ES2374301T3 - Anticuerpos frente a dr5 y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-DR5 que comprende mutaciones en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa 16E2 como se establece en las SEQ ID NO. 1 y 13, respectivamente, o un fragmento del mismo, en el que: dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad mayor por DR5 que el anticuerpo de longitud completa 16E2 y es capaz de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas y las mutaciones comprenden: (i) un conjunto de mutaciones de la cadena pesada seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) N53Q, L102Y; (ii) M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y; (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) G33A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Y, L102Y; (viii) T28A, N53Q, L102Y y (ix) T28A, N53Y, L102Y en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 y (ii) un conjunto de mutaciones de la cadena ligera seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y y (iii) Q24S, K51A, R91A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13.

Description

Anticuerpos frente a dr5 y sus usos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere generalmente a anticuerpos frente a DR5, incluyendo anticuerpos agonistas, y a procedimientos de uso de dichos anticuerpos frente a DR5.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] En la técnica se han identificado diversos ligandos y receptores pertenecientes a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Entre estos ligandos se incluyen el factor de necrosis tumoral alfa ("TNF alfa"), el factor de necrosis tumoral beta ("TNF beta" o “linfotoxina alfa”), linfotoxina beta ("LT beta), ligando CD30, ligando CD27, ligando CD40, ligando OX-40, ligando 4-1BB, LIGHT, ligando Apo-1 (también denominado ligando Fas o ligando CD95), ligando Apo-2 (también denominado como Apo2L y TRIAL), ligando Apo-3 (también denominado como TWEAK). APRIL, ligando OPG (también denominado ligando RANK, ODF o TRANCE) y TALL-1 (también denominado como BlyS, BAFF o THANK) (véase, p. ej., Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377-411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry y col., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Browsing y col., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage y col. Nature, 357:80-82 (1992), documento WO 97/01633 publicado el 16 de enero de 1997; documento WO 97/25428 publicado el 17 de julio de 1997; Marsters y col., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche y col., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne y col., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento WO98/28426 publicado el 2 de julio de 1998; documento WO98/4675 publicado el 22 de octubre de 1998; documento WO/98/18921 publicado el 7 de mayo de 1998; Moore y col., Science, 285:260-263 (1999); Shu y col., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider y col., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay y col., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

[0003] Típicamente, la inducción de diversas respuestas celulares mediadas por estos ligandos de la familia del TNF se inicia por su unión a receptores celulares específicos. Algunos, pero no todos, los ligandos de la familia del TNF se unen e inducen diversas actividades biológicas a través de "receptores de muerte" de la superficie celular activando caspasas o enzimas que participan en la ruta de muerte celular o apoptosis (Salvesen y col., Cell, 91:443446 (1997). Los miembros incluidos en la superfamilia de receptores del TNF identificados hasta la fecha son TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (también denominado Apo-1 o CD95), DR4 (también denominado TRAIL-R1), DR5 (también denominado Apo-2 o TRAIL-R2), DcR1, DcR2, osteoprotegerina (OPG), RANK y Apo-3 (también denominado DR3 o TRAMP) (véase, p. ej., Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi y Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi y Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, páginas 377411; Locksley y col., Cell, 104:487-501 (2001); Gruss y Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman y col., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563, publicado el 20 de marzo de 1991; Loetscher y col., Cell, 61:351 (1990); Schall y col., Cell, 61:361 (1990); Smith y col., Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin y col., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic y col., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallet y col., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson y col., Nature, 390:175-179 (1997); Chicheportiche y col., J. Biol. Chem., 272:3240132410 (1997); Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Pan y col., Science, 277:815-818 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda y col., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow y col., Science, 278:138-141 (1997)).

[0004] La mayoría de estos miembros de la familia de receptores del TNF comparten la estructura típica de receptores de superficie celular con regiones extracelular, transmembrana e intracelular, mientras que otros se encuentran de forma natural como proteínas solubles carentes de dominio transmembrana e intracelular. La porción extracelular de los TNFR típicos contiene un patrón repetitivo de secuencia de aminoácidos de dominios múltiples ricos en cisteína (DRC) que empiezan desde el NH2 terminal.

[0005] El ligando denominado Apo-2L o TRAIL se identificó hace varios años como miembro de la familia de citoquinas TNF. (véase, p. ej. Wiley y col., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti y col., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996); documentos WO 97/01633 y WO 97/25428; patente de EE. UU. Nº 5.763.223 presentada el 9 de junio de 1998; patente de EE. UU. Nº 6.284.236 presentada el 4 de septiembre de 2001). La secuencia polipeptídica nativa completa de Apo2L/TRAIL es una proteína transmembrana de tipo II de 281 aminoácidos. Algunas células pueden producir una forma soluble natural del polipéptido, mediante la escisión enzimática de la región extracelular polipeptídica (Mariani y col., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)). Los estudios cristalográficos de las formas solubles de Apo2L/TRAIL, muestran una estructura homotrimérica similar a las estructuras del TNF y otras proteínas relacionadas (Hymowitz y col., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha y col., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya y col., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz y col., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Sin embargo, se ha encontrado que Apo2L/TRIAL, a diferencia de otros miembros de la familia del TNF, tiene una característica estructural exclusiva en tres restos de cisteína (en la posición 230 de cada subunidad del homotrímero) coordinados conjuntamente con un átomo de cinc y que la unión al cinc es importante para la estabilidad del trímero y la actividad biológica (Hymowitz y col., supra; Bodmer y col., J. Biol. Chem., 275:2063220637 (2000)).

[0006] Se ha publicado en la literatura que Apo2L/TRIAL puede tener una función principal en la modulación del sistema inmune, incluso en enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide [véase, p. ej., Thomas y col., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen y col., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith y col., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song y col., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)].

[0007] También se ha publicado que las formas solubles de Apo2L/TRAIL inducen la apoptosis en diversas células cancerígenas, como tumores de colon, pulmón, mama, próstata, vejiga, riñón, ovario y cerebro, así como melanoma, leucemia y mieloma múltiple (véase, p. ej., Wiley y col., supra; Pitti y col., supra; patente de EE. UU. Nº

6.030.945 presentada el 29 de febrero de 2000; patente de EE. UU. Nº 6.746.668 presentada el 8 de junio de 2004; Rieger y col., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi y col., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak y col., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane y col., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani y col., Clin Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu y col., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). Los estudios in vivo en modelos de tumores murinos sugieren además que Apo2L/TRIAL, solo o en combinación con quimioterapia o radioterapia, puede ejercer efectos antitumorales sustanciales (véase, p. ej., Ashkenazi y col., supra; Walzcak y col., supra; Gliniak y col., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan y col., supra; Roth y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); solicitud de patente US/00/15512; solicitud de patente US/01/23691). Al contrario que muchos tipos de células cancerosas, la mayoría de los tipos de células humanas normales parecen resistentes a la inducción de apoptosis mediante determinadas formas recombinantes de Apo2L/TRIAL (Ashkenazi y col., supra; Walzcak y col., supra). Jo y col. han publicado que una forma soluble etiquetada con polihistidina de Apo2L/TRIAL inducía apoptosis in vitro en hepatocitos humanos normales aislados, pero no en no humanos (Jo y col., Nature Med., 6:564-567 (2000); véase también, Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Se considera que determinadas preparaciones de Apo2L/TRIAL recombinante pueden variar en términos de propiedades bioquímicas y actividades biológicas en células enfermas frente a normal dependiendo, por ejemplo, de la presencia o ausencia de una molécula etiqueta, contenido de cinc y % del contenido en el trímero (véase Lawrence y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin y col., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

[0008] Se ha encontrado que Apo2L/TRIAL se une al menos a cinco receptores diferentes. Al menos dos de los receptores a los que se une Apo2L/TRIAL contienen un dominio de muerte citoplasmático funcional. Uno de estos receptores se ha denominado “DR4” (y alternativamente TR4 o TRAIL-R1) (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véanse también los documentos WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998; WO99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000, patentes de EE. UU. 6.433.147 presentada el 13 de agosto de 2002; 6.461.823 presentada el 8 de octubre de 2002 y 6.342.383 presentada el 29 de enero de 2002).

[0009] Otro receptor para Apo2L/TRIAL se ha denominado DR5 (también se ha denominado alternativamente Apo-2; TRAIL-R o TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 o KILLER) (véanse, p. ej., Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997), Pan y col., Science, 277:815-818 (1997), documento WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998; documento WO98/41629 publicado el 24 de septiembre de 1998; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak y col., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); documentos WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; EP870,827 publicado el 14 de octubre de 1998; WO98/4664 publicado el 22 de octubre 1998; WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; US 2002/0072091 publicado el 13 de agosto de 2002; US 2002/0098550 publicado el 7 de diciembre de 2001; US 6.313.269 presentada el 6 de diciembre de 2001; US 2001/0010924 publicado el 2 de agosto de 2001; US 2003/01255540 publicado el 3 de julio de 2003; US 2002/0160446 publicado el 31 de octubre de 2002, US 2002/0048785 publicado el 25 de abril de 2002; US 6.342.369 presentado en febrero de 2002; US 6.569.642 presentado el 27 de mayo de 2003, US 6.072.047 presentada el 6 de junio de 2000, US 6.642.358 presentado el 4 de noviembre de 2003; US 6.743.625 presentado el 1 de junio de 2004). Al igual que DR4, se notifica que DR5 contiene tres dominios ricos en cisteína en su porción extracelular y un único dominio de muerte citoplasmático y es cada de realizar la señalización de la apoptosis tras la unión del ligando (o tras la unión de una molécula, como un anticuerpo agonista, que mimetiza la actividad del ligando). La estructura cristalina del complejo formado entre Apo-2L/TRIAL y DR5 se describe en Hymowitz y col., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

[0010] Tras la unión del ligando, tanto DR4 como DR5 pueden desencadenar independientemente la apoptosis reclutando y activando el iniciador de apoptosis, caspasa-8, a través de la molécula adaptadora que contiene el dominio de muerte denominado FADD/Mort1 [Kischkel y col., Immunity 12:611-620 (2000); Sprick y col., immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer y col., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]. En particular, DR5 señaliza la apoptosis a través de la ruta "extrínseca celular", que es independiente del gen supresor tumoral p53 (Ashkenazi y Dixit, Science 281:1305-8 (1998); Ashkenazi, Nat Rev Cancer 2:420-30 (2002)). La activación de esta ruta supone una formación rápida de un completo de señalización inductor de muerte (DISC, por sus siglas en inglés) en el dominio de muerte del receptor citoplasmático activado. En primer lugar, la molécula adaptadora FADD se une a DR5 mediante interacción homófila con dominio de muerte (Kischkel y col., supra, Sprick y col., supra, Bodmer y col., supra). Posteriormente, FADD recluta las proteasas que inician la apoptosis caspasa-8 y caspasa-10, mediando en su actividad a través de la inducción de las caspasa-9 y caspasa-10 de proximidad que sufren un autoprocesamiento, liberando subunidades solubles activas de la caspasa al citoplasma, donde se acoplan y escinden caspasas efectoras, como la caspasa 3 y la caspasa 7. La escisión tiene como resultado la activación de las caspasas efectoras, que desarrollan el programa celular de apoptosis (Thornberry y Lazebnik, Science 281:13126 (1998)).

[0011] Se ha publicado que Apo2L/TRAIL también se une a los receptores denominados DcR1, DcR2 y OPG, que se considera funcionan como inhibidores, más que como traductores de señalización (véase, p. ej., DCR1 (también denominada TRID, LIT o TRAIL-R3) [Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan y col., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane y col., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider y col., FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti y col., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997) y Mongkolsapaya y col., J. Immunol., 160:3-6 (1998); DCR2 (también denominado TRUNDD o TRAIL-R4) [Marsters y col., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan y col., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti y col., Immunity, 7:813-820 (1997)] y OPG [Simonet y col., supra]. Al contrario que DR4 y DR5, los receptores DcR1 y DcR2 no señalizan la apoptosis.

[0012] Se han recogido en la literatura determinados anticuerpos que se unen a los receptores DR4 y/o DR5. Por ejemplo, anticuerpos anti-DR4 dirigidos frente al receptor DR4 y que tienen actividad agonista o apoptótica en determinadas células de mamíferos se describen, por ejemplo, en los documentos WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; WO 00/73349 publicado el 12 de julio de 2000; WO 03/066661 publicado el 14 de agosto de 2003. Véase, p. ej., Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai y col., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); documentos WO 02/097033 publicado el 2 de diciembre de 2002; WO 03/042367 publicado el 22 de mayo de 2003; W0 03/038043 publicado el 8 de mayo de 2003; W0 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Igualmente se han descrito determinados anticuerpos anti-DR5, véase p. ej..; el documento WO 98/51793 publicado el 8 de noviembre 1998; Griffith y col., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa y col., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander y col., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2ª Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Resumen, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, 29 de agosto-1 de septiembre de 2002, Banff, Alberta, Canadá; documentos WO 03/038043 publicado el 8 de mayo 2003 y WO 03/037913 publicado el 8 de mayo de 2003. Además, se han descrito determinados anticuerpos que presentaban reactividad cruzada con ambos receptores DR4 y DR5 (véase, p. ej., la patente de EE. UU. Nº 6252.050 presentada el 26 de junio de 2001).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0013] En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-DR5 que comprende mutaciones en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa 16E2 como se establece en las SEQ ID NO. 11 y 13, respectivamente, o un fragmento del mismo, en el que:

dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad mayor por DR5 que el anticuerpo de longitud completa 16E2 y es capaz de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas y las mutaciones comprenden:

(i)

un conjunto de mutaciones de la cadena pesada seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) N53Q, L102Y; (ii) M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y, (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) 033A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Q, L102Y; (viii) G33A, N53Y, L102Y; (ix) T28A, N53Q, L102Y y (x) T28A, N53Y, L102Y en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 y

(ii)

un conjunto de mutaciones de la cadena ligera seleccionados entre el grupo compuesto por (i) Q24S, G50K, K51D, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y y (iii) Q24S, KS1A, R91A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 13.

[0014] Aún en otra realización, el anticuerpo anti-DR5 comprende una mutación estructural seleccionada entre el grupo compuesto por Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q.

[0015] En una realización adicional, el anticuerpo anti-DR5 comprende todas las mutaciones estructurales Q6E, V114, B12V, R13Q y K105Q.

[0016] En una realización en particular, el anticuerpo anti-DR5 comprende las siguientes mutaciones: G33A, N53Q, L102Y en la secuencia de la SEQ ID NO. 11 y Q24S, K51A, R91A en la secuencia de SEQ ID NO. 13 y puede comprender adicionalmente al menos una mutación estructural, que puede ser, por ejemplo, al menos uno de los restos 6, 11, 12, 13 y 105 de la SEQ ID NO. 11.

[0017] A continuación se proporcionan ejemplos de anticuerpos anti-DR5 y se seleccionan entre el grupo compuesto por los Apomabs1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 y 9.3.

[0018] A continuación se proporcionan ejemplos adicionales de anticuerpos anti-DR5 y se seleccionan entre el grupo compuesto por Apomab 5.2, 5.3, 6.2, 6.3, 7.2, 7.3, 8.3 y 25.3.

[0019] Aun en otra realización en particular, el anticuerpo anti-DR5 es Apomab 7.3 o Apomab 8.3, especialmente Apomab 7.3.

[0020] Todavía en una realización adicional, el anticuerpo anti-DR5 es un fragmento de anticuerpo, que puede seleccionarse entre el grupo compuesto por fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, dianticuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

[0021] En otras realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo de cadena sencilla.

[0022] Los anticuerpos anti-DR5 pueden, por ejemplo, tener actividad antineoplásica, como, por ejemplo, puede poseer la capacidad de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas.

[0023] El cáncer incluye, por ejemplo, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.

[0024] Entre los ejemplos de cáncer más específicos se incluyen carcinoma epidermoide, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM), linfoma no Hodgkin, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y cáncer de cabeza y cuello.

[0025] Entre los grupos especiales de cáncer se incluyen el cáncer de pulmón (p. ej. carcinoma pulmonar no microcítico; CPNM) o adenocarcinoma, que pueden ser, por ejemplo, adenocarcinoma colorrectal, pancreático y metastásico. También se incluyen los cánceres hematológicos.

[0026] Los anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos están dentro del alcance de este documento, ya que son anticuerpos que median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés).

[0027] En una realización preferida, el anticuerpo anti-DR5 comprende Apomab 7.3 o Apomab 8.3, o un fragmento de los mismos.

[0028] Los anticuerpos pueden estar en forma dimérica y/o en forma entrecruzada, por ejemplo, con una región Fc de una IgG anti-humano.

[0029] En otras realizaciones, los anticuerpos anti-DR5 de este documento se fusionan con una secuencia de epítope etiqueta.

[0030] En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula quimérica que comprende un anticuerpo anti-DR5 o fragmento de anticuerpo de este documento, fusionado con una secuencia de aminoácidos heteróloga, en la que la secuencia de aminoácidos heteróloga puede, por ejemplo, comprender una secuencia de inmunoglobulina, como una región Fc de una IgG anti-humano.

[0031] Aún en otro aspecto, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican los anticuerpos anti-DR5 o fragmentos de este documento, vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, células huésped que comprenden estas moléculas de ácido nucleico y procedimientos para producir anticuerpos y fragmento de anticuerpo de este documento.

[0032] La invención además se refiere a una composición que comprende un anticuerpo anti-DR5 como se define anteriormente en este documento y un vehículo.

[0033] El vehículo puede ser un vehículo farmacéuticamente aceptable y la composición puede comprender además un agente antineoplásico adicional y/o un anticuerpo anti-DR5 adicional.

[0034] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para inducir la apoptosis que comprende la exposición de las células cancerosas de mamífero a un anticuerpo anti-DR5 como se define en este documento, o un fragmento del mismo.

[0035] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-DR5 según se define en este documento, o un fragmento del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0036]

En la figura 1 se muestra la secuencia de nucleótidos del ADNc del ligando Apo-2 humano (SEQ ID NO. 2) y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO. 1). La letra "N" en la posición del nucleótido 447 (en la SEQ ID NO. 2) se usa para indicar que la base del nucleótido puede ser una "T" o una "G".

En las figuras 2A-2C se muestra la secuencia de nucleótidos de un ADNc (SEQ ID NO. 4) para el receptor de longitud completa DR4 humano y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO. 3). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos respectivas para el receptor DR4 humano también se recogen en Pan y col., Science,

276:111 (1997).

En las figuras 3A-3C se muestra la secuencia de 411 aminoácidos del receptor DR5 humano (SEQ ID NO. 5) como se publica en el documento WO 98/51793 de 19 de noviembre de 1998 y la secuencia de nucleótidos codificada (SEQ ID NO. 6).

En las figuras 4A-4C se muestra la secuencia de 440 aminoácidos del DR5 humano (SEQ ID NO. 7) y la secuencia de nucleótidos codificas (SEQ ID NO. 8), según también se publica en el documento WO 98/35986 de 20 de agosto de 1998.

En la figura 5 se muestra la secuencia de nucleótidos del anticuerpo anti-DR5 de cadena sencilla 16E2 (scFv de 16E2) (SEQ ID NO. 9).

En la figura 6 se muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-DR5 de cadena sencilla 16E2 (scFv de 16E2) (SEQ ID NO. 10), donde se muestran la secuencia señal y los CDR de las cadenas pesada y ligera.

En la figura 7 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 16E2 de longitud completa (SEQ ID NO. 11). En la figura 8 se muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del anticuerpo 16E2 de longitud completa (SEQ ID NO. 12).

En la figura 9 se muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 16E2 de longitud completa (SEQ ID NO. 13).

En la figura 10 se muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del anticuerpo 16E2 de longitud completa (SEQ ID NO. 14).

En las figuras 11A y B se muestra la secuencia del plásmido pDR1 (SEQ ID NO. 15, 5.391 pb) para la expresión de las cadenas ligeras de inmunoglobulina. El vector pDR1 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby y col., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)), los codones de inicio y parada que se indican en negrita y subrayados.

En las figuras 12A y B se muestra la secuencia del plásmido pDR2 (SEQ ID NO. 16) para la expresión de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina. El vector pDR2 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD3 humanizado (Shalaby y col., supra), los codones de inicio y parada que se indican en negrita y subrayados.

La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de Apomab 7.3 (SEQ ID NO. 17).

La figura 14 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Apomab 7.3 (SEQ ID NO. 18).

La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera de Apomab 7.3 (SEQ ID NO. 19).

La figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Apomab 7.3 (SEQ ID NO. 20).

En las figuras 17A y B se muestra el alineamiento de las cadenas pesadas de 16E2 y Apomab 7.3.

En la figura 18 se muestra el alineamiento de las cadenas ligeras de 16E2 y Apomab 7.3. La figura 19 es un modelo de homología para la cadena pesada del anticuerpo anti-DR5.

La figura 20 es un modelo de homología para la cadena pesada del anticuerpo anti-DR5.

En la figura 21 se muestra la actividad antineoplásica de una única dosis intraperitoneal (i. p.) de Apomab 5.3, 6.3 y

8.3 en comparación con el anticuerpo de longitud completa 16E2 (versión 1) en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano Colo 205 en ratón atímico desnudo.

En la figura 22 se muestra la actividad antineoplásica de una única dosis intraperitoneal (i. p.) de Apomab 5.2, 6,2, 5.3, 7.2 y 7.3 en comparación con el anticuerpo de longitud completa 16E2 (versión 1) en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano Colo 205 en ratón atímico desnudo.

En la figura 23 se muestra la actividad antineoplásica de una única dosis intraperitoneal (i. p.) de Apomab 5.2, 7,3 y 8,3 en comparación con el anticuerpo de longitud completa 16E2 (versión 1) en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano Colo 205 en ratón atímico desnudo.

En la figura 24 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 23.3 y 25.3 en comparación con Apomab 7.3 en el modelo de xenoinjerto cáncer de colon Colo 205 en ratones atímicos desnudos.

En la figura 25 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 derivado de una línea celular estable frente a una línea celular transitoria en el modelo de xenoinjerto de cáncer de colon humano Colo 205 en ratones atímicos desnudos.

En la figura 26 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con CPT-11 en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón HCT15.

En la figura 27 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con CPT-11 en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón LS 180. En la figura 28 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo o en combinación con RITUXAN® (rituximab) en un modelo de xenoinjerto de linfoma no Hodgkin BJAB en ratones SCID CE17 ICR.

En la figura 29 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con gemcitabina en un modelo de xenoinjerto de cáncer de adenocarcinoma pancreático humano LS 180 en ratones atímicos desnudos.

En la figura 30 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con carboplatino y taxol en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano células H460.

En la figura 31 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con carboplatino y taxol en un modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H2122.

En la figura 32 se muestra la curva de respuesta frente a dosis de Apomab 7.3 en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H2122.

En la figura 33 se muestra la actividad antineoplásica de Apomab 23.3 y 25.3 en comparación con Apomab 7.3 en el modelo de de xenoinjerto de cáncer de colon humano Colo 205.

En la figura 34 se muestra la mediana del crecimiento tumoral y la gráfica de Kaplan-Meier para Apo2L.0 solo, Apomab 7.3 solo y en diversas combinaciones frente a xenoinjertos de carcinoma de colon humano Colo205 en ratones desnudos.

En las figuras 35 y 36 se muestra la mediana del crecimiento tumoral y las gráficas de Kaplan-Meier para Apo2L.0 solo, Apomab 7.3 solo y en diversas combinaciones, frente a células de la línea de carcinoma pulmonar no microcítico humano (CPNM) SKMES-1 en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos.

En la figura 37 se muestra la mediana del crecimiento tumoral y la gráfica de Kaplan-Meier para Apo2L.0 solo, Apomab 7.3 solo y en diversas combinaciones en el modelo de xenoinjerto de la línea de carcinoma de colon humano Colo205.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA

I. Definiciones

[0037] Los términos “ligando Apo-2", "Apo-2L”, “Apo2L”, “ligando Apo-2/TRAIL” y “TRAIL” se usan de forma indistinta en este documento para referirse a una secuencia polipeptídica que incluye los restos de aminoácidos 114-281 inclusive, los restos 95-281 inclusive, los restos 92-281 inclusive, los restos 91-281 inclusive, los restos 41-281 inclusive, los restos 39-281 inclusive, los restos 15-281, inclusive o los restos 1-281 inclusive, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEQ ID NO. 1), así como fragmentos biológicamente activos, o variantes de deleción, inserción y/o sustitución de las secuencias anteriores. En una realización, la secuencia polipeptídica comprende los restos 114-281 de la figura 1 (SEQ ID NO. 1). Opcionalmente, la secuencia de polipéptidos comprende los restos 92-281 o los restos 91-281 de la figura 1 (SEQ ID NO. 1). Los polipéptidos Apo-2L pueden estar codificados por la secuencia de nucleótidos nativa que se muestra en la figura 1 (SEQ ID NO. 2). Opcionalmente, el codón que codifica el resto Pro119 (figura 1; SEQ ID NO. 2) puede ser “CCT” o "CCG”. Opcionalmente, los fragmentos o variantes son biológicamente activos y tienen una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 80%, o una identidad de secuencia de al menos el 90% o una identidad de secuencia de algunos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente. La definición abarca variantes de sustitución del ligando Apo-2 en las que al menos uno de sus aminoácidos nativos están sustituidos por otro aminoácido, como un resto de alanina. La definición también abarca una secuencia nativa del ligando Apo-2 aislada de una fuente de ligando Apo-2 o preparada mediante procedimientos recombinantes y/o sintéticos. El ligando Apo-2 de la invención incluye los polipéptidos denominados ligando Apo-2 o TRAIL descritos en los documentos WO97/01633 publicado el 16 de enero de 1997, WO97/25428 publicado el 17 de julio de 1997, WO99/36535 publicado el 22 de julio de 1999, WO 01/00832 publicado el 4 de enero de 2001, WO02/09755 publicado el 7 de febrero de 2002, WO 00/75191 publicado el 14 de diciembre de 2000 y la patente de EE. UU. Nº

6.030.945 presentada el 29 de febrero de 2000. Los términos se utilizan para referirse generalmente a formas del ligando Apo-2, que incluyen formas monómero, dímero, trímero, hexámero u oligómeros superiores del polipéptido. Todas las numeraciones de los restos de aminoácidos hacen referencia a la secuencia de Apo-2L usada en la numeración según la figura 1 (SEQ ID NO. 1), siempre que específicamente no se establezca otra cosa.

[0038] “Receptor del ligando Apo-2” incluye los receptores denominados en la técnica como “DR4” y “DR5” cuyas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos se muestran en las figuras 2A-2C (SEQ ID NO. 4 y 3) y 3A-3C (SEQ ID NO. 6 y 5), respectivamente. Pan y col., han descrito al miembro de la familia del receptor de TNF denominado "DR4" (Pan y col., Science, 276:111-113 (1997); véase también los documentos WO98/32856 publicado el 30 de julio de 1998; WO 99/37684 publicado el 29 de julio de 1999; WO 00/73349 publicado el 7 de diciembre de 2000; las patentes de EE. UU. 6.433.147 presentada el 13 de agosto de 2002, 6.461.823 presentada el 8 de octubre de 2002 y 6.342.383 presentada el 29 de enero de, 2002). Sheridan y col., Science, 277:818-821 /1997) y Pan y col., Science, 277:815-818 (1997) describieron otro receptor para Apo2L/TRAIL (véanse también los documentos WO98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998 y WO98/4162 publicado el 24 de septiembre de 1998). Este receptor se denomina DR5 (el receptor también se denomina alternativamente Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tanto-63, hAP08, TRICK2 o KILLER; Screaton y col., Curr. Biol., 7:693-696 (1997), Walczak y col., EMBO J., 16:5386-5387 (1997), Wu y col., Nature Genetics, 17:141-143 (1997), documentos WO98/35986 publicado el 20 de agosto de 1998; EP870.827 publicado el 14 de octubre de 1998; WO98/4664 publicado el 22 de octubre 1998; WO99/02653 publicado el 21 de enero de 1999; WO99/09165 publicado el 25 de febrero de 1999; WO99/11791 publicado el 11 de marzo de 1999; patentes de EE. UU. 2002/0072091 publicada el 13 de agosto de 2002; 2002/0098550 publicada el 7 de diciembre de 2001; 6.313.269 presentada el 6 de diciembre de 2001; 2001/0010924 publicada el 2 de agosto de 2001; 2003/01255540 publicada el 3 de julio de 2003; 2002/0160446 publicada el 31 de octubre de 2002, 2002/0048785 publicada el 25 de abril de 2002; 6.569.642 presentada el 27 de mayo de 2003,

6.072.047 presentada el 6 de junio de 2000, 6.642.358 presentada el 4 de noviembre de 2003). Como se describió anteriormente, entre otros receptores para Apo-2L se incluyen DcR1, DcR2 y OPG (véanse, Sheridan y col, supra, Marsters y col., supra y Simonet y col., supra). El término “receptor Apo-2L” cuando se usa en este documento abarca al receptor de secuencia nativa y las variantes del receptor. Estos términos abarcan al receptor Apo-2L expresado en diversos mamíferos, incluso en humanos. El receptor de Apo-2L puede expresarse de forma endógena como sucede naturalmente en diversos estirpes de tejidos humanos o puede expresarse mediante procedimientos recombinantes o sintéticos. Un "receptor de Apo-2L de secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un receptor de Apo-2L derivado de la naturaleza. Por tanto, un receptor de Apo-2L de secuencia nativa puede tener la secuencia de aminoácidos del receptor de Apo-2L natural de cualquier mamífero, incluso de humanos. Este receptor de Apo-2L de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios de recombinación o síntesis. El término “receptor de Apo-2L de secuencia nativa” abarca específicamente las formas del receptor naturales truncadas o secretadas (p. ej., una forma soluble que contiene, por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas variantes naturales (p. ej., formas de ayuste alternativo) y variantes alélicas naturales. Las variantes del receptor pueden incluir fragmentos o mutantes de deleción del receptor de Apo-2L de secuencia nativa. En las figuras 3A-3C se muestra la secuencia de 411 aminoácidos del DR5 humano como se publicó en el documento WO 98/51793 el 19 de noviembre de 1998. En la técnica es conocida una variante de ayuste transcripcional de la DR5 humana. Esta variante de ayuste codifica la secuencia de 440 aminoácidos del DR5 humano como se muestra en las figuras 4A-4C, junto con su secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO. 7 y 8) y según se publica en el documento WO 98/35986 de 20 de agosto de 1998.

[0039] “Anticuerpo frente al receptor de muerte” se usa en este documento para referirse en general a un anticuerpo o anticuerpos dirigidos frente a un receptor de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral que contienen un dominio de muerte capaz de señalizar la apoptosis y, entre estos anticuerpos, se incluyen el anticuerpo frente a DR5 y el anticuerpo frente a DR4.

[0040] "Anticuerpo frente al receptor DR5", "anticuerpo frente a DR5" o "anticuerpo anti-DR5" se usan en un sentido amplio para referirse a anticuerpos que se unen al menos a una forma de un receptor DR5 o a un dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR5 se fusiona o une a una secuencia o molécula heteróloga. Preferiblemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a formar complejos de orden superior u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR5 se une al receptor DR5 pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún otro receptor de Apo-2L (p. ej. DR4, DcR1 o DcR2). Opcionalmente el anticuerpo es un agonista de la actividad de señalización de DR5. El término “anticuerpo anti-DR5” y sus equivalentes gramaticales abarcan específicamente a los anticuerpos descritos en los ejemplos, incluyendo pero sin limitaciones, los anticuerpos “Apomab" enumerados en las tablas 11 y 12, como, por ejemplo, Apomab 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 y 9.3, preferiblemente Apomab 7.3.

[0041] Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR5 de la invención se une a un receptor DR5 a un rango de concentraciones de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM según se determina en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos frente a DR5 de la invención muestran un valor de IC50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM según se determina en el ensayo de unión BIAcore.

[0042] "Anticuerpo frente al receptor DR4", "anticuerpo frente a DR4" o "anticuerpo anti-DR4" se usan en un sentido amplio para referirse a anticuerpos que se unen al menos a una forma del receptor DR4 o a un dominio extracelular del mismo. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR4 se fusiona o une a una secuencia o molécula heteróloga. Preferiblemente, la secuencia heteróloga permite o ayuda al anticuerpo a formar complejos de orden superior u oligoméricos. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR4 se une al receptor DR4 pero no se une ni reacciona de forma cruzada con ningún otro receptor de Apo-2L (p. ej. DR5, DcR1 o DcR2). Opcionalmente el anticuerpo es un agonista de la actividad de señalización de DR4.

[0043] Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR4 se une a un receptor DR4 a un rango de concentraciones de aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 20 mM según se determina en un ensayo de unión BIAcore. Opcionalmente, los anticuerpos frente a DR5 de la invención muestran un valor de IC50 de aproximadamente 0,6 nM a aproximadamente 18 mM según se determina en el ensayo de unión BIAcore.

[0044] El término “agonista” se usa en el sentido más amplio e incluye a cualquier molécula que de forma parcial, o completa, potencia, estimula o activa una o más actividades biológicas de Apo2L/TRAIL, DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo. Entre los ejemplos de estas actividades de unión de Apo2L/TRAIL a DR4 o DR5, se incluyen la apoptosis así como las recogidas en la bibliografía. Un agonista puede funcionar de forma directa o indirecta. Por ejemplo, el agonista puede funcionar potenciando, estimulando o activando parcial o totalmente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo como resultado de su unión directa a DR4 o DR5, lo que causa la activación o transducción de señales. El agonista también puede funcionar indirectamente potenciando, estimulando o activando parcial o totalmente una o más actividades biológicas de DR4 o DR5, in vitro, in situ o in vivo como resultado de, por ejemplo, estimular otra molécula efectora que causa, de este modo, la activación o transducción de señales de DR4 o DR5. Se contempla que un agonista puede actuar como molécula potenciadora que funciona indirectamente potenciando o aumentando la activación o actividad de DR4 o DR5. Por ejemplo, el agonista puede potenciar la actividad de Apo-2L endógena en un mamífero. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la formación previa de complejos DR4 o DR5 o estabilizando los complejos del ligando respectivo con el receptor DR4 o DR5 (como la estabilización de un complejo nativo formado entre Apo-2L y DR4 o DR5).

[0045] El término “dominio extracelular” o “DEC” se refiere a una forma de ligando o receptor, que está esencialmente libre de dominios transmembrana y citoplasmático. Generalmente, la DEC soluble tendrá menos del 1% de estos dominios transmembrana y citoplasmático y, preferiblemente, tendrá menos del 0,5% de estos dominios.

[0046] El término “epítope etiquetado” cuando se usa en este documento se refiere a un polipéptido quimérico que comprende una proteína, como el ligando Apo-2 o el receptor DR5, una porción de estos o un anticuerpo que se une a este ligando o receptor, fusionado con un “polipéptido etiqueta”. El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos como para proporcionar un epítope frente al cual puede obtenerse un anticuerpo y aún es suficientemente corto como para que este no interfiera con la actividad del ligando o el receptor. El polipéptido etiqueta preferiblemente también es bastante exclusivo como para que el anticuerpo no presente una reacción cruzada considerable con otros epítopes. Los polipéptidos etiqueta adecuados generalmente tienen al menos seis restos de aminoácido y, normalmente, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 restos (preferiblemente, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 restos).

[0047] "Aislado" cuando se usa para describir las diversas proteínas descritas en este documento, significa una proteína que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que tópicamente podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos de la proteína y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En las realizaciones preferidas, la proteína se purificará (1) a un nivel suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal o internos usando un secuenciador de taza giratoria o

(2) a homogeneidad mediante PAGE en presencia de SDS en condiciones reductoras y no reductoras usando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción de plata. Proteína aislada incluye una proteína in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del ambiente natural del ligando Apo-2 no estará presente. Sin embargo, generalmente la proteína aislada se preparará mediante al menos un paso de purificación.

[0048] El “porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias identificadas en este documento se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia del ligando, receptor o anticuerpo comparado, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad en la secuencia de aminoácidos puede conseguirse de diversas formas que están dentro de las habilidades de la técnica, pueden determinarse parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo la asignación de algoritmos necesarios para lograr un alineamiento máximo a lo largo de las secuencias de longitud completa que se están comparando. A los fines expresados en este documento, los valores del porcentaje de identidad de aminoácidos pueden obtenerse usando el programa de ordenador de comparación de secuencias ALIGN-2, que fue creado por Genentech, Inc. y cuyo código fuente ha sido presentado con la documentación del usuario en la oficina de propiedad de derechos de autor de EE. UU., Washington, DC 20559, registrado con el número de registro de derechos de autor de EE. UU. Nº TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público a través de Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Todos los parámetros de comparación de secuencia se establecen en el programa ALIGN-2 y no deberán variar. A continuación, se calcula el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos en relación con la secuencia más larga. Por consiguiente, incluso si la secuencia más corta está completamente incluida en la secuencia más larga, la identidad de secuencia será menos del 100%.

[0049] El término “secuencias control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificadora unida de forma operativa en un organismo huésped en particular. Las secuencias control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Es sabido que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

[0050] El ácido nucleico se une “de forma operativa” cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretor se une de forma operativa al ADN de un polipéptido si este se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o un potenciador se une de forma operativa a una secuencia codificadora si este afecta a la transcripción de la secuencia, o un sitio de unión al ribosoma se une de forma operativa a una secuencia codificadora si se coloca de modo que facilita la traducción. Generalmente, “unido de forma operativa” significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, en caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores estén contiguos. La unión se logra por ligamiento a sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

[0051] El término "poliol", cuando se usa en este documento, se refiere en líneas generales a compuestos de alcohol polihidroxílico. Los polioles pueden ser cualquier polímero de poli(óxido alquileno) hidrosoluble y pueden tener una cadena lineal o ramificada. Entre los polioles preferidos se incluyen aquellos sustituidos en una o más posiciones hidroxilo con un grupo químico como un grupo alquilo que tiene entre uno y cuatro carbonos. Típicamente, el poliol es un poli(alquilénglicol), preferiblemente poli(etilénglicol) (PEG). Sin embargo, los expertos en la técnica reconocen que pueden emplearse otros polioles, como, por ejemplo, poli(propilénglicol) y copolímero de polietileno y polipropilénglicol usando las técnicas para conjugación descritas en este documento para el PEG. Entre los polioles se incluyen aquellos bien conocidos en la técnica y los que están a disposición del público, como de fuentes disponibles en el mercado como Nektar® Corporation.

[0052] El término “conjugado” se usa en este documento según su definición más amplia para significar ligados o unidos entre sí. Las moléculas son “conjugados" cuando actúan u operan como si estuvieran unidas entre sí.

[0053] Un experto en la materia determina fácilmente la “rigurosidad” de las reacciones de hibridación y, generalmente, es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para una hibridación apropiada, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridar cuando se presentan cadenas complementarias en un entorno por debajo de la temperatura de fusión. Cuanto más alto sea el grado de identidad deseado entre la sonda y la secuencia hibridable mayor será la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se entiende que temperaturas relativas más elevadas tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas mientras que temperaturas más bajas lo harían menos. Para obtener más detalles y explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

[0054] Las “condiciones rigurosas” o "condiciones muy rigurosas”, según se define en este documento, se identifican como aquellas en las que: (1) se emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50ºC; (2) se emplea un agente desnaturalizante durante la hibridación, como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficoll al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón fosfato sódico 50mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42ºC o (3) se emplea formamida al 50%, SSCx5 (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, solución de Denhardt x5, ADN de esperma de

5 salmón sonicado (50 μg/ml), SDS al 0,1% y sulfato de dextrano al 10% a 42ºC, con lavados a 42ºC en SSCx0,2 (cloruro sódico/citrato sódico) y formamida al 50% a 55ºC, seguido de un lavado en condiciones muy rigurosas compuesto por SSCx0,1 que contiene EDTA a 55ºC.

[0055] Las “condiciones moderadamente rigurosas" se identifican como las descritas por Sambrook y col.,

10 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (p. ej., temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: Formamida al 20%, SSCx5 (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt x 5, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón desnudo

15 desnaturalizado a 20 mg/ml, seguido de lavado de los filtros con SSCx1 a aproximadamente 37-50ºC. El experto reconocerá cómo ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc., cuando sea necesario acomodar factores como la longitud de la sonda y similares.

[0056] Los términos “aminoácido" y “aminoácidos" se refieren a todos los aminoácidos L-alfa naturales.

20 En esta definición se incluyen norleucina, ornitina y homocisteína. Los aminoácidos se identifican por las designaciones de uno o de tres letras: Asp D ácido aspártico Ile I isoleucina Thr T treonina Leu L leucina Ser S serina Tyr Y tirosina Glu E ácido glutámico Phe F fenilalanina Pro P prolina His H histidina Gly G glicina Lys K lisina Ala A alanina Arg R arginina Cys C cisteína Trp W triptófano Val V valina Gln Q glutamina Met M metionina Asn N asparragina

[0057] Puede que en las figuras se empleen otras designaciones de una o tres letras para referirse e 25 identificar dos o más aminoácidos o nucleótidos en una posición determinada de la secuencia.

[0058] El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y cubre especialmente a anticuerpos monoclonales anti-DR5 sencillos (incluyendo anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes o bloqueantes) y composiciones de anticuerpo anti-DR5 con especificidad poliepitópica. "Anticuerpo" como se utiliza en este

30 documento incluye moléculas de inmunoglobulina o anticuerpo intactas, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos) y fragmentos de inmunoglobulina (como Fab, F(ab')2 o Fv), siempre que muestren cualquiera de las propiedades agonista o antagonistas deseadas descritas en este documento.

35 [0059] Los anticuerpos son, típicamente, proteínas o polipéptidos que muestran especificidad de unión por un antígeno específico. Los anticuerpos vírgenes normalmente son glucoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Típicamente, cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de isotipos de inmunoglobulina diferentes. Cada cadena pesada y ligera

40 también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados de forma regular. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se considera que restos de aminoácidos particulares forman una interfaz

45 entre los dominios variables de las cadenas ligera y pesada [Chothia y col., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny y Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)]. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas ligeras, las inmunoglobulinas pueden asignarse a

50 clases diferentes. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y algunas de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), p. ej, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente.

55 [0060] Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, dianticuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formadas a partir de fragmentos de anticuerpo.

[0061] El término “variable” se usa en este documento para describir determinadas porciones de los dominios variables, que difieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular por su antígeno en particular. Sin embargo, la variabilidad normalmente no se distribuye uniformemente a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Típicamente se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables ambas tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservada de los dominios variables se denominan regiones estructurales (FR por sus siglas en inglés). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran medida una configuración de lámina �, conectadas mediante tres CDR, que forman lazos conectados y formando, en algunos casos, parte de la estructura en lámina beta. Los CDR en cada cadena se mantiene juntos y próximos mediante las regiones FR y, con los CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos [véanse Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)]. Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno, pero muestran diversas funciones efectores, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

[0062] Según se usa en este documento, el término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden presentarse en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos estando dirigidos frente a un único sitio antigénico. Además, al contrario que las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos frente a diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal se dirige hacia un único determinante de un antígeno.

[0063] Los anticuerpos monoclonales de este documento incluyen anticuerpos quiméricos, híbridos y recombinantes producidos por ayuste de un dominio variable (incluso hipervariable) de un anticuerpo anti-DR5 con un dominio constante (p. ej., anticuerpos "humanizados") o una cadena ligera con una cadena pesada o una cadena de una especie con una cadena de otra especie, o fusiones con proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen o de la designación de clase o subclase de la inmunoglobulina, así como fragmentos de anticuerpo (p. ej., Fab, F(ab’)2 y Fv), siempre que muestren la actividad biológica o las propiedades deseadas. Véanse, p. ej., la patente de EE. UU. Nº 4.816.567 y Mage y col., en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications págs. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: Nueva York, 1987).

[0064] Por tanto, el adjetivo “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que la producción del anticuerpo requiere ningún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizan según la presente invención pueden obtenerse por el procedimiento de obtención de hibridomas descrito por primera vez por Köhler y Milstein, Nature, 256:495 (1975) o pueden obtenerse mediante procedimientos de ADN recombinantes como se describe en la patente de EE. UU. Nº 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" pueden también aislarse a partir de bibliotecas de fagos generados usando las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990), por ejemplo.

[0065] Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas específicas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión al antígeno) que contienen la secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los restos de una región de determinación de complementariedad (CDR) del receptor se sustituyen por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador), como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseables. En algunos casos, los restos de la región estructural (FR) del Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los restos no humanos correspondientes. Adicionalmente, el anticuerpo humanizado puede comprender restos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o estructurales importadas. Estas modificaciones se hacen para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente al menos uno, y típicamente dos, dominios variables completos, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado comprenderá al menos una porción de una región o dominio constante de la inmunoglobulina (Fc), que típicamente es el de una inmunoglobulina humana.

[0066] Un “anticuerpo humano” es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que se corresponden con la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha construido usando cualquiera de las técnicas para la obtención de anticuerpos humanos conocidas en la técnica o descritas en este documento. Esta definición de anticuerpo humano incluye anticuerpos que comprenden al menos un polipéptido de la cadena pesada humana o al menos un polipéptido de la cadena ligera humana, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de la cadena ligera murina y de la cadena pesada humana. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando diversas técnicas conocidas en la materia. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona a partir de una biblioteca de fagos, donde esta biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col. Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets y col. PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Los anticuerpos humanos también pueden obtenerse introduciendo loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo, en ratones en los que los genes endógenos de la inmunoglobulina se han inactivado parcial o completamente. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos que a todos los respectos, se asemejan a los observados en humanos, incluyendo reordenamientos génicos, ensamblaje y creación de un repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. Nº 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661,016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano puede prepararse mediante inmortalización de linfocitos B humanos produciendo un anticuerpo dirigido frente a un antígeno diana (así pueden recuperarse linfocitos B de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro). Véase, p. ej., Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner y col. J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991) y la patente de EE. UU. Nº 5.750.373.

[0067] El término "región Fc” se usa para definir la región C-terminal de una cadena pesada de la inmunoglobulina, que puede generarse mediante digestión con papaína de un anticuerpo intacto. La región Fc puede ser una región Fc de secuencia nativa o una variante de la región Fc. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina podrían variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana normalmente se define como la extensión desde un resto de aminoácido aproximadamente en la posición Cys226, o desde aproximadamente la posición Pro230, hasta el extremo carboxilo terminal de la región Fc (usando el sistema de numeración de este documento según Kabat y col., supra). La región Fc de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, opcionalmente comprende un dominio CH4.

[0068] Por "cadena de la región Fc" de este documento se entiende una de las dos cadenas polipeptídicas de una región Fc.

[0069] El “dominio CH2” de la región Fc de la IgG humana (también denominado dominio “Cy2”) se extiende normalmente desde el resto de aminoácido aproximadamente en la posición 231 hasta el resto de aminoácido de aproximadamente la posición 340. El dominio CH2 es exclusivo porque no está formando pareja estrecha con otro dominio. Más bien, se interponen dos cadenas de hidratos de carbono ramificados con sitio N de glucosilación entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que el hidrato de carbono puede proporcionar un sustituto para la pareja dominio-dominio y ayuda a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985). El dominio CH2 de este documento puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o variante del dominio CH2.

[0070] El “dominio CH3” comprende la extensión de residuos del extremo C terminal desde un dominio CH2 en la región Fc (es decir, de un resto de aminoácido en aproximadamente la posición 341 a un resto de aminoácido en aproximadamente la posición 447 de una IgG). La región CH3 en este documento puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o una variante del dominio CH3 (p. ej., un dominio CH3 con una “protuberancia” en una cadena del mismo y la correspondiente “cavidad” introducida en la otra cadena de la misma, véase la patente de EE. UU. Nº 5.821.333). Estos dominios CH3 variantes pueden usarse para obtener anticuerpos multiespecíficos (p. ej., biespecíficos) como se describe en este documento.

[0071] La "región bisagra” se define generalmente como la extensión desde aproximadamente el resto Glu216, o aproximadamente el resto Cys226, a aproximadamente el resto Pro230 de la IgG1 humana (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el último resto de cisteína formando enlaces S-S dentro de la cadena pesada en las mismas posiciones. La región bisagra en este documento puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una variante de la región bisagra. Las dos cadenas polipeptídicas de una región bisagra variante generalmente retienen al menos un resto de cisteína por cadena polipeptídica, de modo que dos cadenas polipeptídicas de la región bisagra variante puede formar un puente disulfuro entre las dos cadenas. La región bisagra preferida de este documento es una región bisagra humana de secuencia nativa, p. ej., una región bisagra de una IgG1 humana de secuencia nativa.

[0072] Una “región Fc funcional” posee al menos una “función efectora” de una región Fc de secuencia nativa. Entre los ejemplos de “funciones efectoras” se incluyen la unión de C1q, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), unión al receptor de Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis, regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de célula B, BCR), etc. Estas funciones efectores generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (p. ej., un dominio variable de anticuerpo) y puede evaluarse usando diversos ensayos conocidos en la materia para evaluar estas funciones efectoras del anticuerpo.

[0073] Una “región Fc de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fc que se encuentra en la naturaleza. Una “región Fc variante” comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos. Preferiblemente, la región Fc variante tiene al menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región Fc de secuencia nativa o con la región Fc de un polipéptido parental, p. ej., de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos y, preferiblemente, de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fc de secuencia nativa

o en la región Fc del polipéptido parental. La región Fc variante de este documento tendrá preferiblemente al menos aproximadamente una identidad de secuencia del 80% con una región Fc de secuencia nativa y/o con una región Fc de un polipéptido parental y, más preferiblemente, al menos aproximadamente una identidad de secuencia del 90% con las mismas, más preferiblemente, una identidad de secuencia de aproximadamente el 95% con las mismas.

[0074] “Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo” y “ADCC” se refieren a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células citotóxicas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen un anticuerpo unido a una célula diana y, posteriormente, causan la lisis de la célula diana. Las células principales que median en la ADCC, las células NK, expresan FcyRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo de ADCC in vitro, como el que se describe en las patentes de EE.UU. Nº 5.500.362 o 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células citotóxicas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede evaluarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes y col. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

[0075] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan al menos FcyRIII y realizan una función efectora de ADCC. Entre los ejemplos de leucocitos humanos que median en la respuesta ADCC se incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citotóxicas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, siendo las preferidas las PBMC y las células NK. Las células efectoras pueden aislarse a partir una fuente nativa, p. ej., de la sangre o de PBMC, como se describe en este documento.

[0076] Los términos “Receptor Fc” y “FcR” se usan para describir un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de ayuste alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptores a base de tirosinas (ITAM, por sus siglas en inglés) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptores a base de tirosinas (ITIM) en su dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods, 4:25-34 (1994) y de Haas y col, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están incluidos en el término "FcR" de este documento. El término también incluye al receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim y col., 1994, J. Immunol., 24:249 (1994)).

[0077] “Citotoxicidad dependiente de complemento” y “CDC” se refieren a la lisis de una diana en presencia de complemento. La ruta de activación del complemento se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) formando complejo con un antígeno relacionado. Para evaluar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de CDC, p. ej., como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0078] Un anticuerpo con “afinidad madurada” es aquel con una o más alteraciones en uno o más CDR del mismo, lo que da lugar a una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posea esas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen mediante procedimientos conocidos en la técnica. Marks y col. Bio/Technology 10:779-783 (1992) describen la maduración de la afinidad mediante mezcla aleatoria de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de restos CDR y/o estructurales se describe en Barbas y col. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier y col. Gene 169:147-155 (1995); Yelton y col. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) y Hawkins y col, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0079] El término “inmunoespecífico” según se usa en “unión inmunoespecífica de anticuerpos" por ejemplo, se refiere a la interacción de unión específica de antígeno que tiene lugar entre el sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo y el antígeno específico reconocido por este anticuerpo.

[0080] A los fines de este documento, “biológicamente activo” y “actividad biológica deseada” significan que tiene la capacidad de modular la actividad de DR5 o la activación de DR5, incluyendo, a modo de ejemplo, apoptosis (de forma agonista o estimulante o de forma antagonista o bloqueante) en al menos un tipo de células de mamífero in vivo o ex vivo, uniéndose a un ligando Apo-2 (TRAIL) o modulando la activación de una o más moléculas en la ruta de señalización intracelular como la caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 o FADD. Los ensayos para determinar la activación de estas moléculas intracelulares son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Boldin y col., J. Biol. Chem., 270:7795-7798 (1995); Peter, Cell Death Differ., 7:759-760 (2000); Nagata, Cell, 88:355-365 (1998); Ashkenazi y col., Science, 281:1305-1308 (1999).

[0081] El término “agonista” cuando se usa en este documento se refiere o describe una molécula que es capaz de, directa o indirectamente, inducir, promover o potenciar sustancialmente la actividad biológica o activación de DR5. Opcionalmente, un "anticuerpo agonista de DR5” es un anticuerpo que tiene una actividad comparable a la del ligando de DR5, conocido como ligando Apo-2 (TRAIL) o es capaz de activar al receptor DR5 dando lugar a la activación de una o más rutas de señalización intracelular, que puede incluir la activación de la caspasa 3, caspasa 8, caspasa 10 y FADD.

[0082] El término “antagonista” cuando se usa en este documento se refiere o describe una molécula que es capaz de, directa o indirectamente, contrarrestar, reducir o inhibir sustancialmente la actividad biológica o activación de DR5. Opcionalmente, un antagonista es una molécula que neutraliza la actividad biológica resultante de la activación de DR5 o de la formación de un complejo entre DR5 y su ligando, como el ligando Apo-2.

[0083] Los términos “apoptosis” y “actividad apoptótica” se usan en un sentido amplio y se refieren a la forma ordenada o controlada de muerte celular en mamíferos que, típicamente, va acompañada de uno o más cambios celulares característicos, como condensación del citoplasma, pérdida de microvellosidades de la membrana plasmática, segmentación del núcleo, degradación del ADN cromosómico o pérdida de función mitocondrial. Esta actividad puede determinarse y medirse, por ejemplo, mediante ensayos de viabilidad celular, ensayos de unión de anexina V, pruebas de PARP, ensayos por FACS o electroforesis de ADN, todos ellos conocidos en la técnica. Opcionalmente, la actividad apoptótica se determinará mediante un ensayo de anexina V o PARP.

[0084] Los términos “cáncer”, "canceroso” y “maligno” se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cánceres se incluyen, pero sin limitaciones, carcinoma, incluyendo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, glioma, sarcoma, mieloma (como el mieloma múltiple) y leucemia. Más ejemplos particulares de estos cánceres son carcinoma epidermoide, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma pulmonar de células escamosas, cáncer gastrointestinal, linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, glioma, cáncer de ovario, cáncer hepático como carcinoma hepático y hepatoma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón como carcinoma de células renales y tumores de Wilms, carcinoma de célula basal, melanoma, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, cáncer de testículo, cáncer de esófago y diversos tipos de cánceres de cabeza y cuello.

[0085] El término “enfermedad relacionada con el sistema inmune” significa una enfermedad en la que un componente del sistema inmune de un mamífero causa, media o contribuye de algún modo a una morbilidad en el mamífero. También se incluyen las enfermedades en las que la estimulación o intervención de la respuesta inmune tiene un efecto de mejora sobre la progresión de la enfermedad. Dentro de este término se incluyen las enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias mediadas por el sistema inmune, enfermedades inflamatorias no mediadas por el sistema inmune e inmunodeficiencias. Entre los ejemplos de enfermedades relacionadas con el sistema inmune e inflamatorias, algunas de las cuales son inmunes o están mediada por células T, que pueden tratarse según la invención se incluyen lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, artritis crónica juvenil, espondiloartropatías, esclerosis sistémica (escleroderma), miopatías inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis o polimiositis), síndrome de Sjögren, vasculitis sistémica, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune (pancitopenia inmune o hemoglobinuria nocturna paroxística), trombocitopenia autoinmune (púrpura trombocitopénica idiopática o trombocitopenia medida por el sistema inmune), tiroiditis (enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil o tiroiditis atrófica), diabetes mellitus, enfermedad renal mediada por el sistema inmune (glomerulonefritis o nefritis tubulointersticial), enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idiopática o síndrome de Guillain-Barré y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedades hepatobiliares como la hepatitis infecciosa (hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotróficos), hepatitis activa crónica autoinmune, cirrosis biliar primaria, hepatitis granulomatosa y colangitis esclerosante, enfermedades pulmonares inflamatorias y fibróticas, como enfermedad intestinal inflamatoria (colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn), enteropatía sensible al gluten y enfermedad de Whipple, enfermedades cutáneas autoinmunes o mediadas por el sistema inmune como enfermedades cutáneas bullosas, eritema multiforme y dermatitis de contacto, psoriasis, enfermedades alérgicas como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria, enfermedades inmunológicas del pulmón como neumonías eosinofílicas, fibrosis pulmonar idiopática o neumonitis por hipersensibilidad, enfermedades asociadas al trasplante, como rechazo del injerto y enfermedad injerto contra huésped. Entre las enfermedades infecciosas se incluyen el SIDA (infección por VIH), hepatitis A, B, C, D y E, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas, infección por protozoos e infecciones por parásitos.

[0086] “Enfermedad autoinmune” se usa en este documento en un sentido amplio y general para referirse a enfermedades o afecciones de mamíferos en las que la destrucción de tejidos normales o sanos es debida a respuestas inmunes humorales o celulares del individuo mamífero a los constituyentes de sus propios tejidos. Son ejemplos, pero sin limitaciones, lupus eritematoso, tiroiditis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune y enfermedad intestinal inflamatoria (EII).

[0087] Un “agente inhibidor del crecimiento” cuando se usa en este documento, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula in vitro y/o in vivo. Por tanto, el agente inhibidor del crecimiento puede ser aquel que reduzca significativamente el porcentaje de células en fase S. Entre los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento se incluyen agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un lugar distinto a la fase S), como agentes que inducen la parada en G1 y la parada en fase M. Entre los bloqueantes de la fase M clásicos se incluyen los derivados de la vinca (vincristina y vinblastina), TAXOL® e inhibidores de la topoisomerasa II como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopósido y bleomicina. Los agentes que detienen el ciclo celular en la fase G1 también se expande a la parada en fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN, como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5fluorouracilo y ara-C. Pueden encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, titulado “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" de Murakami y col. (WB Saunders: Filadelfia 1995), especialmente la pág. 13.

[0088] El término “profármaco” como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células cancerosas en comparación con el fármaco parental y es capaz de activarse o convertirse enzimáticamente en la forma parental más activa. Véanse, p. ej., Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Entre los profármacos de esta invención se incluyen, pero sin limitaciones, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados de aminoácidos D, profármacos glucosilados, profármacos que contiene beta lactama, opcionalmente profármacos sustituidos con fenoxiacetamida u, opcionalmente, profármacos que contienen fenilacetamidas sustituidas, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre más activo. Entre los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivatizados en una forma profármaco para su uso en esta invención se incluyen, pero sin limitaciones, los agentes quimioterapéuticos descritos a continuación.

[0089] El término “agente citotóxico” según se usa en este documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función celular y/o causa la muerte o destrucción de las células. El término pretende incluir isótopos radiactivos (p. ej., At221, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu), agente quimioterapéuticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluso fragmentos y/o variantes de las mismas.

[0090] Un “agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de afecciones como el cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN™), sulfonatos de alquilo como busulfán, improsulfán y piposulfán, aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa, etileniminas y metilamelaminas como altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán), briostatina, calistatina, CC-1065 (incluyendo sus análogos adozelesina, carzelesina y bizelesina), criptoficinas (especialmente criptoficina 1 y criptoficina 8), dolastatina, duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CBI-TMI), eleuterobina, pancratistatina, una sarcodictina, espongistatina, mostazas nitrogenadas como clorambucilo, clornafacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo, nitrosoureas, como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibióticos como los antibióticos de enedina (p. ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina yII y caliqueamicina 0II, véase, p. ej., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:83-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y cromóforos cromoproteínas de antibióticos de enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolin-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolin-doxorrubicina y deoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipirina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; 5-FU, andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico relleno como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; maitansinoides como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina, dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida, tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucilo; gemcitabina, 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatino y carboplatino; vinblastina, platino; etoposido (VP16); ifosfamida; mitomicina C, mitoxantrona; vincristina, vinorrelbina, navelbina, novantrona; tenipósido, daunomicina; aminopterina; xeloda, ibandronato; CPT-11, inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico, capecitabina y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción de hormonas, como antiestrógenos, sobre los tumores como por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona y toremifeno (Fareston) y antiandrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprólido y goserelina, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquier de los anteriores.

[0091] El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de estas citoquinas son las linfoquinas, monoquinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen hormonas de crecimiento como la hormona del crecimiento humana, hormona del crecimiento humana con N-metionilo y la hormona del crecimiento bovino, hormona paratifoidea, tiroxina, insulina, proinsulina, relaxina, prorrelaxina, hormonas glucoprotéicas como hormona folículo estimulante (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona leutinizante (LH), factor de crecimiento hepático, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno de placenta, factor de necrosis tumoral alfa y beta, sustancia inhibidora mulleriana, péptido asociado a gonadotropina de ratón, inhibina, activina, factor de crecimiento del endotelio vascular, integrina, trombopoyetina (TPO), factores de crecimiento nerviosos como NGF-alfa, factor de crecimiento de plaquetas, factores de crecimiento transformantes (TGF) como TGF-alfa y TGF-beta, factor de crecimiento similar a insulina I y II, eritropoyetina (EPO), factores osteoinductores, interferones como el interferón alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSF) como CSF de macrófagos (M-CSF), CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y CSF de granulocitos (G-CSF), interleuquinas (IL) como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12; un factor de necrosis tumoral como TNF-alfa o TNF-beta y otros factores polipeptídicos como LIF y el ligando kit (KL). Como se usa en este documento, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de un cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa.

[0092] Los términos “tratando”, "tratamiento” y "terapia” según se usan en este documento se refieren a terapia curativa y terapia preventiva.

[0093] El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un fármaco eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas, reducir el tamaño del tumor, inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y, preferiblemente, detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, inhibir (es decir, ralentizar hasta cierto punto y, preferiblemente, detener) las metástasis tumorales, inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral y/o aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Según el grado en que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o matar a las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para el tratamiento del cáncer la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, evaluando la carga o volumen tumoral, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TPE) y/o determinar las tasas de respuesta (TR).

[0094] El término “mamífero” como se usa en este documento se refiere a cualquier mamífero clasificado como mamífero superior, incluyendo humanos, primates, vacas, caballos, perros y gatos. En una realización preferida de la invención, el mamífero es un humano.

[0095] El término "respuesta objetiva" se define como una respuesta completa o parcial al tratamiento de un sujeto, según de determina usando los criterios de evaluación de la respuesta en tumores sólidos (RECIST, por sus siglas en inglés) (J. Nat. Cancer Inst. 92(3):205-216 (2000)).

[0096] El término “duración de la respuesta” se usa en este documento para referirse al tiempo desde una respuesta completa o parcial inicial hasta el tiempo de la progresión de la enfermedad o la muerte.

[0097] El término “supervivencia sin progresión” se usa en este documento para referirse al tiempo desde el primer día del tratamiento hasta la progresión de la enfermedad o la muerte, lo que ocurra antes.

[0098] El término “regresión completa (RC)” se usa para indicar que el volumen del tumor es � 13,5 mm3 en tres medidas consecutivas.

[0099] El término “regresión parcial (RP)” indica que el volumen del tumor es � 50% de su volumen el día 1 en tres medidas consecutivas y � 13,5 mm3 para una o más de estas medidas.

I. Composiciones y procedimientos de la invención

A. Anticuerpos frente a DR5

[0100] En una realización de la invención, se proporcionan anticuerpos frente a DR5. Entre los ejemplos de anticuerpos se incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados. Estos anticuerpos puede ser anticuerpos agonistas, antagonistas o bloqueantes.

1.

Anticuerpos policlonales

[0101] Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. Los procedimientos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para los expertos. Los anticuerpos policlonales puede obtenerse en un mamífero, por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, de un adyuvante. Típicamente, el agente inmunizante y/o el adyuvante se inyectarán en el mamífero mediante inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples. El agente inmunizante puede incluir al polipéptido DR5 (o un DEC de DR5) o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante a una proteína conocida por ser inmunogénica en el mamífero que se está inmunizando. Entre los ejemplos de estas proteínas inmunogénicas se incluyen, pero sin limitaciones, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina bovina e inhibidor de la tripsina de soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden emplearse están el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato trehalosa sintético). Un experto en la materia puede seleccionar el protocolo de inmunización sin necesidad de experimentación. A continuación, puede sangrarse al mamífero y analizarse el título de anticuerpos frente a DR5 en el suero. Si se desea, el mamífero puede ser inmunizado de nuevo mientras que aumente el título de anticuerpo o hasta alcanza la estabilización.

2.

Anticuerpos monoclonales

[0102] Los anticuerpos de la invención pueden, alternativamente, ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando procedimientos de obtención de hibridomas, como los descritos por Khöler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un procedimiento de hibridomas, un ratón, hámster u otro animal huésped apropiado, típicamente se inmuniza con un agente inmunizante para provocar que los linfocitos produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, puede inmunizarse a los linfocitos in vitro.

[0103] El agente inmunizante incluirá típicamente el polipéptido DR5 (o un DEC de DR5) o una proteína de fusión del mismo, como una proteína de fusión DEC de DR5-IgG. El agente inmunizante puede comprender alternativamente un fragmento o porción de DR5 que tiene uno o más aminoácidos que participan en la unión de Apo-2L a DR5. En una realización preferida, el agente inmunizante comprende una secuencia del dominio extracelular de DR5 fusionado a una secuencia IgG.

[0104] Generalmente, se usan linfocitos de sangre periférica (“PBL”, por sus siglas en inglés) si se desean células de origen humano, o células esplénicas o células de ganglio linfático si se desean fuentes de mamíferos no humanos. A continuación, los linfocitos se fusionan con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, como polietilénglicol, para formar una célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), págs. 59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero transformadas, especialmente células de mieloma de roedores, bovinas o de origen humano. Normalmente se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que, preferiblemente, contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

[0105] Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan de forma eficaz, mantienen un nivel de expresión estable elevado del anticuerpo por parte de las células que producen el anticuerpo seleccionado y son sensibles a medios tales como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino que pueden obtenerse, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Un ejemplo de esta línea celular de mieloma murino es P3X63Ag8U, (ATCC CRL 1580). También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón y humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) págs. 51-63].

[0106] A continuación, puede ensayarse la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a DR5 en el medio de cultivo en el que se cultivan las células del hibridoma. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA). Estas técnicas y ensayos también son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem.,

107:220 (1980).

[0107] Después de que se han identificado las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse por procedimientos de dilución límite y crecimiento por procedimientos convencionales (Goding, supra). Entre los medios de cultivo adecuados para este fin se incluyen, por ejemplo, el medio de Eagle modificado por Dulbecco o el RPMI 1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden crecerse in vivo como ascitis en un mamífero.

[0108] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse a partir del medio de cultivo o del líquido ascítico por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas, como, por ejemplo, columna de sefarosa-proteína A, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

[0109] Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse mediante procedimientos de ADN recombinante, como los descritos en la patente de EE. UU. Nº 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla y secuencia fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión que, a continuación se transfectan dentro de células huésped, como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. También puede modificarse el ADN, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora de los dominios constantes de la cadena pesada y ligera humanas en el lugar de las secuencias de ratón homólogas (Morrison y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984); o mediante unión covalente a toda o parte de la secuencia que codifica la inmunoglobulina con la secuencia codificadora de un polipéptido no inmunoglobulina. De esta forma, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-DR5 del presente documento.

[0110] Típicamente, estos polipéptidos no inmunoglobulina sustituyen a los dominios constantes de un anticuerpo de la invención o sustituyen a los dominios variables de un sitio de combinación con el antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad por DR5 y otro sitio de combinación con el antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

[0111] Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro, usando procedimientos químicos de síntesis de proteínas conocidos, incluyendo aquellos que implican el uso de agentes de entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas usando una reacción de intercambio de disulfuro

o formando un enlace tioéster. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este fin se incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

[0112] Los fragmentos Fv de cadena sencilla también puede ser producidos como se describe en IIiades y col., FEBS Letters, 409:437-441 (1997). La conjugación de estos fragmentos de cadena sencilla usando diversos enlazadores se describe en Kortt y col., Protein Engineering, 10:423-433 (1997). En la técnica se conocen diversas técnicas para la producción recombinante y manipulación de anticuerpos. A continuación se describen con mayor detalle ejemplos ilustrativos de estas técnicas que típicamente utilizan los expertos.

(i) Anticuerpos humanizados

[0113] Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos introducidos en este procedentes de una fuente no humana. Estos restos de aminoácidos no humanos a menudo se denominan restos “importados", que típicamente se ha tomado de un dominio variable “importado”. La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el procedimiento de Winter y colaboradores [Jones y col, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)], sustituyendo los CDR o secuencias de los CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano.

[0114] Por consiguiente, estos anticuerpos “humanizados” son anticuerpos quiméricos en los que sustancialmente se ha sustituido menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos FR de los sitios análogos en los anticuerpos del roedor.

[0115] Es importante que los anticuerpos se humanicen reteniendo la alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, según un procedimiento preferido, se preparan anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos conceptuales humanizados usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas están disponibles a nivel general y son familiares para los expertos en la materia. Están disponibles programas de ordenador que ilustran y muestran probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias seleccionadas de inmunoglobulinas candidatas. La inspección de estas visualizaciones permite el análisis del probable papel de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta forma, pueden seleccionarse restos FR y combinarse a partir de la secuencia consenso e importada de modo que se consiga la característica del anticuerpo deseada, como por ejemplo, un aumento de la afinidad por los antígenos diana. En general, los restos de CDR están directa, y más considerablemente, implicados en influir sobre la unión al antígeno.

(ii) Anticuerpos humanos

[0116] Los anticuerpos monoclonales humanos pueden obtenerse mediante el procedimiento de hibridomas. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón y humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos, por ejemplo en Kozbor, J. Immunol., 133; 3001 (1984) y Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987).

[0117] Hoy en día es posible producir animales transgénicos (es decir, ratones) que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes para la línea germinal da lugar a una inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de los genes de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana a estos ratones mutantes en la línea germinal dará lugar a la producción de anticuerpos humanos tras la inmunización con el antígeno. Véanse, p. ej. Jakobovits y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits y col., Nature 362, 255-258 (1993).

[0118] Mendez y col. (Nature Genetics 15: 146-156 [1997]) han mejorado adicionalmente la tecnología y han generado una línea de ratones transgénicos designados “Xenomouse II” que, cuando se inmunizan con un antígeno, producen anticuerpos completamente humanos con alta afinidad. Esto se conseguía mediante la integración en la línea germinal de los loci megabase de la cadena pesada y la cadena ligera humanas en ratones con una deleción del segmento JH endógeno como se describió anteriormente. Los Xenomouse II son portadores

1.020 kb del locus de la cadena pesada humana que contienen aproximadamente 66 genes VH, las regiones DH y JH completas y tres regiones constantes diferentes.(μ, 5 y X) y también son portadores 800 kb del locus K humano que contiene 32 genes VK, segmentos JK y genes CK. Los anticuerpos producidos en estos ratones recuerdan de cerca a los encontrados en humanos a todos los respectos, incluso reordenamiento génico, ensamblaje y repertorio. Los anticuerpos humanos se expresan con preferencia sobre los anticuerpos endógenos debido a la deleción del segmento JH endógeno que previene el reordenamiento génico del locus murino.

[0119] Alternativamente, la tecnología de despliegue de fagos (McCafferty y col., Nature 348, 552-553 [1990]) puede usarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de los repertorios de genes del dominio variable (V) de las inmunoglobulinas de donantes no inmunizados. Según esta técnica, los genesdel dominio V del anticuerpo se clonan en marco dentro de un gen de una proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como M13 o fd y se expresan como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena sencilla del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan lugar a la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra dichas propiedades. Por tanto, el fago mimetiza algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fagos puede realizarse en diversos formatos, para su revisión véase, p. ej., Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Pueden usarse varias fuentes de segmentos de genes V para el despliegue de fagos. Clackson y col., Nature 352, 624-628 (1991) aislaron una matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V a partir de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos a partir de una matriz diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991) o Griffith y col., EMBO J. 12, 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de los anticuerpos acumulan mutaciones a una alta tasa (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una afinidad más alta y se replicarán y diferenciarán preferiblemente células B que muestren inmunoglobulinas de superficie de alta afinidad durante la exposición posterior al antígeno. Este proceso natural puede mimetizarse empleando la técnica conocida como "intercambio de cadenas" (Marks y col., Bio/Technol. 10, 779-783 [1992]). En este procedimiento, la afinidad de los anticuerpos humanos “primarios” obtenidos mediante despliegue de fagos puede mejorarse mediante la sustitución secuencial de los genes de la región V de las cadenas pesada y ligera con repertorios de variantes naturales (repertorios) de los genes del dominio V obtenidas a partir de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con afinidades en el intervalo de concentraciones mM. Waterhouse y col., Nucl. Acids Res. 21, 22652266 (1993) han descrito una estrategia para obtener repertorios de anticuerpos en fagos muy grandes (también conocida como "la madre de todas las bibliotecas”). También puede usarse el intercambio de cadenas para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares a los anticuerpos murinos iniciales. Según este procedimiento, que también se denomina “impronta de epítope”, los genes del dominio V de las cadenas pesada o ligera de anticuerpos de roedores obtenidos a partir de la técnica de despliegue de fagos se sustituyen por un repertorio de genes del dominio V humano, creando quimeras entre roedor y humano. La selección del antígeno da lugar al aislamiento de una variable humana capaz de reestablecer un sitio de unión al antígeno funcional, es decir, el epítope determina (marca) la elección de la pareja. Cuando se repite el proceso para sustituir el dominio V restante del roedor, se obtiene un anticuerpo humano (véase la solicitud de patente PCT WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores mediante sustitución de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos que no tienen restos estructurales o de los CDR originarios del roedor.

[0120] Como se describe en detalles a continuación, los anticuerpos de la invención pueden comprender opcionalmente anticuerpos monoméricos, anticuerpos diméricos así como formas multivalentes de anticuerpos. Los expertos en la materia pueden construir estos dímeros o formas multivalentes mediante técnicas conocidas en la técnica y usando los anticuerpos frente a DR5 de este documento. Los procedimientos para preparar anticuerpos monovalentes son también bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina. Generalmente, la cadena pesada está truncada en cualquier punto de la región Fc de modo que se previene el entrecruzamiento de la cadena pesada. Alternativamente, los restos relevantes de cisteína se sustituyen por cualquier otro resto de aminoácido o está delecionado para prevenir el entrecruzamiento.

(iii) Anticuerpos biespecíficos

[0121] Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es por el receptor DR5, el otro es por cualquier otro antígeno y, preferiblemente, por otro receptor o subunidad del receptor. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se unión específicamente a un receptor DR5 y a otro receptor de apoptosis o señalización están dentro del alcance de la presente invención.

[0122] En la técnica se conocen procedimientos para obtener anticuerpos biespecíficos. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen especificidades diferentes (Milstein y Cuello, Nature, 305, 537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas diferentes de anticuerpo, de los cuales solo uno tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, lo que normalmente se hace mediante pasos de cromatografía de afinidad, es más bien engorroso y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en la publicación de la solicitud PCT Nº WO 93/08829 (publicado el 13 de mayo de 1993) y en Traunecker y col., EMBO J., 10, 3655-3659 (1991).

[0123] Según una aproximación diferente y más preferida, se fusionan los dominios variables de un anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) con secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere que la primera región constante de la cadena pesada (CH1) contenga el sitio necesario para la unión a la cadena ligera presente en al menos una de las dos fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión independientes y se transfectan conjuntamente en un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una flexibilidad mayor a la hora de ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en realizaciones donde se usan proporciones distintas de las tres cadenas polipeptídicas en la construcción que proporciona los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos, o de las tres, cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da lugar a rendimientos mayores o cuando las proporciones no son de especial importancia. En una aproximación preferida de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina solo en una mitad de la molécula biespecífica proporciona una vía fácil de separación. Esta estrategia se describe en la publicación PCT Nº WO 94/04690, publicada el 3 de marzo de 1994.

[0124] Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).

(iv) Anticuerpos heteroconjugados

[0125] Los anticuerpos heteroconjugados también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir a las células del sistema inmune frente a células no deseados (patente de EE. UU. Nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por VIH (publicación de las solicitudes PCT Nº WO 91/00360 y WO 92/200373; documento EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden obtenerse usando cualquier procedimiento de entrecruzamiento conveniente. Los agentes de entrecruzamiento adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de EE. UU. Nº 4.676.980, junto con diversas técnicas de entrecruzamiento.

(v) Fragmentos de anticuerpo

[0126] En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-DR5 (incluyendo anticuerpos murinos, humanos y humanizados, y variantes de anticuerpo) es un fragmento de anticuerpo. Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se obtenían mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véanse, p. ej., Morimoto y col., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse en la actualidad directamente mediante células huésped recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos Fab’-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y conjugarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab’)2 se forma usando el motivo cremallera de leucina en GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula de F(ab')2. Según otra aproximación, los fragmentos Fv, Fab o F(ab’)2 pueden aislarse directamente de los cultivos de células huésped recombinantes. Serán aparente para el experto diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, la digestión puede realizarse usando papaína. Ejemplos de digestión con papaína se describen en el documento WO 94/29348 publicado el 22/12/94 y en la patente de EE. UU. Nº 4.342.566. La digestión con papaína de los anticuerpos típicamente produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos denominados fragmentos Fab, cada uno con un único sitio de unión al antígeno y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab’)2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y sigue siendo capaz de provocar el entrecruzamiento del antígeno.

[0127] Los fragmentos Fab producidos por la digestión del anticuerpo también contienen los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab en la adición de algunos restos en el extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de la cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la designación en este documento para el Fab’ en el que los restos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab’)2 se obtuvieron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros productos químicos para unir los fragmentos de anticuerpo.

(vi) Variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos

[0128] Las variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos anti-DR5 se preparan introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo anti-DR5 o mediante síntesis peptídica. Entre estas variantes se incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos anti-DR5 de los ejemplos de este documento. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo anti-DR5 humanizado o variante, como el cambio en el número o posición de los sitios de glucosilación.

[0129] Un procedimiento útil para la identificación de determinados restos o regiones del anticuerpo anti-DR5 que son localizaciones preferidas para mutagénesis es el denominado “mutaciones mediante alaninas” como se describe en Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989). En este documento, se identifica un resto o un grupo de restos diana (p. ej., restos cargados como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se sustituyen por aminoácidos neutros o cargados negativamente (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el antígeno DR5. Aquellas localizaciones de aminoácidos que muestran sensibilidad funcional a las sustituciones pueden refinarse, a continuación, introduciendo más u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. Por tanto, mientras que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario predeterminar la naturaleza de la mutación per se. Por ejemplo, para analizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza una mutagénesis mediante alaninas o aleatoria en el codón o región diana y se seleccionan las variantes del anticuerpo anti-DR5 expresadas en función de la actividad deseada.

[0130] Las inserciones de una secuencia de aminoácidos incluyen fusiones en el extremo amino y/o carboxilo terminal cuya longitud oscila de un resto a polipéptidos que contienen un centenar de restos o más, así como inserciones intrasecuencia de un único resto de aminoácido o de múltiples restos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo anti-DR5 con un resto metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un epítope

10 etiqueta. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo anti-DR5 incluyen la fusión a los extremos N o C terminales del anticuerpo anti-DR5 de una enzima, un polipéptido o un poliol que aumenta la semivida en suero del anticuerpo.

[0131] Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen al

15 menos un resto de aminoácido en la molécula de anticuerpo anti-DR5 que se ha eliminado y un resto diferente insertado en esta posición. Entre estos sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución se incluyen las regiones hipervariables, aunque también se contemplan las alteraciones de FR. Las sustituciones conservadores se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de “sustituciones preferidas”. Si estas sustituciones dan lugar a cambios en la actividad biológica, entonces pueden introducirse más cambios sustanciales, denominados “ejemplos de

20 sustituciones” en la tabla 1, o según se describe adicionalmente a continuación en referencia a las clases de aminoácidos, y se analizan los productos.

Tabla 1

Resto original

Ejemplos de sustituciones Sustituciones preferidas

Ala (A)

Val; Leu; Ile Val

Arg (R)

Lys; Gln; Asn Lys

Asn (N)

Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln

Asp (D)

Glu; Asn Glu

Cys (C)

Ser; Ala Ser

Gln (Q)

Asn; Glu Asn

Glu (E)

Asp; Gln Asp

Gly (G)

Ala Ala

His (H)

Asn; Gln; Lys; Arg Arg

Ile (I)

Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu

Leu (L)

Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile

Lys (K)

Arg; Gln; Asn Arg

Met (M)

Leu; Phe; Ile Leu

Phe (F)

Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr

Pro (P)

Ala Ala

Ser (S)

Thr Thr

Thr (T)

Ser Ser

Trp (W)

Tyr; Phe Tyr

Tyr (Y)

Trp; Phe; Thr; Ser Phe

Val (V)

Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

25 [0132] Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, con una conformación en lámina o en hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos que

30 aparecen de forma natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1)

hidrófoba: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2)

hidrófila neutra: Cys, Ser, Thr;

(3) ácida: Asp, Glu; 35 (4) básica: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5)

restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro y

(6)

aromáticas: Trp, Tyr, Phe.

[0133] Las sustituciones no conservadoras conllevarán el intercambio de un miembro de una de estas 40 clases por otro de otra clase.

[0134] También puede sustituirse cualquier resto de cisteína que no esté implicado en el mantenimiento de la conformación adecuada del anticuerpo anti-DR5 humanizado o variante generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir los entrecruzamientos aberrantes. Por el contrario, pueden añadirse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (especialmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo, como un fragmento Fv).

[0135] Un tipo especialmente preferido de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más restos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (p. ej., un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, las variantes resultantes seleccionadas para su desarrollo adicional presentarán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo parental a partir del cual se generó. Una forma conveniente de generar estas variantes de sustitución es la maduración de afinidad usando despliegue de fagos. Brevemente, se mutan varios sitios de la región hipervariable (p. ej., 6-7 sitios) para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpo generadas de esta forma se muestran de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. A continuación las variantes de despliegue de fagos se seleccionan en función de su actividad biológica (p. ej., afinidad de unión) como se describe en este documento. Para identificar los sitios de la región hipervariable candidatos para su modificación, puede realizarse una mutagénesis mediante alaninas para identificar los restos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o además, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el DR5 humano. Estos restos de contacto y restos vecinos son candidatos para la sustitución según las técnicas elaboradas en este documento. Una vez que se generan las variantes, el panel de variantes se somete a selección como se describe en este documento y pueden seleccionarse anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos importantes para su desarrollo posterior.

(vii) Variantes de glucosilación de anticuerpos

[0136] Los anticuerpos se glucosilan en posiciones conservadas de sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128 [1997]; Wright y Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]). Las cadenas laterales de oligosacáridos de las inmunoglobulinas afectan a la función de la proteína (Boyd y col., Mol. Immunol. 32:1311-1318[1996]; Wittwe y Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]) y a la interacción intramolecular entre porciones de la glucoproteína, lo que puede afectar a la conformación y a la superficie tridimensional presentada de la glucoproteína (Hefferis y Lund, supra; Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech 7:409-416 [1996]). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir a una glucoproteína determinada hacia determinadas moléculas en base a estructuras de reconocimiento específico. Por ejemplo, se ha publicado que en la IgG no galactosidada, el resto de oligosacáridos sale fuera del espacio inter-CH2 y los restos de N-acetilglucosamina terminales se hacen disponibles para la unión de la proteína que se une a manosa (Malhotra y col., Nature Med. 1:237-243 [1995]). La eliminación mediante glucopeptidasas de los oligosacáridos del anticuerpo monoclonal IgG1 CAMPATH-1H (un anticuerpo monoclonal IgG1 recombinante murino humanizado que reconoce el antígeno CDw52 de linfocitos humanos) producido en células de ovario de hámster chino (CHO) tiene como resultado una reducción completa en la lisis mediada por complemento (CMCL, por sus siglas en inglés) (Boyd y col., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]), mientras que la eliminación selectiva de restos de ácido siálico usando neuraminidasa no produce la pérdida de DMCL. También se ha informado de que la glucosilación de los anticuerpos afecta a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). En particular, se ha publicado que las células CHO con expresión regulada por tetraciclina de �(1,4)-N-acetilglucosaminoltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de GlcNAc bisecada, presentaban una actividad ADCC mejoraba (Umana y col., Nature Biotech. 17:176-180 [1999]).

[0137] Las variantes de glucosilación de anticuerpos son variantes en las que está alterado el patrón de glucosilación de un anticuerpo. Por alterar se entiende la deleción de uno o más restos de hidratos de carbono que se encuentran en el anticuerpo, la adición de uno o más restos de hidratos de carbono al anticuerpo, el cambio en la composición de glucosilación (patrón de glucosilación), el grado de glucosilación, etc. Las variantes de glucosilación pueden prepararse, por ejemplo, eliminando, cambiando y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación en la secuencia del ácido nucleico que codifica el anticuerpo.

[0138] La glucosilación de anticuerpos típicamente es N-glucosilación u O-glucosilación. N-glucosilación se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de un resto de asparragina. Las secuencias tripéptido de asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del restos de hidratos de carbono a la cadena lateral de la asparragina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido genera un posible sitio de glucosilación. O-glucosilación se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más frecuentemente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

[0139] La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se consigue convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para sitios de N.-glucosilación). La alteración también puede hacerse mediante la adición o sustitución de uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de Oglucosilación).

[0140] Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-DR5 se preparan por diversos procedimientos conocidos en la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen, pero sin limitaciones, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se encuentran en la naturaleza) o preparación mediante mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida a sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis por casete de una variante preparada previamente o una versión no variante del anticuerpo anti-DR5.

[0141] La glucosilación (incluyendo el patrón de glucosilación) de anticuerpos también puede estar alterada sin que se altere la secuencia de nucleótidos subyacente. La glucosilación depende en gran medida de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo de célula utilizada para la expresión de glucoproteínas recombinantes, por ejemplo, anticuerpos, como posible agente terapéutico raramente es la célula nativa, es previsible obtener variaciones en el patrón de glucosilación de los anticuerpos (véase, por ejemplo. Hse y col., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070 [1997]). Además de la elección de las células huésped, los factores que afectan a la glucosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación de los medios, la densidad del cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuestos diversos procedimientos para alterar el patrón de glucosilación que se realiza en un organismo hospedador en particular que incluyen la introducción o sobreexpresión de determinadas enzimas implicadas en la producción de oligosacáridos (Patentes de EE. UU. Nº 5.047.335; 5.510.261 y 5.278.299). La glucosilación, o determinados tipos de glucosilación, pueden eliminarse enzimáticamente a partir de la glucoproteína usando, por ejemplo, la endoglucosidasa H (Endo H). Además, la célula huésped recombinante puede manipularse genéticamente para que, por ejemplo, sea defectuosa en el procesamiento de determinados tipos de polisacáridos. Estas y otras técnicas son bien conocidas en la materia.

[0142] La estructura de glucosilación de los anticuerpos puede analizarse fácilmente por técnicas convencionales de análisis de hidratos de carbono, como la cromatografía en lectina, RMN, espectrometría de masas, HPLC, CPG, análisis de composición de monosacáridos, digestión enzimática secuencial y HPAEC-PAD, en el que se utiliza una cromatografía de intercambio aniónico a pH alto para separar oligosacáridos en función de su carga. También son conocidos los procedimientos para la liberación de oligosacáridos para fines analíticos e incluyen, sin limitaciones, tratamiento enzimático (normalmente realizado usando péptido-N-glucosidasa F/endo-galactosidasa), eliminación usando entorno bastante alcalino para liberar principalmente estructuras de Oglucosilación y procedimientos químicos usando hidracina anhidra para liberar tanto oligosacáridos N como O.

(viii) Ejemplos de anticuerpos

[0143] La invención descrita en este documento tiene varios ejemplos de realizaciones. A continuación se describen diversas realizaciones típicas de la invención. Las realizaciones siguientes se ofrecen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar de ninguna forma el alcance de la presente invención.

[0144] Como se describe en los ejemplos que se recogen a continuación, se han identificado varios anticuerpos monoclonales anti-DR5. En una realización, los anticuerpos frente a DR5 de la invención tendrán las mismas características biológicas que cualquiera de los anticuerpos anti-DR5 descritos específicamente en este documento.

[0145] El término “características biológicas” se usa para referirse a las actividades o propiedades in vitro o/y in vivo o propiedades del anticuerpo monoclonal, como la capacidad para unirse específicamente a DR5 o bloquear, inducir o potenciar la activación de DR5 (o de actividades relacionados con DR5). Las propiedades y actividades de los anticuerpos frente a DR5 se describen adicionalmente en los ejemplos a continuación.

[0146] Opcionalmente, los anticuerpos monoclonales de la presente invención tendrán las mismas características biológicas que el anticuerpo 16E2 o cualquiera de los anticuerpos enumerados en las tablas 11-13 y/o se unirán a los mismos epítopes que el anticuerpo 16E2, o cualquiera de los anticuerpos enumerados en las tablas 11-13, en particular, Apomab 7.3 o Apomab 8.3. Esto puede determinarse realizando diversos ensayos, como se describe aquí y en los ejemplos. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad que los anticuerpos frente a DR5 específicamente referidos en este documento, puede compararse su actividad en ensayos de unión competitivos o en ensayos de inducción de apoptosis, como las descritas en los ejemplos a continuación. Además, puede determinarse un epítope al cual se une un anticuerpo anti-DR5 en particular mediante estudio cristalográfico del complejo entre DR5 y el anticuerpo en cuestión.

[0147] Por tanto, un estudio cristalográfico por rayos X del complejo entre el fragmento Fab de Apomab

7.3 y el dominio extracelular de DR5 mostró que Apomab 7.3 se une a un epítope de DR5 que solapa, sin diferir todavía, del sitio de unión de Apo2L/TRIAL en el receptor DR5.

[0148] Los anticuerpos anti-DR5 humanos, quiméricos, híbridos o recombinantes (así como, por ejemplo, dianticuerpos o trianticuerpos descritos en este documento) pueden comprender un anticuerpo que tiene cadenas pesada y ligera de longitud completa o fragmentos de las mismas, como fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 o Fv; un monómero o dímero de esta cadena ligera o cadena pesada, un Fv de cadena sencilla en el que estas cadenas pesadas o ligeras están unidas mediante una molécula de enlace, o que tienen dominios variables (o dominios hipervariables) de estas cadenas pesadas o ligeras combinadas aún con otros tipos de dominios de anticuerpos.

[0149] Los anticuerpos frente a DR5, como se describe en este documento, poseerán opcionalmente una

o más de las actividades o propiedades biológicas deseadas. Estos anticuerpos frente a DR5 pueden incluir, pero sin limitaciones, anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos y de afinidad madurada. Como se describe anteriormente, los anticuerpos frente a DR5 pueden construirse u obtenerse por ingeniería genética usando técnicas diversas para conseguir estas actividades o propiedades deseadas. En una realización, el anticuerpo frente a DR5 tendrán una afinidad de unión al receptor DR5 de al menos 105 M-1, preferiblemente al menos en el intervalo de 106 M-1 a 107 M-1, más preferiblemente, al menos en el intervalo de 108 M-1 a 1012 M-1 e incluso más preferiblemente, al menos en el intervalo de 109 M-1 a 1012 M-1. La afinidad de unión del anticuerpo frente a DR5 puede determinarse sin necesidad de experimentación comprobando los anticuerpos frente a DR5 según técnicas conocidas en la materia, como el análisis de Scatchard (véase Munson y col., supra).

[0150] En otra realización, el anticuerpo frente a DR5 de la invención puede unirse al mismo epítope en DR5 al que se une Apo-2L, o unirse a un epítope en DR5 que coincide o solapa con el epítope de DR5 al que se une Apo-2L como, por ejemplo, el anticuerpo denominado Apomab 7.3. El anticuerpo frente a DR5 también puede interaccionar de esta forma para crear una conformación estérica, que previene la unión del ligando Apo-2 a DR5. Como se anotó anteriormente, la propiedad de unión al epítope de un anticuerpo frente a DR5 de la presente invención puede determinarse usando técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, el anticuerpo frente a DR5 puede probarse en un ensayo in vitro, como en un ensayo de inhibición competitiva, para determinar la capacidad del anticuerpo frente a DR5 para bloquear o inhibir la unión de Apo-2L a DR5. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR5 puede probarse en un ensayo de inhibición competitiva para determinar la capacidad del anticuerpo frente a DR5 para inhibir la unión de un polipéptido Apo-2L a una construcción DR5-IgG o a una célula que expresa DR5. Opcionalmente, el anticuerpo frente a DR5 será capaz de bloquear o inhibir la unión de Apo-2L a DR5 en al menos el 50%, preferiblemente en al menos el 75% e, incluso más preferiblemente, en al menos el 90%, lo que puede determinarse, a modo de ejemplo, en un ensayo de inhibición competitiva in vitro usando una forma soluble del ligando Apo-2 (TRAIL) (como la secuencia del dominio extracelular 114-281 descrita en Pitti y col., J. Biol. Chem., supra, también denominada Apo2L.0) y una DEC de DR5-IgG. La propiedad de unión al epítope de un anticuerpo frente a DR5 también puede determinarse usando ensayos in vitro para comprobar la capacidad del anticuerpo frente a DR5 para bloquear la apoptosis inducida por Apo-2L o mediante estudios de cristalografía.

[0151] En una realización adicional, el anticuerpo frente a DR5 comprenderá un anticuerpo agonista con una actividad comparable al ligando Apo-2 (TRAIL). Preferiblemente, este anticuerpo agonista de DR5 inducirá apoptosis en al menos un tipo de cáncer, línea celular tumoral o tumor primario. La actividad apoptótica de un anticuerpo agonista de DR5 puede determinarse usando ensayos in vitro o in vivo conocidos. Ejemplos de diversos ensayos in vitro e in vivo de este tipo son bien conocidos en la materia. La actividad apoptótica in vitro puede determinarse usando técnicas conocidas como la unión a Anexina V. In vivo, la actividad apoptótica puede determinarse, p. ej., midiendo la reducción de la carga o el volumen tumoral.

[0152] Como se anotó anteriormente los anticuerpos descritos en este documento tienen varias propiedades, entre ellas la capacidad para modular determinadas interacciones y/o procesos fisiológicos. Como se muestra en los ejemplos siguientes, los anticuerpos descritos en este documento son capaces de inducir apoptosis mediada por DR5 y muestran propiedades antineoplásicas potentes en diversos modelos murinos de cáncer de xenoinjerto. En una realización específica de la invención, la actividad agonista del anticuerpo se potencia mediante entrecruzamiento de los anticuerpos con el Fc de la IgG anti-humana. En una realización preferida de la invención, este aumento de la apoptosis es comparable a la actividad apoptótica de Apo-2L.

[0153] Realizaciones adicionales de la invención incluyen un anticuerpo anti-receptor DR5 descrito en este documento que está unido a uno o más polímeros no proteicos seleccionados entre el grupo compuesto por polietilénglicol, polipropilénglicol y polioxialquileno. En una realización alternativa, un anticuerpo anti-receptor DR5 descrito en este documento se une a un agente citotóxico o enzima. Aún en otra realización, un anticuerpo antireceptor DR5 descrito en este documento se une a un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente o un compuesto quimioluminiscente. Opcionalmente, un anticuerpo anti-receptor DR5 descrito en este documento está glucosilado o, alternativamente, no glucosilado.

[0154] Como se describe en detalle a continuación, los anticuerpos de la invención pueden usarse en diversos procedimientos de modulación de procesos fisiológicos. Una de estas realizaciones de la invención incluye un procedimiento para inducir apoptosis en células de mamífero que comprende la exposición de las células de mamífero que expresan el receptor DR5 a una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal frente al receptor DR5 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR5 mostrado en las figuras 3A-3C (411 aminoácidos) o en las figuras 4A-4C (440 aminoácidos), especialmente el dominio extracelular del mismo. En estos procedimientos, las células de mamífero son, típicamente, células cancerosas. En realizaciones preferidas, el anticuerpo anti-receptor DR5 usado en estos procedimientos es un anticuerpo Apomab descrito en los siguientes ejemplos, como un anticuerpo Apomab 7.3 o Apomab 8.3.

[0155] Aún otra realización de la invención es un procedimiento de inducción de apoptosis en células de mamífero que comprende la exposición de las células de mamífero que expresan el receptor DR5 a una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo monoclonal anti-receptor DR5 aislado, que comprende un anticuerpo que se une al receptor DR5 según se define anteriormente en este documento, o un dominio extracelular del mismo.

3.

Trianticuerpos

[0156] Los trianticuerpos también se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Estos anticuerpos se describen, por ejemplo, en Iliades y col., supra y Kortt y col., supra.

4.

Otras modificaciones

[0157] En este documento se contemplan otras modificaciones de los anticuerpos DR5. Los anticuerpos de la presente invención pueden modificarse conjugando el anticuerpo con un agente citotóxico (como una molécula de toxina) o una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco (p. ej., un agente quimioterapéutico peptidilo, véase el documento WO81/01145) en un fármaco antineoplásico activo. Véanse, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente de EE. UU. Nº 4.975.278. Esta tecnología también se denomina “Terapia con profármaco mediado por enzima dependiente de anticuerpo” (ADEPT, por sus siglas en inglés).

[0158] El componente enzimático de los inmunoconjugados útiles para la terapia ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de modo que éste se convierta en su forma citotóxica más activa. Entre las enzimas útiles en el procedimiento de esta invención se incluyen, pero sin limitaciones, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa, útil para convertir profármacos que contiene sulfato en fármacos libres, citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco antineoplásico 5-fluorouracilo; proteasas como la proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como las catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres, caspasas como la caspasa-3; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de aminoácidos D, enzimas que escinden hidratos de carbono, como la beta-galactosidasa y la neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glucosilados en fármacos libres; betalactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con beta-lactamas en fármacos libres y penicilina amidasas, como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la materia como "abzimas", para convertir los profármacos de la invención en fármacos libres activos (véase, p. ej., Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-enzima pueden prepararse como se describe en este documento para administrar la abzima a una población de células tumorales.

[0159] Las enzimas pueden unirse covalentemente a los anticuerpos mediante técnicas bien conocidas en la materia, como el uso de reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales. Alternativamente, las proteínas de fusión que contienen al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención unida a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden construirse usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la materia (véase, p. ej., Neuberger y col. Nature 312: 604-608 (1984).

[0160] Se contemplan modificaciones adicionales del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a uno de los diversos polímeros no proteicos, p. ej., polietilénglicol, polipropilénglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilénglicol y polipropilénglicol. El anticuerpo también puede estar incluido en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacilato), respectivamente) en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980). Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítope de unión al receptor de rescate dentro del anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente de EE. UU. Nº 5.739.277, por ejemplo. Según se usa en este documento, el término "epítope de unión al receptor de rescate" se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula de IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del aumento in vivo de la semivida en suero de la molécula de IgG.

[0161] Los anticuerpos anti-DR5 descritos en este documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, como se describe en Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980) y las patentes de EE. UU. Nº 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con aumento en el tiempo de circulación se describen en la patente de EE. UU. Nº 5.013.556. Pueden generarse liposomas especialmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a liposomas como se describe en Martin y col., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de puentes disulfuro. Opcionalmente, el liposoma contiene un agente quimioterapéutico (como doxorrubicina). Véase Gabizon y col., J.

National Cancer Inst. 81(19):1484 (1989).

[0162] Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos frente a DR5 “entrecruzados”. El término "entrecruzado” según se usa en este documento se refiere a la unión de al menos dos moléculas de IgG para formar una (o única) molécula. Los anticuerpos frente a DR5 pueden entrecruzarse usando diversas moléculas enlazadoras, preferiblemente los anticuerpos frente a DR5 se entrecruzan usando una molécula anti-IgG, complemento, modificación química o ingeniería molecular. Los expertos en la materia aprecian que el complemento tiene una afinidad relativamente alta por las moléculas de anticuerpo una vez que los anticuerpos se unen a la membrana de la superficie celular. Por consiguiente, se considera que puede usarse el complemento como una molécula entrecruzada para unir dos o más anticuerpos anti-DR5 unidos a la membrana de la superficie celular.

5. Procedimientos recombinantes

[0163] La invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que codifican anticuerpos frente a DR5 según se describe en este documento, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

[0164] Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica se aísla e inserta en un vector replicable para su clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. El ADN que codifica el anticuerpo se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas oligonucleotídicas que son capaz de unirse específicamente a los genes que codifican el anticuerpo). Hay disponibles muchos vectores. Entre los componentes del vector generalmente se incluyen, pero sin limitaciones, uno

o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

[0165] Entre los procedimientos de este documento se incluyen procedimientos para la producción de anticuerpos anti-DR5 quiméricos o recombinantes que comprenden los pasos de proporcionar un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera o una cadena pesada del anticuerpo anti-DR5 (o ambas cadenas ligera y pesada), transfectar o transformar una célula huésped con el vector y cultivar las células huésped en condiciones suficientes para producir el producto del anticuerpo anti-DR5 recombinante.

(i) Componente de la secuencia de señalización

[0166] El anticuerpo anti-DR5 de esta invención puede producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo que es preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es aquella que es reconocida y procesada (p. ej., escindida por una señal peptidasa) por la célula huésped. Para células huésped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia señal nativa del anticuerpo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o secuencias líderes de la enterotoxina II termoestable. Para la secreción en levaduras, la secuencia señal nativa puede ser sustituida, p. ej., por la secuencia líder de la invertasa de levadura, la secuencia líder del factor a (incluyendo los líderes del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces) o la secuencia líder de la ácido fosfatasa, la secuencia líder de la glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión células de mamífero, están disponibles las secuencias señal de mamíferos, así como los líderes secretores víricos, por ejemplo, la señal gD del herpes simple.

[0167] El ADN para esta región precursora se liga en marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo.

(ii) Origen del componente de replicación

[0168] Tanto los vectores de expresión como los de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es la que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación y secuencias que se replican de forma autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el origen del plásmido 2μ es adecuado para levaduras y son útiles diversos orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) para los vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen de SV40 puede usarse típicamente solo porque contiene el promotor temprano).

(iii) Componente del gen de selección

[0169] Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también de nominado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a anticuerpos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles a partir de medios complejos, p. ej. el gen que codifica la D-alanina racemasa de Bacilli.

[0170] En un ejemplo de esquema de selección se utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, por tanto, sobreviven al régimen de selección. En los ejemplos de esta selección dominantes se usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0171] Otros ejemplos de marcados seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para alcanzar el ácido nucleico del anticuerpo, como DHFR, timidina cinasa, metalotioneina-I y II, preferiblemente genes de la metalotioneina de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa de primate, etc.

[0172] Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican en primer lugar cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en la actividad DHFR.

[0173] Alternativamente, las células huésped (especialmente huéspedes de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-DR5, la proteína DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable como la aminoglucósido 3’-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante el crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglucósico, p. ej., kanamicina, neomicina o G418. Véase la patente de EE. UU. Nº, 4.965.199.

[0174] Un gen de selección adecuado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb y col. Nature, 282:39 (1979)). El gen trip1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en presencia de triptófano, por ejemplo, ATCC Nº 44076 o PEP4-1, Jones, 1977, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trip1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona, entonces, un ambiente eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano o uracilo. De forma similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC

20.622 o 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos portadores del gen Leu2.

[0175] Además, pueden usarse vectores derivados del plásmido circular pkD1 de 1,6 μm para la transformación de levaduras del género Kluyveromyces. Alternativamente, se publicó un sistema de expresión para producción a gran escala de quimosina bovina recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han descrito vectores de expresión multicopia estables para la selección de albúmina sérica humana recombinante madura mediante cepas industriales de Kluyveromyces. Fleer y col., Bio/Technology, 9:968975 (1991).

(iv) Componente del promotor

[0176] Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido de forma operativa al ácido nucleico del anticuerpo. Entre los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas se incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactamasa a lactosa, fosfata alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos como el promotor tac. Sin embargo, también están disponibles otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida de forma operativa al ADN que codifica el anticuerpo anti-DR5.

[0177] Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Prácticamente todos los genes de eucariotas tiene una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases secuencia arriba del sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases secuencia arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT, en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3’ de la mayoría de los genes de eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de una cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada dentro de los vectores de expresión eucariotas.

[0178] Entre los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso en hospedadores levaduras se incluyen los promotores de la 3-fosfogliceratoquiinasa u otras enzimas glucolíticas, como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

[0179] Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles y tienen la ventaja adicional de una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol 2 deshidrogenasa, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657. Los potenciadores de levaduras también se usan de forma ventajosa con promotores de levaduras.

[0180] La transcripción del anticuerpo anti-DR5 a partir de vectores en células huésped de mamíferos se controla, por ejemplo, mediante promotores obtenidos a partir de los genomas de virus como el virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (como el adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, más preferiblemente, el virus de simio 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, p. ej., el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.

[0181] Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contienen el origen de replicación vírico de SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción de HindDIII E. En la patente de EE. UU. Nº 4.419.446 se describe un sistema de expresión de ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector. En la patente de EE. UU. Nº 4.601.978 se describe una modificación de este sistema. Véase también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del ADNc del interferón � humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Alternativamente, puede usarse la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como componente del elemento promotor (v) potenciador.

[0182] La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-DR5 de esta invención por eucariotas superiores se aumenta a menudo insertando una secuencia potenciadora dentro del vector. En la actualidad se conocen muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de célula eucariótica. Son ejemplos el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma del lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para la activación de promotores eucarióticos. El potenciador puede ayustarse dentro del vector en una posición 5’ o 3’ con respecto a la secuencia que codifica el anticuerpo, pero es preferible que se localice en un sitio 5’ con respecto al promotor.

(vi) Componente de terminación de la transcripción

[0183] Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levaduras, hongos, vegetales, animales, humano o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias están normalmente disponibles a partir de la regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc eucarióticos o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el anticuerpo multivalente. Un componente de terminación de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión descrito en ese documento.

(vii) Selección y transformación de células huésped

[0184] Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de este documento son las células procariotas, de levadura o eucariotas superiores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados para este objetivo son eubacterias, como organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, p. ej., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klesbiella, Proteus, Salmonella, p. ej., Salmonella typhimurium, Serratia, p. ej., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (p. ej., el B. licheniformis 41P descrito en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces. Un huésped preferido de clonación en E. coli es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque se dispone de otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos antes que limitantes.

[0185] Además de los procariotas, los microbios eucariotas como hongos filamentosos o levaduras, son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos frente a DR5. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de panadería común, es la utilizada con mayor frecuencia entre los microorganismos eucariotas inferiores. Sin embargo, están normalmente disponibles y son útiles en este documento diversos otros géneros, especies y cepas como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces, como

p. ej., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis y hongos filamentosos como, p. ej., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y huéspedes del género Aspergillus como A. nidulans y A. niger.

[0186] Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpos glucosilados derivan de organismos multicelulares. Entre los ejemplos de células invertebradas se incluyen células vegetales y de insectos. Se han identificado numerosas cepas y variantes de baculovirus y las correspondientes células huésped de insecto permisivas como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Están disponibles al público diversas cepas víricas para la transfección, p. ej. la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y estos virus pueden usarse como el virus de este documento según la presente invención, especialmente para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda.

[0187] Los cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden ser utilizados como huéspedes.

[0188] Sin embargo, ha aumentado el interés por las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Son ejemplos de líneas celulares huésped de mamíferos útiles la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), línea de riñón embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en suspensión celular, Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2) y células de mieloma o linfoma

(p. ej., Y0, J558L, células P3 y NS0) (véase la patente de EE. UU. Nº 5.807.715).

[0189] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpos y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

(viii) Cultivo de las células huésped

[0190] Las células huésped usadas para producir el anticuerpo de este invención pueden cultivarse en diversos medios. Los medios disponibles en el mercado como el medio F10 de Ham (Sigma), medio esencial mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) están disponibles para el cultivo de las células huésped. Además, puede usarse cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes y col., Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes de EE. UU. Nº 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 o 5.122.469, documentos WO 90/03430, WO 87/00195 o la patente de EE. UU. Re:. 30.985, como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse a necesidad con hormonas y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleótidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como el fármaco GENTAMYCINTM), oligoelementos (definidos como compuestos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a las concentraciones apropiadas que podrían ser conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión y serán aparentes para el experto en la materia.

(ix) Purificación

[0191] Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos particulados, de las células huésped o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se congela en presencia de acetato sódico (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los restos celulares pueden eliminarse por centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de estos sistemas de expresión generalmente se concentran en primer lugar usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasas como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes espontáneos.

[0192] La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la técnica de purificación preferida la cromatografía de afinidad. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier región Fc de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede usarse para purificar anticuerpos que se basen en las cadenas pesada y1, y2 o y4 humanas (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Se recomienda la proteína G para todos los isótopos murinos y para la y3 humana (Guss y col., EMBO J. 5:15671575 (1986)) La matriz a la que se une el ligando de afinidad es con mayor frecuencia la agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y acortan los tiempos de procesamiento que pueden conseguirse con la agarosa. Cuando en anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABXTM (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteínas como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC en fase inversa, cromatografía sobre sílica gel, cromatografía en heparina SEPHAROSETM, cromatografía en resina de intercambio aniónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico), cromatografía de enfoque isoeléctrico, SDS-PAGE y precipitación con sulfato amónico también están disponibles dependiendo del anticuerpo que se quiere recuperar.

B. Usos para los anticuerpos frente a DR5

[0193] Los anticuerpos frente a DR5 de la presente invención tienen diversas utilidades.

[0194] Es sabido que DR5 media en la señalización de la apoptosis. Aunque varios tipos de células normales expresan DR5, la señalización de la apoptosis a través de este receptor parece estar restringida principalmente a células tumorales, que son más susceptibles a la apoptosis mediada por receptores de muerte en el contexto de su transformación por oncogenes como MYC o RAS (Wang y col., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov y col., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). DR5 se expresa con frecuencia en líneas celulares de cáncer humano así como en tumores primarios. Por tanto, los anticuerpos anti-DR5 encuentran utilidad en el diagnóstico y tratamiento del cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos agonistas de DR5 pueden usarse en procedimientos para el tratamiento del cáncer en mamíferos, incluso en humanos. En estos procedimientos, el anticuerpo frente a DR5, preferiblemente un anticuerpo agonista, se administra a un mamífero, solo o en combinación aún con otros agentes

o técnicas terapéuticas. El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer que expresa DR5, como tumores sólidos, en particular tumores sólidos avanzados o metastáticos que han progresado tras tratamiento previo o para los que no existe terapia conocida eficaz. Entre los tipos especiales de cáncer se incluyen, sin limitación, cáncer colorrectal, cáncer pulmonar microcítico (CPNM), cáncer pancreático, cáncer de ovario, cáncer de mama, linfoma no Hodgkin (LNH), glioblastoma o melanoma, preferiblemente cáncer colorrectal, CPNM o LNH.

[0195] Además, los anticuerpos frente a DR5 son útiles en el diagnóstico y tratamiento de otras afecciones patológicas asociadas con DR5, como enfermedades relacionadas con el sistema inmune en mamíferos, incluyendo los humanos.

[0196] El diagnóstico en mamíferos de las diversas afecciones patológicas descritas en este documento puede ser realizado por el médico especialista. En la materia existen técnicas diagnósticas que permiten, p. ej., el diagnóstico o detección del cáncer o de la enfermedad relacionada con el sistema inmune en un mamífero. Por ejemplo, los cánceres pueden identificarse a través de técnicas que incluyen, pero sin limitaciones, técnicas de palpación, análisis de sangre, rayos X, RMN y similares.

[0197] Las enfermedades relacionadas con el sistema inmune también pueden identificarse fácilmente.

[0198] En el lupus eritematoso sistémico, el mediador central de la enfermedad es la producción de anticuerpos autorreactivos con proteínas o tejidos propios y la posterior generación de inflamación mediada por el sistema inmune. Múltiples órganos y sistemas están clínicamente afectados, incluyendo el riñón, pulmón, sistema musculoesquelético, mucocutáneo, ojos, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, tubo digestivo, médula ósea y sangre.

[0199] La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica crónica que afecta principalmente a la membrana sinovial de múltiples articulaciones con la lesión resultante del cartílago articular. La patogénesis es dependiente de linfocitos T y se asocia con la producción de factores reumatoides, autoanticuerpos dirigidos frente a la IgG propia, con la formación resultante de complejos inmunes que alcanzan niveles altos en el líquido sinovial y en sangre. Estos complejos en la articulación pueden inducir una notable infiltración de linfocitos y monocitos dentro de la membrana sinovial y, posteriormente, notables cambios sinoviales; el espacio/líquido de la articulación si está infiltrado por células similares con la adición de numerosos neutrófilos. Los tejidos afectados son principalmente las articulaciones, con frecuencia con un patrón simétrico. Sin embargo, la enfermedad extraarticular también se manifiesta de dos formas principales. Una forma es el desarrollo de lesiones extraarticulares con enfermedad articular progresiva en curso y lesiones típicas de fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas. La segunda forma de enfermedad extraarticular es el denominado síndrome de Felty que aparece de forma tardía en el transcurso de la enfermedad AR, a veces después de que la enfermedad articular se estabilice y conlleva la presencia de neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Esto puede ir acompañado de vasculitis en múltiples órganos con formaciones de infartos, úlceras cutáneas y gangrena. A menudo los pacientes también desarrollan nódulos reumatoides en el tejido subcutáneo que recubre las articulaciones afectadas, el estadio tardío de los nódulos presenta centros necróticos rodeados de un infiltrado celular inflamatorio mixto. Entre otras manifestaciones que pueden aparecer en la AR se incluyen: pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria, neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar, queratoconjuntivitis seca y nódulos reumatoides.

[0200] La artritis crónica juvenil es una enfermedad inflamatoria idiopática crónica que se manifiesta a menudo antes de los 16 años de edad. Su fenotipo tiene algunas similitudes con la AR; determinados pacientes que son positivos para el factor reumatoide se clasifican como con artritis reumatoides juvenil. La enfermedad se subclasifica en tres categorías principales: pauciarticular, poliarticular y sistémica. La artritis puede ser grave y es típicamente destructiva e induce anquilosis de las articulaciones y retraso del crecimiento. Entre otras manifestaciones pueden incluirse uveitis anterior crónica y amiloidosis sistémica.

[0201] Las espondiloartropatías son un grupo de trastornos con determinadas características clínicas comunes y la asociación común con la expresión del producto génico HLA-B27. Entre los trastornos se incluyen: espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter (artritis reactiva), artritis asociada con enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis asociada con soriasis, espondiloartropatía juvenil y espondiloartropatía indiferenciada. Entre las características diferenciadoras se incluyen sacroileitis con o sin espondilitis, artritis asimétrica inflamatoria, asociación con HLA-B27 (un alelo definido serológicamente del locus HLA-B del MHC de clase I), inflamación ocular y ausencia de autoanticuerpos asociados con otra enfermedad reumatoide. La célula más implicada como clave para la inducción de la enfermedad es el linfocito T CD8+, una célula que se dirige hacia el antígeno presentado por las moléculas del MHC de clase I. Las células T CD8+ pueden reaccionar frente al alelo MHC de clase II HLA-B27 como si este fuera un péptido extraño expresado por moléculas MHC de clase I. Se ha planteado la hipótesis de que un epítope de HLA-B27 puede mimetizar un epítope antigénico bacteriano o de otro microorganismo y, por tanto, inducir una respuesta de las células T CD8+.

[0202] La esclerosis sistémica (escleroderma) tiene una etiología desconocida. Un rasgo característico de la enfermedad es el endurecimiento de la piel; que probablemente está inducido por un proceso inflamatorio activo. El escleroderma puede ser localizado o sistémico; las lesiones vasculares son frecuentes y la lesión de las células endoteliales en la microvasculatura es un acontecimiento temprano e importante en el desarrollo de la esclerosis sistémica; la lesión vascular puede estar mediada por el sistema inmune. Está implícita una base inmunológica por la presencia de infiltrado celular mononuclear en las lesiones cutáneas y la presencia de anticuerpos antinucleares en muchos pacientes. A menudo, la expresión de ICAM-1 está regulada por incremento en la superficie celular de los fibroblastos de las lesiones cutáneas, lo que sugiere que la interacción de las células T con estas células puede desempeñar un papel en la patogénesis de la enfermedad. Entre otros órganos afectados se incluyen: el tubo gastrointestinal: la atrofia y la fibrosis del músculo liso produce una peristalsia/motilidad anómala; riñón: proliferación concéntrica de la íntima subendotelial que afecta a las arterias arciforme e interlobular con reducción resultante del flujo de sangre de la corteza renal, que produce proteinuria, azotemia e hipetensión; músculo esquelético: atrofia, fibrosis intersticial; inflamación; pulmón: neumonitis intersticial y fibrosis intersticial y corazón: necrosis en bandas de contracción, cicatrización/fibrosis.

[0203] Las miopatías inflamatorias idiopáticas, incluyendo dermatomiosistis, polimiositis y otras, son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que producen debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular es, a menudo, simétrica y progresiva. Se asocian autoanticuerpos con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de miositis se dirigen e inhibir la función de componentes, proteínas y ARN implicados en la síntesis de proteínas.

[0204] El síndrome de Sjögren se debe a inflamación mediada por el sistema inmune y la posterior destrucción funcional de las glándulas lacrimales y las glándulas salivares. La enfermedad puede estar asociada o ir acompañada de enfermedades tisulares conectivas inflamatorias. La enfermedad se asocia con la producción de autoanticuerpos frente a los antígenos Ro y La, siendo ambos complejos proteína-ARN pequeño. Las lesiones producen queratoconjuntivitis seca, xerostomia, con otros manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar, neuropatía periférica o sensorial y púrpura palpable.

[0205] Las vasculitis sistémica incluye enfermedades en las que la lesión principal es la inflamación y el daño posterior a los vasos sanguíneos que produce isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos irrigados por los vasos afectados y una disfunción eventual en el órgano diana en algunos casos. Las vasculitis también pueden aparecer como lesión secundaria o secuela a otras enfermedades mediadas por el sistema inmune o por inflamación, como artritis reumatoide, esclerosis sistémica, etc., especialmente en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes. Las enfermedades en el grupo de las vasculitis sistémicas primarias son: vasculitis necrotizante sistémica; poliarteritis nodosa, angiitis alérgica y granulomatosis, poliangiitis, granulomatosis de Wegener, granulomatosis linfomatoide y arteritis de células gigantes. Entre las vasculitis diversas se incluyen: síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos (MLNS, por sus siglas en inglés o enfermedad de Kawasaki), vasculitis del SNC aislada, enfermedad de Behet, tromboangitis oclusiva (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea. Se considera que el mecanismo patogénico de la mayoría de los tipos de vasculitis enumerados es debido principalmente al depósito de complejos de inmunoglobulina en la pared del vaso y la posterior inducción de una respuesta inflamatoria vía ADCC, activación del complemento o ambas.

[0206] La sarcoidosis es una afección de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epiteloides en prácticamente cualquier tejido del organismo; siendo lo más normal que se produzca una afectación pulmonar. La patogénesis implica la persistencia de macrófagos activados y células linfoides en los centros de la enfermedad con la posterior secuela crónica resultado de la liberación de productos activos a nivel local y sistémico por estos tipos de células

[0207] La anemia hemolítica autoinmune, que incluye anemia hemolítica autoinmune, pancitopenia inmune y hemoglobinuria paroxística nocturna, es el resultado de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de los eritrocitos (y, en algunos casos, también en otras células sanguíneas como las plaquetas) y es un reflejo de la eliminación de las células recubiertas de anticuerpos a través de la lisis mediada por complemento y/o mecanismos mediados por ADCC/receptor de Fc.

[0208] En la trombocitopenia autoinmune, que incluye trombocitopenia púrpura, y trombocitopenia mediada por el sistema inmune en otros ámbitos clínicos, se produce destrucción/renovación de plaquetas como resultado del ataque del anticuerpo o complemento a las plaquetas y la posterior eliminación mediante lisis por complemento, ADCC o mecánicos mediados por el receptor de Fc.

[0209] La tiroiditis, incluyendo enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, tiroiditis linfocítica juvenil y tiroiditis atrófica, es el resultado de una respuesta autoinmune frente a antígenos del tiroides con producción de anticuerpos que reaccionan con proteínas presentes, y a menudo específicas, de la glándula tiroide. Entre los modelos experimentales se incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos); modelos inducibles: Inmunización de animales con tiroglobulina o antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea).

[0210] La diabetes mellitus de tipo I o diabetes dependiente de insulina es la destrucción autoinmune de las células �del islote pancreático, esta destrucción está mediada por autoanticuerpos y células T autorreactivas. Los anticuerpos frente a la insulina o al receptor de la insulina también pueden producir el fenotipo de insensibilidad de la insulina.

[0211] Las enfermedades renales mediadas por el sistema inmune, como la glomerulonefritis y nefritis tubulointersticial, tienen como resultado la lesión mediada por anticuerpo o linfocito T del tejido renal directamente como resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o de células T frente a antígenos renales o, indirectamente, como resultado del depósito de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón que son reactivos frente a otros antígenos no renales. Por tanto, otras enfermedades mediadas por el sistema inmune que dan lugar a la formación de complejos inmunes también pueden inducir enfermedad renal mediada por el sistema inmune como consecuencia indirecta. Tanto los mecanismos inmunes directos como indirectos dan lugar a una respuesta inflamatoria que produce/induce el desarrollo de lesión en los tejidos renales con alteración resultante de la función orgánica y, en algunos casos, progresión a insuficiencia renal. Ambos mecanismos inmunes humoral y celular puede estar implicados en la patogénesis de las lesiones.

[0212] Se considera que las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, como esclerosis múltiple, polineuropatía desmielinizante idopática o síndrome de Guillain-Barr y polineuropatía desmielizante inflamatoria crónica, tienen una base autoinmune y producen desmielinización de los nervios como resultado del daño causado a los oligodendrocitos o directamente a la mielina. En la EM existen resultados que sugieren que la inducción y progresión de la enfermedad dependen de los linfocitos T. La esclerosis múltiple en una enfermedad desmielinizante que depende de linfocitos T y tiene una evolución de remisión-recaída o una evolución progresiva crónica. La etiología es desconocida; sin embargo, contribuyen infecciones víricas, predisposición genética, entorno y autoinmunidad. Las lesiones contienen infiltrados mediados predominantemente por linfocitos T, células de microglía o macrófagos infiltrantes, los linfocitos T CD4+ son el tipo de célula predominante en las lesiones. El mecanismo de muerte de la célula oligodendrocito y la posterior desmielinización no es conocida pero probablemente está dirigida por los linfocitos T.

[0213] La enfermedad pulmonar inflamatoria y fibrótica, incluyendo neumonías eosinofílicas, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad pueden implicar una respuesta inflamatoria-inmune mal regulada. La inhibición de esta respuesta podría tener beneficio terapéutico.

[0214] Las enfermedades cutáneas autoinmunes o mediadas por el sistema inmune, como enfermedades cutáneas bullosas, eritema multiforme y dermatitis de contacto, están mediadas por autoanticuerpos cuya génesis es dependiente de linfocitos T.

[0215] La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por linfocitos T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, macrófagos y células procesadoras de antígenos y algunos neutrófilos.

[0216] Las enfermedades alérgicas, como asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad alimentaria y urticaria dependen de los linfocitos T. Estas enfermedades están mediadas predominantemente por inflamación inducida por linfocitos T, inflamación mediada por IgE o una combinación de ambas.

[0217] Las enfermedades asociadas con el trasplante, como rechazo del injerto y enfermedad injerto contra huésped (GVHD) dependen de linfocitos T, la inhibición de la función del linfocito T tiene un efecto de mejora.

[0218] Otras enfermedades en las que la intervención de la respuesta inmune y/o inflamatoria es beneficiosa son las enfermedades infecciosas incluyendo, pero sin limitaciones, infección vírica (incluyendo pero sin limitaciones el SIDA y las hepatitis A, B, C, D y E), infección bacteriana, infecciones fúngicas e infecciones protozoarias y parasitarias (pueden utilizarse moléculas (o derivados/agonistas) que estimulan la RML (reacción mixta de linfocitos) para potenciar la respuesta inmune frente a los agentes infecciosos), las inmunodeficiencias (moléculas/derivados/agonistas) que estimulan la RML pueden utilizarse terapéuticamente para potenciar la respuesta inmune ante afecciones hereditarias, adquiridas, inducidas por infección (como en la infección por VIH) o yatrogénicas (es decir, como en la inmunodeficiencia por quimioterapia) y neoplasia.

[0219] Preferiblemente, el anticuerpo se administra al mamífero en un vehículo, preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y col. Típicamente, en la formulación se usa una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para hacer que dicha formulación sea isotónica. Entre los ejemplos de vehículos se incluyen solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 y, más preferiblemente, de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5. Entre otros vehículos se incluyen preparaciones de liberación mantenida, como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, p. ej., películas, liposomas o microcápsulas. Será aparente para los expertos en la materia que ciertos vehículos pueden ser más preferidos dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración de anticuerpo que se va a administrar.

[0220] El anticuerpo puede administrarse al mamífero mediante inyección (p. ej., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intraportal) o mediante otros procedimientos como perfusión que asegura su administración al torrente sanguíneo de forma eficaz. El anticuerpo también puede administrarse mediante técnicas de perfusión aislada, como perfusión tisular aislada, para ejercer efectos terapéuticos locales. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

[0221] Las dosis y programas eficaces para administrar el anticuerpo pueden determinarse empíricamente, y realizar estas determinaciones está dentro de la experiencia de la técnica. Los expertos en la materia entenderán que las dosis de anticuerpo que pueden administrarse variarán dependiendo de, por ejemplo, el mamífero que recibirá el anticuerpo, la vía de administración, el tipo de anticuerpo en especial usado y otros fármacos que se estén administrando al mamífero. Las directrices para seleccionar la dosis de anticuerpo apropiada se encuentran en la literatura sobre usos terapéuticos de anticuerpos, p. ej., Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone y col., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) cap. 22 y págs. 303-357; Smith y col., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber y col., eds., Raven Press, Nueva York (1977) págs. 365-389. Una dosis diaria típica del anticuerpo utilizado solo podría estar en el intervalo de aproximadamente 1 μg/kg a 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

[0222] El anticuerpo también puede administrase al mamífero en combinación con cantidades eficaces de uno o más agentes terapéuticos. Esto es especialmente cierto en el tratamiento del cáncer, ya que muchos tumores adquieren resistencia a la quimioterapia o a la radioterapia mediante la inactivación del gen supresor tumoral p53. Puesto que DR5 estimula la apoptosis independientemente de p53, se prevé que sea clínicamente útil no solo como agente único, sino también en combinación con otros tipos de tratamiento contra el cáncer, como, por ejemplo, quimioterapia (agentes quimioterapéuticos), radioterapia, inmunoadyuvantes, agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos y/o citoquinas. También pueden emplearse otros agentes conocidos por inducir la apoptosis en células de mamíferos y entre estos agentes se incluyen TNF-alfa, TNF-beta, ligando CD30, ligando 4-1BB y ligando Apo-2, así como otros anticuerpos que pueden inducir apoptosis. Entre una y más terapias distintas pueden incluirse anticuerpos terapéuticos (distintos al anticuerpo frente a DR5) y estos anticuerpos pueden incluir anticuerpos anti receptor Her (como HERCEPTIN® (trastuzumab), Genentech, Inc.), anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos anti-CD20 (como RITUXAN® (rituximab), Genentech, Inc.) y anticuerpos frente a otros receptores del ligando Apo-2, como anticuerpos anti-DR4 o anticuerpos frente a otros miembros de la familia del receptor de TNF como ENBLEL® (etanercept) (Immunex).

[0223] Las quimioterapias contempladas por la invención incluyen sustancias químicas o fármacos que son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado, como doxorrubicina, 5-fluorouracilo, etoposido, camptotecina, leucovorina, citosina arabinósido, ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxol, metotrexato, cisplatino, melfalán, vinblastina y carboplatino. La preparación y los programas de administración de esta quimioterapia pueden usarse según las instrucciones del fabricante o como determina empíricamente el médico experto. La preparación y los programas de administración para esta quimioterapia también se describen en Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

[0224] La quimioterapia se administra preferiblemente en un vehículo farmacéuticamente aceptable, como los descritos anteriormente. El modo de administración de la quimioterapia puede ser el mismo que el empleado para el anticuerpo DR5 o puede administrarse al mamífero de un modo diferente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-DR5 puede inyectarse al mamífero mientras se administra la quimioterapia por vía oral.

[0225] La radioterapia puede administrarse al mamífero según los protocolos empleados normalmente en la técnica y conocidos por el experto en la materia. Esta terapia puede incluir radiación con cesio, iridio, yodo y cobalto. La radioterapia puede ser radiación del cuerpo completo o puede estar directamente localizada en un sitio o tejido específico en, o sobre, su organismo. Típicamente, la radioterapia se administra en pulsos durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. Sin embargo, la radioterapia puede administrarse durante periodos de tiempo más largos. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una dosis única o como dosis múltiples secuenciales.

[0226] El anticuerpo puede administrarse de forma secuencial o simultánea con el otro u otros agentes terapéuticos. Las cantidades de anticuerpo y agente terapéutico dependen, por ejemplo, del tipo de fármaco que se está usando, la patología que se está tratando y el programa y vías de administración pero generalmente debería ser menor que si cada uno se utiliza individualmente.

[0227] Tras la administración del anticuerpo al mamífero, puede controlarse la condición fisiológica del mismo de diversas formas bien conocidas por el experto.

[0228] Se contempla que los anticuerpos antagonistas o bloqueantes de DR5 también pueden usarse en tratamiento. Por ejemplo, podría administrarse un anticuerpo anti-DR5 a un mamífero (como se describe anteriormente) para bloquear el receptor DR5 unido a Apo-2L aumentado, de este modo, la biodisponibilidad de Apo-2L, administrado durante el tratamiento con Apo-2L para inducir apoptosis en las células cancerosas.

[0229] Los efectos terapéuticos de los anticuerpos frente a DR5 de la invención pueden examinarse en ensayos in vitro y usando modelos animales in vivo. Pueden usarse diversos modelos animales bien conocidos para entender mejor el papel de los anticuerpos frente a DR5 identificados en este documento en el desarrollo y patogénesis de, por ejemplo, el cáncer o enfermedades relacionados con el sistema inmune y para probar la eficacia de los agentes terapéuticos candidatos. La naturaleza in vivo de estos modelos los hace especialmente pronósticos de las respuestas en paciente humanos.

[0230] En los modelos animales de enfermedades relacionadas con el sistema inmune se incluyen tanto a animales no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Entre los modelos animales no recombinantes se incluyen, por ejemplo, roedores, es decir, modelos murinos. Estos modelos pueden generarse introduciendo células en ratones singénicos usando técnicas convencionales, p. ej., inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implantación esplénico, implantación intraperitoneal e implantación bajo la cápsula renal.

[0231] Se conocen modelos animales, por ejemplo, para la enfermedad injerto contra huésped. La enfermedad injerto contra huésped se produce cuando se trasplantan células inmunocompetentes en pacientes inmunodeprimidos o tolerantes. Las células del donante reconocen y responden ante los antígenos del huésped. La respuesta puede variar de una inflamación grave potencialmente mortal a casos leves de diarrea y pérdida de peso. Los modelos de enfermedad injerto contra huésped proporcionan un sistema para evaluar la reactividad de las células T frente a antígenos MHC y a antígenos de trasplante menores. En Current Protocols in Immunology, unidad

4.3 se describe en detalle un procedimiento adecuado.

[0232] Un modelo animal para el rechazo de un aloinjerto de piel es un medio para comprobar la capacidad de las células T para mediar en la destrucción in vivo de los tejidos, lo que es indicativo y una medida de su función en la inmunidad antivírica y tumoral. Los modelos más frecuentes y aceptados utilizan injertos de piel en la cola de ratón. Experimentos repetidos han mostrado que el rechazo del injerto de piel está mediado por células T, células T colaboradores y células T efectoras o citotóxicas y no por anticuerpos [Auchincloss, H. Jr. y Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2ª ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]. En Current Protocols in Immunology, unidad 4.4, se describe en detalle un procedimiento adecuado. Otros modelos de rechazo de trasplantes que pueden usarse para probar las composiciones de la invención son los modelos de trasplante de corazón alogénico descritos por Tanabe, M. y col., Transplantation, (1994) 58:23 y Tinubu, S. A. y col., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

[0233] Los modelos animales para la hipersensibilidad de tipo retardado proporcionan también una prueba de la función inmune mediada por células. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado son una respuesta inmune in vivo mediada por células T caracterizada por inflamación que no alcanza su máximo hasta que no ha pasado un periodo de tiempo después de la estimulación con el antígeno. Estas reacciones también se producen en enfermedades autoinmunes específicas de tejidos como la esclerosis múltiple (EM) y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE, un modelo de EM). En Current Protocols in Immunology, unidad 4.5 se describe en detalle un procedimiento adecuado.

[0234] Un modelo animal para la artritis es la artritis inducida por colágeno. Este modelo comparte características clínicas, histológicas e inmunológicas con la artritis reumatoide autoinmune humana y es un modelo aceptable para la artritis autoinmune humana. Los modelos de ratón y de rata se caracterizan por sinovitis, erosión del cartílago y del hueso subcondral. La actividad de los anticuerpos frente a DR5 de la invención frente a la artritis autoinmune puede comprobarse usando los protocolos descritos en Current Protocols in Immunology (arriba) unidades 15.5. Véase también el modelo en el que se usa un anticuerpo monoclonal frente a CD18 e integrinas VLA4 descritas en Issekutz A. C. y col., Immunology, (1996) 88:569.

[0235] Se ha descrito un modelo de asma en el que se induce hiperreactividad de las vías respiratorias inducida por antígeno, eosinofilia pulmonar e inflamación sensibilizando al animal con ovoalbúmina y estimulando a continuación al animal con la misma proteína administrada mediante un aerosol. Varios modelos animales (cobaya, rata o primate no humano) muestran síntomas similares al asma atópica en humanos tras la estimulación con antígenos en aerosol. Los modelos murinos tienen muchas de las características del asma humano. Procedimientos adecuados para comprobar la actividad y eficacia de las composiciones de la invención en el tratamiento del asma se describen en Wolyniec, W. W. y col., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 y la referencias citadas en este.

[0236] Adicionalmente, los anticuerpos frente a DR5 de la invención pueden probarse en modelos animales de enfermedades similares a la psoriasis. Los anticuerpos frente a DR5 de la invención pueden probarse en el modelo de ratón scid/scid descrito por Schon, M. P. y col. Nat. Med., (1997) 3:183, en el que los ratones muestran lesiones cutáneas histopatológicas que recuerdan a la psoriasis. Otro modelo adecuado es la quimera de piel humana/ratón SCID preparada como se describe en Nickoloff, B. J. y col., Am. J. Path., (1995) 146:580.

[0237] Diversos modelos animales son bien conocidos para comprobar la seguridad y actividad antineoplásica de una composición terapéutica candidata. Entre estos se incluyen el xenoinjerto de un tumor humano en ratones desnudos atímicos o en ratones scid/scid, o modelos genéticos de tumores murinos como ratones que no expresan p53.

[0238] Los modelos de animales recombinantes (transgénicos) puede modificarse mediante ingeniería genética introduciendo una porción codificadora de las moléculas identificadas en este documento en el genoma de animales de interés, usando técnicas convencionales para la producción de animales transgénicos. Entre los animales que pueden servir como objetivo de la manipulación transgénica se incluyen, sin limitaciones, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cerdos y primates no humanos, p. ej., babuinos, chimpancés y monos, como los macacos cangrejeros. Entre las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgén en estos animales se incluyen la microinyección de pronúcleos (Hoppe y Wanger, patente de EE. UU. Nº 4.873.191); transferencia génica mediada por retrovirus en líneas germinales (p. ej., Van der Putten y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6148-615 [1985]); inserción dirigida de un gen en células madre embriónicas (Thompson y col., Cell, 56, 313-321 [1989]); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol., 3,1803-1814 [1983]); transferencia génica mediada por espermatozoides (Lavitrano y col., Cell, 57, 717-73 [1989]). Para revisión, véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. Nº 4.736.866.

[0239] A los fines de la presente invención, entre los animales transgénicos se incluyen aquellos portadores del transgén solo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgén puede integrarse como un único transgén, o en concatámeros, p. ej., tándems cabeza-cabeza o cabeza-cola. La introducción selectiva de un transgén en un tipo celular en particular también es posible siguiente, por ejemplo, la técnica de Lasko y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-636 (1992).

[0240] La expresión del transgén en animales transgénicos puede monitorizarse mediante técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden usarse análisis por transferencia de tipo Southern o amplificación por PCR para verificar la integración del transgén. El nivel de expresión del ARNm puede analizarse a continuación usando técnicas como hibridación in situ, análisis por inmunotransferencia, PCR o inmunocitoquímica. Pueden además analizarse en los animales los signos de patología por enfermedad inmune, por ejemplo, mediante exploración histológica para determinar la infiltración de células inmunes en tejidos específicos o la presencia de tejido canceroso o neoplásico.

[0241] Alternativamente, pueden obtenerse animales “silenciados” que tengan un gen defectuoso o alterado que codifique un polipéptido identificado aquí, como resultado de la recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el polipéptido y el ADN genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica un polipéptido en particular puede usarse para clonar el ADN genómico que codifica dicho polipéptido según las técnicas establecidas. Una porción del ADN genómico que codifica un polipéptido en particular puede eliminarse o sustituirse por otro gen, como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede usarse para controlar la integración. Típicamente, se incluyen en el vector varios kilobases de ADN flanqueantes sin alterar (a ambos extremos 5' y 3') [véase, p. ej., Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea celular troncal embrionaria (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el ADN introducido se ha recombinado de forma homóloga con el ADN endógeno [véase, por ejemplo, Li y col. Cell. 69:915 (1992)]. A continuación, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), págs. 113-152]. A continuación, puede implantarse un embrión quimérico en una hembra adoptiva seudopreñada adecuada y llevar a término el embrión para obtener un animal “silenciado”. La progenia portadora del ADN recombinado de forma homóloga en sus células germinales puede identificarse mediante técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de forma homóloga. Los animales silenciados pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse frente a determinadas enfermedades y por su desarrollo de enfermedades debido a la ausencia del polipéptido.

[0242] En otra realización de la invención, se proporcionan los procedimientos para emplear el anticuerpo en pruebas diagnósticas. Por ejemplo, pueden emplearse los anticuerpos en pruebas diagnósticas para detectar la expresión o sobreexpresión de DR5 en células y tejidos específicos. Se conocen en la técnica diversas pruebas diagnósticas, como pruebas de diagnóstico por imagen in vivo, ensayos de unión competitivos in vitro, ensayos de tipo sándwich directos o indirectos y ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., (1987), págs. 147-158]. Los anticuerpos usados en los ensayos diagnósticos pueden estar marcados con un resto detectable. El resto detectable podría ser capaz de producir, directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un isótopo radiactivo, como 3H, 14C, 32P, 32S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, como fluoresceína, isotiocianato, rodamina o luciferina, o una enzima, como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para la conjugación del anticuerpo con el resto detectable, incluidos los procedimientos descritos por Hunter, y col., Nature 144:945 (1962) ; David y col., Biochemistry 13:1014-1021 (1974); Pain y col., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981) y Nygren J., Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982).

[0243] Los anticuerpos frente a DR5 también son útiles para la purificación por afinidad de DR5 a partir de cultivos de células recombinantes o de fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos frente al DR5 se inmovilizan en un soporte adecuado, como una resina de Sephadex o un papel de filtro, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Entonces, el anticuerpo inmovilizado se pone en contacto con una muestra que contiene el DR5 que se van a purificar y, a continuación el soporte se lava con un disolvente adecuado que puede retirar sustancialmente todo el material de la muestra, excepto el DR5, que está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que liberará el DR5 del anticuerpo.

[0244] En una realización adicional de la invención, se proporcionan artículos de fabricación y kits que contienen materiales útiles para tratar enfermedades, o detectar o purificar DR5. El artículo de fabricación comprende un recipiente con una etiqueta. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden obtenerse a partir de diversos materiales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que tiene un principio activo que es eficaz para tratar una enfermedad y para detectar o purificar DR5. El principio activo en la composición es un anticuerpo frente a DR5 y, preferiblemente, comprende anticuerpos monoclonales específico para DR5. La etiqueta del recipiente indica que la composición se usa para tratar enfermedades o detectar o purificar DR5 y también puede indicar direcciones para su uso in vivo o in vitro, como las descritas anteriormente.

[0245] El kit de la invención comprende el recipiente descrito anteriormente y un segundo recipiente que comprende un tampón. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con las instrucciones de uso.

[0246] Los ejemplos siguientes se ofrecen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar de ninguna forma el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS

[0247] Los reactivos disponibles en el mercado referidos en los ejemplos se usarán según las instrucciones del fabricante, siempre que no se indique otra cosa. La fuente de estas células identificada en los ejemplos siguientes y a lo largo de la memoria descriptiva, mediante el número de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Varios de los reactivos y protocolos descritos en este documento se describen adicionalmente en los documentos WO 99/37684, WO 00/73349, WO 98/32856, WO 98/51793 y WO 99/64461.

[0248] Algunos de los anticuerpos descritos a continuación se proporcionan a modo de ejemplo comparativo.

Ejemplo 1

Diseño y ensayo de las variantes de anticuerpos anti-DR5

[0249] El anticuerpo anti-DR5 16E2 se derivó como scFV a partir de una biblioteca de despliegue de fagos del anticuerpo humano y ha sido descrito en el documento WO 98/51793 publicado el 19 de noviembre de 1998 (véase el ejemplo 14). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del scFV de 16E2 se muestran en la figura 5 (SEQ ID NO. 9) y en la figura 6 (SEQ ID NO. 10), respectivamente. En la figura 6, se identifican la secuencia señal y las regiones CDR de las cadenas pesada y ligera (las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 están subrayadas).

Materiales y procedimientos

Construcción del anticuerpo 16E2 anti-DR5 de longitud completa

[0250] Para los experimentos descritos a continuación, se prefirieron IgG de longitud completa. Por tanto, los dominios variables de 16E2 se clonaron en vectores pRK descritos previamente adecuados para la expresión en células de mamífero de anticuerpos IgG1 de longitud completa (Gorman y col., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). La comparación de la secuencia de aminoácidos del dominio variable de 16E2 con la base de datos de Kabat (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH, 5ª edición) indicó que la región variable de la cadena ligera (VL) de 16E2 deriva de una familia de genes de cadena ligera lambda humana. Por tanto, el dominio variable de 16E2 se subclonó en primer lugar en un vector que contenía un dominio constante lambda. Los cebadores de PCR se diseñaron para añadir los sitios de las enzimas de restricción SfiI y Mscl y, a continuación, el dominio variable amplificado se digirió con estas dos enzimas. Este fragmento se insertó en el vector digerido de igual forma que contenía el dominio constante lambda. Puesto que este vector fue diseñado para la expresión de Fabs en E. coli, para la expresión de IgG se amplificó por PCR de nuevo la región codificadora de la cadena ligera completa usando cebadores que añadían sitios de restricción para AgeI en el extremo 5' de la región codificadora y HindIII en el extremo 3’. A continuación este fragmento de AgeI a HindIII se insertó en un vector digerido de forma similar, pDR1 (Clontech). La secuencia completa del plásmido pDR1 se muestra en la figura 11 (SEQ ID NO. 15).

[0251] Para la cadena pesada de la versión 1, el dominio variable (VH) de la cadena pesada del scFV de 16E2 se amplificó por PCR usando cebadores diseñados para añadir un sitio de PvuII en el extremo 5' y un sitio ApaI en el extremo 3' del dominio. Este fragmento se clonó a continuación en los sitios PvuII/ApaI del vector pDR2 (Clontech) para la expresión de la cadena pesada completa (dominios VH-CH1-CH2-CH3). La secuencia completa del plásmido pDR2 se muestra en la figura 12 (SEQ ID NO. 16).

[0252] Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 16E2 de longitud completa se muestran en las figuras 7-10 (SEQ ID NO. 11-14) respectivamente. En particular, en las figuras 7 y 8 (SEQ ID NO. 11 y 12) se muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de la cadena pesada de 16E2 de longitud completa y en las figuras 9 y 10 (SEQ ID NO. 13 y 14) se muestran las secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la cadena ligera de 16E2 de longitud completa. Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 16E2 de longitud completa se denominarán también a partir de ahora como “versión 1”. [0253] Construcción de variantes de IgG. Se construyeron variantes de la cadena ligera o pesada por separado usando mutagénesis dirigida a sitio (Kunkel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)). El plásmido pDR1 que codifica la versión 1 de la cadena ligera y el pDR2 que codifica la versión 1 de la cadena pesada, se transformaron en la cepa de E. coli CJ236 (BioRad, Joyce y Grindley, J. Bacteriol. 158:636-643 (1984)) para la preparación de moldes de ADN de cadena sencilla que contienen desoxiuridina. Las alícuotas de las reacciones de mutagénesis se transformaron en la cepa XL-1 Blue de E. coli (Stratagene, San Diego, CA) para la purificación del ADN de doble cadena. Para cada variante, el ADN que codifica las cadenas ligera o pesada se secuenció completamente usando un secuenciados de ADN automático ABI377x1 o ABI3730x1 (Perkin-Elmer Corp.).

[0254] Para cada variante de la IgG, se realizaron transfecciones transitorias cotransfectando un plásmido que expresa la cadena ligera y un plásmido que expresa la cadena pesada en una línea celular embriónica de riñón humano transformada con adenovirus, la 293 (Graham y col., J. Gen. Virol., 39:59-74, (1977)). Brevemente, las células 293 se separaron el día previo a la transfección y se colocaron en placas en medio con suero. Al día siguiente, se preparó un precipitado de fosfato de calcio a partir de ADN de doble cadena de las cadenas ligera y pesada, junto con ADN pAdVantage™ (Promega, Madison, WI) y se añadió gota a gota sobre las placas. Las células se incubaron durante la noche a 37ºC, a continuación se lavaron con PBS y se cultivaron en medio sin suero durante 4 días en cuyo momento de recogió el medio condicionado. Se purificaron los anticuerpos de los sobrenadantes del cultivo usando proteína A unida a Sepharosa CL-4B, a continuación, el tampón se cambió a succinato sódico 10 mM, NaCl 140 mM, pH 6,0 y se concentró usando Centricon-10 (Amicon). Las concentraciones de proteínas se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm o mediante análisis cuantitativo de aminoácidos.

[0255] Ensayo de unión de DR5 mediante electroquimioluminiscencia. La unión relativa de los anticuerpos anti-DR5 se determinó en una fase en solución, en formato de ELISA de competición. La proteína de fusión DR5-Fc se biotiniló usando biotina-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH) y el anticuerpo convencional (tanto la versión 1 como Apomab 7.3) se marcaron con ORI-TAG NHS éster (IGEN International, Gaithersburg, MD) 5 según las direcciones del fabricante. Para realizar el ensayo de unión, las muestras de prueba del anticuerpo se diluyeron de forma seriada en tampón de ensayo (PBS, pH 7,4, que contenía BSA al 0,5% y Tween-20 al 0,5%). Se añadieron volúmenes iguales (25 μl cada) de la muestra de anticuerpo (concentraciones que oscilaban de 50.000 – 0,85 ng/ml), anticuerpo convencional ORI-TAG (150 ng/ml) y DR5-Fc humano biotinilado (15 ng/ml) a placas de polipropileno de 96 pocillos y se incubaron durante 1,5 h a temperatura ambiente con agitación suave. Las perlas

10 magnéticas de estreptavidina (IGEN International) se añadieron a continuación (25 μl/pocillo) y las placas se incubaron como anteriormente durante 30 minutos más. Se añadió tampón del ensayo para llevar el volumen final a 250 μl por pocillo, y las placas se leyeron usando un aparato ORIGEN M3894 (IGEN International). Los valores de IC50 se calcularon usando cuatro parámetros ajustados de las curvas de muestras.

15 [0256] Bioensayo: inhibición del crecimiento/muerte de la célula tumoral. La potencia aparente de cada variante de anticuerpo se determinó en un ensayo de muerte de células tumorales in vitro. La línea celular de carcinoma de colon humano Colo205 se cultivó en medio RPMI que contenía suero bovino fetal al 10%. Se realizaron diluciones seriadas 1:2 de los patrones (de la versión 1 o Apomab 7.3) y las muestras en placas de cultivo tisular de 96 pocillos que contenían medio con, o sin, un anticuerpo de entrecruzamiento (Fc anti-humano, F(ab')2

20 purificado por afinidad de cabra) a 10 microgramos/ml. A continuación, se añadieron las células (20.000/pocillo) a las placas. Las placas se incubaron a 37 ºC durante un total de 48 h. Se añadió AlamarBlue a los pocillos durante las 3 últimas horas de incubación. La fluorescencia se leyó usando un fluorómetro con excitación a 530 nm y emisión de 590 nm. Los datos se analizaron usando un programa de ajuste y curva de cuatro parámetros.

25 Resultados

[0257] El objetivo general de este trabajo ha sido desarrollar anticuerpos anti-DR5 con propiedades bioquímicos mejoradas y eficacia mejorada, sin que se comprometa la seguridad.

30 [0258] Se usaron varias estrategias para lograr las mejoras deseadas, incluyendo sustituciones de aminoácidos en las cadenas pesada y ligera de DR5 para mejorar la estabilidad química o térmica, plegamiento, análisis de alaninas de los restos de los CDR para determinar qué restos podrían ser importantes para la unión o el plegamiento y, por tanto, podrían cambiar a una mayor afinidad, y el uso de bibliotecas de despliegue de fagos de los CDR para identificar clones con mejora de la afinidad. También se estudiaron los cambios en las regiones

35 estructurales para determinar sus posibles efectos sobre la inmunogenicidad y la actividad biológica.

[0259] Se usaron modelos de homología (figuras 19 y 20) como ayuda para la selección de muchos de estos cambios.

40 Variantes de la cadena pesada

Serie 1

[0260] La versión 2 de la cadena pesada contiene 5 cambios con respecto a la versión 1. Estos cambios

45 (Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q) están en la región estructural del dominio variable y se añadieron para acercar la región estructural a la secuencia consenso VHIII humana. En la tabla 1 se muestran las primeras variantes construidas con cambios en los CDR de la cadena pesada. El molde de ADNcs para estos mutantes era la versión 2. El cambio de Leu a Tyr en la posición 102 se hizo para mejorar el empaquetamiento y, por tanto, la estabilidad. En combinación con este cambio, la Asn53 se cambió por Gln o Tyr para eliminar el posible sitio de desamidación.

50 Met34 se cambió por Leu para eliminar un posible sitio de oxidación. Estas variantes de cadena pesada se expresaron con la cadena ligera original para obtener las versiones 20-23 (tabla 1). La cadena pesada que contiene las tres mutaciones M34L, N53Q y L102Y y los cambios en la región estructural como en la versión 2, se denomina posteriormente como “triple pesada uno" o TH1 (por sus siglas en inglés), mientras que la cadena pesada con las tres mutaciones M34L, N53Y, and L102Y y la región estructural de la versión 2 se denomina de forma similar TH2.

Tabla 1. Variantes de CDR de la cadena pesada

Versión a

Sustituciones IC50 de la variante IC50 v1b Actividad del bioensayo con entrecruzamientoc Actividad del bioensayo sin entrecruzamientod

20

N53Q, L102Y 0,11 0,24 *

21

M34L, N53Q, L102Y 0,42 0,54 < 1

22

N53Y , L102Y 0,08 1,30 Ligera

23

M34 L, N53Y, L102Y 0,28 4,47 Ninguna

ª Molde: versión 2

b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

[0261] Puesto que se produjo una pérdida de actividad de unión y de muerte celular in vitro con la adición de la mutación M34L (es decir, v21 en comparación con v20, v23 en comparación con v22, tabla 1), se realizaron una serie de mutaciones adicionales, en las que se sustituyó la alanina u otros restos sugeridos por la exploración 5 de la base de datos de Kabat, en el CDR1 de la cadena pesada usando la versión 20 de la cadena pesada como molde. Estas cadenas pesadas se expresaron con la versión 1 de la cadena ligera. En la tabla 2 se muestran los aminoácidos que estaban mutados, la unión resultante en relación con v1 y los datos del bioensayo para estas versiones. El cambio de Gly33 por Ala producía un aumento de la unión así como una mejora de la potencia. Esta cadena pesada que contenía las tres mutaciones G33A, N53Q y L102Y se denomina TH3. Así mismo, se

10 construcción TH4 que contenía G33A, N53Y y L102Y. El cambio de Thr28 por Ala también producía un aumento de la actividad en comparación con v1 y la cadena pesada que contenía T28A, N53Q y L102Y se denomina TH9. Los cambios en los CDR de TH1, TH2, TH3, TH4 y TH9 se resumen en la tabla 5. Estas cinco cadenas pesadas se estudiaron adicionalmente tras su expresión conjunta con las combinaciones de la cadena ligera (véase a continuación).

Tabla 2. Variantes en CDR H1

Versiónª

Mutación IC50 del MUTANTE IC50 v1b Actividad del bioensayo con entrecruzamientoc Actividad del bioensayo sin entrecruzamientod

111

G26A 0,11 0,42 Ninguna

F27A

ND ND ND

112

T28A 0,19 0,8 Igual que v1

127

F29A 7,6 Ninguno

55

D30A 2,2 ND ND

54

D30S 2,1 ND ND

57

D31A >10 ND ND

56

D31S 4,3 ND ND

113

Y32A 1,65 >100 Ninguna

58

G33A 0,1 0,097 Ligera

59

M34A 0,8 3,49 Ligera

49

M34I 1,2 14,6 Ninguna

50

M34S 1,0 13,8 Ninguna

S35H

ND ND ND

130

S35A ND ND ND

ª El molde para todas las variantes es la versión 20 b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

[0262] Mutación mediante Ala de CDRH2 y CDRH3. Para elucidar adicionalmente la contribución de cada aminoácido de las regiones CDR2 y CDR3 de la cadena pesada se construyeron mutantes mediante 20 sustitución con alaninas para cada uno de estos restos. La mutagénesis dirigida a sitio con oligonucleótidos sintéticos que codifican la sustitución con alanina se realizó usando la versión 1 de la cadena pesada como molde. Estas cadenas pesadas se expresaron usando la versión 1 de la cadena ligera. Los cambios en la afinidad y potencia aparentes de los anticuerpos resultantes se muestran en las tablas 3 y 4. Gly99Ala y Arg100Ala muestran cada uno una mejora de la actividad y, por tanto, podrían usarse estos cambios para construir mutantes de

25 combinación adicionales de la cadena pesada.

Tabla 3. Búsqueda de alanina de DCRH2 Tabla 4. Mutantes de alanina en CDRH3

Versiónª

Mutación Proporción de unión a v1b Actividad del bioensayo con entrecruzamientoc Actividad del bioensayo sin entrecruzamientod

139

G50A 3,55 1,91 Ninguna

140

I51A ND ND ND

141

N52A 2,42 ND ND

W52aA

ND ND ND

142

N53A ND 0,19 Ligera

160

G54A 1,49 ND ND

151

G55A 1,0 0,86 >100 x inferior

143

S56A 1,1 0,81 - igual a v1

144

T57A 1,2 0,54 >100 x inferior

152

G58A 0,55 1,24 -5 x inferior

153

Y59A 2,22 3,42 Ninguna

154

A60A 0,55 0,49 >100 x inferior

158

D61A 0,725 ND ND

155

S62A 0,65 0,73 >100 x inferior

156

V63A 0,041 ND ~ 3 x inferior

159

K64A ND ND ND

G65A

ND ND ND

ª Molde: versión1 b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

Versiónª

Mutación Proporción de unión a v1b Actividad del bioensayo con entrecruzamientoc Actividad del bioensayo sin entrecruzamientod

108

K102A 1,82 >10 ninguna

109

I95A 8,38 Ninguna Ninguna

(1040)

L96A ND ND ND

126

G97A 8,52 Ninguna Ninguna

110

Y98A 24,2 Ninguna Ninguna

128

G99A 0,09 0,43 ~ 8 x superior

129

R100A 0,47 0,128 ~ 4 x superior

116

G100aA 2,84 Ninguna Ninguna

117

W100bA Na Ninguna Ninguna

118

Y100cA 10,85 Ninguna Ninguna

119

F100dA Na Ninguna Ninguna

120

D101A 1,83 ~ 1 Ninguna

ª Molde: versión1 b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

Serie 2

5 [0263] Se construyó una segunda serie de cadenas pesadas usando las mismas regiones CDR de las versiones TH1, TH2, TH3 y TH4 en las que los restos estructurales E6, L11, V12, Q13 y Q105 se revirtieron a los aminoácidos encontrados en la versión 1, es decir, Q6, V11, E12, R13 y K105. Estas cadenas pesadas se denominan TH5, TH6, TH7 y TH8 (véase la tabla 5).

10 Tabla 5. Variantes de cadena pesada con mutaciones en todos los lazos de los CDR

Combinación de cadena ligera

Mutación en CDR H1 Mutación en CDR H2 Mutación en CDR H3 Restos estructurales en 6, 11, 12, 13, 105

TH1

M34L N53Q L102Y E, L,V,Q,Q

TH2

M34L N53Y L102Y E, L,V,Q,Q

TH3

G33A N53Q L102Y E, L,V,Q,Q

TH4

G33A N53Y L102Y E, L,V,Q,Q

TH5

M34L N53Q L102Y Q, V, E,R,K

TH6

M34L N53Y L102Y Q, V,E,R,K

TH7

G33A N53Q L102Y Q,V,E,R,K

TH8

G33A N53Y L102Y Q,V,E,R,K

TH9

T28A N53Q L102Y E,L,V,Q,Q

Variantes de la cadena pesada

Mutación mediante alaninas de los CDR de las cadenas ligeras

[0264] Para comprender mejor la contribución de la unión y de la actividad biológica de los restos CDR de la cadena ligera, se cambió cada aminoácido por alanina usando mutagénesis dirigida a sitio. Cada una de las variantes de la cadena ligera se combinó con la cadena pesada v1 para la expresión transitoria de la IgG, como se describió anteriormente. Los resultados de la mutagénesis mediante alaninas de las regiones CDR de la cadena 20 ligera se resumen en la tabla 6. De manera interesante, al contrario que en muchos otros anticuerpos, el CDR L1 parece tener una función significativa en la unión al antígeno. Esta cadena ligera es una cadena lambda, y el modelo mostrado en la figura 20 sugier2 que CDR1 podría formar una hélice alfa. Las sustituciones por alanina en L2 y L3 se toleraban mejor con la excepción de G50A en CDR2 en la que se suprime la unión. Por el contrario, algunas

sustituciones de Ala, especialmente R19A y K15A mejoraban la unión y la bioactividad.

Tabla 6. Mutantes mediante alaninas de la cadena ligera

Versiónª

Localización Mutación Uniónb Bioensayoc Bioensayod

89

CDR L1 Q24A 1,22 0,87 *

40

CDR L1 G25A 2,54 ND ND

90

CDR L1 D26A 0,76 0,88 Ninguna

41

CDR L1 S27A 2,36 2,79 Ligera

42

CDR L1 L28A >100 ND ND

46

CDR L1 R29A 3,0 ND ND

38

CDR L1 S30A 2,35 5,51 N/A

39

CDR L1 Y31A >10 ND ND

47

CDR L1 A33G 6,4 ND ND

43

CDR L1 S34A 1,54 3,23 Ligera

64

CDR L2 G50A >1.000 ND ND

65

CDR L2 K51A 0,4 0,027 ***

93

CDR L2 N52A 3,12 ND ND

94

CDR L2 N53A 7,54 ND ND

95

CDR L2 R54A 0,89 0,87 *

107

CDR L2 P55A 0,95 1,35 Ligera

163

CDR L2 S56A 1,9 ND ND

72

CDR L3 N89A 3,1 Na Ninguna

73

CDR L3 S90A 0,9 0,91 1,0

74

CDR L3 R91A 0,5 0,098 ****

164

CDR L3 D92A 0,22 ND ND

137

CDR L3 S93A 2,51 0,85 Ligera

138

CDR L3 S94A 0,31 0,15 Ligera

165

CDR L3 G95A 0,06 ND ND

71

CDR L3 N95aA 1,0 1,17 ND

(1024)

CDR L3 V96A ND ND ND

166

CDR L3 H95bA 1,34 ND ND

167

CDR L3 V97A 1,05 ND ND

ª Molde: versión1 b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

5 Cambios de restos en una familia de genes

[0265] Se usó un segundo tipo de mutantes dirigidos para estudiar la cadena ligera. En esta estrategia, los restos CDR que en el modelo parecían estar en uno de los lados de los lazos y, por tanto, podrían tener un papel de apoyo más que estar directamente implicados en la unión al antígeno, se sustituyeron por restos en las

10 posiciones correspondientes en otras familias de genes lambda relacionadas. Estos mutantes también se expresaron usando la cadena pesada v1 y los resultados se resumen en la tabla 7. En el CDR L2, la combinación de G50K, K51D ofrecía una mejora significativa tanto en la unión como en la bioactividad y la combinación que comprendía las cuatro mutaciones G50K, K51D, N52S, N53E, también mejoraba con respecto a v1. No se toleraban otros cambios más conservadores en la misma región, que implicaban solo una sustitución de un resto.

Tabla 7. Variantes de la cadena ligera en base a las secuencias de familias de genes relacionadas.

Versiónª

Localización Mutación Uniónb Bioensayoc Bioensayod

25

CDR L1 Q24S, D26E, Y31K, S34Y 11,7 ND ND

24

D26E, Y31K >100 ND ND

51

S34Y >100 ND ND

44

Q24S 0,96 1,23 Ligera

45

Y31K >1.000 ND ND

106

Y32H 5,1 1,71 Ninguna

26

CDR L2 G50K, K51D, N52S, N53E 0,33 0,071 1

27

G50S, K51D, N52S 0,92 0,29 Ligera

91

G50K, K52S, N53E 14,71 ND ND

92

G50K, K51D 0,09 0,43 ***

28

N52L 6,88 ND ND

125

G50S, K51D, N52S, N53E 1,99 1,0 ND

31

N52Q 5,28 ND ND

33

N53Q 4,48 ND ND

61

N52S, N53E >100 ND ND

62

N52S 1,1 1,1 Ninguna

63

N52Q, N53S >10 ND ND

60

CDR L3 N89L, R91A, N95aT, H95bY >100 ND ND

52

N95aT,H95bY 2,3 ND ND

30

N95aQ 1,65 7,3 Ligera

31

N89Q >1.000 ND ND

29

H95bY 1,68 2,14 Ligera

66

H95bR 0,7 0,97 1,0

67

N95Ak 1,0 0,44 1,0

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Selección de afinidad con bibliotecas de fagos del anticuerpo

[0266] Para cada uno de los CDR L1, L2 y L3, se construyeron bibliotecas de despliegue de fagos

5 independientes y se seleccionaron los clones con aumento en la afinidad por DR5-Ig. La inspección del modelo (figura 20) indicaba que los restos de los CDR estaban probablemente expuestas y se eligieron estos restos para su asignación aleatoria. La cadena ligera lambda completa y el dominio VH de la versión 1 se clonaron en el vector de despliegue de fagos pS1602, que se referencia en Vajdos y col., J. Mol. Biol. 320:415-428 (2002) y además se describió en Sidhu y col., Curr. Opin. Biotechnol. 11:610-616 (2002). Se usó la mutagénesis por el método de Kunkel

10 en la construcción de las bibliotecas. El fagémido v1 se transformó en la cepa CJ236 de E. coli para la preparación de ADN de cadena sencilla y se usaron oligonucleótidos que contenían codones TAA en cada sitio elegido para la asignación aleatoria para generar los moldes de la biblioteca. A continuación, se usaron oligos que utilizaban el codón degenerado NNS (donde N es una mezcla equivalente de G, A, T y C mientras que S es una mezcla equivalente de G y C) para construir las bibliotecas. CDRL1 se mutó usando el oligo molde de parada CA945 y el

15 oligo de biblioteca CA946. CDRL2 se mutó usando el oligo molde de parada CA947 y el oligo de biblioteca CA948. CDRL3 se mutó usando el oligo molde de parada CA949 y el oligo de biblioteca CA950. Library construction is summarized in Table 8.

Tabla 8

Número del oligo

Región Finalidad Secuencia

CA945

CDRL1 Molde de parada

CA946

CDRL1 Asignación aleatoria

CA947

CDRL2 Molde de parada

CA948

CDRL2 Asignación aleatoria

CA949

CDRL3 Molde de parada

CA950

CDRL3 Asignación aleatoria

20 [0267] Los productos de reacción de la mutagénesis aleatoria se electroporaron dentro de las células de

E. coli XLI-Blue (Stratagene) y se amplificaron mediante el crecimiento durante 14-16 horas con el fago colaborador M13K07. El tamaño de la biblioteca se estimó mediante dilución seriada y distribución en placas si la transformación inicial se realizaba en placas de carbenicilina y fue de 1,9 x 109 a 2,2 x 109 clones.

25 [0268] Las bibliotecas se cribaron durante 4 rondas en solución usando DR5-Ig biotinilado (Genentech).

Se bloquearon aproximadamente 1011 fagos con un ml de solución de leche desnatada en polvo al 3% y Tween al 0,2% en PBS (bloqueo del fago) en un agitador rotatorio durante 1 h a TA. Se añadieron DR4-Ig y CD4-Ig a la solución de bloqueo a una concentración de 1 micromolar para disminuir la unión no específica. A continuación, se añadió el antígeno biotinilado a 100 nM para la primera ronda y se dejó que se produjera la unión durante 2 h. En las

5 siguientes rondas de cribado, la concentración del antígeno se redujo a 10, 5 y 1 nanomolar. [0269] Para la captura del fago que se une al antígeno, las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal) se lavaron primero tres veces con solución de bloqueo del fago y, a continuación, se bloquearon con un ml de solución de bloqueo del fago durante 1 h a TA. Las perlas se concentraron usando un imán y se añadieron a la solución de antígeno-fago durante 15 min. A continuación, se uso el imán para extraer de la

10 solución los complejos perla-antígeno-fago. Estas partículas se lavaron después 3 veces con solución de bloqueo del fago, 3 veces con PBS-Tween (Tween al 0,02%) y una vez con PBS. Los fagos se eluyeron de la perlas con 100 microlitos de HCl 0,1 M durante 1 0min y se neutralizaron con NaOH. Los fagos eluidos se usaron para infectar la cepa XL1 Blue de E. coli y se propagaron como anteriormente para las rondas sucesivas. En cada ronda de aumentó la rigurosidad del lavado.

15 [0270] Se secuenciaron los clones de cada biblioteca. Para las bibliotecas de L1, solo se obtuvieron secuencias de tipo silvestre, lo que apoya la idea de que este CDR es importante para la unión al antígeno o la conformación del anticuerpo y pueden tolerarse pocas mutaciones en la posible hélice. Para las bibliotecas en L2, no se encontró secuencia consenso, lo que sugiere que son aceptables secuencias de CDRL2 múltiples para su unión

20 a DR5. Para las bibliotecas de L3, aparecieron varias secuencias múltiples veces y estas secuencias se injertaron en el vector de la cadena ligera de longitud completa usando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. La expresión de IgG se realizó de nuevo en células 293, usando la versión 1 de la cadena pesada para la transfección conjunta. En la tabla 9 se describen las secuencias L3 que se expresaban como anticuerpos de longitud completa y los resultados de la unión y de los bioensayos. Dos de las secuencias probadas, incorporadas en las versiones 69 y 70, producían

25 anticuerpos con una unión y bioactividad mejoradas en comparación con la versión 1.

Tabla 9. Secuencias proteicas del CDR3 de la cadena ligera de la biblioteca de fagos

Versiónª

Secuencia del CDR L3 Proporción de unión a v1b Actividad del bioensayo con entrecruzamientoc Actividad de bioensayo con entrecruzamiento d

68

NSRDSSGSHVV 1,3 0,973 1,0

69

NSRSYSGNHVV 0,1 0,143 ****

70

NSRSSSGSHVV 0,2 0,152 ***

ª Molde: versión1 b Ensayo de unión de CR5 humano competitivo Origen® c Ensayo de inhibición de la célula tumoral d Ensayo de inhibición de la célula tumoral

Combinación de cadenas ligeras

30 [0271] Como se describe anteriormente, se identificaron mutaciones en cada CDR de la cadena ligera que potenciaban individualmente la unión y mataban a la célula tumoral in vitro. A continuación, estas mutaciones se combinaron para obtener varias cadenas ligeras con mejoras en cada uno de los CDR. Estas se designaron TL1, TL2 y TL3 por “triple ligera 1&quot;, etc., y se describen en la tabla 10. Por tanto, TL1 contiene la mutación L1 identificada

35 en la versión 44 combinada con la mutación L2 identificada en la versión 26 y la mutación L3 de la versión 29. Así mismo, TL2 contiene la mutación L1 de la versión 44 con la mutación L2 de v65 y la mutación L3 de v69, mientras que TL3 combina L1 de v44 con L2 de v65 y L3 de v74.

Tabla 10. Mutaciones en las combinaciones de la cadena ligera

Combinación de la cadena ligera

Mutación, CDR L1 Mutaciones, CDR L2 Mutaciones, CDR L3

TL1

Q24S G50K, K51D, N52S, N53E H95bY

TL2

Q24S K51A D92S, S93Y

TL3

Q24S K51A R91A

Tabla 11. Nomenclatura de Apomab

Cadena ligera:

TL1 TL2 TL3

Cadena pesada

TH1

Apomab 1.1 Apomab 1.2 Apomab 1.3

TH2

Apomab 2.1 Apomab 2.2 Apomab 2.3

TH3

Apomab 3.1 Apomab 3.2 Apomab 3.3

TH4

Apomab 4.1 Apomab 4.2 Apomab 4.3

TH5

Apomab 5.1 Apomab 5.2 Apomab 5.3

TH6

Apomab 6.1 Apomab 6.2 Apomab 6.3

TH7

Apomab 7.1 Apomab 7.2 Apomab 7.3

TH8

Apomab 8.1 Apomab 8.2 Apomab 8.3

TH9

Apomab 9.1 Apomab 9.2 Apomab 9.3

En la tabla 12 se muestran más anticuerpos Apomab.

Tabla 12

Versión de Apomab

Secuencias de aminoácidos estructurales en las posiciones 6, 11, 12, 13 y 105 Unión a DR5, en relación con Apomab 7.3 Potencia, relativa a Apomab 7.3, con entrecruzamiento Actividad del bioensayo con entrecruzamiento

7.3*

Q VER K 1,00 1 ND

3.3**

E LVQ Q 2,50 0,53 Ninguna

18.3

E LVQ K 0,51 0,75 Ninguna

24.3

E VER Q 0,80 1 Ninguna

25.3

Q LVQ K 0,77 1 -3 x inferior

26.3

Q VER Q 0,53 1 ~6 x inferior

27.3

E VER K 1,90 1,2 Ninguna

28.3

Q LER K 0,48 0,94 ~5 x inferior

29.3

Q LEQ K 0,52 1,2 -7 x inferior

30.3

Q VVQ K 0,78 0,66 ~3 x superior

36.3

Q VVR K 0,66 ND ND

37.3

Q VEN K 0,84 ND ND

38.3

Q LVR K 0,47 ND ND

18.2

E LVQ K 0,11 0,16 Ninguna

24.2

E VER Q 0,14 0,18 Ninguna

25.2

Q LVQ K 0,10 0,13 ~32 x superior

26.2

Q VER Q 0,14 0,22 ~10 x superior

27.2

E VER K 0,10 0,15 Ninguno

*misma región estructural que en la versión 1 **misma región estructural que en la VH-III consenso humano

Expresión de Apomab

[0272] Tras derivar las cadenas pesadas triples, y las cadenas ligeras triples, se creó una rejilla de 9 x 3 de anticuerpos de combinación mediante la transfección conjunta de cada una de las tres cadenas ligeras con cada

10 una de las nueve cadenas pesadas en células 293 y se purificaron los anticuerpos resultantes como se describió anteriormente. Los estudios in vitro con estos Apomabs indicaban que varias versiones eran bastante potentes en el bioensayo. Por tanto, se preparó el material que era adecuado para los estudios en modelos tumorales en ratón in vivo.

15 Recuperación y purificación de Apomab

[0273] A continuación se describe un procedimiento para la recuperación y purificación de anticuerpos Apomab a partir del líquido recogido del cultivo celular (LRCC):

20 [0274] Cromatografía en columna Prosep de proteína A: el líquido recogido del cultivo celular (LRCC) producido por las células de ovario de hámster chino (CHO), se ajusta a pH 7,0 con Tris base 1,5 M y, a continuación, se carga en la columna Prosep de proteína A (Millipore, EE. UU.) que está equilibrada con NaCl 25 mM/Tris 25 mM/EDTA 5 mM, pH 7,5. Las proteínas no unidas pasan a través de la columna y se eliminan mediante lavado con tampón de equilibrado seguido de un segundo paso de lavado con TMAC 0,5 M en el tampón de

25 equilibrado y un tercer lavado con tampón de equilibrado. El anticuerpo Apomab se eluye de la columna de proteína A usando un paso de elución de ácido acético 0,1 M. La elución de la columna se sigue mediante A280 y se recoge el pico de anticuerpo Apomab.

[0275] Cromatografía en SP-Sepharose Fast Flow: la mezcla del anticuerpo Apomab de Prosep de

30 proteína A se ajusta a pH 5,5, con Tris base 1,5 M y, a continuación, se carga en una columna de SP-Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia, Suecia) que está equilibrada con MOPS 25 mM, pH 7,1. Tras cargar la muestra, la columna se lava hasta absorbancia basal a A280 con tampón de equilibrado. El anticuerpo Apomab se eluye de la columna usando un gradiente lineal de 12 volúmenes de columna de cloruro sódico de 0 a 0,2 M en tampón de equilibrado, pH 8. La elución de la columna se sigue por absorción a A280. Se recogen las fracciones y se mezclan

35 aquellas que contienen el anticuerpo Apomab adecuadamente plegado, según se determina mediante análisis por SEC-HPLC.

[0276] Cromatografía en Q-Sepharose Fast Flow: la mezcla de las fracciones de SP-Sepharosa se carga a continuación en una columna de Q-Sepharose FF (Amersham Pharmacia, Suecia) que está equilibrada en tampón cloruro sódico 50 mM/Tris 25 mM, pH 8. La columna se lava con tampón de equilibrado y se recoge el anticuerpo Apomab en el eluido de la columna.

5 [0277] Formulación UFIDF: la mezcla de Q-Sepharose se concentra mediante ultrafiltración en una membrana que tiene un punto de corte de peso molecular de aproximadamente 10.000 daltons. A continuación, la mezcla de Q-Sepharose FF concentrada se diafiltra a continuación con 10 volúmenes de Histidina 10 mM/sacarosa al 8%, pH 6. La mezcla de Q-Sepharosa diafiltrada se acondiciona con polisorbato 20 al 10% hasta conseguir una concentración final de polisorbato 20 del 0,02%. El volumen total formulado se filtra a través de un filtro de 0,22 μm

10 estéril y se mantiene a 2-8ºC o a -70ºC. La pureza final de los anticuerpos Apomab se determina mediante PAGE-SDS, HPLC-SEC y análisis de secuencia de aminoácidos.

[0278] La secuenciación se realiza en los secuenciadores ABI3700 o ABI3730 de Applied Biosystems. Los cromatogramas de secuencia se analizan usando el software de análisis de secuencia Sequencer (GeneCodes, 15 Ann Arbor, MI).

Prueba de la actividad in vitro de los Apomab

[0279] Antes de empezar los estudios in vivo con Apomab, se comprobó la actividad in vitro de cada lote 20 como se describió anteriormente. Estos resultados se muestran en la tabla 13.

Tabla 13. Actividad in vitro de los Apomab

Versión de Apomab

Número de aumentos en la afinidad aparente, en relación con la versión 1 (v1) Número de aumentos en la potencia aparente, con entrecruzamiento, en relación con la versión 1 (v1) Potencia aparente, sin entrecruzamiento, en relación con la versión 1 (v1)

1.1

11,30 24 Ninguna

1.2

52,10 14 Ninguna

1.3

13,10 6,5 Ninguna

2.1

12,80 5,5 Ninguna

2.2

9,60 3 Ninguna

2.3

29,00 6,5 Ninguna

3.1

15,00 14 Ninguna

3.2

29,20 22 Ninguna

3.3

15,00 8 Ninguna

4.1

25,70 11 Ninguna

4.2

23,10 6 Ninguna

4.3

10,30 12 Ninguna

5.2

26,90 22 -8 x superior

5.3

2,80 10 ~2,4 x inferior

6.2

31,60 6 ~2 x superior

6.3

1,50 4 ~4 x inferior

7.2

31,20 22 -5 x superior

7.3

4,30 16 -2 x inferior

8.2

28,60 9 Muy ligera

8.3

8,30 11 ~ 8 x inferior

9.1

21,90 36 Ninguna

9.2

29,90 48 Ninguna

9.3

10,00 ND Ninguna

EJEMPLO 2

Evaluación de la actividad antitumoral de Apomab en el modelo de xenoinjerto del carcinoma de colon humano Colo 205 y de otros modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal.

[0280] Las abreviaturas utilizadas más frecuentemente en este y en los ejemplos posteriores son las 30 siguientes:

RC regresión completa RP regresión parcial DMR dosis máxima tolerada MVT mediana del volumen tumoral NRT muerte no relacionada con el tratamiento SSTLP superviviente sin tumor a largo plazo

PBS

solución salina tamponada con fosfato

q3d x 4

cada tres días hasta un total de cuatro dosis

qd x 1

una dosis administrada el día 1

qd x 5

una dosis diaria durante cinco días

SST

superviviente sin tumor

RT

muerte relacionada con el tratamiento

TFE

tiempo hasta el final del estudio

T-C

diferencia, en días, entre los valores de la mediana del TFE de los animales tratados y control.

RCT

retraso del crecimiento del tumor; T-C; aumento en la mediana del TFE para un grupo de

tratamiento, en comparación con el grupo control, normalmente expresado como % del control.

[0281]

Tiempo hasta 2xVo, tiempo de duplicación (TD); tiempo necesario para que se duplique el

volumen de un tumor.

Vpre

5 Log muertecelular = log10 [:diferencia entre el logaritmo del volumen real del tumor en el momento del V

[post :

tratamiento, log10(Vpre) y log10(Vpost) (Chenevert y col., Clin. Cancer Res. 3:1457-1466 (1997).

[0282] Ratones hembras desnudos atímicos de 6-8 semanas (Charles River Laboratories) fueron inoculados con 5 millones de células Colo 205 por ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón por vía subcutánea, en la

10 zona derecha del lomo. Se marcó en la oreja a todos los ratones para su identificación. Una vez que el volumen del tumor fue de aproximadamente 100-200 mm3, los ratones portadores del tumor Colo 205 se agruparon aleatoriamente y se les administró el tratamiento.

[0283] La pauta terapéutica fue una única dosis por vía intraperitoneal, con dosis de control vehículo o

15 anticuerpos convencionales o de prueba a una concentración de 3 mg/kg/ratón o 10 mg/kg/ratón. En algunos casos, se sacrificaron 3 o 4 ratones de los grupos de vehículo y 10 mg/kg, y se obtuvieron muestras de suero y los tumores a los 5 minutos, 24 o 48 horas posteriores al tratamiento para estudios de concentración sérica del fármaco e histología tumoral. En el resto de los ratones, se tomaron las medidas del tumor dos veces a la semana durante las 2 primeras semana y, a continuación, una vez a la semana durante otras 4 semanas.

20 [0284] Los resultados obtenidos en el modelo de xenoinjerto de Colo 205 en ratones desnudos atímicos se muestran en las figura 21-25.

[0285] En la figura 21 se muestra que cada Apomab 5.3, 6.3 y 8.3 era muy eficaz a la hora de reducir el 25 volumen medio del tumor a todas las dosis probadas y su eficacia era esencialmente la misma que la de la versión 1 del anticuerpo 16E2.

[0286] La eficacia de las dosis intraperitoneales únicas de Apomab 5.2, 6.2, 7.2 y 7.3 se comprobó en el modelo de xenoinjerto de Colo 205 en ratones desnudos atímicos y los resultados se muestran en la figura 22. 30 Todos los Apomab probados eran muy eficaces a la hora de reducir el volumen del tumor y su eficacia era esencialmente la misma a la de la versión 1 del anticuerpo 16E2.

[0287] De forma similar, los resultados de la figura 23 muestran que los Apomab 5.2, 7.3 y 8.3 eran eficaces a la hora de reducir el volumen del tumor en este modelo de cáncer colorrectal. En este experimento, los

35 Apomab y el anticuerpo 16E2 se administraron en dosis de 1 mg/kg y 3 mg/kg, aunque por lo demás se trataron de la forma descrita anteriormente. Es especialmente notable la eficacia de Apomab 7.3 y 8.3 y no muestran ninguna inversión durante el periodo de ensayo de 20 días.

[0288] Como se muestra en la figura 24, la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 excedía de lejos la 40 actividad de Apomab 23.2 y 25.3 en el modelo de xenoinjerto de Colo 205.

[0289] En la figura 25 se muestran los resultados de un ensayo de comparación entre la actividad antitumoral de Apomab 7.3 derivado de líneas celulares estables y transitorias en el modelo de xenoinjerto de Colo 205 en ratón. En resumen, ratones hembras desnudos atímicos de 6-8 semanas (Charles River Laboratories) fueron

45 inoculados con 5 millones de células Colo 205 por ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón, en la zona derecha del lomo, como se describe anteriormente. En la figura se muestran las dosis. Los datos de la figura 25 muestran que el Apomab 7.3 derivado de líneas celulares estables y transitorias, respectivamente, es igualmente eficaz en el modelo de xenoinjerto de Colo 205 en ratón.

[0290] En la figura 26 se muestra el resultado de un experimento para comprobar la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 (dosis de 10 mg/kg) como monoterapia o politerapia con 80 mg/kg de CPT-11 (irinotecán, fármaco conocido para el tratamiento del cáncer colorrectal) en un modelo de xenoinjerto de la línea de cáncer colorrectal HCT15. Como certifican los resultados mostrados, mientras que tanto Apomab 7.3 como CPT-11 eran eficaces cuando se administraban en monoterapia, la combinación de los dos mostraba un efecto superior que excedía la actividad de Apomab 7.3 y CPT-11 administrados como monoterapia.

[0291] En la figura 27 se muestran los resultados de un experimento representativo en ratones desnudos portadores de xenoinjertos de la línea de sarcoma LS 180, tratados con Apomab 7.3 en combinación con CPT-11 (irinotecán) se muestran. De nuevo se encontró que la politerapia era superior en relación con la administración de Apomab 7.3 o CPT-11 como único fármaco, y la diferencia era estadísticamente significativa (segundo panel). P<0,05 según el modelo de Tukey–Kramer para todos los pares comparados.

EJEMPLO 3

Evaluación de la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 en el modelo de xenoinjerto de células BJAB de linfoma no Hodgkin

[0292] La actividad antineoplásica de Apomab 7.3 (10 mg/kg una vez a la semana) solo y en combinación con RITUXAN® (rituximab, Genentech. Inc.) (4 mg/kg, una vez a la semana) se evaluó en un modelo de xenoinjerto de células BJAB de linfoma no Hodgkin. Puesto que se sabe que las células de linfoma crecen mejor en ratones SCID, en este estudio se usaron ratones SCID de 6-8 semanas (Charles River Laboratory). Los parámetros y los resultados del tratamiento se muestran en la figura 28. Apomab 7.3 y RITUXAN®, cuando se administraban en combinación, mostraban actividad sinérgica.

EJEMPLO 4

Evaluación de la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 en el modelo de xenoinjerto de células BxPC3 de adenocarcinoma pancreático humano

[0293] Se estudió la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 (10 mg/kg i.v.) solo o en combinación con gemcitabina (160 mg/kg i.p.) en un modelo de xenoinjerto de células BxPC3 de adenocarcinoma pancreático humano en ratones hembras desnudos atímicos (Charles River Laboratory). Los parámetros y resultados del tratamiento se muestran en la figura 29. Los datos muestran que la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 administrado como monoterapia era muy superior a la eficacia de gemcitabina. La administración combinada de Apomab 7.3 y gemcitabina daba como resultado un aumento adicional de la eficacia.

EJEMPLO 5

Evaluación de la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con carboplatino y taxol en el modelo de xenoinjerto de células H460 de cáncer de pulmón humano.

[0294] La actividad antineoplásica de Apomab 7.3 (10 mg/kg, una vez a la semana, i.p.) solo o en combinación con carboplatino y taxol se evaluó en relación con un vehículo control y con la combinación de carboplatino y taxol. Se inoculó a 60 ratones hembra desnudos atímicos (Charles River Laboratory) con 5 millones de células H460/ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón por vía subcutánea en la zona derecha del lomo. Se marcó en la oreja a todos los ratones para su identificación. Se permitió que los tumores alcanzaran un volumen tumoral al medio de 100-200 mm3 y se trataron como se muestra en la figura 30. En resumen, los ratones se dividieron en cuatro grupos. El grupo 1 era el grupo control tratado con el vehículo (histidina 10 mM, sacarosa al 8% y Tween 20 al 0,02% (pH 6)). El grupo 2 se trató con Apomab 7.3 en dosis de 10 mg/kg, ratón, i.p., una vez a la semana durante 2 semanas. Al grupo 3 se le administró carboplatino (100 mg/kg/ratón, i.p. una única dosis el día 0) + taxol (6,25 mg/kg/ratón, s.c., diariamente durante 5 días consecutivos durante 2 semanas). El grupo 4 recibió Apomab 7.3 (dosis de 10 mg/kg/ratón, i.p., una vez a la semana durante 2 semanas) + carboplatino (100 mg/kg/ratón, i.p., una única dosis el día 0) + taxol (6,25 mg/kg/ratón, s.c., diariamente durante 5 días consecutivos durante 2 semanas). La actividad antineoplásica de Apomab 7.3 administrado como monoterapia era comparable a la de la combinación de carboplatino + taxol. Se encontró que la administración combinada de Apomab 7.3 + carboplatino + taxón era superior en comparación con las otras modalidades de tratamiento.

EJEMPLO 6

Evaluación de la actividad antineoplásica de Apomab 7.3 solo y en combinación con carboplatino y taxol en el modelo de xenoinjerto de células H2122 de cáncer de pulmón humano

[0295] En este estudio se inoculó a ratones hembra desnudos atímicos (Charles River Laboratory, 10 ratones por grupo) con 5 millones de células H2122/ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón por vía subcutánea en la zona derecha del lomo. Se marcó en la oreja a todos los ratones para su identificación. Se permitió que los tumores alcanzaran un volumen tumoral medio de 100-200 mm3, se agruparon aleatoriamente en cuatro grupos (6 ratones/grupo) y se trataron como se muestra en la figura 31. El grupo 1 era un grupo control tratado con el vehículo (histidina 10 mM, sacarosa al 8% y Tween 20 al 0,02% (pH 6)). Al grupo 2 se le administró carboplatino (100 mg/kg/ratón, i.p., una única dosis el día 0) + taxol (6,25 mg/kg/ratón, s.c., diariamente durante 5 días consecutivos y 2 semanas). El grupo 3 recibió Apomab 7.3 (dosis de 10 mg/kg/ratón, i. p., una vez a la semana durante 2 semanas). El grupo 4 recibió Apomab 7.3 (dosis de 10 mg/kg/ratón, i.p., una vez a la semana durante 2 semanas) + carboplatino (100 mg/kg/ratón, i.p., una única dosis el día 0) + taxol (6,25 mg/kg/ratón, s.c., diariamente durante 5 días consecutivos y 2 semanas). Como se muestra en la figura 31, la combinación de carboplatino + taxol no mostraba actividad antineoplásica significativa en relación en el grupo control tratado con el vehículo. En claro contraste, el Apomab 7.3 administrado como monoterapia mostraba una actividad antineoplásica notable. Los seis ratones tratados con Apomab 7.3 mostraron una respuesta completa (RC) sin ninguna inversión durante el periodo de tratamiento de 70 días. Se encontró la misma actividad en el grupo tratado con la combinación Apomab 7.3 + carboplatino + taxol.

[0296] Para determinar la dosis eficaz máxima de Apomab 7.3 en este modelo, se inoculó a ratones hembra desnudos atímicos (Charles River Laboratory) de 6-8 semanas con 5 millones de células H2122/ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón por vía subcutánea en la zona derecha del lomo. Se marcó en la oreja a todos los ratones para su identificación. Se permitió que los tumores alcanzaran un volumen tumoral medio de 100-200 mm3 y se agruparon de forma aleatoria (13 ratones/grupo) y se trataron como se describe a continuación. Se sacrificó a todos los animales excluidos de los grupos de tratamiento.

[0297] El grupo A era un grupo control tratado con vehículo (succinato de arginina 0,5 M, Tris 20 mM, Tween 20 al 0,02%, pH 7,2). El vehículo se administró 5 veces por semana, i.p durante una semana. Al grupo B se le administró Apomab 7.3 en una única dosis i.v. de 1 mg/kg/ratón. Al grupo C se le administró Apomab 7.3 en una única dosis i.v. de 3 mg/kg/ratón. Al grupo D se le administró Apomab 7.3 en una única dosis i.v. de 10 mg/kg/ratón. Transcurridas 48 horas del primer tratamiento, se sacrificó a tres ratones de los grupos B, C y D y se recogieron sus tumores de la siguiente forma. Se conservó un tumor en formalina al 10% para su estudio histológico. Otro tumor se congeló en nitrógeno líquido para realizar estudios de ARN. Otro tumor se congeló en nitrógeno líquido para inmunotransferencia. Las medidas del tumor se tomaron dos veces a la semana durante las 2 primeras semanas y, a continuación, una vez a la semana durante la siguientes 4 semanas. Al final de las 6 semanas o hasta que los tumores alcanzaban un volumen aproximado de 800-1.000 mm3, todos los ratones restantes fueron sacrificados. Las curvas de dosis-respuesta mostradas en la figura 32, primer panel, indican que Apomab 7.3 era eficaz a todas las dosis probadas, pero las dosis de 3 mg/kg y 10 mg/kg mostraron una mejora marcada (aunque no estadísticamente significativa) en relación con la dosis de 1 mg/kg. P<0,05 según el modelo de Tukey-Kramer para todos los pares comparados (véase la figura 32, segundo panel).

EJEMPLO 7

Evaluación de la actividad antineoplásica de Apomab 23.2, 25.3 y 7.3 en el modelo de xenoinjerto con Colo 205 de cáncer colorrectal humano

[0298] En este estudio se inoculó a ratones hembra desnudos atímicos (Charles River Laboratory) con 5 millones de células Colo 205/ratón en un volumen de 0,2 ml/ratón por vía subcutánea en la zona derecha del lomo. Se marcó en la oreja a todos los ratones para su identificación. Se permitió que los tumores alcanzaran un volumen tumoral medio de 100-200 mm3, se agruparon aleatoriamente en siete grupos (10 ratones/grupo) y se trataron como se muestra en la figura 33. El grupo 1 era un grupo control tratado con el vehículo (histidina 10 mM, sacarosa al 8% y Tween 20 al 0,02% (pH 6)). Al grupo 2 se le administró una única dosis i.v. de 3 mg/kg/ratón de Apomab 7.3. Al grupo 3 se le administró una única dosis i.v. de 10 mg/kg/ratón de Apomab 7.3. Al grupo 4 se le administró una única dosis i.v. de 3 mg/kg/ratón de Apomab 23.3. Al grupo 5 se le administró una única dosis i.v. de 10 mg/ratón de Apomab 23.3. Al grupo 6 se le administró una única dosis i.v. de 3 mg/kg/ratón de Apomab 25.3. Al grupo 7 se le administró una única dosis i.v. de 10 mg/kg/ratón de Apomab 25.3. Se pesó a todos los ratones 24 horas después del tratamiento. Los tumores se midieron dos veces a la semana durante las 2 primeras semanas y, a continuación, una vez a la semana durante las siguientes 4 semanas. Después de 6 semanas o cuando los tumores alcanzaron un tamaño >1.000 mm3 se sacrificó a los ratones.

[0299] Los resultados se muestran en la figura 33. Como se muestra en los datos del día 25, tanto Apomab 7.3 como Apomab 25.3 mostraban actividad antineoplásica significativa en este modelo.

EJEMPLO 8

Evaluación de la actividad antineoplásica del anticuerpo monoclonal Apomab 7.3 frente a xenoinjertos de células Colo 205 de carcinoma de colon humano en ratones desnudos

Animales

[0300] Los ratones hembra desnudos atímicos (nu/nu, Harlan) tenían 11 o 12 semanas el día 1 del estudio. Los animales se mantuvieron con libre acceso al agua y a Lab Diet® NIH 31 modificada e irradiada compuesta de proteína sin procesar al 18,0%, grasa sin procesar al 5,0% y fibra sin procesar al 5,0%. Los ratones se alojaron en lechos animales de laboratorio ALPHA-Dri® bed-o'cobs® irradiados con un ciclo de luz de 12 horas a 2122ºC y humedad del 40-60%.

Implantación del tumor

[0301] Los xenoinjertos se iniciaron a partir de células de carcinoma de colon humano Colo 205 cultivadas. Las células tumorales se crecieron hasta la fase semilogarítmica en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G sódica, sulfato de estreptomicina 100 μg/ml, anfotericina B 0,25 μg/ml, gentamicina 25 μg/ml, glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 10 mM y bicarbonato sódico 0,075%. Los cultivos celulares se mantuvieron en frascas de cultivo celular en un incubador humidificado a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% y aire al 95%. El día de la implantación de las células tumorales se recogieron las células Colo 205 y se resuspendieron en una matriz Matrigel al 50% (BD Biosciences) en PBS a una concentración de 5 x 106 células/ml. Cada ratón del ensayo recibió 1 x 106 células Colo 205 implantadas subcutáneamente en la parte derecha del lomo y el crecimiento del tumor se monitorizó hasta que el tamaño medio se aproximó a 100-300 mm3. Treinta días después, designado como día 1 fuera del estudio, los volúmenes de los tumores individuales oscilaban de 126 a 288 mm3 y los animales se clasificaron en seis grupos compuestos cada uno de diez animales con un volumen medio del tumor de 188 mm3.

Material y tratamiento del ensayo

[0302] El material del ensayo se mantuvo en hielo durante la administración y las soluciones de administración se mantuvieron posteriormente a 4 ºC. En el grupo control de vehículo (grupo 1), los ratones recibieron el vehículo administrado por vía intraperitoneal una vez al día durante cinco días, seguido de dos días de descanso y, a continuación, una vez al día durante cinco días más. En los grupos de ensayo (grupos 2-4) los animales se trataron con ligando Apo2L.0 (60 mg/kg i.p. en un programa 5/2/5), Apomab 7.3 (3 mg/kg i.v. los días 1 y 8) y un anticuerpo monoclonal murino anti-VEGF B20-4.1 (10 mg/kg i.p los días 1 y 8). Los grupos 5 y 6 recibieron la combinación de B20-4.1 (10 mg/kg i.p. los días 1 y 8). Los grupos 5 y 6 recibieron la combinación de B20-4.1 con Apo2L.0 y B20-4.1 con Apomab 7.3, respectivamente. Cada dosis se administró en un volumen de 0,2 ml por cada 20 g de peso corporal (10 ml/kg), llevado a la escala del peso corporal del animal.

Final del estudio

[0303] Los tumores se midieron dos veces a la semana usando calibradores. Cada animal se sacrificó cuando su tumor alcanzó un volumen de 2.000 mm3 o a la conclusión del estudio el día 68, lo que sucediera antes. Se selección un volumen tumoral de final del estudio de 1.000 mm3 para el análisis del retraso en el crecimiento del tumor, debido al número de tumores que no alcanzaban los 2.000 mm3 de tamaño. El tiempo hasta el final del estudio (TFE) para cada ratón se calculó a partir de la siguiente ecuación.

log10(volumen de final del estudio,mm3)� bTFE (días) = M

[0304] Donde b es la intersección y m es la pendiente de la línea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento del tumor transformado en logaritmo. El conjunto de datos comprendía la primera observación que excedía el volumen del final del estudio y las tres observaciones consecutivas que precedían inmediatamente a la obtención del volumen del final del estudio. Los animales que no alcanzaban el final del estudio fueron asignados a un valor de TFE igual a la última fecha del estudio. Los animales que murieron por causas relacionadas con el tratamiento o no relacionadas con el tratamiento debido a metástasis se les asignó a un valor de TFE igual al día de la muerte. Los animales que murieron por causas no relacionadas con el tratamiento o por causas desconocidas se excluyeron de los cálculos del TFE.

[0305] Los resultados del tratamiento se evaluaron por el retraso en el crecimiento del tumor (RCT) que se define como el aumento en la mediana del tiempo hasta el final del estudio (TFE) en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo control:

RCT = T � C

expresado en días o como porcentaje de la mediana del TFE del grupo control

T � C

%RCT = X100

C

donde:

T = mediana del TFE para el grupo de tratamiento. C = mediana del TFE para el grupo control.

[0306] El tratamiento puede causar regresión parcial (RP) o regresión completa (RC) del tumor en un animal. En una respuesta de RP, el volumen tumoral es el 50% o menos de su volumen el día 1 para tres medidas consecutivas durante el transcurso del estudio, e igual o mayor de 13,5 mm3 para uno o más de estas tres medidas. En una respuesta de RC, el volumen tumoral es inferior a 13,5 mm3 para uno o más de estas tres medidas durante el transcurso del estudio. Un animal con una respuesta de RC al finalizar en estudio se clasifica adicionalmente como superviviente sin tumor (SST). Se controlaron y registraron las respuestas de regresión.

Obtención de muestras

[0307] Las muestras tumorales se tomaron al final del estudio de los animales de cada grupo. Estos animales se sacrificaron por dislocación cervical justo antes de la recogida de las muestras. Se recogieron los tumores de tres animales por grupo, se bisecaron y se conservaron en formalina al 10% tamponada a pH neutro durante 12 a 24 horas a temperatura ambiente.

Análisis estadístico y gráfico

[0308] Se usó la prueba de rango logarítmico para analizar la significación de las diferencias entre los valores de TFE de grupos tratados y control. Se realizaron análisis estadísticos bilaterales a un nivel de significación p = 0,05, considerándose significativos los resultados a 0,01 � p �0,05 y muy significativo a p < 0,01.

[0309] Las curvas de la mediana del crecimiento tumoral muestran la mediana de los volúmenes tumorales del grupo como una función del tiempo. Cuando se retiraba del estudio a un animal debido al tamaño del tumor, el volumen tumoral final registrado para el animal se incluyó con los datos usados para calcular la mediana del volumen tumoral del grupo en los puntos temporales posteriores. Se construyeron curvas de Kaplan-Meier para mostrar el porcentaje de animales que permanecían en el estudio como una función del tiempo. Estas curvas usaban los mismos conjuntos de datos que la prueba de rango logarítmico.

Resultados

[0310] En la figura 34 se muestran las curvas de la mediana del crecimiento tumoral del grupo (panel superior) y las curvas de Kaplan-Meier (panel inferior) para cada grupo de este estudio. La mediana del TFE de los ratones control tratados con el vehículo era de 10,0 días, con un tumor (de 10) que no alcanzó el volumen tumoral de final del estudio de 1.000 mm3. El B20-4.1 administrado a 10 mg/kg i.p los días 1 y 8 producía un modesto RCT de 19,9 días (113%) que no era estadísticamente significativo. Las monoterapias con Apo2L.0 y Apomab 7.3 eran eficaces frente a Colo 205, produciendo un retraso en el crecimiento del tumor de 28,4 días (190%) y 53,0 días (355%), respectivamente. La adición de B20-4.1 a Apo2L.0 o Apomab 7.3 no mejoraba la eficacia del tratamiento con respecto al RCT o respuestas de regresión.

EJEMPLO 9

Evaluación de la actividad antineoplásica del anticuerpo monoclonal Apomab 7.3 como monoterapia y en combinación con carboplatino más paclitaxel frente a las células SKMES-1de CPNM humano

[0311] Se comprobaron las actividades antitumorales in vivo del ligando Apo2L.0 y Apomab 7.3 como monoterapias y en combinación con carboplatino más paclitaxel frente a las células SKMES-1 de CPNM humano.

Animales

[0312] Los ratones hembra desnudos atímicos (nu/nu, Harlan) tenían de 9 a 10 semanas y su peso oscilaba de 17,4 a 25,4 g el día 1 del estudio. Los animales se mantuvieron con libre acceso a agua y a Lab Diet® NIH 31 modificada e irradiada compuesta de proteína sin procesar al 18,0%, grasa sin procesar al 5,0% y fibra sin procesar al 5,0%. Los ratones se alojaron en lechos animales de laboratorio ALPHA-Dri® bed-o'cobs® irradiados con un ciclo de luz de 12 horas a 21-22ºC y humedad del 40-60%.

Implantación del tumor

[0313] Los xenoinjertos se iniciaron a partir de tumor de pulmón SKMES-1 mantenidos mediante trasplante seriado en PRC. Cada ratón del ensayo recibió un fragmento de tumor SKMES-1 de 1 mm3 implantado subcutáneamente en la parte derecha del lomo y se controló el crecimiento del tumor. Treinta días después, designado como día 1 del estudio, los volúmenes de los tumores individuales oscilaban de 63 a 144 mm3 y los animales se clasificaron en cuatro grupos compuestos cada uno de diez animales y dos grupos con nueve ratones cada uno. Los volúmenes tumorales medios eran de 93 a 95 mm3.

Material y tratamiento del ensayo

[0314] Todo el material del ensayo se proporcionaba listo para su administración en 0,1 ml por cada 20 g de peso (5 ml/kg) y se conservaron a -80ºC tras su recepción. Los materiales del ensayo se descongelaron el primer día de administración, se mantuvieron en hielo durante la administración y, a continuación se conservaron a 4ºC. El carboplatino (PARAPLATIN® para inyección, Bristol Myers Squibb) se diluyó con dextrosa al 5% en agua (D5W) hasta obtener la dosis deseada en un volumen de 0,2 ml por cada 10 g de peso (10 ml/kg). El paclitaxel (Natural Pharmaceuticals, Inc.) se diluyó con D5W cada día de administración a partir de una solución madre 10X para obtener un vehículo compuesto de etanol al 5% y Cremophor EL al 5% en D5W al 90% (vehículo EC al 5%), de modo que la dosis deseada se administró en 0,1 ml por 20 g de peso.

[0315] En el grupo 1 (control vehículo) los ratones recibieron vehículo administrado por vía intraperitoneal una vez al día durante cinco días (i.p. qd x 5) y sirvieron como controles del crecimiento tumoral. Los ratones de los grupos 2 y 3 recibieron monoterapia con Apo2L.0 (60 mg/kg s.c, qd x 5) y Apomab 7.3 (10 mg/kg i.v. qd x 1), respectivamente. Los ratones del grupo 4 recibieron la combinación de carboplatino (100 mg/kg i.p., qd x 1) más paclitaxel (6,25 mg/kg s.c., qd x 5). Los ratones de los grupos 5 y 6 recibieron carboplatino más paclitaxel en combinación con Apo2L o Apomab 7.3, respectivamente. Cada dosis se administró en el volumen indicado en la sección previa y se llevaron a escala del peso del cuerpo del animal.

Final del estudio, toma de muestras y análisis estadísticos

[0316] Se determinó el final del estudio y se realizaron las tomas de muestra y los análisis estadísticos como se describe en el ejemplo 8 previo.

Resultados

[0317] En las figuras 35 y 36 se muestran las curvas de la mediana del crecimiento tumoral de cada grupo y las curvas de Kaplan-Meier para los grupos tratados con Apo2L.0 y Apomab 7.3, respectivamente.

[0318] Los tumores de todos los ratones control tratados con el vehículo crecieron hasta el volumen final del estudio de 1.500 mm3 con una mediana del TFE de 18,9 días. Por tanto, el RCT máximo alcanzado en este estudio de 45 días era de 26,1 días (138%). La curva de la mediana del crecimiento tumoral y la curva de Kaplan-Meier para el grupo control se incluyen en los paneles superior e inferior de las figuras 35 y 36.

[0319] En el caso del grupo tratado con Apo2L.0 (Grupo 2), la mediana del TFE era de 22,9 días y se correspondía con un RCT de 4,0 días (21%) y una actividad no estadísticamente significativa. La figura 28 (panel superior) indica que la mediana del volumen tumoral del grupo 2 se reducía durante el periodo de tratamiento y, a continuación, se volvía a un crecimiento rápido del tumor.

[0320] La mediana del TFE del grupo 3 era de 2,0 días y se correspondía con un RCT de 7,1 días (38%) y una actividad con una alta significación estadística (p = 0,005). No se documentaron respuestas de regresión y todos los tumores alcanzaron un volumen de final del estudio de 1.500 mm3. La curva de la mediana del crecimiento del tumor del grupo 2 sugiere un retraso inicial en el crecimiento del tumor con respecto a los controles.

[0321] La mediana del TFE de los ratones del grupo 4 tratados con carboplatino más paclitaxel era de 26,5 días y se correspondía con un RCT de 7,6 días (40%) y una actividad estadísticamente significativa (p = 0,01). Todos los tumores del grupo 4 crecieron hasta el volumen de final del estudio de 1.500 mm3 y no se documentaron respuestas de regresión. La curva de la mediana del crecimiento tumoral de los ratones del grupo 4 indica un modesto retraso en el crecimiento tumoral en relación con los ratones control (véanse los paneles superiores de la figuras 35 y 36).

[0322] El tratamiento con la combinación triple de Apo2L.0, carboplatino y paclitaxel producía una mediana del TFE de 32,7 días que se correspondía con un RCT de 13,9 días (73%) y una actividad muy significativa con respecto al grupo 1 (p = 0,002). La mediana del TFE de 32,7 días con esta combinación triple era más larga que la mediana del TFE de 22,9 días del grupo de monoterapia con Apo2L.0 o la mediana del TFE de 16,5 días del tratamiento control con quimioterapia, aunque las diferencias no alcanzaban significación estadística mediante el análisis de rango logarítmico. A pesar de la falta de significación estadística, la curva de la mediana del crecimiento tumoral indicaba una actividad mayor con la combinación del grupo 5 en comparación con la monoterapia con Apo2L.0 o la quimioterapia con carboplatino más paclitaxel (véase el panel superior de la figura 28).

[0323] El tratamiento con la combinación triple de Apomab 7.3 (grupo 6), carboplatino y paclitaxel dio lugar a 3/10 muertes RT, por tanto, este grupo, no fue evaluable para el RCT. Sin embargo, la curva de la mediana del crecimiento tumoral indicaba una actividad mayor con la combinación del grupo 6 en comparación con la monoterapia con Apomab 7.3 o la quimioterapia con carboplatino más paclitaxel (véase el panel superior de la figura 37).

Conclusión

[0324] A pesar de la mortalidad relativamente alta en este experimento, los datos sugieren que Apo2L.0 y Apomab 7.3 pueden añadir beneficio antitumoral al tratamiento con carboplatino y paclitaxel.

EJEMPLO 10

Evaluación de la actividad antineoplásica del anticuerpo monoclonal Apomab 7.3 como monoterapia y en combinación con un anticuerpo anti-VEGF en el modelo de xenoinjerto de células Colo 205 de carcinoma humano

Animales

[0325] Los ratones hembra desnudos atímicos (nu/nu, Harlan) tenían 7-8 semanas el día 1 del estudio. Los animales se mantuvieron con libre acceso a agua y a Lab Diet® NIH 31 modificada e irradiada compuesta de proteína sin procesar al 18,0%, grasa sin procesar al 5,0% y fibra sin procesar al 5,0%. Los ratones se alojaron en lechos animales de laboratorio ALPHA-Dri® bed-o'cobs® irradiados con un ciclo de luz de 12 horas a 21-22ºC y humedad del 40-60%.

Cultivo de células tumorales

[0326] Las células del carcinoma de colon humano Colo 205 se cultivaron en medio RPMI 1640 que contenía penicilina G sódica a 100 unidades/ml, sulfato de estreptomicina a 100 μg/ml, anfotericina B a 0,25 μg/ml y gentamicina a 25 μg/ml. El medio se suplementó con el 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, glutamina 2 mM y bicarbonato sódico 1 mM. Las células tumorales se cultivaron en frascas de cultivo celular en un incubador humidificado a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5% y aire al 95%.

Implantación in vivo

[0327] Las células de carcinoma humano Colo 205 usadas para la implantación se recogieron durante la fase de crecimiento logarítmico y se resuspendieron en Matrigel al 50% a 5 x 106 células/ml. A cada ratón se le inyectaron 1x106 células (0,2 ml de suspensión celular) s.c. en la parte derecha del lomo. Los tumores se controlaron dos veces a la semana y, a continuación, diariamente conforme sus volúmenes se aproximaban a 100-300 mm3. El día 1 del estudio, los animales se clasificaron en grupos de tratamiento con tamaños tumorales de 108,0-220,5 mm3 y una mediana de tamaño tumoral del grupo de 149,8 mm3. El tamaño del tumor puede estimarse asumiendo que 1 mg es equivalente a 1 mm3 del volumen tumoral.

Material y tratamiento del ensayo

[0328] El material del ensayo se proporcionó listo para su administración. Las soluciones para su administración se conservaron a 4ºC.

[0329] Los ratones se clasificaron en seis grupos con diez ratones por grupo. Todos los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal (i.p.).

[0330] Apo2L.0 y su vehículo se administraron cada uno una vez al día los días 1-5 (qd x 5). Apomab 7.3 y el anticuerpo murino anti-VEGF se administraron cada uno una vez el día 1 (qd x 1). Los ratones control del grupo 1 se trataron con el vehículo para Apo2L.0. El grupo 2 recibió monoterapia Apo2L.0 a 60 mg/kg. El grupo 3 recibió monoterapia con Apomab 7.3 a 3 mg/kg. El grupo 4 recibió monoterapia con BY4 a 5 mg/kg. Los grupos 5 y 6 recibieron Apo2L.0 a 60 mg/kg y Apomab 7.3 a 3 mg/kg, respectivamente, cada uno en combinación con anti-G6 a 5 mg/kg. En todos los grupos, el volumen de administración de 0,2 ml/20 g de ratón se llevaron a escala del peso corporal de cada animal.

Final del estudio, toma de muestras y análisis estadísticos

[0331] Se determinó el final del estudio y se realizaron las tomas de muestra y los análisis estadísticos como se describe en el ejemplo 8 previo.

Resultados

[0332] Los resultados se muestran en la figura 37, donde las curvas en el panel superior muestran la mediana de los volúmenes tumorales frente al tiempo de cada grupo; la curva de Kaplan-Meier del panel inferior muestra el porcentaje de animales evaluables que permanecían en cada grupo frente al tiempo.

[0333] Los ratones del grupo 1 control recibieron el vehículo de Apo2L.0 y sirvieron como control para todos los grupos de tratamiento. Los tumores de los diez ratones crecieron hasta el volumen de final del estudio de

1.500 mm3 con una mediana de TFE de 20,8 días. Por tanto, el RCT máximo posible en este estudio de 61 días era del 193%.

[0334] El grupo 2 recibió monoterapia con Apo2L.0 a 60 mg/kg. Este tratamiento producía una actividad antitumoral muy significativa en relación al grupo vehículo control (p<0,001) y una mediana del TFE de 53,6 días. Esta mediana del TFE se corresponde con una T-C de 32,8 días y un RCT del 158%. La mediana del volumen del tumor el día 61 para cinco ratones era 1.210 mm3. Se registró un SSTLP.

[0335] El grupo 3 recibió monoterapia con Apomab 7.3 a 3 mg/kg. Este tratamiento producía una actividad muy significativa (p < 0,001), con el RCT del 193% máximo posible y una MVT(6) de 776 mm3. Se registraron un SSTLP, una respuesta de RC transitoria y tres respuestas de RP.

[0336] El grupo 4 recibió monoterapia anti-G6 a 5 mg/kg. Este tratamiento producía una actividad muy significativa (p < 0,01), con un RCT del 86% y una MVT(2) de 1.224 mm3. No se registraron respuestas de regresión.

[0337] El grupo 5 recibió Apo2L.0 a 60 mg/kg, en combinación con anti-G6 a 5 mg/kg. La politerapia producía un RCT del 138%. La actividad antineoplásica era muy significativa en relación con el tratamiento con el vehículo (p < 0,001), aunque significativa con respecto a ambas monoterapias. En el grupo 5, la MVT(3) era de

1.080 mm3 y se registró una respuesta de RP.

[0338] El grupo 6 recibió politerapia con Apomab 7.3 a 3 mg/kg y anti-G6 a 5 mg/kg. Este tratamiento producía el RCT máximo posible de 193%. La actividad antineoplásica era muy significativa en relación al tratamiento con el vehículo (p < 0,001), significativo en relación con la monoterapia anti-G6, pero insignificante en relación con la monoterapia con Apomab 7.3. En el grupo 6, la MVT(8) era de 208 mm3 y se registraron cinco respuestas de RP.

Conclusiones

[0339] Los tumores respondían en gran medida a la monoterapia con 3 mg/kg de Apomab 7.3 qd x 1 (grupo 3). Este tratamiento producía una actividad muy significativa en relación al grupo control del vehículo y el RCT máximo posible del 193%. Entre los seis ratones que sobrevivieron a día 61 con una MVT de 776 mm3, cinco animales experimentaron regresión del tumor. Esta monoterapia producía una SSTLP, una respuesta de RC transitoria y tres respuestas de RP. La mediana del volumen tumoral no aumentaba hasta después del día 15 (figura 37).

[0340] La politerapia con Apomab 7.3 y el anticuerpo murino anti-VEGF y anti-G6 producía una actividad más fuerte que la observada con Apomab 7.3 o anti-G6 solo. Con esta politerapia hubo ocho supervivientes a 61 días y se generó la MVT más baja del estudio, 208 mm3. La curva de la mediana de crecimiento tumoral muestra reducción tumoral o estasia hasta el día 33, seguido de un crecimiento muy lento del tumor (figura 37). La combinación producía una actividad significativamente más fuerte que la monoterapia anti-G6 pero no difería significativamente de los resultados de la monoterapia con Apomab 7.3. Además, la combinación producía cinco respuestas de RP, mientras que las cinco respuestas de regresión obtenidas con la monoterapia con Apomab 7.3 incluyen una RC transitoria y una SSTLP.

[0341] Todos los tratamientos se toleraron bien. No se observó en el estudio pérdida de peso ni otras toxicidades patentes.

[0342] En resumen, con la politerapia con Apomab 7.3/anti-G6 había más supervivientes a 61 días y se conseguían una MVT más baja que el tratamiento con cualquier de las monoterapias correspondientes. Sin embargo, la combinación Apomab 7.3/anti-G6 no producía actividad curativa, que si se observaba con la monoterapia con Apomab 7.3.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0343]

5 <110> GENENTECH, INC. ADAMS, CAMELLIA W.

<120> ANTICUERPOS FRENTE A DR5 Y SUS USOS

<130> 39766-0164 PCT

<140> POR ASIGNAR 10 <141> Adjunto

<150> US 60/649.550

<151> 02/02/2005

<160> 29

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 15

<210> 1

<211> 281

<212> PROT

<213> Homo sapiens 20 <400> 1

<210> 2 25 <211> 1.042

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_característica 30 <222> 447

<223> n = t o g

<400> 2

<210> 3 5 <211> 468

<212> PROT

<213> Homo sapiens

<400> 3 <210> 4

<211> 2.152 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 4 <210> 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 410 10 <223> Xaa = Leu o Met

<400> 5 <210> 6

<211>

1.799 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211>

1.323 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8 <210> 9

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 309

<212> PROT

<213> Homo sapiens 15 <400> 10

<210> 11

<213> Homo sapiens

<400> 11 <210> 12

<211> 1.353 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 12 <210> 13

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 639

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 14 <210> 15

<211>

5.391 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211>

6.135 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211>

1.353 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17 <210> 18

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400>

18 10

<210> 19

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 19

<210> 20

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400>

20 10

<210> 21 15 <211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética 20 <400> 21

<210> 22 25 <211> 48

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<220>

<221> misc_característica

<222> 15, 16, 24, 25, 30, 31

<223> n = A, T, C y G

<220>

<221> misc_característica

<222> 17, 26, 32

<223> s = G yC

<400> 22

<210> 23

<211> 44

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 23

<210> 24

<211> 47

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<220>

<221> misc_característica

<222> 19, 20, 22, 23, 25, 26

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_característica

<222> 21, 24, 27

<223> s = G yC

<400> 24

<210> 25

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 25

<210> 26

<211> 59

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<220>

<221> misc_característica

<222> 25, 26, 28, 29, 31, 32, 37, 38

<223> n = A, T, C o G

<220>

<221> misc_característica

<222> 27, 30, 33, 39

<223> s = G yC

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PROT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 27

<210> 28

<211> 11

<212> PROT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 28

<210> 29

<211> 11

<212> PROT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia sintética

<400> 29

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo anti-DR5 que comprende mutaciones en las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de longitud completa 16E2 como se establece en las SEQ ID NO. 1 y 13, respectivamente, o un fragmento del mismo, en el que:

   dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene una afinidad mayor por DR5 que el anticuerpo de longitud completa 16E2 y es capaz de activar o estimular la apoptosis en células cancerosas y las mutaciones comprenden:

   (i)

   un conjunto de mutaciones de la cadena pesada seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) N53Q, L102Y;

   (ii)

   M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y; (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) G33A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Y, L102Y; (viii) T28A, N53Q, L102Y y (ix) T28A, N53Y, L102Y en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 y

   (ii)

   un conjunto de mutaciones de la cadena ligera seleccionadas entre el grupo compuesto por (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y y (iii) Q24S, K51A, R91A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13.

2. 2.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une esencialmente al mismo epítope que el anticuerpo 16E2 de longitud completa.

3. 3.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende una o más mutaciones en la región estructural del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo 16E2 de longitud completa en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 o un fragmento de la misma.

4. 4.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 3 en el que la mutación de la región estructural se selecciona entre el grupo compuestos por Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q o un fragmento del mismo.

5. 5.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 4 que comprende todas las mutaciones de la región estructural de Q6E, V11L, E12V, R13Q y K105Q o un fragmento del mismo.

6. 6.

   El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende al menos una de las mutaciones G99A y R100A en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 o un fragmento del mismo.

7. 7.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende las mutaciones siguientes: G33A, N53Q, L102Y en la secuencia de la SEQ ID NO. 11 y Q24S, K51A, R91A en la secuencia de la SEQ ID NO. 13 o un fragmento del mismo.

8. 8.

   El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 1 que comprende las mutaciones siguientes: G33A, N53Y, L102Y en la secuencia de la SEQ ID NO. 11 y Q24S, K51A, R91A en la secuencia de la SEQ ID NO. 13 o un fragmento del mismo.

9. 9.

   El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho fragmento se selecciona entre el grupo compuesto por fragmentos Fab, Fab', (F(ab')2 y Fv, dianticuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpo.

10. 10.

    El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 9 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

11. 11.

    El anticuerpo anti-DR5 de la reivindicación 9 en el que dicho fragmento es un fragmento Fv.

12. 12.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el anticuerpo tiene una actividad antineoplásica mayor que el anticuerpo de longitud completa 16E2.

13. 13.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo tiene una potencia mayor que el anticuerpo 16E2 de longitud completa según se determina en un ensayo de muerte tumoral in vitro.

14. 14.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

15. 15.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que media en la citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC).

16. 16.

    El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en forma dimérica o un fragmento del mismo.

17. 17.

    El anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes entrecruzado con una región Fc de una IgG antihumana o un fragmento del mismo.

18. 18.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes fusionado con una secuencia epítope etiqueta.

19. 19.

    Una molécula quimérica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes fusionada a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

20. 20.

    La molécula quimérica de la reivindicación 19 en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga comprende una secuencia de inmunoglobulina.

21. 21.

    La molécula quimérica de la reivindicación 20 en la que dicha secuencia de inmunoglobulina es una región Fc de una IgG anti-humano.

22. 22.

    Un anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en terapia.

23. 23.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 22, en el que la terapia es el tratamiento del cáncer.

24. 24.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 23, en el que el cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.

25. 25.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 23, en el que dicho cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma epidermoide, cáncer microcítico pulmonar, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM), linfoma no Hodgkin, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y cáncer de cabeza y cuello.

26. 26.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 25, en la que dicho cáncer es CPNM, linfoma no Hodgkin, cáncer colorrectal o cáncer pancreático.

27. 27.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 24, en el que dicho cáncer es un adenocarcinoma.

28. 28.

    El anticuerpo anti-DR5 o un fragmento de anticuerpo para su uso en la terapia de la reivindicación 27, en el que dicho adenocarcinoma es adenocarcinoma colorrectal, pancreático o metastásico.

29. 29.

    El ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

30. 30.

    Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 29.

31. 31.

    Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 30.

32. 32.

    Un procedimiento para producir un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 31 en las condiciones en la que se expresa el ADN.

33. 33.

    Una composición que comprende un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo, y un vehículo.

34. 34.

    La composición de la reivindicación 33 en la que dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.

35. 35.

    La composición de la reivindicación 34 que además comprende un agente antineoplásico adicional.

36. 36.

    La composición de la reivindicación 35 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un anticuerpo.

37. 37.

    La composición de la reivindicación 36 en la que dicho anticuerpo se selecciona entre el grupo compuesto por un anticuerpo anti-DR5, Rituxan (rituximab) y un anticuerpo anti-VEGF.

38. 38.

    La composición de la reivindicación 35 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un agente quimioterapéutico.

39. 39.

    La composición de la reivindicación 38 en la que dicho agente quimioterapéutico se selecciona entre el grupo compuesto por CPT-II (irinotecán), gemcitabina, carboplatino, taxol y paclitaxel.

40. 40.

    La composición de la reivindicación 39 en la que dicho agente antineoplásico adicional es un ligando Apo2L que comprende los aminoácidos 114-281 de la SEQ ID NO. 1.

41. 41.

    Un procedimiento ex vivo de inducción de apoptosis que comprende exponer a las células cancerosas de mamífero a un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo.

42. 42.

    El procedimiento de la reivindicación 14 en el que dichas células cancerosas de mamífero se exponen a un agente que activa DR5.

43. 43.

    Uso de un anticuerpo anti-DR5 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, o un fragmento del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un sujeto mamífero.

44. 44.

    El uso de la reivindicación 43, en la que el sujeto mamífero es un paciente humano.

45. 45.

    El uso de la reivindicación 43 o de la reivindicación 44, en el que dicho cáncer se selecciona entre el grupo compuesto por carcinoma epidermoide, cáncer pulmonar microcítico, cáncer pulmonar no microcítico (CPNM), linfoma no Hodgkin, blastoma, cáncer gastrointestinal, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de estómago, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, carcinoma de endometrio, carcinoma de las glándulas salivares, cáncer de riñón, cáncer hepático, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y cáncer de cabeza y cuello.

46. 46.

    El uso de la reivindicación 45 en el que dicho cáncer es CPNM, cáncer colorrectal, linfoma no Hodgkin

    o cáncer pancreático.

47. 47.

    El uso de la reivindicación 43 o de la reivindicación 44 en el que dicho cáncer es un adenocarcinoma.

48. 48.

    El uso de la reivindicación 47 en la que dicho adenocarcinoma es adenocarcinoma colorrectal, pancreático o metastático.

49. 49.

    El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, que comprende adicionalmente la administración de un agente antineoplásico más.