ES2325305T3 - Anticuerpos dr4 quimericos y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-DR4 quimérico aislado que comprende: (a) un dominio variable de cadena ligera, dominio variable que comprende los residuos de aminoácido 20 a 126 de la SEC ID N.º 9; (b) un dominio CH1 de cadena ligera que comprende los residuos de aminoácido 127 a 233 de la SEC ID N.º 9; (c) un dominio variable de cadena pesada que comprende los residuos de aminoácido 20 a 145 ó 22 a 145 de la SEC ID N.º 12; y (d) los dominios CH1, CH2 y CH3 de cadena pesada que comprenden los residuos de aminoácido 146 a 476 de la SEC ID N.º 1

Description

Anticuerpos DR4 quiméricos y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a anticuerpos frente a DR4 según lo definido en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

Se cree que el control de los números de células en mamíferos está determinado, en parte, por un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular. Una forma de muerte celular, algunas veces denominada muerte celular necrótica, se caracteriza comúnmente por ser una forma patológica de muerte celular como resultado de algún traumatismo o lesión celular. Por el contrario, hay otra forma "fisiológica" de muerte celular que habitualmente tiene lugar de un modo ordenado o controlado. Este modo ordenado o controlado de muerte celular se denomina habitualmente "apóptosis" [véase, p. ej., Barr et al. Bio/Technology, 12:487-493 (1994); Steller et al., Science, 267:1445-1449 (1995)]. La muerte celular apoptótica ocurre de forma natural en muchos procesos fisiológicos que incluyen el desarrollo embrionario y la selección clonal del sistema inmunológico [Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. Sin embargo, la disminución de los niveles de muerte celular apoptótica se ha asociado con una variedad de condiciones patológicas que incluyen el cáncer, el lupus y la infección por el virus del herpes [Thompson, Science, 267:1456-1462 (1995)]. El aumento de los niveles de muerte celular apoptótica puede estar asociado a una variedad de otras condiciones patológicas, incluyendo el SIDA, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, la retinitis pigmentaria, la degeneración cerebelosa, la anemia aplástica, el infarto de miocardio, el derrame cerebral, la lesión por reperfusión y la enfermedad del hígado inducida por toxinas [véase Thompson, supra].

La muerte celular apoptótica está comúnmente acompañada por uno o más cambios bioquímicos y morfológicos característicos en células, tales como la condensación del citoplasma, la pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Se cree que hay una variedad de señales extrínsecas e intrínsecas que desencadenan o inducen tales cambios celulares morfológicos y bioquímicos [Raff, Nature, 356:397-400 (1992); Steller, supra; Sachs et al., Blood, 82:15 (1993)]. Por ejemplo, pueden ser desencadenados por estímulos hormonales, tales como las hormonas glucocorticoides para timocitos inmaduros, así como la retirada de ciertos factores de crecimiento [Watanabe-Fukunaga et al., Nature, 356:314-317 (1992)]. También se ha publicado de que algunos oncogenes identificados tales como myc, rel y E1A, así como supresores tumorales, como el p53, tienen un papel en la inducción de la apóptosis. Asimismo, se ha observado que ciertos fármacos quimioterapéuticos y algunas formas de radiación tienen actividad inductora de la apóptosis [Thompson, supra].

Se han identificado diversas moléculas, tales como el factor-\alpha de la necrosis tumoral ("FNT-\alpha"), factor-\beta de la necrosis tumoral ("FNT-\beta" o "linfotoxina-\beta"), linfotoxina-\beta ("LT-\beta"), el ligando CD30, el ligando CD27, el ligando CD40, el ligando OX-40, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95) y el ligando Apo-2 (también denominado TRAIL), como miembros de la familia de los factores de la necrosis tumoral ("FNT") de las citoquinas [Véase, p. ej., Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); WO 97/25428 publicado el 17 de julio de 1997; WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690(1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992)]]. Entre estas moléculas, se ha publicado que el FNT-\alpha, el FNT-\beta, el ligando CD30, el ligando 4-1BB, el ligando Apo-1 y el ligando Apo-2 (TRAIL) están implicados en la muerte celular apoptótica. Se ha publicado que tanto el FNT-\alpha como el FNT-\beta inducen la muerte apoptótica a células tumorales susceptibles [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986): Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]. Zheng et al. han descrito que el FNT-\alpha está implicado en la apóptosis tras una estimulación de células T positivas en CD8 [Zheng et al., Nature, 377:348-351 (1995)]. Otros investigadores han publicado que el ligando CD30 puede estar implicado en la eliminación de células T auto-reactivas en el timo [Amakawa et al., "Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death", N.º de sumario 10, (1995)].

Las mutaciones de los genes del receptor o ligando Fas/Apo-1 (denominados 1pr y gld, respectivamente) han estado asociadas con algunos trastornos autoinmunes, lo que indica que el ligando Apo-1 puede desempeñar un papel en la regulación de la eliminación clonal de los linfocitos auto-reactivos de la periferia [Krammer et al., Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata et al., Science, 267:1449-1456 (1995)]. También se ha publicado que el ligando Apo-1 induce la apóptosis tras una estimulación en linfocitos T positivos en CD4 y en linfocitos B, y que puede estar implicado en la eliminación de linfocitos activados cuando su función ya no es necesaria [Krammer et al., supra; Nagata et al., supra]. Se ha publicado que los anticuerpos monoclonales de ratón agonistas que se unen específicamente al receptor Apo-1 presentan una actividad de destrucción celular que es comparable con o similar a la del FNT-\alpha [Yonehara et al., J. Exp. Med., 169:1747-1756 (1989)].

Se cree que la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por tales citoquinas de la familia de los FNT es iniciada por su unión a receptores celulares específicos. Se han identificado dos receptores de FNT distintos de aproximadamente 55 kDa (RFNT1) y de 75 kDa (RFNT2) [Hohmann et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); EP 417.563 publicado el 20 de marzo de 1991] y se han aislado y caracterizado ADNc de ser humano y de ratón correspondientes a ambos tipos de receptores [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361(1990); Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]. Se han asociado polimorfismos extensos con ambos genes de receptores de FNT [véase, p. ej., Takao et al., Immunogenetics, 37:199-203 (1993)]. Ambos RFNT comparten la estructura común de los receptores de la superficie celular que incluyen las regiones extracelular, transmembrana e intracelular. Las partes extracelulares de ambos receptores se encuentran de manera natural también como proteínas de unión a FNT solubles [Nophar, Y. et al., EMBO J., 9:3269 (1990); y Kohno, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:8331 (1990)]. Más recientemente, Hale et al. publicaron la clonación de receptores de FNT solubles recombinantes [J. Cell. Biochem. Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)].

La parte extracelular de los RFNT de tipo 1 y de tipo 2 (RFNT1 y RFNT2) contiene un patrón repetitivo de secuencias de aminoácidos de cuatro dominios ricos en cisteína (CRD, Cysteine-Rich Domain) designados 1 a 4, partiendo del terminal de NH_{2}. Cada CRD tiene una longitud de aproximadamente 40 aminoácidos y contiene de 4 a 6 residuos de cisteína en las posiciones que están bien conservadas [Schall et al., supra; Loetscher et al., supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra]. En el RFNT1, los límites aproximados de los cuatro CRD son los siguientes: CRD1: aminoácidos del 14 al aproximadamente 53; CRD2: aminoácidos del aproximadamente 54 al aproximadamente 97; CRD3: aminoácidos del aproximadamente 98 al aproximadamente 138; CRD4: aminoácidos del aproximadamente 139 al aproximadamente 167. En el RFNT2, CRD1 incluye los aminoácidos del 17 al aproximadamente 54; CRD2: aminoácidos del aproximadamente 55 al aproximadamente 97; CRD3: aminoácidos del aproximadamente 98 al aproximadamente 140; CRD4: aminoácidos del aproximadamente 141 al aproximadamente 179 [Banner et al., Cell, 73:431-435(1993)]. El papel potencial de los CRD en la unión de los ligandos también está descrito por Banner et al., supra.

Existe un patrón repetitivo similar de CRD en otras varias proteínas de la superficie celular que incluyen el receptor del factor de crecimiento nervioso p75 (RFCN) [Johnson et al., Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)], el antígeno de células B CD40 [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)], el antígeno de células T OX40 [Mallett et al., EMBO J., 9:1063 (1990)] y el antígeno de Fas [Yonehara et al., supra e Itoh et al., Cell, 66:233-243 (1991)]. También se encuentran CRD en los RFNT solubles (RFNTs) como las proteínas T2 de los virus de la viruela de Shope y del mixoma [Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al., Virology, 184:370 (1991)]. El alineamiento óptimo de estas secuencias indica que las posiciones de los residuos de cisteína están bien conservadas. A veces, estos receptores se denominan colectivamente como miembros de la superfamilia de los receptores de los FNT/FCN. Estudios recientes sobre el RFCN p75 demostraron que la eliminación del CRD1 [Welcher, A. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88:159-163 (1991)] o una inserción de 5 aminoácidos en este dominio [Yan, H. y Chao, M. V., J. Biol. Chem., 266:12099-12104 (1991)] tenían poco o ningún efecto sobre la unión al FCN (Yan, H. y Chao, M.V., supra]. El RFCN p75 contiene un tramo rico en prolina de aproximadamente 60 aminoácidos entre su CRD4 y la región transmembrana que no está implicado en la unión al FCN [Peetre, C. et al., Eur. J. Hematol., 41:414-419 (1988); Seckinger, P. et al., J. Biol. Chem., 264:11966-11973 (1989);
Yan, H. y Chao, M.V., supra]. Se encuentra una región rica en prolina similar en el RFNT2, pero no en el TNFR1.

Itoh et al., revelan que el receptor Apo-1 puede señalizar una muerte celular apoptótica similar a la señalizada por el RFNT1 de receptor 55 kDa [Itoh et al., supra]. También se ha publicado que la expresión del antígeno Apo-1 es regulada secuencia abajo junto con la del RFNT1 cuando las células son tratadas bien con FNT-\alpha o anticuerpo monoclonal de ratón frente a Apo-1 [Krammer et al.,supra; Nagata et al., supra]. Por consiguiente, algunos investigadores sostienen la hipótesis de que las líneas celulares que co-expresan ambos receptores Apo-1 y RFNT1 pueden mediar la muerte celular por las vías de señalización comunes [Id.].

Los ligandos de la familia de los FNT identificados hasta la fecha, con la excepción de la linfotoxina-\alpha, son comúnmente proteínas transmembranales de tipo II cuyo terminal C es extracelular. Por el contrario, la mayoría de los receptores de la familia de receptores de FNT (RFNT) identificados hasta la fecha son comúnmente proteínas transmembranales de tipo I. Sin embargo, en ambas familias de ligandos y receptores de los FNT, la homología identificada entre los miembros de las familias se ha encontrado principalmente en el dominio extracelular (ECD, Extracellular Domain). Varias citoquinas de la familia de los FNT, incluyendo el FNT-\alpha, el ligando Apo-1 y el ligando CD40, son escindidas proteolíticamente en la superficie celular, formando la proteína resultante en cada caso comúnmente una molécula homotrimérica que funciona como una citoquina soluble. Las proteínas de la familia de los receptores de los FNT también son habitualmente escindidas proteolíticamente para liberar los ECD de receptores solubles que pueden funcionar como inhibidores de las citoquinas conocidas.

Recientemente, se han identificado otros miembros de la familia de los RFNT. Tales miembros recién identificados de la familia de los RFNT incluyen CAR1, HVEM y la osteoprotegerina (OPG) [Brojatsch et al., Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al., Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al., J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997); Simonet et al., Cell, 89:309-319(1997)]. A diferencia de otras moléculas de tipo RFNT conocidas, Simonet et al., supra, publican que la OPG no contiene ninguna secuencia que abarque la transmembrana hidrófoba.

En Marsters et al., Curr. Biol., 6:750 (1996), los investigadores describen un polipéptido humano de secuencia nativa de longitud completa, denominado Apo-3, que presenta una similitud con la familia de los RFNT en sus repeticiones ricas en cisteína extracelulares, y que se asemeja al RFNT1 y CD95 en que contiene una secuencia del dominio de muerte citoplasmático [véase, además, Marsters et al., Curr. Biol., 6:1669(1996)]. También se ha hecho referencia a Apo-3 por otros investigadores como DR3, wsl-1 y TRAMP [Chinnaiyan et al., Science, 274:990 (1996); Kitson et al., Nature, 384:372 (1996); Bodmer et al., Immunity, 6:79 (1997)].

Pan et al., han revelado otro miembro de la familia de receptores de los FNT denominado "DR4" [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]. El ADNc de DR4 codifica un marco de lectura abierto de 468 aminoácidos con características propias de un receptor de la superficie celular. Pan et al., describen un péptido señal putativo presente al principio de la molécula (aminoácidos -23 a -1) con la predicción de que la proteína madura comienza en el aminoácido 24 (Ala). Los residuos 108 a 206 contienen dos pseudo-repeticiones ricas en cisteína que se asemejan a las regiones correspondientes del RFNT-1 (cuatro repeticiones), DR3 (cuatro repeticiones), Fas (tres repeticiones) y CAR1 (dos repeticiones). Tras el dominio transmembrana hay una región intracelular que contiene un tramo de 70 aminoácidos con una similitud con los dominios de muerte de RFNT1, DR3, Fas y CAR1. El transcripto de DR4 fue detectado en el bazo, en los leucocitos de la sangre periférica, en el intestino delgado y en el timo. Además, también se encontró la expresión de DR4 en células de eritroleucemia K562, células de carcinoma de mama MCF7 y células T activadas. Par et al., revelan además que se cree que DR4 es un receptor del ligando conocido como ligando Apo-2 o TRAIL.

En Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) y Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), se describe otra molécula considerada como un receptor del ligando Apo-2 (TRAIL). Esa molécula es denominada Apo-2 (también ha sido alternativamente denominada DR5). [véase también el documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; el documento WO98/41629 publicado el 24 de septiembre de 1998]. Esa molécula también ha sido denominada TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER [Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; EP870,827 publicado el 14 de octubre de 1998; WO98/46643 publicado el 22 de octubre de 1998; WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999]. Al igual que DR4, se ha publicado que DR5 contiene un dominio de muerte citoplasmático y que es capaz de señalizar la apóptosis. La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRAIL y DR5 se describe en Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

En Sheridan et al., supra, se revela un receptor denominado DcR1 (o alternativamente, Apo-2DcR) como un posible receptor señuelo del ligando Apo-2 (TRAIL). Sheridan et al. han publicado que DcR1 puede inhibir la función del ligando Apo-2 in vitro. Véase también Pan et al., supra, para la revelación del mismo receptor señuelo denominado TRID. DCR1 también ha sido denominado LIT o TRAIL-R3 [McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters, 416: 329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); y Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160: 3-6 (1998)].

En Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997), se revela un receptor denominado DcR2. Marsters et al. han publicado que DcR2 contiene una región citoplasmática con un dominio de muerte truncado y que puede funcionar como un receptor de Apo-2L inhibidor in vitro. DCR2 también se denomina TRUNDD o TRAIL-R4 [Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)].

Para una revisión de la familia de FNT de las citoquinas y sus receptores, véase Gruss y Dower, supra.

Como se entiende actualmente, el programa de muerte celular contiene al menos tres elementos importantes: activadores, inhibidores y efectores; en C. elegans, estos elementos están codificados respectivamente por tres genes, Ced-4, Ced-9 y Ced-3 [Steller, Science, 267:1445 (1995); Chinnaiyan et al., Science, 275:1122-1126 (1997); Zou et al., Cell, 90:405-413(1997)]. Dos de los miembros de la familia de los RFNT, el RFNT1 y el Fas/Apol (CD95), pueden activar la muerte celular apoptótica [Chinnaiyan y Dixit, Current Biology, 6:555-562 (1996); Fraser y Evan, Cell; 85:781-784 (1996)]. El RFNT1 también es conocido por mediar la activación del factor de transcripción, NF-kB [Tartaglia et al., Cell, 74:845-853 (1993); Hsu et al., Cell, 84:299-308 (1996)]. Además de alguna homología en el ECD, estos dos receptores comparten homología en su dominio intracelular (ICD, Intracellular Domain) en una interfase de oligomerización conocida como el dominio de muerte [Tartaglia et al., supra; Nagata, Cell, 88:355 (1997)]. Los dominios de muerte también se encuentran en varias proteínas metazoarias que regulan la apóptosis, concretamente, la proteína de Drosophila, Reaper, y las proteínas de mamífero denominadas FADD/MORT1, TRADD y RIP [Cleveland e Ihle, Cell, 81:479-482 (1995)]. Tras la unión al ligando y el agrupamiento de receptores, se cree que RFNT1 y CD95 reclutan a FADD en un complejo de señalización inductor de la muerte. Supuestamente, CD95 se une directamente con FADD, mientras que RFNT1 se une indirectamente con FADD a través de TRADD [Chinnaiyan et al., Cell, 81:505-512 (1995); Boldin et al., J. Biol. Chem., 270:387-391 (1995); Hsu et al., supra; Chinnaiyan et al., J. Biol. Chem., 271:4961-4965 (1996)]. Se ha publicado que FADD sirve como una proteína adaptadora que recluta la proteasa relacionada con Ced-3, MACH\alpha/FLICE (caspasa 8), en el complejo de señalización de la muerte [Boldin et al., Cell, 85:803-815 (1996); Muzio et al., Cell, 85:817-827 (1996)] MACH\alpha/FLICE parece ser el desencadenante que da lugar a la cascada de proteasas apoptóticas, incluyendo la enzima de conversión de la interleuquina-1\beta (ECI) y CPP32/Yama, que pueden ejecutar algunos aspectos fundamentales del programa de muerte celular [Fraser y Evan, supra].

Recientemente se reveló que la muerte celular programada implica la actividad de los miembros de una familia de proteasas de cisteína relacionadas con el gen de muerte celular de C. elegans, ced-3, y con la enzima de conversión de IL-1 de mamífero, ECI. La actividad de las proteasas de ECI y CPP32/Yama puede ser inhibida por el producto del gen del virus de la viruela vacuna, crmA, [Ray et al., Cell, 69:597-604 (1992); Tewari et al., Cell, 81:801-809 (1995)]. Estudios recientes muestran que CrmA puede inhibir la muerte celular inducida por RFNT1 y por CD95 [Enari et al., Nature, 375:78-81 (1995); Tewari et al., J. Biol. Chem., 270:3255-3260 (1995)].

\newpage

Según fue revisado recientemente por Tewari et al., RFNT1, RFNT2 y CD40 modulan la expresión de citoquinas proinflamatorias y coestimuladoras, receptores de citoquinas y moléculas de adhesión celular a través de la activación del factor de transcripción NF-kB [Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6: 39-44 (1996)]. El NF-kB es el prototipo de una familia de factores de transcripción diméricos cuyas subunidades contienen regiones Rel conservadas [Verma et al., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649-681 (1996)]. En su forma latente, NF-kB forma complejos con miembros de la familia de inhibidores IkB; tras la desactivación del IkB como respuesta a ciertos estímulos, el NF-kB liberado se desplaza al núcleo en el que se une con secuencias de ADN específicas y activa la transcripción génica.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos frente a DR4 que son capaces de unirse específicamente a DR4. Los anticuerpos frente a DR4 preferidos son capaces de modular actividades biológicas asociadas con DR4 y/o el ligando Apo-2 (TRAIL), en concreto, la apóptosis, siendo, por tanto, útiles en el tratamiento de diversas enfermedades y condiciones patológicas, incluyendo el cáncer o enfermedades inmunes.

Por consiguiente, en un aspecto, a presente invención proporciona un anticuerpo anti-DR4 quimérico aislado que comprende:

(a)

un dominio variable de cadena ligera, dominio variable que comprende los residuos de aminoácido 20 a 126 de la SEC ID N.º 9;

(b)

un dominio CH1 de cadena ligera que comprende los residuos de aminoácido 127 a 233 de la SEC ID N.º 9;

(c)

un dominio variable de cadena pesada que comprende los residuos de aminoácido 20 a 145 ó 22 a 145 de la SEC ID N.º 12; y

(d)

los dominios CH1, CH2 y CH3 de cadena pesada que comprenden los residuos de aminoácido 146 a 476 de la SEC ID N.º 12.

En un aspecto más, la presente invención proporciona ácido nucleico aislado codificante del anticuerpo anti-DR4 quimérico según lo definido anteriormente, vectores que comprenden el ácido nucleico y células huésped que comprenden los vectores.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo anti-DR4 quimérico que comprende cultivar la célula huésped anteriormente definida y recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped.

En un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-DR4 quimérico según lo definido anteriormente en la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células cancerosas de mamífero, por ejemplo, cuando dichas células cancerosas de mamífero comprenden células de cáncer de colon, células de cáncer de pulmón de células pequeñas, células de cáncer de pulmón de células no pequeñas, células de adenocarcinoma de pulmón o células de carcinoma de células escamosas de pulmón.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID N.º 2) de un ADNc para el DR4 humano y su secuencia de aminoácidos derivada (SEC ID N.º 1). Las respectivas secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para el DR4 humano también están publicadas en Pan et al., Science, 276:111 (1997).

La figura 2 muestra el análisis FACS de la unión de DR4 por dos anticuerpos anti-DR4, 4E7.24.3 ("4E7") y 4H6.17.8 ("4H6") (ilustrados mediante las líneas en negrita) en comparación con controles de IgG (líneas de puntos). Ambos anticuerpos reconocieron el receptor DR4 expresado en las células 9D humanas.

La figura 3 es una gráfica que muestra el porcentaje (%) de apóptosis inducida en las células 9D por los anticuerpos DR4 4E7.24.3 y 4H6.17.8.

La figura 4 es un diagrama de barras que muestra el porcentaje (%) de apóptosis, en comparación con Apo-2L, en células 9D por los anticuerpos DR4 4E7.24.3 y 4H6.17.8, en presencia o en ausencia de anticuerpos frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón.

La figura 5 es un diagrama de barras que ilustra la capacidad del anticuerpo frente a DR4 4H6.17.8 para bloquear la apóptosis inducida por Apo-2L en células 9D.

La figura 6 es una gráfica que muestra los resultados de un análisis ELISA que analiza la unión de los anticuerpos frente a DR4 4E7.24.3 y 4H6.17.8 con DR4 y con otros receptores de Apo-2L conocidos denominados Apo-2, DcR1 y DcR2.

La figura 7 muestra las afinidades de unión de los anticuerpos frente a DR4 4E7, 4H6 y 5G11.17.1 ("5G11") con IgG de DR4, según lo determinado en un análisis KinExA^{TM}. Las afinidades de unión, p. ej., de las inmunoadhesinas de DR4 y DR5 con Apo-2L se muestran a modo comparativo.

La figura 8A muestra gráficas que ilustran el porcentaje (%) de apóptosis (según lo determinado por un análisis FACS) inducida en células 9D por diversas concentraciones de anticuerpos frente a DR4 1H5.25.9 ("1H5"), 4G7.18.8 ("4G7") y 5G11, en ausencia o presencia de anticuerpo frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón o complemento de conejo.

La figura 8B muestra gráficas que ilustran la actividad apoptótica (según lo determinado por un análisis FACS) de anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11 sobre células 9D en presencia de anticuerpo frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón o complemento de conejo.

La figura 9 muestra la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 4H6, 4E7, 4G7, 4G10.20.6 ("4G10"), 3G1.17.2 ("3G1"), 5G11, 1H8.17.5 ("1H8") y 1H5.24.9 ("1H5") sobre células de tumor pulmonar SKMES-1 en presencia de anticuerpos frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón.

La figura 10A muestra la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11 sobre células de tumor pulmonar SKMES-1 en presencia o en ausencia de anticuerpos frente a Fc de IgG anti-ratón de cabra.

La figura 10B muestra la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11 sobre células de tumor pulmonar SKMES-1 en presencia o en ausencia de complemento de conejo.

La figura 11A muestra la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11 sobre células de tumor de colon HCT116 en presencia o en ausencia de anticuerpos frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón.

La figura 11B muestra la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11 sobre células de tumor de colon HCT116 en presencia o en ausencia de complemento de conejo.

La figura 12 muestra los resultados de un análisis PARP.

La figura 13 muestra los efectos de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11, sobre el crecimiento de los tumores de colon de HCT116 en ratones desnudos atímicos medidos mediante el volumen tumoral.

La figura 14 muestra los efectos de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 5G11, sobre el crecimiento de los tumores de colon de HCT116 en ratones desnudos atímicos medidos mediante el peso tumoral.

Las figuras 15 y 16 muestras los efectos de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 4H6 sobre el crecimiento de los tumores de colon de Colo205 en ratones desnudos atímicos medidos mediante el volumen tumoral.

La figura 17 proporciona una tabla que identifica los anticuerpos frente a DR4 1H5.24.9; 1H8.17.5; 3G1.17.2; 4E7.24.3; 4G7.18.8; 4H6.17.8; 4G10.20.6 y 5G11.17.1, así como las diversas propiedades y actividades identificadas con cada respectivo anticuerpo.

Las figuras 18A-18C muestran la cadena ligera del anticuerpo anti-DR4 4H6 quimérico e incluyen la secuencia de polinucleótidos codificante (SEC ID N.º 7) y su secuencia de ADN complementaria (SEC ID N.º 8), y la secuencia de aminoácidos putativos (SEC ID N.º 9) que comprende la secuencia señal (vector derivado) (identificada como los residuos de aminoácido 1 a 19 de SEC ID N.º 9); el dominio variable de cadena ligera (identificado como los residuos de aminoácido 20 a 126 de SEC ID N.º 9); y el dominio constante CH1 kappa humano (identificado como los residuos de aminoácido 127 a 233 de SEC ID N.º 9). También se muestran el respectivo marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y las regiones CDR (CDR1, CDR2, CDR3); estando las respectivas regiones subrayadas.

Las figuras 18D-18H muestran la cadena pesada del anticuerpo anti-DR4 4H6 quimérico e incluyen la secuencia de polinucleótidos codificante (SEC ID N.º 10) y su secuencia de ADN complementaria (SEC ID N.º 11), y la secuencia de aminoácidos putativos (SEC ID N.º 12) que comprende la secuencia señal (vector derivado) (identificada como los residuos de aminoácido 1 a 19 de SEC ID N.º 12); el dominio variable de cadena pesada (identificado como los residuos de aminoácido 20 a 145 de SEC ID N.º 12); y los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 de IgG1 humana(identificados como los residuos de aminoácido 146 a 476 de SEC ID N.º 12). El residuo de aminoácido de la posición 20 (que corresponde al primer aminoácido del dominio variable de cadena pesada murino de 4H6) se muestra como un residuo de ácido glutámico. Se destaca que en el dominio variable murino de cadena pesada de 4H6 nativo secuenciado desde el hibridoma de 4H6.17.8, el primer aminoácido es un residuo de glutamina, y no de ácido glutámico. También se muestran el respectivo marco (FR1, FR2, FR3 y FR4) y las regiones CDR (CDR1, CDR2, CDR3); estando las respectivas regiones subrayadas.

La figura 19 muestra los efectos (muerte celular in vitro de células SK-MES-1) del anticuerpo 4H6 quimérico ("Ch4H6") (más Fc de IgG de cabra anti-humana), según lo determinado mediante tinción con violeta cristal. También se muestran los efectos del anticuerpo monoclonal 4H6 murino ("4H6"), 4H6 de F(ab)'2 y Apo2L.

La figura 20 muestra los efectos de ADCC del anticuerpo 4H6 quimérico ("c4H6") (más Fc de IgG de cabra anti-humana) sobre células Colo205, según lo medido en un análisis de liberación de ^{51}Cr.

La figura 21 muestra los efectos del anticuerpo 4H6 quimérico ("ch-4H6") sobre el crecimiento de los tumores de colon de Colo205 en ratones desnudos atímicos medidos mediante el volumen tumoral. También se muestran los efectos del anticuerpo monoclonal murino ("4H6") y la IgG1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Definiciones

Como se usa en las presente memoria, el término "ligando Apo-2" o "Apo-2L" (también conocido como TRAIL) se refiere a un miembro específico de la familia de ligandos de los factores de necrosis tumoral (FNT) que, entre otras cosas, induce la apóptosis en una variedad de alineamientos celulares [véase el documento WO 97/25428 publicado el 17 de julio de 1997; WO97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; Pitti et al., J. Biol. Chem, 271:12687 (1996); Marsters et al., Curr. Biol., 6:79 (1997); Wiley, S. et al., Immunity, 3:637 (1995)].

Se ha identificado un receptor de Apo-2L y se ha denominado DR4, un miembro de la familia de receptores de los FNT que contiene un "dominio de muerte" citoplasmático capaz de engranar el aparato de suicidio celular [véase Pan et al., Science, 276:111 (1997)]. También se ha descrito DR4 en el documento WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998. El término "Receptor de muerte 4" o "DR4" cuando se usa en la presente memoria engloba el DR4 de secuencia nativa y los variantes de DR4 (que se definen más detalladamente en la presente memoria). Estos términos engloban el DR4 expresado en una variedad de mamíferos incluyendo a los seres humanos. El DR4 puede ser expresado endógenamente como ocurre de forma natural en una variedad de alineamientos de tejidos humanos, y puede ser expresado mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. Un "DR4 de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un DR4 derivado de la naturaleza. De este modo, un DR4 de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del DR4 natural de cualquier mamífero. Es posible aislar tal DR4 de secuencia nativa de la naturaleza o producirlo mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. El término "DR4 de secuencia nativa" engloba específicamente formas secretadas o truncadas naturales del DR4 (p. ej., una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas divergentes naturales (p. ej., formas cortadas y empalmadas alternativamente) y variantes alélicas naturales del DR4. En una realización de la invención, el DR4 de secuencia nativa es un DR4 de secuencia nativa de longitud completa o madura que comprende los aminoácidos 1 a 468 de la Fig. 1 (SEC ID N.º 1).

Los términos "dominio extracelular" o "ECD" se refieren en la presente memoria a una forma de DR4 que está esencialmente libre de los dominios transmembrana y citoplasmático de DR4. Normalmente, el ECD de DR4 tendrá menos del 1% de tales dominios transmembrana y/o citoplasmático y, preferiblemente, tendrá menos del 0,5% de tales dominios. Opcionalmente, el ECD de DR4 comprenderá los residuos de aminoácido 1 a 218 o los residuos 24 a 218 de la Fig. 1 (SEC ID N.º 1).

"Variante de DR4" significa un DR4 biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente el 80% o el 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos con el DR4 que tiene la secuencia de aminoácidos deducida mostrada en la Fig. 1 (SEC ID N.º 1) para una secuencia nativa de longitud completa o una secuencia del dominio extracelular del DR4 humano. Tales variantes de DR4 incluyen, por ejemplo, polipéptidos de DR4 en los que se han añadido o eliminado uno o más residuos de aminoácido (i.e., fragmentos), en el terminal N o C de la secuencia de la Fig. 1 (SEC ID N.º 1). Generalmente, una variante de DR4 tendrá al menos aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 90% de identidad de la secuencia de aminoácidos, e incluso más preferiblemente, al menos aproximadamente el 95% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la Fig. 1 (SEC ID N.º 1).

"Porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de DR4 (o la secuencias de los anticuerpos frente a DR4) identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos de aminoácido de una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido de la secuencia de DR4 (o de la secuencia del anticuerpo frente a DR4), tras alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad secuencial, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad secuencial. El alineamiento a efectos de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede realizar de diversos modos que pertenecen al alcance de la técnica, por ejemplo, usando un programa informático a disposición del público tal como ALIGN^{TM}, Megalign (DNASTAR) o ALIGN-2 (autorizado por Genentech, Inc. y presentado en la Oficina estadounidense de Derecho de Autor el 10 de diciembre de 1991). El programa ALIGN-2 está a disposición del público en Genentech, Inc. El programa ALIGN-2 debería estar compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento por la longitud completa de las secuencias que estén siendo comparadas.

"Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos revelados en la presente memoria, significa polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son materiales que comúnmente interferirían en los usos de diagnóstico o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS en condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinte de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido in situ de células recombinantes, pues al menos un componente del medio ambiente natural de DR4 o del anticuerpo frente a DR4 no estará presente. Generalmente, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado mediante al menos una etapa de purificación.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que habitualmente está asociada en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada se diferencia en cuanto a la forma y al entorno en el que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico en que ésta existe en células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el polipéptido en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente de la de las células naturales.

La "restricción" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por cualquier experto habitual en la técnica, y generalmente se trata de un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración salina. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para aparearse apropiadamente, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para volverse a aparear cuando hay presentes cadenas complementarias en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto más elevado es el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable, más elevada será la temperatura relativa que se pueda usar. Como resultado, las temperaturas relativas más elevadas tenderían a hacer posibles condiciones de reacción más restrictivas, mientras que las temperaturas más bajas, condiciones menos restrictivas. Para más información sobre la restricción de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Las condiciones restrictivas" o "las condiciones muy restrictivas", según lo definido en la presente memoria, se pueden identificar por aquéllas que: (1) emplean una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para lavar, por ejemplo, cloruro de sodio 0,015M/citrato de sodio 0,0015M/dodecil sulfato de sodio al 0,1% a 50ºC; (2) emplean durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato de sodio 50mM a pH 6,5 con cloruro de sodio 750mM/citrato de sodio 75mM a 42ºC; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75M, citrato de sodio 0,075M), fosfato de sodio 50mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sometido a tratamiento con ultrasonidos (50 \mug/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC con lavados a 42ºC en 0,2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55ºC, seguida por un lavado en condiciones muy restrictivas que consiste en 0,1 x SSC que contiene EDTA a 55ºC.

Las "condiciones moderadamente restrictivas" se pueden identificar según lo descrito por Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Nueva York: Cold Spring Harbor Press, (1989), e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridación (p. ej., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos restrictivas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente restrictivas es la incubación durante una noche a 37ºC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150mM, citrato de trisodio 15mM), fosfato de sodio 50mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón triturado desnaturalizado, seguido por un lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50ºC. El experto en la técnica sabe cómo ajustar la temperatura, la fuerza iónica, la fuerza iónica, etc. según sus necesidades en virtud de factores tales como la longitud de sonda y similares.

El término "secuencias de control" de la expresión se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un determinado organismo huésped. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente, una secuencia operadora, un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y
potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretor está unido operativamente a ADN para un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o un potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante si está colocado tal que facilite la traducción. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La unión se realiza mediante el enlace en sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se usan adaptadores o ligadores de oligonucleótido sintéticos conforme a la práctica convencional.

\newpage

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-alfa-aminoácidos naturales. Esta definición pretende incluir norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos son identificados mediante denominaciones de bien una sola letra o de tres letras:

1

En el listado secuencial y las figuras, se emplean otras determinadas denominaciones de una sola letra o de tres letras para referirse e identificar dos o más aminoácidos o nucleótidos en una determinada posición de la secuencia. Por ejemplo, en el residuo de aminoácido 20 de la SEC ID N.º 12, se emplea la denominación de tres letras "Xaa" para identificar que en el residuo 20, el aminoácido puede ser glutamina o un residuo de ácido glutámico. En las secuencias de nucleótidos a las que se hace referencia en el ejemplo 16 y en la figura 18D, la denominación "w" indica que el nucleótido puede ser "a" o "t"; "k" indica que el nucleótido puede ser "g" o "t"; "b" indica que el nucleótido puede ser "g" o "t" o "c"; "y" indica que el nucleótido puede ser "c" o "t"; "r" indica que el nucleótido puede ser "a" o "g"; "s" indica que el nucleótido puede ser "g" o "c"; "m" indica que el nucleótido puede ser "a" o "c"; y "n" indica que el nucleótido puede ser "a" o "t" o "c" o "g".

Los términos "agonista" y "agonístico", cuando se usan en la presente memoria, se refieren a o describen una molécula que es capaz de, directa o indirectamente, inducir, promover o potenciar sustancialmente la actividad biológica o la activación de DR4. Opcionalmente, un "anticuerpo frente a DR4 agonista" es un anticuerpo que tiene una actividad comparable con la del ligando de DR4, conocido como ligando Apo-2 (TRAIL).

Los términos "antagonista" y "antagonístico", cuando se usan en la presente memoria, se refieren a o describen una molécula que es capaz de, directa o indirectamente, contrarrestar, reducir o inhibir sustancialmente la actividad biológica o la activación de DR4.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales anti-DR4 individuales (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes o bloqueadores) y composiciones de anticuerpos anti-DR4 con especificidad poli-epitópica. "Anticuerpo", como se usa en las presente memoria, incluye moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo intactas, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (i.e., anticuerpos biespecíficos formadas a partir de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de inmunoglobulina (tales como Fab, F(ab')_{2} o Fv), siempre y cuando presenten cualquiera de las propiedades agonísticas o antagonísticas deseadas descritas en la presente memoria.

Los anticuerpos son comúnmente proteínas o polipéptidos que presentan una especificidad de unión por un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Comúnmente, cada cadena ligera está unida con una cadena pesada mediante un enlace tipo disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de tipo disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Además, cada cadena pesada y ligera tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V_{H}) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V_{L}) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácido forman una interfase entre los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas [Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 82:4592-4596 (1985)] Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de los dos tipos claramente distintos denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas se pueden dividir en subclases (isotipos), p. ej., IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 y IgA-2. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.

"Fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, generalmente, la región variable o de unión antigénica del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')_{2} y fragmentos Fv, fragmentos divalentes, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

El término "variable" se usa en la presente memoria para describir ciertas partes de los dominios variables que difieren en la secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y la especificidad de cada anticuerpo en concreto con su antígeno concreto. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye habitualmente de manera uniforme por los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra comúnmente en tres segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR, Complementarity Determining Regions) o regiones hipervariables de los dominios variables tanto de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas. Las partes más conservadas de los dominios variables se denominan marcos (FR, FRamework). Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR que adoptan en buena parte una configuración de lámina \beta, conectada por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos formando parte de, la estructura de lámina \beta. Las CDR de cada cadena se mantienen muy próximas por las regiones Fr y, con las CDR del resto de cadenas, contribuyen a la formación del sitio de unión antigénica de los anticuerpos [véase Kabat, E. A. et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)]. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo con un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en las presente memoria, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos cuando son dirigidos frente a un solo sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido hacia un solo determinante del antígeno.

Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen anticuerpos quiméricos, híbridos y recombinantes producidos mediante el corte y empalme de un dominio variable (incluyendo hipervariable) de un anticuerpo anti-DR4 con un dominio constante (p. ej., anticuerpos "humanizados") o una cadena ligera con una cadena pesada o una cadena de una especie con una cadena de otra especie o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o la denominación de clase o subclase de la inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpos (p. ej., Fab, F(ab')_{2} y Fv), siempre y cuando presenten la actividad biológica o las propiedades deseadas. Véase, p. ej., la patente estadounidense n. 4.816.567 y Mage et al., en "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).

De este modo, el modificante "monoclonal" indica que el anticuerpo ha sido obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no implica la necesidad de producir el anticuerpo mediante ningún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso según la presente invención se pueden producir mediante el procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975), o se pueden producir mediante procedimientos con ADN recombinante, tales como los descritos en la patente estadounidense n.º 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también se pueden aislar de genotecas de fagos generadas usando las técnicas descritas, por ejemplo, en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (p. ej. murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión a antígenos de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor están reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como de ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco (FR) de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Además, el anticuerpo humanizado puede comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco importadas. Estas modificaciones se realizan para redefinir y optimizar más el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y comúnmente dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región o un dominio constante (Fc) de inmunoglobulina, comúnmente, de una inmunoglobulina humana.

Un "anticuerpo humano" es aquél que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o que ha sido elaborado usando cualquiera de las técnicas para la elaboración de anticuerpos humanos según lo revelado en la presente memoria. Esta definición de anticuerpo humano excluye específicamente a un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona entre una genoteca de fagos, genoteca de fagos que expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS, (EE.UU.) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también se pueden producir introduciendo locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, p. ej., ratones, en los que se han desactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. Tras el desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja bastante a la observada en seres humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización génica, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.º 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar mediante la inmortalización de linfocitos B humanos produciendo un anticuerpo dirigido frente a un antígeno diana (pudiéndose recuperar tales linfocitos B de un individuo o pudiendo haber sido inmunizados in vitro). Véase, p. ej., Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); y la patente estadounidense n.º 5.750.373.

El término "región Fc" se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que se puede generar mediante la digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una región Fc divergente. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se limita habitualmente al tramo que va desde un residuo de aminoácido situado aproximadamente en la posición Cys226, o desde aproximadamente la posición Pro230, al terminal carboxilo de la región Fc (usando en la presente memoria el sistema de numeración según Kabat et al., supra). La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente, comprende un dominio CH4.

El término "cadena de la región Fc" pretende significar en la presente memoria una de las dos cadenas polipeptídicas de una región Fc.

El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana (también denominado dominio "C\gamma2") se extiende habitualmente desde un residuo de aminoácido situado aproximadamente en la posición 231 hasta un residuo de aminoácido situado aproximadamente en la posición 340. El dominio CH2 es único en tanto en cuanto no está apareado estrechamente con otro dominio. Más bien, hay dos cadenas de hidrato de carbono ramificadas unidas a N intercaladas entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado sobre el hecho de que el hidrato de carbono puede sustituir el apareamiento entre dominios y ayudar a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985). El dominio CH2 en la presente memoria puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 divergente.

El "dominio CH3" comprende el tramo de los residuos C-terminales hasta un dominio CH2 de una región Fc (i.e., de un residuo de aminoácido situado aproximadamente en la posición 341 hasta un residuo de aminoácido situado aproximadamente en la posición 447 de una IgG). La región CH3 en la presente memoria puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 divergente (p. ej., un dominio CH3 con una "protuberancia" introducida en una cadena del mismo y una correspondiente "cavidad" introducida en la otra cadena del mismo; véase la patente estadounidense n.º 5.821.333). Tales dominios CH3 divergente se pueden usar para producir anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos) como los descritos en la presente memoria.

"Región bisagra" se define en general como el tramo que se extiende desde aproximadamente Glu216, o desde aproximadamente Cys226, hasta aproximadamente Pro230 de una IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden ser alineadas con la secuencia de IgG1 colocando el primer y último residuo de cisteína que forman los enlaces S-S entre las cadenas pesadas en las mismas posiciones. En la presente memoria, la región bisagra puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una región bisagra divergente. Las dos cadenas polipeptídicas de una región bisagra divergente conservan generalmente al menos un residuo de cisteína por cada cadena de polipéptido, tal que las dos cadenas polipeptídicas de la región bisagra variante pueden formar un enlace tipo disulfuro entre las dos cadenas. La región bisagra preferida en la presente memoria es una región bisagra humana de secuencia nativa, p. ej., una región bisagra de IgG1 humana de secuencia nativa.

Una "región Fc funcional" posee al menos una "función efectora" de una región Fc de secuencia nativa. Los ejemplos de "funciones efectoras" incluyen la unión a C1q; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC); la unión a receptores Fc; la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA); la fagocitosis; la regulación secuencia abajo de receptores de la superficie celular (p. ej., el receptor de células B; RCB), etc. Tales funciones efectoras requieren generalmente que la región Fc esté combinada con un dominio de unión (p. ej., un dominio variable de un anticuerpo) y se pueden medir usando diversos análisis conocidos en la técnica para la evaluación de tales funciones efectoras de anticuerpos.

Una "región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc encontrada en la naturaleza. Una "región Fc divergente" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de la modificación de al menos un aminoácido. Preferiblemente, la región Fc divergente tiene la sustitución de al menos un aminoácido en comparación con la región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, p. ej., sustituciones de aproximadamente uno a aproximadamente diez aminoácidos, y preferiblemente, sustituciones de aproximadamente uno a aproximadamente cinco aminoácido en una región Fc de secuencia nativa o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc divergente de la presente memoria preferiblemente poseerá una identidad secuencial del al menos aproximadamente 80% con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental, y lo más preferible, una identidad secuencial del al menos aproximadamente 90% con la misma, más preferiblemente, una identidad secuencial del al menos aproximadamente 95% con la misma.

"Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos" y "CCDA" se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas inespecíficas que expresan receptores Fc (RFc) (p. ej., células asesinas naturales (NK, Natural Killer), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido sobre una célula diana y, posteriormente, provocan la lisis de la célula diana. Las células principales para mediar la CCDA, las células NK, sólo expresan RFc\gammaIII, mientras que los monocitos expresan RFc\gammaI, RFc\gammaII y RFc\gammaIII. La expresión de RFc sobre células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para analizar la actividad de CCDA de una molécula de interés, se puede realizar un análisis de la CCDA in vitro, tal como el descrito en la patente estadounidense n.º 5.500.362 ó 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o además, es posible analizar la CCDA de la molécula de interés in vivo, p. ej., en un modelo animal tal como el revelado en Clynes et al. PNAS (EE.UU.), 95:652-656 (1998).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más RFc y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos RFc\gammaIII y realizan la función efectora de CCDA. Los ejemplos de leucocitos humanos que median la CCDA incluyen células mononucleares de la sangre periférica (CMSP), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las CMSP y las células NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa de las mismas, p. ej., de sangre o CMSP según lo descrito en la presente memoria.

Los términos "receptor Fc" y "RFc" se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El RFc preferido es un RFc humano de secuencia nativa. Además, un RFc preferido es aquél que se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma, e incluye los receptores de las subclases RFc\gammaI, RFc\gammaII y RFc\gammaIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas cortadas y empalmadas alternativamente de estos receptores. Los receptores RFc\gammaII incluyen el RFc\gammaIIA (un "receptor activador") y RFc\gammaIIB (un receptor inhibidor''), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren fundamentalmente en los dominios citoplasmáticos de las mismas. El receptor activador RFc\gammaIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor (MATI) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor RFc\gammaIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunorreceptor (MITI) en su dominio citoplasmático (revisado por Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los RFc se encuentran revisados en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Hay otros RFc, incluyendo aquéllos que serán identificados en el futuro, que quedan englobados por el término "RFc" en la presente memoria. El término también incluye el receptor neonatal, RFcn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

"Citotoxicidad dependendente del complemento" y "CDC" se refieren a la lisis de una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema complementario (C1q) con una molécula (p. ej., un anticuerpo) que forma un complejo con un antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un análisis de CDC, p. ej., según lo descrito en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

Un anticuerpo "de afinidad madurada" es un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que da como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno en comparación con un anticuerpo parental que no posee aquella o aquellas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares e incluso picomolares por el antígeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks et al. Hio/Technology, 10:779-783 (1992) describe la maduración de la afinidad mediante el barajado de los dominios V_{H} y V_{L}. La mutagénesis aleatoria de los residuos de CDR y/o marco está descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, EE.UU. 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene, 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992).

"Biológicamente activo" y "actividad biológica deseada" a efectos de la presente memoria significa que tiene la capacidad de modular la actividad de DR4 o la activación de DR4, incluyendo, a modo de ejemplo, la apóptosis (bien de un modo agonístico o estimulador, o de un modo antagonístico o bloqueador) en al menos un tipo de célula de mamífero in vivo o ex vivo, o la unión al ligando Apo-2 (TRAIL).

Los términos "apóptosis" y "actividad apoptótica" se usan en su sentido amplio, y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que está comúnmente acompañada de uno o más cambios celulares característicos, incluyendo la condensación del citoplasma, la pérdida de microvellosidades en la membrana plasmática, la segmentación del núcleo, la degradación del ADN cromosómico o la pérdida de la función mitocondrial. Es posible determinar y medir esta actividad, por ejemplo, mediante un análisis de la viabilidad celular, un análisis FACS o una electroforesis de ADN, siendo todas ellas conocidas en la técnica.

\newpage

Los términos "cáncer", "canceroso" y "maligno" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza comúnmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más concretos de tales cánceres incluyen el cáncer de las células escamosas, el cáncer pulmonar de células pequeñas, el cáncer pulmonar de células no pequeñas, el adenocarcinoma pulmonar, el carcinoma de células escamosas de pulmón, el cáncer gastrointestinal, el linfoma de Hodgkin y de no Hodgkin, el cáncer de páncreas, el glioblastoma, el cáncer cervical, el glioma, el cáncer de ovario, el cáncer de hígado tal como el carcinoma y el hematoma hepático, el cáncer de vejiga, el cáncer de mama, el cáncer de colon, el cáncer colorrectal, el carcinoma de endometrio o de útero, el carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñón, tal como el carcinoma de las células renales y los tumores de Wilm, el carcinoma de células basales, el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer de vulva, el cáncer de tiroides, el cáncer de testículo, el cáncer de esófago y diversos tipos de cáncer de cabeza y de
cuello.

El término "enfermedad inmune" significa una enfermedad en la que un componente del sistema inmune de un mamífero provoca, media o contribuye de otro modo a la morbosidad del mamífero. También se incluyen las enfermedades en las que la estimulación o la intervención de la respuesta inmune tiene un efecto paliativo en la progresión de la enfermedad. Se incluyen en este término las enfermedades autoinmunes, las enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmune, las enfermedades inflamatorias no mediadas por el sistema inmune, las enfermedades infecciosas y las enfermedades por inmunodeficiencia. Los ejemplos de enfermedades inmunes e inflamatorias, algunas de las cuales están mediadas por el sistema inmune o las células T, que se pueden tratar según la invención incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (esclerodermia), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis), síndrome de Sjogren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune, hemoglobinuria nocturna paroxismal), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia mediada por el sistema inmune), tiroiditis (enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil, tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por el sistema inmune (glomerulonefritis, nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas neviosos central y periférico, tales como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré, y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares, tales como hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos), hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas, tales como enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa: enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al glúten y enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas autoinmunes o mediadas por el sistema inmune, incluyendo enfermedades cutáneas bullosas, eritema multiforme y dermatitis por contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas tales como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad y urticaria alimentaria, enfermedades inmunológicas del pulmón, tales como pneumonías eosinófilas, fibrosis pulmonar idiopática y pneumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas con los transplantes, incluyendo el rechazo a injertos y la enfermedad del injerto contra el huésped. Las enfermedades infecciosas incluyen SIDA (infección por VIH), hepatitis A, B, C, D y E, infecciones bacterianas, infecciones por hongos, infecciones por protozoos e infecciones por
parásitos.

"Enfermedad autoinmune" se usa en la presente memoria en su sentido amplio y general para referirse a trastornos o condiciones en mamíferos en los que la destrucción de tejido normal o sano surge de respuestas inmunes celulares o humorales del mamífero individual hacia sus propios constituyentes tisulares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune y enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o a una composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro y/o in vivo. De este modo, el agente inhibidor del crecimiento puede ser uno que reduzca significativamente el porcentaje de células en fase S. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), tales como agentes que inducen la detención de G1 y la detención de la fase M. Los bloqueadores de la fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), TAXOL® e inhibidores de la topoisomerasa II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen G1 también pasan a detener la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilación del ADN, tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar más información en "The Molecular Basis of Cancer", Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1 titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente p.13.

El término "profármaco", como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o a una forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxico a las células cancerosas que el fármaco precursor, y que es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en la forma precursora más activa. Vése, p. ej., Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, Meeting de Belfast n.º 615 (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienn tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados con D-aminoácidos, profármacos glicosilados, profármacos que contienen beta-lactamo, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden ser convertidos en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados en una forma de profármaco para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos más adelante.

El término "agente citotóxico", como se usa en la presente memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (p. ej., At^{211}, I^{131}, I^{125}, Y^{90}, Re^{186}, Re^{188}, Sm^{153}, Bi^{212}, P^{32} e isótopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas activas enzimáticamente de origen bacteriano, micótico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variates de las mismas.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de condiciones como el cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN^{TM}); alquilsulfonatos, tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente, bullatacina y bullatacinona); una canfotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; callistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente, criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiína; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; ureas nitrogenadas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediína (p. ej., calicheamicina, especialmente, la calicheamicina \gamma1' y la calicheamicina \theta^{'}1, véase Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de cromoproteína enediína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolin-doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reaprovisionador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2,2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopísido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorrelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; capecitabina; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tales como antiestrógenos incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, ralozifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston); y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

El término "citoquina" es un término genérico para las proteínas liberadas por una población de células que actúan en otra célula como mediadores intercelulares. Los ejemplos de tales citoquinas son linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen las hormonas del crecimiento tales como la hormona del crecimiento humano, la hormona del crecimiento humano de N-metionilo y la hormona del crecimiento bovino; la hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteínicas tales como la hormona folicoestimulante (HFE), la hormona estimulante de la tiroides (HET) y la hormona luteinizante (HL); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placental; factor alfa y beta de necrosis tumoral; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); factores de crecimiento nervioso tales como el FCN alfa; factor de crecimiento plaquetario; factores de crecimiento transformantes (FCT), tales como el FCT alfa y el FCT beta; factor de crecimiento de tipo insulínico I y II; eritropoietina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como el interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (FEC), tales como FEC de macrófagos (FEC-M); FEC de macrófagos de granulocitos (FEC-MG); FEC de granulocitos (FEC-G); interleuquinas (IL), tales como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; un factor de necrosis tumoral tal como el FNT-alfa o el FNT-beta; y otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando Kit (LK). Como se usa en la presente memoria, el término citoquina incluye proteínas de origen natural o de un cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia", como se usan en la presente memoria, se refieren a la terapia curativa, la terapia profiláctica y la terapia preventiva.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o un trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (i.e., ralentizar hasta un cierto grado y, preferiblemente, detener) la infiltración de las células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (i.e., ralentizar hasta cierto grado y, preferiblemente, detener) la metástasis tumoral; inhibir, hasta cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar hasta cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. En la medida en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o la muerte de las células cancerosas existentes, éste puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, se puede medir la eficacia in vivo, por ejemplo, mediante el análisis de la carga o del volumen del tumor, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (THP) y/o mediante la determinación de las tasas de respuesta (TR).

El término "mamífero", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier mamífero clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la presente invención, el mamífero es un ser humano.

II. Composiciones y procedimientos de la invención A. Anticuerpos frente a DR4

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-DR4 quiméricos según lo expuesto en las reivindicaciones.

Estos anticuerpos pueden ser agonistas, antagonistas o anticuerpos bloqueadores.

\vskip1.000000\baselineskip

1. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la técnica. Es posible elevar los anticuerpos policlonales en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Comúnmente, el agente inmunizante y/o el adyuvante serán inyectados en el mamífero mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante puede incluir el polipéptido DR4 (o un ECD de DR4) o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que esté siendo inmunizado. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina e inhibidor de tripsina de soja. Los ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante de MPL-TDM (lípido A de monofosforilo-dicorinomicolato de trehalosa sintético). El experto en la técnica puede seleccionar el protocolo de inmunización sin la necesidad de una experimentación. Entonces se puede hacer una sangría al mamífero y analizar el suero en cuanto al título de los anticuerpos frente a DR4. Si se desea, el mamífero puede ser estimulado hasta que el título de los anticuerpos aumente o se estabilice.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando procedimientos con hibridomas tales como aquéllos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento del hibridoma, comúnmente se inmuniza un ratón, un hámster u otro animal huésped apropiado con un agente inmunizante para generar linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente con el agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro.

El agente inmunizante incluirá comúnmente el polipéptido DR4 (o un ECD de DR4) o una proteína de fusión del mismo, tal como una proteína de fusión del ECD de IgG de DR4. El agente inmunizante puede comprender alternativamente un fragmento o una parte de DR4 que tenga uno o más aminoácidos que participen en la unión de Apo-2L con DR4. En una realización preferida, el agente inmunizante comprende una secuencia de dominio extracelular de DR4 fusionada con una secuencia de IgG, tal como se describe en el ejemplo 1.

Generalmente, bien se usan linfocitos de sangre periférica (LSP), si se desean células de origen humano, o células de bazo o células de nódulos linfáticos, si se desean fuentes de mamífero no humano. Entonces se fusionan los linfocitos con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Habitualmente, las líneas celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas, particularmente, células de mieloma de origen bovino o humano, o de roedor. Habitualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contenga preferiblemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas sin fusionar. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT.

Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquéllas que se fusionan eficazmente, soportan un nivel elevado de expresión estable de anticuerpo por parte de las células productoras del anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, en el Centro de Distribución Celular del Institudo Salk, San Diego, California, y en la colección americana de cultivos tipo, Manassas, Virginia. Un ejemplo de tal línea celular de mieloma murino es P3X63AgU.1, descrita en el ejemplo 2 que figura más adelante. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón y ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) pp. 51-63].

Entonces se puede analizar el medio de cultivo en el que se cultivan células de hibridoma en cuanto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a DR4. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RIA) o un análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA). Tales técnicas y análisis son conocidos en la técnica. Se puede determinar la afinidad de unión del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Una vez identificadas las células de hibridoma deseadas, se pueden subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitante, y cultivarlos mediante procedimientos estándar [Goding, supra]. Los medios de cultivo adecuados a este efecto incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco o medio RPMI-1640. Alternativamente, se pueden cultivar las células de hibridoma in vivo como ascitos en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o de fluido de ascitos mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía sobre hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

También se pueden producir anticuerpos monoclonales mediante procedimientos con ADN recombinante, tales como aquéllos descritos en la patente estadounidense n.º 4.816.567. El ADN codificante de los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar fácilmente y secuenciar usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótido que sean capaces de unirse específicamente con genes codificantes de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, es posible colocar el ADN en vectores de expresión, que luego son transfectados a células huésped, tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que, de otro modo, no producen proteína inmunoglobulina para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en células huésped recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de los dominios constantes de las cadenas pesadas y ligeras humanas en lugar de las secuencias murinas homólogas [patente estadounidense n.º 4.816.567; Morrison et al., supra] o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante de un polipéptido de no inmunoglobulina. Tal polipéptido de no inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación antigénica de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Según lo descrito en los ejemplos que figuran a continuación, se han identificado y preparado diversos anticuerpos monoclonales anti-DR4, algunos de los cuales son materia de las reivindicaciones. Algunos de aquellos anticuerpos, denominados 4E7.24.3, 4H6.17.8, 1H5.25.9, 4G7.18.8 y 5G11.17.1 en la presente memoria, han sido depositados en la ATCC. En una realización, los anticuerpos monoclonales de la invención tendrán las mismas características biológicas que los anticuerpos monoclonales secretados por la línea o las líneas celulares de hibridoma a las que se hace referencia anteriormente que han sido depositadas en la ATCC. El término "características biológicas" se usa para hacer referencia a las actividades o las propiedades in vitro y/o in vivo del anticuerpo monoclonal, tales como la capacidad para unirse específicamente con DR4 o para bloquear, inducir o aumentar la activación de DR4 (o las actividades relacionadas con DR4). A modo de ejemplo, un anticuerpo bloqueador puede bloquear la unión del ligando Apo-2 con DR4 o bloquear la apóptosis inducida por el ligando Apo-2 en una célula de mamífero (tal como una célula de cáncer). Según lo revelado en la presente memoria (véase la figura 6), el anticuerpo monoclonal 4E7.24.3 se caracteriza por unirse específicamente con DR4 (y tener cierta reactividad cruzada con Apo-2), ser capaz de inducir la apóptosis y no ser capaz de bloquear DR4. El anticuerpo monoclonal 4H6.17.8 se caracteriza por unirse específicamente con DR4 (y tener cierta reactividad cruzada con Apo-2), ser capaz de inducir la apóptosis y ser capaz de bloquear la unión del ligando Apo-2 con DR4. Según lo revelado en la presente memoria, el anticuerpo 4H6.17.8 presentaba una actividad anticancerosa más potente que el anticuerpo 4E7.24.3 en un modelo tumoral in vivo. Es más, el anticuerpo 4E7.24.3 presentaba una actividad antitumoral incluso a pesar de no ser capaz de bloquear la unión del ligando Apo-2 con DR4. Esta observación sugiere que, para la actividad apoptótica o antitumoral, no es fundamental ni necesario un anticuerpo anti-DR4 que tenga un epítopo que sea igual que el sitio de unión con el ligando Apo-2 de DR4, o alternativamente, que bien se solape con el sitio de unión con el ligando Apo-2 de DR4 o cree una configuración esteárica que evite que el ligando Apo-2 se una con DR4. Sin embargo, un anticuerpo frente a DR4 que tenga tal epítopo o configuración esteárica puede presentar una mayor eficacia o potencia de tal actividad apoptótica o antitumoral. Las propiedades y las actividades de los anticuerpos 1H5.25.9, 4G7.18.8 y 5G11.17.1 también se describen en los ejemplos que figuran a continuación (haciéndose también referencia a ellas en la fig. 17). Opcionalmente, los anticuerpos monoclonales de la presente invención se unirán con el mismo o los mismos epítopos que los anticuerpos 4E7.24.3, 4H6.17.8, 1H5.25.9, 4G7.18.8 y/o 5G11.17.1 revelados en la presente memoria. Esto se puede determinar realizando diversos análisis, tales como los descritos en la presente memoria y en los ejemplos. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que los anticuerpos frente a DR4 a los que se hace referencia específicamente en la presente memoria, es posible comparar su actividad en los análisis de bloqueo de DR4 o los análisis de inducción de la apóptosis, tales como aquéllos descritos en los ejemplos que figuran a continuación.

Como se describe más detalladamente en los siguientes ejemplos, se secuenciaron los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo monoclonal 4H6.17.8 murino, y se construyó la forma quimérica del anticuerpo 4H6.17.8 (denominada en la presente memoria "anticuerpo 4H6 quimérico"). La presente invención contempla que los anticuerpos quiméricos anti-DR4 reivindicados tendrán una utilidad terapéutica y/o de diagnóstico, tal como la descrita en la presente memoria. Los anticuerpos anti-DR4 quiméricos, híbridos o recombinantes (así como, por ejemplo, los fragmentos divalentes y trivalentes descritos más detalladamente a continuación) pueden comprender un anticuerpo que tenga cadenas pesadas y ligeras de longitud completa (tales como, p. ej., las cadenas ligeras y pesadas mostradas en las figuras 18A-18H) o fragmentos de las mismas, tales como fragmento Fab, Fab', F(ab')_{2} o Fv, un monómero o un dímero de tal cadena ligera o cadena pesada, un Fv monocatenario en el que tal o tales cadenas pesadas o ligeras estén unidas por una molécula ligadora, o que tenga dominios variables (o dominios hipervariables) de tal o de tales cadenas ligeras o pesadas combinados con incluso otros tipos de dominios del anticuerpo.

En la presente invención, el anticuerpo frente a DR4 comprende una cadena ligera; cadena ligera que incluye un dominio variable que comprende los aminoácidos 20 a 126 de las figuras 18A-18C (SEC ID N.º 9). La cadena ligera de tal anticuerpo frente a DR4 puede comprender opcionalmente una secuencia señal que comprende los aminoácidos 1 a 19 de las figuras 18A-18C (SEC ID N.º 9). Los anticuerpos de la presente invención comprenden además un dominio CH1 humano que comprende los aminoácidos 127 a 233 de las figuras 18A-18C (SEC ID N.º 9), una cadena pesada; cadena pesada que incluye un dominio variable que comprende los aminoácidos 20 a 145 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12) o los aminoácidos 22 a 145 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12). La cadena pesada de tal anticuerpo frente a DR4 puede comprender opcionalmente una secuencia señal que comprende los aminoácidos 1 a 19 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12). Los anticuerpos de la presente invención comprenden además los dominios CH1, CH2 y CH3 humanos que comprenden los aminoácidos 146 a 476 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12).

Se contempla que es posible modificar en términos de la composición de los aminoácidos las diversas regiones o dominios de las secuencias de los anticuerpos descritas en la presente memoria, incluyendo las secuencias del dominio variable (o el dominio hipervariable) (identificadas en las figuras 18A-18H) de las cadenas ligeras y/o pesadas del anticuerpo monoclonal 4H6 murino. Por ejemplo, se contempla la posibilidad de hacer una o más sustituciones conservadoras de los aminoácidos de los dominios variables proporcionados en las figuras 18A-18C o en las figuras 18D-18H. También se contempla la posibilidad de modificar los aminoácidos de una cualquiera o más de las CDR o regiones marco identificadas en los dominios variables mostrados en las figuras 18A-18H.

Tal o tales modificaciones de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser deseables, por ejemplo, para mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Se pueden preparar variantes de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo introduciendo cambios en nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se hace para llegar al constructo final, siempre y cuando el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de los aminoácidos también pueden alterar los procedimientos posteriores a la traducción del anticuerpo, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación. Tales alteraciones se pueden realizar en el anticuerpo parental y/o se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo modificado en el momento de la formación de esa secuencia.

Un procedimiento útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de rastreo de alanina" según lo descrito por Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, se identifica un residuo o un grupo de residuos diana (p. ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y se reemplazan por un aminoácido cargado negativamente o neutro (lo más preferible, alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno. Entonces se mejoran aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones introduciendo más u otras variantes en o para los sitios de sustitución. De este modo, mientras que el sitio para la introducción de una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un determinado sitio, se realiza un rastreo de ala o una mutagénesis aleatoria en el codón o en la región diana, y se rastrean los anticuerpos expresados en cuanto a la propiedad o la actividad deseada.

Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales de una longitud que varía de un residuo a polipéptidos que contienen un centenar o más residuos, así como inserciones intrasecuenciales de un solo o múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado con un agente citotóxico. Otras variantes insercionales de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión del terminal N o C del anticuerpo con una enzima (p. ej., para ADEPT) o un polipéptido que aumente la vida media en suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido de la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan las modificaciones del marco. En la tabla 1, se muestran las sustituciones conservadoras bajo el título de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan como resultado un cambio de la actividad biológica o las propiedades, entonces es posible introducir más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1, o según lo descrito en mayor profundidad más adelante en referencia a las clases de aminoácidos, así como rastrear los productos.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

2

\vskip1.000000\baselineskip

Las modificaciones sustanciales de las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan seleccionando sustituciones que difieren significativamente en cuanto al efecto ejercido sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la estructura del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una configuración de lámina o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el tamaño de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de las cadenas laterales:

(1)

hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2)

hidrófilos neutros: cys, ser, thr;

(3)

ácidos: asp, glu;

(4)

básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5)

residuos que influyen en la orientación de las cadenas: gly, pro; y

(6)

aromáticos: trp, tyr, phe.

\vskip1.000000\baselineskip

Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

También es posible sustituir cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la configuración apropiada del anticuerpo, generalmente, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar un entrecruzamiento anómalo. Por el contrario, es posible añadir un enlace o enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad.

Un tipo particularmente preferido de variante sustitucional implica sustituir uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, la o las variantes resultantes seleccionadas para un mayor desarrollo tendrán mejor actividad biológica o mejores propiedades en comparación con el anticuerpo parental a partir del cual son generadas. Un procedimiento conveniente para generar tales variantes sustitucionales implica la maduración de la afinidad usando un despliegue en fagos. En síntesis, se mutan varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones de aminoácidos posibles en cada sitio. Los anticuerpos así generados desplegados en una forma monovalente desde las partículas de fago filamentoso como fusiones con el producto de gen III de M13 empaquetado en cada partícula. Entonces se rastrean las variantes desplegadas en fagos en cuanto a su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) como se revela en la presente memoria. Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de rastreo de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión con el antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en la presente memoria. Una vez generadas tales variantes, se somete el panel de variantes a un rastreo según lo descrito en la presente memoria, pudiéndose seleccionar los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más análisis relevantes para un mayor desarrollo.

En una realización, el anticuerpo frente a DR4 puede comprender una cadena ligera y/o una cadena pesada que comprenda una secuencia del dominio variable que tenga al menos un 80%, preferiblemente, al menos un 90%, y más preferiblemente, al menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos con una o más de las secuencias del dominio variable, dominio hipervariable o marco identificadas en la presente memoria para el anticuerpo 4H6.

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos frente a DR4 "entrecruzados". El término "entrecruzado", como se usa en la presente memoria, se refiere a la unión de al menos dos moléculas de IgG juntas para formar una (o una sola) molécula. Los anticuerpos frente a DR4 pueden ser entrecruzados usando diversas moléculas ligadoras, preferiblemente, los anticuerpos frente a DR4 son entrecruzados usando una molécula de anti-IgG, un complemento, una modificación química o ingeniería molecular. Los expertos en la técnica saben que el complemento tiene una afinidad relativamente elevada por las moléculas de anticuerpo una vez que los anticuerpos se unen a la membrana de la superficie celular. Por consiguiente, se cree que es posible usar ese complemento como una molécula de entrecruzamiento para unir dos o más anticuerpos anti-DR4 unidos a la membrana de la superficie celular. Entre los diversos isotipos de Ig murina, se sabe que la IgM, IgG2a e IgG2b (tales como los anticuerpos 1H5, 4G7 y 5G11) fijan el complemento. Se analizaron, por tanto, los anticuerpos descritos en los siguientes ejemplos, que pertenecen a las clases de IgG2 murina, en cuanto a la actividad apoptótica en presencia de complemento de conejo. La actividad apoptótica, in vitro, de los anticuerpos entrecruzados (que era comparable con Apo-2L) sugiere que el complemento o los entrecruzadores de IgG-Fc pueden ser útiles en la inducción de la oligomerización de tales anticuerpos frente a DR4, p. ej., la apóptosis de células cancerosas. También se describe en los ejemplos el entrecruzamiento de los otros diversos anticuerpos anti-DR4 usando bien Fc de IgG de cabra antirratón o Fc de IgG de cabra anti-humana. Cabe destacar que para los estudios in vivo descritos en los ejemplos, se siguió observando actividad apoptótica incluso sin haber entrecruzado antes de su administración los anticuerpos frente a DR4 administrados.

\newpage

Los anticuerpos de la invención pueden comprender opcionalmente anticuerpos diméricos, así como formas multivalentes de anticuerpos. Los expertos en la técnica pueden construir tales dímeros o formas multivalentes mediante técnicas conocidas en la técnica y usando los anticuerpos frente a DR4 de la presente memoria.

Los anticuerpos también pueden comprender anticuerpos monovalentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. La cadena pesada está truncada generalmente en cualquier punto de la región Fc para evitar el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son sustituidos por otro residuo de aminoácido o son eliminados para evitar el entrecruzamiento.

Los procedimientos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos Fab, se puede realizar usando técnicas rutinarias conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar la digestión usando papaína. Los ejemplos de digestión con papaína se describen en el documento WO 94/29348 publicado el 12/22/94 y en la patente estadounidense n.º 4.342.566. La digestión con papaína de los anticuerpos produce comúnmente dos fragmentos de unión antigénica idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de unión antigénica, y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de combinación antigénica y sigue siendo capaz de entrecruzar el antígeno.

Los fragmentos Fab producidos en la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH_{1}) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el terminal carboxilo del dominio CH_{1} de la cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación de la presente memoria de Fab' en el que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')_{2} fueron producidos originariamente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

También se puede producir fragmentos Fv monocatenarios, tales como los descritos en Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997). El acoplamiento de tales fragmentos monocatenarios usando diversos ligadores se describe en Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997).

Además de los anticuerpos descritos anteriormente, se contempla la posibilidad de preparar anticuerpos quiméricos o híbridos in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquéllos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace de tipo tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados a tal efecto incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

Los anticuerpos frente a DR4 pueden comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej. murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de unión antigénica de los anticuerpos) que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor están reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como de ratón, rata o conejo, que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región marco de Fv de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. El anticuerpo humanizado puede comprender también residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno y, comúnmente, dos dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquéllas de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente al menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, comúnmente, la de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Los procedimientos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos procedentes de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se denominan habitualmente residuos "importados", que son tomados comúnmente de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], mediante la sustitución de CDR o secuencias de CDR de roedor por las correspondiente secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense n.º 4.816.567), en los que se ha sustituido sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos de CDR y, posiblemente, algunos residuos de FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

\newpage

La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, para su uso en la producción de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. Según el procedimiento del "mejor ajuste", se rastrea la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor frente a una genoteca entera de secuencias de dominios variables humanos conocidos. Entonces se acepta la secuencia humana más cercana a la del roedor como el marco (FR) humano para el anticuerpo humanizado [Sims et al., J. Immunol., 151:2296-2308 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]. Otro procedimiento usa un marco concreto derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras y pesadas. Se puede usar el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:4285-4289 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623-2632 (1993)].

Además es importante que los anticuerpos sean humanizados con la conservación de la afinidad elevada por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para alcanzar este objetivo, según un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Hay programas informáticos disponibles que ilustran y muestran las estructuras configuracionales tridimensionales probables de las secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. El examen de estos despliegues permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, i.e., el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse con su antígeno. De este modo, se pueden seleccionar residuos de FR y combinarlos desde la secuencia consenso e importada, tal que se consigan la característica del anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno o los antígenos diana. En general, los residuos de la CDR están implicados directamente y más sustancialmente en la influencia de la unión antigénica [véase el documento WO 94/04679 publicado el 3 de marzo de 1994].

Es posible producir anticuerpos monoclonales humanos mediante una adaptación del procedimiento del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y Milstein usando linfocitos B humanos como pareja de fusión. Los linfocitos B humanos que producen un anticuerpo de interés se pueden, por ejemplo, aislar de un individuo humano tras obtener el consentimiento informado. Por ejemplo, el individuo puede estar produciendo anticuerpos frente a un auto-antígeno como sucede con ciertos trastornos, tales como el lupus eritematoso sistémico (Shoenfeld et al. J. Clin. Invest., 70:205 (1982)), la púrpura trombocitopénica inmune (PTI) (Nugent et al. Blood, 70(1):16-22 (1987)) o el cáncer. Alternativamente, o además, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Por ejemplo, es posible exponer linfocitos de sangre periférica humanos aislados in vitro ante un agente lisomotrófico (p. ej., L-leucina-O-metiléster, dimetiléster de ácido L-glutámico o L-leucil-L-leucina-O-metiléster) (patente estadounidense n. 5.567.610, Borrebaeck et al.); y/o es posible tratar los linfocitos de sangre periférica humanos agotados en células T in vitro con adyuvantes tales como 8-mercaptoguanosina y citoquinas (patente estadounidense n.º 5.229.275, Goroff et al).

Los linfocitos B recuperados del sujeto o inmunizados in vitro, son entonces, por lo general, inmortalizados para generar un anticuerpo monoclonal humano. Las técnicas para inmortalizar el linfocito B incluyen, pero no se limitan a: (a) fusión del linfocito B humano con mielomas humanos o murinos, o con células de heteromieloma de ratón-ser humano; (b) transformación vírica (p. ej., con el virus de Epstein-Barr; véase Nugent et al., supra, por ejemplo); (c) fusión con una línea celular de linfoblastoide; o (d) fusión con células de linfoma.

Es posible fusionar los linfocitos con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma así preparadas se pueden sembrar y cultivar en un medio de cultivo adecuado que contenga preferiblemente una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales sin fusionar. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá comúnmente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón y ser humano adecuadas (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)). Se analiza el medio de cultivo en el que se cultivan células de hibridoma en cuanto a la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente al antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoanálisis (RIA) o un análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA).

Una vez identificadas las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, la afinidad y/o la actividad deseadas, se pueden subclonar los clones mediante procedimientos de dilución limitante, y cultivarlos mediante procedimientos estándar (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados a este efecto incluyen, por ejemplo, D-MEM o medio RPMI-1640. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, del fluido de ascitos o del suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, cromatografía sobre proteína A, electroforesis sobre gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

También se pueden generar anticuerpos humanos usando un huésped no humano, tal como un ratón, que sea capaz de producir anticuerpos humanos. Como se señala anteriormente, ahora hay disponibles ratones transgénicos que son capaces, tras una inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión de las cadenas pesadas de los anticuerpos (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes de la línea germinal resulta en la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de la línea germinal humana a tal ratón mutante de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras el desafío antigénico. Véase, p. Ej., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patente estadounidense n.º 5.591.669; patente estadounidense n.º 5.589.369; y patente estadounidense n.º 5.545.807. También se pueden preparar anticuerpos humanos usando ratones SCID-hu (Duchosal et al, Nature. 355:258-262 (1992)).

En otra realización, es posible seleccionar el anticuerpo humano de una genoteca de despliegue en fagos de anticuerpos humanos. La preparación de genotecas de anticuerpos o de fragmentos de los mismos es conocida en la técnica, pudiéndose usar cualquiera de los procedimientos conocidos para construir una familia de vectores de transformación que se puedan introducir en células huésped. Las genotecas de cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo en fagos (Huse et al., Science, 246:1275 (1989)) o de proteínas de fusión en fagos o fagémidos se pueden preparar según procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 88:7978-7982 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 89:4457-4461 (1992); Griffiths et al., EMBO Journal, 13:3245-3260 (1994); de Kruif et al., J. Mol. Biol., 248:97-105 (1995); WO 98/05344; WO 98/15833; WO 97/47314; WO 97/44491; WO 97/35196; WO 95/34648; patente estadounidense n.º 5.712.089; patente estadounidense n.º 5.702.892; patente estadounidense n.º 5.427.908; patente estadounidense n.º 5.403.484; patente estadounidense n.º 5.432.018; patente estadounidense n.º 5.270.170; WO 92/06176; WO 99/06587; patente estadounidense n.º 5.514.548; WO97/08320; y patente estadounidense n.º 5.702.892. Se hace pasar el antígeno de interés por la genoteca de fagos usando procedimientos conocidos en el campo de la selección de anticuerpos en fagos que se unen al antígeno diana.

Los anticuerpos frente a DR4, según lo descrito en la presente memoria, poseerán opcionalmente una o más actividades biológicas o propiedades deseadas. Tales anticuerpos frente a DR4 pueden incluir, pero sin limitarse a, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos y de afinidad madurada. Según lo descrito anteriormente, es posible construir o diseñar los anticuerpos frente a DR4 usando diversas técnicas para alcanzar estas actividades o propiedades deseadas. En una realización, el anticuerpo frente a DR4 tendrá una afinidad de unión con el receptor DR4 de al menos 10^{5} M^{-1}, preferiblemente, de al menos en el intervalo de 10^{6} M^{-1} a 10^{7} M^{-1}, más preferiblemente, de al menos en el intervalo de 10^{8} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}, e incluso más preferiblemente, de al menos en el intervalo de 10^{9} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}. Es posible determinar la afinidad de unión del anticuerpo frente a DR4 sin la necesidad de una experimentación, analizando el anticuerpo frente a DR4 según técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el análisis de Scatchard (véase Munson et al., supra) y el análisis KinExA^{TM} (véase el ejemplo 9). Opcionalmente, se puede analizar el anticuerpo frente a DR4 en cuanto a su afinidad de unión usando el análisis KinExA^{TM} descrito en el ejemplo 9 y determinando la afinidad
de unión del anticuerpo frente a DR4 por el constructo receptor de IgG de DR4, según lo descrito en el ejemplo 9.

En otra realización, el anticuerpo frente a DR4 de la invención se puede unir al mismo epítopo de DR4 al que se une Apo-2L, o se puede unir a un epítopo de DR4 que coincida o se solape con el epítopo de DR4 al que se une Apo-2L. El anticuerpo frente a DR4 también puede interactuar de tal modo que cree una configuración esteárica que evite la unión del ligando Apo-2 con DR4. La propiedad de unión epitópica de un anticuerpo frente a DR4 de la presente invención se puede determinar usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, es posible analizar el anticuerpo frente a DR4 en un análisis in vitro, tal como un análisis de inhibición competitiva, para determinar la capacidad del anticuerpo frente a DR4 para bloquear o inhibir la unión del Apo-2L con DR4. Opcionalmente, es posible analizar el anticuerpo frente a DR4 en un análisis de inhibición competitiva para determinar la capacidad del anticuerpo frente a DR4 para inhibir la unión de un polipéptido Apo-2L (tal como el descrito en el ejemplo 17) con un constructo de IgG de DR4 (tal como el descrito en el ejemplo 1) o con una célula que exprese DR4. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR4 será capaz de bloquear o inhibir la unión de Apo-2L con DR4 en al menos el 50%, preferiblemente, en al menos el 75% e, incluso más preferiblemente, en al menos el 90%, lo que se puede determinar, a modo de ejemplo, en un análisis de inhibición competitiva in vitro usando una forma soluble del ligando Apo-2 (TRAIL) y un ECD de IgG de DR4 (tal como el descrito en el ejemplo 1). La propiedad de unión epitópica de un anticuerpo frente a DR4 también se puede determinar usando análisis in vitro para analizar la capacidad del anticuerpo frente a DR4 de bloquear la apóptosis inducida por Apo-2L. Por ejemplo, es posible analizar el anticuerpo frente a DR4 en el análisis descrito en el ejemplo 4 para determinar la capacidad del anticuerpo frente a DR4 de bloquear la apóptosis inducida por Apo-2L en células 9D (u otras células cancerosas que expresen el receptor DR4). Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR4 será capaz de bloquear o inhibir la apóptosis inducida por Apo-2L en un tipo de célula cancerosa de mamífero en al menos el 50%, preferiblemente, en al menos el 75%, e incluso más preferiblemente, en al menos el 90% o el 95%, lo que se puede determinar, por ejemplo, en un análisis in vitro descrito en el ejemplo 4.

En una realización más, el anticuerpo frente a DR4 comprenderá un anticuerpo agonista que tendrá una actividad comparable con la del ligando Apo-2 (TRAIL). Preferiblemente, tal anticuerpo frente a DR4 agonista inducirá la apóptosis en al menos un tipo de cáncer, línea celular tumoral o tumor primario. La actividad apoptótica de un anticuerpo frente a DR4 agonista se puede determinar usando análisis in vitro o in vivo conocidos. Los ejemplos de tales análisis in vitro e in vivo se describen detalladamente en el apartado de ejemplos que se presenta a continuación. La actividad apoptótica in vitro se puede determinar usando técnicas conocidas tales como la unión con anexina V. La actividad apoptótica in vivo se puede determinar, p. ej., midiendo la reducción de la carga o del volumen tumoral.

3. Anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente, humanos o humanizados que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el caso que nos ocupa, una de las especificidades de unión es por el DR4, la otra es por cualquier otro antígeno y, preferiblemente, por una proteína o un receptor o una subunidad receptora de la superficie celular.

Los procedimientos para producir anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se realiza habitualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad. En el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991), se revelan procedimientos similares.

Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar con secuencias de los dominios constantes de inmunoglobulinas. La fusión se realiza preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para la unión con la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN codificantes de las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, de la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados, y son co-transfectados a un organismo huésped adecuado. Para más información sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., "Methods in Enzymology", 121:210 (1986).

\vskip1.000000\baselineskip

4. Anticuerpos heteroconjugados

Los anticuerpos heteroconjugados también pertenecen al ámbito de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos mediante enlace covalente. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, a células del sistema inmune diana frente a células no deseadas [patente estadounidense n.º 4.676.980] y para el tratamiento de la infección por VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Se contempla la posibilidad de preparar los anticuerpos in vitro usando procedimientos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquéllos que implican agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, se pueden construir inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un enlace de tipo tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados a tal efecto incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato, así como aquéllos revelados en, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.676.980.

\vskip1.000000\baselineskip

5. Fragmentos trivalentes

Los fragmentos trivalentes también pertenecen al ámbito de la invención. Tales anticuerpos se describen, por ejemplo, en Iliades et al., supra y Kortt et al., supra.

\vskip1.000000\baselineskip

6. Otras modificaciones

En la presente memoria, se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos frente a DR4. Es posible modificar los anticuerpos de la presente invención conjugando el anticuerpo con un agente citotóxico (como una molécula de toxina) o una enzima de activación de un profármaco, que convierta un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01145) en un fármaco anticanceroso activo. Véase, por ejemplo el documento WO 88/07378 y la patente estadounidense n.º 4.975.278. Esta tecnología también se denomina "terapia de profármaco mediado por enzima dependiente de un anticuerpo" (ADEPT).

El componente enzimático del inmunoconjugado útil en la ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de un modo tal que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el procedimiento de esta invención incluyen, pero no se limitan a, alcalina fosfatasa, útil en la conversión de profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; la arilsulfatasa, útil en la conversión de profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; la citosina desaminasa, útil en la conversión de 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; proteasas, tales como la proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles en la conversión de profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; caspasas, tales como caspasa-3; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles en la conversión de profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas de escisión de carbohidratos, tales como beta-galactosidasa y neuraminidasa, útiles en la conversión de profármacos glicosilados en fármacos libres; beta-lactamasa, útil en la conversión de fármacos derivados con beta-lactamos en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V-amidasa o penicilina G-amidasa, útiles en la conversión de fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "abzimas", para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, p. ej., Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima se pueden preparar según lo descrito en la presente memoria para enviar la abzima a una población de células tumorales.

Es posible unir las enzimas covalentemente con los anticuerpos mediante técnicas conocidas en la técnica, tales como el uso de reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales. Alternativamente, se pueden construir proteínas de fusión que comprendan al menos la región de unión antigénica de un anticuerpo de la invención unida con al menos una parte funcionalmente activa de una enzima de la invención usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica (véase, p. ej., Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984).

Además se contemplan modificaciones en los anticuerpos. Por ejemplo, se puede unir el anticuerpo con uno de una variedad de polímeros no proteínicos, p. ej., polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. También se puede atrapar el anticuerpo en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente), en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se revelan en Remington's Pharmaceutical Sciences, XVI edición, Oslo, A., Ed., (1980). Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, es posible incorporar un epítopo de unión a receptores silvestres en el anticuerpo (especialmente, un fragmento de anticuerpo) según lo descrito en la patente estadounidense n. 5.739.277, por ejemplo. Como se usa en las presente memoria, el término "epítopo de unión a receptores silvestres" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} o IgG_{4}) que es responsable de aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula de IgG.

\vskip1.000000\baselineskip

7. Procedimientos recombinantes

La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados codificantes de anticuerpos frente a DR4 según lo revelado en la presente memoria, vectores y células huésped que comprendan el ácido nucleico y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, se aísla el ácido nucleico codificante del mismo y se inserta en un vector replicable para una posterior clonación (amplificación del ADN) o expresión. El ADN codificante del anticuerpo se puede aislar fácilmente y secuenciar usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótido que sean capaces de unirse específicamente a genes codificantes del anticuerpo). Hay muchos vectores disponibles. Los componentes vectoriales incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Los procedimientos de la presente memoria incluyen procedimientos para la producción de anticuerpos anti-DR4 quiméricos o recombinantes que comprenden las etapas de proporcionar un vector que comprenda una secuencia de ADN codificante de una cadena ligera o una cadena pesada de un anticuerpo anti-DR4 (o tanto una cadena ligera como una cadena pesada), transfectar o transformar una célula huésped con el vector y cultivar la o las células huésped en condiciones suficientes para generar el producto de anticuerpo anti-DR4 recombinante. En una realización, se contempla que la cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo producido recombinantemente puede comprender todos o parte de los dominios variables del anticuerpo 4H6 murino revelado aquí.

\vskip1.000000\baselineskip

(i) Componente de secuencia señal

El anticuerpo anti-DR4 de esta invención se puede producir recombinantemente, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que sea preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el terminal N de la proteína madura o el polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una que sea reconocida y procesada (i.e., escindida por una señal peptidasa) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal nativa del anticuerpo, la secuencia señal es sustituida por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la alcalino-fosfatasa, penicilinasa, lpp o líderes de la enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levaduras, la secuencia señal nativa puede ser sustituida por, p. ej., el líder de la invertasa de levaduras, líder del factor \alpha (incluyendo líderes de factores \alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces) o líder de fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión de células de mamífero, hay disponibles secuencias señal de mamífero, así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

El ADN de tal región precursora es unido en el marco de lectura con el ADN codificante del anticuerpo.

\vskip1.000000\baselineskip

(ii) Componente de origen de replicación

Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permita la replicación del vector independientemente del ADN cromosómico del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónomas. Tales secuencias son conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2\mu es adecuado para la levadura y diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (comúnmente, se puede usar el origen SV40 solo, porque contiene el promotor temprano).

\vskip1.000000\baselineskip

(iii) Selección del componente génico

Los vectores de expresión y de clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Los genes de selección más comunes codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes fundamentales no disponibles en los medios complejos, p. ej., el gen codificante de la D-alanina racemasa para los bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas satisfactoriamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, por tanto, conservan el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquéllos que permiten la identificación de células competentes para la absorción de ácido nucleico del anticuerpo, tal como la DHFR, timidina quinasa, metalotioneína I y II, preferiblemente, genes de metalotioneína de primate, adenosina diaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección de la DHFR son identificadas primero mediante el cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de la DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo natural es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad de la DHFR.

Alternativamente, es posible seleccionar células huésped (particularmente, huéspedes de tipo natural que contienen DHFR endógena) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN codificantes del anticuerpo anti-DR4, la proteína DHFR de tipo natural y otro marcador seleccionable, tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) mediante el crecimiento celular en medio que contiene un agente selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente estadounidense n.º 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 [Stinchcomb, et al., Nature 282:39 (1979)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC N.º 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics 85:12 (1977). La presencia de la lesión de trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un medio ambiente eficaz para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 ó 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Además, se pueden usar vectores derivados del plásmido circular de 1,6 \mum pKD1 para la transformación de levaduras de Kluyveromyces. Alternativamente, se publicó un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina bovina recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión de varias copias estables para la secreción albúmina de suero humano recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

\vskip1.000000\baselineskip

(iv) Componente promotor

Los vectores de expresión y de clonación habitualmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está ligado operativamente al ácido nucleico del anticuerpo. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de \beta-lactamasa y lactosa, la alcalino fosfatasa, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, hay disponibles otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operativamente al ADN codificante del anticuerpo anti-DR4.

\newpage

Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases secuencia arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada de 70 a 80 bases secuencia arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas hay una secuencia ATA, que puede ser la señal para la adición de la cola poli(A) en el extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias están insertadas adecuadamente en los vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura que son promotores inducibles, que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C y fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. En el documento EP 73.657, se describen más detalladamente los vectores y los promotores adecuados para su uso en la expresión de levaduras. Los potenciadores de levadura también se usan ventajosamente con promotores de levadura.

La transcripción del anticuerpo anti-DR4 desde vectores de células huésped de mamífero se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, lo más preferiblemente, el virus 40 de simio (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, p. ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, siempre y cuando tales promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindIII E. En la patente estadounidense n.º 4.419.446, se revela un sistema de expresión de ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector. En la patente estadounidense n.º 4.601.978, se describe una modificación de este sistema. Véase también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc de \beta-interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, se puede usar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

\vskip1.000000\baselineskip

(v) Componente de elemento potenciador

Habitualmente, la transcripción de un ADN codificante del anticuerpo anti-DR4 de esta invención por eucariotas superiores se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Ahora se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Sin embargo, lo común es usar un potenciador de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el último lado del origen de replicación (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma sobre el último lado del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucariotas. Se puede cortar el potenciador y empalmarlo en el vector en la posición 5' ó 3' con respecto a la secuencia codificante del anticuerpo, pero lo preferible es ubicarlo en un sitio 5' desde el promotor.

\vskip1.000000\baselineskip

(vi) Componente de terminación de la transcripción

Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongos, insecto, planta, animal, ser humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias se encuentran comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas de 5' y, ocasionalmente, de 3' de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm codificante del anticuerpo multivalente. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión revelado en esa memoria.

\vskip1.000000\baselineskip

(vii) Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores de la presente memoria son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores anteriormente descritas. Los procariotas adecuados a tal efecto incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, enterobacteriaceas tales como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, p. ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., B. licheniformis 41P revelado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque hay otras cepas adecuadas, tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos y no restrictivos.

Además de los procariotas, los microbios eucariotas, tales como los hongos filamentosos o la levadura, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores codificantes del anticuerpo frente a DR4. Saccharomyces cerevisiae, o una levadura de Baker común, es el usado más comúnmente entre los microorganismos huésped eucariotas inferiores. Sin embargo, hay un número de otros géneros, especies y cepas que están comúnmente disponibles y son útiles en la presente memoria, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces, tales como, p. ej., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos, tales como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes de Aspergillus, tales como A. nidulans y A. Níger.

Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado están derivadas de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células vegetales y de insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes bacuvirales, así como las correspondientes células huésped de insectos permisivos de huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Hay disponibles al público una variedad de cepas virales para la transfección, p. ej., la variante L-1 del VPN de Autographa californica y la cepa Bm-5 del VPN de Bombyx mori, pudiéndose usar tales virus como virus de la presente memoria según la presente invención, particularmente, para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar como huéspedes cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el mayor interés se ha tenido en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario. Los ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 ó 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham, et al., J. Gen Virol., 36 (59): 1977)); células de riñón de hámster neonato (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñón de ratas Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de riñón humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2); y células de mieloma o linfoma (p. ej., células Y0, J558L, P3 y NS0; (véase la patente estadounidense n.º 5.807.715).

Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o de clonación descritos anteriormente para la producción del anticuerpo, y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según proceda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.

\vskip1.000000\baselineskip

(viii) Cultivo de células huésped

Las células huésped usadas para producir el anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como Ham's F10 (Sigma), medio esencial mínimo (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuado para cultivar las células huésped. Además, se puede usar cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), las patentes estadounidenses n.º 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente estadounidense Re. 30.985 como medios de cultivo para las células huésped. Se puede complementar cualquiera de estos medios si fuera necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente energética equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto habitual de la técnica.

\vskip1.000000\baselineskip

(ix) Purificación

Cuando se usan técnicas recombinantes, se puede generar el anticuerpo intracelularmente, en el espacio periplásmico, o se puede secretar directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido intracelularmente, como una primera etapa, se retira el residuo particulado, bien las células huésped o los fragmentos lisados, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados en el espacio periplásmico de E. coli. En síntesis, se funde la pasta celular en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los residuos celulares se pueden eliminar por centrifugación. Cuando se secreta el anticuerpo en el medio, primero se concentran generalmente los sobrenadantes de tales sistemas de expresión usando un filtro de concentración de proteínas comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Pellicon de Millipore. Se puede incluir un inhibidor de la proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis, pudiéndose incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición del anticuerpo preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía sobre hidroxilapatita, electroforesis sobre gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y del isotipo de cualquier región Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo. Se puede usar proteína A para purificar los anticuerpos que estén basados en las cadenas pesadas \gamma1, \gamma2 o \gamma4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para \gamma3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Lo más habitual es que la matriz a la que se une el ligando de afinidad sea agarosa, pero hay otras matrices disponibles. Las matrices estables mecánicamente, tales como el vidrio de poro controlado o el poli(estirendivinil)benceno permiten mayores caudales y menores tiempos de procesamiento de los que se pueden obtener con la agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C_{H}3, la resina ABX^{TM} de Bakerbond (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. También hay disponibles, en función del anticuerpo que se vaya a recuperar, otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico, la precipitación en etanol, la CLAR en fase inversa, la cromatografía sobre sílice, la cromatografía sobre heparina-SEPHAROSE^{TM}, la cromatografía sobre una resina de intercambio iónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y la precipitación en sulfato de amonio.

\vskip1.000000\baselineskip

B. Usos de los anticuerpos frente a DR4

Los anticuerpos frente a DR4 de la invención tienen diversas utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos agonistas de DR4 se pueden emplear en usos médicos para tratar condiciones patológicas en mamíferos, tales como el cáncer o enfermedades inmunes. En los usos médicos, se administra el anticuerpo frente a DR4, preferiblemente, un anticuerpo agonista, a un mamífero, solo o en combinación con incluso otros agentes terapéuticos o técnicas terapéuticas.

El diagnóstico en mamíferos de las diversas condiciones patológicas descritas en la presente memoria lo puede realizar el profesional experto. En la técnica, hay disponibles técnicas de diagnóstico que permiten, p. ej., el diagnóstico o la detección del cáncer o de enfermedades inmunes en un mamífero. Por ejemplo, se pueden identificar cánceres mediante técnicas, incluyendo, pero no limitándose a, la palpación, el análisis de sangre, rayos X, RMN y similares. Las enfermedades inmunes también se pueden identificar fácilmente. En el lupus eritematoso sistémico, el mediador principal de la enfermedad es la producción de anticuerpos auto-reactivos frente a las propias proteínas/tejidos, y la posterior generación de una inflamación mediada por el sistema inmune. Son muchos los órganos y los sistemas que se ven afectados clínicamente, incluyendo el riñón, los pulmones, el sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojos, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tracto gastrointestinal, médula ósea y sangre.

La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que implica principalmente a la membrana sinovial de múltiples articulaciones que resulta en el daño del cartílago articular. La patogénesis es dependiente de los linfocitos T y está asociada con la producción de factores reumatoides, auto-anticuerpos dirigidos frente a la propia IgG, con el resultado de la formación de complejos inmunes que alcanzan niveles elevados en el fluido articular o la sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir a la infiltración notable de linfocitos y monocitos en el sinovio y posteriores cambios sinoviales notables; el espacio/fluido articular es infiltrado por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son fundamentalmente las articulaciones, habitualmente, siguiendo un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad extra-articular también tiene lugar de dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extra-articulares con la enfermedad articular progresiva en curso y lesiones típicas de la fibrosis pulmonar, la vasculitis y las úlceras cutáneas. La segunda forma de la enfermedad extra-articular es el denominado síndrome de Felty, que tiene lugar en una etapa tardía de la enfermedad de RA, a veces una vez que la enfermedad articular se ha vuelto quiescente, e implica la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede estar acompañado por vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras cutáneas y gangrena. Los pacientes a menudo desarrollan nódulos reumatoides en el tejido subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas; la etapa tardía de los nódulos tiene centros necróticos rodeados por un infiltrado celular inflamatorio mixto. Otras manifestaciones que pueden tener lugar en la AR incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, pneumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis sicca y nódulos
reumáticos.

La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que comienza habitualmente a una edad inferior a los 16 años. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la AR; algunos pacientes que son positivos en el factor reumatoide están clasificados como artritis reumatoide juvenil. Esta enfermedad está subclasificada en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser grave y es comúnmente destructiva, y conduce a la anquilosis articular y al retraso del crecimiento. Otras manifestaciones pueden incluir uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con algunas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Los trastornos incluyen: esponilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada con la enfermedad inflamatoria intestinal, espondilitis asociada con la psoriasis, espondiloartropatía de aparición en la juventud y espondiloartropatía no diferenciada. Los rasgos diferenciadores incluyen la sacroileitis con o sin espondilitis; la artritis asimétrica inflamatoria; la asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del CPH de clase I); la inflamación ocular y la ausencia de auto-anticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave en la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que se dirige al antígeno presentada por las moléculas del CPH de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar frente al alelo HLA-B27 del CPH de clase I como si éste fuera un péptido foráneo expresado por las moléculas del CPH de clase I. Se ha planteado la hipótesis de que un epítopo de HLA-B27 puede imitar un epítopo antigénico bacteriano u otro epítopo antigénico microbiano, e inducir así una respuesta de las células T CD8+.

La esclerosis sistémica (esclerodermia) tiene una etiología desconocida. Un distintivo de la enfermedad es la induración de la piel; probablemente, ésta es inducida por un procedimiento inflamatorio activo. La esclerodermia puede ser localizada o sistémica; las lesiones vasculares son comunes y la lesión de las células endoteliales de la microvasculatura es un hecho temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede estar mediada por el sistema inmune. La base inmunológica está implicada por la presencia de infiltrados celulares mononucleares en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos anti-nucleares en muchos pacientes. ICAM-1 es habitualmente regulado sobre la superficie celular de fibroblastos en lesiones cutáneas, lo que sugiere que la interacción de las células T con estas células puede desempeñar un papel en la patogénesis de la enfermedad. Otros órganos implicados incluyen: el tracto gastrointestinal: atrofria y fibrosis del músculo liso que resultan en peristalsis/motilidad anormal; riñón: proliferación intimal subendotelial concéntrica que afecta a las arterias interlobulares y arqueadas pequeñas con el resultado de una reducción del flujo sanguíneo cortical renal, da como resultado proteinuria, azotemia e hipertensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmones: peumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón: necrosis en la banda de contracción, cicatrización/fibrosis.

Las miopatías inflamatorias idiopáticas que incluyen la dermatomiositis, la polimiositis y otras enfermedades, son trastornos de la inflamación muscular crónica de una etiología desconocida que dan como resultado una debilidad muscular. La inflamación/el daño muscular es a menudo simétrico y progresivo. La mayoría de las formas tienen asociados auto-anticuerpos. Estos auto-anticuerpos específicos de la miositis se dirigen frente e inhiben la función de componentes, proteínas y ARN, implicados en la síntesis de proteínas.

El síndrome de Sjogren se debe a la inflamación mediada por el sistema inmune y la posterior destrucción funcional de las glándulas lagrimales y salivales. La enfermedad puede estar asociada con o acompañada por enfermedades inflamatorias de los tejidos conjuntivos. La enfermedad está asociada con la producción de auto-anticuerpos frente a los antígenos Ro y La, ambos de los cuales son complejos pequeños de ARN-proteína. Las lesiones dan como resultado queratoconjuntivitis sicca, xerostomía con otras manifestaciones o asociaciones, incluyendo cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial y púrpura palpable.

Las vasculitis sistémicas son enfermedades en las que la lesión principal es una inflamación y el posterior daño de los vasos sanguíneos que da como resultado una isquemia/necrosis/degeneración en los tejidos abastecidos por los vasos afectados y, en algunos casos, finalmente, una disfunción endorgánica. Las vasculitis también pueden tener lugar como lesión secundaria o secuelas de otras enfermedades mediadas por el sistema inmunoinflamatorio, tales como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., particularmente, en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades del grupo de las vasculitis sistémica primarias incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angeítis alérgica y granulomatosa, poliangeítis; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide y arteritis de células gigantes. Las vasculitis heterogéneas incluyen: el síndrome de los nódulos linfáticos mucocutáneos (SNLM o enfermedad de Kawasaki), la vasculitis aislada del SNC, la enfermedad de Behet, tromboangeítis obliterans (enfermedad de Buerger) y la venulitis necrotizante cutánea. Se cree que el mecanismo patógeno de la mayoría de los tipos de vasculitis enumerados se debe fundamentalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared vascular y la posterior inducción de una respuesta inflamatoria bien mediante la CCDA, la activación de complementos o ambas.

La sarcoidosis es una condición de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido del cuerpo; lo más común es la implicación de los pulmones. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos y células linfoides activados en zonas de la enfermedad con las posteriores secuelas crónicas que resultan de la liberación de productos activos local o sistémicamente liberados por estos tipos de células.

La anemia hemolítica autoinmune, incluyendo la anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune y la hemoglobinuria nocturna paroxismal, es el resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados sobre la superficie de los glóbulos rojos (y, en algunos casos, otras células sanguíneas incluyendo también las plaquetas) y es un reflejo de la eliminación de aquellas células revestidas de los anticuerpos mediante una lisis mediada por complementos y/o CCDA/mecanismos mediados receptores de Fc.

En la trombocitopenia autoinmune, incluyendo la púrpura trombocitopénica y la trombocitopenia inmune en otros entornos clínicos, la destrucción/eliminación de plaquetas tiene lugar como resultado de la unión de bien anticuerpos o complementos con las plaquetas y la posterior eliminación mediante la lisis de complementos, la CCDA o mecanismos mediados por el receptor de Fc.

Las tiroiditis, incluyendo la enfermedad de Grave, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, son el resultado de una respuesta inmune frente a antígenos tiroideos con la producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes en, y habitualmente específicas de, la glándula tiroidea. Existen modelos experimentales incluyendo modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollo obeso); modelos inducibles: la inmunización de animales bien con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea).

La diabetes mellitus de tipo I o la diabetes insulinodependiente es la destrucción autoinmune de células \beta de los islotes pancreáticos; esta destrucción está mediada por auto-anticuerpos y células T auto-reactivas. Los anticuerpos frente a la insulina o al receptor de insulina también pueden producir el fenotipo de no sensibilidad a la insulina.

Las enfermedades renales inmunes, incluyendo glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, son el resultado del daño mediado por los anticuerpos o linfocitos T en el tejido renal bien directamente como resultado de la producción de anticuerpos auto-reactivos o de células T frente a antígenos renales, o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón que son reactivos frente a otros antígenos no renales. De este modo, otras enfermedades inmunes que dan como resultado la formación de complejos inmunes también pueden inducir la enfermedad renal inmune como una secuela indirecta. Los mecanismos inmunes tanto directos como indirectos dan como resultado la respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con la afección de la función orgánica resultante y, en algunos casos, la progresión hacia la insuficiencia renal. Los mecanismos inmunes tanto humorales como celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las
lesiones.

Se cree que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo la esclerosis múltiple; polineuropatía desmielinizante periférica o síndrome de Guillain-Barr; y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, tienen una base auto-inmune y dan como resultado la desmielinización de los nervios como resultado del daño causado en los oligodendrocitos o directamente en la mielina. En la EM hay pruebas que sugieren que la inducción y la progresión de la enfermedad depende de los linfocitos T. La esclerosis múltiple es una enfermedad desmielinizante que depende de los linfocitos T y que cursa bien de un modo recurrente-remitente o progresivo crónico. La etiología es desconocida; sin embargo, contribuyen tanto las infecciones víricas, como la predisposición genética, el medio ambiente y la auto-inmunidad. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales predominantemente mediadas por linfocitos T y macrófagos de infiltración; siendo los linfocitos T CD4+ el tipo de célula predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte de células de oligodendrocitos y la posterior desmielinización es desconocido, pero es probable que esté dirigido por los linfocitos T.

La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo las pneumonías eosinófilas; la fibrosis pulmonar idiopática y la pneumonitis por hipersensibilidad puede implicar una respuesta inmuno-inflamatoria no regulada. La inhibición de esa respuesta tendría un beneficio terapéutico.

La enfermedad cutánea inmune o autoinmune, incluyendo las enfermedades cutáneas vesiculares, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto, están mediadas por auto-anticuerpos, cuya génesis depende de los linfocitos T.

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadores de antígenos, así como algunos neutrófilos.

Las enfermedades alérgicas, incluyendo asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensivilidad alimentaria y urticaria, dependen de los linfocitos T. Estas enfermedades están mediadas predominantemente por la inflamación inducida por linfocitos T, la inflamación mediada por IgE o una combinación de ambas.

Las enfermedades asociadas con los transplantes, incluyendo el rechazo de injertos y la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH), dependen de los linfocitos T; siendo paliativa la inhibición de la función de los linfocitos T.

Otras enfermedades en las que la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria es beneficiosa son las enfermedades infecciosas, incluyendo, pero no limitándose a, la infección vírica (incluyendo, pero no limitándose a, SIDA, hepatitis A, B, C, D, E), la infección bacteriana, infecciones micóticas e infecciones por protozoos y parásitos (se pueden utilizar terapéuticamente moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan el MLR para aumentar la respuesta inmune a los agentes infecciosos), enfermedades de inmunodeficiencia (se pueden utilizar terapéuticamente moléculas/derivados/agonistas que estimulan el MLR para aumentar la respuesta inmune para condiciones de inmunodeficiencia heredada, adquirida, inducida por una infección (tal como la infección por VIH) o iatrogénica (i.e., a partir de una quimioterapia)), y neoplasia.

El anticuerpo se administra preferiblemente al mamífero en un vehículo, preferiblemente, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En "Remington's Pharmaceutical Sciences", XVI edición, 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo et al., se describen vehículos adecuados y sus formulaciones. Comúnmente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para volver la formulación isotónica. Los ejemplos del vehículo incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más preferiblemente, de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando las matrices en forma de artículos conformados, p. ej., de películas, liposomas o micropartículas. Resultará evidente para aquéllos expertos en la técnica que ciertos vehículos pueden ser más preferibles en función de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración del anticuerpo que esté siendo administrado.

Se puede administrar el anticuerpo al mamífero por inyección (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraportal) o mediante otros procedimientos, tales como la infusión que garantiza su administración en el torrente sanguíneo de una forma eficaz. También se puede administrar el anticuerpo mediante técnicas de perfusión aislada, tales como perfusión en tejidos aislados, para ejercer efectos terapéuticos locales. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Las dosis y las posologías eficaces para administrar el anticuerpo se pueden determinar empíricamente, y la realización de tales determinaciones pertenece al alcance de la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que la dosis del anticuerpo que debe ser administrado variará en función de, por ejemplo, el mamífero que vaya a recibir el anticuerpo, la vía de administración, el tipo concreto de anticuerpo usado y de otros fármacos que estén siendo administrados al mamífero. En la bibliografía sobre los usos terapéuticos de los anticuerpos, se encuentra una orientación sobre la selección de las dosis apropiadas, como, p. ej., en "Handbook of Monoclonal Antibodies", Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 y pp. 303-357; Smith et al., "Antibodies in Human Diagnosis and Therapy", Haber et al., eds., Raven Press, Nueva York (1977) pp. 365-389. Una dosis diaria común del anticuerpo usado solo podría variar de aproximadamente 1 \mug/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal o más al día, en función de los factores mencionados anteriormente.

También se puede administrar el anticuerpo al mamífero en combinación con cantidades eficaces de uno o más agentes terapéuticos. El uno o más de los otros agentes terapéuticos o terapias puede incluir, pero no se limita a, quimioterapia (agentes quimioterapéuticos), terapia de radiación, inmunoadyuvantes, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos y citoquinas. También se pueden emplear otros agentes conocidos por inducir la apóptosis en células de mamífero, y tales agentes incluyen FNT alfa, FNT beta, ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-2, así como otros anticuerpos que puedan inducir la apóptosis. La una o más de las otras terapias pueden incluir, anticuerpos terapéuticos (distintos del anticuerpo frente a DR4), y tales anticuerpos pueden incluir anticuerpos frente al receptor anti-Her (tales como, Herceptin^{TM}), anticuerpos anti-FCEV, y anticuerpos frente a otros receptores del ligando Apo-2, tales como anticuerpos anti-Apo-2 (DR5).

Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la técnica y que se encuentran comercialmente disponibles, tales como doxorrubicina, 5-fluorouracilo, etopósido, camptotecina, leucovorina, arabinósido de citosina, ciclofosfamida, tiotepa, busulfano, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatina, melfalano, vinblastina y carboplatina. La preparación y las posologías de tal quimioterapia se pueden usar según las instrucciones del fabricante o según lo determinado empíricamente por el profesional experto. La preparación y las posologías de tal quimioterapia también están descritas en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

La quimioterapia se administra preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como los descritos anteriormente. El modo de administración de la quimioterapia puede ser el mismo empleado para el anticuerpo frente a DR4 o puede ser administrada al mamífero de un modo diferente. Por ejemplo, se puede inyectar el anticuerpo frente a DR4 mientras se administra la quimioterapia oralmente al mamífero.

La terapia de radiación se puede administrar al mamífero según protocolos empleados comúnmente en la técnica y conocidos por el experto en la técnica. Tal terapia puede incluir radiación con cesio, iridio, yodo o cobalto. La terapia de radiación puede ser una radiación en todo el cuerpo o puede estar dirigida localmente a una zona o un tejido específico del o sobre el cuerpo. Comúnmente, la terapia de radiación se administra en pulsos durante un período de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. Sin embargo, es posible administrar la terapia de radiación durante períodos más prolongados de tiempo. Opcionalmente, se puede administrar la terapia de radiación en una sola dosis o en múltiples dosis consecutivas.

Se puede administrar el anticuerpo consecutivamente o simultáneamente al uno o más de los otros agentes terapéuticos. Las cantidades de anticuerpo y de agente terapéutico dependen, por ejemplo, de qué tipo de fármacos se esté usando, de la condición patológica que esté siendo tratada, y de la posología y las vías de administración, pero generalmente serían menores de las que serían si se usara cada una individualmente.

Tras la administración del anticuerpo al mamífero, se puede controlar la condición fisiológica del mamífero de diversos modos conocidos por el profesional experto. También se contempla el uso de anticuerpos frente a DR4 antagonistas o bloqueadores en la terapia. Por ejemplo, se podría administrar un anticuerpo frente a DR4 a un mamífero (tal como se describe anteriormente) para bloquear la unión del receptor DR4 con Apo-2L, aumentando así la biodisponibilidad del Apo-2L administrado durante la terapia con Apo-2L para inducir la apóptosis en las células
cancerosas.

Los efectos terapéuticos de los anticuerpos frente a DR4 de la invención se pueden examinar en análisis in vitro y usando modelos animales in vivo. Se puede usar una variedad de modelos animales conocidos para comprender mejor el papel de los anticuerpos frente a DR4 identificados en la presente memoria en el desarrollo y la patogénesis de, por ejemplo, las enfermedades inmunes o el cáncer, y para analizar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos. La naturaleza in vivo de tales modelos les hace particularmente predictivos de las respuestas de los pacientes humanos. Los modelos animales de enfermedades inmunes incluyen animales tanto recombinantes (transgénicos) como no recombinantes. Los modelos de animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, modelos de roedores, p. ej., modelos murinos. Tales modelos se pueden generar mediante la introducción de células en ratones singeneicos usando técnicas estándar, p. ej., inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación de bazo, implantación intraperitoneal e implantación bajo la cápsula renal.

Los modelos animales, por ejemplo, para la enfermedad del injerto frente al huésped, son conocidos. La enfermedad del injerto frente al huésped tiene lugar cuando se transplantan células inmunocompetentes en paciente inmunosuprimidos o tolerantes. Las células donantes reconocen y responden a los antígenos del huésped. La respuesta puede variar desde una inflamación grave con peligro de muerte hasta casos moderados de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de la enfermedad del injerto frente al huésped proporcionan un medio para analizar la reactividad de las células T frente a antígenos del CPH y antígenos de transplantes menores. En "Current Protocols in Immunology", unidad 4.3, se describe detalladamente un procedimiento adecuado.

Un modelo animal para el rechazo de aloinjertos cutáneos es un medio para analizar la capacidad de las células T en la mediación in vivo de la destrucción de tejidos que es indicativa y una medida de su papel en la inmunidad antiviral y tumoral. Los modelos más comunes y aceptados usan injertos de piel de cola murina. Los experimentos repetidos han demostrado que el rechazo de aloinjertos cutáneos está mediado por células T, células T auxiliares y células T asesinas-efectoras, y no por anticuerpos. [Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D. H., "Fundamental Immunology", 2ª ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]. En "Current Protocols in Immunology", unidad 4.4, se describe detalladamente un procedimiento adecuado. Otros modelos de rechazo de transplantes que se pueden usar para analizar las composiciones de la invención son los modelos de transplantes de corazón alogeneicos descritos por Tanabe, M. et al., "Transplantation", (1994) 58: 23 y Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

Los modelos animales para la hipersensibilidad de tipo retardado proporcionan también un análisis de la función inmune mediada por células. Las reacciones de la hipersensibilidad de tipo retardado son una respuesta inmune in vivo mediada por células T caracterizada por la inflamación, que no alcanza un máximo hasta una vez transcurrido un período de tiempo después del desafío con un antígeno. Estas reacciones también tienen lugar en enfermedades autoinmunes específicas de tejidos, tales como la esclerosis múltiple (EM) y la endefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo para la EM). En "Current Protocols in Immunology", unidad 4.5, se describe detalladamente un procedimiento adecuado.

Un modelo animal para la artritis es la artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas, histológicas e inmunológicas de la artritis reumatoide autoinmune humana, y es un modelo aceptable para la artritis autoinmune humana. Los modelos de ratones y ratas se caracterizan por la sinovitis, la erosión del cartílago y el hueso subcondral. Los anticuerpos frente a DR4 de la invención se pueden analizar en cuanto a su actividad frente a la artritis autoinmune usando los protocolos descritos en "Current Protocols in Immunology" anterior, unidades 15.5. Véase también el modelo que usa un anticuerpo monoclonal frente a las integrinas CD18 y VLA-4 descrito en Issekutz, A. C. et al., Immunology, (1996) 88:569.

Se ha descrito un modelo del asma en el que se inducen la hiper-reactividad de las vías respiratorias inducida por antígenos, la eosinofilia pulmonar y la inflamación mediante la sensibilización de un animal con ovalbúmina y luego el desafío del animal con la misma proteína administrada en aerosol. Hay varios modelos animales (cerdo de guinea, rata, primate no humano) que muestran síntomas similares al asma atópico en seres humanos tras el desafío con antígenos por aerosol. Los modelos murinos tiene muchas de las características del asma humano. Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 y las referencias citadas en esa memoria describen procedimientos adecuados para analizar las composiciones de la invención en cuanto a su actividad y eficacia en el tratamiento del asma.

Además, es posible analizar los anticuerpos frente a DR4 de la invención en modelos animales para las enfermedades de tipo de la psoriasis. Los anticuerpos frente a DR4 de la invención se pueden analizar en el modelo de ratones scid/scid descrito por Schon, M. P. et al., Nat. Med., (1997) 3:183, en el que los ratones demuestran tener lesiones cutáneas histopatológicas que se asemejan a la psoriasis. Otro modelo adecuado es la quimera de piel humana/ratón scid preparada según lo descrito por Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., (1995) 146:580.

Hay diversos modelos animales conocidos para analizar la actividad frente al cáncer de una composición terapéutica candidata. Éstos incluyen el xenoinjerto de tumor humano en ratones desnudos atímicos o ratones scid/scid, o los modelos de tumores murinos genéticos, tales como los ratones noqueados p53.

Se pueden diseñar modelos animales recombinantes (transgénicos) introduciendo la parte codificante de las moléculas identificadas en la presente memoria en el genoma de animales de interés, usando técnicas estándar para producir animales transgénicos. Los animales que pueden servir como diana para la manipulación transgénica incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, cerdos de guinea, ovejas, cabras, cerdos y primates no humanos, p. ej., babuinos, chimpancés y monos. Las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgén en tales animales incluyen la microinyección pronucleica (Hoppe y Wanger, patente estadounidense n.º 4.873.191); la transferencia de genes a líneas germinales mediada por retrovirus (p. ej., Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 82, 6148-615 [1985]); la dirección de genes en células madre embrionarias (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]); la electroporación de embriones (Lo, Mol. Cel. Biol., 3, 1803-1814); la transferencia de genes mediada por esperma (Lavitrano et al., Cell, 57, 717-73 [1989]). Para su estudio, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.736.866.

A efectos de la presente invención, los animales trangénicos incluyen aquéllos que portan el transgén sólo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén puede estar integrado bien como un solo transgén, o en concatámeros, p. ej., tándems de cabeza a cabeza o de cabeza a cola. También es posible la introducción selectiva de un transgén en un determinado tipo de célula siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89, 6232-636 (1992).

La expresión del transgén en animales transgénicos se puede controlar mediante técnicas estándar. Por ejemplo, se puede usar un análisis de transferencia Southern o una amplificación por PCR para verificar la integración del transgén. Entonces se puede analizar el nivel de expresión del ARNm usando técnicas tales como la hibridación in situ, el análisis de transferencia Northern, la PCR o inmunocitoquímica. Se pueden seguir examinando los animales en cuanto a los indicios de una patología inmune, por ejemplo, mediante el examen histológico para determinar la infiltración de células inmunes en tejidos específicos o en cuanto a la presencia de tejido canceroso o maligno.

Alternativamente, se pueden construir animales "noqueados" que tienen un gen defectuoso o modificado codificante de un polipéptido identificado en la presente memoria, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno codificante del polipéptido y el ADN genómico modificado codificante del mismo polipéptido introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo, se puede usar ADNc codificante de un determinado polipéptido para clonar ADN genómico codificante de ese polipéptido según técnicas establecidas. Se puede eliminar o reemplazar una parte del ADN genómico codificante de un determinado polipéptido con otro gen, tal como un gen codificante de un marcador seleccionable que se pueda usar para controlar la integración. Comúnmente, se incluyen en el vector varias kilobases de ADN flanqueante no modificado (tanto en el extremo 5' como en el 3') [véase, p. ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para obtener una descripción de vectores recombinantes homólogos]. El vector se introduce en una línea de células madre embrionarias (p. ej., por electroporación) y se seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha recombinado homogéneamente con el ADN endógeno [véase, p. ej., Li et al., Cell, 69:915 (1992)]. Entonces se inyectan las células seleccionadas en un blastocisto de un animal (p. ej., un ratón o una rata) para formar quimeras de agregación [véase, p. ej., Bradley, en "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach", E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Entonces se puede implantar un embrión quimérico en un animal de acogida hembra pseudopreñado adecuado y llevar a término el embrión para crear un animal "noqueado". Es posible identificar la progenie que alberga el ADN recombinado homogéneamente en sus células germinales mediante técnicas estándar y usarla para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado homogéneamente. Los animales noqueados se pueden caracterizar, por ejemplo, en cuanto a su capacidad para defenderse frente a ciertas condiciones patológicas y en cuanto al desarrollo de condiciones patológicas debido a la ausencia del polipéptido.

En otra realización de la invención, se proporcionan procedimientos para emplear el anticuerpo en análisis de diagnóstico. Por ejemplo, se pueden emplear los anticuerpos en análisis de diagnóstico para detectar la expresión o la sobre-expresión de DR4 en células y tejidos específicos. Se pueden usar diversas técnicas de análisis de diagnóstico conocidas en la técnica, tales como análisis de formación de imágenes in vivo, ensayos de unión competitiva in vitro, análisis en sándwich directo o indirecto y análisis de inmunoprecipitación realizados en fases bien homogéneas o heterogéneas [Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Los anticuerpos usados en los análisis de diagnóstico se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable debería ser capaz de producir, bien directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se puede emplear cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo con el resto detectable, incluyendo aquellos procedimientos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982).

Los anticuerpos frente a DR4 también son útiles para la purificación por afinidad de DR4 procedente de un cultivo celular recombinante o de fuentes naturales. En este procedimiento, los anticuerpos frente a DR4 se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como resina Sephadex o un papel de filtro, usando procedimientos conocidos en la técnica. Entonces se pone en contacto el anticuerpo inmovilizado con una muestra que contiene el DR4 por ser purificado y, después, se lava el soporte con un disolvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra a excepción de DR4 que se haya unido con el anticuerpo inmovilizado. Finalmente, se lava el soporte con otro disolvente adecuado que liberará el DR4 del anticuerpo.

En otra realización más de la invención, se proporcionan artículos de fabricación y equipos que contienen materiales útiles para tratar condiciones patológicas, o detectar o purificar DR4. El artículo de fabricación comprende un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes se pueden formar a partir de una variedad de materiales, tales como el vidrio o el plástico. El recipiente contiene una composición que tiene un agente activo que es eficaz en el tratamiento de condiciones patológicas, o en la detección o purificación de DR4. El agente activo de la composición es un anticuerpo frente a DR4 y, preferiblemente, comprende anticuerpos monoclonales específicos de DR4. La etiqueta del recipiente indica que la composición se usa para tratar condiciones patológicas, o para detectar o purificar DR4, y también puede indicar las instrucciones para su uso bien in vivo o in vitro, tales como aquéllas descritas anteriormente.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo ilustrativo, y no pretenden limitar el ámbito de la presente invención de ningún modo. Algunos de los ejemplos se proporcionan a modo de referencia.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplos

Los reactivos comercialmente disponibles a los que se hace referencia en los ejemplos se usaron según las instrucciones del fabricante, a no ser que se indique lo contrario. La fuente de aquellas células identificadas en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, por los números de acceso de la ATCC es la Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Expresión del ECD de DR4 como una inmunoadhesina

Se preparó un constructo de inmunoadhesina de ECD de DR4 soluble. Se clonó una secuencia del ECD de DR4 madura (aminoácidos 1-218 mostrados en la Fig. 1) en un vector pCMV-1 Flag (Kodak) secuencia abajo de la secuencia señal de Flag, y se fusionó con la región CH1, bisagra y Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina humana G_{1} según lo descrito previamente [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]. Se expresó la inmunoadhesina mediante una transfección transitoria en células 293 humanas y se purificó de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad con la proteína A, según lo descrito por Ashkenazi et al., supra.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Preparación de anticuerpos monoclonales específicos de DR4

Se inmunizaron ratones Balb/c (obtenidos en Charles River Laboratories) inyectando 0,5 \mug/50 \mul de una proteína inmunoadhesina del ECD de DR4 (según lo descrito en el ejemplo 1 anterior) (diluidos en adyuvante de MPL-TDM adquirido en Ribi Immunochemical Research Inc., Hamilton, MT) 11 veces en cada almohadilla de la pata trasera en intervalos de 3-4 días.

Transcurridos tres días de la última inyección, se extirparon los nódulos linfáticos popliteales de los ratones y se preparó una suspensión de una sola célula en medio DMEM (obtenido en Biowhitakker Corp.) complementado con penicilina-estreptomicina al 1%. Entonces se fusionaron las células de los nódulos linfáticos con células de mieloma murino P3X63AgU.1 (ATCC CRL 1597) usando polietilenglicol al 35% y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos. Se seleccionaron los hibridomas resultantes de la fusión en medio HAT. Tras diez días de la fusión, se rastrearon los sobrenadantes del cultivo de hibridomas en un ELISA para analizar la presencia de anticuerpos monoclonales en unión con la proteína inmunoadhesina del ECD de DR4 (descrita en el ejemplo 1).

En el ELISA, se revistieron las placas de microvaloración de 96 pocillos (Maxisorp; Nunc, Kamstrup, Dinamarca) añadiendo 50 \mul de 2 \mug/ml de Fc de IgG de cabra anti-humana (adquirida en Cappel Laboratories) en PBS en cada pocillo e incubando a 4ºC durante una noche. Entonces se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%). Luego se bloquearon los pocillos de las placas de microvaloración con 200 \mul de albúmina de suero bovino al 2,0% en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Entonces se volvieron a lavar las placas tres veces con tampón de lavado.

Tras la etapa de lavado, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de 0,4 \mug/ml de proteína inmunoadhesina de ECD de DR4 en tampón de análisis. Se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente en un aparato agitador, y se lavaron tres veces con tampón de lavado.

Tras las etapas de lavado, se añadieron a los pocillos designados 100 \mul de sobrenadantes de hibridoma o anticuerpo purificado en columna de proteína G-sefarosa (10 \mug/ml). Se añadieron 100 \mul de medio acondicionado de células de mieloma P3X63AgU.1 a otros pocillos designados como controles. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 1 hora en un aparato agitador, y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado.

\newpage

A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 \mul de Fc de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (adquirido en Cappel Laboratorios), diluidos 1:1000 en tampón de análisis (albúmina de suero bovino al 0,5%, Tween-20 al 0,05% en PBS) y se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente en un aparato agitador. Se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado, siguiendo con la adición de 50 \mul de sustrato (sustrato de peroxidasa para micropocillos TMB; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y la incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo 50 \mul de solución de detención de 1 componente TMB (dietilglicol; Kirkegaard & Perry) a cada pocillo, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector automático de placas de microvaloración.

Se consideraron los sobrenadantes de hibridoma rastreados inicialmente en el ELISA en cuanto a su capacidad para unirse a IgG de DR4, pero no a CD4-IgG. Se siguieron analizando los sobrenadantes que resultaron positivos en el ELISA mediante análisis FACS usando células 9D (una línea celular linfoide B humano que expresaba DR4; Genentech, Inc.) e IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC. Para este análisis, se añadieron 25 \mul de células suspendidas (a 4 x 106 células/ml) en tampón de clasificación celular (PBS que contenía SFB al 1% y NaN3 al 0,02%) a pocillos de microvaloración con fondo en forma de U, mezclados con 100 \mul de sobrenadante de cultivo o anticuerpo purificado (10 \mug/ml) en tampón de clasificación celular, y se incubaron durante 30 minutos sobre hielo. Entonces se lavaron y se incubaron las células con 100 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC durante 30 minutos a 4ºC. Luego se lavaron las células dos veces, se volvieron a suspender en 150 \mul de tampón de clasificación celular y después se analizaron por FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

La figura 2 muestra la tinción para FACS de células 9D. Dos anticuerpos particulares, el 4E7.24.3 y el 4H6.17.8, reconocieron al receptor DR4 en las células 9D.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Análisis de la capacidad de los anticuerpos frente a DR4 para inducir agonísticamente la apóptosis

Se analizaron sobrenadantes de hibridoma y anticuerpos purificados (según lo descrito en el ejemplo 2 anterior) en cuanto a la actividad para inducir la apóptosis de las células 9D mediada por DR4. Se incubaron las células 9D (5 x 10^{5} células/0,5 ml) con 5 \mug de Acm frente a DR4 (4E7.24.3 o 4H6.17.8; véase el ejemplo 2 anterior) o anticuerpos control frente a IgG en 200 \mul de medio RPMI completo a 4ºC durante 15 minutos. Luego se incubaron las células durante 5 minutos a 37ºC con o sin 10 \mug de anticuerpo frente a Fc de IgG de cabra anti-ratón (ICN Pharmaceuticals) en 300 \mul de RPMI completo. En ese momento, se incubaron las células durante una noche a 37ºC y en presencia de CO_{2} al 7%. Se cosecharon las células y se lavaron una vez con PBS. Se determinó la apóptosis de las células mediante la tinción de la unión de FITC-anexina V con fosfatidilserina según las recomendaciones del fabricante (Clontech). Se lavaron las células en PBS y se volvieron a suspender en 200 \mul de tampón de unión. Se añadieron 10 \mul de anexina V-FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de yoduro de propidio a las células. Tras una incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D mediante FACS.

Según lo mostrado en la figura 3, ambos anticuerpos frente a DR4 (en ausencia de Fc de IgG de cabra anti-ratón) indujeron la apóptosis en las células 9D en comparación con los anticuerpos control. Sin embargo, la actividad agonista de ambos anticuerpos frente a DR4, se vio aumentada por el entrecruzamiento del receptor DR4 en presencia de Fc de IgG de cabra anti-ratón (véase la figura 4). Este aumento de la apóptosis (figura 4) por ambos anticuerpos frente a DR4 es comparable con la actividad apoptótica de Apo-2L en células 9D.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Análisis de la capacidad de los anticuerpos frente a DR4 para bloquear la apóptosis de 9D inducida por Apo-2L

Se analizaron los sobrenadantes de hibridoma y anticuerpos purificados (según lo descrito en el ejemplo 2 anterior) en cuanto a la actividad para bloquear la apóptosis de las células 9D inducida por el ligando Apo-2.

Se suspendieron las células 9D (5 x 10^{5} células/0,5 ml) en medio RPMI completo (RPMI más SFB al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina, piruvato de sodio) y se preincubaron con anticuerpo frente a DR4 diluido en series (4H6.17.8) y/o un anticuerpo frente a Apo-2 (Acm 3F11, ATCC n.º HB-12456) en tubos individuales Falcon 2052. Se incubaron los tubos que contenían las células sobre hielo durante 15 minutos y luego se suspendieron aproximadamente 0,5 ml de Apo-2L (1 \mug/ml; Apo-2L marcado con His soluble preparado según lo descrito en el documento WO 97/25428) en medio RPMI completo, se añadieron a los tubos que contenían las células 9D y el anticuerpo, y luego se incubaron durante una noche a 37ºC y en presencia de CO_{2} al 7%. Entonces se cosecharon las células incubadas y se lavaron una vez con PBS. Se determinó la viabilidad de las células mediante la tinción de la unión de FITC-anexina V con fosfatidilserina según las recomendaciones del fabricante (Clontech). Específicamente, se lavaron las células en PBS y se volvieron a suspender en 200 \mul de tampón de unión. Se añadieron 10 \mul de anexina V-FITC (1 \mug/ml) y 10 \mul de yoduro de propidio a las células. Tras una incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células 9D mediante FACS.

\newpage

Los resultados se muestran en la figura 5. Como las células 9D expresan más de un receptor de Apo-2L, Apo-2L puede inducir la apóptosis en las células 9D mediante la interacción bien con DR4 o con el receptor denominado Apo-2. De este modo, para detectar cualquier actividad de bloqueo de los anticuerpos frente a DR4, fue necesario bloquear la interacción entre Apo-2 y Apo-2L. En combinación con el anticuerpo anti-Apo-2 bloqueador, 3F11, el anticuerpo frente a DR4 4H6.17.8 fue capaz de bloquear aproximadamente el 50% de la apóptosis inducida por Apo-2L. Se cree que el resto de actividad apoptótica del aproximadamente 50% se debe a la actividad agonista de los anticuerpos frente a DR4 solos, según lo mostrado en la figura 5. Por consiguiente, se cree que 4H6.17.8 es un anticuerpo frente a DR4 bloqueador. (En un análisis realizado de manera similar, los solicitantes descubrieron que el anticuerpo 1H5, descrito en el ejemplo 7, bloqueó la apóptosis de las células 9D realizada por Apo-2L).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Isotipificación de anticuerpos

Los isotipos de los anticuerpos 4H6.17.8 y 4E7.24.3 (según lo descrito anteriormente) se determinaron mediante el revestimiento de placas de microvaloración con Ig de cabra anti-ratón específica del isotipo (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) durante una noche a 4ºC. Entonces se lavaron las placas con tampón de lavado (según lo descrito en el ejemplo 2 anterior). Luego se bloquearon los pocillos de las placas de microvaloración con 200 \mul de albúmina de suero bovino al 2% y se incubaron a temperatura ambiente durante hora. Se volvieron a lavar las placas tres veces con tampón de lavado.

A continuación, se añadieron a los pocillos designados 100 \mul de 5 \mug/ml de anticuerpos frente a DR4 purificados o 100 \mul del sobrenadante de cultivo de hibridoma. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se añadieron a cada pocillo 50 \mul de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRP (según lo descrito anteriormente). Se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó el nivel de HRP unida a la placa usando sustrato de HRP según lo descrito anteriormente.

El análisis de isotipificación mostró que los anticuerpos 4E7.24.3 y 4H6.17.8 son anticuerpos frente a IgG1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Análisis ELISA para analizar la unión de los anticuerpos frente a DR4 con otros receptores de Apo-2L

Se realizó un ELISA para determinar si los dos anticuerpos frente a DR4 descritos en el ejemplo 2 eran capaces de unirse con otros receptores de Apo-2L conocidos además de con DR4. Específicamente, se analizaron los anticuerpos frente a DR4 en cuanto a la unión con Apo-2 [véase, p. ej., Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)], DcR1 [Sheridan et al., supra], y DcR2 [Marsters et al., Curr. Biol., al., 7:1003-1006 (1997)]. El ELISA se llevó a cabo esencialmente según lo descrito en el ejemplo 2 anterior.

Los resultados se muestran en la figura 6. Los anticuerpos frente a DR4 4E7.24.3 y 4H6.17.8 se unieron con DR4 y mostraron cierta reactividad cruzada con Apo-2, DcR1 o DcR2.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Preparación de anticuerpos monoclonales específicos de DR4

Los anticuerpos monoclonales frente a DR4 se produjeron esencialmente según lo descrito en el ejemplo 2. Mediante el uso del ELISA de captura descrito en el ejemplo 2, se identificaron más anticuerpos anti-DR4, denominados 1H5.24.9, 1H8.17.5, 3G1.17.2, 4G7.18.8, 4G10.20.6 y 5G11.17.1. (Véase la tabla de la figura 17). Otros análisis mediante FACS (usando la técnica descrita en el ejemplo 2) confirmaron la unión de estos anticuerpos con células 9D que expresaban DR4 (datos no mostrados).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Isotipificación de anticuerpos

Los isotipos de los anticuerpos anti-DR4 1H5.24.9, 1H8.17.5, 3G1.17.2, 4G7.18.8, 4G10.20.6 y 5G11.17.1 (descritos en el ejemplo 7) se determinaron esencialmente según lo descrito en el ejemplo 5.

El análisis de isotipificación mostró que los anticuerpos 1H8.17.5, 3G1.17.2 y 4H10.20.6 son anticuerpos frente a IgG1. Los anticuerpos anti-DR4 1H5.24.9 y 4G7.18.8 son anticuerpos frente a IgG2a, un anticuerpo 5G11.17.1 es un anticuerpo frente a IgG2b.

\vskip1.000000\baselineskip

\global\parskip0.900000\baselineskip

Ejemplo 9 Determinación de las afinidades de los anticuerpos monoclonales

Se determinaron las constantes de velocidad de asociación y disociación en equilibrio de diversos anticuerpos frente a DR4 (descritos en los ejemplos anteriores) usando KinExA^{TM}, un sistema de inmunanálisis automático (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID), según lo descrito con una modificación por lake et al., "Journal of Biological Chemistry", 271:27677-685 (1996); y Craig et al., "Journal of Molecular Biology", 281:183-201 (1998). En síntesis, se revistieron 1,0 ml de perlas de agarosa e IgG anti-humana (56 \mum, Sigma, St. Louis, MO) con 20 \mug de IgG de DR4 (descrito en el ejemplo 1) en PBS mediante un mezclado suave a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras el lavado con PBS, se bloquearon sitios de unión inespecífica mediante la incubación con suero humano al 10% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se creó un paquete de perlas (altura de -4 mm) en la celda de flujo de observación mediante el instrumento KinExA^{TM}. Se diluyeron las perlas bloqueadas en 30 ml de tampón de análisis (ASB/PBS al 0,01%). A continuación, se vertieron las perlas diluidas (550 \mul) a través de la celda de flujo con una criba de 20 \mum, y se lavó con 1 ml de tampón de electroforesis (ASB al 0,01%; Tween 20 al 0,05% en PBS). Entonces las perlas se vieron afectadas suavemente por una breve corriente hacia atrás de tampón de electroforesis, seguida por un período de reposo de 20 segundos para crear un paquete de perlas uniforme y reproducible. Para las medidas del equilibrio, se mezclaron los anticuerpos frente a DR4 seleccionados (5 ng/ml en ASB/PBS al 0,01%) con una dilución en serie de IgG de DR4 (partiendo de 2,5nM hasta 5,0pM), y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Una vez alcanzado el equilibrio, se vertieron 4,5 ml de esta mezcla a través de las perlas, seguidos por 250 \mul de tampón de electroforesis para lavar los anticuerpos no unidos. Los anticuerpos primarios unidos a las perlas fueron detectados por 1,5 ml de IgG de cabra anti-ratón marcada con ficoeritrina (Jackson Immunoresearch). Se retiró el material marcado no unido vertiendo 4,5 ml de NaCl 0,5M a través del paquete de perlas durante un período de 3 minutos. Se calculó la constante de equilibrio usando el programa informático proporcionado por el fabricante (Sapidyne, Inc.).

En la figura 7, se muestran las determinaciones de la afinidad de los anticuerpos frente a DR4. A modo comparativo, se muestran las determinaciones de la afinidad de los constructos de inmunoadhesina de los receptores DR4 y DR5 por Apo-2L, y el anticuerpo frente a DR5, 3F11, por un constructo de Ig de DR5. Las afinidades (Kd-1) de los anticuerpos 4E7.24.3, 4H6.17.8 y 5G11 fueron de 2pM, 5pM y 22pM, respectivamente, lo que demostró que estos anticuerpos monoclonales tienen fuertes afinidades de unión con IgG de DR4. (Las afinidades (Kd-1) de los anticuerpos 4G7 y 3G1 fueron de 20pM y 40pM, respectivamente; datos no mostrados en la figura 7).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Análisis de la apóptosis de células linfoides tumorales usando anticuerpos frente a DR4

Se examinó la apóptosis de células linfoides B tumorales 9D humanas inducida por anticuerpos monoclonales anti-DR4.

Se suspendieron células 9D humanas (5 x 10^{5}) en 100 microlitros de medio RPMI completo (RPMI más SFB al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y piruvato de sodio) y se añadieron a 24 pocillos de microvaloración (5 x 10^{5} células/0,5 ml/pocillo). Luego se añadieron 100 microlitros de 10 microgramos/ml de anticuerpo frente a DR4 purificado o 100 microlitros de sobrenadante de cultivo a los pocillos que contenían células 9D. Después se incubaron las células durante una noche a 37ºC en presencia de CO_{2} al 7%.

Al finalizar la incubación, se lavaron las células una vez con PBS. Se volvieron a suspender las células lavadas en 200 microlitros de tampón de unión (Clontech) y 10 microlitros de FITC-anexina V (Clontech), y se añadieron 10 microlitros de yoduro de propidio a las células. [Véase, Moore et al., Meth. In Cell Biol., 57:265 (1998)]. Tras una incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células mediante FACScan.

Los resultados se muestran en la figura 8A. Las gráficas de la figura 8A muestran que los anticuerpos 1H5, 4G7 y 5G11 indujeron ellos mismos cierta apóptosis (débil) en las células 9D, pero que la actividad apoptótica de cada anticuerpo se vio aumentada notablemente al entrecruzar estos anticuerpos monoclonales mediante bien Fc de IgG de cabra anti-ratón o complemento (según lo descrito en el ejemplo 11 que figura a continuación).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Análisis de la apóptosis de células 9D usando anticuerpos frente a DR4 entrecruzados

También se examinó la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 entrecruzados sobre células 9D. Se suspendieron células 9D (5 x 10^{5}) en 100 microlitros de medio RPMI completo (RPMI más SFB al 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, penicilina, estreptomicina y piruvato de sodio) y se incubaron con 1 microgramo de anticuerpo frente a DR4/100 microlitros sobre hielo durante 15 minutos. Se incubaron las células con una dilución final de 1:10 de complemento de conejo (Cedar Lane) o 100 microgramos/ml de Fc de IgG de cabra anti-ratón (Cappel Laboratories) en 300 microlitros de medio completo durante una noche a 37ºC en presencia de CO_{2} al 7%.

\global\parskip1.000000\baselineskip

Al finalizar la incubación, se lavaron las células una vez con PBS y se suspendieron en 200 microlitros de tampón de unión (Clontech). A continuación, se añadieron 10 microlitros de FITC-anexina V (Clontech) y 10 microlitros de yoduro de propidio a las células. [Véase, Moore et al., Cell Biol., 57:265 (1998)]. Tras una incubación durante 15 minutos en la oscuridad, se analizaron las células mediante FACScan.

Los resultados se muestran en las figuras 8A y 8B. Los resultados muestran que los anticuerpos anti-DR4 4G7.17.8, 5G11.17.1 y 1H5.24.9 indujeron la apóptosis de células 9D al entrecruzarlos con IgG de cabra anti-ratón o con complemento de conejo, aunque el grado de apóptosis inducido usando el complemento como ligador no fue tan potente en comparación con el uso del ligador de Fc de IgG de cabra anti-ratón. Sin embargo, la actividad apoptótica de los anticuerpos frente a DR4 entrecruzados (a concentraciones de aproximadamente 1-2 microgramos/ml) fue comparable con la actividad apoptótica de Apo-2L a concentraciones similares.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Análisis de la apóptosis de líneas celulares tumorales de pulmón y de colon humanos

Se siguió examinando las actividades apoptóticas de los anticuerpos monoclonales en análisis destinados a determinar la viabilidad celular de las células cancerosas tras el tratamiento con anticuerpos o Apo-2L.

Se sembraron células SKMES-1 (línea celular tumoral de pulmón humano; ATCC) y células HCT-116 (línea celular tumoral de colon humano; ATCC) a 4 x 10^{4} células/pocillo en medio completo 50:50 de alto contenido de glucosa complementado con glutamina, penicilina y estreptomicina, en placas de cultivo tisular y se permitió la unión durante una noche a 37ºC. Entonces se retiró el medio de los pocillos y se añadieron a pocillos seleccionados 0,1 ml de anticuerpo (anticuerpos anti-DR4 diluidos 0,001-10 microgramos/ml en medio completo). Los pocillos control sin anticuerpo recibieron un cambio de medio con o sin Apo-2L. Entonces, se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.

Se retiró el sobrenadante del cultivo de los pocillos que contenían los anticuerpos de análisis y se añadieron a los pocillos 10 microgramos/ml de Fc de IgG de cabra anti-ratón (Cappel Laboratories) o complemento de conejo (Cedar Lane; diluido en medio hasta 1:10). Se cambió el medio de los pocillos control. Luego se incubaron las placas durante una noche a 37ºC. Como control, se diluyó Apo-2L (según lo descrito en el ejemplo 4) (en tampón de fosfato de potasio, pH 7,0) hasta 2 microgramos/ml. Se añadieron 0,1 ml de la solución de Apo-2L diluido a los pocillos seleccionados, y se sacaron 3 diluciones en serie de la placa.

Luego se retiraron los sobrenadantes del cultivo de los pocillos por aspiración y se anegaron las placas con violeta cristal al 0,5% en solución de metanol. Tras 15 minutos, se retiró la solución de violeta cristal anegando las placas con agua corriente. Luego se dejaron secar las placas durante una noche.

Se leyó la absorbancia en un lector de placas SLT 340 ATC (Salzburg, Austria) a 540 nm. Se analizaron los datos usando una macro Excel y un ajuste 4p. En las figuras 9 y 10, se muestran los resultados que ilustran la actividad de los anticuerpos frente a DR4 en células SKMES. Las figuras 9 y 10A muestran que los anticuerpos 1H8.17.5, 4E7.24.3, 4G7.17.8, 4H6.17.8, 4G10.20.6 y 5G11.17.1 indujeron la muerte celular de las células SKMES al incubar las células con los respectivos anticuerpos más Fc de IgG de cabra anti-ratón. (También se ha descubierto que el anticuerpo 1H5 induce la muerte celular de las células SKMES, datos no mostrados en las figuras 9 y 10A). Por el contrario, el anticuerpo 3G1.17.2 no indujo la muerte celular en las células, ni siquiera en presencia del ligador de cruzamiento Fc de IgG. La figura 10B ilustra la actividad apoptótica de los anticuerpos 4G7 (isotipo IgG2a) y de 5G11 (isotipo IgG2b) sobre las células SKMES en presencia de complemento de conejo.

Los resultados ilustrados en la figura 11 muestran la actividad de los anticuerpos frente a DR4 sobre las células de cáncer de colon HCT116. Los anticuerpos frente al DR4 del isotipo IgG2, 4G7 y 5G11, indujeron la apóptosis en las células de cáncer de colon en presencia de Fc de IgG o de complemento. El anticuerpo frente a DR4 4E7 (isotipo IgG1) no indujo la apóptosis en presencia de complemento, aunque el anticuerpo demostró una potente actividad apoptótica en presencia de Fc de IgG de cabra anti-ratón.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Análisis ELISA para analizar la unión de los anticuerpos frente a DR4 con otros receptores de Apo-2L

Se realizó un análisis ELISA (según lo descrito en los ejemplos 2 y 6) para determinar la unión de los anticuerpos frente a DR4 con otros receptores de Apo-2L conocidos, además de DR4.

El anticuerpo 5G11.17.1 se unió a DR4 y Apo-2, y mostró cierta reactividad cruzada (débil) con DcR1 y DcR2. El anticuerpo 4G10.20.6 se unió a DR4 y mostró cierta reactividad cruzada (débil) con Apo-2. El resto de anticuerpos, 1H8.17.5, 4G7.18.8, 1H5.24.9 y 3G1.17.2, se unieron a DR4 pero no a ninguno de los receptores Apo-2, DcR1 o DcR2.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14 Análisis de la poli(ADP-ribosa)polimerasa (PARP)

Se realizó un análisis de la PARP para determinar si la actividad inducida por los anticuerpos anti-DR4 de IgG2 fue alcanzada mediante apóptosis o mediante la lísis complementaria convencional.

Se incubaron células 9D (5 x 10^{5} células en 100 \mul de medio completo (descrito en el ejemplo 11)) con 100 \mul de anticuerpo (4G7 o 5G11) (1 mg/ml) durante 15 minutos sobre hielo. Luego se añadieron a las células 300 \mul de complemento de conejo (Cedar Lane; diluido con 1,0 ml de agua destilada fría seguida por la adición de 2,0 ml de medio). Luego se incubaron las células durante una noche a 37ºC. Al final de la incubación, se microcentrifugaron las células, se cosecharon y se lavaron una vez en tampón de lavado celular (Tris-HCl 50mM, pH 7,5, NaCl 0,15M, CaCl_{2} 1mM, MgCl_{2} 1mM). Luego se lisaron los sedimentos celulares con 50 \mul de tampón de lisis celular (tampón de lavado celular más NP40 al 1%) que contenía inhibidores de proteasa, se incubaron sobre hielo durante 30 minutos y luego se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 minutos.

Se mezcló el lisado celular con un volumen igual de 2 x tampón reductor de SDS. Tras hervir durante 2 minutos, se separaron las proteínas sobre gel de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 7,5% y se transfirieron a membranas de PVDF de inmunotransferencia (Gelman). Tras bloquear los sitios de unión inespecífica con tampón de bloqueo (Boehringer Mannheim), se detectó la poli(ADP-ribosa)polimerasa usando anti-poli(ADP-ribosa)polimerasa de conejo marcada con HRP (Boehringer Mannheim). Este anticuerpo detectará la PARP intacta (116 Kd), así como la degradada (85 Kd) que se genera como una etapa temprana de la apóptosis. Se detectó la anti-poli(ADP-ribosa)polimerasa de conejo anti-HRP unida usando reactivos de señales de inmunoanálisis quimioluminiscentes según las instrucciones del fabricante (Amersham, Arlington Heights, IL).

Los resultados se muestran en la figura 12. Las células tratadas bien con 4G7 o con 5G11 más complemento demostraron la presencia de PARP de 85 Kd escindida, lo que indicó que el mecanismo de la muerte celular de 9D inducido por los respectivos anticuerpos se debía a la apóptosis. Al desactivar mediante calor el complemento añadido al análisis mediante la incubación durante 30 minutos a 56ºC, se dejó de detectar el fragmento escindido de 85 Kd de la PARP. Los resultados sugieren que el complemento del suero de conejo indujo la oligomerizacion de los anticuerpos anti-DR4 unidos a las células, dando como resultado la apóptosis de las células 9D.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15 Actividad in vivo de los anticuerpos frente a DR4

Como los anticuerpos frente a DR4 de la clase IgG2 indujeron la apóptosis en presencia de complemento (descrito en los ejemplos anteriores), se realizó un análisis in vivo para determinar si estos anticuerpos pueden ser capaces de inducir la apóptosis de células tumorales in vivo en presencia de moléculas de complementos nativos presentes en el animal.

Se sembraron células HCT116 (línea celular tumoral de colon humano; ATCC) o células Colo205 (línea celular tumoral de colon humano; ATCC) en medio F-12:DMEM (50:50) de alto contenido en glucosa complementado con SFB al 10%, glutamina 2mM, 100 \mug/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Se cosecharon las células tras el tratamiento con medio de disociación celular (Sigma, IAC) durante 5 minutos. Tras lavar en PBS, se volvieron a suspender las células tumorales en PBS a una concentración de 3 x 10^{7} células/ml.

Se inyectaron 3-5 x 10^{6} células a ratones desnudos subcutáneamente en la zona dorsal en un volumen de 0,1 ml. Cuando el tamaño del tumor de los animales con tumor de HCT116 fue el deseado, se inyectaron 100 \mug i.p. de anticuerpo anti-DR4 monomérico en PBS a los ratones tres veces a la semana, y se midieron los tamaños tumorales tres veces/semana. A los animales con tumor de Colo205 se les inyectaron i.p. concentraciones variables de los anticuerpos frente a DR4 4G7 y 4H6 (según lo mostrado en las figuras 15 y 16). Al final del experimento de examen de los tumores de HCT116, se sacrificaron los ratones y se determinó el peso de cada tumor.

Los resultados ilustrados en las figuras 13 y 14 muestran que tanto 4G7 como 5G11 inhibieron el crecimiento de los tumores de HCT116. Se produjo una inhibición del crecimiento del aproximadamente 35-40% y del 50% de los tumores de HCT116 tras el tratamiento con los anticuerpos 5G11 y 4G7, respectivamente.

Los resultados ilustrados en las figuras 15 y 16 muestran que tanto 4G7 como 4H6 inhibieron el crecimiento de los tumores de Colo205. La Fig. 15 ilustra que el tratamiento con anticuerpos fue más eficaz cuando el tamaño de los tumores era menor. La Fig. 16 muestra que de los ratones tratados con 25-200 microgramos de 4G7 (inyectados tres veces a la semana), los ratones que recibieron las dosis de 50 microgramos de 4G7 alcanzaron la máxima inhibición (70%) del crecimiento de tumor de Colo205. El anticuerpo 4H6 redujo el crecimiento del tumor de Colo205 hasta cerca de cero tras un tratamiento de 10 días. Al final del tratamiento de 10 días de 4H6 (100 microgramos/inyección), 4/8 ratones mostraron un crecimiento nulo del tumor de Colo205 (datos no mostrados). En experimentos relacionados, los solicitantes descubrieron que la regresión del tumor se alcanzó de manera similar con el tratamiento de 4H6 a 5mg/kg una vez a la semana. Cabe destacar que algunos de los tumores volvieron a aparecer una vez detenida la administración del anticuerpo 4H6, lo que sugiere que algunas de las células tumorales no fueron completamente eliminadas durante el tratamiento. Las secciones histológicas de los tumores de Colo205 tres días después de una sola inyección i.p. de 5mg/kg del anticuerpo 4H6 mostraron una apóptosis extendida (los ratones tratados con anticuerpo control de anticuerpo de 4G7 mostraron poca apóptosis). Por el contrario, el grado y la composición del infiltrado celular de los tumores pareció similar en los animales tratados con anticuerpo 4H6 y con anticuerpo control. Estos datos sugirieron que el anticuerpo 4H6 ejerce la actividad antitumoral mediante la inducción de la apóptosis en las células tumorales en lugar de indirectamente mediante el reclutamiento de funciones efectoras inmunes.

En otros experimentos in vivo realizados de manera similar usando ratones desnudos con tumores de Colo205, los ratones fueron tratados con los anticuerpos anti-DR4 anteriores, incluyendo los anticuerpos 1H5 y 3G1, a 2,5 mg/kg, dos veces a la semana, comenzando el día 4. En el día 22, se midieron los tamaños de los tumores y se calculó el % de inhibición del crecimiento en base a considerar la actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal 4H6 como la inhibición del 100%. Los tamaños de los tumores de los animales tratados con PBS (control) y anticuerpo 4H6 fueron de 498\pm322 mm^{3} y mm^{3}, respectivamente. Los anticuerpos 3G1, 4E7 y 4H6 (todos anticuerpos del isotipo IgG1) demostraron una actividad anti-tumoral más potente que los anticuerpos del isotipo IgG2 1H5 y 4G7, y la variante de intercambio isotípico 4H6 de mIgG2a (descrita más adelante). Los intervalos de inhibición del crecimiento de los tumores por los anticuerpos de IgG1 y los anticuerpos de IgG2a fueron del 42-100% y 27-30%, respectivamente. A pesar de que el anticuerpo 3G1 presentó una actividad agonista relativamente débil tras el entrecruzamiento in vitro, el anticuerpo 3G1 inhibió el crecimiento del tumor de Colo205 en un 42% in vivo. Estos resultados sugirieron que el isotipo mIgG1
puede ser más eficaz que el isotipo mIgG2a en la mediación de la actividad anti-tumoral a través del receptor DR4.

Los resultados del estudio también sugirieron que estos anticuerpos frente a DR4 administrados en ausencia de ligadores o modificadores exógenos, pueden ser agentes activos frente al cáncer. Aunque no se entiende completamente, es posible que los anticuerpos administrados indujeran la apóptosis mediante la oligomerización a través de un mecanismo endógeno tal como la interacción de la región Fc con el complemento nativo presente en el animal o con los receptores gamma de Fc sobre células efectoras, o a través de la auto-agregación espontánea de Fc-Fc. Se cree que los anticuerpos anti-DR4 de los isotipos de Ig humana IgG1, IgG2 o IgG3 (que pueden fijar complementos) pueden ser capaces de entrecruzarse de manera similar usando el complemento e induciendo la apóptosis.

Para seguir examinando la diferencia relativa de las actividades de los dos anticuerpos anti-DR4 anteriores, se generó una variante de intercambio del isotipo de IgG2a murino del anticuerpo monoclonal murino 4H6, y se hizo una comparación entre su actividad in vitro e in vivo y el anticuerpo monoclonal murino 4H6 parental.

Se aislaron los genes de VH y VL mediante amplificación por PCR del ARNm procedente del correspondiente hibridoma de 4H6 descrito en Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:4285-4289 (1992), usando polimerasa de Taq. Se usaron secuencias de aminoácidos N-terminales de las cadenas ligeras y pesadas de 4H6 para diseñar los cebadores de PCR de cadena sentido, mientras que los cebadores de PCR antisentido se basaron en las secuencias consenso del marco murino 4 de cada cadena. Los fragmentos de ADN amplificados fueron digeridos con las enzimas de restricción Nsi y RsrII para la cadena ligera y con MluI y ApaI para la cadena pesada. (Para más información, véase el ejemplo 16 que figura a continuación). Se ensamblaron por separado los ADNc de los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas con dominios CH1-CH2-CH3 de IgG2 y Ck murino en vectores de expresión de plásmidos. Se co-transfectaron los vectores de ADNc de las cadenas ligeras y pesadas en 293 células durante 7 días, se cosecharon los medios y se recuperó la forma 4H6 de IgG2a secretada mediante purificación de afinidad usando proteína G.

In vitro, en un análisis realizado esencialmente según lo descrito en el ejemplo 12 (a excepción de que se utilizaron células Colo205 en lugar de células HCT116), los dos isotipos de 4H6 diferentes mostraron una actividad similar tras el entrecruzamiento con IgG de cabra anti-ratón. Por el contrario, in vivo, en un análisis realizado esencialmente según lo descrito en el ejemplo 15 (a excepción de que los animales fueron tratados con anticuerpos a una dosis de 2,5 mg/kg, dos veces a la semana), el isotipo IgG1 de 4H6 fue sustancialmente más activo que su homólogo IgG2a. A una dosis de 2,5 mg/kg, dos veces a la semana, 4H6 de IgG1 y 4H6 de IgG2a inhibieron el crecimiento de los tumores de Colo205 en un 96% y un 35%, respectivamente, en el día 22. La actividad antitumoral del anticuerpo 4G7 de IgG2a fue similar a la del anticuerpo 4H6 de IgG2a. Por consiguiente, para al menos esos dos anticuerpos, el isotipo del anticuerpo parece ser más importante para la actividad in vivo que para el epítopo diana.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16 Preparación del anticuerpo quimérico 4H6.17.8

Se secuenció el anticuerpo 4H6.17.8 purificado (véase el ejemplo 2) para obtener los aminoácidos N-terminales de tanto la cadena pesada como la ligera. Los datos de las secuencias N-terminales se usaron para diseñar los cebadores de PCR específicos de los extremos 5' de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, mientras que los cebadores de 3' se diseñaron para aparearse con el marco de consenso 4 de cada cadena (Kabat, et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). En síntesis, se diseñó un cebador degenerado de 3' que representaba todas las combinaciones posibles del marco 4 para el anticuerpo. Los cebadores fueron diseñados para añadir sitios de enzimas de restricción para la clonación; específicamente NsiI y RsrII para la cadena ligera, y MluI y ApaI para la cadena pesada (posiciones mostradas abajo en negrita).

Cebadores degenerados de 3':

w = a/t, k = g/t, b = g/t/c, y = c/t, r = a/g, s = g/c, m = a/c, n = a/g/t/c

3

Los codones subrayados de la SEC ID N.º 5 anterior corresponden a aquellos codones (figura 18A) de la secuencia nativa de la cadena ligera del anticuerpo 4H6 codificantes de los aminoácidos 21-26 mostrados en la figura 18A-C (SEC ID N.º 9).

4

Los codones subrayados de la SEC ID N.º 6 anterior corresponden a aquellos codones de la secuencia nativa de la cadena pesada del anticuerpo 4H6 codificantes de los seis primeros aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada. Cabe destacar que los dos primeros aminoácidos del dominio variable de 4H6 de secuencia nativa son glutamina (Q) y valina (V) codificados por los codones cag y gtg, respectivamente. Por el contrario, en las figuras 18D-18H, los dos primeros aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada (que aparecen como las posiciones 20 y 21, detrás de la secuencia señal) se muestran como ácido glutámico (E) y valina (V) codificados por los codones gaa y gtt, respectivamente. Este intercambio de los codones codificantes de de los dos primeros aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada se debe al constructo vectorial utilizado; y en la figura 18D, los dos primeros aminoácidos (y los codones correspondientes) del dominio variable (que aparecen en las posiciones 20 y 21) reflejan los aminoácidos que derivan realmente del vector.

El ARN total, extraído de 10^{8} células de hibridoma 4H6.17.8 (véase el ejemplo 2) con un equipo de aislamiento de ARN de Stratagene (200345) se usó como sustrato para la RT-PCR. La transcripción inversa se realizó en condiciones estándar (Kawasaki, E. S. en "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis, M. A., et al., eds. pp. 21-27, Academic Press, Inc., San Diego, 1990), usando los cebadores degenerados del marco 4 y la transcriptasa inversa RNasa H Superscript II (Gibco 18064-014). La amplificación por PCR empleó polimerasa de Taq (Perkin Elmer-Cetus), según lo descrito (Kawasaki, E. S., supra), a excepción de que se incluyó DMSO al 2% en la mezcla de reacción. Los fragmentos de ADN amplificados fueron digeridos con las enzimas de restricción Nsi I y Rsr II (cadena ligera) o con Mlu I y Apa I (cadena pesada), purificados sobre gel y clonados en un vector ss.vegf4chimera [véase, Presta et al., Cancer Research, 57:4593-4599 (1997)]. Los ADNc del dominio variable murino de las cadenas ligeras y pesadas se insertaron secuencia arriba y en marco con respecto a los dominios CH1 de Ckapa humana y de IgG1. Se retiró la cisteína C-terminal, que forma el puente de tipo disulfuro durante la generación de F(ab')_{2}, de la cadena pesada de pAK19 (Carter et al., Bio/ Technology, 10:163 (1992)) para permitir la expresión de sólo la forma Fab del anticuerpo. Se confirmó la unión de la proteína Fab específicamente con su receptor afín, IgG de DR4, mediante un ELISA de captura (realizado esencialmente según lo descrito en el ejemplo 2 anterior, a excepción de la utilización de IgG purificada por afinidad de HRP-oveja y de F(ab)'_{2} de IgG anti-humano (Cappel Laboratories) a 1:2.500). Una vez confirmada la especificidad, se digirieron los dominios variables de las cadenas pesadas murinas de 4H6.17.8 con las enzimas de restricción Pvu II y Apa I, se purificaron sobre gel y se clonaron en el constructo vectorial de IgG1 humana descrito en Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:4285 (1992) (en relación con la humanización del anticuerpo 4D5). El primer aminoácido de la cadena pesada fue derivado de un vector y dio como resultado un cambio de Q a E de la secuencia original o nativa de 4H6.17.8, según lo descrito anteriormente. El segundo aminoácido de la secuencia nativa es V y permanece como V, aunque codificado por un codón diferente, también derivado de un vetor, según lo descrito anteriormente. Los dominios variables de los ADNc de las cadenas ligeras y pesadas murinas se insertaron secuencia arriba y en marco con respecto a los dominios CH1-CH2-CH3 de Ckapa humana y de IgG1. Se co-transfectaron los vectores de ADNc quimérico de las cadenas ligeras y pesadas en células CHO usando técnicas estándar y luego se recuperaron los anticuerpos secretados mediante purificación de afinidad usando columnas de proteína G.

La secuencia de nucleótidos codificante y la secuencia de aminoácidos putativos para las respectivas cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo 4H6.17.8 se muestran en las figuras 18A-18H. La cadena ligera incluía un dominio variable que comprendía los aminoácidos 20 a 126 de las figuras 18A-18C (SEC ID N.º 9). Las figuras 18A-18C también muestran la secuencia señal (los aminoácidos 1 a 19 de las figuras 18A-18C (SEC ID N.º 9)) y el dominio CH1 humano que comprendía los aminoácidos 127 a 233 (figuras 18A-18C; SEC ID N.º 9). La cadena pesada incluía un dominio variable que comprendía los aminoácidos 20 a 145 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12). Las figuras 18D-18H también muestran la secuencia señal (los aminoácidos 1 a 19 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12)) y los dominios CH1, CH2 y CH3 humanos (aminoácidos 146 a 476 de las figuras 18D-18H (SEC ID N.º 12)).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17 Actividades in vitro del anticuerpo 4H6 quimérico

Se determinaron los efectos del anticuerpo 4H6 quimérico anti-DR4 (véase el ejemplo 16) sobre la viabilidad de células SK-MES-1 mediante tinción con violeta cristal. Se incubaron células SK-MES-1 (línea celular tumoral de pulmón humano; ATCC) (4 x 10^{4} células/100 ul/pocillo) durante una noche (en medio DMEM/F-12 (50:50) complementado con SFB al 10%, glutamina 2mM y antibióticos) con diluciones en serie de anticuerpos monoclonales con o sin Fc de IgG de cabra anti-ratón (10 \mug/ml) o Fc de IgG de cabra anti-humana (10 \mug/ml). Los anticuerpos monoclonales analizados incluían una preparación de F(ab)'_{2} de 4H6.17.8 murino, anticuerpo 4H.17.8 murino purificado (descrito en el ejemplo 2) y anticuerpo 4H6 quimérico (descrito en el ejemplo 16). Se añadieron diluciones en serie de Apo2L/TRAIL (que consistían en los aminoácidos 114-281 expresados en E. coli de la secuencia Apo2L/TRAIL revelada en el documento WO97/25428; véase también Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999)) preparadas en un volumen final de 100 \mul a cada placa como un control positivo. Luego se incubaron durante una noche a 37ºC. Se retiró el medio y se tiñeron las células viables usando violeta cristal según lo descrito por Flick et al., J. Immunol. Methods, 68:167-175 (1984). Luego se leyeron las placas en un lector de placas SLT a 540 nM.

Los resultados se muestran en la figura 19. La actividad de matar células SK-MES-1 del anticuerpo 4H6 quimérico entrecruzado fue comparable con la del 4H6.17.8 monoclonal murino.

Se realizó otro análisis para examinar si el anticuerpo 4H6 quimérico induce la citototoxicidad mediada por células dependiente de un anticuerpo (CCDA) in vitro.

Se llevaron a cabo experimentos incubando células Colo205 marcadas con ^{51}Cr (línea celular tumoral de colon humano; ATCC) (2 x 10^{4} células/pocillo en medio RPMI complementado con SFB al 10%, L-glutamina al 1%, penicilina-estreptomicina al 1%) con anticuerpo 4H6 quimérico (5 \mug/ml) primero y luego con LBP humanos durante una noche como fuente de células efectoras. Se purificaron los LBP de sangre entera humana mediante centrifugación de Ficoll-Hypaque. Como controles positivos, se incluyeron células Colo205 marcadas con ^{51}Cr tratadas con anticuerpo 4H6 quimérico más IgG de cabra anti-humana (10 \mug/ml) (adquirida en ICN Pharmaceuticals). Como control negativo, se añadió anticuerpo frente a IgE anti-humana ("2E5"; Genentech). Según lo mostrado en la figura 20, las células Colo205 marcadas con ^{51}Cr tratadas con anticuerpo 4H6 quimérico más IgG de cabra anti-humana dieron como resultado una liberación de ^{51}Cr del 52%. A una proporción de 40:1 entre el efector y la diana, se produjo una liberación de ^{51}Cr del 40%, lo que sugiere que el anticuerpo 4H6 quimérico induce un nivel significativo de CCDA. El porcentaje de liberación de ^{51}Cr se calculó en base a la liberación total de ^{51}Cr de las células Colo205 marcadas con ^{51}Cr tras un tratamiento con Triton-X100 al 1%.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18 Actividad in vivo del anticuerpo 4H6 quimérico

Los experimentos se llevaron a cabo esencialmente según lo descrito en el ejemplo 15. Se cultivaron células tumorales Colo205 en medio de DMEM/F-12 (50:50) complementado con SFB al 10%, glutamina 2mM y antibióticos. Se inyectaron a ratones desnudos atímicos hembra (de 4-6 semanas de edad, 7-8 ratones por grupo) subcutáneamente 5 x 10^{6} células Colo205 en 0,2 ml de PBS en las zonas dorsales. Una vez que los tamaños de los tumores alcanzaron los 50-100 mm^{3}, se agruparon aleatoriamente los ratones y se administraron intraperitonealmente anticuerpos monoclonales [anticuerpo 4H6.17.8 murino purificado (véase el ejemplo 2); anticuerpo 4H6 quimérico (véase el ejemplo 16); y anticuerpo frente a IgG1 control] en un volumen de 0,1 ml a 5 mg/kg, una vez a la semana.

Según lo mostrado en la Fig. 21, el anticuerpo 4H6 quimérico demostró actividad anti-tumoral en el modelo de xenoinjertos en ratones desnudos, aunque el nivel de actividad anti-tumoral del anticuerpo 4H6 quimérico no fue tan potente como el del anticuerpo monoclonal 4H6.17.8 murino. Actualmente, se cree que la actividad anti-tumoral menos potente del anticuerpo 4H6 quimérico se debe al sistema heterólogo usado para el estudio in vivo.

\vskip1.000000\baselineskip

Depósito de material

Los siguientes materiales han sido depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. (ATCC):

5

Este depósito se hizo en virtud de las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes y las regulaciones del mismo (Tratado de Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha del depósito. El depósito será puesto a disposición del público por parte de la ATCC en virtud de los términos del Tratado de Budapest y estará sujeto a un acuerdo entre Genentech, Inc. y ATCC, lo que garantiza la disponibilidad permanente y de libre acceso para el público de la progenie del cultivo del depósito tras la emisión de la pertinente patente estadounidense o tras dar acceso al público a cualquier solicitud de patente estadounidense o extranjera, sea cual sea la primera, y garantiza la disponibilidad de la progenie para cualquier persona determinada por el Comisionado Estadounidense de Patentes y Marcas como autorizada para ello según el apartado 122 de 35 USC y las normas del Comisionado con arreglo a ello (incluyendo el apartado 1.14 de 37 CFR con particular referencia a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que, en caso de que el cultivo de los materiales en depósito muriera o fuera extraviado o destruido al ser cultivado en condiciones adecuadas, los materiales serán reemplazados por otros similares de inmediato previa notificación. La disponibilidad del material depositado no será considerada como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados en virtud de la autoridad de cualquier gobierno en conformidad con sus leyes de patentes.

Se considera que la anterior memoria presentada por escrito es suficiente para permitir la práctica de la invención a cualquier experto en la técnica. La presente invención no estará limitada en cuanto a su alcance por el constructo depositado, pues la realización depositada está destinada simplemente a ilustrar ciertos aspectos de la invención, perteneciendo cualquier constructo que sea funcionalmente equivalente al ámbito de esta invención. El depósito del material de la presente memoria no implica el reconocimiento de que la descripción contenida por escrito en la presente memoria sea inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni será considerado como restrictivo del alcance de las reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de aquéllas mostradas y descritas en la presente memoria, serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 9725428 A [0004] [0027] [0220] [0265]

\bullet WO 9701633 A [0004] [0027]

\bullet EP 417563 A [0006]

\bullet WO 9851793 A [0014]

\bullet WO 9841629 A [0014]

\bullet WO 9835986 A [0014]

\bullet EP 870827 A [0014]

\bullet WO 9846643 A [0014]

\bullet WO 9902653 A [0014]

\bullet WO 9909165 A [0014]

\bullet WO 9911791 A [0014]

\bullet WO 9832856 A [0028]

\bullet US 4816567 A [0048] [0049] [0087] [0087] [0109]

\bullet US 5545807 A [0051] [0116]

\bullet US 5545806 A [0051]

\bullet US 5569825 A [0051]

\bullet US 5625126 A [0051]

\bullet US 5633425 A [0051]

\bullet US 5661016 A [0051]

\bullet US 5750373 A [0051]

\bullet US 5821333 A [0055]

\bullet US 5500362 A [0059]

\bullet US 5821337 A [0059]

\bullet WO 9429348 A [0104]

\bullet US 4342566 A [0104]

\bullet WO 9404679 A [0111]

\bullet US 5567610 A, Borrebaeck [0112]

\bullet US 5229275 A, Goroff [0112]

\bullet US 5591669 A [0116]

\bullet US 5589369 A [0116]

\bullet WO 9805344 A [0117]

\bullet WO 9815833 A [0117]

\bullet WO 9747314 A [0117]

\bullet WO 9744491 A [0117]

\bullet WO 9735196 A [0117]

\bullet WO 9534648 A [0117]

\bullet US 5712089 A [0117]

\bullet US 5702892 A [0117] [0117]

\bullet US 5427908 A [0117]

\bullet US 5403484 A [0117]

\bullet US 5432018 A [0117]

\bullet US 5270170 A [0117]

\bullet WO 9206176 A [0117]

\bullet WO 9906587 A [0117]

\bullet US 5514548 A [0117]

\bullet WO 9708320 A [0117]

\bullet WO 9308829 A [0122]

\bullet US 4676980 A [0124] [0124]

\bullet WO 9100360 A [0124]

\bullet WO 92200373 A [0124]

\bullet EP 03089 A [0124]

\bullet WO 8101145 A [0126]

\bullet WO 8807378 A [0126]

\bullet US 4975278 A [0126]

\bullet US 5739277 A [0129]

\bullet WO 9013646 A [0133]

\bullet US 4965199 A [0140]

\bullet EP 73657 A [0146]

\bullet US 4419446 A [0148]

\bullet US 4601978 A [0148]

\bullet WO 9411026 A [0150]

\bullet DD 266710 [0151]

\bullet EP 402226 A [0152]

\bullet EP 183070 A [0152]

\bullet EP 244234 A [0152]

\bullet US 5807715 A [0155]

\bullet US 4767704 A [0157]

\bullet US 4657866 A [0157]

\bullet US 4927762 A [0157]

\bullet US 4560655 A [0157]

\bullet US 5122469 A [0157]

\bullet WO 9003430 A [0157]

\bullet WO 8700195 A [0157]

\bullet US RE30985 E [0157]

\bullet US 4873191 A [0199]

\bullet US 4736866 A [0199]

\bullet US 09322875 B [0275]

Documentos que no son patentes citados en la descripción

\bulletBARR et al. Bio/Technology, 1994, vol. 12, 487-493 [0002]

\bulletSTELLER et al. Science, 1995, vol. 267, 1445-1449 [0002]

\bulletITOH et al. Cell, 1991, vol. 66, 233-243 [0002] [0008]

\bulletTHOMPSON. Science, 1995, vol. 267, 1456-1462 [0002]

\bulletRAFF. Nature, 1992, vol. 356, 397-400 [0003]

\bulletSACHS et al. Blood, 1993, vol. 82, 15 [0003]

\bulletWATANABE-FUKUNAGA et al. Nature, 1992, vol. 356, 314-317 [0003]

\bulletGRUSS; DOWER. Blood, 1995, vol. 85, 3378-3404 [0004]

\bulletPITTI et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 12687-12690 [0004]

\bulletWILEY et al. Immunity, 1995, vol. 3, 673-682 [0004]

\bulletBROWNING et al. Cell, 1993, vol. 72, 847-856 [0004]

\bulletARMITAGE et al. Nature, 1992, vol. 357, 80-82 [0004]

\bulletSCHMID et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1986, vol. 83, 1881 [0004]

\bulletDEALTRY et al. Eur. J. Immunol., 1987, vol. 17, 689 [0004]

\bulletZHENG et al. Nature, 1995, vol. 377, 348-351 [0004]

\bulletAMAKAWA et al. Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, 1995 [0004]

\bulletKRAMMER et al. Curr. Op. Immunol., 1994, vol. 6, 279-289 [0005]

\bulletNAGATA et al. Science, 1995, vol. 267, 1449-1456 [0005]

\bulletYONEHARA et al. J. Exp. Med., 1989, vol. 169, 1747-1756 [0005]

\bulletHOHMANN et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 14927-14934 [0006]

\bulletBROCKHAUS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, vol. 87, 3127-3131 [0006]

\bulletLOETSCHER et al. Cell, 1990, vol. 61, 351 [0006]

\bulletSCHALL et al. Cell, 1990, vol. 61, 361 [0006]

\bulletSMITH et al. Science, 1990, vol. 248, 1019-1023 [0006]

\bulletLEWIS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, vol. 88, 2830-2834 [0006]

\bulletGOODWIN et al. Mol. Cell. Biol., 1991, vol. 11, 3020-3026 [0006]

\bulletTAKAO et al. Immunogenetics, 1993, vol. 37, 199-203 [0006]

\bulletNOPHAR, Y. et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 3269 [0006]

\bulletKOHNO, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, vol. 87, 8331 [0006]

\bulletHALE et al. J. Cell. Biochem., 1991, vol. 113 (15F), 424 [0006]

\bulletBANNER et al. Cell, 1993, vol. 73, 431-435 [0007]

\bulletJOHNSON et al. Cell, 1986, vol. 47, 545 [0008]

\bulletRADEKE et al. Nature, 1987, vol. 325, 593 [0008]

\bulletSTAMENKOVIC et al. EMBO J., 1989, vol. 8, 1403 [0008]

\bulletMALLETT et al. EMBO J., 1990, vol. 9, 1063 [0008]

\bulletUPTON et al. Virology, 1987, vol. 160, 20-29 [0008]

\bulletSMITH et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991, vol. 176, 335 [0008]

\bulletUPTON et al. Virology, 1991, vol. 184, 370 [0008]

\bulletWELCHER, A.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, 159-163 [0008]

\bulletYAN, H.; CHAO, M.V. J. Biol. Chem., 1991, vol. 266, 12099-12104 [0008]

\bulletPEETRE, C. et al. Eur. J. Hematol., 1988, vol. 41, 414-419 [0008]

\bulletSECKINGER, P. et al. J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, 11966-11973 [0008]

\bulletBROJATSCH et al. Cell, 1996, vol. 87, 845-855 [0011]

\bulletMONTGOMERY et al. Cell, 1996, vol. 87, 427-436 [0011]

\bulletMARSTERS et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 14029-14032 [0011]

\bulletSIMONET et al. Cell, 1997, vol. 89, 309-319 [0011]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 750 [0012]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1996, vol. 6, 1669 [0012]

\bulletCHINNAIYAN et al. Science, 1996, vol. 274, 990 [0012]

\bulletKITSON et al. Nature, 1996, vol. 384, 372 [0012]

\bulletBODMER et al. Immunity, 1997, vol. 6, 79 [0012]

\bulletPAN et al. Science, 1997, vol. 276, 111-113 [0013]

\bulletSHERIDAN et al. Science, 1997, vol. 277, 818-821 [0014] [0225]

\bulletPAN et al. Science, 1997, vol. 277, 815-818 [0014]

\bulletSCREATON et al. Curr. Biol., 1997, vol. 7, 693-696 [0014]

\bulletWALCZAK et al. EMBO J., 1997, vol. 16, 5386-5387 [0014]

\bulletWU et al. Nature Genetics, 1997, vol. 17, 141-143 [0014]

\bulletHYMOWITZ et al. Molecular Cell, 1999, vol. 4, 563-571 [0014]

\bulletMCFARLANE et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 25417-25420 [0015]

\bulletSCHNEIDER et al. FEBS Letters, 1997, vol. 416, 329-334 [0015]

\bulletDEGLI-ESPOSTI et al. J. Exp. Med., 1997, vol. 186, 1165-1170 [0015]

\bulletMONGKOLSAPAYA et al. J. Immunol., 1998, vol. 160, 3-6 [0015]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1997, vol. 7, 1003-1006 [0016] [0225]

\bulletPAN et al. FEBS Letters, 1998, vol. 424, 41-45 [0016]

\bulletDEGLI-ESPOSTI et al. Immunity, 1997, vol. 7, 813-820 [0016]

\bulletSTELLER. Science, 1995, vol. 267, 1445 [0018]

\bulletCHINNAIYAN et al. Science, 1997, vol. 275, 1122-1126 [0018]

\bulletZOU et al. Cell, 1997, vol. 90, 405-413 [0018]

\bulletCHINNAIYAN; DIXIT. Current Biology, 1996, vol. 6, 555-562 [0018]

\bulletFRASER; EVAN. Cell, 1996, vol. 85, 781-784 [0018]

\bulletTARTAGLIA et al. Cell, 1993, vol. 74, 845-853 [0018]

\bulletHSU et al. Cell, 1996, vol. 84, 299-308 [0018]

\bulletNAGATA. Cell, 1997, vol. 88, 355 [0018]

\bulletCLEVELAND; IHLE. Cell, 1995, vol. 81, 479-482 [0018]

\bulletCHINNAIYAN et al. Cell, 1995, vol. 81, 505-512 [0018]

\bulletBOLDIN et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 387-391

\bulletCHINNAIYAN et al. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, 4961-4965 [0018]

\bulletBOLDIN et al. Cell, 1996, vol. 85, 803-815 [0018]

\bulletMUZIO et al. Cell, 1996, vol. 85, 817-827 [0018]

\bulletRAY et al. Cell, 1992, vol. 69, 597-604 [0019]

\bulletTEWARI et al. Cell, 1995, vol. 81, 801-809 [0019]

\bulletENARI et al. Nature, 1995, vol. 375, 78-81 [0019]

\bulletTEWARI et al. J. Biol. Chem., 1995, vol. 270, 3255-3260 [0019]

\bulletTEWARI et al. Curr. Op. Genet. Develop., 1996, vol. 6, 39-44 [0020]

\bulletVERMA et al. Genes Develop., 1996, vol. 9, 2723-2735 [0020]

\bulletBALDWIN. Ann. Rev. Immunol., 1996, vol. 14, 649-681 [0020]

\bulletPAN et al. Science, 1997, vol. 276, 111 [0026] [0028]

\bulletPITTI et al. J. Biol. Chem, 1996, vol. 271, 12687 [0027]

\bulletMARSTERS et al. Curr. Biol., 1997, vol. 6, 79 [0027]

\bulletWILEY, S. et al. Immunity, 1995, vol. 3, 637 [0027]

\bulletAUSUBEL et al. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience Publishers, 1995 [0034]

\bulletSAMBROOK et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989 [0036]

\bulletCHOTHIA et al. J. Mol. Biol., 1985, vol. 186, 651-663 [0044]

\bulletNOVOTNY; HABER. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 4592-4596 [0044]

\bulletKABAT, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1987 [0046]

\bulletMAGE et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 79-97 [0048]

\bulletKOHLER; MILSTEIN. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0049] [0080]

\bulletMCCAFFERTY et al. Nature, 1990, vol. 348, 552-554 [0049]

\bulletVAUGHAN et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 309-314 [0051] [0117]

\bulletSHEETS et al. PNAS, (USA), 1998, vol. 95, 6157-6162 [0051]

\bulletHOOGENBOOM; WINTER. J. Mol. Biol., 1991, vol. 227, 381 [0051]

\bulletMARKS et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581 [0051]

\bulletMARKS et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0051]

\bulletLONBERG et al. Nature, 1994, vol. 368, 856-859 [0051]

\bulletMORRISON. Nature, 1994, vol. 368, 812-13 [0051]

\bulletFISHWILD et al. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 845-51 [0051]

\bulletNEUBERGER. Nature Biotechnology, 1996, vol. 14, 826 [0051]

\bulletLONBERG; HUSZAR. Intern. Rev. Immunol., 1995, vol. 13, 65-93 [0051]

\bulletCOLE et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy. Alan R. Liss, 1985, 77 [0051]

\bulletBOERNER et al. J. Immunol., 1991, vol. 147 (1), 86-95 [0051]

\bulletBURTON. Molec. Immunol., 1985, vol. 22, 161-206 [0054] [0056]

\bulletRAVETCH; KINET. Annu. Rev. Immunol., 1991, vol. 9, 457-92 [0059] [0061]

\bulletCLYNES et al. PNAS (USA), 1998, vol. 95, 652-656 [0059]

\bulletDAËRON. Annu. Rev. Immunol., 1997, vol. 15, 203-234 [0061]

\bulletCAPEL et al. Immunomethods, 1994, vol. 4, 25-34 [0061]

\bulletDE HAAS et al. J. Lab. Clin. Med., 1995, vol. 126, 330-41 [0061]

\bulletGUYER et al. J. Immunol., 1976, vol. 117, 587 [0061]

\bulletKIM et al. J. Immunol., 1994, vol. 24, 249 [0061]

\bulletGAZZANO-SANTORO et al. J. Immunol. Methods, 1996, vol. 202, 163 [0062]

\bulletMARKS et al. Hio/Technology, 1992, vol. 10, 779-783 [0063]

\bulletBARBAS et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA, 1994, vol. 91, 3809-3813 [0063]

\bulletSCHIER et al. Gene, 1995, vol. 169, 147-155 [0063]

\bulletYELTON et al. J. Immunol., 1995, vol. 155, 1994-2004 [0063]

\bulletJACKSON et al. J. Immunol., 1995, vol. 154 (7), 3310-9 [0063]

\bulletHAWKINS et al. J. Mol. Biol., 1992, vol. 226, 889-896

\bullet Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs. MURAKAMI et al. The Molecular Basis of Cancer. WB Saunders, 1995, 13 [0069]

\bulletWILMAN. Prodrugs in Cancer Chemotherapy. Biochemical Society Transactions, 1986, vol. 14, 375-382 [0070]

\bullet Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery. STELLA et al. Directed Drug Delivery. Humana Press, 1985, 247-267 [0070]

\bulletAgnew Chem Intl. Ed. Engl., 1994, vol. 33, 183-186 [0072]

\bulletGODING. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Academic Press, 1986, 59-103 [0082] [0114]

\bulletKOZBOR. J. Immunol., 1984, vol. 133, 3001 [0083]

\newpage

\bulletBRODEUR et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications. Marcel Dekker, Inc, 1987, 51-63 [0083] [0114]

\bulletMUNSON; POLLARD. Anal. Biochem., 1980, vol. 107, 220 [0084]

\bulletCUNNINGHAM; WELLS. Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0093]

\bulletILIADES et al. FEBS Letters, 1997, vol. 409, 437-441 [0106]

\bulletKORTT et al. Protein Engineering, 1997, vol. 10, 423-433 [0106]

\bulletJONES et al. Nature, 1986, vol. 321, 522-525 [0108] [0109]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-329 [0108]

\bulletPRESTA. Curr. Op. Struct. Biol., 1992, vol. 2, 593-596 [0108]

\bulletRIECHMANN et al. Nature, 1988, vol. 332, 323-327 [0109]

\bulletVERHOEYEN et al. Science, 1988, vol. 239, 1534-1536 [0109]

\bulletSIMS et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2296-2308 [0110]

\bulletCHOTHIA; LESK. J. Mol. Biol., 1987, vol. 196, 901-917 [0110]

\bulletCARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 4285-4289 [0110]

\bulletPRESTA et al. J. Immunol., 1993, vol. 151, 2623-2632 [0110]

\bulletSHOENFELD et al. J. Clin. Invest., 1982, vol. 70, 205 [0112]

\bulletNUGENT et al. Blood, 1987, vol. 70 (1), 16-22 [0112]

\bulletKOZBOR. J. Immunol., 1987, vol. 133, 3001 [0114]

\bulletJAKOBOVITS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, vol. 90, 2551 [0116]

\bulletJAKOBOVITS et al. Nature, 1993, vol. 362, 255-258 [0116]

\bulletBRUGGERMANN et al. Year in Immuno., 1993, vol. 7, 33 [0116]

\bulletDUCHOSAL et al. Nature, 1992, vol. 355, 258-262 [0116]

\bulletHUSE et al. Science, 1989, vol. 246, 1275 [0117]

\bulletBARBAS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1991, vol. 88, 7978-7982 [0117]

\bulletMARKS et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0117]

\bulletHOOGENBOOM; WINTER. J. Mol. Biol., 1992, vol. 227, 381-388 [0117]

\bulletBARBAS et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, vol. 89, 4457-4461 [0117]

\bulletGRIFFITHS et al. EMBO Journal, 1994, vol. 13, 3245-3260 [0117]

\bulletDE KRUIF et al. J. Mol. Biol, 1995, vol. 248, 97-105

\bulletMILSTEIN; CUELLO. Nature, 1983, vol. 305, 537-539 [0122]

\bulletTRAUNECKER et al. EMBO J., 1991, vol. 10, 3655-3659 [0122]

\bulletSURESH et al. Methods in Enzymology, 1986, vol. 121, 210 [0123]

\bulletMASSEY. Nature, 1987, vol. 328, 457-458 [0127]

\bulletNEUBERGER et al. Nature, 1984, vol. 312, 604-608 [0128]

\bulletRemington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0129]

\bulletSTINCHCOMB et al. Nature, 1979, vol. 282, 39 [0141]

\bulletJONES. Genetics, 1977, vol. 85, 12 [0141]

\bullet VAN DEN BERG. Bio/Technology, 1990, vol. 8, 135 [0142]

\bulletFLEER et al. Bio/Technology, 1991, vol. 9, 968-975 [0142]

\bulletREYES et al. Nature, 1982, vol. 297, 598-601 [0148]

\bulletYANIV. Nature, 1982, vol. 297, 17-18 [0149]

\bulletGRAHAM et al. J. Gen Virol., 1977, vol. 36, 59 [0155]

\bulletURLAUB et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, vol. 77, 4216 [0155]

\bulletMATHER. Biol. Reprod., 1980, vol. 23, 243-251 [0155]

\bulletMATHER et al. Annals N.Y. Acad. Sci., 1982, vol. 383, 44-68 [0155]

\bulletHAM et al. Meth. Enz., 1979, vol. 58, 44 [0157]

\bulletBARNES et al. Anal. Biochem., 1980, vol. 102, 255 [0157]

\bulletCARTER et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163-167 [0158]

\bulletLINDMARK et al. J. Immunol. Meth., 1983, vol. 62, 1-13 [0159]

\bulletGUSS et al. EMBO J, 1986, vol. 5, 15671575 [0159]

\bullet Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1980 [0182]

\bullet Handbook of Monoclonal Antibodies. Noges Publications, 1985, 303-357 [0184]

\bulletSMITH et al. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy. Raven Press, 1977, 365-389 [0184]

\bulletChemotherapy Service. Williams & Wilkins, 1992 [0186]

\bulletAUCHINCLOSS, H. JR.; SACHS, D. H. Fundamental Immunology. Raven Press, 1989, 889-992 [0193]

\bulletTANABE, M. et al. Transplantation, 1994, vol. 58, 23 [0193]

\bulletTINUBU, S. A. et al. J. Immunol., 1994, 4330-4338 [0193]

\bulletISSEKUTZ, A. C. et al. Immunology, 1996, vol. 88, 569 [0195]

\bulletWOLYNIEC, W. W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1998, vol. 18, 777 [0196]

\bulletSCHON, M. P. et al. Nat. Med., 1997, vol. 3, 183 [0197]

\bulletNICKOLOFF, B. J. et al. Am. J. Path., 1995, vol. 146, 580 [0197]

\bullet VAN DER PUTTEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, 6148-615 [0199]

\bulletTHOMPSON et al. Cell, 1989, vol. 56, 313-321 [0199]

\bulletLO. Mol. Cel. Biol., 1983, vol. 3, 1803-1814 [0199]

\bulletLAVITRANO et al. Cell, 1989, vol. 57, 717-73 [0199]

\bulletLASKO et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, 6232-636 [0200]

\bulletTHOMAS; CAPECCHI. Cell, 1987, vol. 51, 503 [0202]

\bulletLI et al. Cell, 1992, vol. 69, 915 [0202]

\bulletBRADLEY. Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. IRL, 1987, 113-152 [0202]

\bulletZOLA. Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques. CRC Press, Inc, 1987, 147-158 [0203]

\bulletHUNTER et al. Nature, 1962, vol. 144, 945 [0203]

\bulletDAVID et al. Biochemistry, 1974, vol. 13, 1014-1021 [0203]

\bulletPAIN et al. J. Immunol. Meth., 1981, vol. 40, 219-230

\bulletNYGREN. J. Histochem. and Cytochem., 1982, vol. 30, 407-412 [0203]

\bulletARUFFO et al. Cell, 1990, vol. 61, 1303-1313 [0208]

\bulletBLAKE et al. Journal of Biological Chemistry, 1996, vol. 271, 27677-685 [0230]

\bulletCRAIG et al. Journal of Molecular Biology, 1998, vol. 281, 183-201 [0230]

\bulletMOORE et al. Meth. In Cell Biol., 1998, vol. 57, 265 [0235]

\bulletMOORE et al. Cell Biol., 1998, vol. 57, 265 [0238]

\bulletCARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, vol. 89, 4285-4289 [0260]

\bulletKABAT et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest. National Institutes of Health, 1991 [0262]

\bulletKAWASAKI, E. S. et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, Inc, 1990, 21-27 [0263]

\bulletPRESTA et al. Cancer Research, 1997, vol. 57, 4593-4599 [0263]

\bulletCARTER et al. Bio/Technology, 1992, vol. 10, 163 [0263]

\bulletCARTER et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, vol. 89, 4285 [0263]

\bulletASHKENAZI et al. J. Clin. Invest., 1999, vol. 104, 155-162 [0265]

\bulletFLICK et al. J. Immunol. Methods, 1984, vol. 68, 167-175 [0265]

\global\parskip0.000000\baselineskip

<110> Genentech, Inc.

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Anticuerpos frente a DR4 y usos de los mismos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> P1245R1P2BPCT

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 25-05-2000

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/322.875

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 28-05-1999

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 468

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ser humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1407

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ser humano

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2, 16, 17, 19, 21, 22, 27, 28, 31, 32, 34, 35

\vskip0.400000\baselineskip

<223> w = a o t; k = g o t; b = g o t o c; y = c o t; r = a o g; s = g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\hskip1cm

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 27, 28, 31, 34, 39

\vskip0.400000\baselineskip

<223> m = a o c; r = a o g; n = a o g o t o c; s = g o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\hskip1cm

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-36

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia está sintetizada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\hskip1cm

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-36

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia está sintetizada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\hskip1cm

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 702

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-57

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los nucleótidos 1-57 corresponden a una secuencia señal derivada de un vector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 58-435

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los nucleótidos 58-435 son de origen murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 436-702

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los nucleótidos 436-702 son de origen humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 702

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-702

\vskip0.400000\baselineskip

<223> La secuencia está sintetizada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos corresponden a una secuencia señal derivada de un vector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20-126

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos 20-126 son de origen murino

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 127-233

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos 127-233 son de origen humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1431

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 58, 60, 63

\vskip0.400000\baselineskip

<223> s = g o c; r = a o g; k = g o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1431

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1369, 1372, 1374

\vskip0.400000\baselineskip

<223> s = g o c; y = c o t; m = a o c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 476

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1-19

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos 1-19 corresponden a una secuencia señal derivada de un vector

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20-145

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos 20-145 son de origen murino

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> xaa puede ser glutamina o ácido glutámico

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 146-476

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Los aminoácidos 146-476 son de origen humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

200

20

Claims (15)

1. Anticuerpo anti-DR4 quimérico aislado que comprende:

(a) un dominio variable de cadena ligera, dominio variable que comprende los residuos de aminoácido 20 a 126 de la SEC ID N.º 9;

(b) un dominio CH1 de cadena ligera que comprende los residuos de aminoácido 127 a 233 de la SEC ID N.º 9;

(c) un dominio variable de cadena pesada que comprende los residuos de aminoácido 20 a 145 ó 22 a 145 de la SEC ID N.º 12; y

(d) los dominios CH1, CH2 y CH3 de cadena pesada que comprenden los residuos de aminoácido 146 a 476 de la SEC ID N.º 12.

2. Anticuerpo anti-DR4 quimérico de la reivindicación 1, anticuerpo que comprende además una secuencia señal de cadena ligera que comprende residuos de aminoácido 1 a 19 de SEC ID N.º 9.

3. Anticuerpo anti-DR4 quimérico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, anticuerpo que es un anticuerpo agonista que induce la apóptosis en al menos un tipo de célula de mamífero.

4. Anticuerpo anti-DR4 quimérico de la reivindicación 3, anticuerpo agonista que induce la apóptosis en al menos un tipo de célula cancerosa de mamífero.

5. Anticuerpo anti-DR4 quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, anticuerpo que se une al receptor DR4 con una afinidad de unión de al menos 10^{9} M^{-1} a 10^{12} M^{-1}.

6. Anticuerpo anti-DR4 quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, anticuerpo que está conjugado con un agente citotóxico o una enzima de activación de un profármaco.

7. Ácido nucleico aislado codificante de un anticuerpo anti-DR4 quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 7.

9. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8.

10. Célula huésped de la reivindicación 9 que es una E. coli.

11. Célula huésped de la reivindicación 9 que es una célula de ovario de hámster chino.

12. Célula huésped de la reivindicación 9 que es una célula de levadura.

13. Procedimiento para producir un anticuerpo anti-DR4 quimérico que comprende cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y recuperar el anticuerpo del cultivo de la célula huésped.

14. Uso de un anticuerpo anti-DR4 quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento para inducir la apóptosis en células cancerosas de mamífero.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que dichas células cancerosas de mamífero comprenden células de cáncer de colon, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón o carcinoma de células escamosas de pulmón.