모든 변형 및 변화가 보호되는 것이 바람직하다는 것이 이해될 것이다.
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ttctgcacat tccagaccaa 1440 ggaaaatctc tttttcgtga tggagtatct caatggaggc gacttaatgt accacatcca 1500 aagttgccac aaatttgatc tttccagagc cacgttttat gctgctgagg tcatccttgg 1560 tctgcagttc cttcattcca aaggaattgt ctacagggac ctgaagcttg ataatatcct 1620 gttagacaga gatggacata tcaaaatagc agactttggg atgtgcaaag agaacatgct 1680 aggagatgcg aagacaaata ctttctgtgg aactcctgac tacattgctc cggagatctt 1740 gctgggtcag aagtacaacc attccgtcga ctggtggtcc ttcggggtgc tcgtttatga 1800 gatgctgatt ggccagtccc ccttccacgg gcaggacgag gaggagctgt tccactccat 1860 ccgcatggac aaccccttct acccgaggtg gctcgaaagg gaggccaagg accttctagt 1920 gaagcttttt gtgagagaac ctgagaagag gctgggagtg agaggagaca tccgccagca 1980 tcctttgttt cgagagatca actgggaaga gcttgaaagg aaagagattg acccaccctt 2040 cagaccaaaa gtgaaatcac catatgactg tagcaatttc gacaaggaat tcctaagtga 2100 gaaaccccgg ctatcattcg ccgacagagc actcatcaac agcatggacc agaacatgtt 2160 cagcaacttt tccttcatta acccagggat ggagactctc atttgctcct gaacctcatc 2220 tgtctccaga ctggaaggga tttgccttct ctctgggaac 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atcacgttgt tcccagtgat 3120 ttgatggcaa ataagtccct ccttaggcat cctgcaagac aacccaaccc atgcatgcta 3180 tttgcagtag tcagtcctgt tgagttagag tcctaactat acacaatatc gtgcgatgtt 3240 tatatatgtt gatgagatgt tgtgatgata acgtggatat gtaaaaggga ataaaagaag 3300 aaagaaagat gcc 3313 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Phe Ala Arg Lys Gly Ser Leu Arg Gln Lys Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 cagaatatgt tcaggaactt ttccttcatg aaccccg 37 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 8 Gln Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser Phe Met Asn Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 36 <212> 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Ala Pro Glu Ile Leu Leu Gly Gln Lys Tyr Asn His Ser Val 545 550 555 560 Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln 565 570 575 Ser Pro Phe His Gly Gln Asp Glu Glu Glu Leu Phe His Ser Ile Arg 580 585 590 Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro Arg Trp Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp 595 600 605 Leu Leu Val Lys Leu Phe Val Arg Glu Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val 610 615 620 Arg Gly Asp Ile Arg Gln His Pro Leu Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu 625 630 635 640 Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile Asp Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys 645 650 655 Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn Phe Asp Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys 660 665 670 Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp Arg Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln 675 680 685 Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu 690 695 700 Ile Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 705 710 715 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 15 Phe Ala Arg Lys Gly Ser Leu Arg Gln 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 16 Lys Lys Arg Phe Ser Phe Lys Lys Ser Phe Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 17 Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg Ser Lys Tyr Leu 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 18 Lys Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His Met Ala 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Leu Ser Arg Thr Leu Ser Val Ala Ala Lys Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 20 Ala Lys Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His Met 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 21 Val Ala Lys Arg Glu Ser Arg Gly Leu Lys Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 22 Lys Ala Phe Arg Asp Thr Phe Arg Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Pro Lys Arg Pro Gly Ser Val His Arg Thr Pro 1 5 10 <210> 24 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Ala Thr Phe Lys Lys Thr Phe Lys His Leu Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Ser Pro Leu Arg His Ser Phe Gln Lys Gln Gln 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Lys Phe Arg Thr Pro Ser Phe Leu Lys Lys Ser 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Ile Tyr Arg Ala Ser Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Lys Thr Arg Arg Leu Ser Ala Phe Gln Gln Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala Pro Pro Asn Leu 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Met Tyr Arg Arg Ser Tyr Val Phe Gln Thr 1 5 10 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gln Ala Trp Ser Lys Thr Thr Pro Arg Arg Ile 1 5 10 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Arg Gly Phe Leu Arg Ser Ala Ser Leu Gly Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Glu Thr Lys Lys Gln Ser Phe Lys Gln Thr Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Asp Ile Lys Arg Leu Thr Pro Arg Phe Thr Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 35 Ala Pro Lys Arg Gly Ser Ile Leu Ser Lys Pro 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 36 Met Tyr His Asn Ser Ser Gln Lys Arg His 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 37 Met Arg Arg Ser Lys Ser Pro Ala Asp Ser Ala 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Thr Arg Ser Lys Gly Thr Leu Arg Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Leu Met Arg Arg Asn Ser Val Thr Pro Leu Ala 1 5 10 <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Ile Thr Arg Lys Arg Ser Gly Glu Ala Ala Val 1 5 10 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Glu Glu Pro Val Leu Thr Leu Val Asp Glu Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ser Gln Lys Arg Pro Ser Gln Arg His Gly Ser 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Lys Pro Phe Lys Leu Ser Gly Leu Ser Phe Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Ala Phe Arg Arg Thr Ser Leu Ala Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Ala Leu Gly Lys Arg Thr Ala Lys Tyr Arg Trp 1 5 10 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg 1 5 10 <210> 47 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Lys Arg Arg Gln Ile Ser Ile Arg Gly Ile Val 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gly Thr Phe Arg Ser Ser Ile Arg Arg Leu Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Val Val Gly Gly Ser Leu Arg Gly Ala Gln 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Leu Arg Gln Leu Arg Ser Pro Arg Arg Thr Gln 1 5 10 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Lys Thr Arg Lys Ile Ser Gln Ser Ala Gln Thr 1 5 10 <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Asn Lys Arg Arg Ala Thr Leu Pro His Pro Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Asn Ser Arg Arg Pro Ser Arg Ala Thr Trp Leu 1 5 10 <210> 56 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Arg Leu Arg Arg Leu Thr Ala Arg Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Asn Lys Arg Arg Gly Ser Val Pro Ile Leu Arg 1 5 10 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Gly Lys Arg Arg Pro Ser Arg Leu Val Ala Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gln Lys Lys Arg Val Ser Met Ile Leu Gln Ser 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Arg Leu Arg Arg Leu Thr Ala Arg Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic PKC-O sequence <400> 61 Pro Glu Leu Asn Lys Glu Arg Pro Ser Leu Gln Ile Lys Leu Lys Ile 1 5 10 15 Glu Asp Phe Ile Leu His Lys Met Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys 20 25 30 Val Phe Leu Ala Glu Phe Lys Lys Thr Asn Gln Phe Phe Ala Ile Lys 35 40 45 Ala Leu Lys Lys Asp Val Val Leu Met Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr 50 55 60 Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ser Leu Ala Trp Glu His Pro Phe Leu 65 70 75 80 Thr His Met Phe Cys Thr Phe Gln Thr Lys Glu Asn Leu Phe Phe Val 85 90 95 Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Ser Cys 100 105 110 His Lys Phe Asp Leu Ser Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ile 115 120 125 Leu Gly Leu Gln Phe Leu His Ser Lys Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu 130 135 140 Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Ala 145 150 155 160 Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu Asn Met Leu Gly Asp Ala Lys Thr Asn 165 170 175 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu Leu Gly 180 185 190 Gln Lys Tyr Asn His Ser Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu 195 200 205 Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln Ser Pro Phe His Gly Gln Asp Glu Glu 210 215 220 Glu Leu Phe His Ser Ile Arg Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro Arg Trp 225 230 235 240 Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Leu Val Lys Leu Phe Val Arg Glu 245 250 255 Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val Arg Gly Asp Ile Arg Gln His Pro Leu 260 265 270 Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile Asp Pro 275 280 285 Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn Phe Asp 290 295 300 Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp Arg Ala 305 310 315 320 Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser Phe Met 325 330 335 Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu Ile Ser 340 345 <210> 62 <211> 347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic PKC-O sequence <400> 62 Met Gly Pro Glu Leu Asn Lys Glu Arg Pro Ser Leu Gln Ile Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ile Glu Asp Phe Ile Leu His Lys Met Leu Gly Lys Gly Ser Phe 20 25 30 Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Phe Lys Lys Thr Asn Gln Phe Phe Ala 35 40 45 Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val Val Leu Met Asp Asp Asp Val Glu 50 55 60 Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ser Leu Ala Trp Glu His Pro 65 70 75 80 Phe Leu Thr His Met Phe Cys Thr Phe Gln Thr Lys Glu Asn Leu Phe 85 90 95 Phe Val Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln 100 105 110 Ser Cys His Lys Phe Asp Leu Ser Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu 115 120 125 Ile Ile Leu Gly Leu Gln Phe Leu His Ser Lys Gly Ile Val Tyr Arg 130 135 140 Asp Leu Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys 145 150 155 160 Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu Asn Met Leu Gly Asp Ala Lys 165 170 175 Thr Asn Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu 180 185 190 Leu Gly Gln Lys Tyr Asn His Ser Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val 195 200 205 Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln Ser Pro Phe His Gly Gln Asp 210 215 220 Glu Glu Glu Leu Phe His Ser Ile Arg Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro 225 230 235 240 Arg Trp Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Leu Val Lys Leu Phe Val 245 250 255 Arg Glu Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val Arg Gly Asp Ile Arg Gln His 260 265 270 Pro Leu Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile 275 280 285 Asp Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn 290 295 300 Phe Asp Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp 305 310 315 320 Arg Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser 325 330 335 Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu Ile Ser 340 345 <210> 63 <211> 353 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic PKC-O sequence <400> 63 Met Gly Pro Glu Leu Asn Lys Glu Arg Pro Ser Leu Gln Ile Lys Leu 1 5 10 15 Lys Ile Glu Asp Phe Ile Leu His Lys Met Leu Gly Lys Gly Ser Phe 20 25 30 Gly Lys Val Phe Leu Ala Glu Phe Lys Lys Thr Asn Gln Phe Phe Ala 35 40 45 Ile Lys Ala Leu Lys Lys Asp Val Val Leu Met Asp Asp Asp Val Glu 50 55 60 Cys Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ser Leu Ala Trp Glu His Pro 65 70 75 80 Phe Leu Thr His Met Phe Cys Thr Phe Gln Thr Lys Glu Asn Leu Phe 85 90 95 Phe Val Met Glu Tyr Leu Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln 100 105 110 Ser Cys His Lys Phe Asp Leu Ser Arg Ala Thr Phe Tyr Ala Ala Glu 115 120 125 Ile Ile Leu Gly Leu Gln Phe Leu His Ser Lys Gly Ile Val Tyr Arg 130 135 140 Asp Leu Lys Leu Asp Asn Ile Leu Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys 145 150 155 160 Ile Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu Asn Met Leu Gly Asp Ala Lys 165 170 175 Thr Asn Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu 180 185 190 Leu Gly Gln Lys Tyr Asn His Ser Val Asp Trp Trp Ser Phe Gly Val 195 200 205 Leu Leu Tyr Glu Met Leu Ile Gly Gln Ser Pro Phe His Gly Gln Asp 210 215 220 Glu Glu Glu Leu Phe His Ser Ile Arg Met Asp Asn Pro Phe Tyr Pro 225 230 235 240 Arg Trp Leu Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Leu Val Lys Leu Phe Val 245 250 255 Arg Glu Pro Glu Lys Arg Leu Gly Val Arg Gly Asp Ile Arg Gln His 260 265 270 Pro Leu Phe Arg Glu Ile Asn Trp Glu Glu Leu Glu Arg Lys Glu Ile 275 280 285 Asp Pro Pro Phe Arg Pro Lys Val Lys Ser Pro Phe Asp Cys Ser Asn 290 295 300 Phe Asp Lys Glu Phe Leu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Ser Phe Ala Asp 305 310 315 320 Arg Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln Asn Met Phe Arg Asn Phe Ser 325 330 335 Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg Leu Ile Ser His His His His His 340 345 350 His <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Ser is phosphorylated <400> 64 Asn Phe Ser Phe Met Asn Pro Gly Met Glu Arg 1 5 10 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Ser is phosphorylated <400> 65 Ala Leu Ile Asn Ser Met Asp Gln Asn Met Phe Arg 1 5 10 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Thr Asn Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Leu 1 5 10 15 Leu Gly Gln Lys 20 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Tyr Leu Arg Arg Ala Ser Val Ala Gln Leu Thr 1 5 10 <210> 68 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Pro Thr Ser Pro Gly Ser Leu Arg Lys His Lys 1 5 10 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ser Leu Arg Gln Lys Asn Val 1 5 10 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Leu Lys Arg Ser Leu Ser Glu Met 1 5 <210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Arg Thr Pro Lys Leu Ala Arg Gln Ala Ser Ile Glu Leu Pro Ser Met 1 5 10 15 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln 1 5

Claims (61)

  1. (a) PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시험 제제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 조절하는지를 결정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 시험 제제의 존재하에서의 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성의 변화가 PKC-θ 단백질의 조절제의 지표가 되는, PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 키나제 활성을 감소시키는 PKC-θ 단백질의 조절제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 억제제인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 키나제 활성을 증가시키는 PKC-θ 단백질의 조절제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 활성화제인 방법.
  4. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질이 전체길이 PKC-θ 단백질인 방법.
  5. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질이 전체길이 PKC-θ 단백질의 기능적 변이체인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 기능적 단편이 PKC-θ 키나제 도메인인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 결정 단계가 시험 제제의 키나제 활성을 시험 제제의 부재하에서의 키나제 활성에 대해 비교함을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 접촉 단계가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편과 시험 제제의 반응 혼합물을 제공함으로써 수행되는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 반응 혼합물이 50mM 내지 100mM, 100 내지 150mM, 150 내지 200mM, 200 내지 250mM 및 250 내지 300mM로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 농도의 NaCl을 포함하는 완충액 중에 존재하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, NaCl의 농도가 250mM인 방법.
  11. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 단편이 진핵성 세포로부터 수득되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 진핵성 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 접촉 단계가 세포내에서 수행되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질의 조절제가 포유동물의 천식을 치료하는데 유용한 방법.
  15. 제14항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 천식이 IgE 매개성 천식인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 키나제 활성이 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화인 방법.
  18. 제17항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화가 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어나는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 자가인산화가 서열번호 1의 538번 위치의 세린 잔기에서 일어나는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단계(a)가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 제제 및 PKC-θ 기질과 접촉시킴을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 키나제 활성이 PKC-θ 기질의 자가인산화인 방법.
  22. 제20항에 있어서, PKC-θ 기질이 R-X-X-S 모티프 또는 R-X-X-T 모티프(여기서, R은 아르기닌이고, X는 미지의 또는 임의의 공지된 아미노산이고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다)를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, PKC-θ 기질이 KKRFSFKKSFK(서열번호 5), FARKGSLRQKN(서열번호 6), FARKGSLRQ(서열번호 15), KKRFSFKKSFK(서열번호 16), QKRPSQRSKYL(서열번호 17), KIQASFRGHMA(서열번호 18), LSRTLSVAAKK(서열번호 19), AKIQASFRGHM(서열번호 20), VAKRESRGLKS(서열번호 21), KAFRDTFRLLL(서열번호 22), PKRPGSVHRTP(서열번호 23), ATFKKTFKHLL(서열번호 24), SPLRHSFQKQQ(서열번호 25), KFRTPSFLKKS(서열번호 26), IYRASYYRKGG(서열번호 27), KTRRLSAFQQG(서열번호 28), RGRSRSAPPNL(서열번호 29), MYRRSYVFQT(서열번호 30), QAWSKTTPRRI(서열번호 31), RGFLRSASLGR(서열번호 32), ETKKQSFKQTG(서열번호 33), DIKRLTPRFTL(서열번호 34), APKRGSILSKP(서열번호 35), MYHNSSQKRH(서열번호 36), MRRSKSPADSA(서열번호 37), TRSKGTLRYMS(서열번호 38), LMRRNSVTPLA(서열번호 39), ITRKRSGEAAV(서열번호 40), EEPVLTLVDEA(서열번호 41), SQKRPSQRHGS(서열번호 42), KPFKLSGLSFK(서열번호 43), AFRRTSLAGGG(서열번호 44), ALGKRTAKYRW(서열번호 45), VVRTDSLKGRR(서열번호 46), KRRQISIRGIV(서열번호 47), WPWQVSLRTRF(서열번호 48), GTFRSSIRRLS(서열번호 49), RVVGGSLRGAQ(서열번호 50), LRQLRSPRRTQ(서열번호 51), KTRKISQSAQT(서열번호 52), NKRRATLPHPG(서열번호 53), SYTRFSLARQV(서열번호 54), NSRRPSRATWL(서열번호 55), RLRRLTAREAA(서열번호 56), NKRRGSVPILR(서열번호 57), GKRRPSRLVAL(서열번호 58), QKKRVSMILQS(서열번호 59) 및 RLRRLTAREAA(서열번호 60)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  24. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질의 조절제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 2배 이상 감소시키는 방법.
  25. 제1항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편이 세포내에 존재하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포가 비만세포 및 CD4+ T 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  27. 제14항에 있어서, 단계(b)에서 동정된 시험 제제의 효능을 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 평가함을 추가로 포함하며, 여기서, 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제에 비해서 증가된 효능을 나타내는 시험 제제가 천식 치료에 유용한 것으로 동정되는 방법.
  28. (a) PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편을 발현하는 세포를 시험 제제와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시험 제제가 상기 세포내 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화를 감소시키는지를 결정하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 시험 제제의 존재하에서의 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화의 변화가 PKC-θ 단백질의 조절제의 지표가 되는, PKC-θ 단백질의 조절제의 동정 방법.
  29. 제28항에 있어서, 키나제 활성을 감소시키는 PKC-θ 단백질의 조절제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 억제제인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 키나제 활성을 증가시키는 PKC-θ 단백질의 조절제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 활성화제인 방법.
  31. 제28항에 있어서, PKC-θ 단백질이 전체길이 PKC-θ 단백질인 방법.
  32. 제28항에 있어서, PKC-θ 단백질이 전체길이 PKC-θ 단백질의 기능적 변이체인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 기능적 단편이 PKC-θ 키나제 도메인인 방법.
  34. 제28항에 있어서, 결정 단계가 시험 제제의 키나제 활성을 시험 제제의 부재하에서의 키나제 활성에 대해 비교함을 포함하는 방법.
  35. 제28항에 있어서, PKC-θ 단백질의 조절제가 천식을 치료하는데 유용한 방법.
  36. 제35항에 있어서, 단계(b)에서 동정된 시험 제제의 효능을 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 평가함을 추가로 포함하며, 여기서, 시험관내 또는 생체내 천식 모델에서 대조 제제에 비해서 증가된 효능을 나타내는 시험 제제가 천식 치료에 유용한 것으로 동정되는 방법.
  37. 제28항에 있어서, 세포가 진핵성 세포인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 진핵성 세포가 이. 콜라이(E. coli)인 방법.
  39. 제28항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화가 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레 오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어나는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 자가인산화가 서열번호 1의 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 일어나는 방법.
  41. 천식을 앓거나 천식 증상을 앓는 포유동물에게 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 키나제 활성을 감소시키거나 기능적 PKC-θ 단백질의 생산을 감소시키는 제제의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하는, 천식의 치료 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제제가 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 투여되는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 담체가 에어로졸 형태인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 제제가 정맥내, 경구, 경피 및 근육내 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경로를 통해 투여되는 방법.
  45. 제41항에 있어서, 제제가 흡입에 의해 투여되는 방법.
  46. 제41항에 있어서, 천식이 IgE 매개성 천식인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 제제가 β-아드레날린성 제제, 테오필린 화합물, 코르티코스테로이드, 항콜린제, 항히스타민제, 칼슘 채널 차단제 및 크로몰린 나트륨으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약물과 공동 투여되는 방법.
  48. 제41항에 있어서, 제제가 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  51. 제41항에 있어서, 제제가 핵산 분자인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 핵산 분자가 리보핵산 분자인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 리보핵산 분자가 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열의 일부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  54. 제41항에 있어서, 키나제 활성이 PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화인 방법.
  55. 제54항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화가 서열번호 1의 695번 위치의 세린 잔기, 685번 위치의 세린 잔기, 538번 위치의 트레오닌 잔기 및 536번 위치의 트레오닌 잔기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 잔기에서 일어나는 방법.
  56. 제55항에 있어서, PKC-θ 단백질 또는 이의 기능적 단편의 자가인산화가 서열번호 1의 538번 위치의 트레오닌 잔기에서 일어나는 방법.
  57. 제41항에 있어서, 키나제 활성이 PKC-θ 기질의 자가인산화인 방법.
  58. 제57항에 있어서, PKC-θ 기질이 R-X-X-S 모티프 또는 R-X-X-T 모티프(여기서, R은 아르기닌이고, X는 미지의 또는 임의의 공지된 아미노산이고, S는 세린이고, T는 트레오닌이다)를 포함하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, PKC-θ 기질이 KKRFSFKKSFK(서열번호 5), FARKGSLRQKN(서열번호 6), FARKGSLRQ(서열번호 15), KKRFSFKKSFK(서열번호 16), QKRPSQRSKYL(서열번호 17), KIQASFRGHMA(서열번호 18), LSRTLSVAAKK(서열번호 19), AKIQASFRGHM(서 열번호 20), VAKRESRGLKS(서열번호 21), KAFRDTFRLLL(서열번호 22), PKRPGSVHRTP(서열번호 23), ATFKKTFKHLL(서열번호 24), SPLRHSFQKQQ(서열번호 25), KFRTPSFLKKS(서열번호 26), IYRASYYRKGG(서열번호 27), KTRRLSAFQQG(서열번호 28), RGRSRSAPPNL(서열번호 29), MYRRSYVFQT(서열번호 30), QAWSKTTPRRI(서열번호 31), RGFLRSASLGR(서열번호 32), ETKKQSFKQTG(서열번호 33), DIKRLTPRFTL(서열번호 34), APKRGSILSKP(서열번호 35), MYHNSSQKRH(서열번호 36), MRRSKSPADSA(서열번호 37), TRSKGTLRYMS(서열번호 38), LMRRNSVTPLA(서열번호 39), ITRKRSGEAAV(서열번호 40), EEPVLTLVDEA(서열번호 41), SQKRPSQRHGS(서열번호 42), KPFKLSGLSFK(서열번호 43), AFRRTSLAGGG(서열번호 44), ALGKRTAKYRW(서열번호 45), VVRTDSLKGRR(서열번호 46), KRRQISIRGIV(서열번호 47), WPWQVSLRTRF(서열번호 48), GTFRSSIRRLS(서열번호 49), RVVGGSLRGAQ(서열번호 50), LRQLRSPRRTQ(서열번호 51), KTRKISQSAQT(서열번호 52), NKRRATLPHPG(서열번호 53), SYTRFSLARQV(서열번호 54), NSRRPSRATWL(서열번호 55), RLRRLTAREAA(서열번호 56), NKRRGSVPILR(서열번호 57), GKRRPSRLVAL(서열번호 58), QKKRVSMILQS(서열번호 59) 및 RLRRLTAREAA(서열번호 60)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  60. 내인성 PKC-θ 단백질 발현이 결여된 분리된 비만세포.
  61. 제40항에 있어서, 외인성 PKC-θ 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 비만세포.
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