KR101004098B1 - 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드 수용체에선택적인 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 DR5 또는 인간 DR4와 상호작용하여 세포 증식의 억제 및 세포사멸을 유도하는 수용체의 다운스트림(downstream)에서 작용 효과 또는 길항 효과를 나타내는 항체에 관한 것이다. 본 발명에서는 DR5 및 DR4 항체의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 밝히고, 이들 서열을 포함하고 발현시키는 벡터 및 세포를 제조하였다. 세포사멸-관련 질환의 치료 및 세포 생육 조절이상의 치료를 포함하는 본 발명의 항체의 사용 방법도 상세히 개시되었다.

Description

종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드 수용체에 선택적인 항체 및 그의 용도{AN ANTIBODY SELECTIVE FOR A TUMOR NECROSIS FACTOR-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND RECEPTOR AND USES THEREOF}
본 발명은 단일 유형의 종양 괴사 인자(이하, "TNF"라 함)-관련 세포사멸-유도 리간드(이하, "TRAIL"이라 함) 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 보다 구체적으로는 단일 유형 수용체를 발현시키는 생체내 및 시험관내 세포에서 세포사멸을 유도하는 단일클론성 항체, 및 이러한 항체에 기초한 치료 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2001년 11월 1일자 미국 가출원 제 60/346,402 호의 이점, 및 2001년 5월 2일자로 출원된 현재 계류중인 국제 특허출원 제 PCT/US01/14151 호의 우선권을 주장한다. 국제 특허출원 제 PCT/US01/14151 호는 2000년 5월 2일자 미국 가출원 제 60/201,344 호의 이점을 주장한다. 본 출원이 이점을 주장하는 출원은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
본 발명은 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의해 수여되는 그 랜트(Grant) NCI P50 CA 89019-01, 및 관절염 및 근골격 및 피부 질환에 대한 국립 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)에 의해 수여되는 NIH R03-AR44982하의 정부 지원으로 수행되었다.
TRAIL은 단백질의 TNF 계열의 구성원이며, 또한 상기 구성원으로는 TNF-α 및 Fas 리간드를 포함한다(1). 이들 단백질은 유력한 세포사멸 유도인자이다. 현재까지 TRAIL에 대한 5종의 수용체가 확인되었으며, 이중 둘은 세포사멸 신호를 변환시킬 수 있는 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)(2-7)이며 나머지 셋은 세포사멸 신호를 변환시키지 않는 DcR1(TRAIL-R3), DcR2(TRAIL-R4) 및 오스테오프로테게린(OPG)이다(8-12). TRAIL에 대한 상기 5종의 수용체는 모두 세포외 리간드 결합 영역에서 상당한 상동성을 공유한다. Fas 및 TNF 수용체 I(이하, "TNFRI"라 함)과 유사하게, DR4 및 DR5의 세포내 단편은 둘다 사멸 영역을 함유하며, Fas-관련 사멸 영역 단백질(이하, "FADD"라 함) 및 카스파제 8을 포함하는 경로를 통해 세포사멸 신호를 변환시킨다(6,7). 상기 세포사멸 신호 변환 이외에 DR4 및 DR5 수용체는 또한 NFκb를 포함하는 경로를 활성화시킬 수 있다(6,7).
밝혀진 TRAIL의 생물학적 기능은 형질전환된 종양 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 TRAIL의 능력을 포함하며, 정상 세포는 TRAIL-매개된 세포사멸에 대해서는 비교적 내성을 유지한다(13-15). 이러한 선택성은 Fas 리간드와는 대조적으로 TRAIL을 투여하는 경우 현저한 독성의 유도없이 동물 모델에서 TRAIL의 전신 투여에 의해 밝혀진 바와 같이 매우 낮은 수준의 독성과 관련됨을 시사한다(13). 따라서, TRAIL은 암 및 기타 비정상 세포 증식과 관련된 질환의 치료를 위한 적당한 치료제가 될 수 있는 유력한 세포사멸 유도인자로서 제안되어 왔다. TRAIL은 또한 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 적당한 유력한 세포사멸 유도인자인 것으로 제안되어 왔다. TRAIL-매개된 세포사멸은 T 세포의 활성화-유도 세포사멸에 관여함으로써 Fas 리간드에 대한 대체 기전으로서 기능하는 것으로 밝혀졌다(16,17). TRAIL-매개된 세포사멸은 또한 T 세포 및 기타 염증성 세포의 세포사멸을 유도하는 기능을 할 수 있으며(18), NK 세포의 치사 활성(19-21) 및 수지상 세포의 면역조절기능(22,23)에 관여한다. 따라서, TRAIL-매개된 세포사멸은 또한 면역특권(immunoprivilege) 및 면역감시 작용을 할 수 있다.
TRAIL 수용체 시스템은 복잡하며, 둘 이상의 사멸 수용체인 DR4 및 DR5, 및 둘 이상의 비세포사멸 수용체인 DcR1 및 DcR2를 포함한다. 이들 수용체들은 모두 높은 아미노산 서열 상동성을 공유할 뿐만 아니라 TRAIL에 대한 유사한 결합 친화성을 나타낸다(2-12). 세포사멸의 유도없이 TRAIL의 결합에 대해 경쟁하는 DcR1 및 DcR2 수용체의 능력은 이들 수용체가 TRAIL 리간드의 활성을 차단하거나 조절하는 유인 수용체로서 작용함을 시사한다. 더욱이, 미형질전환 세포는 형질전환된 세포보다 높은 수준의 유인 수용체를 발현하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 사멸 및 유인 수용체 발현을 차등 조절하는 경우 TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 세포의 감응성을 결정하는 핵심적인 조절 기전을 나타낼 수 있으나 이것은 수용체-특이적 항체의 부족에 기인하는 것으로 보고되어 있다(2). DR4 및 DR5의 발현 및 기능이 광범위하게 연구되어 왔으나, 수용체-특이적 단일클론성 항체의 부족으로 인해 연구의 진전이 지체되고 있다. DR5의 세포 표면 발현을 입증하는 문헌은 존재하지 않는다. 단지 가교결합을 촉진시키기 위해 항체가 부동화된 경우에만 시험관내에서 흑색종 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 항-TRAIL 수용체 항체 패널이 생성되었고, 경우에 따라, 세포를 액티노마이신 D와 함께 배양하는 것이 요구된다고 보고되어 있다(24). 몇몇 항-DR5 항체가 생성되었다(24). 그러나, 이러한 항-DR5 단일클론성 항체는 가교결합 조건하에서조차 시험관내에서 낮은 세포사멸-유도 활성을 갖는다. 생체내 활성이 보고된 바 없다. 이들 항체는 TRAIL 수용체의 세포 표면의 발현을 검사하는데 사용된 적이 없다(24). 따라서 세포 표면 수용체와 결합할 수 있을 뿐만 아니라 가교결합 또는 부동화시킬 필요없이 생체내 및 시험관내 둘다에서 종양 세포를 포함하는 각종 비정상 세포의 세포사멸을 강력하게 유도할 수 있는 특이적 TRAIL 수용체 각각에 대해 선택적인 단일클론성 항체가 요구된다. 상기와 같은 항체는 유력한 치료제 뿐만 아니라 TRAIL 수용체의 기능 분석을 위한 진단 수단을 제공한다. 사멸 유도 수용체 DR4 및 DR5 각각에 특이적인 항체가 특히 요구된다.
다수의 질환의 발생 및 진전에서 종종 세포가 사멸되지 않는 경우가 있다. 다수의 자가면역 질환 및 염증성 상태에서 생존하는 활성화된 세포가 정상 조직 또는 세포를 공격한다. 추가로, 종양 발생의 전이 및 류마티스성 관절염의 증식성 서혜(鼠溪) 형성은 세포의 억제되지 않은 증식을 특징으로 한다. 따라서, 불충분한 세포사멸로 인해 질환의 발달이 유도되고 세포사멸을 증가시키는 세포사멸-유도 리간드 또는 작용성 단일클론성 항체를 사용하는 것이 원치않는 세포를 제거하기 위한 유력한 치료술로서 고려된다.
예를 들어, 류마티스성 관절염(이하, "RA"라 함)은 통상적인 인간의 자가면역 질환이다. 상기 RA의 병리학에 관한 현재의 이해 수준은 자가면역 T 세포 및 B 세포가 관절에서 염증성 반응을 개시하여 활막 세포의 과증식을 유도한다는 것이다. 활막 세포가 과증식된 결과 메탈로프로테이나제(이하, "MMP"라 함)가 과생성되어 RA 특징인 연골 및 골의 미란성 파괴를 추가로 유도한다(25). RA 치료의 주요 단계는 염증성 활막 세포의 과증식을 억제하는 것이다. 활막 세포의 과증식을 유도하는 분자적 기전은 아직 알려지지 않았다. 과증식성 활막 세포가 악성이 아니며 형질전환되지 않은 경우에도 형질전환된 세포와 일부 특징을 공유하는 것으로 다수 연구에서 시사되어 있다(46). "형질전환-발생 활막 세포"라 불리는 상기 세포들은 조밀한 조면소포체, 다수의 불규칙 핵 및 정상 방추사 형상의 세포골격에서의 변화를 특징으로 한다. 암 유전자 및 바이러스-유도 유전자가 도입되는 경우 RA 활막 세포의 형질전환-발생을 위한 1차 유도가 있다고 제안되어 왔다(46).
RA의 둘 이상의 양태는 조절이상된 세포사멸이 질환 과정에 기여할 수 있으며 세포사멸에 의한 치료 유도가 효과적인 치료법임을 시사하고 있다: 활성화된 T 세포의 제거 실패는 Fas-매개 세포사멸 및 TRAIL-매개된 세포사멸과 관련되는 과정인 T 세포의 활성화-유도 세포사멸에 결함이 있으며, RA의 활막 세포의 과증식적 성질이 RA 병변의 후기 단계에서 기여하는 인자임을 시사한다. 실제로, 항-Fas 항체를 염증성 관절에 투여하는 경우 인간 RA에 대한 동물 모델인 택스 유전자변형 마우스(tax transgenic mice)에서 만성 관절염의 발달을 억제하는 것으로 밝혀졌다(26). 더욱이, 아데노바이러스성 벡터에 의해 Fas 리간드 유전자로 국부적으로 형질도입하면 콜라겐-유도 관절염의 예방에 효과적이다(27). Fas-매개 세포사멸의 증가에 의한 염증성 활막 세포의 과증식의 억제는 상기 두 경우 모두에서 관측된다. 비록 Fas 리간드가 RA 활막 세포에서 강력한 세포사멸 유도인자이지만, 인간에 대한 요법으로서의 Fas 리간드-매개 세포사멸의 적용은 치명적인 간독성에 의해 제한된다. 따라서, TRAIL 수용체-유도 세포사멸은 Fas 리간드-유도 세포사멸보다 RA 치료에 보다 안전하고 효과적인 치료능을 나타낸다. TRAIL-매개된 세포사멸은 정상세포에 대한 영향없이 형질전환된 종양세포의 세포사멸을 특이적으로 유도하는 것으로 알려져 있다. 삼량체화된 가용성 TRAIL을 전신 투여하는 경우 실험 동물에서 독성을 유도하지는 않으면서도 이식된 종양의 퇴행을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다(13,28). 종래 치료를 위한 보조적인 요법으로서의 가능성은, 유방암 세포의 DR5의 발현 및 TRAIL-유도 세포사멸에 대한 감수성이 방사선 조사에 의해 증가된다는 최근의 발견에 의해 강조되었으며, 이것은 방사선 조사와 결합되는 경우 암 요법에서 TRAIL의 효능이 증가됨을 시사한다(29).
또한, TRAIL 수용체 DR5를 코딩하는 유전자는 염색체 8p21-22, 즉 일부 암세포에서 높은 빈도의 돌연변이가 이루어진 좌위에 존재한다(30). 2종 이상의 종양 세포, 소형 폐암(31), 및 두부암 및 경부암(32)은 DR5 유전자의 사멸 도메인에서 돌연변이를 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 암의 발달 및 진행에 대한 수용체 에피토프의 변이 효과를 결정하기 위한 암 연구에서 항-DR5 항체에 대한 필요성이 존재한다. 추가로, TRAIL 수용체 돌연변이의 작용성은 암의 조기 발견에서 다른 바이오마커와 함께 사용되거나 종양 공격성의 예보자로서 사용되는 경우 유용한 임상 진단도구임이 입증될 것이다.
발명의 요약
한 실시양태에서, 본 발명은 TRAIL 수용체 DR5를 인식하고 생체내 및 시험관내 DR5-발현 세포내 세포사멸을 유도하는 항체에 관한 것이다. 추가로, DR5를 인식하지만, DR4, DcR1 또는 DcR2를 인식하지 못하는 항체도 개시되어 있다. 하이브리도마에 의해 제조된 DR5에 대한 단일클론성 항체에 대해서는 구체적으로 설명한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 TRAIL 수용체 DR4를 인식하고 생체내 및 시험관내 DR4-발현 세포내 세포사멸을 유도하는 항체에 관한 것이다. 추가로, DR4를 인식하지만, DR5, DcR1 또는 DcR2를 인식하지 못하는 항체도 개시되어 있다. 하이브리도마에 의해 제조된 DR4에 대한 단일클론성 항체에 대해서는 구체적으로 설명한다.
제공된 방법은 세포를 DR5 또는 DR4에 결합할 수 있는 항체의 치료량과 접촉시킴으로써 표적 세포에서 세포사멸을 유도하고, 표적 세포의 증식을 억제한다. 다양한 실시양태에서, 표적 세포를 항체 둘다와 접촉시킴으로써 세포사멸을 유도하고, 세포 증식을 억제할 수 있다.
또한, DR5 또는 DR4에 대해 활성인 단일클론성 항체의 치료량, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 선택적으로 항체와 담체를 내포하는 용기를 포함하는 약리학적 조성물이 개시되어 있다. 추가로, 본 발명에서는 이상 또는 조절이상 세포의 선택적인 세포사멸을 위한 치료제를 제조하기 위한, DR5를 인식하는 항체 또는 DR4를 인식하는 항체의 용도가 제공된다.
본 발명의 항체는 DR4, DR5, DcR1, DcR2 및 OPG와 같은 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드 수용체와 상호작용한다. 작용성 또는 길항성 종양 괴사 인자 리간드 수용체 에피토프를 선택적으로 결합할 수 있는 본 발명의 항체도 개시되어 있다.
본 발명은 세포사멸 관련 질환, 암, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 갖는 표적 조직을 치료량의 본 발명의 항체에 단독으로, 또는 기타 세포사멸-유도 항체 및/또는 기타 치료제와 함께 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의한 상기 질환에 대한 치료법을 제공한다.
또한, 대상내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 면역글로불린 단백질 또는 이들의 단편에 결합된 것으로 10개 이상의 염기를 갖는 항원성 TRAIL 수용체 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다.
본 발명은 표적 세포가 발현 벡터내의 TRAIL 수용체 핵산 서열로 형질감염되어 TRAIL 수용체가 표적 세포에서 발현되도록 하는 유전자 치료법을 제공한다. 그 다음, 표적 세포는 TRAIL 수용체를 선택적으로 결합하는 항체에 노출된다.
DR5에 대해 선택적인 항체의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 면역글로불린을 코딩하는 핵산 서열 및 아미노산 서열이 제공된다. 또한, DR4와 선택적으로 결합하는 항체를 위한 서열이 제공된다. 또한, 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 인간화 DR5 항체를 생산하는 형질감염된 세포 및 인간화 DR4 항체를 생산하는 형질감염된 세포 뿐만 아니라, 인간화 DR5 항체(예를 들어, TRA-8) 및 인간화 DR4(예를 들어, 2E12)를 제공한다.
인간화 DR5 항체 또는 DR5 항체를 제조하는 방법으로, 숙주를 인간화 면역글로불린 경쇄 및 인간화 면역글로불린 중쇄를 코딩하는 핵산 서열로 형질전환하고, 그 다음 형질전환된 숙주를 소정의 시간 동안 항온배양하는 방법이 설명되어 있다.
또한, 표적 세포에서의 세포사멸을 유도하는 방법, 및 기타 치료제 및 치료법의 존재여부에 따라 약학적 효과량의 인간화 DR5 항체, 인간화 DR4 항체 및 이의 조합과 표적 세포를 접촉시킴을 포함하는 세포 증식을 억제하는 방법이 개시되어 있다.
DR5에 대해 선택성인 인간화 TRA-8 항체 또는 DR4에 대해 선택성인 인간화 항체(예를 들어, 인간화 2E12)를 포함하며, 선택적으로 사용하기 위한 지침서와 함께 적당한 용기내에 포장되어 있는 산업용 키트가 제공된다.
도 1은 TRA-8의 특징에 관한 것이다. 도 1a는 TRA-8의 결합 특이성에 관한 것으로서 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis; 상부 패널)에 의해 TRA-8 또는 항-인간 IgG로 탐침된 TNFR 부류의 재조합 융합 단백질이며, 상세한 내용은 하기와 같다: 레인 1 : DR5/hIgG1 융합 단백질(면역원); 레인 2: DR4/hIgG1(TRAIL-R1); 레인 3: DR5/hIgG1; 레인 4: TRAIL-R3(DcR1)/hIgG1; 레인 5: TRAIL-R4(DcR2)/hIgG1; 레인 6: CD95/hIgG1; 레인 7: 가용성 TNFRI. ELISA 분석법(하부 패널): 웰의 번호는 웨스턴 블롯과 일치하되, 단 제 8 웰은 래트의 DR5/hIgG1 융합 단백질이다. 도 1b는 가용성 TRAIL 및 TRA-8의 DR5 및 DR4에 대한 결합 활성에 관한 것이다. ELISA 평판을 DR5/hIgG1(좌측 패널) 또는 DR4/hIgG1(중간 패널)로 피복하고, 그 다음 TRAIL 또는 TRA-8과 함께 항온배양하였다. 도 1c는 DR5의 표면 발현의 유량 세포분석에 관한 것이다. Cos-7 세포를 전체-길이의 DR5 cDNA를 함유하는 pcDNA3 발현 벡터(속이 채워진 도수분포도), DR4 cDNA(개방형 도수분포도, 직선), 또는 비어있는 벡터(개방형 도수분포도, 점선)로 형질감염시켰다. 형질감염된지 48시간 후에, 세포를 TRA-8로 염색하고, 그 다음 PE-접합 항-마우스 IgG1로 염색하였다. 도 1d는 DR5의 동일 반응계 면역조직화학 반응성에 관한 것이다. DR5-발현 벡터 또는 대조군 벡터로 형질감염된 Cos-7 세포의 사이토스핀 슬라이드를 형질감염된지 48시간 경과한 후에 TRA-8로 염색하였다. 도 1e는 TRA-8의 치사 활성에 관한 것이다. 위르캣(Jurkat) 세포는 지정된 농도의 TRA-8과 함께 항온배양되었다. 세포 생존율은, 하룻밤 동안 배양한 후 ATPLite, MTT 및 PI 배척 분석법으로 측정하였다. ATPLite 및 MTT 분석법의 결과는 배지 대조군의 백분율로서 표시하고, PI 분석치는 PI 네가티브 세포의 백분율로서 표시하였다. 도 1f는 카스파제 활성의 웨스턴 블롯 분석에 관한 것이다. 위르캣 세포를 지정된 시간 동안 500ng/㎖의 TRA-8과 함께 항온배양하였다. 세포 용해질을 15% SDS-PAGE로 분리하고, 블롯팅하고, 항-카스파제 항체로 탐침하였다. 화살표는 각각의 카스파제의 절단된 아단위를 나타낸다. 도 1g는 카스파제 억제 분석에 관한 것이다. 위르캣 세포를 다양한 농도의 지정된 카스파제 억제제의 존재하에서 하룻밤 동안 50ng/㎖ TRA-8과 함께 항온배양하였다. 세포 생존율을 ATPLite 분석법으로 측정하였다.
도 2는 DR5의 세포 표면 발현 및 DR5-매개 세포사멸에 대한 감응성에 관한 것이다. 정상 T 및 B 세포를 말초 혈액으로부터 신선하게 분리하여 T 세포(a 및 a'), 신경교종(b 및 b'), 전립선암 세포(c) 및 B 세포(d) 세포주를 TRA-8 또는 래트의 IgG1 동종형 대조군 항체와 함께 항온배양하고, 그 다음 PE-접합 염소 항-마우스 IgGI와 함께 항온배양하였다. 개방형 도수분포도는 동종형 항체 대조군을 나타내는 반면, 속이 찬 도수분포도는 TRA-8 염색을 나타낸다. 세포사멸은 a, b' 및 d로서 도시한 바와 같이 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)과 함께 하룻밤 동안 항온배양한 후에 ATPLite 분석법으로 측정하였다.
도 3a'에서 T 세포주 U937을 TRA-8 또는 래트의 IgG1 동종형 대조군 항체와 함께 항온배양하였다. 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)과 함께 하룻밤 동안 항온배양한 후, 세포사멸을 ATPLite 분석법에 의해 측정하였다.
도 3에서, 신경교종(b) 및 전립선암(c) 세포주를 TRA-8 또는 래트의 IgG1 동종형 대조군 항체에 의해 항온배양하였다. 세포사멸을 가용성 TRAIL(○) 또는 TRA-8(●)로 하룻밤 동안 항온배양한 후, ATRLite 분석법으로 측정하였다.
도 4는 도 4a에서 나타낸 고정된 농도의 본 발명의 항체의 존재하에서 (A) 고정된 농도의 항체 TRA-1, TRA-8 및 TRA-10 및 (B) 고정된 농도의 TRAIL에 노출시킨 후, 인간 위르캣 세포의 세포 생존율을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 5는 정상 조직 및 암 조직에서의 DR5의 발현에 관한 것이다. 정상 조직 및 암 조직의 균질액을 TRA-8로 탐침하고, 화학발광(chemiluminescence)법으로 전개시켰다. 도 5a는 정상 조직에서 DR5 단백질의 웨스턴 블롯 분석법에 관한 것으로 상세한 내용은 하기와 같다: 레인 1 :간, 레인 2: 뇌, 레인 3: 폐, 레인 4: 신장, 레인 5: 비장, 레인 6: 고환, 레인 7: 난소, 레인 8: 심장, 레인 9: 췌장. 도 5b는 암 조직에서의 DR5 단백질의 웨스턴 블롯 분석에 관한 것이다. 난소(레인 1) , 폐(레인 2), 간(레인 3), 직장(레인 4), 경부(레인 5), 피부(레인 6), 고환(레인 7), 갑상선(레인 8), 자궁(레인 10), 위(레인 11), 후인두(레인 12) 및 췌장(레인 13)으로부터의 암을 함유하는 암 조직을 블롯을 탐침하였다. 정상 인간 조직(c) 및 암 조직(d)의 동일 반응계 면역조직화학에 관한 것이다. 동결된 절편을 TRA-8로 면역염색하였다.
도 6은 TRA-8의 살종양성 활성에 관한 것이다. SCID 마우스에 1321N1 세포를 피하접종하였다. 종양을 접종한 지 2일 후에 단일 투여량의 100㎍ TRA-8을 정맥주사하거나(a) 또는 종양을 접종한 지 7일 후에 3호 투여량의 100㎍ TRA-8을 정맥 주사하였다. 종양의 성장을 중량을 기준으로 측정하고, H&E 염색으로 조직별로 평가하였다. 사진은 대조군 마우스에서는 살아있는 종양의 성장을 나타내만, TRA-8 처리된 마우스(c, 상부 패널)에서는 나타내지 않았고, 하단 패널은 종양의 H&E 염색부(c)이다. SCID 마우스에 106개의 위르캣 세포를 정맥주사하고, 주사한 후 2일째에 TRA-8을 단일 투여함으로써 처리하였다. 7일 후, 비장 세포를 수확하고, 항-인간 CD-3 항체로 염색하고, 유량 세포분석(d) 또는 면역조직화학요법(e)으로 분석하였다.
도 7은 RA(a) 및 OA(b) 활막 세포내 세포 표면 DR5의 발현을 나타낸다. 1x106 개의 1차 배양된 활막 세포는 친화도-정제된 TRA-8 및 이어서 PE-접합 염소 항-마우스 IgG1 항체로 염색되었다. 10,000개의 살아있는 세포를 FACSvantage로 분석하였다.
도 8은 다양한 농도의 재조합 가용성 TRAIL(○) 또는 친화도-정제된 TRA-8(●)에 의해 세포사멸이 유도된 RA(a) 및 OA(b) 활막 세포의 대표적인 균주의 세포 생존율을 TRAIL 및 TRA-8의 농도의 함수로서 나타낸 일련의 그래프이다. 세포 생존율은 미처리된 세포의 cpm에 대한 처리된 세포의 cpm의 백분율이다.
도 9는 RA 활막 세포의 DR5-매개 세포사멸의 카스파제 의존성을 나타내는 일련의 그래프이다. RA 활막 세포(RA512)를 다양한 농도의 카스파제 억제제의 존재하에서 50ng/㎖의 가용성 Fas 리간드(□), 항-Fas 항체(CH-11)(■), 가용성 TRAIL(○) 또는 항-DR5 항체(TRA-8)(●)와 함께 항온배양하였다. 하룻밤 동안 배양한 후, 세포 생존율을 ATPLite로 측정하였다.
도 10a는 NFκb 활성화를 나타내는 전기영동 겔-쉬프트 분석이다. RA1016 세포를 전기영동하기 전에 지정된 시간 동안 20ng/㎖ TNF-a, 50ng/㎖ 가용성 TRAIL 또는 50ng/㎖ TRA-8과 함께 항온배양하였다. 도 10b 및 도 10c는 MMP-1 및 MMP-3의 제조를 나타내는 그래프이다. 지정된 RA 활막 세포 1x106/㎖를 지정된 농도의 TNF-a(○), TRAIL(△) 또는 TRA-8(●)과 함께 항온배양하였다. 하룻밤 동안 배양한 후, 배양액 상층액을 수집하였다. 배양액 상층액내 MMP의 수준을 ELISA로 측정하였다.
도 11은 TRA-8가 간세포 독성을 유도하지 않음을 나타낸다. 도 11a에서는 정상 간 조직이 DR5를 발현하지 않음을 나타낸다. 간세포 암종 조직 및 HepG2 세포의 사이토스핀 제조물이라는 2종의 정상 간 조직의 파라핀 절편을 H&E 염색을 위해 준비하고, 해당하는 동결된 절편을 TRA-8로 염색하였다. 도 11b는 DR5의 세포 표면 발현의 유량 세포분석을 나타낸다. 2종의 정상 간 조직 및 간세포 암종 조직의 경우로부터 단리한 간세포 및 HepG2 세포를 TRA-8, 항-Fas 항체(DX2) 또는 동종형 대조군 항체로 염색하였다. 속이 채워진 도수분포도는 TRA-8 또는 DX2 염색을 나타내고, 개방형 도수분포도는 해당 동종형 대조군을 나타낸다.
도 12에서는 TRA-8은 아니지만, TRAIL은 간세포 독성을 유도함을 나타낸다. 신선한 정상 인간 간세포를 간세포 배양 배지내에 보관하였다. 도 12a에서, 지정된 시간 동안 1㎍/㎖ 가용성 TRAIL + 가교결합제 또는 TRA-8을 이용하여 간세포의 세포사멸을 유도하였다. 세포 생존율을 ATPLite로 측정하였다. 결과는 배지 대조군에 대한 살아있는 세포의 백분율로 나타내었다. 빗금 막대는 TRAIL을 나타내고, 검정 막대는 TRA-8을 나타낸다. 도 12b에서는, 간세포의 농축 핵을 훽스트 33352로 염색하고, 유량 세포분석으로 분석하였다. 도 12c는 간세포 세포사멸에 대한 사이클로헥시미드의 효과에 관한 것이다. 8시간 동안 1㎍/㎖ 사이클로헥시미드의 존재(검색 막대) 또는 부재(흰색 막대) 하에서 대조군 배지에서 또는 1㎍/㎖ TRAIL 또는 TRA-8과 함께 간세포를 배양하였다. 세포 생존율을 ATPLite로 측정하였다. 결과는 2회 시험의 3회 배양물의 평균±SEM으로서 표현하였다. 도 12d는 DR5 및 Fas-매개 세포사멸에 대한 정상 간세포의 감응성을 비교한 것이다. 신선하게 단리한 간세포를 6시간 동안 지정된 농도의 가용성 TRAIL, TRA-8, 가용성 FasL 또는 항-Fas mAb CH11과 함께 항온배양하였다. 세포 생존율을 ATPLite 분석법으로 측정하였다. 세포 생존율은 배지 대조군에 대한 살아있는 세포의 백분율로 나타내었다. 정상 간세포의 경우, 4개의 정상 개체의 평균±SEM으로 나타냈다. 환자에서 나온 간세포 암종 세포 및 HepG2 세포의 결과는 3회 배양물의 평균값으로 나타냈다.
도 13은 TRAIL이 간염을 유도함을 나타낸다. "테트-온(Tet-on)" 전사 요소의 조절 하에서 전체 길이의 인간 TRIAL을 코딩하는 아데노바이러스 벡터 109 pfu를 B6 마우스에 정맥 접종하였다. TRAIL 발현은 지시된 투여량의 테트라사이클린에 의해 유도되었다. 도 13a는 간에서의 인간 TRAIL 발현의 노던 블롯(Northern blot) 분석에 관한 것이다. 벡터를 접종하고, 테트라사이클릭에 의해 유도한지 24시간 후에 전체 RNA를 간으로부터 단리하고, 인간 TRAIL cDNA 또는 β-액틴으로 탐침하였다. 도 13b는 AST의 혈청 수준에 관한 것이다. TRAIL을 형질도입한지 24시간 후에 AST의 혈청 수준을 측정하였다. 도 13c는 아데노바이러스 벡터 감염된 간세포의 TRAIL-매개된 세포사멸에 관한 것이다. 테트라사이클릭-유도성 아데노바이러스 벡터를 B6 마우스에 정맥접종하였다. 접종한 지 48시간 경과후에, 접종된 마우스 및 미접종된 대조군 마우스의 간세포를 분리하고, 지정된 농도의 TRAIL과 함께 8시간(좌측 패널) 동안 항온배양하였다. 간세포의 세포 생존율을 ATPLite 분석법으로 측정하였다. 전술한 바와 같은 아데노바이러스 벡터가 접종된 마우스에 4시간 후에 10㎍의 가용성 인간 TRAIL을 정맥접종하였다. TRAIL을 주사한 지 24시간후 AST의 혈청 수준을 측정하였다(우측 패널). 도 13d 및 13e는 TRAIL-유도된 간 손상의 조직학적 분석에 관한 것이다. TRAIL을 형질도입한 후 24시간(도 13d) 또는 7일(도 13e)째에 간을 수집하였다. 파라핀 절편을 H&E로 염색하고, 100X(상부 패널) 및 400X(하부 패널)로 사진 촬영하였다.
도 14는 휴지 세포(채우지 않음) 및 활성화 세포(빗금)에 대한 유량 세포분석에 의해 측정되는 바와 같이 인간 PBMC에서 정제된 활성화된 T 세포 및 B 세포가 증가된 수준의 DR5를 발현시킴을 나타내는 일련의 그래프이다.
도 15는 피콜-파크(Ficoll Paque)의 상이한 밀도에 의해 수집된 항-CD3 세포 또는 항-μ세포, 활성화된 세포 및 모세포로 48시간 동안 자극된 도 14에 도시된 정제 T 세포 및 B 세포의 생존율을 TRA-8의 농도에 대한 함수로서의 나타낸 그래프이다. ATPLite 분석법으로 생존율을 측정하였다.
도 16은 인간 PBMC 및 TRA-8 또는 IgG(대조군)이 주사된 NK 세포 결핍된 NOD/SCID 마우스에 대한 게이팅된 림프구 모집단에서의 CD3 발현을 나타내는 유량 세포분석 도면과 도수분포도이다.
도 17은 실시예 13에서 상세히 설명된 바와 같은 마우스의 비장 조직의 CD3 및 투넬 염색된 세포 현미경 사진을 나타낸다.
도 18은 TRA-8, BISVIII 및 이들의 조합의 존재하에서 만성 림프구 백혈병(CCL) 및 정상 B 세포(인간)의 세포 독성을 나타내는 도면을 나타낸다.
도 19a는 2E12의 DR4에 대한 특이적 결합을 나타낸다. 지시된 바와 같이, ELISA 평판을 가용성 형태의 인간 TRAIL 수용체-인간 IgG1 Fc 융합 단백질로 피복하고, 지시된 농도의 mAb 2E12 및 이어서, HRP-접합된 항-마우스 IgG1과 함께 항온배양하였다. TMB 기질 완충액으로 반응을 전개시키고, 450/650nM에서 OD값을 측정하였다.
도 19b는 2E12가 세포 표면 DR4에 결합함을 나타낸다. Cos-7 세포를 DR5에 대한 전체 길이의 cDNA를 포함하는 벡터(속이 채워진 도수분포도) 또는 대조군 벡터(개방형 도수분포도)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 20㎍/㎖의 2E12 및 PE-접합된 항-마우스 IgG1로 염색하였다. 유량 세포분석에 의해 세포를 분석하였다.
도 19c는 2E12의 세포사멸-유도 활성을 나타낸다. 인간 라모스 B 림프종 세포를 10㎍/㎖의 항-마우스 IgG1의 존재하에서 지시된 농도의 2E12와 함께 하룻밤 동안 항온배양하였다. 세포 생존율을 ATPLite 분석법에 의해 측정하였다. 도 19d는 2E12에 의해 유도된 카스파제 활성에 관한 것이다. 라모스 세포를 지시된 시간 동안 2E12 및 항-마우스 IgG 항체로 처리하였다. 특정한 항-카스파제 또는 PARP 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석법에 의해 카스파제 활성 및 PARP 절단을 측정하였다.
도 20은 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 종양 성장에 미치는 2E12 및 아드리아마이신의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 두 군의 마우스에게 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍의 2E12를 복강내 주사하였다. 두 군의 마우스에게 8, 12 및 16일째에 아드리아마이신(6㎎/㎏)을 정맥내 주사하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 크기의 평균 변화로서 표시된다(1개 군당 8마리의 마우스).
도 21은 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 종양 성장에 미치는 TRA-8, 2E12 및 아드리아마이신의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 두 군의 마우스에게 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍의 TRA-8 및 2E12를 복강내 주사하였다. 두 군의 마우스에게 8, 12 및 16일째에 아드리아마이신(6㎎/㎏)을 정맥내 주사하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 크기의 평균 변화로서 표시된다(1개 군당 8마리의 마우스).
도 22a는 인간의 유방암 세포주 패널에서 DR5 세포 표면 발현의 유량 세포분석을 도시한 것이다. EDTA를 사용하여 유방암 세포를 수확하고, 10㎍/㎖의 TRA-8 mAb로 4℃에서 1시간 동안 염색한 후, PE-접합된 염소 항-마우스 IgG1로 염색하고, 그 다음 FACScan 및 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 두꺼운 도수분포도는 TRA-8 염색을 나타내고, 얇은 도수분포도는 마우스의 IgG1 동종형 대조군 항체와 함께 항온배양함을 타나낸다. 도 22b는 인간 유방암 세포주에 대한 TRA-8의 세포 독성을 나타낸다. 세포를 트립신처리하고, 1,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 평판으로 다시 도말하였다. 세포를 도말한 후에 TRA-8 항체를 첨가하고, 37℃에서 24시간 동안 항온배양하였다. ATPLite 분석법을 사용하여 TRA-8을 첨가한 지 24시간 후에 세포 생존율을 측정하였다. 2 내지 3개의 독립적인 실험에서 나온 평균 및 SE 값으로서 미처리 대조군 세포에 상대적인 ATP 수준을 기록하였으며, 각각의 실험을 3회 수행하였다.
도 23a는 인간의 유방암 세포주를 TRA-8과 아드리아마이신의 조합물로 처리한 경우의 세포 독성을 보여준다. 세포를 도말한지 24시간 후부터 시작하여 24시간 동안 37℃에서 여러 농도의 아드리아마이신에 세포(1,000/웰)를 노출시켰다. 아드리아마이신을 첨가한지 24시간 후에 TRA-8을 첨가하고, ATP 수준을 24시간 후에 측정하였다. 수치 값은 각각 3회 행해진 2 내지 4회의 독립 실험에서 나온 3회 측정값의 평균 및 SE 값을 나타내고, 미처리된 대조군 세포와 비교하여 기록하였다. 도 23b는 인간의 유방암 세포주를 TRA-8과 파클리탁셀의 조합물 처리한 경우의 세포 독성을 나타낸다. 세포를 도말한 지 24시간 후부터 시작하여 37℃에서 24시간 동안 여러 농도의 파클리탁셀에 세포(1,000/웰)를 노출시켰다. 파클리탁셀을 첨가한지 24시간 후에 TRA-8을 첨가하고, ATP 수준을 24시간 후에 측정하였다. 수치 값은 각각 3회 행해진 2 내지 4회의 독립 실험에서 나온 3회 측정값의 평균 및 SE 값을 나타내고, 미처리된 대조군 세포와 비교하여 기록하였다.
도 24는 확립된 2LMP 인간의 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 종양 성장에 미치는 TRA-8의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 두 군의 마우스의 경우, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍ 또는 600㎍의 TRA-8을 복강내 주사하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 세포(두 개의 직경의 곱)의 평균 변화로서 표시된다(1개 군 당 8마리의 마우스).
도 25는 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 종양 성장에 미치는 TRA-8 및 아드리아마이신의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 두 군의 마우스에게 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍의 TRA-8을 복강내 주사하였다. 두 군의 마우스에게 8, 12 및 16일째에 아드리아마이신(6㎎/㎏)을 정맥내 주사하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 크기(두개의 직경의 곱)의 평균 변화로서 표시된다(1개 군 당 8마리의 마우스).
도 26은 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 TRA-8 및 파클리탁셀의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 두 군의 마우스에게 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍의 TRA-8을 복강내 주사하였다. 두 군의 마우스에게 8, 12, 16, 20 및 24일째에 파클리탁셀(20㎎/㎏)을 정맥내 주사하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 크기(두개의 직경의 곱)에서의 평균 변화로서 표시된다(1개 군 당 8마리의 마우스).
도 27은 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서 종양 성장에 미치는 TRA-8, 아드리아마이신 및 60Co 방사선 조사의 효과를 도시한 것이다. 0일째 날에 2LMP 세포(3 x 107)를 아티믹 누드 마우스의 피하에 주사하였다. 세 군의 마우스에는 7, 10, 14, 17, 21 및 24일째에 200㎍의 TRA-8을 복강내 주사하였다. 두 군의 마우스에게 8, 12 및 16일째에 아드리아마이신(6㎎/㎏)을 정맥내 주사하였다. 네 군의 마우스에게 9일 및 17일째에 3Gy 60Co 방사선 조사를 하였다. 한 군의 마우스에는 어떠한 항체도 주사하지 않았다. 데이터는 7일째의 크기에 대한 종양 크기(두개의 직경의 곱)에서의 평균 변화로서 표시된다(1개 군 당 8마리의 마우스).
세포를 제거하는데 실패하는 것은 예시적으로 리간드, 수용체 또는 세포내 조절자 및 효과기 분자의 발현 또는 기능을 비롯한 결함과 관련된 세포사멸-유도 시스템에서의 결함 때문이다. 본 발명은 결핍된 세포사멸-유도 시스템을 보정하고 주어진 결함적 세포사멸-유도 시스템에서 고유한 특정한 결함을 밝혀내는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 DR5, DR4, DcR1 및 DcR2를 포함하는 특이적 TRAIL 수용체에 대한 선택적인 세포내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는 새로운 부류의 단일클론성 항체에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는 TRAIL 수용체중 하나와 특이적으로 결합한다. "선택적 결합" 또는 "특이적 인식"은 통상의 웨스턴 블롯 분석시 항체가 단지 하나의 TRAIL 수용체와 결합하고 다른 유형의 TRAIL 수용체와는 거의 또는 전혀 결합하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 DR5 항체는 선택적으로 DR5와 결합하고, DR4, DcR1 또는 DcR2에 대해서는 바탕값의 약 1.5배를 초과하는 결합이 존재하지 않는다. 또한, 본 발명의 DR4 항체는 선택적으로 DR4와 결합하고 DR5, DcR1 또는 DcR2에 대해서는 바탕값의 약 1.5배를 초과하는 결합이 존재하지 않는다. 본 발명은 세포사멸 신호화 연구에 대한 시약으로서의 용도, 및 예시적으로 넓은 부류의 암 세포, 세포사멸 시스템의 조절이상을 나타내는 세포, 활성화된 림프구 또는 다른 활성화된 면역 세포(예를 들어, 림프계 세포 및 골수세포), 바이러스성 감염된 세포, 및 자가면역 질환의 이상 증식 활막 세포(예를 들어, 염증성 활막 세포, 활막에서의 활성화 림프계 및 골수 세포, 대식세포형 활막 세포, 및 섬유 모세포형 활막 세포를 포함하는 류마티스성 관절염 활막 세포)를 포함한 TRAIL 수용체를 발현하는 세포에 대한 치료 효과적 용도를 갖는다. 본 발명에 따른 항체는 이들간의 상동성에도 불구하고 특정 유형의 TRAIL 수용체의 결합에 있어 특이적이다. 본 발명의 항체는 표적 TRAIL 수용체를 발현하는 세포만을 표적화되게 세포사멸시키거나, 또는 표적 수용체를 발현하는 세포의 TRAIL 세포사멸을 차단한다.
본 발명의 DR5 단일클론성 항체 또는 DR4 단일클론성 항체는 시험관내 DR5 또는 DR4를 발현하는 세포에서 강력한 세포사멸 유도인자로서, 그리고, 생체내 세포사멸의 유력한 유도인자로서 작용한다. 본 발명의 융합 단백질 DR5 항체 또는 DR4 항체 및 인간화 항체 주요 쇄상에서 이식된 인간화 단편 CDR 서열은 유사한 세포사멸 특성을 나타낸다.
현재까지, 세포 표면 DR5에 결합하고 가교결합제의 부재하에서 생체내 및 시험관내 둘다에서 DR5를 발현하는 세포의 세포사멸을 유도하는 어떠한 단일클론성 항체도 입수가능하지 않았다. 본 발명은 여러 질환에 대한 치료제로서 작용가능한 DR5 항체를 포함한다. 가용성 TRAIL은 생체내에서 종양 세포의 세포사멸의 유도에 효과적인 것으로 알려져 있지만, 치사 활성은 매우 낮아서, 대량의 투여량 및 반복 투여가 요구된다(13). 본 발명은 TRAIL 수용체 DR5에 결합하는 정제된 항체의 제공에 관한 것으로, 여기서 상기 상체는 낮은 농도의 가용 형태로서 DR5-발현 표적 세포에서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서 정제된 항체는 가교 항체의 부재 하에서 TRAIL 수용체 DR5에 결합한다. 바람직하게는, 항체는 정상적인 섬유 모세포의 유의한 세포사멸을 유도하지 않는다. 바람직하게는, 세포사멸-유도 활성은 약 0.1, 1, 5, 10 또는 20㎍/㎖ 미만의 항체 농도 또는 이들 사이의 임의의 항체 농도에서 표적 세포가 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 생존율, 또는 이들 사이의 임의 백분율의 생존율을 나타낸다는 점에 그 특징이 있다. 통상의 웨스턴 블롯 분석시 정제된 항체는 TRAIL 수용체 DR5와 특이적으로 결합하며 TRAIL 수용체 DR4, DcR1 또는 DcR2와 결합하지 않는다. 바람직한 실시양태에 있어서, 항체는 바람직하게는 ATCC 수탁번호 PTA-1428을 갖는 마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8과 동일한 에피토프 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다.
본 발명에 따른 일련의 DR5 항체중 하나인 TRA-8은 인간 DR5 형질전환 유전자를 갖는 동물에 약학적으로 효과적이고, 또한 DR5 및 TRAIL의 역할을 평가하기 위한 모델을 수립하는데 유용하다.
본 발명의 다양한 실시양태는 가교의 존재 또는 부재하에서 세포사멸을 유도하는 항체를 제공한다. 예를 들어, DR5 항체(예를 들어, TRA-8)의 한 바람직한 실시양태에서는 가교의 부재하에서 세포사멸을 유도한다. 다른 실시양태, 예를 들어 DR4 항체(2E12)의 바람직한 실시양태에서는 가교제의 존재하에서 세포사멸을 유도하는 항체를 제공한다.
따라서, 본 발명은 TRAIL 수용체 DR4와 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 제공하는 것으로, 가용 형태의 상기 항체는 DR4-발현 표적 세포에서의 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는다. 하나의 실시양태에 있어서, 항체는 더 유에비 리서치 파운데이션(The UAB Research Foundation)을 대리하여 "인간의 DR4에 대한 2E12 하이브리도마 클론으로 지정되어 2001년 10월 24일에 기탁된 ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 단일클론성 항체이다. 본 발명에 따른 일련의 DR4 항체중의 하나인 2E12는 미처리된 대조 동물에 비해 또는 치료전의 종양 크기에 비해 DR4-발현 암을 갖는 동물 생체내에서 종양 크기를 줄이는데 있어 약학적으로 활성이다.
DR4 및 DR5에 대한 항체 모두는 낮은 투여량에서 가용 형태로서 효과적이며, 이때 낮은 투여량은 시험관내에서는 약 0.01 내지 약 1㎍/㎖ 미만 및 생체내에서는 약 1 내지 10㎎/㎏의 투여량 또는 농도를 의미한다. 본 발명 항체의 바람직한 특징은 이러한 항체들이 정상적인, 활성화되지 않은, 비형질전환된 간세포, 섬유동 세포, 활막 세포 등에서는 세포사멸을 유도하지 않으면서 DR5 또는 DR4 수용체 발현 세포에 대해 선택적으로 세포사멸을 유도한다는데 있다. TRAIL 수용체에 대해 발생하는 본 발명에 따른 항체는 실험용 동물로부터 본 발명에 따라 수확되었지만 당해 분야에 공지된 항체 생산 또는 합성의 임의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 대상내에서 감소되고 치료적으로 허용가능한 면역 반응을 끌어내면서도 수용체 결합 활성을 유지하기 위해서 본 발명에 따른 항체를 인간화함으로써, 본 발명에 따른 인간화 항-TRAIL 수용체 항체가 주어진 TRAIL 수용체에 대한 치료적 작용제 또는 길항제로서 사용된다. 본 발명은, 항-TRAIL 수용체 항체의 제 2 가교결합을 필요로 하지 않기 때문에 생체내 치료제로서 작용가능하다.
본 발명은 작용성 또는 길항성 세포사멸 효과를 갖는 단일 항-TRAIL 수용체 항체를 능가하는 범위로 확장된다. 2종 이상의 항-TRAIL 수용체 항체는 시험관내 세포 배양액 또는 생체내 대상물 조직과 접촉하여 강화된 처리를 생성한다. "강화된 처리"란 임의의 부가적, 상승적 또는 강화적 효과를 의미한다. 예를 들어 신경교종 세포주 U87 및 조혈 세포주 U937 및 몰트-4의 경우, 작용성 항-DR4과 항-DR5 둘 모두에 대해 상승작용적으로 노출시키면 반응성이지만, 작용성 항-DR5 항체 하나에만 노출시킬 경우 세포사멸 유도가 단지 제한적으로만 일어난다.
추가로, 길항성 항-TRAIL 수용체 항체는, 항체가 유인 수용체인 DcR1, DcR2 또는 OPG중 하나에 대해서만 결합 특이적인 경우, 본 발명에서 특히 유용하다. 본 발명에 따른 항체를 이용하여 유인 수용체를 선택적으로 차단하는 것은 유인 수용체를 발현하는 세포 유형에서 TRAIL 결합 평형을 세포사멸 신호를 전달할 수 있는 TRAIL 수용체 쪽으로 이동시키는 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 또 다른 조합된 치료법에서, 유인 수용체 결합 항체는 발현 세포가 작용성 세포사멸 신호 전달 TRAIL 수용체 결합에 대해 민감해지도록 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 설정된 TRAIL 수용체의 작용성 에피토프 및 길항성 에피토프를 밝히는 방법을 제공한다. 또한, 서로 다른 가변 영역 또는 CDR 영역을 갖는 단일클론성 항체의 패널을 사용함으로서, 주어진 TRAIL 수용체와 관련된 개개의 다형성이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 단일클론성 항체의 특성화된 패널은 작용성 및 길항성 에피토프 및 다형을 한정하는 능력을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 단일클론성 항체의 패널은 약제 발견 및/또는 질환 성향에 대한 대상 선별에 유용하다.
또한, 본 발명의 다른 실시양태는 면역글로불린 단백질, 폴리펩티드 또는 이들의 단편과 결합된 TRAIL 수용체의 항원성 단편을 비롯한 융합 단백질을 포함한다. TRAIL 수용체 단편은 표적 세포 표면상에서 발현되는 천연 TRAIL 수용체에 대한 면역원성 반응을 야기하기에 충분한 개수의 염기를 함유하는 것으로 정의된다. TRAIL 수용체 융합 단편은 10개 이상의 아미노산을 포함한다. 면역글로불린 융합 단백질 또는 이들의 단편은 본원에서 대상내에서 면역원성 증폭을 활성화하기 위해서 충분한 개수의 아미노산 염기를 갖는, 천연 또는 합성 단백질 또는 폴리펩티드 단편을 포함하는 것으로 정의된다. 면역글로불린 단편에 결합된 TRAIL 수용체 단편의 융합을 비롯한 본 발명의 면역원은 대상내에서 동일 반응계에서 항-TRAIL 수용체 항체를 알아내는 생체내 치료제로서 유용하다.
또한, 추가의 실시양태에서 본 발명은 유전자 치료로서 효력이 있다. 따라서, 본 발명은 발현성 TRAIL 수용체 핵산 서열을 포함하는 벡터로 표적 세포를 형질감염시키는 단계; 상기 TRAIL 수용체 핵산 서열에 의해 코딩된 TRAIL 수용체를 상기 세포상에서 발현시키는 단계; 및 상기 TRAIL 수용체의 결합에 대해 선택적인 세포사멸-유도 항체와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포에서 선택적으로 세포사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 유전자 치료 양상에서, 표적 세포는 TRAIL 수용체에 해당하는 발현가능한 서열을 수송하는 벡터에 의해 형질감염된다. 벡터는 통상적인 것으로 벡터에 대한 표적 세포의 감응성에 근거하여 선택된다. 유전자 치료 벡터로는 예시적으로는 아데노바이러스, pAdCMV5를 들 수 있다. 형질감염 TRAIL 수용체를 발현하는 표적 세포 또는 조직상에서, 세포 또는 조직은 형질감염 TRAIL 수용체를 결합하는데 특이적인 본 발명에 따른 항체에 노출된다. 항-TRAIL 수용체 항체는 목적하는 치료 결과와 일치하도록 이에 대해 작용성 또는 길항성인 것으로 인식된다.
본 발명의 항체는 또한 민감화제와 함께 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 민감화제는 자외선, 구체적으로 비스인돌말레이미드의 부류와 같은 유기 분자, 중금속 및 자유 라디칼 종을 비롯한 세포사멸을 유도하는 임의의 자극을 포함하는 것으로 정의된다.
암 치료에서, TRA-8은 제 2 가교결합의 부재하에서 카스파제 의존적 방식으로 TRAIL-감응성 암 세포 대부분의 세포사멸을 유도할 수 있다. TRA-8 및 2E12는 단독으로 또는 조합되어 시험관내에서 강한 살암 세포 활성을 나타낸다. 대부분의 TRAIL 감응성 세포의 세포사멸을 유도하는 TRA-8 또는 2E12의 능력은 DR5 또는 DR4중 하나가 단독으로 세포사멸을 촉발하기에 충분하다는 점을 입증하였다. 본원에서 상세히 설명되는 대부분의 종양 세포는 세포 표면 DR5를 발현하고, TRA-8 유도된 세포사멸에 대한 이들의 감응성이 TRAIL에 대한 이들의 감응성과 평행하며, 이는 DRA5가 대부분의 종양 세포에서 TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 1차적 사멸 수용체라는 것을 의미한다. 유사한 결과가 DR4에 특이적인 항체(예를 들어, 2E12)에서 수득된다. 따라서, 정상 세포와 암 세포에 의한 DR5 또는 DR4의 차별적인 발현은 TRAIL-매개된 세포사멸의 선택성에 있어서 효과적이다. TRA-8은 유인 수용체를 우회하여 TRAIL-매개된 세포사멸을 유도한다. 그러나 단지 소수의 TRAIL 내성 종양 세포만이 TRA-8에 민감하며, 이는 유인 수용체가 TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 종양 세포의 내성이 있어서 주요 역할을 수행하는 것으로 보이지 않는다는 것을 나타낸다.
기존의 연구 결과에서는, 동물에서 가용성 형태의 TRAIL을 전신 투여할 경우 독성(3,4,22)을 야기하지 않고 종양 퇴화를 유도하는 것으로 나타났지만, 인간 TRAIL의 막 결합 형태는 본원에 도시된 바와 같이 마우스에서 간 손상을 유도한다. 그러나, 정상 간 세포가 Fas 리간드에 비해 TRAIL-유도된 손상에 덜 민감하고, 생체내에서 TRAIL의 치사율이 없다는 점에 의해 입증되는 바와 같이, TRAIL의 간 독성은 Fas 리간드에 비해 덜 강력하다. 따라서, TRAIL의 적정은 암 치료에 유용하다.
본원에서 설명하는 바와 같이, 정상 간세포에서는 유의한 수준의 DR5 단백질 발현이 존재하지 않는 것으로 밝혀졌으며, 이는 TRA-8 유도 세포사멸에 대한 간세포 내성과 관련된다. DR5을 단일클론성 항체로 가교결합한 것은 세포사멸을 촉발할 수 있는 사멸 수용체의 단독중합체 형태를 조직화하기에는 불충분하다. 마모셋 실험에서는 TRA-8 투여로 인한 간 독성 증거가 제시되지 않았다. 따라서, 작용성 단일클론성 항-DR5 항체는 가용성 TRAIL에 비해 치료제로서 보다 선택적이고 보다 안정하다. 마찬가지로, DR4는 형질전환된 또는 활성화된 세포에 의해 발현되고, 정상 세포(예를 들어, 섬유 모세포)에 의해서는 인지할 수 있을 정도의 양으로 발현되지 않거나 또는 단지 매우 작은 양으로만 발현된다. 본 발명의 DR4는 섬유 모세포 등과 같은 비-표적 세포에서는 감지할 수 있는 세포사멸을 일으키지 않으면서 임의의 표적 세포의 세포사멸을 유도한다. 본원에서, 효과가 없거나 또는 인지할 수 있거나 유의한 효과가 없다는 것은 효과가 전혀 없거나, 또는 효과가 바탕값 또는 대조군 수준 이하이고, 바탕값 또는 대조군 수준의 1.5배 이상 만큼 바탕값 및 대조군 수준을 초과하지 않는다는 것을 의미한다.
선별 분석법 또는 이미지화 수단으로서, 본 발명은 여전히 정상 세포 형태를 나타낼 수 있는 DR4 또는 DR5 세포의 작은 클러스터를 검출하는데 적당하다. 예를 들어, 본 발명에 따른 표지된 항체를 이용한 폐, 전립선 및 간 암을 비롯한 인간 암 세포의 동일 반응계 세포 절편 염색은 암 세포를 용이하게 확인할 수 있다. 본 발명의 항체는 류마티스성 관절염과 같은 다양한 염증성 및 자가면역 질환을 비롯한 다른 질환의 출현을 선별하는데 유용하다. 이러한 선별은 다른 임상적 증상이 개시되기 전에도 유용할 수 있으며, 질환의 위험에서 대상을 선별하는데 사용될 수 있어 다른 신호 또는 증상이 출현하기 전에 예방치료를 개시할 수 있다. 특히, 암 세포는 동일한 유형의 정상 세포에 비해 매우 높은 DR5 수준을 발현하는 것으로 관측되었다. 따라서, 본 발명은 적어도 폐, 전립선, 결장, 혈액, 경부, 유방 및 간을 비롯한 조직 내부의 초기 단계 악성 종양에 대한 민감한 선별 방법으로서 유용하다. 예시적으로 특히 악성 종양 및 림프구 백혈병을 비롯한 질환과 관련된 이상 세포의 증식을 억제하기 위한 치료 방법을 본원에서 상세히 설명한다.
본 발명은 ATCC 수탁번호 PTA-1428을 갖는 것으로 TRA-8로서 표시되는 항-인간 DR5 단일클론성 항체에 대해 본원에서 상세히 설명한다. 작용성 항-인간 DR5 단일클론성 항체 TRA-8에 관해 상세히 기재된 기법 및 결과는 길항성 DR5 항체 및 작용성 및 길항성 방식으로 DR4, DcR1 및 DcR2에 대해 작용하는 항체에까지 확장가능하고 적용가능하다. 따라서, 본 발명은 본원에서 인간의 DR4에 특이적인 세포사멸-유도 항체에 관해 상세히 설명한다. 하나의 실시양태에 있어서, 항체는 2001년 10월 24일에 더 유에비 리써치 파운데이션을 대리하여 미국 메릴랜드 로크빌 소재의 아메리카 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁된 하이브리도마 2E12와 동일한 에피토프 특이성을 갖는다. 기탁된 물질은 2E12로 지정된 균주로서 PCT/US01/14151 참조 도켓 번호를 갖는 "인간의 DR4에 대한 2E12 하이브리도마 클론"이다. 세포사멸 수용체, 예를 들어 Fas의 발현 수준이 반드시 세포사멸에 대한 세포의 감응성에 비례하는 것은 아니다. TRAIL-매개된 세포사멸의 경우, TRAIL을 위한 유인성 수용체의 발현은 세포의 감응성에 영향을 미치는 것으로 제안된다. 게다가, DR5는 FADD 및 카스파제 8 경로를 통해 세포사멸 신호를 효과적으로 전달하기 위해서는 DR4와 관련되어야만 한다고 제시되었다. 작용성 단일클론성 항-DR5 항체를 이용하면 DR5 신호전달의 조절 및 TRAIL-매개된 세포사멸에 있어서의 이들의 상대적 역할을 평가하는 것이 가능하다. TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 세포의 감응성과 TRA-8 매개 세포사멸에 대한 세포의 감응성을 비교하면, TRAIL-매개된 세포사멸에서의 DR5의 역할 및 감응성에 영향을 미칠 수 있는 기전에 대해 통찰할 수 있다. 유사한 장점이 DR4 항체에 의해 제공된다.
이러한 장점은 일반적으로 본 발명의 인간화 DR5 및 DR4 항체까지 확장가능하다. 예를 들어, DR-5에 대한 항체의 분자 클론은 하기 실시예에서 상세히 설명하는 바와 같은 공지된 기법에 의해 준비되었다. 재조합 DNA 방법론(33)은 단일클론성 항체 분자 또는 이들의 항원 결합 영역을 코딩하는 핵산 서열을 구축하는데 효력이 있다.
본 발명은 여전히 효과적인 항체 효과기 기능을 갖지만 인간 항-마우스 항체(이하, "HAMA"로서 지칭됨) 반응(34)을 유도하지 않는 인간화 항-TRAIL 수용체 항체를 구축한다. 또한 완전한 인간의 항체를 제조할 수 있는 마우스(인간의 항체를 제조하도록 유전적으로 개질된 마우스)를 면역화하고, DR5 또는 DR4와 결합하여 세포사멸을 유도하고, TRA-8 또는 2E12 에피토프와 경쟁하는 클론을 선별함으로써, 완전한 인간의 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 완전한 인간의 항체를 제조하는 방법과 관련하여 본원에 참고로 혼입된 론버그 및 후스자(Lonberg and Huszar)의 문헌["Human antibodies from transgenic mice", Int. Rev. Immunol. 13:65-93, 1995)를 참조할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "인간" 및 "인간화"라는 용어는 항체와 관련하여 인간 대상에서 치료적으로 참을 수 있는 약한 면역원성 반응을 야기할 것으로 예상되는 임의의 항체에 관한 것이다.
본 발명은 DR5 항체, 인간화 항-DR5 항체, TRA-8 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 인간화 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 제공한다. 본 발명은 또한 DR4 항체, 인간화 항-DR5 항체, DR4 항체의 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 인간화 중쇄 및 경쇄 면역글로불린, 항체 및 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 및 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 단백질 또는 유전자의 특정 절단물은 전체 서열의 단백질 또는 유전자의 조절 또는 효소 기능을 수행한다. 예를 들어, 이들을 코딩하는 핵산 서열은 단백질 또는 유전자와 동등한 작용을 제공하는 치환, 부가, 삭제 또는 중합성 발현에 의해 개질될 수 있다. 핵산 코딩 서열의 퇴행으로 인해, 천연 생성 단백질의 서열과 실질적으로 동일한 아미노산의 서열을 코딩하는 다른 서열을 본 발명의 실행에서 사용할 수 있다. 이의 예로는, 서열내에서 기능적으로 등가의 아미노산 잔기를 코딩하는 상이한 코돈의 치환에 의해 변경되어, 사일런트(silent) 변화를 생성하는, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 모두 또는 일부를 포함하는 핵산 서열이 포함되나 이로 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열은, 변이체가 TRAIL 수용체 DR5를 인식하는 효과적인 항체를 형성하는 한, 표준 방법(문헌["Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.])에 의해 계산하였을 때 25% 이하의 서열 상동성 변이를 참을 수 있는 것으로 판단된다. 예를 들어, 폴리펩티드 서열내 하나 이상의 아미노산 잔기는 기능적으로 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산에 의해 치환되어 사일런트 변화를 나타낼 수 있다. 서열 내부 아미노산에 대한 치환체는 아미노산이 속해 있는 부류의 다른 요소로부터 선택될 수 있다(즉, 보존 치환체). 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌이 포함된다. 극성 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민이 포함된다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 포함된다. 음으로 하전된(산성) 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산이 포함된다. 예를 들어 글리코실화(glycosylation), 양성자이동(protolytic) 분할, 항체 분자 또는 기타 세포성 리간드에 대한 연결 등에 의해, 번역 도중 또는 번역 후에 상이하게 개질된 단백질 또는 단편 또는 이들의 유도체 또한 본 발명의 범주내에 포함된다. 또한, 본 발명의 항체의 핵산 서열을 코딩하는 재조합 벡터를 유전자 조작하여 벡터의 처리 또는 발현을 개질시킬 수 있다. 항체에서 세포사멸 활성을 감소시키거나 실질적으로 감소시키지 않고 핵산 또는 아미노산 서열에 다른 개질을 가할 수 있다. 당해 분야에 통상적인 기술을 사용하여 CDR 또는 비CDR에서 이런 개질이 발생할 수 있다. CDR 워킹(walking) 돌연변이 방법과 관련하여, 본원에서 참고로 혼입하고 있는 양(Yang) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 254:392-403, 1995]을 참조할 수 있다.
또한, 억제제를 코딩하는 핵산 서열이 시험관내 또는 생체내에서 돌연변이되어 번역, 개시 및/또는 종결 서열을 생성하고/하거나 파괴하거나, 코딩 영역에서 변이를 생성하고/하거나 신규한 제한효소 부위를 형성하거나 기존의 부위를 파괴시켜, 추가의 시험관내 개질을 촉진시킬 수 있다. 시험관내 부위 지향된 돌연변이유도, 문헌[J. Biol. Chem. 253:6551], 탭(Tab) 링커(파마시아(Pharmacia)에서 제조)의 사용 등을 포함하나 이로 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 돌연변이생성 기법을 사용할 수 있다.
X선 결정학 데이터로부터, 접혀진 항체 면역글로불린이 일반적으로 각각 3개 또는 4개의 b-쇄로 이루어진 2개 층의 역평행(antiparallel) b-시트를 포함하는 긴 원통형 구조를 형성함을 알 수 있다. 가변 영역에서는, H 및 L 쇄의 V 도메인 각각에서 나온 3개의 루프가 함께 군집하여 항원-결합 부위를 형성한다. 이러한 루프를 각각 상보성 결정 부위(complementarity determining region; CDR)라 한다. CDR은 항체 내부에서 아미노산 서열이 가장 많이 변이된다. CDR 부분이 아닌 가변 영역 부분은 "골격 영역"("FR" 영역)으로서 지칭되며, 일반적으로 CDR 구조를 유지하는 역할을 한다. 바람직하게는, TRAIL 수용체 에피토프 영역을 위한 결합 영역을 보존하기 위해, 주어진 항체에서 나온 CDR은 모두 수용체 항체로 이식된다. 전체 CDR 양의 일부를 공여자에 이식하는 것이 효과적인 것으로 본원에서 판단된다. 이식은 일반적으로 잔기를 다른 잔기로 교체, 하나의 아미노산 또는 영역을 다른 아미노산 또는 영역으로 교체하는 것을 포함하는 것으로 이해할 수 있다. 그러나, 경우에 따라 특히 영역을 전이하는 경우, 하나 이상의 잔기를 목적에 따라 첨가, 생략 또는 치환될 수 있으며, 이러한 삭제 및 삽입 뿐만 아니라 적합한 치환 및 역위도 당해 분야의 기술 범주에 속한다.
본 발명의 항체는 예를 들어 항-TRAIL 수용체 단일클론성 항체의 L 및 H 쇄 아단위의 각각의 CDR을 인간 항체의 상응하는 CDR 영역으로 이식하여 TRAIL-수용체에 대해 효과적인 마우스 단일클론성 항체를 인간화함으로써 수득된다.
분자의 개별특이형(idiotype)을 함유하는 항체 단편은 또한 공지된 기법을 사용하여 본원에서 생성되고 효과적으로 된다. 예를 들어, 이러한 단편의 예로는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 항-TRAIL 수용체(AB')2 단편, TRAIL 수용체(AB')2 단편의 디설파이드 연결의 환원을 통해 발생되는 TRAIL 수용체 항체 (AB') 단편, 및 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 발생되는 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 항체는 당해 분야에 공지된 다수의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어 특히, 항-DR5 단일클론성 항체 TRA-8은 하이브리도마를 배양시키고, 인간 DR5로 마우스를 면역시키고, 후속적으로 상기 마우스의 비장 세포 또는 림프 결절 세포를 마우스 골수종 세포와 융합시킴으로써 수득될 수 있다.
단일클론성 항체의 제조는 예시적으로 다음의 단계들을 포함한다:
a) 항원으로서 사용하기 위해 생체거대분자를 정제하고;
b) 먼저 항원을 동물에 주사함으로써 동물을 면역화시키고, 비장을 제거할 때를 결정하기 위해 동물의 혈액을 채취하여 항체 역가를 분석하여, 항체 생성 세포를 제조하고;
c) 골수종 세포를 제조하고;
d) 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합하고;
e) 목적 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택하고;
f) 단일 세포 클론을 제조(클로닝)하고;
g) 선택적으로, 하이브리도마 세포를 배양하거나, 또는 단일클론성 항체의 대규모 제조를 위해 하이브리도마 세포가 이식될 동물을 성장시키고;
h) 이렇게 제조된 단일클론성 항체의 생물학적 활성 및 특이성을 시험하거나, 표지 시약의 성질을 분석한다.
단일클론성 항체를 제조하는 과정은 상기 개시된 단계를 참고하여 하기에 설명된다. 본 발명의 항체를 제조하는 이 방법은 단지 제조 방법의 예시일 뿐 이로서 한정되는 것은 아니다. 다른 공지된 방법을 따르거나, 또는 예를 들어 비장 세포 및 골수종이 아닌 항체를 생산하는 다른 세포를 이용함으로써 변형된 방법을 따를 수 있다.
(a) 항원의 제조
항원으로 효과적인 재조합 단백질(이하, "재조합 인간 DR5" 또는 "재조합 인간 DR4"로서 지칭됨)은 인간 DR5 또는 DR4의 세포외 영역 및 인간 IgG1 항체의 Fc 영역(이하, "IgG"로서 지칭됨. 예를 들어, PTA-1428)을 포함하는 융합 단백질용 발현 벡터 pAdDR5-IgG로 QBI-293A 세포를 형질감염시키고, ADENOQuest 키트(캐나다 소재의 퀀텀 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies Inc.))를 이용하여 이를 발현시키고, 발현 생성물을 수집하고 부분적으로 정제함으로써 수득된다. 플라스미드 pAdDR5-IgG는 인간 DR5 또는 DR4 및 인간 IgG 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 pAdCMV5(이는 동물 세포용 발현 벡터이다)로 삽입함으로써 구축된다. DR5 또는 DR4를 코딩하는 DNA, 벡터, 숙주와 같은 다른 물질은 본원에서는 효과적이다.
벡터 pAdDR5-Ig5로 형질감염된 QBI-293A 세포의 배양 상층액에서 생산된 인간 DR5 또는 DR4 및 IgG 융합 단백질은 단백질A-세파로즈 친화성 크로마토그래피 또는 단백질G-세파로즈 친화성 크로마토그래피, 또는 리소스(Resource) Q 컬럼(상표명; 파마시아)을 이용한 이온-교환 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제될 수 있다.
다르게는, 인간 세포주의 세포막으로부터 수득된 정제된 DR5 또는 DR4를 항원으로서 사용한다. 또한 DR4 및 DR5의 1차 구조가 공지되어 있기 때문에(예를 들어, PTA-1428), 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 상거(Sanger) 방법과 같은 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성하여 항원으로 이용할 수 있다.
(b) 항체 생성 세포의 제조
단계 (a)에서 생산된 면역원을 이용하여 마우스에 면역성을 부여하고, 보조제, 예를 들어 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 보조제 또는 백반(alum)과 혼합한다. 다른 적합한 실험 동물은 예시적으로 래트, 기니아 피그, 토끼, 개, 닭, 말, 돼지, 소 및 양을 포함한다.
실험 동물에 면역성을 부여하기 위한 적합한 투여 경로는 피하, 복강내, 정맥내, 피부내 및 근육내 주사 경로를 포함하고, 피하 및 복강내 주사가 바람직하다.
면역화는 선택적으로 단일 투여, 또는 적절한 간격(바람직하게는 1 내지 5주)으로 여러번 반복 투여함으로써 수행된다. 면역화된 동물은 혈청중의 항체 역가에 대해 모니터링되고, 충분히 높은 항체 역가를 갖는 동물이 항체 생성 세포의 공급원으로서 선택된다. 높은 역가를 갖는 동물을 선택하는 것은 후속적인 과정을 보다 효율적이게 한다. 후속적인 융합을 위한 세포는 일반적으로 제 1 면역화시킨지 3 내지 5일 후에 수확한다.
항체 역가를 평가하는 방법은 방사선면역분석(이하, "RIA"로서 지칭됨), 고형 효소 면역분석(이하, "ELISA"로서 지칭됨), 형광 항체 분석 및 수동적 혈구응집 검정법과 같은 잘 공지된 기법을 포함하고, 검출 감응성, 속도, 정확성 및 자동화 가능성의 이유로 인해 RIA와 ELISA가 바람직하다.
예를 들어, 다음과 같이 ELISA에 의해 항체 역가를 측정할 수 있다. 먼저, 정제되거나 부분적으로 정제된 DR5 또는 DR4를 고형, 예를 들어 96웰 ELISA 평판의 표면에 흡착시킨 후, DR5 또는 DR4가 결합하지 않은 임의의 나머지 표면을 항원과는 무관한 단백질(예를 들어, 소의 혈청 알부민(BSA))로 차단시킨다. 세척한 후, 웰의 표면을 연속적으로 희석시킨 마우스의 혈청 샘플과 접촉시켜 샘플중의 DR5 또는 DR4 항체가 항원에 결합할 수 있게 한다. 제 2 항체로서 표지된(labeled) 항-마우스 항체를 마우스 항체에 첨가하여 결합시킨다. 표지는 효소적 표지, 형광 표지 또는 당해 분야에 공지된 다른 표지를 포함할 수 있다. 세척한 후에, 효소 기질을 첨가하고, 기질 등의 변화에 의해 야기된 색 전개로 인한 흡광 변화를 측정함으로써 항체 역가를 측정한다.
(c) 골수종 세포의 제조
확립된 마우스 세포주에서 나온 세포는 골수종 세포의 공급원으로서 작용하고, 예를 들어 BALB/c 골수종 균주인 P3X63Ag8U.1(P3-U1)(35), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)(36), Sp2/0-Ag14(SP-2)(37), P3X63Ag8.653(653)(38) 및 P3X63Ag8(X63)(39)에서 유래한 8-아자구아닌 내성 마우스를 포함한다. 선택된 세포주를 적절한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지로 연속적으로 옮긴다. 8-아자구아닌 배지는 이스코브(Iscove)의 모디파이드 둘베코스 메디움(Modified Dulbecco's Medium)(이하, "IMDM"으로서 지칭됨) 또는 둘베코스 모디파이드 이글 메디움(Modified Eagle Medium)(이하, "DMEM"으로서 지칭됨)을 포함한다. RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, 송아지 태아 혈청(이하, "FCS"로서 지칭됨) 및 8-아자구아닌이 보충된다. 그런 다음, 융합시키기 3 내지 4일 전에 세포를 10% FCS를 함유한 정상 배지, 예를 들어 ASF104 배지(아지노모토(Ajinomoto), K.K,.)로 옮겨 최소한 2x107개의 세포가 융합 일에 이용가능하도록 보증한다.
(d) 세포 융합
동물의 임의의 적합한 부분에서 수득한 림프구 및 혈장 세포는 항체를 생산하기 위한 전구체 세포이다. 림프구 또는 혈장 세포의 공급원은 예시적으로 비장, 림프절, 말초 혈액 또는 이의 임의의 적절한 조합을 포함하고, 비장 세포가 가장 흔한 공급원이다.
최후의 부스터 주사 후에, 항체 생성 세포가 존재하는 조직을 예정된 항체 역가를 갖는 마우스에서 제거한다. 비장 세포와, 단계 (c)에서 제조된 골수종 세포를 융합시키는데 현재 선호되는 기법은 폴리에틸렌 글리콜을 이용하는 것이다.
융합 기법은 비장 및 골수종 세포를 혈청-부재(예를 들어, RPMI 1640) 또는 포스페이트 완충된 염수(이하, "PBS"로서 지칭됨)로 세척하여 골수종 세포에 대한 비장 세포의 비율을 약 5:1 내지 10:1로 유지한 후 원심분리시키는 것을 포함한다. 상층액을 따라내고, 펠렛화된 세포를 충분히 느슨하게 만든 후, 50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(분자량 1000 내지 4000)을 함유하는 혈청-부재 배지 1㎖를 혼합하면서 적가한다. 그런 다음, 10㎖의, 혈청-부재 배지를 서서히 첨가한 후 원심분리시킨다. 상층액을 다시 따라내고, 펠렛을 형성한 세포를 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘의 용액(이하, "HAT"로서 지칭됨) 및 마우스의 인터루킨-2(이하, "IL-2"로서 지칭됨)를 함유하는 HAT 배지 적량에 현탁시킨다. 그런 다음, 현탁액을 배양 평판(또한, 이를 본원에서는 간단히 "평판"으로서 지칭됨)의 웰에 분배하고, 37℃에서 5% v/v CO2의 존재하에서 적절히 HAT 배지를 보충 첨가하면서 약 2주 동안 배양한다.
(e) 하이브리도마의 선택
사용되는 골수종 균주가 8-아자구아닌에 대한 내성을 갖기 때문에, 즉, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소(HGPRT)가 결핍되어 있기 때문에, 임의의 융합되지 않은 골수종 세포 및 임의의 골수종-골수종 융합체는 HAT 배지에서 생존할 수 없다. 한편, 항체 생성 세포와 골수종 세포의 하이브리도마 뿐만 아니라, 항체 생성 세포끼리의 융합체는 생존할 수 있지만, 후자는 단지 제한된 수명을 갖는다. 따라서, HAT 배지에서 계속 배양하면 바람직한 하이브리도마만이 선택된다.
생성된 하이브리도마는 집락으로 성장한 후, 아미노프테린-부재 HAT 배지(HT 배지)로 옮겨진다. 이후에, 배지 상층액 분취액을 회수하여, 예를 들어 ELISA에 의해 항-Fas 항체 역가를 측정한다. 상기 언급된 융합 단백질을 ELISA 항원으로서 사용하는 경우, 인간 IgG1의 Fc 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 클론을 제거하는 것 또한 필요하다. 이런 클론의 존재 여부는, 예를 들어 항체로서 Fas-IgG1 또는 IgG1을 이용하는 ELISA에 의해 증명될 수 있다.
(f) 클로닝
그런 다음, 항체 역가를 측정하기 위해 단계 (b)에 개시된 것과 유사한 방법을 이용하여, 특정한 항체를 생산하는 것으로 도시된 하이브리도마를 클로닝을 위해 다른 평판으로 옮긴다. 적합한 클로닝 방법은 제한 희석 방법(여기서는 하이브리도마를 평판의 웰당 하나의 세포를 함유하도록 희석시킨 다음 배양한다); 연질 한천 방법(여기서는 연질 한천 배지에서 배양한 후 집락을 회수한다); 배양을 위해 단일 세포를 분리하기 위해 마이크로매니플레이터(micromanipulator)를 이용하는 방법; 및 "소트-어-클론(sort-a-clone)"(여기서는 세포 분류기를 이용하여 단일 세포를 분리한다)을 포함한다.
예를 들어, 제한 희석 방법에 따른 클로닝 과정은 항체 역가를 나타내는 각각의 웰당 2 내지 4회 반복되고, 안정한 항체 역가를 갖는 클론을 항-DR5 항체를 생산하는 하이브리도마로 선택한다. 항-마우스 DR5 항체를 생산하는 하이브리도마를 유사한 방법으로 선택하여 항-DR5 단일클론성 항체 생성 세포주를 수득한다.
본 발명의 항체를 위한 기본인 마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8을 2000년 3월 1일자로 ATCC에 기탁하고, 수탁 번호 PTA-1428을 받았다. 상기 개시된 바와 같이 2E12 하이브리도마를 2001년 10월 24일에 ATCC에 기탁하고, 수탁 번호 PTA-3798을 받았다. 따라서, 마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8 또는 임의의 다른 확립된 하이브리도마를 이용하여 항체를 제조하는 경우, 단계 (a) 내지 (f)를 생략하고 단계 (g) 이후부터 시작하는 과정을 따라 제조할 수 있다.
(g) 단일클론성 항체를 제조하는 하이브리도마의 배양
그 다음 클로닝에 의해 수득된 하이브리도마를 HT 배지가 아닌 정상 배지에서 배양한다. 큰 배양 병을 이용하는 롤러 버틀(roller bottle) 배양 또는 스피너(spinner) 배양에 의해 대규모로 배양한다. 그런 다음, 대규모 배양액에서 나온 상층액을 수확하거나, 적합한 방법, 예를 들어 당해 분야에 숙련된 이들에게 잘 공지되어 있는 겔 여과에 의해 정제하여 본 발명의 항체의 기본인 DR5 또는 DR4 단일클론성 항체를 수득한다. 또한 하이브리도마를 공통 유전자 마우스, 예를 들어 BALB/c 마우스 또는 nu/nu 마우스의 복강 내에서 성장시켜, 다량의 DR5 또는 DR4 단일클론성 항체를 함유하는 복수(腹水)를 수득할 수 있다. 시판중인 단일클론성 항체 정제 키트(예를 들어, MAbTrap GII 키트; 파마시아)를 이용하여 수확된 항체를 정제한다.
상기와 같이 제조된 단일클론성 항체는 각각 인간 DR5 또는 DR4에 대해 높은 특이성을 갖는다.
(h) 단일클론성 항체의 분석
단일클론성 항체의 동종형 및 아부류의 적합한 확인 방법은 오크털로니(Ouchterlony) 방법, ELISA 및 RIA를 포함한다. 바람직하게는, 상업적인 키트, 예를 들어 마우스 타이퍼 키트(상표명, Mouse Typer Kit; 바이오라드(BioRad))를 이용하여 확인한다.
폴린-로우리(Folin-Lowry) 방법을 이용하거나, 280㎚에서의 흡광도(1.4(OD280)= 면역글로불린 1㎎/㎖)에 근거하여 단백질을 정량할 수 있다.
단일클론성 항체가 인식하는 에피토프의 확인은 다음과 같이 수행된다. 먼저, 단일클론성 항체가 인식하는 분자의 다양한 부분 구조를 준비한다. 분자의 다양한 부분적 펩티드를 공지된 올리고펩티드 합성 기법에 의해 합성적으로 제조하는 방법, 또는 바람직한 부분적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 적합한 발현 플라스미드에 도입하고, 적합한 숙주, 예를 들어 대장균에 발현하여 펩티드를 생성하는 방법에 의해 부분 구조를 제조한다. 일반적으로 두 방법 모두 상기 목적을 위해 종종 조합되어 사용된다. 예를 들어, 항원 단백질의 C- 또는 N-말단에서 작용하는, 적절하게 감소된 길이를 갖는 일련의 폴리펩티드를 확립된 유전자 조작 기법에 의해 제조할 수 있다. 항체와 반응하는 단편을 확립함으로써, 에피토프 부위의 대략적인 아이디어를 얻는다.
에피토프는 확립된 올리고펩티드 합성 기법을 이용하여 이에 상응하는 다양한 더 작은 올리고펩티드 또는 펩티드의 돌연변이체를 합성하여, 항-DR5 단일클론성 항체에 대한 펩티드의 결합 성질을 측정함으로써 보다 밀접하게 확인되고, 예를 들어 이는 본 발명의 항체의 제조 및 단일클론성 항체를 이용한 항원에 대한 펩티드의 결합의 경쟁성 억제의 근거가 된다. 시판되는 키트, 예를 들어 스팟츠 키트(SPOTs Kit; 제노시스 바이오테크놀리지스 인코포레이티드(Genosys Biotechnologies, Inc.), 및 멀티핀(multipin) 합성 방법(키론 코포레이션(Chiron Corp.))에 근거한 일련의 멀티핀 펩티드 합성 키트를 통상적으로 이용하여 매우 다양한 올리고펩티드를 수득할 수 있다.
본 발명의 항체는 하기 개시된 다양한 기능적 성질 a) 내지 f)를 갖고, 이들 각각은, 예를 들어 하기 개시된 방법에 의해 입증된다.
a) 인간 DR5를 발현하는 세포에 대한 TRA-8의 특이적 결합
본 발명의 독특한 특징은 세포 표면 DR5에 결합하는 능력이다. 이는 DR5를 발현하는 세포의 유량 세포분석에 의해 입증된다. 먼저, DR5의 특이적 세포 표면 결합은 인간 DR5를 코딩하는 전체 길이 cDNA로 형질감염된 Cos-7 세포에 의해 확인된다. 구체적으로, TRA-8은 DR5로 형질감염된 Cos-7 세포만을 인식하고, 비어있는 대조군 벡터나 DR4를 코딩하는 벡터는 인식하지 않는다. 두 번째로, 3가지의 다른 기원, 간조혈, 신경교종 및 전립선의 인간의 악성 종양 세포를 시험한다. 이들 형질전환된 종양 세포의 대부분은 비록 그 발현 수준은 상당히 다양하지만, 상당한 양의 세포 표면 DR5를 발현한다. 세 번째로, RA 및 OA 환자에서 나온 인간의 활막 섬유 모세포의 2가지 패널을 조사한다. 모든 RA 활막 세포는 OA 세포에 비해 상당히 더 높은 수준의 DR5를 발현한다.
b) 가교결합의 부재하에서 시험관내 인간의 악성 종양 세포의 세포사멸의 유도
TRAIL 수용체를 인식하고 악성 인간 종양 세포의 세포사멸을 직접 유도하는 본 발명에 따라 발생되는 항체의 능력은 다양한 농도의 항체, 특히 TRA-8을 이용하여 세포의 시험관내 배양 동안의 세포 생존율 분석(ATPLite)에 의해 측정된다. 종양 세포의 대부분은 TRA-8 유도되는 세포사멸에 민감하다. 일부 세포의 경우, TRA-8은 강한 세포사멸-유도 활성을 나타내고, 예를 들어 TRA-8은 pg/㎖ 수준에서 인간 위르캣(Jurkat) 세포의 세포사멸을 유도할 수 있다. 중요하게는, TRA-8 유도 세포사멸은 가교결합을 요구하지 않고, 대부분의 세포에서, TRA-8은 인핸서(enhancer)의 존재하에서 재조합 가용성 TRAIL보다 더 강한 세포사멸-유도 활성을 나타낸다.
c) TRA-8의 생체내 살종양 활성
TRA-8의 살종양 활성을 2가지의 SCID/인간 종양 세포 모델에서 평가한다. 먼저, SCID 마우스에 인간 백혈구 위르캣 세포를 정맥내 접종하고, 단일 투여량(100㎍)의 TRA-8로 처리한다. 결과는 TRA-8을 이용한 처리에 의해 이식된 위르캣 세포의 대부분이 말초 혈관 및 비장에서 제거됨을 보여주고, 이는 유량 세포분석 및 위르캣 세포의 동일 반응계 면역조직화학 체거름(straining)에 의해 판단된다. 두 번째로 인간의 성상세포종 세포인 1321N1을 SCID 마우스에 피하 접종하고, 종양을 갖고 있는 마우스를 단일 투여량의 TRA-8로 처리한다. 이식된 1321N1 세포의 성장은 TRA-8 처리된 마우스에서 상당히 억제되고, 이는 종양의 크기 및 조직 분석에 의해 측정된다.
d) TRA-8에 의한 RA 활막 세포의 확인
8명의 RA 및 4명의 OA 환자에서 단리된 원발성 활막 세포를 DR5의 세포 표면 발현에 대해 시험한다. TRA-8은 모든 RA 세포를 양성 염색시킬 수 있지만, 모든 OA 세포를 음성 염색시킬 수 있다. 따라서, RA는 TRA-8에 의해 검출되는 바와 같이 DR5의 표면 발현에 의해 OA와 차별화된다.
e) TRA-8에 의한 RA 활막 섬유 모세포에서의 세포사멸의 유도
RA 활막 세포의 세포사멸을 유도하는 TRA-8의 능력은 다양한 농도의 TRA-8의 존재하에서 시험관내 배양 동안 세포 생존율 분석에 의해 측정된다. 모든 RA 세포는 100ng/㎖의 TRA-8에 대한 높음 내지 중간 수준의 감응성을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 모든 OA 세포는 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 본질적으로 내성을 나타낸다. 중요하게는, TRA-8은 인핸서가 있는 가용성 TRAIL에 비해 RA 활막 세포에 대해 더 높은 세포사멸-유도 활성을 나타낸다. 더욱이, 항-Fas 항체(CH-11)에 비해, TRA-8은 RA 활막 세포에 대해 더 좋은 선택성을 나타낸다.
f) TRA-8은 RA 활막 세포에서 MMP의 생산을 유도하지 않는다.
TRA-8은 TNF-a와 같은 RA 활막 세포중의 NFκb 활성화를 유도할 수 있기 때문에 활막 세포의 MMP-1 및 MMP-3 생산에 대한 TRA-8의 효과가 측정된다. TNF-a가 MMP의 투여량 의존적인 증가를 유도하지만, TRA-8은 MMP의 임의의 생산을 유도할 수 없고, TRA-8은 RA 활막 세포중의 MMP의 생산을 약간 감소시킨다.
g) TRA-8은 복합적인 카스파제 활성화를 유도한다.
카스파제는 세포사멸의 유도에 결정적인 역할을 한다. 카스파제 활성화를 유도하는 TRA-8의 역할은 인간 위르캣 세포에서 측정된다. 위르캣 세포를 낮은 투여량(50ng/㎖)의 TRA-8과 함께 배양하는 경우, 웨스턴 블롯 분석 및 카스파제 분해 분석에 의해 입증되는 바와 같이 배양한지 15분이라는 이른 시기에 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제 3의 활성화가 관찰된다. 카스파제 활성화 시기, 수 및 강도의 측면에서, 입증하는 항체 TRA-8을 포함하는 본 발명의 항체는 항-인간 Fas 항체(CH-11)와 같은 임의의 다른 공지된 세포사멸-유도 항체보다 훨씬 더 좋은 활성을 나타낸다.
2E12 항체는 가용성 형태로 DR4에 특이적으로 결합하고, DR4를 발현하는 표적 세포(예를 들어, 암 세포, 류마티스성 관절염 활막 세포, 활성화된 면역 세포와 유사한 활성화된 림프구 및 바이러스에 감염된 세포)에서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖고, 생체내에서 살종양 활성(바람직하게는 비-종양 세포에 대한 독성은 없는)을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 DR4 항체는 30㎍/㎖, 3㎍/㎖, 0.3㎍/㎖ 또는 0.03㎍/㎖ 미만의 항체 농도에서 약 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만의 표적 세포 생존율을 특징으로 하는 세포사멸-유도 활성, 및 종양 크기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 감소를 특징으로 하는 살종양 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 항체는 효과 (a) 내지 (g)에서 나타난 바와 같은 병원성 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 성질을 갖는 물질이다. 따라서, 이는 세포의 부적절한 생존 또는 세포의 부적절한 증식과 연관된 질환, 예를 들어 Fas/Fas 리간드 시스템을 포함하는 세포사멸 시스템의 조절이상에 기인한 질환을 위한 예방 및 치료제로서 유용하다.
세포사멸을 유도하는 본 발명의 항체의 능력은 인간 백혈구 세포주인 위르캣(ATCC TIB-152) 및 성상세포종 세포주 1321N과 같은 세포를 시험 샘플이 첨가된 배지에서 배양하고, ATPLite 분석과 같은 생존율을 측정함으로써 확인된다.
본 발명의 항체, 특히 인간의 항체와 거의 동일한 인간에 대한 면역원성을 갖는 DR5 및 DR4 항체는 염증 및 자가면역 질환의 세포사멸 시스템의 조절이상에 기인한 질환을 포함하는, 세포의 부적절한 생존 또는 세포의 부적절한 증식과 연관된 질환을 위한 예방 및 치료제로서 유용하고, 이런 질환은 예시적으로 전신성 루푸스 홍반증, 하시모토병, 류마티스성 관절염, 이식편-대-숙주 질환, 쇼그렌 증후군, 악성 빈혈, 애디슨 병, 공피증, 굿파스튜어 증후군, 크론병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 불임, 중증근무력증, 다발성 경화증, 바세도우병, 혈소판 감소성 자반증, 인슐린 의존성 당뇨병, 알레르기; 천식, 아토피 질환; 죽상경화증; 심근염; 심근증; 사구체신염; 재생불량성 빈혈; 기관 이식후 거부 및 폐, 전립선, 간, 난소, 결장, 경부, 림프 및 유방 조직의 다양한 악성 종양을 포함한다. 본 발명의 항체는, 표적 세포가 특정한 TRAIL 수용체(즉, DR4 또는 DR5)를 발현하거나 발현하도록 만들어질 수 있는 한, 활성화된 림프구, 림프계 세포, 골수 세포 및 류마티스성 활막 세포(염증성 활막 세포, 대식세포형 활막 세포, 섬유 모세포형 활막 세포를 포함한다) 및 바이러스 감염된 세포(예를 들어, HIV로 감염된 세포를 포함한다)를 포함하는 활성화된 면역 세포를 대상으로 하여 이들 세포에서 세포사멸을 선택적으로 유도하는데 사용될 수 있다.
이런 예방 또는 치료제는 다양한 형태로 투여될 수 있다. 적합한 투여 방식은 경구 투여, 예를 들어 정제, 캡슐, 과립, 분말 및 시럽 또는 비경구 투여, 예를 들어 주사 또는 좌제를 포함한다.
항체 또는 치료제는 경구, 직장, 조(槽)내, 심실내, 두개골내, 포막내, 관절내, 질내, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 국소(분말, 연고 또는 적하제(drops)), 복강내 주사, 경피, 흡입 또는 협측 또는 비강 분무 투여될 수 있다. 필요한 항체 또는 치료제의 정확한 양은 대상마다 변할 수 있고, 대상의 연령, 체중 및 일반적인 상황, 치료되는 질환의 심각성, 종양의 위치 및 크기, 사용되는 특정한 화합물, 투여 방식 등에 의존한다. 적절한 양은 본원에 개시된 일상적인 실험만을 이용하여 당해 분야의 숙련된 이들이 결정할 수 있다. 항체의 전형적인 단일 투여량은 0.1 내지 10,000㎍, 바람직하게는 1 내지 100㎍의 범위이다. 담체중의 전형적인 항체의 농도는 수송된 1㎖당 0.2 내지 2000ng의 범위이다. 관절에 주사되는 경우, 항체 및 담체의 부피는 관절에 따라 변하지만, 약 0.5 내지 10㎖, 바람직하게는 1 내지 5㎖가 인간의 무릎에 주사되고 약 0.1 내지 5㎖, 바람직하게는 1 내지 2㎖가 인간의 발목에 주사된다.
의도하는 투여 방식에 따라, 항체 또는 치료제는 바람직하게는 정확한 투여량을 단일 투여하기에 적합한 단위 투여 형태로, 예를 들어 정제, 좌제, 환제, 캡슐, 분말, 액체 또는 현탁액과 같은 고형, 반-고형 또는 액체 투여 형태의 형식인 약학 조성물에 포함될 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 조합된 선택된 기질의 효과량을 포함할 것이고, 추가하여, 다른 약제, 약학 시약, 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용가능한"은 함유되어 있는 약학 조성물의 임의의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하거나 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않으면서 선택된 기질과 함께 개체에게 투여될 수 있는, 생물학적으로나 달리 바람직하지 않는 물질을 의미한다.
비경구 주사에 적합한 조성물은 생리학적으로 허용가능한 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액, 및 멸균된 주사용 용액 또는 분산액중에 재구성되기 위한 멸균 분말을 포함할 수 있다. 적합한 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 물, 에탄올, 폴리올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세롤 등), 이의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용하거나, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지하거나, 계면활성제를 이용함으로써 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 방부제, 습윤제, 유화제 및 분배제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 미생물의 작용을 방지하는 것은 다양한 항생제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보증될 수 있다. 등장성 시약, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 주사가능한 약학 형태의 흡수를 연장시키는 것은 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약물을 사용함으로써 달성될 수 있다.
경구 투여용 고형 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이런 고형 투여 형태에서는, 활성 화합물을 하나 이상의 불활성의 통상적인 부형제(또는 담체), 예를 들어 나트륨 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트 또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토즈, 슈크로즈, 글루코즈, 만니톨 및 규산, (b) 결합제, 예를 들어 카복시메틸셀룰로즈, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 슈크로즈 및 아카시아 고무, (c) 보습제, 예를 들어 글리세롤, (d) 붕해제, 예를 들어 한천-한천, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 일부 복합 실리케이트 및 나트륨 카보네이트, (e) 용해 지연제, 예를 들어 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예를 들어 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, (d) 흡착제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트, 및 (i) 윤활제, 예를 들어 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 또는 이의 혼합물과 혼합한다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고형 조성물은 또한 고분자량 폴리에틸렌글리콜 등 뿐만 아니라 락토즈 또는 유당과 같은 부형제를 이용하는 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
고형 투여 형태, 예를 들어 정제, 당제, 캡슐, 환제 및 과립은 코팅 및 쉘(shell), 예를 들어 장내 코팅 및 당해 분야에 잘 공지된 다른 것들을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 불투명화제를 함유할 수 있고, 또한 지연되는 방식으로 내장관의 특정한 부분에서 활성 화합물 또는 화합물들을 방출하는 조성물의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 매립 조성물의 예는 중합성 물질 및 왁스이다. 활성 화합물은 또한 적절하게는 상기 언급된 부형제중 하나 이상을 이용하여 미세캡슐화된 형태일 수 있다.
경구 투여용 액체 투여 형태는 약학적으로 허용가능한 유화액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 화합물 이외에, 액체 투여 형태는 당해 분야에 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있고, 이의 예는 물 또는 다른 용매, 용해제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수배유, 올리브유, 피마자유 및 호마유, 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르 및 이들 물질의 혼합물 등이다.
이런 불활성 희석제 이외에도, 조성물은 또한 보조제, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 조미료 및 향료를 포함할 수 있다.
활성 화합물 이외에, 현탁액은 현탁제, 예를 들어 에톡실화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미세결정성 셀룰로즈, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 한천-한천 및 트라가칸트, 또는 이들 물질의 혼합물 등을 함유할 수 잇다.
직장 투여용 조성물은 바람직하게는 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체, 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌글리콜 또는 좌제용 왁스(이는 통상적인 온도에서는 고형이나, 체온에서는 액체이므로, 따라서, 직장 또는 질 강에서 용융되어 활성 화합물을 방출한다)와 본 발명의 화합물을 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제이다.
본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 투여 형태는 연고, 분말, 분무 및 흡입제를 포함한다. 상기 활성 화합물은 경우에 따라 멸균 상태하에서 생리학적으로 허용가능한 담체 및 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 범주에 포함되는 한, 안약 조성물, 안구 연고, 분말 및 용액을 고려할 수도 있다.
본원에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 아미드 및 전구약물"이라는 용어는 본 발명의 화합물의 카복실레이트 염, 아미노산 첨가염, 에스테르, 아미드 및 전구약물을 지칭하며, 이들은 유효한 의약법의 범주안에서 합리적인 유익 대비 위험비를 가져 과도한 유독성, 자극 및 알러지 반응 등 없이 환자의 조직에 접촉시키는 용도, 및 이들의 확장된 용도 뿐만 아니라 가능한 본 발명의 화합물을 쌍성이온 형태로 사용하기에 적당하다. 상기 "염"이라는 용어는 본 발명의 화합물의 비교적 무독성의, 무기산 및 유기산 첨가염을 지칭한다. 상기 염은 상기 화합물의 최종 분리 및 정제과정 도중 동일 반응계에서 제조되거나, 자유 염기 형태의 상기 정제된 화합물과 적당한 유기 또는 무기산과의 반응, 및 이로써 형성된 염의 분리를 개별적으로 수행함으로써 제조될 수 있다. 대표적인 염은 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 설페이트, 비설페이트, 니트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 발러레이트, 올리에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 라우레이트, 보레이트, 벤조에이트, 락테이트, 포스페이트, 토실레이트, 시트레이트, 말리에이트, 푸마레이트, 숙시네이트, 타트레이트, 나프틸레이트 메실레이트, 글루코헵토네이트, 락토비오네이트, 메탄 설포네이트 및 라우릴설포네이트 염 등을 포함한다. 이들은 알칼리 및 알칼리 토금속 계열의 양이온, 예를 들어 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 등 뿐만 아니라, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 에틸아민 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함할 수 있다(예를 들어, 본원의 참조문헌으로 인용된 바르게(S.M. Barge) 등의 문헌["Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977, 66:1-19]을 참조한다).
상기 "전구약물"이라는 용어는, 예를 들어 혈액내 가수분해에 의해 생체내에서 신속히 변형되어 상기 화합물의 모화합물을 생성하는 화합물을 지칭한다. 이에 대한 연구는 히구치(T. Higuchi) 및 스텔라(V. Stella)의 문헌["Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14 of the A.C.S Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 제공된다.
표적 세포는, 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스, 기니아 피그, 토끼, 염소, 암소, 말, 닭, 돼지, 명주원숭이 및 흰족제비를 포함하는 동물의 세포이다.
또한, 본 발명의 항체 또는 치료제는 약학적으로 허용가능한 용매, 예를 들어 물 및 에탄올 등으로 용매화되거나 용매화되지 않은 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 목적을 위해서는 상기 용매화된 형태와 용매화되지 않은 형태가 동등한 것으로 간주된다.
항체 분자는, 예를 들어 아미노 흡수 또는 아미노 친화 크로마토그래피, 고압 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피법 또는 이들의 조합법을 포함하는 공지된 기술에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 생물학적으로 활성인 항-TRAIL 수용체 항체 또는 인간화된 항-TRAIL 수용체 항체를 척추동맥으로 전달시키는 용도의 약학 생성물을 포함한다. 상기 약학 생성물은 약학적 효과량의 항-TRAIL 수용체 항체 또는 이들의 단편, 약학적으로 허용가능한 담체, 및 상기 담체 및 항체를 멸균 상태로 동봉한 용기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 약학적 효과량의 본 발명의 항체는 표적 세포와의 접촉에 의한 세포 증식을 억제하거나 세포사멸을 유도한다. DR4 또는 DR5 인식 항체 또는 DR4 또는 DR5 인식 인간화된 항체의 약학적 효과량은 개체에게 투여되어 바람직한 효과를 유도하기에 충분한 양이다. 본원에 사용된 용어 "약학적 효과량" 및 "치료량"은 동의어이다. DR4 또는 DR5 인식 항체의 약학적 효과량을 투여함으로써 수득되는 바람직한 효과는 하나 이상의 표적 세포의 사멸, 하나 이상의 표적 세포의 성장 억제, DR4 또는 DR5의 자극, DR5로의 결합 및 표적 세포에서의 증가된 NFκb 수준 또는 활성을 포함한다. 표적 세포는 DR5 또는 DR4를 발현하고, 예를 들어 비정상적으로 증식하는 세포, 및 유두종 및 사마귀; 유방암, 결장암, 간암, 백혈병, 폐암, 흑색종, 골수종, 골육종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 두부암 및 경부암, 갑상선암, 자궁암 및 뇌의 종양(예를 들어, 아스트로시토마스(astrocytomas))과 같은 종양, 활성화된 면역 세포(예를 들어, 활성화 림프구, 림프계 세포 및 골수 세포), 염증성 세포, 류마티스성 관절염 활막 세포 및 바이러스 감염된 세포이다. 생체내에서, 상기 표적 세포는, 예를 들어 악성 또는 양성 종양 및 류마티스성 관절염과 같이 비정상적인 세포증식 또는 조절이상을 포함하는 병리학적인 상태를 갖는 개체의 세포이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 표적 세포를 치료제와 접촉시킬 수도 있다.
치료제는 병리학적 상태를 개선시키는데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 치료제의 대표적인 예는 항암 화합물을 포함한다.
항암 화합물은 비정상적으로 증식하는 세포의 증식을 억제하거나 제거하는 데 효과적인 화합물 또는 조성물이다. 항암 화합물의 약학적 효과량은 개체에 투여되어 비정상적으로 증식하는 세포의 증식 억제 또는 제거를 유도하기에 충분한 양이다. 항암 화합물의 대표적인 예는: 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 항암 화합물 및 치료제의 추가예는 문헌[The Merck Manual of Dialgnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow 등., eds., 1987] 및 [Rahway, N. J. and Sladek 등, Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis 등. eds., Taylor and Francis, New York, N.Y.]에 기술되어 있다.
본 발명의 항체는 기타 치료법, 예를 들어 악성 치료에서의 화학요법 및 방사선 조사 치료법과 추가로 조합될 수 있으며, 치료 효능은 세포사멸-유도 화합물, 예를 들어 비스인돌릴말레이미드Ⅷ(BisVIII), 또는 SN-50 또는 LY294002 같은 다른 감응제에 의해 향상될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서 본 발명의 항체는 BisVIII 및 화학요법제(예: 아드리아마이신)와 조합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 비스테로이드성 항염증약(예: 술린닥 설파이드 또는 다른 COX-1 또는 COX-2 억제제) 및 화학요법제(예: 아드리아마이신)와 조합될 수 있다. 다른 질환, 예컨대 자가면역 및 염증성 질환의 치료에서, 치료법을 조합하여 사용할 수도 있다. 예컨대, 항체를, 화학요법제, 항염증약, DMARD, 메토트렉세이트, 비스인돌릴말레이미드VIII 또는 다른 감응제 등과 혼합하여 투여할 수 있다. 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 방사선요법도 다른 치료제와 조합될 수 있다. 당해 분야의 숙련자는 특정 염증성 질환 또는 자가면역 질환에 맞게 방사선요법의 형태를 적합하게 조정할 수 있을 것이다(예: 관절염의 치료에서 방사선 활막 절제술).
또한, 본 발명의 항체를 이용한 치료법은 본 발명의 다른 항체를 이용한 치료법과 조합될 수 있다. 예컨대, DR5에 대한 항체는 DR4에 대한 항체의 투여와 함께, 그 전에 또는 그 후에 필요한 대상에게 투여될 수 있다. 이러한 조합된 항체 치료법은 하나 이상의 치료제(예: 화학요법제, 독소루비신 및/또는 메토트렉세이트), 방사선요법, 또는 이들 둘다와 추가로 조합될 수 있다.
앞서 발표된 항 DR5 항체(24)와 비교하여, 본 발명의 예시적인 TRA-8 항체의 세포사멸-유도 활성은 매우 강하고, 생체 외부의 pg/㎖ 수치를 갖는 위르캣 세포의 세포사멸을 유도할 수 있으며, 앞서 보고된 가용성 TRAIL과 비교하여 보다 우월한 생체내 종양 억제 활성을 나타낸다. TRA-8의 일회분량을 정맥 투여하는 것은 고형 종양 및 조혈 종양 세포 모두의 증식을 억제하기에 충분한 반면, 가용성 TRAIL을 사용하여 생체내 종양 퇴화를 유도하기 위해서는 훨씬 많은 분량(10일 동안 매일 500ug)이 요구된다. 예시 항체 TRA-8은 비변형 섬유 모세포의 세포사멸을 유도하지 않으므로 본 발명의 항-TRAIL 수용체 항체는 가용성 TRAIL만큼 안전한 것으로 여겨진다. 비슷한 결과가 DR4 항체에서도 관찰되었다.
본 발명의 벡터는, 촉진제 또는 강화제와 같은 조절 요소에 작동가능하게 연결된 DR5 또는 DR4 항체의 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 이들이 통상적인 기능을 수행하도록 배열된 뉴클레오티드 서열의 배치를 의미한다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소는 상기 폴리펩티드의 전사, 복사 및/또는 번역을 지시할 수 있다. 당해 분야의 숙련자들은 단일 벡터가 항-DR5 또는 DR4 항체의 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 모두를 위한 코딩 서열을 임의적으로 포함함을 인식할 것이다. 한 실시양태에서 벡터는 인간화된 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린을 코딩한다.
본 발명에 따른 방법 및 결과를 예시하기 위해 하기 실시예를 기술한다. 상기 실시예들은 본 발명의 모든 양태들을 포함하는 것이 아니라 대표적인 방법 및 결과를 예시하고자 함이다. 상기 실시예들은 본 발명의 동등물 및 변형물을 배제시키고자 함이 아니며, 이는 당해 분야의 숙련자들에게 명백히 인식될 것이다.
실시예 1. DR5 항원의 제조
1.1 DR5 cDNA의 클로닝
인간 DR5 단백질을 코딩하는 DNA를 다음을 사용한 하기 RT-PCR 방법으로 클로닝시켰다:
a) 주형
HeLa 세포의 총 RNA를 TRIzol 시약(깁코(GIBCO) BRL)을 사용하여 추출하였다. 상기 PCR 반응을 위한 주형으로 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 제조)를 사용설명서에 따라 사용함으로써 수득된 cDNA를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
상기 PCR을 위한 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00001
달리 지정되지 않는 한, 하기 실시예의 모든 올리고뉴클레오티드는 라이프테크놀로지(Lifetechnology)에 의해 합성되었다. 모든 올리고뉴클레오티드를 증류수에 용해시킨 후 -20℃에서 보관하였다.
c) PCR 반응
PCR 반응 용액의 조성:
주형 cDNA, 총 33㎕ 반응물 중 5㎕;
프라이머 DR5p1, 10pmol;
프라이머 DR5p2, 10pmol;
10x의 농축된 PCR 완충제(키트에 제공됨), 10㎕;
dNTP(각각 2.5mM), 4㎕; 및
택(taq) 폴리머라제(프로메가), 5 유니트.
상기 용액에 총 부피가 100㎕가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였다. 달리 지정되지 않는 한, dNTP는 동일한 몰의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각각 2.5mM)의 혼합물이다.
상기 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 우선, 상기 용액에 대하여 94℃에서 30초, 52℃에서 1분, 72℃에서 3분 동안의 가열 주기를 40회 반복 수행한 후, 94℃에서 2분 동안 가열하였다. 상기 과정이 완결된 후, 반응 용액을 72℃에서 10 분 동안 가열하였다.
이로써 수득된, 확장된 DNA 단편을 0.25μg /㎖ 에티디움 브로마이드를 함유하는 1% 아카로우스 겔상에서 분리시켰다. 목적하는 DNA 단편을 함유한 것으로 결정된 띠를 면도날로 잘라내고 유전자 세척 키트(Gene Clean Kit)(BIO101)를 사용하여 상기 DNA를 회수하였다. 상기 DNA 단편을 TA 클로닝 키트(인비트로겐(InVitrogen), CA)를 사용하여 클로닝시켰다. 이를 다음과 같이 수행하였다.
상기 TA 클로닝 키트와 함께 제공된 pCR2.1 벡터 50ng과 함께, 상기 PCR 반응 용액으로부터 회수한 DNA 단편을, T4 DNA 리가제(1㎕) 4 유니트를 첨가한 10 X 리가제 반응 완충액(6mM 트리스-HCl(pH 7.5), 6mM 마그네슘 클로라이드, 5mM 나트륨 클로라이드, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스페르미딘 및 보빈 세럼 알부민 0.1㎎/㎖) 1㎕와 혼합시켰다. 멸균 탈이온수를 사용하여 상기 혼합물의 총 부피가 10㎕가 되도록 조정하고, 생성된 리가제 용액을 14℃에서 15시간 동안 배양하였다. 15시간 후, 상기 TA 클로닝 키트와 함게 제공된 상기 리가제 반응 용액중 2㎕를, 0.5M β-머캅토에탄올 2㎕를 첨가한 TA 클로닝 키트에 제공된 컴피턴트(competent) 대장균 균주 TOP10F' 50㎕에 첨가하고, 사용설명서에 따라 처리한 다음, 생성된 혼합물을 30분 동안 얼음으로 유지시키고, 30초 동안 42℃에서 유지시킨 다음, 다시 5분 동안 얼음에서 유지시켰다. 다음, 2% v/v 트립톤, 0.5% w/v 이스트 추출물, 0.05% w/v 나트륨 클로라이드, 2.5mM 칼륨 클로라이드, 1mM 마그네슘 클로라이드 및 20mM 글루코즈(이하, "SOC" 배지로서 지칭됨)를 함유하는 배지 500㎕를, 상기 배양액에 첨가하고, 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 진탕하면서 항온배양시켰다. 이어서, 상기 배양액을 L-브로쓰 한천 평판에 100μg/㎖를 함유하도록 칠하였다(1% v/v 트립톤, 0.5% w/v 이스트 추출물, 0.5% w/v 나트륨 클로라이드, 0.1% w/v 글루코즈 및 0.6% w/v 박토-아가(Difco)). 상기 평판상에서 암피실린 저항성을 갖는 콜로니를 선택하고 백금 전달 고리로 벗겨내고, 암피실린 100μg/㎖를 함유하는 37℃의 L-브로쓰 배지에서 하룻밤 동안 200r.p.m.의 속도로 진탕하면서 배양시켰다. 배양 후, 원심 분리를 이용하여 세포를 채취하고, 알칼리법을 사용하여 플라스미드 DNA를 제조하였다. 이로써 수득된 플라스미드로부터의 EcoRI-EcoRI DR5cDNA 단편을 pcDNA3 플라스미드(인비트로겐, CA)로 아클론화시켰다. pcDNA3내 상기 DR5 유전자의 전체 길이를 나열하여 원형 서열과 일치시켰다. 이로써 수득된 플라스미드를 플라스미드 pcDNA3-DR5로 지칭하였다.
1.2 DR5-IgG 발현 벡터의 구축
막횡단 영역이 결핍된 인간 DR5의 가용성 형태를 수득하기 위해, 발현 플라스미드 벡터를 제조한다. 이러한 벡터는 인간 IgGl Fc DNA(41)에 융합된 인간 DR5의 세포외 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하도록 고안된다. 막횡단 영역이 결핍된 인간 DR5를 코딩하는 DNA는 하기 PCR 반응에 따라 수득된다.
a) 주형
PCT 반응을 위한 주형은 pcDNA3-DR5를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00002
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본 실시예에서 모든 올리고뉴클레오티드는 라이프테크놀로지에 의해 합성된다. 모든 올리고뉴클레오티드는 희석된 물속에 용해시킨 후 -20℃에서 저장한다.
c) PCT 반응
PCT 반응을 수행하고 실시예 1.1(c)에 따라 단리된 DNA를 증폭시킨다.
이렇게 수득된 플라스미드를 플라스미드 pCR-ΔDR5로서 지칭한다. BamHI-EcoRI 단편 코딩된 인간 Fc 단편(pmFas-hIgGlFc로부터 회수됨)을 pcDNA3의 BamHI 및 EcoRI 멀티-클로닝 자리로 아클로닝한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pcDNAFc로서 지칭한다. 또한, 인간 가용성 DR5 영역을 코딩하는 BamHI-BamHI 단편(pCR-ΔDR5로부터 회수됨)을 pcDNAFc 플라스미드의 BamHI 자리로 아클로닝한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 플라스미드 pcDNAΔDR5-Fc로서 지칭한다. 인간 가용성 DR5-인간 IgG Fc 영역을 코딩하는 EcoRI 단편(pcDNAΔDR5-Fc 플라스미드로부터 회수됨)을 DNA 폴리머라제 Klenow 단편(깁코 BRL)을 사용하여 둔단(鈍端)시킨 후, 셔틀벡터 pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., 캐나다 소재)로 아클로닝하고, 이를 BamHI에 의해 절단한 후 분리한다. 이렇게 수득된 플라스미드를 pAdΔDR5-Fc로서 지칭한다.
1.3 인간 DR5-IgGl 융합 단백질의 발현 및 정제
QBI-293A 세포(ADENO-Quest 키트와 함께 제공됨)를 ADENO-Quest 키트(Quantum Biotechnologies, Inc., 캐나다 소재)를 지침서에 따라 사용하여 pAdΔDR5-Fc 및 QBI-바이러스성 DNA(ADENO-Quest 키트와 함께 제공됨)와 함께 동시 형질감염시킨다. 재조합 바이러스 플라크를 배양하고 DR5-IgG 융합 단백질의 발현을 위해 상층액의 ELISA 분석에 의해 선별한다. 양성 플라크를 QBI-293A 세포중 증폭시키고 바이러스 원료로서 -80℃에서 저장한다. QBI-293A 세포 50 디시(150mm)에 pAdΔDR5-Fc 재조합 바이러스를 10 m.o.i.(감염다중도; Multiplicity of Infection)로 형질감염시킨다. 48시간 동안 형질감염 후 배지를 수확한다.
DR5-IgG 유전자를 갖는 형질감염된 세포는 2일 동안 5% v/v CO2의 대기하에서 10% v/v FCS를 함유하는 DMEM(깁코) 배지 500㎖중 37℃에서 항온배양에 의해 1 x 106 세포/㎖의 세포밀도까지 성장한다. 이어서 배지를 원심분리하고(1,000rpm, 5분) 상층액을 수거한다. 상층액으로부터 DR5-IgG를 하기 조건하에서 ProteinA-Sepharose CL-4B 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제한다.
칼럼: ProteinA-Sepharose CL-4B 칼럼(칼럼 크기 2㎖; 파마시아);
용리 완충액: 0.1M 글리신(pH 2.4), 0.15M NaCl;
중화 완충액: 1M Tris-HCl(pH 8.5).
상층액 모두를 상기 칼럼에 적용한 후, PBS 20㎖로 3회 세척한 후 용리 완충액 1㎖를 10회 첨가한다. 각각의 용리된 분획(1㎖)의 광학 밀도를 측정한다. 제 2 내지 제 5 분획을 수거하고(OD280≥0.1) 중화 완충액 100㎕를 첨가한 후, 용출물을 투석 튜빙에 별도로 놓고 용출물을 4℃에서 PBS(pH 7.5) 1ℓ에 대해 투석한다. 투석 완충액을 2회 교환한다.
이어서 용출물을 ELISA에 의한 DR5-IgG 유전자 생성물의 발현에 대해 평가한다. 우선, 각 단편 100㎕를 96-웰 마이크로평판(코스타(Costar))의 웰 안으로 별도로 두고 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 그 후, 웰에서 용액을 제거하고 평판을 0.1% v/v 트윈 20을 함유하는 PBS(이하, "PBS-트윈"으로 칭함) 100㎕/웰로 3회 세척한다. 세척 후, 2% w/v 소의 혈청 알부민(이하 "BSA"라 칭함)을 함유하는 PBS를 100㎕/웰의 양으로 첨가하고 평판을 1시간 동안 37℃에서 항온배양한다. 그 후, 웰을 PBS-트윈 100㎕/웰로 3회 추가로 세척한 후 PBS-트윈으로 1000배 희석된 항-인간 IgGI 단일클론성 항체의 용액 100㎕/웰을 각 웰에 첨가하고, 평판을 37℃에서 1시간 동안 한번 더 항온배양하였다. 이어서 웰을 PBS-트윈 100 ㎕/웰로 3회 세척한다. 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(이하, "TMB"라 칭함) 액체 기질 시스템(Sigma)을 100㎕/웰의 양으로 첨가하고 평판을 실온에서 5분 동안 정치하고 반응을 0.2N H2SO4 100㎕/웰을 첨가하여 종결시켰다. 각 웰의 흡광도는 450㎚에서 판독되었으며 대조 판독으로서 650㎚에서의 흡광도를 사용하여 결합 항체의 농도를 측정하였다. 흡광도를 마이크로평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정한다. DR5-IgGl의 생성은 이러한 ELISA 방법을 사용하여 확인된다. 발현된 DR5-IgGl 융합 단백질의 분자량은 웨스턴 블로팅 분석(western blotting analysis)을 사용하여 측정한다(이때, 항-인간 IgG1 mAb(Sigma)가 겔상의 항체를 검출하기 위해 사용됨). 발현된 DR5-IgGl 융합 단백질의 분자량은 약 50kDa이었다. 달성된 순도는 SDS-PAGE상의 분석 및 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색에 의해 단백질을 검출하는 것에 의해 평가했을 때 90% 이상이었다.
실시예 2: 인간 DR5에 대한 단일클론성 항체의 발생
2.1 접종
6 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스(Jackson Laboratory, 미국 메인주 바 하버 소재)에 친화-정제된 인간 DR5/hIgGl 융합 단백질을 접종하였다. 초기 푸트-패드(foot-pad) 접종동안, 융합 단백질(50㎍)을 프로인트(Freund) 주형 보조제(Difco, 미국 미시간주 디트로이트 소재)중에 유화시킨다. 이어서 마우스를 하루 걸러서 보조제 없이 투여된 융합 단백질 50㎍의 4회 주입으로 추가 접종하였다. 마지막 주입 후 3일째, 국소 림프절로부터의 림프구를 NS-1 골수종 세포와 융합시키고 하이브리도마를 10% 소태아혈청이 보충된 F104 배지중에 배양한다. 양성 하이브리도마는 ELISA에 의해 선택되며, 이때 평판을 1㎍/㎖ DR5/hIgGl 또는 대조군으로서 동량의 Fas/hIgGl로 코팅한다. 하이브리도마의 동종형을 마우스 Ig 동종형-특이성 염소 항체 패널(미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology))을 사용하여 ELISA에 의해 측정한다. 단일클론닝 항체는 부동화 항-마우스 IgG1 또는 단백질 G(Sigma)를 사용하여 친화 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
2.2 세포 융합
추가 접종후 3일째, 국소 림프절을 마우스로부터 제거하고, 페니실린 50 단위/㎖, 스트렙토마이신 50㎍/㎖, 및 L-글루탐산 300㎍/㎖를 함유하는 혈청-비함유 RPMI 1640 배지(깁코 BRL) 10㎖ 안에 넣고 약수저를 사용하여 기관을 메쉬(Cell Strainer ; Falcon)를 통과시켜 분쇄하였다. 생성된 세포 현탁액을 원심분리하여 국소 림프절 세포를 작은 알갱이로 만든 다음 혈청-비함유 RPMI 배지로 2회 세척하였다. 이어서, 세척된 세포를 혈청-비함유 RPMI 배지중에 재현탁시키고 계수하였다.
그러는 동안, 골수종 NS1세포(American Type Culture Collection TIB-18)는 5% v/v CO2하에 37℃에서 10% v/v FCS(깁코 BRL)를 함유하는 ASF104 배지(Ajinomoto, K.K.)("혈청을 함유하는 ASF 배지")중 1x108 세포/㎖를 초과하지 않는 세포 밀도까지 성장하였고, 이들을 또한 부수고 세척하고, 재현탁시키고, 계수하였다.
3x107 세포수를 함유하도록 계산된 NS1 세포 현탁액의 양을 3x108 세포를 함유하도록 계산된 비장 세포 현탁액의 양과 혼합한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고 상층액을 따라 부었다. 세포 융합의 다음 단계를 수행하면서 매번 펠렛을 함유하는 플라스틱 시험관을 온수 비이커중에서 37℃로 유지하였다.
50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 1500(베링거 만하임(Boehringer Manheim)) 1㎖를 서서히 상기 시험관에 가하는 내내, 펠렛을 피펫 끝을 사용하여 교반한다. 후속적으로, 37℃까지 미리 데운 혈청-비함유 RPMI 배지 1㎖를 2회로 서서히 가한 후 혈청-비함유 RPMI 배지 7㎖를 추가로 첨가한다. 생성된 혼합물을 원심분리하고, 상층액을 따라내고 10% v/v FCS를 함유하는 HAT 배지 10㎖를 첨가하면서 피펫 끝으로 부드럽게 교반한다. 10% v/v FCS를 함유하는 HAT 배지를 추가로 20㎖ 첨가하고, 현탁액을 100㎕/웰에서 96-웰 세포 배양 마이크로평판 안으로 분배하고 5% v/v CO2 대기하에서 37℃에서 항온배양한다. 7 또는 8일 후, 새로운 HAT 배지 100㎕/웰을 사용하여 황색을 나타내는 임의의 웰중에 배지를 교체한다. 이들 웰로부터의 융합 세포를 이후 설명하는 한계 희석에 의해 클로닝한다.
2.3 한계 희석에 의한 클로닝
4 내지 10주령 암컷 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)로부터 흉선을 제거하고 상기한 바와 같이 메쉬(Cell Strainer ; Falcon)상에서 부수고, 분쇄된 세포를 10% v/v FCS를 함유하는 HT 배지로 2회 세척한다. 하나의 마우스로부터의 흉선 세포에 해당하는 흉선 세포의 양을 10% v/v FCS를 함유하는 HT 배지 30㎖중에 현탁하여 피더 세포 현탁액을 생성한다. 실시예 2.2에서 상기 수득한 융합 세포 제제를 이러한 피더 세포 현탁액으로 10 내지 100배 희석하고 피더 세포 현탁액으로 일련으로 추가로 희석하여 5, 1 및 0.5 세포/㎖의 융합 세포 밀도를 갖는 현탁액을 제조한다. 이렇게 제조한 샘플을 100㎕/웰에서 96-웰 세포 배양 마이크로평판의 웰 안으로 분배하고 5% v/v CO2 하에 37℃에서 5일 동안 항온배양한다.
2.4 선별
성장 하이브리도마로부터의 배양 상층액을 1㎍/㎖ DR5/hIgGl 또는 대조군으로서 동량의 Fas/hIgGl(41)로 코팅된 평판을 사용하여 ELISA에 의해 선별한다. 결합 항체를 기질로서 TMB(Sigma, 미국 미시간주 세이트 루이스 소재)와 함께 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-마우스 면역 글로블린(미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀로지)을 사용하여 검출한다. 1㎍/㎖의 농도에서 정제된 DR5-IgG1 또는 동량의 Fas-hIgGl을 96-웰 ELISA/RIA 스트립 평판(미국 뉴욕 소재 코스타) 웰에 도입한다. 상기 평판을 하룻밤 동안 4℃에서 정치하여 단백질이 웰 표면에 흡착되도록 한다. 그 후, 웰중 용액을 따라내고 각 웰을 PBS-트윈으로 3회 세척한다. 이어서, 1%(w/v) 소의 혈청 알부민(A3803 ; 시그마 케미칼즈 캄파니(Sigma Chemicals Co.))을 함유하는 PBS 100㎕을 각 웰에 첨가하고 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온배양한다. 이어서 웰을 PBS-트윈으로 3회 추가로 세척한 후 성장 하이브리도마로부터 각 배양 상층액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 이어서 평판을 37℃에서 1시간 동안 항온배양하고 웰을 다시 PBS-트윈으로 4회 세척한다. 세척 후, PBS로 1000배 희석된, 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지가 붙여진 염소 항-마우스 면역글로불린 항체(미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀로지) 50㎕을 웰당 첨가하고 평판을 다시 37℃에서 1시간 동안 항온배양한 후, 웰을 PBS-트윈으로 4회 다시 세척하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸-벤지딘(TMB) 액체 기질 시스템(Sigma)을 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하고 평판을 실온에서 5분 동안 정치하고 반응을 0.2N H2S04 100㎕/웰을 첨가하여 종결시켰다. 450㎚(대조군은 650㎚)에서 각 웰의 흡광도를 마이크로평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 측정하고 융합 세포를 융합 세포 상층액에 전혀 첨가되지 않은 것(OD 값; 약 0.03)보다 확실히 높은 흡광도를 갖는(450㎚-650㎚, OD 값; > 0.5) 샘플로부터 선택한다. 또한, 성장 하이브리도마로부터의 배양 상층액을 위르캣 세포를 사용하여 세포사멸-유도 활성을 측정하여 기능적으로 선별한다. 위르캣 세포를 함유하는 RPMI 배지(웰당 1000 세포) 50㎕ 및 5 μM 비스인돌릴말레이미드 VIII(BisVIII, Alexis, San Diego, CA)를 성장 하이브리도마로부터 배양 상층액 50㎕의 존재하에 96 웰 평판중에 첨가한다. 세포를 습도조절된 배양기 안에서 37℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 세포사멸은 제조업체(페커드 인스트루먼츠(Packard Instruments))에 의해 지시된 바와 같이 ATPLite 키트를 사용하여 세포 생존율에 의해 측정하고 샘플을 톱카운터(TopCounter, 페커드 인스트루먼츠)를 사용하여 계수한다.
2.5 TRAIL 및 TRA-8의 수용체에 대한 ELISA 결합
ELISA 평판을 DR4-Ig 또는 DR5-Ig 융합 단백질 2㎍/㎖로 하룻밤 동안 코팅한다. 3% BSA로 차단한 후, 가용성 TRAIL-FLAG 또는 TRA-8을 지시된 농도로 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 항온배양한다. TRAIL 또는 TRA-8의 결합은 각각 HRP-접합된 항-플래그 항체(Alexis) 또는 HRP-접합된 항-뮤린(anti-murine) IgGl (서던 바이오테크놀로지)로 검출한다. 반응은 TMB 기질 완충제에 의해 전개되고 벤치마크 마이크로평판 리더(Benchmark Microplate Reader; 바이오라드)에 의해 측정된다. Kd 값은 그래프페패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 샌디애고 소재의 프래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))를 사용하여 비선형 회귀법의 한자리 결합 모델에 의해 측정한다. 경쟁 ELISA에 대해, TRAIL-FLAG 100ng/㎖를 첨가하고 다양한 농도의 TRA-8의 존재하에 항온배양한다. TRAIL의 결합은 위에서와 같이 측정한다.
2.6 클로닝
상기 실시예 2.3 및 2.4에서 설명한 단계들을 2.4에서 선택된 세포에 대해 5회 반복하여, 각각이 DR5-IgG을 결합하되 Fas-IgG는 결합하지 않는 단일 항체를 생성하는 몇가지 하이브리도마 클론의 선택을 가능하게 한다. 이러한 선택절차의 결과로서, TRA-8로서 지칭되고 DR5-IgG에 대해 결합하지만 Fas-IgG는 결합하지 않는 항체를 생성하는 마우스-마우스 하이브리도마가 수득된다. 이러한 하이브리도마, 즉 TRA-8은 2000년 3월 1일자에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되었고 수탁번호 No. PTA-1428을 부여받았다.
마우스-마우스 하이브리도마 TRA-8(이하 간략히 "TRA-8"로서 지칭됨)에 의해 생성된 항체의 아류는 단일클론성 항체 동종형 키트(Pierce)로 시험 후 IgGl, κ로서 지칭된다.
면역원으로서 인간 DR5-IgGl 융합 단백질을 사용하여, 7개의 하이브리도마 클론을 초기 ELISA 선별에 의해 수득하고, 이들 모두는 DR5-IgG에 대해서는 강하게 양성이지만 Fas-IgG 융합 단백질에 대해서는 그렇지 않았으며, 이는 수득된 하이브리도마가 DR5의 세포외 부분은 인식하지만 IgG1의 Fc 부분은 인식하지 않는(데이터는 도시되지 않음) 항체를 생성함을 나타낸다.
2.7 웨스턴 블롯 분석
정상적인 인간과 암조직 균질액의 웨스턴 블롯 분석을 위한 필터는 제노 테크놀로지(Geno Technology; St Louis, MO)로부터 구입하였다. 각각의 레인에 항-β-악틴 항체에 의해 측정한 동량의 단백질을 적재한다. 블롯을 하룻밤 동안 1㎍/㎖ TRA-8로 엄밀히 조사하고, 실온에서 1시간 동안 HRP-접합된 염소 항-마우스 IgGl(서던 바이오테크놀로지)로 조사하고, 화학발광에 의해 전개시켰다.
2.8 동일 반응계 면역조직화학
인간 조직을 티슈 프로큐어먼트 센터(Tissue Procurement Center of UAB)로부터 수득한다. 동결된 섹션을 70% 에탄올중에 고정하고 PBS중 10% 말 혈청으로 차단한 후 실온에서 60분 동안 친화-정제된 TRA-8의 10㎍/㎖으로 항온배양하였다. 색채 기질로서 디아미노벤지딘을 갖는 항-마우스 IgG ABC 키트(Vector, Burlingame, CA)를 사용하여 반응성을 가시화하였다.
2.9 카스파제 활성의 분석
위르캣 세포(l x l06/㎖)를 500ng/㎖ TRA-8과 함께 항온배양한다. 세포 용해질중 분취액(단백질 30㎍)을 15% SDS-PAGE상에서 분리하고 나일론 막상으로 블롯팅하고, 블롯을 항-카스파제 8, 9 및 3 항체(BD Pharmingen, San Diego, CA)로 엄밀히 조사하고, 이어서 HRP-접합된 제 2 항체로 조사하고 절단된 생성물을 화학발광 가시화하였다. 카스파제 억제제 세트는 R&D 시스템(R&D Systems; Minneapolis, MN)으로부터 구입한다. 각각의 카스파제 억제제를 지시된 농도에서 배양액에 첨가한다.
실시예 3. TRA-8 단일클론성 항체의 정제
마우스-마우스 하이브리도마(hybridoma), TRA-8을, 5일 동안 5% v/v CO2하에 37℃에서, 10% v/v FCS를 함유하는 ASF 배지 500㎖중에서 항온배양시킴으로써 1x106 세포/㎖의 세포 밀도로 성장시켰다. 그 다음, 배양액을 (1,000rpm, 5분 동안) 원심분리하고, 상층액을 수거하였다. 상기 상층액으로부터의 TRA-8을 하기 조건하에서 단백질G-세파로제 CL-4B 친화성 크로마토그래피(파마시아)를 사용하여 정제하였다.
칼럼: 단백질G-세파로제 CL-4B 칼럼 (칼럼 크기 2㎖; 파마시아)
용출 완충액: 0.1 M 글리신 (pH 2.4), 0.15 M NaCl
중화 완충액: 1M Tris-HCl (pH 8. 5).
모든 상층액을 칼럼에 적용하고, PBS 20㎖를 3회 세척한 후, 용출 완충액을 1㎖의 부피로 10회 첨가하였다. 용출된 분획물(1㎖)의 광학 밀도를 측정하였다. 제 2 내지 제 5 분획물(> OD280 = 0.1)을 개별적으로 수거하였다.
중화 완충액 100㎕를 첨가한 후, 용출액을 개별적으로 투석하고, 용출액을 4℃에서 PBS(pH 7.5) 1ℓ에 대해 투석하였다. 상기 투석 완충액은 2번 변하였다. 전술된 기술을 사용하여 제조된 상기 인간 DR5-IgG 융합 단백질을 사용하여 ELISA에 의한 상기 샘플의 항-DR5 항체 활성을 검정하였다.
실시예 4. DR4 항원, DR4-IgG 발현 벡터 및 항-DR4 단일클론성 항체의 제조
실시예 1에서 상세하게 기술된 것 대신 DR4 주형 cDNA 및 프라이머를 사용하여 실시예 1 내지 3의 절차를 반복 실시하여 DR4 항원을 수득하며, 이를 실시예 1.2 내지 3에 따라 DR4에 대해 특이적인 단일클론성 항체를 수득하였다.
실시예 5. DcR1 및 DcR2에 대한 단일클론성 항체
유인(decoy) 수용체 DcR1 및 DcR2에 대한 단일클론성 항체는, 실시예 1에 따라 그에 상응하는 cDNA 및 프라이머를 치환시켜 각각의 항원을 생성시킴으로써 증가되었다. 면역 글로불린 G와의 DcR1 또는 DcR2-융합물 및 생성된 정제 단일클론 성 항체를 위한 발현 벡터를 실시예 2 및 3에 따라 제조하였다.
실시예 6. 단일클론성 항체의 특이성
TNFR 부류의 TRAIL 및 기타 단백질에 대한 모든 수용체들이 상당한 상동성을 가짐에 따라, DR5에 대한 예시적인 항체 TRA-8의 특이성을, 2개의 상이한 인간 DR5-IgG 융합 단백질 및 가용성 재조합 형태의 기타 관련 단백질을 사용하는 웨스턴 블로팅 분석에 의해 측정하였다. 제 1 DR5-Ig 융합 단백질은 인간 IgG1의 불변 영역을 코딩하는 DR5 및 cDNA의 세포외 부분의 잔기 1 내지 180으로부터 cDNA를 융합시킴으로써 구축되었다. 융합된 cDNA를 재조합 아데노바이러스 벡터로 클로닝하였다(문헌 "Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canada"). 50kDa의 상대 분자량을 갖는 발현된 DR5/hIgG1 융합 단백질은, 항-인간 IgG 친화성 칼럼(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma))을 사용하여 정제하였다. 특이성에 관한 웨스턴 블로팅 분석을 위해, 제 2 재조합 인간 DR5/IgG1 융합 단백질(aa. 52 내지 212) 뿐만 아니라 TRAIL-R1, R3 및 R4 융합 단백질을 알렉시스(Alexis)로부터 구입하였다. 가용성 형태의 인간 Fas 및 TNFR1은 미국 캘리포니아주 싸우전즈 오크 소재의 암겐 인코포레이티드(Amgen, Inc.)의 칼 박사(Dr. Carl Edwards)에게서 친절하게 공급받았다. 사용되는 가용성 재조합 인간 DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4, 및 Fas 분자는 인간 IgG1 융합 단백질이었다. 각각의 단백질 0.5㎍을 10%의 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로즈 막 위에 블로팅시켰다. 상기 블로팅 생성물을 1시간 동안 실온에서 PBS중에 5% 건조 우유로 차단시키고, 하룻밤 동안 4℃에서 정제된 단일클론성 항-DR5 항체(클론: TRA-8) 1㎍/㎖ 또는 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG 0.1㎍/㎖로 탐침하였다. 호르세라디쉬-퍼옥시다제(Horseradish-peroxidase, HRP)-접합된 염소 항-마우스 IgG를, 결합된 TRA-8을 검출하기 위한 제 2 항체로서 사용하였다. 블로팅 생성물을 화학발광(chemiluminescence)에 의해 전개시켰다.
전체 길이의 DR5 또는 DR4를 함유하는 pcDNA3 벡터(캘리포니아 팔로 알토 소재의 클론테크(Clontech)), 또는 비어있는(empty) 벡터로 형질감염된 Cos-7 세포가 유량 세포분석을 위해 사용되었다. 전체 길이의 cDNA 코딩 인간 TRAIL 또는 뮤린 Fas 리간드를 테트라사이클린-제어가능한 프로모터(클린테크)의 pTRE 벡터 다운스트림으로 클로닝시켰다. pTRE-hTRAIL 또는 pTRE-mFasL의 XhoI-HindIII 단편을 아데노바이러스 셔틀(shuttle) 벡터 pAdBN(퀀툼 바이오테크놀로지스 인코포레이티드(Quantum Biotechnologies, Inc.))으로 추가로 클로닝시켰다. 293개의 숙주 세포를 선형의 pAd-TRE-hTRAIL 또는 pAd-TRE-mFasL 및 아데노바이러스의 큰 단편 DNA로 동시에 형질감염시켰다. 재조합 바이러스 플라크로부터의 기능성 인간 TRAIL 또는 뮤린 Fas 리간드를, 표적으로서 위르캣을 사용하는 51Cr-릴리이즈 검정을 사용하여 선별하였다.
TRA-8은 도 1a에서 도시된 바와 같이 면역을 위해 사용되는 DR5-IgG 융합 단백질(약 50kDa)과 강하게 반응하고(DR5, #1), 도 1a에서 도시된 바와 같이 제 2 DR5-IgG 융합 단백질(약 60kDa)과는 약하게 반응하였다(DR5, #2). DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) 또는 TNFRI와 TRA-8의 유의한 결함은 없었다. 이들 결과에서는, TRA-8이 DR5에 대해 특이적이지만 기타 부류의 일원과는 공유하지 않는 에피토프인 것으로 나타났다.
TRA-8은 TNF 수용체 상위 부류(superfamily)의 일원, 예컨대 Fas (CD95) 및 TNF 수용체 I과 반응하지 않거나, 또는 TRA-8은 450㎚ 및 650㎚의 광학 흡수율에 의해 제시되는 바와 같이 DR5의 뮤린 동족체와 교차-반응하지 않으며, 여기서 저부 패널은 1 내지 7이다(도 1a, 저부 패널의 칼럼 8). 가용성 TRAIL 및 TRA-8은 동등하게 결합하여 DR5를 부동화시켰다(도 1b, 좌측 패널). 반면, TRAIL은 DR4에 결합하지만, TRA-8은 DR4에 대한 어떠한 결합 활성도 나타내지 않았다(도 1b, 중간 패널). DR5에 대한 TRAIL 및 TRA-8의 결합에 관한 Kd 값을 각각 59nM 및 3nM에서 추정하였다. 중요하게는, TRA-8은 ELISA에서 제시된 바와 같이 DR4가 아닌 DR5에 결합하기 위해 TRAIL과 효율적으로 경쟁하였다(도 1b, 우측 패널). 이들 결과는 인간 DR5에 대한 TRA-8의 특이성을 입증하였다.
TRA-8은 DR5의 세포 표면 발현을 검출할 수 있으며, 유량 세포분석에서는 DR4 또는 비어있는 벡터로 형질감염된 Cos-7 세포가 아닌 전체 길이의 인간 DR5로 형질감염된 Cos-7 세포의 세포 표면에 대해 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 1c). 유사하게, TRA-8을 사용하는 동일반응계 면역조직화학(immunohistochemistry)에서는 대조군 벡터로 형질감염된 Cos-7 세포와의 반응성이 아닌 전체 길이의 DR5 DNA로 형질감염된 Cos-7 세포와의 반응성을 입증하였다(도 1d). TRA-8은 미형질감염된 Cos-7 세포의 세포사멸을 유도하지 않고, 인간 DR5를 코딩하는 한쌍의 프라이머를 사용하는 Cos-7 세포로부터의 RNA의 RT-PCR에서는, 어떠한 특이적 PCR 생성물도 존재하지 않는 것으로 나타났다. 표적으로서 인간 위르캣 세포를 사용하는 추가의 기능성 분석에서는, 가교결합의 부재하에서, TRA-8가 세포사멸을 강하게 유도하는 것으로 나타나며, 이는 ATPLite, MTT 및 PI 배제(exclusion)를 포함하는 3가지 상이한 세포 생존율에 대한 검정에 의해 입증되었다(도 1e). ATPLite 검정에 의해 제시된 바와 같이 위르캣 세포의 50% 이상이 나노그램 수준의 TRA-8에 의해 사멸되었다. DR4-Ig 융합 단백질이 아닌 DR5-Ig 융합 단백질에 의해 차단되는 바와 같이, TRA-8의 사멸 활성은 DR5에 대해 특이적이었다(데이터는 제시되지 않음). 카스파제 8, 9, 및 3의 분할은 위르캣 세포의 TRA-8 처리 후 30분 정도의 웨스턴 블로팅 분석에 의해 검출될 수 있었고(도 1f), 위르캣 세포의 세포사멸은 일반적인 카스파제 억제제(Z-VAD)에 의해 완전히 저해되었다(도 1g). 카스파제 8, 3, 9, 및 10에 대한 개별 카스파제 억제제는 세포사멸을 일부 저해시켰으며, 이는 또한 TRA-8-중재된 세포사멸이 주로 카스파제-의존성 세포사멸 기전을 통해서 이루어졌음을 나타낸다.
실시예 7. 세포 표면 DR5의 발현의 유량 세포분석: 정상 세포상에서가 아닌 다수의 종양 세포상에서의 주요 사멸 수용체
세포 표면에서 발현되는 DR5에 결합하려는 TRA-8의 능력, 및 이 반응의 특이성은, 전체 길이의 인간 DR5 또는 DR4 cDNA를 함유하는 발현 벡터, 또는 대조군으로서의 비어있는 벡터로 형질감염된 Cos-7(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 번호 CRL-1651) 세포를 사용하여 검정하였다. 피코에리트린(Phycoerythrin)(PE)-접합된 항-마우스 IgG1(파르민겐(Pharmingen))을 제 2 항체로서 사용하여 상기 결합된 TRA-8을 검출하였다. 하기 조건하에서 유량 세포분석(FACSVantage)를 사용하여 1x104 세포의 형광성을 측정하였다:
여기 파장: 488㎚
검출 파장: 600㎚
유량 세포분석에서는, 도 1c의 ■(solid) 막대 그래프에서 도시된 바와 같이 TRA-8이 DR5 벡터로 형질감염된 Cos-7 세포의 약 30%로 염색되어 있는 것으로 나타났다. 상기 백분율은 녹색 형광의 단백질(GFP)을 사용하는 형질감염의 분석에 의해 측정된 바와 같은 형질감염 효능에 해당한다(데이터가 제시되지 않음). TRA-8은 DR4 (□(open) 막대 그래프) 또는 대조 벡터 (점선 막대 그래프)로 형질감염된 세포를 크게 염색시키지 않았으며, 이는 TRA-8이 세포 표면 DR5에 대해 특이적임을 나타냈다.
종양 세포에서의 DR5 발현은 mRNA 수준에서 광범위하게 연구되어 왔을지라도(문헌 참조), DR5의 표면 발현은 상세히 기록되지 않았다. 따라서, 단일클론성 항-DR5 항체를 이용할 수 있음으로 인해 본 발명자들은 DR5의 표면 수준을 조사하여 상기 발현이 TRAIL-중재된 세포사멸로의 세포의 감응성과 연관이 있음을 알게 되었다. 하기 패널의 세포(1x106)를 30분 동안 실온에서 친화성 정제된 TRA-8 10㎍/㎖와 함께 배양한 후, 추가의 30분 동안 PE-접합된 항-마우스 IgG1(파르미노겐)로 염색시켰다. 10,000개의 생세포를 하기 조건하에서 FACSvantage 유량 세포분석을 사용하여 분석하였다:
여기 파장 : 488㎚
검출 파장 : 600㎚
시험되는 5개의 조혈 세포주는 위르캣, CEM-6, Molt-4, H-9 및 U937 세포이었다. DR5 발현은 위르캣, CEM-6, H-9, 및 U937 세포의 표면상에서 검출가능하지만, 도 2a 및 2a'에서 도시된 바와 같이 Molt-4 세포상에서는 거의 검출할 수 없었다. 높은 수준의 DR5 RNA 발현이 이전의 (43)에서 기술되어 있을지라도, FACs 분석에서는, 이들 세포가 높은 수준의 표면 DR5를 발현하지 않는 것으로 나타났다. 이들 결과는 DR5의 세포 표면 발현이 DR5의 전사 발현과 관련이 없음을 나타내며, 이는 이러한 수용체에 있어 뜻밖의 것은 아니었다. DR5의 세포 표면 발현의 수준은 세포 계통-특이적인데, 이는 대부분의 조혈 기원 세포가 낮은 수준으로 발현하는 반면, 대부분의 교종 및 전립선 세포가 높은 수준의 DR5를 발현하기 때문이었다.
상이한 유형의 인간 종양 세포의 패널 사이에서의 DR5의 세포 표면 발현 뿐만 아니라 TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포사멸 모두에 대한 이들 세포의 감응성을 TRA-8 단일클론성 항체를 사용하여 검사함으로써 TRAIL-중재된 세포사멸의 역할을 측정하였다. 원발성 말초혈 T 세포는 세포 표면 DR5를 상당 수준으로 발현하지 않았으며, TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포사멸 모두에 대해 저항적이었다(도 2a, 2a' 및 3a). 시험되는 모든 5개의 인간 T-백혈병 세포주는 검출가능하지만 비교적 낮은 수준의 세포 표면 DR5를 발현하고, 이들중 2개(위르캣 및 CEM-6)는 TRAIL-중재된 및 TRA-8-중재된 세포사멸에 대해 매우 감응성이며, 이는 DR5가 단독적으로 이들 세포의 세포사멸을 유도하는데 충분하다는 것을 나타냈다. Molt-4 및 U937 세포는 TRAIL-중재된 세포사멸에 대해 일부 감응성이지만, TRA-8-중재된 세포사멸에 대해서는 비교적 저항적인데, 이는 기타 TRAIL 수용체가 세포사멸 신호의 변환과 관련되어 있음을 암시하는 것이었다. H-9 세포는 TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포사멸에 대해 저항적이며, 이는 세포내 항-세포사멸 경로에 의해 매개되는 차단을 암시한다.
세포의 패널은 인간 악성 교종 세포주, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 및 정상 인간 성상세포를 포함하며, 이는 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학(University of Alabama)의 신경외과 교실(Neurosurgery Department)의 얀세이 박사(Dr. Yancey Gillespie)에게서 공급받았다. 인간 전립선암 세포주, Du154, PC3 및 LnCap는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터의 세포주를 갖고 있는 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학의 병리학 교실(Pathology Department)의 윌리엄 박사(Dr. William Grizzle)에게서 공급받았다. 인간 백혈병 T 세포주, B-세포 림프종, HepG2 위르캣(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 TIB-152) 및 CCRF-CEM CEM-6(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 CCL-119); 단핵구 세포주, U937(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 CRL-2367)을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 구입하였다. 상기 모든 세포주를 10% FCS가 보충된 RPMI 1640중에서 배양하였다. 인간 성상세포종 세포주, 1321N1은 버밍엄 소재의 알라바마 종합대학의 정신의학 교실(Psychiatry Department)의 리차드 박사(Dr. Richard Jope)에게서 공급받았으며, 5% FCS가 보충된 DMEM중에서 배양하였다.
알렉시스 코포레이션(Alexis Corporation)(캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 구입한 가용성 재조합 인간 TRAIL은, N-말단에서 FLAG-태그에 융합된 인간 TRAIL의 세포외 영역(aa 잔기 95 내지 281) 및 8개 아미노산 링커 펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. 이전에 보고된 His-태그된 TRAIL과 달리, 이런 TRAIL의 제조물은 단독으로 위르캣 세포에 대한 반응으로 강한 세포사멸을 유도하지 않으며, 세포사멸을 강화하기 위해 가교결합제로서 항-FLAG 항체를 필요로 한다. 상기 항-FLAG 항체도 또한 알렉시스로부터 구입하였다.
시험되는 모든 10개의 인간 악성 교종 세포는 세포 표면에서 검출가능한 수준의 DR5을 발현시켰다. 대부분은 도 2b에서 도시된 바와 같이 중간 수준 내지 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. 3개의 세포주, D-54MG, U373MG 및 CH-235MG는 높은 수준의 DR5를 발현시키는 반면, 6개의 세포주, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 및 1321N1은 중간 수준의 DR5를 발현시켰다. 단지 하나의 세포주, H-465만이 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다. 모든 3개의 전립선암 세포주는 도 2c에서 도시된 바와 같이 높은 수준의 DR5를 발현시켰다.
정상 원발성 T 세포와 같이, 원발성 B 세포는 상당 수준의 DR5를 발현시키지 않고, TRAIL 또는 TRA-8로 처리한 후, 세포사멸이 일어나지 않았다(도 2d). 시험되는 4개의 B 림프종 세포주중 3개(SKW6. 4, EB-3, 및 라지)는 비교적 높은 수준의 DR5를 발현시키고, TRAIL 및 TRA-8-중재된 세포사멸 모두에 대해서는 매우 감응적이었다. 4번째 세포주, 다우디는 매우 낮은 수준의 DR5를 발현시키고, TRAIL 또는 TRA-8-중재된 세포사멸에 대해서는 매우 낮은 감응성을 나타냈다. 원발성 성상세포가 검출가능한 수준의 세포 표면 DR5를 발현시키지 않을지라도(도 2b), 시험되는 모든 4개의 교종 세포주는 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. T 및 B 세포보다 교종 세포에 대한 DR5의 높은 수준의 발현은, TRAIL 및 DR5-중재된 세포사멸에 대한 매우 높은 감응성에 의해서는 달성되지 않았으며, 이는 DR5의 세포 표면 발현의 수준이 필연적으로 종양 세포의 세포사멸과 관련되어 있지 않음을 암시하였다. 메시지 수준의 DR4, DR5 및 DcR2를 측정하기 위해 실시되는 RT-PCR은, 시험되는 모든 세포에서의 메시지를 검출하였다(표 1).
그러나, 일반적으로, 원발성 정상 세포는 형질전환된 종양 세포에 비해 비교적 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다.
Figure 112004018557262-pct00003
실시예 8. 악성 종양 세포에서 시험관내 세포사멸의 유도
시험관내에서 TRA-8이 형질전환된 세포내의 세포사멸을 유도하는지를 측정하기 위해, 모든 DR5-양성 종양 세포를 그의 TRA-8 또는 TRAIL-유도 세포사멸에 대한 감응성에 대해 검사하였다.
표적 세포(웰당 1x103)를 하룻밤 동안 37℃에서 소정 농도의 가용성 TRAIL + 가교결합제(알렉시스) 또는 TRA-8의 존재하에서 96-웰 평판내에서 배양하였다. 세포 생존율은, (1) 제조업자의 지시사항에 따른 ATPLite 키트(코넥티컷주 메리덴 소재의 페커드 인스트루먼츠); (2) MTT 세포 증식/생존율 키트(시그마); 또는 (3) 죽은 세포의 PI 염색법을 사용하여 측정하고, 유량 세포분석에 의한 분석하였다. 배양의 말단부에서, 세포를 10g/㎖ PI로 염색하고, PI 음성 세포를 생세포로서 수득하였다. 간세포의 응축된 핵의 분석을 위해, 세포를 10ng/㎖의 훽스트 33352(분자 탐침)로 염색하고, 유량 세포분석에 의해 분석하였다.
TRA-8 항체는 악성 인간 교종 세포주 대부분에서(9/10), 3개중 2개의 전립선암 세포주에서, 및 4개중 2개의 DR5-양성 조혈 세포주에서 세포사멸을 유도할 수 있다. Molt-4 세포주에서 세포사멸을 유도하지 못했으며, 이는 거의 검출불가능한 세포 표면 수준의 DR5를 발현시켰다. 그러나, TRA-8-중재된 세포사멸에 대한 세포의 감응성 수준은 세포주마다 매우 다양하였다.
세포사멸을 유도하는 TRA-8 항체에 대한 세포의 감응성의 변이성은, 비록 최소 수준의 DR5의 세포 표면 발현이 요구되지만, DR5의 세포 표면 발현이 반드시 감응성의 주요 결정인자인 것은 아니며, 기타 인자가 이 과정에 영향을 미친다는 것을 제안한다. 모든 교종 세포가 일반적으로 조혈 세포에서보다 상당히 높은 수준의 표면 DR5를 발현시키며, TRA-8 유도 세포사멸에 대한 교종 세포 감응성은 조혈 세포에 비해 정비례로 증가하지 않았다. TRA-8 유도 세포사멸에 대한 5개의 교종 세포주, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG 및 1321N1의 감응성은 높으며, 도 3b에 도시된 바와 같이 TRAIL-중재된 세포사멸에 대한 그들의 감응성과 동일하다. 2개의 교종 세포주, H-456 및 SMK1은 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 매우 적은 감응성을 갖는다. H-456 세포의 경우, DR5의 표면 발현은 낮지만; SMK1상의 DR5의 표면 발현은 더욱 감응성인 세포주와 유사한데, 이는 기타 기전이 TRAIL-중재된 세포사멸에 대한 감응성을 결정하는 역할을 담당한다는 것을 암시한다. 모든 3개의 전립선암 세포주가 높은 수준의 DR5를 발현하지만, 도 3c에서 도시된 바와 같이, Du145 세포는 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 매우 감응성이고, PC3 세포는 부분적으로 감응성인 반면, LnCAP 세포는 완정히 저항적이었다. 조혈 세포 중에서는, 위르캣 및 CEM-6이 도 2a에 도시된 바와 같이 TRA-8-세포사멸에 대해 매우 감응성이지만, 이들 세포주 둘다는 낮은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 비록 DR5가 U937 세포상에서 검출가능하지만, 이들 세포는 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 저항적이었다. 유사하게, H-9 세포가 검출가능한 수준의 DR5를 발현하지만, H-9 세포는 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 저항적이었다. 이들 결과는 DR5-중재된 세포사멸에 영향을 미치는 조절 기전이 존재함을 나타낸다.
추가의 표면 결합성 항-DR5 항체를 실시예 1 내지 3의 절차에 따라 제조하였다. 세포사멸을 유도하여 작용제로서 작용하거나 또는 역으로 TRAIL-중재된 세포사멸을 차단하여 길항제로서 작용하는 상대적 능력을 측정하기 위해 TRA-8과 함께, TRA-1 및 TRA-10으로 지정된 2개의 추가의 항-DR5 항체를 연구하였다. 인간 위르캣 세포를 표적으로서 사용하여 TRA-1, TRA-8 및 TRA-10을 나타내는 3개의 항-DR5 항체의 작용제 및/또는 길항제 활성을 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 세포 생존율은 2.5㎍/㎖으로 하룻밤 동안 배양하였을 때, TRA-10, TRA-1 및 TRA-8 각각에 대해 약 90%, 70% 및 20%이었다. TRA-8은 투여량-의존성 형태로 강한 세포사멸 반응을 유도하는 반면, TRA-1은 단지 보통의 세포사멸 반응을 유도하고, TRA-10은 단지 약한 반응만을 유도하였다. 따라서, TRA-8은 작용제 항-DR5 항체로서 분류된다. 도 4에서, 인간 위르캣 세포의 생존율은 TRAIL-유도 세포사멸의 투여량-의존성 함수로서 도시된다. TRA-10은 낮은 투여량의 TRAIL-유도 세포사멸 연구에서 인간 위르캣 세포의 세포사멸을 상당한 정도로 차단하였다. 따라서, TRA-10은 길항제 항-DR5 항체로서 분류되었다.
TRA-8 유도 세포사멸에 대한 5개의 교종 세포주, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG 및 1321N1의 감응성은, 도 3b에 도시된 바와 같이 TRAIL-중재된 세포사멸에 대한 감응성과 동일한데, 이는 이들 세포에서 TRAIL-유도 세포사멸이 DR5를 통해 주로 중재됨을 나타냈다. 더욱이, 2개의 교종 세포주, Hs683 및 U251-MG는 TRAIL-유도 세포사멸에 저항적이지만, 일부는 TRA-8 유도 세포사멸에 민감한데, 이는 유인 수용체가 이들 세포내에서 작용하고, TRA-8 항체를 이용하면 이런 규칙적인 기전이 우회됨을 나타냈다. 전립선암 세포주에서, TRA-8 유도 세포사멸에 대한 감응성이 다양함에도 불구하고, 이는 TRAIL-유도 세포사멸에 대한 세포의 감응성에 필적한데, 이는 다시 DR5가 전립선암 세포에서의 TRAIL-중재된 세포사멸에서 주요 역할을 담당함을 나타냈다. 조혈 세포중에서, 위르캣 및 CEM-6이 TRA-8 및 TRAIL-중재된 세포사멸 모두에 매우 민감하다는 것이 밝혀졌다. TRA-8 유도 세포사멸의 수준은 도 2a 및 3a'에 도시된 바와 같이 TRAIL-유도 세포사멸에 필적할만하다. 오직 하나의 교종 세포주, U87, 및 2개의 조혈 세포주, U937 및 Molt-4만이 TRAIL-유도 세포사멸에 대한 감응성을 나타내지만, TRA-8 유도 세포사멸에 대해서는 덜 감응성이거나 저항적이다. 하나의 세포주, H-9 세포주는 검출가능한 수준의 DR5를 발현시키지만, TRA-8 또는 TRAIL-유도 세포사멸에 저항적이었다. 최소 수준의 DR5의 발현 수준이 TRA-8 유도 세포사멸에 필요하지만, DR5의 발현 수준이 반드시 TRA-8-중재된 세포사멸에 대한 세포의 감응성을 예견하는 것은 아니고; 유인 수용체가 몇몇 세포내에서 TRAIL-중재된 세포사멸을 조정하는 역할을 담당하지만, 현재 시험되는 대부분의 세포내에서는 주요 역할을 담당하는 것으로 보이지 않고; 예견된 바와 같이, TRA-8 항체는 유인 수용체의 효과를 우회하고; DR5 수용체의 기능적 돌연변이가 형질전환된 세포에서 발생할 수 있으며; 최종적으로, TRAIL 및 DR5-중재된 세포사멸에 대한 세포의 감응성을 규정하는데 있어서, 세포내 조절 기전이 유인 수용체만큼 중요하거나, 또는 이보다 더 중요할 수 있다.
종래 연구에서는, DR5에 대한 mRNA가 정상 조직7에서 광범위하게 분포되어 있음을 제시하였다. 단백질 수준에서의 DR5의 발현을 평가하기 위해, 정상 인간 조직 균질액의 패널(미주리주 세인트 루이스 소재의 게노 테크놀로지(Geno Technology))을 웨스턴 블로팅 분석에서 TRA-8 항체로 탐침하였다. 9개의 정상 인간 조직중에서, 뇌 조직은 약한 양성이었다(도 5a, 레인 2). DR5 단백질은 간(레인 1), 폐(레인 3), 신장(레인 4), 비장(레인 5), 고환(레인 6), 난소(레인 7), 심장(레인 8) 또는 이자(레인 9)에서 TRA-8 반응성에 의해 검출할 수 없었다. 반면, 난소(레인 1), 폐(레인 2), 간(레인 3), 직장(레인 4), 경부(cervix)(레인 5), 피부(레인 6), 고환(레인 7), 갑상선(레인 8), 자궁(레인 10), 위(레인 11), 후인두(레인 12) 및 이자(레인 13)에서의 암을 포함하는 모든 13개의 인간 암 조직은 TRA-8(도 5b)로 양성으로 염색되었다. 더욱이, TRA-8을 사용한 정상 및 암 조직의 동일 반응계 면역조직화학에서는, 비장내의 몇몇 산란된(scattered) 양성 세포를 제외하고, 정상 유방, 폐 및 비장 조직에서의 DR5 발현이 검출될 수 없음을 확인하었다(도 5c). 유방 침윤성 관상 암종(breast infiltrating ductal carcinoma), 작은 세포 폐암, 및 림프종을 포함하는 상응하는 암 조직은 TRA-8과 양성적으로 반응하였다(도 5d). 검사한 총 22개의 암 조직중에서, 6개중 5개의 유방암, 2개중 2개의 경부암, 5개중 4개의 간암, 8개중 5개의 림프종, 2개중 2개의 폐암, 및 2개중 2개의 전립선암이 TRA-8과 양성적으로 반응하였다. 이들 결과는 유량 세포분석과 일치하며, 암 조직이 정상 조직보다 높은 수준의 DR5 단백질을 발현함을 나타낸다.
실시예 9. TRA-8의 생체내 살종양 활성
다양한 이유로, 시험관내 연구에서 유망한 것으로 보여지는 다수의 제제가 생체내에서는 효능을 나타내지 않았다. 따라서, 생체내 동물 모델에서 TRA-8의 효능을 시험하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위해, TRA-8 항-인간 DR5 항체를, 인간 DR5 분자를 발현하는 인간 이종이식편을 갖는 마우스에 투여하였다. 사용되는 마우스는 생후 6 내지 8주된 NOD/SCID 마우스(잭슨 레보레토리(Jackson Laboratory))이며, 상기 마우스는 인간 성상세포종 1321N1 세포가 피하 접종되거나(1x107), 또는 인간 백혈병 위르캣 세포가 정맥내 접종되었다(1x106). 종양을 접종한지 2일 후, 마우스에 TRA-8(100㎍)을 정맥내 접종하였다. TRA-8로 처리한지 5일 후, 1321N1 종양 성장은 종양 덩어리의 크기 및 중량에 의해 결정된다. 위르캣 세포의 성장은 접종된 동물의 비장의 중량, 및 상기 동물의 비장내의 인간 CD3-양성 위르캣 세포의 백분율에 의해 결정된다. 종양 조직의 생체검사를 실시하고 조직 검사를 실시하였다.
종양 접종한지 1일 후, TRA-8 100㎍을 정맥내로 단일 투여로 조기 처리하게 되면, 1321N1 세포가 고형 종양을 형성하는 것을 완전히 저해하였다(도 6a). 종양 접종한지 1주일 후, TRA-8 100㎍을 정맥내로 3회 투여로 늦게 처리하게 되면, 종양의 중량이 4배 이상으로 감소하였다(도 6b). 조기에 TRA-8로 처리된 동물에서는 종양 형성이 관찰되질 않았다(도 6c, 상부 패널). 조직학적 분석에서는, TRA-8로 처리된 동물에서 극적으로 퇴화된 종양 조직을 나타내었다(도 6c, 저부 패널). 유사하게, 비장내에 CD3-양성 위르캣 세포가 거의 없다는 사실에 의해 확인되는 바와 같이, TRA-8 처리는 위르캣 세포에 의한 비장의 군집을 저해하였다(도 6d, 6e). 이식된 종양의 조직학적 분석에서는, 도 6c에 도시된 바와 같이, TRA-8-처리된 동물에서는 몇몇 종양 세포가 연조직내에 분산되어 있는 반면, 대조군은 고형 종양을 형성하는 것으로 나타났다. 도 6a 및 도 6c의 동일 반응계 CD3 염색에 도시된 바와 같이, 위르캣 세포 모델에서 TRA-8-처리된 동물의 비장내의 위르캣 세포의 수는, 유량 세포분석에 의해 입증된 바와 같이, 2% 미만인 반면 대조 동물의 비장에서는 거의 10%였다.
이들 결과에서는 가교결합된 재조합 TRAIL을 전신 투여하면 생체내에서 종양의 성장을 저해된다는 최근의 논증을 확인하고 있다(13). 이들 결과에서는 TRA-8의 단일 투여가 생체내에서 종양 세포의 제거에 매우 효과적임을 나타냈다.
항-인간 항체가 뮤린 모델에 사용되었으므로, TRA-8 치료의 독성을 평가할 수는 없었다. 그러나, 생체내 TRAIL 투여에 관한 연구에서는, 이 치료와 관련된 어떠한 유의한 독성도 없는 것으로 나타났다(13).
실시예 10. RA 활막 세포는 TRAIL 및 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 감응적이다.
대부분의 종래 기술에서의 TRAIL-중재된 세포사멸에 관한 연구는 악성 종양 세포에 초점을 맞추어 왔다. 본 발명에 따른 TRAIL-중재된 세포사멸은 또한 RA와 같은 자가면역 및 염증 상태를 치료하는데 효과적이었다.
10.1 RA 활막 세포에서 세포 표면 DR5 발현의 유량 세포분석
RA를 앓는 환자에서 나온 8개의 배양된 원발성 활막 세포의 패널상에서의 DR5의 발현을, 골관절염(이하 본원에서 "OA"로서 지칭됨)을 앓는 환자로부터의 8개의 배양된 원발성 활막 세포의 패널과 비교하였다. 8개의 인간 원발성 RA 활막 세포 배양액 RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 및 RA-929는, 오츠키 박사(Dr. M. Ohtsuki)(일본 도쿄 소재의 산쿄 캄파니 리미티드(Sankyo Co. Ltd.))에게서 친절하게 공급받았으며, 10% FCS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 DMEM중에서 배양하였다. 7개의 OA 활막 세포 원발성 세포 배양액은, 표준 콜레게나제(collagenas) 방법에 의해 OA 환자의 활막 조직으로부터 단리하고 동일한 조건하에서 배양하였다. 모든 원발성 세포의 계대 배양 횟수는 10회 미만이었다. DR5의 발현은 실시예 5에서 기술된 바와 같이 FACs 분석에 의해 측정하였다.
모든 RA 세포의 1차 배양액은 높은 수준의 표면 DR5를 발현시켰으며, 도 7a에 도시된 바와 같이 상이한 환자로부터 단리된 이들 활막 세포에서 발현 수준의 변화는 거의 없었다. 반면, OA 환자로부터 단리된 활막 세포의 표면상에서의 표면 DR5의 발현은 도 7b에 따르면 매우 낮거나 검출불가능하였다. SV40-형질전환된 활막 세포는 RA 세포에 의해 나타나는 것보다 높은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 반면, 비형질전환된 섬유 모세포는 도 7b에서와 같이 OA 세포에 의해 나타나는 것보다 낮은 수준의 DR5를 발현시키는 것으로 밝혀졌다.
10.2 TRA-8 또는 TRAIL에 의해 중재된 세포사멸에 대한 RA 활막 세포의 감응성
일반적으로, RA 환자로부터 분리된 모든 활막 세포는 TRAIL 및 항-DR5 항체-유도 세포사멸에 대해 감응적이고, 모든 OA 세포는 도 8a, b에 따르면 TRAIL 및 항-DR5 항체-유도 세포사멸에 대해 저항적이었다. 이들 연구에서는, TRA-8 항체는 정상 세포보다 변형 세포를 표적으로 삼는 것으로 나타난다. 더욱이, TRAIL-유도 세포사멸에 대한 감응성 또는 저항성의 패턴은 항-DR5 항체에 의해 유도된 것과 관련되며, 이는 활막 세포가 주로 DR5를 이용하여 TRAIL 세포사멸을 개시함을 의미한다.
악성 종양 세포에 관해 기술된 바와 같이, TRAIL 또는 항-DR5 항체-유도 세포사멸에 대한 감응성은 유사한 수준의 DR5를 발현시킬지라도 RA 활막 세포중에서 다양하였다. RA-512 및 RA-707이 가장 감응적인데, 이는 80% 이상의 세포가 20ng/㎖ 미만의 TRAIL 또는 TRA-8 농도에 의해 사멸되기 때문이었다. RA-1014, RA-811, RA-716 및 RA929는 TRAIL 또는 TRA-8에 대한 중간 수준의 감응성을 갖는 것들이며, 높은 농도(>50ng/㎖)의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서 거의 100% 세포가 사멸되었다. RA-1016 및 RA1021 세포에서, 대부분(60% 이상)의 세포가 낮은 투여량의 TRAIL 또는 TRA-8에 의해 사멸되며, 일부 세포가 높은 농도의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서 생존하였으며, 이는 하위 군집의 세포가 TRAIL-중재된 세포사멸에 대해 저항적임을 나타냈다. 반면, 모든 OA 세포는 TRAIL 및 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 매우 낮은 감응성을 나타냈다. OA52F 및 OA69F에서는, 높은 농도의 TRAIL 또는 TRA-8의 존재하에서도 60% 이하의 세포가 사멸하였다. OA72M 세포는 TRAIL 또는 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 완전히 저항적이었다. SV40 형질전환된 활막 세포 또한 TRAIL 및 TRA-8 유도 세포사멸에 대해 감응적이었다(데이터는 제시되지 않음). 반면, 비형질전환된 섬유 모세포는 TRAIL 및 TRA-8에 대해 저항적인 것으로 보였다.
종래에는, DR5가 경로 의존성인 FADD/카스파제 8을 이용하여 세포사멸을 개시하는 것으로 제시되어 왔다(44). RA 활막 세포의 DR5-중재된 세포사멸의 카스파제-의존성을 측정하기 위해, RA 세포를 특정 카스파제 억제제의 존재하에서 TRAIL 또는 항-DR5 항체와 함께 배양하였다. 도 9에서 도시된 바와 같이, 시험되는 8개의 카스파제 억제제중에서 카스파제 6, 8 및 10 억제제가 TRAIL 및 DR5 둘 모두에 의해 유도된 RA 활막 세포의 세포사멸을 저해할 수 있으며, 이는 이들 3개의 카스파제가 DR5-중재된 세포사멸에 관련되어 있음을 나타냈다.
10.3 TRA-8 또는 TRAIL은 MMP의 방출을 증가시키지 않고 RA 활막 세포에서의 NFκb 활성화를 유도한다.
세포사멸의 신호전달과 증식 신호전달이 밀접하게 관련되어 있다는 발상을 지지하는 상당한 증거가 있다(45). DR5가 세포사멸 신호 전달 이외에 NFκb 경로를 활성화시킬 수 있으며, NFκb 활성화가 항-세포사멸 신호를 전달할 수 있다는 것으로 확인되었다. 따라서, 겔-이동 검정을 수행하였다. 세포를 지시된 시간 동안 증진제 1㎎/㎖의 존재하에 50ng/㎖의 재조합 가용성 TRAIL, Fas 리간드, 또는 50ng/㎖의 TRA-8로 자극하였다. 핵 추출물을 제조하고 2중-착색된 [32P]-표지된 올리고-DNA 탐침과 함께 항온처리하였다. 그 결과를 사이클론 포스파-이매저(cyclone phospha-imager)(TopCount NXT, 신시내티주 소재의 팩커드 인스트루먼트 캄파니(Packard Instrument Company) 제조)를 사용하여 분석하였다. RA 활막 세포를 TNF-α 또는 TRAIL과 함께 항온배양하고, NFκb를 시간-의존적인 방식으로 활성화시켰다. TRA-8 항체는 NFκb를 강하게 활성화시켰다. 대조적으로, Fas 리간드는 도 10a에서와 같이 NFκb 활성화를 유도할 수 없었다.
따라서, 비록 TRAIL 및 TRA-8 항체가 RA 활막 세포에서 강한 세포사멸 반응을 유도하지만, 이들은 또한 NFκb를 활성화하고, NFκb 활성화는 RA에서 TNF-α의 프로염증성 역할에 기여한다고 생각된다. 따라서, TRAIL은 TNF-α와 마찬가지로 프로염증성 시토카인으로서 작용할 수 있다. TRAIL 및 TNF-α에 의해 유도된 NFκb 활성화의 유사한 생물학적 결과가 있는지 여부를 결정하기 위해, ELISA에 의해 MMP의 생성량을 측정하였다. 활막 세포를 배지 단독에서, 또는 50ng/㎖ 인터류킨 1b, 10ng/㎖ TNF-α, 50ng/㎖ TRAIL 또는 50ng/㎖ TRA-8과 함께 하룻밤 배양하였다. 배지 상층액중의 MMP-1 및 MMP-3의 수준을 ELISA 키트로 측정하였다.
RA 활막 세포를 프로염증성 시토카인, TNF-α 또는 IL-lb와 함께 배양하는 경우, MMP-1, 3 및 13의 생성량은 도 10b, c에 도시된 바와 같이 배지 대조군에 비하여 증가하였다. 대조적으로, TRAIL 또는 항-DR5 항체를 이용한 처리는 상기 MMP의 방출의 증가와 관련되지 않았다.
실시예 11A. 간세포 독성 유도의 실패
24-시간 세포 생존율 검정을 위해, 96-웰 평판중의 신선한 정상 인간 간세포를 인 비트로 테크롤로지(In Vitro Technology)(메릴랜드주 볼티모어)에서 구입하였다. 1㎍/㎖의 가용성 TRAIL 또는 TRA-8을 함유하는 간세포 배양 배지에서 간세포를 배양하였다. 6-시간 생존율 검정을 위해, 정상 간세포 또는 간세포암 세포를 UAB 조직 조달 센터(Tissue Procurement Center)로부터 수거된 신선한 외과용 견본으로부터 분리하였다. 간세포 관류 완충액, 소화 배지, 세척 배지 및 부착 배지를 포함하는 인간 간세포의 분리를 위한 모든 시약은 깁코로부터 구입하였다. 조직 슬라이드를 37℃에서 간세포 소화 배질중에서 1시간 동안 진탕시켜(50 rpm) 소화시켰다. 분리된 간세포를 저속 원심분리(50 g, 3분)로 수확하고, 간세포 세척 배지로 6회 세척하였다. 간세포의 단일 세포 현탁액을 96-웰 마트리겔(Matrigel) 평판(BD)에서 10% FCS를 함유하는 부착 배지중에서 6시간 동안 배양하였다. 부착되지 않은 간세포는 예비-가온된 부착 배지로 2회 세척하여 제거하였다. 부착된 간세포를 가교결합제 존재하에 다양한 농도의 가용성 TRAIL 또는 FasL과 함께, 또는 TRA-8 또는 CH11과 함께 추가로 6시간 동안 항온배양하였다.
TRAIL은 세포사멸을 유도할 수 있는 둘 이상의 수용체(DR4 및 DR5)를 갖는다. TRA-8을 이용하여 단지 DR5의 가교결합이 정상 간세포의 세포사멸을 유도하기에 충분한지를 결정하였다. 먼저 5개의 정상 인간 간 조직 및 5개의 간암 조직의 단백질 수준에서의 DR5의 발현을 TRA-8을 사용한 동일 반응계 면역조직화학으로 검사하였다. 정상 간 조직으로부터의 단면은 DR5를 위한 TRA-8과의 양성 반응성이 없으면서(도 11a, 좌측 하단 패널) H&E 착색시(도 11a, 좌측 상단 패널) 정상 구조 및 세포 형상학을 나타내었다. 대조적으로, 인간 간세포암 조직은 세포막 및 세포질 둘 모두에서 암세포상의 DR5 존재와 일치하는 패턴으로 TRA-8과 양성으로 반응하였다. 인간 간세포암 세포주 HepG2도 또한 DR5에 대해 양성이었다. 상기 결과는 5개의 정상 간 조직에서 일치하며, 5개의 간암 조직중 단지 1개(간 선종)만이 DR5-음성이었다. 상기 결과는 다른 정상 조직과 마찬가지로, 정상 인간 간 조직은 DR5 단백질의 상당한 수준을 나타내지 않는다는 점에서 도 5a에 도시된 웨스턴 블로팅(Western blotting) 데이터와 일치한다. 또한, TRA-8로 탐침검사된 분리된 정상 인간 간세포를 웨스턴 블로팅한 결과 DR5가 검출가능한 수준으로 나타나지 않았다.
유량 세포분석에 의한 인간 간세포상의 DR5의 세포 표면 발현은 새로이 준비된 정상 간세포가 검출가능한 수준의 세포 표면 DR5(도 11b, 정상 좌측 패널)를 발현시키지 않았다는 것을 입증하였다. 냉동보존되거나 단기간 배양된 정상 인간 간세포에서도 검출되지 않았다. 대조적으로, 새로이 분리된 간세포암 세포 및 HepG2 세포는 세포 표면 DR5를 발현시켰다. 비교 기준으로 Fas를 이용하였을 때, 정상 간세포, 간세포암 세포 및 HepG2 세포는 모두 동등한 수준의 Fas를 발현시켰다(도 11b, 하단 패널). 상기 결과는 동일 반응계 면역조직화학 및 웨스턴 블로팅을 이용하여 생성된 결과와 일치하며, 세포 표면 DR5가 암에 걸린 간 세포에서는 고도로 발현되나 정상 간세포에서는 발현되지 않는다는 것을 시사한다. RT-PCR23에 의해 예증되는, 인간 간세포에서 DR4, DR5, DcR1 및 DcR2에 대한 mRNA 수준의 존재는 인간 간세포가 TRA-8에 의한 검출을 위한 역치 미만인 매우 낮은 수준의 DR5 단백질을 발현시킨다는 것을 암시한다.
TRA-8이 간세포 독성을 유도하는지 여부를 결정하기 위해, TRA-8 및 가용성 TRAIL+가교결합제에 의해 유도된 정상 인간 간세포의 세포사멸 감응성을 검사하였다. 정상 간세포가 고농도의 TRAIL 존재하에 배양되는 경우, 세포 생존율의 시간-의존적인 감소가 ATPLite(도 12a) 및 MTT 검정에 의해 관찰되었다. 정상 간세포의 TRAIL-매개된 세포 죽음은 TRAIL 첨가한지 4시간 후에 이미 나타났다. 24-시간 배양의 말기에, 간세포의 80% 이상이 TRAIL에 의해 죽었다. 대조적으로, 동일한 배양 기간 동안, 정상 간세포에서는 TRA-8이 상당한 세포 죽음을 유도하지 않았다. 세포사멸의 특징인, 훽스트로 착색된 응축된 핵은 TRAIL-처리된 간세포에서는 증가하였으나 TRA-8-처리된 간세포에서는 그렇지 않았다(도 12b). 세포사멸성 간세포의 수는 ATPLite 검정에 의해 측정된 바와 같은 세포 생존율의 감소와 큰 상관관계가 있었으며, 이는 간세포의 TRAIL-유도된 세포 죽음이 세포사멸에 의해 매개된다는 것을 암시한다. 이는 간세포의 TRAIL-매개된 독성을 저해하는 Z-VAD의 능력으로 확인된다. 사이클로헥시미드가 유력한 세포사멸 증진제이므로, 이 화합물의 효과를 TRAIL 및 TRA-8-처리된 간세포에서의 조사하였다. 4시간 배양 동안, 사이클로헥시미드는 TRAIL에 의해 유도되는 간세포의 세포 죽음을 상당히 증진시켰으며, 사이클로헥시미드 존재하에 TRAIL에 의해 70%를 초과하는 간세포가 죽었다(도 12c). 그러나, 사이클로헥시미드 처리는 간세포에서 TRA-8 매개된 세포 죽음을 증진시킬 수 없었다. 간세포에서 TRA-8 유도 세포사멸의 특징을 TRAIL에 의해 유도된 것과 비교하기 위해, 정상 간세포 및 암 세포를 다양한 농도의 가용성 TRAIL(가교결합제를 가짐) 또는 TRA-8과 함께 배양하였다. 6-시간의 배양 기간 동안, TRAIL은 정상 간세포에서 중간 정도의 세포사멸 반응을 유도하였다. 500ng/㎖의 TRAIL의 존재하에서 간세포가 20% 이상 죽었다(도 12d, 상단 좌측). 동일한 기간동안 정상 간세포를 TRA-8-처리하면 어떠한 유의한 세포 사멸도 야기되지 않았다. 정상 세포와는 반대로, 원발성 간세포암 세포(도 12d, 상단 중앙) 및 HepG2 세포(도 12d, 상단 우측)는 TRAIL 또는 TRA-8에 의해 매개된 세포사멸에 매우 민감하다. 80% 이상의 간세포암 세포 및 거의 100%의 HepG2 세포가 8-시간의 배양 기간 동안 죽었다. 상기 결과는 정상 간세포가 TRA-8 매개된 세포사멸에 완전히 내성이 있으며, 간 암 세포보다는 TRAIL-매개된 세포사멸에 훨씬 덜 민감하다는 것을 시사한다. Fas 리간드 및 항-Fas 항체(CH-11)를 사용하는 경우, 정상 간세포, 간세포암 세포 및 HepG2 세포 사이에 Fas-매개된 세포사멸에 대한 감응성에 뚜렷한 차이는 없었다(도 12d, 하단 패널).
비교예 11B. 생체내에서 간염의 인간 막-결합된 TRAIL 유도
8 내지 10주 나이의 암컷 B6 마우스에게 109 pfu의 Ad/hTRAIL을 동수의 Ad/Tet-on과 함께 정맥주사하였다. 아데노바이러스 벡터를 접종한 직후 음용수중의 상이한 농도의 테트라사이클린을 마우스에게 먹였다. 간 상해를 AST 진단 키트(시그마(Sigma))를 사용하여 AST의 혈청 수준에 의해 측정하였다. TRAIL의 발현을 노던 블로팅 분석에 의해 측정하였다.
TRAIL의 막 결합된 형태가 생체내에서 간 손상을 유도하는지 여부를 결정하기 위해, 전체 길이의 인간 TRAIL을 코딩하는 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad/hTRAIL)를 구축하고, 그의 발현을 테트라사이클린-유도가능한 촉진자의 제어하에 두었다. B6 마우스에게 Ad/hTRAIL을 정맥접종한지 24시간 후, 노던 블로팅 분석에 의해 예증되는 바와 같이 간에서 인간 TRAIL의 테트라사이클린-유도된 발현을 투여량-의존적인 양식으로 관찰하였다(도 13a). TRAIL의 발현 수준은 트랜스아미나제의 혈청 수준의 테트라사이클린-의존적 증가에 의해 나타내어지는 바와 같이, 다시 투여량-의존적인 양식으로 간 손상과 큰 상관관계가 있었다(도 13b). 아데노바이러스 벡터 자체를 접종하는 것이 간세포의 TRAIL-매개된 세포사멸에 대한 감응성을 증가시킬 수 있으므로, Ad/TRAIL이 접종된 마우스로부터의 간세포를 분리하고 TRAIL-매개된 세포 죽음에 대해 시험하였다. Ad/TRAIL 감염된 간세포의 세포 죽음은 대조군 마우스에 비해 크게 증가하지 않았다(도 13c, 좌측 패널). 게다가, Ad/TRAIL 접종된 마우스는 가용성 인간 TRAIL의 정맥 주사 후에 간 상해가 증가하지 않았다. 따라서, 결과적으로 Ad/TRAIL-유도 간염은 막 형태로 발현된 높은 수준의 TRAIL에 의해 매개된다. 간 단면을 조직학 분석하면 벡터를 접종한지 24시간 후에 이미 간세포에 대한 손상이 명백해지며(도 13d), 7일 이상 지속된다(도 13e)하다는 것이 밝혀졌다. 간에서의 상기 병리학적인 변질도 또한 테트라사이클린-의존적이며 투여량-의존적인 방식으로 나타났다. 처리한지 24시간 이내의 TRAIL-유도된 간 손상의 조기 상은 회저의 병소를 특징으로 한다. 이 단계에서는 감염 세포의 침윤은 관찰되지 않았으나, 출혈이 발생하였다. 접종한지 7일 후에는, 두드러진 소열편 난잡성, 불규칙하게 응집된 세포질 및 거대한 투명한 공간을 동반하는 간세포의 심한 퇴화, 및 현저한 세포사멸 및 회저로 확산성 간 손상이 명백하였다. 단핵 세포의 광범위한 침윤이 이 단계에서의 특징이었다. 상기 결과는 막-결합된 형태의 인간 TRAIL이 생체내에서 간 손상을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 인간 TRAIL이 마우스에게 심한 간염을 일으키는 경향이 있음에도 불구하고, 치명적인 반응은 유도하지 않았다. 대조적으로, Fas 리간드를 코딩하는 유사한 테트라사이클린-제어된 벡터가 접종된 마우스의 경우 접종한지 72시간 이내에 테트라사이클린 투여량-의존적으로 다량의 세포사멸 및 간세포의 회저를 갖는 전격성 간염이 발병되었으며 심한 출혈 및 사망을 동반하였다. 치사율은 테트라사이클린 3㎎/㎖ 이상을 수용한 하위 군에서 48시간 이내에 100%에 도달하였다. 대조적으로, Ad/hTRAIL을 수용한 마우스는 테트라사이클린의 투여량에 관계없이 모두 접종한지 4주 후에 여전히 살아있었다. 따라서, 결론적으로, 생체내에서 TRAIL의 막-결합된 형태는 Fas 리간드보다 덜 강력한 간세포 손상의 유도인자이다. 이들은 또한 TRAIL이 Fas 리간드의 독성의 근원을 이루는 기작과는 상이한 기작을 통해 간 손상을 유도한다는 것을 암시한다.
실시예 12. 활성화된 인간 T 및 B 세포는 증가된 수준의 DR5를 발현시킨다.
DR5가 활성화된 T 세포 및 B 세포의 TRAIL-매개된 세포사멸에 역할을 하는지 여부를 결정하기 위해, 휴면중인 T 및 B 세포 및 활성화된 T 및 B 세포 상에서 DR5의 표면 발현을 TRA-8을 사용하여 검사하였다. PBMC에서 미자극된 인간 T 세포는 유의한 수준의 DR5를 발현시키지 않았다(도 14). 항-CD3 또는 Con-A로 자극한지 48시간 후에, 세포 표면 DR5 발현이 상당히 증가하였다. 유사하게, 미자극된 B 세포는 매우 낮은 수준의 DR5를 발현시켰다. 항-μ로 자극하였으나 LPS로는 자극하지 않은 결과 DR5의 세포 표면 발현이 증가하였다. 상기 결과는 활성화된 T 및 B 세포 모두가 더 높은 수준의 세포 표면 DR5를 발현시킨다는 것을 시사한다. 세포를 20㎍/㎖의 TRA-8 및 PE 항-마우스 IgG1로 착색하였다.
실시예 13. 활성화된 T 및 B 세포는 TRA-8 매개된 세포사멸에 감응하게 된다.
활성화된 T 및 B 세포가 TRA-8 매개된 세포사멸에 민감한지 여부를 결정하기 위해, 인간 PBMC의 T 세포 및 B 세포를 시험관내에서 각각 항-CD3 또는 항-μ로 48시간 동안 자극하였다. 생세포 및 증식중인 배아 세포를 구배 원심분리로 수거하고, 다양한 농도의 TRA-8과 함께 항온배양하였다. 미자극된 T 세포 및 B 세포는 TRA-8 매개된 세포사멸에 민감하지 않았다(도 15). 총 자극된 T 세포 및 B 세포는 TRA-8 매개된 세포사멸에 온화하게 증가된 감응성을 나타내었으며, 하룻밤 배양후 TRA-8에 의해 세포의 20%가 죽었다. 고도로 증식중인 배아 T 세포는 TRA-8 매개된 세포사멸에 훨씬 민감하였다. 배아 T 세포의 70% 이상이 TRA-8에 의해 죽었다. 또한, 배아 B 세포는 다른 것들에 비해 TRA-8 매개된 세포사멸에 더욱 민감하였다. 상기 결과는 활성화된 T 및 B 세포가 DR5 매개된 세포사멸에 민감하다는 것을 시사한다.
실시예 14. TRA-8은 인간/SCID 마우스에서 활성화된 T 세포를 고갈시킨다.
TRA-8의 생체내 항-T 세포 효능을 결정하기 위해, NOD/SCID 마우스에게 1x108 인간 PBMC를 정맥 주사하였다. 정상적으로는, SCID 마우스의 인간 T 세포는 이종개체 자극에 반응하여 빨리 활성화되었다. 전달한 날부터 100㎍의 TRA-8 또는 대조용 IgG1를 인간 PBMC/SCID 마우스에게 복막내 주사하였고, 이를 3일 동안 매일 반복하였다. 전달 5일 후에, 단핵 세포를 비장으로부터 분리하고 항-인간 CD3 항체로 착색하고, 림프구 개체군을 유량 세포분석에 의해 게이팅하고, CD3 양성 인간 T 세포를 분석하였다. 대조 처리된 마우스에서 항-인간 CD3를 착색함에 의해 측정된 바와 같이, 비장 림프구의 약 30%는 인간 T 세포이다. 그러나, TRA-8 처리된 마우스의 비장 림프구에서는 소수의 인간 T 세포만이(3% 미만) 관찰되었다(도 16). 동일 반응계 조직학적 연구에서는, 투넬 착색에 의해 예증된 바와 같이 대조군 마우스의 비장에서 인간 T 세포가 비장내 재증식되며 단지 소수의 세포사멸 세포가 관찰된다는 것이 밝혀졌다. 대조적으로, 살아있는 인간 T 세포를 이용한 재증식은 TRA-8 처리된 마우스의 비장에서는 관찰되지 않으며, 오히려 많은 세포사멸성 세포가 관찰되었다(도 17). 상기 결과는 TRA-8이 생체내에서 항-T 세포 활성을 갖는다는 것을 예증하며, GVH 질환의 치료를 위한 본 발명의 항체의 용도를 시사한다.
실시예 15. TRA-8의 항-암 치료 활성
15.1 인간 암 조직 및 세포주에서의 DR5-발현 및 기능
i) TRA-8로 동일 반응계 착색함에 의한 인간 암 조직에서의 DR5 발현
암 세포 및 조직이 차별적으로 더 높은 수준의 DR5를 발현시키는지 여부를 결정하기 위해, 20개의 유방암 조직, 6개의 난소암 조직, 5개의 결장암 조직 및 5개의 전립선암 조직을 포함하는 인간 암 조직의 패널을 면역조직화학을 위해 TRA-8로 착색하였다. 상기 암 조직의 대부분이 검출가능한 DR5를 발현시켰다. 상기 암 조직에서의 DR5의 발현 수준은 다양하였다. 일반적으로, 암 조직은 비연관 조직보다 더 높은 수준의 DR5를 발현시켰다. 또한, DR5 발현은 p53의 돌연변이와 명백히 상관관계가 없었다.
ii) 인간 암 세포주에서의 DR5-발현 및 기능(표 2)
9개의 인간 유방암 세포주, 3개의 난소암 세포주, 3개의 결장암 세포주 및 3개의 전립선암 세포주를 시험관내에서 DR5의 세포 표면 발현 및 TRA-8 유도 세포사멸에 대한 감응성에 대해 검사하였다. 9개의 유방암 세포주중 7개, 3개의 난소암 세포주중 3개, 3개의 결장암 세포주중 3개 및 3개의 전립선암 세포주중 3개가 다양한 수준의 세포 표면 DR5를 발현시켰다. 9개의 유방암 세포주중에서, TRA-8 매개된 세포사멸에 대해 3개는 매우 민감하였으며, 3개는 중간이었고 3개는 내성이 있었다. 3개의 난소암 세포주 모두가 매우 민감하였다. 3개의 결장암 세포주중 1개는 매우 민감한 반면, 2개는 중간 감응성을 가졌다. 3개의 전립선암 세포주중 2개는 중간 감응성을 가지고 1개는 내성이 있었다.
Figure 112007063543844-pct00133
iii) 아드리아마이신과의 TRA-8의 조합된 세포 독성
몇개의 유방암 세포주에서, TRA-8 유도 세포사멸에 대한 아드리아마이신의 효과를 검사하였다. 아드리아마이신을 다량으로 투여하자 추가적인 효과가 나타났다. 그러나, 일부 TRA-8 내성 세포주에서는 소량의 아드리아마이신을 투여하자 TRA-8 유도 세포사멸이 상승작용적으로 증진되었다.
iv) TRA-8의 인간 암 세포에 대한 시험관내 및 생체내 결합 활성.
방사성 동위원소 표지된 TRA-8을 사용함. TRA-8의 유방암 세포주에 대한 결합 활성을 종양이 이식된 SCID 마우스의 시험관내 및 생체내에서 검사하였다. 암 세포에 대한 시험관내 결합 활성은 3nM의 Kd값으로 평가되었으며, 이는 ELISA를 사용한 이전의 평가와 일치하고, 가용성 TRAIL보다 50배 이상 높은 것이었다. 생체내에서, TRA-8은 이식된 종양 조직에 집중되었다.
15.2. NOD/SCID 마우스에서 TRA-8을 사용한 만성 림프성 백혈병의 요법
만성 림프성 백혈병(CLL)은 B 세포 악성의 일반적인 형태이다. CLL에서 대부분의 악성 B 세포는 성숙한 표현형이며 많은 세포사멸 자극에 내성이 있다. CLL을 앓는 5명의 환자의 B 세포에서 DR5-발현 및 기능을 검사하였다. PBMC에서 95% 이상의 CD19+ B 세포에 의해 나타내어지는 바와 같이, 모든 환자가 다수의 말초 B 세포를 가졌다. 정상 원발성 B 세포에 비해, 모든 환자의 CLL B 세포는 더 높은 수준의 세포 표면 DR5를 가졌으며 시험관내에서 TRA-8 유도 세포사멸에 더욱 민감하였다. 흥미롭게도, CLL B 세포는 또한 비스인돌말레이미드 VIII(BisVIII) 유도된 세포 독성에 민감하였다. 이후 TRA-8과 BisVIII을 조합하여 처리한 결과, CLL B 세포의 거의 50%가 죽은 반면 정상 B 세포는 반응하지 않은 채로 유지되었다(도 18). CLL B 세포를 NOD/SCID 마우스로 전달하면 전달한지 5일 후에 수용 마우스의 비장에서 재증식된 약 25% 내지 30%의 CD19+B 세포를 야기하였다. 그러나, 100㎍의 TRA-8을 3회 투여하는 치료로 수용 SCID 마우스의 비장에서 5명의 환자중 4명의 CLL B 세포를 완전히 제거하였다. 따라서, TRA-8은 단독으로 또는 다른 물질과 함께 만성 림프성 백혈병의 치료제로서 활성이 있다.
실시예 16. cDNA 클로닝
(1) TRA-8의 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열의 결정
TRA-8의 중쇄 및 경쇄의 cDNA를 수득하기 위해, TRA-8의 중쇄 및 경쇄 및 클로닝된 TRA-8 유전자의 N-말단 아미노산 서열을 공지된 기법으로 결정하였다.
항-인간 DR5 항체 TRA-8을 함유하는 용액 10㎍을 120분 동안 12% w/v의 겔 농도, 100V의 일정 전압을 이용하여 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동("SDS-PAGE")시켰다. 전기영동 후, 겔을 전달 완충액인 25mM Tris-HCl(pH 9.5), 20% 메탄올, 0.02% v/v SDS에 5분 동안 침지시켰다. 이후, 겔의 단백질 내용물을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막("PVDF 막"; 공극 크기 0.45um; 일본 밀리포어(Millipore) 제조)에 전달하고, 10V의 일정 전압, 4℃의 조건하에서 14시간 동안 블로팅 장치(KS-8451; 마리솔(Marisol))를 이용하여 전이 완충액중에 예비침지하였다.
이후, PVDF 막을 세척 완충액인 25mM NaCl, 10mM 붕산나트륨 완충액(pH 8.0)으로 세척한 후, 착색 용액(50% v/v 메탄올, 20% v/v 아세트산 및 0.05% w/v 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue))중에서 5분 동안 착색시켜 단백질 밴드의 위치를 확인하였다. 이어서 PVDF 막을 90% v/v 메탄올 수용액으로 탈색시키고, 이전에 PDVF 막에 위치된, 중쇄에 해당하는 밴드, 즉 낮은 이동성을 갖는 밴드 및 경쇄, 즉 높은 이동성을 갖는 밴드를 절제하고 탈이온수로 세척하였다.
중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 기상 단백질 서열기(PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.)를 사용하는 에드맨(Edman) 자동화법(Edman, P., et al., (1987), Eur. J. Biochem., 1, 80)에 의해 결정하였다.
중쇄에 해당하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 하기와 같이 결정되었고:
Figure 112007063543844-pct00005
경쇄에 해당하는 밴드의 N-말단 아미노산 서열은 하기와 같이 결정되었다:
Figure 112004018557262-pct00006
상기 아미노산 서열을 카바트(Kabat) 등에 의해 공개된 항체 아미노산 서열의 데이터베이스(Kabat E.A., et al., (1991), in "Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II,"U.S. Department of Health and Human Services)와 비교한 결과, TRA-8의 중쇄(γ1 쇄) 및 경쇄(k 쇄)는 각각 아류형 3d 및 1에 속한다는 것이 밝혀졌다.
(2) cDNA 클로닝
상기 발견에 기초하여, 상기 마우스 아류형에 속하는 유전자의 5'-미번역된 영역 및 3'-번역된 영역 부분과 혼성될 것으로 기대되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다. 이어서, TRA-8의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA를 역전사 및 PCR(RT-PCR)의 하기 조합에 의해 클로닝하였다.
a) 주형
TRA-8 하이브리도마의 전체 RNA(ATCC PTA-1428)를 TRIzol 시약(깁코 BRL)으로 추출하였다. PCR 반응을 위한 주형은 제 1-스트랜드 cDNA 합성 키트(아머샴 파마시아 바이오테크)를 사용하여 이 키트와 함께 제공된 안내 설명서에 따라 수득된 cDNA를 사용하였다.
b) PCR 프라이머
하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR용으로 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00007
Figure 112004018557262-pct00008
별도로 특정하지 않는 한, 이들 실시예들에서 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech)에서 합성하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 증류수에 용해시킨 후에, -20℃에서 보관하였다.
c) PCR 반응
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
주형 cDNA, 총 33㎕의 반응 용액중 5㎕;
프라이머 BR5p1, 10pmol;
프라이머 BR5p2, 10pmol;
10x로 농축된 PCR 완충액(키트에서 제공됨), 10㎕;
dNTP(각각 2.5mM), 4㎕; 및
택 폴리머라제(프로메가(Promega), 5 유니트(unit)).
멸균 증류수를 상기 용액에 첨가하여 총 부피를 100㎕로 만들었다. 별도로 특정하지 않는 한, dNTP는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(각각 2.5mM)의 동몰 혼합물이다.
PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 상기 용액을 먼저 2분 동안 94℃에서 가열한 후, 94℃에서 30초간, 52℃에서 1분 동안 그리고 72℃에서 3분 동안 가열하는 주기를 40회 반복하였다. 이 절차가 완료된 후에, 반응 용액을 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이와 같이 수득된 증폭된 DNA 단편을 0.25㎍/㎖의 에티디움 브로마이드를 함유하는 1% 아가로즈 겔상에서 분리하였다. 원하는 DNA 단편을 포함하는 것으로 결 정된 밴드(band)를 면도날로 절단하고, DNA를 진 클린 키트(Gene Clean kit)(BIO101)를 사용하여 밴드로부터 회수하였다. DNA 단편을 pGEM-T 이지(Easy) 벡터(프로메가)를 사용하여 클로닝하였다. 이 클로닝은 다음과 같이 수행하였다:
PCR 반응 용액으로부터 회수한 DNA 단편을 50ng의 pGEM-T 이지 벡터(Easy vector)(키트에서 제공됨)와 함께 1㎕의 10x 리가제 반응 완충액(6mM Tris-HCl(pH 7.5), 6mM 염화마그네슘, 5mM 염화나트륨, 7mM β-머캅토에탄올, 0.1mM ATP, 2mM DTT, 1mM 스퍼미딘 및 0.1㎎/㎖ 소의 혈청 알부민)과 혼합하고, 여기에 4 유니트의 T4 DNA 리가제(1㎕)를 첨가하였다. 혼합물의 총 부피를 멸균 증류수로 10㎕로 조정하고, 생성된 리가제 용액을 14℃에서 15시간 동안 항온배양하였다. 이후, 2㎕의 리가제 반응 용액을 50㎕의 컴피턴트 대장균 균주 JM109(키트에서 제공되고 지시 매뉴얼에 따라 컴피턴트 균주로 제조함)에 첨가하고, 2㎕의 0.5M β-머캅토에탄올을 첨가한 후, 생성된 혼합물을 얼음중에서 30분 동안 방치한 후, 42℃에서 30초간 그리고 다시 얼음상에서 5분 동안 방치하였다. 다음에, 2%(부피/부피(v/v))의 트립톤, 0.5%(중량/부피(w/v))의 효모 추출물, 0.05%(w/v)의 염화나트륨, 2.5mM의 염화칼륨, 1mM의 염화마그네슘 및 20mM의 글루코즈를 포함하는 배지(이하, "SOC" 배지로서 지칭됨) 500㎕를 상기 배양물에 첨가하고, 이 혼합물을 진탕시키면서 37℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이후, 이 배양물을 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰(broth) 아가 평판(1%(v/v)의 트립톤, 0.5%(w/v)의 효모 추출물, 0.5%(w/v)의 염화나트륨, 0.1%(w/v)의 글루코즈 및 0.6%(w/v)의 박토-아가(디프코(Difco))에 도말하였다. 평판상에서 생존하는 암파실린 저항성 콜로니를 선별하고 백금 전이 루프(loop)로 긁어내어 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 L-브로쓰 배지에서 200rpm으로 진탕시키면서 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 후에, 세포를 원심분리하여 수확하고, 이로부터 플라스미드 DNA를 알칼리 방법으로 제조하였다. 수득한 플라스미드를 TRA-8의 중쇄에 대해서는 플라스미드 pH62로, TRA-8의 경쇄에 대해서는 플라스미드 pL28로서 지칭하였다. 이들 플라스미드를 갖는 형질전환된 대장균 균주를 대장균 JM109/pH62 및 대장균 JM109/pL28로서 지칭하고, 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 각각 수탁번호 FERM BP-7560 및 FERM BP-7561을 부여받았다. TRA-8의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 이들 DNA의 핵산 서열을 3700 DNA 분석기(아비 프리즘(ABI Prism); 일본 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈(Perkin Elmer Applied Biosystems))를 사용하여 디데옥시 방법으로 확인하였다(상거(Sanger, F.S.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467, 1997])
TRA-8의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열을 각각 서열목록의 서열번호: 21 및 서열번호: 22로 제공하였다. TRA-8의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 각각 서열목록의 서열번호: 23 및 서열번호:24로 제공하였다. 상기 확립된 TRA-8의 중쇄 및 경쇄의 N-말단 아미노산 서열은 정확히 일치하였다. 또한, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 항체들의 아미노산 서열에 대한 데이터베이스와 비교한 결과, 중쇄의 경우 서열번호: 21에서 58번 내지 414번의 뉴클레오티드가 가변 영역을 차지하고, 서열번호: 21에서 415번 내지 1392번의 뉴클레오티드가 항구 영역을 차지하였다. 경쇄의 경우에는 서열번호: 22에서 64번 내지 387번 뉴클레오티드가 가변 영역을 차지하고, 서열번호: 22에서 388번 내지 702번 뉴클레오티드가 항구 영역을 차지하였다. CDR의 위치 및 서열을 또한 데이터베이스에서 상동성을 갖는 서열들을 비교함으로써 밝혀내었다. TRA-8의 중쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열번호: 25, 26 및 27로 나타내었다. TRA-8의 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 각각 서열번호: 28, 29 및 30으로 나타내었다.
실시예 17. TRA-8-항체의 인간화 형태 고안
(1) TRA-8의 가변 영역의 분자 모델링
TRA-8의 가변 영역을 상동성 모델링으로 일반적으로 공지된 방법에 의해 분자 모델링을 수행하였다(문헌[Methods in Enzymology, 203, 121-153, 1991]). X선 결정학으로부터 유래한 3차원 구조를 제공하는 단백질 데이터 뱅크에 등록된 인간 면역글로불린의 가변 영역의 1차 서열(문헌[Nuc. Acid Res., 28, 235-242, 2000])을 상기 결정된 TRA-8의 골격 영역과 비교하였다. 그 결과, 각각 TRA-8의 경쇄 및 중쇄의 골격 영역에 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 1NCD 및 1HIL을 선별하였다. 골격 영역의 3차원 구조를 TRA-8의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 1NCD 및 1HIL의 좌표를 조합하여 "골격 모델"을 수득함으로써 생성하였다. 초티아(Chothia) 등에 의해 정의된 분류법을 사용하여, TRA-8의 CDR들을 다음과 같이 분류하였다: CDRL1, CDRL2, CDRH1 및 CDRH2는 각각 정준 계열 2, 1, 1 및 3에 속하나, CDRL3은 임의의 특정 정준 계열에 속하지 않는다. CDRL1, CDRL2, CDRH1 및 CDRH2의 CDR 루프를 그들의 각각의 정준 계열에 고유한 구조로 고정시켜 골격 모델에 통합시켰다. CDRL3은 토른톤(Thornton) 등(문헌[J. Mol. Biol., 263, 800-815, 1996])의 분류법에 따라 클러스터 8A의 구조를 할당하고, CDRH3은 H3 규칙을 사용하여 k(8)C로 분류하였다(문헌[FEBS letter, 455, 188-197, 1999]). 그 다음 CDRL3 및 CDRH3의 대표적인 구조를 골격 모델에 통합시켰다.
최종적으로, 에너지 관점에서 TRA-8의 가변 영역의 가능한 분자 모델을 수득하기 위해, 바람직하지 않은 원자간 접촉을 제거하여 에너지를 계산하였다. 상기 절차는 상업적으로 입수가능한 통상적인 분자 모델링 시스템 ABM(옥스포드 몰레큘라 리미티드 인코포레이티드(Oxford Molecular Limited, Inc.)을 사용하여 수행하였다. 수득된 분자 모델에 대해서, 구조의 정확성을 프로첵(PROCHECK) 소프트웨어를 사용하여 더욱 조사하였다(문헌[J. Appl. Cryst., 26, 283-291, 1993]).
(2) 인간화된 TRA-8의 아미노산 서열 고안
인간화된 TRA-8 항체를 CDR 이식으로 일반적으로 공지된 방법으로 구축하였다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033, 1989]). 수용자 항체를 골격 영역의 아미노산 상동성에 기초하여 선택하였다. TRA-8의 골격 영역의 서열 을 항체들의 아미노산 서열에 대한 카바트 데이터베이스에서 모든 인간 골격 서열과 비교하였다(문헌[Nuc. Acid Res., 29, 205-206, 2001]). 그 결과, mAb58'CL 항체가 골격 영역에 대해 80%의 가장 높은 서열 상동성을 가짐에 따라 이를 수용자로서 선택하였다. mAb58'CL의 골격 영역의 아미노산 잔기를 TRA-8의 골격 영역의 아미노산 잔기와 나란히 정렬하고, 상이한 아미노산이 사용된 위치들을 확인하였다. 이들 잔기들의 위치를 상기 구성된 TRA-8의 3차원 모델을 사용하여 분석하여, 수용자상에 이식될 공여자 잔기를 퀸(Queen) 등(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033, 1989])에 의해 제공된 기준에 따라 선택하였다. 인간화된 TRA-8의 서열을 수용자 항체인 mAb58'CL에 몇몇 공여자 잔기를 전달함으로써 하기 실시예에 기술된 바와 같이 구축하였다.
실시예 18. 인간화된 항체의 중쇄에 대한 발현 벡터의 구축
(1) 인간화된 TRA-8의 중쇄의 가변 영역 DNA를 포함하는 플라스미드의 구축
인간화된 TRA-8의 활성을 결정하기 위해, 인간화된 TRA-8의 중쇄를 포함하는 플라스미드를 다음과 같이 구성하였다. 그러나, TRA-8의 인간화는 이들 실시예로 한정되는 것은 아님에 유의한다.
서열목록의 서열번호: 31에 나타난 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 중쇄의 아미노산 서열을 인간화시켜, 13번 아미노산(리신), 19번 아미노산(리신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 84번 아미노산(세린), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌) 및 115번 아미노산(류신)을 각각 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글리신, 글리신, 아스파라긴, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 대체하였다.
인간화된 TRA-8의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA를 갖는 플라스미드(서열목록의 서열번호: 31)를 다음과 같이 구성하였다.
PCR을 사용하여 상기에 기술한 것을 각각 포함하는 하기 DNA 서열을 합성하였다.
하기 12개의 올리고뉴클레오티드가 합성되었다.
Figure 112004018557262-pct00009
Figure 112004018557262-pct00010
하기 2개의 PCR 프라이머를 전술한 바와 같이 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00011
IgG-CH1 영역의 N-말단에 분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중쇄의 가변 영역 및 8개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA의 합성을 각각의 PCR 조합을 사용하여 수행하였다.
DNA 단편을 하기와 같이 제조하였다.
PCR 반응 용액의 조성물:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 x 파이로베스트 완충용액II, 10㎕;
dNTP 혼합액, 8㎕;
파이로베스트 DNA 중합효소, 0.5㎕; 및
3차 증류수로 최종 농도 50㎕ 적정.
PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다. 먼저 용액을 94℃에서 5분 동안 가온한 후, 98℃에서 10초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 동안 가온하는 사이클을 7회 반복하였다. 이 과정이 끝난 후에 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가온하였다.
동일한 양의 페놀-클로로포름(물로 포화된 50%부피/부피의 페놀, 48%부피/부피의 클로로포름 및 2%부피/부피의 이소아밀알콜)을 200㎕의 PCR 생성물을 각각 가하고 1분 동안 격렬하게 혼합하였다. 그리고 나서, 혼합액을 10,000 x g로 원심분리하고, 수성층을 회수하여 동일한 양의 클로로포름-이소아밀 알콜(96%부피/부피의 클로로포름 및 4%부피/부피의 이소아밀 알콜)과 혼합하였으며, 이를 다시 10,000 x g로 원심분리하여 수성층을 회수하였다. 이 단락에서 인용된 일련의 단계는 이후에 "페놀 추출"로서 지칭된다.
이어, 회수된 수성층에 대한 에탄올 추출을 수행하였다. 본원에서 사용되고 지칭된 바와 같이, "에탄올 침전"은 1/10부피의 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2) 및 2.5 부피의 100% 에탄올을 처리될 용액에 가하여 혼합하고, 드라이 아이스를 사용하여 혼합액을 냉동시켰다. 이어, 생성된 혼합액을 10,000 x g로 원심분리하여 DNA를 침전물로서 회수하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공 건조시키고, 3차 최소량의 증류수로 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기연동으로 분리하였다. 전기연동 후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 인간화 TRA-8 DNA에 대응하는 DNA 밴드를 면도날을 사용하여 잘라내서 진클린 스핀 키트(Geneclean Spin Kit, BIO 101, CA, USA)를 사용하여 겔로부터 용출하였다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA는 7,500 x g로 원심분리하여 농축하고, 이어 에탄올 침전을 수행한 후, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
생성된 추출된 DNA 각각은 하기와 같이 pGEM-T Easy 벡터를 사용하여 클로닝하였다.
PCR 반응에서 회수된 DNA 단편, 5㎕;
10 x 테크 중합효소 완충용액, 1㎕;
dNTP 혼합액, 1㎕
테크 중합효소(5 단위/㎖), 1㎕; 및
2차 증류수로 최종 체적 10㎕ 적정.
상기 용액 각각을 70℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 제작사의 프로토콜에 따라 DNA 연결 키트 버젼 2.0(DNA Ligation Kit version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 각 DNA 용액과 pGEM-T Easy 벡터를 연결하였다.
15℃에서 4시간 동안 배양한 후, 2㎕의 배양된 반응 용액을 1 내지 2 x 109 세포/㎖의 세포 농도(Takara Shuzo Co., Ltd.)의 100㎕의 컴피턴트 대장균 균주 JM109와 혼합하고, 혼합액을 얼음에 30분 동안 방치하고 나서, 42℃에서 30초 동안 방치하고, 다시 1분 동안 얼음에 방치하였다. 이어, 500㎕의 SOC 배지(2% 부피/부피의 트립톤, 0.5%중량/부피의 효모 추출물, 0.05%중량/부피의 염화나트륨, 2.5mM중량/부피의 염화칼륨, 1mM의 염화마그네슘 및 20mM의 글루코즈)에 혼합액을 가하여 교반하면서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 이어, 형질전환 균주를 분리하였고, "분자 클로닝 실험실용 설명서(Molecular Cloning A Laboratory Manual)"에 기술된 바와 같이 상기 균주로부터 플라스미드 DNA을 수득하였다. 인간화 TRA-8의 중쇄를 코딩하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 3700 DNA 분석기(3700 DNA 어낼라이저(Analyzer), 아비 프리즘; 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈, 일본)를 이용하는 디데옥시 방법(생거(Sanger, F. S.)등(1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467)으로 확인하였다.
생성된 플라스미드는 pHB14(인간화 TRA-8의 중쇄를 코딩하는 cDNA를 갖는 플라스미드)로 명명되었다. 이들 플라스미드를 정착하는 대장균 형질전환 균주(대장균 JM109/pHB14로 명명됨)를 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 수탁번호 FERM BP-7556을 부여받았다.
(2) 인간화 TRA-8의 중쇄의 가변 영역 DNA를 갖는 발현 플라스미드의 구축
하기와 같이 인간화 TRA-8의 중쇄(상기에서 클로닝됨)를 코딩하는 DNA를 삽입하여 동물 세포용 제조합 발현 벡터를 제조하였다.
인간화 항-Fas 단일클론성 항체 HFE7A 및 인간 IgG1 불변 영역 게노믹 DNA를 갖는 포유동물 세포용 벡터인 플라스미드 pSRHHH3(EP 특허공개 제 0-909-816 호)의 1㎕를 제한효소 HindIII 및 ApaI으로 절단하고 3% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 전기영동 후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 인간화 HFE7A의 중쇄의 가변 영역은 없으면서 인간 IgG1 불변 영역 게노믹 DNA을 갖는 벡터 DNA 밴드를 면도날을 사용하여 잘라내고, 진클린 스핀 키트(BIO 101, CA, USA)를 사용하여 겔로부터 용출하였다. 페놀 추출 후에, 용출된 DNA를 7,500 x g로 원심분리하여 농축한 후 에탄올 침전을 수행하였으며, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해켰고, CIP를 사용하여 탈인산화하였다. DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 인간화 TRA-8의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 DNA을 함유하는 1㎍의 pHB14 DNA 단편과 생성된 절단되고 탈인산화된 플라스미드(100ng)를 연결하였으며, 이를 또한 HindIII 및 ApaI으로 절단하였다. 이어, 연결 혼합액을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰고, 이어 이를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 아가 평판에 도말하였다.
50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 2㎖의 액체 LB 배지에서 이 방법으로 생성된 형질전환체를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 이어, 알칼리-SDS 방법으로 생성된 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.
추출된 플라스미드 DNA를 HindIII 및 ApaI으로 절단하고, 3% 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 인간화 TRA-8의 중쇄의 가변 영역을 코딩하는 삽입 DNA의 유무를 확인하였다. 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 DNA 염기서열분석에 의해 벡터내의 목적하는 DNA 단편의 삽입 및 방향성을 확인되었다. 인간화 TRA-8의 중쇄를 코딩하는 cDNA를 갖는 생성된 발현 플라스미드를 pHB14-1로 명명하였다.
실시예 19. 인간화 항체의 경쇄의 발현 벡터의 구축
(1) TRA-8 인간화 항체의 경쇄의 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열번호: 46에 지시된 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경쇄의 아미노산 서열을 인간화할 경우에, TRA-8 경쇄의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번 아미노산(히스티딘), 9번 아미노산(리신), 10번 아미노산(페닐알라닌), 11번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(트레오닌), 20번 아미노산(세린), 42번 아미노산(글루타민), 43번 아미노산(세린), 60번 아미노산(아스파르트산), 63번 아미노산(트레오닌), 77번 아미노산(아스파라긴), 78번 아미노산(발린), 80번 아미노산(세린), 83번 아미노산(류신), 85번 아미노산(아스파르트산), 87번 아미노산(페닐알라닌), 99번 아미노산(글리신), 103번 아미노산(류신) 및 108번 아미노산(알라닌)을 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 리신, 알라닌, 세린, 세린, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 각각 치환하였다. 생성된 서열을 LM2로 명명하였다.
항-인간 DR-5 항체 TRA-8의 인간화 경쇄의 아미노산 서열의 이 같은 유형을 갖는 발현 벡터를 하기와 같이 제조하였다.
1) 인간화 TRA-8의 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
PCR 조합을 사용하여 LM2 폴리펩티드 서열(서열목록의 서열번호: 46)을 코딩하는 DNA를 각각 합성하였으며, 이들 서열 각각은 인간화 항-DR5 항체 TRA-8의 가변 영역과 인간 IgG 경쇄(κ쇄)의 불변 영역을 융합한 것이다.
7AL1P(서열번호: 47) 및 7ALCN(서열번호: 48)에 더해서, PCR을 위한 하기 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00012
2) 플라스미드 pCR3.1/M2-1의 구축(인간화 TRA-8 경쇄의 클로닝)
서열 목록의 서열번호: 46에서 정의된 아미노산 서열을 암화화하는 동일한 서열 목록의 서열번호: 55에서 정의된 LM2-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행함으로써 제조하고, 플라스미드 벡터에 삽입하여 대장균에서 클로닝하였다.
a) 제 1 단계 PCR
분비 신호 서열 및 5'-말단에 부가된 HindIII 제한효소 절단 부위를 갖는 FRL1 영역의 일부를 코딩하는 LM2-F1-DNA 단편을 하기 조건하에서 제조하였다. 주형 플라스미드 pHSGHM17 및 pSRPDHH를 유럽 특허공개 0 909 816 호에 기술한 방법에 따라 수득하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pHSGHM17 DNA(유럽 특허공개 0 909 816 호), 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR11, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(Perkin Elmer), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
FRL1, CDRL1, FRL2 및 CDRL2를 코딩하는 LM2-F2-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pL28 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF11, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR12, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(퍼킨 엘머), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
CDRL2, FRL3 및 CDRL3의 일부를 코딩하는 LM2-F3-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pDRPDHH DNA(유럽 특허공개 0 909 816 호), 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF22, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR22, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 2차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
CDRL3 및 FRL4 및 3'-말단에 부가된 EcoR1 제한효소 절단 부위를 갖는 불변 영역을 코딩하는 LM2-F4-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
플라스미드 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCF12, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(퍼킨 엘머), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 이후에 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 염색시켜 자외선하에서 DNA를 검출하였다. 검출된 개개의 DNA 밴드는 면도날로 잘라냈다.
b) 제 2 단계 PCR
상기에서 기술한 LM2-F1-DNA, LM2-F2-DNA, LM2-F3-DNA 및 LM2-F4-DNA 단편이 융합되어 있는 LM2-DNA를 하기 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성물:
제 1 단계에서 제조된 LM2-F1-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F2-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F3-DNA의 겔 단편,
제 1 단계에서 제조된 LM2-F4-DNA의 겔 단편
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 혼합물, 5㎕
10 x PCR 완충용액, 5㎕
암플리테크 DNA 중합효소(퍼킨 엘머), 2.5 단위
상기 조성물을 갖는 반응 용액에 3차 증류수를 가하여 최종 부피를 50㎕로 조정하고 PCR용으로 사용하였다.
PCR 온도 조건: 2분 동안 94℃로 가온, 이후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72 ℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복 수행, 이어 10분 동안 72℃로 가온함.
제조사의 프로토콜에 따라 유케리오틱 TA 클로닝 키트(Eukaryotic TA cloning Kit, Invitrogen)을 사용하여 상기에서 제조된 LM2-DNA 단편을 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트내에 포함된 컴피턴트 대장균 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열을 3700 DNA 분석기(아비 프리즘; 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템즈, 일본)를 이용하는 디데옥시 방법(생거(Sanger, F. S.)등(1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74; 5463-5467)으로 확인하였다.
생성된 플라스미드를 pCR3.1/M2-1(인간화 TRA-8의 경쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 갖는 플라스미드)로 명명하였다.
LM2-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/M2-1을 제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하였다.
DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여 1㎍의 클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA을 제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하고, CIP로 탈인산화시켰다. 생성된 탈인산화된 pHSG399 DNA 단편 및 LM2-DNA 단편(제한 효소 HindIII 및 EcoR1로 절단됨)을 연결하였다. 이어, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, 이를 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 함유하는 LB 아가 배지에 도말하였다. 수득된 흰색 형질전환체를 50㎍/㎖의 클로람페니콜이 함유한 액체 LB 배지에 배양하였고, 알칼리-SDS 방법에 따라 생성된 배양액으로부터 플라스미드 DNA을 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA을 HindIII 및 EcoR1로 절단하였고, 이어, LM2-DNA 단편을 갖는 클론을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 선발하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM2 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ 쇄의 불변 영역의 융합 단편을 갖는 플라스미드 pHSG/M2-1-4를 수득하였다. 이들 플라스미드를 정착시키고, 대장균 DH5α/pHSG.M2-1-4로서 명명된 대장균 형질전환 균주를 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 국제 특허 미생물 기탁기관인 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지에 2001년 4월 20일자로 기탁하여 수탁번호 FERM BP-7563을 부여받았다.
3) 플라스미드 pSR/M2-1(인간화 LM2 TRA-8 경쇄의 발현 플라스미드)의 구축
인간화 LM2 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ 쇄의 불변 영역을 갖는 수득된 플라스미드 pHSG/M2-1-4를 제한효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하였다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허공개 제 0-909-816 호)을 제한효소 HindIII 및 EcoR1로 절단하고, 이어 CIP로 탈인산화시켰다. DNA 연결 키트 버젼 2.0(Takara Shuzo Co., Ltd.)을 사용하여, 생성된 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M2-1-4로부터 수득된 HindIII-EcoR1 DNA 단편을 연결하였다. 이어, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환시키고, LB 아가에 도말하였다. 수득된 형질전환체를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하였고, 알칼리-SDS 방법에 따라 생성된 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저; 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 DNA 염기서열분석에 의해 pSRPDHH 벡터내에 목적하는 DNA 단편의 삽입 및 방향성을 확인하였다.
인간화 TR-8의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 갖는, 생성된 발현 플라스미드를 pSR/M1로 명명하였다
실시예 20. 인간화 항체의 생산
상기에서 수득된 인간화 TRA-8 중쇄 및 인간화 TRA-8 경쇄의 발현 벡터로 Cos-7 세포, 즉 원숭이 신장에서 유래한 세포주의 형질감염은 키트와 함께 제공되는 사용 설명서에 따라 FUGENE6 형질감염 시제 방법(베링거 만하임 바이오케미카(Boehringer Mannheim Biochemica))에 의해 수행되었다.
Cos-7 세포(아메리칸 타입 컬처 컬렉션 CRL-1651)는 10%의 소 태아 혈청(이하, "FCS"로서 약으로서 지칭됨; 모어게이트(Moregate))으로 추가된 둘베코스 모디파이드 이글 배지(이하, "D-MEM"으로서 지칭됨; 깁코 BRL)를 함유하는 배양 접시(배양 면적:57㎠; Sumitomo Bakelite)에서 성장하면서 반-융합체(semi-confluent, 3 x 106 세포/접시)를 형성하였다.
동시에, 알칼리-SDS 방법 및 염화세슘 농도 구배 원심분리에 의해 제조된 10㎍/접시(총 5개의 접시)의 인간화 DR5 중쇄의 발현 벡터 DNA(pHA15-1) 및 10㎍/접시의 인간화 DR5 경쇄의 발현 벡터 DNA를 혼합하고 나서 에탄올로 침전시켰으며, 이어 5㎕/접시의 dH2O에 현탁하였다.
15㎕/접시의 FUGENE6 형질감염 시약을 FCS가 없는 180㎕/접시의 D-MEM과 혼합한 후에, 이 FUGENE6 용액(185㎕/접시)을 10㎕/접시의 인간화 DR5 중쇄의 발현 플라스미드 DNA 및 10㎕/접시의 인간화 DR5 경쇄의 발현 플라스미드 DNA를 함유하는 5㎕/접시의 DNA 용액과 혼합하였다. 실온에서 15분 동안 배양한 후에, 생성된 플라스미드 현탁액(200㎕)을 이전에 제조된 Cos-7 평판에 가하였다. 37℃에서 24시간 동안 5% CO2 존재하에서 배양한 후에, 배양 배지를 FCS가 없는 D-MEM으로 바꾸어 주었다. 37℃에서 72시간 동안 5% CO2 존재하에서 배양한 후에, 배양 상층액을 회수하여 상층 유동액중의 발현 생성물을 정제하였다. 상기에 기술한 방법에 따라, Cos-7 세포를 각각의 하기 플라스미드 조합으로 형질감염시켰다:
(A): 플라스미드 DNA 없음
(B): pHB14-1 및 pSR/M2-1의 동시 형질감염
이어, 배양액을 원심분리(1,000r.p.m에서 5분)하여 상층액을 수집하였다. 상층액을 다시 원심분리(9,800r.p.m에서 15분)하고, 0.45㎛ 필터(어드밴텍 도요 디스믹(ADVANTEC TOYO DISMIC)-25cs, 카탈로그 넘버 25CS045 AS)로 여과하였다. 프로테인 G-포로스(PROTEIN G-POROS) 친화성 크로마토그래피(어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 하기의 조건에서 같이 여액으로부터 IgG를 정제하였다:
HPLC: BioCAD 700E(어플라이드 바이오시스템즈)
컬럼: 단백질G-ID 감지기 카트리지(컬럼 크기:2.1 ㎜ID x 30㎜ LD, 층부피: 0.1㎖; 카탈로그 넘버 2-1002-00, 어플라이드 바이오시스템즈)
용출 완충용액: 0.1M 글리신-HCl(pH 2.5)
중화 완충용액: 1M 트리스-HCl(pH 8.5)
검출: 280㎚
유속:1㎖/분
분획 크기: 0.5㎖/0.5분
분획 시험관:1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로시험관
온도:4℃
모든 여액을 컬럼에 적용한 후에, 30㎖의 PBS(Sigma, 카탈로그 넘버 1000-3)을 사용하여 컬럼을 세척하였다. 용출 완충용액이 적용될 때, 분획 수집기가 작동한다. 각 분획 마이크로시험관은 이미 PBS내에 55㎕의 1M NaCl, 110㎕의 중화 완충용액 및 74㎕의 2㎎/㎖ 우 혈청 알부민(Sigma, 카탈로그 넘버 A-7030)을 함유하고 있었다. 8 내지 10번 분획을 수집하여 슬라이드-A 라이저(Slide-A lyzer, Pierce, 카탈로그 넘버 66450)를 사용하여 4℃에서 1일 동안 1ℓ의 PBS에서 투석하였다. 투석 완충용액을 2회 바꿔주었다.
항-인간 IgG에 대한 항체를 사용하여 ELISA에 의해 인간화 항체의 발현을 확인하고 제조된 배양액 상층 유동액중의 발현 생성물의 양적 측정을 수행하였다.
96 웰 평판(MaxiSorp, Nunc)의 각 웰에 흡수 완충용액(0.05M 탄화수소 나트륨, 0.02%, 아지드 나트륨, pH 9.6)에 0.5㎕/㎖의 최종 농도로 용해된 100㎕의 염소 항-인간 IgG Fc 특이 다클론성 항체(Kappel)를 가하였고, 평판을 37℃에서 2시간 동안 배양하여 항체를 흡수하게 하였다. 이어, 평판을 0.05% 트윈-20(바이오라드)을 함유하는 350㎕의 PBS(-)(이하, "PBS-T"로서 지칭됨)로 5회 세척하였다. 세척한 후 웰에 10% FCS를 함유하는 D-MEM으로 희석된 배양액 상층액을 가하였고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS-T로 다시 세척한 후에, PBS-T로 10,000배 희석된 100㎕의 알칼리 탈인산화효소-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 특이 다클론성 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab.))를 각 웰에 가하였고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS-T로 다시 세척한 후에 알칼리 탈인산화효소 기질 키트(Alkaline Phosphatase Substrate Kit, 바이오라드)로부터 수득된 p-니트로페닐 포스페이트의 기질 용액을 키트와 함께 제공되는 사용 설명서에 따라 가하였다. 37℃에서 0.5 내지 1시간 동안 배양한 후에 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서 10% FCS를 함유하는 D-MEM으로 특정 농도로 희석된 인간 플라즈마 면역글로빈 G 하위클라스1(IgG1)(Biopure AG)을 배양 상층 유동액에 함유된 인간화 DR5 항체의 농도 기준 샘플로서 사용하였다.
그 결과, 배양 상층액에서 발현 및 정제된 생성물을 항 인간 IgG 항체로 특이적으로 검출하였다. 인간 IgG 항체의 양은 8.96㎍(800㎕)이었다.
실시예 21. 인간화 항체의 세포사멸-유도 활성
위르캣 세포(ATCC TIB-152)를 사용하여 정제된 인간화 TRA-8 항체의 세포사멸-유도 활성을 측정하였다.
5% CO2존재하에서 37℃에서 3일 동안 10% FCS(깁코 BRL)를 함유한 RPMI1640 배지에서 배양된 위르캣 세포를 96-웰 마이크로평판(Sumitomo Bakelite)의 각 웰에 웰당 50㎕씩 분주하였다. 실시예 20에서 제조된 인간화 TRA-8을 실시예 20에 기술 한 방법에 따라 유동액중의 이들의 농도를 측정함으로써 10% FCS를 함유하는 RPMI1640 배지로 목적하는 최종 생성물의 농도를 100ng/㎖로 조정하였다. 100ng/㎖로 조정된 발현 생성물의 용액 각각을 사용하여, 10% FCS를 함유하는 RPMI1640으로 연속적인 2배 희석을 반복함으로써 일련의 희석액을 제조하였다. 희석된 인간화 TRA-8 용액 각각을 각 웰에 웰당 50㎕씩 가하였다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후에, 1㎎/㎖의 XTT(2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-2H-테트라졸륨-5-카르복시아닐라이드 분자내 염; 시그마 케미칼즈 캄파니)를 함유하는 50㎕의 25μM PMS(페나진 메토설페이트, 시그마 케미칼즈 캄파니)를 가하였다(XTT에 대해 250㎍/㎖의 최종 농도 및 PMS에 대해 5μM/㎖의 최종 농도). 3시간 동안 배양한 후에, 450㎚에서 각각의 웰의 흡광도를 측정하여, 미토콘드라아의 감소 능력을 지표로서 사용함으로써 세포의 생존율을 계산하였다.
각 웰에서의 세포의 생존율은 하기 수학식 1에 따라 계산되었다:
생존율(%) = 100x(a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 측정값이고;
"b"는 어떠한 세포도 없는 웰의 측정값이며;
"c"는 어떠한 항체도 첨가하지 않은 웰의 측정값이다.
그 결과, 실시예 20에서 제조된 발현 생성물(인간화 TRA-8)은 인간 DR5 항원을 발현시키는 T 임파구 세포주의 세포에서 세포사멸을 유도하는 것으로 증명되었 다.
실시예 22. 다양한 DR5 분자에 대한 TRA-8의 반응성
다양한 DR5 분자에 대한 TRA-8의 반응성을 측정하기 위해 다음과 같이 활성화된 림프구를 사용하여 TRA-8의 반응성을 검사하였다.
먼저, 말초혈 샘플을 인간(30㎖), 명주원숭이(3㎖) 및 게잡이원숭이(20㎖)로부터 채취하였다. 상기 말초혈 샘플은 이들에 첨가된 1㎖의 헤파린(노보헤파린(Novoheparin; Novo)을 포함하고, 이어서 상기 샘플을 동일 부피의 피콜-파크(Ficoll-Paque) PLUS 용액(아머샴 파마시아 바이오테크) 1.072의 비중을 갖는 게잡이원숭이를 제외하고는 모두 비중이 1.077임) 위에 천천히 적층시키고, 말초혈 단핵구 세포 분획을 수득하기 위해 1,700rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 이 단핵구 세포 분획을 행크스(Hanks) 균형 염 용액으로 2회 세척한 후, 세포 밀도가 1x106 cell/㎖가 되도록 10% v/v FCS를 포함하는 RPMI 1640 배지 중에 현탁시켰다. 피토헤마글루티닌-P(PHA-P, 시그마 케미칼즈 캄파니(Sigma Chemicals, Co.))를 최종 농도가 5㎍/㎖가 되도록 생성된 현탁액에 첨가하고, 샘플을 37℃에서 5% v/v CO2 하에 24시간동안 배양하였다. 24시간 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고 세척하고 10% v/v FCS를 함유한 RPMI 1640 배지 중에 재현탁시켰다. 이어서, 회수된 세포를 활성화하기 위해 인터루킨-2(아머샴 파마시아 바이오텍)를 최종 농도가 10 유니트/㎖가 되도록 상기 현탁액에 첨가하고, 이를 37℃에서 5% v/v CO2 하에 72시간동안 배양하였다.
1x106개의 활성화된 림프구 세포를 함유하도록 계산된 활성화된 제제의 양을 시험관에 넣고 PBS 1㎖ 당 TRA-8을 0.5, 1, 5, 10㎍ 함유하는 각각의 용액 50㎕ 또는 PBS 50㎕ 중에 현탁시켰다. 생성된 현탁액을 얼음 위에서 1시간동안 방치한 후, 세포를 PBS 500㎕ 분취액으로 3회 세척한 후 PBS 1㎖ 당 FITC-표지된 항-마우스 IgG 항체(바이오리소스(Bioresource))의 용액 50㎕ 중에 현탁시켰다. 대조군으로서 PBS 500㎕ 중에 현탁된 세포를 사용하여, 유량 세포분석기(FACS Calibur; 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))를 사용하여 형광 강도를 측정하였다.
형광 강도에 의한 세포수 분포를 얻고 총 세포수에 대한 착색된 세포수의 비를 계산하였다. 또한, 각각의 Kd 값을 TRA-8의 농도 및 총 세포수에 대한 착색된 세포수의 비를 사용하여 계산하였다. 인간, 명주원숭이 및 게잡이원숭이의 활성화된 림프구에 대한 각각의 반응성 빈도는 거의 동일하였다. 따라서 TRA-8은 TRA-8이 원래 제조되었던 것에 비해 인간을 비롯한 광범위한 영장류 DR5와 결합할 수 있다.
실시예 23. 명주원숭이에서의 TRA-8 투여량 증감 연구
TRA-8 투여량 증감 예비 독성 연구는 1마리의 수컷 명주원숭이와 1마리의 암컷 명주원숭이를 사용하여 수행되었다. 1회 정맥내 투여 후 7일간의 투여 중지 기간을 두는 것을 1세트로 하여 이를 3번 실시하였다. TRA-8의 투여량을 50, 250 및 1250㎍/body로 설정하였다. 각각 치료한 후 48 시간 후에 대퇴정맥으로부터 혈액을 모아 플라즈마를 제조하였다. 플라즈마 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성을 분석기(FUJI DRI-CHEML: 후지 필름 메디칼 캄파니 리미티드(Fuji Film Medical Co., Ltd))를 사용하여 측정하였다. 모든 혈액을 어떠한 마취 없이 채취하였다. 그 결과, 각각의 치료 후에 간 손상을 나타내는 흔적이 플라즈마 생화학 검사에서 나타나지 않았다.
실시예 24. 암 세포에 대한 TRA-8의 시험관내 및 생체내 약물학적 연구
TRA-8이 항암 치료에 치료 효능을 갖는지의 여부를 측정하기 위해 다양한 암 세포주를 사용하여 TRA-8의 시험관내 치사 활성을 다음과 같이 검사하였다.
5% CO2의 존재하에 37℃에서 10% FCS(깁코 BRL)를 포함하는 깁코 BRL로부터 수득된 RPMI1640 배지(위르캣의 경우), DMEM 배지(HCT-116의 경우), MEM-R(WiDr의 경우), 또는 DMEM-F12(COL2-Jck의 경우)에서 배양된 다양한 암 세포(2x103 내지 8x103 cell/50㎕)를 96개 웰 마이크로평판(스미토모 바켈라이트(Sumitomo Bakelite))의 각각의 웰에 분배하였다. 10% FCS를 함유한 배지와 함께 관심있는 최종 생성물의 농도가 100ng/㎖가 되도록 TRA-8을 조절하였다. TRA-8 용액(100ng/㎖)을 10% FCS를 함유한 배지로 연속 2배 희석시킴을 반복하여 일련의 희석액을 만들었다. 각각의 희석된 TRA-8 용액을 각 웰에 웰 당 50㎕로 첨가하고 37℃에서 배양하였다. 37℃에서 72시간동안 반응시킨 후, 1㎎/㎖의 XTT를 함유한 25μM PMS(페나진 메토설페이트; 시그마 케미칼 캄파니) 50㎕를 첨가하였다(XTT의 최종 농도 250㎍/㎖ 및 PMS 5μM). 3시간동안 배양한 후, 각 웰의 450㎚에서의 흡광도를 측정하고 미토콘드리아의 감소능을 지수로서 사용하여 세포 생존율을 계산하였다.
각 웰에서의 세포 생존율을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다:
수학식 1
생존율(%)=100(a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 측정값이고;
"b"는 어떠한 세포도 없는 웰의 측정값이며;
"c"는 어떠한 항체도 첨가하지 않은 웰의 측정값이다.
결과를 하기 표 3에 나타내었다:
Figure 112004018557262-pct00013
다양한 암 세포주는 시험관내 조건하에서 TRA-8에 의해 강하게 세포사멸 유도된다.
또한, WiDr 세포가 이식된 누드 마우스에서의 TRA-8의 생체내 항암 효과를 측정하였는데, TRA-8이 래트과 DR5와 교차반응하지 않기 때문이다.
TRA-8 항-인간 DR5 항체를 인간 DR5 분자를 발현시키는 인간 이종이식편을 갖고 있는 누드 마우스에 투여하였다. 사용된 마우스는, 인간 결장암 세포주 WiDr(5㎜3)가 이식된 6주된 BAL b/c 누드/누드 마우스(암컷, 클리아 재팬 인코포레이티드(Clea Japan Inc.))였다. 종양 이식 후, 이식된 마우스를 매일 TRA-8(5㎍/body)의 관절내 주사로 14 회까지 치료하였다. WiDr 종양 성장은 종양 덩어리의 크기로 매일 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다:
Figure 112004018557262-pct00014
이러한 방식으로, 치료하지 않은 모든 동물에서는 명백한 종양 성장이 나타났지만 TRA-8로 치료한 동물에서의 종양 성장은 종양의 크기에 의해 나타난 바와 같이 저해되었다. 이러한 결과로 TRA-8이 생체내 종양 세포의 제거에 효과적임을 알 수 있었다.
실시예 25. TRA-8의 조합 연구
인간 전립선암 세포주 PC-3은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 수득되고, 10% 태아 소 혈청(FBS, 하이클론(Hyclone)), 1% L-글루타민-200mM(25030-149, 깁코 BRL) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액(P-7539, 시그마)을 함유한 F-12K 양분 혼합물(21127-022, 깁코 BRL)에서 유지되었다. 10% FBS 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 부가된 RPMI1640 배지(MED-008, IWAKI)를 다음의 실험에서 사용하였다. 지수적으로 성장하는 PC-3 세포를 트립신 처리에 의해 수거하고 신선한 배지로 2회 세척하였다. 이어서 세포를 계측하고 신선한 배지 중에 5x104 cell/㎖의 밀도로 재현탁시키고, 실험하기 하루 전날 100㎕/웰의 총 부피로 바닥이 평평한 96개 웰 평판(3598, 코닝-코스터(Corning-Coster))에 3중으로 분포시켰다. 디메틸설폭시드에 용해된 대표적인 항암 약물인 파클리탁셀(Paclitaxel)(169-18611, 와코(Wako))(10㎎/㎖)을 신선한 배지로 희석한 후, 웰 당 50㎖의 세포를 함유한 96개 웰 평판에 첨가하였다. 디메틸설폭시드의 최종 농도는 0.1% 미만이었다. 5% CO2 대기하에서 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 신선한 배지로 희석된 TRA-8을 웰에 첨가하였다. 추가로 24시간동안 배양한 후, 1㎎/㎖의 XTT 및 25μM의 PMS를 함유한 최소한의 필수 배지(11095-0098, 깁코 BRL) 50㎕를 웰에 첨가하고, 평판을 6시간동안 배양하였다. OD450을 스펙트라 맥스(SPECTRA MAX 250)(Molecular Devices)에 의해 측정하고 세포 생존율을 하기 수학식 2에 따라 계산하였다:
Figure 112004018557262-pct00015
대표적인 항암 약물인 파클리탁셀과 조합된 TRA-8에 관한 상기 검정의 결과는 다음과 같다. 파클리탁셀은 PC-3 세포의 세포 생존율을 감소시켰지만, 40% 이하의 신호는 200nM 이하의 농도에서도 여전히 살아있는 암세포가 존재함을 나타낸다. 특히, 0.1ng/㎖의 TRA-8을 첨가하면 암 세포의 세포 생존율이 10% 이하까지 크게 감소되었지만, 이 농도의 TRA-8을 단일 적용한 후에는 세포 생존율의 감소가 나타나지 않았다. 이 결과는 TRA-8이 다른 항암 약물과 조합된 경우에 상승작용적으로 항암 활성을 나타내는 것임을 명백히 보여준다.
실시예 26. TRA-8의 다른 유형의 인간화 항체 분석
(1) 인간화 항체의 설계
TRA-8의 인간화 버젼은 일반적으로 CDR 이식으로서 공지된 방법에 의해 제조되었다. mAB58'CL 항체를 참고 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수용체로서 사용하고 TRA-8 항체의 CDR 영역을 수용체 상에 이식하였다. 골격 영역에서, 퀸(Queen) 등이 제공한 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989))에 의해 TRA-8 또는 인간 컨센서스 서열에서 나온 몇몇 아미노산을 수용체 상에 이식하고, 인간화 TRA-8 서열을 하기 기술된 바와 같이 제조하였다.
(2) 다른 유형의 인간화 또는 마우스 TRA-8의 중쇄의 가변 영역 DNA를 갖는 플라스미드의 구축
서열목록의 서열번호: 56에 지시된 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 중쇄의 아미노산 서열을 H1형 인간화하여 3번 아미노산(메티오닌), 13번 아미노산(리신), 19번 아미노산(리신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 84번 아미노산(세린), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글리신, 글리신, 아스파라진, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 59에 지시된 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 중쇄의 아미노산 서열을 H3형 인간화하여 13번 아미노산(리신), 19번 아미노산(리신), 40번 아미노산(트레오닌), 42번 아미노산(글루탐산), 44번 아미노산(아르기닌), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 글리신, 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 60에 지시된 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 중쇄의 아미노산 서열을 H4형 인간화하여 13번 아미노산(리신), 19번 아미노산(리신), 88번 아미노산(세린), 93번 아미노산(메티오닌), 114번 아미노산(트레오닌), 115번 아미노산(류신)을 글루타민, 아르기닌, 알라닌, 발린, 류신 및 발린으로 각각 대체하였다.
서열목록의 서열번호: 61에 지시된 바와 같이, 재조합 TRA-8의 중쇄의 가변 영역 DMA를 전달하는 플라스미드를 "M형"으로서 지칭하였다. 또한 실시예 17 및 18에 기술된 인간환 TRA-8을 "H2형"으로서 지칭하였다.
인간화 또는 재조합 TRA-8의 DNA 코딩 중쇄의 가변 영역을 전달하는 플라스미드는 다음과 같이 제조되었다.
PCR을 사용하여 하기 기술된 바와 같이 구성된 각각의 DNA 서열을 제조하였다.
하기 24개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00016
Figure 112004018557262-pct00017
Figure 112004018557262-pct00018
하기 2개의 PCR 프라이머를 전술한 바와 같이 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00019
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중쇄의 가변 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H1형 DNA 코딩 폴리펩티드 쇄의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H1형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트(Pyrobest) 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 2차 증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분 동안 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 2차 증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. H1형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 진클린 스핀 키트(미국 캘리포니아주 BIO 101)를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중쇄의 가변 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H3형 DNA 코딩 폴리펩티드 쇄의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H3형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 2차 증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분 동안 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가열하였다.
페놀 추출 및 에탄올 침전 후, 생성된 DNA 침전물을 진공하에 건조시키고, 최소량의 2차 증류수에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움 브로마이드의 1㎍/㎖ 수용액으로 착색시켜 자외선하에 DNA를 검출할 수 있게 하였다. H3형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도칼로 절단하고, 진클린 스핀 키트를 사용하여 겔로부터 용출시켰다. 페놀 추출 후, 용출된 DNA를 7,500Xg에서의 원심분리에 의해 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 마지막으로 5㎕의 증류수에 용해시켰다.
분비 신호 서열, 인간화 TRA-8 중쇄의 가변 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단에 있는 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 H4형 DNA 코딩 폴리펩티드 쇄의 합성은 각각 PCR의 조합을 사용하여 수행되었다.
H4형-DNA 단편은 다음과 같이 제조되었다.
PCR 반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
50㎕의 최종 부피가 되도록 만드는데 필요한 2차 증류수.
PCR 반응은 다음과 같이 수행되었다. 먼저 용액을 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 1분 동안 가열하는 순환을 7번 반복하였다. 상기 과정을 완결한 후, 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가열하였다.
페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후, 생성된 DNA 침전물을 진공에서 건조시키고, 최소량의 2차 증류된 물에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리시킨다. 전기영동한 후, 겔을 1㎍/㎖의 에티디움 브로마이드 수용액으로 염색시켜 UV 광 하에서 DNA가 검출될 수 있게 한다. H4 유형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도날을 이용하여 절단하고, 진클린 스핀 키트를 이용하여 겔로부터 용출시킨다. 페놀로 추출한 후, 용출된 DNA를 7,500xg에서 원심분리하여 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해시킨다.
분비 신호 서열, 키메릭 TRA-8 중쇄의 가변 영역 및 IgG-CH1 영역의 N-말단의 8개의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 M 유형 DNA를 각각 PCR의 조합을 이용하여 합성한다.
M 유형 DNA 단편을 다음과 같이 제조한다.
PCR 반응 용액의 조성:
올리고뉴클레오티드 A, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 B3, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 C2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 D, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 E3, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 F2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 G, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 H3, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 I2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 J, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 K3, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 L2, 10pmol;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P1, 2μM;
올리고뉴클레오티드 프라이머 P2, 2μM;
10 X 피로베스트(Pyrobest) 완충액 II, 10㎕;
dNTP 혼합물, 8㎕;
피로베스트 DNA 폴리머라제, 0.5㎕; 및
최종 부피가 50㎕가 되게 하는 양의 2차 증류수.
PCR 반응을 다음과 같이 수행한다. 용액을 먼저 94℃에서 5분 동안 가열한 후, 98℃에서 10초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분 가열하는 사이클을 7회 반복한다. 이 과정이 종료된 후, 반응 용액을 72℃에서 15분 동안 가열한다.
페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨 후, 생성된 DNA 침전물을 진공에서 건조시키고, 최소량의 2차 증류된 물에 용해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리시킨다. 전기영동한 후, 겔을 1㎍/㎖의 에티디움 브로마이드 수용액으로 염색시켜 UV 광 하에서 DNA가 검출될 수 있게 한다. M 유형-DNA에 상응하는 DNA 밴드를 면도날을 이용하여 절단하고, 진클린 스핀 키트를 이용하여 겔로부터 용출시킨다. 페놀로 추출한 후, 용출된 DNA를 7,500xg에서 원심분리하여 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해시킨다.
생성된, 각각의 추출된 DNA(H1 유형, H3 유형, H4 유형 및 M 유형)를 다음과 같이 pGEM-T 이지 벡터(프로메가 제품)를 이용하여 클로닝한다:
PCR 반응으로부터 회수한 DNA 단편(H1, H3, H4 또는 M), 5㎕;
10 X 택(Taq) 폴리머라제 완충액, 1㎕;
dNTP 혼합물, 1㎕;
택 폴리머라제(5유니트/㎖), 1㎕; 및
최종 부피가 10㎕가 되게 하는 양의 2차 증류수.
상기 각각의 용액을 70℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 각각의 DNA 용액 및 pGEM-T 이지 벡터를 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드(Takara Shuzo Co., Ltd.)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 연결시킨다.
15℃에서 4시간동안 항온배양한 후, 2㎕의 항온배양된 반응 용액을 1㎖당 1-2x109개의 세포가 있는 세포 밀도의 컴피튼트(competent) 대장균(E.Coli) 균주 JM109(다카라 스조 캄파니 리미티드) 100㎕와 혼합하고, 혼합물을 30분 동안 얼음에서, 42℃에서 30초간 그리고, 얼음 중에서 1분 동안 방치한다. 그런 다음, 500㎕의 SOC 배지(2% v/v 트립톤, 0.5%w/v 효모 추출물, 0.05% w/v 염화나트륨, 2.5mM w/v 염화 칼륨, 1mM 염화 마그네슘 및 20mM의 글루코즈)를 혼합물에 첨가하고, 이를 진탕하면서 추가 시간동안 배양한다. 그런 다음, 형질전환 균주를 단리하고, 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual"]에 따라 플라스미드 DNA를 균주로부터 제조한다. 인간화(humanized)되거나 또는 래트의 TRA-8의 H 쇄를 코딩하는 이 DNA의 뉴클레오티드 서열을 각각 디데옥시 방법(상거(Sanger, F.S.) 등의 문헌[(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467])에 의해 3700 DNA 어낼라이저(아비 프리즘; 일본의 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스)를 이용하여 확인한다.
생성된 플라스미드를 pHA15(인간화된 TRA-8의 H1 유형 중쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드), pHC10(인간화된 TRA-8의 H3 유형 중쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드), pHD21(인간화된 TRA-8의 H4 유형 중쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드) 및 pM11(키메릭 TRA-8의 중쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드)라 명명한다. 이들 플라스미드를 포함하는 형질전환체 대장균 균주를 대장균 JM109/pHA15, 대장균 JM109/pHC10, 대장균 JM109/pHD21 및 대장균 JM109/pM11로 명명하고, 미생물 기탁에 대한 부다페스트 협약에 따라 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지의 국제 특허 미생물 기탁소에 기탁하였고, 각각 수탁 번호 FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 및 FERM BP-7559를 받았다.
(3) 여러 유형의 인간화되거나 마우스의 TRA-8의 중쇄 가변 영역을 운반하는 발현 플라스미드의 구축
H1 유형, H3 유형 및 H4 유형의 인간화되거나 또는 M 유형의 키메릭 TRA-8(상기에서 클로닝됨)의 중쇄를 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 동물 세포용 재조합 발현 벡터를 구축한다.
인간화된 항-Fas 단일클론성 항체 HFE7A의 중쇄 가변 영역 및 인간의 IgG1 불변 영역 게놈 DNA을 운반하는, 포유동물 세포용 발현 벡터인 플라스미드 pSRHHH3(유럽 특허원 제 EP 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 HindIII 및 ApaI으로 분해시키고, 3% 아가로즈 겔 전기영동으로 분리시킨다. 전기영동한 후, 겔을 1㎍/㎖의 에티디움 브로마이드 수용액으로 염색시켜 UV 광 하에서 DNA가 검출될 수 있게 한다. 인간화된 HFE7A의 중쇄 가변 영역 없이 인간의 IgG1 불변 영역 게놈 DNA를 함유하는 DNA 밴드를 면도날을 이용하여 절단하고, 진클린 스핀 키트를 이용하여 겔로부터 용출시킨다. 페놀로 추출한 후, 용출된 DNA를 7,500xg에서 원심분리하여 농축시키고, 에탄올로 침전시키고, 최종적으로 5㎕의 증류수에 용해시킨후, CIP를 이용하여 탈인산화시킨다. 결과적으로 생성된 분해되고 탈인산화된 플라스미드(100ng)를 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)를 이용하여 (또한 HindIII 및 ApaI을 이용하여 분해된) 인간화되거나 키메릭 TRA-8의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 pM11, pHA15, pHC10 또는 pHD21의 DNA 단편 1㎍과 함께 연결시킨다. 그런 다음, 연결 혼합물을 이용하여 대장균 JM109를 형질전환시킨후, 이를 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 아가 평판상에서 플레이팅한다.
이 방법으로 수득된 형질전환체를 37℃에서 하룻밤동안 50㎍/㎎의 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지 2㎖중에서 배양한 후, 생성된 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법을 이용하여 추출한다.
추출된 플라스미드 DNA를 HindIII 및 ApaI을 이용하여 분해하고, 3% w/v 아가로즈 겔 전기영동하여 인간화되거나 키메릭 TRA-8의 H 쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 삽입체의 존재 유무를 확인한다. 벡터에서 바람직한 DNA 단편의 삽입 및 배향 은 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저; 어플라이드 바이오시스템스)를 이용한 DNA 서열화에 의해 확인된다. 인간화되거나 키메릭 TRA-8의 H 쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 생성된 발현 플라스미드는 각각 pHA15-1, pHC10-3, pHD21-1 및 pM11-1로 명명되었다.
(4) 인간화된 경쇄를 위한 벡터의 구축
(4.1) 인간화된 항체의 경쇄(LM1 유형)용 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열 번호 72에 나타난 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경쇄의 아미노산 서열의 다른 인간화(LM1 유형)는 TRA-8 L 쇄의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 3번째 아미노산(발린), 8번째 아미노산(히스티딘), 9번째 아미노산(리신), 10번째 아미노산(페닐알라닌), 11번째 아미노산(메티오닌), 13번째 아미노산(트레오닌), 20번째 아미노산(세린), 42번째 아미노산(글루타민), 43번째 아미노산(세린), 60번째 아미노산(아스파트산), 63번째 아미노산(트레오닌), 77번째 아미노산(아스파라긴), 78번째 아미노산(발린), 80번째 아미노산(세린), 83번째 아미노산(류신), 85번째 아미노산(아스파트산), 87번째 아미노산(페닐알라닌) 및 99번째 아미노산(글리신), 103번째 아미노산(류신) 및 108번째 아미노산(알라닌)을 각각 글루타민, 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 리신, 알라닌, 세린, 세린, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로 치환함을 포함한다. 생성된 서열을 LM1이라 명명한다.
항-인간 DR5 항체 TRA-8의 이 유형의 인간화된 경쇄 아미노산 서열을 운반하는 발현 플라스미드(LM1 유형, 서열 목록의 서열 번호 72)는 다음과 같이 구축된다.
1) 인간화된 TRA-8의 경쇄의 가변 및 불변 영역(LM1 유형)을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각이 인간화된 항-DR5 항체 TRA-8 L 쇄(LM1 유형)의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄(κ쇄)의 불변 영역의 융합인 LM1 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA(서열 목록의 서열 번호 72)를 각각 PCR의 조합을 이용하여 합성한다.
7AL1P(서열 번호 47), 7ALCN(서열 번호 48), HKCDF11(서열 번호 50), HKCDR12(서열 번호 51), HKCDF22(서열 번호 52), HKCDR22(서열 번호 53) 및 HKCF12(서열 번호 54)에 추가하여, 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성한다:
Figure 112004018557262-pct00020
2) 플라스미드 pCR3.1/LM1-2(인간화된 TRA-8 경쇄 유형 LM1의 클로닝)의 구축
서열 번호 72에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 LM1-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행하여 제조하고, 플라스미드 벡터에 삽입하고 대장균에서 클로닝한다.
a) 제 1 단계 PCR
HindIII 제한 효소 분해 부위가 5' 말단에 첨가되어 있고, 분비 신호 서열 및 FRL1 영역의 일부를 코딩하는 LM1-F1-DNA 단편을 다음의 조건하에서 제조한다. 주형 플라스미드인 pHSGHM17 및 pSRPDHH를 유럽 특허원 제 EP 0 909 816 A1 호의 개시에 따라 수득한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
플라스미스 pHSGHM17 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR12, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택(앰플리택) DNA 폴리머라제(퍼킨 엘머(퍼킨 엘머)), 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
FRL1, CDRL1, FRL2 및 CDRL2의 일부를 코딩하는 LM1-F2-DNA 단편을 다음과 같은 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
플라스미스 pL28 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF11, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR12, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
CDRL2, FRL3 및 CDRL3의 일부를 코딩하는 LM1-F3-DNA 단편을 다음과 같은 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
플라스미스 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDF22, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCDR22, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
3'-말단에 EcoRI 제한 효소 분해 부위가 첨가되어 있고, CDRL3, FRL4 및 불변 영역을 코딩하는 LM1-F4-DNA 단편을 다음과 같은 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
플라스미스 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKCF12, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
PCR 후에 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시킨다. 전기영동한 후, 겔을 1㎍/㎖의 에티디움 브로마이드로 염색시켜 UV 광 하에서 DNA를 검출한다. 이렇게 검출된 각각의 DNA 밴드를 면도날로 잘라낸다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 개시된 LM1-F1-DNA, LM1-F2-DNA, LM1-F3-DNA 및 LM1-F4-DNA 단편이 융합된 LM1-DNA를 다음의 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F1-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F2-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F3-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM1-F4-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 칵테일, 5.0㎕
10XPCR 완충액, 5.0㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
이렇게 제조된 LM1-DNA 단편을 제조자의 프로토콜에 따라 유카리오틱 TA 클로닝 키트(Eukaryotic TA cloning kit; 인비트로겐)를 이용하여 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고, 이 키트에 포함된 컴피텐트 대장균 TOP10F'에 도입한다. 인간화된 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이들 DNA(LM1 유형)의 뉴클레오티드 서열은 3700 DNA 어낼라이저(아비 프리즘, 일본 소재의 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스 제품)를 이용한 디데옥시 방법(상거 등의 문헌[(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467])에 의해 확인된다.
생성된 플라스미드를 pCR3.1/LM1-2라 명명한다(이 플라스미드는 인간화된 TRA-8의 경쇄 가변 영역(LM1 유형) 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 운반한다).
LM1-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM1-2를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해한다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후 CIP로 탈인산화시킨다. 생성된 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM1-DNA 단편(제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시켰음)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시킨다. 그런 다음, 대장균 DH5α를 연결된 DNA를 이용하여 형질전환시키고, 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖의 클로람페니콜(최종 농도)를 함유하는 LB 아가 배지에 도말한다. 수득된 백색 형질전환체를 50㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하고, 알칼리-SDS 방법에 따라 플라스미드 DNA를 생성된 배양액에서 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후, LM1-DNA 단편을 운반하는 클론을 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 선택한다.
상기 과정의 결과로서, 인간화된 LM1 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ의 불변 영역의 융합 단편을 갖는 플라스미드 pHSG/M1-2-2가 수득된다. 이들 플라스미드를 갖고 있는 형질전환 대장균 균주를 대장균 DH5α/pHSG/M1-2-2로 명명하고, 이를 미생물 기탁에 대한 부다페스트 협약에 따라 2001년 4월 20일에 일본 305-5466 이바라키켄, 츠쿠바시, 1 초메, 히가시 1-1 소재의 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지의 국제 특허 미생물 기탁소에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7562를 받았다.
3) 플라스미드 pSR/LM1-2(인간화된 LM1 TRA-8 경쇄용 발현 플라스미드)의 구축
인간화된 LM1 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 수득된 플라스미드 pHSG/M1-2를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허원 제 EP 0 909 816 A1 호)를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후, CIP를 이용하여 탈인산화시킨다. 생성된 탈인산화된 pSRPDHH DNA, 및 pHSG/M1-2-2로부터 수득된 HindIII-EcoRI DNA 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)를 이용하여 연결시킨다. 그런 다음, 대장균 DH5α를 연결된 DNA를 이용하여 형질전환시키고 LB 아가 상에 도말한다. 수득된 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하고, 알칼리-SDS 방법에 따라 플라스미드 DNA를 생성된 배양액에서 추출하였다. pSRPDHH 벡터로의 원하는 DNA 단편의 삽입 및 배향을 유전자 서열 분석기를 이용한 DNA 서열화에 의해 확인한다.
인간화된 LM1 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 생성된 발현 플라스미드를 pSR/LM1-2라 명명한다.
(4.2) 인간화된 항체의 경쇄(LM3 유형)용 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열 번호 73에서 보여지는 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경쇄의 아미노산 서열의 다른 인간화(LM3 유형)는 TRA-8 경쇄의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번째 아미노산(히스티딘), 9번째 아미노산(리신), 10번째 아미노산(페닐알라닌), 11번째 아미노산(메티오닌), 13번째 아미노산(트레오닌), 20번째 아미노산(세린), 42번째 아미노산(글루타민), 43번째 아미노산(세린), 77번째 아미노산(아스파라긴), 78번째 아미노산(발린), 80번째 아미노산(세린), 83번째 아미노산(류신), 85번째 아미노산(아스파트산), 87번째 아미노산(페닐알라닌), 99번째 아미노산(글리신), 103번째 아미노산(류신) 및 108번째 아미노산(알라닌)의 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 리신, 알라닌, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로의 치환을 수반한다. 결과적인 서열은 LM3으로 명명된다.
이 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 인간화된 L 쇄 아미노산 서열(LM3 유형, 서열 목록의 서열 번호 73)을 운반하는 발현 플라스미드는 다음과 같이 구축된다.
1) 인간화된 LM3 TRA-8의 경쇄의 가변 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각이 인간화된 항-DR5 항체 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ의 경쇄(κ쇄)의 불변 영역의 융합인 LM3 폴리펩티드 쇄(서열 목록의 서열 번호 73)를 코딩하는 DNA는 각각 PCR의 조합을 이용하여 합성된다.
7AL1P(서열 번호 47) 및 7ALCN(서열 번호 48)에 추가하여, 다음의 올리고뉴 클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성한다:
Figure 112004018557262-pct00021
Figure 112004018557262-pct00022
2) 플라스미드 pCR3.1/LM3-3-44(인간화된 TRA-8 경쇄 유형 LM3의 클로닝)의 구축
서열 번호 73에 정의된 것과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 LM3-DNA 절편을 2단계 PCR을 수행하고, 플라스미드 벡터에 삽입하고, 대장균에서 클로닝하여 제조한다.
a) 제 1 단계 PCR
HindIII 제한 효소 분해 부위가 5' 말단에 첨가되어 있는 분비 신호 서열 및 FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 및 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM3-F31B-DNA 단편을 다음의 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F5, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F6, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R6, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R7, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
EcoRI 제한 효소 분해 부위가 3'-말단에 첨가되어 있는 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM3-F31C-DNA 절편을 다음 조건하에서 제조한다.
주형 플라스미드인 pSRPDHH를 유럽 특허원 제 EP 0 909 816 A1 호의 개시에 따라 수득한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
플라스미스 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
PCR후에 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시킨다. 전기영동한 후, 겔을 1㎍/㎖의 에티디움 브로마이드로 염색시켜 UV 광 하에서 DNA를 검출한다. 이렇게 검출된 각각의 DNA 밴드를 면도날로 잘라낸다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 개시된 LM3-F31B-DNA 및 LM3-F31C-DNA 단편이 융합된 LM3-DNA를 다음의 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM3-F31B-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM3-F31C-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN 50pmol
dNTP 칵테일, 5.0㎕
10XPCR 완충액, 5.0㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
이렇게 제조된 LM3-DNA 단편을 제조자의 프로토콜에 따라 유카리오틱 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 이용하여 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고, 이 키트에 포함된 컴피튼트 대장균 TOP10F'에 도입한다. 인간화된 LM3 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이들 DNA의 뉴클레오티드 서열은 3700 DNA 어낼라이저(아비 프리즘, 일본 소재의 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템스 제품)를 이용한 디데옥시 방법(상거 등의 문헌[(1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467])에 의해 확인된다.
생성된 플라스미드를 pCR3.1/LM3-3-44라 명명한다(이 플라스미드는 인간화된 TRA-8의 경쇄 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 운반한다).
LM3-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM3-3-44를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해한다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후 CIP로 탈인산화시킨다. 생성된 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM3-DNA 단편(제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시켰음)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)를 이용하여 연결시킨다. 그런 다음, 대장균 DH5α를 연결된 DNA를 이용하여 형질전환시키고, 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖의 클로람페니콜(최종 농도)를 함유하는 LB 아가 배지에 도말한다. 수득된 백색 형질전환체를 50㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하고, 생성된 배양액에서 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 따라 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후, LM3-DNA 단편을 갖고 있는 클론을 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 선택한다.
상기 과정의 결과로서, 인간화된 LM3 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 플라스미드 pHSG/M3-3-22가 수득된다. 이들 플라스미드를 갖고 있는 형질전환체 대장균 균주를 대장균 DH5α/pHSG/M3-3-22로 명명하고, 이를 미생물 기탁에 대한 부다페스트 협약에 따라 2001년 4월 20일자로 일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지의 국제 특허 미생물 기탁소에 기탁하여 수탁 번호 FERM BP-7564를 받았다.
3) 플라스미드 pSR/LM3-3-44-10(인간화된 LM3 TRA-8 경쇄용 발현 플라스미드)의 구축
인간화된 LM3 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 수득된 플라스미드 pHSG/M3-3-22를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨다.
1㎍의 클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허원 제 EP 0 909 816 A1 호)를 제한 효소 HindIII 및 EcoRI으로 분해시킨 후, CIP를 이용하여 탈인산화시킨다. 생성된 탈인산화된 pSRPDHH DNA, 및 pHSG/M3-3-22로부터 수득된 HindIII-EcoRI DNA 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결시킨다. 그런 다음, 대장균 DH5α를 연결된 DNA를 이용하여 형질전환시키고 LB 아가 상에 도말한다. 수득된 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에서 배양하고, 생성된 배양액에서 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 따라 추출하였다. pSRPDHH 벡터로의 원하는 DNA 단편의 삽입 및 배향을 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저; 어플라이드 바이오시스템스)를 이용한 DNA 서열화에 의해 확인한다.
인간화된 LM3 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는 생성된 발현 플라스미드를 pSR/LM3-3-44-10이라 명명한다.
(4.3) 인간화된 항체의 경쇄(LM4 유형)용 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열 번호 74에서 보여지는 바와 같이, 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 경쇄의 아미노산 서열의 다른 인간화(LM4 유형)는 TRA-8 경쇄의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 8번째 아미노산(히스티딘), 9번째 아미노산(리신), 10번째 아미노산(페닐알라닌), 11번째 아미노산(메티오닌), 13번째 아미노산(트레오닌), 20번째 아미노산(세린), 42번째 아미노산(글루타민), 43번째 아미노산(세린), 77번째 아미노산(아스파라긴), 78번째 아미노산(발린), 80번째 아미노산(세린), 83번째 아미노산(류신), 85번째 아미노산(아스파트산), 99번째 아미노산(글리신), 103번째 아미노산(류신) 및 108번째 아미노산(알라닌)의 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 리신, 알라닌, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트레오닌, 글루타민, 발린 및 트레오닌으로의 치환을 수반한다. 결과적인 서열은 LM4로 명명된다.
이 유형의 항-인간 DR5 항체 TRA-8의 인간화된 L 쇄 아미노산 서열(서열 목록의 서열 번호 74)을 운반하는 발현 플라스미드는 다음과 같이 구축된다.
1) 인간화된 LM4 TRA-8의 경쇄의 가변 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각각이 인간화된 항-DR5 항체 TRA-8 L 쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄(κ쇄)의 불변 영역의 융합인 LM4 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 DNA(서열 목록의 서열 번호 74)를 각각 PCR의 조합을 이용하여 합성한다.
7AL1P(서열 번호 47), 7ALCN(서열 번호 48), MOD1F1(서열 번호 78), MOD1R1(서열 번호 79), MOD1F22(서열 번호 80), MOD1R22(서열 번호 81), MOD1F3(서열 번호 82), MOD1R3(서열 번호 83), MOD1F42(서열 번호 84), MOD1R4(서열 번호 85), MOD1F5(서열 번호 86), MOD1R52(서열 번호 87), MOD1F7(서열 번호 90) 및 MOD1R7(서열 번호 91), LR17(서열 번호 101)에 추가하여, 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR을 위해 합성한다:
Figure 112004018557262-pct00023
2) 플라스미드 pCR3.1/LM4-5-3(인간화된 TRA-8 경쇄 유형 LM4의 클로닝)의 구축
서열 번호 74에서 정의된 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 LM4-DNA 단편을 2단계 PCR을 수행하여 제조하고, 플라스미드 벡터에 삽입하고 대장균에서 클로닝한다.
a) 제 1 단계 PCR
HindIII 제한 효소 분해 부위가 5' 말단에 첨가되어 있는 분비 신호 서열, FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 및 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM4-F41B-DNA 단편을 다음의 조건하에서 제조한다.
반응 용액의 조성은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F5, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F62, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R62, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R7, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17, 50pmol
dNTP 칵테일, 5㎕
10XPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 폴리머라제, 2.5 유니트.
상기 조성을 갖는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 조절하여 PCR에 사용한다.
PCR 가열 조건: 94℃에서 2분 동안 가열한 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 가열 주기를 30회 반복한 후, 72℃에서 10분 동안 가열한다.
EcoRI 제한 효소 분해 부위가 3'-말단에 첨가되어 있는 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM4-F41C-DNA 절편을 다음 조건하에서 제조한다.
주형 플라스미드, pSRPDHH를 하기의 유럽 특허 출원 제 0 909 816 A1 호에 기술된 것으로서 얻었다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
플라스미드 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
10xPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고, PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
PCR 후에 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리하였다. 전기 영동 후에, 생성된 DNA를 UV광 하에서 검출하기 위하여 겔을 1㎍/㎖ 에티디움 브로마이드에 의해 염색하였다. 검출된 상대적인 DNA 밴드를 면도날로 절제하였다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 기술된 LM4-F41B-DNA 및 LM4-F41C-DNA 단편이 융합된 LM4-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM4-F41B-DNA의 겔 단편
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM4-F41C-DNA의 겔 단편
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고튜클레온티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5.0㎕
10xPCR 완충액, 5.0㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕에 맞추고 PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이렇게 제조된 LM4-DNA 단편을 유캐리오틱 TA 클로닝 키트(Eukaryotic TA cloning Kit)(인비트로겐)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고, 키트에 함유된 컴피텐트 대장균 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 LM4 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이러한 DNA의 핵산 서열은 3700 DNA 분석기(아비 프리즘; 퍼킨 엘머 어플라이드 바이오시스템, 일본)를 이용한 디데옥시 방법(상거(Sanger, F.S.) 등의 문헌["Proc.Natl.Acad.Sci.USA", 74:5463-5467, (1977)])에 의해 확인하였다.
결과로서 생성되는 플라스미드를 pCR3.1/LM4-5-3(인간화 LM4 TRA-8의 경쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드)으로 나타내었다.
LM4-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM4-5-3은 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절 단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과로서 생성되는 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM4-DNA 단편(제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ에 의해 절단됨)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(DNA Ligation Kit Version 2.0)(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다.
이어서, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 액체 LB 배지에 배양하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA는 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 LM4-DNA 단편을 운반하는 클론을 1% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 선택하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM4 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ체인의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 플라스미드 pHSG/M4-5-3-1을 수득하였다.
이 플라스미드가 잠복하고, 대장균 DH5α/pHSG/M4-5-3-1로 나타내는 형질 전환체 대장균 종은 미생물 기탁을 위한 부다페스트 조약에 따르는 국제 특허 미생물 기탁기관(일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지)에 2001년 4월 20일 기탁하여 승인 번호 제 FERM BP-7565를 수여하였다.
3) 플라스미드 pSR/LM4-5-3-3(인간화 LM4 TRA-8 경쇄용 발현 플라스미드)의 구축
인간화 LM4 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ쇄의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는, 수득된 플라스미드 pHSG/M4-5-3-1을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 출원 제 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과로서 생성되는 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M4-5-3-1로부터 생성된 Hind Ⅲ-EcoRⅠ DNA 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다. 이어서, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고, LB 한천에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에 배양하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. pSRPDHH 벡터 내 바람직한 DNA 단편의 삽입 및 배향은 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저; 어플라이드 바이오시스템)를 이용한 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
인간화 LM4 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는, 결과로서 생성되는 발현 플라스미드를 pSR/LM4-5-3-3으로 나타내었다.
(4.4) 인간화 항체(LM5 유형)의 경쇄의 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열 번호: 75에서 나타난 것과 같이, TRA-8 경쇄의 아미노산 서열의 N-말단의 8번째 아미노산(히스티딘), 9번째 아미노산(리신), 10번째 아미노산(페닐알라닌), 11번째 아미노산(메티오닌), 13번째 아미노산(트레오닌), 20번째 아미노산(세린), 42번째 아미노산(글루타민), 43번째 아미노산(세린), 77번째 아미노산(아스파라긴), 78번째 아미노산(발린), 80번째 아미노산(세린), 83번째 아미노산(류신), 103번째 아미노산(류신) 및 108번째 아미노산(알라닌) 치환을 수반하는 마우스 항-인간 DR5 항체 TRA-8 경쇄의 아미노산 서열의 다른 인간화형(LM5 유형)은 각각 프롤린, 세린, 세린, 류신, 알라닌, 트레오닌, 리신, 알라닌, 세린, 류신, 프롤린, 페닐알라닌, 발린 및 트레오닌으로 치환하였다. 결과로서 생성되는 서열을 LM5로 나타내었다.
항-인간 DR5 항체 TRA-8(LM5 유형)(서열 목록의 서열 번호: 75)의 인간화 경쇄의 아미노산 서열의 이러한 유형을 운반하는 발현 플라스미드를 하기와 같이 제조하였다.
1) 인간화 LM5 TRA-8 경쇄의 가변 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각 인간화 항-DR5 항체 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄(κ쇄)의 불변 영역의 융합인, LM5 폴리펩티드 쇄(서열 목록의 서열 번호: 75)를 코딩하는 DNA를 PCR 조합을 이용하여 각각 합성하였다.
7AL1P(서열 번호: 47), 7ALCN(서열 번호: 48), MOD1F1(서열 번호: 78), MOD1R1(서열 번호: 79), MOD1F22(서열 번호: 80), MOD1R22(서열 번호: 81), MOD1F3(서열 번호: 82), MOD1R3(서열 번호: 83), MOD1F42(서열 번호: 84), MOD1R4(서열 번호: 85), MOD1R52(서열 번호: 87), MOD1F7(서열 번호: 90), 및 LR17(서열 번호: 101) 이외에, 하기의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 PCR로 추가로 합성하 였다:
Figure 112004018557262-pct00024
2) 플라스미드 pCR3.1/LM5-3-42(인간화 TRA-8 경쇄의 유형 LM5의 클로닝)의 구축
서열 번호: 75의 정의와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 LM5-DNA 단편을 2-단계 PCR의 실행, 플라스미드 벡터에 삽입하고, 대장균에 클로닝하여 제조하였다.
a) 제 1 단계 PCR
5'-말단에 부가된 Hind Ⅲ 제한 효소 절단 부위를 갖는 분비 신호 서열 구간, FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 및 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM5-F51B-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
올리고뉴클레오티드 프라이머 MODIF1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R1, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R22, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R3, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F42, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R4, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F52, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R52, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F63, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R63, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1F7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MOD1R72, 5pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 LR17, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
lOxPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고, PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동 안 가열하였다.
3'-말단에 부가된 EcoR Ⅰ 제한 효소 절단 부위를 갖는 불변 영역 일부를 코딩하는 LM5-F51C-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다. 주형 플라스미드, pSRPDHH는 하기의 유럽 특허 출원 제 0 909 816 A1 호에 기술된 것으로 얻었다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
플라스미드 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 MODIF7, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
lOxPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고 PCR에 사용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
PCR 후에 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리하였다. 전기 영동 후에 생성된 DNA를 UV광 하에서 검출하기 위하여 겔을 1㎍/㎖ 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 이렇게 검출된 상대적인 DNA 밴드를 면도날로 절제하였다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 기술된 LM5-F51B-DNA 및 LM5-F51C-DNA 단편이 융합된 LM5-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM5-F51B-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM5-F51C-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5.0㎕
lOxPCR 완충액, 5.0㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고 PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이렇게 제조된 LM5-DNA 단편을 유캐리오틱 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 이용하여 제조자의 프로토콜을 따라 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트에 함유된 컴피텐트 대장균 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 LM5 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이러한 DNA의 핵산 서열을 DNA 분석기를 이용한 디데옥시 방법(상거 등의 문헌["Proc.Natl.Acad.Sci.USA", 74:5463-5467, (1977)])에 의해 확인하였다.
결과로서 생성되는 플라스미드를 pCR3.1/LM5-3-42(인간화 LM5 TRA-8의 경쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드)로 나타내었다.
LM5-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM5-3-42를 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과로서 생성되는 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM5-DNA 단편(제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단됨)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다. 그 후에, E. coli DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 액체 LB 배지에 배양
하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 LM5-DNA 단편을 운반하는 클론을 1% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 선택하였다.
상기 과정의 결과로서, 인간화 LM5 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ쇄의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 플라스미드 pHSG/M5-3-27을 수득하였다.
3) 플라스미드 pSR/LM5-3-27-1(인간화 LM5 TRA-8 경쇄용 발현 플라스미드)의 구축
인간화 LM5 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ 쇄의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는, 수득된 플라스미드 pHSG/M5-3-27을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA(유럽 특허 출원 제 0 909 816 A1 호) 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과로서 생성되는 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M5-3-27로부터 생성된 HindⅢ-EcoRⅠ DNA 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다. 이어서, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고 LB 한천에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에 배양하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. pSRPDHH 벡터 내 바람직한 DNA 단편의 삽입 및 배향을 유전자 서열 분석기(아비 프리즘 3700 DNA 어낼라이저, 어플라이드 바이오시스템)를 이용한 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
인간화 LM5 TRA-8 경쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는, 결과로서 생성되는 발현 플라스미드를 pSR/LM5-3-27-1로 나타내었다.
(4.5) 인간화 항체(키메라 유형) 경쇄용 발현 벡터의 구축
서열 목록의 서열 번호: 76에서 나타난, 키메라 유형 TRA-8 경쇄의 아미노산 서열을 LM6으로 나타내었다.
항-인간 DR5 항체 TRA-8(LM6 유형)(서열 목록 서열 번호:75)의 인간화 경쇄의 아미노산 서열의 이러한 유형을 운반하는 발현 플라스미드를 하기와 같이 제조하였다.
1) 인간화 LM6 TRA-8의 경쇄의 가변 및 불변 영역을 제조하기 위한 프라이머의 합성
각 인간화 항-DR5 항체 TRA-8 경쇄의 가변 영역(LM6 유형) 및 인간 Ig 경쇄(κ 쇄)의 불변 영역의 융합인, LM6 폴리펩티드 쇄(서열 목록 SEQ ID.75)을 코딩하는 DNA를 PCR 조합을 이용하여 각각 합성하였다.
7AL1P (서열 번호: 47) 및 7ALCN (서열 번호: 48) 이외에, 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 PCR로 추가로 합성하였다:
Figure 112004018557262-pct00025
2) 플라스미드 pCR3.1/LM6-1-16(인간화 TRA-8 경쇄의 유형 LM6의 클로닝)의 구축
서열 번호: 75의 정의와 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 LM6-DNA 단편을 2-단계 PCR의 실행, 플라스미드 벡터에 삽입하고 대장균에 클로닝하여 제조하였다.
a) 제 1 단계 PCR
분비 신호 서열 및 5'-말단에 부가된 Hind Ⅲ 제한 효소 절단 부위를 갖는 FRL1 부위의 일부를 코딩하는 LM6-F1-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다. 주형 플라스미드, pHSGHM17 및 pSRPDHH는 하기의 유럽 특허 출원 제 0 909 816 A1 호에 기술된 것에 의해 얻었다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
플라스미드 pHSGHM17 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 HKSPR13, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
lOxPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소(펄킨 엘머), 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고, PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 일부 및 불변 영역의 일부를 코딩하는 LM6-F2-DNA 절편을 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
플라스미드 pL28 DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 MVF11, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 MVR12, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
lOxPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고 PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
FRL4의 일부 및 3'-말단에 첨가된 EcoR Ⅰ 제한 효소 절단 부위를 갖는 불변 영역을 코딩하는 LM6-F3-DNA 단편을 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
플라스미드 pSRPDHH DNA, 25ng
올리고뉴클레오티드 프라이머 MCF11, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5㎕
lOxPCR 완충액, 5㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고 PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
PCR 후에 증폭된 DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 분리하였다. 전기 영동 후에 생성된 DNA를 UV광 하에서 검출하기 위하여 겔을 1㎍/㎖ 에티디움 브로마이드로 염색하였다. 이렇게 검출된 상대적인 DNA 밴드를 면도날로 절단하였다.
b) 제 2 단계 PCR
상기 기술된 LM6-F1-DNA, LM6-F2-DNA, 및 LM6-F3-DNA 단편이 융합된 LM6-DNA를 하기의 조건하에서 제조하였다.
반응 용액의 조성은 하기와 같다:
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F1-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F2-DNA의 겔 단편,
제 1 단계 PCR에서 제조된 LM6-F3-DNA의 겔 단편,
올리고뉴클레오티드 프라이머 7AL1P, 50pmol
올리고뉴클레오티드 프라이머 7ALCN, 50pmol
dNTPs 칵테일, 5.0㎕
lOxPCR 완충액, 5.0㎕
앰플리택 DNA 중합효소, 2.5 단위
상기 조성을 가지는 반응 용액을 2차 증류수를 첨가하여 최종 부피 50㎕로 맞추고 PCR에 이용하였다.
PCR 온도 조건: 94℃에서 2분 동안 가열하고, 그 후에 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 2분의 온도 사이클을 30회 반복하고, 이어서 72℃에서 10분 동안 가열하였다.
이렇게 제조된 LM6-DNA 단편을 유캐리오틱 TA 클로닝 키트(인비트로겐)를 이용하여 제조자의 프로토콜을 따라 플라스미드 pCR3.1DNA에 삽입하고 키트에 함유된 컴피텐트 대장균 TOP10F'에 도입하였다. 인간화 LM6 TRA-8의 경쇄를 코딩하는 이러한 DNA의 핵산 서열을 DNA 분석기를 이용한 디데옥시 방법에 의해 확인하였다.
결과로서 생성되는 플라스미드를 pCR3.1/LM6-1-16(마우스 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Ig 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 cDNA를 운반하는 플라스미드)으로 나타내었다.
LM6-DNA 단편을 함유하는 수득된 플라스미드 pCR3.1/LM6-1-16을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pHSG399 DNA 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과로서 생성되는 탈인산화된 pHSG399 DNA 및 LM6-DNA 단편(제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단됨)을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다. 그 후에, E. coli DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고 0.1mM IPTG, 0.1% X-Gal 및 50㎍/㎖ 클로람페니콜(최종 농도)을 함유하는 LB 한천 배지에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 50㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 액체 LB 배지에 배양하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. 추출된 플라스미드 DNA를 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 LM6-DNA 단편을 운반하는 클론을 1% 아가로스 겔 전기 영동에 의해 선택하였다.
상기 과정의 결과로서, 마우스 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ쇄의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는 플라스미드 pHSG/M6-1-4-1을 수득하였다. 이 플라스미드를 갖고, 대장균 DH5α/pHSG/M6-1-4-1로 표현되는 형질 전환체 대장균 종을 미생물 기탁을 위한 부다페스트 조약에 따르는 국제 특허 미생물 기탁기관(일본 305-5466 이바라키켕 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-1 소재의 내쇼날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리알 사이언스 앤드 테크놀로지)에 2001년 4월 20일 기탁하여 승인 번호 제 FERM BP-7566을 받았다.
3) 플라스미드 pSR/LM6-1-4-6(키메라 유형 LM6 TRA-8 경쇄의 발현 플라스미드)의 구축
마우스 TRA-8 경쇄의 가변 영역 및 인간 Igκ 쇄의 불변 영역의 융합 단편을 운반하는, 수득된 플라스미드 pHSG/M6-1-4-1을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ로 절단하였다.
클로닝 플라스미드 pSRPDHH DNA 1㎍을 제한 효소 Hind Ⅲ 및 EcoR Ⅰ으로 절단하고, 이어서 CIP로 탈인산화하였다. 결과적으로 생성된 탈인산화된 pSRPDHH DNA 및 pHSG/M6-1-4-1로부터 생성된 HindⅢ-EcoRⅠ DNA 단편을 DNA 연결 키트 버전 2.0(다카라 스조 캄파니 리미티드)을 이용하여 연결하였다. 이어서, 대장균 DH5α를 연결된 DNA로 형질전환하고 LB 한천에 도말하였다. 수득된 백색 형질 전환체를 100㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 액체 LB 배지에 배양하고, 플라스미드 DNA를 알칼리-SDS 방법에 의해 배양액으로부터 추출하였다. 벡터 내 바람직한 DNA 단편의 삽입 및 배향은 유전자 서열 분석기를 이용한 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다.
TRA-8(키메라 유형)의 경쇄를 코딩하는 cDNA를 운반하는, 결과로서 생성되는 발현 플라스미드를 pSR/LM6-1-4-6으로 나타내었다.
(5) 몇 가지 유형의 인간화 또는 키메릭 TRA-8 항체 생산
Cos-7 세포의 형질감염을 FUGENE6 형질감염 시약 방법(베링거 만하임 바이오케미카의 키트에 제공된 지시에 따라 실행하였다.
Cos-7 세포(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 CRL-1651)를 10% 송아지 배아 혈청(이하, "FCS"로서 약칭됨; 모어게이트)으로 보충된 덜베코의 모디파이드 이글 배지(이하, "D-MED"로서 지칭됨; 깁코 BRL)를 함유하는 배양 디쉬(배양 면적; 57㎠; 스미토모 베이크라이트(Sumitomo Bakelite))에 반-융합(3x106 셀/디쉬)으로 배양하였다.
그 동안에, 알칼리-SDS 방법 및 염화 세슘 밀도 구배 원심분리기에 의해 제조된 인간화 DR5 형질 중쇄의 발현 플라스미드 DNA(pHA15-1) 10㎍/디쉬(총 5 디쉬) 및 인간화 DR5 경쇄의 발현 플라스미드 DNA 10㎍/디쉬를 혼합하고, 이어서 에탄올로 침전시키고, dH2O 5㎕/디쉬로 현탁하였다.
FUGENE6 형질감염 시약 15㎕/디쉬를 FCS를 제외한 D-MEM 180㎕/디쉬와 혼합한 후, 이 FUGENE 용액(185㎕/디쉬)을 10㎍/디쉬의 인간화 DR5 중쇄의 발현 플라스미드 DNA 및 10㎍/디쉬의 인간화 DR5 경쇄의 발현 플라스미드 DNA를 함유하는 5㎕/디쉬의 DNA 용액과 혼합하였다. 실온에서 15분 배양한 후, 수득된 플라스미드 현탁액(200㎕)을 미리 제조한 Cos-7 평판에 가했다. 37℃의 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 후, 배양 배지를 FCS가 없는 D-MEM으로 교환하였다. 37℃의 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 후, 배양 상층액을 상등 용액의 발현 생성물을 정제하기 위하여 회복시켰다. 상기 기술된 방법에 의해, Cos-7 세포는 하기의 각 플라스미드 조합으로 형질감염하였다:
(A): pHA15-1 및 pSR/LM1-2(H1L1)의 동시 형질감염
(B): pHB14-1 및 pSR/M2-1(H2L2)의 동시 형질감염
(C): pHB14-1 및 pSR/LM3-3-44-10(H2L3)의 동시 형질감염
(D): pHB14-1 및pSR/LM4-5-3-3(H2L4)의 동시 형질감염
(E): pHClO-3 및 pSR/M2-1(H3L2)의 동시 형질감염
(F): pHClO-3 및 pSR/LM3-3-44-10(H3L3)의 동시 형질감염
(G): pHC 10-3 및 pSR/LM4-5-3-3(H3L4)의 동시 형질감염
(H): pHD21-1 및 pSR/LM5-3-27-1(H4L5)의 동시 형질감염
(I): pMl1-1 및 pSR/LM6-1-4-6(Chimera)의 동시 형질감염
이어서, 배양액을 원심 분리(3,500 rpm, 15분)하고, 상층액을 얻었다. 상층액을 0.45㎛ 필터(어드밴텍 도요 디스믹-25cs, 카탈로그 넘버 25CS045 AS))로 여과하였다. 여과액으로부터 IgG의 정제는 하기의 조건하에서 프로테인 G-포로스 친화성 크로마토그래피(Protein G-POROS affinity chromatography) (어플라이드 바이오시스템)를 이용하여 실시하였다:
HPLC 시스템:BioCAD 700E(어플라이드 바이오시스템)
컬럼: 단백질G-ID 센서 카트리지
(컬럼 크기: 2.1mm IDx30mm LD, 층부피: 0.1㎖; 어플라이드 바이오시스템)
용출 완충액: 0.1M 글리신-HCl(pH 2.5)
중화 완충액: 1M 트리스-HCl(pH 8.5)
검출: 280㎚
유속: 1㎖/분
분별 사이즈: 0.5㎖/0.5분
분별 튜브: 1.5㎖ 폴리프로필렌 마이크로튜브
온도: 4℃
모든 여과액을 컬럼에 가한 후, PBS(시그마, 카탈로그 넘버 1000-3) 50㎖를 컬럼 세척에 사용하였다. 용출 완충액이 가해질 때, 분별 수집을 시작하였다. 각 분별 마이크로튜브는 1M NaCl 55㎕, 중화 완충액 110㎕ 및 PBS 내 2㎎/㎖ 우황 혈청 알부민(시그마, 카탈로그 넘버 A-7030) 74㎕를 함유하였다. 제 8분획을 통해 제 7분획으로부터 분획을 얻었다.
인간화 항체의 발현의 검증 및 제조된 배양액 상층액 용액 내 발현 생성물의 정량 분석을 항-인간 IgG에 대한 항체로의 ELISA에 의해 수행하였다.
96-웰 평판(맥시솔프(MaxiSorp), Nunc)의 각 웰에, 흡수 완충액(0.05M 탄산수소나트륨, 0.02% 아지드화나트륨, pH 9.6) 내의 최종 농도 0.5㎍/㎖로 용해된 염소 항-인간 IgG Fc 특이성 폴리클로날 항체(카펠) 100㎕를 가하고 평판을 항체의 흡수를 위해 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후에, 평판을 PBS-T 350㎕로 5회 세척하였다. 세척 후 웰에, 10% FCS를 함유한 D-MEM으로 희석된 배양 상층액을 가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 다시 PBS-T로 세척한 후, PBS-T로 10,000배 희석된 알칼리 포스파타아제-표지된 염소 항-인간 IgG Fc 특이성 폴리클로날 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩)를 각 웰에 가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. PBS-T로 다시 세척한 후, 알칼리 포스파타아제 기질 키트(바이오 라드)로부터 생성된 p-니트로페닐 포스페이트 기질 용액을 제공된 지시에 따라 가하였다. 37℃에서 0.5 내지 1시간 배양 후에, 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에서, 10% FCS를 함유한 D-MEM로 특정 농도까지 희석된 인간 혈장 글로불린 항체 G 아부류 1(IgG1)(바이오 퓨어(Biopure) AG)을 배양액 상층액 내 함유된 인간화 DR5 항체의 농도 참조 샘플로서 이용하였다.
결과로서, 배양액 상층액 내 발현 및 정제된 생성물을 항-인간 IgG 항체로 명확히 검출하였다. 인간 IgG 항체의 최종 농도는 각각 44.03㎍/㎖(H1L1), 39.8㎍/㎖(H2L2), 26.7㎍/㎖(H2L3), 41.0㎍/㎖(H2L4), 39.3㎍/㎖(H3L2), 24.7㎍/㎖(H3L3), 21.5㎍/㎖(H3L4), 16.7㎍/㎖(H4L5) 및 18.3㎍/㎖(키메라)이었다.
(6) 몇 가지 유형의 인간화 항체 또는 키메릭 항체 세포사멸-유도 활성
위르캣 세포(ATCC TIB-152)를 정제된 인간화 TRA-8 항체의 세포사멸-유도 활성을 검사하기 위해 사용하였다.
37℃, 5% CO2의 존재 하의 10% FCS(깁코 BRL)이 있는 RPMI1640 배지에서 3일간 배양된 위르캣 세포를 96-웰 마이크로평판(스미토모 베이크라이트)의 각 웰에 웰당 50㎕로 투여하였다. 실시예 26에서 제조된 인간화 TRA-8을 실시예 26에 기술된 방법에 따라 용액 내 농도로 측정하여, 10% FCS를 함유한 RPMI1640 배지로 100ng/㎖의 최종 생성물 농도를 가지도록 맞추었다. 이렇게, 100ng/㎖로 맞춘 발현 생성물의 각 용액을 10% FCS를 함유한 RPMI1640으로 연속 2배 희석하여 연속 희석액을 만드는데 사용하였다. 각 희석된 인간화 TRA-8 용액(H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 또는 H4L5)을 웰 당 50㎕로 각 웰에 가하였다. 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 후, 1㎎/㎖의 XTT를 함유한 25μM의 PMS 50㎕를 가하였다(XTT 250㎍/㎖ 및 PMS 5μM의 최종 농도). 3시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 산출하기 위해 미토콘드리아의 감소 능력을 인덱스로서 이용하여 450㎚에서 각 웰의 흡광도를 측정하였다.
각 웰의 세포 생존율을 하기의 수학식 1에 따라 산출하였다:
수학식 1
생존율(%) = 100x(a-b)/(c-b)
상기 식에서,
"a"는 시험 웰의 수치이고,
"b"는 세포가 없는 웰의 수치이고,
"c"는 항체가 가해지지 않은 웰의 수치이다.
결과로서, 시험된 인간화 항체는 인간 DR5 항원을 발현하는 T 임파종 세포주의 세포에 세포사멸을 유도하는 것으로 증명되었다.
더욱이, 인간화 TRA-8의 PC-3로의 세포사멸-유도 활성은 실시예 25에 기술된 방법에 따라 탁솔(taxol)을 첨가함으로써 검사하였다.
인간 전립선암 세포주 PC-3(ATCC CRL-1435)은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 얻고 10% 태아 우황 혈청(FBS, 히클론(Hyclone)), 1% L-글루타민-200mM(25030-149, 기보 BRL) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액(P-7539, 시그마)을 함유하는 F-12K 뉴트리언트 믹스쳐(F-12K Nutrient Mixture)(21127-022, 깁코 BRL)에 유지하였다. 10% FBS 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신 용액이 보충된 RPMI1640 배지(메드(MED)-008, 이와키(IWAKI))를 하기의 실험에 사용하였다. 기하급수적으로 성장하는 PC-3 세포를 트립신처리하여 모으고 신선한 배지로 2회 세척하였다. 그 후, 세포 수를 산정하고, 신선한 배지로 5x104 세포/㎖의 밀도가 되도록 재현탁하여 넓적 바닥 96 웰 평판(3598, 코팅-코스터)에 실험 시작 1일 전 총 부피 100㎕/웰로 3배가 되게 하였다. 디메틸설폭시드(10㎎/㎖)에 용해된 대표적인 항암제, 파크리탁셀(Paclitaxel)(169-18611, 와코(Wako))을 신선한 배지에 희석하고 이어 50㎕/웰의 세포를 함유하는 96-웰 평판에 가하였다. 디메틸설폭시드의 최종 농도는 0.1% 미만이었다. 37℃, 5% CO2 대기에서 24시간 배양 후, 신선한 배지에 희석된 인간화 TRA-8 항체(H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 또는 H4L5)를 웰에 가하였다. 추가의 24시간 동안 배양한 후에, 1㎎/㎖의 XTT 및 25mM의 PMS를 함유하는 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium)(11095-098, 깁코 BRL) 50㎕를 웰에 가하고 평판을 6시간 동안 배양하였다. 그 후, OD450을 아르보 HTS 1420 멀티라벨 카운터(ARVO HTS 1420 Multilabel Counter)(왈락 버톨드(Wallac Berthold))로 측정하고 세포 생존율을 하기에 따라 산출하였다.
수학식 2
Figure 112004018557262-pct00026
결과로서, 시험된 인간화 항체는 인간 DR5 항원을 발현하는 인간 전립선암 세포에 세포사멸을 유도하는 것으로 증명되었다.
실시예 27. DR4 항체의 생성
인간 DR4의 세포외 영역(아미노산 1 내지 236) 및 인간 IgG1의 Fc 부분을 포함하는 융합 단백질을 재조합 아데노바이러스의 벡터로 형질감염된 Cos-7에서 발현시켰다. 융합 단백질을 단백질 A 친화 컬럼으로 정제하였다. BAlb/c 마우스를 상기 정제한 융합 단백질로 면역시켰다. DR4에 특이적으로 결합하고 라모스 인간 B 림프종 세포의 세포사멸-유도 능력이 있는 하이브리도마 클론인 2E12(IgG1, κ)를 3회 하위클론화하였다. IgG1 융합 단백질을 대조 항체로 인간 DR5, DcR1 및 DcR2를 사용하여 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석으로 2E12의 결합 특이성을 측정하였다. 세포 표면 DR4에의 2E12의 결합을 인간 DR4를 코딩하는 전체 길이의 cDNA로 형질감염된 Cos-7 세포의 유량 세포분석에 의해 측정하였다. 염소 항-마우스 IgG1의 존재하에서 2E12 1㎍/㎖로 라모스 세포를 배양하여 세포사멸-유도 활성을 측정하였다. 세포 생존율을 상기한 ATPLite 분석에 의해 측정하였다.
실시예 28. DR4 항체의 특성화
DR4 단일클론성 항체(2E12)는 ELISA에서 DR5, DcR1 및 DcR2와 같은 다른 TRAIL 수용체에 결합하지 않았기 때문에 인간 DR4에 특이적이다(도 19a). DR4 형질감염된 Cos-7 세포의 유량 세포분석에서 입증되었듯이 2E12는 세포 표면 DR4를 인식하였다(도 19b). 2E12는 2차 항체의 가교결합 존재하에 투여량 의존적 형태로 라모스 림프종 세포의 세포사멸을 유도할 수 있었다(도 19c). 라모스 세포를 2E12로 시험관내 처리하면 카스파제 8, 9 및 3가 시간 의존적 활성화되고 PARP이 절단되었다. 이러한 결과는 2E12가 카파제 의존적 형태로 세포사멸을 유도하는 길항성 항 DR4 항체임을 나타낸다.
항 DR4(2E12) 및 이어서 PE-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG1 항체를 이용하고 유량 세포분석을 실시하여, DR4 항체가 섬유육종 세포주(Hs 913T) 및 여러 유방암 세포주(2LMP. MDA-MB231 및 MDA-MB 453)의 세포에 결합하지만, 정상적인 인간 피부 섬유 모세포 세포주(Malme-3)에는 거의 결합하지 않는 것을 나타내었다.
실시예 29. DR4 항체의 살종양 활성
2E12의 살종양 활성을 유방암 종양 모델을 사용하여 시험하였다. 누드 마우스에 인간 유방암 세포주인 2LMP를 피하 접종하였다. 종양 세포 주사후, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일에 200㎍의 투여량의 2E12을 복강내 투여하였다. 동물에게 8, 12 및 16일에 아드리아마이신(독소루비신)(6㎎/㎏)을 정맥 주사하였다. 2E12 및 아드리아마이신(도 20)을 처리하였을 때 2E12 또는 아드리아마이신을 단독으로 처리하였을 때보다 더 큰 종양 성장 억제를 나타내었다.
동일한 유방암 종양 모델을 사용하여 2E12와 조합된 TRA-8의 살종양 활성을 시험하였다. 종양 세포 주사후, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일에 TRA-8 및 2E12 200㎍의 투여량을 복강내 투여하였다. 동물에게 8, 12 및 16일에 아드리아마이신(6㎎/㎏)을 정맥 주사하였다. TRA-8 + 2E12 또는 TRA-8 + 2E12 + 아드리아마이신의 처리시, 각각 88% 및 100%의 완전 종양 퇴화를 나타내었다(도 21).
실시예 30. 다른 치료와 조합된 DR4/DR5 항체의 살종양 활성
(1) 세포주 및 시약
인간 유방암 세포주 MDA-MB-231의 2LMP 하위클론, MDA-MB-435의 LCC6 하위클론 및 MDA-MB-361의 DY36T2 하위클론을 워싱턴 디 씨 소재의 조지타운 대학교의 마크 리프만 박사(Dr. Marc Lipmann)로부터 입수하고, 이를 유타주 로간 소재의 히클론의 10%의 FBS로 보충한 개량 MEM중에서 유지시켰다. MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, SK-BR-3 및 ZR-75-1 인간 유방암 세포주를 버지니아주 마나사스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. MDA-MB-231, MDA-MB-453 및 MDA-MB-468 세포를 MEM 비타민, MEM 불필수 아미노산, 1mM의 피루브산 나트륨 및 10%의 FBS으로 보충한 DMEM중에서 배양하였다. BT-474 세포를 10㎍/㎖의 인슐린, 4.5g/ℓ의 포도당, 10mM의 HEPES, 1mM의 피루브산 나트륨 및 10%의 FBS로 보충한 RPMI 1640중에서 배양하였다. SK-BR-3 세포를 15%의 FBS를 함유한 McCoy 배지에서 배양하였다. ZR-75-1 세포를 20%의 FBS를 함유한 Ham's F12K 배지중에서 배양하였다. 모든 세포주를 5% CO2 대기중 37℃에 항생물질 없는 배지중에 유지시켰고 미코플라스마 오염 여부에 대하여 전형적으로 선별하였다.
정제된 TRA-8(IgG1)mAb를 UAB에서 생산하였고 이는 또한 일본 도쿄 소재의 산쿄 캄파니 리미티드에 의해 제공되었다. 피고에리트린-결합 염소 항-마우스 IgG1 및 동형 특이적 IgG1 대조 항체를 미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠로부터 입수하였다. 아드리아마이신 및 파클리탁셀을 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼즈 캄파니(Sigma Chemicals Co.)로부터 구입하였고 증류수 또는 DMSO중 10mM의 모액으로 각각 제조하였다. 동물 연구를 위하여, 뉴저지주 프린스톤 소재의 브리스톨-마이어르 스큅 컴퍼니사(Bristol-Myers Squibb Co.)의 파클리탁셀 임상적 제제를 알라바마주 버밍엄 소재의 버밍엄 병원 약국의 알라바마 대학으로부터 입수하였다. 이 제제를 사용직전 PBS에 1:5로 희석하였다.
(2) DR5 발현의 간접 면역형광 및 유량 세포분석
기하급수적 성장 단계의 세포를 둘베코 PBS(Ca2+ 및 Mg2+ 결핍)로 한번 세척하고 37℃에서 4mM EDTA/0.5%KCl로 수득하였다. 세포를 4℃에서 1,000rpm으로 5분 동안의 원심분리에 의해 수집하고, 한번 세척하고 4℃에서 1%의 BSA 및 0.01%의 아지드화나트륨을 함유하는 PBS(FACS 완충액)중 재현탁시켰다. 세포를 4℃에서 60분 동안 정제된 TRA-8 또는 동형 특이적 IgG1 대조 항체 10㎍/㎖와 함께 배양하고, 완충액으로 한번 세척한 후, 4℃에서 20분 동안 PE-결합 염소 항-마우스 IgG1 10㎍/㎖로 배양하였다. 항체 염색후, 세포를 FACS 완충액으로 한번 세척하고, 빙상에서 15분 동안 1%의 파라포름알데히드로 고정하였다. 샘플을 캘리포니아주 산 조스 소재의 벡톤 딕킨슨 FACScan에서 분석하였고, 데이터를 셀퀘스트 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
(3) ATPLite를 사용한 세포 생존율 분석
세포에 트립신을 가하고 완전 배양 배지에 재현탁시켰다. 웰당 1,000개 세포를 광학적으로 투명한 96-웰 블랙 평판(뉴욕주 코닝사의 코스타 #3904)에 놓고 처리를 시작하기 전에 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 약물 및 항체를 사용직전 배양 배지에 희석시켜, DMSO의 최종 농도가 항상 0.001% 이하가 되도록 하였다. TRA-8에만 24시간 노출시킨 후 세포 생존율을 측정하였다. 세포 독성이 있는 약물과의 조합 처리를 위하여, 항체를 가하기 전 세포를 약물로 24시간동안 전처리하였고, 추가적으로 24시간동안 배양한 후, 콘넥티컷주 메리덴 소재의 패커드 인스트루먼츠를 사용한 ATPLite 발광에 기초한 분석으로 세포의 ATP 농도의 측정함으로써 세포 생존율을 측정하였다. 모든 반응 용적(배양 배지 및 시약)을 절반으로 감소시킨 것을 제외하고는 제조사의 권고 프로토콜을 따랐다. 모든 샘플을 3중으로 분석하였고, 3개의 독립적인 실험결과의 최소값으로부터 평균 ±SE로서 기록하였다.
(4) 유방암 이종이식편을 갖는 아티믹 누드 마우스에서의 TRA-8 단독의 또는 화학요법이나 방사선 조사와의 조합에 의한 TRA-8 치료 연구
아티믹 누드 마우스에 3x107 2LMP 세포로 피하 주사하였다. 종양 세포 주사후 7일에, TRA-8 200 또는 600㎍(10 또는 30㎎/㎏)을 복강 투여하고 10, 14, 17, 21 및 24일에 5회 추가적으로 주사하였다. 종양의 성장을 시간에 따라 모니터링하였다. 연이은 연구에서, 2LMP 피하 주사 종양을 갖는 동물에 TRA-8 200㎍을 7, 10, 14, 17, 21 및 24일에 단독으로 또는 아드리아마이신(6㎎/㎏ 정맥 주사, 8, 12 및 16일) 또는 파클리탁셀(20㎎/㎏ 복강내 주사, 8, 12, 16, 20 및 24일)과 조합하여 복강내 주사하였다. 종양 크기 및 퇴화율을 측정하였다. 더욱이, 9 및 17일에 2LMP 이종이식편의 3 Gy 60Co 조사와 조합하여 상기와 동일한 처방 계획에 따라 TRA-8 및 아드리아마이신으로 연구를 실시하였다.
(5) 이종이식편에서의 세포사멸 분석
0일에 3x107 2LMP 세포로 피하 주사한 아티믹 누드 마우스에 7 및 10일에 TRA-8 100㎍을 복강내 투여하였다. 2마리 마우스로 구성된 군들에 대해 각각 8 및 11일에 아드리아마이신(3㎎/㎏)을, 8 및 11일에 파클리탁셀(10㎎/㎏)을, 또는 TRA-8 및 아드리아마이신 또는 파클리탁셀의 조합을 동일한 투여량 및 계획으로 투여하였다. 마우스의 한 군은 처리하지 않았다. 종양 세포 주사후 14일에 세포사멸의 연구를 위하여 이종이식편을 절제하였다. 표준 처리 프로토콜과 비교하였을 때 처리 강도가 실질적으로 감소한 이유는 14일에의 분석에 적당한 종양 조직을 사용하기 때문이다. 종양 이종이식편중 세포사멸에 대한 투넬 분석(Tunel assay)을 하기와 같이 시행하였다. 조직의 5마이크론 파라핀 단편을 수퍼프로스트/플러스(Superfrost/Plus) 슬라이드에 올려놓고 58℃에서 1시간동안 가열하였다. 조직 단편을 크실렌의 3 교환처리하여 파라핀을 제거하고 무수 에탄올, 95% 에탄올 및 70% 에탄올의 1 교환으로, 각각 5분씩 증가시키면서, 재수화하였다. 그 후, 조직편을 트리스 완충 식염수(0.5M 트리스 염기, 0.15M NaCl, 0.0002% 트리톤 X-100, pH 7.6)중에 놓았다. 뉴욕주 퍼체이스 소재의 인터겐(Intergen)사의 아포프 탁 페록시다제 키트(Apop Tag Peroxidase kit)를 사용하여 세포사멸이 일어난 핵을 검출하였다. 프로테이나제 K(탈이온 증류수중 20㎍/㎖)를 조직편에 가하고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 3%의 과산화수소 수용액으로 5분 동안 처리하여 내인성 페록시다제를 급냉시켰다. 조직편을 평형 완충액으로 30분 동안 처리한 후 파라필름 커버를 사용하여 TdT/효소(표지 반응 혼합물중에 희석됨)로 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 본 배양을 하는 동안, TdT 효소는 DNA 절편의 3'-OH 말단에 결합하여 디곡시제닌 표지된 데옥시뉴클레오티드 및 표지되지 않은 데옥시뉴클레오티드의 첨가를 촉진시킨다. 음성 대조군을 TdT 효소 대신 증류수(표지 반응 혼합물중 희석됨)로 배양하였다. 표지 반응을 종결시키기 위하여 실온에서 10분 동안 종결 완충액을 첨가하였다. 항-디곡시제닌 결합물을 30분 동안 각 슬라이드에 첨가하였다. DNA 절편의 표지된 3'-OH를 눈으로 보이게 하기 위하여 크로마겐 3,3' DAB를 사용하였다. 그 후 슬라이드를 탈온수로 헹구고 헤마톡실린으로 가볍게 대비염색하고, 알콜 및 크실렌을 사용하여 탈수하고 퍼마운트(Permount)를 사용하여 유리를 덮었다. 약 10 무작위 필드에 대하여 염색된 투넬 백분율 및 조직중 강하게 염색된 세포사멸체의 백분율을 측정하였다.
(6) 통계 분석
(A) 시험관내 약물 세포 독성과 TRA-8 상호작용의 분석
세포 독성 데이터를 평가하여 조합 세포 독성 효과가 부가적인지, 부가적인 것에 미달하는지(길항적인지), 또는 부가적인 것을 초과하는지(상승적인지)에 대하여 분석하였다. 제닝의 문헌[On Testing for Drug/Chemical Interactions: Definitions and Inference, pp.457-468, 2000]에서 추천한 바와 같이, 9개 세포주 각각에 대하여 1차, 2차 및 상호작용 관계를 갖는 2차 반응 표면 모델을 사용하여(문헌[Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments, New York: Wiley, 2001]) 약물 단독으로 및 이를 조합하여 투여량 반응 관계를 설계하였다. 유의한 상호작용 관계는 그 관계가 부가적인 독성을 초과하는 음성인지, 또는 부가적 독성에 미달하는 양성인지에 따라, 상승적 또는 길항적인 것으로 분류되었다. 상호작용 관계가 유의하지 않은 경우, TRA-8과 아드리아마이신, 또는 TRA-8과 파클리탁셀 사이의 관계는 부가적 관계가 유의한 경우에만 부가적인 것으로 간주하였다.
(B) 개개 동물 실험의 TRA-8, 화학요법, 방사선 조사 및 조합 치료의 분석
6개의 독립적 실험에서 나온 데이터를 개별적인 실험에 의해 분석하였다. 처리 조합을 세 개의 종점으로 측정된 생체내 항-종양 효능, 즉 종양 성장의 억제와 비교하였다; 종양 배가 시간의 연장, 종양 퇴화 백분율 및 시간에 대한 성장률. 종양 세포 주사후 7일에서의 기준선에 상대적으로 표면적(두 직경의 산물)에서 종양 배가되는 실질적인 일수가 배가 시간 분석에 사용되었다. 매개변수가 없는 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 시험을 이용하여 처리군 사이의 종양이 2배가 되는 시간의 중간값을 비교하였다. 피셔(Fisher)의 정확한 시험을 이용하여 처리군간 종양 퇴화 및 재발하지 않은 퇴화의 비율을 비교하였다. 조합 치료가 종양 성장의 유의한 상승 억제를 일으키는지, 즉 부가적인 것을 초과하는지를 결정하기 위하여, 연속적 면적 측정으로부터 얻은 성장 곡선을 치료 시작후 첫 3주에 대하여 선형 혼합 모델 접근을 사용하여 비교하였다(문헌[Lindsey, J. K. Models for Repeated Measurements, pp. 100-142, Oxford, 1993]). 조합 치료의 상승 효과에 대하여 시험하기 위하여, 상호작용 관계가 모델에 포함되었다. 상호작용 관계가 유의하고, 그 효과가 부가적인 것 보다 더 큰 정도로 성장을 억제하는 것이라면 그 상호작용은 상승적이라고 간주하였다.
(C) 치료 효과의 군집 분석
총 166마리의 동물, 10개의 치료군 및 6개의 독립적인 실험이 군집 분석에 포함되었다. 처리 조합을 생체내 항-종양 효능과 비교하였다. 크루스칼-월리스 시험을 이용하여 중간 종양 배가 시간을 분석하고 피셔의 정확한 시험을 사용하여 처리군에 대하여 종양 퇴화 및 재발하지 않은 퇴화의 비율을 비교하였다.
모든 통계 분석은 사스(SAS, 등록상표)를 사용하여 실시되었다(문헌[Sas/Stat User's Guide, SAS OnlineDoc, Version 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999]).
(7) 유방암 세포주내 DR5-발현 및 TRA-8 유도성 세포 독성
도 22a에 지시된 바와 같이, 모든 9개의 유방암 세포주는 강하게 양성인(LCC6 및 MDA-MB-453)인 것부터 약하게 양성(MDA-MB-468 및 SK-BR-3)인 다양한 발현 정도를 갖는 DR5 양성이었다. 도 22b는 TRA-8이 9개의 세포주의 세포 독성을 유도하였음을 나타낸다. 4개의 세포주는 17 내지 299ng/㎕의 IC50 농도를 가질 정도로 TRA-8 유도성 세포 독성에 민감하였고(LCC6, 2LMP, MDA-MB-231, MDA-MB-468), 반면 다른 것들은 상당히 저항성이 있었다(DY36T2, BT-474, MDA-MB-453). MDA-MB-453 및 MDA-MB-468 세포주에 의해 나타난 바와 같이, DR5-발현과 TRA-8 유도성 세포 독성 정도 사이에는 양호한 관련성이 없었다.
그 후 화학요법 유도된 세포 독성에 미치는 TRA-8의 영향을 아드리아마이신(도 23a) 및 파클리탁셀(도 23b)를 이용하여 시험하였다. 항체 및 약물 효과간의 상호작용에 대한 시험 분석이 하기 표 5에 요약되어 있다. TRA-8 및 파클리탁셀간에 유의한 상승적 상호작용은 없었고, 대부분의 상호작용이 부가적이었다. 9개의 세포주중 4개의 세포주는 TRA-8 및 아드리아마이신간의 상승적 상호작용에 대한 요건을 충족하였다. 2LMP 세포주는 아드리아마이신 또는 파클리탁셀에 대하여 뿐 아니라 TRA-8에 대하여도 양호한 감도를 나타내었다. 이러한 세포주는 항체 및/또는 약물의 생체내 효능을 조사하기 위하여 선택되었다.
Figure 112004018557262-pct00027
(8) TRA-8 단독 또는 화학요법 및/또는 방사선 조사와의 조합의 생체내 항-종양 효과
TRA-8을 200㎍ 및 600㎍ 투여량으로 1주일에 2회 6투여량 투여하였을 때 확립된 2LMP 피하 주사 종양에 대하여 유사한 종양 성장 억제를 보였다(도 24). 세 가지 부가적인 독립적 실험에서, 미처리 대조군과 비교하였을 때 계획당 200㎍ 투여량은 통계적으로 종양 성장의 유의적 억제(p<0.004, 종양 배가 시간에 대한 크루스칼-월리스 시험)를 보였고 이 투여량 및 계획은 추가적인 연구에 대해서도 채택되었다. 도 25는 TRA-8, 아드리아마이신, 또는 TRA-8 및 아드리아마이신의 조합의 항-종양 효능에 대한 효과를 나타낸다. 미처리 대조군과 비교할 때, TRA-8 단독 또는 TRA-8 + 아드리아마이신의 치료는 유의한 종양 성장 억제를 보였고(p=0.002, 크루스칼-윌리스 시험), 반면 아드리아마이신은 대조군과 달랐다. TRA-8 및 아드리아마이신의 조합은 어느 하나만 단독으로 투여하였을 때보다 더 큰 성장 억제를 나타내었고(p=0.002), 단독으로 투여하였을 때 종양의 완전 퇴화가 발견되지 않았던 것(p<0.001, 피셔의 정확한 시험)에 비해 조합한 경우 유의하게 더 큰 종양의 완전 퇴화가 관찰되었다. 생체내 TRA-8 및 아드리아마이신 상승작용을 초기 성장 곡선 분석을 이용하여 측정하였다. 상호작용 관계가 유의하였고(p<0.001) 상승적이었다. 상승적 상호관계는 2번째 독립된 실험에서 확증되었다.
TRA-8 및 파클리탁셀의 효과에 대하여 이와 동일한 모델에서 유사한 방식으로 연구하였다(도 26). 미처리 대조군과 비교하여, TRA-8 및 TRA-8 + 파클리탁셀은 종양 성장의 유의한 억제를 나타내었다(p<0.001, 크루스칼-월리스 시험). TRA-8 + 파클리탁셀로 처리한 동물에서 종양 성장은 파클리탁셀 단독으로 처리한 것(p=0.008)과 상당히 달랐고 어느 하나만 단독 처리한 경우 완전 퇴화가 나타나지 않았던 것에 비해 3/8의 완전 퇴화를 보였다. 초기 종양 성장 곡선의 분석으로 상승적 효과가 거의 유의함을 보이고 있고(p+0.063), 반면 부가적 효과는 유의했다(p<0.001).
최종적으로, 도 27에 지시된 바와 같이 단독 및 여러 조합에서의 TRA-8, 아드리아마이신 및 60Co 조사의 효과를 분석하였다. 종양 배가 시간에 관하여 전체적으로 유의한 차이가 있었고(p<0.001) 다중 비교로 TRA-8, 아드리아마이신 및 60Co 의 3중 치료가 다른 치료군보다 유의하게 다른 종양 성장 억제를 나타내었고, 반면 두 가지 치료군(아드리아마이신 + TRA-8 또는 60Co + TRA-8)은 단일제군(p<0.01)과 달랐다. 방사선 조사만으로 처리한 60Co 동물은 미처리 대조군과 다르지 않았다(p=0.926). 모든 두 방식 처리 조합은 유의한 상승 효과를 나타내었다(p<0.001). 완전 퇴화가 3중 치료를 받은 6/8의 동물에서 관찰되었고 4마리의 동물은 이후 180일이 지나서도 종양이 재발하지 않았다.
(9) 치료 효과의 군집 분석
생체내 항-종양 연구는 166마리의 동물로 이루어졌고, 각 처리군의 모든 동물에 대하여 종양 배가 시간 및 완전 종양 퇴화 빈도를 분석하였다(표 6). 평균 종양 배가 시간에 대한 ANOVA 분석은 치료군간 유의한 차이를 나타냄(p<0.001)을 보였는데, 다중 비교로 TRA-8 + 파클리탁셀, TRA-8 + 아드리아마이신 및 TRA-8 + 아드리아마이신 + 60Co는 TRA-8이 결핍된 다른 치료군보다 더 오랜 평균 종양 배가 시간을 가짐을 알 수 있었다. 어느 치료법에 TRA-8의 부가는 그 치료법 단독인 경우보다 더 오랜 종양 배가 시간을 나타내었다. 유사하게, 종양 배가에 대한 중간 시간에 관한 크루스칼-월리스 시험에서 전체적으로 중간값이 유의하게 다름을 알 수 있었다(p<0.001). 윌콕신(Wilcoxin) 표지된 등급 시험을 이용한 쌍 비교는 종양 배가 중간 시간에 대하여 ANOVA 다중 비교와 유사한 양상을 나타내었다. 이러한 분석은 본 실험의 종료시까지 종양의 배가에 도달하지 않은 군이 실험 종료일에 결정되었다는 점에서, 가장 효과적인 처리에 의해 일어난 성장 억제를 평가절하한다. 표 6은 또한 실험의 종료시까지 종양의 완전 퇴화 빈도 및 종료의 지속 빈도를 제공한다. 확립된 종양 성장 및 종양 공격성에 대하여 화학요법 처방 또는 방사선 조사 어느 하나만으로 처리한 동물에서는 종양의 완전 퇴화가 없었다. 피셔의 정확한 시험으로부터, 처리군간 종양 완전 퇴화 빈도에서 유의한 차이가 있었다(p<0.001). 166마리의 동물중 30마리에서 완전 퇴화가 성취되었고, 이들중 28마리에는 TRA-8을 단독 투여하거나 다른 것과 조합하여 투여하였다. 42마리의 대조 동물중 1마리; 화학요법, 방사선 조사 또는 조합을 받은 54마리의 동물중 1마리; 및 TRA-8 단독 또는 TRA-8 조합 처방을 받은 68마리의 동물중 28마리에서 완전 퇴화가 일어났다. TRA-8 처리군은 완전 퇴화의 빈도가 유의하게(p<0.001) 더 컸다. 유사하게, 대조군 42마리중 1마리 및 화학요법 및/또는 방사선 조사 처리한 52마리의 동물중 0마리에서 종양 재성장이 일어나지 않았던 것에 비하여, TRA-8 또는 TRA-8 조합을 투여받은 경우 68마리의 동물중 14마리에서는 종양 재성장이 일어나지 않았다. 재발이 일어나지 않는 퇴화는 99 내지 171일의 기간(146±24일)동안 관찰하였다.
Figure 112004018557262-pct00028
(10) 처리한 종양에서의 세포사멸
TRA-8, 아드리아마이신, 파클리탁셀, TRA-8 + 아드리아마이신, 및 TRA-8 + 파클리탁셀로의 처리후 2LMP 이종이식편중의 세포사멸-유도를 투넬 분석을 이용하여 분석하였다. 미처리 동물에서, 종양은 4%(1%는 진함)의 염색 세포를 가졌고, 반면 아드리아마이신 또는 파클리탁셀로 처리한 동물에서는 8%(6%는 진함) 및 7%(2%는 진함) 염색 세포를 가졌다. TRA-8 단독으로 처리한 동물은 25%(15%는 진함) 염색세포를 가져 현저한 세포사멸을 나타내었다. TRA-8 + 아드리아마이신은 28%(22%는 진함)였고, TRA-8 + 파클리탁셀은 26%(12%는 진함)의 염색 세포를 가졌다.
본 명세서에서 언급한 어떤 특허나 출판물은 본 발명이 속하는 기술분야에서의 숙련자의 수준으로 기술하고 있다. 이러한 특허 또는 출판물은 각각의 출판물이 특이적으로 및 개별적으로 참고로 인용되도록 의도된 것과 같은 정도로 본원에 참고로 인용되었다.
본 발명은 실시예에서 개시된 상기 기탁물 또는 실시양태에 의해 제한되지 않으며, 이는 본 발명의 몇몇 양태 및 임의의 실시양태의 설명이 본 발명의 범주내에 있는 것으로 의도된다. 본원에 나타나고 기술된 변형 이외에, 본 발명의 다양한 변형은 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이며, 첨부된 청구의 범위의 범주내에 포함되는 것으로 의도된다.
참고 문헌
Figure 112004018557262-pct00029
Figure 112004018557262-pct00030
Figure 112004018557262-pct00031
Figure 112004018557262-pct00032
<110> UAB RESEARCH FOUNDATION <120> AN ANTIBODY SELECTIVE FOR A TUMOR NECROSIS FACTOR-RELATED APOPTOSIS-INDUCING LIGAND RECEPTOR AND USES THEREOF <150> US 60/346,402 <151> 2001-11-01 <160> 102 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 1 gacgatgccc gatctacttt aaggg 25 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 2 ccactgggtg atgttggatg gg 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 3 ggatccgtgg acacattcga tgtc 24 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 4 Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 6 cagcactgaa cacggacccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 7 aaaggtaatt tattgagaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> 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catcagtagg agacagggtc 120 agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta tcaacagaaa 180 ccagggcaat ctcctaaact actgatttac tgggcatcca cccggcacac tggagtccct 240 gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag caatgtgcag 300 tctgaagact tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac gttcggtgga 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa 705 <210> 23 <211> 462 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 23 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser 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Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 75 <211> 213 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 76 <211> 213 <212> PRT <213> synthetic construct <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 77 <211> 60 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 77 gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60 60 <210> 78 <211> 65 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60 ccagg 65 <210> 79 <211> 69 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 79 cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt 60 cttaagctt 69 <210> 80 <211> 67 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 80 ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga 60 cagggtc 67 <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag 54 <210> 82 <211> 67 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 60 ccaggaa 67 <210> 83 <211> 72 <212> DNA <213> synthetic construct <400> 83 tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt 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Claims (104)

  1. 종양 괴사 인자-관련 세포사멸-유도 리간드(TRAIL) 수용체 DR4에 특이적으로 결합하되, DR5, DcR1 또는 DcR2에는 결합하지 않으며, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC) 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12에 의해 생산되며, DR4를 발현하는 표적 세포에서 가용성 형태로서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는 단일클론성 항체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    DR4가 인간 DR4인 단일클론성 항체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    표적 세포가 암 세포인 단일클론성 항체.
  6. 청구항 6은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서,
    표적 세포가 류머티스성 관절염 활막 세포인 단일클론성 항체.
  7. 청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 있어서,
    표적 세포가 활성 림프구인 단일클론성 항체.
  8. ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12와 동일한 에피토프 특이성을 갖는 단일클론성 항체.
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    인간화된 항체.
  11. 청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 따른 항체의 치료량을 DR4를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR4를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 포함하는, DR4를 발현하는 표적 세포에서 세포사멸을 선택적으로 유도하는 방법.
  12. 청구항 12은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    접촉이 생체내에서 이루어지는 방법.
  13. 청구항 13은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    접촉이 시험관내에서 이루어지는 방법.
  14. 청구항 14은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    표적 세포가 암 세포인 방법.
  15. 청구항 15은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    표적 세포가 류머티스성 관절염 활막 세포인 방법.
  16. 청구항 16은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    표적 세포가 활성 림프구인 방법.
  17. 청구항 17은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    표적 세포가 바이러스 감염된 세포인 방법.
  18. 청구항 18은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    TRAIL 수용체 DR5에 특이적으로 결합하는 제 2 항체의 치료량을 DR5를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR5를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제 2 항체가 가용성 형태로 상기 표적 세포에서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는 방법.
  19. 청구항 19은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    치료제를 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  20. 청구항 20은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 방법.
  21. 청구항 21은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  22. 청구항 22은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 방법.
  23. 청구항 23은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    치료제가 파클리탁셀인 방법.
  24. 청구항 24은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 방법.
  25. 청구항 25은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 11 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 청구항 26은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 18 항에 있어서,
    치료제를 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 청구항 27은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 방법.
  28. 청구항 28은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  29. 청구항 29은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 방법.
  30. 청구항 30은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서,
    치료제가 파클리탁셀인 방법.
  31. 청구항 31은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 26 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 방법.
  32. 청구항 32은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 18 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 청구항 33은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 19 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 청구항 34은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 10 항에 따른 항체의 치료량을 DR4를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR4를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 포함하는, DR4를 발현하는 표적 세포에서 세포사멸을 선택적으로 유도하는 방법.
  35. 청구항 35은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 1 항에 따른 항체의 치료량을 DR4를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR4를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 포함하는, DR4를 발현하는 표적 세포의 증식을 억제하는 방법.
  36. 청구항 36은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    접촉이 생체내에서 이루어지는 방법.
  37. 청구항 37은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    접촉이 시험관내에서 이루어지는 방법.
  38. 청구항 38은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    표적 세포가 암 세포인 방법.
  39. 청구항 39은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    표적 세포가 류머티스성 관절염 활막 세포인 방법.
  40. 청구항 40은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    표적 세포가 활성 림프구인 방법.
  41. 청구항 41은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    TRAIL 수용체 DR5에 특이적으로 결합하는 제 2 항체의 치료량을 DR5를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR5를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제 2 항체가 가용성 형태로 상기 표적 세포에서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는 방법.
  42. 청구항 42은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    치료제를 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 청구항 43은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 방법.
  44. 청구항 44은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  45. 청구항 45은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 방법.
  46. 청구항 46은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    치료제가 파클리탁셀인 방법.
  47. 청구항 47은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 방법.
  48. 청구항 48은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 35 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  49. 청구항 49은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 41 항에 있어서,
    치료제를 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 청구항 50은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 49 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 방법.
  51. 청구항 51은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 49 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  52. 청구항 52은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 49 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 방법.
  53. 청구항 53은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 49 항에 있어서,
    치료제가 파클리탁셀인 방법.
  54. 청구항 54은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 49 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 방법.
  55. 청구항 55은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 41 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 청구항 56은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 42 항에 있어서,
    표적 세포를 방사선 조사하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  57. 청구항 57은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 10 항에 따른 항체의 치료량을 DR4를 발현하는 비-인간 표적 세포와 생체내 또는 시험관내에서 접촉시키거나, 또는 DR4를 발현하는 인간 표적 세포와 시험관내에서 접촉시키는 단계를 포함하는, DR4를 발현하는 표적 세포의 증식을 억제하는 방법.
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 대상(subject)내 암 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 제 1 항에 따른 항체의 치료량을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서,
    TRAIL 수용체 DR5에 특이적으로 결합하는 제 2 항체의 치료량을 추가로 포함하되, 상기 제 2 항체가 가용성 형태로 DR5를 발현하는 악성 종양 세포에서 생체내 및 시험관내 세포사멸-유도 활성을 갖는 약학 조성물.
  62. 제 60 항에 있어서,
    치료제를 추가적으로 포함하는 약학 조성물.
  63. 제 62 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 약학 조성물.
  64. 제 62 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 약학 조성물.
  65. 청구항 65은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 62 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 약학 조성물.
  66. 청구항 66은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 62 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 약학 조성물.
  67. 제 60 항에 있어서,
    방사선 조사 치료되는 대상에게 투여하기 위한 약학 조성물.
  68. 제 61 항에 있어서,
    치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  69. 제 68 항에 있어서,
    치료제가 화학요법제인 약학 조성물.
  70. 제 68 항에 있어서,
    치료제가 블레오마이신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 다우노루비신, 악티노마이신, 디에틸스틸베스트롤, 독소루비신, 에토포시드, 5-플루오로우라실, 플록스우리딘, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 6-머캅토퓨린, 테니포시드, 6-티오구아닌, 빈크리스틴 및 빈블라스틴으로 구성된 군으로부터 선택된 약학 조성물.
  71. 청구항 71은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 68 항에 있어서,
    치료제가 독소루비신인 약학 조성물.
  72. 제 68 항에 있어서,
    치료제가 파클리탁셀인 약학 조성물.
  73. 청구항 73은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 69 항에 있어서,
    치료제가 메토트렉세이트인 약학 조성물.
  74. 제 61 항에 있어서,
    방사선 조사 치료되는 대상에게 투여하기 위한 약학 조성물.
  75. 제 62 항에 있어서,
    방사선 조사 치료되는 대상에게 투여하기 위한 약학 조성물.
  76. 대상내 암 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 제 10 항에 따른 항체의 치료량을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  77. DR4 수용체를 갖는 표적 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 제 1 항에 따른 항체의 치료량을 포함하는 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  78. 청구항 78은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 77 항에 있어서,
    표적 세포가 활성 면역 세포인 약학 조성물.
  79. 청구항 79은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 78 항에 있어서,
    활성 면역 세포가 활성 림프구인 약학 조성물.
  80. 청구항 80은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.
    제 77 항에 있어서,
    표적 세포가 류머티스성 관절염 활막 세포인 약학 조성물.
  81. 제 77 항에 있어서,
    표적 세포의 세포사멸을 유도하는 제 2 항체의 치료량을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  82. 제 77 항에 있어서,
    염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 치료량의 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  83. 제 81 항에 있어서,
    염증성 질환 또는 자가면역 질환의 치료에 사용되는 치료제의 치료량을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  84. DR4 수용체를 갖는 표적 세포의 세포사멸을 선택적으로 유도하는 제 10 항에 따른 항체의 치료량을 포함하는, 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물.
  85. ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12에 의해 발현되며, TRAIL 수용체 DR4에 결합할 수 있고 DR4 수용체를 갖는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 항체의 중쇄 면역글로불린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 제 85 항에 있어서,
    코딩된 중쇄가 인간화된 단리된 핵산.
  89. 제 88 항에 따른 핵산 및 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 인자를 포함하는 벡터.
  90. 제 89 항에 따른 벡터를 포함하는 배양 세포.
  91. ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12에 의해 발현되며, TRAIL 수용체 DR4에 결합할 수 있고 DR4 수용체를 갖는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 항체의 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 제 91 항에 있어서,
    코딩된 경쇄가 인간화된 단리된 핵산.
  95. 제 94 항에 따른 핵산 및 핵산에 작동가능하게 연결된 조절 인자를 포함하는 벡터.
  96. 제 95 항에 따른 벡터를 포함하는 배양 세포.
  97. ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12에 의해 발현되며, TRAIL 수용체 DR4에 결합할 수 있고 DR4 수용체를 갖는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 항체의 중쇄 면역글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드.
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 제 97 항에 있어서,
    중쇄 면역글로불린이 인간화된 정제된 폴리펩티드.
  101. ATCC 수탁 번호 PTA-3798을 갖는 하이브리도마 2E12에 의해 발현되며, TRAIL 수용체 DR4에 결합할 수 있고 DR4 수용체를 갖는 세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 항체의 경쇄 면역글로불린의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드.
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 제 101 항에 있어서,
    경쇄 면역글로불린이 인간화된 정제된 폴리펩티드.
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