NO341791B1 - DR5-antistoffer med forbedrede egenskaper, sammensetninger som omfatter slike antistoffer, fremgangsmåter for å fremstille slike antistoffer og deres terapeutiske anvendelse i behandlingen av kreft. - Google Patents

Abstract

Sammendrag Oppfinnelsen vedrører anti-DR5-antistoffer med forbedrede egenskaper, preparater som omfatter slike antistoffer, fremgangsmåter og måter for å fremstille slike antistoffer og deres terapeutiske anvendelse, spesielt i behandlingen av kreft.

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt DR5-antistoffer inkludert agonistiske antistoffer og til fremgangsmåter for å anvende slike DR5-antistoffer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Forskjellige ligander og reseptorer som tilhører tumor nekrose faktor (TNF)-superfamilien har blitt identifisert på fagområdet. Inkludert blant slike ligander er tumor nekrose faktor alfa (”TNF-alfa”), tumor nekrose faktor beta (”TNF-beta” eller ”lymfotoksin-alfa”), lymfotoksin-beta (”LT-beta”), CD30-ligand, CD27-ligand, CD40-ligand, OX-40-ligand, 4-1BB-ligand, LIGHT, Apo-1-ligand (også referert til som Fas-ligand eller CD95-ligand), Apo-2-ligand (også referert til som Apo2L eller TRAIL), Apo-3-ligand (også referert til som TWEAK), APRIL, OPG-ligand (også referert til som RANK-ligand, ODF eller TRANCE) og TALL-1 (også referert til som BlyS, BAFF eller THANK) (se f. eks. Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002), Ashkenazi og Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998), Ashkenazi og Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000), Goldstein, Curr. Biol., 7:750-753, (1997), Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, s. 377-411, Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001), Gruss og Dower, Blood, 85:3378-3404 (1994), Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986), Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987), Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996), Delatry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987), Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996), Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995), Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993), Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), WO 97/01633 publisert 16. januar, 1997, WO 97/25428 publisert 17. juli 1997, Masters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998), Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:

32401-32410 (1997), Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998), WO 98/28426 publisert 2. juli, 1998, WO 98/46751 publisert 22. oktober, 1998, WO 98/18921 publisert 7. mai, 1998, Morre et al., Science, 285:260-263 (1999), Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999), Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999), Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)).

Induksjon av forskjellige cellulære responser mediert av slike TNF-familie ligander blir typisk initiert av deres binding til spesifikke celle-reseptorer. Noen, men ikke alle, TNF-familie ligander binder til og induserer forskjellige biologiske aktiviteter via celleoverflate-«dødsreseptorer» for å aktivere kaspaser, eller enzymer som utfører celledøden eller apoptoseveien (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997). Inkludert blant medlemmene av TNF-reseptor superfamilien som per i dag er identifisert er TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (også referert til som Apo-1 eller CD95), DR4 (også referert til som TRAIL-R1), DR5 (også referert til som Apo-2 eller TRAIL-R2), DcR1, DcR2, osteoprotegerin (OPG), RANK og Apo-3 (også referert til som DR3 eller TRAMP) (se f. eks. Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420:430 (2002), Ashkenazi og Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998), Ashkenazi og DIxit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000), Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, side 377-411, Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001), Gruss og Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995), Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989), Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990), EP 417 563, publisert 20. mars, 1991, Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990), Schall et al., Cell, 61:361 (1990), Smith et al., Science, 248:1019-1023 (1990), Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991), Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991), Stamenkovic et al., EMBO J, 8:1403-1410 (1989), Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990), Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997), Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997), Pan et al., Science, 276:111-113 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997), Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997), Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997), Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997), vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)).

De fleste av disse TNF-reseptor familiemedlemmene deler den typiske strukturen til celleoverflate-reseptorer, inkludert ekstracellulære regioner, transmembrane regioner og intracellulære regioner, mens andre blir funnet naturlig som løselige proteiner som mangler et transmembrant og intracellulært domenet. Den ekstracellulære delen av typiske TNFR-er inneholder et repetert aminosyresekvens mønster med flere cysteinrike domener (CRD), som starter fra NH2-terminalen.

Liganden som blir referert til som Apo-2L eller TRAIL ble identifisert for flere år siden som et medlem av TNF-familien av cytokiner. (Se f. eks. Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995), Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996), WO 97/01633, WO 97/25428, US patentskrift 5 763 223 meddelt 9. juni, 1998, US patentskrift nr. 6 284 236 meddelt 4. september 2001). Den native full-lengde sekvensen til humant Apo2L/TRAIL-polypeptid er et 281 aminosyrer langt, Type-II-transmembran protein. Noen celler kan produsere en naturlig, løselig form av polypeptidet ved enzymatisk kløyving av polypeptidets ekstracellulære region (Mariani et al., J. Cell. Biol., 137:221-229 (1997)).

Krystallografiske studier av løselige former av Apo2L/TRAIL avslører en homotrimer struktur som ligner strukturene til TNF og andre beslektede proteiner (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999), Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999), Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999), Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). Apo2L/TRAIL, ulikt andre TNF-familie medlemmer, ble imidlertid funnet å ha en unik, strukturell egenskap i at tre cysteinrester (på posisjon 230 på hver sub-enhet i homotrimeren) sammen koordinerer et sinkatom, og at sinkbindingen er viktig for trimerstabilitet og biologisk aktivitet. (Hymowitz et al., ovenfor, Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).

Det har blitt rapportert i litteraturen at Apo2L/TRAIL også kan spille en rolle i immunsystem modulering, inkludert autoimmune sykdommer slik som reumatoid artritt (se f. eks. Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998), Johnsen et al., cytokine, 11:664-672 (1999), Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999), Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000)).

Løselige former av Apo2L/TRAIL har også blitt rapportert å indusere apoptose i et mangfold av kreftceller, inkludert kolon-, lunge-, bryst-, prostata-, blære-, nyre-, ovarie- og hjernetumorer, så vel som i melanom, leukemi og multippelt myelom (se f. eks. Wiley et al., ovenfor, Pitti et al., ovenfor, US patentskrift nr. 6 030 945 meddelt 29. februar, 2000, US patentskrift nr. 6 746 668 meddelt 8. juni, 2004, Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998), Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999), Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999), Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999), Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999), Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999), Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000), Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000)). In vivo-studier i murine tumormodeller tyder ytterligere på at Apo2L/TRAIL, alene eller i kombinasjon med kjemoterapi eller strålingsterapi, kan utøve vesentlige antitumoreffekter (se f. eks. Ashkenazi et al., ovenfor, Walzcak et al, ovenfor, Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999), Chinnaiyan et al., ovenfor, Roth et al., Biochem.

Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999), PCT-søknad US/00/15512, PCT-søknad US/01/23691). I motsetning til mange typer av kreftceller ser de fleste, normale, humane celletypene ut til å være resistente overfor apoptose-induksjon av visse rekombinante former av Apo2L/TRAIL (Ashkenazi et al., ovenfor, Walzcak et al., ovenfor). Jo et al. har rapportert at en polyhistidin-merket løselig form av Apo2L/TRAIL induserte apoptose in vitro i normale, isolerte, humane, men ikke i ikke-humane, hepatocytter (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000), se også Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000)). Det er antatt at visse rekombinante Apo2L/TRAIL-preparater kan variere i kraft av biokjemiske egenskaper og biologiske aktiviteter på syke versus normale celler, avhengig for eksempel av nærværet eller fraværet av et merke-molekyl, sink innhold og % trimer innhold (se Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001), Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001)).

Apo2L/TRAIL har blitt funnet å binde til minst fem forskjellige reseptorer. Minst to av reseptorene som binder til Apo2L/TRAIL inneholder et funksjonelt cytoplasmisk dødsdomene. Én slik reseptor har blitt referert til som ”DR4” (og alternativt som TR4 eller TRAILR1) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997), se også WO 98/32856 publisert 30. juli 1998, WO 99/37684 publisert 29. juli 1999, WO 00/73349 publisert 7. desember 2000, US 6 433 147 meddelt 13. august 2002, US 6 461 823 meddelt 8. oktober, 2002 og

US 6 342 383 meddelt 29. januar 2002).

En annen slik reseptor for Apo2L/TRAIL har blitt referert til som DR5 (den har også alternativt blitt referert til som Apo-2, TRAIL-R eller TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 eller KILLER) (se f. eks. Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), WO 98/51793 publisert 19. november, 1998, WO 98/41629 publisert 24. september, 1998, Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997), Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997), Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997), WO 98/35986 publisert 20. august, 1998, EP 870 827 publisert 14. oktober, 1998,

WO 98/46643 publisert 22. oktober, 1998, WO 99/02653 publisert 21. januar, 1999, WO 99/09165 publisert 25. februar, 1999, WO 99/11791 publisert 11. mars, 1999,

US 2002/0072091 publisert 13. august, 2002, US 2002/0098550 publisert 7. desember 2001, US 6 313 269 meddelt 6. desember, 2001, US 2001/0010924 publisert 2. august, 2001, US 2003/01255540 publisert 3. juli, 2003, US 2002/0160446 publisert 31. oktober, 2002, US 2002/0048785 publisert 25. april, 2002, US 6 342 369 meddelt februar, 2002, US 6 569 642 meddelt 27. mai, 2003, US 6 072 047 meddelt 6. juni, 2000, US 6 642 358 meddelt 4. november, 2003, US 6 743 625 meddelt 1. juni, 2004. Slik som for DR4 er DR5 rapportert å inneholde tre cysteinrike domener på sin ekstracellulære del og et enkelt cytoplasmatisk dødsdomene, og er i stand til å signalisere apoptose ved ligandbinding (eller ved binding av et molekyl slik som et agonist antistoff, som mimikerer aktiviteten til liganden). Krystallstrukturen til komplekset som ble dannet mellom Apo-2L/TRAIL og DR5 er beskrevet i Hymowitz et al., Molecular Cell, 4:563-571 (1999).

Ved ligand binding kan både DR4 og DR5 uavhengig utløse apoptose ved å rekruttere og aktivere apoptose-initiatoren kaspase-8, via det dødsdomene-inneholdende adaptor-molekylet som er referert til som FADD/Mort1 (Kischkel et al., Immunity, 12:611-620 (2000), Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000), Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)). Spesielt signaliserer DR5 apoptose ved «celle-ekstrinsik»-veien som er uavhengig av p53-tumorsuppressor genet (Ashkenazi og Dixit, Science, 281:1305-8 (1998), Ashkenazi, Nat. Rev. Cancer, 2:420-30 (2002)). Aktivering av denne veien involverer raiddannelse av et døds-induserende signalkompleks (DISC) på den aktiverte reseptorens cytoplasmatiske dødsdomene. Først bindes adaptor-molekylet FADD til DR5 gjennom homofil dødsdomene interaksjon (Kischkel et al., ovenfor, Sprick et al., ovenfor, Bodmer et al., ovenfor). Deretter rekrutterer FADD de apoptose-initierende proteasene kaspase-8 og kaspase-10, og medierer deres aktivering ved indusert proksimitet. Kaspase-9 og kaspase-10 gjennomgår selvprosessering og frigjør løselige, aktive kaspase-subenheter inn i cytoplasma, der de settes sammen og kløyver effektor-kaspaser, slik som kaspase-3 og kaspase-7. Kløyving fører til aktivering av effektor-kaspasene, som utfører det apoptotiske celleprogrammet (Thornberry og Lazebnik, Science, 281:1312-6 (1998)).

Apo2L/TRAIL har blitt rapportert å også binde de reseptorene som er referert til som DcR1, DcR2 og OPG, som er omtalt å virke som inhibitorer, heller enn overførere av signalisering (se f. eks. DCR1 (også referert til som TRID, LIT eller TRAIL-R3) (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997), Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997), Schneider et al., FEBS Letters, 416:329-334 (1997), Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997) og Mongkolaspaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998), DCR2 (også kalt TRUNDD eller TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997), Pan et al., BEFS Letters, 424:41-45 (1998), Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997) og OPG (Simonet et al., ovenfor). I motsetning til DR4 og DR5 signaliserer ikke DcR1- og DcR2-reseptorene apoptose.

Visse antistoffer som binder til DR4- og/eller DR5-reseptorene har blitt rapportert i litteraturen. For eksempel er anti-DR4-antistoffer som er rettet mot DR4-reseptoren og som har agonistisk eller apoptotisk aktivitet i visse pattedyrceller er beskrevet i f. eks.

WO 99/37684 publisert 29. juli, 1999, WO 00/73349 publisert 12. juli, 2000,

WO 03/066661 publisert 14. august, 2003. Se også f. eks. Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999), Chunmtharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001), WO 02/097033 publisert 2. desember, 2002, WO 03/042367 publisert 22. mai, 2003, WO 03/038043 publisert 8. mai, 2003, WO 03/037913 publisert 8. mai, 2003. Visse anti-DR5-antistoffer har likeledes blitt beskrevet, se f. eks. WO 98/51793 publisert 8. november, 1998, Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999), Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001), Hylander et al., ”An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patients Derived Grastrointestinal Tumors Grown in SCID mice”, Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, 29. august - 1. September, 2002, Banff, Alberta, Canada: WO 03/038043 publisert 8. mai, 2003, WO 03/037913 publisert 8. mai, 2003. I tillegg har visse antistoffer som har kryssreaktivitet med både DR4- og DR5-reseptorer blitt beskrevet (se f.eks. US patentskrift nr. 6 252 050, meddelt 26. juni, 2001).

Oppsummering av oppfinnelsen

I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et anti-DR5-antistoff som omfatter mutasjoner i den tunge og lettekjeden til full-lengde antistoff 16E2 som henholdsvis vist i Sekv. id. nr. 11 og 13 eller et fragment derav, hvor

nevnte antistoff eller antistoff-fragment har en større affinitet for DR5 enn fulllengde antistoffet 16E2 og er istand til a aktivere eller stimulere apoptose i kreftceller; og mutasjonene omfatter

(i) et sett av tung kjede mutasjoner valgt fra gruppen som består av (i) N53Q, L102Y, (ii) M34L, N53Q, L102Y, (iii) N53Y, L102Y, (iv) M34L, N53Y, L102Y, (v) G33A, N53Q, L102Y, (vi) M34L, N53Y, L102Y, (vii) G33A, N53Q, L102Y, (viii) G33A, N53Y, L102Y, (ix) T28A, N53Q, L102Y og (x) T28A, N53Y, L102Y i aminosyresekvensen med Sekv. id. nr. 11, og

(ii) et sett av lett kjede mutasjoner valgt fra gruppen som består av (i) Q24S, G50K, K51D, H95bY, (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y og (iii) Q24S, K51A, R91A i aminosyresekvensen med Sekv. id. nr. 13

I nok en annen utførelsesform omfatter anti-DR5-antistoffet en rammeverksmutasjon som er valgt fra gruppen som består av Q6E, V11L, E12V, R13Q og K105Q.

I en ytterligere utførelsesform omfatter anti-DR5-antistoffet alle rammeverksmutasjoner Q6E, V11L, E12V, R13Q og K105Q.

I en spesiell utførelsesform omfatter anti-DR5-antistoffet de følgende mutasjonene: G33A, N53Q, L102Y i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 11 og Q24S, K51A, R91A i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 13, og kan ytterligere omfatte minst én rammeverksmutasjon, som kan for eksempel være minst én av restene 6, 11, 12, 13 og 105 i Sekv. id. nr. 11.

Eksempler på anti-DR5-antistoff er vist nedenfor og valgt fra gruppen som består av Apomabs 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.3, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 og 9.3.

Ytterliger eksempler på anti-DR5-antistoff er vist nedenfor og valgt fra gruppen som består av Apomab 5.2, 5.3, 6.2, 6.3, 7.2, 7.3, 8.3 og 25.3.

I nok et annet spesielt eksempel er anti-DR5-antistoffet Apomab 7.3 eller Apomab 8.3, spesielt Apomab 7.3.

I nok en ytterligere utførelsesform er anti-DR5-antistoffet et antistoff-fragment som kan være valgt fra gruppen som består av Fab, Fab’, F(ab’)2 og Fv-fragmenter, diastoffer, enkeltkjede antistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer som er dannet fra antistofffragmenter.

I en andre utførelsesformer kan antistoffet være et enkeltkjede antistoff.

Anti-DR5-antistoffene kan, for eksempel, ha anti-kreftaktivitet, for eksempel slik at de kan inneha evnen til å aktivere eller stimulere apoptose i kreftceller.

Krefttypene inkluderer for eksempel karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi.

Mer spesifikke eksempler på krefttyper inkluderer skvamøs cellekreft, småcellet lungekreft, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), non-Hodgkins lymfom, blastom, gastrointestinalkreft, nyrekreft, ovariekreft, leverkreft, magekreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, kolonkreft, kolorektalkreft, pankreaskreft, endometriumkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, leverkreft, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, hepatisk karsinom og hode- og nakkekreft.

Spesielle grupper av kreft inkluderer lungekreft (f. eks. ikke-småcellet lungekarsinom – NSCLC), eller adenokarsinom, som for eksempel kan være kolorektalt, pankreatisk eller metastatisk adenokarsinom. Hematologiske kreftformer er også inkludert.

Kimære, humaniserte og humane antistoffer ligger innenfor omfanget her, og det er også antistoffer som medierer antistoffavhengig, cellulær cytotoksisitet (ADCC).

I en foretrukket utførelsesform omfatter anti-DR5-antistoffet Apomab 7.3 eller Apomab 8.3, eller et fragment derav.

Antistoffene kan foreligge i en dimer form og/eller i en form som er kryssbundet for eksempel med en anti-human IgG-Fc-region.

I en annen utførelsesform er anti-DR5-antistoffene her fusjonert til en epitop merkesekvens.

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et kimært molekyl som omfatter et anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment her, fusjonert til en heterolog aminosyresekvens, der den heterologe aminosyresekvensen for eksempel kan omfatte en immunglobulinsekvens, slik som en anti-human IgG-Fc-region.

I nok et annet aspekt vedrører oppfinnelsen isolerte nukleinsyremolekyler som koder for anti-DR5-antistoffene eller antistoff-fragmentene her, vektorer som omfatter slike nukleinsyremolekyler, vertsceller som omfatter slike nukleinsyremolekyler og fremgangsmåter for å fremstille antistoffer og antistoff-fragmenter her.

Oppfinnelsen vedrører ytterligere en sammensetning som omfatter et anti-DR5-antistoff som definert her ovenfor, og en bærer.

Bæreren kan være en farmasøytisk akseptabel bærer, og sammensetningen kan ytterligere omfatte et ytterligere antikreftmiddel og/eller et ytterligere anti-DR5-antistoff.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ex vivo fremgangsmåte for å indusere apoptose som omfatter å eksponere pattedyrkreftceller for et anti-DR5-antistoff som definert her, eller et fragment derav.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anvendelsen av et anti-DR5 antistoff, som definert her, eller et fragment derav, til fremstilling av et medikament of a behandle kreft i et pattedyrindivid.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser nukleotidsekvensen til humant Apo-2-ligand cDNA (Sekv. id. nr. 2) og dens avledede aminosyresekvens (Sekv. id. nr. 1). ”N” på nukleotidposisjon 447 (i Sekv. id. nr. 2) ble benyttet for å indikere at nukleotidbasen kan være en ”T” eller ”G”.

Figurene 2A-2C viser nukleotidsekvensen til et cDNA (Sekv. id. nr. 4) for human DR4-full-lengdereseptor og dens avledede aminosyresekvens (Sekv. id. nr. 3). De respektive nukleotid- og aminosyresekvensene for human DR4-reseptor er også rapportert i Pan et al., Science, 276:111 (1997).

Figurene 3A-3C viser sekvensen på 411 aminosyrer for human DR5-reseptor (Sekv. id. nr. 5) slik den er publisert i WO 98/51793 den 19. november, 1998, og den kodende nukleotidsekvensen (Sekv. id. nr. 6).

Figurene 4A-4C viser sekvensen på 440 aminosyrer for human DR5 (Sekv. id. nr. 7) og den kodende nukleotidsekvensen (Sekv. id. nr. 8), slik den er publisert i WO 98/35986 den 20. august, 1998.

Figur 5 viser nukleotidsekvensen til enkeltkjede anti-DR5-antistoff 16E2 (16E2-scFv) (Sekv. id. nr. 9).

Figur 6 viser aminosyresekvensen til enkeltkjede-anti-DR5-antistoff 16E2 (16E2-scFv) (Sekv. id. nr. 10), der signalsekvensen og tungkjede- og lettkjede-CDR er vist.

Figur 7 viser aminosyresekvensen til 16E2-full-lengde antistofftungkjede (Sekv. id. nr. 11).

Figur 8 viser nukleotidsekvensen til 16E2-full-lengde antistofftungkjede (Sekv. id. nr. 12).

Figur 9 viser aminosyresekvensen til 16E2-full-lengde antistofflettkjede (Sekv. id. nr. 13).

Figur 10 viser nukleotidsekvensen til 6E2-full-lengde antistofflettkjede (Sekv. id. nr.

14).

Figurene 11A og B viser sekvensen til plasmid pDR1 (Sekv. id. nr. 15, 5391 bp) for ekspresjon av immunglobulin lettkjede. pDR1 inneholder sekvenser som koder for et irrelevant antistoff, lettkjeden til et humanisert anti-CD3-antistoff (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)), startkodon og stoppkodon som er indikert i fet skrift og understreket.

Figurene 12A og B viser sekvensen til plasmid pDR2 (Sekv. id. nr. 16) for ekspresjon av immunglobulin tungkjede. pDR2 inneholder sekvenser som koder for et irrelevant antistoff, tungkjeden for et humanisert anti-CD3-antistoff (Shalaby et al., ovenfor), startkodon og stoppkodon som er indikert i fet skrift og understreket.

Figur 13 viser tungkjede nukleotidsekvensen for Apomab 7.3 (Sekv. id. nr. 17). Figur 14 viser tungkjede nukleotidsekvensen for Apomab 7.3 (Sekv. id. nr. 18). Figur 15 viser lettkjede nukleotidsekvensen for Apomab 7.3 (Sekv. id. nr. 19). Figur 16 viser lettkjede nukleotidsekvensen for Apomab 7.3 (Sekv. id. nr. 20). Figurene 17A og B viser sammenstillingen av tungkjedene til 16E2 og Apomab 7.3. Figur 18 viser sammenstillingen av lettkjedene til 16E2 og Apomab 7.3.

Figur 19 er en homologimodell for tungkjeden til anti-DR5-antistoffet.

Figur 20 er en homologimodell for lettkjeden til anti-DR5-antistoffet.

Figur 21 viser antikreftaktiviteten til en enkelt intraperitoneal (IP) dose av Apomabs 5.3, 6.3 og 8.3 sammenlignet med 16E2-full-lengdeantistoffet (versjon 1) i Colo 205-xenograft atymisk nakenmusmodell for human kolonkreft.

Figur 22 viser antikreftaktiviteten av en enkelt IP-dose av Apomabs 5.2, 6.2, 5.3, 7.2 og 7.3 sammenlignet med 16E2-full-lengdeantistoffet (versjon 1) i Colo 205-xenograft atymisk nakenmusmodell for human kolonkreft.

Figur 23 viser antikreftaktiviteten av en enkelt IP-dose av Apomabs 5.2, 7.3 og 8.3 sammenlignet med 16E2-full-lengdeantistoffet (versjon 1) i Colo 205-xenograft atymisk nakenmusmodell for human kolonkreft.

Figur 24 viser antikreftaktiviteten av Apomabs 23.3 og 25.3 sammenlignet med Apomab 7.3 i Colo 205-xenograft atymisk nakenmusmodell for human kolonkreft.

Figur 25 viser antikreftaktiviteten av Apomabs 7.3 som er avledet fra en stabil cellelinje i forhold til en transient cellelinje i Colo 205-xenograft atymisk nakenmusmodell for human kolonkreft.

Figur 26 viser antikreftaktiviteten av Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med CPT-11 i en HCT15-xenograftmodell for lungekreft.

Figur 27 viser antikreftaktiviteten av Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med CPT-11 i en LS180-xenograftmodell for humant sarkom.

Figur 38 viser antigenkreftaktiviteten av Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med RITUXAN (rituximab) i en BJAB-xenograft-CB17-ICR-SCID-musemodell for non-Hodgkins lymfom.

Figur 29 viser antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med gemcitabin i en BxPC3-xenograft atymisk nakenmusmodell for humant pankreas adenokarsinom.

Figur 30 viser antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med karboplatin og taksol i en H460-xenograftmodell for human lungekreft.

Figur 31 viser antikreft aktivitet til Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med karboplatin og taksol i H2122-xenograftmodellen for human lungekreft.

Figur 32 viser doseresponskurven for Apomab 7.3 i H2122-xenograftmodellen for human lungekreft.

Figur 33 viser antikreftaktiviteten til Apomab 23.3 og 25.3 sammenlignet med Apomab 7.3 i Colo 205-xenograftmodellen for human kolonkreft.

Figur 34 viser den gjennomsnittlige tumorveksten og Kaplan-Meier-plottet for Apo2L.0 alene, Apomab 7.3 alene og i forskjellige kombinasjoner, mot humane Colo 205-kolonkarsinom xenografter i nakenmus.

Figurene 35 og 36 viser den gjennomsnittlige tumorveksten og Kaplan-Meier plottene for Apo2L.0 alene, Apomab 7.3 alene og i forskjellige kombinasjoner, mot humant SKMES-1 ikke-småcellet lungekarsinom (NSCLC)-celler i en xenograftmodell for atymiske nakenmus.

Figur 37 viser den gjennomsnittlige tumorveksten og Kaplan-Meier-plottet for Apo2L.0 alene, Apomab 7.3 alene og forskjellige kombinasjoner, i den humane Colo 205-kolonkarsinom xenograftmodellen.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesformene

I. Definisjoner

Uttrykkene ”Apo-2 ligand”, ”Apo-2L”, ”Apo2L”, Apo-2 ligand/TRAL” og ”TRAIL” blir her benyttet om hverandre for å referere til en polypeptidsekvens som inkluderer aminosyrerestene 114-281, inkludert, 95-281, inkludert, restene 92-281, inkludert restene 91-281, inkludert restene 41-281, inkludert restene 95-281, inkludert restene 15-281, inkludert, eller restene 1-281, inkludert av aminosyresekvensen vist ifølge Figur 1 (Sekv. id. nr. 1), i tillegg til biologisk aktive fragmenter, delesjonsvarianter, insersjonsvarianter og/eller substitusjonsvarianter av sekvensene ovenfor. I en utførelsesform omfatter polypeptidsekvensen restene 114 til 281 ifølge Figur 1 (Sekv. id. nr. 1). Eventuelt omfatter polypeptidsekvensen restene 92 til 281 eller restene 91 til 281 ifølge Figur 1 (Sekv. id. nr.

1). Apo-2L-polypeptidene kan være kodet for av den native nukleotidsekvensen vist ifølge Figur 1 (Sekv. id. nr. 2). Eventuelt kan kodonet som koder for resten 219 (Figur 1, Sekv. id. nr. 2) være ”CCT” eller ”CCG”. Eventuelt er fragmentene eller variantene biologisk aktive og har minst omtrent 80 % aminosyresekvensidentitet, eller minst omtrent 90 % sekvensidentitet, eller minst 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % sekvensidentitet med enhver av sekvensene ovenfor. Definisjonen omfatter substitusjonsvarianter av Apo-2-ligand der minst én av dens native aminosyrer er substituert med en annen aminosyre slik som en alaninresidie. Definisjonen omfatter også en nativ sekvens Apo-2-ligand som er isolert fra en Apo-2-ligandkilde eller fremstilt ved hjelp av rekombinante fremgangsmåter og/eller syntesefremgangsmåter. Apo-2-liganden ifølge oppfinnelsen inkluderer polypeptidene som er referert til som Apo-2-ligand eller TRAIL som er tilkjennegjort i

WO 97/01633, publisert 16. januar, 1997, WO 97/25428, publisert 17. juli, 1997,

WO 99/36535, publisert 22. juli, 1999, WO 01/00832, publisert 4. januar, 2001,

WO 02/09755, publisert 7. februar, 2002, WO 00/75191, publisert 14. desember, 2000 og US patentskrift nr. 6 030 945, meddelt 29. februar, 2000. Uttrykkene blir benyttet for å referere generelt til former av Apo-2-liganden som inkluderer monomerformer, dimerformer, trimerformer, heksamerformer eller høyere oligomere former av polypeptidet. All nummerering av aminosyrerester som er referert til i Apo-2L-sekvensen benytter nummereringen ifølge Figur 1 (Sekv. id. nr. 1), hvis ikke annet spesifikt er gitt.

”Apo-2-ligandreseptor” inkluderer reseptorene som på fagområdet er referert til som ”DR4” og ”DR5”, hvis polynukleotid- og polypeptidsekvenser er vist ifølge Figurene 2A-2C (Sekv. id. nr. 4 og 3) og 3A-3C (Sekv. id. nr. 6 og 5). Pan et al. har beskrevet TNF-reseptorfamilimedlemmet som er referert til som ”DR4” (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997), se også WO 98/32856, publisert 30. juli, 1998, WO 99/37684, publisert 29. juli, 1999, WO 00/73349, publisert 7. desember, 2000, US 6 433 147, meddelt 13. august, 2002, US patentskrift 6 461 823, meddelt 8. oktober, 2002 og US patentskrift 6 342 383, meddelt 29. januar, 2002). Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) og Pan et al., Science, 277:815-818 (1997) beskriver en annen reseptor for Apo2L/TRAIL (se også WO 98/51793, publisert 19. november, 1998, WO 98/41629, publisert 24. september, 1998). Denne reseptoren blir referert til som DR5 (reseptoren har også blitt alternativt referert til som Apo-2, TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 eller KILLER, Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997), Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997), Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997), WO 98/35986, publisert 20. august, 1998, EP 870 827, publisert 14. oktober, 1998, WO 98/46643, publisert 22. oktober, 1998, WO 99/02653, publisert 21. januar, 1999, WO 99/09165, publisert 25. februar, 1999, WO 99/11791, publisert 11. mars, 1999, US 2002/0072091, publisert 13. august, 2002, US 2002/0098550, publisert 7. desember, 2001, US 6 313 269, meddelt 6. desember, 2001, US 2001/0010924, publisert 2. august 2001, US 2003/0125540, publisert 3. juli, 2003, US 2002/0160446, publisert 31. oktober, 2002, US 2002/0048785, publisert 25. april, 2002, US 6 569 642, meddelt 27. mai, 2003, US 6 072 047, meddelt 6. juni, 2002, US 6 642 358, meddelt 4. november, 2003). Som beskrevet ovenfor inkluderer andre reseptorer for Apo-2L DcR1, DcR2 og OPG (se Sheridan et al, ovenfor, Marsters et al, ovenfor og Simonet et al., ovenfor). Uttrykket ”Apo-2L-reseptor” omfatter når de blir benyttet her nativ sekvensreseptor og reseptorvarianter. Disse uttrykkene omfatter Apo-2L-reseptor uttrykt i en mengde pattedyr, inkludert mennesker. Apo-2L-reseptor kan bli endogent uttrykt slik det forekommer naturlig i en mengde, humane vevslinjer, eller kan bli uttrykt ved hjelp av rekombinante fremgangsmåter eller syntesefremgangsmåter. En ”nativsekvens-Apo-2L-reseptor” omfatter et polypeptid som har den samme aminosyresekvensen som en Apo-2L-reseptor som er avledet fra naturen. En nativsekvens-Apo-2L-reseptor kan slik ha aminosyresekvensen til naturlig forekommende Apo-2L-resepto fra ethvert pattedyr, inkludert mennesker. En slik nativsekvens-Apo-2L-reseptor kan bli isolert fra naturen eller kan bli fremstilt rekombinant eller syntetisk. Uttrykket ”nativsekvens-Apo-2L-reseptor” omfatter spesifikt naturlig forekommende trunkerte eller utskilte former av reseptoren (f. eks. en løselig form som for eksempel inneholder en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende variantformer (f. eks. alternativt spleisede former) og naturlig forekommende allelvarianter. Reseptorvarianter kan inkludere fragmenter eller delesjonsmutanter av nativsekvens-Apo-2L-reseptoren. Figurene 3A-3C viser sekvensen på 411 aminosyrer til human DR5 slik den er publisert i WO 98/51793 den 19. november, 1998. En transkripsjons spleisevariant av human DR5 er kjent på fagområdet. Denne DR5-spleisevarianten koder for sekvensen på 440 aminosyrer til human DR5 slik den vist i Figurene 4A-4C, sammen med dens nukleotidsekvens (Sekv. id. nr. 7 og 8) og slik det er publisert i WO 98/35986 den 20. august, 1998.

”Dødsreseptor antistoff” blir her benyttet for å referere generelt til antistoff eller antistoffer som er rettet mot en reseptor i tumor nekrose faktor superfamilien og som inneholder et dødt domene som er i stand til å signalisere apoptose, og slike antistoffer inkluderer DR5-antistoff og DR4-antistoff.

”DR5-reseptorantistoff”, ”DR5-antistoff” eller ”anti-DR5-antistoff” blir benyttet i en bred betydning for å referere til antistoffer som binder til minst én form av en DR5-reseptor eller ekstracellulærdomene derav. Eventuelt er DR5-antsitoffet fusjonert eller bundet til en heterolog sekvens eller molekyl. Den heterologe sekvensen muliggjør eller hjelper antistoffet fortrinnsvis til å danne høyere ordens eller oligomere komplekser. Eventuelt binder DR5-antistoffet til DR5-reseptor, men binder ikke eller kryssreagerer ikke med noen ytterligere Apo-2L-reseptor (f. eks. DR4, DcR1 eller DcR2). Eventuelt er antistoffet en agonist for DR5-signaliseringsaktiviteter. Uttrykket ”anti-DR5-antistoff” og dets grammatikalske ekvivalenter omfatter spesifikt antistoffene som er beskrevet i eksemplene, inkludert ”Apomab-antistoffene” som er fremlagt i Tabellene 11 og 12, slik som for eksempel Apomab-typene 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.3, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 og 9.3, fortrinnsvis Apomab 7.3.

Eventuelt binder DR5-antistoffet ifølge oppfinnelsen til en DR5-reseptor ved et konsentrasjonsområde på omtrent 0,1 nM til omtrent 20 mM, slik dette er målt i en BIAcore-bindingsanalyse. Eventuelt oppviser DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen en IC50-verdi på omtrent 0,6 nM til omtrent 18 mM slik dette er målt i en BIAcore-bindingsanalyse.

”DR4-reseptorantistoff”, ”DR4-antistoff” eller ”anti-DR4-antistoff” blir benyttet i en bred betydning for å referere til antistoffer som binder minst én form av en DR4-reseptor eller ekstracellulærdomene derav. Eventuelt er DR4-antsitoffet fusjonert til eller bundet til en heterolog sekvens eller molekyl. Den heterologe sekvensen tillater antistoffet eller hjelper antistoffet fortrinnsvis til å danne høyere ordens- eller oligomere komplekser. DR4-antistoffet binder eventuelt til DR4-reseptor, men binder ikke til eller kryssreagerer ikke med noen ytterligere Apo-2L-reseptor (f. eks. DR5, DcR1 eller DcR2). Eventuelt er antistoffet en agonist av DR4-signaliseringsaktivitet.

DR4-antistoffet binder eventuelt til en DR4-reseptor ved et konsentrasjonsområde på omtrent 0,1 nM til omrent 20 mM slik dette er målt i en BIAcore-bindingsanalyse. DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen oppviser eventuelt en IC50-verdi på omtrent 0,6 nM til omtrent 18 mM, slik dette er målt i en BIAcore-bindingsanalyse.

Uttrykket ”agonist” blir benyttet i sin bredeste betydning, og inkluderer ethvert molekyl som delvis eller fullstendig forsterker, stimulerer eller aktiverer en eller flere biologiske aktiviteter for Apo2L/TRAIL, DR4 eller DR5, in vitro, in situ eller in vivo.

Eksempler på slike biologiske aktivitetsbindinger av Apo2L/TRAIL til DR4 eller DR5 inkluderer apoptose i tillegg til de som ytterligere er rapportert i litteraturen. En agonist kan virke på en direkte eller indirekte måte. Agonisten kan for eksempel virke slik at den delvis eller fullstendig forsterker, stimulerer eller aktiverer en eller flere biologiske aktiviteter for DR4 eller DR5, in vitro, in situ eller in vivo som et resultat av dens direkte binding til DR4 eller DR5, som forårsaker reseptoraktivering eller signaloverføring.

Agonisten kan også virke indirekte for delvis eller fullstendig å forsterke, stimulere eller aktivere en eller flere biologiske aktiviteter for DR4 eller DR5 in vitro, in situ eller in vivo, som et resultat av for eksempel stimulering av et annet effektormolekyl som deretter forårsaker DR4- eller DR5-aktivering eller signaloverføring. Det er omfattet at en agonist kan virke som et forsterkende molekyl som virker indirekte for å forsterke eller øke DR4-eller DR5-aktivering eller –aktivitet. Agonisten kan for eksempel forsterke aktivitet for endogent Apo-2L i et pattedyr. Dette kan for eksempel bli oppnådd ved å danne forhåndskomplekser av DR4 eller DR5 eller ved å stabilisere komplekser av den respektive liganden med DR4- eller DR5-reseptor (slik som stabilisering av nativt kompleks dannet mellom Apo-2L og DR4 eller DR5).

Uttrykket ”ekstracellulærdomene” eller ”ECD” refererer til en form av ligand eller reseptor som essensielt er fri for transmembran- og cytoplasmadomener. Den løselige ECD vil ordinært ha mindre enn 1 % av slike transmembran- eller cytoplasmadomener, og vil fortrinnsvis ha mindre enn 0,5 % av slike domener.

Uttrykket ”epitopmerket” refererer når det blir benyttet her til et kimært polypeptid som omfatter et protein slik som Apo-2-ligand eller DR5-reseptor, eller en del derav eller et antistoff som binder en slik ligand eller reseptor, fusjonert til et ”merkepolypeptid”.

Merkepolypeptidet har nok rester til å tilveiebringe en epitop mot hvilken et antistoff kan bli fremstilt, men samtidig kort nok slik at det ikke påvirker aktivitet for liganden eller reseptoren. Merkepolypeptidet er fortrinnsvis også ganske unikt slik at antistoffet ikke vesentlig kryssreagerer med andre epitoper. Passende merkepolypeptider har vanligvis minst seks aminosyrerester og vanligvis mellom omtrent 8 til omtrent 50 aminosyrerester (fortrinnsvis mellom omtrent 10 til omtrent 20 rester).

”Isolert” betyr når det blir benyttet for å beskrive de forskjellige proteiner som er blitt tilkjennegjort her, protein som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en komponent i dets naturlige miljø. Kontaminerende komponenter i dets naturlige miljø er materialer som typisk vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av proteinet, og kan inkludere enzymer, hormoner og andre proteininneholdende eller ikkeproteininneholdende oppløsende midler. I foretrukne utførelsesformer vil proteinet være renset (1) til en grad som er tilstrekkelig til å oppnå minst 15 rester med N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av en spinning-cup-sekvenator eller (2) til homogenitet ved hjelp av SDS-PAGE eller ikke-reduserende eller reduserende betingelser ved å benytte Coomassie-blåfarging eller fortrinnsvis sølvfarging. Isolert protein inkluderer protein in situ innenfor rekombinante celler, siden minst én komponent fra det naturlige miljøet til Apo-2-ligand ikke vil være tilstede. Isolert protein vil ordinært likevel bli fremstilt ved hjelp av minst et rensetrinn.

”Prosent (%) aminosyresekvensidentitet”, med hensyn på sekvensene som er identifisert her, blir definert som prosentandelen av aminosyrerester i en kandidatsekvens som er identiske med aminosyrerestene i den sammenlignende ligand-, -reseptor eller antistoffsekvensen, etter å ha sammenstilt sekvensene og innført åpninger, hvis nødvendig, for å oppnå den maksimale, prosentvise sekvensidentiteten, og uten å overveie noen konservative substitusjoner som en del av sekvensidentiteten. Sammenstilling for formålet av å bestemme prosentvis aminosyresekvensidentitet kan bli oppnådd på forskjellige måter som ligger innenfor kunnskapen på fagområdet og som kan bestemme passende parametere for å måle sammenstilling, inkludert tilordning av algoritmer som kan bli anvendt for å oppnå maksimal sammenstilling over full-lengdesekvensen som ble sammenlignet. For formål her, kan prosentvise aminosyre identitetsverdier bli fremskaffet ved å benytte sekvenssammenligningsdataprogrammet ALIGN-2, som ble skrevet av Genentech, Inc. og kildekoden til dette programmet har blitt innsendt med brukerdokumentasjon til the US Copyright Office, Washington, DC, 20559, registrert under US Copyright Registration nr. TXU510087. ALIGN-2-programmet er allment tilgjengelig via Genentech, Inc., South San Francisco, CA. Alle sekvens-sammenligningsparametere er satt i ALIGN-2-programmet og varierer ikke. Prosentvis aminosyresekvens identitet blir deretter beregnet relativt i forhold til den lengre sekvensen. Selv om den kortere sekvensen er fullstendig inkludert i den lengre sekvensen, vil dermed sekvensidentiteten være mindre enn 100 %.

Uttrykket ”kontrollsekvenser” refererer til DNA-sekvenser som er nødvendig for ekspresjonen av en opererbart bundet, kodende sekvens i en spesiell vertsorganisme.

Kontrollsekvensene som er passende for prokaryoter inkluderer for eksempel en promotersekvens, eventuelt en operatorsekvens, og et ribosombindingssete. Eukaryote celler er kjent for å benytte promotorer, polyadenyleringssignaler og enhancere.

Nukleinsyrer er ”opererbart bundet” når de blir plassert i et funksjonelt forhold med en annen nukleinsyresekvens. DNA for en presekvens eller en sekretorisk leder er for eksempel opererbart bundet til DNA for et polypeptid hvis det blir uttrykt som et preprotein som deltar i utskillingen av polypeptidet, en promoter eller enhancer er opererbart bundet til en kodende sekvens hvis det påvirker transkripsjonen av sekvensen, eller et ribosombindingssete er opererbart bundet til en kodende sekvens hvis den er posisjonert slik at den fremmer translasjon. ”Opererbart bundet” betyr generelt at DNA-sekvensene som er bundet er kontinuerlige, og i tilfellet for en sekretorisk leder, kontinuerlige og i leseramme. Enhancere behøver likevel ikke å være kontinuerlige. Binding blir oppnådd ved ligering på hensiktsmessige restriksjonsseter. Hvis slike seter ikke eksisterer, blir de syntetiske oligonukleotidadaptorene eller linkere benyttet i overensstemmelse med konvensjonell praksis.

Uttrykket ”polyol” refererer når det blir benyttet her i bred forstand til polyhydriske alkoholforbindelser. Polyoler kan være enhver vannløselig poly(alkylenoksid)-polymer for eksempel, og kan ha en lineær eller forgrenet kjede. Foretrukne polyoler inkluderer de som er substituert på en eller flere hydroksylposisjoner med en kjemisk gruppe, slik som en alkylgruppe som har mellom en og fire karboner. Typisk er polyolen en poly(alkylenglykol), fortrinnsvis poly(etylenglykol) (PEG). Fagfolk på området kjenner likevel til andre polyoler, slik som for eksempel poly(propylenglykol) og polyetylen-polypropylenglykolkopolymerer, som kan bli benyttet ved å benytte teknikkene for konjugering som er beskrevet her for PEG. Polyolene inkluderer de som er velkjente på fagområdet og de som er allment tilgjengelige, slik som fra kommersielt tilgjengelige kilder slik som Nektar Corporation.

Uttrykket ”konjugat” blir her benyttet ifølge sin bredeste definisjon for å bety koblet eller bundet sammen. Molekyler er ”konjugerte” når de virker som eller opererer som om de er koblet sammen.

”Stringens” ved hybridiseringsreaksjoner kan enkelt bli bestemt av fagfolk på området, og er generelt en empirisk beregning som er avhengig av probelengde, vasketemperatur og saltkonsentrasjon. Generelt trenger lengre prober høyere temperaturer for riktig annealing, mens korte prober trenger lavere temperaturer. Hybridisering er generelt avhengig av evnen til denaturert DNA i å anneale på nytt når komplementære tråder er tilstede i et miljø under deres smeltetemperatur. Jo høyere graden av ønsket identitet mellom proben og hybridiserbar sekvens, jo høyere den relative temperaturen som kan bli benyttet. Som et resultat av dette følger det at høyere, relative temperaturer har en tendens til å gjøre reaksjonsbetingelsene mer stringente, mens lavere temperaturer gjør dette i mindre monn. For ytterligere detaljer og forklaring av stringens i hybridiseringsreaksjoner, se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

”Stringente betingelser” eller ”høyt stringente betingelser”, slik de er definert her, er identifisert ved de betingelsene som: (1) benytter lav ionestyrke og høy temperatur til vasking, for eksempel 0,015 M natriumklorid/0,0015 M natriumcitrat/0,1 % natriumdodecylsulfat ved 50<o>C, (2) i løpet av hybridisering benytter et denatureringsmiddel, slik som formamid, for eksempel 50 % (v/v) formamid med 0,1 % bovint serumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfatbuffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumcitrat ved 42<o>C, eller (3) benytter 50 % formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 mM natriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat, 5 x Denhardts løsning, sonikert laksesperma-DNA (50 μg/ml), 0,1 % SDS og 10 % dekstransulfat ved 42<o>C, med vaskinger ved 42<o>C i 0,2 x SSC (natriumklorid/natriumcitrat) og 50 % formamid ved 55<o>C, etterfulgt av en høystringent vasking som består av 0,1 x SSC inneholdende EDTA ved 55<o>C.

”Moderat stringente betingelser” er identifisert som beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, og inkluderer anvendelsen av vaskeløsning og hybridiseringsbetingelser (f. eks. temperatur, ionestyrke og % SDS) som er mindre stringente enn de som er beskrevet ovenfor. Et eksempel på moderat stringente betingelser er overnatt inkubering ved 37<o>C i en løsning som omfatter: 20 % formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6), 5 x Denhardts løsning, 10 % dekstransulfat og 20 mg/ml denaturert, oppbrutt laksesperma-DNA, etterfulgt av vasking av filtrene i 1x SSC ved omtrent 37-50<o>C. Fagfolk på området vil være kjent med hvordan man kan justere temperatur, ionestyrke osv., slik dette er nødvendig for å tilpasse faktorer slik som probelengde og lignende.

Uttrykkene ”aminosyre” og ”aminosyrer” refererer til alle naturlig forekommende L-alfa-aminosyrer. Denne definisjonen er ment å skulle inkludere norleucin, ornitin og homocystein. Aminosyrene blir identifisert ved enten enkeltbokstavsbetegnelser eller trebokstavsbetegnelser:

Asp D asparaginsyre Ile I isoleucin

Thr T treonin Leu L leucin

Ser S serin Tyr Y tyrosin

Glu E glutaminsyre Phe F fenylalanin

Pro P prolin His H histidin

Gly G glycin Lys K lysin

Ala A alanin Arg R arginin

Cys C cystein Trp W tryptofan

Val V valin Gln Q glutamin

Met M metionin Asn N asparagin

I figurene kan visse andre enkeltbokstavsbetegnelser eller trebokstavsbetegnelser bli benyttet for å referere til og identifisere to eller flere aminosyrer eller nukleotider på en gitt posisjon i sekvensen.

Uttrykket ”antistoff” blir benyttet i den bredeste betydningen og dekker spesifikt enkelte, monoklonale anti-DR5-antistoffer (inkludert agonistantistoffer, antagonist antistoffer og nøytraliserende eller blokkerende antistoffer), og anti-DR5-antistoffpreparater med polyepitopspesifisitet. ”Antistoff” inkluderer slik det blir benyttet her, intakt immunglobulin eller antistoffmolekyler, polyklonale antistoffer, multispesifikke antistoffer (dvs. bispesifikke antistoffer som er dannet fra minst to intakte antistoffer) og immunglobulinfragmenter (slik som Fab, F(ab’)2 eller Fv) så lenge de oppviser enhver av de ønskede agonistiske eller antagonistiske egenskaper som er beskrevet her.

Antistoffer er typisk proteiner eller polypeptider som oppviser bindingsspesifisitet til et spesifikt antigen. Native antistoffer er vanligvis heterotetramere glykoproteiner som er sammensatt av to identiske lettkjeder (L) og to identiske tungkjeder (H). Typisk er hver lettkjede bundet til en tungkjede ved hjelp av en kovalent disulfidbinding, mens antallet disulfidbindinger varierer mellom tungkjedene i forskjellige immunglobulin isotyper. Hver tungkjede og lettkjede har også jevnt fordelte intrakjededisulfidbroer. Hver tungkjede har på en ende et variabeldomene (VH) etterfulgt av et antall konstantdomener. Hver lettkjede har et variabeldomene på en ende (VL) og et konstantdomene på den andre enden, der konstantdomenet på lettkjeden er sammenstilt med det første konstantdomenet på tungkjeden, og lettkjedevariabeldomenet er sammenstilt med variabeldomenet på tungkjeden. Spesielle aminosyrerester er antatt å danne en grenseflate mellom en lettkjede- og tungkjede variabeldomene (Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985), Novotny og Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 (1985)). Lettkjedene på antistoffer fra enhver virveldyrart kan bli tilordnet i en av to klart forskjellige typer, kalt kappa og lambda, basert på aminosyresekvensen til deres konstantdomener. Avhengig av aminosyresekvensen til konstantdomenet på deres tungkjeder, kan immunglobuliner bli tilordnet til forskjellige klasser. Det foreligger fem hovedklasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM, og flere av disse kan ytterligere bli delt i underklasser (isotyper), for eksempel IgG-1, IgG-2, IgG-3 og IgG-4, IgA-1 og IgA-2. Tungkjede konstantdomener som tilsvarer de forskjellige klassene av immunglobuliner blir henholdsvis kalt alfa, delta, epsilon, gamma og mu.

”Antistoff-fragmenter” omfatter en del av et intakt antistoff, vanligvis den antigenbindende region eller variabelregionen til det intakte antistoffet. Eksempler på antistoff fragmenter inkluderer Fab-, Fab’-, F(ab’)2 og Fv-fragmenter, diastoffer, enkeltkjede antistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer som er dannet fra antistoff-fragmenter.

Uttrykket ”variabel” ble her benyttet for å beskrive visse deler av variabeldomenene som er forskjellig i sekvens blant antistoffer og som ble benyttet i bindingen og spesifisiteten til hvert spesielle antistoff for dens spesielle antigen. Variabiliteten er likevel ikke jevnt fordelt på variabeldomenene til antistoffet. Den er typisk konsentrert i tre segmenter kalt komplementaritetsbestemmende regioner (CDR) eller hypervariable regioner både på lettkjede- og tungkjedevariabeldomener. De mer konserverte delene av variabeldomenet ble kalt rammeverket (FR). Variabeldomenene til native tungkjeder og lettkjeder omfatter hver fire FR-regioner, som hovedsak har tilpasset en β-flatekonfigurasjon, sammenbundet av tre CDRer, som danner løkker som binder, og som i noen tilfeller danner en del av, β-flatestrukturen. CDRene i hver kjede blir holdt tett sammen av FR-regionene og bidrar sammen med CDRene fra den andre kjeden til dannelsen av det antigenbindende setet for antistoffer (se Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)). Konstantdomener er ikke direkte involvert i binding av et antistoff til et antigen, men oppviser forskjellige effektorfunksjoner slik som deltagelse for antistoffet i antistoffavhengig, cellulær toksisitet.

Uttrykket ”monoklonalt antistoff” refererer slik det blir benyttet her til et antistoff som er fremskaffet fra en populasjon av vesentlig homogene antistoffer, dvs. at de individuelle antistoffene som utgjør populasjon er identiske bortsett fra mulige naturlige forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke der de er rettet mot et enkelt antigensete. I motsetning til konvensjonelle (polyklonale) antistoffpreparater som typisk inkluderer forskjellige antistoffer som er rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), så er videre hvert monoklonalt antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet.

De monoklonale antistoffene her inkluderer kimære, hybride og rekombinante antistoffer som er fremstilt ved å spleise et variabeldomene (inkludert hypervariabeldomene) fra et anti-DR5-antistoff med et konstantdomene (f. eks. ”humaniserte” antistoffer), eller en lettkjede med en tungkjede, eller en kjede fra en art med en kjede fra en annen art, eller fusjoner med heterologe proteiner, uavhengig av opphavsarten eller immunglobulinklassen eller –underklassebetegnelsen, i tillegg til antistoff-fragmenter (f. eks. Fab, F(ab’)2 og Fv) så lenge de oppviser de ønskede, biologiske aktivitetene eller egenskapene. Se for eksempel US patentskrift nr. 4 816 567 og Mage et al., in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 79-97 (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987).

“Monoklonal” indikerer slik karakteren til antistoffet som å være fremskaffet fra en vesentlig homogen populasjon av antistoffer, og skal ikke bli ansett som å kreve produksjon av antistoffet ved noen spesiell fremgangsmåte. De monoklonale antistoffene som skal bli benyttet i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse kan for eksempel bli fremstilt ved hjelp av hybridomfremgangsmåten som børst ble beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256:495 (1975), eller det kan bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter slik som beskrevet i US patentskrift nr. 4 816 567. De ”monoklonale antistoffene” kan også bli isolert fra bakteriofagbiblioteker som er generert ved å benytte teknikker som her beskrevet i McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

”Humaniserte” former av ikke-humane (f. eks. murine) antistoffer er spesifikke, kimære immunglobuliner, immunglobulinkjeder eller fragmenter derav (slik som Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 eller andre antigenbindende undersekvenser av antistoffer) som inneholder minimalt med sekvens som er avledet fra ikke-humant immunglobulin. For det meste er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottakerantistoff) der rester fra en komplementaritetsbestemmende region (CDR) fra mottakeren er erstattet med rester fra en CDR fra en ikke-human art (donorantistoff) slik som mus, rotte eller kanin som har den ønskede spesifisiteten, affiniteten og kapasiteten. I noen tilfeller er Fv-rammeverksregion (FR)-rester fra det humane immunglobulinet erstattet med tilsvarende ikke-humane rester. Det humaniserte antistoffet kan ytterligere omfatte rester som verken er funnet i mottagerantistoffet eller i de importerte CDR- eller rammeverkssekvensene. Disse modifiseringene blir gjort for ytterligere å raffinere og optimalisere antistoffutøvelse. Vanligvis vil det humaniserte antistoffet omfatte vesentlig alle av minst ett, og typisk to, variabeldomener, der alle eller vesentlig alle CDR-regioner tilsvarerer de fra et ikke-humant immunglobulin og alle eller vesentlig alle FR-regioner er de fra en human immunglobulin konsensussekvens. Det humaniserte antistoffet vil også optimalt omfatte minst én del av en immunglobulin konstantregion eller -domene (Fc), typisk den fra et humant immunglobulin.

Et ”humant antistoff” er et som omfatter en aminosyresekvens som tilsvarerer sekvensen til et antistoff som er produsert av et menneske og/eller som har blitt fremstilt til å benytte enhver av teknikkene for å fremstille humane antistoffer, som er kjent på fagområdet eller som er tilkjennegjort her. Definisjonen av et humant antistoff inkluderer antistoffer som omfatter minst et humant tungkjede polypeptid eller minst et humant lettkjede polypeptid, for eksempel et antistoff som omfatter murine lettkjede- og humane tungkjede polypeptider. Humane antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte forskjellige teknikker som er kjent på fagområdet. I en utførelsesform er det humane antistoffet valgt fra et bakteriofag bibliotek, der dette bakteriofagbiblioteket uttrykker humane antistoffer (Vaughan et la., Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets et al., PNAS, (USA), 95:6157-6162 (1998)), Hoogenboom og Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Humane antistoffer kan også bli fremstilt ved å introdusere humane immunglobulinlokus inn i transgene dyr, for eksempel mus der de endogene immunglobulingenene delvis eller fullstendig har blitt inaktivert. Ved utfordring blir human antistoffproduksjon observert, som ligner mye på den som ble sett hos mennesker i alle henseender, inkludert genrearrangering, sammensetning og antistoffrepertoar. Denne tilnærmingen er for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 545 807, 5 545 806, 5 569 825, 5 625 126, 5 633 425, 5 661 016, og i de følgende publikasjonene: Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992), Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994), Morrison, Nature, 368:812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996), Lonberg og Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativt kan det humane antistoffet bli fremstilt via udødeliggjøring av humane B-lymfocytter som produserer et antistoff som er rettet mot et målantigen (slike B-lymfocytter kan bli gjenvunnet fra et individ eller kan ha blitt immunisert in vitro). Se for eksempel Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, s. 77 (1985), Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991) og US patentskrift nr. 5 750 373.

Uttrykket ”Fc-region” blir benyttet for å definere den C-terminale regionen på en immunglobulin tungkjede som kan bli generert ved papainfordøying av et intakt antistoff. Fc-regionen kan være en nativsekvens-Fc-region eller en variant-Fc-region. Selv om grensene for Fc-regionen på en immungloublintungkjede kan variere, er den humane IgG-tungkjede-Fc-regionen vanligvis definert til å strekke seg fra en aminosyrerest på en posisjon Cys226, eller fra omtrent posisjon Pro230, til karboksylterminalen på Fc-regionen (ved her å benytte nummereringssystemet ifølge Kabat et al., ovenfor). Fc-regionen på et immunglobulin omfatter generelt to konstantdomener, et CH2-domene og et CH3-domene, og omfatter eventuelt et CH4-domene.

Med ”Fc-regionkjede” er det her ment en av de to polypeptidkjedene på en Fcregion.

”CH2-domenet” fra en human IgG-Fc-region (også referert til som ”C γ2-domene”) strekker seg vanligvis fra en aminosyrerest på omtrent posisjon 231 til en aminosyrerest på omtrent posisjon 340. CH2-domenet er unikt ved at det ikke er nært paret med et annet domene. To N-bundne, forgrenede karbohydratkjeder er heller strukket inn mellom de to CH2-domenene til et intakt, nativt IgG-molekyl. Det har blitt spekulert på om karbohydratet kan tilveiebringe en substitutt for domene-domene-paringen og hjelpe til ved å stabilisere CH2-domenet. Burton, Molec. Immunol., 22:161-206 (1985). CH2-domenet her kan være et nativsekvens-CH2-domene eller variant-CH2-domene.

”CH3-domenet” omfatter strekningen av rester som ligger C-terminalt i forhold til et CH2-domene på en Fc-region (dvs. fra en aminosyrerest på omtrent posisjon 341 til en aminosyrerest på omtrent posisjon 447 på en IgG). CH3-regionen her kan være et nativsekvens-CH3-domene eller et variant-CH3-domene (f. eks. et CH3-domene med en introdusert ”utstikker” i en kjede derav og et tilsvarende, introdusert ”hulrom” i den andre kjeden derav, se US patentskrift nr. 5 821 333). Slike variant-CH3-domener kan bli benyttet for å fremstille multispesifikke (f. eks. bispesifikke) antistoffer som beskrevet her.

”Hengsel-region” er generelt definert som å strekke seg fra omtrent Glu216, eller omtrent Cys226, til omtrent Pro230 til humant IgG1 (Burton, Molec. Immunol., 22:161-206 (1985)). Hengsel-regioner fra andre IgG-isotyper kan bli sammenstilt med IgG1-sekvensen ved å plassere den første og den siste cysteinresidien som danner inter-tungkjede-S-S-bindinger på de samme posisjonene. Hengsel-regionen her kan være en nativ sekvens hengsel-region eller en variant hengsel-region. De to polypeptidkjedene i en variant hengsel-region opprettholder vanligvis minst én cysteinresidie per polypeptidkjede, slik at de to polypeptidkjedene i variant hengsel-regionen kan danne en disulfidbinding mellom de to kjedene. Den foretrukne hengsel-regionen her er en human nativ sekvens hengselregion, for eksempel en human nativsekvens-IgG1-hengsel-region.

En ”funksjonell Fc-region” innehar minst én ”effektorfunksjon” fra en nativ sekvens-Fc-region. Eksempelmessige ”effektorfunksjoner” inkluderer C1q-binding, komplementavhengig cytotoksisitet (CDC), Fc-reseptorbinding, antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflatereseptorer (f. eks. B-celle reseptor, BCR) osv. Slike effektorfunksjoner krever generelt at Fc-regionen er kombinert med et bindingsdomene (f. eks. et antistoff variabeldomene) og kan bli vurdert ved å benytte forskjellige analyser som er kjent på fagområdet for å evaluere slike antistoff effektorfunksjoner.

En ”nativsekvens-Fc-region” omfatter en aminosyresekvens som er identisk med aminosyresekvensen til en Fc-region som er funnet i naturen. En ”variant-Fc-region” omfatter en aminosyresekvens som er forskjellig fra sekvensen til en nativsekvens-Fcregion i kraft av minst én aminosyremodifisering. Variant-Fc-region har fortrinnsvis minst én aminosyresubstitusjon sammenlignet med en nativsekvens-Fc-region eller med Fcregionen til et opphavspolypeptid, for eksempel fra omtrent en til omtrent ti aminosyresubstitusjoner, og fortrinnsvis fra omtrent en til omtrent fem aminosyresubstitusjoner i en nativsekvens-Fc-region eller i Fc-regionen til opphavspolypeptidet. Variant-Fc-regionen her vil fortrinnsvis inneha minst omtrent 80 % sekvensidentitet med en nativsekvens-Fc-region og/eller med en Fc-region fra et opphavspolypeptid, og mest foretrukket minst omtrent 90 % sekvensidentitet med den, mer foretrukket minst omtrent 95 % sekvensidentitet med denne.

”Antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet” og ”ADCC” refererer til en cellemediert reaksjon der ikke-spesifikke, cytotoksiske celler som uttrykker Fc-reseptorer (FcR) (f. eks. naturlige dreperceller (NK)-celler, nøytrofiler og makrofager) gjenkjenner bundet antistoff på en målcelle og deretter forårsaker lysis på målcellen. De primære cellene for å mediere ADCC, NK-celler, uttrykker kun Fc γRIII, mens monocytter uttrykker Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII. FcR-ekspresjon på hematopoietiske celler er oppsummert i Tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). For å undersøke ADCC-aktivitet for et molekyl av interesse, kan en in vitro-ADCC-analyse, slik som den som er beskrevet i US patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337 bli utført. Nyttige effektorceller for slike analyser inkluderer perifere, mononukleære blodceller (PBMC) og naturlige dreperceller (NK)-celler. Alternativt, eller i tillegg, så kan ADCC-aktivitet for molekylet av interesse bli undersøkt in vivo, for eksempel i en dyremodell slik som den som er tilkjennegjort i Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

”Humane effektorceller” er leukocytter som uttrykker en eller flere FcR-typer og som utfører effektorfunksjoner. Cellene uttrykker fortrinnsvis minst Fc γRIII og utfører ADCC-effektorfunksjon. Eksempler på humane leukocytter som medierer ADCC inkluderer perifere, mononukleære blodceller (PBMC), naturlige dreperceller (NK)-celler, monocytter, cytotoksiske T-celler og nøytrofiler, der PBMC og NK-celler er foretrukket. Effektorcellene kan bli isolert fra en nativ kilde derav, for eksempel fra blod eller PBMC som beskrevet her.

Uttrykkene ”Fc-reseptor” og ”FcR” blir benyttet for å beskrive en reseptor som binder til Fc-regionen på et antistoff. Den foretrukne FcR er en human nativsekvens-FcR. En foretrukket FcR er videre en som binder et IgG-antistoff (en gammareseptor) og inkluderer reseptorer av underklassene Fc γRI, Fc γRII og Fc γRIII, inkludert allelvarianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. Fc γRII-reseptorer inkluderer Fc γRIIA (en ”aktiverende reseptor”) og Fc γRIIB (en ”inhiberende reseptor”), som har lignende aminosyresekvenser som primært er forskjellige i cytoplasmadomenet derav. Aktiverende reseptor Fc γRIIA inneholder et immunreseptor tyrosinbasert aktiveringsmotiv (ITAM) på sitt cytoplasmadomene. Inhiberende reseptor Fc γRIIB inneholder et immunreseptor tyrosinbasert inhiberingsmotiv (ITIM) på sitt cytoplasmadomene (gjennomgått i Daëron, Annu. Rev. Immuno., 15:203-234 (1997)). FcR-typer er gjennomgått i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991), Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994) og de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Andre FcR-typer, inkludert de som kommer til å bli identifisert i fremtiden, er omfattet av uttrykket ”FcR” her. Uttrykket inkluderer også neonatal reseptor, FcRn, som har ansvaret for overføringen av IgG fra mor til fosteret (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) og Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)).

”Komplementavhengig cytotoksisitet” og ”CDC” refererer til lyseringen av et mål i nærvær av komplement. Komplementaktiveringsveien blir satt i gang ved bindingen av den første komponenten i komplementsystemet (C1q) til et molekyl (f. eks. et antistoff) i kompleks med et tilhørende antigen. For å undersøke komplementaktivering kan en CDC-analyse, for eksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) bli utført.

Et ”affinitetsmodnet” antistoff er et med en eller flere endringer i en eller flere CDRer derav, som fører til en forbedring i affiniteten til antistoffet for antigen sammenlignet med et opphavsantistoff som ikke innehar disse endringene. Foretrukne, affinitetsmodnede antistoffer vil ha nanomolare eller til og med pikomolare affiniteter for målantigenet.

Affinitetsmodnede antistoffer blir fremstilt ved hjelp av prosedyrer som er kjent på fagområdet. Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992) beskriver affinitetsmodning ved hjelp av VH- og VL-domeneombytting. Tilfeldig mutagenese av CDR- og/eller rammeverksrester er beskrevet av: Barbas et al, Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 91:3809-3813 (1994), Schier et al., Grene, 169:147-155 (1995), Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995), Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995) og Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992).

Uttrykket ”immunspesifikk” slik det blir benyttet i for eksempel ”immunspesifikk binding av antistoffer” refererer til den antigenspesifikke bindingsinteraksjonen som foregår mellom det antigenkombinerende setet på et antistoff og det spesifikke antigenet som er gjenkjent av antistoffet.

”Biologisk aktiv” og ”ønsket biologisk aktivitet” for formålet her, betyr å ha evnen til å modulere en DR5-aktivitet eller DR5-aktivering, inkludert for eksempel et sted, for eksempel apoptose (enten på en agonistisk eller stimulerende måte eller på en antagonistisk eller blokkerende måte) i minst én type pattedyrceller in vivo eller ex vivo, binding til Apo-2-ligand (TRAIL) eller modulerende aktivering av en eller flere molekyler i den intracellulære signaliseringsveien slik som kaspase-3, kaspase-8, kaspase-10 eller FADD. Analyse for å bestemme aktivering av slike intracellulære molekyler er kjent på fagområdet, se for eksempel Boldin et al., J. Biol. Chem., 270:7795-7798 (1995), Peter, Cell Death Differ., 7:759-760 (2000), Nagata, Cell, 88:355-365 (1998), Ashkenazi et al., Science, 281:1305-1308 (1999).

Uttrykkene “agonist” og “agonistisk” refererer, når de blir benyttet her, til eller beskriver, et molekyl som er i stand til direkte eller indirekte å vesentlig indusere, fremme eller forsterke biologisk DR5-aktivitet eller –aktivering. Eventuelt er et ”DR5-agonistantistoff” et antistoff som har aktivitet som er sammenlignbar med liganden for DR5, kjent som Apo-2-ligand (TRAIL), eller er i stand til å aktivere DR5-reseptor som fører til en aktivering av en eller flere intracellulære signaliseringsveier som kan inkludere aktivering av kaspase-3, kaspase-8, kaspase-10 eller FADD.

Uttrykkene ”antagonist” og ”antagonistisk” refererer, når de blir benyttet her, eller de beskriver, et molekyl som direkte eller indirekte er i stand til å vesentlig motvirke, redusere eller inhibere biologisk DR5-aktivitet eller DR5-aktivering. Eventuelt er en antagonist et molekyl som nøytraliserer den biologiske aktiviteten som skyldes DR5-aktivering eller dannelse av et kompleks mellom DR5 og dens ligand, slik som Apo-2-ligand.

Uttrykkene ”apoptose” og ”apoptotisk aktivitet” blir benyttet i en bred betydning og refererer til den ordnede eller kontrollerte formen for celledød hos pattedyr som typisk blir fulgt av en eller flere karakteristiske celleendringer, inkludert kondensering av cytoplasma, tap av plasmamembranmikrofili, segmentering av kjernen, degradering av kromosomalt DNA eller tap av mitokondriefunksjon. Denne aktiviteten kan bli bestemt og målt, for eksempel ved hjelp av celleviabilitetsanalyser, anneksin-V-bindingsanalyser, PARP-analyser, FACS-analyse eller DNA-elektroforese, der alle disse er kjent på fagområdet. Eventuelt vil apoptotisk aktivitet bli bestemt ved hjelp av en anneksin-V- eller PARP-analyse.

Uttrykkene ”kreft”, ”kreftrammet” og ”malign” refererer til eller beskriver den fysiologiske tilstanden hos pattedyr som typisk er karakterisert ved uregulert cellevekst.

Eksempler på kreftformer inkluderer karsinom, inkludert adenokarsinom, lymfom, blastom, melanom, gliom, sarkom, myelom (slik som multippelt myelom) og leukemi. Mer spesielle eksempler på slike kreftformer inkluderer skvamøs cellekreft, småcellet lungekreft, ikkesmåcellet lungekreft, lungeadenokarsinom, lungeskvamøst cellekarsinom, gastrointestinal kreft, Hodgkins og non-Hodgkins lymfom, pankreaskreft, glioblastom, cervixkreft, gliom, ovariekreft, leverkreft slik som hepatisk karsinom og hepatom, blærekreft, brystkreft, kolonkreft, kolorektalkreft, endometriumkarsinom eller livmorkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft slik som nyrecellekarsinom og Wilms tumor, basal cellekarsinom, melanom, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, testikkelkreft, øsofaguskreft og forskjellige typer av hode- og nakkekreft.

Uttrykket ”immunrelatert sykdom” betyr en sykdom der en komponent i immunsystemet hos et pattedyr forårsaker, medierer eller på annen måte bidrar til en sykelighet hos pattedyret. Også inkludert er sykdommer der stimulering eller intervensjon i immunresponsen har en lindrende effekt på progresjonen til sykdommen. Inkludert innenfor dette uttrykket er autoimmune sykdommer, immunmedierte inflammatoriske sykdommer, ikke-immunmedierte inflammatoriske sykdommer, smittsomme sykdommer og immunsviktsykdommer. Eksempler på immunrelaterte sykdommer og inflammatoriske sykdommer, noen av disse er immune eller T-cellemedierte, som kan bli behandlet i overensstemmelse med oppfinnelsen, inkluderer systemisk lupus erytematose, reumatoid artritt, juvenil kronisk artritt, spondyloartropatier, systemisk sklerose (skleroderma), idiopatiske inflammatoriske myopatier (dermatomyositt, polymyositt), Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi (immun pancytopeni, paroksysmal nokturnal hemoglobinuri), autoimmun trombocytopeni (idiopatisk trombocytopenisk purpura, immunmediert trombocytopeni), tyroiditt (Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt tyroiditt, atrofisk tyroiditt), diabetes mellitus, immunmediert nyresykdom (glomerulonefritt, tubulointerstitiell nefritt), demyelinerende sykdommer i sentralnervesystemet og i det perifere nervesystemet slik som multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom og kronisk inflammatorisk demyelinerende polyneuropati, hepatobilliære sykdommer slik som smittsom hepatitt (hepatitt-A, -B, -C, -D, -E og andre ikke-heptotropiske virus), autoimmun kronisk aktiv hepatitt, primær, biliær cirrose, granulomatøs hepatitt og skleroserende koloangitt, inflammatoriske og fibrotiske lungesykdommer slik som inflammatorisk tarmsykdom (ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), glutensensitiv enteropati og Whipples sykdom, autoimmune eller immunmedierte hudsykdommer inkludert bulløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psoriasis, allergiske sykdommer slik som astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, matvare hypersensitivitet og urtikaria, immunologiske sykdommer i lungen slik som eosinofile lungebetennelser, idiopatisk pulmonær fibrose og hypersensitivitets pneumonitt, transplantasjonsassosierte sykdommer inkludert transplantatavstøting og transplantat versus vertssykdom. Smittsomme sykdommer inkluderer AIDS (HIV-infeksjon), hepatitt-A, -B, -C, -D og –E, bakterieinfeksjoner, soppinfeksjoner, protozolinfeksjoner og parasittinfeksjoner.

”Autoimmunsykdom” blir her benyttet i en bred betydning, og en generell måte for å referere til forstyrrelser eller tilstander hos pattedyr der ødeleggelse av normalt eller friskt vev fremkommer fra humorale eller cellulære immunresponser i det individuelle pattedyret på komponentene av dets eget vev. Eksempler inkluderer lupus erytematosus, tyroiditt, reumatoid artritt, psoriasis, multippel sklerose, autoimmun diabetes og inflammatorisk tarmsykdom (IBD).

Et ”vekstinhibitorisk middel” referer når det blir benyttet her til en forbindelse eller et preprat som inhiberer veksten for en celle in vitro og/eller in vivo. Det vekstinhibitoriske middelet kan slik være et som vesentlig reduserer prosentandelen av celler i S-fase.

Eksempler på vekstinhibitoriske midler inkluderer midler som blokkerer cellesyklusprogresjon (på et sted forskjellig fra S-fase), slik som midler som induerer G1-arrest og M-fasearrest. Klassiske M-faseblokkere inkluderer vinkaene (vinkristin og vinblastin), Taxol og topo-II-inhibitorer slik som doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid og bleomycin. De midlene som stopper G1 går også over i S-fasearrest, for eksempel DNA-alkylerende midler slik som tamoksifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluoruracil og ara-C. Ytterligere informasjon kan bli funnet i The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn og Israel, red., kapittel 1, med tittelen ”Cell cycle regulation, oncogenes, and antioneoplastic drugs” av Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), spesielt på s.

13.

Uttrykket ”prodroge” referer slik det blir benyttet i denne søknaden til en forløper eller en derivatform av et farmasøytisk aktivt stoff som er mindre cytotoksisk ovenfor kreftceller sammenlignet med opphavslegemiddelet og er i stand til å bli enzymatisk aktivert eller konvertert til den mer aktive opphavsformen. Se for eksempel Wilman, ”Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, s. 375-382, 615<th>Meeting Belfast (1986) og Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (red.), s. 247-267, Humana Press (1985).

Prodrogene ifølge denne oppfinnelsen inkluderer fosfatinneholdende prodroger, tiofosfatinneholdende prodroger, sulfatinneholdende prodroger, peptidinneholdende prodroger, D-aminosyremodifiserte prodroger, glukosylerte prodroger, beta-laktaminneholdende prodroger, eventuelt substituerte fenoksyacetamidinneholdende prodroger eller eventuelt substituerte fenylacetamidinneholdende prodroger, 5-fluorcytosin og andre 5-fluoruridinprodroger som kan bli konvertert til det mer active, cytotoksiske frie legemiddelet.

Eksempler på cytotoksiske legemidler som kan bli derivatisert til en prodrogeform for anvendelse i denne oppfinnelsen inkluderer de kjemoterapeutiske midlene som er beskrevet nedenfor.

Uttrykket ”cytotoksisk middel” refererer slik det blir benyttet her til stoffer som inhiberer eller forhindrer funksjon av celler og/eller som forårsaker ødeleggelse av celler.

Uttrykket er ment å skulle inkludere radioaktive isotoper (f. eks. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>og radioaktive isotoper av Lu), kjemoterapeutiske midler og toksiner slik som småmolekyltoksiner eller enzymatisk aktive toksiner av bakterieopphav, soppopphav, planteopphav eller dyreopphav, inkludert fragmenter og/eller varianter derav.

Et ”kjemoterapeutisk middel” er en kjemisk forbindelse som er nyttig i behandlingen av tilstander slik som kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler inkluderer alkylerende midler slik som tiotepa og syklofosfamid (CYTOXAN), alkylsulfonater slik som busulfan, improsulfan og piposulfan, aziridiner slik som benzodopa, karbokuon, meturedopa og uredopa, etyleniminer og metylamelaminer inkludert altretamin, trietylenmelamin, trietylenfosforamid, trietylentiofosforamid og trimetylololmelamin, acetogeniner (spesielt bullatacin og bullatacinon), et kaptotecin (inkludert den syntetiske analogen topotekan), bryostatin, kallystatin, CC-1065 (inkludert dens syntetiske adozelezin-, karzelesin- og bizelesinanaloger), kryptofyciner (spesielt kryptofycin-1 og kryptofycin-8), dolastatin, duokarmycin (inkludert de syntetiske analogene KW-2189 og CBI-TMI), eleuterobin, pankreatistatin, et sarkodiktyin, spongistatin, nitrogensennepper slik som klorambucil, klornafazin, kolofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretaminoksidhydroklorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilsennepp, nitrosoureaer slik som karmustin, klorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin, antibiotika slik som enediyn antibiotikaene (f. eks. kalicheamicin, spesielt kalicheamicin- γ1<I>og kalichamicin 2<I>1, se for eksempel Angnew Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994), dynemicin, inkludert dynemicin-A, et esperamicin, i tillegg til neokarzinostatinkremofor og beslektede kromoproteinenediynantibiotika kromoforer), aklacinomysiner, aktinomycin, autramycin, azaserin, bleomyciner, kaktinomycin, karabicin, karminomycin, karzinofilin, kromomyciner, daktinomycin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (inkludert morfolinodoksorubicin, cyanomorfolinodoksorubicin, 2-pyrrolinodoksorubicin og deoksydoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcellomycin, mitomyciner, mykofenolsyre, nogalamycin, olivomyciner, peplomycin, potfiromycin, puromycin, quelamycin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin, antimetabolitter slik som metotreksat og 5-fluoruracil (5-FU), folsyreanaloger slik som denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat, purinanaloger slik som fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin, pyridinanaloger slik som anciatabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, cytarabin, dideoksyuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU, androgener slik som kalusteron, dromostanolonpropionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton, anti-adrenaler slik som aminoglutetimid, mitotan, trilostan, folsyreerstattere slik som frolinsyre, aceglaton, aldofosfamidglykosid, aminolevulinsyre, amsakrin, bestrabucil, bisantren, edetraksat, deforfamin, demekolcin, diazikon, elfornitin, elliptiniumacetat, et epotilon, etoglucid, galliumnitrat, hydroksyurea, lentinan, lonidamin, maytansinoider slik som maytansin og ansamitociner, mitoguazon, mitoxantron, mopidamol, nitrakrin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podofyllinsyre, 2-etylhydrazid, prokarbazin, PSK, razoksan, rizoksin, sizofiran, spirogermanium, tenuazonsyre, triazikon, 2,2’2’’-triklortrietylamin, trikotecener (spesielt T-2-toksin, verrakurin-A, roridin-A og anguidin), uretan, vindesin, dakarbazin, mannomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytosin, arabinosid (”Ara-C”), syklofosfamid, tiotepa, taksoider, for eksempel paklitaksel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og doksetaksel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike), klorambucin, gemcitabin, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, platinaanaloger slik som cisplatin og karboplatin, vinblastin, platina, etoposid (VP-16), ifosfamid, mitomycin-C, mitoksantron, vinkristin, vinorelbin, navelbin, novantron, teniposid, daunomycin, aminopterin, xeloda, ibandronat, CPT-11, topoisomeraseinhibitor RFS 2000, difluormetylornitin (DMFO), retinolsyre, kapecitabin og farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de som er beskrevet over. Også inkludert i denne definisjonen er anti-hormon midler som virker slik at det regulerer eller inhiberer hormonvirkning på tumorer slik som antiøstrogener inkludert for eksempel tamoksifen, raloksifen, aromatseinhiberende 4(5)-imidazoler, 4-hydroksytamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston og toremifen (Fareston), og antiandrogener slik som flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid og goserelin, og farmasøytisk akseptable salter, syrer eller derivater av enhver av de som er beskrevet over.

Uttrykket ”cytokin” er et generisk uttrykk for proteiner som blir frigjort av en cellepopulasjon som virker på en annen celle som intercellulære mediatorer. Eksempler på slike cytokiner er lymfokiner, manokiner og tradisjonelle polypeptidhormoner. Inkludert blant cytokinenene er veksthormon slik som humant veksthormon, N-metionyl humant veksthormon og bovint veksthormon, paratyroidhormon, tyroksin, insulin, proinsulin, relaksin, prorelaksin, glykoproteinhormoner slik som folikkelstimulerende hormon (FSH), tyroidstimulerende hormon (TSH) og luteiniserende hormon (LH), hepatisk vekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, prolaktin, placentalaktogen, tumor nekrose faktor-alfa og –beta, mullerian-inhiberende stoff, musegonadotropinassosiert peptid, inhibin, aktivin, vaskulær endotel vekstfaktor, integrin, trombopoietin (TPO), nervevekstfaktorer slik som NGF-alfa, platevekstfaktor, transformerende vekstfaktorer (TGF) slik som TGF-alfa og TGF-beta, insulinlignende vekstfaktor-I og –II, erytropoietin (EPO), osteoinduktive faktorer, interferoner slik som interferon-alfa, -beta og –gamma, kolonistimulerende faktorer (CSF), slik som makrofag-CSF (M-CSF), granulocytt-makrofag-CSF (GM-CSF) og granulocytt-CSF (G-CSF), interleukiner (IL) slik som IL-1, IL-1-alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; en tumornektosefaktor slik som TNF-alfa eller TNF-beta, og andre polypeptidfaktorer inkludert LIF og kit-ligand (KL). Som benyttet her inkluderer uttrykket cytokin proteiner fra naturlige kilder eller fra rekombinant cellekultur og biologisk aktive ekvivalenter av nativsekvenscytokinene.

Uttrykkene ”behandle”, ”behandling” og ”terapi” referer slik det blir benyttet her til kurerende terapi, profylaktisk terapi og preventiv terapi.

Uttrykket ”terapeutisk effektiv mengde” refererer til en mengde av et legemiddel som er effektivt til å behandle en sykdom eller forstyrrelse hos et pattedyr. I tilfellet med kreft, kan den terapeutisk effektive mengden av legemiddelet redusere antallet kreftceller, reduserer tumorstørrelsen, inhibere (dvs. i noe omfang, bremse og fortrinnsvis stoppe), kreftcelleinfiltrering inn i perifere organer, inhibere (dvs. i noe omfang bremse og fortrinnsvis stoppe) tumormetastaser, inhibere, i noen grad, tumorvekst og/eller i noen grad lindre omfanget av et eller flere av symptomene som er assosiert med forstyrrelsen. Ved det omfanget legemiddelet kan forhindre vekst og/eller drepe eksisterende kreftceller kan det være cytostatisk og/eller cytotoksisk. For kreftterapi kan for eksempel effektivitet in vivo bli målt ved å undersøke tumorbyrde eller volum, tiden til sykdomsprogresjon (TTP) og/eller bestemme responsrater (RR).

Uttrykket ”pattedyr” refererer slik det blir benyttet her til ethvert pattedyr som er klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, høyere primater, kuer, hester, hunder og katter. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er pattedyret et menneske.

Uttrykket ”objektiv respons” er definert som en fullstendig eller delvis respons på behandling av et individ, som bestemt ved å benytte the Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) (J. Nat. Cancer Insc., 92(3):205-216 (2000)).

Uttrykket ”varighet av respons” blir her benyttet for å referere til tiden fra en initiell, fullstendig eller delvis respons til tiden for sykdomsprogresjon eller død.

Uttrykket ”progresjonsfri overlevelse” blir her benyttet for å referere til tiden fra den første dagen med behandling til sykdomsprogresjon eller død, uansett hvem av disse som forkommer først.

Uttrykket ”fullstendig regresjon (CR)” blir benyttet for å indikere at tumorvolumet er < 13,5 mm<3>i tre påfølgende målinger.

Uttrykket ”delvis regresjon (PR)” indikerer at tumorvolumet er < 50% av volumet på dag 1, i tre påfølgende målinger, og > 13,5 mm<3>i en eller flere av disse målingene.

II. Preparater og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen

A. DR5-antistoffer

I en utførelsesform av oppfinnelsen blir DR5-antitoffet tilveiebrakt. Eksempelmessige antistoffer inkluderer polyklonale, monoklonale, humaniserte, bispesifikke og heterokonjugate antistoffer. Disse antistoffene kan være agonister, antagonister eller blokkerende antistoffer.

1. Polyklonale antistoffer

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan omfatte polyklonale antistoffer. Fremgangsmåte for fremstille polyklonale antistoffer er kjent for fagfolk på området. Polyklonale antistoffer kan bli frembrakt i et pattedyr, for eksempel ved hjelp av en eller flere injeksjoner av et immuniserende middel, og hvis ønskelig, en adjuvans. Typisk vil det immuniserende middelet og/eller adjuvansen bli injisert inn i pattedyret ved hjelp av flere subkutane eller intraperitoneale injeksjoner. De immuniserende midler kan inkludere DR5-polypeptidet (eller en DR5-ECD) eller et fusjonsprotein derav. Det kan være nyttig å konjugere det immuniserense middelet til et protein som er kjent for å være immunogent i pattedyret som blir immunisert. Eksempler på slike immunogene proteiner inkluderer keyhole limpet hemocyanin, serumalbumin, bovint tyroglobulin og soyabønne trypsininhibitor. Eksempler på adjuvanser som kan bli benyttet inkluderer Freunds komplette adjuvans og MPL-TDM-adjuvans (monofosforyl-lipid-A, syntetisk trehalose dikorynomykolat). Immuniseringsprotokollen kan bli valgt av en fagperson på området uten unødvendig eksperimentering. Pattedyret kan deretter bli tappet og serumet kan bli analysert for DR5-antistofftiter. Hvis ønskelig kan pattedyret bli boostret inntil antistofftiteret øker eller når et platå.

2. Monoklonale antistoffer

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan alternativt være monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer kan bli fremstilt ved å benytte hybridomfremgangsmåter, slik som de som er beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256:495 (1975). I en hybridomfremgangsmåte blir en mus, hamster eller annet passende vertsdyr typisk immunisert med et immuniserende middel for å utløse lymfocytter som produserer eller som er i stand til å produsere antistoffer som spesifikt vil binde til det immuniserende middelet. Alternativt kan lymfocyttene bli immunisert in vitro.

Det immuniserende middelet vil typisk inkludere DR5-polypeptidet (eller en DR5 ECD) eller et fusjonsprotein derav, slik som et DR5 ECD-IgG-fusjonsprotein. Det immuniserende middelet kan alternativt omfatte et fragment eller en del av DR5 som har en eller flere aminosyrer som deltar i bindingen av Apo-2L til DR5. I en foretrukket utførelsesform omfatter det immuniserende middelet en ekstracellulær domenesekvens fra DR5 fusjonert til en IgG-sekvens.

Generelt blir enhver perifer blodlymfocytt (”PBL”) benyttet hvis celler av humant opphav er ønskelig, eller miltceller eller lymfeknuteceller blir benyttet hvis ikke-humane pattedyrkilder er ønskelige. Lymfocyttene ble deretter fusjonert med en udødeliggjort cellelinje ved å benytte et passende fusjoneringsmiddel, slik som polyetylenglykol, for å danne en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) s. 59-103). Udødeliggjorte cellelinjer er vanligvis transformerte pattedyrceller, spesielt myelomceller av gnageropphav, bovint opphav eller humant opphav.

Vanligvis blir rotte- eller musemyelomcellelinjer benyttet. Hybridomcellene kan bli dyrket i et passende kulturmedium som fortrinnsvis inneholder et eller flere stoffer som inhiberer veksten eller overlevelsen for de ikke-fusjonerte, udødeliggjorte cellene. Hvis opphavscellene for eksempel mangler enzymet hypoxantinguaninfosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil kulturmediet for hybridomene typisk inkludere hypoxantin, aminopterin og tymidin (”HAT-medium”), der disse stoffene forhindrer veksten av HGPRT-manglende celler.

Foretrukne, udødeliggjorte cellelinjer er de som fusjonerer effektivt, som støtter stabil høynivekspresjon av antistoff fra de valgte, antistoffproduserende cellene, og som er sensitive overfor et medium slik som HAT-medium. Mer foretrukne, udødeliggjorte cellelinjer er murine myelomlinjer, som kan bli fremskaffet for eksempel fra the Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California og the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Et eksempel på en slik murin myelomcellelinje er P3X63Ag8U.1, (ATCC CRL 1580). Humane myelomcellelinjer og muse-humane heteromyelomcellelinjer har også blitt beskrevet for fremstillingen av humane, monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987), s. 51-63).

Kulturmediumet der hybridomcellene blir dyrket kan deretter bli analysert for tilstedeværelsen av monoklonale antistoffer rettet mot DR5. Bindingsspesifisiteten for monoklonale antistoffer som er produsert av hybridomcellene blir fortrinnsvis bestemt ved hjelp av immunpresipitering eller ved hjelp av in vitro-bindingsanalyser, slik som radioimmunanalyse (RIA) eller enzymbundet immunabsorbent analyse (ELISA). Slike teknikker og analyser er kjent på fagområdet. Bindingsaffiniteten for det monoklonale antistoffet kan for eksempel bli bestemt ved hjelp av Scatchard-analysen til Munson og Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Etter at de ønskede hybridomcellelinjene er hybridisert, kan klonene bli subklonet ved hjelp av begrensede fortynningsprosedyrer og dyrket ved hjelp av standard fremgangsmåter (Goding, ovenfor). Passende kulturmedier til dette formålet inkluderer for eksempel Dulbeccos Modified Eagles Medium eller RPMI-1640-medium. Alternativt kan hybridomcellene bli dyrket in vivo som ascites hos et pattedyr.

De monoklonale antistoffene som ble utskilt av subklonene kan bli isolert eller renset fra kulturmediet eller ascitesvæsken ved hjelp av konvensjonelle immunglobulin renseprosedyrer slik som for eksempel protein-A-sefarase, hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse eller affinitetskromatografi.

De monoklonale antistoffene kan også bli fremstilt ved hjelp av rekombinante DNA-fremgangsmåter, slik som de som er beskrevet i US patentnr. 4 816 567. DNA som koder for de monoklonale antistoffene kan enkelt bli isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f. eks. ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for tungkjedene og lettkjedene til de monoklonale antistoffene). Hybridomcellene virker som en foretrukket kilde for slikt DNA. Med en gang det er isolert kan DNA bli plassert i ekspresjonsvektorer, som deretter blir overført inn i vertsceller slik som E. coli-celler, ape-COS-celler, kinesisk hamster ovarie(CHO)-celler eller myelomceller som ellers ikke produserer immunglobulinprotein, for å oppnå syntesen av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. DNA kan også bli modifisert, for eksempel ved å substituere den kodende sekvensen for den humane tungkjede- og lettkjedekonstantdomener, i stedet for det homologe, murine sekvensene, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851 (1984), eller ved kovalent å koble den immunglobulinkodende sekvensen til hele eller deler av den kodende sekvensen for et ikke-immunglobulin polypeptid. På denne måten blir ”kimere” eller ”hybride” antistoffer fremstilt som har bindingsspesifisiteten for et monoklonalt anti-DR5 antistoff her.

Typisk blir slike ikke-immunglobulin polypeptider substituert for konstantdomenet til et antistoff ifølge oppfinnelsen, eller de blir substituert for variabeldomener til et antigenkombinerende sete på et antistoff ifølge oppfinnelsen for å danne et kimert, bivalent antsitoff som omfatter et antigenkombinerende sete som har spesifisitet for DR5 og et annet antigenkombinerende sete som har spesifisitet for et annet antigen.

Kimere antistoffer eller hybride antistoffer kan også bli fremstilt in vitro ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet for syntetisk proteinkjemi, inkludert de som involverer kryssbindingsmidler. Immuntoksiner kan for eksempel bli konstruert ved å benytte en disulfid utbyttingsreaksjon eller ved å danne en tioeterbinding. Eksempler på passende reagenser for dette formål inkluderer iminotiolat og metyl-4-perkaotpbutyrimidat.

Enkeltkjede-Fv-fragmenter kan også bli fremstilt, slik som beskrevet i Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997). Kobling av slike enkeltkjedefragmenter ved å benytte forskjellige linkere er beskrevet i Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997). En mengde teknikker for den rekombinante fremstillingen og manipuleringen av antistoffer er velkjent på fagområdet. Illustrerende eksempler på slike teknikker som typisk blir benyttet av erfarne fagfolk er beskrevet i større detalj nedenfor.

(i) Humaniserte antistoffer

Generelt har et humanisert antistoff fått en eller flere aminosyrerester introdusert inn i seg fra en ikke-human kilde. Disse ikke-humane aminosyrerestene ble ofte referert til som ”importrester” som typisk er tatt fra et ”import variabeldomene”. Humaniseringen kan essensielt bli utført ved å følge fremgangsmåten til Winter og samarbeidspartnere (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332.323-327 (1998), Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988) ved å substituere gnager-CDRer eller CDR-sekvenser for de tilsvarende sekvensene fra et humant antistoff.

Dermed er slike ”humaniserte” antistoffer kimere antistoffer der en vesentlig mindre enn et humant intakt variabeldomene har blitt substituert med den tilsvarende sekvensen fra en ikke-human art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer der noen CDR-rester og muligens noe FR-rester er substituert med rester fra analoge seter på gnagerantistoffer.

Det er viktig at antistoffer blir humanisert ved opprettholdelse av høy affinitet for antigenet og andre fordelaktige, biologiske egenskaper. For å oppnå dette målet, ifølge en foretrukket fremgangsmåte, blir humaniserte antistoffer fremstilt ved hjelp av en prosess med analyse av opphavssekvensen og forskjellige konseptmessige, humaniserte produkter ved å benytte tredimensjonale modeller for opphavssekvensen av de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er allment tilgjengelige og kjent for fagfolk på området. Dataprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og oppviser mulige, tredimensjonale, konformasjonsmessige strukturer for valgte kandidat immunglobulinsekvenser. Inspeksjon av disse fremvisningene muliggjør analysen av den sannsynlige rollen til restene i virkningen av kandidatimmunglobulinsekvensen, dvs. analyser av rester som påvirker evnen for kandidatimmunglobulinet til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-rester bli valgt og kombinert fra konsensussekvensen og importsekvensen slik at de ønskede antistoffkarakteristika, slik som økt affinitet for målantigenet blir oppnådd.

Generelt er CDR-restene direkte og mest vesentlig involvert i å påvirke antigenbinding.

(ii) Humane antistoffer

Humane, monoklonale antistoffer kan bli fremstil ved hjelp av hybridomfremgangsmåter. Humane myelomcellelinjer og muse-humane heteromyelomcellelinjer for fremstillingen av humane monoklonale antistoffer har blitt beskrevet, for eksempel av Kozbor, J. Immunol., 133, 3001 (1984) og Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987).

Det er nå mulig å fremstille transgene dyr (f. eks. mus) som ved immunisering er i stand til å produsere et repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. Det har for eksempel blitt beskrevet at den homozygote delesjonen av det antistoff-tungkjede-sammenbindende region (JH)-genet i kimerer og kimcellelinjemutante mus fører til fullstendig inhibering av endogen antistoffproduksjon. Overføring av den humane kimcellelinjeimmunglobulin gensamlingen til slike kimcellelinjemutante mus fører til produksjon av humane antistoffer ved antigenutfordring. Se for eksempel Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 2551-255 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362, 255-258 (1993).

Mendez et al., (Nature Genetics 15: 146-156 (1997)) har ytterligere forbedret teknologien og har generert en linje av transgene mus som er betegnet ”Xenomouse-II” som når den blir utfordret med et antigen, genererer fult humane høyaffinitetsantistoffer. Dette ble oppnådd ved hjelp av kimcellelinjeintegrering av humane megabase-tungkjede lokus og –lettkjedelokus inn i mus med delesjon inn i endogent JH-segment som beskrevet ovenfor. Xenomouse-II bærer 1020 kb av et humant tungkjedelokus som inneholder omtrent 66 VH-gener, fullstendig DH- og JH-regioner og tre forskjellige konstantregioner ( μ,� og �), og bærer også 800 kb av humant �-lokus inneholdende 32 V�-gener, J�-segmenter og C�-gener. Antistoffene som blir fremstilt i disse musene ligner mye på de som ble sett hos mennesker i alle henseender, inkludert genrearrangering, sammensetting og repertoar. De humane antistoffene blir fortrinnsvis uttrykt i forhold til endogene antistoffer på grunn av delesjon i endogent JH-segment som forhindrer genrearrangering i det murine lokuset.

Alternativt kan bakteriofagfremvisningsteknologien (McCafferty et al., Nature, 348, 552-553 (1990)) bli benyttet for å fremstille humane antistoffer og antistoff-fragmenter in vitro, fra immunglobulin variabel (V)-domenegenrepertoarer fra ikke-immuniserte donorer. Ifølge denne teknikken ble antistoff-V-gener klonet i ramme inn i enten et hoved- eller mindre kappeproteingen fra en filamentøs bakteriofag, slik som M13 eller fd, og oppvist som funksjonelle antistoff-fragmenter på overflaten av bakteriofagpartikkelen. Fordi den filamentøse partikkel inneholder en enkelttrådet DNA-kopi av bakteriofaggenomet, fører seleksjoner basert på de funksjonelle egenskapene til antistoffet også til seleksjon av genet som koder for antistoffet som oppviser disse egenskapene. Slik mimikerer bakteriofagen noen av egenskapene til B-cellen. Bakteriofag fremvisning kan bli utført i en mengde forskjellige formater, og for deres gjennomgang se for eksempel Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3, 564-571 (1993). Flere kilder for V-gensegmenter kan bli benyttet til bakteriofagfremvisning. Clackson et al., Nature, 352, 624-628 (1991), isolerte et bredt utvalg av anti-oksazolonantistoffer fra et lite tilfeldig kombinatorisk bibliotek av V-gener avledet fra milt fra immuniserte mus. Et repertoar av V-gener fra ikke-immuniserte, humane donorer kan bli konstruert og antistoffer mot et bredt utvalg av antigener (inkludert selv-antigener) kan bli isolert ved essensielt å følge teknikkene som er beskrevet av Marks et al., J. Mol. Biol., 222, 581-597 (1991) eller Griffith et al., EMBO J., 12, 725-734 (1993). I en naturlig immunrespons akkumulerer antistoffgenmutasjoner i stort omfang (somatisk hypermutasjon). Noen av endringene som blir introdusert vil overføre høyere affinitet, og B-celler som oppviser høyaffinitet overflateimmunglobulin blir fortrinnsvis replikert og differensiert i løpet av påfølgende antigenutfordring. Den naturlige prosessen kan bli hermet ved å benytte teknikken kjent som ”kjedeombytting” (Marks et al., Bio/Technol., 10, 779-73 (1992)). I denne fremgangsmåten kan affiniteten til ”primære”, humane antistoffer som er fremskaffet ved bakteriofag fremvisning bli forbedret ved sekvensielt å erstatte tungkjede- og lettkjede-V-regiongener med repertoarer av naturlig forekommende varianter (repertoarer) av V-domenegener som er fremskaffet fra ikke-immuniserte donorer. Denne teknikken muliggjør produksjon av antistoffer og antistoff-fragmenter med affiniteter i nM-området. En strategi for å fremstille svært store bakteriofage antistoffrepertoarer (også kjent som ”the mother-of-all libraries”) har blitt beskrevet av Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21, 2265-2266 (1993). Genombytting kan også bli benyttet for å utlede humane antistoffer fra gnagerantistoffer, der det humane antistoffet har lignende affiniteter og spesifisiteter som start gnagerantistoffet. Ifølge denne fremgangsmåten, som også ble referert til som ”epitop-imprinting” blir tungkjede- eller lettkjede-V-domenegenet til gnagerantistoffer fremskaffet ved bakteriofag fremvisningsteknikk erstattet med et repertoar av humane V-domenegener, for å danne gnager-humane kimerer. Seleksjon på antigen fører til isolering av humane variabel som er i stand til å gjenopprette et funksjonelt antigenbindende sete, dvs. epitopen hjelper til med valget av partner. Når prosessen blir gjentatt for å erstatte det gjenværende gnager-Vdomenet, blir et humant antistoff fremskaffet (se PCT-patentsøknad WO 93/06213, publisert 1. april, 1993). Ulikt tradisjonell humanisering av gnagerantistoffer ved hjelp av CDR-transplantering tilveiebringer denne teknikken fullstendig humane antistoffer, som ikke har noen rammeverks- eller CDR-rester av gnageropphav.

Som diskutert i detalj nedenfor kan antistoffer ifølge oppfinnelsen eventuelt omfatte monomere antistoffer, dimere antistoffer i tillegg til multivalente former av antistoffet.

Fagfolk på området kan konstruere slike dimerer eller multivalente former ved hjelp av teknikker som er kjent på fagområdet og ved å benytte DR5-antistoffene her. Fremgangsmåter for å fremstille monovalente antistoffer også velkjente på fagområdet. En fremgangsmåte involverer for eksempel rekombinant ekspresjon av immunglobulin lettkjede og modifisert tungkjede. Tungkjeden blir trunkert generelt på ethvert punkt et Fc-regionen for å forhindre tungkjede kryssbinding. Alternativt blir de relevante cysteinrestene substituert med en annen aminosyrerest eller blir fjernet for å forhindre kryssbinding.

(iii) Bispesifikke antistoffer

Bispesifikke antistoffer er monoklonale, fortrinnsvis humane eller humaniserte, antistoffer som har bindingsspesifisiteter for minst to forskjellige antigener. I foreliggende tilfelle er en av bindingsspesifisitetene for DR5-reseptoren, den andre er for ethvert annet antigen, og fortrinnsvis for en annen reseptor eller reseptorsubenhet. For eksempel i bispesifikke antistoffer som hver spesifikt binder en DR5-reseptor og en annen apoptose/-signaliseringsreseptor innenfor omfaget av foreliggende oppfinnelse.

Fremgangsmåte for å fremstille bispesifikke antistoffer er kjent på fagområdet. Tradisjonelt ble rekombinant produksjon av bispesifikke antistoffer basert på den samtidige ekspresjonen av to immunglobulin-tungkjede-lettkjedepar, der de to tungkjedene har forskjellige spesifisiteter (Millstein og Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). På grunn av det tilfeldige utvalget av immunglobulintungkjede- og –lettkjeder produserer disse hybridomene (kvadromer) en potensiell blanding av 10 forskjellige antistoffmolekyler, der kun et har den korrekte, bispesifikke strukturen. Rensingen av det korrekte molekylet, som vanligvis blir utført ved hjelp av affinitetskromatografitrinn, er heller arbeidskrevende og produktutbyttene er lave. Lignende prosedyrer er tilkjennegjort i PCT-søknadsnr. WO 93/08829 (publisert 13. mai, 1993) og i Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991).

Ifølge en annen mer foretrukket tilnærming blir antistoffvariabeldomener med de ønskede bindingsspesifisitetene (antistoff-antigenkombinerende seter) fusjonert til immunglobulin konstantdomenesekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis med et immunglobulin tungkjedekonstantdomene som omfatter minst én del av hengsel-, CH2- og CH3-regionene. Det er foretrukket at den første tungkjede konstantregionen (CH1) inneholder setet som er nødvendig for lettkjedebinding, tilstede på minst én av fusjonene. DNA-moleyler som koder for immunglobulin tungkjedefusjoner, og hvis ønskelig, immunglobulinlettkjeden blir satt inn i separate ekspresjonsvektorer og blir kotransfektert inn i en passende vertsorganisme.

Dette gir stor fleksibilitet for å justere de innbyrdes forholdene mellom de tre polypeptidfragmentene i utførelsesformer der forskjellige forholder til de tre polypeptidkjedene som blir benyttet i konstruksjonen gir de optimale utbyttene. Det er like vel mulig å sette inn de kodende sekvensene for to eller alle tre polypeptidkjedene i en ekspresjonsvektor når ekspresjonen av minst to polypeptidkjeder i forskjellige forhold fører til høye utbytter, eller når forholdene ikke er av noen spesiell betydning. I en foretrukket utførelsesform av denne tilnærmingen, er de bispesifikke antistoffene sammensatt av en hybrid immunglobulin tungkjede med en første bindingsspesifisitet på en arm og et hybridimmunglobulin tungkjede-lettkjedepar (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) på den andre armen. Det ble funnet at ved denne asymetriske strukturen fremmer separasjonen av den ønskede, bispesifikke forbindelsen fra uønskede immunglobulinkjedekombinasjoner, siden tilstedeværelsen av en immunglobulinlettkjede på kun halvparten av det bispesifikke molekylet gir en enkel måte for separasjon. Denne tilnærmingen er tilkjennegjort i PCT-publikasjo nr. WO 94/04690, publisert 3. mars, 1994.

For ytterligere detaljer som gjelder generering av bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al., Methods in Enzymology, 121, 210 (1986).

(iv) Heterokonjugat antistoffer

Heterokonjugat antistoffer ligger også innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Heterokonjugat antistoffer sammensatt av to kovalent sammenbundne antistoffer. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått å styre immunsystemceller mot uønskede celler (US patentskrift nr. 4 676 980) og til behandling av HIV-infeksjon (PCT-søknad publikasjonsnr. WO 91/00360 og WO 92/200373, EP 03089). Heterokonjugatantistoffer kan bli fremstilt ved å benytte enhver hensiktsmessig kryssbindingsfremgangsmåte. Passende kryssbindingsmidler er velkjente på fagområdet og er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 4 676 980 sammen med et antall kryssbindingsteknikker.

(v) Antistoff-fragmenter

I visse utførelsesformer er anti-DR5-antistoffet (inkludert murine, humane og humaniserte antistoffer, og antistoffvarianter) et antistoff-fragment. Forskjellige teknikker har blitt utviklet for fremstilling av antistoff-fragmenter. Tradisjonelt blir disse fragmentene avledet via proteolytisk fordøying av intakte antistoffer (se f. eks. Morimoto et al., J.

Biochem. Biophys. Methods, 24:107-117 (1992) og Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Disse fragmentene kan likevel ennå bli fremstilt direkte ved hjelp av rekombinante vertsceller. Fab’-SH-fragmenter kan for eksempel bli direkte gjenvunnet fra E. coli og kjemisk koblet for å danne F(ab’)2-fragmenter (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). I en annen utførelsesform blir F(ab’)2 dannet ved å benytte leucinzipperen GCN4 for å fremme sammensetning av F(ab’)2-molekylet. Ifølge en annen tilnærming kan Fv-, Fab- eller F(ab’)2-fragmentet bli isolert direkte fra rekombinant vertscellekultur. En mengde teknikker for fremstilling av antistoff-fragmenter vil være kjent for fagfolk på området. Fordøying kan for eksempel bli utført ved å benytte papain. Eksempler på papainfordøying er beskrevet i WO 94/29348, publisert 12/22/94 og i US patentskrift nr. 4 342 566.

Papainfordøying av antistoffer frembringer typisk to identiske antigenbindingsfragmenter, kalt Fab-fragmenter, der hvert har et enkelt antigenbindende sete og et gjenværende Fcfragment. Pepsinbehandling gir et F(ab’)2-fragment som har to antigenkombinerende seter og som fremdeles er i stand til å kryssbinde antigen.

Fab-fragmentene som ble frembrakt ved antistoffordøyingen inneholder også konstantdomener til lettkjeden og det første konstantadomenet (CH1) til tungkjeden. Fab’-fragmenter er forskjellig fra Fab-fragmenter ved tillegg av noen få rester på karboksyterminalen på tungkjede-CH1-domenet inkludert et eller flere cysteiner fra antistoff hengselregionen. Fab’-SH er betegnelsen her for Fab’ der cysteinrestene på konstantdomenet bærer en fri tiolgruppe. F(ab’)2-antistoff-fragmenter ble opprinnelig produsert som par av Fab’-fragmenter som har hengslecysteiner mellom seg. Andre kjemiske koblinger av antistoff-fragmenter er også kjent.

(vi) Aminosyresekvensvarianter av antistoffer

Aminosyresekvensvarianter av anti-DR5-antistoffene ble fremstilt ved å introdusere passende nukleotidendringer inn i anti-DR5-antistoff-DNA, eller ved hjelp av peptidsyntese. Slike varianter inkluderer for eksempel delesjoner fra og/eller insersjon i og/eller substitusjoner av rester innenfor aminosyresekvensene til anti-DR5-antistoffene i eksemplene her. Enhver kombinasjon av delesjon, insersjon og substitusjon blir utført for å komme fram til den endelige konstruksjonen, gitt at den endelige konstruksjon innehar de ønskede karakteristika. Aminosyreendringene kan også endre posttranslasjonelle prosesser av det humaniserte antistoffet eller variant-DR5-antistoffet, slik som å endre antallet eller posisjon av glykosyleringsseter.

En nyttig fremgangsmåte for å identifisere visse rester eller regioner på anti-DR5-antistoffet som er foretrukne lokaliseringer for mutagenese blir kalt ”alanin scanningsmutagenese”, som beskrevet av Cunningham og Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). Her blir en residie eller en gruppe av målrester identifisert (f. eks. ladde rester slik som arg, asp, his, lys og glu) og erstattet med en nøytral eller negativt ladd aminosyre (mest foretrukket alanin eller polyalanin) for å få til interaksjonen av minosyrene med DR5-antigen. De aminosyrelokaliseringene som viser funksjonell sensitivitet ovenfor substitusjoner blir deretter raffinert ved å introdusere ytterligere eller andre varianter på, eller istedenfor, setene for substitusjon. Mens setet for introdusering av en aminmosyresekvensvariasjon er forhåndsbestemt, trenger slik ikke egenskapene til mutasjonen per se å være forhåndsbestemt. For å analysere oppførselen til en mutasjon på et gitt sete, kan for eksempel ala-scanning eller tilfeldig mutagenese bli utført på målkodonet eller regionen og de uttrykte, anti-DR5-antistoffvarianene ble screenet for den ønskede aktiviteten.

Aminosyresekvensinsersjon inkluderer amino- og/eller karboksyterminale fusjoner som strekker seg lengre fra en residie til polypeptider som inneholder 100 eller flere rester, i tillegg til intrasekvensinsersjon av enkelt eller flere aminosyrerester. Eksempler på terminale insersjon inkluderer et anti-DR5-antistoff med en N-terminal metionylresidie eller antistoff fusjonert til et epitopmerke. Andre insersjonsvarianter av anti-DR5-antistoffmolekyler inkluderer fusjonen til N- eller C-terminalen og anti-DR5-antistoffet med et enzym eller et polypeptid eller polyol som øker halveringstiden for antistoffet i serum.

En annen type av variant er en aminosyresubstitusjonsvariant. Disse variantene har fått minst én aminosyrerest i anti-DR5-antistoffmolekylet fjernet og en annen residie innsatt i dens sted. Setene av størst interesse for substitusjonsmutagenese inkluderer hypervariable regioner, men FR-endringer er også omfattet. Konservative substitusjoner er vist i Tabell 1 under overskriften ”foretrukne substitusjoner”. Hvis slike substitusjoner fører til en endring i biologisk aktivitet, kan mer vesentlige endringer, betegnet ”eksempelmessige substitusjoner” i Tabell 1, eller som ytterligere beskrevet nedenfor med referanse til aminosyreklasser, bli introdusert og produktene blir screenet.

Tabell 1

Vesentlige modifiseringer i de biologiske egenskapene til antistoffet blir oppnådd ved å velge substitusjoner som er vesentlig forskjellig i deres effekt i å opprettholde (a) strukturen til polypeptidryggradstrukturen i området ved substitusjon, for eksempel som en flatekonformasjon eller en helikskonformasjon, (b) ladningen eller hydrofobisiteten til molekylet på målsetet eller (c) omfanget av sidekjeden. Naturlige forekommende rester ble delt i grupper basert på felles sidekjede egenskaper:

(1) hydrofobe: norleucin, met, ala, val, leu, ile,

(2) nøytralt hydrofile: cys, ser, thr,

(3) sure: asp, glu,

(4) basiske: asn, gln, his, lys, arg,

(5) rester som påvirker kjedeorientering: gly, pro, og

(6) aromatiske: tyr, tyr, phe.

Ikke-konservative substitusjoner vil omfatte å bytte et medlem av en av disse klassene med en annen klasse.

Enhver cysteinresidie som ikke er involvert til å opprettholde den riktige konformasjonen for det humaniserte eller variant-anti-DR5-antistoffet kan også bli substituert, vanligvis med serin, for å forbedre den oksidative stabiliteten til molekylet og for å forhindre feilaktig kryssbinding. I motsatt fall kan cysteinbindinger bli innført i antistoffet for å forbedre dets stabilitet (spesielt der antistoffet er et antistoff-fragment slik som et Fvfragment).

En spesielt foretrukket type substitusjonsvariant involverer å substituere en eller flere hypervariabelregionrester i et opphavsantistoff (f. eks. et humanisert eller humant antistoff). Vanligvis vil den resulterende varianten som er valgt for ytterligere utvikling ha forbedrede, biologiske egenskaper relativt i forhold til opphavsantistoffet fra hvilket de er generert. En hensiktsmessig måte for å generere slike substitusjonsvarianter på er affinitetsmodning ved å benytte bakteriofagfremvisning. Kort fortalt blir flere hypervariabel regionseter (f. eks. 6-7 seter) mutert for å generere alle mulige aminosyresubstitusjoner på hvert sete. Antistoffvariantene som blir generert på denne måten blir oppvist på en monovalent måte på filamentøse bakteriofagpartikler som fusjoner til gen-III-produktet fra M13 forpakket innen hver partikkel. De bakteriofagoppviste variantene ble deretter screenet for deres biologiske aktivitet (f. eks. bindingsaffinitet) som tilkjennegjort her. For å kunne identifisere kandidat hypervariabelregionseter til modifisering, kan alaninscanningsmutagenese bli utført for å identifisere hypervariabelregionrester som vesentlig bidrar til antigenbinding. Alternativt, eller i tillegg, kan det være fordelaktig å analysere en krystallstruktur av antigen-antistoffkomplekset for å identifisere kontaktpunktet mellom antistoffet og human DR5. Slike kontaktrester og tilliggende rester er kandidater for substitusjon ifølge teknikkene som er antatt her. Med en gang slike varianter et generert, blir panelet av varianter utsatt for screening som beskrevet her og antistoffer med overlegne egenskaper i en eller flere relevante analyser kan bli valgt for ytterligere utvikling.

(vii) Glykosyleringsvarianter av antistoffer

Antistoffer er glykosylerte på konserverte posisjoner på deres konstantregioner (Jefferis og Lund, Chem. Immunol., 65:111-128 (1997), Wright og Morrison, TibTECH 15:26-32 (1997)). Oligosakkarid sidekjedene til immunglobulinene påvirker proteinets funksjon (Body et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 (!996), Wittwe og Howard, Biochem., 29:4175-4181 (1990)), og den intramolekylære interaksjonen mellom deler av glykoproteinet som kan påvirke konformasjonen og den presenterte tre-dimensjonale overflaten til glykoproteinet (Hefferis og Lund, ovenfor, Wyss og Wagner, Current Opin. Biotech., 7:409-416 (1996)). Oligosakkarider kan også virke for å styre et gitt glykoprotein til visse molekyler basert på spesifikke gjenkjenningsstrukturer. Det har for eksempel blitt rapportert at i agalaktosylert IgG så ”flipper” oligosakkaridenheten ut av inter-CH2-hulrommet og terminale N-acetylglykosamidrester blir tilgjengeliggjort for å binde mannosebindingsprotein (Malhotra et al., Nature Med., 1:237-243 (1995)). Glykopeptidasefjerning av oligosakkaridene fra CAMPATH-1H (et rekombinant, humanisert, murint, monoklonalt IgG1-antistoff som gjenkjenner CDw52-antigenet på humane lymfocytter) som blir produsert i kinesisk hamster ovarie(CHO)-celler førte til en fullstendig reduksjon i komplementmediert lysis (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol., 32:1311-1318 (1996)), mens selektiv fjerning av sialinsyrerester ved å benytte neuraminidase ikke førte til noe tap av DMCL. Glykosylering av antistoffer har også blitt rapportert å påvirke antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Spesielt ble CHO-celler med tetrasyklinregulert ekspresjon av β(1,4)-N-acetylglukosaminyltransferase-III (GnTIII), som er en glykosyltransferase som katalyserer dannelsen av avgrensende GlcNAc, rapportert å ha forbedret ADCC-aktivitet (Umana et al., Mature Biotech., 17:176-180 (1999)).

Glykosyleringsvarianter av antistoffer er varianter der glykosyleringsmønsteret til et antistoff er endret. Med endring er det ment fjerning av en eller flere karbohydratenheter som blir funnet på antistoffet, tilsetning av en eller flere karbohydratenheter på antistoffet, endring av sammensetningen av glykosylering (glykosyleringsmønster), omfanget av glykosylering osv. Glykosyleringsvarianter kan for eksempel bli fremstilt ved å fjerne, endre og/eller innføre et eller flere glykosyleringsseter i nukleinsyresekvensen som koder for antistoffet.

Glykosylering av antistoffer er typisk enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet refererer til påkoblingen av karbohydratenheten på sidekjeden av en asparaginresidie.

Tripeptidsekvensene asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin, der X er enhver aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjenningssekvensene for enzymatisk påkobling av karbohydratenheten på asparagin sidekjeden. Tilstedeværelsen av enhver av disse tripeptidsekvensene på et polypeptid danner et potensielt glykosyleringssete. O-bundet glykosylering refererer påkoblingen av en av sukkertypene N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose på en hydroksyaminosyre, mest vanlig serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan bli benyttet.

Innføring av glykosyleringsseter på antistoffet blir hensiktsmessig utført ved å endre aminosyresekvensen slik at den inneholder en eller flere av tripeptidsekvensene som er beskrevet ovenfor (for N-bundne glykosyleringsseter). Endringen kan også bli innført ved innføringen, eller substitusjon av, en eller flere serin- eller treoninrester i sekvensen til det opprinnelige antistoffet (for O-bundne glykosyleringsster).

Nukleinsyremolekyler som koder for aminosyresekvensvarianter av anti-DR5-antistoffet blir fremstilt ved hjelp av en mengde fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Disse fremgangsmåtene inkluderer isolering fra naturlig kilde (i tilfellet med naturlig forekommende aminosyresekvensvarianter) eller fremstilling ved hjelp av oligonukleotidmediert (eller seterettet) mutagenese, PCR-mutagenese og kassettmutagenese av en tidligere fremstilt variant eller en ikke-variantversjon av anti-DR5-antistoffet.

Glykosyleringen (inkludert glykosyleringsmønsteret) for antistoffet kan også bli endret uten å endre den underliggende nukleotidsekvensen. Glykosylering er i stor grad avhengig av vertscellen som blir benyttet for å uttrykke antistoffet. Siden celletypen som blir benyttet til ekspresjon av rekombinante glykoproteiner, for eksempel antistoffer, som potensielle terapeutiske midler sjelden er den native cellen, så kan vesentlige variasjoner i glykosyleringsmønsteret til antistoffene bli forventet (se f. eks. Hse et al., J. Biol. Chem., 272:9063-9070 (1977)). I tillegg til valget av vertsceller inkluderer faktorer som påvirker glykosylering i løpet av rekombinant produksjon av antistoffer vekstforhold, mediumformulering, kultur tetthet, oksygenering, pH, renseskjeamer og lignende. Forskjellige fremgangsmåter har blitt foreslått for å endre glykosyleringsmønsteret som blir oppnådd i en spesiell vertsorganisme, inkludert introdusering eller overekspresjon av visse enzymer som er involvert i oligosakkaridproduksjon (US patentskrift nr. 5 047 335, 5 510 261 og 5 278 299). Glykosylering, eller visse typer av glykosylering, kan bli enzymatisk fjernet fra glykoproteinet, for eksempel ved å benytte endoglykosidase-H (Endo H). I tillegg kan den rekombinante vertscellen bli genetisk endret, for eksempel gjort ute av stand til prosessere visse typer polysakkarider. Disse og lignende teknikker er velkjente å fagområdet.

Glykosyleringsstrukturen til antistoffer kan enkelt bli analysert ved hjelp av konvensjonelle teknikker for karbohydratanalyse, inkludert lektinkromatografi, NMR, massespektrometri, HPLC, GPC, monosakkarid sammensetningsanalyse, sekvensiell, enzymatisk fordøying og HPAEC-PAD, som benytter antionbytterkromatografi med høy pH for å separere oligosakkarider basert på ladning. Fremgangsmåter for å frigjøre oligosakkarider i analytiske formål er også kjent, og inkluderer uten begrensning enzymatisk behandling (vanligvis utført ved å benytte peptid-N-glykosidase-F/endo- β-glaktosidase), eliminering ved å benytte sterkt alkalisk miljø for å frigjøre i hovedsakt O-bundne strukturer, og kjemiske fremgangsmåter ved å benytte vannfritt hydrazin for å frigjøre både N- og O-bundne oligosakkarider.

(viii) Eksempelmessige antistoffer

Oppfinnelsen som er tilkjennegjort her har et antall eksempelmessige utførelsesformer. En mengde av de typiske utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er beskrevet nedenfor.

Som beskrevet i eksemplene nedenfor har et antall monoklonale anti-DR5-antistoffer blitt identifisert. I en utførelsesform vil DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen ha de samme biologiske karakteristika som ethvert av anti-DR5-antistoffene som spesifikt er tilkjennegjort her.

Uttrykket ”biologiske karakteristika” blir benyttet for å referere til in vitro- og/eller in vivo-aktivitetene eller –egenskapene til det monoklonale antistoffet, slik som evnen til spesifikt å binde til DR5 eller til å blokkere, indusere eller forsterke DR5-aktivering (eller DR5-relaterte aktiviteter). Egenskapene og aktivitene til DR5-antistoffene er ytterligere beskrevet i eksemplene nedenfor.

Eventuelt vil de monoklonale antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse ha de samme biologiske karakteristika som antistoffet 16E2 ellet ethvert av antistoffene som er fremlagt i Tabellene 11-13 og/eller som binder til de samme epitopene som antistoff 16E2, eller ethvert av antistoffene som er samlet i Tabellene 11-13, spesielt Apomab 7.3 eller Apomab 8.3. Dette kan bli bestemt ved å utføre forskjellige analyser, slik som beskrevet her og i eksemplene. For å bestemme hvorvidt et monoklonalt antistoff har den samme spesifisiteten som DR5-antistoffene som spesifikt er referert til her, kan man for eksempel sammenligne dets aktivitet i kompetitive bindingsanalyser eller apoptoseinduksjonsanalyser, slik som de som er beskrevet i eksemplene nedenfor. I tillegg kan en epitop som et spesielt anti-DR5-antistoff binder til, bli bestemt ved hjelp av krystallografisk undersøkelse av komplekset mellom DR5 og antistoffet det er snakk om.

Slik viste en røntgenkrystallografiundersøkelse av komplekset mellom Fabfragmentet til Apomab 7.3 og det ekstracellulære domenet til DR5 at Apomab 7.3 binder til en DR5-epitop som overlapper med, men som fremdeles er forskjellig fra, bindingssetet for Apo2L/TRAIL på DR5-reseptoren.

Humane, kimere, hybride eller rekombinante anti-DR5-antistoffer (i tillegg for eksempel diastoffer eller Triastoffer som er beskrevet her), kan omfatte et antistoff som har full-lengde tungkjeder og full-lengde lettkjeder eller fragmenter derav, slik som et Fab-, Fab’-, F(ab’)2- eller Fv-fragment, en monomer eller dimer av en slik lettkjede eller tungkjede, en enkeltkjede-Fv der en slik tungkjede eller lettkjede er bundet ved hjelp av et linkermolekyl, eller som har variabeldomener (eller hypervariabeldomener) av slike lettkjeder eller tungkjeder, kombinert med enda andre typer av antistoffdomener.

DR5-antistoffene, slik de er beskrevet her, vil eventuelt inneha en eller flere ønskede, biologiske aktiviteter eller egenskaper. Slike DR5-antistoffer kan inkludere, men er ikke begrenset til, kimere, humaniserte, humane og affinitetsmodnede antistoffer. Som beskrevet ovenfor kan DR5-antistoffene bli konstruert eller endret ved å benytte forskjellige teknikker for å oppnå disse ønskede aktivitetene eller egenskapene. I en utførelsesform vil DR5-antistoffet ha en DR5-reseptorbindingsaffinitet på minst 10<5>M<-1>, fortrinnsvis minst i området på 10<6>M<-1>til 10<7>M<-1>, mer foretrukket minst i området 10<8>M<-1>til 10<12>M<-1>og enda mer foretrukket minst i området 10<9>M<-1>til 10<12>M<-1>. Bindingsaffiniteten til DR5-antistoffet kan bli bestemt uten unødvendig eksperimentering ved å teste DR5-antistoffet i overensstemmelse med teknikker som er kjent på fagområdet, inkludert Scatchard-analyse (se Munson et al., ovenfor).

I en annen utførelsesform kan DR5-antistoffet ifølge oppfinnelsen binde den samme epitopen på DR5 som Apo-2L binder til, eller bindende epitop på DR5 som faller sammen med eller som overlapper epitopen på DR5 som Apo-2L binder til, slik som for eksempel antistoffet som er betegnet Apomab 7.3. DR5-antistoffet kan også interagere på en slik måte at det blir dannet en sterisk konformasjon som forhindrer Apo-2-ligand å binde til DR5. Som påpekt ovenfor så kan epitopbindingsegenskapen til et DR5-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse bli bestemt ved å benytte teknikker som er kjent på fagområdet. DR5-antistoffet kan for eksempel bli testet i en in vitro-analyse, slik som en kompetitiv inhiberingsanalyse, for å bestemme evnen til DR5-antistoffet i å blokkere eller inhibere binding av Apo-2L til DR5. DR5-antistoffet kan eventuelt bli testet i en kompetitiv inhiberingsanalyse for å bestemme evnen til DR5-antistoffet i å inhibere binding av et Apo-2L polypeptid til en DR5-IgG-konstruksjon eller til en celle som uttrykker DR5. DR5-antistoffet vil eventuelt være i stand til å blokkere eller inhibere binding av Apo-2L til DR5 med minst 50%, fortrinnsvis med minst 75% og enda mer foretrukket med minst 90%, som kan bli bestemt, for eksempelets del, i en kompetitiv in vitro-inhiberingsanalyse ved å benytte en løselig form av Apo-2-ligand (TRAIL) (slik som 114-281 ekstracellulærdomenesekvensen som beskrevet i Pitti et al., J. Biol., Chem., ovenfor, som også referert til som Apo2L.0) og en DR5-ECD-IgG. Epitopbindingsegenskapen til et DR5-antistoff kan så bli bestemt ved å benytte en in vitro-analyse for å teste evnen til DR5-antistoffet i å blokkere Apo-2L-indusert apoptose, eller ved hjelp av krystallografiske undersøkelser.

I en ytterligere utførelsesform vil DR5-antistoffet omfatte et agonistantistoff som har aktivitet som er sammelignbar med Apo-2-ligand (TRAIL). Et slikt agonist-DR5-antistoff vil fortrinnsvis indusere apoptose i minst én krefttype eller en tumorcellelinje eller primær tumor. Den apoptotiske aktiviteten til et DR5-agonistantistoff kan bli bestemt ved å benytte kjente in vitro- eller in vivo-analyser. Eksempler på en mengde av slike in vitro- og in vivoanalyser er velkjente på fagområdet. In vitro kan apoptotisk aktivitet bli bestemt ved å benytte kjente teknikker slik som anneksin-V-binding. In vivo kan apoptotisk aktivitet bli bestemt ved for eksempel å måle reduksjon i tumorbyrde eller volum.

Som påpekt ovenfor, har antistoffene som er tilkjennegjort her et antall egenskaper inkludert evnen til modulere visse fysiologiske interaksjoner og/eller prosesser. Som vist i eksemplene nedenfor er antistoffer som er tilkjennegjort her i stand til å indusere DR5-mediert apoptose, og viser sterke antitumoregenskaper i forskjellige murine xenograftmodeller for kreft. I en spesifikk utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir den agonistiske aktiviteten til antistoffet forsterket ved å kryssbinde antistoffene med anti-humant IgG-Fc. I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er denne forsterkede apoptosen sammenlignbar med den apoptotiske aktiviteten til Apo-2L.

Ytterligere utførelsesformer ifølge oppfinnelsen inkluderer et anti-DR5-reseptorantistoff som er tilkjennegjort her som her bundet til en eller flere ikke-proteininneholdende polymerer som er valgt fra gruppen som består av polyetylenglykol, polypropylenglykol og polyoksyalkylen. I en alternativ utførelsesform er et anti-DR5-reseptorantistoff som er tilkjennegjort her bundet til et cytotoksisk middel eller et enzym. I nok en annen utførelsesform er et anti-DR5-reseptorantistoff som er tilkjennegjort her bundet til en radioisotop, en fluorescerende forbindelse eller en kjemiluminescerende forbindelse. Et anti-DR5-reseptorantistoff som er tilkjennegjort her er eventuelt glykosylert eller alternativt ikke-glykosylert.

Som diskutert i detalj nedenfor kan antistoffene ifølge oppfinnelsen bli benyttet i en mengde fremgangsmåter for å modulere fysiologiske prosesser. En slik utførelsesform ifølge oppfinnelsen inkluderer en fremgangsmåte for å indusere apoptose i pattedyrceller som omfatter å eksponere pattedyrcellene som uttrykker DR5-reseptor ovenfor en terapeutisk effektiv mengde av et isolert, monoklonalt anti-DR5-reseptorantistoff, som omfatter et antistoff som binder til en DR5-reseptor som vist i Figurene 3A-3C (411 aminosyrer) eller Figurene 4A-4C (440 aminosyrer), spesielt ekstracellulærdomenet derav. I slike fremgangsmåter er pattedyrcellene typisk kreftceller. I foretrukne utførelsesformer er anti-DR5-reseptorantistoffer som blir benyttet i disse fremgangsmåtene et Apomabantistoff som er beskrevet i eksemplene nedenfor, slik som Apomab 7.3- eller Apomab 8.3-antistoff.

Nok en annen utførelsesform av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å indusere apoptose i pattedyrceller som omfatter å eksponere pattedyrcellene som uttrykker DR5-reseptor ovenfor en terapeutisk effektiv mengde av et isolert, monoklonalt anti-DR5-reseptorantistoff, som omfatter et antistoff som binder til DR5-reseptorer som definert ovenfor, eller ekstracellulærdomene derav.

3. Triastoffer

Triastoffer ligger også innenfor omfanget av oppfinnelsen. Slike antistoffer er for eksempel beskrevet i Iliades et al, ovenfor og Kortt et al., ovenfor.

4. Andre modifiseringer

Andre modifiseringer av DR5-antistoffene er omfattet her. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli modifisert ved å konjugere antistoffet til et cytotoksisk middel (slik som et toksinmolekyl) eller en prodrogeaktiverende enzym som konverterer en prodroge (f. eks. et kjemoterapeutisk peptidylmiddel, se WO 81/01145) til et aktivt antikreft legemiddel. Se for eksempel WO 88/07378 og US patentskrift nr. 4 975 278. Denne teknologien ble også referert til som ”Antistoffavhengig, enzymmediert prolegemiddelterapi” (ADEPT).

Enzymkomponenten i immunkonjugatet som er nyttig for ADEPT inkluderer ethvert enzym som er i stand til å virke på en prodroge på en slik måte at det blir konvertert til sin mer aktive, cytotoksiske form. Enzymer som er nyttige i fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen inkluderer alkalisk fosfatase som er nyttig for å konvertere fosfatinneholdende prodroger til frie legemidler, arylsulfatase som er nyttig for å konvertere sulfatinneholdende prodroger til frie legemidler, cytosindeaminase som er nyttig for å konvertere ikke-toksisk 5-fluorcytosin til anti-kreft legemiddelet 5-fluoruracil, proteaser slik som serratia-protease, termolysin, subtilisin, karboksypeptidaser og katepsiner (slik som katepsin-B og –L), som er nyttig for å konvertere peptidinneholdende prodroger til frie legemidler, kaspase slik som kaspase-3, D-alanylkarboksypeptidaser som er nyttig for å konvertere prodroger som inneholder D-aminosyresubstituenter, karbohydratkløyvende enzymer slik som betagalaktosidase og neuraminidase som er nyttig for å konvertere glykosylerte prodroger til frie legemidler, beta-laktamase nyttig for å konvertere legemidler som er derivatisert med betalaktamer til frie legemidler, og penicillingamidaser, slik som penicillin-V-amidase eller penicillin-G-amidase, som er nyttig for å konvertere legemidler som er derivatisert for deres aminnitrogener med henholdsvis fenoksyactyl- eller fenylacetylgrupper, til frie legemidler. Alternativt kan antistoffer med enzymatisk aktivitet, også kjent på området som ”abzymer”, bli benyttet for å konvertere legemidler ifølge oppfinnelsen til frie, aktive legemidler (se f. eks. Massey, Nature, 328:457-458 (1987)). Antistoff-enzymkonjugater kan bli fremstilt som beskrevet her for levering av abzymet til en tumorcellepopulasjon.

Enzymet kan bli kovalent bundet til antistoffene ved hjelp av teknikker som er velkjente på fagområdet, slik som anvendelsen av et heterobifunksjonelt kryssbindingsreagens. Alternativt kan fusjonsproteiner som omfatter minst den antigenbindende regionen til et antistoff ifølge oppfinnelsen, bli bundet til minst én funksjonelt aktiv del av et enzym ifølge oppfinnelsen, konstruert ved å benytte rekominante DNA-teknikker som er velkjente på fagområdet (se f. eks. Neuberger et al., Nature, 312:604-608 (1984).

Ytterligere antistoffmodifiseringer er omfattet. Antistoffet kan for eksempel bli bundet til en av en mengde ikke-proteininneholdende polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylenglykol, polyoksyalkylener eller kopolymerer av polyetylenglykol og polypropylenglykol. Antistoffer kan også bli fanget inn i mikrokapsler som for eksempel er fremstilt ved hjelp av koacerveringsteknikker eller ved hjelp av grenseflatepolymerisering (f.

eks. hydroksymetylcellulose- eller gelatin-mikrokapsler og poly-(metmetacylat)-mikropkapsler i kolloidale legemiddelleveringssystemer (f. eks. liposomer, albumin mikrokulerer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler), eller i makroemulsjoner. Slike teknikker er tilkjennegjort i Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Oslo, A., red. (1980). For å øke halveringstiden til antistoffet i serum, kan man inkorporere en redningsbindingsepitop i antistoffet (spesielt et antistoff-fragment) som for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 739 277. Som benyttet her refererer uttrykket ”redningsreseptorbindingsepitop” til en epitop på Fc-regionen til et IgG-molekyl (f. eks. IgG1, IgG2, IgG3 eller IgG4) som er ansvarlig for å øke halveringstiden in vivo i serum for IgG-molekylet.

Anti-DR5-antisoffene som er tilkjennegjort her kan også bli formulert som immunliposomer. Liposomer som inneholder antistoffet ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten kjent på fagområdet, slik som beskrevet i Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985), Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980) og US patentskrift nr. 4 485 045 og 4 544 545. Liposomer for bedre sirkuleringstid er tilkjennegjort i US patentskrift nr. 5 013 556. Spesielt nyttige liposomer kan bli generert ved hjelp av reversfase avdampningsfremgangsmåten med et lipidpreparat som omfatter fosfatidylkolin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomer blir tvunget gjennom filteret med definert porestørrelse for å gi liposomer med den ønskede diameteren. Fab’-fragmenter av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli konjugert til liposomer som beskrevet i Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982) ved hjelp av en disulfid interendringsreaksjon. Et kjemoterapeutisk middel (slik som doksorubicin) er eventuelt inneholdt inn i liposomet. Se Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989).

Antistoffene ifølge oppfinnelsen inkluderer ”kryssbundne” DR5-antistoffer.

Uttrykket ”kryssbundet” referer slik det blir benyttet her til binding av minst to IgG-molekyler sammen for å danne et (eller enkelt) molekyl. DR5-antistoffene kan bli kryssbundet ved å benytte forskjellige linkermolekyler, og fortrinnsvis bli DR5-antistoffene kryssbundet ved å benytte et anti-IgG-molekyl, komplement, kjemisk modifisering eller molekylær endring. Det er kjent for fagfolk på området at komplement har en relativt høy affinitet for antistoffmolekyler med en gang antistoffene binder til celleoverflatemembranen. Det er antatt at komplement kan bli benyttet som et kryssbindingsmiddel for å binde samme to eller flere anti-DR5-antistoffer som binder celleoverflatemembraner.

5. Rekombinante fremgangsmåter

Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte nukleinsyrer som koder for DR5-antistoffer slik de er tilkjennegjort her, vektorer og vertsceller som omfatter nukleinsyre og rekombinante teknikker for fremstillingen av antistoffet.

For rekombinant produksjon av antistoffet blir nukleinsyren som koder for det isolert og satt inn i en replikerbar vektor for ytterligere kloning (amplifisering av DNA) eller til ekspresjon. DNA som koder for antistoffet kan enkelt bli isolert og sekvensert ved å benytte konvensjonelle prosedyrer (f. eks. ved å benytte oligonukleotidprober som er i stand til å binde spesifikt til gener som koder for antistoffet). Mange vektorer er tilgjengelige. Vektorkomponentene inkluderer generelt, men er ikke begrenset til, en eller flere av de følgende: en signalsekvens, et startsted for replikasjon, et eller flere markørgener, et enhancerelement, en promoter og en transkripsjonstermineringssekvens.

Fremgangsmåten her inkluderer fremgangsmåter for fremstilling av kimere eller rekombinante anti-DR5-antistoffer som omfatter trinnene med å tilveiebringe en vektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for en anti-DR5-antistoff lettkjede eller –tungkjede (eller både en lettkjede og en tungkjede), transfektere eller transformere en vertscelle med denne vektoren og dyrke vertscellene under betingelser som er tilstrekkelig til å produsere det rekombinante anti-DR5-antistoffproduktet.

(i) Signalsekvenskomponent

Anti-DR5-antistoffet ifølge denne oppfinnelsen kan bli fremstilt rekombinant, ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid, som fortrinnsvis er en signalsekvens eller et annet polypeptid som har et spesifikt kløyvingssete på N-terminalen til det modne proteinet eller polypeptidet. Den heterologe signalsekvensen som er valgt er fortrinnsvis en som blir gjenkjent og prosessert (dvs. kløyvd av en signalpeptidase) i vertscellen. For prokaryote vertsceller som ikke gjenkjenner å prosessere den native antistoff signalsekvensen, blir signalsekvensen substituert med en prokaryot signalsekvens som for eksempel er valgt fra gruppen av alkalisk fosfatase, penicillinase, lpp eller varmestabil enterotoksin-II-ledere. For gjærutskilling kan den native signalsekvensen bli substituert med for eksempel gjærinvataselederen, α-faktor lederen (inkludert Saccharomyces og Kluyveromyces α-faktorlederne), eller sur fosfataselederen, C. albicansglukoamylaselederen eller signalet som er beskrevet i WO 90/13646. Ved pattedyrcelle ekspresjon er pattedyrsignalsekvenser i tillegg til sekretoriske virusledere, for eksempel herpeks simpleks-gD-signalet, tilgjengelig.

DNA for en slik forløperregion ble ligert i leserammen til DNA som koder for antistoffet.

(ii) Komponent for startstedet for replikasjon

Både ekspresjons- og kloningsvektorer inneholdt en nukleinsyresekvens som gjør vektoren i stand til å replikere i en eller flere valgte vertsceller. I kloningsvektorer er denne sekvensen generelt en som gjør vektoren i stand til å replikere uavhengig av vertens kromosomale DNA, og inkluderer startstedet for replikasjon eller autonomt replikerende sekvenser. Slike sekvenser er velkjente for en mengde bakterier, gjær og viruser.

Startsted for replikasjon fra plasmidet pBR322 er passende til gram-negative bakterier, startstedet fra 2 μ-plasmidet er passende for gjær og forskjellige virusstartsteder (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er nyttige for kloningsvektorer i pattedyrceller.

Generelt er ikke komponenten med startsted for replikasjon nødvendig for pattedyr ekspresjonsvektorer (Sv40-startstedet kan typisk bli benyttet kun fordi det inneholder den tidligere promoteren).

(iii) Seleksjonsgenkomponent

Ekspresjons- og kloningsvektorer kan inneholde et seleksjonsgen, også betegnet en selekterbar markør. Typiske seleksjonsgener som koder for proteiner som (a) overføres resistent ovenfor antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, metotreksat og tetrasyklin, (b) komplementerer auxotrofe mangler, eller (c) tilfører kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra kompleksmedium, for eksempel genet som koder for D-alaninracematet for Bacilli.

Et eksempel på seleksjonsskjema benytter et legemiddel for å stoppe veksten av en vertscelle. Cellene som blir vellykket transformert med et heterologt gen produserer et protein som overfører legemiddelresistens og overlever slik seleksjonsregime. Eksempler på slik dominant seleksjon benytter legemidlene neomycin, mykofenolsyre og hygromycin.

Et annet eksempel på passende, selekterbare markører for pattedyrceller er de som er mulige for identifisering av celler som er kompetente til å ta opp antistoffnukleinsyre, slik som DHFR, tymidinkinase, metallotionein-I og –II, fortrinnsvis primat-metallotioneingener, adenosindeaminase, ornitindekarboksylase osv.

Celler som er transformert med DHFR-seleksjonsgenet blir for eksempel først identifisert ved å dyrke alle transformantene i et kulturmedium som inneholder metotreksat (Mtx), som er en kompetitiv antagonist av DHFR. En passende vertscelle, når villtype DHFR blir benyttet, er den kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet.

Alternativt kan vertsceller (spesielt villtype verter som inneholder endogent (DHFR) som er transformert eller kotransformert med DNA-sekvenser som koder for anti-DR5-antistoffet, villtype-DHFR-protein og en annen selekterbar markør slik som aminoglykosid-3’-fosfotransferase (APH) ble valgt av cellevekst i medium inneholdende et seleksjonsmiddel for den selekterbare markøren slik som et aminoglykosid antibiotikum, for eksempel kanamycin, neomycin eller G418. Se US patentskrift nr. 4 965 199.

Et passende seleksjonsgen til anvendelse i gjær er et trp1-gen som foreligger på gjærplasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). Trp1-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant stamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977).

Tilstedeværelsen av trp1-lesjonen i gjærvertscellegenomet tilveiebringer da et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved vekst i fraværet av tryptofan. Likeledes er Leu2-manglende gjærstammer (ATCC 20 6662 eller 38 626 komplementert ved hjelp av kjente plasmider som bærer Leu2-genet.

I tillegg kan vektorer som er avledet fra det sirkulære plasmidet pKD1 på 1,6 μg bli benyttet til transformasjon av Kluyveromyces-gjær. Et ekspresjonssystem for storskalaproduksjon av rekombinant kalvekymosin ble alternativt rapportert for K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Stabile multikopi ekspresjonsvektorer for utskilling av modent, rekombinant, humant serumalbumin ved hjelp av industrielle stammer av Kluyveromyces har også blitt tilkjennegjort. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(iv) Promoterkomponent

Ekspresjon- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promoter som blir gjenkjent av vertsorganismen og er opererbart bundet til antistoff nukleinsyren. Promotere som er passende til anvendelse med prokaryote verter inkluderer phoA-promoteren, βlaktamase- og laktosepromotersystemer, alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp)-promotorsystem og hybridpromotorer slik som tac-promotoren. Andre kjente bakterielle promotorer er likevel også passende. Promotorer til anvendelse i bakteriesystemer vil også inneholde en Shine-Delgarno (S.D.)-sekvens opererbart bundet til DNA som koder for anti-DR5-antistoffet.

Promotersekvenser er kjent for eukaryoter. Nesten alle eukaryote gener har en AT-rik region lokalisert omtrent 25 til 30 baser oppstrøms fra setet der transkripsjonen blir satt i gang. En annen sekvens som blir funnet 70 til 80 baser oppstrøms fra startstedet for transkripsjonen på mange gener er en CNCAAT-region der N kan være ethvert nukleotid. På den 3’ enden av de fleste eukaryote gener foreligger en AATAAA-sekvens som kan være signalet for påsetting av poly-A-halen på den 3’ enden av den kodende sekvensen. Alle disse sekvensene kan hensiktsmessig bli innsatt i eukaryote ekspresjonsvektorer.

Eksempler på passende promotorsekvenser til anvendelse med gjærverter inkluderer promotorene for 3-fosfoglyceratkinase eller andre glykolytiske enzymer slik som enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfotruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase.

Andre gjærpromotorer, som er induserbare promotorer som har det ytterligere fortrinnet å være transkripsjonskontrollert ved vekstbetingelser, er promotorregionene for alkoholdehydrogenase-2, isocytokrom-C, sur fosfatase, degraderende enzymer som er asosisert med nitrogenmetabolisme, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlig for maltose- og galaktoseomsetning. Passende vektorer og promotorer til anvendelse ved gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i EP 73 657.

Gjærenhancere blir også fordelaktig benyttet sammen med gjærpromotore.

Anti-DR5-antistofftranskripsjon fra vektorer i pattedyrvertsceller blir for eksempel kontrollert med promotorer som er fremskaffet fra genomene til virus slik som polyomavirus, fuglekoppevirus, adenovirus (slik som adenovirus-2), bovint papillomvirus, fuglesarkomvirus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt-B-virus og mest foretrukket apevirus-40 (SV40), fra heterologe pattedyrpromotorer, for eksempel aktinpromotoren eller en immunglobulinpromotor, fra varmesjokk promotorer, gitt at slike promotorer er kompatible med vertscellesystemer.

De tidlige og sene promotorene i SV40-viruset blir hensiktsmessig fremskaffet som et SV40-restriksjonsfragment som også inneholder replikasjonsstartestedet fra SV40-viruset. Den umiddelbart tidligere promotoren fra det humane cytomegaloviruset blir hensiktsmessig fremskaffet som et HindIII E restriksjonsfragment. Et system for å uttrykke DNA i pattedyrverter ved å benytte det bovine papillomvirus som en vektor er tilkjennegitt i US patentskrift nr. 4 419 446. En modifisering av dette systemet er beskrevet i US patentskrift nr. 4 601 978. Se også Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) som gjelder ekspresjon av humant β-interferon-cDNA i museceller under kontrollen av en tymidinkinasepromotor fra herpes simpleks virus. Alternativt kan den lange, terminale repetisjon fra Rous-sarkomvirus bli benyttet som promotoren.

(v) Enhancer elementkomponent

Transkripsjon av et DNA som koder for anti-DR5-antistoff ifølge denne oppfinnelsen med høyere eukaryoter blir ofte økt ved å sette inn en enhancersekvens i vektoren. Mange enhancersekvenser er kjent fra pattedyrgener (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein og insulin). Typisk vil man likevel benytte en enhancer fra et eukaryot cellevirus. Eksempler inkluderer SV40-enhanceren på den sene siden av replikasjonsstartstedet (bp 100-270), den tidlige promotorenhanceren fra cytomegalovirus, polyoma-enhanceren på den sene siden av replikasjonstartstedet og adenovirus enhancere. Se også Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) som gjelder enhancerelementer for aktivering av eukaryote promotorer.

Enhanceren kan bli spleiset inn i vektoren på en posisjon som ligger 5’ eller 3’ i forhold til den antistoffkodende sekvensen, men er fortrinnsvis lokalisert på et sted som ligger 5’ i henhold til promotoren.

(vi) Transkripsjonstermineringskopmonent

Ekspresjonsvektorer som blir benyttet i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, innsekter, planter, dyr, mennesker eller celler med kjerner fra andre flercellede organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendig for terminering eller transkripsjon for å stabilisere mRNA. Slike sekvenser er allment tilgjengelige fra de 5’, og av og til de 3’, ikketranslaterte regionene fra eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse regionene inkluderer neuklotidsegmenter som blir transkribert som polyadenylerte fragmenter i den ikketranslaterte delen av mRNA som koder for det multivalente antistoffet. En nyttig transkripsjonstermineringskomponent er den bovine veksthormon polyadenyleringsregion. Se WO 94/11026 og ekspresjonsvektoren som er tilkjennegjort der.

(vii) Seleksjon og transformering av vertsceller

Passende vertsceller til kloning eller ekspresjon av DNA i vektorene her er de prokaryote cellene, gjærcellene eller høyere eukaryote cellene som er beskrevet ovenfor. Passende prokaryoter for dette formål inkluderer eubakterier, slik som gram-negative eller gram-positive organismer, for eksempel Enterobacteriaceae slik som Esherichia, for eksempel E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella, i tillegg til Bacilli, slik som B. subtilis og B. licheniformis (f. eks. B. licheniformis 41P som er tilkjennegjort i DD 266 710, publisert 12. april, 1989), Pseudomonas slik som P. aeruginosa og Streptomyces. En foretrukket E. coli-kloningsvert er E. coli 294 (ATCC 31 446), selv om andre stammer slik som E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31 537) og E. coli W3110 (ATCC 27 325) er tilgjengelige. Disse eksemplene er illustrerende.

I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober slik som filamentøse sopper eller gjær passende klonings- eller ekspresjonsverter for DR5-antistoffkodende vektorer.

Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest vanlig benyttede blant lavere, eukaryote vertsmikroorganismer. Et antall andre slekter, arter og stammer er likevel allment tilgjengelige og nyttige her, slik som Schizosaccharomyces pombe;

Kluyveromyces-verter slik som for eksempel K. lactis, K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906), K. thermotolerans og K. marxianus, yarrowia (EP 402 226), Pichia pastoris (EP 183 070), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa, Schwanniomyces slik som Schwanniomyces occidentalis, og filamentøse sopper slik som for eksempel verter av Neurospora, Penicillium, Tolypocladium og Aspergillus slik som A. nidulans og A. niger.

Passende vertsceller for ekspresjonen av glykosylert antistoff er avledet fra flercelleorganismer. Eksempler på celler som ikke er fra virveldyr inkluderer planteceller og innsektsceller. Mange baculovirusstammer og varianter og tilsvarende permissive innsektsvertsceller fra verter slik som Spodoptera frugiperda (larve), Aedes aegypti (mygg), Aedes albipictus (mygg), Drosophila melanogaster (bananflue) og Bombyx mori har blitt identifisert. En mengde virusstammer for transfeksjon er allment tilgjengelig, for eksempel L-1-varianten av Autographa californica NPV og Bm-5-stammen av Bombyx mori NPV, og slike virus kan bli benyttet som viruset her i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, spesielt til transfeksjon av Spodoptera frugiperda-celler.

Plantecellekulturer av bomull, mais, potet, soyabønne, petunia, tomat og tobakk kan også benyttes som verter.

Interessen har likevel vært størst for virveldyrceller, og frembringelse av virveldyrceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre. Eksempler på nyttige pattedyrvertscellelinjer er apenyre-CV1-linjen transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), humant, embryonal nyrelinje (293- eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjonskultur, Gramhan et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)), babyhamster nyrecelle (BHK, ATCC CCL 10), kinesisk hamster ovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), musesertoliceller (TM4, Mather, biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), apenyreceller (CV1 ATC CCCL 70), afrikansk grønnape nyreceller (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane cervixs karsinomceller (HELA, ATCC CCL 2), hundenyrecelle (MDCK, ATCC CCL 34), bøffelrotte leverceller (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G2, HB 8065), musebrysttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI-celler (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)), MRC5-celler, FS4-celler, en human hepatomlinje (Hep G2) og myelom- eller lymfoceller (f. eks. Y0, J558L, P3 og NS9-celler) (se US patentskrift nr. 5 807 715).

Vertsceller blir transformert med ekspresjonsvektorene og kloningsvektorene som er beskrevet ovenfor for antistoffproduksjon og dyrket i konvensjonelt næringsmedium som er modifisert slik det er hensiktsmessig for å indusere promotorer, selektere transformanter eller amplifisere genene som koder for de ønskede sekvensene.

(viii) Dyrking av vertsceller

Vertscellene som blir benyttet for å produsere antistoffer ifølge denne oppfinnelsen kan bli dyrket i en mengde forskjellige medier. Kommersielt tilgjengelig medium slik som Hams F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) og Dulbeccos Modified Eagles Medium ((DMEM), Sigma) er passende for å dyrke vertscellene. I tillegg kan ethvert av mediene som er beskrevet i Ham et al. Meth. ENzy. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), US patentskrift nr. 4 767 704, 4 657 866, 4 927 762, 4 560 655 eller 5 122 469, WO 90/03430, WO 87/00195 eller US patentskrift Re 30 985 ble benyttet som kulturmedium for vertscellene. Ethvert av disse mediene kan bli tilsatt slik det er nødvendig med hormoner og/eller andre vekstfaktorer (slik som insulin, transferrin eller epidermal vekstfaktor), salter (slik som natriumklorid, kalsium, magnesium og fosfat), buffere (slik som HEPES), nukleotider (slik som adenosin og tymidin), antibiotika (slik som Gentamycin-legemiddel), sporstoffer (definert som uorganiske forbindelser som vanligvis foreligger ved sluttkonsentrasjoner i mikromolare områder) og glukose eller en ekvivalent energikilde. Ethvert annet nødvendig tilskudd kan også bli inkludert ved passende konstellasjoner som vil være kjent for fagfolk på området. Dyrkningsbetingelsene, slik som temperatur, pH og lignende, er de som tidligere er benyttet med vertscellen som er valgt til ekspresjon og vil være åpenbare for fagfolk på området.

(ix) Rensing

Når man benytter rekombinante teknikker kan antistoffet bli fremstilt intracellulært i det periplasmatiske hulrommet, eller direkte utskilt i mediet. Hvis antistoffet blir produsert intracellulært, blir som et første trinn det partikulære avfallet, enten vertsceller eller lyserte fragmenter, fjernet, for eksempel ved hjelp av sentrifugering eller ultrafiltrering. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) beskriver en prosedyre for å isolere antistoffer som blir utskilt i det periplasmatiske hulrommet i E. coli. Kort fortalt blir celler tint i nærvær av natriumacetat (pH 3,5), EDTA og fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) i løpet av omtrent 30 minutter. Celleavfall kan bli fjernet ved hjelp av sentrifugering. Der antistoffet blir utskilt i medium, blir supernatanter fra slike ekspresjonssystemer vanligvis først konsentrert ved å benytte et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, for eksempel en Amiconeller Millipore Pellicon-ultrafilteringsenhet. En proteaseinhibitor slik som PMSF kan bli inkludert i ethvert av de foregående trinnene for å inhibere proteolyse og antibiotika kan bli inkludert for forhindre veksten av skadelige kontaminanter.

Antistoffpreparatet som ble fremstilt fra cellene kan bli renset ved for eksempel å benytte hydroksylapatittkromatografi, gelelektroforese, dialyse og affinitetskromatografi, der affinitetskromatografi er foretrukket som renseteknikk. Hensiktsmessigheten av protein-A som en affinitetsligand er avhengig av typene og isotypen av enhver immunglobulin-Fc-region som foreligger på antistoffet. Protein-a kan bli benyttet for å rense antistoffer som er basert på humane γ1-, γ2- eller γ4-tungkjeder (LIndmark et al., J.

Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). Protein-G er anbefalt for alle museisotyper og for human γ3 (Guss et al., EMBO J., 5:15671575 (1986)). Matriksen som affinitetsliganden er festet til er oftest agarose, men andre matriser er tilgjengelige. Mekanisk stabile matriser slik som kontrollert poreglass eller poly(styrendivinyl)benzen muliggjør raskere strømningshastigheter og kortere prosesseringstider enn det som kan bli oppnådd med agarose. Der antistoffet omfatter et CH3-domene, er Bakerbond ABX-harpiks (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), nyttig til rensing. Andre teknikker for proteinrensing slik som fraksjonering på en ionebytterkolonne, etanolpresipitering, reversfase-HPLC, kromatografi på silika, kromatografi på heparin-Sepharose, kromatografi på et anion- eller kationbytterharpiks (slik som en polyasparaginsyrekolonne), kromatofokusering, SDS-PAGE og ammoniumsulfatpresipitering, er også tilgjengelig avhengig av antistoffet som skal bli gjenvunnet.

B. Anvendelser av DR5-antistoffer

DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen har forskjellige anvendelser.

DR5 er kjent for å mediere apoptosesignalisering. Selv om flere typer av normale celler uttrykker DR5, ser apoptosesignalisering gjennom denne reseptoren ut til å være begrenset primært til tumorceller, som blir mer utsatt for dødsreseptormediert apoptose i konteksten av deres transformasjon ved onkogener slik som MYC eller RAS (Wang et al., Cancer Cell, 5:501-12 (2004), Nesterov et al., Cancer Res., 64:3922-7 (2004)). DR5 blir hyppig uttrykt av humane kreftcellelinjer i tillegg til av primære tumorer. ANti-DR5-antistoffer finder slik anvendelse i diagnosen og behandlingen av kreft. DR5-agonist-antistoffer kan for eksempel bli benyttet i fremgangsmåter for å behandle kreft hos pattedyr, inkludert mennesker. I disse fremgangsmåtene blir DR5-antistoffet, fortrinnsvis et agonistantsitoff, administrert til et pattedyr, alene eller i kombinasjon med andre terapeutiske midler eller teknikker. Kreften kan være enhver type av DR5-uttrykkende kreft, inkludert faste tumorer, spesielt fremskredne eller metastatiske, faste tumorer som har utviklet seg ved tidligere terapi eller for hvilke det ikke finnes noen effektiv kjent terapi. Spesielle krefttyper inkluderer uten begrensning, kolorektalkreft, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), pankreaskreft, ovariekreft, brystkreft, non-Hodgkins lymfom (NHL), glioblastom eller melanom, fortrinnsvis kolorektal kreft, NSCLC eller NHL.

I tillegg er DR5-antistoffer nyttige i diagnostiseringen og behandlingen av andre DR5-assosierte, patologiske tilstander, slik som immunrelaterte sykdommer hos pattedyr, inkludert mennesker.

Diagnostisering hos pattedyr av de forskjellige patologiske tilstander som er beskrevet her kan bli utført av erfarne fagfolk. Diagnostiske teknikker er tilgjengelige på fagområdet, som for eksempel muliggjør diagnostiseringen eller påvisningen av kreft eller immunrelaterte sykdommer hos et pattedyr. Kreft kan for eksempel bli identifisert via teknikker, inkludert palpatasjon, blodanalyse, røntgen, NMR og lignende.

Immunrelaterte sykdommer kan også lett bli identifisert.

I systemisk lupus erytematosus er den sentrale mediatoren av sykdom produksjon av autoreaktive antistoffer mot selvproteiner/vev og den påfølgende genereringen av immunmediert inflammasjon. Flere organer og systemer blir rammet klinisk, inkludert nyre, lunge, muskelskjellettsystemet, slimhinne, øynene, sentralnervesystemet, det kardiovaskulære systemet, gastrointestinal traktus, benmarg og blod.

Reumatoid artritt (RA) er en kronisk, systemisk, inflammatorisk autoimmun sykdom som i hovedsak involverer synovialmembranen i mange ledd med påfølgende skade på den artikulære brusken. Patogenesen er T-lymfocyttavhengig og er assosiert med produksjon av reumatoide faktorer, autoantistoffer som er rettet mot selv-IgG, med den påfølgende dannelsen av immunkomplekser som opprettholdes i høye nivåer i leddvæske og i blod. Disse kompleksene i leddet kan indusere den markerte infiltreringen av lymfocytter og monocytter inn i synovium og påfølgende, markerte synovialendringer, leddhulrom/væsken hvis infiltrert av tilsvarende celler med tillegget av utallige neutrofiler. Vev som blir rammet er primært leddene, ofte i symmetrisk mønster. Ekstraartikulær sykdom forekommer likevel også i to hovedformer. En form er utviklingen av ekstraartikulære lesjoner med pågående progressiv leddsykdom og typiske lesjoner med pulmonær fibrose, vaskulitt og kutane sår. Den andre formen av ekstraartikulær sykdom er det såkalte Feltys syndrom som foregår sent i RA-sykdomsutviklingen, noen ganger etter at leddsykdom har blitt synlig, og involverer tilstedeværelsen av neutropeni, trombocytopeni og spelnomegali.

Dette kan bli fulgt av vaskulitt i flere organer med dannelse av infarkter, hudsår og gangrene. Pasienter utvikler også ofte reumatoide knuter i underhudsvev som ligger over rammede ledd, knutenes senestadium har nekrotiske sentere omgitt av blandede, inflammatoriske celleinfiltrater. Andre manifestasjoner som kan forekomme ved RA inkluderer: perikarditt, pleuritt, koronar artritt, interstitiell pneumonitt med pulmonær fibrose, keratokonjuktivitis sikka og reumatoide knuter.

Juvenil kronisk artritt er en kronisk, idiopatisk inflammatorisk sykdom som ofte begynner ved en alder på mindre enn 16 år. Dens fenotype har noen likheter med RA, noen pasienter som er reumatoid faktorpositiv blir klassifisert som juevenil reumatoid artritt. Sykdommen blir underklassifisert i tre hovedkategorier: pausiartikulær, polyartikulær og systemisk. Artritten kan være alvorlig og er typisk destruktiv og fører til leddankylose og hemmet vekst. Andre manifestasjoner kan inkludere kronisk anterior uveitt og systemisk amyloidose.

Spondyloartropatier er en gruppe av forstyrrelser med noen felles kliniske egenskaer og den vanlige assosieringen med ekspresjonen av HLA-B27-genprodukt.

Forstyrrelsene inkluderer: ankyloserende spondylitt, Reiters syndrom (reaktiv artritt), artritt assosiert med inflammatorisk tarmsykdom, spondylitt assosiert med psorasis, spondyloartropati hos barn og ikke-differensiert spondyloartropati. Spesielle egenskaper inkluderer sakroileititt med eller uten spondylitt, inflammatorisk asymmetrisk artritt, assosiert med HLB-B27 (et serologisk definert allel av HLA-B-lokuset i klasse-I-MHC), okkular inflammasjon og fravær av autoantistoffer som er assosiert med andre reumatoide sykdommer. Cellen som er mest implisert som nøkkel til induksjon av sykdommen er CD8+ T-lymfocytten, en celle som målsøker antigen som er presentert av klasse-I MHC-molekyler. CD8+ T-celler kan reagere mot klasse-I-MHC-allelet HLA-B27 som om det var et fremmed peptid uttrykt av MHC-klasse-I-molekylet. Det har blitt fremlagt en hypotese om at en epitop på HLA-B27 kan herme en bakteriell antigenepitop eller annen mikrobe antigenepitop og slik indusere en CD8-T-cellerespons.

Systemisk sklerose (skleroderma) har en ukjent etiologi. Et kjennetegn med sykdommen er fortykkelse av huden, og dette blir sannsynlig indusert ved en aktivt, inflammatorisk prosess. Skleroderma kan være lokalisert eller systemisk, vaskulære lesjoner er vanlige og endotelcelleskade i mikrovaskulaturet er en tidlig og viktig hendelse i utviklingen av systemisk sklerose, den vaskulære skaden kan være immunmediert. En immunologisk basis er implisert ved tilstedeværelsen av mononukleære celleinfiltrater i de kutane lesjonene og tilstedeværelsen av anti-nukleære antistoffe rhos mange pasienter. ICAM-1 er ofte oppregulert på celleoverflaten til fibroblaster i hudlesjoner, noe som tyder på at T-celleinteraksjon med disse cellene kan spille en rolle i patogenesen til sykdommen. Andre organer som er involvert inkluderer: gastrointestinal traktus: glattmuskel atrofi og fibrose som fører til unormal peristalsis/bevegelighet, nyre: konsentrisk, subendotel, intimal proliferasjon som rammer små buede og interlobulære arterier med resulterende redusert blodgjennomstrømning i nyrebarken, som fører til proteinuri, azotemi og hypertensjon, skjellettmuskel, atrofi, interstitiell fibrose, inflammasjon, lunge: interstitiell pneumonitt og interstitiell fibrose, og hjerte: kontraksjonsbånd nekrose, arrdannelse/fibrose.

Idiopatiske, inflammatoriske myopatier, inkludert dermatomyositt, polymyositt og andre, er forstyrrelser med kronisk muskelinflammasjon av ukjent etiologi som fører til muskelsvakhet. Muskelskade/inflammasjon er ofte symmetrisk og progressiv.

Autoantistoffer er assosiert med de fleste formene. Disse myosittspesifikke autoantistoffene er rettet mot og inhiberer virkningen av komponenter, proteiner og RNA som er involvert i proteinsyntese.

Sjøgrens syndrom skyldes immunmediert inflammasjon og påfølgende funksjonell ødeleggelse av tårekjertlene og spyttkjertlene. Sykdommen kan være assosiert med eller fulgt av inflammatoriske bindevevssykdommer. Sykdommer assosiert med autoantistoffproduksjon mot Ro- og La-antigener, der begge disse er små RNA-proteinkomplekser.

Lesjoner fører til keratokonjuktivitis sikka, xerostomi, med andre manifestasjoner eller assosiasjoner inkludert billiær cirrhose, perifer eller sensorisk neuropati og palpabel purpura.

Systemisk vaskulitt inkluderer sykdommer der den primære lesjonen er inflammasjon og påfølgende skade på blodkar som fører til iskemi/nekrose/degenerering av vev som blir tilført blod av de rammede blodkarene og eventuell endeorgan feilfunksjon, i noen tilfeller. Vaskulitider kan også forekomme som en sekundær lesjon eller sekveler på andre immuninflammatoriskmedierte sykdommer slik som reumatoid artritt, systemisk sklerose osv., spesielt i sykdommer som også er assosiert med dannelsen av immunkomplekser. Sykdommer i den primære, systemisk vaskulittgrupper inkluderer: systemisk nekrotiserende vaskulitt: polyartritis nodosa, allergisk angitt og granulomatose, polyangitt, Wegeners granulomatose, lymfomatoid granulomatose og storcelle artritt. Forskjellige vaskulitider inkluderer: mukokutant lymfeknutesyndrom (MLNS eller Kawasakis sykdom), isolert CNS-vaskulitt, Behet sykdom, tromboangitis obliterans (Buergers sykdom) og kutan nekrotiserende venulitt. Den patogene mekanismen for de fleste typene av vaskulitt som er fremlagt er antatt primært å skyldes deponeringen av immunglobulinkomplekser i karveggen og påfølgende induksjon av en inflammatorisk respons enten via ADCC, komplementaktivering eller begge.

Sarkoidose er en tilstand med ukjent etiologi som er karakterisert ved tilstedeværelsen av epiteloide granulomer i nær sagt ethvert vev i kroppen, involvering i lungen er mest vanlig. Patogenesen involverer ved varigheten av aktiverte makrofager og lyfoidceller på steder med sykdommen med påfølgende kroniske sekveler som skyldes frigjøringen av lokale og systemisk aktive produkter som blir frigjort av disse celletypene.

Autoimmun hemolyttisk anemi, inkludert autoimmun hemolyttisk anemi, immun pancytopeni og paroksysmal nokturnal hemoglobinuri er et resultat av produksjon av antistoffer som reagerer med antigener som er uttrykt på overflaten av røde blodceller (og i noen tilfeller andre blodceller inkludert plater) og er en refleksjon av fjerningen av disse antistoffbelagte cellene via komplementmediert lysis og/eller ADCC/Fc-reseptormedierte mekanismer.

I autoimmun trymbocytopeni, inkludert trombocytopenisk purpura og immunmediert trombocytopeni i andre kliniske settinger foregår plateødeleggelse/fjerning som et resultat av at enten antistoff eller komplement fester seg på plater og påfølgende fjerning ved komplementlysis, ADCC eller Fc-reseptormedierte mekanismer.

Tyroiditt, inkludert Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt og atropisk tyroiditt, er resultatet av en autoimmunrespons mot tyroide antigener med produksjon av antistoffer som reagerer med proteiner som foreligger i og som ofte er spesifikke for tyroidkjertelen. Eksperimentelle modeller foreligger, inkludert spontane modeller: rotter (BUF- og BB-rotter) og høns (overvektig hønsestamme), induserbare modeller, immunisering av dyr med enten tyroglobulin, tyroid mikrosomalt antigen (tyroid peroksidase).

Diabetes mellitus type I eller insulinavhengig diabetes er den autoimmune ødeleggelsen av pankreas- β-øyceller, og denne ødeleggelsen blir mediert ved autoantistoffer og autoreaktive T-celler. Antistoffer mot insulin eller insulinreseptoren kan også produsere fenotypen med insulin-ikke-responsivitet.

Immunmedierte nyresykdommer, inkludert glomerulonefritt og tubulointerstitiell nefritt er resultatet av antistoff- eller T-lymfocyttmediert skade på nyrevev enten direkte som et resultat av produksjon av autoreaktive antistoffer eller T-celler mot nyreantigener eller indirekte som et resultat av deponeringen av antistoffer og/eller immunkomplekser i nyrene som er reaktive mot andre, ikke-nyreantigener. Andre immunmedierte sykdommer som fører til dannelsen av immunkomplekser kan slik også indusere immunmedierte nyresykdommer som en indirekte følgesykdom. Både direkte og indirekte immunmekanismer fører til inflammatorisk respons som produserer/induserer lesjonsutvikling i nyrevev med påfølgende organfunksjonssvikt og i noen tilfeller progresjon til nyresvikt. Både humorale og cellulære immunmekanismer kan være involvert i patogenesen til lesjoner.

Demyelinerende sykdommer i sentralnervesystemet og det perifere nervesystemet, inkludert multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barrsyndrom, og kronisk inflammatorisk demyelinerende polyneuropati, er antatt å ha en autoimmun basis og fører til nervedemyelinering som et resultat av skade forårsaket på oligodendrocytter eller direkte på myelin. I MS foreligger det bevis som tyder på at sykdomsinduksjon og progresjon er avhengig av T-lymfocytter. Multippel sklerose er en demyelinerende sykdom som er T-lymfocyttavhengig og som enten har en tilbakefallende utvikling eller en kronisk, progressiv utvikling. Etiologien er ukjent, likevel bidrar virusinfeksjoner, genetisk predisponering, miljø og autoimmunitet til denne. Lesjoner inneholder infiltrater av i hovedsak T-lymfocyttmedierte mikrogliceller og infiltrerende makrofager, CD4+T-lymfocytter er den fremherskende celletypen i lesjoner. Mekanismen for oligodendrocyttcelledød og påfølgende demyelinering er ikke kjent, men er sannsynligvis T-lymfocyttdrevet.

Inflammatorisk og fibrotisk lungesykdom, inkludert eosinofile lungebetennelser, idiopatisk pulmonær fibrose og hypersensitivitets lungebetennelse kan involvere en feilregulert immuninflammatorisk respons. Inhibering av denne responsen vil være et terapeutisk fortrinn.

Autoimmun eller immunmediert hudsykdom inkludert bulløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt blir mediert av autoantistoffer, der fremkomsten av disse er T-lymfocyttavhengig.

Psoriasis er en T-lymfocyttmediert, inflammatorisk sykdom. Lesjoner inneholder infiltrater av T-lymfocytter, makrofager og antigenprosesserende celler, og noen neutrofiler.

Allergiske sykdommer, inkludert astma, allergisk rinitt, atopisk dermatitt, matvare hypersensitivitet og urtikaria er T-lymfocyttavhengige. Disse sykdommene blir i hovedsak mediert ved T-lymfocyttindusert inflammasjon, IgE-mediert inflammasjon eller en kombinasjon av begge.

Transplantasjonsassosierte sykdommer, inkludert transplantatavstøting og transplantat versus vertssykdom (GVHD) er T-lymfocyttavhengig, og inhibering av T-lymfocyttvirkning er lindrende.

Andre sykdommer der intervensjon av immun- og/eller inflammasjonsresponsen er en fordel er smittsomme sykdommer inkludert virusinfeksjon (inkludert AIDS, hepatitt-A, -B, -C, -D, -E) bakterieinfeksjoner, soppinfeksjoner og protozol- og parasittinfeksjoner (molekyler (eller derivater/agonister) som stimulerer MLR, kan bli benyttet terapeutisk for å forsterke immunresponsen ovenfor smittsomme midler), immunsviktsykdommer (molekyler/derivater/agonister) som stimulerer MLR kan bli benyttet terapeutisk for å forsterke immunresponsen for tilstander som er arvet, pådratt, infeksjonsinduserte (som HIV-infeksjon) eller iatrogene (dvs. fra kjemoterapi) immunsvikt) og neoplasi.

Antistoffet blir fortrinnsvis administrert til pattedyret i en bærer, fortrinnsvis en farmasøytisk akseptabel bærer. Passende bærere og deres formuleringer er beskrevet i Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. utg., 1980, Mack Publishing Co., utgitt av Olso et al. Typisk blir en passende mengde av et farmasøytisk akseptabelt salt benyttet i formuleringen for å gjøre formuleringen isoton. Eksempler på bærerne inkluderer fysiologisk saltløsning, Ringers løsning og dekstroseløsning. Ph i løsningen er fortrinnsvis fra omtrent 5 til omtrent 8, mer foretrukket fra omtrent 7 til omtrent 7,5. Ytterligere bærere inkluderer preparter med vedvarende frigjøring slik som halvgjennomtrengelige matriser av faste hydrofobe polymerer som inneholder antistoffet, der matrisene foreligger i form av formgitte artikler, for eksempel filmer, liposomer eller mikropartikler. Det er åpenbart for fagfolk på området at visse bærere kan være mer fordelaktig avhengig av for eksempel administreringsmåten og konsentrasjonen av antistoffet som blir administrert.

Antistoffet kan bli administrert til pattedyr ved hjelp av injeksjon (f. eks. intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulært, intraportal), eller ved hjelp av andre fremgangsmåter slik som infusjon som sikrer dets levering til blodstrømmen i en effektiv form. Antistoffet kan også bli administrert ved hjelp av isolerte perfusjonsteknikker, slik som isolert vevsperfusjon for å utøve lokale terapeutiske effekter. Lokal eller intravenøs injeksjon er foretrukket.

Effektive doseringer og skjemaer for administrering av antistoffet kan bli bestemt empirisk, og slike bestemmelser ligger innfor kunnskapen på fagområdet. Fagfolk på området vil være på det rene med at doseringen av antistoff som må bli administrert vil variere avhengig av for eksempel pattedyret som skal motta antistoffet, administreringsmåten, den spesielle typen antistoff som blir benyttet og andre legemidler som blir administrert til pattedyret. Rettledning i valg av passende doser for antistoff blir funnet i litteraturen og terapeutiske anvendelse av antistoffer, for eksempel Handbook og Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., red., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985), kap. 22 og s. 303-357, Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Hber et al., red., Raven Press, New York (1977), s. 365-389. En typisk daglig dosering av antistoffet benyttet alene kan strekke seg fra omtrent 1 μg/kg til opp til 100 mg/kg per kroppsvekt eller mer per dag, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor.

Antistoffet kan også bli administrert til pattedyret i kombinasjon med effektive mengder av et eller flere andre terapeutiske midler. I behandlingen av kreft gjelder dette spesielt, siden mange tumorer pådrar seg resistens ovenfor kjemoterapi eller radioterapi via aktivering av p53-tumor suppressorgenet. Siden DR5 simulerer apoptoseuavhengig p53, er den antatt å være klinisk nyttig, ikke bare som et enkelt middel, men også i kombinasjon med andre typer av kreftbehandling, slik som for eksempel kjemoterapi (kjemoterapeutiske midler), strålingsterapi, immunadjuvanser, vekstinhibitoriske midler, cytotoksiske midler og/eller cytokiner. Andre midler som er kjent for å indusere apoptose i pattedyrceller kan også bli benyttet, og slike midler inkluderer TNF-alfa, TNF-beta, CD30-ligand, 4-1BB-ligand og Apo-2-ligand, i tillegg til andre antistoffer som kan indusere apoptose. De en eller flere andre terapiene kan inkludere terapeutiske antistoffer (forskjellig fra DR5-antistoffet) og slike antistoffer kan inkludere anti-Her-reseptorantistoffer (slik som Herceptin (trastuzumab), Genentech, Inc.), anti-VEGF-antistoffer, anti-CD20-antistoffer (slik som Rituxan (rituximab), Genentech, Inc.) og antistoffer mot andre reseptorer for Apo-2-ligand, slik som anti-DR4-antistoffer eller antistoffer mot andre TNF-reseptorfamiliemedlemmer slik som Enbrel (entanerecept) (Immunex).

Kjemoterapier som er omfattet av oppfinnelsen inkluderer kjemiske stoffer eller legemidler som er kjent på fagområdet og som er kommersielt tilgjengelige, slik som doksorubicin, 5-fluoruracil, etoposid, kamptotecin, leukovorin, cytosinarabinosid, syklofosfatmid, tiotepa, busulfan, cytoksin, taksol, metotreksat, cisplatin, melfalan, vinblastin og karboplatin. Fremstillings- og doseringsskjema for slik kjemoterapi kan bli benyttet i overensstemmelse med produsentens instruksjoner, eller slik det er bestemt empirisk av fagfolk på området. Fremstillings- og doseringsskjema for slik kjemoterapi er også beskrevet i Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

Kjemoterapien blir fortrinnsvis administrert i en farmasøytisk akseptabel bærer, slik som de som er beskrevet ovenfor. Administreringsmåten for kjemoterapien kan være den samme som den som er benyttet for DR5-antistoffet eller den kan bli administrert til pattedyret på annen måte. DR5-antistoffet kan for eksempel bli injisert mens kjemoterapien blir administrert oralt til pattedyret.

Strålingsterapi kan bli administrert til pattedyret i overensstemmelse med protokoller som vanligvis blir benyttet på fagområdet som er kjent for fagfolk på området. Slik terapi kan inkludere cesium-, iridium-, jod- eller koboltstråling. Strålingsterapi kan være helkropps bestråling, eller kan være rettet lokalt mot et spesifikt sted eller et vev i eller på kroppen. Strålingsterapi blir typisk administrert i pulser over en tidsperiode fra omtrent 1 til omtrent 2 uker. Strålingsterapien kan likevel bli administrert over lengre tidsperioder. Strålingsterapien kan eventuelt bli administrert som en enkelt dose eller som flere, sekvensielle doser.

Antistoffet kan bli administrert sekvensielt eller samtidig med det ene eller de flere andre terapeutiske midlene. Mengden av antistoff og terapeutisk middel er for eksempel avhengig av hvilken type legemidler som blir benyttet, den patologiske tilstande3n som blir behandlet og skjemaet og administreringsmåten, men vil generelt være mindre enn hvis hver av dem ble benyttet individuelt.

Etter administrering av antistoff til pattedyret kan pattedyrets fysiologiske tilstand bli overvåket på forskjellige måter som er velkjente for fagfolk på området.

Det er omfattet at antagonisten eller de blokkerende DR5-antistoffene også kan bli benyttet ved terapi. Et DR5-antistoff kan for eksempel bli administrert til et pattedyr (slik som beskrevet ovenfor) for å blokkere DR5-reseptorbinding til Apo-2L, for slik å øke den biologiske tilgjengeligheten av Apo-2L som blir administrert i løpet av Apo-2L-terapi for å indusere apoptose i kreftceller.

De terapeutiske effektene av DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli undersøkt i in vitro-analyser og ved å benytte in vivo-dyremodeller. En mengde velkjente dyremodeller kan bli benyttet for ytterligere å forstå rollen til DR5-antistoffene som er identifisert her i utviklingen og patogenese av for eksempel kreft eller immunrelaterte sykdommer, og for å teste effektiviteten av de terapeutiske kandidatmidlene. In vivoegenskapene til slike modeller gjør dem spesielt prediktive på responser hos humane pasienter.

Dyremodeller for immunrelaterte sykdommer inkluderer både ikke-rekombinante og rekombinante (transgene) dyr. Ikke-rekombinante dyremodeller inkluderer for eksempel gnagermodeller, for eksempel murine modeller. Slike modeller kan bli generert ved å introdusere celler inn i syngeneiske mus ved å benytte standardteknikker, for eksempel subkutan injeksjon, haleveneinjeksjon, miltimplantasjon, intraperitoneal implantasjon og implantasjon under nyrekapselen.

Dyremodeller, for eksempel for transplantat-versus-vertssykdom, er kjente.

Transplantat-versus-vertssykdom forekommer når immunkompetente celler blir transplantert inn i immunundertrykte eller tolerante pasienter. Donorcellene gjenkjenner og responderer på vertsantigener. Responsen kan variere fra livstruende, alvorlig inflammasjon til milde tilfeller med diaré og vekttap. Transplantat-versus-vertssykdomsmodeller tilveiebringer en måte for å undersøke T-cellereaktivitret mot MHC-antigener og mindre transplantatantigener. En passende prosedyre er beskrevet i detalj i Current Protocls in Immunology, enhet 4.3.

En dyremodell for hudallograftavstøting er en måte for å teste evnen til T-celler i å mediere in vivo-vevsødeleggelse som er indikativt på og et mål på deres rolle i anti-virusog tumorimmunitet. De mest vanlig aksepterte modellene benytter murine halehud transplantater. Gjentatte eksperimenter har vist at hud-allograftavstøting ble mediert ved T-celler, hjelpe-T-celler og dreper-effektor-T-celler, og ikke antistoffer. (Auchincloss, H. Jr. og Sachs, D.H., Fundamental Immunology, 2. utg., W.E. Paul, red., Raven Press, NY, 1989, 889-992). En passende prosedyre er beskrevet i detalj i Durrent Protocols in Immunology, enhet 4.4. Andre trnasplantavstøtingsmodeller som kan bli benyttet for å teste prepartene ifølge oppfinnelsen er de allogene hjertetransplantatmodellene som er beskrevet av Tanabe, M. et al., Transplantation, (1994) 58:23 og Tinubu, S.A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338.

Dyremodeller for forsinket type hypersensitivitet tilveiebringer en analyse for cellemediert immunfunksjon i tillegg. Forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner er en T-cellemediert in vivo-immunrespons som er karakterisert ved inflammasjon som ikke når en topp før en tidsperiode har gått etter utfordring med et antigen. Disse reaksjonene forekommer også ved vevsspesifikke autoimmunsykdommer slik som multiple sklerose (MS) og eksperimentell, autoimmun encefalomyelitt (EAE, en modell for MS). En passende prosedyre er beskrevet i detalj i Current Protocols in Immunology, enhet 4.5.

En dyremodell for artritt er kollagenindusert artritt. Denne modellen har felles kliniske, histologiske og immunologiske karakteristika for human, autoimmun reumatoid artritt og er en akseptabel modell for human autoimmun artritt. Muse- og rottemodeller er karakterisert ved synovitt, nedbrytning av brusk og subkondralt ben. DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli testet for aktivitet mot autoimmun artritt ved å benytte protokollene som er beskrevet i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhet 15.5. Se også modellen som benytter et monoklonalt antistoff mot CD18 og VLA-4-integriner som er beskrevet i Issekutz, A.C. et al., Immunology, (1996) 88:569.

En modell for astma har blitt beskrevet der antigenindusert, luftveis hyperreaktivitet, pulmonær eosinofili og inflammasjon blir indusert ved å sensitivisere et dyr med ovalbumin og deretter utfordre dyret med det samme proteinet levert ved hjelp av aerosol.

Flere dyremodeller (marsvin, rotte, ikke-human primat) viser symptomer som ligner atopisk astma hos mennesker med utfordring med aerosolantigener. Murine modeller har mange av egenskapene til human astma. Passende prosedyrer for å teste preparatene ifølge oppfinnelsen for aktivitet og effektivitet i behandling av astma er beskrevet av Wolyniec, W.W: et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 og referansene som er sitert der.

DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan ytterligere bli testet på dyremodeller for psoriasislignende sykdommer. DR5-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan bli testet i scid/scid-musemodellen som er beskrevet av Schon, M.P. et al., Nat. Med., (1997), 3:183, der mus viser histopatologiske hudlesjoner som ligner psoriasis. En annen passende modell er den humane hud/scid-musekimeren som er fremstilt som beskrevet av Nickoloff, B.J. et al., Am. J. Path., (1995) 146:580.

Forskjellige dyremodeller er velkjente for testing av tryggheten og antikreftaktiviteten til et terapeutisk preparatkandiadat. Disse inkluderer human tumortransplantering inn i atymiske nakenmuss eller scid/scid-mus, eller genetisk, murine tumormodeller slik som p53-knockout mus.

Rekombinate (transgene) dyremodeller kan bli fremstilt ved å introdusere den kodende delen av molekylene som er identifisert her inn i genomet til dyr av interesse, ved å benytte standard teknikker for å fremstille transgene dyr. Dyr som kan virke som et mål for transgen manipulasjon inkluderer uten begrensning mus, rotter, kaniner, marsvin, sau, geiter, griser og ikke-humane primeter, for eksempel bavianer, sjimpanser og aper, slik som cynomolgus aper. Teknikker som er kjent på fagområdet for å introdusere et transgen inn i slike dyr inkluderer pronuklein mikroinjeksjon (Hoppe og Wanger, US patentskrift nr.

4 873 191), retrovirusmediert genoverføring inn i kimcellelinjer (f. eks. Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6148-615 (1985), genmålsøking i embryonale stamceller (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 (1989)), elektroporering av embryoer (Lo, Mol. Cell. Biol., 3, 1803-1814 (1983)), spermamediert genoverføring (Lavitrano et al., Cell, 57, 717-73 (1989)). For en gjennomgang, se for eksempel US patentskrift nr. 4 736 866.

For formålene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer transgene dyr de som bærer transgene i kun en del av deres celler (”mosaikk dyr”). Transgenet kan enten bli integrert som et enkelt transgen, eller i konkatamerer, for eksempel hode-til-hode eller hode-til-hale tandem. Selektiv introduksjon av et transgen inn i en spesiell celletype er også mulig for eksempel ved å følge teknikken til Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6232-636 (1992).

Ekspresjonen av transgenet i transgene dyr kan bli overvåket ved hjelp av standard teknikker. For eksempel kan Southern blott-analyse eller PCR-amplifisering bli benyttet for å verifesere integreringen av transgenet. Nivået av mRNA-ekspresjon kan deretter bli analysert ved å benytte teknikker slik som in situ-hybridisering, Nothern-blottnanalyse, PCR eller immuncytokjemi. Dyrene kan ytterligere bli undersøkt før tegn på immunsykdomspatologi, for eksempel ved hjelp av histologisk undersøkelse ved å bestemme infiltrering av immunceller inn i spesifikke vev eller for tilstedeværelsen av kreftrammet eller malignt vev.

Alternativt kan ”knock-out dyr” bli konstruert som har et ødelagt eller endret gen som koder for et polypeptid som er identifisert her, som et resultat av homolog rekombinasjon mellom det endogene genet som koder for polypeptidet og endret, genomisk DNA som koder for det samme polypeptidet introdusert inn i en embryonal celle hos et dyr. cDNA som koder for et spesielt polypeptid kan for eksempel bli benyttet for å klone genomisk DNA som koder for dette polypeptidet i overensstemmelse med etablerte teknikker. En del av det genomiske DNA som koder for et spesifikt polypeptid kan bli fjernet eller erstattet med et annet gen, slik som et gen som koder for en selekterbar markør som kan bli benyttet for å overvåke integrering. Typisk blir flere kilobaser med uendret, flankerende DNA (både på den 5’ og 3’ enden) inkludert i vektoren (se f. eks. Thomas og Capecchi, Cell, 51:503 (1987) for en beskrivelse av homologe rekombinasjonsvektorer). Vektoren blir introdusert inn i en embryonal stamcellelinje (f. eks. ved hjelp av elektroporering) og celler der det introduserte DNA homologt har blitt rekombinert med det endeogene DNA blir valgt (se f. eks. Li et al., Cell, 69:915 (1992)). De valgte cellene blir deretter injisert inn i en blastocytt hos et dyr (f. eks. en mus eller rotte) for å danne aggregeringskimerer (se f. eks. Bradley i Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, red. (IRL, Oxford, 1987), s. 113-152). Et kimert embryo kan deretter bli implantert inn i et passende pseudogravid hunnfosterdyr og embryoet kan bli brakt i kraft for å danne et ”knock-out dyr”. Avkom som bærer det homologt rekombinerte DNA i sine kjønnsceller kan bli identifisert ved hjelp av standard teknikker og benyttet for å ale opp dyr der alle cellene til dyret inneholder det homologt rekombinerte DNA. Knock-out-dyr kan for eksempel bli karakterisert for deres evne til å beskytte mot visse patologiske tilstander og for deres utvikling av patologiske tilstander som skyldes fraværet av polypeptidet.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen blir fremgangsmåter for å benytte antistoffet i diagnostiske analyser tilveiebrakt. Antistoffene kan for eksempel bli benyttet i diagnostisk analyse for å påvise ekspresjon eller overekspresjon av DR5 i spesifikke celler og vev. Forskjellige diagnostiske analyseteknikker som er kjent på fagområdet kan bli benyttet, slik som in vivo-synliggjøringsanalyse, in vitro-kompetitive bindingsanalyser, direkte eller indirekte sandwichanalyser og immunpresipiteringsanalyser som blir utført i enten heterogene eller homogene faser (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., (1987), s. 147-158). Antistoffene som blir benyttet i de diagnostiske analysene kan bli merket med en påvisbar enhet. Den påvisbare enheten bør være i stand til å produsere, enten direkte eller indirekte, et påvisbart signal. Den påvisbare enheten kan for eksempel være en radioisotop slik som<3>H,<14>C,<32>P,<35>S eller<125>I, en fluorescerende eller kjemiluminiscerende forbindelse slik som fluoresceinisotiocyanat, rhodamin eller luciferin, eller et enzym som alkalisk fosfatase, beta-galaktosidase eller pepperrotperoksidase. Enhver fremgangsmåte som er kjent på fagområdet for å konjugere antistoffer til den påvisbare enheten kan bli benyttet, inkludert fremgangsmåtene som er beskrevet av Hunter et al. Nature, 144:945 (1962), David et al., Biochemistry, 13:1014-1021 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219-230 (1981) og Nygren, J. HIstochem. Og Cytochem., 30:407-412 (1982).

DR5-antistoffer er også nyttige til affinitetsrensingen av DR5 fra rekombinant cellekultur fra naturlige kilder. I denne prosessen er antistoffene mot DR5 immobiliserte på en passende bærer, slik som et Sefadex-harpiks eller filterpapir, ved å benytte fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Det immobiliserte antistoffet blir deretter kontaktet med en prøve som inneholder DR5 som skal bli renset, og deretter blir bæreren vasket med et passende løsningsmiddel som vil fjerne vesentlig alt materiale i prøven, bortsett fra DR5, som er bundet til det immobiliserte antistoffet. Til slutt blir bæreren vasket med et annet passende løsningsmiddel som vil frigjøre DR5 fra antistoffet.

I en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen blir det tilveiebrakt fremstilte artikler og sett som inneholder materialer som er nyttige for å behandle patologiske tilstander eller for å påvise eller rense DR5. Den fremstilte artikkelen omfatter en beholder med et merke. Passende beholdere inkluderer for eksempel flasker rør og testrør. Beholderne kan bli utformet fra en mengde materialer slik som glass og plastikk. Beholderen inneholder et preparat som har et aktivt middel som er effektivt for å behandle patologiske tilstander eller for å påvise eller rense DR5. Det aktive middelet i preparatet er et DR5-antistoff og omfatter fortrinnsvis monoklonale antistoffer som er spesifikke for DR5. Merket på beholderen indikerer at preparatet blir benyttet for å behandle patologiske tilstander eller for å påvise eller rense DR5, og kan også indikere retningslinjer for enten in vivo- eller in vitro-anvendelse, slik som de som er beskrevet over.

Settet ifølge oppfinnelsen omfatter beholderen som er beskrevet ovenfor og en annen beholder som omfatter en buffer. Det kan ytterligere inkludere andre materialer som er ønskelig fra et kommersielt ståsted og brukerståsted, inkludert andre buffere, fortynningsmidler, filtere, nåler, sprøyter og pakningsinnstikk med instruksjoner for anvendelse.

EKSEMPLER

Kommersielt tilgjengelige reagenser som er referert til i eksemplene ble benyttet i overensstemmelse med produsentens instruksjoner hvis ikke annet er indikert. Kilden for cellene som er identifisert i de følgende eksemplene, og gjennom hele beskrivelsen, ved hjelp av ATCC-aksesjonsnummer er the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Et antall av reagensene og protokollene som er tilkjennegjort her er ytterligere diskutert i WO 99/37684, WO 00/73349, WO 98/32856, WO 98/51793 og WO 99/64461.

Noen av antistoffene beskrevet nedenfor er tatt med som sammenligningseksempler.

Eksempel 1

Design og testing av anti-DR5-antistoffvarianter

Anti-DR5-antistoff 16E2 ble avledet som en scFv fra et humant antistoff-bakteriofagfremvisningsbibliotek og har blitt beskrevet i WO 98/51793, publisert 19. november, 1998 (se Eksempel 14). Nukleotid- og aminosyresekvensen til scFv-16E2 er vist i Figur 5 (Sekv. id. nr. 9) og Figur 6 (Sekv. id. nr. 10). I Figur 6 er signalsekvensen og tungkjede og lettkjede-CDR-regionene identifisert (CDR1, CDR2 og CDR5-regioner er understreket).

Materialer og fremgangsmåter

Konstruksjon av full-lengde anti-DR5-antistoff 16E2

Til eksperimentene som er beskrevet nedenfor var full-lengde IgG-molekyler ønskelige. Derfor ble det variable domenet til 16E2 klonet inn i tidligere beskrevne pRK-vektorer som er passende til pattedyrcelle ekspresjon av full-lengde IgG1-antistoffer (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech., 2:3-10 (1990)). Sammenligning av aminosyresekvensen til 16E2-variabelt domenet med Kabat-databasen (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH, 5. utgave), tyder på at den lette kjedens variable region (VL) til 16E2 er avledet fra en human lambda lett kjede genfamilie. Det variable domenet til 16E2 ble derfor først subklonet inn i en vektor inneholdende et lambda-konstant domene. PCR-primere ble designet for å innføre restriksjonsenzym setene SfiI og MscI og deretter ble det amplifiserte variable domenet fordøyd med disse to enzymene. Dette fragmentet ble satt inn i den tilsvarende fordøyde vektoren inneholdende lambda-konstant domenet. Siden denne vektoren var designet til ekspresjon av Fab-typer i E. coli for IgG-ekspresjon, ble hele den lette kjedens kodende region igjen PCR-amplifisert ved å benytte primere for å innføre restriksjonssetet AgeI på den 5’ enden av den kodende regionen, og HindIII på den 3’ enden. Deretter ble dette AgeI til HindIII-fragmentet satt inn i en tilsvarende fordøyd vektor, pDR1 (Clontech). Hele sekvensen til plasmid-pDR1 er vist i Figur 11 (Sekv. id. nr. 15).

For den tunge kjeden i versjon 1 ble det variabel (VH)-domenet til den tunge kjeden til scFv-16E2 PCR-amplifisert ved å benytte primere som er designet for å innføre et PvuII-sete på den 5’ enden og et ApaI-sete på den 3’ enden av domenet. Dette fragmentet ble deretter klonet inn i PvuII/ApaI-setene i vektoren pDR2 (Clontech) for ekspresjon av den fullstendige tunge kjeden (VH-CH1-CH2-CH3-domener). Hele sekvensen til plasmid pDR2 er vist i Figur 12 (Sekv. id. nr. 16).

Nukleotid- og aminosyresekvensen til full-lengde antistoffet 16E2s tunge og lette kjeder er henholdsvis vist i Figurene 7-10 (Sekv. id. nr. 11-14). Figurene 7 og 8 (Sekv. id. nr. 11 og 12) viser spesielt aminosyre- og nukleotidsekvensene til full-lengde-16E2s tunge kjeden, og Figur 9 og 10 (Sekv. id. nr. 13 og 14) viser aminosyre- og nukleotidsekvensen til full-lengde-16E2s lette kjeden. De tunge og lette kjedene til full-lengde16E2-antistoffet vil heretter også bli referert til som ”Versjon 1”.

Konstruksjon av IgG-varianter. Variantene ble konstruert på den lette eller tunge kjeden separat ved å benytte seterettet mutagenese (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)). Plasmid-pDR1 som koder for lettkjedeversjon 1, eller pDR2 som koder for tungkjedeversjon 1 ble transformert inn I E. coli-stamme CJ236 (BioRad, Joyce og Grindley, J. Bacteriol., 158:636-643 (1984)) for fremstilling av deoksyuridininneholdende, enkelttrådede DNA-templater. Volumer av mutagenesereaksjoner ble transformert inn i E. coli-stamme XL-1-Blue (Stratagene, San Diego, CA) for rensing av dobbeltrådet DNA. For hver variant ble DNA som koder for lettkjeden eller tungkjeden fullstendig sekvensert ved å benytte ABI377 x 1 eller ABI3730 x 1-atomatisert DNA-sekvensator (Perkin-Elmer Corp.).

For hver IgG-variant ble transiente transfeksjoner utført ved å kotransfektere et lettkjedeuttrykkende plasmid og et tungkjedeuttrykkende plasmid inn i en adenovirustransformert, human, embryonal nyrecellelinje, 293 (Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59-74 (1977)). Kort fortalt ble 293-celler splittet på dagen før transfeksjon og platet ut i seruminneholdende medium. På den følgende dagen ble et kalsiumfosfatpresipitat fremstilt fra dobbelttrådet DNA fra lettkjeden og tungkjeden, sammen med pAdVantage DMA (Promega, Madison, WI), og så dråpevis tilsatt til platene. Cellene ble inkubert over natten ved 37<o>C, og deretter vasket med PBS og dyrket i serumfritt medium i 4 dager, og på dette tidspunktet ble kondisjonert medium høstet. Antistoff ble renset fra kultursupernatanter ved å benytte protein-A-Sefarose-CL-4B, deretter ble buffer endret til 10 mM natriumsuksinat, 140 mM NaCl, pH 6,0 og konsentrert ved å benytte en Centricon-10 (Amicon). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved å måle absorbans ved 280 nm eller ved hjelp av kvantitativ aminosyreanalyse.

Elektrokjemisk luminiuscent DR5-bindingsanalyse. Den relative bindingen av anti-DR5-antistoffet ble bestemt i en løsningsfase, konkurranse-ELISA-format. DR5-Fcfusjonsproteinet ble biotinylert ved å benytte biotin-X-NHS (Research Organics, Cleveland, OH) og standardantistoffet (enten versjon 1 eller Apomab 7.3) ble merket med ORI-TAG-NHS-ester (IGJEN International, Gaithersburg, MD) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. For å utføre bindingsanalysen ble testantistoffprøver seriefortynnet i analysebuffer (PBS, pH 7,4, inneholdende 0,5% BSA og 0,5% Tween-20). Like volumer (25 μl hver) av antistoffprøven (konsentrasjonsområde fra 50 000 – 0,85 ng/ml), ORI-TAG-standard antistoff (150 ng/ml) og biotinylert, humant DR5-Fc (15 ng/ml) ble tilsatt til 96-brønners polypropylenplater og innkubert i 1,5 time ved romtemperatur ved forsiktig risting. Magnetiske streptavidinkuler (IGEN International) ble deretter tilsatt (25 μl/brønn) og platene ble innkubert som ovenfor i ytterligere 30 minutter. Analysebuffer ble tilsatt for å bringe sluttvolumet til 250 μl per brønn og platene ble avlest ved å benytte et ORIGEN M384-instrument (IGEN International). IC50-verdiene ble beregnet ved å benytte fire parametertilpasninger for prøvekurvene.

Bioanalyse: tumorcellevekstinhibering/-dreping. Den tilsynelatende styrken for hver antistoffvariant ble bestemt i en in vitro-tumorcelle-drepeanalyse. Human Colo205 kolonkarsinom cellelinje ble dyrket i RPMI-medium inneholdende 10% fetalt, bovint serum. To-gangers seriefortynninger av standard (enten versjon 1 eller Apomab 7.3) og prøvene ble utført i 96-brønners vevskulturplater inneholdende medium med eller uten et kryssbindende antistoff (anti-humant Fc, geit affinitetsrenset F(ab’)2) ved 10 mikrogram/ml. Celler (20000/brønn) ble deretter tilsatt til platene. Platene ble innkubert ved 37<o>C i totalt 48 timer. AlmarBlue ble tilsatt til brønnene i inkubering i minst 3 timer. Fluorescens ble avlest ved å benytte et fluorometer med eksitasjon ved 530 nm og emisjon ved 590 nm. Dataene ble analysert ved å benytte et fire-parameters kurvetilpasningsprogram.

Resultater

Det overordnede målet med dette arbeidet har vært å utvikle anti-DR5-antistoffer med forbedrede biokjemiske egenskaper og forbedret effektivitet, uten å kompromittere trygghet.

Flere tilnærminger ble benyttet for å oppnå de ønskede forbedringene, inkludert aminosyresubstitusjoner i DR5-tungkjedene og DR5-lettkjedene for å forbedre kjemisk eller termisk stabilitet, folding, alaninscanning av CDR-restene for å bestemme hvilke rester som er viktige for binding eller folding, og som derfor kan bli endret for å få større affinitet, og anvendelsen av bakteriofagfremvisende biblioteker av CDR-typene for å identifisere klonene med forbedret affinitet. Endringer i rammeverksregioner ble også undersøkt for deres mulige effekter på immunogenisitet og biologisk aktivitet.

Homologimodeller (Figurene 19 og 20) ble benyttet som en hjelp for å velge mange av disse endringene.

Tungkjede varianter

Serie 1

Versjon 2 av tungkjeden inneholder 5 endringer i forhold til versjon 1. Disse endringene (Q6E, V11L, E12V, R13Q og K105Q) foreligger i rammeverket til det variable domenet og ble innført for å bringe rammeverket nærmere den humane VHIII-konsensussekvensen. Vist i Tabell 1 er de første variantene som er konstruert med endringer i tungkjede-CDRene. ssDNA-templatet for disse mutatene var versjon 2. Leu til Tyr-endringen på posisjon 102 ble gjort for å forbedre pakking, og slik stabilitet. I kombinasjon med denne endringen ble Asn53 endret til Gln eller Tyr for å fjerne det potensielle deamideringssetet. Met34 ble endret til Leu for å fjerne et potensielt oksidasjonssete. Disse tungkjedevariantene ble uttrykt med den opprinnelige lettkjeden for å gi versjonene 20-23 (Tabell 1). Tungkjeden som inneholder de tre mutasjonene M34L, N53Q og L102Y, og rammeverksendringene som i versjon 2, blir deretter referert til som ”triple heavy one” eller TH1, mens tungkjeden med de tre mutasjonene M34L, N53Y og L102Y og rammverk i versjon 2 likeledes blir betegnet TH2.

Tabell 1 Tungkjede-CDR-varianter

<a>Templat: versjon 2

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Siden det var ikke noe tap av binding og in vitro-celledrepingsaktivitet med innføringen av M34L-mutasjonen (dvs. v21 sammenlignet med v20, v23 sammenlignet med v22, Tabell 1), ble en serie ytterligere mutasjoner, ved å substituere enten alanin eller andre rester som er antydet ved scanning av Kabat-databasen, innført i tungkjede-CDR1 ved å benytte tungkjedeversjon 20 som templat. Disse tungkjedene ble uttrykt med lettkjede-versjon 1. Aminosyrene som ble mutert, den resulterende bindingen i forhold til v1, og bioanalysedataene for disse versjonene er vist i Tabell 2. Endring av Gly33 til Ala ga forsterkning av binding i tillegg til en forbedret styrke. Denne tungkjeden som inneholder de tre mutasjonene G33A, N53Q og L102Y er betegnet TH3. Likeledes ble TH4 konstruert som hadde G33A, N53Y og L102Y. Endring av Thr28 til Ala ga også forsterket aktivitet sammenlignet med v1 og tungkjeden inneholdende T28A, N53Q, L102Y er betegnet TH9. CDR-endringer i TH1, TH2, TH3, TH4 og TH9 er oppsummert i Tabell 5. Disse fem tungkjedene ble ytterligere undersøkt etter å ha uttrykt dem sammen med lettkjedekombinasjoner (se nedenfor).

Tabell 2. Varianter i CDR-H1

<a>Templat for alle varianter er versjon 20

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Ala-Scanning av CDRH2 og CDRH3. For ytterligere å utlede bidraget for hver aminosyre i tungkjede-CDR2 og –CDR3 ble mutanter konstruert med alanin substitutert for hver av disse restene. Seterettet mutagenese med syntetisk oligonukleotider som koder for alaninsubstitusjon ble utført ved å benytte tungkjede versjon 1 som templat. Disse tungkjedene ble uttrykt ved å benytte lettkjeden i versjon 1. Endringene i tilsynelatende affinitet og styrke for de resulterende antistoffene vist i Tabellene 3 og 4. Gly99Ala og Arg100Ala viser hver forbedret aktivitet, og derfor kan disse endringene bli benyttet til å konstruere ytterligere kombinasjonsmutatanter av tungkjeden.

Tabell 3. Alaninscanning av CDRH2

<a>Templat: Versjon 1

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Tabell 4. Alaninmutanter i CDRH3

<a>Templat: Versjon 1

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Serie 2

En andre serie med tungkjeder ved å benytte de samme CDRene som versjonene TH1, TH2, TH3 og THF4 ble konstruert der rammeverksresisidene E6, L11, V12, Q13 og Q105 ble reversert til aminosyrene som er funnet i Versjon 1, dvs. Q6, V11, E12, R13 og K105. Disse tungkjedene er referert til som TH5, TH6, TH7 og TH8 (se Tabell 5).

Tabell 5. Tungkjedevarianter med mutasjoner i alle CDR-løkker

Lettkjedevarianter

Alaninscanning av lettkjede-CDRene

For bedre å forstå bidraget til binding og de biologisk aktivitet til CDR-restene i lettkjeden ble hver aminosyre endret til alanin ved å benytte seterettet mutagenese. Hver av lettkjedevariantene ble kombinert med tungkjede-v1 for transient ekspresjon av IgG som beskrevet ovenfor. Resultater av lettkjede-CDR-ala-scanningen er oppsummert i Tabell 6. Interessant å bemerke i motsetning til andre antistoffer, er at CDR-L1 ser ut til å spille en vesentlig rolle i antigenbinding. Denne lettkjeden er en lambdakjede, og modellen som er vist i Figur 20 tyder på at CDR1 kan danne en alfa-heliks. Substitusjoner til alaning i L2 og L3 er mer tolerante med unntak av G50A i CDR2 som ødelegger binding. I motsatt fall forbedret noen ala-substitusjoner, spesielt R91A og K51A, binding og bioaktivitet.

Tabell 6. Lettkjede alaninscanningsmutanter

<a>Templat: Versjon 1

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Genfamilie restbytter

En annen type av rettede mutanter ble nyttet for å undersøke lettkjeden. I denne tilnærmingen ble CDR-rester som i modellen så ut til å ligge på enhver side av løkkene, og som slik kan ha en støttende rolle heller enn å bli direkte involvert i antigenbinding, ble byttet med rester på tilsvarende lokaliseringer i andre nært beslektede lambda-genfamilier. Disse mutatene ble også uttrykt ved å benytte v1-tungkjede, og resultater er oppsummert i Tabell 7. I CDR-L2 gir kombinasjonen av G50K, K51D vesentlig forbedring i både binding og bioaktivitet, og kombinasjonen som omfatter de fire mutasjonene G50K, K51D, N52S, N53E er også forbedret i forhold til v1. Andre mer konservative endringer i den samme regionen, som kun involverer en restsubstitusjon, ble ikke tolerert.

Tabell 7. Lettkjedevarianter basert på beslektede genfamiliesekvenser

<a>Templat: Versjon 1

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Affinitetsseleksjon med antistoff bakteriofagbiblioteker

For hver av CDRene L1, L2 og L3, ble bakteriofagfremvisningsbiblioteker konstruert separat og valgt for kloner med økt affinitet for DR5-Ig. Inspeksjon av modellen (Figur 20) indikerte hvilke rester i CDRene som sannsynligvis var eksponert og disse restene ble valgt for randomisering. Hele lambdalettkjeden og VH-domenet i Versjon 1 ble klonet inn i bakteriofagfremvisningsvektoren pS1602, som er referert i Vajdos et al., J. Mol. Biol., 320:415-418 (2002) og som ytterligere er beskrevet i Sidhu et al., Curr. Opin. Biotechnol., 11:610-616 (2002). Kunkel-mutagenese ble benyttet i konstruksjonen av bibliotekene. V1-fagemidet ble transformert inn i E. coli-stamme CJ236 for enkelttrådet DNA-preparering og oligonukleotider som inneholder TAA-kodon på hvert sete valgt til randomisering ble benyttet for å generere bibliotektemplatene. Oligoner som benytter det degenererte kodonet NNS (der N er en lik blanding av G, A, T og C, mens S er en lik blanding av G og C) ble deretter benyttet for å konstruere bibliotekene. CDRL1 ble mutert ved å benytte stopptemplat oligo CA945 og bibliotekoligo CA946. CDRL1 ble mutert ved å benytte stopptemplat oligo CA947 og bibliotekologi CA948. CDRL3 ble mutert ved å benytte stopptemplatoligo CA949 og bibliotekoligo CA950. Bibliotekkonstruksjon er oppsummert i Tabell 8.

Tabell 8

Produktene av tilfeldig mutagenesereaksjon ble elektroporert inn i XLI-Blue-E. coliceller (Stratagene) og amplifisert ved dyrking i 14-16 timer sammen med M13K07-hjelperfag. Bibliotekstørrelse ble estimert ved hjelp av seriefortynning og utplating hvis den opprinnelige transformasjonen var på karbanicillinplater, og var fra 1,9 x 10<9>til 2,2 x 10<9>kloner.

Bibliotekene ble pannert i 4 runder i løsning ved å benytte biotinylert DR5-Ig (Genentech). Omtrent 10<11>fag ble blokkert med en 1 ml løsning av 3% fettfri tørrmelk, 0,2% Tween i PBS (bakteriofagblokkering) på et roterende hjul i 1 time ved romtemperatur. DR4-IG og CD4-IG ble hver tilsatt til blokkeringsløsningen ved 1 mikromolar for å minske ikke-spesifikk binding. Biotinylert antigen ble deretter tilsatt ved 100 nM i den første runden og binding ble tillatt å fortsette i 2 timer. I påfølgende runder med pannering ble antigenkonsentrasjon senket til 10, 5 og 1 nanomolar.

For innfangning av antigenbindende fag, ble streptavidinbelagte, magnetiske kuler (Dynal) først vasket tre ganger med bakteriofag blokkering og deretter blokkert med 1 ml bakteriofag blokkering i 1 time ved romtemperatur. Kuler ble konsentrert ved å benytte en magnet og tilsatt til antigen-bakteriofagløsningen i 15 minutter. Magneten ble deretter benyttet for å trekke kule-antigen-bakteriofagkompleksene ut av løsning. Disse partiklene ble deretter vasket 3 ganger med bakteriofag blokkering, 3 ganger med PBS-Twee (0,02% Tween) og en gang med PBS. Bakteriofag ble eluert fra kuler med 100 mikroliter med 0,1 M HCl i 10 minutter og nøytralisert med NaOH. Eluert bakteriofag ble benyttet for å infisere XL1Blue E. coli og fremlagt som ovenfor i påfølgende runder. Stringensen for vasking ble økt ved hver runde.

Kloner fra hvert bibliotek ble sekvensert. For L1-bibliotekene ble kun villtype sekvenser fremskaffet, noe som støtter ideen om at denne CDRen er viktig for antigenbinding eller antistoff konformasjon, og få mutasjoner i den potensielle heliksen kan bli tolerert. For bibliotekene i L2, ble ingen konsensussekvenser funnet, noe som tyder på at flere CDRL2-sekvenser er akseptable for binding til DR5. For L3-bibliotekene fremkom flere sekvenser flere ganger, og disse sekvensene ble transplantert inn på full-lengde lettkjedevektoren ved å benytte oligorettet mutagenese. Ekspresjon av IgGer ble igjen gjort i 293-celler ved å benytte tungkjede-versjon 1 til ko-transfeksjon. Tabell 9 beskriver L3-sekvensene som blir uttrykt som full-lengde antistoffer og resultatene av binding og bioanalyse. To av sekvensene ble testet, inkorporert i versjon 69 og 60, ga antistoffer med forbedret binding og bioaktivitet sammenlignet med versjon 1.

Tabell 9. Proteinsekvenser for lettkjede-CDR3, avledet fra bakteriofag bibliotek

<a>Templat: Versjon 1

<b>«Origen» kompetitiv, human DR5-bindingsanalyse

<c>Tumorcelleinhiberingsanalyse

<d>Tumorcelleinhiberingsanalyse

Kombinasjonslettkjeder

Som beskrevet ovenfor ble mutasjoner identifisert i hver av lettkjede-CDRene som individuelt forsterker binding og tumorcelledreping in vitro. Disse mutasjonene ble deretter kombinert for å fremstille flere lettkjeder med forbedringer i hver av CDRene. Disse ble betegnet TL1, TL2 og TL3 for ”trippel light 1” osv., og ble beskrevet i Tabell 10. Slik inneholder TL1 L1-mutasjonen som er identifisert i versjon 44 kombinert med L2-mutasjonen som er identifisert i versjon 25 og L3-mutasjonen i versjon 29. Likeledes inneholder TL2 L1-mutasjonen fra versjon 44 med L2-mutasjonen fra v65 og L3-mutasjonen fra v69, mens TL3 kombinerer L1 fra v44 med L2 fra v65 og L3 fra v74.

Tabell 10. Mutasjoner i lettkjedekombinasjoner

Tabell 11. Apomab-nomenklatur

Ytterligere Apomab-antistoffer er vist i Tabell 12.

Tabell 12

* samme rammverk som Versjon 1 ;* samme rammeverk som human konsensus VH-III

Apomab-ekspresjon

Etter å ha utledet trippeltungkjedene og trippellettkjedene ble et 9 x 3 nett av kombinasjonsantistoffer dannet ved hjelp av kotransfektering av hver av de tre lettkjedene med hver av de ni tungkjedene i 293-celler og resulterende antistoffene ble renset som beskrevet ovenfor. In vitro-undersøkelser med disse Apomab-typene tyder på at flere versjoner var ganske sterke i bioanalysene. Derfor ble materialet fremstilt som var passende til in vivo-musetumormodell undersøkelser.

Apomab-gjenvinning og –rensing

En fremgangsmåte for gjenvinning og rensing av Apomab-antistoffer fra et Harvested Cell Culture Fluid (HCCF) er beskrevet som følger:

Prosep-protein-A-kromatografi – Harvested Cell Culture Fluid (HCCF) fremstilt fra kinesisk hamster ovarie-(CHO)-celler er justert til pH 7,0 med 1,5 M Tris-base og deretter påsatt på Prosep-protein-A-kolonnen (Millipore, USA), som er balansert med 25 mM NaCl/25 mM tris/5 mM EDTA, pH 7,5. De ikke-bindende proteinene går gjennom og blir fjernet ved vasking med balanseringsbuffer etterfulgt av et andre vasketrinn med 0,5 M TMAC i balanseringsbufferen og en tredje vasking med balanseringsbuffer. Apomabantistoff ble eluert fra Protein-A-kolonne ved å benytte en trinn-eluering med 0,1 M eddiksyre. Kolonneeluering blir overvåket av A280. Apomab-antistofftoppen blir slått sammen.

SP-Sefarose-Fast-flow-kromatografi – Det sammenslåtte Apomab-antistoffet fra Prosep-protein-A blir justert til pH 5,5 med 1,5 M Tris-base og deretter påsatt en kolonne med SP-Sefarose-Fast-flow (Amersham Pharmacia, Sverige) som er balansert med 25 mM MOPS, pH 7,1. Etter en prøve er påsatt blir kolonnen vasket med balanseringsbuffer til baselinje @ A280. Apomab-antistoffet blir eluert av kolonnen ved å benytte en lineær, 12-kolonnevolumers gradient med 0,2 M natriumklorid i balanseringsbufferen, pH 8. Det som ble eluert fra kolonnen ble overvåket ved A280. Fraksjoner ble samlet og de som inneholder riktig foldet Apomab-antistoff, som bestemt ved hjelp av SEC-HPLC-analyse, ble slått sammen.

Q-Sefarose-Fast-flow-kromatogrtafi – De sammenslåtte SP-Sefarosefraksjonene er deretter påsatt en kolonne med Q-Sefarose-FF (Amersham Pharmacia, Sverige) som er balansert i 50 mM natriumklorid/25 mM Tris-buffer, pH 8. Kolonnen ble vasket med balanseringsbuffer og Apomab-antistoffet ble samlet i kolonne-efluenten.

UF/DF-formulering – Det sammenslåtte fra Q-Sefarose blir konsentrert ved hjelp av ultrafiltrering på en membran med en molekylvektgrense på omtrent 10 000 dalton. Det konsentrerte, sammenslåtte fra Q-Sefarose-FF ble deretter diafiltrert med 10 volumer 10 mM histidin/8% sukkrose, pH 6. Det diafiltrerte, sammenslåtte fra Q-Sefarose blir kondisjonert med 10% Polysorbat-20 for en sluttkonsentrasjon på 0,02% Polysorbat-20. Den formulerte bulken blir filtrert gjennom et sterilt filter på 0,22 μm og lagret ved 2-8<o>C eller -70<o>C. Den endelige renheten av Apomab-antistoffer blir bestemt ved hjelp av SDS-PAGE, SEC-HPLC og aminosyresekvensanalyse.

Sekvensering blir utført på sekvenseringsmaskinene ABI3700 eller ABI3730 fra Applied Biosystems. Sekvenseringskromatogrammene blir analysert ved å benytte Sequencer (GeneCodes, Ann Arbor, MI)-sekvensanalyse programvare.

Testing av in vitro-aktivitet for Apomab-typer

Før in vivo-undersøkelsene med Apomab-typer begynte, ble hver utgave testet for in vitro-aktivitet som beskrevet ovenfor. Disse resultatene er vist i Tabell 13.

Tabell 13. In vitro-aktivitet for Apomab-typer

Eksempel 2

Evaluering av Apomab-antitumoraktivitet i den humane Colo205-kolonkarsinom xenograftmodellen og andre xenograftmodeller for kolorektalkreft

Vanlig benyttede forkortelser anvendt i dette og påfølgende eksempler er som følger:

CR fullstendig regresjon

PR delvis regresjon

MTD maksimalt tolerert dose

MTV gjennonsnitlig tumorvolum

NTR ikke-behandlingsrelatert død

LTTFS langstids tumorfri overlevelse

PBS fosfatbufret saltløsning

q3d x 4 en gang hver 3. dag med totalt 4 doser

qd x 1 en dose gitt på dag 1

qd x 5 en gang daglig i 5 dager

TFS tumorfri overlevelse

TR behandlingsrelatert død

TTE tid til endepunkt

T-C forskjell i dager mellom de gjennomsnitlige TTE-verdiene for behandlede dyr og kontrolldyr

TGD tumorvekst forsinkelse, T-C, økning i gjennomsnitt TTE for en behandlingsgruppe, sammenlignet med kontrollgruppe, vanligvis som % av kontroll

Tid til 2xVo doblingstid (DT), tiden som det tar for en tumor å doble et volum.

Log-celledreping = forskjell mellom logaritmen til det faktiske tumorvolumet med tidspunktet for behandling, log10(Vpre) og log10(Vpost) (Chenevert et al., Clin. Cancer Res., 3:1457-1466 (1997).

6-8-uker gamle, atymiske hunn-nakenmus (Charles River Laboratories) ble inokulert med 5 millioner Colo205-celler per mus i et 0,2 ml volum/mus, subkutant, i høyre ryggflankeområde. Alle mus ble øremerket for identifisering. Med en gang tumoren hadde nådd omtrent 100-200 mm<3>ble de Colo205-tumorbærende musene tilfeldig gruppert og behandling ble administrert.

Behandlingsregimet var en enkeltdose intraperitonealt med doser med vehikkelkontroll, eller standard- og test-antistoffer, ved 3 mg/kg/mus eller 10 mg/kg/mus. I noen tilfeller ble 3 eller 4 mus drept av vehikkelen og 10 mg/kg grupper, og serum og tumorer ble samlet ved 5 minutter, 24 timer eller 48 timer før behandling for serumlegemiddelkonsentrasjon og tumorhistologiundersøkelse. I de gjenværende musene ble tumormålinger tatt to ganger i uken i de første 2 ukene, og deretter en gang i uken i ytterligere 4 uker.

Resultater som er fremskaffet i den atymiske Colo205 xenograft nakenmusmodellen er vist i Figurene 21-25.

Figur 21 viser at hver av Apomab 5.3, 6.3 og 8.3 var svært effektive i å redusere det gjennomsnittlige tumorvolumet ved alle doseringer som ble testet, og deres effektivitet var essensielt den samme som den for antistoff 16E2 versjon 1.

Effektiviteten av intraperitoneale enkeltdoser av Apomab 5.2, 6.2, 5.3, 7.2 og 7.3 ble testet i den atymiske Colo 205 xenograft nakenmusmodellen og resultatene er vist i i Figur 22. Alle Apomab-typene som ble testet var svært effektive i å redusere tumorvolum, og deres effektivitet var essensielt den samme som den for antistoff 16E2 versjon 1.

Likeledes viser resultatene som er vist i Figur 23 at Apomab 5.2, 7.3 og 8.3 var effektive i å redusere tumorvolumer i denne modellen med kolorektalkreft. I dette eksperimentet ble Apomab-typer og 16E2 administrert i doser på 1 mg/kg og 3 mg/kg, men ellers behandlet som beskrevet ovenfor. Effektiviteten av Apomab 7.3 og 8.3 er spesielt oppsiktsvekkende, og viser ingen reversering i løpet av testperioden på 20 dager.

Som vist i Figur 24 overskrider antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 i stor grad effektiviteetn til Apomab 23.3 og 25.3 i Colco 205 xenograftmodellen.

Figur 25 viser resultatene fra en analyse som sammenligner antitumoraktiviteten til Apomab 7.3 som er avledet fra stabile og transiente cellelinjer i Colo 205 musexenograft modellen. Kort fortalt ble atymiske hunn nakenmus med en alder på 6-8 uker inokulert med 5 millioner Colo 205 celler/mus i et 0,2 ml volum/mus, subkutant i høyre ryggflankeområde, som beskrevet ovenfor. Doseringene er vist i figuren. Data vist i Figur 25 viser at Apomab 7.3 som er avledet fra stabile og transiente cellelinjer er spesielt effektiv i Colco 205 musexenograft modellen.

Figur 26 viser resultatet av et eksperiment som tester antikreft aktiviteten til Apomab 7.3 (10 mg/kg dose) som monoterapi eller som kombinasjonsterapi med 80 mg/kg CPT-11 (irinotekan, et kjent legemiddel for behandlingen av kolorektal kreft) i en HCT15-xenograftmodell for kolorektalkreft. Som bekreftet ved resultatene vist, mens både Apomab 7.3 og CPT-11 var effektive når de blir administrert alene, så hadde kombinasjonen av de to en overlegen effekt, og overskred aktiviteten til både Apomab 7.3 og CPT-11 administrert som monoterapi.

Resultatene av et representativt eksperiment i nakenmus som bærer LS180 sarkomxenografter behandlet med Apomab 7.3 i kombinasjpn med CPT-11 (irinotekan) er vist i Figur 27. Igjen har kombinasjonsterapi blitt funnet å være overlegen i forhold til å administrere enten Apomab 7.3 eller CTP-11 som et enkelt middel, og forskjellen var satistisk signifikant (andre panel). Tukey-Kramer P<0,05 for alle par som er sammenlignet.

Eksempel 3

Evaluering av Apomab 7.3-antikreft aktivitet i BJAB-xenograftmodellen for non-Hudgkins lymfom

Antikreft aktivitet til Apomab 7.3 (10 mg/kg q1 uke) alene og i kombinasjon med Rituxan (rituximab, Genentech, Inc.) (4 mg/kg, q1 uke) ble uttrykt i en BJAB-xenograftmodell for non-Hodgkins lymfom. Siden lymfomceller ble kjent for å vokse bedre i SCID-mus, så ble 6-8 uker gamle SCID-mus (Charles River Laboratory) benyttet i denne undersøkelsen. Behandlingsparameterne og resultatene er vist i Figur 28. Apomab 7.3 og Rituxan viste, når de blir administrert i kombinasjon, synergistisk aktivitet.

Eksempel 4

Evaluering av Apomab 7.3-antikreftaktivitet i BxPC3-xenograftmodellen for human pankreas adenokarsinom

Antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 (10 mg/kg, i.v.) alene og i kombinasjon med gemcitabin (160 mg/kg, i.p.) i en BxPC3-xenograftmodell for humant pankreatisk adenokarsinom hos atymiske hunn nakenmus (Charles River Laboratory) ble undersøkt. Behandlingsparameterne og resultatene er vist i Figur 29. Dataene viste at antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 administrert som monoterapi var svært overlegen i forhold til effektiviteten til gemcitabin. Kombinert administrering av Apomab 7.3 og gemcitabin førte til en ytterligere forbedring i effektivitet.

Eksempel 5

Evaluering av Apomab 7.3-antikreftaktivitet alene og i kombinasjon med karboplatin og taksol i H460-xenograftmodellen for human lungekreft Antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 (10 mg/kg, 1 x uke, IP) alene og i kombinasjon med karboplatin og taksol ble vurdert relativt i forhold til en vehikkelkontroll og til kombinasjonen av karboplatin og taksol. 60 atymiske hunn nakenmus (Charles River Laboratory) ble inokulert med 5 millioner H406-celler/mus i et 0,2 volum/mus subkutant i høyre ryggflankeområde. Alle mus var øremerket for identifisering. Tumorer ble tillatt å nå et gjennomsnittlig tumorvolum på 100-200 mm<3>og behandlet som vist i Figur 30. Kort fortalt ble musene delt i fire grupper. Gruppe 1 var en vehikkelbehandlet kontrollgruppe (10 mM histidin, 8% sukkrose og 0,02% Tween-20 (pH 6)). Gruppe 2 ble behandlet med Apomab 7.3 i en dose på 10 mg/kg/mus IP, 1 x /uke i 2 uker. Gruppe 3 ble administrert karboplatin (100 mg/kg/mus IP, en enkelt dose på dag 0) taksol (6,25 mg/kg/mus, s.c., daglig i 5 påfølgende dager i 2 uker). Gruppe 4 mottok Apomab 7.3 (10 mg/kg/mus, IP, 1 x /uke i 2 uker) karboplatin (100 mg/kg/mus, IP, en enkelt dose på dag 0) taksol (6,25 mg/kg/mus, s.c., daglig i 5 påfølgende dager i 2 uker). Antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 administrert som monoterapi var sammenlignbar med aktiviteten til kombinasjonen karboplatin taksol. Kombinert administrering av Apomab 7.3 karboplatin taksol ble funnet å være overlegen når den ble sammenlignet med de andre behandlingsmodalitetene.

Eksempel 6

Evaluering av antikreftaktiviteten til Apomab 7.3 alene og i kombinasjon med karboplatin og taksol i H2122-xenograftmodellen for human lungekreft.

I denne undersøkelsen ble atymiske hunn nakenmus (Charles River Laboratory, 10 mus/gruppe) inokulert med 5 millioner H2122-celler/mus i et 0,2 ml volum/mus, subkutant, i det høyre ryggflankeområdet. Alle mus var øremerkede for identifisering. Tumorer ble tillatt å nå et gjennomsnittlig tumorvolum på 100-200 mm<3>, tilfeldig gruppert i 4 grupper (6 mus/gruppe) og behandlet som vist i Figur 31. Gruppe 1 var en vehikkelbehandlet kontrollgruppe (10 mM histidin, 8% sukkrose og 0,02% Tween-20 (pH 6)). Gruppe 2 ble administrert karboplatin (100 mg/kg/mus, IP, en enkeltdose på dag 0) taksol (6,25 mg/kg/mus, s.c., daglig i 5 påfølgende dager i 2 uker). Gruppe 3 mottok Apomab 7.3 (10 mg/kg/mus, IP, 1x/uke i 2 uker). Gruppe 4 mottok Apomab 7.3 (10 mg/kg/mus, IP, 1x/uke i 2 uker) karboplatin (100 mg/kg/mus, IP, en enkeltdose på dag 0) taksol (6,25 mg/kg/mus, s.c., daglig i 5 påfølgende dager i 2 uker). Som vist i Figur 31, viste ikke kombinasjonen av karboplatin taksol vesentlig antikreftaktivitet relativt i forhold til den vehikkelbehandlede kontrollgruppen. I sterk kontrast til dette viste Apomab 7.3 administrert som monoterapi oppsiktsvekkende antitumoraktivitet. Alle seks mus behandlet med Apomab 7.3 viste en fullstendig respons (CR) uten noen reversering i løpet av behandlingsperioden på 70 dager. Den samme aktiviteten ble funnet i gruppen behandlet med Apomab 7.3 karboplatin taksol.

For å bestemme den maksimale effektive dosen av Apomab 7.3 i denne modellen ble atymiske hunn nakenmus (Charles River Laboratory), i en alder på 6-8 uker, inokulert med 5 millioner H2122-celler/mus i et 0,2 ml volum/mus, subkutant i høyre ryggflankeområde. Alle mus var øremerkede for identifisering. Tumorer ble tillatt å nå et gjennomsnittlig tumorvolum på 100-200 mm<3>og tilfeldig gruppert (13 mus/gruppe) og behandlet som beskrevet nedenfor. Alle mus som ble ekskludert fra behandlingsgruppene ble avlivet.

Gruppe A var en vehikkelbehandlet kontrollgruppe (0,5 M argininsuksinat, 20 mM Tris, 0,02% Tween-20, pH 7.2). Vehikkel ble administrert 5x/uke, IP i en uke. Gruppe B ble administrert Apomab 7.3 i en 1 mg/kg/mus enkelt-IV-dose. Gruppe C ble administrert Apomab 7.3 i en 3 mg/kg/mus enkelt-IV-dose. Gruppe D ble administrert Apomab 7.3 i en 10 mg/kg/mus enkelt-IV-dose. 48 timer etter den første behandlingen ble tre mus fra hver av Gruppene B, C og D avlivet og deres tumorer ble samlet inn på følgende måte. En tumor ble preservert i 10% formalin for histologiundersøkelse. En tumor ble frosset i flytende nitrogen for RNA-undersøkelser. En tumor ble frosset i flytende nitrogen for Westernblotting. Tumormålinger ble tatt 2x/uke i de 2 første ukene og deretter 1x/uke i de neste 4 ukene. På slutten av de 6 ukene eller inntil tumorstørrelse nådde et omtrentlig volum på 800-1000 mm<3>, ble alle gjenværende mus avlivet. Doseresponskurvene som er vist i Figur 32, første panel, tyder på at Apomab 7.3 var effektivt i alle doser som ble testet, men dosene på 3 mg/kg og 10 mg/kg viste en distinkt (selv om den ikke var signifikant statistisk) forbedring relativt i forhold til dosen på 1 mg/kg. Tukey-Kramer P<0,05 for alle par ble sammenlignet (se Figur 32, andre panel).

Eksempel 7

Evaluering av antikreftaktivitet for Apomab 23.3, 25.3 og 7.3 i Colo 205-xenograftmodellen for human kolorektal kreft

I denne undersøkelsen ble atymiske hunn nakenmus (Charles River Laboratory) inokulert med 5 millioner Colo 205-celler/mus i et 0,2 ml volum/mus, subkutant i høyre ryggflankeområde. Alle mus var øremerket for identifisering. Tumor ble tillatt å nå et gjennomsnittlig tumorvolum på 100-200 mm<3>, tilfeldig gruppert i 7 grupper (10 mus/gruppe) og behandlet som vist i Figur 33. Gruppe 1 var en vehikkelbehandlet kontrollgruppe (10 mM histidin, 8% sukkrose og 0,02% Tween 20 (pH 6)). Gruppe 2 ble administrert i en enkeltdose på 3 mg/kg/mus i.v. med Apomab 7.3. Gruppe 3 ble administrert en enkeltdose på 10 mg/kg/mus i.v. med Apomab 7.3. Gruppe 4 ble administrert i en enkeltdose med 3 mg/kg/mus i.v. med Apomab 23.3. Gruppe 5 ble administrert en enkeltdose på 10 mg/kg/mus i.v. med Apomab 23.3. Gruppe 6 ble administrert en enkeltdose på 3 mg/kg/mus i.v. med Apomab 25.3. Gruppe 7 ble administrert en enkeltdose på 10 mg/kg/mus i.v. med Apomab 25.3. 24 timer etter behandling ble alle musene veid. Tumorer ble målt 2x/uke i de første 2 ukene og deretter ukentlig i de neste 4 ukene. Etter 6 uker eller når tumorene nådde en størrelse på >1000 mm<3>ble musene avlivet.

Resultatene er vist i Figur 33. Som vist ved 25-dagers dataene viste både Apomab 7.3 og Apomab 25.3 signifikant antikreftaktivitet i denne modellen.

Eksempel 8

Evaluering av antikreft-aktiviteten til monoklonalt antistoff Apomab 7.3 mot Colo 205-humane kolonkarsinom xenografter i nakenmus

Dyr

Atymiske hunn nakenmus (nu/nu, Harlan) var 11 eller 12 uker gamle på dag 1 i undersøkelsen. Dyrene ble foret ad libitum med vann og NIH 31 MOdified and Irradiated Lab Diet bestående av 18,0% råprotein, 5,0% råfett og 5,0% råfiber. Musene ble holdt og bestrålt på ALPHA-Dri bed-o’cobs Laboratory Animal Bedding i statiske mikroisolatorer på en 12-timers lyssyklus ved 21-22<o>C og 40-60% fuktighet.

Tumorimplantering

Xenografter ble initiert fra dyrkede, humane Colo 205-kolonkarsinomceller. Tumorcellene ble dyrket til midtre log-fase i RPMI-1640 tilsatt 10% varminaktivert fetalt, bovint serium, 100 enheter/ml penicillin-G-natrium, 100 μm/ml streptomycinsulfat, 0,25 μg/ml amfotericin-B og 25 μg/ml gentamicin, 2 mM glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 0,075% natriumbikarbonat. Cellekulturer ble opprettholdt i vevskulturflasker i en fuktet inkubator ved 37<o>C, i en atmosfære på 5% CO2 og 95% luft. På dagen med tumorcelleimplantering ble Colo 205-celler høstet og resuspendert i 50% Matrigel-matriks (BD Biosciences) i PBS med en konsentrasjon på 5 x 10<6>celler/ml. Hver testmus mottok 1 x 10<6>Colo 205-celler implantert subkutant i høyre flanke og tumorvekst ble overvåket etter hvert som den gjennomsnittlige pulsen nærmet seg 100 til 300 mm<3>. 13 dager senere, betegnet som Dag 1 i undersøkelsen, var individuelle tumorvolumer fra 126 til 288 mm<3>og dyrene ble sortert i 6 grupper som hver bestod av 10 mus med gjennomsnittlige tumorvolumer på 188 mm<3>.

Testmaterialer og behandling

Testmaterialene ble holdt på is i løpet av dosering og doseringsløsninger ble deretter lagret ved 4<o>C. I vehikkelkontrollgruppen (Gruppe 1) mottok mus vehikkel administrert intraperitoneal en gang om dagen i 5 dager, etterfulgt av to dagers hvilke, og deretter igjen daglig i ytterligere 5 dager. I testgruppen (Gruppene 2-4) ble dyr behandlet med Apo2L.0-ligand (60 mg/kg i.p. på et skjema med 5/2/5), Apomab 7.3 (3 mg/kg i.v., Dagene 1, 8) og et murint, monoklonalt anti-VEGF-antistoff B20-4.1 (10 mg/kg i.v., Dagene 1 og 8). Gruppene 5 og 6 mottok kombinasjon av B20-4.1 med Apo2L.0 og B20-4.1 med Apomab 7.3. Hver dose ble levert i et volum på 0,2 ml per 20 g kroppsvekt (10 mg/kg), skalert til kroppsvekten til dyret.

Endepunkt

Tumorer ble målt to ganger ukentlig ved å benytte målepasser. Hvert dyr ble avlivet når dens tumor nådde et volum på 2000 mm<3>eller ved sluttførelsen av undersøkelsen på Dag 68, uansett hva som kom først. Et endepunkts tumorvolum på 1000 mm<3>ble valgt for analyse av tumorvekstforsinkelse, på grunn av antallet tumorer som ikke nådde 2000 mm<3>-størrelsen. Tiden til endepunkt (TTE) for hver mus ble beregnet fra den følgende ligningen:

TTE (dager) = log10 (endepunktsvolum, mm<3>)-b

M

Der b er skjæringen og m er stigningen på linjen fremskaffet ved lineær regresjon av et log-transformert tumorvekst datasett. Datasettet bestod av den første observasjonen som gikk ut over undersøkelsesendepunktsvolumet og de tre påfølgende observasjonene som kom straks etter oppnåelsen av endepunktsvolumet. Dyr som ikke nådde endepunktet ble tilordnet en TTE-verdi lik med den siste datoen i undersøkelsen. Dyr som led av behandlingsrelatert død eller ikke-behandlingsrealtert død på grunn av metastaser ble tilordnet en TTE-verdi lik med dagen for død. Dyr som led av ikke-behandlingsrelatert død eller død av ukjente årsaker ble ekskludert fra TTE-beregningene.

Behandlingsutkomme ble evaluert ved tumorvekstforsinkelse (TGD), som er definert som økningen i den gjennomsnittlige tiden til endepunkt (TTE) i behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen:

TGD = T-C,

uttrykt i dager, eller som en prosentandel av gjennomsnittlig TTE for kontrollgruppen

%TGD = T-C x 100

C

der:

T = gjennomsnittlig TTE for behandlingsgruppen,

C = gjennomsnittlig TTE for kontrollgruppen.

Behandling kan forårsake delvis regresjon (PR) eller fullstendig regresjon (CR) av tumor i et dyr. I en PR-respons er tumorvolumet 50% eller mindre av dens volum på Dag 1 i tre påfølgende målinger i løpet av utviklingen av undersøkelsen, og lik med eller større enn 134,5 mm<3>i en eller flere av disse tre målingene. I en CR-respons er tumorvolumet mindre enn 13,5 mm<3>i en eller flere av disse tre målingene ved hjelp av utviklingen av undersøkelsen. Et dyr med en CR-respons ved avslutningen av undersøkelsen ble ytterligere klassifisert som en tumorfri overlever (TFS). Regresjonsresponser ble overvåket og registrert.

Prøvetakning

Tumorprøver ble tatt ved endepunkt fra dyr i hver gruppe. Disse dyrene ble avlivet ved hjelp av nakkebrudd rett før prøvetakning. Tumorene til tre dyr per gruppe ble høstet, skåret opp og preservert i 10% nøtralt bufret formalin i 12 til 24 timer ved romtemperatur.

Statistisk og grafisk analyse

Logrank-testen ble benyttet til å analysere signifikansen til ulikhetene mellom TTE-verdiene for behandlede grupper og kontrollergrupper. To-halede, statistisk analyser ble utført ved signifikansnivå P = 0,05, der resultatene ble ansett som signifikante ved 0,01 < P < 0,05, og svært signifikant ved P < 0,01.

Gjennomsnittlige tumorvekstkurver viser gruppegjennomsnittlige tumorvolumer som en funksjon av tid. Når et dyr gikk ut av undersøkelsen på grunn av tumorstørrelse, ble det endelige tumorvolumet som var registrert for dyret inkludert i dataene som ble benyttet til å beregne gruppegjennomsnittlig tumorvolum ved påfølgende tidspunkter.

Kaplan-Meier plot ble konstruert for å vise prosentandelen av dyr som forble i undersøkelsen som en funksjon av tid. Disse plottene benyttet det samme datasettet som Logrank-testen.

Resultater

Figur 34 viser gruppegjennomsnittlige tumorvekstkurver (øvre panel) og Kaplan-Meier-plottene (nedre panel) for hver gruppe i denne undersøkelsen. Den gjennomsnittlige TTE for vehnikkelbehandlede kontrollmus var 10,0 dager, der en tumor (av ti) ikke oppnådde endepunkttumorvolumet på 1000 mm<3>. B20-4.1 administrert ved 10 mg/kg i.p.

på Dagene 1 og 8 produserte en moderat TGD på 19,9 dager (113%) som ikke var statistisk signifikant. Apo2L.0- og Apomab 7.3-monoterapier var effektive mot Colo 205 og ga tumorvekstforsinkelser på henholdsvis 28,4 dager (190%) og 53,0 dager (355%).

Tilsetningen av B20-4.1 til enten Apo2L.0 eller Apomab 7.3 forbedret ikke effektiviteten til behandling med hensyn på TGD eller regresjonsresponser.

Eksempel 9

Evaluering av anti-kreftaktiviteten til monoklonalt antistoff Apomab 7.3 som monoterapi og i kombinasjon med karboplatin pluss paklitaksel mot SKMES-1 human NSCLC

In vivo-antitumoraktivitetene til Apo2L.0-liganden og Apomab 7.3, som monoterapier, og i rekombinasjon med karboplatin pluss paklitaksel mot SKMES-1 human NSCLC ble testet.

Dyr

Atymiske hunn nakenmus (nu/nu, Harlan) var 9 til 10 uker gamle og h adde kroppsvekt fra 17,4 til 25,4 g på Dag 1 av undersøkelsen. Dyrene ble foret ad libitum med vann og NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet bestående av 18,0% råprotein, 5,0% råfett og 5,0% råfiber. Musene ble holdt på bestrålt ALPHA-Dri bed-o’ cobs Laboratory Animal Bedding i statiske mikroisolatorer på en 12-timers lyssyklus ved 21-22<o>C og 40-60% fuktighet.

Tumorimplantering

Xenografter ble initiert fra SKMES-1-lungetumorer opprettholdt ved serietransplantasjon ved PRC. Hver testmus mottok et SKMES-1-tumorfragment på 1 mm<3>implantert subkutant i høyre flanke og tumorveksten ble overvåket. 13 dager senere, betegnet som Dag 1 i undersøkelsen, så var individuelle tumorvolumer fra 63 til 144 mm<3>, og dyrene ble sortert i fire grupper som hver bestod av 10 mus og 2 grupper som hver bestod av 9 mus. Gjennomsnittlige tumorvolumer var 93 til 95 mm<3>.

Testmaterialer og behandling

Alle testmaterialer ble tilveiebrakt klar til å dosere ved 0,1 ml per 20 g kroppsvekt (5 mg/kg) og ble lagret ved -80<o>C frem til levering. Testmaterialene ble tint på den første dagen med dosering, holdt på is i løpet av dosering og deretter lagret ved 4<o>C. Karboplatin (PARAPLATIN-injeksjon, Bristol Myers Squibb) ble fortynnet med 5% dekstrose i vann (D5W) for å gi den ønskede dosen i et volum på 0,2 ml per 10 g kroppsvekt (10 ml/kg). Paklitaksel (Natural Pharmaceuticals, Inc.) ble fortynnet med D5W på hver dag med dosering fra en 10X stokkløsning for å gi et vehikkel bestående av 5% etanol og 5% Kremofor EL i 90% D5W (5% EC-vehikkel), slik at den ønskede dosen ble levert i 0,1 ml per 20 g kroppsvekt.

Gruppe 1 (vehikkelkontroll) mus mottok vehikkel administrert intraperitonealt en gang daglig i 5 dager (i.p., qd x 5) og virket som tumorvekstkontroller. Mus i Gruppene 2 og 3 mottok monoterapi med Apo2L.0 (60 mg/kg s.c. qd x 5) og Apomab 7.3 (10 mg/kg i.v. qd x 1). Mus i Gruppe 4 mottok kombinasjonen av karboplatin (100 mg/kg i.p. qd x 1) pluss paklitaksel (6,25 mg/kg s.c. qd x 5). Mus i Gruppene 5 og 6 mottok karboplatin pluss paklitaksel i kombinasjon med Apo2L eller Apomab 7.3. Hver dose ble administrert i volumet som er indikert i den tidligere seksjonen, og ble skalert til kroppsvekten til dyret.

Endepunkt, prøvetakning og statistisk analyse

Endepunkt ble bestemt og prøvetakning og statistisk analyse utført som beskrevet i tidligere Eksempel 8.

Resultater

Figurene 35 og 36 viser gruppegjennomsnittlig tumorvekstkurver og Kaplan-Meierplott for grupper behandlet med Apo2L.0 og Apomab 7.3.

Tumorene til alle vehikkelbehandlede kontrollmus vokste til endepunktvolumet 1500 mm<3>med en gjennomsnittlig TTE på 18,9 dager. Den maksimale TGD oppnåelig i denne 45-dagers undersøkelsen var derfor 26,1 dager (138%). Den gjennomsnittlige tumorvekstkurven av Kaplan-Meier-plottet for kontrollgruppen er inkludert i det øvre og det nedre panelet i Figurene 35 og 36.

For den Apo2L.0-behandlede gruppe (Gruppe 2) var gjennomsnittlig TTE 22,9 dager og tilsvarte en 4,0 dag (21%) TGD og statistisk ikke-signifikant aktivitet. Figur 28 (øvre panel) indikerer at gjennomsnittlig tumorvolumer i Gruppe 2 skrumpet inn i løpet av behandlingsperioden, og deretter gjenoppstod rask tumorvekst.

Den gjennomsnittlige TTE for Gruppe 3 var 2,0 dager og tilsvarte en 7,1-dag (38%) TGD og svært statistisk signifikant aktivitet (P = 0,005). Ingen regresjonsresponser ble dokumentert og alle tumorer opprettholdt endepunktsvolumet på 1500 mm<3>. Gruppe 3-gjennomsnittlig tumorvekstkurve tyder på en første forsinkelse i tumorvekst i forhold til kontroller.

Gjennomsnittlige TTE i Gruppe 4-mus behandlet med karboplatin pluss paklitaksel var 26,5 dager og tilsvarte en 7,6-dagers (40%) TGF og statistisk signifikant aktivitet (P = 0,01). Alle Gruppe 4-tumorer vokste til endepunktvolum på 1500 mm<3>og ingen regresjonsresponser ble dokumentert. Den gjennomsnittlige tumorvekstkurven for Gruppe 4-mus indikerte en moderat forsinkelse i tumorvekst relativt i forhold til kontrollmus (se Figurene 35 og 36, øvre paneler).

Behandling med trippelkombinasjonen av Apo2L.0, karboplatin og paklitaksel produserte en gjennomsnittlig TTE på 32,7 dager, som tilsvarte en 13,9-dagers (73%) TGD og svært signifikant aktivitet i forhold til Gruppe 1 (P = 0,002). Den 32,7-dagers gjennomsnittlige TTE med denne trippelkombinasjonen var lengre enn 22,9-dagers gjennomsnitt-TTE for Apo2L.0-monoterapigruppen eller 16,5-dagers gjennomsnitt-TTE for kjemoterapi kontrollbehandlingen, men forskjellen oppnådde ikke statistisk signifikans ved Logrank-analyse. På tross av mangelen på statistisk signifikans tyder de gjennomsnittlige tumorvekstkurvene på større aktivitet med Gruppe 5-kombinasjon sammenlignet med enhver av Apo2L.0 monoterapien eller karboplatin pluss paklitaksel kjemoterapi (se Figur 28, øvre panel).

Behandling med trippelkombinasjonen med Apomab 7.3 (Gruppe 6), karboplatin og paklitaksel førte til 3/10 TR-død, og derfor blir denne gruppen ikke evaluert for TGD. De gjennomsnittlige tumorvekstkurvene tydet likevel på større aktivitet med Gruppe 6-kombinasjon sammenlignet med enhver av Apomab 7.3-monoterapien eller kjemoterapien med karboplatin pluss paklitaksel (se Figur 37, øvre panel).

Konklusjon

På tross av den relativt høye dødeligheten i dette eksperimentet, tyder dataene på at enhver av Apo2L.0 og Apomab 7.3 kan tilføre antitumorgevinst til behandling med karboplatin og paklitaksel.

Eksempel 10

Evaluering av anti-kreft aktiviteten til monoklonalt antistoff Apomab 7.3 som monoterapi i kombinasjon med et anti-VEGF-antistoff i den humane Colo 205-karsinom xenograftmodellen

Dyr

Atymiske hunn nakenmus (nu/nu, Harlan) var 7-8 uker gamle på Dag 1 i undersøkelsen. Dyrene ble foret ad libitum med vann og NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet bestående av 18,0% råprotein, 5,0% råfett og 5,0% råfiber. Musene ble holdt på bestrålt ALPHA-Dri bed-o’cobs Laboratory Animal Bedding i statiske mikroisolatorer på en 12-timers lyssyklus ved 21-22<o>C og 40-60% fuktighet.

Tumorcellekultur

Humane Colo 205 kolonkarsinomceller ble dyrket i RPMI 1640-medium inneholdende 100 enheter/ml penicillin-G-natrium, 100 μg/ml streptomycinsulfat, 0,25 μg/ml amptoericin-B og 25 μg/ml gentamicin. Mediet var tilsatt 10% varmeinaktivert, fetalt, bovint serum, 2 mM glutamin og 1 mM natriumbikarbonat. Tumorcellene ble dyrket i vevskulturflasker i en fuktet inkubator ved 37<o>C i en atmosfære på 5% CO2 og 95% luft.

In vivo-implantering

De humane Colo 205-karsinomcellene som ble benyttet til implantering ble høstet i løpet av logfase vekst og resuspendert i 50% matrigel ved 5 x 10<6>celler/ml. Hver mus ble injisert s.c. i høyre flanke med 1 x 10<6>celler (0,2 ml cellesuspensjon). Tumorer ble overvåket to ganger ukentlig og deretter daglig ettersom deres volumer nærmet seg 100-300 mm<3>. På Dag 1 av denne undersøkelsen ble dyrene sortert i behandlede grupper med tumorstørrelse på 108,0-220,5 mm<3>og en gruppe med gjennomsnittlig tumorstørrelse på 149,8 mm<3>. Tumorvekt kan bli beregnet med den antagelsen at 1 mg er ekvivalent med 1 mm<3>tumorvolum.

Testmaterialer og behandling

Testmaterialene ble tilveiebrakt klare for dosering. Doseringsløsningen ble lagret ved 4<o>C.

Mus ble sortert i 6 grupper med 10 mus per gruppe. Alle behandlingene ble administrert intraperitonealt (i.p.).

Apo2L.0 og dens vehikkel ble hver administrert en gang daglig på Dagene 1-5 (qd x 5). Apomab 7.3 og murint anti-VEGF-antistoff anti-G6 ble hver gitt en gang på Dag 1 (qd x 1). Kontrollgruppe 1-mus ble behandlet med vehikkelen for Apo2L.0. Gruppe 2 mottok Apo2L.0-monoterapi ved 60 mg/kg. Gruppe 3 mottok Apomab 7.3-monoterapi ved 3 mg/kg. Gruppe 4 mottok BY4-monoterapi ved 5 mg/kg. Gruppene 5 og 6 mottok henholdsvis Apo2L.0 ved 60 mg/kg og Apomab 7.3 ved 3 mg/kg, hver i kombinasjon med anti-G6 ved 5 mg/kg. I alle gruppene ble doseringsvolumet på 0,2 ml/20 g mus skalert til kroppsvekten til hvert dyr.

Endepunkt, prøvetakning og statistisk analyse

Endepunkt ble bestemt og prøvetakning og statistiske analyser utført som beskrevet i tidligere Eksempel 8.

Resultater

Resultatene er vist i Figur 37 der kurvene i øvre panel viser gruppegjennomsnittlig tumorvolumer versus tid som Kaplan-Meier-plottet i det lavere panelet viser prosentandelen av evaluerbare dyr som er en i hver gruppe, i forhold til tid.

Kontrollgruppe-1-mus mottok Apo2L.0-vehikkel og virker som kontrollen for alle behandlingsgrupper. Tumor i alle 10 mus vokste til endepunktsvolumet på 1500 mm<3>med en gjennomsnittlig TTE på 20,8 dager. Derfor var den maksimale mulige TGD i denne 61-dagers undersøkelsen på 193%.

Gruppe 2 mottok Apo2L.0-monoterapi ved 60 mg/kg. Denne behandlingen frebrakte svært signifikant antitumoraktivitet relativt i forhold til vehikkelkontrollgruppen (P<0,001) og en gjennomsnittlig TTE på 53,6 dager. Gjennomsnittlig TTE tilsvarerer en 32,8-dagers T-C og 158% TGD. Det gjennomsnittlige tumorvolumet på Dag 61 for 5 mus var 1 210 mm<3>. En LTTFS ble registrert.

Gruppe 3 mottok Apomab 7.3-monoterapi med 3 mg/kg. Denne behandlingen frembrakte svært signifikant aktivitet (P<0,001) med maksimalt mulig 193% TGD og en MTV(5) pp 776 mm<3>. En LTTFS, en forbigående CR-respons og tre FR-responser ble registrert.

Gruppe 4 mottok anti-G6-monoterapi ved 5 mg/kg. Denne behandlingen frembrakte svært signifikant aktivitet (P< 0,01) med 86% TGF og en MTV(3) på 1 224 mm<3>. Ingen regresjonsresponser ble registrert.

Gruppe 5 mottok Apo2L.0 ved 60 mg/kg i kombinasjon med anti-G6 ved 5 mg/kg. Kombinasjonsbehandlingen ga 138% TGD. Antitumoraktivitet var svært signifikant relativt i forhold til vehikkelbehandlingen (P<0,001), men ikke signifikant relativt til begge monoterapier. I Gruppe 5 var MTV(3) på 1 080 mm<3>og en PR-respons ble registrert.

Gruppe 6 mottok kombinasjonsbehandling med Apomab 7.3 ved 3 mg/kg og anti-G6 ved 5 mg/kg. Denne behandlingen ga den maksimalt mulige 193% TGD. Antitumoraktivitet var svært signifikant relativ i forhold til vehikkelbehandlingen (P<0,001), signifikant relativt i forhold til anti-G6-monoterapi, men ikke-signifikant i forhold til Apomab 7.3-monoterapi. I Gruppe 6 var MTV(8) på 208 mm<3>og 5 PR-responser ble registrert.

Konklusjoner

Tumor responderte sterkt på monoterapi med 3 mg/kg qd x 1 Apomab 7.3 (Gruppe 3). Denne behandlingen ga svært signifikant aktivitet relativt i forhold til vehikkelkontrollgruppen, og den maksimale mulige 193% TGD. Blant 6 mus som overlevde til Dag 61 med en MTV på 776 mm<3>opplevde 5 dyr tumorregresjon. Denne monoterapien ga en LTTFS, en forbigående CR-respons og tre PR-responser. Det gjennomsnittlige tumorvolumet økte ikke før etter Dag 15 (Figur 37)

Kombinasjonsterapi med Apomab 7.3 og det murine anti-VEGF-antistoffet anti-G6 ga sterkere aktivitet enn det som ble observert med enhver av Apomab 7.3 eller anti-G6 alene. Denne kombinasjonsbehandlingen ga 8 overlevende ved Dag 61 og genererte undersøkelsens laveste MTV på 208 mm<3>. Den gjennomsnittlige tumorvekstkurven viste tumorregresjon eller statis inn til Dag 33, etterfulgt av svært sakte tumorvekst (Figur 37). Kombinasjonen frembrakte signifikant sterkere aktivitet enn anti-G6-monoterapien, men var ikke signifikant forskjellig fra resultatene for Apomab 7.3-monoterapien. I tillegg ga kombinasjonen 5 PR-responser, mens de 5 regresjonsresponsene som ble oppnådd med Apomab 7.3-monoterapi inkluderer en forbigående CR og en LTTFS.

Alle terapier var godt tolererte. Ikke noe kroppsvekttap eller annen overdreven toksisitet ble observert i denne undersøkelsen.

Oppsummert ga Apomab 7.3/anti-G6-kombinasjonsterapien flere overlevere på Dag 61 og en lavere MTV enn behandling med enhver av de tilsvarende monoterapiene.

Apomab 7.3/anti-G6-kombinasjonen ga likevel ikke kurerende aktivitet, noe som ble observert med Apomab 7.3-monoterapi.

Claims (49)

Pa ten tkra v

1. Anti-DR5-antistoff som omfatter mutasjoner i den tunge og den lette kjeden til fulllengde antistoffet 16E2 som vist i henholdsvis Sekv. id. nr. 11 og 13, eller et fragment derav,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t det nevnte antistoffet eller antistoff-fragmentet har en større affinitet for DR5 enn full-lengde antistoffet 16E2, og er istand til å aktivere eller stimulere apoptose i kreftceller; og mutasjonene omfatter

(i) et sett av tung kjede mutasjoner som er valgt fra gruppen som består av (i) N53Q, L102Y, (ii) M34L, N53Q, L102Y, (iii) N53Y, L102Y, (iv) M34L, N53Y, L102Y, (v) G33A, N53Q, L102Y, (vi) M34L, N53Y, L102Y, (vii) G33A, N53Q, L102Y, (viii) G33A, N53Y, L102Y, og (ix) T28A, N53Q, L102Y i aminosyresekvensen ifølge Sekv. Id. Nr. 11, og

(ii) et sett av lett kjede mutasjoner som er valgt fra gruppen som består (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY; (ii) Q24S, KS1A, D92S, S93Y; and (iii) Q24S, K51A, R91A i aminosyresekvensen ifølge Sekv. id. nr. 13.

2. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 1, hvor nevnte antistoff binder essensielt til den samme epitopen som full-lengde antistoff 16E2.

3. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 1, som omfatter én eller flere mutasjoner i rammeverket til full-lengde 16E2-antistoffets tunge kjedes variable domene i aminosyresekvensen ifølge Sekv. id. nr. 11 eller et fragment derav.

4. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 3, hvor rammeverksmutasjonen er valgt fra gruppen som består av Q6E, V11L, E12V, R13Q og K105Q eller et fragment derav.

5. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 4, som omfatter alle rammeverksmutasjonene Q6E, V11L, E12V, R13Q og K105Q eller et fragment derav.

6. Anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene som omfatter minst én av mutasjonene G99A og R100A i aminosyresekvensen ifølge Sekv. id. nr. 11, eller et fragment derav.

7. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 1, som omfatter de følgende mutasjonene: G33A, N53Q, L102Y i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 11, og Q24S, K51A, R91A i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 13, eller et fragment derav.

8. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 1, som omfatter de følgende mutasjonene: G33A, N53Y, L102Y i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 11, og Q24S, K51A, R91A i sekvensen ifølge Sekv. id. nr. 13, eller et fragment derav.

9. Anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor nevnte fragment er valgt fra gruppen som består av Fab-, Fab’-, F(ab’)2- og Fv-fragmenter, diastoffer, enkeltkjedede antistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer dannet fra antistoff-fragmenter.

10. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 9, hvor nevnte antistoff er et enkeltkjedet antistoff.

11. Anti-DR5-antistoff ifølge krav 9, hvor nevnte fragment er et Fv-fragment.

12. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragmentet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor antistoffet har en større anti-kreftaktivitet enn full-lengde 16E2 antistoff.

13. DR5-antistoff eller antistoff-fragment ifølge krav 1, ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor antistoffet har en større styrke enn full-lengde 16E2 antistoffet som bestemt i en in vitro-tumordrepingsanalyse.

14. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, som er et kimært, humanisert eller humant antistoff.

15. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, som medierer antistoffavhengig, cellulær cytotoksisitet (ADCC).

16. Anti-DR5-antistoff ifølge ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene i en dimer form eller et fragment derav.

17. Anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, som er kryssbundet med en anti-human IgG-Fc-region eller et fragment derav.

18. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, som er fusjonert til en epitopmerket sekvens.

19. Kimært molekyl,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter antistoffet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, fusjonert til en heterolog aminosyresekvens.

20. Kimært molekyl ifølge krav 19, hvor nevnte heterologe aminosyresekvens omfatter en immunglobulinsekvens.

21. Kimært molekyl ifølge krav 20, hvor nevnte immunglobulinsekvens er en antihuman IgG-Fc-region.

22. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, for anvendelse i terapi.

23. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 22, hvor terapien er behandling av kreft.

24. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 23, hvor kreften er valgt fra gruppen som består av karsinom, lymfom, blastom, sarkom og leukemi.

25. Anti-DR5-antisoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 23, hvor nevnte kreft er valgt fra gruppen som består av skvamøs cellekreft, småcellet lungekreft, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), non-Hodgkins lymfom, blastom, gastrointestinalkreft, nyrekreft, ovariekreft, leverkreft, magekreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, kolonkreft, kolorektalkreft, pankreaskreft, endometriumkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, leverkreft, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, hepatisk karsinom og hode- og nakkekreft.

26. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 25, hvor nevnte kreft er NSCLC, non-Hodgkins lymfom, kolorektalkreft eller pankreaskreft.

27. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 24, hvor nevnte kreft er et adenokarsinom.

28. Anti-DR5-antistoff eller antistoff-fragment for anvendelse i terapi ifølge krav 27, hvor nevnte adenokarsinom er kolorektalt, pankreas- eller metastatisk karsinom.

29. Isolert nukleinsyre,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t den koder for den tunge eller lette kjeden til et anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18.

30 Vektor,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t den omfatter nukleinsyren ifølge krav 29.

31. Vertscelle,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t den omfatter nukleinsyren ifølge krav 30.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av et anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18, som omfatter å dyrke vertscellen ifølge krav 31 under betingelser der DNAet blir uttrykt.

33. Sammensetning,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t det omfatter et anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18, eller et fragment derav, og en bærer.

34. Sammensetning ifølge krav 33, hvor nevnte bærer er en farmasøytisk akseptabel bærer.

35. Sammensetning ifølge krav 34, som videre omfatter et ytterligere anti-kreftmiddel.

36. Sammensetning ifølge krav 35, hvor nevnte ytterligere anti-kreftmiddel er et antistoff.

37. Sammensetning ifølge krav 36, hvor nevnte antistoff er valgt fra gruppen som består av et ytterligere anti-DR5-antistoff, Rituxan (rituximab) og et anti-VEGF-antistoff.

38. Sammensetning ifølge krav 35, hvor nevnte ytterligere anti-kreftmiddel er et kjemoterapeutisk middel.

39. Sammensetning ifølge krav 38, hvor nevnte kjemoterapeutiske middel er valgt fra gruppen som består av CPT-11 (irinotekan), gemcitabin, karboplatin, taksol og paklitaksel.

40. Sammensetning ifølge krav 39, hvor nevnte ytterligere anti-kreftmiddel er en Apo2L-ligand som omfatte aminosyrene 114-281 ifølge Sekv. id. nr. 1.

41. En ex vivo fremgangsmåte for å indusere apoptose, som omfatter å eksponere pattedyrkreftceller for et anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1-18, eller et fragment derav.

42. Fremgangsmåte ifølge krav 41, hvor nevnte pattedyrkreftceller blir eksponert ovenfor et middel som aktiverer DR5.

43. Anvendelse av et anti-DR5-antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 18, eller et fragment derav, til fremstilling av et medikament for behandling av kreft i et pattedyrindivid.

44. Anvendelse ifølge krav 43, hvor nevnte pattedyrindivid er en human pasient.

45. Anvendelse ifølge krav 43 eller krav 44, hvor nevnte kreft er valgt fra gruppen som består av skvamøs cellekreft, småcellet lungekreft, ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), non-Hodgkins lymfom, blastom, gastrointestinal kreft, nyrekreft, ovariekreft, leverkreft, magekreft, blærekreft, hepatom, brystkreft, kolonkreft, kolorektalkreft, pankreaskreft, endometriumkarsinom, spyttkjertelkarsinom, nyrekreft, leverkreft, prostatakreft, vulvakreft, tyroidkreft, hepatisk karsinom og hode- og nakkekreft.

46. Anvendelse ifølge krav 45, hvor nevnte kreft er NSCLC, kolorektalkreft, non-Hodgkins lymfom eller pankreaskreft.

47. Anvendelse ifølge krav 43 eller krav 44, hvor nevnte kreft er et adenokarsinom.

48. Anvendelse ifølge krav 47, hvor nevnte adenokarsinom er kolorektalt, pankreatisk eller metastatisk adenokarsinom.

49. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 43 til 48, som ytterligere omfatter administrering av et ytterligere anti-kreftmiddel.