PL211755B1 - Oczyszczone przeciwciało wiążące wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL, sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych, sposób hamowania prolifereacji komórek docelowych, kompozycja farmaceutyczna zawierająca przeciwciało, zastosowanie przeciwciała, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, hodowana komórka i oczyszczony polipeptyd - Google Patents

Abstract

Przeciwciało według wynalazku wchodzi w reakcję z ludzkim DR5 lub z ludzkim DR4 wytwarzając agonistyczne lub antagonistyczne efekty regulacji ujemnej receptora obejmujące hamowanie proliferacji komórkowej i apoptozy. Ujawniono sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencje aminokwasowe przeciwciał DR5 i DR4 oraz wektory i komórki zawierające i eksprymujące te sekwencje były wygenerowane. Opisano szczegółowo sposoby i zastosowania dla tych przeciwciał włączając leczenie związanych z apoptozą chorób i leczenia nieprawidłowego wzrostu komórkowego.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczone przeciwciało wiążące wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL, sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych, sposób hamowania proliferacji komórek docelowych, kompozycja farmaceutyczna zawierająca to przeciwciało, zastosowanie tego przeciwciała, wyizolowany kwas nukleinowy, wektor, hodowana komórka i oczyszczony polipeptyd.

Niniejszy wynalazek dotyczy oczyszczonego przeciwciała, które zdolne jest do specyficznego wiązania się z pojedynczym typem receptora dla liganda indukującego apoptozę (określanego tu dalej jako „TRAIL), spokrewnionego z czynnikiem martwicy nowotworu (określanego tu dalej jako „TNF), bardziej szczegółowo dotyczy przeciwciała monoklonalnego, które indukuje apoptozę in vivo i in vitro w komórkach z ekspresją pojedynczego typu receptora oraz terapii na nim opartych.

Tło wynalazku

TRAIL jest członkiem rodziny białek TNF, która obejmuje także TNF-α i ligand Fas (1). Białka te są silnymi induktorami apoptozy. Do tej pory zidentyfikowano pięć receptorów TRAIL, z których dwa, DR4 (TRAIL-R1) i DR5 (TRAIL-R2) (2-7), są zdolne do przenoszenia sygnału apoptotycznego, podczas gdy pozostałe trzy DcR1 (TRAIL-R3), DcR2 (TRAIL-R4) oraz osteoprotegryna (OPG) nie przenoszą sygnału apoptotycznego (8-12). Wszystkie pięć receptorów TRAIL wykazuje znaczną homologię zewnątrzkomórkowych domen wiążących ligand. Podobnie do receptora I dla Fas i TNF (określanego tu dalej jako „TNFRI), wewnątrzkomórkowe segmenty zarówno DR4, jak i DR5 zawierają domenę śmierci i przenoszą sygnał apoptotyczny przez szlak, który angażuje białko z domeną śmierci związane z Fas (określane tu dalej jako „FADD i kaspazę 8 (6, 7). Ponadto oprócz przenoszenia sygnału apoptotycznego, receptory DR4 i DR5 mogą także aktywować szlak angażujący Nfab (6, 7).

Biologiczne funkcje TRAIL, które zostały wykazane obejmują zdolność TRAIL do selektywnej indukcji apoptozy w transformowanych komórkach nowotworowych, przy czym komórki zdrowe są stosunkowo oporne na apoptozę w której pośredniczy TRAIL (13-15). Ta selektywność sugeruje, że w przeciwieństwie do ligandu Fas, podawanie TRAIL jest związane z bardzo niskimi poziomami toksyczności, jak pokazano poprzez ogólnoustrojowe podawanie TRAIL w modelu zwierzęcym bez indukowania znaczącej toksyczności (13). Tak więc, zaproponowano TRAIL jako silny środek indukujący apoptozę, który byłby odpowiednim środkiem terapeutycznym w leczeniu nowotworu i innych chorób związanych z nieprawidłową proliferacją komórek. Zaproponowano także TRAIL jako silny środek indukujący apoptozę, który mógłby być odpowiedni do leczenia chorób autoimmunologicznych i zapalnych. Wykazano, że związana z TRAIL apoptoza bierze udział w śmierci komórek T, jaka jest indukowana aktywacją komórek, służąc tym samym jako alternatywny mechanizm dla liganda Fas (16, 17). Apoptoza za pośrednictwem TRAIL może także odgrywać rolę w indukcji apoptozy komórek T i innych komórek zapalnych (18) i odgrywa rolę w uśmiercającej aktywności komórek NK (19-21) oraz immunomodulującej funkcji komórek dendrytowych (22, 23). Tak więc, apoptoza za pośrednictwem TRAIL może także odgrywać rolę w nietykalności immunologicznej i nadzorze immunologicznym.

System receptora TRAIL jest złożony i obejmuje przynajmniej dwa receptory śmierci, DR4 i DR5, oraz przynajmniej dwa receptory nieapoptotyczne, DcR1 i DcR2. Wszystkie te receptory wykazują nie tylko dużą homologię sekwencji aminokwasowych, ale także podobne powinowactwo wiązania do TRAIL (2-12). Zdolność receptorów DcR1 i DcR2 do współzawodniczenia w wiązaniu z TRAIL bez indukcji apoptozy sugeruje, że mogą one działać jako receptory przynętowe, które blokują lub modulują aktywność liganda TRAIL. Ponadto stwierdzono, że niestransformowane komórki posiadają wyższy poziom ekspresji receptorów przynętowych, niż komórki transformowane. Tak więc, zaproponowano, że różnicująca modulacja ekspresji receptorów śmierci i receptorów przynętowych może reprezentować kluczowy mechanizm regulacyjny, który determinuje podatność komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, lecz dzięki brakowi przeciwciał specyficznych do receptora (2). Pomimo, że ekspresja i funkcja DR4 i DR5 były intensywnie badane, postęp w badaniach był hamowany poprzez brak specyficznych dla receptora przeciwciał monoklonalnych. Ekspresja DR5 na powierzchni komórki nie została udokumentowana. Doniesiono o wytworzeniu zestawu przeciwciał przeciwko receptorowi TRAIL, które są zdolne in vitro do indukcji apoptozy w komórkach czerniaka, ale tylko po unieruchomieniu przeciwciał, żeby promować wiązanie krzyżowe, a w niektórych przypadkach komórki wymagają hodowli z aktynomycyną D (24). Wytworzono kilka przeciwciał anty-DR5 (24). Jednakże wcześniej wytworzone przeciwciała monoklonalne anty-DR5 mają niską aktywność indukcji apoptozy in vitro,

PL 211 755 B1 nawet w warunkach wiązania krzyżowego. Nie stwierdzono żadnej aktywności in vivo. Przeciwciała te nie były używane do badania ekspresji receptorów TRAIL na powierzchni komórki (24). Tak więc, istnieje potrzeba wytworzenia przeciwciała monoklonalnego selektywnego względem każdego specyficznego receptora TRAIL, które jest nie tylko zdolne do wiązania receptora na powierzchni komórki, ale także silnie indukuje apoptozę w różnych typach nieprawidłowych komórek, włączając komórki nowotworowe, zarówno in vivo, jak i in vitro bez potrzeby wiązania krzyżowego lub immobilizacji. Takie przeciwciało nie tylko dostarczyłoby potencjalnego środka terapeutycznego, ale także narzędzia diagnostycznego do funkcjonalnej analizy receptora TRAIL. Istnieje szczególna potrzeba wytworzenia specyficznego przeciwciała przeciwko każdemu z receptorów DR4 i DR5 indukujących śmierć.

Przyczyną rozwoju lub postępu wielu chorób jest to, że komórki nie są eliminowane. W wielu chorobach autoimmunologicznych i w stanach zapalnych, przeżywające zaktywowane komórki atakują zdrowe tkanki i komórki. Ponadto, postęp nowotworzenia i formowanie łuszczki rozrostowej reumatoidalnego zapalenia stawów charakteryzują się niekontrolowaną proliferacją komórek. A zatem, niedostateczna apoptoza prowadzi do rozwoju choroby i zastosowania liganda indukującego apoptozę lub agonistycznego przeciwciała monoklonalnego w celu wzmocnienia apoptozy mogą być rozważane jako potencjalna strategia w eliminacji tych niechcianych komórek.

Na przykład, reumatoidalne zapalenie stawów (określane tu dalej jako „RA”) jest powszechną ludzką chorobą autoimmunologiczną. Obecne zrozumienie patofizjologii RA jest takie, że autoimmunologiczne komórki T i komórki B inicjują odpowiedź zapalną w stawach, co powoduje hiperproliferację komórek mazi stawowej. Jako konsekwencja hiperproliferacji komórek maziówkowych, metaloproteiny (określane tu dalej jako „MMPs) ulegają nadprodukcji, co z kolei prowadzi do erozyjnej destrukcji chrząstki i kości, które jest charakterystyczne dla RA (25). Tak więc kontrola hiperproliferacji zapalnych komórek maziówkowych jest kluczowym etapem w leczeniu RA. Mechanizm molekularny prowadzący do hiperpolaryzacji komórek maziówkowych jest nadal nieznany. Pomimo, że hiperproliferujące komórki maziówkowe są niezłośliwe i niestransformowane, wiele badań sugerowało, że mają one pewne wspólne cechy z komórkami transformowanymi (46). Komórki te, tak zwane „komórki maziówkowe z cechami transformacji charakteryzują się gęstą szorstką siateczkę śródplazmatyczną, licznymi nieregularnymi jądrami i zmianami w zwykle wrzecionowatym cytoszkielecie komórki. Zaproponowano, że wbudowanie onkogenów i genów pochodzenia wirusowego może być pierwotnym czynnikiem zmiany komórek maziówkowych RA w kierunku transformacji (46).

Przynajmniej dwa aspekty RA sugerują, że w procesie chorobowym może odgrywać rolę rozregulowana apoptoza a terapeutyczne wywołanie apoptozy może być skutecznym leczeniem: defekt w usuwaniu zaktywowanych komórek T sugeruje, że istnieje wadliwa indukowana aktywacją śmierć tych komórek T, która jest procesem angażującym apoptozę za pośrednictwem Fas i apoptozę za pośrednictwem TRAIL, a hiperproliferacyjna natura komórek maziówkowych RA jest istotnym czynnikiem patofizjologii w późniejszych stadiach RA. Istotnie, wykazano, że podawanie przeciwciała anty-Fas do stawów w stanie zapalnym hamuje rozwój przewlekłego zapalenia stawów w transgenicznych myszach tax, które są zwierzęcym modelem ludzkiego RA (26). Ponadto zlokalizowana transdukcja genem liganda Fas przy pomocy wektora adenowirusowego jest skuteczna w zapobieganiu zapalenia stawów indukowanego kolagenem (27). Zahamowanie proliferacji zapalnych komórek maziówkowych przez wzmocnienie apoptozy za pośrednictwem Fas jest obserwowane w obydwu przypadkach. Pomimo, że ligand Fas jest silnym induktorem apoptozy w komórkach maziówkowych RA, stosowanie apoptozy indukowanej ligandem Fas jako terapii dla ludzi było ograniczone przez letalną toksyczność dla wątroby. Tak więc, apoptoza indukowana przez receptor TRAIL reprezentuje bezpieczniejszą i bardziej skuteczną terapię w leczeniu RA niż apoptoza indukowana ligandem Fas.

Apoptoza indukowana poprzez receptor TRAIL reprezentuje także bezpieczniejszą i bardziej skuteczną terapię w leczeniu nowotworu niż apoptoza indukowana ligandem Fas. Wiadomo, że apoptoza indukowana TRAIL specyficznie indukuje apoptozę transformowanych komórek nowotworowych bez wpływu na komórki zdrowe. Wykazano, że ogólnoustrojowe podawanie rozpuszczalnego trimeru TRAIL nie powoduje toksyczności u zwierząt eksperymentalnych nadal indukując cofanie się implantowanych guzów (13, 28). Jego zaleta jako terapii wspomagającej tradycyjne sposoby leczenia została podkreślona przez obecne odkrycia ujawniające, że ekspresja DR5 i podatność na apoptozę indukowaną TRAIL komórek nowotworu piersi jest wzmocniona przez napromieniowanie, sugerując, że skuteczność TRAIL byłaby zwiększona w leczeniu nowotworu w połączeniu z napromieniowaniem (29).

Ponadto gen kodujący receptor DR5 TRAIL został zmapowany do chromosomu 8p21-22, miejsca z wysoką częstością mutacji w pewnych komórkach nowotworowych (30). Stwierdzono, że przy4

PL 211 755 B1 najmniej dwa rodzaje komórek nowotworowych, drobnokomórkowy rak płuc (31) i rak głowy i szyi (32) wykazuje mutacje w domenie śmierci w genie DR5. Tak więc, istnieje potrzeba skonstruowania przeciwciała anty-DR5 w badaniach nowotworu w celu określenia efektu zmian w epitopach receptora podczas rozwoju i progresji nowotworów. Ponadto, funkcjonalna analiza mutacji receptora TRAIL dostarczyłaby użytecznego narzędzia diagnostycznego przy użyciu w połączeniu z innymi biomarkerami we wczesnym wykrywaniu nowotworów i określaniu agresywności nowotworu.

Przedmiotem wynalazku jest zatem oczyszczone przeciwciało, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

W korzystnym wykonaniu wynalazku oczyszczone przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wspomniane DR4 jest ludzkim DR4, a komórką docelową korzystnie jest komórka nowotworowa. Komórką docelową może być także komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów, ewentualnie aktywowany limfocyt.

W następnym korzystnym rozwiązaniu oczyszczone przeciwciało będące przeciwciałem monoklonalnym, wytwarzane jest przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

W korzystnym rozwiązaniu oczyszczone przeciwciało według wynalazku jest przeciwciałem humanizowanym.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR4, obejmujący etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała jak zdefiniowano powyżej.

W korzystnym wykonaniu wynalazku sposób obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

W sposobie według wynalazku komórką docelową korzystnie jest komórka nowotworowa, ewentualnie komórką docelową jest komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów, oraz także korzystnie komórką docelową jest aktywowany limfocyt.

Komórką docelową może być także korzystnie komórka zakażona wirusem.

W następnej korzystnej postaci wynalazku sposób obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym, i w tym przypadku także w bardziej korzystnym wykonaniu sposobu komórki docelowe napromieniowuje się.

Czynnikiem terapeutycznym korzystnie jest czynnik chemioterapeutyczny.

Czynnik terapeutyczny korzystnie jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksorubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

W sposobie według wynalazku korzystnie czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna, ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel, lub także czynnikiem terapeutycznym może być metotreksat.

W kolejnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku, sposób ten obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor DR5 dla TRAIL, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro komórek docelowych wyrażających DR5, a bardziej korzystnie komórki docelowe ponadto napromieniowuje się.

W tym powyżej opisanym wykonaniu w następnej korzystnej postaci wynalazku sposób obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym, i w tym przypadku także, w bardziej korzystnym wykonaniu sposobu komórki docelowe napromieniowuje się.

Korzystnie czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny. Bardziej korzystnie czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

Także korzystnie czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna, ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel, lub też metotreksat.

PL 211 755 B1

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR4, który polega na tym, że obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około

0,1 μg/ml, i które to przeciwciało jest humanizowane.

Przedmiotem wynalazku jest sposób hamowania proliferacji komórek docelowych wyrażających DR4, który to sposób obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek z terapeutyczną ilością przeciwciała, wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

Sposób ten korzystnie obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

W korzystnym wykonaniu sposób według wynalazku doprowadzenie do kontaktu ma miejsce in vitro.

Korzystnie komórką docelową jest komórka nowotworowa, a bardziej korzystnie komórką docelową jest komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

W następnym korzystnym wykonaniu sposobu komórką docelową jest aktywowany limfocyt.

Sposób według wynalazku jak zdefiniowano powyżej obejmuje ponadto kontaktowanie komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym. Bardziej korzystnie i w tym wykonaniu dokonuje się napromieniowania komórek docelowych.

Korzystnym czynnikiem terapeutycznym może być czynnik chemioterapeutyczny.

Czynnik terapeutyczny jest korzystnie wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

Czynnikiem terapeutycznym w sposobie według wynalazku korzystnie jest doksorubicyna, ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel, lub też czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

W innej korzystnej postaci wynalazku sposób obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor TRAIL DR5, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro komórek docelowych wyrażających DR5.

Korzystnie sposób ten obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

Sposób według wynalazku może obejmować korzystnie ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym, a bardziej korzystnie obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

Czynnik terapeutyczny jest korzystnie wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

Czynnikiem terapeutycznym w sposobie według wynalazku korzystnie jest doksorubicyna, ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel, lub też czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób hamowania proliferacji komórek docelowych wyrażających DR4, obejmujący etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA6

PL 211 755 B1

-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml, i które to przeciwciało jest humanizowane.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera terapeutyczną ilość przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja charakteryzująca się tym, że zawiera terapeutyczną ilość przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml, i które to przeciwciało jest humanizowane i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml, do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała selektywnie indukuje apoptozę komórek nowotworowych u tego osobnika.

Zgodnie z wynalazkiem zastosowanie korzystnie obejmuje ponadto poddanie osobnika radioterapii.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku kompozycja obejmuje ponadto czynnik terapeutyczny, którym korzystnie jest czynnik chemioterapeutyczny. Zastosowanie według wynalazku obejmuje w tym przypadku także poddawanie osobnika radioterapii.

Czynnik terapeutyczny korzystnie może być wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku czynnikiem terapeutycznym jest korzystnie doksorubicyna, paklitaksel ewentualnie, lub ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

W następnym korzystnym wykonaniu wynalazku w zastosowaniu kompozycja obejmuje ponadto terapeutyczną ilości przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor TRAIL DR5, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w złośliwych komórkach nowotworowych wyrażających DR5.

Zastosowanie według wynalazku obejmuje ponadto poddawanie osobnika radioterapii.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku kompozycja obejmuje ponadto czynnik terapeutyczny a bardziej korzystnie obejmuje ponadto poddanie osobnika radioterapii. W zastosowaniu według wynalazku bardziej korzystnym czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

Zgodnie z wynalazkiem czynnik terapeutyczny korzystnie może być wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

PL 211 755 B1

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna, ewentualnie czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie przeciwciała które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około

0,1 μg/ml, i które to przeciwciało jest humanizowane do wytarzania kompozycji do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym terapeutyczna ilość tego przeciwciała selektywnie indukuje apoptozę komórek nowotworowych u osobnika.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml, do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z chorobą zapalną albo chorobą autoimmunologiczną, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR4, a korzystnie obejmuje ponadto terapeutyczną ilość czynnika terapeutycznego stosowanego w leczeniu choroby zapalnej albo choroby autoimmunologicznej.

Według wynalazku w zastosowaniu komórkami docelowymi są korzystnie aktywowane komórki immunologiczne, przy czym bardziej korzystnie aktywowanymi komórkami immunologicznymi są aktywowane limfocyty.

W innym korzystnym wykonaniu zastosowania komórkami docelowymi są komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

Według wynalazku w zastosowaniu przeciwciała do wytwarzania kompozycji, kompozycja ta korzystnie obejmuje ponadto terapeutyczną ilość drugiego przeciwciała, które indukuje apoptozę komórek docelowych oraz także korzystnie może obejmować ponadto terapeutyczną ilość czynnika terapeutycznego stosowanego w leczeniu choroby zapalnej albo choroby autoimmunologicznej.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu .ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml, i które to przeciwciało jest humanizowane do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z chorobą zapalną albo chorobą autoimmunologiczną, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR4.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje immunoglobulinowy łańcuch ciężki przeciwciała, które to przeciwciało wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

W korzystnym wykonaniu wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

PL 211 755 B1

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku wyizolowany kwas nukleinowy zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

Także korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku, charakteryzuje się tym, że kodowany łańcuch ciężki jest łańcuchem ciężkim humanizowanym.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, który zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej i element regulacyjny połączony funkcjonalnie z tym kwasem nukleinowym.

Przedmiotem wynalazku jest również hodowana komórka która charakteryzuje się tym, że zawiera wektor jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje immunoglobulinowy łańcuch lekki przeciwciała, które to przeciwciało wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

Korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

Również korzystnie wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydową, która koduje łańcuch lekki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

W korzystnym wykonaniu wyizolowany kwas nukleinowy kodujący immunoglobulinowy łańcuch lekki charakteryzuje się tym, że kodowany łańcuch lekki jest łańcuchem humanizowanym.

Przedmiotem wynalazku jest również wektor, który zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej i element regulacyjny połączony funkcjonalnie z tym kwasem nukleinowym.

Przedmiotem wynalazku jest również hodowana komórka charakteryzująca się tym, że zawiera wektor zawierający kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej i element regulacyjny połączony funkcjonalnie z tym kwasem nukleinowym.

Przedmiotem wynalazku jest także oczyszczony polipeptyd charakteryzujący się tym, że zawiera sekwencję aminokwasową immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego przeciwciała, które wiąże wybiórczo receptor TRAIL DR4 i nie wiąże DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę

2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

W korzystnej realizacji wynalazku oczyszczony polipeptyd charakteryzuje się tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

W następnej korzystnej postaci wynalazku sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

W innej korzystnej postaci wynalazku oczyszczony polipeptyd charakteryzuje się tym, że łańcuch ciężki immunoglobuliny jest humanizowany.

Przedmiotem wynalazku jest również oczyszczony polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową immunoglobulinowego łańcucha lekkiego przeciwciała które wiąże wybiórczo receptor TRAIL DR4 i nie wiąże DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

PL 211 755 B1

W korzystnej odmianie wynalazku oczyszczony polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasową, która jest sekwencją aminokwasową łańcucha lekkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

Także korzystnie oczyszczony polipeptyd charakteryzuje się tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

Oczyszczony polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że łańcuch lekki immunoglobuliny jest humanizowany.

Dostarczony w wynalazku sposób to indukcja apoptozy w komórkach docelowych albo zahamowanie proliferacji komórek poprzez doprowadzenie do kontaktu komórki z terapeutyczną ilością przeciwciała zdolnego do wiązania się z DR5 lub DR4. W różnych wykonaniach sposobu, apoptoza może być indukowana albo proliferacja komórek zahamowana poprzez doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z obydwoma przeciwciałami.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku oddziałuje z receptorem dla liganda - czynnika martwicy nowotworu, takim jak receptor DR4, DR5, DcR1, DcR2 i OPG, indukując apoptozę w komórkach z ekspresją takiego receptora. Ujawnione jest przeciwciało według tego wynalazku zdolne do selektywnego wiązania agonistycznego lub antagonistycznego epitopu receptora dla liganda - czynnika martwicy nowotworu.

Niniejszy wynalazek pozwala na leczenie choroby związanej z apoptozą, raka, choroby zapalnej lub choroby autoimmunologicznej przy zastosowaniu sposobu, który obejmuje doprowadzenie do kontaktu docelowej tkanki objętej chorobą z terapeutyczną ilością przeciwciała według wynalazku, samego albo w połączeniu z innymi przeciwciałami indukującymi apoptozę i/lub innymi czynnikami terapeutycznymi lub leczeniem.

Ponadto opisana jest fuzja białkowa, która zawiera antygenową sekwencję aminokwasową receptora TRAIL o długości przynajmniej dziesięciu aminokwasów połączoną z białkiem immunoglobuliny lub jego fragmentem zdolnym do wywołania u osobnika odpowiedzi immunologicznej.

Niniejszy wynalazek pozwala na zaprojektowanie terapii genowej, w której komórka docelowa jest transfekowana sekwencją kwasu nukleinowego receptora TRAIL na wektorze ekspresyjnym, tak że receptor TRAIL jest wyrażany na powierzchni komórki docelowej. Komórka docelowa jest następnie eksponowana na przeciwciało, które selektywnie wiąże się do receptora TRAIL.

Dostarczone są sekwencje kwasu nukleinowego i sekwencje aminokwasowe kodujące ciężki i lekki łańcuch immunoglobulin przeciwciała selektywnego dla DR5. Dostarczone są także sekwencje dla przeciwciała selektywnego dla DR4. Wyszczególnione są także wektory, które zawierają sekwencję kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku i komórki gospodarza transformowane wektorem według wynalazku.

Niniejszy wynalazek dostarcza humanizowanego przeciwciała wobec DR5 (np. TRA-8) oraz humanizowanego przeciwciała wobec DR4 (np. 2E12), jak również stransfekowanej komórki wytwarzającej humanizowane przeciwciało wobec DR5 lub stransfekowanej komórki wytwarzającej humanizowane przeciwciało wobec DR4.

Opisany jest sposób wytwarzania humanizowanego przeciwciała wobec DR5 lub przeciwciała wobec DR4, w którym gospodarz jest transformowany sekwencjami kwasu nukleinowego kodującymi humanizowany lekki łańcuch immunoglobuliny i humanizowany ciężki łańcuch immunoglobuliny, po czym gospodarz jest inkubowany przez określony wcześniej okres czasu.

Opisany jest także proces indukowania apoptozy w komórkach docelowych albo hamowania proliferacji komórek, który obejmuje doprowadzenie do kontaktu docelowej komórki z farmaceutycznie skuteczną ilością humanizowanego przeciwciała wobec DR5 lub humanizowanego przeciwciała wobec DR4 albo ich kombinacji, w obecności albo nieobecności innych czynników terapeutycznych i leczenia.

Zestaw do indukowania apoptozy, może zatem zawierać humanizowane przeciwciało TRA-8 selektywne względem DR5 lub humanizowane przeciwciało wobec DR4 (np. humanizowane 2E12); zapakowany w odpowiedni pojemnik wraz z instrukcjami użycia.

Krótki opis rysunków

Fig. 1. Charakterystyka TRA-8. (a.) Specyficzność wiązania TRA-8: analiza typu Western (górny rząd): Rekombinowane fuzje białkowe z rodziny TNFR z użyciem sondy w postaci TRA-8 lub anty-ludzkiej IgG. Ścieżka 1: fuzja białkowa DR5/hIgG1 (immunogen); Ścieżka 2: DR4/hIgG1 (TRAIL-R1);

PL 211 755 B1

Ścieżka 3: DR5/hIgG1; Ścieżka 4: TRAIL-R3 (DcR-1)/hIgG1; Ścieżka 5: TRAIL-R4(DcR-2)/hIgG1; Ścieżka 6, CD95/hIgG1; Ścieżka 7: rozpuszczalny TNFRI. Analiza testem ELISA (niższy rząd): Numery studzienek odpowiadają tym z analizy techniką Western z wyjątkiem studzienki 8, w której jest mysia fuzja białkowa DR5/hIgG1. (b.) Aktywność wiązania rozpuszczalnego TRAIL i TRA-8 do DR5 i DR4: Płytki do testu ELISA pokryto DR5/hIgG1 (lewy panel) lub DR4/hIgG (środkowy panel) a następnie inkubowano z TRAIL lub TRA-8. (c.) Analiza powierzchniowej ekspresji DR5 przy użyciu cytometrii przepływowej. Komórki Cos-7 transfekowano wektorem ekspresyjnym pcDNA3 zawierającym pełnej długości cDNA DR5 (wypełniony histogram), cDNA DR4 (pusty histogram, linia ciągła) lub pustym wektorem (pusty histogram, linia przerywana). Czterdzieści osiem godzin po transfekcji komórki barwiono TRA-8 po czym podawano antymysie IgG1 sprzężone z PE. (d.) Immunohistochemiczna reaktywność DR5 in situ: Cytospinowe preparaty histologiczne komórek Cos-7 transfekowanych wektorem kontrolnym lub ekspresyjnym z DR5 barwiono TRA-8 48 godzin po transfekcji, (e.) Aktywność zabijania TRA-8: komórki Jurkat inkubowano we wskazanych stężeniach TRA-8. Żywotność komórek oznaczano testami ATPLite, MTT i wymiany PI po nocnej hodowli. Wyniki oznaczeń ATPLite i MTT są zaprezentowane jako procent komórek Pl-negatywnych (f.) Analiza aktywacji kaspaz techniką Western: komórki Jurkat były inkubowane w 500 ng/ml TRA-8 przez wskazany czas. Lizaty komórek rozdzielono na 15% żelu SDS-PAGE, przeniesiono na filtr i hybrydyzowano z przeciwciałami przeciwko kaspazom. Strzałki wskazują przecięte podjednostki każdej z kaspaz. g. oznaczanie inhibicji kaspaz: komórki Jurkat inkubowano z 50 ng/ml TRA-8 przez noc w obecności różnych stężeń wskazanych inhibitorów kaspaz. Żywotność komórek była oznaczana testem ATPLite.

Fig. 2. Ekspresja DR5 na powierzchni komórki i podatność na apoptozę za pośrednictwem DR5. Zdrowe komórki T i B świeżo wyizolowane z krwi obwodowej, linie komórkowe komórek T (a i a'), glejaka (b i b'), komórek raka prostaty (c) i komórek B (d) inkubowano z TRA-8 lub kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem IgG, po którym podawano kozie anty-mysie IgG sprzężone z PE. Otwarte histogramy przedstawiają kontrolne przeciwciało izotypowe, podczas, gdy wypełnione histogramy przedstawiają barwienie TRA-8. Apoptozę oznaczono testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koł a) lub TRA-8 (wypeł nione koł a), jak pokazano na a, b' i d.

Fig. 3a'. Linię komórkową U937 komórek T inkubowano z TRA-8 lub z kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem IgG1. Apoptozę oznaczano testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub TRA-8 (wypełnione koła).

Fig. 3. Linie komórkowe glejaka (b) i raka prostaty (c) inkubowano z TRA-8 lub kontrolnym mysim izotypowym przeciwciałem IgG1. Apoptozę oznaczano testem ATPLite po nocnej inkubacji z rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub TRA-8 (wypełnione koła).

Fig. 4 jest serią wykresów pokazujących żywotność ludzkich komórek Jurkat po ekspozycji na wskazane stężenia klonów przeciwciał TRA-1, -8, i -10 (A) oraz TRAIL (B) w obecności ustalonego stężenia wynalezionych klonów przeciwciał przedstawionych na Fig. 4A.

Fig. 5. Ekspresja DR5 w tkankach zdrowych i nowotworowych: Homogenaty tkanek prawidłowych i nowotworowych były hybrydyzowane z TRA-8 i uwidocznione przy pomocy chemiluminescencji. (a). Analiza techniką Western białka DR5 w normalnych tkankach: ścieżka 1: wątroba, ścieżka 2: mózg, ścieżka 3: płuco, ścieżka 4: nerka, ścieżka 5: śledziona, ścieżka 6: jądra. Ścieżka 7: jajnik, ścieżka 8: serce, ścieżka 9: trzustka, b. Analiza techniką Western białka DR5 w tkankach nowotworowych: Hybrydyzowano filtr zawierający tkanki nowotworowe z nowotworów jajnika (ścieżka 1), płuca (ścieżka 2), wątroby (ścieżka 3), odbytnicy (ścieżka 4), szyjki macicy (ścieżka 5), skóry (ścieżka 6), jąder (ścieżka 7), tarczycy (ścieżka 8), macicy (ścieżka 10), żołądka (ścieżka 11), krtani (ścieżka 12), trzustki (ścieżka 13). Immunohistochemia in situ normalnych ludzkich tkanek (c.) i tkanek nowotworowych (d.). Zamrożone skrawki były poddawane immunobarwieniu przy użyciu TRA-8.

Fig. 6. Przeciwnowotworowa aktywność TRA-8. Myszy SCID zaszczepiono podskórnie komórkami 1321N1. Myszom wstrzyknięto dożylnie pojedynczą dawkę 100 μg TRA-8 na drugi dzień po zaszczepieniu nowotworu (a.), lub trzy dawki 100 μg TRA-8 poczynając od 7 dnia po zaszczepieniu nowotworu (b). Wzrost nowotworu oznaczono poprzez masę i zbadany histologicznie w barwieniu H&E. Fotografie pokazują intensywny wzrost guza w myszach kontrolnych, lecz nie w komórkach traktowanych TRA-8 (c, górny rząd), i barwienie H&E guza (c, dolny rząd). Myszom SCID wstrzyknięto dożylnie 10⁶ komórek Jurkat i traktowano pojedynczą dawką TRA-8 na drugi dzień po wstrzyknięciu. Siedem dni później wycięto śledzionę, wybarwiono przeciwciałem przeciwko ludzkiemu CD3 i analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej (d.), lub immunohistochemii (e).

PL 211 755 B1

Fig. 7 pokazuje ekspresję DR5 na powierzchni komórek w komórkach maziówkowych w RA (A) i OA (B). 1 x 10⁶ hodowanych pierwotnych komórek maziówkowych wybarwiono przy użyciu TRA-8 oczyszczonego na kolumnie powinowactwa po czym dodano kozie przeciwciało antymysia IgG1 sprzężone z PE. 10000 żywotnych komórek przeanalizowano na FACSvantage.

Fig. 8 jest serią wykresów pokazujących żywotność komórek jako funkcję stężenia TRAIL i TRA-8 indukujących apoptozę w wybranych szczepach komórek maziówkowych z RA (A) i OA (B) traktowanych różnymi stężeniami rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL (puste koła) lub TRA-8 oczyszczonego na kolumnie powinowactwa (wypełnione koła). Żywotność komórek jest procentem cpm komórek traktowanych w stosunku do cpm komórek niczym nie traktowanych.

Fig. 9 jest serią wykresów pokazujących zależność apoptozy indukowanej DR5 od kaspaz w komórkach maziówkowych RA. Komórki maziówkowe RA (RA512) są inkubowane z 50 ng/ml rozpuszczalnego ligandu Fas (puste kwadraty), przeciwciałem anty-Fas (CH-11) (wypełnione kwadraty), rozpuszczalnym TRAIL (puste koła) lub przeciwciałem anty-DR5 (TRA-8) (wypełnione koła) w obecności różnych stężeń inhibitorów kaspaz. Po nocnej hodowli żywotność komórek oznaczano przy zastosowaniu ATPLite.

Fig. 10A jest oznaczeniem zmiany migracji podczas elektroforezy w żelu wskazującej na aktywację NfKb. Przed wykonaniem elektroforezy komórki RA1016 inkubowano z 20 ng/ml TNF-a, 50 ng/ml rozpuszczalnego TRAIL lub 50 ng/ml TRA-8 w ciągu wskazanych okresów czasu. Fig. 10B i C są wykresami pokazującymi produkcję MMP-1 i MMP-3. 1x10⁶/ml wskazanych komórek maziówkowych RA inkubowano ze wskazanymi stężeniami TNF-a (puste koła), TRAIL (puste trójkąty) lub TRA-8 (wypełnione koło). Po nocnej hodowli zebrano z hodowli supernatanty. Poziomy MMPs w supernatantach z hodowli oznaczano testem ELISA.

Fig. 11. TRA-8 nie indukuje toksyczności w komórkach wątroby. (a.) W normalnych tkankach wątrobowych nie zachodzi ekspresja DR5. Do barwienia H&E przygotowano skrawki parafinowe dwóch normalnych tkanek wątrobowych, jedna tkanka raka wątroby i cytospinowy preparat komórek HepG2 a odpowiadające im zamrożone skrawki wybarwiono TRA-8. (b.) Analiza ekspresji DR5 na powierzchni komórki przy użyciu cytometrii przepływowej. Hepatocyty wyizolowane z dwóch normalnych tkanek wątrobowych i jednego przypadku tkanki raka wątroby oraz komórki HepG2 wybarwiono TRA-8, przeciwciałem anty-Fas (DX2) lub izotypowym przeciwciałem kontrolnym. Histogramy wypełnione wskazują na barwienie TRA-8 lub DX2, a puste histogramy są odpowiadającymi im kontrolami izotypowymi.

Fig. 12. TRAIL, ale nie TRA-8, indukuje toksyczność komórek wątrobowych. Świeże normalne ludzkie hepatocyty były hodowane w pożywce do hodowli kepatocytów. (a.) Apoptozę hepatocytów indukowano przy użyciu 1 μg/ml rozpuszczalnego TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego lub TRA-8 przez wskazane okresy czasu. Żywotność komórek oznaczano przy użyciu ATPLite. Wyniki są przedstawione jako procent żywotnych komórek w porównaniu z pożywką kontrolną. Zakreskowane słupki wskazują na TRAIL, a czarne słupki wskazują na TRA-8. (b.) Skondensowane jądra hepatocytów wybarwiono Hoexhst 33352 i analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. (c.) Wpływ cykloheksimidu na apoptozę hepatocytów. Hepatocyty hodowano w pożywce kontrolnej lub z 1 μg/ml TRAIL lub TRA-8 w obecności (wypełnione słupki) lub bez (puste słupki) 1 μg/ml cykloheksimidu przez 8 godzin. Żywotność komórek oznaczono przy użyciu ATPLite. Wyniki są przedstawione jako średnia ± błąd standardowy trzykrotnie powtórzonych hodowli z dwóch eksperymentów. d. Porównanie wrażliwości prawidłowych hepatocytów na apoptozę indukowaną DR5 i Fas. Świeżo wyizolowane hepatocyty inkubowano ze wskazanymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL, TRA-8, rozpuszczalnego FasL lub anty-Fas mAb CH11 przez 6 godzin. Żywotność komórek oznaczono testem ATPLite. Wyniki są przedstawione jako procent żywotnych komórek w porównaniu z pożywką kontrolną. Dla normalnych hepatocytów przedstawiono średnie ± błąd standardowy dla czterech zdrowych przypadków. Wyniki dla komórek raka wątrobokomórkowego z jednego pacjenta i komórek HepG2 są przedstawione jako średnie potrójnych hodowli.

Fig. 13. TRAIL indukuje zapalenie wątroby. Myszy B6 dożylnie zaszczepiono 10⁹ pfu wektora adenowirusowego kodującego ludzki TRAIL pełnej długości pod kontrolą elementu transkrypcyjnego „Tet-on. Ekspresja TRAIL była indukowana przez wskazane dawki tetracykliny, (a.) Analiza techniką Northern ekspresji ludzkiego TRAIL w wątrobie. 24 godziny po wstrzyknięciu wektora i indukcji tetracykliną wyizolowano totalne RNA i hybrydyzowano z ludzkim cDNA TRAIL lub β-aktyny. (b.) Poziomy AST w surowicy krwi. 24 godziny po transdukcji TRAIL oznaczono poziomy AST w surowicy krwi. (c.) Śmierć hepatocytów zainfekowanych wektorem adenowirusowym za pośrednictwem TRAIL: Myszy B6

PL 211 755 B1 zaszczepiono dożylnie adenowirusowym wektorem indukowanym tetracykliną. 48 godzin po zaszczepieniu z zaszczepionych i niezaszczepionych kontrolnych myszy wyizolowano hepatocyty i inkubowano ze wskazanymi stężeniami TRAIL przez 8 godzin (lewy rząd). Żywotność hepatocytów oznaczono testem ATPLite. Myszom zaszczepionym wektorem adenowirusowym jak powyżej 48 godzin później wstrzyknięto dożylnie 10 μg rozpuszczalnego ludzkiego TRAIL. 24 godziny po wstrzyknięciu TRAIL zmierzono poziomy AST w surowicy krwi (prawy rząd). (d. i e.) Histologiczna analiza uszkodzenia wątroby indukowanego przez TRAIL. Wątroby zostały pobrane 24 godziny (d.) lub 7 dni (e.) po transdukcji TRAIL. Parafinowe skrawki wybarwiono H&E i sfotografowano przy powiększeniu 100x (górny rząd) i 400x (dolny rząd).

Fig. 14 jest serią wykresów pokazujących, że zaktywowane komórki T i komórki B oczyszczone z ludzkiej PBMC wykazują ekspresję DR5 na podwyższonych poziomach przy oznaczaniu cytometrem przepływowym komórek w stanie spoczynku (niewypełnione) i komórek zaktywowanych (zacieniowane).

Fig. 15 to wykresy przeżywalności jako funkcji stężenia TRA-8 dla oczyszczonych komórek T i komórek B przedstawionych na Fig. 14, stymulowanych przez 48 godzin anty-CD3 i anty-μ, w porównaniu z komórkami zaktywowanymi i komórkami blastycznymi zebranymi techniką różnicujących gęstości Ficoll-Paque. Żywotność jest oznaczona testem ATPLite.

Fig. 16 przedstawia histogram i wykresy z cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję CD3 w wybranej populacji limfocytów u myszy NOD/SCID pozbawionej komórek NK, której wstrzyknięto ludzkie PBMC i TRA-8 lub IgG (kontrola).

Fig. 17 pokazuje mikrografy komórkowe barwione CD3 i TUNEL mysiej tkanki śledziony jak wyszczególniono w Przykładzie 13.

Fig. 18 pokazuje wykresy cytotoksyczności dla przewlekłej białaczki limfolitycznej (CCL) i normalnych ludzkich komórek B w obecności TRA-8, BISVIII i ich kombinacji.

Fig. 19(a) pokazuje specyficzne wiązanie 2E12 do DR4. Płytki ELISA powlekano rozpuszczalną postacią fuzji białkowych ludzkiego receptora TRAIL - Fc ludzkiej IgG1 jak wskazano i inkubowano ze wskazanymi stężeniami mAb 2E12, a następnie z przeciwciałem anty-mysia IgG1 połączonym z HRP. Reakcję wywoływano przy użyciu buforu z substratem TMB i mierzono wartości OD przy 450/650 nM.

Fig. 19(b) pokazuje, że 2E12 wiąże się z DR4 na powierzchni komórek. Komórki Cos-7 transfekowano wektorem zawierającym cDNA pełnej długości dla DR4 (zaciemniony histogram) oraz wektorem kontrolnym (otwarty histogram). Transfekowane komórki barwiono 10 pg/ml 2E12 i przeciwciałem anty-mysia IgG1 połączonym z PE. Komórki analizowano poprzez cytometrię przepływową.

Fig. 19(c) pokazuje aktywność indukowania apoptozy 2E12. Ludzkie komórki chłoniaka B Ramos inkubowano przez noc ze wskazanymi stężeniami 2E12 w obecności 2 μg/ml przeciwciała anty-mysia IgG1. Żywotność komórek ustalano przy użyciu testu ATPLite. (d) Aktywacja kaspazy indukowana przez 2E12. Komórki Ramos traktowano 2E12 i przeciwciałem anty-mysia IgG1 przez wskazane punkty czasowe. Aktywację kaspazy i cięcie PARP ustalano poprzez analizę Western przy użyciu przeciwciał anty-kaspaza lub PARP.

Fig. 20 pokazuje efekt 2E12 i adriamycyny u bezgrasiczych nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano podskórnie bezgrasiczym nagim myszom w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg 2E12 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Dwie grupy myszy otrzymały i.v. adriamycynę (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane są wyrażone jako średnia zmiana w rozmiarze guza w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=8 myszy/grupę).

Fig. 21 pokazuje efekt TRA-8, 2E12 i adriamycyny u bezgrasiczych nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano s.c. bezgrasiczym nagim myszom w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg TRA-8 i 2E12 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Dwie grupy myszy otrzymały i.v. adriamycynę (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane są wyrażone jako średnia zmiana w rozmiarze guza w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=8 myszy/grupę).

Fig. 22A pokazuje analizę ekspresji DR5 na powierzchni komórek w zestawie linii komórkowych raka sutka poprzez cytometrię przepływową. Komórki raka sutka zbierano przy użyciu EDTA i barwiono 10 μg/ml mAb TRA-8 przez 1 godz. w 4°C, potem kozimi przeciwciałami anty-mysia IgG1, połączonymi z PE, a następnie analizowano stosując oprogramowanie FACScan i CellQuest. Grube histogramy pokazują barwienie TRA-8, a cienkie histogramy pokazują inkubację z przeciwciałem kontrolnym dla mysiego izotypu IgG1. Fig. 22B pokazuje cytotoksyczność TRA-8 wobec ludzkich linii komórkowych raka sutka. Komórki trypsynizowano i wysiewano przy gęstości 1000 komórek/studzienkę

PL 211 755 B1 w 96-studzienkowej płytce. Po wysianiu komórek dodawano przeciwciało TRA-8 i inkubowano przez 24 godz. w 37°C. Żywotność komórek badano 24 godz. po dodaniu TRA-8 stosując testy ATPLite. Poziomy ATP podawano względem nie traktowanych komórek kontrolnych jako średnią i SE z 2-3 niezależnych doświadczeń, każde wykonane w trzech powtórzeniach.

Fig. 23A pokazuje cytotoksyczność łącznego traktowania TRA-8 i adriamycyną ludzkich linii komórkowych raka sutka. Komórki (1000/studzienkę) wystawiono na działanie różnych stężeń adriamycyny przez 24 godz. w 37°C, rozpoczynając 24 godz. po wysianiu komórek. TRA-8 dodawano 24 godz. po dodaniu adriamycyny i poziomy ATP określano 24 godz. później. Wartości reprezentują średnią i SE 2-3 niezależnych doświadczeń, każde wykonane w trzech powtórzeniach i są wyrażone w stosunku do nie traktowanych komórek kontrolnych.

Fig. 23B pokazuje cytotoksyczność łącznego traktowania TRA-8 i paklitakselem ludzkich linii komórkowych raka sutka. Komórki (1000/studzienkę) wystawiono na działanie różnych stężeń paklitakselu przez 24 godz. w 37°C, rozpoczynając 24 godz. po wysianiu komórek. TRA-8 dodawano 24 godz. po dodaniu paklitakselu i poziomy ATP określano 24 godz. później. Wartości reprezentują średnią i SE 2-3 niezależnych doświadczeń, każde wykonane w trzech powtórzeniach i są wyrażone w stosunku do nie traktowanych komórek kontrolnych.

Fig. 24 pokazuje wpływ TRA-8 na wzrost guza u bezgrasiczych nagich myszy niosących ustabilizowane ksenoprzeszczepy raka sutka 2LMP. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano s.c. bezgrasiczym w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg lub 600 μg TRA-8 i 2E12 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane reprezentują średnią zmianę w rozmiarze guza (produkt dwóch średnic) w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=8 myszy/grupę).

Fig. 25 pokazuje wpływ TRA-8 i adriamycyny na wzrost guza u bezgrasiczych nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano podskórnie bezgrasiczym nagim myszom w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg TRA-8 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Dwie grupy myszy otrzymały i.v. adriamycynę (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane są wyrażone jako średnia zmiana w rozmiarze guza (produkt dwóch średnic) w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=6-8 myszy/grupę).

Fig. 26 pokazuje wpływ TRA-8 i paklitakselu na wzrost guza u bezgrasiczych nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano podskórnie bezgrasiczym nagim myszom w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg TRA-8 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Dwie grupy myszy otrzymały i.v. paklitaksel (20 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane są wyrażone jako średnia zmiana w rozmiarze guza (produkt dwóch średnic) w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=8 myszy/grupę).

Fig. 27 pokazuje wpływ TRA-8, adriamycyny i napromieniowania ⁶⁰Co na wzrost guza u bezgrasiczych nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka. Komórki 2LMP (3x10⁷) wstrzykiwano podskórnie bezgrasiczym nagim myszom w dniu 0. Dwóm grupom myszy wstrzykiwano dootrzewnowo 200 μg TRA-8 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24. Dwie grupy myszy otrzymały i.v. adriamycynę (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Cztery grupy myszy otrzymały 3 Gy promieniowania ⁶⁰Co w dniach 9 i 17. Jedna grupa myszy nie otrzymała przeciwciała. Dane są wyrażone jako średnia zmiana w rozmiarze guza (produkt dwóch średnic) w stosunku do rozmiarów w dniu 7 (n=8 myszy/grupę).

Szczegółowy opis wynalazku

Niemożność usuwania komórek jest spowodowana defektami w systemie indukcji apoptozy, które są związane z defektami obejmującymi przykładowo ekspresję lub funkcjonowanie liganda, receptora albo wewnątrzkomórkowe cząsteczki regulatorowe lub efektorowe. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu korekcji wadliwego systemu indukującego apoptozę, jak również wyjaśnienia specyficznych defektów właściwych danemu systemowi indukcji apoptozy.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowej klasy przeciwciał monoklonalnych, które mają selektywną aktywność indukującą apoptozę in vivo i in vitro przeciwko specyficznym receptorom TRAIL, włączając w to DR5, DR4, DcR1 i DcR2. A zatem przeciwciała według wynalazku wiążą się specyficznie z jednym z receptorów TRAIL. „Selektywnie wiążące się albo „specyficznie rozpoznające oznacza, że przeciwciało wiąże się tylko z jednym receptorem TRAIL i wykazuje niewielkie albo brak wiązania z innymi typami receptorów TRAIL w tradycyjnej analizie Western. Przeciwciało wobec DR5 według niniejszego wynalazku wiąże się selektywnie z DR5 i wykazuje brak wiązania powyżej 1,5-krotności tła z DR4, DcR1 lub DcR2. Podobnie przeciwciało wobec DR4 według niniejszego wynalazku wiąże się selektywnie z DR4 i wykazuje brak wiązania powyżej 1,5-krotności tła z DR5, DcR1 lub DcR2. Niniej14

PL 211 755 B1 szy wynalazek ma zastosowanie jako odczynnik w badaniach sygnalizacji apoptozy, jak również jako skuteczny terapeutyk przeciwko komórkom z ekspresją receptorów TRAIL przykładowo obejmującym szerokie klasy komórek nowotworowych, komórki wykazujące rozregulowanie systemu apoptotycznego, aktywowane limfocyty lub inne aktywowane komórki immunologiczne (np. komórki limfoidalne i komórki mieloidalne), komórki zakażone wirusem i nieprawidłowo proliferujące komórki maziówkowe (np. komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów, włączając w to zapalne komórki maziówkowe, aktywowane komórki limfoidalne i komórki mieloidalne w maziówce, komórki maziówkowe makrofago-podobne i komórki maziówkowe fibroblasto-podobne) w chorobach autoimmunologicznych. Przeciwciała według niniejszego wynalazku są swoiste w wiązaniu poszczególnych typów receptorów TRAIL pomimo istnienia homologii pomiędzy nimi. Przeciwciała według wynalazku umożliwiają docelową apoptozę tylko komórek z ekspresją docelowego receptora TRAIL lub odwrotnie, blokowanie apoptozy z udziałem TRAIL w komórkach z ekspresją docelowego receptora.

Przeciwciało monoklonalne wobec DR5 lub przeciwciało monoklonalne wobec DR4 według niniejszego wynalazku służy jako silny induktor apoptozy w komórkach wyrażających, odpowiednio, DR5 lub DR4 in vitro i jako silny induktor apoptozy in vivo. Humanizowane częściowe sekwencje CDR połączone ze szkieletami humanizowanych przeciwciał i fuzje białkowe przeciwciał anty- DR5 lub DR4 według niniejszego wynalazku wykazują podobne właściwości apoptotyczne.

Do chwili obecnej nie było dostępne żadne przeciwciało monoklonalne, które wiązałoby się z DR5 na powierzchni komórki i które, nawet w niskich stężeniach, indukowałoby apoptozę w komórkach wyrażających DR5 zarówno in vitro, jak i in vivo, przy braku odczynnika do wiązania krzyżowego. Niniejszy wynalazek obejmuje przeciwciało wobec DR5 skuteczne jako środek terapeutyczny do leczenia różnych chorób. Pomimo że wykazano, iż rozpuszczalny TRAIL skutecznie indukuje apoptozę nowotworowych komórek in vivo, to okazało się, że jego aktywność zabijania była bardzo niska i często wymagane były duże i powtarzane dawki (13). Niniejszy wynalazek dostarcza wyizolowanego przeciwciała, które wiąże się z receptorem DR5 TRAIL, gdzie takie przeciwciało, w swojej postaci rozpuszczalnej w niskich stężeniach, ma aktywność indukującą apoptozę w docelowych komórkach wyrażających DR5. W korzystnym wykonaniu, oczyszczone przeciwciało wiąże się z receptorem DR5 TRAIL w nieobecności wiązania krzyżowego przeciwciała. Korzystne jest, jeżeli przeciwciało nie indukuje znaczącej apoptozy w prawidłowych fibroblastach. Korzystne jest, jeżeli aktywność indukująca apoptozę charakteryzuje się mniej niż 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% żywotnością albo dowolnym procentem pomiędzy tymi wartościami komórek docelowych przy stężeniach przeciwciała mniej niż około 0,1, 1,5, 10 lub 20 μg/ml lub dowolnym stężeniu pomiędzy. Oczyszczone przeciwciało wiąże się specyficznie z receptorem DR5 TRAIL, ale nie wiąże się z receptorami TRAIL, DR4, DcR1 lub DcR2 w tradycyjnej analizie Western. W korzystnym wykonaniu przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, korzystnie mające tą samą specyficzność epitopową, co mysio-mysia hybrydoma TRA-8 o numerze dostępu ATCC PTA-1428.

TRA-8, jedno z serii przeciwciał wobec DR5 według niniejszego wynalazku jest farmaceutycznie skuteczne u zwierząt niosących ludzki transgen DR5, a także na zastosowanie w tworzeniu modelu do badań nad rolą DR5 i TRAIL.

Różne wykonania wynalazku dostarczają przeciwciał, które indukują apoptozę w obecności lub nieobecności wiązania krzyżowego. Przykładowo, korzystne wykonanie przeciwciała DR5 (np. TRA-8) indukuje apoptozę w nieobecności wiązania krzyżowego. Inne wykonania dostarczają przeciwciał, które indukują apoptozę w obecności czynników wiążących krzyżowo, włączając w to, na przykład korzystne wykonanie przeciwciała DR4 (2E12).

A zatem, wynalazek dostarcza oczyszczonego przeciwciała, które wiąże się specyficznie z receptorem DR4 TRAIL, gdzie takie przeciwciało, w swojej postaci rozpuszczalnej, ma aktywność indukującą apoptozę w docelowych komórkach wyrażających DR4 in vitro i in vivo. W jednym z wykonań, przeciwciałem jest przeciwciało monoklonalne, korzystnie mające tą samą specyficzność epitopową co hybrydoma 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798, zdeponowana 24 października, 2001, mająca nadaną nazwę „Klon hybrydomy 2E12 przeciw ludzkiemu DR4, w imieniu The UAB Research Foundation. 2E12, jedno z serii przeciwciał wobec DR4 według niniejszego wynalazku, jest aktywne farmaceutycznie w zmniejszaniu rozmiarów guza w porównaniu z nietraktowanymi zwierzętami kontrolnymi albo w porównaniu z rozmiarami guza przed traktowaniem, in vivo u zwierząt z nowotworami wyrażającymi DR4.

Obydwa przeciwciała, wobec DR4 i DR5, są skuteczne w postaci rozpuszczalnej w niskich dawkach, gdzie niskie dawki mają oznaczać dawki lub stężenia mniejsze niż około 0,01 do około

PL 211 755 B1 μg/ml in vitro i mniejsze niż około 1-10 mg/kg in vivo. Korzystną właściwością przeciwciał według niniejszego wynalazku jest to, że indukują apoptozę selektywnie w komórkach wyrażających receptory DR5 lub DR4 bez indukowania apoptozy w normalnych, nieaktywowanych, nietransformowanych komórkach wątroby, fibrocytach, komórkach maziówkowych, itd.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku skierowane przeciwko receptorowi TRAIL jest uzyskiwane według niniejszego wynalazku ze zwierzęcia doświadczalnego, ale może być wytwarzane dowolnym sposobem wytwarzania lub syntezy przeciwciała, znanym w tej dziedzinie. Poprzez humanizowanie przeciwciała według niniejszego wynalazku w celu utrzymania aktywności wiązania receptora, jednocześnie uzyskując zmniejszoną i terapeutycznie tolerowaną odpowiedź immunologiczną u człowieka, humanizowane przeciwciało przeciwko receptorowi TRAIL według niniejszego wynalazku można użyć jako terapeutycznego agonistę lub antagonistę dla danego receptora TRAIL. Niniejszy wynalazek jest skuteczny jako terapeutyk in vivo, ponieważ wtórne krzyżowe wiązanie przeciwciała przeciwko receptorowi TRAIL nie jest ewentualnie konieczne.

Niniejszy wynalazek wykracza poza pojedyncze przeciwciało przeciwko receptorowi TRAIL mające agonistyczne i antagonistyczne efekty apoptotyczne. Lepiej, jeżeli doprowadza się do kontaktu dwa lub więcej rodzajów przeciwciał przeciwko receptorowi TRAIL z hodowlą komórkową in vitro lub tkanką pacjenta in vivo w celu uzyskania wzmocnionego traktowania. „Wzmocnione traktowanie ma oznaczać dowolny addytywny, synergiczny albo wzmacniający efekt. Na przykład, linia komórkowa glejaka U87 i hemopoetyczne linie komórkowe U937 i Molt-4 są wrażliwe na poddanie ich synergicznemu działaniu przeciwciał anty-DR4 i anty-DR5, podczas gdy poddanie ich działaniu samego agonistycznego przeciwciała anty-DR5 pokazuje ograniczony wpływ na indukcję apoptozy.

Ponadto antagonistyczne przeciwciała przeciwko receptorowi TRAIL posiadają szczególną użyteczność w niniejszym wynalazku, gdy przeciwciało posiada swoistość wiązania jednego z receptorów przynętowych DcR1, DcR2 lub OPG. Selektywne zablokowanie receptora przynętowego przeciwciałem według niniejszego wynalazku wywołuje zmianę w typach receptorów przynętowych ulegających ekspresji w komórce lub zmianę w równowadze wiązania TRAIL do receptorów TRAIL zdolnych do przenoszenia sygnału apoptotycznego. Tak więc, w innej łączonej terapii według niniejszego wynalazku przeciwciało wiążące receptor przynętowy uwrażliwia komórkę z ekspresją na agonistyczny sygnał apoptotyczny indukowany związaniem receptora TRAIL.

W innym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu określenia agonistycznych i antagonistycznych epitopów dla danego receptora TRAIL. Ponadto polimorfizmy pomiędzy ludźmi związane z danym receptorem TRAIL są określone według niniejszego wynalazku przez zastosowanie zestawu przeciwciał monoklonalnych, z których każdy ma różny region zmienny lub region CDR. Scharakteryzowany zestaw dostarcza możliwości zdefiniowania agonistycznych i antagonistycznych epitopów i polimorfizmów. Tak więc, zestaw przeciwciał monoklonalnych według niniejszego wynalazku ma zastosowanie w znajdywaniu leków i/lub badaniach przesiewowych w kierunku predyspozycji do choroby.

Jeszcze inne wykonanie niniejszego wynalazku obejmuje fuzje białkowe, włączając w to antygenowy fragment receptora TRAIL połączony z białkiem immunoglobulinowym, polipeptydem lub jego fragmentem. Fragment receptora TRAIL jest zdefiniowany tutaj jako zawierający wystarczającą liczbę aminokwasów, aby wywołać odpowiedź immunologiczną w kierunku natywnego receptora TRAIL ulegającego ekspresji na powierzchni komórek pacjenta. Fragment receptora TRAIL wchodzący w skład fuzji obejmuje przynajmniej dziesięć aminokwasów. Immunoglobulinowa fuzja białkowa lub jej fragment jest zdefiniowana tutaj jako obejmująca natywne lub syntetyczne białko lub fragment polipeptydu mający wystarczającą liczbę reszt aminokwasowych, aby zaktywować u pacjenta kaskadę odpowiedzi immunologicznej. Immunogen według niniejszego wynalazku obejmujący fuzję fragmentu receptora TRAIL połączonego z fragmentem immunoglobulinowym jest użyteczny jako terapeutyk in vivo do wykazania obecności przeciwciała przeciwko receptorowi TRAIL u pacjenta in situ.

W jeszcze innym wykonaniu, niniejszy wynalazek jest skuteczny jako terapia genowa. A zatem wynalazek dostarcza sposobu selektywnej indukcji apoptozy w komórkach docelowych obejmującego etap transfekowania komórek docelowych wektorem zawierającym, podlegającą ekspresji, sekwencję kwasu nukleinowego receptora TRAIL; wyrażenie na takiej komórce docelowej receptora TRAIL, doprowadzenie do kontaktu komórek z indukującym apoptozę przeciwciałem selektywnym dla wiązania takiego receptora TRAIL. W aspekcie terapii genowej według niniejszego wynalazku, komórki docelowe są transfekowane wektorem niosącym, mogącą ulec ekspresji; sekwencję odpowiadającą receptorowi TRAIL, a wektor jest powszechnie stosowany i wybrany na podstawie podatności komórek docelowych na wektor. Wektory stosowane w terapii genowej przykładowo obejmują adenowirusa,

PL 211 755 B1 pAdCMV5. Po zajściu ekspresji transfekowanego receptora TRAIL w docelowych komórkach lub tkankach, komórki lub tkanki są poddawane działaniu przeciwciała według niniejszego wynalazku specyficznego do wiązania transfekowanego receptora TRAIL. Będzie zauważone, że przeciwciało przeciwko receptorowi TRAIL jest zarówno agonistą lub antagonistą zgodnie z pożądanym wynikiem terapeutycznym.

Przeciwciała według niniejszego wynalazku są także skuteczne w połączeniu ze środkiem uwrażliwiającym. Środek uwrażliwiający używany tutaj jest zdefiniowany jako obejmujący dowolny bodziec stymulujący, który indukuje apoptozę, włączając światło ultrafioletowe, cząsteczki organiczne włączając w to w szczególności klasę bisindolomaleimidów, metale ciężkie i substancje wolnorodnikowe.

W kontekście terapii nowotworowej, TRA-8 jest także zdolne do indukcji apoptozy większości komórek nowotworowych wrażliwych na TRAIL w sposób zależny od kaspaz przy braku wtórnego wiązania krzyżowego. Obydwa, TRA-8 i 2E12, same albo w połączeniu wykazują in vivo silną aktywność przeciwnowotworową. Zdolność TRA-8 lub 2E12 do indukcji apoptozy większości komórek wrażliwych na TRAIL potwierdza, że sam DR5 lub DR4 jest wystarczający do włączenia apoptozy. W większości komórek nowotworowych tutaj wyszczególnionych obecna jest ekspresja DR5 na powierzchni komórki i wrażliwość na śmierć komórki indukowaną TRA-8 korelując z ich podatnością na działanie TRAIL, co wskazuje na to, że DR5 jest głównym receptorem śmierci dla apoptozy za pośrednictwem TRAIL w większości komórek nowotworowych. Podobne wyniki otrzymano dla przeciwciał specyficznych wobec DR4 (np. 2E12). Tak więc, zróżnicowana ekspresja DR5 lub DR4 w komórkach zdrowych i nowotworowych przekłada się na selektywność apoptozy za pośrednictwem TRAIL. TRA-8 pomija receptory przynęty przy indukcji apoptozy za pośrednictwem TRAIL. Jednakże tylko niektóre z komórek opornych na TRAIL są wrażliwe na TRA-8, wskazując, że receptory przynętowe nie odgrywają głównej roli w oporności komórek nowotworowych na apoptozę za pośrednictwem TRAIL.

Pomimo, że wcześniejsze badania wskazywały, że ogólnoustrojowe podawanie rozpuszczalnej formy TRAIL u zwierząt indukuje regresję guza bez wywoływania toksyczności^3,4,22, forma ludzkiego TRAIL związana z błoną powoduje uszkodzenie wątroby w myszach, jak tutaj pokazano. Jednakże toksyczny wpływ TRAIL na wątrobę jest znacznie mniej silny niż ligandu Fas, jak pokazano przez mniejszą wrażliwość prawidłowych hepatocytów na uszkodzenie indukowane TRAIL w porównaniu z ligandem Fas oraz przez brak letalności TRAIL in vivo. Tak więc, miareczkowanie TRAIL ma zastosowanie w terapii nowotworu.

Jak opisano tutaj szczegółowo, brak znaczących poziomów ekspresji białka DR5 w przypadku zdrowych hepatocytów jest wykazany i jest związany z opornością hepatocytów na apoptozę indukowaną TRAIL. Krzyżowe wiązanie DR5 z przeciwciałem monoklonalnym jest niewystarczające do wytworzenia form homopolimerowych receptora śmierci, zdolnych do włączenia apoptozy. Eksperymenty na marmozetach wskazują na brak dowodów toksyczności wątroby związanej z podawaniem TRA-8. Tak więc, agonistyczne przeciwciało monoklonalne anty-DR5 jest prawdopodobnie bardziej selektywne i bezpieczniejsze jako środek terapeutyczny niż rozpuszczalny TRAIL. Podobnie, DR4 jest wyrażany przez transformowane albo aktywowane komórki i nie jest wyrażany w istotnych ilościach albo jedynie w znacznie niższych ilościach przez komórki prawidłowe, np. fibroblasty. DR4 według niniejszego wynalazku indukuje apoptozę pewnych komórek docelowych bez widocznej śmierci komórkowej w komórkach nie-docelowych, takich jak fibroblasty, itd. Jak stosowany tutaj, brak efektu albo brak widocznego albo znaczącego efektu dotyczy i obejmuje całkowitą nieobecność efektu albo efekt, który jest mniejszy niż lub równy tłu albo poziomom kontrolnym i nie przekracza tła i poziomów kontrolnych więcej niż 1,5-krotny poziom tła lub kontrolny.

Jako test przesiewowy niniejszy wynalazek nadaje się do wykrywania małych skupisk komórek nowotworowych DR4 lub DR5, które mogą nadal wykazywać normalną morfologię komórki. Przykładowo, barwienie skrawków komórkowych in situ ludzkich komórek nowotworowych, włączając nowotwory płuca, prostaty i wątroby wyznakowanych przeciwciałami według niniejszego wynalazku łatwo identyfikuje komórki zmienione nowotworowo. Przeciwciała według niniejszego wynalazku są również przydatne do przeszukiwania pod kątem występowania innych chorób, włączając w to na przykład różne choroby zapalne i autoimmunologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów. Takie przeszukiwanie może być przydatne nawet przed wystąpieniem innych objawów klinicznych i może być zastosowane do przeszukiwania osobników z ryzykiem choroby, tak że traktowanie profilaktyczne można zacząć przed wystąpieniem innych oznak i objawów. Konkretnie, w komórkach nowotworowych obserwuje się ekspresję DR5 na wysokich poziomach w porównaniu z komórkami zdrowymi

PL 211 755 B1 tego samego typu. Tak więc, niniejszy wynalazek ma zastosowanie jako czuła technika w badaniach przesiewowych w kierunku nowotworów we wczesnym stadium w tkankach włączając przynajmniej płuco, prostatę, okrężnicę, krew, szyjkę macicy, sutek i wątrobę. Wyszczególniony jest tutaj proces terapeutyczny prowadzący do zahamowania proliferacji zmienionych komórek związanych z chorobami przykładowo obejmującymi nowotwory złośliwe i białaczki limfatyczne.

Niniejszy wynalazek jest opisany tutaj szczególnie w odniesieniu do przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu DR5 nazwanego TRA-8, mającego Numer Dostępu ATCC PTA-1428. Warto zauważyć, że techniki i opisane tutaj wyniki odnoszące się do agonistycznego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu DR5 można w całości rozciągnąć i zastosować dla antagonistycznych przeciwciał DR5 jak również dla przeciwciał skierowanych przeciwko DR4, DcR1 i DcR2 działających w sposób agonistyczny lub antagonistyczny. A zatem niniejszy wynalazek jest tu opisany szczegółowo w odniesieniu do indukującego apoptozę przeciwciała swoistego wobec ludzkiego DR4. W jednym z wykonań, przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co hybrydoma 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798, zdeponowana 24 października, 2001, która uzyskała numer dostępu w imieniu The UAB Research Foundation w American Type Culture Collection, Rockville, Md. Opis zdeponowanego materiału to „Klon hybrydomy 2E12 przeciw ludzkiemu DR4, z oznaczeniem szczepu 2E12 i z numerem odnośnika PCT/USO1/14151. Poziomy ekspresji receptora apoptotycznego, takiego jak Fas niekoniecznie korelują z podatnością komórek na apoptozę. W przypadku apoptozy za pośrednictwem TRAIL zasugerowano, że ekspresja receptorów przynętowych TRAIL wpływa na podatność komórek na apoptozę. Ponadto zasugerowano, że DR5 musi być związany z DR4 dla efektywnego przenoszenia sygnału apoptotycznego przez szlak FADD i kaspazy 8. Dostępność agonistycznych przeciwciał anty-DR5 pozwoliła na oszacowanie regulacji przenoszenia sygnału przez DR5 i jego względnej roli w apoptozie za pośrednictwem TRAIL. Porównanie podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 z podatnością komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL umożliwia zbadanie roli DR5 w apoptozie za pośrednictwem TRAIL oraz mechanizmów, które mogą wpływać na wrażliwość. Podobne korzyści są dostarczone przez przeciwciało DR4.

Ta zaleta ogólnie rozciąga się na humanizowane przeciwciała wobec DR5 i DR4 według niniejszego wynalazku. Molekularny klon przeciwciała przeciwko DR-5 wytwarza się na przykład przy zastosowaniu znanych technik, jak opisano w odniesieniu do następujących Przykładów. Techniki rekombinowania DNA (33) są skuteczne tutaj do wytworzenia sekwencji kwasów nukleinowych, które kodują cząsteczkę przeciwciała monoklonalnego lub jego region wiążący antygen.

Niniejszy wynalazek pozwala na skonstruowanie humanizowanych przeciwciał przeciwko receptorowi TRAIL, które nie powinny indukować odpowiedzi w postaci ludzkich anty-mysich przeciwciał (określanych tu dalej jako „HAMA”) (34), nadal posiadając skuteczną funkcję efektorową przeciwciała. Można również wytworzyć w pełni ludzkie przeciwciała poprzez immunizacje myszy zdolnych do wytwarzania w pełni ludzkiego przeciwciała (np. myszy zmodyfikowanych genetycznie w celu wytwarzania ludzkich przeciwciał), przeszukiwania pod kątem klonów, które wiążą DR5 lub DR4, indukują apoptozę i współzawodniczą o epitop dla TRA-8 lub 2E12. Patrz np., Lonberg and Huszar (1995), Human antibodies from transgenic mice, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93, który jest tu włączony w całości jako odniesienie dla metod wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał. Stosowane tutaj określenia „ludzki i „humanizowany w odniesieniu do przeciwciał dotyczą dowolnego przeciwciała, od którego oczekuje się, że będzie wykazywać tolerowaną terapeutycznie słabą odpowiedź immunologiczną u osobnika.

Niniejszy wynalazek dostarcza przeciwciała wobec DR5, humanizowanego przeciwciała antyDR5, immunoglobulin TRA-8 ciężkiego i lekkiego łańcucha i immunoglobulin humanizowanego ciężkiego i lekkiego łańcucha. Wynalazek dostarcza również przeciwciała wobec DR4, humanizowanego przeciwciała wobec DR4, immunoglobulin ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała wobec DR4 i immunoglobulin humanizowanego ciężkiego i lekkiego łańcucha kwasów nukleinowych, które kodują ciężkie i lekkie przeciwciała, wektorów zawierających te kwasy nukleinowe i komórek zawierających te wektory. Pewne krótsze formy tych białek lub genów pełnią funkcje regulatorowe lub enzymatyczne całej sekwencji białka lub genu. Na przykład sekwencje kodujących je kwasów nukleinowych mogą być w tym celu zmienione przez podstawienia, addycje, delecje lub ekspresję multimeryczną, tak że dostarczają funkcjonalnych odpowiedników białek lub genów. Na skutek degeneracji sekwencji kwasów nukleinowych, inne sekwencje, które kodują zasadniczo te same sekwencje aminokwasowe, jak te w naturalnie występujących białkach mogą być użyte w zastosowaniu niniejszego wynalazku. Obejmują one, między innymi, sekwencje kwasów nukleinowych obejmujących całe sekwencje lub fragmenty sekwencji kwasów nukleinowych kodujących powyższe peptydy, które są zmienione przez

PL 211 755 B1 podstawienia innych kodonów, tak że kodują funkcjonalnie równoważną resztę aminokwasową w obrębie sekwencji, powodując tym samym tzw. cichą zmianę. Warto zauważyć, że sekwencja nukleotydowa immunoglobuliny według niniejszego wynalazku toleruje zmiany homologii sekwencji do 25%, jak obliczono standardowymi sposobami („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, str. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.) tak długo, jak wariant tworzy działające przeciwciało, które rozpoznaje receptor DR5 dla TRAIL. Przykładowo, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji polipeptydowej może być podstawiona przez inny aminokwas o podobnej polarności, który działa jak funkcjonalny odpowiednik, dając cichą zmianę. Podstawienia dla aminokwasu w sekwencji mogą być wybrane z innych członków klasy, do której ten aminokwas należy (tj. podstawienia konserwatywne). Na przykład, niepolarne (hydrofobowe) aminokwasy obejmują alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne aminokwasy obojętne obejmują glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Dodatnio naładowane aminokwasy (zasadowe) obejmują argininę, lizynę i histydynę. Ujemnie naładowane (kwaśne) aminokwasy obejmują kwas asparaginowy i glutaminowy. Zakresem niniejszego wynalazku objęte są również białka lub ich fragmenty lub pochodne, które są różnie zmodyfikowane podczas lub po translacji, np. poprzez glikozylację, cięcie proteolityczne, połączenie z cząsteczką przeciwciała lub innymi ligandami komórkowymi itp. Ponadto, rekombinowany wektor kodujący sekwencje kwasów nukleinowych przeciwciał według niniejszego wynalazku może być przekształcany tak, aby zmodyfikować obróbkę lub ekspresję wektora. Innych modyfikacji można dokonać bądź w sekwencji kwasu nukleinowego bądź aminokwasowej bez zmniejszania albo zasadniczego zmniejszania aktywności apoptotycznej przeciwciała. Takie modyfikacje mogą nastąpić w regionach CDR i nie-CDR dzięki zastosowaniu technik rutynowych w tej dziedzinie. Patrz np., Yang i wsp. (1995), J. Mol. Biol. 254: 392-403, który jest tu włączony w całości jako odniesienie dla metod kroczącej mutagenezy CDR.

Dodatkowo, do sekwencji kwasu nukleinowego kodującego inhibitor można wprowadzić mutację in vitro lub in vivo aby utworzyć i/lub usunąć sekwencje inicjacji i/lub terminacji translacji albo aby wytworzyć zmiany w obszarach kodujących i/lub utworzyć nowe lub usunąć istniejące wcześniej miejsca restrykcyjne, aby ułatwić późniejsze modyfikacje in vitro. Można zastosować dowolną technikę mutagenezy znaną w tej dziedzinie, włączając w to między innymi ukierunkowaną mutagenezę in vitro, J. Biol. Chem. 253:6551, wykorzystanie łączników Tab (Pharmacia) i tym podobne.

Dane uzyskane przy pomocy krystalografii w promieniach rentgenowskich wskazują, że przeciwciałoimmunoglobulina fałduje się zwykle tworząc cylindryczną strukturę zawierającą dwie warstwy przeciwrównoległych kartek β, z których każda składa się z czterech łańcuchów β. W obszarze zmiennym trzy pętle wszystkich domen V łańcuchów H i L łączą się razem, tworząc miejsce wiązania antygenu. Każdą z tych pętli nazywa się regionem determinującym dopasowanie (CDR). Regiony CDR mają najwyższą zmienność aminokwasową w obrębie przeciwciała. Fragmenty regionów zmiennych nie będące częścią CDR nazywa się „regionem zrębowym (obszar FR) i zwykle odgrywają one rolę utrzymywania struktury CDR. Korzystne jest, jeżeli wszystkie regiony CDR danego przeciwciała wszczepia się do przeciwciała akceptorowego w celu zachowania obszaru wiązania dla epitopu receptora TRAIL. Jest oczywiste, że wszczepienie części spośród wszystkich regionów CDR donorowi zachowuje funkcjonalność. Jest zrozumiałe, że wszczepienie zwykle oznacza zastąpienie, reszta za resztę, jednego aminokwasu lub regionu przez inny. Może się jednak zdarzyć, zwłaszcza w przypadku przenoszenia regionu, że jedną lub więcej reszt można dodać lub pominąć lub zastąpić według potrzeby, a takie delecje i insercje, jak również odpowiednie podstawienia i inwersje, mieszczą się w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku otrzymuje się na przykład przez przeszczepienie każdego z CDR łańcucha L i H podjednostki przeciwciała monoklonalnego przeciw receptorowi TRAIL do odpowiedniego obszaru CDR przeciwciała ludzkiego, tym samym skutecznie humanizując mysie monoklonalne przeciwciało przeciwko receptorowi TRAIL.

Wytwarza się również różne funkcjonalne fragmenty przeciwciała zawierające idiotyp cząsteczki przy użyciu znanych technik. Takie fragmenty obejmują na przykład fragment (AB')2 przeciw receptorowi TRAIL, który można wytworzyć przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała, fragmenty (AB')2 przeciwciała przeciw receptorowi TRAIL wytworzone przez redukcję mostków dwusiarczkowych fragmentu (AB')2 przeciw receptorowi TRAIL oraz fragmenty przeciwciała wytworzone przez poddanie cząsteczki działaniu papainy i czynnika redukującego.

PL 211 755 B1

Przeciwciało według niniejszego wynalazku można wytworzyć przy zastosowaniu wielu technik znanych w tej dziedzinie. Jako przykład, przeciwciało monoklonalne TRA-8 przeciw receptorowi DR5 można otrzymać przez hodowlę hybrydomy, którą z kolei można otrzymać immunizując myszy ludzkim DR5 i następnie doprowadzając do fuzji mysich komórek śledziony lub węzła chłonnego z mysimi komórkami szpiczaka.

Wytwarzanie przeciwciała monoklonalnego obejmuje przykładowo następujące etapy:

a) oczyszczania biomakrocząsteczki do użycia jako antygen;

b) przygotowania komórek wytwarzających przeciwciało; po pierwszej immunizacji zwierzęcia zastrzykami antygenu skrwawienie zwierzęcia i oznaczenie miana przeciwciał w celu określenia czasu pobrania śledziony;

c) przygotowania komórek szpiczaka;

d) fuzji komórek wytwarzających przeciwciała z komórkami szpiczaka;

e) selekcji hybrydomy wytwarzającej pożądane przeciwciało;

f) otrzymania klonu z pojedynczej komórki (klonowanie);

g) ewentualnie, hodowli komórek hybrydomy lub hodowli zwierząt, którym przeszczepiono komórki hybrydomy do przygotowania przeciwciała monoklonalnego na dużą skalę; oraz

h) badanie biologicznej aktywności i swoistości lub testowanie właściwości czynnika markerowego przygotowanego w ten sposób przeciwciała monoklonalnego.

Sposób wytwarzania przeciwciała jest opisany szczegółowo poniżej w odniesieniu do opisanych wyżej etapów. Ten sposób przygotowania przeciwciała według niniejszego wynalazku podaje się tylko dla ilustracji sposobów wytwarzania i nie stanowi ograniczenia. Można również wykorzystać inne znane procedury lub modyfikacje podanych sposobów, na przykład z wykorzystaniem komórek wytwarzających przeciwciała innych niż komórki śledziony i szpiczak.

(a) Wytwarzanie antygenu

Zrekombinowane białko (nazywane tu dalej „zrekombinowanym ludzkim DR5” lub „zrekombinowanym ludzkim DR4) skuteczne jako antygen otrzymuje się przez transfekcję komórek QBI-293A wektorem ekspresyjnym pAdDR5-IgG dla fuzji białkowej złożonej z zewnątrzkomórkowej domeny ludzkiego DR5 lub DR4 i regionu Fc ludzkiego przeciwciała IgG1 (nazywanego tu dalej „IgG), (patrz PTA-1428) w celu jej wyrażenia przy użyciu zestawu ADENO-Quest (Quantum Biotechnologies Inc., Kanada) oraz zebranie i częściowe oczyszczenie produktu ekspresji. Plazmid pAdDR5-IgG konstruuje się przez wstawienie DNA kodującego fuzję białkową ludzkiego DR5 lub DR4 i ludzkiej IgG do pAdCMV5, który jest wektorem ekspresyjnym dla komórek zwierzęcych. Inne materiały, takie jak DNA kodujące DR5 lub DR4, wektor i gospodarz są działającymi w tym systemie.

Fuzję białkową ludzkiego DR5 lub DR4 i IgG wytworzoną w supernatancie hodowli komórek QBI-293A transfekowanych wektorem pAdDR5-IgG można częściowo oczyścić poprzez chromatografię powinowactwa Białko A-Sefaroza lub chromatografię powinowactwa Białko G-Sefaroza lub chromatografię jonowymienną przy użyciu kolumny Resource Q (znak towarowy; Pharmacia).

Alternatywnie, jako antygen wykorzystuje się oczyszczony DR5 lub DR4 otrzymany z błon komórkowych ludzkich linii komórkowych. Ponadto, ponieważ znana jest pierwszorzędowa struktura DR4 i DR5 (patrz PTA-1428), można zsyntetyzować chemicznie peptyd o sekwencji aminokwasowej SEK NR ID: 1 jedną ze znanych metod, taką jak metoda Sangera, i użyć jako antygen.

(b) Otrzymywanie komórek wytwarzających przeciwciało

Mysz immunizuje się immunogenem wytworzonym w punkcie (a), zmieszanym z adiuwantem, takim jak kompletny lub niekompletny adiuwant Freunda lub ałun. Inne odpowiednie zwierzęta doświadczalne obejmują dla przykładu szczury, świnki morskie, króliki, psy, kurczaki, świnie, krowy i owce.

Odpowiednie drogi podawania w celu immunizacji zwierzęcia doświadczalnego obejmują zastrzyki: podskórne, dootrzewnowe, dożylne, doskórne i domięśniowe, przy czym korzystne są zastrzyki podskórne i dootrzewnowe.

Immunizację przeprowadza się ewentualnie w pojedynczej dawce, bądź w kilku powtarzanych dawkach w odpowiednich odstępach czasu (korzystnie 1 do 5 tygodni). U immunizowanych zwierząt śledzi się miano przeciwciał w osoczu i zwierzę z wystarczająco wysokim mianem przeciwciał wybiera się jako źródło komórek wytwarzających przeciwciała. Wybór zwierzęcia z wysokim mianem przeciwciał czyni kolejne etapy procedury bardziej wydajnymi. Komórki do przeprowadzania fuzji zwykle pobiera się od zwierzęcia 3 do 5 dni po końcowej immunizacji.

PL 211 755 B1

Metody oznaczania miana przeciwciał obejmują różne, dobrze znane techniki, takie jak test radioimmunologiczny (nazywany tu dalej „RIA), enzymatyczny test immunologiczny w stałej fazie (nazywany tu dalej „ELISA), test przeciwciał fluorescencyjnych oraz test biernej hemaglutynacji, przy czym RIA i ELISA są korzystne ze względu na czułość wykrywania, szybkość, dokładność i możliwość automatyzacji.

Miano przeciwciał można określić na przykład przez ELISA według następującej procedury. Najpierw oczyszczone lub częściowo oczyszczony DR5 lub DR4 adsorbuje się na powierzchni fazy stałej, takiej, jak 96-studzienkowa płytka ELISA, a następnie blokuje się całą pozostałą powierzchnię, do której nie przyłączył się DR5 lub DR4 białkiem nie spokrewnionym z antygenem, takim jak albumina osocza bydlęcego (BSA). Po przemyciu, doprowadza się do kontaktu powierzchni studzienek z seryjnie rozcień czonymi próbkami mysiej surowicy, aby umoż liwić wią zanie przeciwciał a wobec DR5 lub DR4 z próbek z antygenem. Jako drugorzędowe przeciwciało dla związania z przeciwciałem mysim dodaje się wyznakowane enzymatycznie przeciwciało anty-mysie. Po przemyciu dodaje się substrat enzymu, a miano przeciwciał szacuje się określając zmianę absorbancji spowodowaną powstaniem zabarwienia, które spowodowała zmiana w substracie lub tym podobne.

(c) Otrzymywanie komórek szpiczaka

Komórki z ustabilizowanej mysiej linii komórkowej służą jako źródło komórek szpiczaka i obejmują na przykład mysz oporną na 8-azaguaninę, otrzymaną z linii szpiczaka BALB/c P3X63Ag8U.1 (P3-U1) (35), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1) (36). Sp2/0-Ag14 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) i P3X63Ag8 (X63) (39). Wybraną linię komórkową przenosi się kolejno do odpowiedniej pożywki, takiej jak pożywka z 8-azaguaniną. Pożywka z 8-azaguaniną zawiera pożywkę Dulbecco zmodyfikowaną przez Iscovea (nazywaną tu „IMDM) lub pożywkę Eaglea zmodyfikowaną przez Dulbecco (nazywaną tu „DMEM). Pożywkę RPMI-1640 uzupełnia się glutaminą, β-merkaptoetanolem, gentamycyną, płodową surowicą cielęcą (nazywaną tu dalej „FCS) oraz 8-azaguaniną. Następnie, 3 do 4 dni przed fuzją, komórki przenosi się do normalnej pożywki, takiej, jak pożywka ASF104 (Ajinomoto, K. K.) zawierająca 10% FCS w celu zapewnienia dostępności w dniu fuzji przynajmniej 2 x 10⁷ komórek.

(d) Fuzja komórek

Limfocyty i komórki plazmatyczne otrzymane z dowolnej odpowiedniej części zwierzęcia są komórkami prekursorowymi dla wytwarzania przeciwciał. Źródła limfocytów lub komórek plazmatycznych obejmują przykładowo śledzionę, węzły chłonne, krew obwodową lub dowolne odpowiednie ich połączenie, przy czym komórki śledzony są źródłem najczęstszym.

Po ostatnim zastrzyku przypominającym, tkankę w której obecne są komórki wytwarzające przeciwciała pobiera się z myszy o określonym wcześniej mianie przeciwciała. W obecnie faworyzowanej technice fuzji komórek śledziony z komórkami szpiczaka otrzymanymi w punkcie c) wykorzystuje się glikol polietylenowy.

Technika fuzji obejmuje przemycie śledziony i komórek szpiczaka pożywką bez surowicy (taką, jak RPMI 1640) lub solą fizjologiczną, buforowaną fosforanem (nazywaną tu dalej „PBS) tak, aby stosunek liczbowy komórek śledziony do komórek szpiczaka wynosił pomiędzy 5:1 a 10:1, a następnie zwirowanie. Po odrzuceniu supernatantu i odpowiednim rozluźnieniu osadu komórek, dodaje się kroplami, mieszając, 1 ml pożywki bez surowicy, zwierającej 50% (wag./obj.) glikolu polietylenowego (masa cząsteczkowa 1000 do 4000). Następnie powoli dodaje się 10 ml pożywki bez surowicy i zwirowuje. Supernatant znów się odrzuca, a zwirowane komórki zawiesza się w odpowiedniej ilości pożywki HAT, zawierającej roztwór hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny (nazywanej tu dalej „HAT) oraz mysiej interleukiny-2 (nazywanej tu dalej „IL-2). Zawiesinę następnie rozdziela się do studzienek płytek do hodowli (nazywanych tu dalej po prostu „płytkami) i inkubuje w obecności 5% obj./obj. CO2 w 37°C przez około 2 tygodnie, dodając dla uzupełnienia odpowiednie ilości pożywki HAT.

e) Selekcja hybrydom

Jeśli użyty typ komórek szpiczaka jest oporny na 8-azaguaninę, np. nie posiada enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantynowoguaninowej (HGPRT), każda nie ulegająca fuzji komórka szpiczaka oraz fuzje komórek szpiczaka z innymi komórkami szpiczaka nie są w stanie przeżyć w pożywce HAT. Z drugiej strony, fuzje komórek wytwarzających przeciwciała, jak również hybrydomy z komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka przeżywają, z czego te pierwsze tylko przez ograniczony czas. W związku z tym przedłużona inkubacja w pożywce HAT prowadzi do selekcji tylko pożądanych hybrydom.

Otrzymane hybrydomy tworzą kolonie, które następnie przenosi się do pożywki HAT bez aminopteryny (pożywka HT). Następnie, pobiera się próbki supernatantu hodowli w celu określenia miana

PL 211 755 B1 przeciwciał przeciwko Fas, na przykład metodą ELISA. Jeśli jako antygen w teście ELISA wykorzystuje się wspomnianą wyżej fuzję białkową, konieczne jest także usunięcie klonów wytwarzających przeciwciało specyficznie wiążące się z regionem Fc ludzkiego IgG1. Obecność lub brak takiego klonu można określić na przykład przy zastosowaniu tesu ELISA wykorzystując Fas-IgG1 lub IgG1 jako antygen.

(f) Klonowanie

Hybrydomy, dla których wykazano produkcję specyficznych przeciwciał wykorzystując do określenia miana przeciwciał metodę podobną do opisanej w punkcie b), przenosi się następnie w celu klonowania na inną płytkę. Odpowiednie metody klonowania obejmują: metodę ograniczających rozcieńczeń, w której hybrydomy rozcieńcza się tak, aby w jednej studzience znalazła się jedna komórka, a następnie hoduje; metodę miękkiego agaru, w której kolonie odzyskuje się po hodowli w pożywce z miękkim agarem; metodę wykorzystującą mikromanipulator w celu oddzielenia pojedynczej komórki do hodowli oraz metodę „sortowania klonu, w której pojedyncze komórki rozdzielane są przy zastosowaniu sortera komórek.

Procedurę klonowania, na przykład metodą ograniczających rozcieńczeń, powtarza się 2 do 4 razy dla każdej studzienki wykazującej miano przeciwciała, a jako hybrydomy wytwarzające przeciwciała monoklonalne przeciw DR5 wybiera się klony o stabilnym mianie przeciwciał. Hybrydomy wytwarzające przeciwciało przeciw mysiemu DR5 wybiera się w podobny sposób, dla otrzymania linii komórkowej wytwarzającej przeciwciała monoklonalne przeciw DR5.

Mysio-mysią Hybrydomę TRA-8, która jest podstawą dla przeciwciał według niniejszego wynalazku, zdeponowano w American Type Culture Collection 1 marca 2000 i nadano numer dostępu PTA-1428. Hybrydomę 2E12 zdeponowano w American Type Culture Collection 24 października, 2001, jak opisano powyżej i ma ona numer dostępu ATCC PTA-3798. A zatem, jeśli przygotowuje się przeciwciała wykorzystując mysio-mysią hybrydomę TRA-8 lub dowolną inną ustabilizowaną hybrydomę, przygotowanie można wykonać według procedury rozpoczynającej się od punktu g) poniżej, z pominięciem punktów od (a) do (f).

(g) Hodowla hybrydomy w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych

Hybrydomę otrzymaną przez klonowanie hoduje się w normalnej pożywce, a nie w pożywce HT. Hodowlę na dużą skalę prowadzi się w butelkach obrotowych, używając dużych butelek do hodowli lub butelek z mieszaniem. Supernatant z hodowli na dużą skalę oczyszcza odpowiednią metodą dobrze znaną specjalistom w tej dziedzinie, taką jak filtracja na żelu, w celu otrzymania przeciwciał monoklonalnych przeciw DR5 lub DR4, które stanowią podstawę przeciwciał według niniejszego wynalazku. Hybrydomę można również hodować śródootrzewnowo w syngenicznej myszy, takiej, jak mysz BALB/c lub nu/nu, w celu otrzymania płynu puchlinowego zawierającego duże ilości przeciwciała monoklonalnego wobec DR5 lub DR4. Wygodne jest stosowanie do oczyszczania zebranych przeciwciał dostępnych handlowo zestawów do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych (na przykład zestawu MAbTrap GIl Kit; Pharmacia).

Przeciwciała monoklonalne otrzymane jak wyżej są wysoce swoiste wobec, odpowiednio, ludzkiego DR5 lub DR4.

(h) Test przeciwciał monoklonalnych

Odpowiednie metody identyfikacji izotypu i podklasy przeciwciała monoklonalnego obejmują metodę Ouchterlony, ELISA i RIA. Korzystnie, do identyfikacji wykorzystuje się komercyjny zestaw, taki jak zestaw Mouse Typer (znak towarowy; BioRad).

Ilościowe oznaczenie białka można przeprowadzić metodą Folin-Lowry lub przez obliczenia oparte o absorbancję przy długości fali 280 nm (1,4 (OD280)=1 mg/ml immunoglobuliny).

Identyfikację epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało monoklonalne przeprowadza się jak następuje. Najpierw przygotowuje się różne, częściowe struktury cząsteczki, która rozpoznaje przeciwciało monoklonalne. Takie częściowe struktury przygotowuje się metodą, w której różne częściowe peptydy cząsteczki są otrzymywane syntetycznie według znanej techniki syntezy oligopeptydów lub metodą, w której DNA, kodujący pożądany częściowy polipeptyd, włącza się do odpowiedniego plazmidu ekspresyjnego i wyraża się go w celu wytworzenia peptydów w odpowiednim gospodarzu, takim, jak E. coli. Zwykle, dla powyższego celu wykorzystuje się często obie metody w połączeniu. Na przykład można przygotować znanymi metodami inżynierii genetycznej zestaw polipeptydów o odpowiednio zredukowanej długości, zaczynając od końca C lub końca N białka antygenowego. Przez określenie, które fragmenty reagują z przeciwciałem, otrzymuje się przybliżone umiejscowienie epitopu.

PL 211 755 B1

Epitop identyfikuje się dokładniej syntetyzując, przy użyciu znanych technik syntezy oligopeptydów, wiele mniejszych oligopeptydów odpowiadających peptydowi lub mutacjom peptydu, i aby określić właściwości wiązania tych peptydów do przeciwciała monoklonalnego przeciw DR5, które jest podstawą do przygotowania przeciwciała według niniejszego wynalazku, kompetycyjnie blokując wiązanie peptydu do antygenu przeciwciałem monoklonalnym. Do otrzymania wielu wariantów oligopeptydów można wygodnie wykorzystać dostępne handlowo zestawy, takie, jak zestaw SPOTs (Genosys Biotechnologies, Inc.) czy seria zestawów syntezy peptydów na wielu końcówkach („multipin opartych na metodzie syntezy na wielu końcówkach (Chiron Corp.).

Przeciwciało według niniejszego wynalazku posiada różne cechy funkcjonalne, opisane poniżej w punktach od a) do f), wszystkie zweryfikowane np. odpowiednią, przytoczoną poniżej metodą.

a) Specyficzne wiązanie TRA-8 do komórek wyrażających ludzki DR5.

Unikalną cechą niniejszego wynalazku jest zdolność do wiązania z DR5 na powierzchni komórek. Wykazano to metodą cytometrii przepływowej komórek wyrażających DR5. Po pierwsze potwierdzono specyficzne wiązanie DR5 na powierzchni komórek dla komórek COS-7, transfekowanych pełnej długości cDNA, kodującym ludzki DR5. Dokładniej, TRA-8 rozpoznaje tylko komórki COS-7 transfekowane DR5, ale nie kontrolnym pustym wektorem czy wektorem kodującym DR4. Po drugie, badano trzy rodzaje komórek różnego pochodzenia: hemopoetyczne, glejaka i ludzkie komórki złośliwego raka prostaty. Większość tych transformowanych komórek nowotworowych wyrażała w znaczącym stopniu DR5 na powierzchni komórek, chociaż poziomy ekspresji znacznie się różniły. Po trzecie, badano dwa zestawy ludzkich pierwotnych fibroblastów maziówki od pacjentów z RA i OA. Wszystkie komórki maziówki z PA wyrażały znacząco wyższy poziom DR5 w porównaniu z komórkami OA.

b) Indukcja apoptozy ludzkich komórek nowotworu złośliwego in vitro przy braku wiązania krzyżowego.

Zdolność przeciwciała uzyskanego według niniejszego wynalazku do rozpoznawania receptora TRAIL oraz do bezpośredniej indukcji apoptozy ludzkich komórek nowotworu złośliwego określono przy zastosowaniu testu żywotności komórek (ATPLite) w czasie hodowli in vitro komórek z różnymi stężeniami przeciwciała, a konkretnie TRA-8. Większość komórek nowotworu jest podatna na apoptozę indukowaną TRA-8. Dla niektórych komórek, TRA-8 wykazywało silną aktywność indukowania apoptozy; na przykład TRA-8 może wywołać apoptozę ludzkich komórek Jurkat już na poziomie pg/ml. Co ważne, apoptoza indukowana TRA-8 nie wymaga wystąpienia wiązania krzyżowego, a w większości komórek, TRA-8 wykazywało silniejszą aktywność indukującą apoptozę niż zrekombinowany, rozpuszczalny TRAIL w obecności wzmacniacza.

c) Aktywność zabijania nowotworu przez TRA-8 in vivo

Aktywność zabijania nowotworu przez TRA-8 określono na dwóch modelach SCID/ludzkiego nowotworu. Najpierw myszom SCID dożylnie podano ludzkie komórki białaczkowe Jurkat i poddano je działaniu pojedynczej dawki (100 μg) TRA-8. Wyniki uzyskane metodą cytometrii przepływowej oraz znakowaniem immunohistochemicznym in situ komórek Jurkat pokazują, że większość wszczepionych komórek Jurkat jest eliminowana z krwi obwodowej i śledziony przez działanie TRA-8. Następnie komórki ludzkiej astrocytomy 1321N1 wszczepia się podskórnie myszom SCID i taką mysz z nowotworem poddaje się działaniu pojedynczej dawki TRA-8. Wzrost implantowanych komórek 1321N1 jest znacząco zahamowany u myszy poddanych działaniu TRA-8, jak określono na podstawie rozmiarów guzów i analizy histochemicznej.

d) Identyfikacja komórek maziówkowych z RA przez TRA-8

Pierwotne komórki maziówkowe od 8 pacjentów RA i 4 pacjentów OA badano pod kątem wyrażania DR5 na powierzchni komórek. TRA-8 ma zdolność do barwienia dodatniego wszystkich komórek RA, ale barwi ujemnie wszystkie komórki OA. Dlatego można odróżnić PA od OA poprzez ekspresję DR5 na powierzchni komórek wykrywaną przez TRA-8.

e) Indukcja apoptozy w fibroblastach maziówkowych RA przez TRA-8

Zdolność TRA-8 do indukowania apoptozy komórek maziówkowych RA określa się w teście żywotności komórek w czasie hodowli in vitro w obecności TRA-8 o różnych stężeniach. Wszystkie komórki RA wykazywały wysoki do średniego poziom wrażliwości na 100 ng/ml TRA-8. Przeciwnie, wszystkie komórki OA są zasadniczo oporne na apoptozę indukowaną TRA-8. Co ważne, TRA-8 wykazuje większą aktywność indukowania apoptozy komórek maziówkowych RA niż rozpuszczalny TRAIL wraz ze wzmacniaczem. Co więcej, w porównaniu do przeciwciała anty-Fas (CH-11), TRA-8 wykazuje większą wybiórczość w stosunku do komórek maziówkowych.

f) TRA-8 nie indukuje wytwarzania MMP w komórkach maziówkowych RA

PL 211 755 B1

Ponieważ TRA-8 indukuje aktywację NF-kB w komórkach maziówkowych, podobnie jak TNF-α, można określić wpływ TRA-8 na wytwarzanie MMP1 i MMP3 przez komórki maziówkowe. Podczas, gdy TNF -α indukował zależny od dawki wzrost MMP, TRA-8 nie indukował produkcji MMP w ogóle, a w pewnych stężeniach TRA-8 lekko obniżał produkcję MMP w komórkach maziówkowych RA.

g) TRA-8 indukuje aktywację wielu kaspaz

Ponieważ kaspazy odgrywają kluczową rolę w indukcji apoptozy, zdolność TRA-8 do indukcji aktywacji kaspaz określa się w ludzkich komórkach Jurkat. Kiedy komórki Jurkat inkubuje się z niewielkimi dawkami (50 ng/ml) TRA-8, obserwuje się aktywację kaspazy 8, kaspazy 9 i kaspazy 3 już po 15 minutach inkubacji, jak to określono przez analizę Western oraz analizę cięcia dla kaspaz. Jeśli idzie o czas, liczbę i siłę aktywacji kaspaz, przeciwciała według niniejszego wynalazku, w tym przykładowe przeciwciało TRA-8, wykazywały dużo lepszą aktywność niż inne znane przeciwciała indukujące apoptozę, takie jak ludzkie przeciwciało Fas (CH-11).

Przeciwciało 2E12 wiąże się swoiście z DR4 w jego rozpuszczalnej postaci i ma zdolność indukowania apoptozy in vitro i in vivo w docelowych komórkach wyrażających DR5 (włączając w to na przykład komórki nowotworowe, komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów, aktywowane komórki immunologiczne takie jak limfocyty i komórki zakażone wirusem), ma aktywność zabijania komórek nowotworowych in vivo (korzystnie przy braku toksyczności wobec komórek nienowotworowych). Korzystne jest, jeżeli przeciwciało wobec DR4 według wynalazku ma aktywność indukującą apoptozę charakteryzującą się mniej niż około 60%, 50%, 40%, 30%, 20% lub 10% żywotnością komórek docelowych przy stężeniach przeciwciała mniej niż około 30 μg/ml, 3 μg/ml, 0,3 μg/ml lub 0,03 μg/ml i aktywność zabijania komórek nowotworowych charakteryzującą się 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub 100% zmniejszaniem rozmiarów guza. A zatem, przeciwciało według niniejszego wynalazku jest substancją o właściwości wybiórczej indukcji apoptozy w komórkach patogennych, jak to pokazano w punktach (a) i (g). Dlatego też jest ono przydatne jako środek profilaktyczny i terapeutyczny w chorobach związanych z nieprawidłową przeżywalnością komórek lub nieprawidłową proliferacją komórek, takich jak te, które przypisuje się nieprawidłowej regulacji apoptozy, w tym systemu opartego na Fas/ligandzie Fas.

Zdolność przeciwciała według niniejszego wynalazku do indukcji apoptozy potwierdza się hodując takie komórki jak ludzkie białaczkowe linie komórkowe Jurkat (American Type Culture No. TIB-152) oraz linie komórkowe astrocytomy 1321N1 w pożywce, w której dodaje się próbkę testową i określa się stopień przeżywania, na przykład testem ATPLite.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku, zwłaszcza przeciwciała wobec DR5 i DR4, posiadające niemal identyczną immunogenność dla człowieka jak przeciwciała ludzkie, wykorzystuje się jako środek w profilaktyce lub leczeniu chorób związanych z nieprawidłową przeżywalnością komórek lub nieprawidłową proliferacją komórek, włączając w to te, które przypisuje się nieprawidłowej regulacji apoptozy w chorobach autoimmunologicznych, obejmujących przykładowo toczeń rumieniowaty układowy, chorobę Hashimoto, reumatoidalne zapalenie stawów, chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi, zespół Sjogrena, niedokrwistość złośliwą, chorobę Addisona, sklerodermę, zespół Goodpasture'a, chorobę Crohna, hemolityczną autoimmunologiczną anemię, bezpłodność, miastenię, stwardnienie rozsiane, chorobę Basedowa, plamicę małopłytkową, cukrzycę insulinozależną, alergię; chorobę atopową; miażdżycę tętnic; zapalenie mięśnia sercowego; kardiomiopatię; zapalenie kłębuszków nerkowych; anemię aplastyczną; odrzucenie narządów po przeszczepach oraz liczne nowotwory złośliwe płuc, prostaty, wątroby, jajnika, tkanek limfatycznych i sutka. Przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować do kierowania do celu i selektywnego indukowania apoptozy w aktywowanych komórkach immunologicznych, włączając w to aktywowane limfocyty, komórki limfoidalne, komórki mieloidalne i komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów (włączając w to zapalne komórki maziówkowe, komórki maziówkowe makrofago-podobne i komórki maziówkowe fibroblasto-podobne) oraz komórki zakażone wirusem (włączając w to na przykład te zakażone wirusem HIV) tak długo, jak te docelowe komórki wyrażają albo można uczynić je wyrażającymi specyficzne receptory dla TRAIL (tj. DR4 lub DR5).

Takie czynniki profilaktyczne lub lecznicze można podawać w różnych postaciach. Odpowiednie sposoby podawania obejmują podawanie doustne, takie jak w tabletkach, kapsułkach, granulkach, proszku i syropy, lub podawanie pozajelitowe, takie jak przez iniekcje, iniekcje kroplowe i czopki.

Przeciwciało lub czynnik terapeutyczny można podawać doustnie, doodbytniczo, dojamowo, dokomorowo, doczaszkowo, dooponowo, dopochwowo, pozajelitowo (dożylnie, domięśniowo lub podskórnie), domiejscowo (proszki, maści lub krople), przez iniekcje dootrzewnowe, przezskórne, przez

PL 211 755 B1 inhalacje lub w rozpylaczu do nosa i do jamy ustnej. Dokładna wymagana ilość przeciwciała lub czynnika terapeutycznego jest różna w zależności od pacjenta i zależy od wieku, wagi, ogólnego stanu pacjenta, ciężkości leczonego stanu, umiejscowienia i rozmiaru guza, użycia konkretnych substancji, sposobu podawania i tym podobnych. Specjalista w tej dziedzinie może określić odpowiednią ilość przeprowadzając jedynie rutynowe doświadczenia według niniejszego opisu. Typowe jednorazowe dawki przeciwciała wahają się między 0,1 a 10000 mikrogramów, korzystnie między 1 a 100 mikrogramów. Typowe stężenia przeciwciała w nośniku wahają się od 0,2 do 2000 nanogramów na dostarczony mililitr. Do zastrzyków do stawów, objętości przeciwciała i nośnika będą zróżnicowane w zależności od stawu, ale około 0,5-10 ml, a korzystnie 1-5 ml wstrzykuje się do ludzkiego kolana i około 0,1-5 ml, a korzystnie 1-2 ml wstrzykuje się do ludzkiego stawu skokowego.

Zależnie od zakładanego sposobu podawania, przeciwciało lub czynnik terapeutyczny może występować w kompozycji farmaceutycznej w postaci dawki w formie stałej, półstałej lub płynnej, takiej, jak na przykład tabletki, czopki, pigułki, kapsułki, proszki, płyny lub zawiesiny, korzystnie w jednostkach dawkowania odpowiednich do jednorazowego podawania precyzyjnej dawki. Kompozycje zawierają skuteczną ilość wybranego substratu w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem oraz dodatkowo mogą zawierać inne środki medyczne, farmaceutyczne, nośniki lub rozcieńczalniki. Przez „farmaceutycznie dopuszczalny rozumie się materiał, który nie jest biologicznie lub w inny sposób niepożądany, który można podawać pacjentowi wraz z wybranym substratem, nie powodując znaczących niepożądanych skutków biologicznych lub szkodliwych interakcji z innymi składnikami kompozycji farmaceutycznej, w której jest zawarty.

Kompozycje odpowiednie do iniekcji pozajelitowych mogą składać się z fizjologicznie dopuszczalnych, sterylnych, wodnych lub niewodnych roztworów, substancji rozproszonej, zawiesin lub emulsji oraz sterylnych proszków do odtworzenia w postaci sterylnych roztworów do wstrzykiwania lub zawiesin.

Przykłady odpowiednich wodnych i nie zawierających wody nośników, rozcieńczalników, rozpuszczalników lub przenośników obejmują wodę, etanol, poliole (glikol propylenowy, glikol polietylenowy, glicerol i tym podobne), odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne (jak oliwa z oliwek) nadające się do wstrzykiwania estry organiczne, takie jak oleinian etylu. Właściwą płynność można zachować na przykład przez użycie substancji powlekającej, takiej jak lecytyna, przez utrzymanie wymaganej wielkości cząsteczek w przypadku zawiesin i przez użycie środków powierzchniowo czynnych.

Takie kompozycje mogą również zawierać dodatki, takie jak środki konserwujące, zwilżające, emulgujące i dawkujące. Działaniu mikroorganizmów można zapobiegać rozmaitymi środkami przeciwbakteryjnymi i przeciwgrzybowymi, jak na przykład parabeny, chlorobutanol, fenol, kwas sorbinowy i tym podobne. Może być również pożądane włączenie środków izotonicznych, na przykład cukrów, chlorku sodu i tym podobnych. Przedłużone wchłanianie wstrzykiwanej postaci farmaceutycznej można otrzymać stosując środki spowalniające wchłanianie, na przykład monostearynian glinu i żelatynę.

Postaci stałe do podawania doustnego obejmują kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulki. W takich postaciach do podawania w formie stałej do aktywnego związku dodaje się przynajmniej jedną obojętną zwyczajową zaróbkę (lub nośnik), taką jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy lub (a) wypełniacze bądź domieszki objętościowe, na przykład skrobia, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol, i kwas krzemowy, (b) środki spajające, jak na przykład karboksymetyloceluloza, alginian, żelatyna, pirolidon, sacharoza i guma arabska, (c) czynniki utrzymujące wilgoć, na przykład glicerol, (d) środki rozpraszające, na przykład agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub z tapioki, kwas alginowy, niektóre złożone krzemiany i węglan sodu, (e) opóźniacze rozpuszczania, na przykład parafina, (f) przyspieszacze wchłaniania, na przykład, czwartorzędowe związki amonowe, (g) środki zwilżające, na przykład, alkohol cetylowy i monostearynian glicerolu, (h) adsorbenty, na przykład, kaolin i bentonit oraz (i) lubrykanty, jak na przykład talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan sodowy lub ich mieszaniny. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek postaci do podawania mogą również zawierać środki buforujące.

Kompozycje stałe podobnego rodzaju można zastosować jako wypełniacze do miękkich i sztywno wypełnionych kapsułek żelatynowych przy użyciu zaróbek, takich jak laktoza lub cukier mleczny, jak również glikole polietylenowe o dużej masie cząsteczkowej i temu podobne.

Dawki w postaci stałej, takie jak tabletki, drażetki, kapsułki, pigułki i granulki można wytwarzać w powłokach i łupinach, takich jak powłoki dojelitowe i inne dobrze znane w tej dziedzinie. Mogą one również zawierać czynniki zmętniające i mogą mieć skład powodujący uwalnianie czynnika lub czynników aktywnych w pewnej części przewodu pokarmowego w opóźniony sposób. Przykłady kompozycji

PL 211 755 B1 do osadzania, które można zastosować, to substancje polimeryczne i woski. Związki aktywne mogą mieć również, gdy jest to pożądane, postać mikrokapsułek z jedną lub więcej z zaróbek wymienionych wyżej.

Postaci płynne do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz związków aktywnych płynne postaci dawkowania mogą zwierać obojętne rozpuszczalniki powszechnie stosowane w dziedzinie, jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki zwiększające rozpuszczalność i emulgatory, jak na przykład alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, bezozoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3-butylenowy, dimetyloformamid, oleje, a w szczególności olej bawełniany, olej z orzechów ziemnych, olej z kiełków kukurydzy, oliwa z oliwek, olej rycynowy i olej sezamowy, glicerol, alkohol tetrahydrofurfurylowy, glikole polietylenowe oraz estry kwasów tłuszczowych i sorbitolu lub mieszaniny tych substancji i tym podobne.

Oprócz takich obojętnych rozcieńczalników kompozycja może zawierać dodatki, takie jak środki zwilżające, emulgujące i zawieszające, słodzące, nadające smak i zapach.

Zawiesiny oprócz związków aktywnych mogą zawierać czynniki zawieszające, takie jak na przykład etoksylowane alkohole izostearylowe, sorbitol polioksyetylenowy i estry sorbitanowe, celuloza mikrokrystaliczna, metawodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar i guma tragakantowa lub mieszaniny tych substancji i tym podobne.

Korzystnymi kompozycjami do podawania doodbytniczego są czopki, które można wytworzyć przez zmieszanie związków według niniejszego wynalazku z odpowiednimi, nie podrażniającymi zaróbkami lub nośnikami, takimi jak masło kakaowe, glikol polietylenowy lub wosk do czopków, które są stałe w normalnych temperaturach, ale płynne w temperaturze ciała, a zatem topią się w odbycie lub pochwie i uwalniają związek czynny.

Postaci do podawania związku według tego wynalazku miejscowo obejmują maści, proszki, rozpylane płyny i środki do inhalacji. Związek czynny miesza się w sterylnych warunkach z dopuszczalnym fizjologicznie nośnikiem i dowolnym środkiem konserwującym, buforem lub propelentem, w zależności od potrzeb. W zakresie tego wynalazku są również preparaty dooczne, maści, proszki i roztwory do oczu.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie dopuszczalne sole, estry, amidy i proleki odnosi się do tych soli karboksylowych, aminowych, estrów, amidów i proleków związków według niniejszego wynalazku, które według poważnego osądu medycznego są odpowiednie do użycia w styczności z tkankami pacjentów bez nadmiernej toksyczności, podrażnienia, odpowiedzi alergicznej i tym podobnych, o współmiernym racjonalnym stosunku korzyści do ryzyka i skuteczne przy ich zastosowaniu, jak również, gdy to możliwe, amfoteryczne postaci związków według wynalazku. Termin „sole odnosi się do stosunkowo nietoksycznych soli kwasów nieorganicznych i organicznych związków według niniejszego wynalazku. Te sole można przygotować in situ podczas końcowej izolacji i oczyszczania związków lub przez osobne reagowanie oczyszczonego związku w postaci czystej zasady z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym i izolację tak powstałej soli. Przykładowe sole obejmują bromowodorek, chlorowodorek, siarczan, wodorosiarczan, azotan, octan, szczawian, walerian, oleinian, palmitynian, stearynian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosyl, cytrynian, jabłaczan, fumaran, bursztynian, winian, naftylan, metylan, glukoheptan, laktan, sulfonian metanowy i sole laurylosiarczanowe i tym podobne. Mogą one zawierać kationy silnych zasad i wapniowców, jak sód, lit, potas, wapń, magnez i tym podobne, jak również nietoksyczne kationy amonowe, czwartorzędowe kationy amonowe i aminowe włączając w to między innymi amoniak, sole tetrametyloamonowe, tetraetyloamonowe, metyloaminę, dimetyloaminę, trimetyloaminę, trietyloaminę, etyloaminę i tym podobne (patrz na przykład, S.M. Barge i wsp., „Pharmaceutical Salts, J Pharm. Sci., 1977, 66:1-19, który jest tu włączony jako odniesienie).

Termin „prolek odnosi się do związków, które są szybko przekształcane in vivo, dając związek macierzysty według powyższego wzoru, na przykład wskutek hydrolizy we krwi. Szczegółowe omówienie można znaleźć w I. Higuchi i V. Stella, „Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Tom. 14 A.C.S. Symposium Series oraz w „Bioreversible Carriers in Drug Design, wyd. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

Komórka docelowa to komórka zwierzęcia, włączając w to na przykład komórki człowieka, innych naczelnych, szczura, myszy, świnki morskiej, królika, kozy, owcy, krowy, konia, kurczaka, świni, małpy marmozet i fretki.

PL 211 755 B1

Dodatkowo, przeciwciało lub środek leczniczy według niniejszego wynalazku może istnieć zarówno w formie nierozpuszczonej, jak i rozpuszczonej, z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozpuszczalnikami, takimi jak woda, etanol i tym podobne. Na ogół dla celów niniejszego wynalazku postaci rozpuszczone uważa się za równoważne postaciom nierozpuszczonym.

Cząsteczki przeciwciał oczyszcza się znanymi technikami, dla przykładu obejmującymi aminową chromatografię absorpcyjną lub aminową chromatografię powinowactwa, techniki chromatograficzne, takie jak wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa lub ich połączenie.

Inny aspekt niniejszego wynalazku obejmuje produkt farmaceutyczny do zastosowania do dostarczania kręgowcowi aktywnego biologicznie przeciwciała anty-receptor TRAIL lub humanizowanego przeciwciała anty-receptor TRAIL. Produkt farmaceutyczny obejmuje farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwciała anty-receptor TRAIL lub jego fragmentu, farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz pojemnik, w którym nośnik i przeciwciało są jałowo zamknięte.

W korzystnym wykonaniu wynalazku, farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała według wynalazku hamuje proliferację komórek przez kontakt z komórką docelową. Farmaceutycznie skuteczna ilość przeciwciała rozpoznającego bądź DR5 bądź DR4 lub humanizowanego przeciwciała rozpoznającego bądź DR5 bądź DR4, to ilość podana osobnikowi, wystarczająca do wywołania pożądanego skutku. Stosowane tu terminy „farmaceutycznie skuteczna ilość i „ilość terapeutyczna to synonimy. Pożądane skutki podania farmaceutycznie skutecznej ilości przeciwciał rozpoznających DR5 lub DR4 obejmują śmierć jednej lub większej liczby komórek docelowych, zahamowanie wzrostu jednej lub większej liczby komórek docelowych, pobudzenie, odpowiednio, DR5 lub DR4, wiązanie się, odpowiednio, do DR5 lub DR4 i podwyższone poziomy lub aktywność NFkB w docelowej komórce. Docelowa komórka to komórka, która wyraża DR5 lub DR4 i obejmuje na przykład komórki nieprawidłowo rosnące oraz nowotwory, takie jak brodawczaki i kłykciny, rak sutka, rak okrężnicy, wątrobiak, białaczki, rak płuc, czerniak, szpiczak, kostniakomięsak, rak jajnika, rak trzustki, rak prostaty, nowotwory głowy i szyi, nowotwór tarczycy, nowotwór macicy i guzy mózgu, takie jak astrocytomy, aktywowane komórki immunologiczne, (np. aktywowane limfocyty, komórki limfoidalne i mieloidalne), komórki zapalne, komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów oraz komórki zakażone wirusem. In vivo komórka docelowa to komórka osobnika ze stanem patologicznym, włączając w to takie, w których proliferacja komórek jest nieprawidłowa lub rozregulowana, jak nowotwór łagodny lub złośliwy i reumatoidalne zapalenie stawów.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku komórka docelowa styka się również ze środkiem terapeutycznym.

Środkiem terapeutycznym jest związek lub kompozycja skuteczna w łagodzeniu stanu patologicznego. Przykładem ilustrującym środek terapeutyczny może być związek przeciwnowotworowy.

Związek przeciwnowotworowy to związek lub kompozycja, która skutecznie hamuje lub zatrzymuje wzrost nieprawidłowo rosnących komórek. Farmaceutycznie skuteczna ilość związku przeciwnowotworowego to ilość podana osobnikowi, która wystarcza do wywołania zahamowania lub zatrzymania wzrostu nieprawidłowo rosnących komórek. Przykłady ilustrujące związki przeciwnowotworowe obejmują leki takie jak: bleomycyna, karboplatyna, chlorambucyl, cisplatyna, kolchicyna, cyklofosfamid, daunorubicyna, daktynomycyna, dietylstylbestrol, doksyrubicyna, etopozyd, 5-fluorouracyl, floksurydyna, melfalan, metotreksat, mitomycyna, 6-merkaptopuryna, tenipozyd, 6-tioguanina, winkrystyna i winblastyna. Dalsze przykłady związków przeciwnowotworowych i środków leczniczych można znaleźć w „The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, wyd. 15, Berkow i wsp., wyd., 1987, Rahway, N.J. oraz Sladek i wsp. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis i wsp. wyd., Taylor i Francis, New York, N.Y.

Przeciwciało według niniejszego wynalazku można dalej łączyć z innymi terapiami, jak chemioterapia i/lub radioterapia w leczeniu złośliwych nowotworów, a skuteczność terapeutyczną można wzmóc związkami indukującymi apoptozę, takimi jak bisindolilomaleimid VIII (BisVIII) lub inne czynniki uwrażliwiające takie jak SN-50 lub LY294002. A zatem w jednym z wykonań przeciwciało według niniejszego wynalazku można łączyć z BisVIII i czynnikiem chemioterapeutycznym (np. adriamycyną). W innym wykonaniu, przeciwciało albo przeciwciała według niniejszego wynalazku można łączyć z niesterydowym lekiem przeciwzapalnym (np. siarczek sulindaku lub inne inhibitory COX-1 lub COX- 2) i czynnikiem chemioterapeutycznym (np. adriamycyną). W leczeniu innych chorób, np. chorób autoimmunologicznych albo zapalnych można również stosować leczenie łączone. Na przykład, przeciwciało można podawać w połączeniu z innymi czynnikami terapeutycznymi, takimi jak czynniki chemioterapeutyczne, czynniki przeciwzapalne, DMARD, metotreksat, bisindolilomaleimid VIII) lub inne czynPL 211 755 B1 niki uwrażliwiające i temu podobne. Radioterapię można również łączyć z innymi czynnikami terapeutycznymi przy leczeniu chorób zapalnych albo autoimmunologicznych. Specjalista w tej dziedzinie przystosuje formę radioterapii do konkretnej choroby zapalnej albo autoimmunologicznej (np. napromieniowanie po wycięciu błony maziowej w leczeniu zapalenia stawów).

Terapię z zastosowaniem przeciwciała według niniejszego wynalazku można również łączyć z terapiami z zastosowaniem innego przeciwciała według wynalazku. Przykładowo, przeciwciało wobec DR5 można podawać osobnikowi tego potrzebującemu razem z, przed albo po podaniu przeciwciała wobec DR4. Taką łączoną terapię przeciwciałową można ponadto łączyć podawaniem jednego lub większej liczby czynników terapeutycznych (np. chemioterapeutyków, doksorubicyny i/lub metotreksatu), radioterapii albo obydwu.

W porównaniu z uprzednio opublikowanym przeciwciałem anty-DR5 (24), aktywność indukowania apoptozy przez przykładowe przeciwciało TRA-8 według niniejszego wynalazku jest bardzo silna i jest ono zdolne do wywołania apoptozy komórek Jurkat w stężeniach rzędu pg/ml in vitro oraz wykazuje większą aktywność zabijania nowotworów in vivo w porównaniu z poprzednim, rozpuszczalnym TRAIL. Dożylne podanie pojedynczej dawki TRA-8 wystarcza do zahamowania wzrostu zarówno guza litego, jak i nowotworu komórek hemopoetycznych, podczas gdy wywołanie in vivo cofania się nowotworu przy pomocy rozpuszczalnego TRAIL wymaga o wiele wyższej dawki (500 μg dziennie przez 10 dni). Przeciwciała przeciw receptorowi TRAIL według niniejszego wynalazku wydają się być równie bezpieczne jak rozpuszczalny TRAIL, ponieważ przykładowe przeciwciało TRA-8 nie wywołuje apoptozy nie transformowanych komórek fibroblastów. Podobne wyniki zaobserwowano dla przeciwciał wobec DR4.

Wektory według niniejszego wynalazku zawierają sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki lub lekki łańcuch immunoglobulinowy przeciwciała wobec DR5 lub DR4, połączony funkcjonalnie z elementem regulacyjnym, takim jak promotor lub wzmacniacz. „Połączenie funkcjonalne odnosi się do takiego ułożenia sekwencji nukleotydowych, że mogą one pełnić swoje właściwe funkcje. A zatem, element regulacyjny połączony funkcjonalnie z sekwencją nukleotydową kodującą polipeptyd jest zdolny do kierowania transkrypcją, replikacją i/lub translacją polipeptydu. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że pojedynczy wektor może ewentualnie zawierać sekwencje kodujące zarówno dla immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego, jak i lekkiego przeciwciała wobec DR5 lub DR4. W jednym z wykonań wektory kodują humanizowane immunoglobulinowe łańcuchy lekkie lub ciężkie.

Następujące przykłady są przedstawione poniżej dla zilustrowania sposobów i wyników według niniejszego wynalazku. Przykłady te nie mają na celu objęcia wszystkich aspektów niniejszego wynalazku, ale raczej zilustrowanie reprezentatywnych sposobów i wyników. Przykłady te nie mają wykluczać ekwiwalentów i wariantów niniejszego wynalazku, które są oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie.

P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie antygenu DR5

1.1. Klonowanie cDNA DR5

DNA kodujący ludzkie białko DR5 klonuje się następującą metodą RT-PCR stosując:

a) Matrycę

Całkowity RNA komórek HeLa izoluje się używając odczynnika TRIzol (GIBCO BRL). Jako matrycę do reakcji PCR używa się cDNA otrzymanego przy zastosowaniu zestawu First-Strand cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.

b) Startery do PCR

Syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SEK NR ID:1);

5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SEK NR ID:2);

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych Przykładach syntetyzowano w Lifetechnologies. Wszystkie oligonukleotydy przechowuje się w -20°C po rozpuszczeniu w wodzie destylowanej.

c) Reakcja PCR

Skład mieszaniny reakcji PCR:

matryca cDNA, 5 μl z całkowitych 33 μl reakcji starter DR5p1, 10 pmol;

starter DR5p2, 10 pmol;

x stężony bufor do PCR (dostarczony w zestawie), 10 gl; dNTP (każdy 2,5 mM), 4 gl; oraz polimeraza Taq (Promega), 5 jednostek.

PL 211 755 B1

Sterylną destylowaną wodę dodaje się do mieszaniny do całkowitej objętości 100 gl. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, dNTP stanowią ekwimolową mieszaninę dATP, dCTP, dGTP i dTTP (2,5 mM każdy).

Reakcję PCR przeprowadza się następująco. Mieszaninę początkowo podgrzewa się w 94°C przez 2 minuty, po czym 40 razy powtarza cykle podgrzewania do 94°C przez 30 sek., 54°C przez minutę i 72°C przez 3 minuty. Po zakończeniu tej procedury, mieszaninę reakcyjną podgrzewa się w 72°C przez 10 minut.

Namnożone fragmenty DNA otrzymane w ten sposób rozdziela się w 1% żelu agarozowym, zawierającym 0,25 gg/ml bromku etydyny. Prążki zawierające pożądane fragmenty DNA wycina się z żelu używając skalpela i odzyskuje z nich DNA stosując zestaw Gene Clean (BIO101). Fragment DNA klonuje się stosując zestaw TA Cloning Kit (Invitrogen, CA). Przeprowadza się to jak następuje.

Fragment DNA odzyskany z mieszaniny reakcji PCR oraz 50 ng wektora pCR2.1, który jest dostarczony w zestawie TA Cloning Kit miesza się z 1 gl 10 x stężonego buforu reakcji ligazy (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorek magnezu, 5 mM chlorek sodu, 7 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, mM DTT, 1 mM spermidyna i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej), do którego dodaje się 4 jednostki ligazy DNA T4 (1 gl). Całkowitą objętość mieszaniny doprowadza się do 10 gl sterylną dejonizowaną wodą i powstałą mieszaninę ligacyjną inkubuje w 14°C przez 15 godzin. Po tym czasie, 2 gl mieszaniny ligazy dodaje się do 50 gl kompetentnych komórek E. coli szczepu TOP10F', dostarczonych z zestawem TA cloning kit i doprowadzonych do kompetencji zgodnie z instrukcją, do których dodaje się 2 gl 0,5 M β-merkaptoetanolu i powstałą mieszaninę trzyma w lodzie przez 30 minut, później w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 5 minut. Następnie do kultury dodaje się 500 gl pożywki, zawierającej 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodu, 2,5 mM chlorku potasu, 1 mM chlorku magnezu i 20 mM glukozę (nazywaną tu dalej pożywką „SOC) i inkubuje mieszaninę przez godzinę w 37°C z wytrząsaniem. Po tym czasie hodowlę rozprowadza się na płytce agarowej z pożywką bulionową L (1% obj./obj. trypton, 0,5% wag./obj. ekstrakt drożdżowy, 0,5% wag./obj. chlorek sodowy, 0,1% wag./obj. glukoza oraz 0,6% wag./obj. bakto-agar (Difco)), zawierającą 100 gg/ml ampicyliny. Selekcjonowano kolonie oporne na ampicylinę pojawiające się na płytce, pobiera się platynową ezą i hoduje w pożywce bulionowej L, zawierającej 100 gg/ml ampicyliny w 37°C przez noc z wytrząsaniem przy 200 obr. na min. Po hodowli z komórek zbieranych przez wirowanie izoluje się plazmidowy DNA metodą lizy alkalicznej. Fragmenty EcoRI-EcoRI DR5cDNA z tak otrzymanych plazmidów subklonuje się do plazmidu pcDNA3 (Invitrogen, CA). Gen DR5 pełnej długości w pcDNA3 sekwencjonuje się i porównuje z opublikowaną sekwencją. Plazmid otrzymany w ten sposób jest nazwany plazmidem pcDNA3-DR5.

1.2. Konstrukcja wektora ekspresyjnego DR5-IgG

W celu otrzymania rozpuszczalnej formy ludzkiego DR5 pozbawionej domeny transbłonowej, skonstruowano plazmidowy wektor ekspresyjny. Wektor ten zaprojektowano tak, by kodował fuzję białkową zawierającą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego DR5 dołączoną do DNA ludzkiego Fc IgG1 (41). DNA kodujący ludzki DR5 pozbawiony domeny transbłonowej otrzymano w następującej reakcji PCR:

a) Matryca

Jako matrycę do reakcji PCR używano pcDNA3-DR5

b) Startery do PCR

Zsyntetyzowano następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5p1: SEK NR ID:1);

5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DR5p3: SEK NR ID:3);

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych Przykładach syntetyzowano w Lifetechnologies. Wszystkie oligonukleotydy przechowywano w -20°C po rozpuszczeniu w wodzie destylowanej.

c) Reakcja PCR

Reakcję PCR oraz izolację powielonego DNA przeprowadzano jak w Przykładzie 1.1(c).

Tak otrzymany plazmid oznaczono jako plazmid pCR^DR5. Fragment BamHI-EcoRI kodujący ludzki fragment Fc, otrzymany z pmFas-hIgGIFc subklonowano w miejsca BamHI i EcoRI w obrębie wielu miejsc do klonowania pcDNA3. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako pcDNAFc. Następnie, fragment BamHI-BamHI kodujący rozpuszczalny region ludzkiego DR5 otrzymany z pCR^DR5 subklonowano w miejsce BamHI plazmidu pcDNAFc. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako plazmid pcDNAΔDR5-Fc. We fragmencie EcoRI kodującym ludzki rozpuszczalny DR5-ludzki region Fc IgG

PL 211 755 B1 otrzymany z plazmidu pcDNAΔDR5-Fc wytępiono lepie końce stosując fragment Klenowa polimerazy DNA (GIBCO BRL) i subklonowano do wektora wahadłowego pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies Inc., Canada), w którym wytępiono lepkie końce po cięciu BamHI. Tak otrzymany plazmid oznaczono jako pAdΔDR5-Fc.

1.3. Ekspresja i oczyszczanie ludzkiej fuzji białkowej DR5-IgG1.

Komórki QBI-293A (dostarczone z zestawem ADENO-Quest Kit) kotransfekowano DNA pAdΔDR5-Fc oraz QBI-viral (dostarczonym z zestawem ADENO-Quest Kit) stosując zestaw ADENOQuest Kit (Quantum Biotechnologies Inc., Canada) zgodnie z instrukcją. Hodowano rekombinowane łysinki wirusowe i przeszukiwano pod kątem wyrażania fuzji białkowej DR5-IgG poprzez analizę supernatantu testem ELISA. Dodatnie łysinki amplifikowano w komórkach QBI-293A i przechowywano w -80°C jako zapas wirusa. Pięćdziesiąt szalek (150 mm) z komórkami QBI-293A transfekowano rekombinowanym wirusem pAdΔDR5-Fc przy m.o.i. (ang. Multiplicity of Infection, wielokrotności infekcji) 10. Pożywkę zbierano 48 godzin po transfekcji.

Stransfekowane komórki zawierające gen DR5-IgG hodowano do gęstości 1 x 10⁶ komórki/ml inkubując w 500 ml pożywki DMEM (GIBCO), zawierającej 10% obj./obj. FCS, w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2 przez 2 dni. Następnie hodowle odwirowywano (1000 r.p.m., 5 minut) i zbierano supernatant. Oczyszczano DR5-IgG z supernatantu stosując chromatografię powinowactwa Białko A-Sefaroza CL-4B (Pharmacia) w następujących warunkach:

kolumna: kolumna Białko A-Sefaroza CL-4B (wielkość kolumny 2 ml; Pharmacia) bufor do wymywania: 0,1 M glicyna (pH 2,4), 0,15 M NaCl; bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5).

Po nałożeniu całego supernatantu na kolumnę, przepłukiwano ją trzy razy 20 ml PBS, następnie 10 razy dodawano 1 ml buforu do wymywania. Mierzono gęstość optyczną każdej wymytej frakcji (1 ml). Zbierano frakcje od drugiej do piątej (OD₂₈₀ > 0,1) i po dodaniu 100 μl buforu do neutralizacji eluaty umieszczano oddzielnie w worku dializacyjnym i dializowano je wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C. Bufor do dializy zmieniano dwukrotnie.

Eluaty następnie oznaczano pod kątem wyrażania produktu genu DR5-IgG w teście ELISA. Początkowo, 100 μl każdej frakcji umieszczano oddzielnie w studzienkach 96-studzenkowej mikropłytki (Costar) i inkubowano w 37°C przez godzinę. Po tym czasie usuwano roztwór ze studzienek i przepłukiwano płytkę 3 razy 100 μl/studzienka PBS zawierającym 0,1% obj./obj. Tween 20 (nazywany tutaj dalej „PBS-Tween). Po przepłukaniu, dodawano PBS zawierający 2% wag./obj. albuminę surowicy bydlęcej (nazywany tutaj dalej „BSA) w ilości 100 μl/studzienkę i inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Po tym czasie studzienki przepłukiwano kolejne 3 razy 100 μl/studzienkę PBS-Tween, po czym do każdej studzienki dodawano 100 μl/studzienkę roztworu monoklonalnych przeciwciał anty-ludzkie IgG rozcieńczonych 1000 razy w PBS-Tween i ponownie inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Następne studzienki przepłukiwano 3 razy 100 μl/studzienkę PBS-Tween. Potem dodawano system płynnego substratu w postaci 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (nazywany tutaj dalej „TMB) (Sigma) w ilości 100 μl/studzienkę i trzymano płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie zatrzymywano reakcję poprzez dodawanie 100 μl/studzienkę 0,2 N H₂SO₄. Absorbancję każdej studzienki odczytywano przy 450 nm w celu oszacowania stężenia związanego przeciwciała, stosując absorbancję przy 650 nm jako odczyt kontrolny. Absorbancję mierzono używając czytnika mikropłytek (Molecular Devices). Wytwarzanie DR5-IgG1 potwierdzano stosując metodę ELISA. Ciężar cząsteczkowy wyrażanej fuzji białkowej DR5-IgG1 określano stosując analizę Western, w której w celu wykrycia przeciwciał na żelu używano mAb anty-ludzkie IgG1 (Sigma). Ciężar cząsteczkowy wyrażanej fuzji białkowej DR5-IgG1 wynosił około 50 kDa. Osiągnięta czystość wynosiła ponad 90% jak określono poprzez analizę typu SDS-PAGE i wykrywanie białka przez barwienie błękitem Coomassie.

P r z y k ł a d 2. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciw ludzkiemu DR5

2.1. Immunizacja

Samice myszy Balb/c (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) w wieku 6-8 tygodni immunizowano ludzką fuzją białkową DR5/hIgG1 oczyszczoną przez powinowactwo. Do wstępnej immunizacji w poduszeczkę łapy tworzono emulsję białka (50 μg) w kompletnym adiuwancie Freunda (Difco, Detroit, MI). Myszy poddawano czterem szczepieniom przypominającym z 50 μg fuzji białkowej podawanej bez adiuwanta każdego następnego dnia. Trzy dni po ostatnim szczepieniu limfocyty z miejscowych węzłów chłonnych poddawano fuzji z komórkami szpiczaka NS-1 i hodowano hybrydomy w pożywce F104 uzupełnionej 10% cielęcą surowicą płodową. Pozytywne hybrydomy selekcjonowano w teście ELISA, w którym płytki opłaszczano 1 μg/ml DR5/hIgG1 lub tą samą ilością Fas/hlgG1 jako

PL 211 755 B1 kontrolą. Izotypy hybrydom określano przez ELISA stosując zestaw kozich przeciwciał specyficznych wobec mysich izotypów Ig (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Przeciwciała monoklonalne oczyszczano przez chromatografię powinowactwa stosując unieruchomione anty-mysie IgG1 lub Białko G (Sigma).

2.2 Fuzja komórek

Trzeciego dnia po szczepieniu przypominającym, z myszy pobierano miejscowe węzły chłonne i umieszczano w 10 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy (GIBCO BRL), zawierającej 50 jednostek/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny i 300 μg/ml kwasu L-glutaminowego, następnie rozrywano poprzez przepuszczanie organu przez sito (Cell Strainer; Falcon) stosując łopatkę. Powstałą zawiesinę komórek wirowano w celu osadzenia komórek miejscowych węzłów chłonnych, które następnie przepłukiwano dwukrotnie w pożywce RPMI 1640 bez surowicy. Przepłukane komórki zawieszano w pożywce RPMI 1640 bez surowicy i liczono.

Jednocześnie komórki szpiczaka NS-1 (American Type Culture Collection TIB-18) hodowano do gęstości nie przekraczającej 1 x 10⁸ komórek/ml w pożywce ASF104 (Ajinomoto, K. K.) zawierającej 10% obj./obj. FCS (Gibco BRL) („pożywka ASF z surowicą) w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2, następnie w podobny sposób je rozrywano, przepłukiwano i liczono.

Ilość zawiesiny komórek NS1, zawierającą 3 x 10⁷ komórek mieszano z ilością zawiesiny komórek śledzony, zawierającą 3 x 10⁸ komórek. Powstałą mieszaninę wirowano i odrzucano supernatant. Przeprowadzano następujące etapy fuzji komórek, cały czas trzymając plastikowe probówki z osadem w 37°C w zlewce z ciepłą wodą.

Do probówki powoli dodawano 1 ml 50% (w/v) glikolu polietylenowego 1500 (Boehringer Manheim), mieszając osad końcówką pipety. Następnie dodawano powoli, w 2 porcjach, 1 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy podgrzanej do 37°C, po czym dodawano kolejne 7 ml pożywki RPMI 1640 bez surowicy. Powstałą mieszaninę wirowano, odrzucano supernatant i dodawano 10 ml pożywki HAT zawierającej 10% obj./obj. FCS, delikatnie mieszając końcówka pipety. Następnie dodawano kolejne 20 ml pożywki HAT zawierającej 10% obj./obj. FCS i zawiesinę rozdzielano do 96-studzenkowej mikropłytki do hodowli komórek po 100 μl/studzienka i inkubowano w 37°C w obecności 5% obj./obj. CO₂. Po 7 lub 8 dniach, 100 μl/studzienkę świeżej pożywki HAT używano do wymiany pożywki w każdej studzience wykazującej żółte zabarwienie. Komórki fuzji z tych studzienek klonowano poprzez graniczne rozcieńczanie jak opisano poniżej.

2.3 Klonowanie poprzez oraniczające rozcieńczanie

Pobierano grasice 4-10 tygodniowych samic myszy BALB/c (z Japan SLC, Inc.), rozrywano na sicie (Cell Strainer; Falcon) jak opisano powyżej i rozłączone komórki przepłukiwano dwukrotnie pożywką HT zawierającą 10% obj./obj. FCS. Ilość komórek grasicy odpowiadającą ilości z jednej myszy zawieszano w pożywce FIT zawierającej 10% obj./obj. FCS w celu wytworzenia odżywczej zawiesiny komórek. Preparat fuzji komórkowej otrzymany powyżej w Przykładzie 2.2 rozcieńczano w odżywczej zawiesinie komórek 10 - 100 razy, a następnie rozcieńczano seryjnie w odżywczej zawiesinie komórek, aby otrzymać zawiesiny mające gęstość komórek fuzji 5, 1 i 0,5 komórek/ml. Tak przygotowane próbki rozdzielano do studzienek 96-studzenkowych mikropłytek do hodowli komórek po 100 μl/studzienka i inkubowano przez 5 dni w 37°C w obecności 5% obj./obj. CO2.

2.4 Przeszukiwanie

Supernatanty hodowli hodowanych hybrydom przeszukiwano w teście ELISA stosując płytki opłaszczone 1 μg/ml DR5/hIgG1 lub tą samą ilością Fas/hlgG1 (41) jako kontrolą. Związane przeciwciała wykrywano stosując anty-mysie immunoglobuliny sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (Southern Biotechnology. Birmingham, AL) oraz TMB (Sigma, St Louis, MI) jako substrat. Oczyszczone DR5/hIgG1 w stężeniu 1 μg/ml lub tę samą ilość Fas/hIgG1 umieszczono w studzience 96-studzenkowej ELISA/RIA STRIP PLATE (Costar, NY). Płytkę trzymano w 4°C przez noc w celu umożliwienia adsorpcji białka na powierzchni studzienki. Po tym czasie usunięto mieszaninę ze studzienek i każdą studzienkę przepłukano 3 razy PBS-Tween. Następnie, do każdej studzienki dodawano 100 μl PBS, zawierającego 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (A3803; Sigma Chemicals Co.) i inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę. Następnie przepłukiwano studzienki 3 razy w PBS-Tween, po czym do każdej studzienki dodawano 50 μl supernatantu każdej hodowli hodowanych hybrydom. Płytkę inkubowano w 37°C przez godzinę, a studzienki ponownie przepłukiwano 4 razy PBS-Tween. Po przepłukaniu, do każdej studzienki dodawano 50 μl koziego przeciwciała anty-mysia immunoglobulina znakowanego peroksydazą chrzanową (Southern Biotechnology. Birmingham, AL) rozcieńczonego 1000 razy w PBS i ponownie inkubowano płytkę w 37°C przez godzinę, po czym przepłukiwano

PL 211 755 B1 studzienki 4 razy PBS-Tween. Następnie dodawano system płynnego substratu w postaci 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB) (Sigma) w ilości 100 gl/studzienkę i trzymano płytkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie zatrzymywano reakcję poprzez dodawanie 100 gl/studzienkę 0,2 N H2SO4. Absorbancję każdej studzienki odczytywano przy 450 nm (650 nm jako kontrola) używając czytnik mikropłytek (Molecular Devices) i wybierano fuzje komórkowe z próbek mających absorbancję (450 nm-650 nm, wartości OD; > 0,5) wyraźnie wyższą niż te, do których nie dodawano supernatantu fuzji komórkowych (wartości OD; ~ 0,03). Następnie supernatanty hodowli hodowanych hybrydom przeszukiwano pod względem funkcjonalnym poprzez pomiar aktywności indukującej apoptozę używając komórki Jurkat. Pięćdziesiąt gl pożywki RPMI, zawierającej komórki Jurkat (1000 na studzienkę) oraz 5 gM bisindolilomaleimidu VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) dodawano do 96-studzienkowych płytek w obecności 50 gl supernatantów hodowli hodowanych hybrydom. Komórki hodowano w nawilżanym inkubatorze w 37°C przez noc. Apoptozę oznaczano poprzez ocenę żywotności komórek stosując zestaw ATPLite kit zgodnie z zaleceniami producenta (Packard Instruments), a próbki zliczano stosując TopCounter (Packard Instruments).

2.5. Test ELISA wiązania TRAIL i TRA-8 do receptorów

Płytki do ELISA opłaszczano przez noc 2 gg/ml fuzji białkowych DR4-Ig lub DR5-Ig. Po blokowaniu 3% BSA dodawano rozpuszczalny TRAIL-FLAG lub TRA-8 we wskazanych stężeniach i inkubowano w 37°C przez godzinę. Wiązanie TRAIL-FLAG lub TRA-8 wykrywano odpowiednio przez przeciwciało anty-Flag sprzężone z HRP (Alexis) lub przeciwciało anty-mysie IgG1 sprzężone z HRP (Southern Biotechnology). Reakcje wywoływano stosując bufor z substratem TMB i mierzono stosując Benchmark Microplate Reader (BioRad). Wartości Kd szacowano stosując model wiązania w jednym miejscu nieliniowej regresji, używając oprogramowania GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Do kompetycyjnego testu ELISA, dodawano 100 ng/ml TRAIL-FLAG i inkubowano w obecności różnych stężeń TRA-8. Wiązanie TRAIL wyznaczano jak powyżej.

2.6 Klonowanie

Etapy opisane w Przykładach 2.3 i 2.4 powtarzano 5 razy dla komórek wyselekcjonowanych w 2.4, w ten sposób umożliwiając selekcję kilku klonów hybrybom, z których każdy wytwarzał pojedyncze przeciwciało wiążące DR5-IgG, ale nie wiążące Fas-IgG. W wyniku tej procedury selekcji, otrzymano hybrydomę mysz-mysz, oznaczoną TRA-8, która wytwarzała przeciwciało wiążące DR5IgG, ale nie Fas-IgG. Hybrydomę tę, TRA-8, zdeponowano w American Type Culture Collection 1 marca 2000 i przypisano jej numer dostępu PTA-1428.

Wykazano, że subklasa przeciwciała wytwarzanego przez hybrydomę mysz-mysz TRA-8 (dla uproszczenia nazywaną tuta] „TRA-8) to IgG1, κ, po teście zestawem do izotypowania przeciwciał monoklonalnych (Pierce).

Wykorzystując naszą ludzką fuzję białkową DR5-IgG1 jako immunogen, uzyskano siedem klonów hybrydom stosując wstępny test ELISA, z których każdy był silnie pozytywny wobec fuzji białkowej DR5-IgG, ale nie wobec Fas-IgG, co wskazywało, że otrzymane hybrydomy wytwarzały przeciwciała, które rozpoznawały zewnątrzkomórkową część DR5, nie rozpoznając części Fc IgG1 (dane nie pokazane).

2.7 Analiza typu Western

Filtry do analizy Western z homogenatami zdrowych i nowotworowych tkanek zakupiono od Geno Technology (St Louis, MO). Do każdej ścieżki nałożono równą ilość białka, co oszacowano stosując przeciwciało anty-e-aktyna. Filtry inkubowano z 1 gg/ml TRA-8 przez noc, a następnie z kozimi przeciwciałami anty-mysie IgG1 sprzężonymi z HRP (Southern Biotechnology) w temperaturze pokojowej przez godzinę i wywoływano stosując chemiluminescencję.

2.8 Immunohistochemia in situ

Ludzkie tkanki otrzymano od Tissue Procurement Center UAB. Zamrożone skrawki utrwalano w 70% etanolu, blokowano w 10% surowicy końskiej w PBS, a następnie inkubowano z 10 gg/ml oczyszczonego przez powinowactwo TRA-8 w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Do wizualizacji reaktywności jako substrat kolorymetryczny stosowano zestaw anty-mysie IgG ABC z diaminobenzydyną (Vector, Burlingame, CA).

2.9 Analiza aktywacji kaspaz

Komórki Jurkat (1x10⁶/ml) inkubowano z 500 ng/ml TRA-8. Próbki (30 gg białka) lizatu komórkowego rozdzielano w 15% SDS-PAGE, przenoszono na błonę nylonową i inkubowano z przeciwciałami anty-kaspaza 8, 9 i 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), a następnie z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z HRP i odcięte produkty wizualizowano przez chemiluminescencję. Zestaw inhibi32

PL 211 755 B1 torów kaspaz zakupiono od R & D Systems (Minneapolis, MN). Każdy inhibitor kaspazy dodawano do hodowli we wskazanych stężeniach.

P r z y k ł a d 3. Oczyszczanie przeciwciała monoklonalnego TRA-8

Hybrydomę mysz-mysz TRA-8 hodowano do gęstości 1 x 10⁶ komórki/ml inkubując w 500 ml pożywki ASF, zawierającej 10% obj./obj. FCS, w 37°C i obecności 5% obj./obj. CO2 przez 5 dni. Następnie hodowle odwirowywano (1000 obr. na min., 5 minut) i zbierano supernatant. Oczyszczania TRA-8 z supernatantu dokonywano stosując chromatografię powinowactwa Białko G-Sefaroza CL-4B (Pharmacia) w następujących warunkach:

kolumna: kolumna Białko G-Sefaroza CL-4B (wielkość kolumny 2 ml; Pharmacia) bufor do elucji: 0,1 M glicyna (pH 2,4), 0,15 M NaCl; bufor do neutralizacji: 1M Tris-HCl (pH 8,5).

Po nałożeniu całego supernatantu na kolumnę, przepłukiwano ją trzy razy 20 ml PBS, następnie 10 razy dodawano 1 ml buforu do elucji. Mierzono gęstość optyczną każdej wyeluowanej frakcji (1 ml). Oddzielnie zbierano frakcje od nr 2 do nr 5 (OD280 > 0,1).

Po dodaniu 100 μl buforu do neutralizacji eluaty umieszczano oddzielnie w worku dializacyjnym i dializowano je wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C. Bufor do dializy zmieniano dwukrotnie. Próbkę testowano pod kątem aktywności przeciwciała anty-DR5 w teście ELISA, używając przygotowaną powyżej ludzką fuzję białkową DR5-IgG i stosując technikę opisaną powyżej.

P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie antygenu DR4, wektora ekspresyjnego DR4-IgG i przeciwciała monoklonalnego anty-DR4

Powtórzono procedury z Przykładów 1-3 stosując matrycę cDNA i startery dla DR4 w miejsce opisanych w Przykładzie 1, aby otrzymać antygen DR4, który użyto jak w Przykładach 1.2-3 do otrzymania przeciwciała monoklonalnego specyficznego wobec DR4.

P r z y k ł a d 5. Przeciwciała monoklonalne przeciw DcR1 i DcR2

Przeciwciała monoklonalne przeciw receptorom przynętowym DcR1 i DcR2 uzyskano zastępując odpowiedni cDNA i startery w celu wytworzenia odpowiednich antygenów jak w Przykładzie 1. Wektory ekspresyjne dla fuzji DcR1 lub DcR2 z immunoglobuliną G oraz powstałe w rezultacie oczyszczone przeciwciała wytworzono jak w Przykładach 2 i 3.

P r z y k ł a d 6. Swoistość przeciwciała monoklonalnego

Ponieważ wszystkie receptory TRAIL i innych białek z rodziny TNFR wykazują istotną homologię, swoistość przykładowego przeciwciała TRA-8 dla DR5 określono w analizie Western stosując dwie różne ludzkie fuzje białkowe DR5-IgG oraz rozpuszczalne, rekombinowane formy innych spokrewnionych białek. Na początku skonstruowano fuzję białkową DR5-Ig łącząc cDNA kodujący reszty 1-180 zewnątrzkomórkowej części DR5 i cDNA kodujący stały region ludzkiej IgG1. Połączony cDNA wklonowano do rekombinowanego wektora adenowirusowego (Quantum Biotechnogies, Inc., Montreal, Canada). Wyrażaną fuzję białkową DR5/hIgG1, mającą względny ciężar cząsteczkowy 50 kDa, oczyszczano stosując kolumnę powinowactwa anty-ludzkie IgG (Sigma, St Louis, MO). Do analizy specyficzności, drugą rekombinowaną ludzką fuzję białkową DR5/hIgG1 (aa. 52-212), jak również fuzje białkowe TRAIL-R1, R3 i R4 zakupiono od Alexis. Rozpuszczalne formy ludzkiego Fas oraz TNFR1 otrzymano dzięki życzliwości Dr. Carla Edwardsa z Amgen, Inc., Thousands Oaks, CA, USA. Użyte rozpuszczalne rekombinowane ludzkie cząsteczki DR4, DcR1, DcR2, TNFR1, R4 i Fas są fuzjami białkowymi ludzkiej IgG1. 0,5 g każdego białka rozdzielono w 10% SDS-PAGE i przenoszono na membranę nitrocelulozową. Filtry blokowano w 5% mleku w PBS w temperaturze pokojowej przez godzinę i inkubowano z 1 μg/ml oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego anty-DR5 (klon: TRA-8) lub 0,1 μg/ml kozich przeciwciał anty-ludzkie IgG sprzężonych z HRP w 4°C przez noc. Kozie przeciwciała anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową używano jako przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia TRA-8. Filtry wywoływano stosując chemiluminescencję.

Komórki Cos-7 stransfekowane wektorem pcDNA3 (Clontech, Palo Alto, CA), zawierającym DR5 lub DR4 pełnej długości albo pustym wektorem używano do analizy stosują cytometrię przepływową. Pełnej długości cDNA kodujący ludzki TRAIL lub mysi ligand Fas klonowano w wektor pTRE poniżej promotora kontrolowanego tetracykliną (Clontech). Fragmenty XhoI-HindIII pTRE-hTRAIL lub pTRE-mFasL klonowano następnie do adenowirusowego wektora wahadłowego pAdBN (Quantum Biotechnologies, Inc.). Komórki gospodarza 293 kotransfekowano zlinearyzowanym pAd-TRE-hTRAIL lub pAdTRE-mFasL oraz dużym fragmentem DNA adenowirusa. Ekspresję funkcjonalnego ludzkiego TRAIL lub mysiego ligandu Fas w zrekombinowanych łysinkach wykrywano stosując test uwalniania ⁵¹Cr z Jurkat jako komórkami docelowymi.

PL 211 755 B1

TRA-8 reagowało silnie z fuzją białkową DR5-IgG (~50 kDa), którą użyto do immunizacji, jak pokazano na Fig. 1a DR5, #1 oraz słabo z drugą fuzją białkową DR5-IgG (~60 kDa), jak pokazano na Fig. 1a DR5, #2. Nie było znaczącego wiązania TRA-8 do DR4, DcR1, DcR2, Fas (CD95) lub TNFRI. Wyniki te wskazują, że TRA-8 rozpoznaje epitopy, które są specyficzne dla DR5, ale nie występują u innych przedstawicieli rodziny.

TRA-8 nie reagowało z innymi przedstawicielami nadrodziny receptora TNF takimi, jak Fas (CD95) i TNF receptor I, ani nie reaguje krzyżowo z mysim homologiem DR5, jak wykazano poprzez stosunek absorbancji optycznej dla 450 nm i 650 nm, numery 1-7 dolnej części rysunku (Fig. 1a, kolumna 8 dolnej części). Rozpuszczalny TRAIL i TRA-8 wiązały się podobnie do unieruchomionego DR5 (Fig. 1b, lewa część). W przeciwieństwie do tego, TRAIL wiązał DR4, ale TRA-8 nie wykazywał żadnej aktywności wiązania do DR4 (Fig. 1b, środkowa część). Wartości Kd wiązania TRAIL i TRA-8 do DR5 oszacowano odpowiednio na 59 nM i 3 nM. Co ważne, TRA-8 efektywnie współzawodniczył z TRAIL przy wiązaniu DR5, ale nie przy wiązaniu DR4, jak wykazano w kompetycyjnym teście ELISA (Fig. 1b, prawa część). Te wyniki wykazały specyficzność TRA-8 względem ludzkiego DR5.

TRA-8 jest zdolne do wykrywania ekspresji DR5 na powierzchni komórki, stosując analizę cytometrii przepływowej, wykazującą specyficzne wiązanie do powierzchni komórek Cos-7 transfekowanych pełnej długości DR5, ale nie w przypadku komórek Cos-7 transfekowanych DR4 lub pustym wektorem (Fig. 1c). Podobnie, immunohistochemia z TRA-8 wykazała reaktywność z komórkami Cos-7 transfekowanymi DNA DR5 pełnej długości, ale nie z tymi transfekowanymi wektorem kontrolnym (Fig. 1d). TRA-8 nie wywołuje apoptozy nietransfekowanych komórek Cos-7, a RT-PCR z RNA z komórek Cos-7 przy zastosowaniu pary starterów kodujących DR5 wykazała brak specyficznego produktu PCR. Kolejna analiza funkcjonalna przy zastosowaniu ludzkich komórek Jurkat jako celu wykazała, że przy braku łączenia krzyżowego TRA-8 silnie indukuje śmierć komórek, co wykazano w trzech różnych testach żywotności komórek, włączając ATPLite, MTT i wykluczanie PI (Fig. 1e). Więcej niż 50% komórek Jurkat jest zabijanych przez nanogramowe poziomy TRA-8, jak wykazano w teście ATPLite. Zabójcza aktywność TRA-8 jest specyficzna dla DR5 jako, że mogła być blokowana przez fuzję białkową DR5-Ig, ale nie przez DR4-Ig (dane nie pokazane). Cięcie przez kaspazy 8, 9 i 3 można było wykryć w analizie Western zaledwie w 30 minut po traktowaniu komórek Jurkat TRA-8 (Fig. 1f), a śmierć komórkowa komórek Jurkat jest całkowicie hamowana przez ogólny inhibitor kaspaz (Z-VAD) (Fig. 1g). Pojedyncze inhibitory kaspaz dla kaspazy 8, 3, 9 i 10 częściowo hamowały śmierć komórkową, dodatkowo wykazując, że śmierć komórkowa za pośrednictwem TRA-8 następuje przede wszystkim poprzez mechanizm apoptozy zależny od kaspaz.

P r z y k ł a d 7. Analiza przy zastosowaniu cytometrii przepływowej ekspresji DR5 na powierzchni komórki: głównego receptora śmierci na wielu komórkach nowotworowych, ale nie na komórkach zdrowych

Zdolność TRA-8 do wiązania DR5 wyrażanego na powierzchni komórki oraz specyficzność tej reakcji była następnie oceniana stosując komórki COS-7 (American Type Culture Collection nr CRL-1651) transfekowane wektorem ekspresyjnym zawierającym ludzki DR5 pełnej długości, cDNA DR4 lub pustym wektorem jako kontrola. Anty-mysie IgG1 sprzężone z fikoerytyryną (PE) (Pharmingen) stosowano jako drugorzędowe przeciwciała do wykrywania związanego TRA-8. Mierzono fluorescencję 1 x 10⁴ komórek stosując cytometr przepływowy (FACSVantage) w następujących warunkach:

Długość fali wzbudzenia: 488 nm

Długość fali detekcji: 600 nm.

Analiza cytometrią przepływową wykazała, że TRA-8 barwiło około 30% komórek COS-7 transfekowanych wektorem DR5, jak pokazano na histogramie Fig. 1c. Ten procent odpowiada wydajności transfekcji, jak wykazano stosując analizę transfekcji przy użyciu białka zielonej fluorescencji (GFP) (dane nie pokazane). TRA-8 nie barwiło znacząco komórek transfekowanych zarówno DR4 (histogram nie wypełniony), jak i wektorem kontrolnym (histogram kropkowany), wykazując, że TRA-8 jest specyficzny dla DR5 na powierzchni komórki.

Jakkolwiek ekspresję DR5 w komórkach nowotworowych intensywnie badano na poziomie mRNA (Rieger J. i wsp. 1: FEBS Lett 1998 May 1; 427 (1): 124-8), powierzchniowa ekspresja DR5 nie jest dobrze poznana. Gibson S. B. i wsp. 1: Mol Cell Biol 2000 Jan; 20 (1): 205-12; Kim K. i wsp. 1: Clin Cancer Res 2000 Feb; 6 (2): 335-46. Zatem dostępność przeciwciała monoklonalnego anty-DR5 pozwala nam na badanie poziomów powierzchniowego DR5 oraz na korelację ekspresji z podatnością komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. Następujący zestaw komórek (1x10⁶) inkubowano z 10 μg/ml TRA-8 oczyszczonego przez powinowactwo w temperaturze pokojowej przez 30 minut,

PL 211 755 B1 a następnie barwiono anty-mysimi IgG1 sprzężonymi PE (Pharmingen) przez następne 30 minut. 10000 żywych komórek analizowano stosując cytometr przepływowy FACSVantage w następujących warunkach:

Długość fali wzbudzenia: 488 nm

Długość fali detekcji: 600 nm.

Testowano pięć krwiotwórczych linii komórkowych: Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 i U937. Ekspresja DR5 była wykrywana na powierzchni komórek Jurkat, CEM-6, H-9 i U937, ale prawie nie była wykrywana na komórkach Molt-4, jak przedstawiono na Fig. 2a i 2a'. Chociaż wysokie poziomy ekspresji RNA DR5 opisano poprzednio (43), analiza FACs wykazała, że komórki te nie wyrażają powierzchniowego DR5 na wysokich poziomach. Wyniki te wskazują, że ekspresja DR5 na powierzchni komórki nie koreluje z transkrypcyjną ekspresją DR5, co nie jest nieoczekiwane dla takiego receptora. Poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki może być specyficzny dla danej linii, ponieważ większość komórek pochodzenia krwiotwórczego wyrażała DR5 na niskich poziomach, podczas gdy większość komórek glejakowych i komórek prostaty wyrażała DR5 na wysokich poziomach.

Monoklonalne przeciwciało TRA-8 używano do określenia roli DR5 w indukcji apoptozy za pośrednictwem TRAIL poprzez badanie jego ekspresji na powierzchni komórki w zestawie różnych typów ludzkich komórek nowotworowych, jak również podatność tych komórek na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL, jak i TRA-8. Pierwotne komórki T krwi obwodowej nie wyrażały DR5 na powierzchni komórki na znaczących poziomach i były odporne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL jak i TRA-8 (Fig. 2a, 2a' i 3a). Jakkolwiek wszystkie 5 z testowanych linii komórek ludzkiej białaczki T wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych choć względnie niskich poziomach, dwie z nich (Jurkat i CEM-6) były wysoce podatne na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL jak i TRA-8, co wskazywało na to, że sam DR5 jest wystarczający do indukcji apoptozy w tych komórkach. Komórki Molt-4 i U937 były częściowo podatne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, będąc względnie odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8, co sugeruje, że inne receptory TRAIL mogą być zaangażowane w transdukcję sygnału apoptozy. Komórki H-9 były odporne zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8, co implikowano blok za pośrednictwem wewnątrzkomórkowej ścieżki przeciwapoptotycznej.

Zestaw komórek obejmował ludzkie komórki glejaka złośliwego, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 oraz zdrowe astrocyty, które były dostarczone przez Dr Yancey Gillespie z Neurosurgery Department of the University of Alabama w Birmingham. Ludzkie komórki nowotworu prostaty, Du154, PC3 i LnCap, były dostarczone przez Dr William Grizzle of the Pathology Department of the University of Alabama w Birmingham, który otrzymał je z American Type Culture Collection. Ludzkie linie komórkowe białaczki T, chłoniaka komórek B, HepG2 Jurkat (American Type Culture Collection TIB-152) i CCRF-CEM CEM-6 (American Type Culture Collection CCL-119); linie komórkowe monocytów, U937 (American Type Culture Collection CRL-2367); zakupiono od American Type Culture Collection. Wszystkie powyższe linie komórkowe hodowano w RPMI 1640 uzupełnionej 10% FCS. Ludzką linię komórkową gwiaździaka, 1321N1, otrzymano dzięki życzliwości Dr. Richard Jope z Psychiatry Department of the University of Alabama w Birmingham, hodowana w DMEM uzupełnionej 5% FCS.

Rozpuszczalny zrekombinowany ludzki TRAIL, zakupiony od Alexis Corporation (San Diego, CA), jest fuzją białkową zawierającą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego TRAIL (reszty aminokwasowe od 95 do 281), połączoną na końcu N ze znacznikiem FLAG i 8-aminokwasowym peptydem łącznikowym. W przeciwieństwie do poprzednio opublikowanego TRAIL ze znacznikiem His, ten preparat TRAIL nie indukuje silnej odpowiedzi apoptotycznej w komórkach Jurkat i wymaga przeciwciała anty-FLAG jako odczynnika do wiązania krzyżowego do podwyższenia apoptozy. Przeciwciało antyFLAG również zakupiono od Alexis.

Wszystkie 10 badanych ludzkich komórek glejaka złośliwego wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach. DR5 było najczęściej wyrażane na średnich do wysokich poziomach jak przedstawiono na Fig. 2b. Trzy linie D-54MG, U373MG i CH-235MG wyrażały DR5 na wysokich poziomach, podczas gdy 6 linii, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 i 1321N1, wyrażało DR5 na średnich poziomach. Tylko jedna linia komórkowa H-465 wyrażała DR5 na niskich poziomach. Wszystkie trzy linie komórkowe nowotworu prostaty wyrażały DR5 na wysokich poziomach, jak przedstawiono na Fig. 2c.

Podobnie jak zdrowe pierwotne komórki T, pierwotne komórki B nie wyrażały DR5 na znaczących poziomach i nie przechodziły apoptozy po traktowaniu zarówno TRAIL, jak i TRA-8 (Fig. 2d).

PL 211 755 B1

Trzy (SKW6. 4, EB-3 i Raji) z czterech testowanych linii komórkowych chłoniaka B wyrażały DR5 na względnie wysokich poziomach i były bardzo podatne zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Czwarta linia komórkowa, Daudi, wyrażała DR5 na bardzo niskich poziomach i była znacznie mniej podatna zarówno na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Chociaż pierwotne astrocyty nie wyrażały DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach (Fig. 2b'), wszystkie cztery testowane linie glejaka wyrażały wysokie poziomy DR5. Wyższemu poziomowi ekspresji DR5 na komórkach glejaka w porównaniu z komórkami T i B nie towarzyszyła znacząco wyższa podatność na apoptozę za pośrednictwem TRAIL i DR5, co sugeruje, że poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki niekoniecznie koreluje z poziomem apoptozy komórek nowotworowych. Reakcja RT-PCR przeprowadzona w celu określenia poziomów mRNA DR4, DR5 i DcR2, wykryła mRNA we wszystkich testowanych komórkach (Tabela 1). Jednakże, ogólnie, pierwotne zdrowe komórki wyrażały DR5 na względnie niskich poziomach w porównaniu z transformowanymi komórkami nowotworowymi.

T a b e l a 1: Analiza RT-PCR ekspresji receptora TRAIL*

Komórki	DR5	DR4	DcR2
Pierwotne komórki T	<0,001	<0,001	0,015
Jurkat	0,10	<0,001	0,21
CEM-6	0,50	0,59	0,25
Molt-4	0,10	<0,001	0,05
H-9	0,73	0,61	0,07
Pierwotne komórki B	<0,001	<0,001	0,024
SKW6.4	0,95	0,66	0,45
EB3	0,40	<0,001	0,35
Raji	0,55	0,11	0,45
Daudi	0,73	0,36	0,63
Zdrowe astrocyty	0,05	<0,001	0,12
SH683	0,56	0,96	0,14
U87	0,44	0,56	0,21
D54	1,15	0,46	0,12
1321N1	0,25	0,35	0,05

* Całkowite RNA izolowano z komórek i przeprowadzano RT-PCR jak opisano w Metodach. Produkty PCR rozdzielano w 3% żelu agarozowym i analizowano stosując Fluor-S MAX Multilmager System (BioRad). Wartości przedstawiono jako względny stosunek do β-aktyny.

P r z y k ł a d 8. Indukcja apoptozy in vitro w komórkach nowotworowych

W celu określenia czy TRA-8 indukuje apoptozę w transformowanych komórkach in vitro wszystkie komórki DR5-dodatnie badano pod kątem ich podatności na apoptozę indukowaną zarówno przez TRA-8, jak i TRAIL.

₃

Komórki docelowe (1 x 10³ na studzienkę) hodowano w 96-studzienkowych płytkach w obecności wskazanych stężeń rozpuszczalnego TRAIL oraz odczynnika do wiązania krzyżowego (Alexis) lub TRA-8 w 37°C przez noc. Żywotność komórek oznaczano stosując (1) zestaw ATPLite zgodnie z zaleceniami producenta (Packard Instruments, Meriden, CT); (2) zestaw MTT Cell proliferation/viability (Sigma) lub (3) barwienie martwych komórek PI i analizowano stosując cytometrię przepływową. Na koniec hodowli komórki barwiono, 10 gg/ml PI, a komórki PI ujemne bramkowano jako komórki żywe. Przy analizie skondensowanych jader hepatocytów, komórki barwiono 10 ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes) i analizowano stosując cytometrię przepływową.

Przeciwciało TRA-8 było zdolne do indukcji apoptozy w większości ludzkich linii komórek złośliwego glejaka (9/10), w 2 z 3 linii komórek nowotworu prostaty oraz w 2 z 4 DR5-dodatnich linii komórek krwiotwórczych. Nie indukowało ono apoptozy w linii komórek Molt-4, która wyrażała DR5 na po36

PL 211 755 B1 wierzchni komórki na prawie niewykrywalnych poziomach. Jednakże, poziomy podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 różniły się znacznie wśród linii komórkowych.

Zróżnicowanie podatności komórek na apoptozę indukowaną przez przeciwciało TRA-8 sugeruje, że jakkolwiek minimalny poziom ekspresji DR5 na powierzchni komórki jest wymagany, poziom DR5 wyrażanego na powierzchni komórki niekoniecznie jest podstawowym wyznacznikiem podatności i inne czynniki wpływają na ten proces. Chociaż komórki glejaka ogólnie wyrażały znacznie wyższe poziomy powierzchniowego DR5 niż komórki krwiotwórcze, podatność komórek glejaka na apoptozę indukowaną przez TRA-8 nie jest proporcjonalnie podwyższona w porównaniu z komórkami krwiotwórczymi. Podatność pięciu linii komórek glejaka D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG i 1321N1 na apoptozę indukowaną przez TRA-8 jest wysoka i jest równoważna z ich podatnością na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak pokazano na Fig. 3b. Dwie z linii komórek glejaka, H-456 i SMK1, są znacznie mniej podatne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. W przypadku komórek H-456 powierzchniowa ekspresja DR5 jest niska, jednakże powierzchniowa ekspresja DR5 na komórkach SMK1 jest podobna do bardziej podatnych linii komórkowych, co sugeruje, że inne mechanizmy mogą odgrywać rolę w wyznaczaniu podatności na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. Jakkolwiek wszystkie trzy linie komórkowe nowotworu prostaty wyrażały DR5 na wysokich poziomach, komórki Du145 są najbardziej wrażliwe na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, komórki PC3 są częściowo wrażliwe, podczas gdy komórki LnCAP są zupełnie odporne, jak pokazano na Fig. 3c. Wśród komórek krwiotwórczych, wykazano, że Jurkat i CEM-6 są bardzo podatne na apoptozę TRA-8, jak pokazano na Fig. 2a, chociaż wykazano, że obie te linie komórkowe wyrażają DR5 na niskich poziomach. Jakkolwiek DR5 jest wykrywalny na komórkach U937, komórki te są odporne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Podobnie, jakkolwiek komórki H-9 wyrażają wykrywalne ilości DR5, komórki H-9 są odporne na na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Wyniki te wykazały istnienie mechanizmy regulującego, który wpływa na apoptozę za pośrednictwem DR5.

Dodatkowe wiążące się do powierzchni przeciwciała anty-DR5 wytworzono w procedurach Przykładów 1-3. Dwa dodatkowe przeciwciała anty-DR5 oznaczone TRA-1 i TRA-10 badano razem z TRA-8 w celu określenia porównywalnej zdolności do indukcji apoptozy i przez to działania jako agonista lub odwrotnie do blokowania apoptozy za pośrednictwem TRAIL i przez to działania jako antagonista. Ludzie komórki Jurkat używano jako komórki docelowe do określania aktywności agonisty i/lub antagonisty trzech przeciwciał anty-DR5 oznaczonych TRA-1, TRA-8 i TRA-10. Jak pokazano na Fig. 4 przeżywalność komórek wynosiła około 90%, 70% i 20% odpowiednio dla TRA-10, TRA-1 i TRA-8 po inkubacji przez noc z 2,5 μg na ml. TRA-8 indukowało silną odpowiedź apoptotyczną w sposób zależy od dawki, podczas gdy TRA-1 indukowało tylko umiarkowaną odpowiedź apoptotyczną a TRA-10 indukowało zaledwie słabą odpowiedź. Zatem TRA-8 sklasyfikowano jako agonistyczne przeciwciało anty-DR5. Na Fig 4. przeżywalność ludzkich komórek Jurkat pokazano jako, zależną od dawki, funkcję apoptozy indukowanej przez TRAIL. TRA-10 blokowało apoptozę ludzkich komórek Jurkat w znaczącym stopniu w badaniach małej dawki apoptozy indukowanej przez TRAIL. Tak więc, TRA-10 sklasyfikowano jako antagonistyczne przeciwciało anty-DR5. TRA-1 zdeponowano w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA-1741. TRA-10 zdeponowano podobnie w American Type Culture Collection pod numerem dostępu PTA-1742.

Podatność pięciu linii komórkowych glejaka D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG i 1321N1 na apoptozę indukowaną przez TRA-8 jest równoważna w ich podatności na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, jak pokazano na Fig. 3b, co sugeruje, że apoptoza indukowana przez TRAIL w tych komórkach następuje przede wszystkim za pośrednictwem DR5. Ponadto, dwie linie komórkowe glejaka, Hs683 i U251-MG, są odporne na apoptozę indukowaną TRAIL, ale częściowo podatne na apoptozę indukowaną TRA-8, co wskazuje, że receptory przynętowe działają w tych komórkach oraz, że użycie przeciwciała TRA-8 pomija ten mechanizm regulatorowy. W liniach komórkowych nowotworu prostaty, mimo zróżnicowania wrażliwości na apoptozę indukowaną przez TRA-8, odpowiada ona wrażliwości komórek na apoptozę indukowaną przez TRAIL, ponownie sugerując, że DR5 odgrywa główną rolę w apoptozie za pośrednictwem TRAIL w komórkach raka prostaty. Wśród komórek krwiotwórczych wykazano, że Jurkat i CEM-6 są bardzo podatne na apoptozę zarówno za pośrednictwem TRAIL, jak i TRA-8. Poziom apoptozy indukowany przez TRA-8 był porównywalny z tym indukowanym przez TRAIL, jak pokazano na Fig. 2a i 3a'. Tylko jedna linia glejaka U87 i dwie linie komórek krwiotwórczych, U937 i Molt-4, wykazywały wrażliwość na apoptozę indukowaną przez TRAIL, ale były mniej wrażliwe lub odporne na apoptozę indukowaną przez TRA-8. Jedna linia komórkowa, H-9, wyrażała DR5 na wykrywalnych poziomach, ale była odporna na apoptozę indukowaną zarówno przez

PL 211 755 B1

TRAIL, jak i TRA-8. Podczas gdy minimalny poziom ekspresji jest wymagany przy apoptozie indukowanej przez TRA-8, poziom ekspresji niekoniecznie określa podatność komórek na apoptozę za pośrednictwem TRA-8; receptory przynętowe odgrywają rolę w modulowaniu apoptozy za pośrednictwem TRAIL w niektórych komórkach, ale nie wydają się odgrywać głównej roli w większości testowanych do tej pory komórek; jak przypuszczano przeciwciało TRA-8 pomija efekty receptorów przynętowych; mutacje funkcjonalne receptora DR5 mogą pojawiać się w transformowanych komórkach, i wreszcie wewnątrzkomórkowe mechanizmy regulatorowe mogą być tak samo lub bardziej ważne niż receptory przynęty w określaniu podatności komórek na apoptozę za pośrednictwem TRAIL i DR5.

Poprzednie badania wykazały, że mRNA DR5 jest powszechna w zdrowych tkankach⁷. W celu zbadania ekspresji DR5 na poziomie białkowym, zestaw homogenatów zdrowych ludzkich tkanek (Geno Technology, St. Louis, MO) inkubowano z przeciwciałem TRA-8 w analizie Western. Wśród dziewięciu zdrowych ludzkich tkanek, tkanka mózgowa była słabo dodatnia (Fig. 5a, ścieżka 2). Nie wykrywano białka DR5 przez reaktywność TRA-8 w wątrobie (ścieżka 1), płucach (ścieżka 3), nerce (ścieżka 4), trzustce (ścieżka 5), jądrach (ścieżka 6), jajniku (ścieżka 7), sercu (ścieżka 8) lub trzustce (ścieżka 9). W przeciwieństwie do tego, wszystkie trzynaście ludzkich tkanek nowotworowych barwiło się dodatnio TRA-8 (Fig. 5b), włączając w to nowotwory jajnika (ścieżka 1), płuc (ścieżka 2), wątroby (ścieżka 3), odbytnicy (ścieżka 4), szyjki macicy (ścieżka 5), skóry (ścieżka 6), jąder (ścieżka 7), tarczycy (ścieżka 8), macicy (ścieżka 10), żołądka (ścieżka 11), krtani (ścieżka 12) i trzustki (ścieżka 13). Dodatkowo immunohistochemia in situ zdrowych i nowotworowych tkanek z TRA-8 potwierdziła, że oprócz kilku rozproszonych komórek dodatnich w trzustce, ekspresja DR5 w zdrowych tkankach piersi, płuc i śledziony nie jest wykrywana (Fig. 5c). Odpowiadające tkanki nowotworowe włączając przewodowy nowotwór naciekowy sutka, nowotwór płuc z małych komórek i chłoniaka reagowały dodatnio z TRA-8 (Fig. 5d). Wśród 22 badanych tkanek nowotworowych, 5 z 6 nowotworów sutka, 2 z 2 nowotworów szyjki macicy, 4 z 5 nowotworów wątroby, 5 z 8 chłoniaków, 2 z 2 nowotworów płuc i 2 z 2 nowotworów prostaty reagowały dodatnio z TRA-8. Wyniki te są zgodne z wynikami analizy cytometrią przepływową i wykazują, że tkanki nowotworowe wyrażają wyższe poziomy białka DR5 niż zdrowe tkanki.

P r z y k ł a d 9. Aktywność TRA-8 zabijania nowotworu in vivo

Z wielu przyczyn, wiele czynników, które wykazują obiecujące działanie w badaniach in vitro nie wykazuje skuteczności in vivo. Ważne jest zatem zbadanie skuteczności TRA-8 w modelu zwierzęcym in vivo. Aby tego dokonać przeciwciało TRA-8 anty-ludzki DR5 podawano myszom z ludzkim heteroprzeszczepem wyrażającym cząsteczkę ludzkiego DR5. Użytymi myszami były 6 do 8 tygodniowe myszy NOD/SCID (Jackson Laboratory), którym podano podskórnie ludzkie komórki gwiaździaka 1321N1 (1 x 10⁷) lub podano dożylnie ludzkie komórki białaczki Jurkat (1 x 10⁶). W dwa dni po podaniu nowotworu, myszom podawano dożylnie TRA-8 (100 gg). Pięć dni po traktowaniu TRA-8 rozwój nowotworu 1321N1 określano po przez wielkość i ciężar masy guza. Rozwój komórek Jurkat określano poprzez ciężar śledziony zwierząt, którym je podano. Pobrano i badano histologicznie biopsje tkanek nowotworowych.

Wczesne traktowanie pojedynczą dożylną dawką 100 gg TRA-8 w dzień po podaniu nowotworu zahamowało zupełnie tworzenie zwartego guza przez komórki 1321N1 (Fig. 6a). Późne traktowanie trzema dawkami 100 gg TRA-8 tydzień po podaniu nowotworu, zredukowało ciężar guza 4 lub więcej razy (Fig. 6b). Tworzenie się guza nie było widoczne u zwierząt traktowanych TRA-8 we wczesnym punkcie czasowym (Fig. 6c, górne pole). Analiza histologiczna wykazała silną degenerację tkanki nowotworowej u zwierząt traktowanych TRA-8 (Fig. 6c, dolne pole). Podobnie, traktowanie TRA-8 zahamowało populację komórek śledziony przez komórki Jurkat jak pokazano wykazując niedobór CD3-pozytywnych komórek Jurkat w śledzionie (Fig. 6d, 6e). Analiza histologiczna wszczepionego nowotworu wykazała kilka komórek nowotworowych rozproszonych w tkance miękkiej u zwierząt traktowanych TRA-8, podczas gdy kontrole wykazały tworzenie się zwartego nowotworu jak pokazano na Fig. 6c. W modelu komórek Jurkat, liczba komórek Jurkat w śledzionach zwierząt traktowanych TRA-8 wynosiła mniej niż 2% w porównaniu do prawie 10% w śledzionach zwierząt kontrolnych jak wykazano stosując analizę cytometrią przepływową jak pokazano na Fig. 6a oraz barwieniem CD3 in situ - Fig. 6c.

Wyniki te potwierdzają niedawne wykazanie, że ogólnoustrojowe podawanie związanego krzyżowo rekombinowanego TRAIL hamuje rozwój nowotworu in vivo (13). Wyniki te wskazują, że pojedyncza dawka TRA-8 jest wysoce skuteczna w eliminacji komórek nowotworowych in vivo.

PL 211 755 B1

Ponieważ anty-ludzkie przeciwciało stosowano w modelu mysim, nie można było określić toksyczności traktowania TRA-8. Jednakże badania polegające na podawaniu TRAIL in vivo wykazały, że z traktowaniem nie jest związana znacząca toksyczność (13).

P r z y k ł a d 10. Maziówkowe komórki RA są podatne na apoptozę indukowaną TRAIL i TRA-8

Większość poprzednich badań apoptozy za pośrednictwem TRAIL w tej dziedzinie skupiało się na komórkach złośliwych. Apoptoza za pośrednictwem TRAIL według niniejszego wynalazku jest również lecznicza w stanach autoimmunologicznych i zapalnych takich, jak RA.

10.1 Analiza ekspresji DR5 na powierzchni komórki w komórkach maziówkowych RA przy zastosowaniu cytometrii przepływowej.

Ekspresję DR5 w zestawie ośmiu pierwotnych hodowanych komórek maziówkowych od pacjentów z RA porównywano z ekspresją na ośmiu pierwotnych hodowanych komórek maziówkowych od pacjentów z zapaleniem kości i stawów (nazywanych tutaj dalej „OA). Osiem ludzkich pierwotnych hodowli komórek maziówkowych RA RA-1014, RA-1016, RA-1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 i RA-929 otrzymanych dzięki życzliwości Dr M. Ohtsuki (Sankyo Co. Ltd., Tokyo, Japan) hodowano w DMEM uzupełnionej 10% FCS, penicyliną, streptomycyną i glutaminą. Siedem pierwotnych hodowli komórek maziówkowych OA izolowano z tkanek maziówkowych od pacjentów z OA stosując standardową metodę kolagenazową i hodowano w tych samych warunkach. Liczba pasaży wszystkich pierwotnych linii nie przekraczała 10. Ekspresję DR5 określano poprzez analizę cytometrią przepływową, jak opisano w Przykładzie 5.

Wszystkie pierwotne hodowle komórek RA wyrażały powierzchniowy DR5 na wysokich poziomach, z małymi różnicami w poziomach ekspresji wśród komórek maziówkowych izolowanych z różnych pacjentów, jak pokazano na Fig. 7a. W przeciwieństwie do tego, ekspresja powierzchniowego DR5 na powierzchni komórek maziówkowych wyizolowanych z pacjentów z OA była bardzo niska lub niewykrywalna, jak na Fig. 7b. Wykazano, że komórki maziówkowe transformowanie SV40 wyrażają DR5 na wysokich poziomach, porównywalnych z wykazywanymi przez komórki RA. W przeciwieństwie do tego, nietransformowane komórki fibroblastyczne wyrażały DR5 na niskich poziomach porównywalnych z wykazywanymi przez komórki OA na Fig. 7b.

10.2 Podatność komórek maziówkowych RA na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 lub TRAIL.

Ogólnie, wszystkie komórki maziówkowe izolowane z pacjentów z RA są podatne na apoptozę indukowaną zarówno przez TRAIL, jak i przeciwciało anty-DR5 oraz wszystkie komórki OA są oporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i przeciwciało anty-DR5 jak pokazano na Fig. 8a, b. Badania te wykazują, że przeciwciało TRA-8 wiąże komórki zmienione preferencyjnie do komórek zdrowych. Dodatkowo, wzór podatności lub odporności na apoptozę indukowaną przez TRAIL koreluje z apoptozą indukowaną przez przeciwciało anty-DR5, co wskazuje na to, że komórki maziówkowe przede wszystkim używają DR5 do wyzwalania apoptozy TRAIL.

Jak opisano dla komórek złośliwych, podatność na apoptozę indukowaną przez TRAIL lub przeciwciało anty-DR5 różniła się pomiędzy komórkami maziówkowymi RA pomimo wyrażania DR5 na podobnych poziomach. RA-512 i RA-707 były najbardziej podatne, jako że ponad 80% komórek było zabijanych przy stężaniu TRAIL lub TRA-8 poniżej 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 i RA929 były wśród tych ze średnią podatnością na TRAIL lub TRA-8 z prawie 100% śmiercią komórek w obecności wysokich stężeń (> 50 ng/ml) TRAIL lub TRA-8. Dla komórek RA-1016 i RA1021, chociaż większość (ponad 60%) komórek było zabijanych przez niskie dawki TRAIL lub TRA-8, część komórek przeżywało w obecności wysokich dawek TRAIL lub TRA-8, co wskazywało, że subpopulacja komórek była odporna na apoptozę za pośrednictwem TRAIL. W przeciwieństwie do tego, wszystkie komórki były o wiele mniej podatne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8. Nie więcej niż 60% komórek było zabijanych w przypadku OA52F i OA69F nawet w obecności wysokiego stężenia TRAIL lub TRA-8. Komórki OA72M były całkowicie odporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL lub TRA-8. Komórki maziówkowe transformowane SV40 były również podatne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8 (dane nie pokazane). W przeciwieństwie do tego, nietransformowane komórki fibroblastyczne okazały się być odporne na apoptozę indukowaną przez TRAIL i TRA-8.

Poprzednio wykazano, że do wyzwalania apoptozy DR5 wykorzystuje ścieżkę zależną od FADD/kaspazy 8 (44). W celu określenia zależności apoptozy za pośrednictwem DR5 komórek maziówkowych od kaspazy, komórki PA hodowano z TRAIL i przeciwciałem anty-DR5 w obecności specyficznych inhibitorów kaspaz. Spośród ośmiu badanych inhibitorów kaspaz, inhibitory kaspazy 6, 8 i 10 były zdolne do hamowania apoptozy komórek maziówkowych RA indukowanej zarówno przez

PL 211 755 B1

TRAIL, jak i DR5, jak pokazano na Fig. 9, co wskazuje, że te trzy kaspazy są zaangażowane w apoptozę za pośrednictwem DR5.

10.3 TRA-8 lub TRAIL indukuje aktywację NF-Kb w komórkach maziówkowych RA bez podwyższonego uwalniania MMP.

Istnieje ważny dowód potwierdzający koncepcję, że istnieją bliskie powiązania pomiędzy sygnalizacją apoptozy a sygnalizacją proliferacji (45). Wykazano, że DR5 obok transdukcji sygnału apoptotycznego jest zdolny do aktywacji ścieżki NF-Kb oraz że aktywacja NF-Kb może być zdolna do transdukcji sygnału przeciwapoptotycznego. Przeprowadzono zatem test typu opóźnienia migracji w żelu. Komórki stymulowano 50 ng/ml rekombinowanego rozpuszczalnego TRAIL, ligandem Fas w obecności 1 mg/ml wzmacniacza lub 50 ng/ml TRA-8 przez określony czas. Przygotowywano ekstrakty jądrowe i inkubowano z podwójnie zabarwioną sondą DNA-oligonukleotydową wyznakowaną [³²P]. Wyniki analizowano stosując urządzenie cyclone phospha-imager (TopCount NXT, Packard Instrument Company, CT). Po inkubacji komórek maziówkowych RA z TNF-α lub TRAIL, NF-Kb był aktywowany w sposób zależny od czasu. Przeciwciało TRA-8 było zdolne do silnej aktywacji NF-Kb. W przeciwieństwie do tego, ligand Fas nie był zdolny do indukcji aktywacji NF-Kb, jak pokazano na Fig. 10a.

Tak więc, jakkolwiek TRAIL i przeciwciało TRA-8 indukowały silną odpowiedź apoptotyczną w komórkach maziówkowych PA, aktywowały również NF-Kb, a aktywację NF-Kb uważano za przyczyniającą się do prozapalnego działania TNF-α w RA. Zatem możliwe jest, że TRAIL podobnie jak TNF-α, może działać jako cytokina prozapalna. W celu zbadania, czy istnieje podobne następstwo biologiczne aktywacji NF-Kb indukowanej przez TRAIL i TNF-α, określono wytwarzanie MMP stosując ELISA. Komórki maziówkowe hodowano w czystej pożywce lub z dodatkiem 50 ng/ml interleukiny 1b, 10 ng/ml TNF-α, 50 ng/ml TRAIL, 50 ng/ml TRA-8 przez noc. Poziomy MMP-1 i MMP-3 w supernatantach hodowli określano stosując zestawy ELISA.

Kiedy komórki maziówkowe RA inkubowano z prozapalną cytokiną, TNF-α lub IL-1b, wytwarzanie MMP-1, 3 i 13 było podwyższone w porównaniu z pożywką kontrolną, jak pokazano na Fig. 10 b, c. W przeciwieństwie do tego traktowanie TRAIL lub przeciwciałem anty-DR5 nie było związane z podwyższonym uwalnianiem tych MMP.

P r z y k ł a d 11A. Niepowodzenie przy indukcji toksyczności hepatocytowej.

Do 24 godzinnych testów żywotności komórek, świeże, zdrowe ludzkie hepatocyty na 96-studzienkowych płytkach zakupiono od In Vitro Technology (Baltimore, MD). Hepatocyty hodowano w pożywce do hodowli hepatocytów Hepatocyte Culture Medium zawierającej 1 gg/ml rozpuszczalnego TRAIL i TRA-8. Do 6 godzinnych testów żywotności, zdrowe hepatocyty lub nowotworowe komórki hepatocytowe izolowano ze świeżych próbek otrzymanych z UAB Tissue Procurement Center. Wszystkie odczynniki do izolacji ludzkich hepatocytów, włączając w to bufor do perfuzji hepatocytów, pożywkę do trawienia, pożywkę do płukania oraz pożywkę do przyklejania, zakupiono od Gibco. Skrawki tkanki trawiono w pożywce do trawienia hepatocytów Hepatocyte Digest Medium w 37°C z wytrząsaniem (50 obr. na min.) przez godzinę. Wyizolowane hepatocyty zbierano przez wirowanie z małą prędkością (50 g, 3 min.) i przepłukiwano sześciokrotnie w pożywce do płukania hepatocytów Hepatocyte Washing Medium. Zawiesinę pojedynczych komórek hepatocytów hodowano w pożywce do przyklejania Attachement Medium zawierającej 10% FCS w 96-studzienkowych płytkach Matrigel (BD) przez 6 godzin. Nie przyklejone hepatocyty usuwano poprzez dwukrotne płukanie podgrzaną pożywką do przyklejania. Przyklejone hepatocyty inkubowano następnie z różnymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL lub FasL w obecności odczynnika do wiązania krzyżowego lub TRA-8 lub CH11 przez 6 godzin.

TRAIL ma przynajmniej dwa receptory (DR4 i DR5), które są zdolne do indukcji apoptozy. TRA-8 używano do określania, czy wyłącznie DR5 przez wiązanie krzyżowe jest wystarczające do indukcji apoptozy zdrowych hepatocytów. Ekspresję DR5 na poziomie białka badano początkowo w pięciu zdrowych ludzkich tkankach wątroby i w pięciu nowotworowych tkankach wątroby, stosując immunocytochemię in situ używając TRA-8. Skrawki zdrowych tkanek wątroby wykazywały normalną budowę i morfologię komórkową przy barwieniu H & E (Fig. 11a, lewa górna część) z jednoczesnym brakiem pozytywnej reaktywności z TRA-8 dla DR5 (Fig. 11a, lewa dolna część). W przeciwieństwie do tego, ludzka nowotworowa tkanka hepatocytowa reagowała pozytywnie z TRA-8, wykazując wzór zgodny z obecnością DR5 w błonie komórkowej i cytoplazmie nowotworowych komórek. Ludzka nowotworowa hepatocytowa linia komórkowa HepG2 była również dodatnia pod względem DR5. Wyniki te były zgodne dla pięciu zdrowych tkanek wątroby i tylko jedna (gruczolak wątroby) z pięciu tkanek nowotwo40

PL 211 755 B1 rowych wątroby była negatywna pod względem DR5. Wyniki te były zgodne z danymi pochodzącymi z analizy Western, przedstawionymi na Fig. 5a, które pokazują, że podobnie jak inne zdrowe tkanki, zdrowa ludzka tkanka wątroby nie wyraża znaczących poziomów białka DR5. Dodatkowo, analiza Western izolowanych zdrowych ludzkich hepatocytów inkubowanych z TRA-8 nie wykazała DR5 na wykrywalnych poziomach.

Analiza ekspresji DR5 na powierzchni komórki ludzkich hepatocytów przy zastosowaniu cytometrii przepływowej wykazała, że świeżo przygotowane zdrowe hepatocyty nie wyrażają DR5 na powierzchni komórki na wykrywalnych poziomach (Fig. 11b, górne lewe części). DR5 nie było wykrywane na zdrowych ludzkich hepatocytach, które były zamrażane w obecności czynnika krioochronnego lub umieszczane w hodowli krótkoterminowej. W przeciwieństwie do tego, świeżo izolowane nowotworowe komórki hepatocytowe, jak również komórki HepG2 wyrażały DR5 na powierzchni komórki. Używając Fas dla porównania, zdrowe hepatocyty, nowotworowe komórki hepatocytowe i komórki HepG2 wyrażały odpowiednie poziomy Fas (Fig. 11b, dolne części). Wyniki te są zgodne z wynikami otrzymanymi przy zastosowaniu immunohistochemii in situ oraz analizy Western i wykazują, że DR5 na powierzchni komórki jest wyrażany na wysokich poziomach w nowotworowych komórkach wątroby i nie jest wyrażany w zdrowych hepatocytach. Obecność mRNA dla DR4, DR5, DcR1 i DcR2 w ludzkich hepatocytach, wykazana przez RT-PCR²³, sugeruje, że ludzkie hepatocyty mogą wyrażać białko DR5 na bardzo niskich poziomach, będących poniżej poziomu detekcji przez TRA-8.

W celu określenia, czy TRA-8 indukuje toksyczność hepatocytów, badano podatność zdrowych ludzkich hepatocytów na apoptozę wywołaną TRA-8 i rozpuszczalnym TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego. Gdy zdrowe hepatocyty hodowano w obecności dużego stężenia TRAIL, obserwowano zależne od czasu obniżenie żywotności komórek w testach ATPLite (Fig. 12 a) i MTT. Śmierć komórkowa za pośrednictwem TRAIL zdrowych hepatocytów była obserwowana zaledwie po 24 godzinach hodowli, ponad 80% hepatocytów było zabijanych przez TRAIL. W przeciwieństwie do tego, podczas tego samego czasu hodowli, TRA-8 nie wywoływało znaczącej śmierci komórkowej zdrowych hepatocytów. Występowanie skondensowanych jąder barwionych Hoechst, charakterystycznych przy apoptozie, było zwiększone w hepatocytach traktowanych TRAIL, ale nie w traktowanych TRA-8 (Fig. 12b). Liczba apoptotycznych hepatocytów dobrze korelowała z obniżoną żywotnością komórek określoną w teście ATPLite, co sugeruje, że śmierć komórkowa hepatocytów indukowana TRAIL zachodzi przez apoptozę. Potwierdzono to przez zdolność Z-VAD do hamowania toksyczności hepatocytów za pośrednictwem TRAIL. Ponieważ cykloheksymid jest silnym wzmacniaczem apoptozy, badano wpływ tego związku na hepatocyty traktowane TRAIL i TRA-8. Podczas czterogodzinnej hodowli cykloheksymid znacząco podnosił śmierć komórkową hepatocytów indukowaną przez TRAIL, z ponad 70% zabijaniem hepatocytów przez TRAIL w obecności cykloheksymidu (Fig. 12c). Jednakże traktowanie cykloheksymidem nie było zdolne do podniesienia śmierci komórkowej za pośrednictwem TRA-8 w hepatocytach. W celu porównania właściwości apoptozy indukowanej przez TRA-8 z indukowaną przez TRAIL w hepatocytach, zdrowe hepatocyty jak również komórki nowotworowe inkubowano z różnymi stężeniami rozpuszczalnego TRAIL z odczynnikiem do wiązania krzyżowego lub TRA-8. Podczas sześciogodzinnego okresu hodowli, TRAIL wywoływał słabą odpowiedź apoptotyczną w zdrowych hepatocytach. Ponad 20% hapatocytów było zabijanych w obecności 500 ng/ml TRAIL (Fig. 12d, górna lewa część). Traktowanie zdrowych hepatocytów TRA-8 nie wywoływało znaczącej śmierci komórkowej przez ten sam okres. W przeciwieństwie do tego do zdrowych komórek hepatocytów, pierwotne nowotworowe komórki hepatocytowe (Fig. 12d, górna środkowa część) oraz komórki HepG2 (Fig. 12d, górna prawa część) były wysoce podatne na apoptozę za pośrednictwem zarówno TRAIL, jak i TRA-8. Ponad 80% nowotworowych komórek hepatocytowych i prawie 100% komórek HepG2 było zabijanych podczas 8-godzinnego okresu hodowli. Wyniki te wykazują, że zdrowe hepatocyty są zupełnie odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 i są dużo mniej podatne na apoptozę za pośrednictwem TRAIL niż nowotworowe komórki wątroby. Stosując ligand Fas i przeciwciało anty-Fas (CH-11), nie zaobserwowano znaczącej różnicy w podatności na apoptozę za pośrednictwem Fas wśród zdrowych hepatocytów, nowotworowych komórek hepatocytowych i komórek HepG2 (Fig. 12d, dolne części).

Porównawczy przykład 11B. Indukcja zapalenia wątroby in vivo przez ludzki TRAIL związany z błoną.

8-10-tygodniowe samice myszy B6 szczepiono dożylnie 10⁹ pfu Ad/hTRAIL i równą liczbą Ad/Tet-on. Myszom podawano różne stężenia tetracykliny w wodzie pitnej tuż po podaniu wektorów

PL 211 755 B1 adenowirusowych. Uszkodzenie wątroby określano przez poziomy AST w surowicy, stosując zestaw diagnostyczny AST (Sigma). Ekspresję TRAIL określano przez analizę Northern.

W celu określenia, czy forma TRAIL związana z błoną indukuje uszkodzenie wątroby in vivo, skonstruowano rekombinowany wektor adenowirusowy kodujący ludzki TRAIL (Ad/hTRAIL) pełnej długości, którego ekspresja jest pod kontrolą promotora indukowanego tetracykliną. Po 24 godzinach od dożylnego podania Ad/hTRAIL myszom B6, obserwowano indukowaną tetracykliną ekspresję ludzkiego TRAIL w wątrobie w sposób zależny od dawki, jak określono w analizie Northern (Fig. 13a). Poziomy ekspresji TRAIL dobrze korelowały z uszkodzeniem wątroby jak pokazano przez zależne od tetracykliny podwyższenie poziomu transaminaz w surowicy, ponownie w sposób zależny od dawki (Fig. 13b). Ponieważ samo podanie wektora adenowirusowego może podnieść podatność hepatocytów na apoptozę za pośrednictwem TRAIL, izolowano hepatocyty z myszy, którym podano Ad/TRAIL i badano śmierć komórkowa za pośrednictwem TRAIL. Nie wykazano istotnego podwyższenia śmierci komórkowej hepatocytów infekowanych Ad/TRAIL w porównaniu z hepatocytami z myszy kontrolnych (Fig. 13c, lewa część). Dodatkowo, myszy, którym podano Ad/TRAIL nie wykazywały podwyższonego uszkodzenia wątroby po wszczepieniu dożylnym ludzkiego rozpuszczalnego TRAIL. Zatem znaczy to, że zapalanie wątroby indukowane przez Ad/TRAIL jest za pośrednictwem ekspresji TRAIL w jego błonowej formie na wysokich poziomach. Analiza histologiczna skrawków wątroby wykazała, że zniszczenie hapatocytów jest widoczne zaledwie w 24 godziny po podaniu wektora (Fig. 13d) i pozostaje przez przynajmniej 7 dni (Fig. 13e). Te zmiany morfologiczne w wątrobie były również zależne od tetracykliny i pojawiały się w sposób zależny od dawki. Wczesna faza, w ciągu 24 godzin traktowania, uszkodzenia wątroby indukowanego TRAIL cechuje się ogniskami nekrozy. Naciekanie komórkami zapalnymi nie było obserwowane na tym etapie, lecz nastąpił krwotok. Do 7 dnia po podaniu, widoczne było rozproszone zapalenie wątroby z zaznaczonym nieładem płacikowym, poważną degeneracją hepatocytów z nieregularnie zlepioną cytoplazmą oraz dużymi przezroczystymi przestrzeniami oraz wyraźną apoptoza i nekrozą. Obszerny naciek jednojądrowych komórek był charakterystyczną cechą na tym etapie. Wyniki te wskazują, że ludzki TRAIL w swojej formie związanej z błoną jest zdolny do indukcji uszkodzenia wątroby in vivo. Pomimo skłonności ludzkiego TRAIL do wywoływania ciężkiego zapalenia wątroby u myszy, nie indukował on odpowiedzi śmiertelnej. W przeciwieństwie do tego, myszy, którym podano podobne kontrolowane tetracykliną wektory kodujące ligand Fas rozwinęły gwałtowne zapalenie wątroby z ogromną apoptoza i nekrozą hepatocytów, połączone z ciężkim krwotokiem oraz umieralnością zależną od dawki tertacykliny w ciągu 72 godzin od podania. Umieralność ogólna osiągała 100% w ciągu 48 godzin w tych podgrupach, które otrzymywały 3 lub więcej mg/ml tetracykliny. W przeciwieństwie do tego, wszystkie myszy, które otrzymały Ad/hTRAIL, bez względu na dawkę tetracykliny, były żywe po czterech tygodniach po podaniu. Zatem znaczy to, że in vivo forma TRAIL związana z błonami jest słabszym induktorem uszkodzenia hepatocytów niż ligand Fas. To dodatkowo sugeruje, że TRAIL może indukować uszkodzenie wątroby poprzez mechanizm, który różni się od mechanizmu będącego podłożem toksyczności ligandu Fas.

P r z y k ł a d 12. Aktywowane komórki T i B wyrażają podwyższone poziomy DR5

W celu określenia, czy DR5 odgrywa rolę w apoptozie za pośrednictwem TRAIL aktywowanych komórek B i komórek T, badano powierzchniową ekspresję DR5 na komórkach T i B w stanie spoczynku i aktywowanych używając TRA-8. Niestymulowane ludzkie komórki T w PBMC nie wyrażały DR5 na znaczących poziomach (Fig. 14). 48 godzin po stymulacji zarówno anty-CD3 jak i Con-A, ekspresja DR5 na powierzchni komórki była znacznie podniesiona. Podobnie, niestymulowane komórki B wyrażały DR5 na bardzo niskich poziomach. Stymulacja anty-T, ale nie LPS, powodowała podwyższoną ekspresję DR5 na powierzchni komórki. Wyniki te wskazują, że zarówno aktywowane komórki T, jak i B wyrażają DR5 na powierzchni komórki na wysokich poziomach. Komórki barwiono 20 μg/ml TRA-8 i anty-mysimi IgG1 PE.

P r z y k ł a d 13. Aktywowane komórki T i B stają się podatne na apoptozę za pośrednictwem

TRA-8

W celu zbadania, czy aktywowane komórki T i B są podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8, komórki T i B ludzkiego PBMC stymulowano odpowiednio anty-CD3 lub anty-T in vitro przez 48 godzin. Żywotne komórki i proliferujące komórki blastyczne zbierano przez gradientowe wirowanie i inkubowano w różnych stężeniach TRA-8. Niestymulowane komórki T i B nie były podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 (Fig. 15). Wszystkie stymulowane komórki T i komórki B wykazywały nieco podwyższoną podatność na apoptozę za pośrednictwem TRA-8 z 20% komórek zabitych przez TRA-8 po nocnej hodowli. Mocno proliferujące komórki blastyczne T były nawet bardziej podatne na

PL 211 755 B1 apoptozę za pośrednictwem TRA. Ponad 70% komórek blastycznych T było zabijanych przez TRA-8. Komórki blastyczne B były również bardziej podatne na apoptozę za pośrednictwem TRA w porównaniu do innych. Wyniki te wskazują, źe aktywowane komórki T i B są podatne na apoptozę za pośrednictwem DR5.

P r z y k ł a d 14. TRA-8 usuwa aktywowane komórki T u człowieka/myszy SCID

W celu zbadania skuteczności anty-komórki T in vitro dla TRA-8, myszy NOD/SCID szczepiono dożylnie 1x10⁸ ludzkich PBMC. Zwykle, ludzkie komórki T w myszach SCID są szybko aktywowane w odpowiedzi na stymulację ksenogeniczną. Ludzkie PBMC/myszy SCID szczepiono dootrzewnowo 100 μg TRA-8 lub kontrolnymi IgG1 począwszy od dnia transferu i powtarzano codziennie przez trzy dni. Po pięciu dniach po transferze jednojądrowe komórki izolowano ze śledziony i barwiono przeciwciałem anty-ludzki CD3 i bramkowano populację limfocytów stosując cytometrię przepływową i analizowano ludzkie komórki T dodatnie pod względem CD3. Około 30% limfocytów śledziony było ludzkimi komórkami T, jak wykazano przez barwienie anty-ludzki CD3 u traktowanych myszy kontrolnych. Jednakże tylko kilka ludzkich komórek T (mniej niż 3%) obserwowano wśród limfocytów śledziony u myszy traktowanych TRA-8 (Fig. 16). Badania histologiczne in situ wykazały, że w śledzionie myszy kontrolnych ludzkie komórki T namnażają się w śledzionie, z jedynie kilkoma komórkami apoptotycznymi obserwowanymi poprzez barwienie TUNEL. W przeciwieństwie do tego, nie obserwowano ponownego zasiedlania żywych ludzkich komórek T w śledzionie myszy traktowanych TRA-8, obserwując za to wiele komórek apoptotycznych (Fig. 17). Wyniki te pokazują, ze TRA-8 ma aktywność antykomórki T in vivo i wskazują użyteczność przeciwciał według wynalazku do leczenia choroby GVH.

P r z y k ł a d 15. Przeciwnowotworowa lecznicza aktywność TRA-8

15.1 Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich tkankach i liniach komórek nowotworowych

i) Badanie ekspresji DR5 w ludzkich tkankach nowotworowych poprzez barwienie TRA-8 in situ. W celu określenia, czy komórki i tkanki nowotworowe w zróżnicowany sposób wyrażają DR5 na podwyższonych poziomach, zestaw ludzkich tkanek nowotworowych włączając w to 20 raków sutka, 6 raków jajników, 5 raków okrężnicy i 5 raków prostaty barwiono TRA-8 do analizy immunocytochemicznej. Większość z tych tkanek nowotworowych wyrażała DR5 na wykrywalnych poziomach. Poziomy ekspresji DR5 w tych tkankach nowotworowych różniły się. Ogólnie, tkanki nowotworowe wyrażały wyższe poziomy DR5 niż tkanki z tym niezwiązane. Dodatkowo, ekspresja DR5 w oczywisty sposób nie korelowała z mutacją p53.

ii) Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich liniach komórek nowotworowych (Tabela 2). Dziewięć ludzkich linii komórek raka sutka, trzy linie raka jajnika, trzy linie raka okrężnicy, trzy linie raka prostaty badano pod kątem ekspresji DR5 na powierzchni komórki i podatności na apoptozę indukowaną przez TRA-8 in vitro. 7 z 9 linii raka sutka, 3 z 3 linii raka jajnika, 3 z 3 linii raka okrężnicy i 3 z 3 linii raka prostaty wyrażały DR5 na powierzchni komórki na zróżnicowanych poziomach. Z 9 linii raka sutka, trzy były bardzo podatne, trzy średnio i trzy były odporne na apoptozę za pośrednictwem TRA-8. Wszystkie trzy linie raka jajnika były bardzo podatne. Jedna z trzech linii raka okrężnicy była bardzo podatna, podczas gdy dwie miały średnią wrażliwość. Dwie z trzech linii raka prostaty miały średnią wrażliwość i jedna była odporna.

T a b e l a 2. Ekspresja i funkcja DR5 w ludzkich liniach komórek nowotworowych

Linia komórkowa	Pochodzenie	Ekspresja1	Podatność2
1	2	3	4
2LMP	sutek	+	++++
LCC6	sutek	+++	++++
MB468	sutek	+++	+++
MB231	sutek	++	+++
ZR-75-1	sutek	+++	++
SKBR3	sutek	+	++
MB453	sutek	++	+
BT474	sutek	+	-
DY36T2	sutek	-	-

PL 211 755 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
Caov-3	jajnik	+	++++
OVCAR-3	jajnik	++	++++
Skov-3	jajnik	+	+++
WiDR	okrężnica	+++	++++
HST29	okrężnica	++	+++
T84	okrężnica	+	++
PC3	prostata	+++	++
LnCap	prostata	+++	+
Du-145	prostata	+++	+

Uwaga: ¹wyznaczone przy zastosowaniu cytometrii przepływowej, komórki barwiono 20 pg/ml TRA-8 i porównywano do przeciwciała kontrolnego. ²wyznaczone w teście ATPLite. ++++: ponad 80% zabijanie, +++: zabijanie pomiędzy 60-80%, ++: zabijanie pomiędzy 40-60%, +: zabijanie pomiędzy 20-40%, -: brak zabijania.

iii) Łączna cytotoksyczność TRA-8 i adriamycyny. W kilku liniach raka sutka, badano wpływ adriamycyny na apoptozę indukowaną TRA-8. Duże dawki adriamycyny wykazywały dodatkowy wpływ. Jednakże, w niektórych liniach odpornych na TRA-8 małe dawki adriamycyny synergicznie wzmacniały apoptozę indukowaną przez TRA-8.

iv) Aktywność wiązania się TRA-8 do ludzkich komórek nowotworowych in vitro i in vivo. Stosowano TRA-8 wyznakowane radioizotopem. Wiązanie się TRA-8 do linii raka sutka badano in vitro i in vivo w myszach SCID, którym wszczepiano nowotwór. Aktywność wiązania in vitro do komórek nowotworowych oszacowano jako Kd o wartości 3 nM, co jest zgodne z wcześniejszym oszacowaniem przy zastosowaniu ELISA i przynajmniej 50 razy wyższe niż dla rozpuszczalnego TRAIL. In vivo, TRA-8 lokalizowało się we wszczepionej tkance nowotworowej.

15.2. Terapia z użyciem TRA-8 przewlekłej białaczki limfolitycznej u myszy NOD/SCID.

Przewlekła białaczka limfolityczna (CLL) jest częstą formą nowotworu komórek B. Większość komórek B o charakterze nowotworowym w CLL ma dojrzały fenotyp i jest odporna na wiele aktywatorów apoptozy. Badano ekspresję i funkcję DR5 w komórkach B pięciu pacjentów z CLL. Wszyscy pacjenci mieli wysokie ilości obwodowych komórek B, jak wykazano większym niż 95% udziałem komórek B CD19+ w PBMC. W porównaniu ze zdrowymi pierwotnymi komórkami B, komórki B z CLL wszystkich pacjentów miały wyższe poziomy DR5 na powierzchni komórki i były bardziej podatne na apoptozę indukowaną TRA-8 in vitro. Co ciekawe, komórki B z CLL były również wrażliwe na cytotokstczność wywołaną bisindolemaleimidem VIII (BisVIII.). Po łącznym traktowaniu TRA-8 i BisVTII, prawie 50% komórek B z CLL było zabijanych, podczas gdy zdrowe komórki B pozostawały niewrażliwe (Fig. 18). Przeniesienie komórek B z CLL do myszy NOD/SCID prowadziło do około 25%-30% ponownego zasiedlania komórek B CD19+ w śledzionie myszy biorców pięć dni po transferze. Jednakże traktowanie trzema dawkami 100 pg TRA-8 zupełnie wyeliminowało komórki B z CLL czterech z pięciu pacjentów ze śledziony myszy SCID biorców. Zatem TRA-8, pojedynczo lub w obecności innych substancji, jest aktywnym czynnikiem terapeutycznym w przewlekłej białaczce limfolitycznej.

P r z y k ł a d 16. Klonowanie cDNA (1) Ustalenie N-końcowych sekwencji aminokwasowych lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8

W celu otrzymania cDNA lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8, N-końcowe sekwencje aminokwasowe lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8 i sklonowanych genów TRA-8 ustalono przy zastosowaniu znanych technik.

pg roztworu zawierającego przeciwciało anty-ludzkie DR5, TRA-8, poddaje się elektroforezie w żelu SDS-poliakryloamid („SDS-PAGE), stosując stężenie żelu 12% wag./obj., stałe napięcie 100 V, przez 120 minut. Po elektroforezie, żel zanurza się w buforze do transferu 25 mM Tris-HCl (pH 9,5), 20% metanol, 0,02% obj./obj. SDS na 5 minut. Po tym czasie, zawartość białkową żelu przenosi się na błonę poliwinylidenodifluorkową („błona PVDF; rozmiar porów 0,45 pm; Millipore, Japonia) namoczoną uprzednio w buforze do transferu, przy użyciu urządzenia do transferu (KS-8451; Marysol) w warunkach stałego napięcia 10 V, 4°C, przez 14 godzin.

Po tym czasie, błonę PVDF przemywa się buforem do płukania 25 mM NaCl, 10 mM buforowany boran sodowy (pH 8,0), a następnie barwi się w roztworze do barwienia (50% obj./obj. metanol,

PL 211 755 B1

20% obj./obj. kwas octowy i 0,05% wag./obj. Coomassie Brilliant Blue) przez 5 minut w celu zlokalizowania prążków białkowych. Błonę PVDF odbarwia się następnie 90% obj./obj. wodnym roztworem metanolu i prążek odpowiadający łańcuchowi ciężkiemu, prążek o niższej ruchliwości, i łańcuchowi lekkiemu, prążek o wyższej ruchliwości, zlokalizowane uprzednio na błonie PDVF wycina się i przemywa wodą dejonizowaną.

N-końcową sekwencję aminokwasową łańcuchów ciężkich i lekkich ustala się przy zastosowaniu zautomatyzowanej metody Edmana (Edman, P., i wsp., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) używając sekwenatora białkowego w fazie gazowej (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

N-końcową sekwencję aminokwasową prążka odpowiadającego łańcuchowi ciężkiemu ustalono jako: Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Lys-Leu (SEK NR ID: 4 z Listy sekwencji);

a prążka odpowiadającego łańcuchowi lekkiemu ustalono jako:

Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEK NR ID: 5 z Listy sekwencji).

Porównanie tych sekwencji aminokwasowych z sekwencjami aminokwasowymi z bazy danych przeciwciał sporządzonej przez Kabat i wsp. (Kabat E. A., i wsp., (1991), w „Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II, U. S. Department of Health and Humań Services) wykazało, że łańcuch ciężki (łańcuch γ1) i łańcuch lekki (łańcuch k) TRA-8 należą do podtypów 3d i 1, odpowiednio.

(2) Klonowanie cDNA

W oparciu o powyższe wyniki, syntetyzuje się starter oligonukleotydowy, dla którego spodziewa się hybrydyzacji z częściami 5' nie podlegających translacji regionów i skrajnymi odcinkami podlegających translacji regionów 3' genów należących do tych mysich podtypów. Następnie, cDNA kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy TRA-8 klonuje się przy zastosowaniu następującej kombinacji odwrotnej transkrypcji i PCR (RT-PCR):

a) Matryca

Całkowity RNA z hybrydomy TRA-8 (ATCC nr PTA-1428) ekstrahuje się stosując TRIzol Reagent (GIBCO BRL). W reakcji PCR jako matrycę używa się cDNA, który jest otrzymany przy zastosowaniu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA First-Strand cDNA synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech) zgodnie z instrukcją dostarczoną z zestawem.

b) Startery do PCR

Następujące startery oligonukleotydowe syntetyzuje się w reakcji PCR:

5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SEK NR ID: 6 z Listy sekwencji);

5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SEK NR ID: 7 z Listy sekwencji);

5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SEK NR ID: 8 z Listy sekwencji);

5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5SS2: SEK NR ID: 9 z Listy sekwencji);

5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SEK NR ID: 10 z Listy sekwencji);

5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SEK NR ID: 11 z Listy sekwencji);

5'-tttaccagga gagtgggagag-3' (H3CR: SEK NR ID: 12 z Listy sekwencji);

5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEK NR ID: 13 z Listy sekwencji);

5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEK NR ID: 14 z Listy sekwencji);

5'-aagacatttt ggattctaac-3' (L5NCS2: SEK NR ID: 15 z Listy sekwencji);

5'-tatcatgaag tctttgtatg-3' (L5SS1: SEK NR ID: 16 z Listy sekwencji);

5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5SS2: SEK NR ID: 17 z Listy sekwencji);

5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (L5CS: SEK NR ID: 18 z Listy sekwencji);

5'-ttaacactca ttcctgttga-3' (L3CR: SEK NR ID: 19 z Listy sekwencji); oraz

5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SEK NR ID: 20 z Listy sekwencji).

Jeżeli nie zaznaczono inaczej, wszystkie oligonukleotydy w tych Przykładach zostały zsyntetyzowane przez Pharmacia Biotech. Wszystkie oligonukleotydy po rozpuszczeniu w wodzie przechowuje się w -20°C.

c) Reakcja PCR

Skład roztworu do reakcji PCR:

matryca cDNA, 5 gl z 33 gl całkowitej mieszaniny reakcyjnej starter 1, 10 pmol; starter 2, 10 pmol;

x stężony bufor do PCR (dostarczony w zestawie), 10 gl; dNTP (każdy 2,5 mM), 4 gl; oraz polimeraza Taq (Promega), 5 jednostek.

PL 211 755 B1

Do roztworu dodaje się sterylną wodę destylowaną do całkowitej objętości 100 pl. Jeżeli nie zaznaczono inaczej, dNTP to ekwimolarna mieszanina dATP, dCTP, dGTP i dTTP (każdy 2,5 mM).

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 2 minuty, po czym 40 razy powtarza się cykl ogrzewania do 94°C przez 30 sek., 52°C przez 1 minutę i 72°C przez 3 minuty. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA otrzymane w ten sposób rozdziela się w 1% żelu agarozowym zawierającym 0,25 pg/ml bromku etydyny. Prążki, dla których ustalono, że zawierają pożądane fragmenty DNA wycina się przy użyciu skalpela i DNA odzyskuje się z niego przy użyciu zestawu Gene Clean (BIO101). Fragment DNA klonuje się przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega). Przeprowadza się to jak następuje.

Fragment DNA odzyskany z roztworu reakcji PCR, razem z 50 ng wektora pGEM-T Easy (dostarczonego w zestawie), miesza się z 1 pl 10 X bufor do reakcji ligacji (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorek magnezowy, 5 mM chlorek sodowy, 7 mM (β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidyna i 0,1 mg/ml albuminy z surowicy wołowej), do których dodawane są 4 jednostki ligazy DNA T4 (1 pl). Całkowitą objętość mieszaniny doprowadza się do 10 pl sterylną wodą destylowaną, a otrzymany w rezultacie roztwór do ligacji inkubuje się w 14°C przez 15 godzin. Po tym czasie dodaje się 2 pl roztworu do ligacji do 50 pl kompetentnego szczepu JM109 E. coli (dostarczonego w zestawie i doprowadzonego do stanu kompetencji zgodnie z instrukcją), do którego dodano 2 pl 0,5 M β-merkaptoetanolu i otrzymaną mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 5 minut. Następnie do hodowli dodaje się 500 pl pożywki zawierającej 2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy (określanej tu dalej jako pożywka SOC) i mieszaninę inkubuje się przez 1 godzinę w 37°C z wytrząsaniem. Po tym czasie, hodowlę wysiewa się na płytki agarowe z bulionem L (1% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,5% wag./obj. chlorku sodowego, 0,1% wag./obj. glukozy i 0,6% wag./obj. baktoagaru (Difco)), zawierające 100 pg/ml ampicyliny. Selekcjonuje się oporne na ampicylinę kolonie pojawiające się na płytce i zdrapuje platynową ezą i hoduje w pożywce L zawierającej 100 pg/ml ampicyliny w 37°C przez noc, z wytrząsaniem przy 200 obr. na min. Po inkubacji zbiera się poprzez wirowanie komórki, z których otrzymuje się plazmidowy DNA przy użyciu metody lizy alkalicznej. Otrzymany plazmid jest nazwany plazmidem pH62 dla łańcucha ciężkiego TRA-8 lub pL28 dla łańcucha lekkiego TRA-8. Szczepy transformantów E. coli niosące te plazmidy, nazwane E. coli JM109/pH62 i E. coli JM109/pL28 zostały zdeponowane w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano im numery dostępu FERM BP-7560 i FERM BP-7561, odpowiednio. Sekwencje nukleotydowe DNA kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki TRA-8 są potwierdzone przez sekwencjonowanie metodą dideoksy (Sanger, F. S. i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) przy użyciu analizatora DNA 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Sekwencje nukleotydowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 są podane jako SEK NR ID: 21 i NR ID: 22 z Listy sekwencji, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 są podane jako SEK NR ID: 23 i NR ID: 24 z Listy sekwencji, odpowiednio. N-końcowe sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich TRA-8 ustalone powyżej w pełni pasowały do siebie. Ponadto, kiedy porównywano sekwencje aminokwasowe łańcuchów ciężkich i lekkich z bazami danych sekwencji aminokwasowych przeciwciał ustalono, że dla łańcucha ciężkiego nukleotydy od nr 58 do 414 w SEK NR ID: 21 stanowiły region zmienny, podczas gdy nukleotydy od nr 415 do 1392 w SEK NR ID: 21 stanowiły region stały. Dla łańcucha lekkiego nukleotydy od nr 64 do 387 w SEK NR ID: 22 stanowiły region zmienny, podczas gdy nukleotydy od nr 388 do 707 w SEK NR ID: 22 stanowiły region stały. Położenie i sekwencje CDR ustalono również poprzez porównanie homologii z bazami danych. Sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcuchów ciężkich TRA-8 są pokazane w SEK NR ID: 25, NR: 26 i NR: 27, odpowiednio. Sekwencje aminokwasowe CDR1, CDR2 i CDR3 łańcucha lekkiego TRA-8 są pokazane w SEK NR ID: 28, NR: 29 i NR: 30, odpowiednio.

P r z y k ł a d 17. Projektowanie humanizowanej wersji przeciwciała TRA-8 (1) Modelowanie molekularne regionu zmiennego TRA-8

PL 211 755 B1

Modelowanie molekularne regionu zmiennego TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako modelowanie poprzez homologię (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Pierwszorzędowe sekwencje regionów zmiennych ludzkiej immunoglobuliny zarejestrowane w bazie danych białek Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), dla których dostępne są trójwymiarowe struktury pochodzące z krystalografii promieniami X porównuje się z ustalonymi powyżej regionami zrębowymi TRA-8. W rezultacie, wybrano 1NCD i 1HIL jako mające największe homologię sekwencji z regionami zrębowymi lekkich i ciężkich łańcuchów TRA-8, odpowiednio. Trójwymiarowe struktury regionów zrębowych wytwarza się poprzez łączenie odpowiednich pozycji 1NCD i 1HIL, które odpowiadają łańcuchom lekkim i ciężkim TRA-8, w celu otrzymania „modelu zrębowego. Stosując klasyfikację zdefiniowaną przez Chothia i wsp., CDR TRA-8 klasyfikuje się jak następuje; CDRL1, CDRL2, CDRH1 i CDRH2 należą do kanonicznych klas 2, 1, 1, 3, odpowiednio, podczas gdy CDRL3 nie należą do żadnej konkretnej kanonicznej klasy. Pętle CDR: CDRL1, CDRL2, CDRH1, CDRH2 są związane z konformacjami charakterystycznymi dla ich odpowiednich kanonicznych klas i włączone do modelu zrębowego. CDRL3 przypisuje się konformację zgrupowania 8A, zgodnie z klasyfikacją Thornton i wsp. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), a CDRH3 jest zaklasyfikowany do k(8)C przy zastosowaniu reguły H3 (FEBS letter 455, 188-197 (1999)). Następnie reprezentatywne konformacje dla CDRL3 i CDRH3 włącza się do modelu zrębowego.

Na koniec przeprowadza się obliczenia energii w celu wyeliminowania niekorzystnych kontaktów międzyatomowych w celu otrzymania prawdopodobnego modelu cząsteczkowego regionu zmiennego biorąc pod uwagę energię. Powyższą procedurę przeprowadza się przy użyciu dostępnego handlowo systemu modelowania molekularnego ABM (Oxford Molecular Limited, Inc.). Dla otrzymanego modelu molekularnego, dokładność struktury ocenia się następnie przy zastosowaniu oprogramowania PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26, 283-291).

(2) Projektowanie sekwencji aminokwasowych humanizowanych TRA-8.

Konstrukcję humanizowanych przeciwciał TRA-8 przeprowadzono przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako wszczepianie CDR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Przeciwciało akceptorowe wybiera się w oparciu o homologię aminokwasową w regionie zrębowym. Sekwencje regionu zrębowego w TRA-8 porównuje się ze wszystkimi sekwencjami zrębowymi w bazie danych sekwencji aminokwasowych Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)). W rezultacie jako akceptor, wybrano przeciwciało mAB58'CL ze względu na najwyższą homologię sekwencji wynoszącą 80% dla regionu zrębowego. Reszty aminokwasowe w regionie zrębowym dla mAb58'CL dopasowuje się z tymi dla TRA-8 i identyfikuje pozycje, gdzie użyte są różne aminokwasy. Położenie tych reszt analizuje się dla trójwymiarowych modeli skonstruowanego powyżej TRA-8 i reszty donorowe, które powinny być wczepione do akceptora wybiera się na podstawie kryteriów podanych przez Queen i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Sekwencje humanizowanego TRA-8 konstruuje się jak opisano w następujących Przykładach poprzez przeniesienie kilku reszt donorowych do przeciwciała akceptorowego, mAb58'CL.

P r z y k ł a d 18. Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała (1) Konstrukcja plazmidu niosącego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8

W celu ustalenia aktywności humanizowanego TRA-8, konstruuje się plazmid niosący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 jak następuje. Jednakże należy zwrócić uwagę, że humanizowanie TRA-8 nie ogranicza się do tych Przykładów.

Jak pokazano w SEK NR ID: 31 z Listy sekwencji, humanizowanie sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie aminokwasu 13 (lizyna), aminokwasu 19 (lizyna), aminokwasu 40 (treonina), aminokwasu 42 (kwas glutaminowy), aminokwasu 44 (arginina), aminokwasu 84 (seryna), aminokwasu 88 (seryna), aminokwasu 93 (metionina), aminokwasu 114 (treonina), aminokwasu 115 (leucyna), odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, asparaginą, alaniną, valiną, leucyną oraz valiną.

Plazmid niosący DNA kodujący region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8 (SEK NR ID: 31 z Listy sekwencji) konstruuje się jak następuje.

PCR stosuje się do konstrukcji następujących sekwencji DNA, każdej z nich zawierającej co opisano powyżej.

Zsyntetyzowano 12 następujących oligonukleotydów:

PL 211 755 B1

5'- ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEK NR ID: 32);

5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEK NR ID: 33);

5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEK NR ID: 34);

5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEK NR ID: 35);

5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E;

SEK NR ID: 36);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEK NR

ID: 37);

5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (G; SEK NR ID: 38);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SEK NR ID: 39);

5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (1; SEK NR ID: 40);

5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEK NR ID: 41);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEK NR ID: 42); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEK NR ID: 43).

Następujące 2 startery do PCR syntetyzuje się jak opisano powyżej:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (P1; SEK NR ID: 44); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEK NR ID: 45).

Syntezę DNA kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA wytwarza się jak następuje.

Skład roztworu do reakcji PCR: oligonukleotyd A, 10 pmol; oligonukleotyd B, 10 pmol; oligonukleotyd C, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E, 10 pmol; oligonukleotyd F, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H, 10 pmol; oligonukleotyd I, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1,2 μM; starter oligonukleotydowy P2, 2, μM;

X bufor Pyrobest II, 10 gl; dNTP mix, 8 gl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 gl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 gl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Równą objętość fenolu-chloroformu (50% obj./obj. fenolu nasyconego wodą, 48% obj./obj. chloroformu, 2% obj./obj. alkoholu izoamylowego) dodaje się do 200 gl każdego z produktów PCR i miesza się intensywnie przez 1 minutę. Po tym czasie, mieszaninę odwirowuje się przy 10000 X g, zbiera

PL 211 755 B1 warstwę wodną i miesza z równą objętością chloroformu-alkoholu izoamylowego (96% obj./obj. chloroform i 4% obj./obj. alkohol izoamylowy), po czym znowu mocno odwirowuje przy 10000 X g i zbiera górną warstwę. Seria etapów przedstawionych w tym akapicie jest tu dalej określana jako „ekstrakcja fenolowa.

Następnie zebraną warstwę wodną dodaje się wytrącaniu etanolem. Stosowane tu określenie „wytrącanie etanolem obejmuje dodawanie z mieszaniem jednej dziesiątej objętości 3M octanu sodowego (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu do roztworu, który miał być traktowany i zamrażanie mieszaniny przy użyciu suchego lodu. Otrzymaną w rezultacie mieszaninę odwirowuje się przy 10000 X g w celu odzyskania DNA w postaci osadu.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 μg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA humanizowanego TRA-8 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 μl wody destylowanej.

Otrzymany w rezultacie każdy z wyekstrahowanych DNA klonuje się przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega) jak następuje:

Fragment DNA odzyskany z reakcji PCR, 5 gl:

X bufor dla polimerazy Taq, 1 gl; mieszanina dNTP, 1 gl;

Polimeraza Taq (5 jednostek/ml), 1 gl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 10 gl.

Po przeprowadzeniu reakcji w każdym z roztworów w 70°C przez 30 minut, każdy roztwór DNA i wektor pGEM-T Easy poddaje się ligacji przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) stosując protokół producenta.

Po 4 godzinach inkubacji w 15°C, 2 gl inkubowanego roztworu reakcyjnego miesza się ze 100 gl kompetentnego szczepu JM109 E. coli przy gęstości 1-2 x 10⁹ komórek/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) i mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 1 minutę. Następnie dodaje się 500 gl pożywki SOC (2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy) do mieszaniny, którą inkubuje się przez dalszą godzinę z wytrząsaniem. Następnie izoluje się szczepy transformantów, plazmidowy DNA wytwarza się ze szczepów jak opisano w „Molecular Cloning A Laboratory Manual. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) przy użyciu 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pHB14 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8). Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli JM109/pHB14 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7556.

(2) Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych niosących DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8

Zrekombinowane wektory ekspresyjne dla komórek zwierzęcych konstruuje się poprzez wstawienie DNA kodującego łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 (sklonowanego jak wyżej) jak następuje.

Jeden gg plazmidu pSRHHH3 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0-909-816-A1) niosącego region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-Fas HFE7A i genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1, wektora ekspresyjnego dla komórek ssaczych, trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Apal i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążki wektorowego DNA zawierające genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1 bez regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego HFE7A są wycinane przy użyciu skalpela i wymywane z żelu przy użyciu zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącePL 211 755 B1 nie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 gl wody destylowanej, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany w rezultacie strawiony, defosforylowany plazmid (100 ng) poddaje się następnie ligacji z 1 gg fragmentu DNA pHB14 zawierającego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8, który został również strawiony Hindlll i Apal, przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Mieszaninę ligacyjną używa się następnie do transformacji E. coli JM109, który wysiewa się następnie na płytki agarowe LB zawierające 50 gg/ml ampicyliny.

Utrzymane tą metodą transformanty hoduje się w 2 ml płynnej pożywki LB zawierającej 50 gg/ml ampicyliny w 37°C przez noc i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS.

Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i Apal i poddaje elektroforezie w 3% wag./obj. żelu agarozowym w celu potwierdzenia obecności lub nieobecności wstawki DNA kodującej region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 jest nazwany pHB 14-1.

P r z y k ł a d 19. Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (1) Konstrukcja wektorów dla łańcuchów lekkich humanizowanych wersji przeciwciała TRA-8

Jak pokazano w SEK NR ID: 46 z Listy sekwencji, przy humanizowaniu sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, aminokwas 8 (histydyna), aminokwas 9 (lizyna), aminokwas 10 (fenyloalanina), aminokwas 11 (metionina), aminokwas 13 (treonina), aminokwas 20 (seryna), aminokwas 42 (glutamina), 43 (seryna), aminokwas 60 (kwas asparaginowy), aminokwas 63 (treonina), aminokwas 77 (asparagina), aminokwas 78 (walina), aminokwas 80 (seryna), aminokwas 83 (leucyna), aminokwas 85 (kwas asparaginowy), aminokwas 87 (fenyloalanina) oraz aminokwas 99 (glicyna), aminokwas 103 (leucyna) i aminokwas 108 (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 są zastępowane odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, seryną, seryną, leucyna, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM2.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8, są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM2 (SEK NR ID: 46 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47) i 7ALCN (SEK NR ID: 48), syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3' (HKSPR11; SEK NR

ID: 49);

5'-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc-3' (HKCDF11; SEK NR ID: 50);

5'-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg-3' (HKCDR12; SEK NR ID: 51);

5'-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt-3' (HKCDF22; SEK NR ID: 52);

5'-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3' (HKCDR22; SEK NR ID: 53); oraz

5'-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3' (HKCF12; SEK NR ID: 54).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/M2-1 (klonowanie łańcuchów lekkich humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM2 zdefiniowany w SEK NR ID: 55 z Listy sekwencji, kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 46, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM2-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRLI z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących

PL 211 755 B1 warunkach. Plazmidy matrycowe pHSGHM17 i pSRPDHH, są otrzymane zgodnie z opisem w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pHSGHM17 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1), 25 ng starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKSPRll, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 μl bufor do PCR 10x, 5 μl polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM2-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2 i CDRL2 jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pL28, 25 ng starter oligonukleotydowy HKCDF11, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKCDR12, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 μl bufor do PCR 10x, 5 μl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM2-F3 kodujący CDRL2, FRL3 i część CDRL3 jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1), 25 ng starter oligonukleotydowy HKCDF22, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKCDR22, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 μl bufor do PCR 10x, 5 μl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM2-F4 kodujący CDRL3, FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH, 25 ng starter oligonukleotydowy HKCF12, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 μl bufor do PCR 10x, 5 μl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

PL 211 755 B1

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

DNA LM2, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM2-F1, LM2-F2, LM2-F3 i LM2-F4 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM2-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM2-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM2-F3 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA M2-F4 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5,0 gl bufor do PCR 10x, 5,0 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Tak wytworzony fragment LM2-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TPA-8 TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/M2-1 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego TPA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/M2-1 zawierający fragment DNA LM2 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 gg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 gg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM2 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/M2-1-4 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5α/pHSG/M2-1-4 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7563.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/M2-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM2 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M2-1-4 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego LM2 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu

PL 211 755 B1

CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M2-1-4, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny, niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM2 TRA-8 jest nazwany pSR/M2-1.

P r z y k ł a d 20. Wytwarzanie humanizowanego przeciwciała

Transfekcję komórek COS-7, tj. linii komórkowej pochodzącej z małpiej nerki otrzymanymi powyżej plazmidami ekspresyjnymi dla łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8 i łańcucha lekkiego humanizowanego TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metod z odczynnikiem do transfekcji FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem.

Komórki COS-7 (American Type Culture Collection Nr CRL-1651) hoduje się do półkonfluencji (3 x 10⁶ komórek/płytkę) w płytkach hodowlanych (powierzchnia hodowli: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) zawierających pożywkę Dulbecco's Modified Eagle medium (określaną tu dalej jako „D-MEM; Gibco BRL) uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (nazywaną tu dalej w skrócie jako „FCS; Moregate).

W międzyczasie, miesza się 10 pg/płytkę (w sumie 5 płytek) DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 (pHA15-1) i 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5 otrzymanych metodą lizy alkalicznej-SDS i wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu, a następnie wytrąca etanolem, po czym zawiesza w 5 pl/płytkę dH2O.

Następnie miesza się 15 pl/płytkę odczynnika FUGENE6 Transfection regent z 180 pl/płytkę D-MEM bez FCS, ten roztwór FUGENE (185 pl/płytkę) miesza się z 5 pl/płytkę roztworu DNA zawierającego 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 i 10 pg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej otrzymaną zawiesinę plazmidów (200 pl) dodaje się do przygotowanych wcześniej płytek COS-7. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 24 godziny, pożywkę hodowlaną zamienia się na D-MEM bez FCS. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 72 godzin, zbiera się supernatant z hodowli w celu oczyszczenia produktów ekspresji z płynów supernatantu. Stosując opisaną powyżej metodę, komórki COS-7 transfekuje się każdą z następujących kombinacji plazmidów:

(A) : bez plazmidowego DNA (B) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/M2-1

Hodowlę zwirowuje się następnie (1000 obr. na min., 5 minut) i zbiera się supernatant. Supernatant odwirowuje się ponownie (9800 obr. na min., 15 minut) i filtruje przy użyciu filtra 0,45 pm (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, # kat. 25CS045 AS). Oczyszczanie IgG z filtratów uzyskuje się stosując chromatografię powinowactwa Protein G-POROS (Applied Biosystems) w następujących warunkach:

HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolumna: ProteinG-ID sensor cartridge (wielkość kolumny: 2,1 mmID x 30 mm LD, objętość pusta: 0,1 ml; # kat; 2-1002-00, Applied Biosystems) bufor do wymywania: 0,1 M Glicyna-HCl (pH 2,5) bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5) wykrywanie: 280 nm tempo przepływu: 1 ml/min. wielkość frakcji: 0,5 ml/0,5 min.

probówki do zbierania frakcji: 1,5 ml mikroprobówka polipropylenowa temperatura: 4°C

Po nałożeniu wszystkich filtratów na kolumnę, 30 ml PBS (Sigma, # kat: 1000-3) używa się do przemycia kolumny. Po zastosowaniu buforu do przemywania uruchamia się kolektor frakcji. Każda mikroprobówka do zbierania frakcji zawiera już 55 pl 1 M NaCl, 110 pl buforu do neutralizacji i 74 pl bydlęcej albuminy surowiczej 2 mg/ml (Sigma, # kat; A-7030) w PBS. Frakcje od nr 8 do nr 10 zbiera się i dializuje wobec 1 litra PBS (pH 7,5) w 4°C przez 1 dzień stosując Slide-A lyzer (Pierce, # kat; 66450). Bufor do dializy jest zmieniany dwukrotnie. Weryfikację ekspresji humanizowanych przeciwciał i test ilościowy na produkt ekspresji w otrzymanych płynach znad hodowli przeprowadza się poprzez ELISA z przeciwciałem przeciw anty-ludzka IgG.

PL 211 755 B1

Do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki (MaxiSorp, Nunc), dodaje się 100 gl koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (appel) rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,5 gg/ml w buforze do adsorpcji (0,05 M wodorowęglan sodowy, 0,02% azydek sodowy, pH 9,6) i płytkę inkubuje się w 37°C przez 2 godziny w celu adsorpcji przeciwciała. Następnie płytkę przemywa się pięciokrotnie 350 gl PBS(-) zawierającym 0,05% Tween-20 (BioRad) (nazywanym tu dalej jako „PBS-T). Po przemywaniu do studzienek dodaje się supernatant hodowlany rozcieńczony w D-MEM zawierającej 10% FCS i inkubuje się w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, do każdej studzienki dodaje się 100 gl wyznakowanego alkaliczną fosfatazą koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Jackson Immune Research Lab.) rozcieńczonego 10000-krotnie w PBS-T i inkubuje w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, dodaje się roztwór substratu p-nitrofenylofosforanu otrzymanego w zestawie Alkaline Phosphatase Substrate kit (Bio Rad) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem. Po inkubacji w 37°C przez 0,5 to 1 godziny, mierzy się absorbancję w 405 nm. W niniejszych doświadczeniach, immunoglobulina G podklasy 1 (IgG1) z ludzkiego osocza (Biopure AG) rozcieńczona w D-MEM zawierającej 10% FCS do pewnych stężeń jest stosowana jako próbki odnośnikowe dla stężenia humanizowanych przeciwciał DR5 zawartych w płynach znad hodowli.

W rezultacie ekspresja i oczyszczone produkty w supernatantach hodowlanych są specyficznie wykrywane przeciwciałem anty-ludzka IgG. Ilość ludzkiego przeciwciała IgG wynosi 8,96 gg (800 gl).

P r z y k ł a d 21. Aktywność indukowania apoptozy przeciwciała humanizowanego

Komórki Jurkat (ATCC nr TIB-152) używa się do badania aktywności indukowania apoptozy oczyszczonego humanizowanego przeciwciała TRA-8.

Komórki Jurkat hodowane w pożywce RPMI1640 z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 gl na studzienkę. Humanizowane TRA-8 wytworzone w Przykładzie 20 doprowadza się do stężenia 100 ng/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką RPMI1640 zawierającą 10% FCS poprzez oszacowanie ich stężeń w płynie zgodnie z metodą opisaną w Przykładzie 20. Każdy z roztworów z produktów ekspresji doprowadzony w ten sposób do 100 ng/ml używa się do sporządzenia serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń RPMI 1640 zawierającą 10% FCS. Każdy z rozcieńczonych roztworów humanizowanego TRA-8 jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 gl na studzienkę. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 12 godzin, dodaje się 50 gl 25 gM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (bierna sól 2, 3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanirydu; Sigma Chemical Co.) (końcowe stężenia 250 gg/ml dla XTT i 5 gM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 nm w celu obliczenia żywotności komórek stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

Żywotność komórek w każdej ścieżce oblicza się zgodnie z następującym wzorem:

Żywotność (%) = 100 x (a-b)/(c-b)

Gdzie „a jest pomiarem dla studzienki testowej, „b jest pomiarem dla studzienki bez komórek, a „c jest pomiarem dla studzienki bez dodanego przeciwciała.

W rezultacie wykazano, że produkt ekspresji wytworzony w Przykładzie 20 (humanizowane TRA-8) indukuje apoptozę w komórkach linii komórkowej chłoniaka T wyrażających ludzki antygen DR5.

P r z y k ł a d 22. Reaktywność TRA-8 wobec różnych cząsteczek DR5

W celu określenia reaktywności TRA-8 wobec różnych cząsteczek DR5, bada się reaktywność TRA-8 stosując aktywowane limfocyty jak następuje.

Najpierw pobiera się próbki krwi obwodowej od człowieka (30 ml), małpy marmozet (3 ml) i makaka jawajskiego (20 ml). Próbki krwi mają dodany 1 ml heparyny (Novoheparin; Novo), i próbki nawarstwia się następnie powoli na równą objętość roztworu Ficoll-Paque PLUS ((Amersham Pharmacia Biotech.) ciężar specyficzny: 1,077 dla wszystkich z wyjątkiem małpy cynomolgus dla której ciężar specyficzny wynosi 1,072) i zwirowuje przy 1700 obr. na min. przez 30 minut w celu otrzymania frakcji komórek jednojądrzastych z krwi obwodowej. Tą frakcję komórek jednojądrzastych przemywa się dwukrotnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa, a następnie zawiesza w pożywce RPMI 1640 z 10% obj./obj. FCS tak aby gęstość komórek wynosiła 1 x 10⁶ komórek/ml. Do otrzymanej zawiesiny dodaje się fitohemaglutyninę-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) do stężenia końcowego 5 gg/ml i próbkę inkubuje się w 37°C pod 5% obj./obj. CO2 przez 24 godzin. Po tym czasie, komórki odzyskuje się poprzez wirowanie, przemywa i zawiesza ponownie w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% obj./obj. FCS. Następnie, w celu aktywacji odzyskanych komórek, do zawiesiny dodaje się interleuki54

PL 211 755 B1 nę-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) do stężenia końcowego 10 jednostek/ml i inkubuje się to w 37°C pod 5% obj./obj. CO2 przez 72 godzin.

Ilość aktywowanego preparatu wyliczoną tak, aby zawierała 1 x 10⁶ aktywowanych komórek limfocytów umieszcza się w probówce testowej i zawiesza albo w 50 pl 0,5, 1, 5, 10 pg/ml TRA-8 w PBS albo 50 pl samego PBS. Otrzymaną zawiesinę pozostawia się w lodzie przez 1 godzinę, po czym komórki przemywa się 3 razy porcjami po 500 pl PBS, a następnie zawiesza w 50 pl 20 pg/ml wyznakowanego FITC przeciwciała anty-mysia IgG (Bioresource) w PBS. Stosując komórki zawieszone w 500 pl PBS jako kontrole mierzy się intensywności fluorescencji, przy użyciu cytometru przepływowego (FACSCalibur; Becton Dickinson).

Otrzymuje się rozkład liczby komórek ze względu na intensywność fluorescencji i oblicza się proporcje liczby komórek wybarwionych do całkowitej liczby komórek. Ponadto, oblicza się wartość Kd stężenie TRA-8 i proporcje liczby komórek wybarwionych do całkowitej liczby komórek. Każda częstość reaktywności aktywowanych limfocytów człowieka, małpy marmozet i makaka jawajskiego jest prawie taka sama. A zatem, TRA-8 ma zdolność wiązania się z DR5 z szerokiego zakresu gospodarzy, uwłaczając w to człowieka, wobec którego TRA-8 jest wyjściowo wytworzony.

P r z y k ł a d 23. Badania wzrastającej dawki TRA-8 u małp marmozet

Wstępne badania nad toksycznością wzrastającej dawki TRA-8 przeprowadzono u 1 samicy i 1 samca małpy marmozet. Podano dożylnie zestaw trzech pojedynczych dawek, które były rozdzielone 7-dniowym okresem przerwy w podawaniu. Dawkę TRA-8 ustalono na 50, 250 i 1250 pg/ciało. Czterdzieści osiem godzin po każdym traktowaniu z żyły udowej pobiera się krew i uzyskuje się osocze. Aktywności aminotransferazy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej osocza mierzy się przy użyciu analizatora (FUJI DRI-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Wszystkie próbki krwi pobiera się bez jakichkolwiek anestetyków. W rezultacie, nie zanotowano oznak wskazujących na uszkodzenie wątroby przy badaniu biochemicznym osocza po każdym traktowaniu.

P r z y k ł a d 24. Badania farmakologiczne in vitro i in vivo nad działaniem TRA-8 przeciw komórkom nowotworowym

W celu ustalenia, czy TRA-8 ma skuteczność terapeutyczną w terapii przeciwnowotworowej, aktywność zabijania przez TRA-8 in vitro z użyciem różnych linii nowotworowych bada się jak następuje.

Rozmaite komórki nowotworowe (2-8 x 10³ komórkek/50 pl) hodowane w pożywce RPMI 1640 (dla Jurkat), pożywce DMEM (dla HCT-116), MEM-R (dla WiDr) lub DMEM-F12 (dla COL2-Jck) otrzymane z Gibco BRL z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 pl na studzienkę. TRA-8 doprowadza się do stężenia 100 ng/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką zawierającą 10% FCS. Roztwór TRA-8 (100 ng/ml) używa się do sporządzenia serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń pożywką zawierającą 10% FCS. Każdy z rozcieńczonych roztworów TRA-8 jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 pl na studzienkę i inkubowany w 37°C. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 72 godziny, dodaje się 50 pl 25 pM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (końcowe stężenia 250 pg/ml dla XTT i 5 pM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 nm w celu obliczenia żywotności komórek stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

Żywotność komórek w każdej ścieżce oblicza się zgodnie z następującym wzorem:

Żywotność (%) = 100 x (a-b)/(c-b)

Gdzie „a jest pomiarem dla studzienki testowej, „b jest pomiarem dla studzienki bez komórek, a „c jest pomiarem dla studzienki bez dodanego przeciwciała.

Wyniki są pokazane w Tabeli 3, poniżej.

T a b e l a 3

Komórki	ED50 (pg/ml)
Jurkat	0,001-0,01
HCT-116	0,004-0,02
WiDr	0,007-0,03
COL2-Jck	2,28

PL 211 755 B1

Rozmaite linie komórek nowotworowych wykazują silną indukcję apoptozy przez TRA-8 w warunkach in vitro.

Ponadto, określa się przeciwnowotworowy efekt TRA-8 in vivo u nagich myszy, do których przeszczepiono WiDr, ponieważ TRA-8 nie wykazuje reakcji krzyżowej z mysim DR5.

Przeciwciało TRA-8 anty-ludzki DR5 podaje się nagim myszom niosącym ludzkie heteroprzeszczepy, które wyrażają ludzką cząsteczkę DR5. Użytymi myszami były 6-tygodniowe myszy BALb/c nagie/nagie (samice, z Clea Japan Inc.), którym wszczepiono ludzką linię komórek raka okrężnicy WiDr (5 mm³). Jeden dzień po przeszczepie guza, myszy z przeszczepem traktowano codziennie poprzez dostawowe wstrzyknięcie TRA-8 (5 gg/ciało) do 14 razy. Wzrost guza WiDr ustalano codziennie na podstawie rozmiarów guza. Wyniki są pokazane w Tabeli 4, poniżej.

T a b e l a 4

	8 dni	11 dni	15 dni	18 dni	22 dni	25 dni
Kontrola	196	249	469	584	833	1193
(PBS)
SD	±55	±77	±149	±230	±274	±419
TRA-8	158	97	155	195	365	530
SD	±78	±30	±60	±58	±91	±135

W tym modelu, nietraktowane zwierzęta wykazywały widoczny wzrost guza, natomiast wzrost guza u zwierząt traktowanych TRA-8 był hamowany, co pokazano poprzez rozmiar guza. Wynik ten wskazuje, że TRA-8 jest skuteczny w usuwaniu komórek nowotworowych in vivo.

P r z y k ł a d 25. Badania podawania łącznego dla TRA-8

Ludzka linia komórek raka prostaty PC-3 jest otrzymana z kolekcji American Tissue Culture Collection (ATCC) i utrzymywana w pożywce F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Hyclone), 1% L-glutamina-200 mM (25030-149, Gibco BRL) i 0,5% roztwór Penicillin Streptomycin Solution (P-7539, Sigma). Pożywkę RPMI1640 (MED-008, IWAKI) uzupełnioną 10% FBS i 0,5% roztworem Penicillin Streptomycin Solution jest używana w następującym doświadczeniu. Rosnące wykładniczo komórki PC-3 zbiera się poprzez trypsynizację i przemywa dwukrotnie świeżą pożywką. Komórki następnie liczy się, zawiesza ponownie w świeżej pożywce przy gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml i umieszcza w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach (3598, Corning-Coster) w całkowitej objętości 100 gl/studzienkę na dzień przed rozpoczęciem doświadczenia. Reprezentatywny lek przeciwnowotworowy, Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (10 mg/ml) rozcieńcza się w pożywce, a następnie dodaje do 96-studzienkiowych płytek zawierających komórki w ilości 50 gl/studzienkę. Stężenie końcowe dimetylosulfotlenku wynosi mniej niż 0,1%. Po inkubacji przez 24 godz. w 37°C w atmosferze 5% CO2, do studzienek dodaje się TRA-8 rozcieńczony w świeżej pożywce. Po inkubacji przez dalsze 24 godz., do studzienek dodaje się 50 gl pożywki Minimum Essential Medium (11095-098, Gibco BRL) zawierającej 1 mg/ml XTT i 25 mM PMS i płytki inkubuje się przez 6 godz. Następnie mierzy się OD450 przy użyciu SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) i żywotność komórek oblicza się jak następuje.

Żywotność komórek (%) = (OD450 dla studzienki zawierającej komórki traktowane Taxol i/lub (czynnikiem(ami)) TRA-8 - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek ani czynnika) x 100 / (OD450 dla studzienki zawierającej komórki bez czynnika - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek ani czynnika).

Wynik powyższego testu dla łącznego traktowania TRA-8 z reprezentatywnym lekiem przeciwnowotworowym, Paclitaxelem, jest następujący. Paclitaxel obniżał żywotność komórek PC-3, ale nadal pozostawało ponad 40% sygnału wskazującego na żywe komórki nowotworowe dla stężenia do 200 nM. Watro odnotować, że dodanie 0,1 ng/ml TRA-8 bardzo zmieszało żywotność komórek nowotworowych, aż do 10%, pomimo tego, że nie widać zmniejszenia żywotności komórek przy pojedynczym podawaniu TRA-8 w tym stężeniu. Wynik ten wyraźnie wskazuje, że TRA-8 hamuje synergistycznie aktywność przeciwnowotworową w połączeniu z innymi lekami przeciwnowotworowymi.

P r z y k ł a d 26. Analiza innych typów humanizowanych przeciwciał TRA-8 (1) Projektowanie humanizowanych przeciwciał

Konstrukcję humanizowanych wersji TRA-8 przeprowadza się przy zastosowaniu metody ogólnie znanej jako wszczepianie CDR. Przeciwciało mAB58'CL używa się jako akceptorowe jak opisano

PL 211 755 B1 w Przykładzie 2 stanowiącym odniesienie i regiony CDR TRA-8 przeciwciała wszczepia się do akceptora. W regionie zrębowym niektóre aminokwasy są wszczepiane do akceptora na podstawie bądź TRA-8 bądź ludzkich sekwencji największej zgodności według kryteriów podanych przez Queen i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989) i sekwencje humanizowanych TRA-8 konstruuje się jak opisano poniżej.

(2) Konstrukcja plazmidu niosącego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego innych typów humanizowanego albo mysiego TRA-8

Jak pokazano w SEK NR ID: 56 z Listy sekwencji, humanizowanie typu H1 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 3 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 40 aminokwasu (treonina), 42 aminokwasu (kwas glutaminowy), 44 aminokwasu (arginina), 84 aminokwasu (seryna), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna), odpowiednio, glutaminą, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, asparaginą, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 59 z Listy sekwencji, humanizowanie typu H3 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 40 aminokwasu (treonina), 42 aminokwasu (kwas glutaminowy), 44 aminokwasu (arginina), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna) odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, glicyną, glicyną, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 60 z Listy sekwencji, humanizowanie typu H4 sekwencji aminokwasowych łańcucha ciężkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, uzyskuje się poprzez zastąpienie 13 aminokwasu (lizyna), 19 aminokwasu (lizyna), 88 aminokwasu (seryna), 93 aminokwasu (metionina), 114 aminokwasu (treonina), 115 aminokwasu (leucyna), odpowiednio, glutaminą, argininą, alaniną, waliną, leucyną i waliną.

Jak pokazano w SEK NR ID: 61 z Listy sekwencji, plazmid niosący DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego chimerowego TRA-8 jest nazwany „typem M. Ponadto, humanizowane TRA-8 opisane w Przykładzie 17 i 18 jest nazwane „typem H2.

Plazmidy niosące DNA kodujące region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego lub chimerowego TRA-8 konstruuje się jak następuje.

PCR stosuje się do konstrukcji następujących sekwencji DNA, każdej z nich zawierającej co opisano powyżej.

Zsyntetyzowano 24 następujące oligonukleotydy:

5'-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEK NR ID: 32);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEK NR ID: 33);

5'-tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B2; SEK NR ID: 57);

5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B3; SEK NR ID: 66);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEK NR ID: 34);

5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta-3' (C2; SEK NR ID: 64);

5'-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEK NR ID: 35);

5'-tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEK NR ID: 36);

5'-tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E2; SEK NR ID: 62);

5'-tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E3; SEK NR ID: 67);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEK NR ID: 37);

5'-ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F2; SEK NR ID: 68);

PL 211 755 B1

5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (G; SEK NR ID: 38);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SEK NR ID: 39);

5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H2; SEK NR ID: 58);

5'-tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H3; SEK NR ID: 69);

5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (1; SEK NR ID: 40);

5'-tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (12; SEK NR ID: 65);

5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEK NR ID: 41);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEK NR ID: 42);

5'-ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K2; SEK NR ID: 63);

5'-ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K3; SEK NR ID: 70);

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEK NR ID: 43) oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L2; SEK NR ID: 71).

Następujące 2 startery do PCR syntetyzuje się jak opisano powyżej:

5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (P1; SEK NR ID: 44); oraz

5'-gaccgatggg cccttggtgga-3' (P2; SEK NR ID: 45).

Syntezę DNA typu H1 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H1 wytwarza się jak następuje.

Skład roztworu do reakcji PCR: oligonukleotyd A, 10 pmol; oligonukleotyd B2, 10 pmol; oligonukleotyd C, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E, 10 pmol; oligonukleotyd F, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H2, 10 pmol; oligonukleotyd I, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1, 2 pM; starter oligonukleotydowy P2, 2, pM;

X bufor Pyrobest II, 10 pl; dNTP mix, 8 pl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 pl;

oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 pl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu

PL 211 755 B1 umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H1 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 gl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu H3 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H3 wytwarza się jak następuje.

Skład roztworu do reakcji PCR: oligonukleotyd A, 10 pmol; oligonukleotyd B, 10 pmol; oligonukleotyd C, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E2, 10 pmol; oligonukleotyd F, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H2, 10 pmol; oligonukleotyd I, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K2, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1, 2 gM; starter oligonukleotydowy P2, 2 gM;

X bufor Pyrobest II, 10 gl; dNTP mix, 8 gl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 gl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 gl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H3 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 gl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu H4 kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TPA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu H4 wytwarza się jak następuje.

Skład roztworu do reakcji PCR: oligonukleotyd A, 10 pmol; oligonukleotyd B, 10 pmol; oligonukleotyd C2, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E2, 10 pmol; oligonukleotyd F, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H2, 10 pmol; oligonukleotyd 12, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K2, 10 pmol; oligonukleotyd L, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1, 2 gM;

PL 211 755 B1 starter oligonukleotydowy P2, 2 μM;

X bufor Pyrobest II, 10 gl; dNTP mix, 8 gl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 gl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 gl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu H4 jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 gl wody destylowanej.

Syntezę DNA typu M kodującego łańcuch polipeptydowy zawierający sekwencję sygnału sekrecyjnego, region zmienny humanizowanego TRA-8 łańcucha ciężkiego i 8 reszt aminokwasowych z końca N regionu IgG-CH1 przeprowadzono poprzez kombinację reakcji PCR, odpowiednio.

Fragment DNA typu M wytwarza się jak następuje.

Skład roztworu do reakcji PCR: oligonukleotyd A, 10 pmol; oligonukleotyd B3, 10 pmol; oligonukleotyd C2, 10 pmol; oligonukleotyd D, 10 pmol; oligonukleotyd E3, 10 pmol; oligonukleotyd F2, 10 pmol; oligonukleotyd G, 10 pmol; oligonukleotyd H3, 10 pmol; oligonukleotyd 12, 10 pmol; oligonukleotyd J, 10 pmol; oligonukleotyd K3, 10 pmol; oligonukleotyd L2, 10 pmol; starter oligonukleotydowy P1, 2 gM; starter oligonukleotydowy P2, 2 gM;

X bufor Pyrobest II, 10 gl; dNTP mix, 8 gl;

polimeraza DNA Pyrobest, 0,5 gl; oraz redestylowana woda do objętości końcowej 50 gl.

Reakcję PCR przeprowadza się jak następuje. Roztwór ogrzewa się najpierw w 94°C przez 5 minut, po czym 7 razy powtarza się cykl ogrzewania do 98°C przez 10 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 1 minutę. Po zakończeniu tej procedury mieszaninę reakcyjną ogrzewa się w 72°C przez 15 minut.

Po ekstrakcji fenolowej i wytrącaniu etanolem, otrzymany w rezultacie osad DNA suszy się pod próżnią, rozpuszcza w minimalnej ilości wody redestylowanej i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążek DNA odpowiadający DNA typu M jest wycinany przy użyciu skalpela i wymywany z żelu przy zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 gl wody destylowanej.

Każdy z uzyskanych w rezultacie, wyekstrahowanych DNA (typu H1, typu H3, typu H4, i typu M) jest klonowany przy użyciu wektora pGEM-T Easy (Promega) jak następuje:

Fragment DNA odzyskany z reakcji PCR (H1, H3, H4 lub M), 5 gl;

X bufor dla polimerazy Taq, 1 gl;

mieszanina dNTP, 1 gl polimeraza Taq (5 jednostek/ml), 1 gl; oraz

PL 211 755 B1 redestylowana woda do objętości końcowej 10 pl.

Po przeprowadzeniu reakcji w każdym z roztworów w 70°C przez 30 minut, każdy roztwór DNA i wektor pGEM-T Easy poddaje się ligacji przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) stosując protokół producenta.

Po 4 godzinach inkubacji w 15°C, 2 pl inkubowanego roztworu reakcyjnego miesza się ze 100 pl kompetentnego szczepu JM109 E. coli przy gęstości 1-2 x 10⁹ komórek/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) i mieszaninę trzyma się w lodzie przez 30 minut, a następnie w 42°C przez 30 sekund i ponownie w lodzie przez 1 minutę. Następnie dodaje się 500 pl pożywki SOC (2% obj./obj. tryptonu, 0,5% wag./obj. ekstraktu drożdżowego, 0,05% wag./obj. chlorku sodowego, 2,5 mM chlorku potasowego, 1 mM chlorku magnezowego i 20 mM glukozy) do mieszaniny, którą inkubuje się przez dalszą godzinę z wytrząsaniem. Następnie izoluje się szczepy transformantów, plazmidowy DNA wytwarza się ze szczepów jak opisano w „Molecular Cloning A Laboratory Manual. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch ciężki humanizowanego TRA-8 potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F.

S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) przy użyciu 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pHB5 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H1 humanizowanego TRA-8), pHC10 (niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H3 humanizowanego TRA-8), pHD21 (niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki typu H4 humanizowanego TRA-8) i pM11 (niosący cDNA kodujący łańcuch ciężki chimerowego TRA-8). Szczepy transformantów E. coli niosące te plazmidy, nazwane E. coli JM109/pHB15, E. coli JM109/pHC10, E. coli JM109/pHD21 i E. coli JM109/pM11 zostały zdeponowane w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano im numer dostępu, odpowiednio FERM BP-7555, FERM BP-7557, FERM BP-7558 i FERM BP-7559.

(3) Konstrukcja plazmidów ekspresyjnych niosących DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego kilku typów humanizowanego albo mysiego TRA-8

Zrekombinowane wektory ekspresyjne dla komórek zwierzęcych konstruuje się poprzez wstawienie DNA kodującego łańcuch ciężki typu H1, typu H3 i typu H4 humanizowanego albo typu M chimerowego TRA-8 (sklonowanego jak wyżej) jak następuje.

Jeden pg plazmidu pSRHHH3 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0-909-816-A1) niosącego region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała monoklonalnego anty-Fas HFE7A i genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgG1, wektora ekspresyjnego dla komórek ssaczych, trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i Apal i rozdziela poprzez elektroforezę w 3% żelu agarozowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 pg/ml wodnego roztworu bromku etydyny w celu umożliwienia wykrycia DNA w świetle UV. Prążki wektorowego DNA zawierające genomowy DNA regionu stałego ludzkiej IgGl bez regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego HFE7A są wycinane przy użyciu skalpela i wymywane z żelu przy użyciu zestawu Geneclean Spin Kit (BIO 101, CA, USA). Po ekstrakcji fenolowej, wymyty DNA zatęża się poprzez wirowanie przy 7500 X g, a następnie wytrącenie etanolem, a na koniec rozpuszcza się w 5 pl wody destylowanej, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany w rezultacie strawiony, defosforylowany plazmid (100 ng) poddaje się następnie ligacji z 1 pg fragmentu DNA pHB15, pHC10, pHD21 lub pM11 zawierającego DNA regionu zmiennego łańcucha ciężkiego humanizowanego lub chimerowego TRA-8, który został również strawiony Hindlll i Apal, przy użyciu zestawu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Mieszaninę ligacyjną używa się następnie do transformacji E. coli JM109, który wysiewa się następnie na płytki agarowe LB zawierające 50 pg/ml ampicyliny.

Otrzymane tą metodą transformanty hoduje się w 2 ml płynnej pożywki LB zawierającej 50 pg/ml ampicyliny w 37°C przez noc i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS.

Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i Apal i poddaje elektroforezie w 3% wag./obj. żelu agarozowym w celu potwierdzenia obecności lub nieobecności wstawki DNA kodującej region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego TRA-8. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze potwierdza się metodą dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Otrzymane w rezultacie plazmidy ekspresyjne niosące cDNA kodujący łańcuch

PL 211 755 B1 ciężki humanizowanego lub chimerowego TRA-8 są nazwane odpowiednio, pHB 15-1, pHC10-3, pHD21-1 i pM11-1.

(4) Konstrukcja wektorów dla humanizowanych łańcuchów lekkich (4.1) Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla łańcuchów lekkich humanizowanego przeciwciała (typu LM1)

Jak pokazano w SEK NR ID: 72 z Listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM1) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 3 aminokwasu (walina), 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 (seryna), 60 aminokwasu (kwas asparaginowy), 63 aminokwasu (treonina), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna) 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 87 aminokwasu (fenyloalanina), and 99 aminokwasu (glicyna) 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 są zastępowane odpowiednio, glutaminą, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, seryną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM1.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 (typu LM1, SEK NR ID: 72 z Listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM1 (SEK NR ID: 72 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego przeciwciała antyludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN (SEK NR ID: 48), HKCDF11 (SEK NR ID: 50), HKCDR12 (SEK NR ID: 51), HKCDF22 (SEK NR ID: 52), HKCDR22 (SEK NR ID: 53) i HKCF12 (SEK NR ID: 54) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SEK NR ID: 77).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM1-2 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM1 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM1 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 72, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM1-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmidy matrycowe pHSGHM17 i pSRPDHH, są otrzymane zgodnie z opisem w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pHSGHM17 (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0909816 A1), 25 ng starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKSPR12, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 μl bufor do PCR 10x, 5 μl polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM1-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2 i CDRL2 jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pL28, 25 ng

PL 211 755 B1 starter oligonukleotydowy HKCDF11, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKCDR12, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek.

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM1-F3 kodujący CDRL2, FRL3 i część CDRL3 jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH, 25 ng starter oligonukleotydowy HKCDF22, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKCDR22, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 g polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM1-F4 kodujący CDRL3, FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

DNA plazmidu pSRPDHH, 25 ng starter oligonukleotydowy HKCF12, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

DNA LM1, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM1-F1, LM1-F2, LM1-F3 i LM1-F4 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM1-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F3 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM1-F4 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5,0 gl bufor do PCR 10x, 5,0 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

PL 211 755 B1

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 pl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°c przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Tak wytworzony fragment LM1-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F.

S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM1-2 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego (typu LM1) humanizowanego TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM1-2 zawierający fragment DNA LM1 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM1 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/LM1-2-2 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM1 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/LM1-2-2 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7562.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM1-2 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM1 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M1-2-2 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM1 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0909816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M2-1-4, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny, niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LMl TRA-8 jest nazwany pSR/LM1-2.

(4.2) Konstrukcja wektorów ekspresyjnych dla łańcuchów lekkich humanizowanego przeciwciała (typu LM3)

Jak pokazano w SEK NR ID: 73 z Listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM3) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (sery64

PL 211 755 B1 na) 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 87 aminokwasu (fenyloalanina), 99 aminokwasu (glicyna) 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, tyrozyną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM3.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM3, SEK NR ID: 73 z Listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM3 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM3 (SEK NR ID: 73 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47) i 7ALCN (SEK NR ID: 48) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3' (MOD1F1; SEK NR ID: 78);

5'-cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt-3' (MOD1R1; SEK NR ID: 79);

5'-ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SEK NR ID: 80);

5'-acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3' (MOD1R22; SEK NR ID: 81);

5'-accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3' (MOD1F3; SEK NR ID: 82);

5'-tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga-3' (MOD1R3; SEK NR ID: 83);

5'-aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t-3' (MOD1F42; SEK NR ID: 84);

5'-cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3' (MOD1R4; SEK NR ID: 85);

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat -3' (MOD1F5; SEK BR ID: 86);

5'-actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3' (MOD1R52; SEK NR ID: 87);

5'-tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F6; SEK NR ID: 88);

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3' (MOD1R6; SEK NR ID: 89);

5'-aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g-3' (MOD1F7; SEK NR ID: 90);

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa-3' (MOD1R7; SEK NR ID: 91); oraz

5'-agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEK NR ID: 101).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM3-3-44 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM3 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM3 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 73, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM3-F31B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5', FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji: starter oligonukleotydowy M0D1F1, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1R1, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F22, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1R22, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F3, 5 pmol

PL 211 755 B1 starter oligonukleotydowy M0D1R3, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F42, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1R4, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F5, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1R52, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F6, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1R6, 5 pmol starter oligonukleotydowy M0D1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R7, 5 pmol starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq (PerkinElmer), 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM3-F31C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1

Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

LM3-DNA w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM3-F31B i LM3-F31C są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM3-F31B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM3-F31C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5,0 gl bufor do PCR 10x, 5,0 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

PL 211 755 B1

Tak wytworzony fragment LM3-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F.

S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM3-3-44 (plazmid niosący cDNA kodujący łańcuch region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM1 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM3-3-44 zawierający fragment DNA LM3 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM2, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% XGal i 50 pg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 pg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM3 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/M3-3-22 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM1 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7564.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM3-3-44-10 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM3 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M3-3-22 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha Igx trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden pg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M3-3-22, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 100 pg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 jest nazwany pSR/LM3-3-44-10.

(4.3) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu LM4)

Jak pokazano w SEK NR ID: 74 z Listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM 4) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), aminokwasu (seryna) 83 aminokwasu (leucyna), 85 aminokwasu (kwas asparaginowy), 99 aminokwasu (glicyna) 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, treoniną, glutaminą, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM4.

PL 211 755 B1

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 (typu LM4) (SEK NR ID: 74 z Listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM4 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM4 (SEK NR ID: 74 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN (SEK NR ID: 48), M0D1F1 (SEK NR ID: 78), MOD1R1 (SEK NR ID: 79), MOD1F22 (SEK NR ID: 80), MOD1R22 (SEK NR ID: 81), MOD1F3 (SEK NR ID: 82), MOD1R3 (SEK NR ID: 83), MOD1F42 (SEK NR ID: 84), MOD1R4 (SEK NR ID: 85), MOD1F5 (SEK NR ID: 86), MOD1R52 (SEK NR ID: 87), MOD1F7 (SEK NR ID: 90), and MOD1R7 (SEK NR ID: 91), LR17 (SEK NR ID: 101) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62; SEK NR ID: 92)

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R62; SEK NR ID: 93)

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM4-5-3 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM4 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM4 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 74, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM4-F41B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5', FRL1, CDRL1, FRL2 oraz CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji: starter oligonukleotydowy MOD1F1, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R1, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F22, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R22, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F3, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R3, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F42, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R4, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F5, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R52, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F62, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R62, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R7, 5 pmol starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl

10xPCRbufor, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM4-F41C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1.

Skład roztworu do reakcji: plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng

PL 211 755 B1 starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°c przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

LM4-DNA w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM4-F41B i LM4-F41C są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM4-F41B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM4-F41C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5,0 gl bufor do PCR 10x, 5,0 gl polimeraza DNA ampliTag, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Tak wytworzony fragment LM4-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM4 TRA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM4-5-3 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM4 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM4-5-3 zawierający fragment DNA LM4 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM4, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 gg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 gg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM4 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/ LM4-5-3-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM4 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/LM4-5-3-1 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, IbarakiPL 211 755 B1 ken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7565.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM4-5-3-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM4 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/LM4-5-3-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM4 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0909816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/LM4-5-3-1, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 100 gg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM3 TRA-8 jest nazwany pSR/LM4-5-3-3.

(4.4) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu LM5)

Jak pokazano w SEK NR ID: 75 z Listy sekwencji, inna humanizacja (typu LM5) sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego mysiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8, polega na zastąpieniu 8 aminokwasu (histydyna), 9 aminokwasu (lizyna), 10 aminokwasu (fenyloalanina), 11 aminokwasu (metionina), 13 aminokwasu (treonina), 20 aminokwasu (seryna), 42 aminokwasu (glutamina), 43 aminokwasu (seryna), 77 aminokwasu (asparagina), 78 aminokwasu (walina), 80 aminokwasu (seryna) 83 aminokwasu (leucyna), 103 aminokwasu (leucyna) i 108 aminokwasu (alanina) z N-końca sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego TRA-8 odpowiednio, proliną, seryną, seryną, leucyną, alaniną, treoniną, lizyną, alaniną, seryną, leucyną, proliną, fenyloalaniną, waliną i treoniną. Otrzymana w rezultacie sekwencja jest nazwana LM5.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowych łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM5) (SEK NR ID: 75 z Listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM5 (SEK NR ID: 75 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch K) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47), 7ALCN (SEK NR ID: 48), MOD1F1 (SEK NR ID: 78), MOD1R1 (SEK NR ID: 79), MOD1F22 (SEK NR ID: 80), MOD1R22 (SEK NR ID: 81), MOD1F3 (SEK NR ID: 82), MOD1R3 (SEK NR ID: 83), MOD1F42 (SEK NR ID: 84), MOD1R4 (SEK NR ID: 85), MOD1R52 (SEK NR ID: 87), MOD1F7 (SEK NR ID: 90) i LR17 (SEK NR ID: 101), syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3' (MOD1F52; SEK

NR ID: 94)

5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F63; SEK NR ID: 95)

5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R63; SEK NR ID: 96)

5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc gaa-3' (MOD1R72; SEK NR ID: 102)

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM5-3-42 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM5 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM4 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 75, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

PL 211 755 B1

Fragment DNA LM5-F51B kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5', FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 i część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji: starter oligonukleotydowy MOD1F1, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R1, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F22, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R22, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F3, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R3, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F42, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R4, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F52, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R52, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F63, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R63, 5 pmol starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy MOD1R72, 5 pmol starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy LR17, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl x PCR bufor, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM5-F51C kodujący część regionu stałego z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmid matrycowy, pSRPDHH, jest otrzymany według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1.

Skład roztworu do reakcji:

plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng starter oligonukleotydowy MOD1F7, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 gl bufor do PCR 10x, 5 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

LM5-DNA, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM5-F51B i LM5-F51C są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM5-F51B z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM5-F51C z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol

PL 211 755 B1 mieszanina dNTP, 5,0 μl bufor do PCR 10x, 5,0 μl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 μl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Tak wytworzony fragment LM4-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP10F' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM5 TPA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy (Sanger, F. S., i wsp., (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) z zastosowaniem 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japonia).

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM5-3-42 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TRA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM5-3-42 zawierający fragment DNA LM5 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden μg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM5, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 μg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 μg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM5 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/LM5-3-27 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego LM4 humanizowanego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM5-3-27-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich humanizowanego LM5 TRA-8)

Otrzymany plazmid pHSG/M5-3-27 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego humanizowanego łańcucha lekkiego LM5 TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden μg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/LM5-3-27, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny humanizowanego łańcucha lekkiego LM5 TRA-8 jest nazwany pSR/LM5-3-27-1.

(4.5) Konstrukcja wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała (typu chimerowego)

Sekwencja pokazana w SEK NR ID: 76 z Listy sekwencji, sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego TRA-8 typu chimerowego jest nazwana LM6.

Plazmidy ekspresyjne niosące ten typ humanizowanych sekwencji aminokwasowej łańcucha lekkiego przeciwciała anty-ludzkie DR5, TRA-8 (typu LM6) (SEK NR ID: 75 z Listy sekwencji) są konstruowane jak następuje.

PL 211 755 B1

1) Synteza starterów do wytwarzania regionów zmiennych i stałych łańcucha lekkiego humanizowanego LM6 TRA-8

DNA kodujące łańcuch polipeptydowy LM6 (SEK NR ID: 75 z Listy sekwencji), każdy z nich stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała anty-ludzki DR5, TRA-8 i regionu stałego łańcucha lekkiego (łańcuch κ) ludzkiej Ig są odpowiednio syntetyzowane poprzez zastosowanie kombinacji reakcji PCR.

Poza 7AL1P (SEK NR ID: 47) i 7ALCN (SEK NR ID: 48) syntetyzuje się następujące startery oligonukleotydowe do PCR:

5'-tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3' (HKSPR13; SEK NR ID: 97);

5'-tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVF11; SEK NR ID: 98);

5'-aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc-3' (MVR11; SEK NR ID: 99); and

5'-aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc-3' (MCF11; SEK NR ID: 100).

2) Konstrukcja plazmidu pCR3.1/LM6-1-16 (klonowanie łańcuchów lekkich typu LM6 humanizowanego TRA-8)

Fragment DNA LM6 kodujący sekwencję aminokwasową jak zdefiniowano w SEK NR ID: 75, wytwarza się przez przeprowadzenie 2-etapowego PCR, wstawienie do wektora plazmidowego i klonowanie w E. coli.

a) Pierwszy etap PCR

Fragment DNA LM6-F1 kodujący sekwencję sygnału sekrecyjnego i część regionu FRL1 z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego Hindlll dodanym na końcu 5' jest wytworzony w następujących warunkach. Plazmidy matrycowe, pHSGHM17 i pSRPDHH, są otrzymane według następującego opisu w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 909 816 A1.

Skład roztworu do reakcji:

plazmid pHSGHMl7 DNA, 25 ng starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy HKSPR13, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 pl bufor do PCR 10x, 5 pl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 pl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM6-F2 kodujący część FRL1, CDRL1, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 oraz część regionu stałego jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

plazmid pL28 DNA, 25 ng starter oligonukleotydowy MVF11, 50 pmol starter oligonukleotydowy MVR12, 50 pmol mieszanina dNTP, 5 pl

10x PCR bufor, 5 pl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 pl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Fragment DNA LM6-F3 kodujący część FRL4 i region stały z miejscem cięcia dla enzymu restrykcyjnego EcoRI dodanym na końcu 3' jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji: plazmid pSRPDHH DNA, 25 ng starter oligonukleotydowy MCFll, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, pl 10xPCR bufor, 5 pl

PL 211 755 B1 polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Powielone fragmenty DNA po PCR rozdziela poprzez elektroforezę w 5% żelu poliakryloamidowym. Po elektroforezie, żel barwi się 1 gg/ml wodnego roztworu bromku etydyny dla wykrycia wytworzonego DNA w świetle UV. Odpowiednie prążki DNA wykryte w ten sposób są wycinane przy użyciu skalpela.

b) Drugi etap PCR

LM6-DNA, w którym opisane powyżej fragmenty DNA LM6-F1 i LM6-F2 i LM6-F3 są ze sobą połączone jest wytworzony w następujących warunkach.

Skład roztworu do reakcji:

Fragment DNA LM6-F1 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM6-F2 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR,

Fragment DNA LM6-F3 z żelu, wytworzony w pierwszym etapie PCR, starter oligonukleotydowy 7AL1P, 50 pmol starter oligonukleotydowy 7ALCN, 50 pmol mieszanina dNTP, 5,0 gl bufor do PCR 10x, 5,0 gl polimeraza DNA ampliTaq, 2,5 jednostek

Roztwór do reakcji mający powyższy skład doprowadza się do objętości końcowej 50 gl poprzez dodanie wody redestylowanej i używa w reakcji PCR.

Warunki termiczne PCR: Ogrzewanie w 94°C przez 2 minuty, a następnie powtarzanie 30 razy cyklu termicznego 94°C przez 1 minutę, 55°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty, po czym ogrzewanie w 72°C przez 10 minut.

Tak wytworzony fragment LM6-DNA wstawia się do plazmidu pCR3.1DNA stosując zestaw do klonowania Eukaryotic TA cloning Kit (Invitrogen) zgodnie z protokołem producenta i wprowadza się do kompetentnej E. coli TOP1OF' zawartej w zestawie. Sekwencje nukleotydowe tych DNA kodujących łańcuch lekki humanizowanego LM6 TPA-8 potwierdza się przy użyciu metody dideoksy z zastosowaniem analizatora DNA.

Otrzymane w rezultacie plazmidy nazwano pCR3.1/LM6-1-16 (plazmid niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego LM5 TPA-8 i region stały łańcucha lekkiego ludzkiej Ig).

Otrzymany plazmid pCR3.1/LM6-1-16 zawierający fragment DNA LM6 trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg plazmidu do klonowania pHSG399 DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pHSG399 i fragment DNA LM6, które zostały strawione enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB zawierające 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal i 50 gg/ml chloramfenikolu (stężenia końcowe). Otrzymane białe transformanty hoduje się w płynnej pożywce LB zawierającej 50 gg/ml chloramfenikolu i z otrzymanej hodowli ekstrahuje się plazmidowy DNA metodą alkaliczną z SDS. Wyekstrahowany plazmidowy DNA trawi się Hindlll i EcoRI, a następnie klon niosący fragment DNA LM6 wybiera się na podstawie elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

Jako rezultat powyższej procedury otrzymano plazmid pHSG/M6-1-4-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK. Szczep transformanta E. coli niosący ten plazmid, nazwany E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1 został zdeponowany w International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japonia 20 kwietnia, 2001, zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim dotyczącym depozytu mikroorganizmów i przypisano mu numer dostępu FERM BP-7566.

3) Konstrukcja plazmidu pSR/LM6-1-4-1 (plazmid ekspresyjny dla łańcuchów lekkich chimerowego TRA-8 typu LM6)

PL 211 755 B1

Otrzymany plazmid pHSG/LM6-1-4-1 niosący fragment stanowiący fuzję regionu zmiennego łańcucha lekkiego mysiego TRA-8 i regionu stałego ludzkiego łańcucha IgK trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI.

Jeden gg DNA plazmidu do klonowania pSRPDHH (europejskie zgłoszenie patentowe EP 0 909 816 A1) trawi się enzymami restrykcyjnymi Hindlll i EcoRI, a następnie defosforyluje przy użyciu CIP. Otrzymany defosforylowany DNA pSRPDHH i fragment DNA Hindlll-EcoRI otrzymany z pHSG/M6-1-4-1, poddaje się ligacji przy użyciu DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Następnie E. coli DH5a transformuje się poddanym ligacji DNA i wysiewa na płytki agarowe LB. Otrzymane transformanty hoduje się płynnej pożywce LB zawierającej 100 gg/ml ampicyliny i plazmidowy DNA ekstrahuje się następnie z otrzymanej hodowli metodą alkaliczną z SDS. Wstawienie i orientację pożądanego fragmentu DNA w wektorze pSRPDHH potwierdza się poprzez sekwencjonowanie DNA przy użyciu analizatora sekwencji (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).

Otrzymany w rezultacie plazmid ekspresyjny niosący cDNA kodujący region zmienny łańcucha lekkiego TRA-8 (typu chimerowego) jest nazwany pSR/LM6-1-4-1.

(5) Wytwarzanie różnych typów humanizowanego albo chimerowego przeciwciała TRA-8

Transfekcję komórek COS-7 przeprowadza się przy zastosowaniu metod z odczynnikiem do transfekcji FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem.

Komórki COS-7 (American Type Culture Collection Nr CRL-1651) hoduje się do półkonfluencji (3 x 10⁶ komórek/płytkę) w płytkach hodowlanych (powierzchnia hodowli: 57 cm²; Sumitomo Bakelite) zawierających pożywkę Dulbecco's Modified Eagle medium (określaną tu dalej jako „D-MEM; Gibco BRL) uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (nazywaną tu dalej w skrócie jako „FCS; Moregate).

W międzyczasie, miesza się 10 gg/płytkę (w sumie 5 płytek) DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 (pHA15-1) i 10 gg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5 otrzymanych metodą lizy alkalicznej-SDS i wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu, a następnie wytrąca etanolem, po czym zawiesza w 5 gl/płytkę dH2O.

Następnie miesza się 15 gl/płytkę odczynnika FUGENE6 Transfection regent z 180 gl/płytkę D-MEM bez FCS, ten roztwór FUGENE (185 gl/płytkę) miesza się z 5 gl/płytkę roztworu DNA zawierającego 10 gg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha ciężkiego humanizowanego DR5 i 10 gg/płytkę DNA plazmidu ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego humanizowanego DR5. Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej otrzymaną zawiesinę plazmidów (200 gl) dodaje się do przygotowanych wcześniej płytek COS-7. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 24 godziny, pożywkę hodowlaną zamienia się na D-MEM bez FCS. Po inkubacji w 5% CO2 w 37°C przez 72 godzin, zbiera się supernatant z hodowli w celu oczyszczenia produktów ekspresji z płynów supernatantu. Stosując opisaną powyżej metodę, komórki COS-7 transfekuje się każdą z następujących kombinacji plazmidów:

(A) : kotransfekcja pHA15-1 i pSR/LM1-2 (H1L1) (B) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/M2-1 (H2L2) (C) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/LM3-3-44-10 (H2L3) (D) : kotransfekcja pHB14-1 i pSR/LM4-5-3-3 (H2L4) (E) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/M2-1 (H3L2) (F) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/LM3-3-44-10 (H3L3) (G) : kotransfekcja pHC10-3 i pSR/LM4-5-3-3 (H3L4) (H) : kotransfekcja pHD21-1 i pSR/LM5-3-27-1 (H4L5) (I) : kotransfekcja pM11-1 i pSR/LM6-1-4-6 (Chimera)

Hodowlę zwirowuje się następnie (1000 obr. na min., 5 minut) i zbiera się supernatant. Supernatant odwirowuje się ponownie (9800 obr. na min., 15 minut) i filtruje przy użyciu filtra 0,45 um (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, # kat. 25CS045 AS). Oczyszczanie IgG z filtratów uzyskuje się stosując chromatografię powinowactwa Protein G-POROS (Applied Biosystems) w następujących warunkach:

system HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolumna: ProteinG-ID sensor cartridge (wielkość kolumny: 2,1 mmID x 30 mm LD, objętość pusta: 0,1 ml; # kat; 2-1002-00, Applied Biosystems) bufor do wymywania: 0,1 M Glicyna-HCl (pH 2,5) bufor do neutralizacji: 1 M Tris-HCl (pH 8,5) wykrywanie: 280 nm tempo przepływu: 1 ml/min.

PL 211 755 B1 wielkość frakcji: 0,5 ml/0,5 min.

probówki do zbierania frakcji: 1,5 ml mikroprobówka polipropylenowa temperatura: 4°C

Po nałożeniu wszystkich filtratów na kolumnę, 50 ml PBS (Sigma, # kat: 1000-3) używa się do przemycia kolumny. Po zastosowaniu buforu do przemywania uruchamia się kolektor frakcji. Każda mikroprobówka do zbierania frakcji zawiera już 55 gl 1 M NaCl, 110 gl buforu do neutralizacji i 74 gl bydlęcej albuminy surowiczej 2 mg/ml (Sigma, # kat; A-7030) w PBS. Zbiera się frakcje od nr 7 do nr 8.

Weryfikację ekspresji humanizowanych przeciwciał i test ilościowy na produkt ekspresji w otrzymanych płynach znad hodowli przeprowadza się poprzez ELISA z przeciwciałem przeciw antyludzka IgG.

Do każdej studzienki 96-studzienkowej płytki (MaxiSorp, Nunc), dodaje się 100 gl koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Kappel) rozcieńczonego do stężenia końcowego 0,5 gg/ml w buforze do adsorpcji (0,05 M wodorowęglan sodowy, 0,02% azydek sodowy, pH 9,6) i płytkę inkubuje się w 37°C przez 2 godziny w celu adsorpcji przeciwciała. Następnie płytkę przemywa się pięciokrotnie 350 gl PBS-T. Po przemywaniu do studzienek dodaje się, supernatant hodowlany rozcieńczony w D-MEM zawierającej 10% FCS i inkubuje się w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, do każdej studzienki dodaje się 100 gl wyznakowanego alkaliczną fosfatazą koziego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzka IgG swoistego wobec Fc (Jackson Immune Research Lab.) rozcieńczonego 10000-krotnie w PBS-T i inkubuje w 37°C przez 2 godziny. Po ponownym przemyciu PBS-T, dodaje się roztwór substratu p-nitrofenylofosforanu otrzymanego w zestawie Alkaline Phosphatase Substrate kit (Bio Rad) zgodnie z instrukcjami postępowania dostarczonymi z zestawem. Po inkubacji w 37°C przez 0,5 to 1 godziny, mierzy się absorbancję w 405 nm. W niniejszych doświadczeniach, immunoglobulina G podklasy 1 (IgG1) z ludzkiego osocza (Biopure AG) rozcieńczona w D-MEM zawierającej 10% FCS do pewnych stężeń jest stosowana jako próbki odnośnikowe dla stężenia humanizowanych przeciwciał DR5 zawartych w płynach znad hodowli.

W rezultacie ekspresja i oczyszczone produkty w supernatantach hodowlanych są specyficznie wykrywane przeciwciałem anty-ludzka IgG. Stężenie końcowe ludzkiego przeciwciała IgG wynosi odpowiednio, 44,03 gg/ml (H1L1), 39,8 gg/ml (H2L2), 26,7 gg/ml (H2L3), 41,0 gg/ml (H2L4), 39,3 gg/ml (H3L2), 24,7 gg/ml (H3L3), 21,5 gg/ml (H3L4), 16,7 gg/ml (H4L5) i 18,3 gg/ml (chimera).

(6) Aktywność indukowania apoptozy kilku typów przeciwciał humanizowanych albo chimerowych

Komórki Jurkat (ATCC nr TIB-152) używa się do badania aktywności indukowania apoptozy oczyszczonego humanizowanego przeciwciała TRA-8.

Komórki Jurkat hodowane w pożywce RPMI1640 z 10% FCS (Gibco BRL) w 37°C przez 3 dni w obecności 5% CO2 umieszcza się w każdej studzience 96-studzienkowej mikropłytki (Sumitomo Bakelite) po 50 gl studzienkę. Humanizowane TRA-8 wytworzone w Przykładzie 26 doprowadza się do stężenia 100 gg/ml dla końcowego produktu będącego przedmiotem zainteresowania pożywką RPMI1640 zawierającą 10% FCS poprzez oszacowanie ich stężeń w płynie zgodnie z metodą opisaną w Przykładzie 26. Każdy z roztworów z produktów ekspresji doprowadzony w ten sposób do 100 gg/ml używa się do sporządzenia serii rozcieńczeń poprzez powtarzanie serii 2-krotnych rozcieńczeń RPMI1640 zawierającą 10% FCS. Każdy z rozcieńczonych roztworów humanizowanego TRA-8 (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 lub H4L5) jest dodawany do każdej studzienki w ilości 50 gl studzienkę. Po przeprowadzeniu reakcji w 37°C przez 12 godzin, dodaje się 50 gl 25 gM PMS (metosiarczan fenazyny; Sigma Chemical Co.) zawierającego 1 mg/ml XTT (bierna sól 2, 3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-2H-tetrazolium-5-karboksyanirydu; Sigma Chemical Co.) (końcowe stężenia 250 gg/ml dla XTT i 5 gM dla PMS). Po inkubacji przez 3 godziny, dla każdej studzienki mierzy się absorbancję przy w 450 nm w celu obliczenia żywotności komórek stosując jako wskaźnik zdolność redukcyjną mitochondriów.

Żywotność komórek w każdej ścieżce oblicza się zgodnie z następującym wzorem:

Żywotność (%) = 100 x (a-b)/ (c-b)

Gdzie „a jest pomiarem dla studzienki testowej, „b jest pomiarem dla studzienki bez komórek, a „c jest pomiarem dla studzienki bez dodanego przeciwciała.

W rezultacie wykazano, że produkt ekspresji wytworzony w Przykładzie 20 (humanizowane TRA-8) indukuje apoptozę w komórkach linii komórkowej chłoniaka T wyrażających ludzki antygen DR5.

PL 211 755 B1

Ponadto, aktywność indukowania apoptozy humanizowanego TPA-8 wobec PC-3 bada się poprzez dodanie taksolu według metody opisanej w Przykładzie 25.

Ludzka linia komórek raka prostaty PC-3 (ATCC No. CRL-1435) jest otrzymana z kolekcji American Tissue Culture Collection (ATCC) i utrzymywana w pożywce F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) zawierającej 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS, Hyclone), 1% L-glutaminę-200 mM (25030-149, Gibco BRL) i 0,5% roztwór Penicillin Streptomycin Solution (P-7539, Sigma). Pożywka RPMI 1640 (MED-008, IWAKI) uzupełniona 10% FBS i 0,5% roztworem Penicillin Streptomycin Solution jest używana w następującym doświadczeniu. Rosnące wykładniczo komórki PC-3 zbiera się poprzez trypsynizację i przemywa dwukrotnie świeżą pożywką. Komórki następnie liczy się, zawiesza ponownie w świeżej pożywce przy gęstości 5 x 10⁴ komórek/ml i umieszcza w trzech powtórzeniach w 96-studzienkowych płytkach (3598, Corning-Coster) w całkowitej objętości 100 pl/studzienkę na dzień przed rozpoczęciem doświadczenia. Reprezentatywny lek przeciwnowotworowy, Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (10 mg/ml) rozcieńcza się w pożywce, a następnie dodaje do 96-studzienkiowych płytek zawierających komórki w ilości 50 pl/studzienkę. Stężenie końcowe dimetylosulfotlenku wynosi mniej niż 0,1%. Po inkubacji przez 24 godz. w 37°C w atmosferze 5% CO2, do studzienek dodaje się humanizowane przeciwciało TRA-8 (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 or H4L5) rozcieńczone w świeżej pożywce. Po inkubacji przez dalsze 24 godz., do studzienek dodaje się 50 pl pożywki Minimum Essential Medium (11095-098, Gibco BRL) zawierającej 1 mg/ml XTT i 25 mM PMS i płytki inkubuje się przez 6 godz. Następnie mierzy się OD450 przy użyciu ARVO HTS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) i żywotność komórek oblicza się jak następuje.

Żywotność komórek (%) = (OD450 dla studzienki zawierającej komórki traktowane Taxol i/lub (czynnikiem(ami))TRA-8 - OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek ani czynnika) x 100 / (OD450 dla studzienki zawierającej komórki bez czynnika OD450 dla studzienki nie zawierającej ani komórek ani czynnika).

Wynik jest taki, iż wykazano, że testowane humanizowane przeciwciała indukują apoptozę w ludzkich komórkach raka prostaty wyrażających ludzki antygen DR5.

P r z y k ł a d 27. Wytwarzanie przeciwciała DR4

Fuzję białkową zawierającą zewnątrzkomórkową domenę ludzkiego DR4 (a. a. 1-236) i część Fc ludzkiej IgG1 wyrażono w komórkach Cos-7 transfekowanych zrekombinowanym wirusem adenowirusowym. Fuzję białkową oczyszczono poprzez kolumnę powinowactwa z białkiem A. Myszy Balb/c immunizowano oczyszczoną fuzją białkową jak opisano powyżej. Jeden klon hybrydomy, 2E12 (IgG1, K), o swoistym wiązaniu się z DR4 i zdolności indukowania apoptozy ludzkiego chłoniaka B Ramos subklonowano trzykrotnie. Specyficzność wiązania 2E12 ustalono poprzez analizę ELISA i Western przy zastosowaniu fuzji białkowych ludzkich DR5, DcR1 i DcR2 z IgG1 jako antygenów kontrolnych. Wiązanie się 2E12 z DR4 na powierzchni komórek ustalono poprzez analizę z zastosowaniem cytometrii przepływowej komórek Cos-7 transfekowanych pełnej długości cDNA kodującym ludzki DR4. Aktywność indukowania apoptozy określono poprzez inkubowanie komórek Ramos z 1 pg/ml 2E12 w obecności koziego przeciwciała anty-mysia IgG1. Żywotność komórek ustalono w teście ATPLite jak opisano powyż ej.

P r z y k ł a d 28. Charakteryzacja przeciwciała DR4

Przeciwciało monoklonalne DR4 (2E12) jest specyficzne wobec ludzkiego DR4 jako ze nie wiąże się z innymi receptorami TRAIL, takimi jak DR5, DcR1 i DcR2 w teście ELISA (Fig. 19a). 2E12 rozpoznawał DR4 na powierzchni komórek co ustalono poprzez analizę w cytometrii przepływowej komórek Cos-7 transfekowanych DR4 (Fig. 19b). 2E12 był zdolny do indukowania apoptozy ludzkiego chłoniaka B Ramos w obecności drugiego łączącego krzyżowo przeciwciała w sposób zależny od dawki (Fig. 19c). Traktowanie in vitro komórkek Ramos 2E12 prowadziło do zależnej od czasu aktywacji kaspazy 8, 9 i 3 i cięcia PARP (Fig. 19d). Wyniki te wskazują, że 2E12 jest agonistycznym przeciwciałem anty-DR4, które indukuje apoptozę w sposób zależny od kaspazy.

Stosując anty-DR4 (2E12), a następnie kozie przeciwciało anty-mysia IgGl połączone z PE i cytometrię przepływową, pokazano, że przeciwciało DR4 wiąże się z komórkami linii włókniakomięsaka (Hs 913T) i kilkoma liniami komórkowymi raka sutka (2LMP.MDA-MB231 i MDA-MB453), ale wykazuje małe albo brak wiązania z linią komórkową normalnych ludzkich fibroblastów skóry (Malme-3).

P r z y k ł a d 29. Aktywność zabijania nowotworu przeciwciał wobec DR4

Aktywność zabijania nowotworu 2E12 testowano przy zastosowaniu modeli mysiego raka sutka. Nagie myszy inokulowano s.c. ludzką linią komórkową raka sutka, 2LMP. Traktowanie i.p. dawkami

PL 211 755 B1

200 pl 2E12 następowało w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24 po wstrzyknięciu nowotworu. Zwierzęta otrzymały i.v. adriamycynę (doksorubicynę) (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Traktowanie 2E12 i adriamycyną (Fig. 20) dawało większe zahamowanie wzrostu guza niż samych 2E12 albo adriamycyny.

Aktywność zabijania nowotworu TRA-8 w połączeniu z 2E12 testowano przy zastosowaniu tych samych modeli mysiego raka sutka. Traktowanie i.p. dawkami 200 pl TRA-8 i 2E12 następowało w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24 po wstrzyknięciu nowotworu. Zwierzęta otrzymały i.v. adriamycynę (6 mg/kg) w dniach 8, 12 i 16. Traktowanie TRA-8 plus 2E12 lub TRA-8 plus 2E12 i adriamycyną dawało, odpowiednio, 88% i 100% całkowitą regresję nowotworu (Fig. 21.)

P r z y k ł a d 30. Aktywność zabijania nowotworu przeciwciał wobec DR4/DR5 w połączeniu z innymi terapiami (1) Linie komórkowe i odczynniki

Subklon 2LMP linii komórkowej raka sutka MDA-MB-231, subklon LCC6 MDA-MB-435 i subklon DY36T2 MDA-MB-361 otrzymano od Dr. Marca Lipmanna (Georgetown University, Washington, D.C.) i utrzymywano w MEM uzupełnionej 10% FBS (Hyclone, Logan, UT). Linie komórkowe raka sutka MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB-468, BT-474, SK-BR-3 i ZR-75-1 otrzymano z American Type Culture Collection (Manassas, VA). Komórki MDA-MB-231, MDA-MB-453 i MDA-MB-468 hodowano w DMEM uzupełnionej witaminami MEM, nie niezbędnymi aminokwasami MEM, 1 mM pirogronianem sodowym i 10% FBS. Komórki BT-474 hodowano w RPMI 1640 uzupełnionej 10 ng/ml insuliny, 4,5 g/l glukozy, 10 mM HEPES, 1 nM pirogronianem sodowym i 10% FBS. Komórki SK-BR-3 hodowano w pożywce McCoy z 15% FBS. Komórki ZR-75-1 hodowano w pożywce Ham F12K z 20% FBS. Wszystkie linie utrzymywano w pożywce wolnej od antybiotyku w 37°C w atmosferze 5% CO2 i rutynowo badano pod kątem zanieczyszczenia Afycopiasma.

Oczyszczone mAb TPA-8 (IgG1) były wytwarzane w UAB, a także dostarczone przez Sankyo Co., Ltd. (Tokio, Japonia). Połączone z fikoerytryną kozie przeciwciało anty-mysia IgG1 i specyficzne wobec izotypu IgG1 przeciwciało kontrolne otrzymano z Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL). Adriamycynę i paklitaksel kupiono z Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) i przygotowywano jako 10 mM roztwory podstawowe, odpowiednio, w H2O destylowanej lub DMSO. Do badań na zwierzętach kompozycję farmaceutyczną paklitakselu (Bristol-Myers Squibb Co., Princeton, NJ) otrzymano z University of Alabama at Birmingham Hospital Pharmacy (Birmingham, AL) . Preparat ten rozcieńczano 1:5 w PBS bezpośrednio przed użyciem.

(2) Analiza ekspresji DR5 poprzez pośrednią immunofluorescencję i cytometrię przepływową

Komórki w wykładniczej fazie wzrostu przemywano raz PBS Dulbecco (bez Ca²⁺ i Mg²⁺) i zbierano w 4 mM EDTA/0,5% KCl w 37°C. Komórki zbierano poprzez odwirowanie w 4°C przez 5 min. przy 1000 rpm, przemywano raz i zawieszano w PBS zawierającym 1% BSA i 0,01% azydek sodu (bufor FACS) w 4°C. Komórki inkubowano z 10 pg/ml oczyszczonych TRA-8 lub specyficznym wobec izotypu IgG1 przeciwciałem kontrolnym przez 60 min. w 4°C, przemywano raz buforem, a następnie inkubowano z 10 pg/ml połączonego z PE koziego przeciwciała anty-mysia IgG1 przez 20 min w 4°C. Po wybarwieniu przeciwciałem, komórki przemywano raz buforem FACS i utrwalano w 1% paraformaldehydzie przez 15 min. w lodzie. Próbki analizowano w Becton Dickinson FACScan (San Jose, CA) i dane analizowano przy użyciu oprogramowania CellQuest.

(3) Testy na żywotność komórek przy zastosowaniu ATPLite

Komórki trypsynizowano i zawieszano w pełnej pożywce hodowlanej. Tysiąc komórek na studzienkę wysiewano na optycznie czyste 96-studzienkowe czarne płytki (Costar #3904, Corning, NY) i inkubowano przez noc w 37°C przed rozpoczęciem traktowania. Leki i przeciwciało rozcieńczano w pożywce hodowlanej bezpośrednio przed użyciem, a końcowe stężenie DMSO wynosiło zawsze <0,001%. Żywotność komórek badano po 24 godz. ekspozycji na sam TRA-8. Do traktowania łącznego lekami cytotoksycznymi, komórki traktowano wstępnie lekiem przez 24 godz. przed dodaniem przeciwciała i inkubowano przez dodatkowe 24 godz. przed badaniem żywotności komórek poprzez pomiar komórkowych poziomów ATP przy użyciu opartego na fluorescencji testu ATPLite (Packard Instruments, Meriden, CT). Postępowano zgodnie z protokołem rekomendowanym przez wytwórcę z tą różnicą, że wszystkie objętości reakcji (pożywka hodowlana i odczynniki) były zmniejszone o połowę. Wszystkie próbki badano w trzech powtórzeniach i wyniki przedstawiono jako średnią z przynajmniej 3 niezależnych doświadczeń.

(4) Badania terapii TRA-8, samym albo w połączeniu z chemioterapią lub napromieniowaniem u nagich myszy niosących ksenoprzeszczepy raka sutka

PL 211 755 B1

Nagim myszom wstrzykiwano s.c. 3 X 10⁷ komórek 2LMP. 7 dni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych podawano i.p. 200 lub 600 gg (10 lub 30 mg/kg) TRA-8, a następnie pięć dodatkowych zastrzyków w dniach 10, 14, 17, 21 i 24. Wzrost guzów śledzono w czasie. W kolejnych badaniach zwierzętom niosącym nowotwory z wszczepionych s.c. komórek 2LMP wstrzyknięto 200 gg TRA-8 w dniach 7, 10, 14, 17, 21 i 24, samego albo w połączeniu z adriamycyną (6 mg/kg i.v., dni 8, 12 i 16) lub paklitakselem (20 mg/kg i.p., w dniach 8, 12, 16, 20 i 24). Ustalano rozmiar guza i tempo regresji. Dodatkowo, przeprowadzano badania z TRA-8 i adriamycyną stosując opisany powyżej tryb w połączeniu z napromienowaniem ksenoprzeszczepów 2LMP 3 Gy ⁶⁰Co w dniach 9 i 17.

(5) Analiza apoptozy w ksenoprzeszczepach

Nagie myszy, którym wstrzyknięto s.c. 3 X 10⁷ komórek 2LMP w dniu 0, otrzymały i.p. 100 gg TRA-8 w dniach 7 i 10. Grupy po 2 myszy otrzymały adriamycynę (3 mg/kg) w dniach 8 i 11, paklitaksel (10 mg/kg) w dniach 8 i 11 lub kombinację TRA-8 i adriamycyny lub paklitakselu w tej samej dawce i trybie podawania. Jedna grupa myszy była nie traktowana. Ksenoprzeszczepy wycięto do badania apoptozy 14 dnia po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Powodem zasadniczego zmniejszenia intensywności traktowania w porównaniu z naszym standardowym protokołem leczenia było udostępnienie odpowiedniej tkanki nowotworowej do analizy w dniu 14. Test Tunel dla apoptozy w ksenoprzeszczepach nowotworu przeprowadzono jak następuje. Pięciomikronowe parafinowe skrawki tkanki umieszczano na szkiełkach Superfrost/Plus i ogrzewano w 58°C przez 1 godz. Ze skrawków tkanek usuwano parafinę poprzez trzy zmiany ksylenu i uwadniano poprzez jedną zmianę etanolu absolutnego, etanolu 95% i etanolu 70%, każdą przez okres 5 min. Następnie, skrawki umieszczano w soli fizjologicznej buforowanej Tris (0,5 M Tris base, 0,15 M NaCl, 0,0002% Triton X-100, pH 7,6). Jądra apoptotyczne wykrywano przy zastosowaniu zestawu Apop Tag Peroxidase (Intergen, Purchase, NY). Do próbek tkanek dodawano proteinazę K (20 gg/ml w destylowanej dejonizowanej H2O) i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Endogenne peroksydazy wyciszano 3% wodnym roztworem nadtlenku wodoru przez 5 min. Skrawki traktowano buforem do równoważenia przez 30 min., a następnie inkubowano z enzymem TdT (rozcieńczonym w mieszaninie reakcyjnej do znakowania) przez 1 godz. w 37°C stosując przykrycie z parafilmu. W trakcie tej inkubacji, enzym TdT wiąże się z końcami 3'-OH fragmentów DNA i katalizuje dodanie wyznakowanych digoksygeniną i niewyznakowanych deoksynukleotydów. Kontrole negatywne inkubowano z destylowaną H2O (rozcieńczoną w mieszaninie reakcyjnej do znakowania) zamiast enzymu TdT. Bufor stop dodawano po 10 min. w temperaturze pokojowej w celu zakończenia reakcji znakowania. Koniugat anty-digoksygenina dodawano do każdego szkiełka na 30 min. Chromogen 3,3'DAB dodawano w celu uwidocznienia wyznakowanego końca 3'-OH fragmentów DNA. Szkiełka przemywano następnie dejonizowaną wodą i lekko wybarwiano hematoksyliną, odwadniano przy użyciu rosnących stężeń alkoholu i ksylenu i umieszczano na nich szkiełka nakrywkowe przy użyciu Permount. Około 10 losowych pól oceniano pod kątem procentu wybarwionych Tunel i procentu intensywnie wybarwionych ciałek apoptotycznych w tkance.

(6) Analiza statystyczna (A) Analiza oddziaływania TRA-8 z cytotoksycznością leku in vitro

Dane z cytotoksyczności oceniano w celu zbadania, czy łączenie efektów cytotoksycznych było addytywne, mniej niż addytywne (antagonistyczne) lub więcej niż addytywne (synergiczne). Związek dawki z odpowiedzią dla czynników, samych albo w kombinacji, modelowano przy zastosowaniu powierzchniowego modelu odpowiedzi drugiego stopnia, z parametrami liniowymi, kwadratowymi i oddziaływania dla każdej z 9 linii komórkowych (Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments, New York: Wiley, 2001), zgodnie z zaleceniami Gennings (On Testing for Drug/Chemical Interactions: Definitions and Inference, str. 457-468, 2000). Znaczące oddziaływanie klasyfikowano jako bądź synergiczne bądź antagonistyczne, w zależności od tego, czy oddziaływanie było negatywne, z więcej niż addytywną cytotoksycznością, czy pozytywne z mniej niż addytywną cytotoksycznością. Jeżeli oddziaływanie było nieznaczące, wówczas związek między TRA-8 i adriamycyną lub TRA-8 i paklitakselem byłby uważany za addytywny, zakładając że addytywność jest znacząca.

(B) Analiza TRA-8, chemioterapii, napromieniowania i terapii łączonej w indywidualnych doświadczeniach na zwierzętach.

Dane z 6 niezależnych doświadczeń analizowano poprzez indywidualne doświadczenia. Leczenie łączone porównywano biorąc pod uwagę skuteczność przeciwnowotworową in vivo, tj. hamowanie wzrostu guzów nowotworowych, które mierzono w trzech punktach czasowych; wydłużenie czasu podwajania się nowotworu, procent regresji nowotworu i szybkość wzrostu w czasie. Liczbę dni, w trakcie których guz podwoił swoją powierzchnię (produkt dwóch średnic) w stosunku do linii podstaPL 211 755 B1 wowej w dniu 7 po wstrzyknięciu komórek nowotworowych zastosowano w analizie czasu podwajania. Bezparametrowy test Kruskal-Wallis zastosowano dla porównania średniego czasu podwajania guza przy różnych traktowaniach. Test dokładności Fishera zastosowano do porównania proporcji regresji guza i regresji bez nawrotów w traktowanych grupach. W celu ustalenia, czy którakolwiek terapia łączona dawała znaczące synergiczne hamowanie wzrostu guza nowotworowego, tj. więcej niż addytywne, krzywe wzrostu z seryjnych pomiarów powierzchni porównywano przy zastosowaniu liniowego mieszanego modelu w czasie pierwszych 3 tygodni od rozpoczęcia terapii (Lindsey, J. K. Models for Repeated Measurements, str. 100-142, Oxford, 1993). W celu przetestowania efektów synergicznych terapii łączonych, w modelu uwzględniono oddziaływania. Jeżeli oddziaływanie było znaczące i efektem było hamowanie wzrostu z szybkością większą niż addytywną, wówczas oddziaływanie uważano za synergiczne.

(C) Analiza zbiorowa efektów terapii

Analizą zbiorową objęto w sumie 166 zwierząt, 10 grup traktowania i 6 niezależnych doświadczeń. Leczenie łączone porównywano biorąc pod uwagę skuteczność przeciwnowotworową in vivo. Średnie czasy podwajania guza analizowano przy zastosowaniu testu Kruskal-Wallis i testu dokładności Fishera w celu porównania proporcji regresji guza i regresji bez nawrotów w traktowanych grupach.

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SAS® (Sas/Stat User's Guide,SAS OnlineDoc, Version 8, Cary NC: SAS Institute Inc., 1999).

(6) Ekspresja DR5 i indukowana TRA-8 cytotoksyczność w liniach komórkowych raka sutka

Jak przedstawiono na Fig. 22A, wszystkie dziewięć linii komórkowych raka sutka było DR5 dodatnich z różnymi stopniami ekspresji, od silnie dodatniej (LCC6 i MDA-MB-453) do słabo dodatniej (MDA-MB-468 i SK-BR-3). Fig. 22B pokazuje cytotoksyczność indukowaną przez TRA-8 dziewięciu linii komórkowych. Cztery linie komórkowe były wrażliwe na cytotoksyczność indukowaną przez TRA-8, ze stężeniami IC50 od 17 do 299 ng/ml (LCC6, 2LMP, MDA-MB-231, MDA-MB-468), podczas gdy inne były całkiem odporne (DY36T2, BT-474, MDA- MB-453). Nie było dobrej korelacji ekspresji DR5 i stopnia cytotoksyczności indukowanej przez TRA-8, co pokazują linie komórkowe MDA-MB-453 i MDA-MB-468.

Wpływ TRA-8 na indukowaną TRA-8 cytotoksyczność badano następnie dla adriamycyny (Fig. 23A) i paklitakselu (Fig. 23B). Analizę w celu zbadania oddziaływania pomiędzy przeciwciałem i efektami leków podsumowano w Tabeli 5. Nie było znaczącej reakcji synergicznej pomiędzy TRA-8 i paklitakselem, przy czym większość oddziaływań była addytywną. Cztery z dziewięciu linii komórkowych spełniały kryteria dla oddziaływania synergicznego pomiędzy TRA-8 i adriamycyną. Linia komórkowa 2LMP wykazywała dobrą wrażliwość na TRA-8, jak również wrażliwość bądź na adriamycynę bądź paklitaksel. Ta linia została wybrana do badania skuteczności in vivo przeciwciała i/lub leku.

Tabela 5. Wpływ oddziaływania in vitro dla leczenia skojarzonego

TRA-8 + adriamycyna TRA-8 + paklitaksel

Linia komórkowa	Oddziaływanie	wartość pa	Oddziaływanie	wartość p
LCC6	Synergiczne	<0,001	Addytywne	0,624
MDA-MB-453	Synergiczne	<0,001	Brak odpowiedzic	0,615
2LMP	Addytywne	0,153	Addytywne	0,937
MDA-MB-231	Addytywne	0,663	Addytywne	0,064
BT-474	Synergiczne	<0,001	ND b	0,992
ZR-75-1	Synergiczne	0,013	Addytywne	0,172
DY36T2NDb	0,808	NDb	0,798
MDA-MB-468	Addytywne	0,184	Addytywne	0,724
SK-BR-3	Addytywne	0,361	Brak odpowiedzi	0,871

^a wartość p dotyczy istotności oddziaływania synergicznego. Jeżeli obydwa efekty, TRA-8 i leku, były znaczące i oddziaływanie było znaczące, wówczas efekty łączenia były uważane za synergiczne. Jeżeli wartość p dla oddziaływania nie wynosiła <0,05, wówczas efekty łączenia były uważane za addytywne.

^b Nie ustalono, ponieważ efekt TRA-8 był nie znaczący, a efekt adriamycyny/paklitakselu był znaczący.

^c Nie było znaczącej odpowiedzi na dawkę dla żadnego z czynników

PL 211 755 B1 (7) Efekty przeciwnowotworowe in vivo samego TRA-8 albo w połączeniu z chemioterapią i/lub napromieniowaniem

TRA-8 w dawkach 200 gg i 600 gg dwa razy w tygodniu dla 6 dawek dawał podobne zahamowanie wzrostu guza dla guzów uzyskanych poprzez wstrzyknięcie s.c. 2LMP (Fig. 24). W trzech dodatkowych niezależnych doświadczeniach, tryb dawki 200 gg dawał statystycznie znaczące zmniejszenie wzrostu guza (p<0,004, test Kruskal-Wallis dla czasów podwajania guza) w porównaniu z nie traktowanymi kontrolami i tę dawkę i tryb wybrano do dalszych badań. Fig. 25 ilustruje efekty TRA-8, adriamycyny lub połączenia TRA-8 i adriamycyny na skuteczność przeciwnowotworową. W porównaniu z nie traktowanymi kontrolami, terapia samym TRA-8 lub TRA-8 plus adriamycyną dawała znaczące zahamowanie wzrostu guza (p=0,002, test Kruskal-Wallis), podczas gdy adriamycyną nie różniła się od kontroli. Łączenie TRA-8 plus adriamycyną dawała większe zahamowanie wzrostu niż sam czynnik (p=0,002), jak również znacząco bardziej kompletną remisję guzów (cztery) niż sam czynnik, tam gdzie nie widać było całkowitej regresji (p<0,001, test dokładności Fishera). Synergizm TRA-8 i adriamycyny in vivo oceniano przy zastosowaniu analizy wczesnej krzywej wzrostu. Oddziaływanie było znaczące (p<0,001) i synergiczne. Oddziaływanie synergiczne badano w drugim niezależnym doświadczeniu.

Efekty TRA-8 i paklitakselu badano w tym samym modelu z podobnymi obserwacjami (Fig. 26). W porównaniu z nie traktowanymi kontrolami, TRA-8 i TRA-8 plus paklitaksel dawały znaczące zahamowanie wzrostu guza (p<0,001, test Kruskal-Wallis). Wzrost guza u zwierząt traktowanych TRA-8 plus paklitakselem był znacząco różny niż samym paklitakselem (p=0,008) i dawał 3/8 całkowitych regresji w porównaniu do żadnego w przypadku samego czynnika. Analiza krzywej wzrostu dla wczesnych guzów wykazała, że efekt synergiczny był bliski znaczącego (p=0,063), podczas gdy efekty addytywne były znaczące (p<0,001).

Na koniec analizowano efekty TRA-8, adriamycyny i napromieniowania ⁶⁰Co jako pojedynczych czynników i w różnych kombinacjach, jak przedstawiono na Fig. 27. Występowały znaczące ogólne różnice dotyczące czasów podwajania nowotworów (p<0,001) i wielokrotne porównania wskazywały, że potrójna terapia TRA-8, adriamycyną i napromieniowaniem ⁶⁰Co dawała zahamowanie wzrostu guza, które było znacząco różne niż we wszystkich innych traktowanych grupach, podczas gdy obydwie grupy z podwójnym traktowaniem (adriamycyną plus TRA-8 lub ⁶⁰Co plus TRA-8) były różne od każdej z grup z pojedynczym czynnikiem (p<0,001). Zwierzęta traktowane jedynie napromieniowaniem ⁶⁰Co nie różniły się od nie traktowanych kontroli (p=0,926). Wszystkie kombinacje dwóch rodzajów traktowania miały znaczące efekty synergiczne (p<0,001). Całkowita regresja była widoczna u 6/8 zwierząt otrzymujących potrójną terapię i u czterech zwierząt nowotwór nie pojawił się ponownie na przestrzeni następnych 180 dni.

(8) Zbiorcza analiza efektów terapii

Badania przeciwnowotworowe in vivo obejmowały 166 zwierząt i analizowano czasy podwajania guza i częstość całkowitej regresji nowotworu dla wszystkich zwierząt w każdej grupie traktowania (Tabela 6). Analiza ANOVA dla średnich czasów podwajania guza wskazywały na znaczące różnice pomiędzy grupami traktowania (p<0,001), gdzie wielokrotne porównania pokazały, że TRA-8 + paklitaksel, TRA-8 + adriamycyna i TRA-8 + adriamycyna + ⁶⁰Co miały znacząco dłuższy średni czas podwajania guza niż jakakolwiek grupa traktowania bez TRA-8. Dodanie TRA-8 do któregokolwiek sposobu traktowania dawało dłuższy czas podwajania guza niż każdy z tych sposobów sam. Podobnie, test Kruska-Wallis dla median czasu podwajania guza pokazywał, że mediany były ogólnie znacząco różne (p<0,001). Porównania dla par przy zastosowaniu testu Wilcoxin dawało podobne wzory dla median czasu podwajania guza co porównania wielokrotne ANOVA. Analiza ta zaniża hamowanie wzrostu będące wynikiem najbardziej skutecznego traktowania w tych grupach, które nie osiągnęły podwajania guza przed końcem doświadczenia określanego jako dzień zakończenia eksperymentu. Tabela 6 dostarcza również częstości całkowitej regresji nowotworu i częstości utrzymywania się tej regresji do końca doświadczenia. Nie było widać całkowitej regresji nowotworu u zwierząt traktowanych tylko chemioterapią albo promieniowaniem, co świadczyło o dobrze ustabilizowanym wzroście guza i agresywności nowotworu. Z testu dokładności Fishera, nie było znaczących różnic w częstości całkowitych regresji pomiędzy grupami traktowania (p<0,001). Trzydzieści spośród 166 zwierząt osiągnęło całkowitą regresję, a 28 z nich otrzymywało TRA-8, samo albo w połączeniu z innymi sposobami. Całkowita regresja nastąpiła u 1/42 zwierząt kontrolnych, 1/54 zwierząt otrzymujących chemioterapię, napromieniowanie lub ich połączenie i 28/68 dla TRA-8, samego albo trybach łączonych z TRA-8. Grupy traktowane TRA-8 miały znacząco (p<0,001) większą częstość całkowitej regresji. Podobnie,

PL 211 755 B1

14/68 zwierząt otrzymujących TRA-8 lub kombinacje z TRA-8 nie miały ponownego wzrostu guza w porównaniu z 1/42 w kontroli i 0/52 u zwierząt traktowanych chemioterapią i/lub napromieniowaniem. Okresy obserwacji dla regresji wolnych od nawrotów wynosiły od 99 do 171 dni (146±24 dni).

Tabela 6. Zbiorcze wyniki czasu podwajania i częstości całkowitej regresji guzów 2LMP
		Całkowite regresje
Traktowanie	# Zwierzęta	Czas podwajania guza (dni) (średnia/mediana)	Całkowita (%)	Bez nawrotów (%)	Średni okres obserwacji (dni)
Nie traktowane kontrole	44(42)a	12/8	1(2%)	1(2%)	177
60Co	8(7)	14/10	0	0	186
Adriamycyna	31(28)	17/18	0	0	197
Paklitaksel	7(5)	25/20	0	0	-
Adriamycyna + 60Co	8(8)	39/36	1(13%)	0	197
TRA-8	30(26)	47/23	6(20%)	5(17%)	159
TRA-8 + 60Co	8(8)	65/50	3(38%)	1(13%)	186
TRA-8 + paklitaksel	8(8)	71/62	3(38%)	1(13%)	148
TRA-8 + adriamycyna	14(12)	81/64	10(71%)	3(21%)	185
TRA-8 + adriamycyna + 60Co	8(6)	>140/179	6(75%)	4(50%)	192

^aLiczby w nawiasach są liczbą nie cenzurowanych zwierząt (9) Apoptoza w traktowanych nowotworach

Indukcję apoptozy w ksenoprzeszczepach 2LMP po traktowaniu TRA-8, adriamycyną, paklitakselem, TRA-8 + adriamycyną i TRA-8 + paklitakselem badano przy zastosowaniu techniki TUNEL. W traktowanych zwierzętach nowotwory mają 4% zabarwionych komórek (1% intensywnie), podczas gdy traktowanie adriamycyną lub paklitakselem dawało 8% (6% intensywnie) i 7% (2% intensywnie) zabarwionych komórek. Zwierzęta traktowane samym TRA-8 miały uderzającą apoptozę z 25% (15% intensywnie) zabarwionych komórek. TRA-8 plus adriamycyną dawały 28% (22% intensywnie), a TRA-8 plus paklitaksel dawały 26% (12% intensywnie) zabarwionych komórek.

Odnośniki

1. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland GR, Smith TD, Rauch C, Smith CA, i wsp. Immunity 1995 Grudz.; 3(6): 673-82

2. Pan G, O'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM Science 1997 4 kwieć.; 276(5309): 111-3

3. Walczak H, Degli-Esposti MA, Johnson RS, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Timour MS, Gerhart MJ, Schooley KA, Smith CA, Goodwin RG, Rauch CT. EMBO J 1997 1 wrz.; 16(17): 5386-97

4. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasula SM, Fernandes-Alnemri T, Cohen GM, Alnemri ES. J Biol Chem 1997 10 paźdź.; 272(41): 25417-20.

5. Degli-Esposti MA, Dougall WC, Smolak PJ, Waugh JY, Smith CA, Goodwin RG. Immunity 1997 Grudz.; 7(6): 813-20

6. Chaudhary PM, Eby M, Jaśmin A, Bookwalter A, Murray J, Hood L. Immunity 1997 Grudz.; 7(6): 821-30

7. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J. Immunity 1997 Grudz.; 7(6): 831-6

8. Degli-Esposti MA, Smolak PJ, Walczak H, Waugh J, Huang CP, DuBose RF, Goodwin RG, Smith CA. J Exp Med 1997 6 paźdź.; 186(7): 1165-70

9. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Science 1997 8 sierp.; 277(5327): 818-21

10. Pan G, Ni J, Wei YF, Yu G, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 8 sierp.; 277(5327): 815-818

PL 211 755 B1

11. Marsters SA, Sheridan JP, Pitti RM, Huang A, Skubatch M, Baldwin D, Yuan J, Gurney A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curr Biol 1997 1 grudz.; 7(12): 1003-6

12. Emery JG, McDonnell P, Burke MB, Deen KC, Lyn S, Silverman C, Dul E, Appelbaum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds PA, James IE, Rosenberg M, Lee JC, Young PR. J Biol Chem 1998 5 czerw.; 273(23): 14363-7

13. Walczak H, Miller RE, Ariail K, Gliniak B, Griffith TS, Kubin M, Chin W, Jones J, Woodward A, Le T, Smith C, Smolak P, Goodwin RG, Rauch CT, Schuh JC, Lynch DH. Nat Med 1999 Luty; 5(2): 157-63

14. Gazitt Y. Leukemia 1999 Nov; 13(11): 1817-24

15. Rieger J, Naumann U, Glaser T, Ashkenazi A, Weller M. FEBS Lett 1998 1 maj; 427(1): 124-8

16. Jeremias I, Herr I, Boehler T, Debatin KM. Eur J Immunol 1998 Stycz.; 28(1): 143-52

17. Martinez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Pineiro A, Naval J, Anel A. Eur J Immunol 1998 Wrz.; 28(9): 2714-25

18. Phillips TA, Ni J, Pan G, Ruben SM, Wei YF, Pace JL, Hunt JS. J Immunol 1999 15 maj; 162(10): 6053-9

19. Kayagaki N, Yamaguchi N, Nakayama M, Takeda K, Akiba H, Tsutsui H, Okamura H, Nakanishi K, Okumura K, Yagita H. J Immunol 1999 15 sier.; 163(4): 1906-13

20. Johnsen AC, Haux J, Steinkjer B, Nonstad U, Egeberg K, Sundan A, Ashkenazi A, Espevik T. Cytokine 1999 Wrz.; 11(9): 664-72

21. Zamai L, Ahmad M, Bennett IM, Azzoni L, Alnemri ES, Perussia B. J Exp Med 1998 21 grudz.; 188(12): 2375-80

22. Fanger NA, Maliszewski CR, Schooley K, Griffith TS. J Exp Med 1999 18 paźdź.; 190(8): 1155-64

23. Griffith TS, Wiley SR, Kubin MZ, Sedger LM, Maliszewski CR, Fanger NA. J Exp Med 1999 19 kwiec.; 189(8): 1343-54

24. Griffith TS, Rauch CT, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Lynch DH, Smith CA, Goodwin RG, Kubin MZ. J. Immunology 1999 162:2597-2605

25. Albani S and Carson DA, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, wydanie 13, tom 2, 979-992.

26. Fujisawa K, Asahara H, Okamoto K, Aono H, Hasunuma T, Kobata T, Iwakura Y, Yonehara S, Sumida T i Nishioka K. J. Clin. Invest. 1996 98(2): 271-278

27. Zhang H, Yang Y, Horton JL, Samoilova EB, Judge TA, Turka LA, Wilson JM i Chen Y. 1997 J. Clin. Invest. 100(8), 1951-1957.

28. Roth W, Isenmann S, Naumann U, Kugler S, Bahr M, Dichgans J, Ashkenazi A, Weller M. Locoregional. Biochem Biophys Res Commun 1999 19 list.; 265(2): 479-83

29. Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar S, Hamstra DA, Shanaiah M, Chenevert TL, Ross BD, Rehemtulla A. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000 15 luty; 97(4): 1754-1759

30. Arai T, Akiyama Y, Okabe S, Saito K, Iwai T, Yuasa Y. Cancer Lett 1998 27 list.; 133(2): 197-204

31. Lee SH, Shin MS, Kim HS, Lee HK, Park WS, Kim SY, Lee JH, Han SY, Park JY, Oh RR, Jang JJ, Han JY, Lee JY, Yoo NJ. Cancer Res 1999 15 list.; 59(22): 5683-5686

32. Pai SI, Wu GS, Ozoren N, Wu L, Jen J, Sidransky D, El-Deiry WS. 1998 Cancer Res Sier. 15; 58(16): 3513-3518

33. Maniatis i wsp., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harber, NY

34. Schroff i wsp., 1985 Cancer Res., 45, 879-885.

35. Yelton, D. E., i wsp., 1978 Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7

36. Kohler, G., i wsp., 1976 European J. Immunology, 6, 511-519

37. Shulman, M., i wsp., 1978 Nature, 276.269-270

38. Kearney, J. F., i wsp., 1979 J. Immunology, 123, 1548-1550

39. Horibata, K. and Harris, A. W., 1975 Nature, 256, 495-497

40. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishinan, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P i Ashkenazi A, 1997 Science, 277, 818-821.

41. Cheng J i wsp., 1994 Science, 263, 1759-1762

42. Bendele AM i wsp., 1999 Clin Exp Rheumatol, 17(5), 553-560

PL 211 755 B1

43. Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gurney A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P i Ashkenazi A. 1997 Science, 277, 818-821.

44. Schneider P, Thome M, Burns K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka T, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity Grudz.; 7(6): 831-836.

45. Kennedy NJ, Kataoka T, Tschopp J i Budd RC. 1999 J. Exp. Med. 1891-1896.

46. Miiler-Ladner U, Gay RE i Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rheumatology, wydanie 13, Tom 1, 243-254.

Lista sekwencji <110> UAB RESEARCH FOUNDATION

Zhou, Tong Kimberly, Robert P.

Koopman, William J.

LoBuglio, Albert S.

Buchsbaum, Donald J.

<120> Przeciwciało selektywne względem receptora dla liganda indukującego apoptozę spokrewnionego z czynnikiem martwicy nowotworu i jego zastosowania <130> 21085.0029P2 <150> US 60/346,402 <151> 2001-11-01 <150> PCT/US01/14151 <151> 2001-05-02 <150> US 60/201,344 <151> 2000-05-02 <160> 102 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 1 gacgatgccc gatctacttt aaggg <210>

<211>

<212>

DNA

PL 211 755 B1 <213> konstrukt syntetyczny <400> 2 ccactgggtg atgttggatg gg 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 3 ggatccgtgg acacattcga tgtc 24 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny

<400>	4
Glu Val Met 1	Leu	Val Glu Ser Gly Gly 5	Gly Leu Val Lys 10	Pro Gly Gly 15
Ser Leu Lys	Leu 20
<210>	5
<211>	20
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny

<400>	5
Asp Ile Val 1	Met	Thr Gin 5	Ser His Lys Phe Met Ser Thr 10	Ser Val Gly 15
Asp Arg Val	Ser 20
<210>	6
<211>	20

PL 211 755 B1

PL 211 755 B1 <400> 10 gaagtgatgc tggtggagtc 20

<210>	11
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 11 agtgtgaagt gatgctggtg 2Q

<210>	12
<211>	21
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 12 tttaccagga gagtgggaga g 21

<210>	13
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 13 tgcagagaca gtgaccagag 20

<210>	14
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 14 tgttcaggac cagcatgggc 20 <210> 15

PL 211 755 B1

<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	15

aagacatttt ggattctaac

<210>	15
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<4 00>	16

tatcatgaag tctttgtatg

<210>	17
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<4 00>	17

gatggagaca cattctcagg

<210>	18
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<4 00>	18

gacattgtga tgacccagtc 20

<210>	19
<211>	20
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1 <400> 19 ttaacactca ttcctgttga <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 20 gactgggtca tcacaatgtc <210> 21 <211> 1386 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

<400> 21 atgaacttcg	ggctcagctt	gattttcctt	gtccttgttt	taaaaggtgt	ccagtgtgaa	60
gtgatgctgg	tggagtctgg	gggaggctta	gtgaagcctg	gagggtccct	gaaactctcc	120
tgtgcagcct	ctggattcac	tttcagtagc	tatgtaatgt	cttgggttcg	ccagactccg	180
gagaagaggc	tggagtgggt	cgcaaccatt	agtagtggtg	gtagttacac	ctactatcca	240
gacagtgtga	aggggcgatt	caccatctcc	agagacaatg	ccaagaacac	cctgtacctg	300
caaatgagca	gtctgaggtc	tgaggacacg	gccatgtatt	actgtgcaag	acggggggac	360
tctatgatta	cgacggacta	ctggggccaa	ggcaccactc	tcacagtctc	ctcagccaaa	420
acgacacccc	catctgtcta	tccactggcc	cctggatctg	ctgcccaaac	taactccatg	480
gtgaccctgg	gatgcctggt	caagggctat	ttccctgagc	cagtgacagt	gacctggaac	540
tctggatccc	tgtccagcgg	tgtgcacacc	ttcccagctg	tcctgcagtc	tgacctctac	600
actctgagca	gctcagtgac	tgtcccctcc	agcacctggc	ccagcgagac	cgtcacctgc	660
aacgttgccc	acccggccag	cagcaccaag	gtggacaaga	aaattgtgcc	cagggattgt	720
ggttgtaagc	cttgcatatg	tacagtccca	gaagtatcat	ctgtcttcat	cttcccccca	780
aagcccaagg	atgtgctcac	cattactctg	actcctaagg	tcacgtgtgt	tgtggtagac	840
atcagcaagg	atgatcccga	ggtccagttc	agctggtttg	tagatgatgt	ggaggtgcac	900

PL 211 755 B1

acagctcaga	cgcaaccccg	ggaggagcag	ttcaacagca	ctttccgctc	agtcagtgaa	960
cttcccatca	tgcaccagga	ctggctcaat	ggcaaggagt	tcaaatgcag	ggtcaacagt	1020
gcagctttcc	ctgcccccat	cgagaaaacc	atctccaaaa	ccaaaggcag	accgaaggct	1080
ccacaggtgt	acaccattcc	acctcccaag	gagcagatgg	ccaaggataa	agtcagtctg	1140
acctgcatga	taacagactt	cttccctgaa	gacattactg	tggagtggca	gtggaatggg	1200
cagccagcgg	agaactacaa	gaacactcag	occatcatgg	acacagatgg	ctcttacttc	1260
gtctacagca	agctcaatgt	gcagaagagc	aactgggagg	caggaaatac	tttcacctgc	1320
tctgtgttac	atgagggcct	gcacaaccac	catactgaga	agagcctctc	ccactctcct	1380

ggtaaa 1386 <210> 22 <211> 705 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

<400> 22 atgaagtctt	tgtatgtgtt	agtgtataca	cattatctgt	ttctgtttgc	aggtgttgaa	60
ggagacattg	tgatgaccca	gtctcacaaa	ttcatgtcca	catcagtagg	agacagggtc	120
agcatcacct	gcaaggccag	tcaggatgtg	ggtactgctg	tagcctggta	tcaacagaaa	180
ccagggcaat	ctcctaaact	actgatttac	tgggcatcca	cccggcacac	tggagtccct	240
gatcgcttca	caggcagtgg	atctgggaca	gatttcactc	tcaccattag	caatgtgcag	300
tctgaagact	tggcagatta	tttctgtcag	caatatagca	gctatcggac	gttcggtgga	360
ggcaccaagc	tggaaatcaa	acgggctgat	gctgcaccaa	ctgtatccat	cttcccacca	420
tccagtgagc	agttaacatc	tggaggtgcc	tcagtcgtgt	gcttcttgaa	caacttctac	480
cccaaagaca	tcaatgtcaa	gtggaagatt	gatggcagtg	aacgacaaaa	tggcgtcctg	540
aacagttgga	ctgatcagga	cagcaaagac	agcacctaca	gcatgagcag	caccctcacg	600
ttgaccaagg	acgagtatga	acgacataac	agctatacct	gtgaggccac	tcacaagaca	660
tcaacttcac	ccattgtcaa	gagcttcaac	aggaatgagt	gttaa		705
<210> 23
<211> 462
<212> PRT

PL 211 755 B1 <213> konstrukt syntetyczny <400> 23

Met ,

Asn

Phe

Gly :

Leu :

Ser :

Leu

Ile

Phe

Leu

Val

Leu

Val

Leu

Lys

Gly

1

5

10

15

Val

Gin

Cys

Glu

Val :

Met

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Gly

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Ser

Ser

Tyr

Val

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Val

Ala

Thr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Pro

65

70

75

80

Asp

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

85

90

95

Thr

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

100

105

110

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Met

Ile

Thr

Thr

Asp

Tyr

Trp

115

120

125

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

130

135

140

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn

Ser

Met

145

150

155

160

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

165

170

175

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

180

185

190

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

Thr

Val

195

200

205

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Glu

Thr

Val

Thr

Cys

Asn

Val

Ala

His

210

215

220

Pro

Ala

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

Ile

Val

Pro

Arg

Asp

Cys

225

230

235

240

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys

Thr

Val

Pro

Glu

Val

Ser

Ser

Val

Phe

245

250

255

Ile

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

Ile

Thr

Leu

Thr

Pro

260

265

270

Lys

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Ile

Ser

Lys

Asp

Asp

Pro

Glu

Val

275

280

285

PL 211 755 B1

Gin

Phe 290

Ser

Trp

Phe

Val

Asp 295

Asp

Val

Glu

Val

His 300

Thr

Ala

Gin

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

Val

Ser

Glu

305

310

315

320

Leu

Pro

Ile

Met

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

Lys

Cys

325

330

335

Arg

Val

Asn

Ser

Ala

Ala

Phe

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

340

345

350

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

Pro

Pro

355

360

365

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Met

Ile

370

375

380

Thr

Asp

Phe

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

Trp

Asn

Gly

385

390

395

400

Gin

Pro

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile

Met

Asp

Thr

Asp

405

410

415

Gly

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Ser

Asn

Trp

420

425

430

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr

Phe

Thr

Cys

Ser

Val

Leu

His

Glu

Gly

Leu

His

435

440

445

Asn

His

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

450

455

4 60

<210> 24

<211> 234

<212> PRT

<213> konstrukt

syntetyczny

<400>

24

Met

Lys

Ser

Leu

Tyr

Val

Leu

Val

Tyr

Thr

His

Tyr

Leu

Phe

Leu

Phe

1

5

10

15

Ala

Gly

Val

Glu

Gly

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

His

Lys

Phe

Met

20

25

30

Ser

Thr

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Ser

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

35

40

45

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

50

55

60

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

ΊΟ 75 80

PL 211 755 B1

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly Ser 85

Gly

Ser

Gly Thr Asp 90

Phe

Thr

Leu

Thr 95

Ile

Ser

Asn

Val

Gin

Ser

Glu

Asp

Leu

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Tyr

100

105

110

Ser

Ser

Tyr

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

115

120

125

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

I le

Phe

Pro

Pro

Ser

Ser

Glu

Gin

130

135

140

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

3 4 5

150

155

160

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

Gin

165

170

175

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

180

185

190

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

Glu

Tyr

Glu

Arg

195

200

205

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro

210

215

220

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

225

230

<210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny <400> 25

Ser Tyr Val Met Ser
1	5
<210>	26
<211>	17
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny
<400>	26
Thr Ile Ser Ser 1	Gly Gly Ser Tyr 5	Thr Tyr Tyr 10	Pro Asp Ser Val Lys 15

Gly

PL 211 755 B1

<210>	27
<211>	10
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny
<4Ο0>	27
Arg Gly Asp Ser 1	Met Ile Thr Thr 5	Asp	Tyr 10
<210>	28
<211>	11
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny
<400>	28
Lys Ala Ser Gin 1	Asp Val Gly Thr 5	Ala	Val Ala 10
<210>	29
<211>	7
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny
<400>	29
Trp Ala Ser Thr 1	Arg His Thr 5
<210>	30
<211>	8
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny
<400>	30
Gin Gin Tyr Ser 1	Ser Tyr Arg Thr 5

PL 211 755 B1 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny

<400> 31

Glu 1

Val

Met

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Val

Met

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Thr 50

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly 55

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr 60

Pro

Asp

Ser

Val

Lys 55

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Arg

Gly 100

Asp

Ser

Met

Ile

Thr 105

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

<210> 32 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 32 ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag 50 caacagctac aggtgtccac 80 <210> 33 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1

<210> 37 <211> 64 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1 <400> 37 ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc 60 ggtc 64 <210> 38 <211> 60 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 38 ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa 60 <210> 39 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 39 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg <210> 40 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 40 tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag 80 <210> 41 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1

<210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1 <400> 45 gaccgatggg cccttggtgg a 21 <210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny <400> 46

Asp 1

Ile Val Met

Thr 5

Gin Ser

Pro

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

Gly

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

115

120

125

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

130

135

140

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

145

150

155

160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

165

170

175

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

180

185

190

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

195

200

205

Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 47

PL 211 755 B1 <211> 34 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 47 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct 34

<210>	48
<211>	45
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 48 cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac 45

<210>	49
<211>	60
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	49

gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga 60

<210>	50
<211>	48
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 50 ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc 48

<210>	51
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

100

PL 211 755 B1

<400> 51 agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag	tagtttagga	gctttccctg	gtttctg	57
<210>	52
<211>	48
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 52 tgggcatcca cccggcacac tggggtccca	agcaggttta	gtggcagt		48
<210>	53
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 53 ataactacta tattgctgac agtaataggt	tgcaaaatcc	tccggctgca	gactagagat	60
ggt					63
<210>	54
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 54 cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt	caaggcacca	aggtggaaat	caaacggact	60
gtg					63

<210> 55 <211> 711 <212> DNA <213> konst-rukt syntetyczny

PL 211 755 B1

101 <4 Ο 0> 55

atggagacag	acacaatcct	gctatgggtg	ctgctgctct	gggttccagg	ctccactggt	60
gacattgtga	tgacccaatc	tccaagttct	ttgtctgcat	ctgtggggga	cagggtcacc	120
atcacctgca	aggccagtca	ggatgtgggt	actgctgtag	cctggtatca	acagaaacca	180
gggaaagctc	ctaaactact	gatttactgg	gcatccaccc	ggcacactgg	ggtcccaagc	240
aggtttagtg	gcagtgggtc	tgggacagac	ttcaccctca	ccatctctag	tctgcagccg	300
gaggattttg	caacctatta	ctgtcagcaa	tatagtagtt	atcggacgtt	cggtcaaggc	360
accaaggtgg	aaatcaaacg	gactgtggct	gcaccatctg	tcttcatctt	cccgccatct	420
gatgagcagt	tgaaatctgg	aactgcctct	gttgtgtgcc	tgctgaataa	cttctatccc	480
agagaggcca	aagtacagtg	gaaggtggat	aacgccctcc	aatcgggtaa	ctcccaggag	540
agtgtcacag	agcaggacag	caaggacagc	acctacagcc	tcagcagcac	cctgacgctg	600
agcaaagcag	actacgagaa	acacaaagtc	tacgcctgcg	aagtcaccca	tcagggcctg	660
agctcgcccg	tcacaaagag	cttcaacagg	ggagagtgtt	agtaagaatt	c	711

<210> 56 <211> 119 <212> PRT <213> konstrukt syntetyczny

<401

3>

56

Glu

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Gin

Pro

Gly

Gly

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Val

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Thr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Met

Ile

Thr

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

Ser

115

102

PL 211 755 B1 <210> 57 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 57 tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60 ctctcctgtg cagcctctgg 80 <210 58 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400 58 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga 60 gtggacacct gtagctgttg 80 <210 59 <211> 119 <212> PRT ^<213> konstrukt syntetyczny <400 59

Glu 1

Val

Met Leu

Val 5

Glu

Ser Gly Gly Gly Leu Val 10

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Val

Met

Ser

Trp

val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Thr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Ser

Ser

Leu

Arg

Al a

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

PL 211 755 B1

103

Ala Arg	Arg	Gly 100	Asp Ser Met Ile	Thr 105	Thr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110
Thr Leu	Val 115	Thr	Val Ser Ser
<210>	60
<211>	119
<212>	PRT
<213>	konstrukt	syntetyczny

<400>

60

Glu 1

Val

Met

Leu

Val 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly 10

Leu

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser 30

Ser

Tyr

Val

Met

Ser 35

Trp

Val

Arg

Gin

Thr 40

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Thr 50

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly 55

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr 60

Pro

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Arg

Gly 100

Asp

Ser

Met

Ile

Thr 105

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly 110

Gin

Gly

Thr

Leu

Val 115

Thr

Val

Ser

Ser

<210>	61
<211>	119
<212>	PRT
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 61

Glu

Val

Met

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Gly

Gly

Leu

Val

Lys

Pro

Gly

Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Lys

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

104

PL 211 755 B1

Val

Met Ser 35

Trp Val Arg

Gin

Thr 40

Pro Glu

Lys

Arg

Leu 45

Glu

Trp

val

Ala

Thr

Ile

Ser

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Tyr

Pro

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg

Asp

Asn

Ala

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Met

Tyr

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Arg

Gly

Asp

Ser

Met

Ile

Thr

Thr

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ser

115 <210> 62 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 62 tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 80 <210> 63 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 63 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 <210> 64 <211> 80 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 64

PL 211 755 B1

105

106

PL 211 755 B1 <400> 68 ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc

ggtc
<210>	69
<211>	80
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 69 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg

<210>	70
<211>	80
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 70 ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt

<210>	71
<211>	70
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 71 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta

<210>	72
<211>	212
<212>	PRT

PL 211 755 B1

107

<2ΐ;	konstrukt	syntetyczny
<400> 72
Asp	Ile Gin Met	Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1		5 10 15
Asp	Arg Val Thr	Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
	20	25 30
Val	Ala Trp Tyr	Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
	35	40 45
Tyr	Trp Ala Ser	Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
	50	55 60
Ser	Gly Ser Gly	Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
65		70 75 80
Glu	Asp Phe Ala	Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
		85 90 95
Phe	Gly Gin Gly	Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
	100	105 110
Ser	Val Phe Ile	Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr
	115	120 125
Ala	Ser Val Val	Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
	130	135 140
Val	Gin Trp Lys	Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145		150 155 160
Ser	Val Thr Glu	Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
		165 170 175
Thr	Leu Thr Leu	Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
	180	185 190
Cys	Glu Val Thr	His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
	195	200 205
Asn	Arg Gly Glu
	210
<210> 73
<211> 213
<212> PRT
<213> konstrukt	syntetyczny

<400> 73

108

PL 211 755 B1

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Asp

Val

Gly 30

Thr

Ala

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Trp 50

Ala

Ser

Thr

Arg

His 55

Thr

Gly

Val

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin 90

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Arg 95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 100

Thr

Lys

Val

Glu

Ile 105

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 110

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 115

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 120

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 130

Val

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 145

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 150

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 155

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 165

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser 170

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 195

Thr

His

Gin

Gly

Leu 200

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 205

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg 210

Gly

Glu

Cys

<210>

74

<211>

213

<212>

PRT

<213> konstrukt syntetyczny

<400> 74

Asp Ile Val 1

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp Arg Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Asp

Val

Gly 30

Thr

Ala

PL 211 755 B1

109

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Trp 50

Ala

Ser

Thr

Arg

His 55

Thr

Gly

Val

Pro

Asp 60

Arg

Phe

Thr

Gly

Ser 65

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp 70

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile 75

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro 80

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr 85

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin 90

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Arg 95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 100

Thr

Lys

Val

Glu

Ile 105

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 110

Aia

Pro

Ser

Val

Phe 115

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 120

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 130

Val

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 145

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 150

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 155

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 165

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser 170

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 195

Thr

His

Gin

Gly

Leu 200

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 205

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg 210

Gly

Glu

Cys

<210>

75

<211> :

213

<212>

PRT

<213> konstrukt

syntetyczny

<400>

75

Asp 1

Ile

Val

Met

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Asp

Arg

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Asp

Val

Gly 30

Thr

Ala

Val

Ala

Trp 35

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro 40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys 45

Leu

Leu

Ile

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

55 60

110

PL 211 755 B1

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

100

105

110

Ser

Val

Phe 115

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 120

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 130

Val

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 145

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 150

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 155

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 165

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser 170

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 195

Thr

His

Gin

Gly

Leu 200

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 205

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg 210

Gly

Glu

Cys

<210>

76

<211>

213

<212>

PRT

<213> konstrukt

syntetyczny

<400> Ί

'6

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

His

Lys

Phe

Met

Ser

Thr

Ser

Val

Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Ser

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

Gly

Thr

Ala

20

25

30

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

His

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Thr

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Asn

Val

Gin

Ser

65

70

75

80

Glu

Asp

Leu

Ala

Asp

Tyr

Phe

Cys

Gin

Gin

Tyr

Ser

Ser

Tyr

Arg

Thr

85

90

95

PL 211 755 B1

111

Phe

Gly

Gly

Gly 100

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile 105

Lys

Arg

Ala

Val

Ala 110

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 115

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 120

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 125

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 130

Val

Val

Cys

Leu

Leu 135

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 140

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 145

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 150

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser 155

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 160

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 165

Asp

Ser

Lys

Asp

Gly 170

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 175

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 180

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 185

Glu

Lys

His

Lys

Val 190

Tyr

Al a

Cys

Glu

Val 195

Thr

His

Gin

Gly

Leu 200

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 205

Lys

Ser

Phe

Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210>	77
<211>	60
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	77

gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60 <210> 78 <211> 65 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60 ccagg 65 <210> 79 <211> 69 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

112

PL 211 755 B1

<400> 79 cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag	aactagatga	gaggatgctt	60
cttaagctt			69
<210>	80
<211>	67
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 80 ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct	ttgtctgcat	ctgtggggga	60
cagggtc			67
<210>	81
<211>	54
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct	ggaacccaga	gcag	54
<210>	82
<211>	67
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg	tagcctggta	ccaacagaaa	60
ccaggaa			67

<210> 83 <211> 72 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny

PL 211 755 B1

113 <400> 83

tacagcagta cccacatcct gactggcctt	gcaggtgatg	gtgaccctgt	cccccacaga	60
tgcagacaaa ga				72
<210>	84
<211>	71
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 84 aagcacccaa actcctcatc tattgggcat	ccacccggca	cactggggtc	ccagataggt	60
ttacaggcag t				71
<210>	85
<211>	72
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 85 cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat	gaggagtttg	ggtgcttttc	ctggtttctg	60
ttggtaccag gc				72
<210>	86
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400> 86 gggtctggga cagacttcac cctcaccatc	tctagtctgc	agccggagga	ttttgcaacc	60

tat 63 <210> 87 <211> 60 <212> DNA

114

PL 211 755 B1 ^<213> konstrukt syntetyczny <400> 87 actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac

<210>	88
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny

<400> 88 tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaaę gcaccaaggt ggaaatc <210> 89 <211> 57 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 89 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac <210> 90 <211> 51 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 90 aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g <210> 91 <211> 63 <212> DNA <213> konstrukt syntetyczny <400> 91

PL 211 755 B1

115

116

PL 211 755 B1

<210>	96
<211>	57
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	96

cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag 57

<210>	97
<211>	51
<212>	DNA

<213> Jcanstrukt syntetyczny <400> 97 tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a 51

<210>	98
<211>	51
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	98

tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c 51

<210>	99
<211>	49
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	99

aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc 49 <210> 100 <211> 45

PL 211 755 B1

117

<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	100

aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc 45

<210>	101
<211>	30
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	101

agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa 30

<210>	102
<211>	63
<212>	DNA
<213>	konstrukt syntetyczny
<400>	102

gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc 60 gaa 63

118

PL 211 755 B1

Claims (99)

1. Oczyszczone przeciwcia ło, które wiąże wybiórczo receptor DR4 dla TRAIL i nie wiąże receptora DR5, DcR1 lub DcR2, przy czym wspomniane przeciwciało ma tą samą specyficzność epitopową co przeciwciało monoklonalne wytworzone przez hybrydomę 2E12 posiadającą numer dostępu ATCC PTA-3798 i przy czym wspomniane przeciwciało w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w komórkach docelowych wyrażających DR4, i przy czym ta aktywność indukowania apoptozy in vitro jest scharakteryzowana przez mniej niż 50% żywotność komórek docelowych przy stężeniu przeciwciała mniejszym niż około 0,1 μg/ml.

2. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym.

3. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że DR4 jest ludzkim DR4.

4. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że komórką docelową jest komórka nowotworowa.

5. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że komórką docelową jest komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

6. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że komórką docelową jest aktywowany limfocyt.

7. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem monoklonalnym i jest wytwarzane przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

8. Oczyszczone przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest humanizowane.

9. Sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR4, znamienny tym, że obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że komórką docelową jest komórka nowotworowa.

11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że komórką docelową jest komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że komórką docelową jest aktywowany limfocyt.

13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że komórką docelową jest komórka zakażona wirusem.

14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

20. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel.

21. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

22. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor TRAIL DR5, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro komórek docelowych wyrażających DR5.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym.

25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

PL 211 755 B1

119

26. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

27. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

28. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel.

29. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

30. Sposób wybiórczego indukowania apoptozy w komórkach docelowych wyrażających DR4, znamienny tym, że obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8.

31. Sposób hamowania proliferacji komórek docelowych wyrażających DR4, znamienny tym, że obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek z terapeutyczną ilością przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że doprowadzenie do kontaktu ma miejsce in vitro.

33. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że komórką docelową jest komórka nowotworowa.

34. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że komórką docelową jest komórka maziówkowa w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

35. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że komórką docelową jest aktywowany limfocyt.

36. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

37. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym.

38. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

39. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

40. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

41. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

42. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel.

43. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

44. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor DR5 dla TRAIL, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro komórek docelowych wyrażających DR5.

45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że obejmuje ponadto napromieniowanie komórek docelowych.

46. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że obejmuje ponadto doprowadzenie do kontaktu komórek docelowych z czynnikiem terapeutycznym.

47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

48. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

49. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

50. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel.

51. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

120

PL 211 755 B1

52. Sposób hamowania proliferacji komórek docelowych wyrażających DR4, znamienny tym, że obejmuje etap in vitro doprowadzenia do kontaktu komórek docelowych z terapeutyczną ilością przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8.

53. Kompozycja znamienna tym, że zawiera terapeutyczną ilość przeciwciała jak zdefinowano w zastrz. 1 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

54. Kompozycja znamienna tym, że zawiera terapeutyczną ilość przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.

55. Zastosowanie przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała selektywnie indukuje apoptozę komórek nowotworowych u tego osobnika.

56. Zastosowanie według zastrz. 55, znamienne tym, że kompozycja obejmuje ponadto terapeutyczną ilości przeciwciała, które wiąże specyficznie receptor TRAIL DR5, gdzie to drugie przeciwciało, w swojej rozpuszczalnej postaci ma aktywność indukowania apoptozy in vivo i in vitro w złośliwych komórkach nowotworowych wyrażających DR5.

57. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że kompozycja obejmuje ponadto czynnik terapeutyczny.

58. Zastosowanie według zastrz. 57, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

59. Zastosowanie według zastrz. 37, znamienne tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

60. Zastosowanie według zastrz. 57, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

61. Zastosowanie według zastrz. 57, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

62. Zastosowanie według zastrz. 55, znamienne tym, że obejmuje ponadto poddanie osobnika radioterapii.

63. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że obejmuje ponadto podanie osobnikowi czynnika terapeutycznego.

64. Zastosowanie według zastrz. 63, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest czynnik chemioterapeutyczny.

65. Zastosowanie według zastrz. 63, znamienne tym, że czynnik terapeutyczny jest wybrany z grupy składającej się z bleomycyny, karboplatyny, chlorambucylu, cisplatyny, kolchicyny, cyklofosfamidu, daunorubicyny, aktynomycyny, dietylostylbestrolu doksyrubicyny, etopozydu, 5-fluorouracylu, floksurydyny, melfalanu, metotreksatu, mitomycyny, 6-merkaptopuryny, tenipozydu, 6-tioguaniny, winkrystyny i winblastyny.

66. Zastosowanie według zastrz. 63, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest doksorubicyna.

67. Zastosowanie według zastrz. 63, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest paklitaksel.

68. Zastosowanie według zastrz. 63, znamienne tym, że czynnikiem terapeutycznym jest metotreksat.

69. Zastosowanie według zastrz. 55, znamienne tym, że obejmuje ponadto poddawanie osobnika radioterapii.

70. Zastosowanie według zastrz. 56, znamienne tym, że obejmuje ponadto poddawanie osobnika radioterapii.

71. Zastosowanie przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8 do wytarzania kompozycji do leczenia osobnika z nowotworem, przy czym terapeutyczna ilość tego przeciwciała selektywnie indukuje apoptozę komórek nowotworowych u osobnika.

72. Zastosowanie przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1 do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z chorobą zapalną albo chorobą autoimmunologiczną, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR4.

73. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że komórkami docelowymi są aktywowane komórki immunologiczne.

PL 211 755 B1

121

74. Zastosowanie według zastrz. 73, znamienne tym, że aktywowanymi komórkami immunologicznymi są aktywowane limfocyty.

75. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że komórkami docelowymi są komórki maziówkowe w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

76. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że kompozycja obejmuje ponadto terapeutyczną ilość drugiego przeciwciała, które indukuje apoptozę komórek docelowych.

77. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że kompozycja obejmuje ponadto terapeutyczną ilość czynnika terapeutycznego stosowanego w leczeniu choroby zapalnej albo choroby autoimmunologicznej.

78. Zastosowanie według zastrz. 76, znamienne tym, że kompozycja obejmuje ponadto terapeutyczną ilość czynnika terapeutycznego stosowanego w leczeniu choroby zapalnej albo choroby autoimmunologicznej.

79. Zastosowanie przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 8 do wytwarzania kompozycji do leczenia osobnika z chorobą zapalną albo chorobą autoimmunologiczną, przy czym terapeutyczna ilość przeciwciała wybiórczo indukuje apoptozę komórek docelowych mających receptory DR4.

80. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje immunoglobulinowy łańcuch ciężki przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

81. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 80, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

82. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 80, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową koduje łańcuch ciężki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

83. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 80, znamienny tym, że kodowany łańcuch ciężki jest humanizowany.

84. Wektor znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 83 i element regulacyjny połączony funkcjonalnie z tym kwasem nukleinowym.

85. Hodowana komórka znamienna tym, że zawiera wektor jak zdefiniowano w zastrz. 84.

86. Wyizolowany kwas nukleinowy zawierający sekwencję nukleotydową, która koduje immunoglobulinowy łańcuch lekki przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

87. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 86, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową koduje łańcuch lekki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

88. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 86, znamienny tym, że sekwencja nukleotydową koduje łańcuch lekki immunoglobuliny wyrażany przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

89. Wyizolowany kwas nukleinowy według zastrz. 86, znamienny tym, że kodowany łańcuch lekki jest humanizowany.

90. Wektor znamienny tym, że zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 89 i element regulacyjny połączony funkcjonalnie z tym kwasem nukleinowym.

91. Hodowana komórka znamienna tym, że zawiera wektor jak zdefiniowano w zastrz. 90.

92. Oczyszczony polipeptyd znamienny tym, że zawiera sekwencję aminokwasową immunoglobulinowego łańcucha ciężkiego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

93. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 92, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

94. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 92, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha ciężkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

95. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 92, znamienny tym, że łańcuch ciężki immunoglobuliny jest humanizowany.

96. Oczyszczony polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową immunoglobulinowego łańcucha lekkiego przeciwciała jak zdefiniowano w zastrz. 1.

97. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 96, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798.

122

PL 211 755 B1

98. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 96, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową jest sekwencja aminokwasowa łańcucha lekkiego immunoglobuliny wyrażanego przez hybrydomę 2E12 o numerze dostępu ATCC PTA-3798 z jedną lub większą liczbą konserwatywnych podstawień aminokwasowych.

99. Oczyszczony polipeptyd według zastrz. 96, znamienny tym, że łańcuch lekki immunoglobuliny jest humanizowany.