KR101297467B1 - Ｄｒ５ 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개선된 특성을 갖는 항-DR5 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물, 상기 항체를 제조하기 위한 방법 및 수단, 및 특히 암의 치료에서 이들의 치료 용도에 관한 것이다.
항-DR5 항체, 조성물, 암, 치료, 종양

Description

ＤＲ５ 항체 및 그의 용도 {DR5 ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 일반적으로 DR5 항체, 예를 들어 작용제 항체, 및 상기 DR5 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리에 속하는 다양한 리간드 및 수용체가 당업계에서 확인되었다. 상기 리간드에는 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-알파"), 종양 괴사 인자-베타 ("TNF-베타" 또는 "림프독소-알파"), 림프독소-베타 ("LT-베타"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, LIGHT, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로도 칭함), Apo-2 리간드 (Apo2L 또는 TRATL로도 칭함), Apo-3 리간드 (TWEAK로도 칭함), APRIL, OPG 리간드 (RANK 리간드, ODF, 또는 TRANCE로도 칭함), 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로도 칭함)이 포함된다 (예를 들어, Ashkenazi, Nature Review. 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference. Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Grass and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987); Pitti et al., J. Biol. Chem, 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992), 1997년 1월 16일 공개된 WO 97/01633; 1997년 1월 17일 공개된 WO 97/25428; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185- 1190 (1998); 1998년 7월 2일 공개된 WO98/28426; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46751; 1998년 5월 7일 공개된 WO/98/18921; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999) 참조).
상기 TNF 패밀리 리간드에 의해 매개된 다양한 세포 반응의 유도는 일반적으로 특정 세포 수용체에 대한 그의 결합에 의해 개시된다. 전부는 아니지만 일부의 TNF 패밀리 리간드는 카스파제, 또는 세포 사멸 또는 세포자멸 (apoptosis) 경로를 수행하는 효소를 활성화시키는 세포 표면 "사멸 수용체"에 결합하고 이 수용체를 통해 다양한 생물학적 활성을 유도한다 (Salvesen et al., Cell, 91:443-446 (1997)). 지금까지 확인된 TNF 수용체 수퍼패밀리의 멤버에는 TNFR1, TNFR2, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (Apo-1 또는 CD95로도 칭함), DR4 (TRAIL-R1로도 칭함), DR5 (Apo-2 또는 TRAIL-R2로도 칭함), DcR1, DcR2, 오스테오프로테게린 (OPG), RANK 및 Apo-3 (DR3 또는 TRAMP로도 칭함)가 포함된다 (예 를 들어, Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002); Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference. Academic Press, 2000, pages 377-411; Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001); Grass and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990); 1991년 3월 20일 공개된 EP 417,563; Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al., Science. 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991); Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989); Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990); Anderson et al., Nature. 390:175-179 (1997); Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Pan et al., Science. 276:111-113 (1997); Pan et al., Science. 277:815-818 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997); vonBulow et al., Science. 278:138-141 (1997) 참조).
대부분의 상기 TNF 수용체 패밀리 멤버는 세포외, 트랜스멤브레인 및 세포내 영역을 포함하여 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유하지만, 다른 멤버는 트랜스멤브레인 및 세포내 도메인이 결여된 가용형 단백질로서 자연에서 발견된다. 전형적인 TNFR의 세포외 부분은 NH2-말단으로부터 출발하는 다수의 시스테인-풍부 도메인 (CRD)의 반복적인 아미노산 서열 패턴을 포함한다.
Apo-2L 또는 TRAIL로 언급되는 리간드는 수년 전에 시토킨의 TNF 패밀리 멤버로서 확인되었다 (예를 들어, Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem, 271: 12697-12690 (1996); WO 97/01633; WO 97/25428; 1998년 6월 9일 등록된 미국 특허 5,763,223; 2001년 9월 4일 등록된 미국 특허 6,284,236 참조). 전장 천연 서열 인간 Apo2L/TRAIL 폴리펩티드는 281개 아미노산 길이의 타입 II 트랜스멤브레인 단백질이다. 일부 세포는 폴리펩티드의 세포외 영역의 효소에 의한 절단을 통해 폴리펩티드의 천연 가용형 형태를 생산할 수 있다 (Mariani et al., J. Cell. Biol, 137:221-229 (1997)). Apo2L/TRAIL의 가용형 형태에 대한 결정학적 연구는 TNF 및 다른 관련 단백질의 구조와 유사한 단독삼량체 (homotrimeric) 구조를 규명하였다 (Hymowitz et al., Molec. Cell, 4:563-571 (1999); Cha et al., Immunity, 11:253-261 (1999); Mongkolsapaya et al., Nature Structural Biology, 6:1048 (1999); Hymowitz et al., Biochemistry, 39:633-644 (2000)). 그러나, 다른 TNF 패밀리 멤버와 달리 Apo2L/TRAIL은 3개의 시스테인 잔기 (단독삼량체의 각각의 서브유닛의 위치 230의)가 함께 아연 원자와 배위 결합하고 아연 결합이 삼량체 안정성 및 생물학적 활성에 중요하다는 점에서 특유한 구조 적 특징을 갖는 것으로 밝혀졌다 (Hymowitz et al., 상기 문헌; Bodmer et al., J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)).
Apo2L/TRAIL이 자가면역 질병, 예를 들어 류마티스성 관절염을 포함하여 면역계 조절에서 기능을 수행할 수 있음이 문헌에 보고되었다 [예를 들어, Thomas et al., J. Immunol., 161:2195-2200 (1998); Johnsen et al., Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith et al., J. Exp. Med., 189:1343-1353 (1999); Song et al., J. Exp. Med., 191:1095-1103 (2000) 참조].
또한, Apo2L/TRAIL의 가용형 형태는 결장, 폐, 유방, 전립선, 방광, 신장, 난소 및 뇌 종양, 및 흑색종, 백혈병, 및 다발 골수종을 포함하여 다양한 암 세포에서 세포자멸을 유도하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, Wiley et al., 상기 문헌; Pitti et al., 상기 문헌; 2000년 2월 29일 등록된 미국 특허 6,030,945; 2004년 6월 8일 등록된 미국 특허 6,746,668; Rieger et al., FEBS Letters, 427:124-128 (1998); Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104:155-162 (1999); Walczak et al., Nature Med., 5:157-163 (1999); Keane et al., Cancer Research, 59:734-741 (1999); Mizutani et al., Clin. Cancer Res., 5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824 (1999); Yu et al., Cancer Res., 60:2384-2389 (2000); Chinnaiyan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759 (2000) 참조). 또한, 쥐 종양 모델에서 생체내 연구는 Apo2L/TRAIL이 단독으로 또는 화학요법 또는 방사선 요법과 조합되어 실질적인 항-종양 효과를 보일 수 있음을 제시하였다 (예를 들어, Ashkenazi et al., 상기 문헌; Walzcak et al., 상기 문헌; Gliniak et al., Cancer Res., 59:6153-6158 (1999); Chinnaiyan et al., 상기 문헌; Roth et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999 (1999); PCT 출원 US/00/15512; PCT 출원 US/01/23691 참조). 많은 종류의 암 세포와 대조적으로, 대부분의 정상 인간 세포 형태는 Apo2L/TRAIL의 특정 재조합 형태에 의한 세포자멸 유도에 저항성인 것으로 보인다 (Ashkenazi et al., 상기 문헌; Walzcak et al., 상기 문헌). 조 (Jo) 등은 Apo2L/TRAIL의 폴리히스티딘-태깅된 (tagged) 가용형 형태가 단리된 정상 인간 간세포에서 세포자멸을 시험관내 유도하지만, 비인간 간세포에서는 유도하지 않음을 보고하였다 (Jo et al., Nature Med., 6:564-567 (2000); Nagata, Nature Med., 6:502-503 (2000) 참조). 특정 재조합 Apo2L/TRAIL 제제는 예를 들어 태그 분자의 존재 또는 부재, 아연 함량 및 ％ 삼량체 함량에 따라 이환된 세포 대 정상 세포에 대한 생화학적 특성 및 생물학적 활성이 상이할 수 있다고 생각된다 (Lawrence et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385 (2001); Qin et al., Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386 (2001) 참조).
Apo2L/TRAIL은 5종 이상의 상이한 수용체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. Apo2L/TRAIL에 결합하는 2종 이상의 수용체는 기능성 세포질 사멸 도메인을 포함한다. 상기 한 수용체는 "DR4"로 (또는 TR4 또는 TRADL-R1로) 언급되었다 (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); 또한 1998년 7월 30일 공개된 WO98/32856; 1999년 7월 29일 공개된 WO99/37684; 2000년 12월 7일 공개된 WO 00/73349; 2002년 8월 13일 등록된 US 6,433,147; 2002년 10월 8일 등록된 US 6,461,823 및 2002년 1월 29일 등록된 US 6,342,383 참조).
Apo2L/TRAIL에 대한 다른 수용체는 DR5로 (또는 Apo-2; TRAIL-R 또는 TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로) 언급되었다 (예를 들어, Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997), Pan et al., Science, 277:815-818 (1997), 1998년 11월 19일 공개된 WO98/51793; 1998년 9월 24일 공개된 WO98/41629; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics. 17:141-143 (1997); 1998년 8월 20일 공개된 WO98/35986; 1998년 10월 14일 공개된 EP870,827; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46643; 1999년 1월 21일 공개된 WO99/02653; 1999년 2월 25일 공개된 WO99/09165; 1997년 3월 11일 공개된 WO99/11791; 2002년 8월 13일 공개된 US 2002/0072091; 2001년 12월 7일 공개된 US 2002/0098550; 2001년 12월 6일 등록된 US 6,313,269; 2001년 8월 2일 공개된 US 2001/0010924; 2003년 7월 3일 공개된 US 2003/01255540; 2002년 10월 31일 공개된 US 2002/0160446; 2002년 4월 25일 공개된 US 2002/0048785; 2002년 2월 등록된 US 6,342,369; 2003년 7월 27일 등록된 US 6,569,642; 2000년 6월 6일 등록된 US 6,072,047, 2003년 11월 4일 등록된 US 6,642,358; 2004년 6월 1일 등록된 US 6,743,625 참조). DR4처럼, DR5는 그의 세포외 부분 내의 3개의 시스테인-풍부 도메인 단일 세포질 사멸 도메인을 포함하고 리간드 결합 시에 (또는 리간드의 활성을 모방하는 작용제 항체와 같은 분자에 결합시에) 세포자멸의 신호를 전달할 수 있는 것으로 보고되었다. Apo-2L/TRAIL과 DR5 사이에 형성된 복합체의 결정 구조는 문헌에 기재되어 있다 [Hymowitz et al., Molecular Cell. 4:563-571 (1999)].
리간드 결합시, DR4 및 DR5는 모두 FADD/Mort1로 언급되는 사멸-도메인 함유 어댑터 분자를 통해 세포자멸 개시제인 카스파제-8을 동원하여 활성화시킴으로써 세포자멸을 독립적으로 촉발할 수 있다 [Kischkel et al., Immunity. 12:611-620 (2000); Sprick et al., Immunity, 12:599-609 (2000); Bodmer et al., Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)]. 특히, DR5는 p53 종양 서프레서 유전자와 무관한 "세포 외부 (cell-extrinsic)" 경로를 통해 세포자멸 신호를 전달한다 (Ashkenazi and Dixit, Science 281:1305-8 (1998); Ashkenazi, Nat Rev Cancer 2:420-30 (2002)). 상기 경로의 활성화는 활성화된 수용체의 세포질 사멸 도메인에서 사멸-유도 신호전달 복합체 (DISC)의 신속한 형성을 수반한다. 먼저, 어댑터 분자 FADD가 동종친화성 사멸 도메인 상호작용을 통해 DR5에 결합한다 (Kischkel et al., 상기 문헌, Sprick et al., 상기 문헌, Bodmer et al., 상기 문헌). 이어서, FADD는 세포자멸을 개시하는 프로테아제 카스파제-8 및 카스파제-10을 동원하고, 유도된 근접성에 의해 이들의 활성화를 매개한다. 카스파제-9 및 카스파제-10은 자가 프로세싱을 거치고, 가용형 활성 카스파제 서브유닛을 세포질 내로 방출하고, 여기서 서브유닛이 효과기 카스파제, 예를 들어 카스파제-3 및 카스파제-7를 모으고 절단한다. 상기 절단에 의해 세포자멸 프로그램을 수행하는 효과기 카스파제가 활성화된다 (Thornberry and Lazebnik,. Science 281:1312-6 (1998)).
Apo2L/TRAIL은 또한 신호전달시의 전달자보다는 억제제로서 기능하는 것으로 생각되는, DcR1, DcR2 및 OPG로서 언급되는 수용체에 결합하는 것으로 보고되었다 (예를 들어, DCR1 (TRID, LIT 또는 TRAIL-R3로도 칭함) [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science. 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al., FEBS Letters. 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); 및 Mongkolsapaya et al., J. Immunol. 160:3-6 (1998); DCR2 (또한 TRUNDD 또는 TRAIL-R4로도 불림) [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters. 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)], 및 OPG [Simonet et al., 상기 문헌] 참조). DR4 및 DR5와 대조적으로, DcR1 및 DcR2 수용체는 세포자멸 신호를 전달하지 않는다.
DR4 및/또는 DR5 수용체에 결합하는 특정 항체가 문헌에 보고되었다. 예를 들어, DR4 수용체에 대해 작용하고 특정 포유동물 세포에서 작용제 또는 세포자멸 활성을 갖는 항-DR4 항체가 예를 들어 1999년 7월 29일 공개된 WO 99/37684; 2000년 7월 12일 공개된 WO 00/73349; 2003년 8월 14일 공개된 WO 03/066661에 기재되어 있다 (또한, 예를 들어 Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Chuntharapai et al., J. Immunol., 166:4891-4898 (2001); 2002년 12월 2일 공개된 WO 02/097033; 2003년 85 22일 공개된 WO 03/042367; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/038043; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/037913 참조). 특정 항-DR5 항체도 문헌에 기재된 바 있다 [예를 들어 1998년 11월 8일 공개된 WO 98/51793; Griffith et al., J. Immunol., 162:2597-2605 (1999); Ichikawa et al., Nature Med., 7:954-960 (2001); Hylander et al., "An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice", Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/038043; 2003년 5월 8일 공개된 WO 03/037913 참조]. 또한, DR4 및 DR5 수용체 모두에 대한 교차반응성을 갖는 특정 항체가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어 2001년 6월 26일 등록된 미국 특허 6,252,050 참조).
<발명의 개요>
본 발명은 인간 DR5에 특이적으로 결합할 수 있고(있거나) DR5 및/또는 그의 리간드(들)과 관련된 생물학적 활성, 특히 세포자멸을 조절할 수 있어 암 또는 면역 관련 질병을 포함하여 다양한 질병 및 병태의 치료에 유용한 DR5 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 전장 항체 16E2의 중쇄 및/또는 경쇄 (각각 서열 11 및 서열 13)에 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편에 관한 것이고, 상기 항체, 또는 항체 단편은 항체 16E2와 비교시에 DR5에 대한 적어도 동일한 친화도 및/또는 적어도 동일한 생물학적 활성 및/또는 효능을 보인다. 특정 실시태양에서, 항체 또는 항체 단편은 필수적으로 전장 항체 16E2와 동일한 에피토프에 결합할 것이다. 다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 전장 항체 16E2보다 DR5에 대한 더 큰 친화도 및/또는 전장 항체 16E2에 비해 증가된 생물학적 활성 및/또는 증가된 효능을 보일 것이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 항-DR5 항체 및 항체 단편은 WO 98/51793에 기재된 단일쇄 Fc 항-DR5 항체 16E2와 비교시에 DR5에 대한 적어도 동일한 친화도 및/또는 적어도 동일한 생물학적 활성 및/또는 효능 을 보인다.
한 실시태양에서, 항-DR5 항체는 임의의 표 1 내지 표 7 및 표 9 내지 표 12에 나열된 1종 이상의 치환을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 단편을 포함한다.
다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 16E2 항체 중쇄 가변 도메인의 프레임워크에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Q6E, V11L, E12V, R13Q 및 K105Q로 이루어진 군에서 선택되는 프레임워크 돌연변이를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항-DR5 항체는 모든 프레임워크 돌연변이 Q6E, V11L, E12V, R13Q 및 K105Q를 포함한다.
또다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 전장 항체 16E2의 중쇄 (서열 11) 또는 그의 단편에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
상이한 실시태양에서, 항-DR5 항체는 서열 11의 아미노산 서열 또는 그의 단편에 T28A, G33A, M34L, M34A, M34I, M34S, N53Q, N53Y 및 L102Y로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 서열 11의 아미노산 서열 또는 그의 단편에 돌연변이 G99A 및 R1OOA 중 1개 이상을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 항-DR5 항체는 서열 11의 아미노산 서열 또는 그의 단편에 (i) N53Q, L102Y; (ii) M34L, N53Q, L102Y; (iii) N53Y, L102Y; (iv) M34L, N53Y, L102Y; (v) G33A, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L102Y; (vii) G33A, N53Q, L102Y; (viii) G33A, N53Y, L102Y; (ix) T28A, N53Q, L102Y; 및 (x) T28A, N53Y, L102Y로 이루어진 군에서 선택되는 돌연변이 세트를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항-DR5 항체는 전장 16E2 항체의 경쇄 (서열 13) 또는 그의 단편에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 실시태양에서, 경쇄는 람다 쇄이다.
다른 특정 실시태양에서, 경쇄 돌연변이는 CDR L1에 존재한다.
추가의 실시태양에서, 경쇄 돌연변이는 서열 13의 아미노산 서열 내의 Q24A, Q24S, G25A, D26E, S27A, L28A, R29A, S30A, Y31A, Y31K, Y32H, A33G, S34A 및 S34Y로 이루어진 군에서 선택된다.
추가의 실시태양에서, 경쇄 돌연변이는 서열 13의 아미노산 서열 내의 (i) Q24S, D26E, Y31K, S34Y; 및 (ii) D26E, Y31K로 이루어진 군에서 선택된다.
상이한 실시태양에서, 경쇄 돌연변이는 CDR L2에 존재한다.
따라서, 예를 들어 돌연변이는 서열 13의 아미노산 서열 내의 G50A, G50K, G50S, K51D, N52A, N52S, N52L, N52Q, N53A, N53E, N53Q, N53S, P55A 및 S56A로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
다른 실시태양에서, 항체는 서열 13의 아미노산 서열에 (i) G50K, K52S, N53E; (ii) G50S, K51D, N52S, N53E; (ii) N52S, N53E; 및 (iv) N52Q, N53S로 이루어진 군에서 선택되는 돌연변이 세트를 포함할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 경쇄 돌연변이는 CDR L3에 존재한다.
또다른 실시태양에서, 항체는 서열 13에 N89A, N89L, N89Q, R91A, S93A, N95aA, N95aT, N95aQ, H95bA, N95bY, V96A, V97A로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상의 돌연변이를 포함한다.
별법으로, 항-DR5 항체는 서열 13의 서열에 (i) N89L, R91A, N95aT, H95bY; 및 (ii) N95aT, H95bY로 이루어진 군에서 선택되는 돌연변이 세트를 포함한다.
추가의 실시태양에서, 항-DR5 항체는 서열 13의 아미노산 서열에 (i) Q24S, G50K, K51D, H95bY; (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y; 및 (iii) Q24S, K51A, R91A로 이루어진 군에서 선택되는 경쇄 돌연변이 세트를 포함하고, 서열 11의 아미노산 서열에 (ii) M34L, N53Q, L102Y; (ii) M34L, N53Y, L102Y; (iii) G33A, N53Q, L102Y; (iv) G33A, N53Y, L102Y; (v) M34L, N53Q, L102Y; (vi) M34L, N53Y, L103Y; (vii) G33A, N53Q, L102Y; (viii) G33A, N53Y, L102Y; 및 (ix) T28A, N53Q, L102Y로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 돌연변이 세트 및 임의로 표 5에 나열된 프레임워크 돌연변이 세트를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 항-DR5 항체는 서열 11의 서열에 G33A, N53Q, L102Y 및 서열 13의 서열에 Q24S, K51A, R91A의 돌연변이를 포함하고, 예를 들어 서열 11의 잔기 6, 11, 12, 13 및 105 중 1개 이상일 수 있는 1개 이상의 프레임워크 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Apomab 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 및 9.3으로 이루어진 군에서 선택된다.
특정 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Apomab 5.2, 5.3, 6.2, 6.3, 7.2, 7.3, 8.3 및 25.3으로 이루어진 군에서 선택된다.
또다른 특정 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Apomab 7.3 또는 Apomab 8.3, 특히 Apomab 7.3이다.
추가의 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디 (diabody), 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 항체로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 항체 단편이다.
다른 실시태양에서, 항체는 단일쇄 항체일 수 있다.
항-DR5 항체는 예를 들어 항암 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 항체는 암 세포에서 세포자멸을 활성화시키거나 자극하는 능력을 가질 수 있다.
암은 예를 들어 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다.
암의 보다 구체적인 예는 편평세포암, 소세포 (small-cell) 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 비-호지킨 림프종, 모세포종, 위장암, 신암, 난소암, 간암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 직장암, 결장직장암, 췌장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종 및 두부경부암을 포함한다.
특정 군의 암은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐 암종 - NSCLC); 또는 예를 들어 결장직장, 췌장, 또는 전이성 선암종일 수 있는 선암종을 포함한다. 혈액암도 포함된다.
항체-의존성 세포 매개 세포독성 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC)을 매개하는 항체인 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체는 본 발명의 범위에 포함된다.
바람직한 실시태양에서, 항-DR5 항체는 Apomab 7.3, 또는 Apomab 8.3 또는 그의 단편을 포함한다.
항체는 이량체 형태 및/또는 예를 들어 항-인간 IgG Fc 영역과 가교결합된 형태일 수 있다.
다른 실시태양에서, 본원에서 항-DR5 항체는 에피토프 태그 서열에 융합된다.
다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 면역글로불린 서열, 예를 들어 항-인간 IgG Fc 영역을 포함할 수 있는 이종 아미노산 서열에 융합된 본 발명의 항-DR5 항체 또는 항체 단편을 포함하는 키메라 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-DR5 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포, 및 본 발명의 항체 및 항체 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 본원에서 정의된 항-DR5 항체, 및 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
담체는 제약상 허용되는 담체일 수 있고, 조성물은 추가의 항암제, 및/또는 추가의 항-DR5 항체를 추가로 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 포유동물 암 세포를 상기 본원에서 정의된 항-DR5 항체에 노출시키는 것을 포함하는, 세포자멸 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 포유동물 대상체에게 상기 정의된 유효량의 항-DR5 항체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.
모든 측면에서, 대상체는 인간 환자일 수 있고, 암은 상기 나열된 암을 포함하여 임의의 암일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 용기, 및 상기 용기 내에 포함된, 본 발명의 항-DR5 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 제조품에 관한 것이다. 제조품은 항-DR5 항체를 시험관내 또는 생체내 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 지침서는 암의 치료에 관한 것이다.
도 1은 인간 Apo-2 리간드 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 2) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 1)을 보여준다. 뉴클레오티드 위치 447의 "N" (서열 2에서)은 뉴클레오티드 염기가 "T" 또는 "G"일 수 있음을 나타내기 위해 사용된다.
도 2A-2C는 전장 인간 DR4 수용체에 대한 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 4) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (서열 3)을 보여준다. 인간 DR4 수용체에 대한 각각의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 또한 문헌 [Pan et al., Science, 276:111 (1997)]에도 보고된 바 있다.
도 3A-3C는 1998년 11월 19일 WO 98/51793에서 공개된 인간 DR5 수용체의 411개 아미노산 서열 (서열 5), 및 코딩 뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 보여준다.
도 4A-4C는 1998년 8월 20일 WO 98/35986에서 공개된 인간 DR5의 440개의 아미노산 서열 (서열 7) 및 코딩 뉴클레오티드 서열 (서열 8)을 보여준다.
도 5는 단일쇄 항-DR5 항체 16E2 (16E2 scFv)의 뉴클레오티드 서열 (서열 9)을 보여준다.
도 6은 단일쇄 항-DR5 항체 16E2 (16E2 scFv)의 아미노산 서열 (서열 10)을 보여주고, 시그날 서열 및 중쇄 및 경쇄 CDR이 도시되어 있다.
도 7은 전장 16E2 항체 중쇄의 아미노산 서열 (서열 11)을 보여준다.
도 8은 전장 16E2 항체 중쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 12)을 보여준다.
도 9는 전장 16E2 항체 경쇄의 아미노산 서열 (서열 13)을 보여준다.
도 10은 전장 6E2 항체 경쇄의 뉴클레오티드 서열 (서열 14)을 보여준다.
도 11A 및 B는 면역글로불린 경쇄의 발현을 위한 플라스미드 pDR1의 서열 (서열 15, 5391 bp)을 보여준다. pDR1은 관련없는 항체인 인간화 항-CD3 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, 그에 대한 출발 및 정지 코돈을 진하게 밑줄로 표시하였다 (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217- 225 (1992)).
도 12A 및 B는 면역글로불린 중쇄의 발현을 위한 플라스미드 pDR2의 서열 (서열 16)을 보여준다. pDR2는 관련없는 항체인 인간화 항-CD3 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하고, 그에 대한 출발 및 정지 코돈을 진하게 밑줄로 표시하였다 (Shalaby et al., 상기 문헌).
도 13은 Apomab 7.3 중쇄 뉴클레오티드 서열 (서열 17)을 보여준다.
도 14는 Apomab 7.3 중쇄 아미노산 서열 (서열 18)을 보여준다.
도 15는 Apomab 7.3 경쇄 뉴클레오티드 서열 (서열 19)을 보여준다.
도 16는 Apomab 7.3 경쇄 아미노산 서열 (서열 20)을 보여준다.
도 17A 및 B는 16E2 및 Apomab 7.3 중쇄의 배열을 보여준다.
도 18은 16E2 및 Apomab 7.3 경쇄의 배열을 보여준다.
도 19는 항-DR5 항체 중쇄에 대한 상동성 모델이다.
도 20은 항-DR5 항체 경쇄에 대한 상동성 모델이다.
도 21은 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 전장 16E2 (버젼 1) 항체에 비해 Apomab 5.3, 6.3 및 8.3의 단일 복강내 (IP) 투여량의 항암 활성을 보여준다.
도 22는 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 전장 16E2 (버젼 1) 항체에 비해 Apomab 5.2, 6.2, 5.3, 7.2 및 7.3의 단일 IP 투여량의 항암 활성을 보여준다.
도 23은 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 전장 16E2 (버젼 1) 항체에 비해 Apomab 5.2, 7.3 및 8.3의 단일 IP 투여량의 항암 활성을 보여준다.
도 24는 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 Apomab 7.3에 비해 Apomab 23.3 및 25.3의 항암 활성을 보여준다.
도 25는 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 안정한 세포주 대 일시적 세포주로부터 유도된 Apomab 7.3의 항암 활성을 보여준다
도 26은 폐암의 HCT15 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 CPT-11과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 27은 인간 육종의 LS 180 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 CPT-11과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 28은 비-호지킨 림프종의 BJAB 이종이식 CB17 ICR SCID 마우스 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 RITUXAN(등록상표) (리툭시맙)과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 29는 인간 췌장 선암종의 BxPC3 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 겜시타빈과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 30은 인간 폐암의 H460 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 카르보플라틴 및 탁솔과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 31은 인간 폐암의 H2122 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 단독 및 카르보플라틴 및 탁솔과 조합시의 항암 활성을 보여준다.
도 32는 인간 폐암의 H2122 이종이식 모델에서 Apomab 7.3의 투여량-반응 곡선을 보여준다.
도 33은 인간 결장암의 Colo 205 이종이식 모델에서 Apomab 7.3과 비교하여 Apomab 23.3 및 25.3의 항암 활성을 보여준다.
도 34는 누드 마우스에서 Colo 205 인간 결장 암종 이종이식에 대한 Apo2L.O 단독, Apomab 7.3 단독 및 다양한 조합의 정중 (median) 종양 성장 및 카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 그래프를 보여준다.
도 35 및 36은 무흉선 누드 마우스 이종이식 모델에서 SKMES-1 인간 비-소세포 폐 암종 (NSCLC) 세포에 대한 Apo2L.O 단독, Apomab 7.3 단독 및 다양한 조합의 정중 종양 성장 및 카플란-마이어 그래프를 보여준다.
도 37은 인간 Colo 205 결장 암종 이종이식 모델에서 Apo2L.O 단독, Apomab 7.3 단독 및 다양한 조합의 정중 종양 성장 및 카플란-마이어 그래프를 보여준다.
I. 정의
용어 "Apo-2 리간드", "Apo-2L", "Apo2L", Apo-2 리간드/TRAIL" 및 "TRAIL"은 도 1 (서열 1)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 114-281, 95-281, 잔기 92-281, 잔기 91-281, 잔기 41-281, 잔기 39-281, 잔기 15-281 또는 잔기 1-281 (여기서 잔기는 처음 및 마지막 번호의 잔기를 포함함)를 포함하는 폴리펩티드 서열, 및 상기 서열의 생물학적 활성 단편, 결실, 삽입 및/또는 치환 변이체를 의미하기 위해 상호교환가능하게 본원에 사용된다. 한 실시태양에서, 폴리펩티드 서열은 도 1 (서열 1)의 잔기 114-281을 포함한다. 임의로, 폴리펩티드 서열은 도 1 (서열 1)의 잔기 92-281 또는 잔기 114-281을 포함한다. Apo-2L 폴리펩티드는 도 1 (서열 2)에 도시된 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 임의로, 도 1 (서열 2)의 잔기 Pro119를 코딩하는 코돈은 "CCT" 또는 "CCG"일 수 있다. 임의로, 단편 또는 변이체는 생물학적으로 활성이고, 상기 서열의 임의의 하나와 적어도 약 80％ 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 약 90％ 서열 동일성, 또는 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 서열 동일성을 갖는다. 상기 정의는 1개 이상의 그의 천연 아미노산이 다른 아미노산, 예를 들어 알라닌 잔기로 치환된 Apo-2 리간드의 치환 변이체를 포함한다. 또한, 상기 정의는 Apo-2 리간드 공급원으로부터 단리되거나 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조된 천연 서열 Apo-2 리간드를 포함한다. 본 발명의 Apo-2 리간드는 1997년 1월 16일 공개된 WO97/01633, 1997년 1월 17일 공개된 WO97/25428, 1999년 7월 22일 공개된 WO99/36535, 2001년 1월 4일 공개된 WO 01/00832, 2002년 2월 7일 공개된 WO02/09755, 2000년 12월 14일 공개된 WO 00/75191, 및 2000년 2월 29일 등록된 미국 특허 6,030,945에 개시된 Apo-2 리간드 또는 TRAIL로 언급되는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 일반적으로 폴리펩티드의 단량체, 이량체, 삼량체, 육량체 또는 그 이상의 올리고머 형태를 포함하는 Apo-2 리간드의 형태를 의미하기 위해 사용된다. Apo-2L 서열에서 언급되는 아미노산 잔기의 모든 넘버링은 달리 구체적으로 언급되지 않으면 도 1 (서열 1)에 따른 넘버링을 사용한다.
"Apo-2 리간드 수용체"는 그의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 도 2A-2C (서열 4 및 3) 및 3A-3C (서열 6 및 5)에 나타낸 "DR4" 및 "DR5"로서 당업계에서 언급되는 수용체를 포함한다. 문헌 (Pan et al., Science, 276:111-113 (1997))에 "DR4"로 언급되는 TNF 수용체 패밀리 멤버가 기재되어 있다 (또한, 1998년 7월 30일 공개된 WO98/32856; 1999년 7월 29일 공개된 WO 99/37684; 2000년 12월 7일 공개된 WO 00/73349; 2002년 8월 13일 등록된 US 6,433,147; 2002년 10월 8일 등록된 US 6,461,823, 및 2002년 1월 29일 등록된 US 6,342,383 참조). 문헌 [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997) 및 Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]은 Apo2L/TRAIL에 대한 다른 수용체를 기재하고 있다 (또한, 1998년 11월 19일 공개된 WO98/51793; 1998년 9월 24일 공개된 WO98/41629 참조). 상기 수용체는 DR5로도 언급된다 (수용체는 또한 별법으로 Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, hAPO8, TRICK2 또는 KILLER로도 언급된 바 있다; Screaton et al., Curr. Biol., 7:693-696 (1997); Walczak et al., EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); 1998년 8월 20일 공개된 WO98/35986; 1998년 10월 14일 공개된 EP870,827; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46643; 1999년 1월 21일 공개된 WO99/02653; 1999년 2월 25일 공개된 WO99/09165; 1999년 3월 11일 공개된 WO99/11791; 2002년 8월 13일 공개된 US 2002/0072091; 2001년 12월 7일 공개된 US 2002/0098550; 2001년 12월 6일 등록된 US 6,313,269; 2001년 8월 2일 공개된 US 2001/0010924; 2003년 7월 3일 공개된 US 2003/01255540; 2002년 10월 31일 공개된 US 2002/0160446; 2002년 4월 25일 공개된 US 2002/0048785; 2003년 5월 27일 등록된 US 6,569,642; 2000년 6월 6일 등록된 US 6,072,047; 2003년 11월 4일 등록된 US 6,642,358). 상기한 바와 같이, Apo-2L에 대한 다른 수용체는 DcR1, DcR2 및 OPG를 포함한다 (Sheridan et al., 상기 문헌, Marsters et al., 상기 문헌, 및 Simonet et al., 상기 문헌 참조). 본원에서 사용될 때 용어 "Apo-2L 수용체"는 천연 서열 수용체 및 수용체 변이체를 포함한다. 상기 용어는 인간을 포함하여 다양한 포유동물에서 발현되는 Apo-2L 수용체를 포함한다. Apo-2L 수용체는 다양한 인간 조직 계통에서 자연 발생하는 바와 같이 내인성으로 발현될 수 있거나, 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수 있다. "천연 서열 Apo-2L 수용체"는 자연에서 유도되는 Apo-2L 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 Apo-2L 수용체는 인간을 포함하여 임의의 포유동물의 자연 발생 Apo-2L 수용체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 천연 서열 Apo-2L 수용체는 자연으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 Apo-2L 수용체"는 구체적으로 수용체의 천연 생성 말단 절단 (truncated) 또는 분비 형태 (예를 들어 세포외 도메인 서열을 포함하는 가용성 형태), 천연 생성 변이체 형태 (예를 들어, 교대 스플라이싱된 형태) 및 천연 생성 대립유전자 변이체를 포함한다. 수용체 변이체는 천연 서열 Apo-2L 수용체의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다. 도 3A-3C는 1998년 11월 19일 공개된 WO 98/51793에 제시된 인간 DR5의 411개의 아미노산 서열을 보여준다. 인간 DR5의 전사 스플라이스 변이체는 당업계에 공지되어 있다. 상기 DR5 스플라이스 변이체는 그의 뉴클레오티드 서열 (서열 7 및 8)과 함께 도 4A-4C에 도시된, 1998년 8월 20일에 WO 98/35986에서 공개된 바와 같은 인간 DR5의 440개의 아미노산 서열을 코딩한다.
"치사 수용체 항체"는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 수용체에 대해 작용하고 세포자멸의 신호를 전달할 수 있는 사멸 도메인을 포함하는 항체 또는 항체들을 일반적으로 의미하기 위해 본원에 사용되고, 상기 항체는 DR5 항체 및 DR4 항체를 포함한다.
"DR5 수용체 항체", "DR5 항체", 또는 "항-DR5 항체"는 하나 이상의 형태의 DR5 수용체 또는 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 넓은 의미로 언급하기 위해 사용된다. 임의로, DR5 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 형태의 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 임의로, DR5 항체는 DR5 수용체에 결합하지만, 임의의 추가의 Apo-2L 수용체 (예를 들어 DR4, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR5 신호전달 활성의 작용제이다. 용어 "항-DR5 항체"는 문법상 동등체로서, 표 11 및 12에 나열된 "Apomab" 항체, 예를 들어, Apomab 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1, 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2, 8.2, 9.2, 1.3, 2.2, 3.3, 4.3, 5.3, 6.3, 7.3, 8.3 및 9.3, 바람직하게는 Apomab 7.3을 포함하고 이로 제한되지 않는, 실시예에서 설명되는 항체를 구체적으로 포함한다.
임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도 범위에서 DR5 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR5 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 보인다.
"DR4 수용체 항체", "DR4 항체" 또는 "항-DR4 항체"는 하나 이상의 형태의 DR4 수용체 또는 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 가장 넓은 의미로 언급하기 위해 사용된다. 임의로, DR4 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 형태의 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 임의로, DR4 항체는 DR4 수용체에 결합하지만, 임의의 추가의 Apo-2L 수용체 (예를 들어 DR5, DcR1 또는 DcR2)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 항체는 DR4 신호전달 활성의 작용제이다.
임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.1 nM 내지 약 20 mM의 농도에서 DR4 수용체에 결합한다. 임의로, 본 발명의 DR4 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.6 nM 내지 약 18 mM의 IC50 값을 보인다.
용어 "작용제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관내, 계내 (in situ) 또는 생체내 Apo2L/TRAIL, DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 임의의 분자를 포함한다. Apo2L/TRAIL의 DR4 또는 DR5에 대한 상기 생물학적 활성 결합의 예는 세포자멸 및 문헌에 추가로 보고된 것을 포함한다. 작용제는 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 예를 들어, 작용제는 수용체 활성화 또는 신호 전달을 야기하는 DR4 또는 DR5에 대한 그의 직접 결합의 결과로서, 시험관내, 계내 또는 생체내 DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 기능을 수행한다. 작용제는 또한 예를 들어 DR4 또는 DR5 활성화 또는 신호 전달을 추후 야기하는 다른 효과기 분자의 자극의 결과로서, 시험관내, 계내 또는 생체내 DR4 또는 DR5의 하나 이상의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 전체적으로 향상, 자극 또는 활성화시키는 기능을 간접적으로 수행한다. 작용제가 DR4 또는 DR5 활성화 또는 활성을 향상 또는 증가시키는 기능을 간접적으로 수행하는 인핸서 분자로서 기능할 수 있음도 고려된다. 예를 들어, 작용제는 포유동물에서 내인성 Apo-2L의 활성을 향상시킬 수 있다. 이것은 예를 들어 DR4 또는 DR5의 예비복합체화 또는 DR4 또는 DR5 수용체와 각각의 리간드의 복합체의 안정화 (예를 들어 Apo-2L과 DR4 또는 DR5 사이에 형성된 천연 복합체의 안정화)에 의해 달성될 수 있다.
용어 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 리간드 또는 수용체의 형태를 의미한다. 통상적으로, 가용형 ECD는 1％ 미만의 상기 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 상기 도메인을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "에피토프 태깅된"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 단백질, 예를 들어 Apo-2 리간드 또는 DR5 수용체, 또는 그의 일부 또는 상기 리간드 또는 수용체에 결합하는 항체를 포함하는 키메라 분자를 의미한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 작용할 수 있는 에피토프를 제공하도록 충분한 잔기를 갖지만, 리간드 또는 수용체의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 또한, 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 항체가 다른 에피토프에는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특유하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.
본원에 개시된 다양한 단백질을 설명하기 위해 사용될 때 "단리된"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 일반적으로 단백질의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 단백질은 (1) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 단백질은 Apo-2 리간드의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 (in situ) 단백질을 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 단백질은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 확인된 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후 비교 리간드, 수용체, 또는 항체 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 할당 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있는, 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 그 소스 코드가 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에서 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록된 제넨테크, 인크. (Genentech. Inc.) 소유의 서열 비교 컴퓨터 프로그램 "ALIGN-2"를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 입수가능하다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다. 이어서, 아미노산 서열 동일성 비율은 보다 긴 서열에 대해 계산된다. 따라서, 더 짧은 서열이 보다 긴 서열에 충분히 포함된다 하더라도, 서열 동일성은 100％ 미만일 것이다.
용어 "조절 서열"은 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리올"은 다가 알콜 화합물을 넓게 의미한다. 폴리올은 예를 들어 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체일 수 있고, 직쇄 또는 분지쇄를 가질 수 있다. 바람직한 폴리올은 하나 이상의 히드록실 위치에서 화학기, 예를 들어 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기로 치환된 것을 포함한다. 일반적으로, 폴리올은 폴리(알킬렌 글리콜), 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이다. 그러나, 당업자는 다른 폴리올, 예를 들어, 폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체를 본원에서 설명되는 PEG에 대한 컨쥬게이션 기술을 사용하여 이용될 수 있음을 알 것이다. 폴리올은 당업계에 공지된 것 및 예를 들어 상업적으로 이용가능한 공급처, 예를 들어 Nektar(등록상표) Corporation으로부터 입수가능한 것을 포함한다.
용어 "컨쥬게이트"는 함께 결합 또는 연결되는 것을 의미하기 위해 그의 가장 넓은 정의에 따라 본원에서 사용된다. 분자는 결합된 것처럼 작용 또는 기능할 때 "컨쥬게이팅된" 것이다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 경험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 동일성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격성 조건" 또는 "고엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도의 사용; 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안 변성제, 예를 들어 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/O.1％ 폴리비닐피롤리돈/5O mM 인산나트륨 버퍼 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃)의 사용; 또는 (3) 42℃의 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃의 50％ 포름아미드를 사용한 세척, 이어서 55℃의 EDTA 함유 0.1 x SSC로 구성된 고엄격성 세척과 함께 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M/시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트 (42℃)의 사용으로 확인된다.
"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 상기한 것보다 덜 엄격한 혼성화 조건 (예를 들어 온도, 이온 강도 및 ％SDS) 및 세척 용액의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 조건의 예는 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 약 37-50℃의 1 x SSC를 사용한 필터의 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 생성 L-알파-아미노산을 의미한다. 상기 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 의미를 갖는다. 아미노산은 단문자 또는 3문자 명명법으로 확인된다.
Asp D 아스파르트산 Ile I 이소류신
Thr T 트레오닌 Leu L 류신
Ser S 세린 Tyr Y 티로신
GIu E 글루탐산 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 His H 히스티딘
Gly G 글리신 Lys K 라이신
Ala A 알라닌 Arg R 아르기닌
Cys C 시스테인 Trp W 트립토판
Val V 발린 Gln Q 글루타민
Met M 메티오닌 Asn N 아스파라긴
도면에서, 특정 다른 단문자 또는 3문자 명명법을 사용하여 서열 내의 제시된 위치에서 2 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 언급 및 확인할 수 있다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 단일 항-DR5 모노클로날 항체 (작용제, 길항제, 및 중화 또는 차단 항체 포함) 및 다중에피토프 특이성을 갖는 항-DR5 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 사용되는 "항체"는 무손상 면역글로불린 또는 항체 분자, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (즉, 2종 이상의 무손상 항체로부터 형성된 이중특이적 항체) 및 본원에 설명된 요구되는 임의의 작용제 또는 길항제 특성을 보이는 면역글로불린 단편 (예를 들어 Fab, F(ab')2, 또는 Fv)을 포함한다.
항체는 일반적으로 특이적인 항원에 대한 결합 특이성을 보이는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 천연 항체는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 이종사량체 당단백질이다. 일반적으로, 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄에서 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다 [Chothia et al., J. Mol. Biol., 186:651-663 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:4592-4596 (1985)]. 임의의 척추동물종의 항체의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류의 하나로 분류될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4, IgA-1 및 IgA-2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부, 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 내의 서열에서 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용됨을 설명하기 위해 사용된다. 그러나, 가변성은 대체로 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 이것은 일반적으로 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 보존도가 큰 부분은 프레임워크 영역 (FR)으로 언급된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 쇄 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987) 참조]. 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존성 세포독성에서 항체의 참여를 보인다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 자연 발생 변이체를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 특이성이 높고, 단일 항원 부위에 대해 작용한다. 또한, 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다.
본원에서 모노클로날 항체는 요구되는 생물학적 활성 또는 특성을 보이는 한, 항-DR5 항체의 가변 (초가변 포함) 도메인을 불변 도메인 (예를 들어 "인간화" 항체)과, 또는 경쇄를 중쇄와, 또는 한 종으로부터의 쇄을 다른 종으로부터의 쇄와 스플라이싱에 의해, 또는 기원하는 종 또는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스 명칭에 무관하게 이종 단백질과의 융합에 의해 생산된 키메라 항체, 하이브리드 항체 및 재조합 항체, 및 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, 및 Fv)을 포함한다 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 Mage et al., in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Defcker, Inc.: New York, 1987) 참조).
따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
비인간 (예, 쥐) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능을 보다 개선하고 항체 성능을 최적화하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 1개 이상, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc), 일반적으로 일부의 인간 면역글로불린을 포함할 것이다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고(되거나) 당업계에 공지되거나 본원에 개시되는 임의의 인간 항체 제조 기술을 사용하여 제조된 항체에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 상기 인간 항체의 정의는 1종 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 1종 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어 쥐 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산할 수 있다. 한 실시태양에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다 (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996): Sheets et al., PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 또한, 인간 항체는 인간 면역글로불린 로커스를 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 (transgenic) 동물, 예를 들어 마우스 내로 도입함으로써 생성시킬 수 있다. 시험 접종 시에, 인간 항체 생산이 관찰되고, 이것은 유전자 재배열, 회합 및 항체 레파토리를 포함하여 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 상기 방법은 문헌에 기재되어 있다 [예를 들어 미국 특허 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature. 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature. 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology. 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)]. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 작용하는 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불사 처리를 통해 제조할 수 있다 (상기 B 림프구는 개체로부터 회수할 수 있거나 시험관내 면역화시킬 수 있다) [예를 들어, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (l):86-95 (1991); 및 미국 특허 5,750,373 참조].
용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하기 위해 사용되고, 이는 무손상 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있다. Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대체로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 Fc 영역의 카르복실-말단에 걸치는 것으로 규정된다 (문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따른 넘버링 시스템을 본원에서 사용함). 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다.
본원에서 "Fc 영역 쇄"는 Fc 영역의 2개의 폴리펩티드 쇄 중의 하나를 의미한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인으로도 칭함)은 대체로 위치 231의 아미노산 잔기로부터 대체로 위치 340의 아미노산 잔기까지 연장된다. CH2 도메인은 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 특유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄이 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 삽입된다. 탄수화물은 도메인-도메인 페어링을 위한 대용물을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추정된다 [Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)]. 본원에서 CH2 도메인은 천연 서열 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다.
"CH3 도메인"은 Fc 영역의 CH2 도메인의 C-말단 잔기의 스트레치 (즉, IgG의 대략 위치 341의 아미노산 잔기로부터 대략 위치 447의 아미노산 잔기까지)를 포함한다. 본원에서 CH3 영역은 천연 서열 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인 (예를 들어 그의 한 쇄에 도입된 "융기부 (protroberance)"를, 그의 다른 쇄에 대응하는 도입된 "공동 (cavity)"을 갖는 CH3 도메인; 미국 특허 5,821,333 참조)일 수 있다. 상기 변이체 CH3 도메인은 본원에서 설명되는 다중특이적 (예를 들어 이중특이적) 항체의 제조에 사용될 수 있다.
"힌지 영역"은 인간 IgG1의 약 Glu216, 또는 약 Cys226으로부터 약 Pro230까지 이어지는 것으로서 일반적으로 규정된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 제1 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬시킬 수 있다. 본원에서 힌지 영역은 천연 서열 힌지 영역 또는 변이체 힌지 영역일 수 있다. 변이체 힌지 영역의 두개의 폴리펩티드 쇄는 일반적으로 폴리펩티드 쇄 당 1개 이상의 시스테인 잔기를 보유하여 변이체 힌지 영역의 두개의 폴리펩티드 쇄는 두 쇄 사이에 디술피드 결합을 형성할 수 있다. 본원에서 바람직한 힌지 영역은 천연 서열 인간 힌지 영역, 예를 들어 천연 서열 인간 IgG1 힌지 영역이다.
"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 "효과기 기능"을 보유한다. 예시적인 "효과기 기능은" C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 상기 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하고, 상기 항체 효과기 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 분석을 사용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역에 비해 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 비해 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역에 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80％ 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90％ 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 약 95％ 서열 동일성을 갖는다.
"항체-의존성 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적인 세포독성 세포 (예를 들어 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합 항체를 인식한 후, 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하고, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)]의 464 페이지 표 3에 요약되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석에 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 별법으로, 또는 추가로, 목적하는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 효과기 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγRIII을 발현하고 ADCC 효과기 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고, PBMC 및 NK 세포가 바람직하다. 효과기 세포는 본원에서 설명되는 바와 같이 그의 천연 공급원, 예를 들어 혈액 또는 PBMC로부터 단리될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 교대 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997) 참고). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR가 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원과 복합체화된 분자 (예를 들어 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.
"친화도 성숙" 항체는 변형(들)을 갖지 않는 모 항체에 비교할 때 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 그의 하나 이상의 CDR에 하나 이상의 변형을 갖는 항체이다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 과정으로 제조된다. 문헌 [Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783 참조]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 설명하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이는 예를 들어 문헌 [Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene. 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); 및 Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)]에 기재되어 있다.
"항체의 면역특이적 결합"에 사용되는 용어 "면역특이적"은 예를 들어 항체의 항원 결합 부위와 항체에 의해 인식되는 특이적 항원 사이에 발생하는 항원 특이적 결합 상호작용을 의미한다.
본원의 목적을 위해, "생물학적 활성" 및 "요구되는 생물학적 활성"은 예를 들어 1종 이상의 포유동물 세포에서의 생체내 또는 생체외 세포자멸 (작용 또는 자극 방식으로 또는 길항 또는 차단 방식으로), Apo-2 리간드 (TRAIL)에 대한 결합 또는 세포내 신호전달 경로의 하나 이상의 분자, 예를 들어 카스파제 3, 카스파제 8, 카스파제 10 또는 FADD의 활성화 조절을 포함하여 DR5 활성 또는 DR5 활성화를 조절하는 능력을 갖는다는 것을 의미한다. 상기 세포내 분자의 활성화를 결정하는 분석은 당업계에 공지되어 있다 [예를 들어, Boldin et al., J. Biol. Chem., 270:7795-7798 (1995); Peter, Cell Death Differ., 7:759-760 (2000); Nagata, Cell, 88:355-365 (1998); Ashkenazi et al., Science, 281:1305-1308 (1999) 참조].
본원에서 사용되는 용어 "작용제" 및 "작용성"은 DR5의 생물학적 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로, 실질적으로 유도, 촉진 또는 향상시킬 수 있는 분자를 의미하거나 설명한다. 임의로, "작용제 DR5 항체"는 Apo-2 리간드 (TRAIL)로도 알려진 DR5에 대한 리간드에 동등한 활성을 갖거나, DR5 수용체를 활성화시켜 카스파제 3, 카스파제 8, 카스파제 10 또는 FADD의 활성화를 포함할 수 있는 하나 이상의 세포내 신호전달 경로의 활성화를 야기할 수 있는 항체이다.
본원에서 사용되는 용어 "길항제" 및 "길항성"은 DR5의 생물학적 활성 또는 활성화를 직접 또는 간접적으로, 실질적으로 중화, 감소 또는 억제할 수 있는 분자를 의미하거나 설명한다. 임의로, 길항제는 DR5 활성화 또는 DR5와 그의 리간드, 예를 들어 Apo-2 리간드 사이의 복합체의 형성에 기인하는 생물학적 활성을 중화시키는 분자이다.
용어 "세포자멸" 및 "세포자멸 활성"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 사멸을 의미한다. 상기 활성은 예를 들어 그 모두가 당업계에 공지된 세포 생존성 분석, 애넥신 V 결합 분석, PARP 분석, FACS 분석 또는 DNA 전기영동에 의해 결정 및 측정될 수 있다. 임의로, 세포자멸 활성은 애넥신 V 또는 PARP 분석에 의해 결정될 것이다.
용어 "암", "암성" 및 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 예를 들어 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 신경아교종, 육종, 골수종 (예를 들어 다발 골수종) 및 백혈병을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 위장암, 호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 신경아교종, 난소암, 간암, 예를 들어 간 암종 및 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 예를 들어 신장 세포 암종 및 윌름즈 (Wilms) 종양, 기초 세포 암종, 흑색종, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 고환암, 식도암, 및 다양한 종류의 두부경부암을 포함한다.
용어 "면역 관련 질병"은 포유동물의 면역계의 성분이 포유동물의 이환을 야기하거나, 매개하거나 또는 다른 방식으로 작용하는 질병을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 개입이 질병의 진행에 대한 개선 효과를 갖는 질병이 포함된다. 상기 용어에는, 자가면역 질병, 면역 매개 염증 질환, 비면역 매개 염증 질환, 감염성 질병, 및 면역결핍 질병이 포함된다. 그 일부가 면역 또는 T 세포 매개성인, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 면역 관련 및 염증 질환의 예는 전신 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 소아 만성 관절염, 척추관절병증, 전신 경화증 (피부경화증), 특발성 염증성 근육병증 (피부근육염, 다발근육염), 쇼그렌 증후군, 전신 혈관염, 유육종증, 자가면역 용혈 빈혈 (면역 범혈구감소증, 발작성 야간혈색소뇨증), 자가면역 저혈소판증 (특발성 혈소판 감소 자색반, 면역-매개 저혈소판증), 갑상선염 (그레이브스병, 하시모또 (Hashimoto) 갑상선염, 소아 림프구성 갑상선염, 위축 갑상선염), 당뇨병, 면역 매개 신장병 (사구체신염, 세뇨관 간질성 신장염)), 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환, 예를 들어 다발 경화증, 특발성 탈수초성 다발신경병증 또는 기랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증; 간담즙성 질환, 예를 들어 감염성 간염 (A, B, C, D, E형 간염 및 다른 비간친화성 바이러스), 자가면역 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종 간염, 및 경화성 담관염, 염증성 및 섬유성 폐 질환, 예를 들어 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 대장염 및 크론병); 글루텐 민감 장병증, 및 휘플 (Whipple) 병, 자가면역 또는 면역 매개 피부병, 예를 들어 수포성 피부 질환, 다형홍반 및 접촉성 피부염, 건선; 알레르기 질환, 예를 들어 천식, 알레르기 비염, 아토피성 피부염, 음식 과민증 및 두드러기, 폐의 면역학적 질병, 예를 들어 호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민증 폐렴; 이식 관련 질환, 예를 들어 이식편 거부 및 이식편 대 숙주 질환을 포함한다. 감염성 질병은 AIDS (HIV 감염), A, B, C, D 및 E형 간염, 세균 감염, 진균 감염, 원충 감염 및 기생충 감염을 포함한다.
"자가면역 질병"은 넓은, 일반적인 의미로 정상 또는 건강한 조직의 파괴가 개별 포유동물의 체액성 또는 세포성 면역 반응으로부터 그 자신의 조직 성분까지 발생하는 포유동물의 질환 또는 병태를 의미하기 위해 사용된다. 그 예는 홍반성 루푸스, 갑상선염, 류마티스성 관절염, 건선, 다발 경화증, 자가면역성 당뇨병 및 염증성 장 질환 (IBD)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내 세포 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에) 차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔(등록상표) 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al., (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "전구약물"은 모약물에 비해 암 세포에 대한 세포독성이 작고 효소 활성화되거나 보다 활성의 모형태로 전환될 수 있는, 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 의미한다 (예를 들어, Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 및 Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) 참조). 본 발명의 전구약물은 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 술페이트-함유 전구약물, 펩티드-함유 전구약물, D-아미노산-변형 전구약물, 글리코실화 전구약물, 베타-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세타미드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세타미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기한 화학요법제를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포독성제"는 세포의 기능의 억제 또는 제한 및/또는 세포의 파괴를 야기하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, Il31, Il25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 및 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하고자 한 것이다.
"화학요법제"는 암과 같은 병태의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드 (CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포라미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄포테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도제레신, 카르제레신 및 비제레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 에류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타이인; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레틸아민 옥시드 염산염, 멜파란, 노벤비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 에네디와인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 (1I 및 칼리케아미신 2I1 (예를 들어, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33 : 183-186 (1994) 참조); 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 네오카르지노스타틴 흡광단 (chromophore) 및 관련 크로모단백질 에네디와인 항생제 흡광단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 항-대사산물, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플로스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테치미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표), 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology, 미국 뉴저지주 프린스톤)), 및 독세탁셀 (TAXOTERE(등록상표), 롱-쁘랑 로러 (Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미토미신 C; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 상기 정의에 종양에서 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON); 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 물질의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
용어 "시토킨"은 세포간 매개제로서 다른 세포에 대해 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 관용어이다. 상기 시토킨의 예는 림포킨, 모노킨 및 전통적인 폴리펩티드 호르몬이다. 시토킨에는 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 전구인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 황체 형성 호르몬 (LH); 간 성장인자; 섬유모세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-회합 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-알파; 혈소판-성장인자; 전환 성장인자 (TGF), 예를 들어 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (IL), 예를 들어 IL-1, IL-1알파, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-1O, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-알파 또는 TNF-베타; 및 LIF 및 kit 리간드 (KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 시토킨은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 시토킨의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료" 및 "요법"은 치료 요법, 예방 요법 및 억제 요법을 의미한다.
용어 "치료 유효량"은 포유동물에서 질병 또는 질환의 치료에 효과적인 약물의 양을 의미한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포수의 감소, 종양 크기의 감소, 주변 기관으로의 암 세포 침투의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도의 감소, 바람직하게는 중지); 어느 정도 종양 성장의 억제 및/또는 암과 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감의 효과를 달성할 수 있다. 약물이 성장을 방지하고(하거나) 존재하는 암 세포를 괴사시킬 수 있는 점에서, 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 치료를 위해, 생체내 효능은 예를 들어 종양 부하량 또는 부피, 종양 진행시까지의 시간 (TTP)의 평가 및/또는 반응 속도 (RR)의 결정에 의해 측정할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "포유동물"은 인간, 고등 영장류, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하는, 포유동물로서 분류된 임의의 포유동물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "객관적인 반응"은 고형 종양의 반응 평가 기준 (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST)) (J. Nat. Cancer hist. 92(3):205-216 (2000))을 사용하여 측정한, 대상체의 치료에 대한 완전 또는 부분 반응으로서 정의된다.
용어 "반응 지속 시간"은 초기 완전한 또는 부분 반응으로부터 질병 진행 또는 사멸시까지의 시간을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "무진행 생존"은 치료 제1일로부터 질병 진행 또는 사멸시까지 (어느 상황이 먼저 발생하는지 불문하고)의 시간을 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "완전 소실 (CR)"은 종양 부피가 3회 연속 측정시에 ≤13.5 mm3임을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "부분 소실 (PR)"은 종양 부피가 3회 연속 측정시에 그의 제1일 부피의 ≤50％이고, 상기 측정치의 하나 이상이 ≥13.5 mm3임을 나타내기 위해 사용된다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. DR5 항체
본 발명의 한 실시태양에서, DR5 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적, 및 이종컨쥬게이트 (heteroconjugate) 항체를 포함한다. 상기 항체는 작용제, 길항제 또는 차단 항체일 수 있다.
1. 폴리클로날 항체
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 면역화제 및 필요한 경우 면역보강제의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및/또는 면역보강제는 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에게 주사될 것이다. 면역화제는 DR5 폴리펩티드 (또는 DR5 ECD) 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예는 프로인트 (Freund) 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험을 실시하지 않으면서 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이어서, 포유동물로부터 채혈하여 혈청을 DR5 항체 역가에 대해 분석할 수 있다. 필요한 경우, 포유동물을 항체 역가가 증가하거나 평탄해질 때가지 부스터링할 수 있다.
2. 모노클로날 항체
본 발명의 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Kohler et al., 1975, Nature 256: 495]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제로 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관내 면역화될 수 있다.
면역화제는 일반적으로 DR5 폴리펩티드 (또는 DR5 ECD) 또는 그의 융합 단백질, 예를 들어 DR5 ECD-IgG 융합 단백질을 포함할 것이다. 면역화제는 별법으로 Apo-2L의 DR5에 대한 결합에 참여하는 하나 이상의 아미노산을 갖는 DR5의 단편 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 면역화제는 IgG 서열에 융합된 DR5의 세포외 도메인 서열을 포함한다.
일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구될 경우 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 요구될 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불사 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 불사 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 대체로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 불사 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 불사 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 보다 바람직한 불사 세포는 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 얻을 수 있는 쥐 골수종 라인이다. 상기 쥐 골수종 세포주의 예는 P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL 1580)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
이어서, 하이브리도마 세포를 배양할 수 있는 배양 배지를 DR5에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석에 의해 결정할 수 있다 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)].
요구되는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기 문헌)으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배지는 예를 들어 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수로서 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로즈, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제될 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기 방식으로, 본원의 항-DR5 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.
일반적으로, 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신하거나, 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 DR5에 대한 특이성을 갖는 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
또한, 키메라 또는 하이브리드 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관내 제조할 수도 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
또한, 단일쇄 Fv 단편은 예를 들어 문헌 [Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 다양한 링커를 사용한 상기 단일쇄 단편의 커플링은 문헌 [Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997)]에 기재되어 있다. 항체의 재조합 생산 및 조작을 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로 당업자에 의해 이용되는 상기 기술의 예를 아래에서 보다 상세히 설명한다.
(i) 인간화 항체
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science. 239:1534-1536 (1988)]을 따라 수행할 수 있다.
따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 컨센서스 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
(ii) 인간 항체
인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 및 Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.
면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험접종시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362. 255-258 (1993) 참조] 참조).
문헌 [Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997)])에서는 기술을 보다 개선시켜, 항원으로 시험접종시에 고친화도의 인간 항체를 충분히 생성시키는 "Xenomouse II"로 명명된 트랜스제닉 마우스 라인을 생성시켰다. 이것은 메가베이스의 인간 중쇄 및 경쇄 로커스의 상기한 바와 같은 내인성 JH 세그먼트가 결실된 마우스 내로의 생식세포 통합에 의해 달성되었다. Xenomouse II는 약 66 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 영역 및 3개의 상이한 불변 영역 (μ, δ 및 χ)를 포함하는 1,020 kb의 인간 중쇄 로커스를 보유하고, 또한 32 Vκ 유전자, Jκ 세그먼트 및 Cκ 유전자를 포함하는 800 kb의 인간 κ 로커스를 보유한다. 상기 마우스에서 생산된 항체는 유전자 재배열, 회합 및 항체 레파토리를 포함하여 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 인간 항체는 쥐 로커스에서 유전자 재배열을 방지하는 내인성 JH 세그먼트의 결실에 의해 내인성 항체보다 우선적으로 발현된다.
별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 비면역처리된 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선별을 통해 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역처리된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 비면역처리된 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적시킨다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변이의 일부는 보다 높은 친화도를 부여하고, 고친화도 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포는 후속 항원 시험접종 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. 상기 천연 과정은 "쇄 셔플링"으로 알려진 기술 (Marks et al., Bio/Technol., 1O, 779-783 [1992])을 사용하여 모방할 수 있다. 상기 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 얻은 "1차" 인간 항체의 친화도는 비면역화된 공여자로부터 얻은 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 후속적으로 대체함으로써 개선시킬 수 있다. 상기 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("mother-of-all libraries"로도 알려짐)를 제조하기 위한 한 전략은 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 또한, 유전자 셔플링을 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 설치류-인간 키메라를 생성시킨다. 항원에 대해 선택하여 기능성 항원-결합 부위를 저장할 수 있는 인간 가변 도메인을 단리한다. 즉, 에피토프가 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 과정을 반복할 때, 인간 항체를 얻게 된다 (PCT 특허 출원 1993년 4월 1일 공개된 WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅 (grafting)에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 인간 항체를 제공한다.
아래에서 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 임의로 단량체 항체, 이량체 항체, 및 다가 형태의 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 기술에 의해 본원의 DR5 항체를 사용하여 상기 이량체 또는 다가 형태를 제조할 수 있다. 1가 항체의 제조 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 일반적으로 Fc 영역의 임의의 지점에서 말단 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 결실되어 가교결합을 방지한다.
(iii) 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날의, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성의 하나는 DR5 수용체에 대한 것이고, 다른 결합 특이성은 임의의 다른 항원, 바람직하게는 다른 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다. 예를 들어, DR5 수용체 및 다른 세포자멸/신호전달 수용체에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 본 발명의 범위 내에 포함된다.
이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature, 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 PCT 출원 공개 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한, 보다 바람직한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 2개 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특히 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다. 상기 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 쇄 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 1994년 3월 3일 공개된 PCT 공개 WO 94/04690에 개시되어 있다.
이중특이적 항체를 생성하는 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121, 210 (1986)]을 참조한다.
(iv) 이종컨쥬게이트 항체
또한, 이종컨쥬게이트 항체가 본 발명의 범위에 포함된다. 이종컨쥬게이트 항체는 2개의 공유연결된 항체로 이루어진다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화시키고 (미국 특허 4,676,980), HIV 감염의 치료를 위해 (PCT 출원 공개 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
(v) 항체 단편
특정 실시태양에서, 항-DR5 항체 (쥐, 인간 및 인간화 항체, 및 항체 변이체)는 항체 단편이다. 항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992) 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985) 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 실시태양에서, F(ab')2는 F(ab')2 분자의 회합을 촉진하기 위해 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 다른 방법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술을 당업자는 쉽게 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 파파인을 사용한 소화를 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예는 1994년 12월 22일 공개된 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 기재되어 있다. 항체를 파파인으로 소화하면 일반적으로 단일 항원 결합 부위를 각각 갖는, Fab 단편으로 불리는 두개의 동일한 항원 결합 단편, 및 잔여 Fc 단편이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
항체 소화에서 생성된 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
(vi) 항체의 아미노산 서열 변이체
항-DR5 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-DR5 항체 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변경을 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조된다. 상기 변이체는 예를 들어 본원에서 제시된 항-DR5 항체의 아미노산 서열의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구성체가 요구되는 특성을 갖는다면 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 수행할 수 있다. 또한, 아미노산 변경은 인간화 또는 변이체 항-DR5 항체의 번역후 프로세싱의 변경, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경을 야기할 수 있다.
돌연변이 생성을 위해 바람직한 위치인 항-DR5 항체의 특정 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 발생"으로 불린다. 여기서, 표적 잔기들의 잔기 또는 기가 확인되고 (예, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 대전된 잔기), DR5 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 주도록 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체된다. 이어서, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치는 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위해 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 발생이 표적 코돈 또는 영역에서 수행되고, 발현된 항-DR5 항체 변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝된다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 하나의 잔기 내지 100 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항-DR5 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항-DR5 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소의 항-DR5 항체의 N- 또는 C-말단, 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.
다른 종류의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 항-DR5 항체 분자의 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 대신에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이를 위한 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변이도 포함된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"의 표제 하에 표 I에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명된 또는 아미노산 종류에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.
본래 서열 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg gln
Asp (D) glu; asn glu
Cys (C) ser; ala ser
Gln (Q) asn; glu asn
Glu (E) asp; gln asp
Gly (G) ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르류신 leu
Leu (L) 노르류신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르류신 leu
항체의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 형태로서의 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.
(1) 소수성: 노르뉴신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비보존성 치환은 상기 종류의 하나의 멤버를 다른 종류와 교환하는 것을 수반한다.
인간화 또는 변이체 항-DR5 항체의 적절한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한 분자의 산화적 안정성을 개선시키고 비정상적 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 반대로, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 항체에 첨가될 수 있다 (특히 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우).
특히 바람직한 종류의 치환 변이체는 모 항체 (예를 들어 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성되는 변이체(들)은 이들이 생성되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 특성을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하기 위한 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙이다. 간단히, 몇몇 초가변 영역 부위 (예를 들어 6-7개의 부위)가 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하도록 돌연변이된다. 이렇게 생성된 항체 변이체는 각 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 산물에 대한 융합체로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 양식으로 디스플레이된다. 이어서 파지-디스플레이된 변이체를 본원에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해, 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인하도록 알라닌 스캐닝 돌연변이를 수행할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항체와 인간 DR5 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 상기 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 본원에서 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체의 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝시키고, 하나 이상의 관련 분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
(vii) 항체의 글리코실화 변이체
항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128 [1997]; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 주고 (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]), 당단백질의 일부 사이의 분자내 상호작용은 당단백질의 입체 형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 줄 수 있다 (Hefferis and Lund, 상기 문헌; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 [1996]). 또한, 올리고당은 특이적 인식 구조를 기초로 하여 제시된 당단백질가 특정 분자를 표적화하도록 기능할 수 있다. 예를 들어, 비갈락토실화된 IgG에서, 올리고당 잔기는 CH2 공간 내로부터 '튀어오르고 (flipping)', 말단 N-아세틸글루코사민 잔기가 만노스 결합 단백질에 대한 결합에 이용가능하게 된다 (Malhotra et al., Nature Med. 1:237-243 [1995]). 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 CAMPATH-1H (인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화 쥐 모노클로날 IgG1 항체)로부터 올리고당의 글리코펩티다제에 의한 제거는 보체 매개 용해 (CMCL)의 완전한 감소를 야기하지만 (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]), 뉴라미니다제를 사용한 시알산 잔기의 선택적인 제거는 DMCL의 손실을 전혀 야기하지 않았다. 또한, 항체의 글리코실화는 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 보이는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180 [1999]).
항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변경된 변이체이다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실, 하나 이상의 탄수화물 잔기의 항체에 대한 부가, 글리코실화 조성 (글리코실화 패턴)의 변경, 글리코실화 수준의 변경 등을 의미한다. 글리코실화 변이체는 예를 들어 항체를 코딩하는 핵산 서열에 하나 이상의 글리코실화 부위의 제거, 변경 및/또는 부가를 통해 제조할 수 있다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 효능있는 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌 중의 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 본래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해).
항-DR5 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 상기 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 항-DR5 항체의 초기 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위-지정) 돌연변이 발생, PCR 돌연변이 발생, 및 카세트 돌연변이 발생에 의한 제조를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
또한, 항체의 글리코실화 (글리코실화 패턴)은 근본적인 뉴클레오티드 서열을 변경시키지 않으면서 변경될 수 있다. 글리코실화는 주로 항체 발현에 사용된 숙주 세포에 따라 결정된다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 종류는 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 유의한 변경을 예상할 수 있다 (예를 들어 Hse et at, J. Biol. Chem. 272:9062-9070 [1997] 참조). 숙주 세포의 선택에 추가하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 주는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 방식 등을 포함한다. 올리고당 생산에 관여하는 특정 효소의 도입 또는 과다발현을 포함하여 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경시키기 위해 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 5,047,335; 5,510,261 및 5.278,299). 글리코실화, 또는 특정 종류의 글리코실화는 예를 들어 엔도글리코시다제 H (Endo H)를 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 예를 들어 특정 종류의 다당류의 프로세싱에 결함이 있도록 유전공학적으로 처리될 수 있다. 상기 기술 및 유사한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량분광분석, HPLC, GPC, 단당류 조성 분석, 순차적 효소 소화 및 전하를 기초로 하여 올리고당을 분리하기 위해 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 HPAEC-PAD를 포함하여 종래의 탄수화물 분석 기술에 의해 쉽게 분석할 수 있다. 또한, 분석 목적을 위해 올리고당을 방출하는 방법이 공지되어 있고, 효소 처리 (통상 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행), 주로 O-연결 구조를 방출하기 위해 가혹한 알칼리 환경을 사용한 제거, 및 N- 및 O-연결된 올리고당을 모두 방출하기 위해 무수 히드라진을 사용하는 화학적 방법을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
(viii) 예시적인 항체
본원에 개시된 본 발명은 많은 예시적인 실시태양을 갖는다. 본 발명의 다양한 전형적인 실시태양을 아래에서 설명한다. 다음 실시태양은 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다.
하기 실시예에 설명된 바와 같이, 많은 항-DR5 모노클로날 항체가 확인되었다. 실시태양에서, 본 발명의 DR5 항체는 본원에 구체적으로 개시된 임의의 항-DR5 항체와 동일한 생물학적 특성을 가질 것이다.
용어 "생물학적 특성"은 모노클로날 항체의 생체내 활성 또는 특성, 예를 들어 DR5에 특이적으로 결합하거나 DR5 활성화 (또는 DR5-관련 활성)를 차단, 유도 또는 향상시키는 능력을 의미하기 위해 사용된다. DR5 항체의 특성 및 활성은 아래 실시예에서 보다 설명된다.
임의로, 본 발명의 모노클로날 항체는 항체 16E2 또는 표 11-13에 나열된 임의의 항체와 동일한 생물학적 특성을 갖고(갖거나) 항체 16E2, 또는 표 11-13에 나열된 임의의 항체, 특히 Apomab 7.3 또는 Apomab 8.3과 동일한 에피토프(들)에 결합할 것이다. 이것은 본원에서 및 실시예에서 설명된 바와 같은 다양한 분석을 수행함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체가 본원에서 구체적으로 언급된 DR5 항체와 동일한 특이성을 갖는지를 결정하기 위해, 하기 실시예에서 설명하는 바와 같은 경쟁적 결합 분석 또는 세포자멸 유도 분석에서 그의 활성을 비교할 수 있다. 또한, 특정 항-DR5 항체가 결합하는 에피토프는 DR5와 목적하는 항체 사이의 복합체에 대한 결정학 연구에 의해 결정될 수 있다.
따라서, Apomab 7.3의 Fab 단편과 DR5의 세포외 도메인 간의 복합체에 대한 X선 결정학 연구는 DR5 수용체 상의 Apo2L/TRATL의 결합 부위와 중복되지만 상이한 DR5 에피토프에 Apomab 7.3이 결합함을 보여주었다.
인간 항-DR5 항체, 키메라 항-DR5 항체, 하이브리드 항-DR5 항체 또는 재조합 항-DR5 항체 (및, 예를 들어 본원에 기재된 디아바디 또는 트리아바디)는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편, 상기 경쇄 또는 중쇄의 단량체 또는 이량체, 상기 중쇄 또는 경쇄(들)이 링커 분자에 의해 연결되거나, 또다른 종류의 항체 도메인과 조합된 상기 경쇄 또는 중쇄(들)의 가변 도메인 (또는 초가변 도메인)을 갖는 단일쇄 Fv를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 DR5 항체는 임의로 하나 이상의 요구되는 생물학적 활성 또는 특성을 보유할 것이다. 상기 DR5 항체는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 및 친화도 성숙 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기한 바와 같이, DR5 항체는 상기 요구되는 활성 또는 특성을 달성하기 위해서 다양한 기술을 사용하여 제조되거나 공학처리될 수 있다. 한 실시태양에서, DR5 항체는 적어도 105 M-1, 바람직하게는 적어도 106 M-1 내지 107 M-1, 보다 바람직하게는 적어도 108 M-1 내지 1012 M-1, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 109 M-1 내지 1012 M-1의 DR5 수용체 결합 친화도를 보유할 것이다. DR5 항체의 결합 친화도는 스캐챠드 분석 (Munson et al., 상기 문헌 참조)을 포함하여 당업계에 공지된 기술에 따라 DR5 항체를 시험함으로써 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 DR5 항체는 Apo-2L이 결합하는 DR5 상의 동일한 에피토프에 결합하거나, 예를 들어 Apomab 7.3으로 명명된 항체처럼 Apo-2L이 결합하는 DR5 상의 에피토프와 일치하거나 중복되는 DR5 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 또한, DR5 항체는 상기 방식으로 상호작용하여 DR5에 대한 Apo-2 리간드 결합을 방지하는 입체 형태를 생성시킬 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 DR5 항체의 에피토프 결합 특성은 당업계에 공지된 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, DR5 항체는 DR5 항체가 Apo-2L의 DR5에 대한 결합을 차단하거나 억제하는 능력을 결정하기 위해 시험관내 분석, 예를 들어 경쟁적 억제 분석으로 시험할 수 있다. 임의로, DR5 항체는 Apo-2L 폴리펩티드의 DR5-IgG 구성체에 대한 또는 DR5를 발현하는 세포에 대한 결합을 억제하는 DR5 항체의 능력을 결정하기 위해 경쟁적 억제 분석으로 시험할 수 있다. 임의로, DR5 항체는 Apo-2L의 DR5에 대한 결합을 적어도 50％, 바람직하게는 적어도 75％, 보다 바람직하게는 적어도 90％ 차단 또는 억제할 수 있을 것이고, 이는 예를 들어 가용형 형태의 Apo-2 리간드 (TRAIL) (예를 들어 문헌 [Pitti et al., J. Biol. Chem., 상기 문헌]에 기재된 114-281 세포외 도메인 서열, Apo2L.O으로도 칭함) 및 DR5 ECD-IgG를 사용한 시험관내 경쟁적 억제 분석으로 결정될 수 있다. 또한, DR5 항체의 에피토프 결합 특성은 DR5 항체의 Apo-2L 유도 세포자멸을 차단하는 능력을 시험하기 위한 시험관내 분석, 또는 결정학 연구에 의해 결정될 수 있다.
추가의 실시태양에서, DR5 항체는 Apo-2 리간드 (TRAIL)에 견줄 수 있는 활성을 갖는 작용제 항체를 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 작용제 DR5 항체는 1종 이상의 암 또는 종양 세포주 또는 원발 종양에서 세포자멸을 유도할 것이다. 작용제 DR5 항체의 세포자멸 활성은 공지의 시험관내 또는 생체내 분석을 사용하여 결정할 수 있다. 다양한 상기 시험관내 및 생체내 분석은 당업계에 공지되어 있다. 시험관내에서, 세포자멸 활성은 공지의 기술, 예를 들어 애넥신 V 결합을 사용하여 결정할 수 있다. 생체내에서, 세포자멸 활성은 예를 들어 종양 부하량 또는 부피의 감소를 측정함으로써 결정할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본원에 개시된 항체는 특정 생리학적 상호작용 및/또는 과정을 조절하는 능력을 포함하여 많은 특성을 갖는다. 하기 실시예에서 제시되는 바와 같이, 본원에 개시된 항체는 DR5 매개 세포자멸을 유도할 수 있고, 다양한 쥐 이종이식 암 모델에서 효능있는 항-종양 특성을 보인다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 항체의 작용제 활성은 항체를 항-인간 IgG Fc와 가교결합시켜 향상된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 향상된 세포자멸은 Apo-2L의 세포자멸 활성에 필적한 것이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 비단백질성 중합체에 연결된 본원에 개시된 항-DR5 수용체 항체를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본원에 개시된 항-DR5 수용체 항체는 세포독성제 또는 효소에 연결된다. 또다른 실시태양에서, 본원에 개시된 항-DR5 수용체 항체는 방사성 동위원소, 형광 화합물 또는 화학발광 화합물에 연결된다. 임의로, 본원에 개시된 항-DR5 수용체 항체는 글리코실화되거나 비글리코실화된다.
아래에서 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 생리학적 과정을 조절하는 다양한 방법에 사용될 수 있다. 상기 본 발명의 한 실시태양은 도 3A-3C (411개의 아미노산) 또는 도 4A-4C (440개의 아미노산)에 도시된 DR5 수용체, 특히 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 포함하는, 단리된 항-DR5 수용체 모노클로날 항체의 치료 유효량에 DR5 수용체를 발현하는 포유동물 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법을 포함한다. 상기 방법에서, 포유동물 세포는 일반적으로 암 세포가다. 바람직한 실시태양에서, 상기 방법에 사용되는 항-DR5 수용체 항체는 하기 실시예에서 설명되는 Apomab 항체, 예를 들어 Apomab 7.3 또는 Apomab 8.3 항체이다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 상기 본원에서 정의된 DR5 수용체 또는 그의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 포함하는, 단리된 항-DR5 수용체 모노클로날 항체의 치료 유효량에 DR5 수용체를 발현하는 포유동물 세포를 노출시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법을 포함한다.
3. 트리아바디 ( triabody )
트리아바디도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 항체는 예를 들어 문헌 [Iliades et al., 상기 문헌 및 Kortt et al., 상기 문헌]에 기재되어 있다.
4. 다른 변형
DR5 항체의 다른 변형이 본원에서 고려된다. 본 발명의 항체는 항체를 세포독성제 (독소 분자와 같은) 또는 전구약물 (예를 들어 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항암 약물 [예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 4,975,278 참조]로 전환시키는 전구약물 활성화 효소에 컨쥬게이팅시켜 변형시킬 수 있다. 상기 기술은 "Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy" (ADEPT)로도 언급된다.
ADEPT에 유용한 면역컨쥬게이트의 효소 성분은 전구약물을 그의 보다 활성의 세포독성 형태로 전환시키기 위해 상기 방식으로 전구약물에 대해 작용할 수 있는 임의의 효소를 포함한다. 발명의 방법에 유용한 효소는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼린 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어 세라티아 (serratia) 프로테아제, 테르몰리신, 섭틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예를 들어, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸기 또는 페닐아세틸기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 효소 활성을 갖는 항체 (당업계에서 "아브자임 (abzyme)"으로도 알려짐)가 본 발명의 전구약물을 유리 활성 약물로 전환시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458 (1987)] 참조). 길항제-아브자임 컨쥬게이트는 종양 세포 집단으로 아브자임의 전달을 위해 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
효소는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해, 예를 들어 상기 논의된 헤테로 2관능성 가교결합제를 사용하여 항체에 공유 결합될 수 있다. 별법으로, 적어도 본 발명의 효소의 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 항체의 항원 결합 영역을 적어도 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)]을 참조한다).
다른 항체 변형이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체는 다양한 비단백성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다. 항체는 또한 예를 들어 액적 형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)에, 각각 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 5,739,277에 기재된 바와 같이 샐비지 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 포함시킬 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자 (예, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 나타낸다.
또한, 본원에 개시된 항-DR5 항체는 면역리포좀으로서 제형화될 수 있다. 항체를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 미국 특허 4,485,045 및 4,544,545]에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포좀은 미국 특허 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 수득하도록 규정된 공극 크기의 필터를 통해 압출된다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 컨쥬게이트될 수 있다. 화학요법제 (예를 들어 독소루비신)는 임의로 리포좀 내에 함유된다 (문헌 [Gabizon et al. J. National Gancer Inst. 81(19):1484 (1989)] 참조).
본 발명의 항체는 "가교결합된" DR5 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "가교결합된"은 2개 이상의 IgG 분자가 함께 결합하여 하나의 (또는 단일) 분자를 형성함을 의미한다. DR5 항체는 다양한 링커 분자를 사용하여 가교결합될 수 있고, 바람직하게는 DR5 항체는 항-IgG 분자, 보체, 화학적 변형 또는 분자공학을 사용하여 가교결합된다. 당업자는 세포 표면막에 항체가 결합하면 보체가 항체 분자에 대한 비교적 높은 친화도를 갖는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 보체를 가교결합 분자를 세포 표면막에 결합된 2 이상의 항-DR5 항체를 연결시키는 가교결합 분자로서 사용할 수 있음이 생각된다
5. 재조합 방법
본 발명은 또한 본원에 개시되는 DR5 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 항체 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체 코딩 핵산은 단리되어 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입된다. 항체 코딩 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 과정 (예를 들어 항체 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)에 의해 서열결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 시그날 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 항-DR5 항체 경쇄 또는 중쇄 (또는 경쇄와 중쇄 모두)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계, 숙주 세포를 상기 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계 및 숙주 세포(들)를 재조합 항-DR5 항체 생성물을 생산하기에 충분한 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 키메라 또는 재조합 항-DR5 항체의 제조 방법을 포함한다.
(i) 시그날 서열 성분
본 발명의 항-DR5 항체는 직접 및 바람직하게는 시그날 서열인 이종 폴리펩티드 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 다른 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 선택되는 이종성 시그날 서열은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 인식 및 프로세싱 (즉, 시그날 펩티다제에 의한 분해)되는 것이다. 천연 항체 시그날 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵 숙주 세포의 경우, 시그날 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택되는 원핵 시그날 서열에 의해 치환된다. 효모 분비를 위해, 천연 시그날 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 팩터 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 알파-팩터 리더), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더, WO 90/13646에 기재된 시그날에 의해 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 시그날 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 단순 포진 gD 시그날이 이용가능하다.
상기 전구체 영역을 위한 DNA는 항체를 코딩하는 DNA에 리딩 프레임으로 라이게이션된다.
(ii) 복제 기점 성분
발현 및 클로닝 벡터는 모두 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제하도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 일반적으로, 벡터 클로닝시에 상기 서열은 숙주 염색체 DNA에 무관하게 벡터가 복제하도록 하는 것이고, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)는 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다 (SV40 기점은 단지 초기 프로모터를 포함하기 때문에 일반적으로 사용될 수 있다).
(iii) 선택 유전자 성분
발현 및 클로닝 벡터는 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
선택 방식의 일례는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환된 상기 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성하고, 따라서 선택법에서 생존할 수 있다. 상기 우성 선택의 예는 약물 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 이용한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 다른 예는 항체 핵산, 예를 들어 DHFR, 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다.
예를 들어, DHFR 선택 유전자로 형질전환된 세포는 먼저 메토트렉세이트(Mtx), DHFR의 경쟁적 길항제를 포함하는 배양 배지에서 모든 형질전환체를 배양함으로써 확인한다. 야생형 DHFR을 사용할 때 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주이다.
별법으로, 항-DR5 항체, 야생형 DHFR 단백질 및 또다른 선택가능 마커, 예를 들어 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환된 또는 동시-형질전환된 숙주 세포 (특히 내인성 DHFR을 포함하는 야생형 숙주)는 선택가능 마커에 대한 선택제, 예를 들어, 아미노글리코사이드계 항생제, 예를 들어, 카나마이신, 네오마이신, 또는 G418를 포함하는 배지에서 세포의 성장에 의해 선택될 수 있다 (미국 특허 4,965,199를 참조).
효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈 내의 trp1 병변의 존재는 트립토판 부재시의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게, Leu2-결여 효모 균주 (ATCC 기탁 번호 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 포함하는 공지의 플라스미드에 의해 보완된다.
또한, 1.6 ㎛ 환상 플라스미드 pKD1에서 유래한 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용될 수 있다. 별법으로, 케이. 락티스 (K. lactis)에 대한 재조합 송아지 키모신의 대량 생산용 발현 시스템이 문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)]에 보고되었다. 성숙 재조합 인간 혈청 알부민의 클루이베로마이세스의 산업적 균주에 의한 분비를 위한 안정한 다중 카피 발현 벡터도 개시되어 있다 (Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)).
(iv) 프로모터 성분
발현 및 클로닝 벡터는 대체로 숙주 유기체에 의해 인식되고 항체 핵산에 작동가능하게 연결된 특정 프로모터를 포함한다. 원핵 숙주에 사용하기 적합한 프로모터는 phoA 프로모터, 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터를 포함한다. 그러나, 다른 공지의 세균 프로모터도 적합하다. 또한 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 항-DR5 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno; S.D.) 서열을 포함할 것이다.
프로모터 서열이 진핵세포에 대해 공지되어 있다. 실질적으로 모든 당단백질 유전자는 전사가 개시되는 부위의 약 25 내지 30 염기 상류에 위치하는 AT 풍부 영역을 갖는다. 많은 유전자의 전사 개시점으로부터 70 내지 80 염기 상류에 존재하는 또다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오티드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 테일의 부가를 위한 시그날일 수 있는 AATAAA 서열이 대부분의 당단백질 유전자의 3' 말단에 존재한다. 상기 모든 서열은 진핵 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.
포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 항-DR5 항체 전사는 프로모터가 숙주 세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.
SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 또한 SV40 바이러스 복제 기점을 포함하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 인간 사이토메갈로바이러스의 최조기 (immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 얻는다. 소 파필로마 바이러스를 벡터로서 사용하는 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하기 위한 시스템은 미국 특허 4,419,446에 기재되어 있다. 이 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스로부터 티미딘 키나제 프로모터의 조절 하에 마우스 세포에서 인간 베타-인터페론 cDNA의 발현에 대해서는 문헌 [Reyes et al., Nature 297: 598-601 (1982)]을 참조한다. 별법으로, 라우스 (rous) 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수 있다.
(v) 인핸서 엘리먼트 성분
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 항-DR5 항체를 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가된다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 또한, 진핵 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 엘리먼트는 문헌 [Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 위치 5' 또는 3'에서 항체 코딩 서열까지 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
(vi) 전사 종결 성분
진핵 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 영역은 다가 항체를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다. 한 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. W094/11026 및 본원에 개시된 발현 벡터를 참조한다.
(vii) 숙주 세포의 선택 및 형질전환
본원에서 벡터 내에 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 적합한 숙주 세포는 상기한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 본 목적에 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)가 적합하다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 항-DR5 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 저등 진핵 숙주 미생물 사이에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 일반적으로 이용가능하고 본원에서 유용하다.
글리코실화 항체 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포성 유기체로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다.
면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 감자의 식물 세포 배양액도 숙주로서 이용할 수 있다.
그러나, 척추동물 세포에 대한 관심이 가장 컸고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 경부 암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 인간 간암 세포주 (Hep G2); 및 골수종 또는 림프종 세포 (예를 들어 YO, J558L, P3 및 NSO 세포) (미국 특허 5,807,715 참조)이다.
숙주 세포는 항체 생산을 위해 상기 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.
(viii) 숙주 세포의 배양
본 발명의 항체를 생산하기 위해 사용된 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (Sigma), 최소 영양 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM, Sigma)가 숙주 세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업계의 숙련인에게 잘 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
(ix) 정제
재조합 기술을 사용할 때, 항체는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포 내에서 생산되면, 제1 단계로서, 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]에는 이. 콜라이의 주변 세포질 공간에 분비되는 항체를 단리하기 위한 절차가 설명되어 있다. 간단히 설명하면, 세포 페이스트는 아세트산 나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동된다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백질 분해를 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에서 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 의존한다. 단백질 A가 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 기초로 하는 항체를 정제하기 위해 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형 및 인간 γ3에 대해 추천된다 (Guss et al., 1986, EMBO J. 5:15671575). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 종종 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적 안정성 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠이 아가로스를 사용하여 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유동 속도와 더 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX (등록상표) 수지 (제이.티. 베이커 (J.T. Baker), 미국 뉴저지주 필립스버그)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (등록상표) 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전도 회수되는 항체에 따라 사용될 수 있다.
B. DR5 항체의 용도
본 발명의 DR5 항체는 다양한 유용성을 갖는다.
DR5는 세포자멸 신호전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 여러 종류의 정상 세포가 DR5를 발현하지만, 상기 수용체를 통한 세포자멸 신호전달은 1차적으로 종양유전자, 예를 들어 MYC 또는 RAS에 의한 그의 형질전환의 측면에서 사멸 수용체-매개 세포자멸에 보다 취약하게 되는 종양 세포에 제한되는 것으로 보인다 (Wang et al., Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterov et al., Cancer Res. 64:3922-7 (2004)). DR5는 인간 암 세포주 및 원발 종양에 의해 종종 발현된다. 따라서, 항-DR5 항체는 암 진단 및 치료시에 유용성을 보인다. 예를 들어, DR5 작용제 항체는 인간을 포함하여 포유동물의 암 치료 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법에서, DR5 항체, 바람직하게는 작용제 항체는 단독으로 또는 다른 치료제 또는 기술과 조합되어 포유동물에게 투여된다. 암은 고형 종양, 특히 이전 치료시에도 계속 진행되거나 효과적인 치료법이 알려진 바 없는 특정 진행성 또는 전이성 고형 종양을 포함하여 임의의 종류의 DR5-발현 암일 수 있다. 특정 종류의 암은 결장직장암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 췌장암, 난소암, 유방암, 비-호지킨 림프종 (NHL), 교모세포종, 또는 흑색종, 바람직하게는 결장직장암, NSCLC, 또는 NHL를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
또한, DR5 항체는 인간을 포함한 포유동물에서 다른 DR5-관련 병태, 예를 들어 면역-관련 질병의 진단 및 치료에 유용하다.
포유동물에서 본원에 기재된 다양한 병태의 진단은 통상의 숙련된 의사에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 포유동물에서 암 또는 면역 관련 질병의 진단 또는 검출이 가능한 진단 기술이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 암은 촉진, 혈액 분석, x선, NMR 등을 포함하여 이로 제한되지 않는 기술을 통해 확인할 수 있다.
또한, 면역 관련 질병도 쉽게 확인할 수 있다.
전신성 홍반 루푸스에서, 질환의 주요 매개인자는 자가 단백질/조직에 대한 자가반응성 항체의 생성 및 그 이후의 면역-매개 염증의 발생이다. 신장, 폐, 근골격계, 피부점막, 눈, 중추신경계, 심혈관계, 위장관, 골수 및 혈액 등의 여러 조직 및 계가 임상적으로 영향을 받는다.
류마티스성 관절염 (RA)은 관절 연골의 손상과 함께 여러 관절의 활막이 주로 관련된 만성 전신성 자가면역 염증성 질환이다. 병원은 T 림프구 의존성이고, 류마티스성 인자, 자가 IgG에 대한 자가항체의 생성과 관련되어 있으며, 결과적으로 면역 복합체가 형성되어 관절액 및 혈액에 높은 수준으로 존재하게 된다. 관절내에서 이러한 복합체는 림프구 및 단핵세포가 활막으로 현저하게 침윤되도록 한 후에 활막에서 상당한 변화가 일어나도록 유도할 수 있다 (다수의 호중구가 추가되면서 유사한 세포들이 침윤하면 관절 공간/유액이 변화함). 영향을 받는 조직은 주로 관절이며, 흔히 대칭적인 패턴으로 나타난다. 그러나, 관절외 질환도 2 가지 주요 형태로 발생한다. 한 형태는 진행성 관절 질환이 진행중인 관절외 병변 및 폐섬유증, 맥관염 및 피부 궤양의 전형적 병변의 발생이다. 다른 한 형태의 관절외 질환은 이후에 때때로 RA 질환 과정의 후기, 때로는 관절 질환이 사라진 후에 발생하는 소위 펠티 (Felty) 증후군이며, 호중구 감소증, 혈소판 감소증 및 비종대의 존재를 포함한다. 이는 여러 기관에서 맥관염을 수반할 수 있으며, 경색증, 피부 궤양 및 괴저의 형성을 동반한다. 또한, 환자들에서는 흔히 영향을 받은 관절 바로 위쪽의 피하 조직에서 류마티스성 결절이 일어나고, 결절 후기 단계에서는 혼합 염증 세포 침윤물로 둘러싸인 괴사 중심을 갖게 된다. RA에서 발생할 수 있는 다른 증상은 다음을 포함한다: 심막염, 흉막염, 관상 동맥염, 폐섬유증을 동반한 간질성 폐렴, 건성각결막염 및 류마티스성 결절.
연소성 만성 관절염은 흔히 16세 미만에 시작하는 만성 특발성 염증성 질환이다. 이 표현형은 RA와 몇 가지 유사성이 있다. 류마티스성 인자가 양성인 몇몇 환자들은 연소성 류마티스성 관절염으로서 분류된다. 이 질환은 소수관절성, 다관절성 및 전신성의 3 가지 주요 범주로 더욱 분류된다. 관절염은 중증일 수 있고 보통 파괴적이며, 관절 강직 및 성장 지연을 초래한다. 다른 증상으로는 만성 전포도막염 및 전신성 유전분증을 포함할 수 있다.
척추관절병증은 HLA-B27 유전자 생성물의 발현과 몇몇 공통적인 임상적 특징 및 공통된 관련성을 갖는 질환군이다. 이 질환은 다음을 포함한다: 강직성 척추염, 라이터 증후군 (반응성 관절염), 염증성 장질환과 관련된 관절염, 건선과 관련된 경화증, 연소성 척추관절병증 및 비분화 척추관절병증. 구별되는 특징으로는 척추염이 있거나 없는 천장골염; 염증성 비대칭 관절염; HLA-B27과의 관련성 (클래스 I MHC의 HLA-B 로커스의 혈청학적으로 한정된 대립유전자); 안구 염증, 및 다른 류마티스성 질환과 관련된 자가항체의 부재가 포함된다. 질환 유도에 중요한, 가장 많이 관련된 세포는 CD8+ T 림프구이고, 이 세포는 클래스 I MHC 분자가 제시하는 항원을 표적으로 한다. CD8+ T 세포는 클래스 I MHC 대립유전자 HLA-B27에 대해서 MHC 클래스 I 분자에 의해 발현된 외래 펩티드인 것처럼 반응할 수 있다. HLA-B27의 에피토프는 박테리아 또는 다른 미생물의 항원성 에피토프를 모방할 수 있어서 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있음이 가설로 되어 있다.
전신 경화증 (피부경화증)의 병인은 알려져 있지 않다. 이 질환의 징후는 피부 경화이고, 이는 활성 염증 과정에 의해 유도되기 쉽다. 피부경화증은 국소적 또는 전신적일 수 있고, 혈관 병변은 공통적이고, 미소혈관계에서의 내피세포 손상이 전신성 경화증의 발생의 주요한 초기 사건이며, 혈관 손상은 면역-매개일 수 있다. 피부 병변에서의 단핵세포 침윤물 존재 및 다수의 환자에서의 항-핵 항체의 존재로 면역학적 근거가 제시된다. ICAM-1은 흔히 피부 병변에 있는 섬유아세포의 세포 표면상에서 상향조절되며, 이것은 이들 세포와 T 세포와의 상호작용이 질환의 병원에 역할을 할 수 있음을 시사한다. 기타의 관련 기관은 다음을 포함한다: 위장관 (비정상적인 연동운동/운동성을 초래하는 섬유증 및 평활근 위축); 신장 (소궁상동맥 및 소엽간동맥에 영향을 주어 결과적으로 신장 피질 혈류를 감소시키는 동심성 내피하층의 내막 증식은 단백뇨, 질소혈증 및 고혈압을 초래함); 골격근 (위축, 간질성 섬유증, 염증); 폐 (간질성 폐렴 및 간질성 섬유증); 및 심장 (수축 밴드 괴사, 반흔형성/섬유증).
피부근육염, 다발성 근육염 등을 비롯한 특발성 염증성 근육병증은 근육 약화를 유발하는 병인 불명의 만성 근육 염증성 장애이다. 근육 손상/염증은 흔히 대칭적이며 진행성이다. 자가항체는 대부분의 형태와 연관이 있다. 이러한 근염-특이적 자가항체는 단백질 합성에 관여하는 성분, 단백질 및 RNA에 대항하여 이들의 기능을 억제한다.
쇼그렌 증후군은 면역-매개 염증성 및 후속의 눈물샘 및 침샘의 기능적 파괴에서 비롯된다. 상기 질환은 염증성 결합 조직 질환과 관련되거나 그와 동반될 수 있다. 이 질환은 Ro 및 La 항원 (둘 다 작은 RNA-단백질 복합체임)에 대한 자가항체 생성과 관련되어 있다. 병변은 담즙성 간경변, 말초 또는 감각 신경병증 및 촉지성 자반병을 비롯한 다른 증상 또는 관련 질환과 함께 건성각결막염, 구강건조증을 유발한다.
전신성 혈관염은 1차 병변이 염증, 및 감염된 혈관에 의해 공급되는 조직의 허혈/괴사/퇴행 및 일부 경우에서 결과적으로 말단 기관 기능부전을 초래하는 후속의 혈관 손상인 질환이다. 또한, 혈관염은 류마티스성 관절염, 전신성 경화증 등의 다른 면역 염증 매개성 질환, 특히 면역 복합체 형성과도 관련된 질환의 2차 병변 또는 후유증으로서 발생할 수 있다. 원발성 전신성 혈관염 군에 속하는 질환으로는 전신성 괴사성 혈관염: 결절성 다발 동맥염, 알레르기성 혈관염 및 육아종증, 다발성 맥관염; 베게너 육아종증; 림프종양 육아종증; 및 거대세포 동맥염이 포함된다. 그밖의 혈관염으로는 피부점막 림프절 증후군 (MLNS 또는 가와사키병), 단리성 CNS 혈관염, 베체트병, 폐색성 혈전맥관염 (뷔르거병) 및 피부 괴사성 정맥염이 포함된다. 열거된 혈관염 유형 중 대부분의 병원성 메카니즘은 주로 혈관벽에서의 면역글로불린 복합체의 침착 및 후속적인 ADCC 또는 보체 활성화, 또는 둘 다를 통한 염증 반응의 유도에서 비롯된 것으로 여겨진다.
유육종증은 체내 거의 모든 조직에서의 상피양 육아종증의 존재를 특징으로 하는 병인 불명의 증상이며, 폐가 관련된다는 점이 가장 공통적이다. 병인에는 질환 부위에서 활성화된 대식세포 및 림프양 세포의 존재가, 이들 세포 유형에 의해 방출된 국소적 및 전신적 활성 생성물의 방출로부터 야기되는 후속의 만성 후유증과 함께 포함된다.
자가면역 용혈성 빈혈, 면역성 범혈구감소증 및 발작성 야간혈색소뇨증을 비롯한 자가면역 용혈성 빈혈은 적혈구 (일부 경우에는 혈소판을 비롯한 다른 혈구) 표면에 발현된 항원과 반응하는 항체가 생성되어 야기된 결과이며, 보체 매개 용해 및/또는 ADCC/Fc-수용체 매개 메카니즘을 통해 이러한 항체-코팅 세포를 제거한 결과이다.
다른 임상 환경에서의 혈소판 감소성 자반병 및 면역-매개 혈소판 감소증을 비롯한 자가면역 혈소판 감소증에서, 혈소판 파괴/제거는 혈소판에 부착된 항체 또는 보체 및 후속적인 보체 용해, ADCC 또는 Fc-수용체 매개 메카니즘에 의한 제거의 결과로서 발생한다.
그레이브스병, 하시모또 갑상선염, 연소성 림프구성 갑상선염 및 위축성 갑성선염을 비롯한 갑상선염은 갑상선에 존재하고 흔히 갑상선에 특이적인 단백질과 반응하는 항체를 생성하는, 갑상선 항원에 대한 자가면역 반응의 결과이다. 자발적 모델 (래트 (BUF 및 BB 래트) 및 치킨 (비만계 치킨)); 유도가능한 모델 (티로글로불린, 갑상선 미소체 항원 (갑상선 퍼옥시다제)을 이용한 동물의 면역화)을 비롯한 실험 모델이 존재한다.
I형 진성 당뇨병 또는 인슐린-의존성 당뇨병은 췌장섬 β 세포의 자가면역 파괴이며, 이러한 파괴는 자가항체 및 자가반응성 T 세포에 의해 매개된다. 또한, 인슐린 또는 인슐린 수용체에 대한 항체는 인슐린 비반응성의 표현형을 생성할 수 있다.
사구체신염 및 세뇨관 간질성신염을 비롯한 면역-매개 신장 질환은 직접적으로 신장 항원에 대한 자가반응성 항체 또는 T세포의 생성 결과이거나 또는 간접적으로 신장에서 다른 비-신장 항원에 대해 반응성인 항체 및/또는 면역 복합체 침착의 결과로서, 신장 조직에 대한 항체 또는 T 림프구 매개된 손상의 결과이다. 그러므로, 면역 복합체의 형성을 초래하는 다른 면역-매개 질환은 또한 간접적인 후유증으로 면역-매개 신장 질환을 유도할 수 있다. 직접 및 간접 면역 메카니즘 모두가 신장 조직에서 병변 발생을 생성/유도하는 염증 반응을 초래하여 결과적으로 기관 기능 손상 및 일부 경우에서 신부전으로의 진행을 초래하게 된다. 체액성 및 세포성 면역 메카니즘 모두가 병변의 병인에 관여할 수 있다.
다발성 경화증; 특발성 탈수초성 다발성 신경염 또는 길랑-바레 증후군; 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경염을 비롯한 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환은 자가면역이며, 희소돌기아교세포 또는 미엘린에 직접 발생된 손상의 결과로서 신경의 탈수초를 유발하는 것으로 여겨진다. MS에서 질환 유도 및 진행은 T 림프구에 의존적임을 나타내는 증거가 존재한다. 다발성 경화증은 T 림프구 의존성이며, 재발-이장성 (relapsing-remitting) 과정 또는 만성 진행성 과정을 갖는 탈수초 질환이다. 병인은 알려져 있지 않으나, 바이러스 감염, 유전적 소인, 환경 및 자가면역 모두가 기여한다. 병변은 주로 T 림프구 매개된, 소교세포 및 침윤성 대식세포의 침윤물을 함유하고, CD4+T 림프구는 병변에서 우세한 세포 유형이다. 희소돌기아교세포의 세포 사멸 및 후속적인 탈수초 메카니즘은 알려져 있지는 않으나, 거의 T 림프구에 의해 발생하는 것으로 보인다.
호산구성 폐렴, 특발성 폐섬유증 및 과민성 폐렴을 비롯한 염증성 및 섬유성 폐 질환은 조절장애성 면역 염증 반응을 포함할 수 있다. 이러한 반응의 억제는 치료상 이로울 것이다.
수포성 피부 질환, 다형성 홍반 및 접촉성 피부염을 비롯한 자가면역 또는 면역-매개 피부 질환은 자가항체에 의해 매개되며, 이의 병원은 T 림프구 의존성이다.
건선은 T 림프구 매개 염증성 질환이다. 병변은 T 림프구, 대식세포 및 항원 프로세싱 세포 및 특정 호중구의 침윤물을 함유한다.
천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증 및 두드러기를 비롯한 알레르기성 질환은 T 림프구 의존성이다. 이들 질환은 주로 T 림프구 유도성 염증, IgE 매개 염증 또는 이 둘 모두의 조합에 의해 매개된다.
이식편 거부반응 및 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 비롯한 이식 관련 질환은 T 림프구 의존성이며, T 림프구 기능을 억제하면 개선된다.
면역 및/또는 염증 반응의 개입이 이로운 다른 질환으로는 바이러스 감염 (AIDS, A, B, C, D, E형 간염을 포함되고, 이에 한정되는 것은 아님), 박테리아 감염, 진균 감염, 및 원생동물 감염 및 기생충 감염 (MLR을 자극하는 분자 (또는 유도체/작용제)는 감염제에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 면역 결핍 질환 (MLR을 자극하는 분자/유도체/작용제는 유전적, 후천적, (HIV 감염에서와 같은) 감염 유도 증상, 또는 의원성 (즉, 화학요법으로 인한) 증상에 대한 면역 반응을 강화시키기 위해 치료적으로 이용될 수 있음), 및 신생물 (이에 한정되는 것은 아님)을 비롯한 감염성 질환이다.
항체는 바람직하게는 담체; 바람직하게는 제약학상 허용되는 담체 중에서 포유동물에 투여된다. 적합한 담체 및 그의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.]에 기재되어 있다. 일반적으로, 제제를 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 제약학상 허용되는 염이 제제에 사용된다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 지연 방출 제제, 예를 들어 성형 용품, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 마이크로입자의 형태인 항체 함유 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 당업자는 예를 들어 투여 경로 및 투여되는 항체의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있음을 분명하게 알 수 있을 것이다.
항체는 주사 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근내, 문맥내), 또는 다른 방법, 예를 들어 유효 형태로 혈류 내로 전달되는 것을 보장하는 주입에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 또한, 항체는 국소 치료 효과를 발생시키기 위해 분리된 관류 기술, 예를 들어 분리된 조직 관류에 의해 투여될 수 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체의 유효 투여량 및 투여 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 이 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있는 것이다. 당업자는 투여되어야 하는 항체 투여량이 예를 들어 항체를 투여하는 포유동물, 투여 경로, 사용되는 항체의 특정 종류 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 상이함을 이해할 것이다. 적절한 항체 투여량 선택에 대한 지침은 항체의 치료 용도에 대한 문헌에서 볼 수 있다 [예를 들어, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, NJ., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 요인에 따라 약 1 내지 100 mg/kg/일 (체중) 또는 그 초과일 수 있다.
또한, 항체는 유효량의 하나 이상의 다른 치료제와 조합되어 포유동물에게 투여될 수 있다. 암의 치료시에, 이것은 많은 종양이 p53 종양 서프레서 유전자의 불활성화를 통해 화학요법 또는 방사선요법에 대한 내성을 획득하기 때문에 특히 적절할 수 있다. DR5는 p53과 무관하게 세포자멸을 자극하기 때문에, 이것은 단일 치료제로서 뿐만 아니라 다른 종류의 암 치료제, 예를 들어 화학요법 (화학요법제), 방사선 요법, 면역보강제, 성장 억제제, 세포독성제, 및/또는 시토킨과 조합한 경우에도 임상적으로 유용할 것으로 기대된다. 또한, 포유동물 세포에서 세포자멸을 유도하는 것으로 알려진 다른 물질도 사용할 수 있고, 상기 물질은 TNF-알파, TNF-베타, CD30 리간드, 4-1BB 리간드 및 Apo-2 리간드, 및 세포자멸을 유도할 수 있는 다른 항체를 포함한다. 하나 이상의 다른 치료제는 치료 항체 (DR5 항체 이외의 다른)를 포함할 수 있고, 상기 항체는 항-Her 수용체 항체 (예를 들어 HERCEPTIN(등록상표) (트라추주맙), 제넨테크, 인크.), 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체 (예를 들어 RITUXAN(등록상표) (리툭시맙), 제넨테크, 인크.) 및 Apo-2 리간드의 다른 수용체에 대해 작용하는 항체, 예를 들어 항-DR4 항체, 또는 다른 TNF 수용체 패밀리 멤버에 대해 작용하는 항체, 예를 들어 ENBREL(등록상표) (에타네르셉트) (이뮤넥스 (Immunex))를 포함할 수 있다.
본 발명에서 고려되는 화학요법제는 당업계에 공지되고 상업적으로 입수가능한 화학 물질 또는 약물, 예를 들어 독소루비신, 5-플루오로우라실, 에토포시드, 캄프토테신, 류코보린, 시토신 아리비노시드, 시클로프스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴 및 카르보플라틴을 포함한다.
상기 화학요법제의 제제화 및 투여 계획은 제조자의 지침에 따라 또는 통상의 숙련의에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 상기 화학요법제의 제제화 및 투여 계획은 문헌에 기재되어 있다 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]. 화학요법제는 바람직하게는 상기한 바와 같은 제약학상 허용되는 담체 중에서 투여된다. 화학요법제의 투여 방식은 DR5 항체와 동일할 수 있거나 또는 상이한 방식으로 포유동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, DR5 항체는 주사될 수 있는 반면에, 화학요법제는 포유동물에게 경구 투여된다.
방사선 요법은 당업계에서 통상 사용되고 당업자에게 공지된 프로토콜에 따라 포유동물에게 수행될 수 있다. 상기 요법은 세슘, 이리듐, 요오드 또는 코발트 조사를 포함할 수 있다. 방사선 요법은 전체 신체 조사일 수 있거나, 특정 부위 또는 조직 또는 신체 상에 국소 조사될 수 있다. 일반적으로, 방사선 요법은 약 1 내지 약 2주의 기간에 걸쳐 펄스로 투여한다. 그러나, 방사선 요법은 보다 오랜 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 임의로, 방사선 요법은 단일 투여 또는 순차적인 다중 투여로 투여될 수 있다.
항체는 하나 이상의 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 항체 및 치료제의 양은 예를 들어 사용되는 약물의 종류, 치료되는 병태 및 투여 계획 및 경로에 따라 상이하지만, 일반적으로 각각 개별적으로 사용될 경우보다는 적을 것이다.
포유동물에 대한 항체의 투여 후에, 포유동물의 생리학적 상태를 당업자에게 공지되어 있는 다양한 방법으로 모니터링할 수 있다.
길항제 또는 차단 DR5 항체도 요법에 사용될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, DR5 항체는 Apo-2L에 대한 DR5 수용체 결합을 차단하여 암 세포에서 세포자멸을 유도하기 위해 Apo-2L 치료 동안 투여되는 Apo-2L의 생체이용률을 증가시키기 위해 포유동물 (상기한 바와 같은)에게 투여될 수 있다.
본 발명의 DR5 항체의 치료 효과는 시험관내 분석 및 생체내 동물 모델을 사용하여 조사할 수 있다. 다양한 잘 공지된 동물 모델을 사용하여 예를 들어 암 또는 면역-관련 질병의 발생 및 발병기전에서 본원에서 확인된 DR5 항체의 역할을 추가로 이해하고 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 상기 모델의 생체내 특성을 통해 인간 환자의 반응을 예측할 수 있다.
면역 관련 질병의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물을 모두 포함한다. 비-재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류, 예를 들어 쥐 모델을 포함한다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 및 신피막 하 이식을 사용하여 세포를 동계 마우스 내로 도입함으로써 생성시킬 수 있다.
예를 들어 이식편 대 숙주 질환의 동물 모델이 알려져 있다. 이식편 대 숙주 질환은 면역적격 세포가 면역억제되거나 관용성인 환자에게 이식될 때 발생한다. 공여 세포는 숙주 항원을 인식하고 반응한다. 반응은 치명적인 심한 염증으로부터 설사 및 체중 감소의 온건한 반응까지 상이할 수 있다. 이식편 대 숙주 질환 모델은 MHC 항원 및 작은 이식 항원에 대한 T 세포 반응성의 평가 수단을 제공한다. 적합한 과정은 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.3]에 상세히 기재되어 있다.
피부 동종이식 거부의 동물 모델은 항-바이러스 및 종양 면역에서 그의 역할을 나타내거나 그의 역할의 척도인 생체내 조직 파괴를 매개하는 T 세포의 능력을 시험하는 수단이다. 가장 통상적인 허용되는 모델은 쥐 꼬리-피부 이식편을 사용한다. 반복 실험은 피부 동종이식 거부가 항체가 아니라 T 세포, 헬퍼 T 세포 및 킬러-효과기 T 세포에 의해 매개됨을 보여주었다 [Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology. 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992]. 적합한 과정은 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.4]에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 조성물을 시험하기 위해 사용될 수 있는 다른 이식 거부 모델은 동종이형 심장 이식 모델이다 [Tanabe, M. et al., Transplantation, (1994) 58:23 및 Tinubu, S. A. et al., J. Immunol., (1994) 4330-4338].
지연형 과민반응의 동물 모델은 세포 매개 면역 기능에 대한 분석을 제공한다. 지연형 과민반응은 항원 시험접종 후에 일정 시간 경과 후까지 피크에 도달하지 않은 염증을 특징으로 하는 T 세포 매개 생체내 면역반응이다. 또한, 상기 반응은 조직 특이적 자가면역 질병, 예를 들어 다발 경화증 (MS) 및 실험 자가면역 뇌척수염 (EAE, MS의 모델)에서 발생한다. 적합한 과정은 문헌 [Current Protocols in Immunology, unit 4.5]에 상세히 기재되어 있다.
관절염에 대한 동물 모델은 콜라겐-유발 관절염이다. 상기 모델은 인간 자가면역 류마티스성 관절염의 임상적, 조직학적 및 면역학적 특징을 공유하고, 인간 자가면역 관절염의 허용되는 모델이다. 마우스 및 래트 모델은 윤활막염, 연골의 침식 및 연골하 골을 특징으로 한다. 본 발명의 DR5 항체는 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌, units 15.5]에 기재된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 자가면역 관절염에 대한 활성에 대해 시험될 수 있다. 또한, CD18 및 VLA-4 인테그린에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 모델은 문헌 [Issekutz, A. C. et al., Immunology, (1996) 88:569]에 기재되어 있다.
동물을 난알부민으로 감작시킨 후, 동물을 에어로졸로 전달된 동일한 단백질로 시험접종하여 항원 유발 기독 과민반응증, 폐 호산구 증가증 및 염증을 유도한 천식 모델이 문헌에 기재되어 있다. 몇몇 동물 모델 (기니아 피그, 래트, 비-인간 영장류)은 에어로졸 항원으로 시험접종시에 인간의 아토피성 천식과 유사한 증상을 보인다. 쥐 모델은 인간 천식의 많은 특징을 갖는다. 천식 치료시의 활성 및 효능에 대해 본 발명의 조성물을 시험하기에 적합한 과정은 문헌에 기재되어 있다 [Wolyniec, W. W. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., (1998) 18:777 및 이 문헌에서 언급된 참고 문헌].
추가로, 본 발명의 DR5 항체는 건선 유사 질병에 대해 동물 모델에서 시험될 수 있다. 본 발명의 DR5 항체는 마우스가 건선과 유사한 병리조직학적 피부 병변을 보이는, 문헌 [Schon, M. P. et al., Nat. Med., (1997) 3:183]에 기재된 scid/scid 마우스 모델에서 시험될 수 있다. 다른 적합한 모델은 문헌 [Nickoloff, B. J. et al., Am. J. Path., (1995) 146:580]에 기재된 바와 같이 제조된 인간 피부/scid 마우스 키메라이다.
후보 치료 조성물의 안전성 및 항암 활성을 시험하기 위한 다양한 동물 모델이 공지되어 있다. 이 모델은 무흉선 누드 마우스 또는 scid/scid 마우스 내로 이종이식된 인간 종양, 또는 유전자 쥐 종양 모델, 예를 들어 p53 낙아웃 (knockout) 마우스를 포함한다.
재조합 (트랜스제닉) 동물 모델은 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위한 표준 기술을 사용하여 본원에서 확인된 분자의 코딩 부분을 목적하는 동물의 게놈 내로 도입함으로써 공학처리될 수 있다. 트랜스제닉 조작을 위한 표적으로서 기능할 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지, 및 비-인간 영장류, 예를 들어 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이, 예를 들어 사이노몰거스 원숭이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 도입유전자를 상기 동물에 도입하기 위한 당업계에 공지된 기술은 전핵 미세주사 (Hoppe and Wanger, 미국 특허 4,873,191); 생식선 내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예를 들어, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6148-615 [1985]); 배아줄기세포에서 유전자 표적화 (Thompson et al., Cell, 56, 313-321 [1989]); 배아의 전기천공 (Lo, Mol. Cel. Biol., 3, 1803-1814 [1983]); 정자 매개 유전자 전달 (Lavitrano et al., Cell, 57, 717-73 [1989])를 포함한다 (또한, 예를 들어 미국 특허 4,736,866 참조).
본 발명의 목적을 위해, 트랜스제닉 동물은 세포의 일부에만 도입 유전자를 보유하는 동물 ("모자이크 동물")을 포함한다. 도입 유전자는 단일 도입 유전자로서, 또는 콘카타머 (concatamer), 예를 들어 헤드 투 헤드 (head-to-head) 또는 헤드 투 테일 (head-to-tail) 연결체로 통합될 수 있다. 도입 유전자의 특정 세포형 내로의 선택적인 도입은 예를 들어 문헌 [Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 6232-636 (1992)]의 기술을 따라 수행할 수도 있다.
트랜스제닉 동물에서 도입 유전자의 발현은 표준 기술에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 서던 블로트 분석 또는 PCR 증폭을 사용하여 도입 유전자의 통합을 확인할 수 있다. 이어서, mRNA 발현 수준은 계내 혼성화, 노던 블로트 분석, PCR, 또는 면역세포화학과 같은 기술을 사용하여 분석할 수 있다. 동물은 또한 예를 들어 특정 조직 내로의 면역 세포의 침윤을 결정하는 조직학적 조사에 의해 면역 질환 병리학의 징후에 대해 또는 암성 또는 악성 조직의 존재에 대해 추가로 조사할 수 있다.
별법으로, 본원에서 확인된 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아 세포 내로 도입된 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변경된 게놈 DNA 사이의 상동 재조합의 결과로 본원에서 확인된 폴리펩티드의 결함 또는 변경 유전자를 갖는 "낙아웃" 동물을 제조할 수 있다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 확립된 기술에 따라 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 삭제하거나 다른 유전자, 예를 들어 통합을 모니터링하기 위해 사용될 수 있는 선택가능 마커를 코딩하는 유전자로 대체할 수 있다. 일반적으로, 수킬로베이스의 비변형된 플랭킹 (flanking) DNA (5' 및 3' 모두에)가 벡터에 포함된다 [예를 들어, 상동 재조합 텍터에 대한 설명은 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)) 참조]. 상기 벡터는 배아줄기세포주 (예를 들어 전기천공에 의해) 내로 도입되고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포를 선택한다 [예를 들어, Li et al., Cell, 69:915 (1992) 참조]. 이어서, 선택된 세포는 동물 (예를 들어, 마우스 또는 래트)의 포낭에 주사되어 응집 키메라를 형성한다 [예를 들어, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152 참조]. 이어서, 키메라 배아는 적합한 가임신 (pseudopregnant) 암컷 대리모 동물에 착상되고, 배아는 분만하여 "낙아웃" 동물을 생산할 수 있다. 그의 생식 세포에 상동 재조합 DNA를 보유하는 자손체는 표준 기술에 의해 확인되어 동물의 모든 세포가 상동 재조합 DNA를 보유하는 동물을 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 낙아웃 동물은 예를 들어 특정 병태에 대해 방어하는 능력 및 폴리펩티드의 부재에 의한 병태 발생에 대해 특성화될 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 항체를 진단 분석에 사용하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 항체는 특정 세포 및 조직에서 DR5의 발현 또는 과다발현을 검출하기 위한 진단 분석에 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 진단 분석 기술, 예를 들어 생체내 영상 분석, 시험관내 경쟁 결합 분석, 직접 또는 간접 샌드위치 분석 및 불균질 또는 균질상에서 수행되는 면역침전 분석을 사용할 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. 진단 분석에서 사용되는 항체는 검출가능한 잔기로 표지될 수 있다. 검출가능한 잔기는 검출가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 생산할 수 있어야 한다. 예를 들어, 검출가능한 잔기는 방사성 동위원소, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S 또는 125I, 형광 또는 화학발광 화합물, 예를 들어 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린 또는 효소, 예를 들어 알칼린 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다. 문헌 [Hunter et al., Nature. 144:945 (1962); David et al., Biochemistry. 13:1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219-230 (1981); 및 Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407-412 (1982)]에 기재된 방법을 포함하여 항체를 검출가능한 잔기에 컨쥬게이팅시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, DR5 항체는 재조합 세포 배양액 또는 천연 공급원으로부터 DR5의 친화도 정제에 유용하다. 상기 방법에서, DR5에 대한 항체는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적합한 지지체, 예를 들어 Sephadex 수지 또는 여과지 상에 고정된다. 이어서, 고정된 항체는 정제될 DR5를 함유하는 샘플과 접촉한 후, 지지체를 적합한 용매로 세척하고, 이에 의해 고정된 항체에 결합된 DR5를 제외하고 샘플 내의 실질적으로 모든 물질을 제거될 것이다. 마지막으로, 지지체는 항체로부터 DR5를 방출하는 다른 적합한 용매로 세척한다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 병태 치료 또는 DR5의 검출 또는 정제에 유용한 물질을 포함하는 제조품 및 키트가 제공된다. 제조품은 라벨이 존재하는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 병태 치료 또는 DR5의 검출 또는 정제에 효과적인 활성제를 갖는 조성물을 보유한다. 조성물 내의 활성제는 DR5 항체이고, 바람직하게는 DR5에 특이적인 모노클로날 항체를 포함한다. 용기 상의 라벨은 조성물이 병태 치료 또는 DR5의 검출 또는 정제에 사용됨을 나타내고, 또한 상기 설명한 바와 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지침을 나타낼 수 있다.
본 발명의 키트는 상기한 용기 및 버퍼를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 또한, 키트는 상업적인 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 충전제, 바늘, 주사기, 및 지침서와 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제시되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
본원 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 그 전부가 본원에 참고로 포함된다.
하기 실시예에 언급된 시판되는 시약들은 달리 지시되지 않는다면 제조자의 지침서에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 본원 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 나타낸 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (미국 버지니아주 매나서스 소재)이다. 본원에 개시된 많은 시약 및 프로토콜은 그 전부가 본원에 참고로 포함된 WO 99/37684, WO 00/73349, WO 98/32856, WO 98/51793 및 WO 99/64461에 추가로 논의되어 있다.
실시예 1:
항- DR5 항체 변이체의 설계 및 시험
항-DR5 항체 16E2를 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 scFv로서 유도하였고, 이는 1998년 11월 19일 공개된 WO 98/51793 (실시예 14 참조)에 기재되어 있다. scFv 16E2의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 도 5 (서열 9) 및 도 6 (서열 10)에 제시되어 있다. 도 6에서, 시그날 서열 및 중쇄 및 경쇄 CDR 영역이 확인된다 (CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역은 밑줄로 표시되어 있다).
물질 및 방법
전장 항- DR5 항체 16 E2 의 제조
아래에서 설명되는 실험을 위해, 전장 IgG이 필요하다. 따라서, 16E2의 가변 도메인을 전장 IgG1 항체의 포유동물 세포 발현에 적합한, 문헌에 기재된 pRK 벡터 내로 클로닝하였다 (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)). 16E2 가변 도메인의 아미노산 서열을 Kabat 데이타 베이스 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH, 5th edition)와 비교하면, 16E2의 경쇄 가변 영역 (VL)은 인간 람다 경쇄 유전자 패밀리로부터 유도됨을 알 수 있다. 따라서, 16E2의 가변 도메인을 먼저 람다 불변 도메인을 포함하는 벡터 내로 서브클로닝하였다. 제한 효소 부위 SfiI 및 MscI를 부가하도록 PCR 프라이머를 고안한 후, 증폭된 가변 도메인을 상기 2개의 효소로 소화시켰다. 상기 단편을 람다 불변 도메인을 포함하는 유사하게 소화된 벡터 내에 삽입하였다. 상기 벡터는 이. 콜라이에서 Fab의 발현을 위해 고안되었기 때문에, IgG 발현을 위해 전체 경쇄 코딩 영역은 코딩 영역의 5' 말단에 제한 부위 AgeI를, 3' 말단에 HindIII를 부가하는 프라이머를 사용하여 다시 PCR 증폭시켰다. 이어서, 상기 AgeI 내지 HindIII 단편을 유사하게 소화된 벡터 pDR1 (클론테크 (Clontech)) 내에 삽입하였다. 플라스미드 pDR1의 전체 서열은 도 11 (서열 15)에 제시되어 있다.
버젼 1의 중쇄의 경우, scFv 16E2의 중쇄 가변 (VH) 도메인은 도메인의 5' 말단에 PvuII 부위를, 3' 말단에 ApaI 부위를 부가하도록 고안된 프라이머를 사용 하여 PCR 증폭하였다. 이어서, 상기 단편을 완전 중쇄 (VH-CH1-CH2-CH3 도메인)의 발현을 위해 벡터 pDR2 (클론테크)의 PvuII/ApaI 부위 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pDR2의 전체 서열을 도 12 (서열 16)에 제시하였다.
전장 항체 16E2 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 각각 도 7-10 (서열 11-14)에 도시하였다. 특히, 도 7 및 8 (서열 11 및 12)은 전장 16E2 중쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여주고, 도 9 및 10 (서열 13 및 14)은 전장 16E2 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 보여준다. 전장 16E2 항체의 중쇄 및 경쇄는 아래에서 "버젼 1"로도 언급될 것이다.
IgG 변이체의 제조. 부위 지정 돌연변이를 사용하여 경쇄 또는 중쇄에 대한 변이체를 별개로 제조하였다 (Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488-492 (1985)). 경쇄 버젼 1을 코딩하는 플라스미드 pDR1, 또는 중쇄 버젼 1을 코딩하는 pDR2를 데옥시우리딘 함유 단쇄 DNA 주형의 제조를 위해 이. 콜라이 균주 CJ236 (BioRad,Joyce and Grindley, J. Bacterid. 158:636-643 (1984)) 내로 형질전환시켰다. 돌연변이 유발 반응의 분취액을 이중가닥 DNA의 정제를 위해 이. 콜라이 균주 XL-1 Blue (스트라타젠 (Stratagene), 미국 캘리포니아주 샌 디에고) 내로 형질전환시켰다. 각각의 변이체의 경우, 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA의 서열은 ABI377x1, 또는 ABI3730x1 자동 DNA 서열결정기 (퍼킨-엘머 코포레이션 (Perkin-Elmer Corp.))를 사용하여 완전히 결정하였다.
각각의 IgG 변이체에 대해, 일시적 형질감염은 경쇄 발현 플라스미드 및 중쇄 발현 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 (Graham et al., J. Gen. Virol, 36:59-1 A, (1977)) 내로 동시형질감염시켜 수행하였다. 간단히 설명하면, 293 세포를 형질감염 1일 전에 떼어내어, 혈청 함유 배지에 도말하였다. 다음날, 인산칼슘 침전물을 pAdVantage™DNA (프로메가 (Promega), 미국 위스콘신주 메디슨)와 함께 경쇄 및 중쇄의 이중가닥 DNA로부터 제조하고, 플레이트에 적가하였다. 세포를 37℃에서 철야 인큐베이팅한 후, PBS로 세척하고, 4일 동안 혈청 미함유 배지에서 배양하고, 조건화 배지를 수거하였다. 단백질 A-Sepharose CL-4B를 사용하여 항체를 배양 상등액으로부터 정제한 후, 버퍼를 10 mM 숙신산나트륨, 140 mM NaCl (pH 6.0)으로 교환하고, Centricon-10 (아미콘 (Amicon))을 사용하여 농축하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도 측정 또는 정량적 아미노산 분석에 의해 측정하였다.
전기화학발광 DR5 -결합 분석. 항-DR5 항체의 상대적인 결합은 액상의 경쟁-ELISA 포맷으로 결정하였다. DR5-Fc 융합 단백질은 비오틴-X-NHS (리서치 오개닉스 (Research Organics), 미국 오하이오주 클리블랜드)를 사용하여 비오티닐화시키고, 표준 항체 (버젼 1 또는 Apomab 7.3)를 제조사의 지시에 따라 ORI-TAG NHS 에스테르 (이겐 인터내셔날 (IGEN International), 미국 메릴랜드주 게이터스버그)로 표지하였다. 결합 분석을 수행하기 위해, 시험 항체 샘플을 분석 버퍼 (PBS, pH 7.4, 0.5％ BSA 및 0.5％ Tween-20 함유)로 연속 희석하였다. 동일 부피 (각각 25 ㎕)의 항체 샘플 (농도: 50,000 - 0.85 ng/ml), ORI-TAG 표준 항체 (150 ng/ml), 및 비오티닐화된 인간 DR5-Fc (15 ng/ml)를 96 웰 폴리프로필렌 플레이트에 첨가하고, 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1.5 hr 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 자성 스트렙타비딘 비드 (이겐 인터내셔날)를 첨가하고 (25 ㎕/웰), 플레이트를 추가로 30 min 동안 상기한 바와 같이 인큐베이팅하였다. 분석 버퍼를 첨가하여 최종 부피를 웰당 250 ㎕로 만들고, 플레이트를 ORIGEN M384 장치 (이겐 인터내셔날)를 사용하여 판독하였다. IC50 값은 샘플 곡선의 4개의 파라미터 적합도 (fit)를 사용하여 계산하였다.
생물학적 분석: 종양 세포 성장 억제/사멸. 각각의 항체 변이체의 외관상 효능은 시험관내 종양 세포-치사 분석으로 결정하였다. Colo205 인간 결장 암종 세포주를 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 표준물질 (버젼 1 또는 Apomab 7.3) 및 샘플의 2배 연속 희석을, 가교결합 항체 (항-인간 Fc, 염소 친화도-정제된 F(ab')2)가 존재하거나 존재하지 않는, 10 ㎍/ml의 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에서 수행하였다. 이어서, 세포 (20,000/웰)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 총 48 h 동안 37℃에서 인큐베이팅하였다. AlamarBlue를 마지막 3 h의 인큐베이팅 동안 웰에 첨가하였다. 530 nm에서 여기되고 590 nm에서 방출하는 형광측정기를 사용하여 형광을 판독하였다. 데이타는 4개 파라미터의 곡선 적합 (curve-fitting) 프로그램을 사용하여 분석하였다.
결과
상기 작업의 전반적인 목적은 안전성을 훼손하지 않으면서 개선된 생화학적 특성 및 개선된 효능을 갖는 항-DR5 항체를 개발하는 것이었다.
상기 요구되는 개선을 달성하기 위해, 화학적 또는 열 안정성을 개선시키기 위한 DR5 중쇄 및 경쇄의 아미노산 치환; 폴딩 (folding); 결합 또는 폴딩에 중요하여 보다 큰 친화도를 위해 변경될 수 있는 잔기를 결정하기 위한 CDR 잔기의 알라닌 스캐닝; 및 개선된 친화도를 갖는 클론을 확인하기 위한 CDR의 파지 디스플레이 라이브러리의 용도를 포함하여 여러 방법이 사용되었다. 또한, 프레임워크 영역의 변경도 면역원성 및 생물학적 활성에 대한 그의 가능한 효과에 대해 연구되었다.
많은 상기 변경의 선택을 돕기 위해 상동성 모델 (도 19 및 20)을 사용하였다.
중쇄 변이체
시리즈 1
중쇄의 버젼 2는 버젼 1로부터 5가지가 변경된 것이다. 상기 변경 (Q6E, VI1L, E12V, R13Q 및 K105Q)은 가변 도메인의 프레임워크에 존재하고, 프레임워크를 인간 VHIII 컨센서스 서열에 보다 근접하게 만들기 위해 부가되었다. 중쇄 CDR에서 변경되도록 제조된 제1 변이체를 표 1에 제시한다. 상기 돌연변이체의 ssDNA 주형은 버젼 2이었다. 위치 102에서 Leu의 Tyr으로의 변경은 치밀화, 따라서 안정성을 개선시키기 위해 도입되었다. 상기 변경과 조합하여, Asn53은 잠재적인 탈아미드화 부위를 제거하기 위해 Gln 또는 Tyr으로 변경되었다. Met34는 잠재적인 산화 부위를 제거하기 위해 Leu으로 변경되었다. 상기 중쇄 변이체는 본래의 경쇄와 함께 발현되어 버젼 20-23을 생성시켰다 (표 1). 3개의 돌연변이 M34L, N53Q 및 L102Y 및 버젼 2에서와 같은 프레임워크 변경을 포함하는 중쇄는 추후 "삼중변이 중쇄 (triple heavy one)" 또는 TH1로 언급되고, 3개의 돌연변이 M34L, N53Y, 및 L102Y 및 버젼 2의 프레임워크를 갖는 중쇄는 유사하게 TH2로 언급된다.
중쇄 CDR 변이체
버젼a 치환 IC50
변이체
IC50 v1b 		가교결합 존재시의
생물학적 분석 활성c 		가교결합 부재시의
생물학적 분석 활성d
20 N53Q, L102Y 0.11 0.24 *
21 M34L, N53Q, L102Y 0.42 0.54 <1
22 N53Y, L102Y 0.08 1.30 미약
23 M34L, N53Y, L102Y 0.28 4.47 없음
a 주형: 버젼 2
b Origen(등록상표) 경쟁적 인간 DR5 결합 분석
c 종양 세포 억제 분석
d 종양 세포 억제 분석
M34L 돌연변이의 부가시에 결합 및 시험관내 세포 사멸 활성의 감소가 존재하기 때문에 (즉, v20에 비해 v21, v22에 비해 v23, 표 1), Kabat 데이타 베이스를 스캐닝하여 제안된 알라닌 또는 다른 잔기를 치환하는 일련의 추가의 돌연변이를, 주형으로서 중쇄 버젼 20을 사용하여 중쇄 CDR1에 도입하였다. 상기 중쇄는 경쇄 버젼 1과 함께 발현되었다. 돌연변이된 아미노산, v1에 비해 생성되는 결합, 및 상기 버젼에 대한 생물학적 분석 데이타를 표 2에 제시한다. Gly33을 Ala으로 변경하면 결합을 향상시키고 효능을 개선시켰다. 3개의 돌연변이, 즉 G33A, N53Q 및 L102Y를 포함하는 상기 중쇄는 TH3으로 명명한다. 이와 유사하게, G33A, N53Y 및 L102Y를 갖는 TH4를 제조하였다. 또한, Thr28을 Ala으로 변경하면 v1에 비해 활성을 향상시키고, T28A, N53Q, L102Y를 포함하는 중쇄를 TH9로 명명한다. TH1, TH2, TH3, TH4 및 TH9에서 CDR의 변경을 표 5에 요약한다. 상기 5개의 중쇄는 이들을 경쇄 조합물과 함께 동시 발현시킨 후에 추가로 연구하였다 (하기 참조).
CDR H1의 변이체
버젼a 돌연변이 IC50
변이체
IC50 v1b 		가교결합 존재시의
생물학적 분석 활성c 		가교결합 부재시의
생물학적 분석 활성d
111 G26A 0.11 0.42 없음
F27A ND ND ND
112 T28A 0.19 0.8 v1과 동일
127 F29A 7.6 없음
55 D30A 2.2 ND ND
54 D30S 2.1 ND ND
57 D31A >10 ND ND
56 D31S 4.3 ND ND
113 Y32A 1.65 >100 없음
58 G33A 0.1 0.097 미약
59 M34A 0.8 3.49 미약
49 M34I 1.2 14.6 없음
50 M34S 1.0 13.8 없음
S35H ND ND ND
130 S35A ND ND ND
a 모든 변이체의 주형은 버젼 20이다.
b Origen(등록상표) 경쟁적 인간 DR5 결합 분석
c 종양 세포 억제 분석
d 종양 세포 억제 분석
Ala-스캐닝 CDRH2 및 CDRH3 .
중쇄 CDR2 및 CDR3의 각각의 아미노산의 기여도를 추가로 규명하기 위해, 각각의 상기 잔기 대신에 알라닌을 갖는 돌연변이체를 제조하였다. 알라닌 치환을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 부위 지정 돌연변이를, 중쇄 버젼 1을 주형으로서 사용하여 수행하였다. 상기 중쇄는 버젼 1 경쇄를 사용하여 발현되었다. 생성되는 항체의 외관상 친화도 및 효능의 변경을 표 3 및 4에 제시한다. Gly99Ala 및 Arg1OOAla는 각각 개선된 활성을 보이고, 따라서, 상기 변경은 중쇄의 추가의 조합 돌연변이체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
CDRH2의 알라닌 스캐닝
버젼a 돌연변이 v1에 대한
결합 비율b 		가교결합 존재시의
생물학적 분석 활성c 		가교결합 부재시의
생물학적 분석 활성d
139 G50A 3.55 1.91 없음
140 I51A ND ND ND
141 N52A 2.42 ND ND
W52aA ND ND ND
143 N53A ND 0.19 미약
160 G54A 1.49 ND ND
151 G55A 1.0 0.86 >100x 감소
143 S56A 1.1 0.81 v1과 거의 동일
144 T57A 1.2 0.54 >100x 감소
152 G58A 0.55 1.24 ~5x 감소
153 Y59A 2.22 3.42 없음
154 A60A 0.55 0.49 >100x 감소
158 D61A 0.725 ND ND
155 S62A 0.65 0.73 >100x 감소
156 V63A 0.041 ND ~3x 감소
159 K64A ND ND ND
G65A ND ND ND
a 주형: 버젼 1
b Origen(등록상표) 경쟁적 인간 DR5 결합 분석
c 종양 세포 억제 분석
d 종양 세포 억제 분석
CDRH3의 알라닌 돌연변이체
버젼a 돌연변이 v1에 대한
결합 비율b 		가교결합 존재시의
생물학적 분석 활성c 		가교결합 부재시의
생물학적 분석 활성d
108 K102A 1.82 >10 없음
109 I95A 8.38 없음 없음
(1040) L96A ND ND ND
126 G97A 8.52 없음 없음
110 Y98A 24.2 없음 없음
128 G99A 0.09 0.43 ~8x 상승
129 R100A 0.47 0.128 ~4x 상승
116 G100aA 2.84 없음 없음
117 W100bA Na 없음 없음
118 Y100cA 10.85 없음 없음
119 F100dA Na 없음 없음
120 D101A 1.83 ~1 없음
a 주형: 버젼 1
b Origen(등록상표) 경쟁적 인간 DR5 결합 분석
c 종양 세포 억제 분석
d 종양 세포 억제 분석
시리즈 2
프레임워크 잔기 E6, L11, V12, Q13 및 Q105가 버젼 1에서 발견되는 아미노산, 즉 Q6, V11, E12, R13 및 K105로 다시 전환된 제2 시리즈의 중쇄를 버젼 TH1, TH2, TH3 및 TH4와 동일한 CDR을 사용하여 제조하였다. 상기 중쇄는 TH5, TH6, TH7 및 TH8로 언급된다 (표 5 참조).
모든 CDR 루프에서 돌연변이를 갖는 중쇄 변이체
중쇄 돌연변이
조합		 CDR H1의
돌연변이		 CDR H2의
돌연변이		 CDR H3의
돌연변이		 6, 11, 12, 13, 105의
프레임워크 잔기
TH1 M34L N53Q L102Y E, L, V, Q, Q
TH2 M34L N53Y L102Y E, L, V, Q, Q
TH3 G33A N53Q L102Y E, L, V, Q, Q
TH4 G33A N53Y L102Y E, L, V, Q, Q
TH5 M34L N53Q L102Y Q, V, E, R, K
TH6 M34L N53Y L102Y Q, V, E, R, K
TH7 G33A N53Q L102Y Q, V, E, R, K
TH8 G33A N53Y L102Y Q, V, E, R, K
TH9 T28A N53Q L102Y E, L, V, Q, Q
경쇄 변이체
경쇄 CDR 의 알라닌-스캐닝
경쇄의 CDR 잔기의 결합 및 생물학적 활성에 대한 기여도를 이해하기 위해, 각각의 아미노산을 부위 지정 돌연변이를 사용하여 알라닌으로 변경시켰다. 각각의 경쇄 변이체를 상기한 바와 같이 IgG의 일시적 발현을 위해 중쇄 v1과 조합하였다. 경쇄 CDR의 ala 스캔 결과를 표 6에 요약한다. 흥미롭게도, 많은 다른 항체와 달리, CDR L1은 항원 결합시에 유의한 역할을 수행하는 것으로 보인다. 상기 경쇄는 람다 쇄이고, 도 20에 도시된 모델은 CDR1이 알파 나선을 형성할 수 있음을 제시한다. L2 및 L3에서 알라닌으로의 치환은 CDR2에서 G50A가 결합을 해제하는 것을 제외하고는 보다 더 관용성이다. 반대로, 몇몇 ala 치환, 특히 R91A 및 K51A는 결합 및 생활성을 개선시켰다.
Figure 112007063552901-pct00001
유전자 패밀리 잔기 교환
제2 종류의 지정 돌연변이체를 사용하여 경쇄를 연구하였다. 이 방법에서, 모델에서 루프의 어느 한 면에 위치하여 항원 결합에 직접 관여하는 것보다는 지지하는 역할을 수행할 수 있는 것으로 보이는 CDR 잔기를 다른 밀접하게 관련된 람다 유전자 패밀리의 대응하는 위치의 잔기로 교환하였다. 또한, 상기 돌연변이체도 v1 중쇄를 사용하여 발현시켰고, 그 결과를 표 7에 요약한다. CDR L2에서, G50K, K51D의 조합은 결합과 생활성을 모두 유의하게 개선시키고, 4개의 돌연변이, 즉 G50K, K51D, N52S, N53E를 포함하는 조합도 v1보다 개선시킨다. 하나의 잔기 치환만을 수반하는, 동일한 영역의 다른 보다 보존적인 변경은 관용성이 아니었다.
Figure 112007063552901-pct00002
항체-파지 라이브러리를 사용한 친화도 선택
각각의 CDR L1, L2 및 L3에 대해, 파지 디스플레이 라이브러리를 별개로 제작하고, DR5-Ig에 대한 친화도가 증가한 클론을 선택하였다. 모델 조사 결과 (도 20)는 CDR의 어느 잔기가 노출되기 쉬운지를 나타내고, 이 잔기를 무작위화 (randomization)를 위해 선택하였다. 전체 람다 경쇄 및 버젼 1의 VH 도메인을 파지 디스플레이 벡터 pS1602 [Vajdos et al., J. Mol. Biol. 320:415-428 (2002), 및 Sidhu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 11:610-616 (2002)] 내로 클로닝하였다. 쿤겔 (Kunkel) 돌연변이 유발을 라이브러리 제조에 사용하였다. v1 파지미드를 단일가닥 DNA 제조를 위해 이. 콜라이 균주 CJ236 내로 형질전환시키고, 무작위화를 위해 선택된 각각의 부위에 TAA 코돈을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리 주형을 생성시켰다. 이어서, 다의성 (degenerate) 코돈 NNS (여기서, N은 G, A, T 및 C의 동등한 혼합물이고, S는 G 및 C의 동등한 혼합물임)를 사용하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 라이브러리를 제조하였다. 정지 주형 올리고 CA945 및 라이브러리 올리고 CA946을 사용하여 CDRL1을 돌연변이시켰다. CDRL1은 정지 주형 올리고 CA947 및 라이브러리 올리고 CA948을 사용하여 돌연변이시켰다. CDRL3은 정지 주형 올리고 CA949 및 라이브러리 올리고 CA950을 사용하여 돌연변이시켰다. 라이브러리 구성은 표 8에 요약한다.
Figure 112007063552901-pct00003
무작위 돌연변이 반응 생성물을 XLI-Blue 이. 콜라이 세포 (스트라타젠) 내로 전기천공시키고, M13K07 헬퍼 파지와 함께 14-16시간 성장시켜 증폭하였다. 라이브러리 크기는 초기 형질전환이 카르베니실린 플레이트 상에 수행된 경우 연속 희석 및 도말에 의해 평가하였고, 1.9 x 1O9 내지 2.2 x 1O9 클론이었다.
라이브러리를 비오티닐화된 DR5-Ig (제넨테크)를 사용하여 용액에서 4회 팽창시켰다. 약 1011개의 파지를 1시간 동안 실온에서 회전 휠에서 PBS 중의 3％ 탈지분유, 0.2％ Tween의 1 ml 용액 (파지 차단액)으로 차단하였다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해 DR4-IG 및 CD4-IG를 각각 1 마이크로몰로 차단 용액에 첨가하였다. 이어서, 비오티닐화된 항원을 제1 라운드를 위해 100 nM로 첨가하고, 2 h 동안 결합시켰다. 후속 라운드의 팽창시에, 항원 농도는 10, 5 및 1 나노몰로 저하되었다.
항원-결합 파지를 포획하기 위해, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 (다이날 (Dynal))를 먼저 파지 차단액으로 3회 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 1 ml의 파지 차단액으로 차단하였다. 비드를 자석으로 모으고, 15분 동안 항원-파지 용액에 첨가하였다. 이어서, 자석을 사용하여 비드-항원-파지 복합체를 용액으로부터 꺼내었다. 상기 입자를 이어서 파지 차단액으로 3회, PBS-Tween (0.02％ Tween)으로 3회, PBS로 1회 세척하였다. 파지를 100 마이크로리터의 0.1 M HCl로 10분 동안 비드로부터 용출시키고, NaOH로 중화시켰다. 용출된 파지를 사용하여 XL1Blue 이. 콜라이를 감염시키고, 후속 라운드를 위해 상기와 같이 증식시켰다. 세척 엄격도는 각 라운드에서 증가시켰다.
각각의 라이브러리로부터의 클론의 서열을 결정하였다. L1 라이브러리의 경우, 단지 야생형 서열만이 얻어졌고, 이는 상기 CDR이 항원 결합 또는 항체 입체 형태에 중요하고 잠재적인 나선에서의 돌연변이가 거의 관용될 수 없다는 생각을 지지한다. L2 라이브러리의 경우, 어떠한 컨센서스 서열도 발견되지 않았고, 이는 다중 CDRL2 서열이 DR5에 대한 결합을 위해 허용됨을 제시한다. L3 라이브러리의 경우에는, 복수의 서열이 다수회 나타났고, 상기 서열은 올리고-지정 돌연변이 유발을 사용하여 전장 경쇄 벡터에 도입하였다. IgG는 동시-형질감염을 위해 중쇄 버젼 1을 사용하여 다시 293 세포에서 발현되었다. 표 9는 전장 항체로서 발현된 L3 서열, 및 결합 및 생물학적 분석 결과를 설명한다. 버젼 69 및 70 내로 통합된 시험된 2개의 서열은 버젼 1에 비해 결합 및 생활성이 개선된 항체를 생성시켰다.
파지 라이브러리로부터 유도된 경쇄 CDR3의 단백질 서열
버젼a CDR L3 서열 v1에 대한
결합 비율b 		가교결합 존재시의
생물학적 분석 활성c 		가교결합 부재시의
생물학적 분석 활성d
68 NSRDSSGSHVV 1.3 0.973 1.0
69 NSRSYSGNHVV 0.1 0.143 ****
70 NSRSSSGSHVV 0.2 0.152 ***
a 주형: 버젼 1
b Origen(등록상표) 경쟁적 인간 DR5 결합 분석
c 종양 세포 억제 분석
d 종양 세포 억제 분석
조합 경쇄
상기한 바와 같이, 시험관내 결합 및 종양 세포 사멸을 개별적으로 향상시킨 각각의 경쇄 CDR에서 돌연변이를 확인하였다. 이어서, 상기 돌연변이를 조합하여 각각의 CDR에 개선된 복수의 경쇄를 제조하였다. 이를 "삼중 경쇄 (triple light) 1" 등에 대해 TL1, TL2 및 TL3으로 명명하고, 표 10에 나타내었다. 따라서, TL1은 버젼 26에서 확인된 L2 돌연변이 및 버젼 29의 L3 돌연변이와 조합된, 버젼 44에서 확인된 L1 돌연변이를 포함한다. 이와 유사하게, TL2는 v65로부터의 L2 돌연변이 및 v69로부터의 L3 돌연변이와 함께 버젼 44로부터의 L1 돌연변이를 포함하고, TL3은 v44로부터의 L1을 v65로부터의 L2 및 v74로부터의 L3과 조합한 것이다.
경쇄 조합 돌연변이
경쇄 조합 돌연변이, CDR L1 돌연변이, CDR L2 돌연변이, CDR L3
TL1 Q24S G50K, K51D,
N52S, N53E		 H95bY
TL2 Q24S K51A D92S, S93Y
TL3 Q24S K51A R91A
Apomab 명칭
경쇄: TL1 TL2 TL3
중쇄
TH1 Apomab 1.1 Apomab 1.2 Apomab 1.3
TH2 Apomab 2.1 Apomab 2.2 Apomab 2.3
TH3 Apomab 3.1 Apomab 3.2 Apomab 3.3
TH4 Apomab 4.1 Apomab 4.2 Apomab 4.3
TH5 Apomab 5.1 Apomab 5.2 Apomab 5.3
TH6 Apomab 6.1 Apomab 6.2 Apomab 6.3
TH7 Apomab 7.1 Apomab 7.2 Apomab 7.3
TH8 Apomab 8.1 Apomab 8.2 Apomab 8.3
TH9 Apomab 9.1 Apomab 9.2 Apomab 9.3
추가의 Apomab 항체를 표 12에 제시한다.
Apomab
버젼		 위치 6, 11, 12, 13
및 105에서
프레임워크
아미노산 서열		 Apomab 7.3과
비교할 때
DR5에 대한 결합		 Apomab 7.3과
비교할 때
가교결합
존재시의 효능		 가교결합
존재시의
생물학적
분석 활성
7.3* Q VER K 1.00 1 ND
3.3** E LVQ Q 2.50 0.53 없음
18.3 E LVQ K 0.51 0.75 없음
24.3 E VER Q 0.80 1 없음
25.3 Q LVQ K 0.77 1 ~3x 감소
26.3 Q VER Q 0.53 1 ~6x 감소
27.3 E VER K 1.90 1.2 없음
28.3 Q LER K 0.48 0.94 ~5x 감소
29.3 Q VEQ K 0.52 1.2 ~7x 감소
30.3 Q VVQ K 0.78 0.66 ~3x 상승
36.3 Q VVR K 0.66 ND ND
37.3 Q VEN K 0.84 ND ND
38.3 Q LVR K 0.47 ND ND
18.2 E LVQ K 0.11 0.16 없음
24.2 E VER Q 0.14 0.18 없음
25.2 Q LVQ K 0.10 0.13 ~32x 상승
26.2 Q VER Q 0.14 0.22 ~10x 상승
27.2 E VER K 0.10 0.15 없음
* 버젼 1과 동일한 프레임워크
** 인간 컨센서스 VH-III과 동일한 프레임워크
Apomab 발현
삼중 중쇄 및 삼중 경쇄를 유도한 후에, 상기한 바와 같이 각각의 3개의 경쇄를 각각의 9개의 중쇄와 함께 293 세포에 동시형질감염시키고 생성 항체를 정제하여 9 x 3 그리드의 조합 항체를 생성시켰다. 상기 Apomab을 사용한 시험관내 연구는 복수의 버젼이 생물학적 분석에서 큰 효능을 보임을 나타내었다. 따라서, 생체내 마우스 종양 모델 연구에 적합한 물질을 제조하였다.
Apomab 회수 및 정제
수거된 세포 배양 유체 (Harvested Cell Culture Fluid; HCCF)로부터 Apomab 항체를 회수 및 정제하는 방법을 아래에서 설명한다.
Prosep 단백질 A 크로마토그래피 - 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터 생산된 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)의 pH를 1.5 M Tris 염기를 사용하여 7.0으로 조정한 후, 25 mM NaCl/25 mM Tris/5 mM EDTA (pH 7.5)로 평형화시킨 Prosep 단백질 A 컬럼 (밀리포어 (Millipore), 미국) 상에 로딩한다. 비-결합 단백질은 유동시키고, 평형 버퍼로 세척한 후, 평형 버퍼 중의 0.5 M TMAC로 세척하고, 평형 버퍼로 다시 세척하여 제거한다. Apomab 항체는 0.1 M 아세트산의 단계 용출을 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용출시킨다. 컬럼 용리액을 A280으로 모니터링한다. Apomab 항체 피크를 모은다.
SP-Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 - Prosep 단백질 A로부터의 Apomab 항체 풀 (pool)의 pH를 1.5 M Tris 염기로 5.5로 조정하고, 25 mM MOPS (pH 7.1)로 평형화시킨 SP-Sepharose Fast Flow (아머샴 파마시아 (Amersham pharmacia), 스웨덴)의 컬럼 상에 로딩한다. 샘플을 로딩한 후, 컬럼을 A280에서 기준선까지 평형 버퍼로 세척한다. Apomab 항체를 평형 버퍼 중의 0 내지 0.2 M 염화나트륨 (pH 8)의 직선 12 컬럼-부피 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 컬럼 용리액을 A280으로 모니터링한다. 분획을 모으고, SEC-HPLC 분석에 의해 측정시에 적절하게 폴딩된 Apomab 항체를 포함하는 분획을 모은다.
Q-Sepharose Fast Flow 크로마토그래피 - SP-Sepharose 분획의 풀을 이어서 50 mM 염화나트륨/25 mM Tris 버퍼 (pH 8)에 평형화시킨 Q-Sepharose FF (아머샴 파마시아)의 컬럼 상에 로링한다. 컬럼을 평형 버퍼로 세척하고, Apomab 항체를 컬럼 용출액에 수거한다.
UF/DF 제제화 - Q-Sepharose의 풀을 분자량 컷오프 (cut off)가 약 10,000 달톤인 막에 대한 한외여과에 의해 농축한다. 농축된 Q Sepharose FF 풀을 이어서 10 부피의 10 mM 히스티딘/8 ％ 슈크로스 (pH 6)으로 한외여과한다. 한외여과된 Q Sepharose 풀을 0.02％ 폴리소르베이트 20의 최종 농도를 달성하기 위해 10％ 폴리소르베이트 20으로 조건화시킨다. 제제화된 물질을 멸균 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하여 2-8 ℃ 또는 -70℃에서 보관한다. Apomab 항체의 최종 순도는 SDS-PAGE, SEC-HPLC 및 아미노산 서열 분석에 의해 결정한다.
서열결정은 ABI3700 또는 ABI3730 Applied Biosystems 서열결정기로 수행한다. 서열결정 크로마토그램을 Sequencer (젠코드 (GeneCodes), 미국 몬태나주 안 아버) 서열 분석 소프트웨어로 분석한다.
Apomab 의 시험관내 활성 시험
Apomab을 사용한 생체내 연구를 시작하기 전에, 각각의 로트를 상기한 바와 같이 시험관내 활성에 대해 시험하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
Apomab의 시험관내 활성
Apomab
버젼		 버젼 1 (v1)에
비교하여
외관상 친화도의
증가 배수		 버젼 1 (v1)에
비교하여
가교결합 존재시
외관상 효능의
증가 배수		 버젼 1 (v1)에
비교하여
가교결합 부재시
외관상 효능
1.1 11.30 24 없음
1.2 52.10 14 없음
1.3 13.10 6.5 없음
2.1 12.80 5.5 없음
2.2 9.60 3 없음
2.3 29.00 6.5 없음
3.1 15.00 14 없음
3.2 29.20 22 없음
3.3 15.00 8 없음
4.1 25.70 11 없음
4.2 23.10 6 없음
4.3 10.30 12 없음
5.2 26.90 22 ~8x 상승
5.3 2.80 10 ~2.4x 감소
6.2 31.60 6 ~2x 상승
6.3 1.50 4 ~4x 감소
7.2 31.20 22 ~5x 상승
7.3 4.30 16 ~2x 감소
8.2 28.60 9 매우 미약
8.3 8.30 11 ~8x 감소
9.1 21.90 36 없음
9.2 29.90 48 없음
9.3 10.00 ND 없음
실시예 2
Colo 205 인간 결장 암종 이종이식 모델 및 결장직장암 의
다른 이종이식 모델에서 Apomab 항종양 활성의 평가
본 실시예 및 후속 실시예에서 사용된 약어는 다음과 같다.
CR 완전 소실
PR 부분 소실
MTD 최대 내용량
MTV 정중 종양 부피
NTR 비-처리 관련 사멸
LTTFS 장기간 종양 부재 생존자
PBS 포스페이트-완충 염수
q3d x 4 총 4회 투여량에 대해 3일마다 1회
qd x 1 제1일에 제시된 1회 투여량
qd x 5 5일 동안 1일 1회
TFS 종양 부재 생존자
TR 처리 관련 사멸
TTE 종말점까지의 소요 시간
T-C 처리 동물 및 대조 동물의 정중 TTE 값의 차이 (일)
TGD 종양 성장 지연; T-C; 대조군에 비해 처리군의 정중 TTE의 증가,
대체로 대조군에 대한 ％로 표시됨.
2xV0까지의 시간 배가 시간 (DT); 종양 부피가 2배로 되는 시간.
LogCellKill = log10 [Vpre/Vpost] 치료시의 실제 종양 부피의 로그값인 log10(Vpre)와 log10(Vpost)의 차이 (Chenevert et al., Clin. Cancer Res. 3:1457-1466 (1997)).
6-8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리 (Charles River Laboratories))의 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 Colo 205 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 확인을 위해 모든 마우스의 귀에 태그를 부착하였다. 종양 부피가 약 100-200 mm3일 때, Colo 205 종양 보유 마우스를 무작위로 군으로 나누고, 처리제를 투여하였다.
처리 요법은 투여량 3 mg/kg/마우스 또는 10 mg/kg/마우스의 비히클 대조군, 또는 표준 및 시험 항체의 복강내 단일 투여이었다. 일부 예에서, 3 또는 4마리의 마우스를 비히클 및 10 mg/kg 군으로부터 안락사시키고, 혈청 약물 농도 및 종양 조직 연구를 위해 혈청 및 종양을 처리 5분, 24시간 또는 48시간 후에 수집하였다. 나머지 마우스에서, 처음 2주 동안에는 1주에 2회, 이어서 다음 4주 동안에는 1주에 1회 종양을 측정하였다.
Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 얻은 결과를 도 21-25에 도시하였다.
도 21은 각각의 Apomab 5.3, 6.3 및 8.3이 시험된 모든 투여량에서 평균 종양 부피의 감소시에 매우 효과적이고, 그의 효능이 항체 16E2 버젼 1과 필수적으로 동일함을 보여준다.
Apomab 5.2, 6.2, 5.3, 7.2 및 7.3의 단일 복강내 투여량의 효능을 Colo 205 이종이식 무흉선 누드 마우스 모델에서 시험하고, 그 결과를 도 22에 도시하였다. 시험된 모든 Apomab은 종양 부피 감소시에 매우 효과적이었고, 그의 효능은 항체 16B2 버젼 1의 항체와 필수적으로 동일하였다.
유사하게, 도 23에 도시된 결과는 Apomab 5.2, 7.3 및 8.3이 상기 결장직장암 모델에서 종양 부피의 감소에 효과적임을 보여준다. 상기 실험에서, Apomab 및 16E2는 1 mg/kg 및 3 mg/kg의 투여량으로 투여하였지만, 나머지는 상기한 바와 같이 처리하였다. Apomab 7.3 및 8.3의 효능이 특히 현저하고, 20일의 시험 기간 동안 임의의 반전을 보이지 않았다
도 24에 도시된 바와 같이, Apomab 7.3의 항암 활성은 Colo 205 이종이식 모델에서 Apomab 23.3 및 25.3의 활성을 훨씬 초과하였다.
도 25는 Colo 205 마우스 이종이식 모델에서 안정한 일시적 세포주로부터 유도된 Apomab 7.3의 항종양 활성을 비교하는 분석 결과를 보여준다. 간단히 설명하면, 6-8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스에게 상기한 바와 같이 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 Colo 205 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 투여량은 도면에 도시되었다. 도 25의 데이타는 각각 안정한 일시적 세포주로부터 유도된 Apomab 7.3이 Colo 205 마우스 이종이식 모델에서 동등하게 효과적임을 보여준다.
도 26은 결장직장암의 HCT15 이종이식 모델에서 단제요법 또는 80 mg/kg CPT-11 (이리노테칸, 결장직장암 치료를 위한 공지의 약물)과의 조합요법으로서의 Apomab 7.3 (10 mg/kg 투여량)의 항암 활성을 시험하는 실험 결과를 보여준다. 도시된 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, Apomab 7.3 및 CPT-11은 모두 단독 투여시에 효과적이었지만, 이들의 조합 투여시에는 단제요법으로 투여된 Apomab 7.3 및 CPT-11의 활성을 넘어설 정도로 매우 우수한 효과를 보였다.
CPT-11 (이리노테칸)과 조합하여 Apomab 7.3으로 처리한, 육종 LS 180 이종이식편을 보유하는 누드 마우스에서의 대표적인 실험 결과를 도 27에 도시하였다. 다시, 조합 요법은 단일 약제로서의 Apomab 7.3 또는 CPT-11 투여에 비해 매우 우수한 효과를 보이는 것으로 밝혀졌고, 그 차이는 통계적으로 유의한 것이었다 (제2 패널). 비교된 모든 쌍에 대해 Tukey-Kramer P<O.05이었다.
실시예 3
비- 호지킨 림프종의 BJAB 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 항암 활성의 평 가
Apomab 7.3 (10 mg/kg q1 wk)의 단독 투여 및 RITUXAN(등록상표) (리툭시맙, 제넨테크, 인크.) (4 mg/kg, q1 wk)과 조합 투여시의 항암 활성을 비-호지킨 림프종의 BJAB 이종이식 모델에서 평가하였다. 림프종 세포는 SCID 마우스에서 더 잘 성장하는 것으로 알려져 있기 때문에, 6-8주령의 SCDD 마우스 (챨스 리버 래보래토리)를 상기 연구에 사용하였다. 처리 파라미터 및 결과를 도 28에 도시하였다. Apomab 7.3 및 RITUXAN(등록상표)은 조합 투여시에 시너지 활성을 보였다.
실시예 4
인간 췌장 선암종의 BxPC3 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 항암 활성의 평가
암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리)에서 인간 췌장 선암종의 BxPC3 이종이식 모델에서 Apomab 7.3 (10 mg/kg, i.v.)의 단독 투여 및 겜시타빈 (160 mg/kg, ip)과 조합 투여시의 항암 활성을 조사하였다. 처리 파라미터 및 결과를 도 29에 도시하였다. 데이타는 단제요법으로 투여된 Apomab 7.3이 겜시타빈의 효능보다 훨씬 더 우수함을 보여준다. Apomab 7.3 및 겜시타빈의 조합 투여시에는 효능을 더욱 개선시켰다.
실시예 5
인간 폐암의 H460 이종이식 모델에서 단독 투여 및 카르보플라틴 및 탁솔과의 조합 투여시의 Apomab 7.3 항암 활성의 평가
Apomab 7.3 (10 mg/kg, 1x wk, IP)의 단독 투여 및 카르보플라틴 및 탁솔과의 조합 투여시의 항암 활성을 비히클 대조군 및 카르보플라틴 및 탁솔의 조합물과 비교하여 평가하였다. 6마리의 암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리)에게 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 H460 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 확인을 위해 모든 마우스에게 태그를 부착하였다. 종양을 평균 종양 부피가 100-200 mm3가 되도록 성장시킨 후, 도 30에 도시된 바와 같이 처리하였다. 간단히 설명하면, 마우스를 4개의 군으로 나누었다. 제1군은 비히클-처리 대조군 (10 mM 히스티딘, 8％ 슈크로스 및 0.02％ Tween 20 (pH 6))이었다. 제2군은 2주 동안 1x/주로 10 mg/kg/마우스 투여량의 Apomab 7.3으로 IP로 처리하였다. 제3군에는 카르보플라틴 (100 mg/kg/마우스, IP, 0일에 단일 투여량) + 탁솔 (6.25 mg/kg/마우스, s.c, 2주 동안 5일 연속하여 매일)을 투여하였다. 제4군에는 Apomab 7.3 (10 mg/kg/마우스 투여량, IP, 2주 동안 1x/주) + 카르보플라틴 (100 mg/kg/마우스, IP, 0일에 단일 투여량) + 탁솔 (6.25 mg/kg/마우스, s.c, 2주 동안 5일 연속하여 매일)을 투여하였다. 단제요법으로 투여된 Apomab 7.3의 항암 활성을 카르보플라틴 + 탁솔 조합물과 비교하였다. Apomab 7.3 + 카르보플라틴 + 탁솔의 조합 투여는 다른 처리 방식에 비해 훨씬 우수한 것으로 밝혀졌다.
실시예 6
인간 폐암의 H2122 이종이식 모델에서 단독 투여 및 카르보플라틴 및
탁솔과 조합 투여시의 Apomab 7.3의 항암 활성의 평가
상기 연구에서, 암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리, 10 마우스/군)에게 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 H2122 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 확인을 위해 모든 마우스에게 태그를 부착하였다. 종양을 평균 종양 부피가 100-200 mm3가 되도록 성장시킨 후, 4개의 군 (6 마우스/군)으로 나누고, 도 31에 도시된 바와 같이 처리하였다. 제1군은 비히클-처리 대조군 (10 mM 히스티딘, 8％ 슈크로스 및 0.02％ Tween 20 (pH 6))이었다. 제2군에는 카르보플라틴 (100 mg/kg/마우스, IP, 0일에 단일 투여량) + 탁솔 (6.25 mg/kg/마우스, s.c, 2주 동안 5일 연속하여 매일)을 투여하였다. 제3군에는 Apomab 7.3 (10 mg/kg/마우스 투여량, IP, 2주 동안 1x/주)을 투여하였다. 제4군에는 Apomab 7.3 (10 mg/kg/마우스 투여량, IP, 2주 동안 1x/주) + 카르보플라틴 (100 mg/kg/마우스, IP, 0일에 단일 투여량) + 탁솔 (6.25 mg/kg/마우스, s.c, 2주 동안 5일 연속하여 매일)을 투여하였다. 도 31에 도시된 바와 같이, 카르보플라틴 + 탁솔의 조합물은 비히클-처리 대조군에 비해 유의한 항암 활성을 보이지 않았다. 이와 대조적으로, 단제요법으로 투여된 Apomab 7.3은 현저한 항종양 활성을 보였다. Apomab 7.3으로 처리된 6마리의 모든 마우스는 70일의 처리 기간 동안 어떠한 반전도 없이 완전한 반응 (CR)을 보였다. 동일한 활성이 Apomab 7.3 + 카르보플라틴 + 탁솔 조합물로 처리된 군에 관찰되었다.
상기 모델에서 Apomab 7.3의 최대 유효 투여량을 결정하기 위해서, 6-8주령의 암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리)에게 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 H2122 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 확인을 위해 모든 마우스에게 태그를 부착하였다. 종양을 평균 종양 부피가 100-200 mm3가 되도록 성장시킨 후, 무작위로 여러 군 (13 마우스/군)으로 나누고, 아래에서 설명하는 바와 같이 처리하였다. 처리군으로부터 배제된 마우스는 안락사시켰다.
A군은 비히클-처리 대조군 (0.5 M 아르기닌 숙시네이트, 20 mM Tris, 0.02％ Tween 20, pH 7.2)이었다. 비히클은 1주 동안 5x/주로 IP 투여하였다. B군은 1 mg/kg/마우스 단일 IV 투여량으로 Apomab 7.3을 투여하였다. C군은 3 mg/kg/마우스 단일 IV 투여량으로 Apomab 7.3을 투여하였다. D군은 10 mg/kg/마우스 단일 IV 투여량으로 Apomab 7.3을 투여하였다. 제1 처리 48시간 후에, 각각의 B, C 및 D군으로부터 3마리의 마우스를 안락사시키고, 이들의 종양을 다음과 같이 수집하였다. 하나의 종양을 조직학적 연구를 위해 10％ 포르말린에 보관하였다. 하나의 종양을 RNA 연구를 위해 액체 질소로 동결시켰다. 한 종양은 웨스턴 블로트를 위해 액체 질소로 동결시켰다. 종양 측정은 처음 2주 동안에는 2x/주로, 다음 4주 동안에는 1x/주로 실시하였다. 6주 종료시 또는 종양 부피의 근사치가 800-1000 mm3에 도달할 때, 나머지 모든 마우스를 안락사시켰다. 도 32에 도시된 투여량-반응 곡선의 제1 패널은 Apomab 7.3이 시험된 모든 투여량에서 효능을 보였지만, 3 mg/kg 및 10 mg/kg 투여량은 1 mg/kg 투여량에 비해 특유한 (통계적으로 유의하지 않지만) 개선을 보였음을 나타낸다. 비교된 모든 쌍에 대해 Tukey-Kramer P<O.05이었다. (도 32, 제2 패널 참조).
실시예 7
인간 결장직장암 의 Colo 205 이종이식 모델에서
Apomab 23.3, 25.3 및 7.3의 항암 활성의 평가
상기 연구에서, 암컷 무흉선 누드 마우스 (챨스 리버 래보래토리)에게 우측 등쪽 옆구리 영역에 마우스당 5백만 개의 Colo 205 세포를 0.2 ml 부피/마우스로 피하 접종하였다. 확인을 위해 모든 마우스에게 태그를 부착하였다. 종양을 평균 종양 부피가 100-200 mm3가 되도록 성장시킨 후, 7개의 군 (10 마우스/군)으로 무작위로 나누고, 도 33에 도시된 바와 같이 처리하였다. 제1군은 비히클-처리 대조군 (10 mM 히스티딘, 8％ 슈크로스 및 0.02％ Tween 20 (pH 6))이었다. 제2군에는 3 mg/kg/마우스의 i.v. 단일 투여량의 Apomab 7.3을 투여하였다. 제3군에는 10 mg/kg/마우스의 i.v. 투여량의 Apomab 7.3을 투여하였다. 제4군에는 3 mg/kg/마우스의 i.v. 단일 투여량의 Apomab 23.3을 투여하였다. 제5군에는 10 mg/kg/마우스의 i.v. 단일 투여량의 Apomab 23.3을 투여하였다. 제6군에는 3 mg/kg/마우스의 i.v. 단일 투여량의 Apomab 25.3을 투여하였다. 제7군에는 10 mg/kg/마우스의 i.v. 단일 투여량의 Apomab 25.3을 투여하였다. 처리 24시간 후에, 모든 마우스의 체중을 측정하였다. 종양은 처음 2주 동안에는 2x/주로, 다음 4주 동안에는 매주 측정하였다. 6주 후에 또는 종양 크기가 >1000 mm3에 도달할 때, 마우스를 안락사시켰다.
그 결과를 도 33에 도시하였다. 25일 데이타에 도시된 바와 같이, Apomab 7.3 및 Apomab 25.3은 모두 상기 모델에서 유의한 항암 활성을 보였다.
실시예 8
누드 마우스에서 Colo 205 인간 결장암종 이종이식에 대한
모노클로날 항체 Apomab 7.3의 항암 활성의 평가
동물
암컷 무흉선 누드 마우스 (nu/nu, Harlan)는 연구 첫날에 11 또는 12주령이었다. 동물에게 원하는 만큼 물, 및 18.0％ 조질 단백질, 5.0％ 조질 지방 및 5.0％ 조질 섬유로 이루어진 NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet(등록상표)를 공급하였다. 마우스를 21-22℃ 및 40-60％ 습도에서 12시간의 일광 사이클로 고정된 격리기 (microisolator) 내의 방사선 조사된 ALPHA-Dri(등록상표) bed-o'cobs(등록상표) Laboratory Animal Bedding에 수용하였다.
종양 이식
이종이식은 배양된 Colo 205 인간 결장 암종 세포로부터 개시하였다. 종양 세포를 10％ 열 불활성화된 소 태아 혈청, 100 단위/mL 페니실린 G 나트륨, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 술페이트, 0.25 ㎍/mL 암포테리신 B, 및 25 ㎍/mL 겐타마이신, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 10 mM HEPES 및 0.075％ 중탄산나트륨으로 보충된 RPMI- 1640에서 로그 중간기 (mid-log phase)까지 성장시켰다. 세포 배양액을 5％ CO2 및 95％ 공기의 분위기 중에서 37℃에서 가습 인큐베이터 내의 조직 배양 플라스크에 유지하였다. 종양 세포 이식일에, Colo 205 세포를 수거하여 5 x 1O6 세포/mL의 농도로 PBS 중의 50％ 마트리겔 (matrigel) 매트릭스 (비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences))에 재현탁시켰다. 각각의 시험 마우스에게 1 x 106 Colo 205 세포를 우측 옆구리에 피하 이식하고, 종양 성장을 평균 크기가 100 내지 300 mm3에 도달하는지 모니터링하였다. 연구 제1일로 지정된 13일 후에, 개개의 종양 부피는 126 내지 288 mm3이었고, 동물을 각각 평균 종양 부피가 188 mm3인 마우스로 이루어진 6개의 군으로 분류하였다.
시험 물질 및 처리
시험 물질을 투여 동안 빙상에 유지시키고, 이어서 투여 용액을 4℃에서 보관하였다. 비히클 대조군 (제1군)에서, 마우스에게 5일 동안 비히클을 매일 1회 복강내 투여한 후, 2일 동안 휴식시키고, 다시 추가로 5일 동안 1일 1회 투여하였다. 시험군 (제2-4군)에서는, 동물을 Apo2L.O 리간드 (60 mg/kg i.p. 5/2/5 투여계획), Apomab 7.3 (3 mg/kg i.v. 제1일, 8일), 및 항-VEGF 쥐 모노클로날 항체 B20-4.1 (10 mg/kg i.p. 제1일, 8일)로 처리하였다. 제5 및 6군에게는 각각 B20-4.1과 Apo2L.O의 조합물 및 B20-4.1과 Apomab 7.3의 조합물을 투여하였다. 각각의 투여량은 동물의 체중을 측정하여 0.2 mL/20 g (체중) (10 mL/kg)의 부피로 전달하였다.
종말점
종양을 캘리퍼스를 사용하여 매주 2회 측정하였다. 각각의 동물을 그의 종양이 2000 mm3의 부피에 도달하거나 68일차의 연구 종료시 중에서 빨리 도달하는 시점에 안락사시켰다. 종양의 수가 2000 mm3 크기에 도달하지 않기 때문에, 1000 mm3의 종말점 종양 부피를 종양 성장 지연 분석을 위해 선택하였다. 각각의 마우스의 종말점까지의 소요 시간 (TTE)을 다음 식으로부터 계산하였다.
TTE (일)= [log1O(종말점 부피, mm3)-b]M
여기서, b는 인터셉트 (intercept)이고, m은 로그-형질전환된 종양 성장 데이타 세트의 선형 회귀에 의해 얻은 선의 기울기이다. 데이타 세트는 연구 종말점 부피를 초과하는 제1 관찰 및 종말점 부피 도달 직전의 3개의 연속적인 관찰로 이루어졌다. 종말점에 도달하지 않은 동물에게 연구 마지막날과 동일한 TTE 값을 할당하였다. 전이에 의한 처리-관련 사멸 또는 비처리 관련 사멸로 고통받는 동물에게는 사멸 당일과 동일한 TTE 값을 할당하였다. 비처리 관련 사멸 또는 원인 불명의 사멸로 고통받는 동물은 TTE 계산으로부터 배제하였다.
처리 결과는 대조군에 비해 처리군에서 종말점까지의 정중 소요 시간 (TTE)으로 정의되는 종양 성장 지연 (TGD)에 의해 평가하였다.
TGD = T- C (일수로, 또는 다음과 같이 대조군의 정중 TTE의 비유로 표현됨)
％TGD = (T-C)/C x 100
여기서,
T = 처리군의 정중 TTE
C = 대조군의 정중 TTE
처리는 동물에서 종양의 부분 소실 (PR) 또는 완전 소실 (CR)을 야기할 수 있다. PR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3개의 연속 측정치에 대해 그의 제1일차 부피의 50％ 이하이고, 상기 3개의 측정치의 하나 이상에 대해 13.5 mm3과 동일하거나 이보다 더 크다. CR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 상기 3개의 측정치의 하나 이상에 대해 13.5 mm3 미만이다. 연구 종료시에 CR 반응을 보이는 동물은 종양-부재 생존자 (TFS)로서 추가로 분류된다. 소실 반응을 모니터링하고, 기록하였다.
샘플링
종양 샘플을 각각의 군의 동물로부터 종말점에서 채취하였다. 상기 동물을 샘플링 직전에 자궁경부 전위에 의해 안락사시켰다. 군당 3마리의 동물의 종양을 수거하고, 이등분하여 10％ 중성 완충 포르말린에서 12 내지 24시간 동안 실온에서 보존하였다.
통계적 및 그래프 분석
Logrank 시험을 사용하여 처리군과 대조군의 TTE 값 사이의 차이의 유의성을 분석하였다. 투-테일드 (Two-tailed) 통계 분석을 유의 수준 P = 0.05에서 수행하고, 0.01 ≤ P ≤ 0.05에서 유의한 것으로, P < 0.01에서 매우 유의한 것으로 평가하였다.
정중 종양 성장 곡선은 시간의 함수로서 군의 정중 종양 부피를 보여준다. 종양 크기 때문에 연구에서 동물을 배제할 때, 동물에 대해 기록된 최종 종양 부피를 포함시키고, 데이타를 후속 시점에서의 군의 정중 종양 부피 계산에 사용하였다. 카플란-마이어 그래프를 그려 연구에 남은 동물의 비율을 시간의 함수로서 제시하였다. 이 그래프는 Logrank 시험과 동일한 데이타 세트를 사용하였다.
결과
도 34는 상기 연구의 각각의 군에 대한 군의 정중 종양 성장 곡선 (상부 패널) 및 카플란-마이어 그래프 (하부 패널)를 보여준다. 비히클-처리 대조군 마우스의 정중 TTE는 10.0일이었고, 하나의 종양 (10개 중에서)은 1000 mm3 종말점 종양 부피에 도달하지 못하였다. 1일 및 8일에 10 mg/kg i.p.로 투여된 B20-4.1은 통계적으로 유의하지 않은 중등도의 19.9일 (113％) TGD을 생성시켰다. Apo2L.O 및 Apomab 7.3 단제요법은 Colo 205에 대해 효능을 보이고, 각각 28.4일 (190％) 및 53.0일 (355％)의 종양 성장 지연을 생성시켰다. Apo2L.O 또는 Apomab 7.3에 B20-4.1을 첨가할 경우, TGD 또는 소실 반응에 대한 처리 효능이 개선되지 않았다.
실시예 9
SKMES -1 인간 NSCLC 에 대한 모노클로날 항체 Apomab 7.3의
단제요법으로서 및 카르보플라틴 + 파클리탁셀 조합 투여시의 항암 활성의 평가
SKMES-1 인간 NSCLC에 대한 Apo2L.O 리간드 및 Apomab 7.3의 단제요법으로서 및 카르보플라틴 + 파클리탁셀과 조합 투여시의 생체내 항종양 활성을 시험하였다.
동물
암컷 무흉선 누드 마우스 (nu/nu, Harlan)는 연구 1일차에 9 내지 10주령이었고, 체중은 17.4 내지 25.4 g이었다. 동물에게 원하는 만큼 물, 및 18.0％ 조질 단백질, 5.0％ 조질 지방 및 5.0％ 조질 섬유로 이루어진 NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet(등록상표)를 공급하였다. 마우스를 21-22℃ 및 40-60％ 습도에서 12시간의 일광 사이클로 고정된 격리기 내의 방사선 조사된 ALPHA-Dri(등록상표) bed-o'cobs(등록상표) Laboratory Animal Bedding에 수용하였다.
종양 이식
이종이식은 PRC에서 연속 이식에 의해 유지된 SKMES-1 폐 종양으로부터 개시하였다. 각각의 시험 마우스의 오른쪽 옆구리에 1 mm3 SKMES-1 종양 단편을 피하 이식하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 연구 제1일로 지정된 13일 후에, 개개의 종양 부피는 63 내지 144 mm3이었고, 동물을 각각 10마리의 마우스로 이루어진 4개의 군 및 9마리의 마우스로 이루어진 2개의 군으로 분류하였다. 평균 종양 부피는 93 내지 95 mm3이었다.
시험 물질 및 처리
모든 시험 물질을 0.1 mL/20 g (체중) (5 mL/kg)으로 투여하기 위해 준비된 상태로 제공받고, 수령시에 -80℃에서 보관하였다. 시험 물질을 투여 제1일에 해동시키고, 투여 동안 빙상에서 유지한 후, 4 ℃에서 보관하였다. 카르보플라틴 (PARAPLATIN(등록상표) 주사제, 브리스톨 마이어스 스퀴브 (Bristol Myers Squibb))을 0.2 mL/10 g (체중) (10 mL/kg)의 부피로 요구되는 투여량을 제공하기 위해 5％ 덱스트로스 수용액 (D5W)으로 희석하였다. 파클리탁셀 (내쳐럴 파마슈티칼스, 인크. (Natural Pharmaceuticals, Inc.))을 1OX 원액으로부터 매일 투여시에 D5W로 희석하여 90％ D5W 중의 5％ 에탄올 및 5％ Cremophor EL로 이루어지는 비히클 (5％ EC 비히클)을 제조하고, 이를 사용하여 요구되는 투여량을 0.1 mL/20 g (체중)으로 전달하였다.
제1군 (비히클 대조군) 마우스에는 비히클을 5일 동안 매일 1회 복강내 (i.p. qd x 5) 투여하고, 종양 성장 대조군으로 사용하였다. 제2 및 3군의 마우스에는 각각 Apo2L.O (60 mg/kg s.c. qd x 5) 및 Apomab 7.3 (10 mg/kg i.v. qd x 1)을 단제요법으로 투여하였다. 제4군의 마우스에는 카르보플라틴 (100 mg/kg i.p. qd x 1) + 파클리탁셀 (6.25 mg/kg s.c. qd x 5)의 조합물을 투여하였다. 제5 및 6군의 마우스에는 각각 카르보플라틴 + 파클리탁셀을 Apo2L 또는 Apomab 7.3과 조합하여 투여하였다. 각각의 투여량은 이전 섹션에서 나타낸 부피로 투여하고, 동물의 체중을 측정하였다.
종말점 , 샘플링 및 통계적 분석
상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 종말점을 결정하고, 샘플링 및 통계적 분석을 수행하였다.
결과
도 35 및 36은 각각 Apo2L.O 및 Apomab 7.3으로 처리된 군에 대한 정중 종양 성장 곡선 및 카플란-마이어 그래프를 보여준다.
모든 비히클-처리 대조군 마우스의 종양은 18.9일의 정중 TTE으로 1500 mm3 종말점 부피까지 성장하였다. 따라서, 상기 45일 연구에서 달성가능한 최대 TGD는 26.1일 (138％)이었다. 대조군에 대한 정중 종양 성장 곡선 및 카플란-마이어 그래프는 도 35 및 36의 상부 및 하부 패널에 포함된다.
Apo2L.O 처리군 (제2군)의 경우, 정중 TTE는 22.9 일이고, 4.0일 (21％) TGD 및 통계적으로 유의하지 않은 활성에 대응하였다. 도 28 (상부 패널)은 제2군의 정중 종양 부피가 처리 기간 동안 감소한 후, 빠른 종양 성장으로 회복됨을 나타낸다.
제3군의 정중 TTE는 2.0일이고, 7.1일 (38％) TGD 및 통계적으로 매우 유의한 활성 (P = 0.005)에 대응하였다. 어떠한 소실 반응도 관찰되지 않았고, 모든 종양은 1500 mm3 종말점 부피에 도달하였다. 제3군 정중 종양 성장 곡선은 대조군에 비해 종양 성장의 초기 지연을 제시한다.
카르보플라틴 및 파클리탁셀로 처리된 제4군 마우스의 정중 TTE는 26.5일이고, 7.6일 (40％) TGF 및 통계적으로 유의한 활성 (P = 0.01)에 대응하였다. 모든 제4군 종양은 1500 mm3 종말점 부피까지 성장하였고, 소실 반응은 관찰되지 않았다. 제4군 마우스의 정중 종양 성장 곡선은 대조군 마우스에 비해 종양 성장의 중등도의 지연을 나타낸다 (도 35 및 36, 상부 패널 참조).
Apo2L.O, 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 삼중 조합물을 사용한 처리는 32.7일의 정중 TTE를 보였고, 13.9일 (73％) TGD 및 제1군에 비해 매우 유의한 활성에 대응하였다 (P = 0.002). 상기 삼중 조합물에 의한 32.7일 정중 TTE는 Apo2L.O 단제요법군의 22.9일 정중 TTE 또는 화학요법 대조 처리군의 16.5일 정중 TTE보다 길었지만, 이 차이는 Logrank 분석에 의한 통계적 유의성을 갖지 못하였다. 통계적 유의성의 결여에도 불구하고, 정중 종양 성장 곡선은 Apo2L.O 단제요법 또는 카르보플라틴 + 파클리탁셀 화학요법에 비해 제5군 조합물에서 보다 큰 활성을 나타내었다 (도 28, 상부 패널 참조).
Apomab 7.3 (제6군), 카르보플라틴 및 파클리탁셀의 삼중 조합물을 사용한 처리는 3/10 TR 사멸을 야기하고, 따라서, 상기 군은 TGD에 대해 평가할 수 없었다. 그러나, 정중 종양 성장 곡선은 Apomab 7.3 단제요법 또는 카르보플라틴 + 파클리탁셀 화학요법에 비해 제6군 조합물에서 보다 큰 활성을 나타내었다 (도 37, 상부 패널 참조).
결론
상기 실험에서 비교적 높은 사망률에도 불구하고, 데이타는 Apo2L.O 및 Apomab 7.3이 카르보플라틴 및 파클리탁셀을 사용한 처리에 항종양 효과를 부가할 수 있음을 시사한다.
실시예 10
인간 Colo 205 암종 이종이식 모델에서 단제요법으로서의 및 항- VEGF 항체와의
조합 투여시의 모노클로날 항체 Apomab 7.3의 항암 활성의 평가
동물
암컷 무흉선 누드 마우스 (nu/nu, Harlan)는 연구 첫날에 7-8주령이었다. 동물에게 원하는 만큼 물, 및 18.0％ 조질 단백질, 5.0％ 조질 지방 및 5.0％ 조질 섬유로 이루어진 NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet(등록상표)를 공급하였다. 마우스를 21-22℃ 및 40-60％ 습도에서 12시간의 일광 사이클로 고정된 격리기 내의 방사선 조사된 ALPHA-Dri(등록상표) bed-o'cobs(등록상표) Laboratory Animal Bedding에 수용하였다.
종양 세포 배양
인간 Colo 205 결장 암종 세포를 100 단위/mL 페니실린 G 나트륨, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 술페이트, 0.25 ㎍/mL 암포테리신 B, 및 25 ㎍/mL 겐타마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 배지를 10％ 열-불활성화된 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 및 1 mM 중탄산나트륨으로 보충하였다. 종양 세포를 5％ CO2 및 95％ 공기 분위기 하에 37℃에서 가습 인큐베이터 내의 조직 배양 플라스크에서 배양하였다.
생체내 이식
이식에 사용된 인간 Colo 205 암종 세포를 로그기 성장 동안 수거하여 5 x 1O6 세포/mL로 50％ 마트리겔에 재현탁시켰다. 각각의 마우스를 1 x 1O6 세포 (0.2 mL 세포 현탁액)로 우측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양을 매주 2회 모니터링한 후, 그 부피가 100-300 mm3에 도달한 후에는 매일 모니터링하였다. 연구 첫날, 동물을 종양 크기가 108.0-220.5 mm3이고 군 평균 종양 크기가 149.8 mm인 처리군으로 분류하였다. 1 mg이 1 mm의 종양 부피에 대응한다는 가정 하에 종양 중량을 추정할 수 있다.
시험 물질 및 처리
시험 물질을 투여하기 위해 준비된 상태로 제공받았다. 투여 용액을 4℃에서 보관하였다.
마우스를 군당 10마리의 마우스로 이루어진 6개의 군으로 분류하였다. 모든 처리제는 복강내 (i.p.) 투여하였다.
Apo2L.O 및 그의 비히클을 각각 1-5일에 매일 1회 (qd x 5) 투여하였다. Apomab 7.3 및 쥐 항-VEGF 항체 항-G6을 각각 1일에 1회 (qd x 1) 투여하였다. 대조군 1 마우스에는 Apo2L.O의 비히클을 투여하였다. 제2군에는 Apo2L.O 단제요법을 60 mg/kg으로 투여하였다. 제3군에는 Apomab 7.3 단제요법을 3 mg/kg으로 투여하였다. 제4군에는 BY4 단제요법을 5 mg/kg으로 투여하였다. 제5 및 6군에는 각각 5 mg/kg의 항-G6과 조합하여 각각 Apo2L.O을 60 mg/kg, Apomab 7.3을 3 mg/kg 투여하였다. 모든 군에서, 0.2 ml/20 g (마우스)의 투여 부피를 각각의 동물의 체중을 측정하여 투여하였다.
종말점 , 샘플링 및 통계적 분석
상기 실시예 8에 기재된 바와 같이 종말점을 결정하고, 샘플링 및 통계적 분석을 수행하였다.
결과
결과를 도 37에 도시하였고, 여기서 상부 패널의 곡선은 군 정중 종양 부피를 보여주고, 하부 패널의 시간 카플란-마이어 그래프는 각각의 군에 남은 평가가능한 동물의 비율을 시간에 대해 보여준다.
대조군 1 마우스에는 Apo2L.O 비히클을 투여하였고, 모든 처리군에 대한 대조군으로서 기능한다. 10마리의 모든 마우스의 종양은 20.8일의 정중 TTE로 1500 mm3 종말점 부피까지 성장하였다. 따라서, 상기 61일 연구에서 최대로 가능한 TGD는 193％이었다.
제2군에는 Apo2L.O 단제요법을 60 mg/kg으로 투여하였다. 상기 처리는 비히클 대조군에 비해 매우 유의한 항-종양 활성 (P<O.001) 및 53.6일의 정중 TTE를 생성시켰다. 상기 정중 TTE는 32.8일 T-C 및 158％ TGD에 대응한다. 5마리의 마우스에 대한 61일차의 정중 종양 부피는 1,210 mm3이었다. 하나의 LTTFS가 기록되었다.
제3군에는 Apomab 7.3 단제요법을 3 mg/kg으로 투여하였다. 상기 처리는 매우 유의한 활성 (P<O.001), 최대 가능한 193％ TGD 및 776 mm3의 MTV(6)를 생성시켰다. 하나의 LTTFS, 하나의 일시적 CR 반응, 및 3개의 FR 반응이 기록되었다.
제4군에는 항-G6 단제요법을 5 mg/kg으로 투여하였다. 상기 처리는 매우 유의한 활성 (P<O.01), 86％ TGF 및 1,224 mm3의 MTV(3)을 생성시켰다. 어떠한 소실 반응도 기록되지 않았다.
제5군에는 60 mg/kg의 Apo2L.O을 5 mg/kg의 항-G6과 조합하여 투여하였다. 조합 처리는 138％ TGD를 생성시켰다. 항종양 활성은 비히클 처리에 비해 매우 유의하였지만 (P<O.001), 단제요법에 비해서는 유의하지 않았다. 제5군에서, MTV(3)은 1,080 mm3이었고, 하나의 PR 반응이 기록되었다.
제6군에는 3 mg/kg의 Apomab 7.3을 5 mg/kg의 항-G6과 조합하여 투여하였다. 상기 처리는 최대로 가능한 193％ TGD를 생성시켰다. 항종양 활성은 비히클 처리에 비해 매우 유의하였고 (P<O.001), 항-G6 단제요법에 비해 유의하였지만, Apomab 7.3 단제요법에 비해서는 유의하지 않았다. 제6군에서, MTV(8)은 208 mm3이었고, 5개의 PR 반응이 기록되었다.
결론
종양은 3 mg/kg qd x 1 Apomab 7.3 (제3군)의 단제요법에 강하게 반응하였다. 상기 처리는 비히클 대조군에 비해 매우 유의한 활성 및 최대로 가능한 193％ TGD를 생성시켰다. 776 mm3의 MTV로 61일차에 생존한 6마리의 마우스 중에서, 5마리의 동물은 종양 소실을 경험하였다. 상기 단제요법은 하나의 LTTFS, 하나의 일시적 CR 반응, 및 3개의 PR 반응을 생성시켰다. 정중 종양 부피는 제15일차 후까지 증가하지 않았다 (도 37).
Apomab 7.3 및 쥐 항-VEGF 항체 항-G6의 조합 요법은 Apomab 7.3 또는 항-G6 단독 처리시에 관찰되는 것보다 더 큰 활성을 생성시켰다. 상기 조합 처리는 8마리의 61일 생존자를 보였고, 연구의 가장 낮은 MTV, 즉 208 mm3을 생성시켰다. 정중 종양 성장 곡선은 제33일차까지 종양 감소 또는 정체를 보인 후, 매우 느린 종양 성장을 보였다 (도 37). 조합 처리는 항-G6 단제요법보다 유의하게 더 강한 활성을 생성시켰지만, Apomab 7.3 단제요법의 결과와 유의하게 상이하지 않았다. 또한, 조합 처리는 5개의 PR 반응을 생성시킨 반면, Apomab 7.3 단제요법으로 얻은 5개의 소실 반응은 하나의 일시적 CR 및 하나의 LTTFS를 포함한다.
모든 치료제는 잘 관용되었다. 체중 감소 또는 다른 명백한 독성이 연구에서 관찰되지 않았다.
요약하면, Apomab 7.3/항-G6 조합 요법은 대응하는 단제요법 처리보다 더 많은 61일 생존자 및 더 낮은 MTV를 생성시켰다. 그러나, Apomab 7.3/항-G6 조합 처리는 Apomab 7.3 단제요법에서 관찰된 치료 활성을 생성시키지 못하였다.
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aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 300 taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 360 gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa 420 tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa 480 tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc 540 cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg 600 tttagtgaac cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag 660 acaccgggac cgatccagcc tccgcggccg ggaacggtgc attggaacgc ggattccccg 720 tgccaagagt gacgtaagta ccgcctatag agtctatagg cccaccccct tggcttcgtt 780 agaacgcggc tacaattaat acataacctt atgtatcata cacatacgat ttaggtgaca 840 ctatagaata acatccactt tgcctttctc tccacaggtg tccactccca ggtccaactg 900 cacctcggtt ctatcgattg aattccacca tgggatggtc atgtatcatc ctttttctag 960 tagcaactgc aactggagta cattcagaag ttcagctggt ggagtctggc ggtggcctgg 1020 tgcagccagg gggctcactc cgtttgtcct gtgcagcttc tggctactcc tttaccggct 1080 acactatgaa ctgggtgcgt caggccccag gtaagggcct ggaatgggtt gcactgatta 1140 atccttataa aggtgttact acctatgccg atagcgtcaa gggccgtttc actataagcg 1200 tagataaatc caaaaacaca gcctacctgc aaatgaacag cctgcgtgct gaggacactg 1260 ccgtctatta ttgtgctaga agcggatact acggcgatag cgactggtat tttgacgtct 1320 ggggtcaagg aaccctggtc accgtctcct cggcctccac caagggccca tcggtcttcc 1380 ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca 1440 aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg 1500 tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga 1560 ctgtgccctc tagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca 1620 gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc 1680 caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac 1740 ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga 1800 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg 1860 ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca 1920 ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag 1980 ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac 2040 aggtgtacac cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 2100 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc 2160 cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct 2220 acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg 2280 tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta 2340 aatgagtgcg acggccctag agtcgacctg cagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 2400 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 2460 catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 2520 tctggatcga tcgggaatta attcggcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga 2580 ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccatc tgtggaatgt gtgtcagtta 2640 gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2700 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 2760 atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 2820 actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 2880 gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 2940 ggcctaggct tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3000 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg 3060 ccagttggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgtagcc 3120 tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 3180 accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 3240 tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 3300 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 3360 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 3420 tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 3480 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 3540 tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 3600 aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 3660 tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta 3720 tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 3780 tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 3840 tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 3900 cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 3960 tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 4020 taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 4080 tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 4140 gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 4200 gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 4260 cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 4320 tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 4380 tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 4440 atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 4500 ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 4560 gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 4620 gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 4680 gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 4740 gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 4800 gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 4860 cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 4920 atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 4980 tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 5040 ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 5100 gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc 5160 tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 5220 ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 5280 ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 5340 gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 5400 ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 5460 tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag 5520 cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc 5580 agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 5640 agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 5700 gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc 5760 tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt 5820 accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 5880 gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 5940 attcattaat ccaactggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 6000 gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 6060 gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 6120 catgattacg aatta 6135 <210> 17 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gaagttcagc tggtgcagtc tgggggaggt gtggaacggc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt atcaattggc agggtggtag cacaggatat 180 gcagactctg tgaagggccg agtcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaatcctg 300 ggtgccggac ggggctggta cttcgattac tgggggaagg ggaccacggt caccgtctcg 360 agtgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg actgtgccct ctagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggaa 1080 gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 18 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Glu Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Gln Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Leu Gly Ala Gly Arg Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 19 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 19 tctgagctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca 60 tgctcaggag acagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag 120 gcccctgtac ttgtcatcta tggtgcaaac aacaggcctt cagggatccc agaccgattc 180 tctggctcca gctcaggaaa cacagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat 240 gaggctgact attactgtaa ctccgcggac agcagtggta accatgtggt attcggcgga 300 gggaccaagc tgaccgtcct tggccaacct aaggctgcac catctgtcac cctcttcccg 360 ccatcttctg aggagttgca agctaacaaa gccactcttg tgtgcctgat cagtgacttc 420 tatcccggag cggtcacagt agcgtggaag gcggatagct cccccgtaaa ggctggcgtc 480 gagacgacta ccccttcgaa gcagagcaac aacaaatacg ccgccagcag ctacctgtcg 540 ctgaccccag aacagtggaa gagccacaaa agctactcct gccaagtcac ccatgagggc 600 tcgaccgtcg aaaagaccgt cgccccgaca gagtgttct 639 <210> 20 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 20 Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Val Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly 35 40 45 Ala Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ala Asp Ser Ser Gly Asn His Val 85 90 95 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala 115 120 125 Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala 130 135 140 Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val 145 150 155 160 Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser 165 170 175 Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys Ser Tyr 180 185 190 Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala 195 200 205 Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 21 catgccaagg agactaactc agataatatt aagctagctg gtaccagc 48 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 15, 16, 24, 25, 30, 31 <223> n = A,T,C and G <220> <221> misc_feature <222> 17, 26, 32 <223> s = G and C <400> 22 catgccaagg agacnnsctc agannstatn nsgctagctg gtaccagc 48 <210> 23 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 23 gtcatctatg gtaaataata acggccgtct ggcatcccag accg 44 <210> 24 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 19, 20, 22, 23, 25, 26 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 21, 24, 27 <223> s = G and C <400> 24 cttgtcatct atggtaaann snnsnnsccg tctggcatcc cagaccg 47 <210> 25 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 25 gctgactatt actgtaactc ccggtaataa taaggctaac atgtggtatt cggcggagg 59 <210> 26 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> 25, 26, 28, 29, 31, 32, 37, 38 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 27, 30, 33, 39 <223> s = G and C <400> 26 gctgactatt actgtaactc ccggnnsnns nnsggcnnsc atgtggtatt cggcggagg 59 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 27 Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Ser His Val Val 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 28 Asn Ser Arg Ser Tyr Ser Gly Asn His Val Val 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized sequence <400> 29 Asn Ser Arg Ser Ser Ser Gly Ser His Val Val 1 5 10

Claims (76)

  1. 각각 서열 11 및 서열 13의 전장 항체 16E2의 중쇄 및 경쇄에
    (a) 서열 11의 아미노산 서열에 (i) N53Q, L102Y, (ii) M34L, N53Q, L102Y, (iii) N53Y, L102Y, (iv) M34L, N53Y, L102Y, (v) G33A, N53Q, L102Y, (vi) M34L, N53Y, L102Y, (vii) G33A, N53Y, L102Y, (viii) T28A, N53Q, L102Y, 및 (ix) T28A, N53Y, L102Y로 이루어진 군에서 선택된 중쇄 돌연변이 세트, 및
    (b) 서열 13의 아미노산 서열에 (i) Q24S, G50K, K51D, N52S, N53E, H95bY, (ii) Q24S, K51A, D92S, S93Y, 및 (iii) Q24S, K51A, R91A로 이루어진 군에서 선택된 경쇄 돌연변이 세트
    를 포함하는 돌연변이를 포함하고, 전장 항체 16E2보다 DR5에 대한 친화도가 더 크고 암 세포에서 세포자멸(apoptosis)을 활성화 또는 자극할 수 있는,
    항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 전장 항체 16E2와 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 전장 16E2 항체 중쇄 (서열 11) 가변 도메인의 프레임워크에 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  4. 제3항에 있어서, 프레임워크 돌연변이가 Q6E, V11L, E12V, R13Q 및 K105Q로 이루어진 군에서 선택된 것인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  5. 제4항에 있어서, 프레임워크 돌연변이 Q6E, V11L, E12V, R13Q 및 K105Q를 모두 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 11의 아미노산 서열에 G99A 및 R100A 중 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 서열 11의 서열에 돌연변이 G33A, N53Q, L102Y를 포함하고, 서열 13의 서열에 돌연변이 Q24S, K51A, R91A를 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  8. 제1항에 있어서, 서열 11의 서열에 돌연변이 G33A, N53Y, L102Y를 포함하고, 서열 13의 서열에 돌연변이 Q24S, K51A, R91A를 포함하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  9. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단편이 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 항-DR5 항체.
  10. 제9항에 있어서, 단일쇄 항체인 항-DR5 항체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 단편이 Fv 단편인 항-DR5 항체.
  12. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체 16E2보다 항암 활성이 더 큰 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  13. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내 종양 치사 분석으로 결정했을 때 전장 항체 16E2보다 더 높은 효능을 갖는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  14. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  15. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC)을 매개하는 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  16. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이량체 형태인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  17. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항-인간 IgG Fc 영역과 가교결합된 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  18. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 태그 서열에 융합된 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  19. 이종 아미노산 서열에 융합된 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 키메라 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 이종 아미노산 서열이 면역글로불린 서열을 포함하는 것인 키메라 분자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 면역글로불린 서열이 항-인간 IgG Fc 영역인 키메라 분자.
  22. 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  23. 제22항에 있어서, 상기 치료가 암 치료인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  24. 제23항에 있어서, 암이 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택된 것인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  25. 제23항에 있어서, 상기 암이 편평세포암, 소세포 (small-cell) 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 비-호지킨 림프종, 모세포종, 위장암, 신암(renal cancer), 난소암, 간암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 췌장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종 및 두부경부암으로 이루어진 군에서 선택된 것인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 암이 NSCLC, 비-호지킨 림프종, 결장직장암 또는 췌장암인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  27. 제24항에 있어서, 상기 암이 선암종인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  28. 제27항에 있어서, 상기 선암종이 결장직장 선암종, 췌장 선암종 또는 전이성 선암종인 항-DR5 항체 또는 그의 단편.
  29. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산.
  30. 제29항의 핵산을 포함하는 벡터.
  31. 제30항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 DNA가 발현되는 조건하에 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체의 제조 방법.
  33. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체 또는 그의 단편 및 담체를 포함하는, 암 치료용 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 담체가 제약학상 허용되는 담체인 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 추가의 항암제를 추가로 포함하는 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 추가의 항암제가 항체인 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체가 추가의 항-DR5 항체, Rituxan (리툭시맙) 및 항-VEGF 항체로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  38. 제35항에 있어서, 상기 추가의 항암제가 화학요법제인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 화학요법제가 CPT-11 (이리노테칸), 겜시타빈, 카르보플라틴, 탁솔 및 파클리탁셀로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 추가의 항암제가 서열 1의 아미노산 114-281을 포함하는 Apo2L 리간드인 조성물.
  41. 포유동물 암 세포를 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체 또는 그의 단편에 노출시키는 것을 포함하는, 세포자멸의 생체외 유도 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 포유동물 암 세포를, DR5를 활성화시키는 약제에 노출시키는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항의 항-DR5 항체 또는 그의 단편을 포함하는, 포유동물 대상체에서 암을 치료하기 위한 제약 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 포유동물 대상체가 인간 환자인 제약 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 상기 암이 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 비-호지킨 림프종, 모세포종, 위장암, 신암, 난소암, 간암, 위암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 췌장암, 자궁내막 암종, 침샘 암종, 신장암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종 및 두부경부암으로 이루어진 군에서 선택된 것인 제약 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 암이 NSCLC, 결장직장암, 비-호지킨 림프종 또는 췌장암인 제약 조성물.
  47. 제43항에 있어서, 상기 암이 선암종인 제약 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 선암종이 결장직장 선암종, 췌장 선암종 또는 전이성 선암종인 제약 조성물.
  49. 제43항에 있어서, 추가의 항암제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
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