KR20060127409A - 종양 치료 방법 및 스크리닝 검정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 종양 전이를 치료하기 위한 후보 분자를 스크리닝하는 것과, 이러한 분자를 이용한 치료 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 (1) 복수 개의 시험 물질을, 원발성 종양의 존재 또는 부재 하에 하나 이상의 연질 조직 또는 뼈 전이를 수반하는 비-인간 동계 면역적격한 동물 모델에게 투여하는 단계; (2) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 성장과, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한 상기 시험 물질의 효과를 결정하는 단계; 및 (3) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 상태에 대해서 유해한 효과를 나타내지 않으면서, 연질 조직 또는 뼈 전이의 성장을 억제하는 시험 물질을 확인하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 포함한다.
Figure 112006040910914-PCT00004
종양 전이 치료, 연질 조직 또는 뼈 전이, TGF-β 길항제

Description

종양 치료 방법 및 스크리닝 검정{SCREENING ASSAYS AND METHODS OF TUMOR TREATMENT}
본 발명은 일반적으로, 종양 (종양 전이 포함)을 치료하기 위한 후보 분자를 스크리닝하는 것과, 이러한 분자를 이용하는 치료 방법에 관한 것이다.
종양 및 암
고등생물의 진화 과정은 시간적 공간적으로 조절된 세포 분할의 절묘한 패턴을 특징으로 한다. 세포 분할의 정상적인 생리 기능이 붕괴되면, 거의 반드시 해가 된다. 이러한 한 가지 유형의 붕괴가 암인데, 이는 일련의 유전적 사건으로부터 유발될 수 있는 질환이다.
암 세포는 2가지 유전적 특성, 즉 제어 불가능한 수준의 성장과 제어 불가능한 수준의 정상 조직 침습으로써 규정된다. 암성 세포는 세포 내의 정상적인 성장 저해요인을 무시하고 분할하여, 국소 성장 또는 종양을 유발시킬 수 있다. 또한, 몇몇 암 세포는 그들의 초기 부위로부터 벗어나 이동하여 환자의 다른 건강한 조직에 침입할 수 있는 능력을 획득하기도 한다. 이들 2가지 특징이 조합하여 나타나면, 암세포는 특히 위험한 것이 된다. 인간에게서의 암은 다단계 공정을 통하여 발생되는데, 이는 정상 세포를 악성 표현형을 나타내는 세포로 전환시키기 위해서 는 다중적 변화가 일어나야만 한다는 것을 지시해준다. 이에 관여하는 한 가지 부류의 유전자로는, 돌연변이에 의해 활성화되거나 부적절하게 발현되는 경우에, 정상적인 세포성 제어 기전에 우선하여 구속되지 않는 수준으로 세포 증식을 촉진시키는 세포성 종양형성 유전자 (oncogene)가 있다.
제어 불가능한 수준으로 성장하는 분리된 비정상적 세포 집단이 종양 또는 신생물을 유발시킬 것이다. 이러한 신생물이 단일 장소에 있는 한은, 이것은 양성으로 간주되므로, 신생물 덩어리를 외과적으로 제거함으로써 완전한 치유를 기대할 수 있다. 종양 또는 신생물이 악성인 경우, 즉 그의 세포들이 주변 조직에 침입할 수 있는 능력을 갖는 경우에는, 이것이 암으로서 간주된다. 진정한 악성은 세포가 기저판을 가로질러 하부 연결 조직에 침입하기 시작할 때 시작된다. 악성은 세포가 주요 종양 덩어리로부터 이탈하고, 혈류 또는 림프계 혈관 내로 유입하여 신체의 다른 부위에 이차 종양 또는 전이를 형성시킬 수 있는 능력을 획득한 경우에 일어난다. 종양이 보다 광범위하게 전이될 수록, 이를 치료 및 박멸하기가 더 어려워진다.
표피학적 및 임상적 연구로부터 결정된 바와 같이, 대부분의 암은 약한 수준의 양성에서부터 악성 신생물로 서서히 진행된다. 악성 암은 통상적으로, 형성 장애 (dysplasia)로 불리우는 비정상적 성장 특징을 나타내는 양성 국재 세포 집단으로서 시작한다. 비정상적인 세포는 비정상적 성장 특징을 획득하여, 국소성 성장과 팽윤을 나타내는 세포 집단으로서 특징지워지는 신생물이 생성된다. 처치하지 않을 경우, 이러한 신생물은 원 위치에서 악성 신생물로 진행될 수 있다. 형성 장 애 징후가 처음 나타난 뒤부터 말기 악성 암 발병까지는 수년, 또는 10년이 경과될 수도 있다. 이러한 특징적 과정이 수 많은 암에서 관찰되고 있다.
전환 성장 인자-β (TGF-β)
TGF-β는 초파리 (drosophila)와 인간 만큼 다양한 유기체에서의 각종 생물학적 과정을 조절하는데 관여하는 광범위한 성장 인자 슈퍼패밀리 (사이토킨)의 한 구성원이다 [참조: Grande, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 214(1): 27-40 (1997)]. 이러한 과정에는 세포 증식과 분화, 세포외 매트릭스 대사, 뼈 형태발생, 부착, 아폽토시스(apoptosis), 세포 유주, 배아형성, 조직 복구 및 면역계 조정이 포함된다. 사실상, 체내의 모든 세포 (예: 상피, 내피, 상피, 조혈, 신경원 및 결합 조직 세포)는 TGF-β에 대한 수용체를 생성시켜 이를 갖고 있다.
친밀한 TGF-β 패밀리에는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 및 TGF-β5로 명명된 여러 가지 이소형이 존재하는데, 포유류 이소형이 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3이다. 각 이소형은 별개의 유전자에 의해 암호화되고, 조직 특이적이고도 발생적으로 조절된 방식으로 발현된다. 예를 들어, TGF-β1 mRNA는 상피, 내피, 조혈 및 결합 조직 세포에서 광범위하게 발현되는 반면, TGF-β2 mRNA는 주로 상피 및 신경원 세포에서 발현되고, TGF-β3 mRNA는 주로 중간엽 세포에서 발현된다. 이들 포유류 이소형은 종들 간에 고도로 보존되는데, 이는 각 이소형에 대한 중요한 생물학적 기능을 지시해준다. 그들의 유사성에도 불구하고, 이들 이소형은 TGF-β 수용체에 대한 그들의 결합 친화성 측면에서 서로 상이하다.
3가지 포유류 TGF-β 이소형 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 녹아웃 (knockout)으로부터 비롯된 표현형은 극히 별개이며 중복되지 않는다. TGF-β1 기능없는 (null) 마우스는 자가면역-유사 염증 질환을 나타내고, TGF-β2 녹아웃 마우스는 출생전후 사망률과 중증의 발생 결함을 나타내며, TGF-β3-결핍 마우스는 구개열 (cleft palate)이 있고 폐 발생에 결함이 있다. 이는 이들 리간드가 다른 계열 구성원들에 의해서 상쇄될 수 없는 이소형-특이적 활성을 지니고 있다는 것을 지시해준다.
TGF-β 계열 구성원은 유형 I, II 및 III으로서 명명된 3가지 고 친화성 수용체와 결합함으로써 그들의 세포성 작용을 개시한다 (엔도글린은 내피 세포 상에 풍부한 또 다른 TGF-β 수용체이다). 존재하는 경우에 가장 풍부한 형태인 유형 III 수용체 (베타 글리칸으로 불리우기도 함)는, 3가지 TGF-β 이소형 모두와 결합한 다음 이들을 신호 전달 수용체, 유형 I 및 II에 제시함으로써 기능한다. 유형 III 수용체의 가용성 세포외 도메인이 TGF-β 길항제로서 기능할 수 있다 [참고: Vilchis Landeros et al., Biochem. J., 355: 215-222 (2001)]. 유형 I 및 II 수용체의 세포내 도메인은 세린/트레오닌 단백질 키나제를 함유하는데, 이는 "SMADs" [이 용어는 캐노르하브디티스 엘레간스 (Caenorhabditis elegans) 및 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster)에서 확인된 Sma 및 MAD 유전자 상동체로부터 유래된 것이다]로서 지칭된 몇 가지 신호 전달 단백질을 인산화시킴으로써 세포내 신호 전달을 개시시킨다. TGF-β가 유형 III 수용체와 결합한 다음 이러한 TGF-β가 유형 I 및 II 수용체에 제시될 수 있긴 하지만, TGF-β1과 TGF-β3은 유형 II 수용체와 직접적으로 결합할 수도 있다. 리간드가 유형 II 수용체와 결합한 후, 유형 II 수용체는 유형 I 수용체를 동원하고, 이와 결합하여 인산화시킴으로써, 상기 수용체의 단백질 키나제 활성을 자극한다. 이러한 일반적 방식으로, TGF-β는 신호 전달을 개시한다.
TGF-β1은 정량적으로 중요한 이소형이지만, 본질적으로 모든 조직은 3가지 이소형들 중의 하나 이상을 그들의 동족 수용체와 함께 발현한다. 3가지 이소형의 발현 패턴은 발생 동안 및 성체 동물 모두에게서 공간적 및 시간적으로 상이한데, 이는 이들이 중복되지 않는 (필요한) 역할을 한다는 것을 지시해준다. 이러한 개념을 지지하여, 이들 3가지 이소형에 대한 녹아웃 마우스는 중복되지 않는 표현형 스펙트럼을 지니고 있다. 3가지 TGF-β 모두가 발생에 있어 중요하다는 사실은 명백한데, 이는 이들 유전자 중의 어떠한 것을 녹아웃시켜도 일부 배아성 또는 출생전후 치사율이 유발되기 때문이다. (교란되지 않은 동물에서 챌린지에 반응하여) TGF-β의 발현 패턴으로부터, (유전적 조작을 통해서 또는 TGF-β 길항제를 적용함으로써) TGF-β 기능을 손상시킨 마우스의 표현형으로부터, 및 상이한 특수 세포 유형에 대한 TGF-β의 효과를 나타내는 시험관내 연구로부터, 성체 동물에서의 부가적 역할을 추론할 수 있다. 따라서, TGF-β는 세포 증식, 분화 및 프로그램된 세포 사멸, 면역계 기능, 혈관형성, 및 조직 복구를 조절하는데 있어 중요한 역할을 한다. 결과적으로, 많은 질환 과정은 이상한 TGF-β 기능과 연관이 있다. TGF-β 기능 상실은 암, 아테롬성 경화증 및 자가면역 질환의 발병 기전에 밀접한 영향을 끼친 반면, 과도한 TGF-β 생성은 섬유증식성 장애, 기생충 유도된 면역저해, 및 전이에 밀접한 영향을 끼쳤다 [참고: Roberts and Sporn, The Transforming Growth Factors-β, in Sporn and Roberts (eds.), Handbook of Experimental Pharmacology: Peptide Growth Factors and Their Receptors, Springer Verlag, Berlin (1990), at pages 419-472; Flanders and Roberts, Transforming Growth Factor-β, in Oppenheim and Feldmann, Cytokine Reference, Academic Press, London (2000); Dunker and Krieglstein, Eur. J. Biochem., 267: 6982-6988 (2000); Branton and Kopp, Microbes Infect., 1: 1349-1365 (1999); and Chen and Wahl, Microbes Infect.. 1: 1367-1380 (1999)].
TGF-β의 증가 및 감소는 아테롬성 경화증, 및 신장, 간 및 폐의 섬유성 질환을 포함한 수 많은 질환과 연관이 있어왔다. TGF-β, 그의 수용체, 및/또는 TGF-β와 연관된 세포내 신호 전달 분자에 있어서의 유전적 돌연변이 또한, 발병 과정, 특히 암 및 유전성 출혈성 모세혈관 확장증에 있어 중요하다.
TGF-β 이소형은 각종 종양의 종양형성시 복합적인 역할을 한다. 많은 경우에 있어, 종양 세포는 TGF-β에 대한 내성을 지니게 되는데, 이는 종종, (a) 수용체를 암호화하거나, (b) 신호 전달에 직접적으로 관여하는 분자 (SMADS)를 암호화하거나, 또는 (c) 세포 주기 제어에 있어 결정적 역할을 하는 하단 단백질 (예: CDK-억제제, Rb 단백질 등)을 암호화하는 유전자 내에서의 돌연변이에 기인한다. 더우기, 몇 가지 연구 결과는, 종양 세포에서 TGF-β의 분비가 증강되어 인접한 조직의 증식을 억제시킬 수 있다고 보고하였다. 이러한 TGF-β 분비 증강은 혈관형성을 촉진시킬 수도 있다 (VEGF의 생성을 자극함). 양 효과가 종양 성장을 자극한다.
TGF-β는 종양 성장에 직접적으로 (세포 성장과 분화에 영향을 미침) 및 간접적으로 (면역계, 세포외 매트릭스 전환, 및 혈관형성을 조정함) 영향을 미칠 수 있는 다형질성 (pleiotropic) 사이토킨이다. 기존의 데이터는 종양 세포가 TGF-β에 대한 그들의 반응을, 초기 단계 종양에서의 성장 억제성에서부터 후기 단계 종양에서의 프로-전이성으로 변화시킬 수 있다는 사실을 제시하였다 TGF-β 신호 전달 경로는 종양 저해인자 경로로서와, 종양 진행과 침습 촉진인자로서 둘 다 간주되었다 [참고: 예를 들어, Derynck et al., Nat. Genet., 29 (2): 117-129 (2001)].
정상 세포에서는, TGF-β가 세포성 증식을 억제하고/하거나 세포성 분화 또는 아폽토시스를 촉진시킴으로써 종양 저해인자로서 작용할 수 있다. 종양형성 과정 동안에 많은 세포는 그들의 TGF-β-매개성 성장 억제 기능을 상실한다. TGF-β에 의한 성장 억제에 대한 내성이 발생한 후, 종양 세포 및 종양 내의 간질 세포는 종종, 그들의 TGF-β 생성을 증가시킨다. 이와 같이 증가된 TGF-β 생성은 종양 세포의 증가된 침습력과, 종양 세포가 별개의 기관으로 전이되는 것과 연관이 있는데, 이는 적어도 부분적으로는, TGF-β-매개성 혈관형성 자극, 세포 운동성, 면역억제, 및 종양 세포와 세포외 매트릭스 간의 상호 작용 변경에 기인한다. 따라서, TGF-β에 대한 종양 세포 내성과, 이에 수반되는 TGF-β 리간드의 과생성으로 인해, 종양 형성이 증강되고 이들 종양 세포의 공격력이 더 커지게 된다. 실제로, TGF-β 및 이와 연관된 수용체는 건강과 질병에 있어 매우 중요한 역할을 한다.
TGF-β는 상피 세포 증식의 강력한 억제제이고, TGF-β 시스템은 많은 조직 에 있어 종양 저해인자 활성을 지니고 있다 [참고: Gold, Crit. Rev. Oncol., 10: 303-360 (1999); Massague et al., Cell, 103: 295-309 (2000); and Akhurst and Balmain, J. Pathol., 187: 82-90 (1999)]. TGF-β 수용체 또는 하단 신호 전달 성분의 감소 또는 상실이, 위장관, 유방 및 전립선 종양을 포함한 많은 인간 종양 유형에서 관찰된다. 유전 공학적으로 처리시킨 마우스 모델 또는 유전적으로 조작한 종양 세포주의 이종이식편을 사용하여 연구한 결과, TGF-β 기능 저하와 종양형성 증가 간의 인과관계를 확인하였다. 그러나, 종양형성에 있어서의 TGF-β의 역할은 복합적인데, 이는 많은 말기 인간 종양이 전이 증가 및 불량한 예후와 연관이 있는 TGF-β 발현 증가를 나타내기 때문이다. TGF-β는 종양형성 초기에는 종양 저해인자로서 기능하지만, 말기에서는 종양형성 유전자로서 기능하여 공격적인 (침습성이 강한) 전이성 질환의 발병을 촉진시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 전이 촉진에 대한 기전에는 종양 세포 침습력 증강, 혈관형성 증강 및 면역감시계의 저해가 포함되는 것으로 사료된다. TGF-β2 및 TGF-β3이 몇몇 경우에 있어 밀접한 영향을 끼쳐왔긴 했지만, TGF-β1은 말기 인간암에서 가장 흔히 상향 조절되는 이소형이다.
TGF-β 발현은 많은 인간 진행암에서 증가되는데, 이는 침습력 및/또는 전이성 증강과 상관이 있다. TGF-β1 및 TGF-β3은 이에 통상적으로 관여하는 이소형이다. 종종, 혈장 수준의 TGF-β가 진행암 환자에게서 증가되기도 하는데, 이는 종양이 상당량의 TGF-β를 순환계 내로 분비시키고 있다는 것을 지시해준다. TGF-β 발현 상승을 나타내는 종양에는 유방, 결장, 위, 간, 췌장, 전립선, 폐, 신장, 방광 및 비인두 암종, 흑색종, 연골육종 및 골육종이 포함된다.
TGF-β1에 대한 면역조직화학적 염색은 인간 유방암에서의 질병 진행과 연관되고 [참고: Gorsch et al., Canc. Res., 52: 6949-6952 (1992)], 결절 양성도 및 전이성과 상관이 있다 [참고: Walker and Dearing, Eur. J. Canc.. 28: 641-644 (1992)]. 분비된 세포외 TGF-β1 단백질은 원발성 인간 유방 암종의 진행성 가장자리와 림프절 전이에서 증가된다 [참고: Dalal et al., Am. J. Pathol.. 143: 381-389 (1993)]. TGF-β1은 새롭게 진단된 유방암 환자 81%의 혈장에서 증가되고, 그 수준은 결절-양성 환자에게서가 아니라 결절-음성 환자에게서 외과적으로 절제함으로써 표준화시키는데, 이는 원발성 종양 및 전이가 상당량의 TGF-β1을 순환계 내로 분비한다는 것을 제안해준다 [참고: Kong et al., Ann. Surg., 222: 155-162 (1995)]. TGF-β3의 혈장 수준 증가가 양성 림프절을 수반한 유방암 환자에게서 또한 밝혀졌고 [참고: Li et al., Intl. J. Canc., 79: 455-459 (1998)], 침습성 종양에서 양성 TGF-β3 발현과 림프절 관련성의 조합 특성은 불량한 예후과 연관이 있었다 [참고: Ghellal et al., Anticancer Res., 20: 4413-4418 (2000)].
결장암 환자의 경우, 절제된 원발성 종양 내에서의 TGF-β1에 대한 매우 짙은 염색은 질병이 전이로 진행되는 것과 상당한 상관이 있었다 [참고: Friedman et al., Canc. Epidemiol. Biomarkers Prev., 4: 549-554 (1995)]. 또한, 원발성 종양과 비교해서 증가된 수준의 TGF-β1 염색이, 국소 림프절에 침입한 암 세포에서 발견되었고, TGF-β1 수준 상승은 검사된 증례의 75%에서 전이성 과정에 밀접한 영향을 끼쳤다 [참고: Picon et al., Canc. Epidemiol. Biomarkers Prev., 7: 497- 504 (1998)]. 혈장 TGF-β1 및 TGF-β2 수준은 결장직장암 환자에게서 증가되고, 그 수준은 보다 진행된 질환에서 보다 높다 [참고: Tsushima et al., Gastroenterol., 110; 375- 382 (1996); and Bellone et al., Eur. J. Canc., 37: 224-233 (2001)]. 유사하게, TGF-β1 혈장 수준 상승이 간세포 암종 환자에게서 관찰되었고, 그 수준은 종양을 절제한 후 표준화시켰는데, 이는 상기 종양이 TGF-β1의 공급원이었다는 것을 지시해준다 [참고: Shirai et al., Jpn. Canc. Res., 83: 676-697 (1992)]. 위암 조직에서의 TGF-β1에 대한 양성 염색은 장막 침습 및 림프절 전이와 밀접한 관계가 있고 [참고: Maehara et al., J. Clin. Oncol., 17: 607-614 (1999)], TGF-β1의 혈청 수준 상승은 림프절 전이 및 불량한 예후와 상관이 있다 [참고: Saito et al., Anticancer Res., 20: 4489-4493 (2000)]. 또한, TGF-β1, 2 및 3에 대한 mRNAs는 췌장암 증례의 50%에게서 증가되고, 이와 같은 발현 증가는 생존율 감소와 상관이 있다 [참고: Friess et al., Gastroenterol., 105: 1846-1856 (1993)].
TGF-β1 염색 증가는 전립선 암 환자에게서 보다 고악성도 종양 및 전이와 연관이 있다 [참고: Wikstrom et al., Prostate, 37: 19-29 (1998)]. TGF-β1 염색 증가는 환자 생존에 대해 부정적인 예측 인자이다 [참고: Stravodimos et al., Anticancer Res., 20: 3823-3828 (2000)]. 전이가 진행된 원발성 종양은 TGF-β1에 대해 전이가 진행되지 않은 종양보다 고수준의 염색을 나타냈다 [참고: Eastham et al., Lab. Invest., 73: 628-635 (1995)]. 더우기, TGF-β1 혈장 수준은 임상적으로 명백한 전이를 나타내는 환자 [참고: Adler et al., J. Urol., 161: 182- 187 (1999)], 또는 초기 III/IV 질환을 나타내는 환자 [참고: Ivanovic et al., Nat. Med., 1: 282-284 (1995)]에게서 상당히 상승된다.
추출 가능한 TGF-β1 단백질 증가가, 전이를 나타내지 않는 환자와 비교해서 림프절 전이를 나타내는 폐암 환자의 원발성 종양에서 발견되었다 [참고: Hasegawa et al., Canc. 91: 964-971 (2001)]. TGF-β1의 혈장 수준 상승과, 이 보다는 덜한 정도의 TGF-β2의 혈장 수준 상승이, 국소성이 아닌 범발성 (disseminated) 흑색종 질환 환자에게서 발견된다 [참고: Krasagakis et al., Br. J. Canc., 77: 1492-1494 (1998)]. 골육종에서는, TGF-β1 또는 TGF-β3에 대한 면역조직화학적 염색 증가가 보다 높은 비율의 후속 폐 전이와 연관이 있다 [참고: Yang et al., J. Exp. Med., 184: 133-142 (1998)]. TGF-β1 혈장 수준 역시, 연골육종 환자에게서 상당히 상승되고 [참고: Gridley et al., Canc. Detect. Prev., 22: 20-29 (1998)], 신세포 암종 환자에게서 상당히 상승되는데 [참고: Wunderlich et al., Urol. Intl., 60: 205-207 (1998); and Junker et al., Cytokine, 8: 794-798 (1996)], 이는 이들 유형의 종양이 고수준의 TGF-β를 분비한다는 것을 제안하고 있다. 혈청 TGF-β1 수준은 표재성 (얕은) 방광암이 아니라 침습성 방광암 환자에게서 증가되긴 하지만, 전이성 질환 환자에게서는 추가의 증가가 발견되지 않는다 [참고: Eder et al., J. Urol ., 156: 953-957 (1996)]. 혈청 TGF-β1은 또한, 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus)-관련 비인두 암종 환자, 특히 재발성 종양 환자에게서 증가된다 [참고: Xu et al., Intl. J. Canc., 84: 396-399 (1999)].
혈청 무함유 배양물에서 랫트 유방 선암종 세포주를 TGF-β1 단백질로 예비 처리한 결과, 동계 랫트에게 주사한 후의 폐 전이 수가 상당히 증가한 것으로 밝혀졌다 [참고: Welch et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 87: 7678-7682 (1990)]. 원발성 인간 전립선 종양 세포를 TGF-β1 유전자로 형질감염시키는 것이, SCID 마우스에서 동소 (같은 자리) 이식 후의 전이를 자극하는 것으로 밝혀졌다 [참고: Stearns et al., Canc. Res., 5: 711-720 (1999)]. 랫트 전립선 암 세포 [참고: Steiner and Barrack, Mol. Endocrinol., 6: 15-25 (1992)] 및 중국산 햄스터 난소 세포 [참고: Ueki et al., Jpn. J. Canc. Res., 84: 589-593 (1993)]를 이용하여 유사한 결과를 획득하였다.
무흉선 마우스를 TGF-β1, 2 및 3에 대한 중화 항체로 처치하면, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231를 복강내 접종한 후의 폐 전이 형성이 저해된 것으로 밝혀졌다 [참고: Arteaga et al., J. Clin. Invest., 92: 2569-2576 (1993)]. 이와 동일한 항체는, B16F1 흑색종 세포를 동계 마우스의 꼬리 정맥 내로 주사한 경우에 형성된 전이 수를 3배 정도 감소시켰다 [참고: Wojtowicz-Praga et al., J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol., 19: 169-175 (1996)]. 다른 보고서에는, 항-TGF-β1 모노클로날 항체가, 인간 암종 세포주를 무흉선 마우스에게 피하 이식한 후의 전이 발생을 저하시키는 것으로 밝혀졌다 [참고: Hoefer and Anderer, Canc. Immunol. Immunother. 41: 302-308 (1995)]. 이들 3가지 연구 모두에서는, 숙주 동물의 천연 킬러 세포, 단구 또는 림포카인-활성화 킬러 세포에 의한 면역감시에 대한 TGF-β의 저해 효과가 전이 효율 증가에 밀접한 영향을 끼쳤다 또한, 악성 마우스 섬유육종 세포를 TGF-β1에 대한 특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드 로 처치하면, 이들 세포의 전이 특성이 상당히 저하되었는데, 이는 종양 세포 그 자체에 의해 생성된 TGF-β가 전이를 촉진시키는데 있어 중요하다는 것을 제안하고 있다 [참고: Spearman et al., Gene, 149: 25-29 (1994)].
3가지 상이한 실험 시스템에서는, 우세 음성 유형 II TGF-β 수용체로 형질감염시킴으로써 TGF-β에 대한 유방 종양 세포주의 반응성을 저해시키는 것이, 이들 세포의 전이 효율을 상당히 감소시켰다 [참고: McEarchem et al., Int. J. Canc., 91: 76-82 (2001); Oft et al., Curr. Biol., 8: 1243-1252 (1998); and Yin et al., J. Clin. Invest., 103: 197-206 (1999)]. 인간 유방암 세포주 MDA-MB-23 1의 경우에는, 뼈 전이가 상당히 감소되었고 무흉선 마우스를 이용한 이종이식편 모델에서 생존이 연장되었다 [Yin et al., 상기 참고]. 이들 결과는 적어도 유방암에서는 종양 세포 상에서 직접적으로 작용하는 TGF-β가 전이 효율을 증가시킬 수 있다는 것을 제안해준다. 그의 기전에는 침습력 증강과, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드의 생성 증가가 포함된다.
그러나, TGF-β는 균일하게 프로-전이성이 아닌데, 이는 TGF-β로 예비처리하면, 중국산 햄스터 연골육종 세포에 의한 폐 전이 형성이 억제되었고 [참고: Fujisawa et al., J. Exp. Med., 187: 203-213 (2000)], TGF-β3으로 형질감염시키면 랫트 구강 암종 세포주의 전이성 파종 (전파)이 저하되었으며 [참고: Davies et al., J. Oral. Pathol. Med. 29: 232-240 (2000)], 유형 II TGF-β 수용체의 과발현이 K-ras-형질전환된 갑상선 세포의 전이 가능성을 저하시켰기 때문이다 [참고: Turco et al., Intl. J. Canc., 80: 85-91 (1999)]. 이는 전이를 촉진시킬 수 있 는 TGF-β의 능력이 종양 유형에 따라 다양할 수 있다는 것을 제안해 준다.
TGF-β는 많은 기관 시스템에서 정상적인 세포성 생체 항상성을 유지하는데 있어 상기와 같이 중요한 역할을 하기 때문에, TGF-β-구동된 병리 상태를 치료하기 위해 TGF-β 길항제를 사용하는 것에 따른 중요한 개념적 문제점은 정상 조직에 대해 바람직하지 못한 부작용이 발생할 수도 있다는 것인데, 이러한 부작용에는 많은 상피에서 TGF-β의 종양 저해인자 기능 상실로 인한 종양 형성 증가와 이상한 세포 증식 뿐만 아니라 면역계의 조절 장애 (예: 다초점 염증, 자가면역 징후 및 골수성 과형성)에 기인한 문제점이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이들 병리 상태는 실험적으로 손상시킨 TGF-β 기능을 나타내는 마우스에 관한 연구를 기초로 하여 예측한다.
생존을 연장시켜 줄 수 있는 Rag2 기능없는 유전적 배경 상의 TGF-β1 기능없는 (null) 마우스에게서 비-전이성 결장암이 발생하는데 [참고: Engle et al., Canc. Res., 59: 3379-3386 (1999)], 이는 내인성 TGF-β1이 결장 상피에서 종양 저해인자로서 기능한다는 개념과 일치한다. 단지 1개의 기능적 TGF-β1 대립 유전자 만을 갖는 TGF-β1 +/- 마우스는 선위(腺胃)의 과형성을 나타내고 [참고: Boivin et al., Lab. Invest., 74: 513-518 (1996)], 간과 폐에서 발암원-유도된 종양형성에 대한 감수성이 증가된다 [참고: Tang et al., Nat. Med., 4: 802-807 (1998)]. 유사하게, 우세 음성 TGF-β 수용체의 표적화 과발현에 의해 TGF-β 반응성을 저해하면, 과형성이 유발되고 피부와 유선에서 발암원-유도된 종양형성에 대한 감수성이 증가하며 [참고: Amendt et al., Oncogene, 17: 25-34 (1998); and Bottinger et al., Canc. Res., 57: 5564-5570 (1997)], 자발적 유방 종양형성이 증가된다 [참고: Gorska et al., Proc. Am. Assoc. Canc. Res., 42: 422 (2001)].
젖을 뗀 직후, TGF-β 기능없는 마우스는, 림프구와 대식세포를 많은 기관, 특히 심장과 폐로 대량 침윤시켜 주는 다초점 염증성 반응과 연관된 신속한 소모 증후군으로 인해 사망한다 [참고: Shull et al., Nature, 359: 693-699 (1992); and Kulkarni et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 770-774 (1993)]. 상기 증후군은 자가면역 질환의 많은 특징을 지니고 있는데, 이에는 핵 항원으로의 항체 순환, 면역 복합체 침착 및 주요 조직적합성 복합체 항원 (MHCI 및 MHCII)의 발현 증강이 포함된다 [참고: Dang et al., J. Immunol. 155: 3205-3212 (1995)]. 염증이 저해되는 MCH-결핍성 배경에서는, 골수성 과형성이 존재한다 [참고: Letterio et al., J. Clin. Invest.. 98: 2109-2119 (1996)]. 이들 연구는 면역계의 다중 구획 내에서 정상적인 생체 항상성을 유지하는데 있어서의 TGF-β1의 중요한 역할을 제안하고 있다. 이와 일관되게, CD4+ 및 CD8+ T-세포에서 우세 음성 TGF-β 수용체의 트랜스제닉 발현에 의한 TGF-β 반응성 저하는 효과기 T-세포로의 T-세포 분화를 유발시키고, 이는 또한 자가면역-유사 증후군을 선도하는 반면 [참고: Gorelik and Flavell, Immun, 12: 171-181 (2000)], 초기 T 세포에서 우세 음성 수용체의 발현은 CD8+ T 세포 림프증식성 장애를 유발시켜 림프계 기관의 광범위한 팽창을 가져다 준다 [참고: Lucas et al., J. Exp. Med., 191: 1187-1196 (2000)].
수 많은 동물 모델 시스템에서 TGF-β-구동된 병리 상태, 특히 섬유증을 치료하기 위해, 선행 기술 분야에서 TGF-β 길항제 (항체, 다음에 논의된 SR2F, 안티 센스 TGF-β DNA 및 우세 음성 TGF-β 수용체)를 사용하였다. 그러나, 이는 일반적으로, 상기 길항제의 국소 전달을 종종 포함하는, 비교적 단기간 실험이었고, TGF-β 길항제에 대한 장기간 실험 결과는 특히 종양형성과 면역계 기능에 관해 평가하지 못하였다.
TGF-β의 과발현은 수 많은 질환, 특히 섬유성 장애 및 말기 암의 발병 기전에 밀접한 영향을 끼쳤다. TGF-β 길항제를 이용한 초기 연구는 항-TGF-β 항체 또는 천연 발생적 TGF-β 결합성 단백질을 사용하였다. 예를 들어, 항-TGF-β 항체와, TGF-β 결합성 단백질인 프로테오글리칸 데코린 둘 다가, 실험상 신장 섬유증으로부터 보호해주기 위해 랫트 모델에서 성공적으로 사용되었다 [참고: Border et al., Nature, 360: 361-364 (1992); and Border et al., Nature, 346: 371-374 (1990)].
TGF-β는 신호 전달 수용체 복합체와 결합하기 전에 활성화시켜야만 하는 생물학적 잠복성 복합체로서 합성된다. 잠복성은 TGF-β 프로-펩티드의 절단된 전구체 프로-영역을 성숙한 TGF-β와 비-공유적으로 연합시킴으로써 부여한다. 이러한 전구체 프로-영역은 잠복성 관련 펩티드 (Latency-associated peptide; LAP)로서 공지되기도 하고, 정제된 TGF-β1 LAP는 3가지 TGF-β 이소형 모두에 대한 길항제로서 기능할 수 있다 [참고: Bottinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 5877 (1996)].
일반적으로, 항체 및 결합성 단백질에 의거한 길항제는 친화성이 비교적 낮았다. 유형 II TGF-β 수용체의 세포외 리간드-결합성 도메인은 TGF-β1 및 TGF- β3에 대한 높은 친화성 결합 부위를 갖고 있다 [참고: O'Connor-McCourt et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 766: 300-302 (1995)]. 이러한 친화성은 가용성 세포외 리간드-결합성 도메인을, 리간드 결합성 도메인의 이량체화를 유발시켜 주는 인간 면역글로불린의 Fc 도메인과 융합시키는 경우에 추가로 증가된다. Fc 도메인을 가용성 사이토킨 수용체에 부가하면, 그들의 생체내 반감기가 증가되기도 한다 [참고: Capon et al., Nature. 337: 525-531 (1989)]. 가용성 TGF-β 수용체-Fc 융합 단백질 (SR2F)이 수 많은 실험실에서 생성되었고, 이는 디메틸니트로사민에 의해 유도되거나 랫트에서 총담관 (common bile duct)을 결찰시킴으로써 유도된 간 섬유발생; 실험상 사구체신염 모델에서의 섬유증; 마우스에서 방사선 유도된 장병증; 햄스터에서 블레오마이신 유도된 폐 섬유증; 및 랫트 발룬 카테터 박피 모델에서 외막 섬유증 및 혈관내막 병변 형성을 차단 또는 저하시키는데 성공적으로 사용되어 왔다 [참고: Ueno et al., Hum. Gene Ther., 11: 33-42 (2000); George et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 12719-12724 (1999); Isaka et al., Kidney Intl., 55: 465-475 (1999); Zheng et al., Gastroenterol., 110: 1286-1296 (2000); Wang et al., Thorax. 54: 805-812 (1999); and Smith et al., Circ. Res., 84: 1212-1222 (1999)]. 대부분의 경우, SR2F 길항제는 정제된 단백질의 주사제로서 제공되긴 하지만, 2가지 경우에는 cDNA를 근육 내로 도입함으로써 유전자 요법 접근법으로 제공되었다 [Ueno et al., 상기 참고; 및 Isaka et al., 상기 참고]. 상기 저자들은 부적당한 부작용을 전혀 인지하지 못했을 뿐만 아니라 이들 모두는 비교적 단기간 연구였다.
TGF-β는 이를 수용체에 결합시켜 생물학적 반응을 유도시키기 전에 활성화시켜야만 하는 생물학적으로 잠복성인 형태로 합성된다 [참고: Munger et al., Kidney Intl., 51: 1376-1382 (1997)]. 실험적으로 정량적 활성 TGF-β와 잠복성 TGF-β 간을 식별하는 것이 곤란하기 때문에, 생체내 TGF-β 활성화 기전과 환경에 관해서는 공지된 바가 거의 없다. 동결 조직 박편에서 활성 TGF-β와 잠복성 TGF-β를 구별시켜 주는 면역형광 기술을 사용하여, 잠복성 TGF-β의 활성화가 정상 조직의 상피에서 세포에 기준하여 극히 국소적으로 일어날 수 있다는 사실이 최근에 유선에 대해 밝혀졌다 [참고: Barcellos-Hoff and Ewan, Breast Canc. Res, 2: 92-99 (2000)]. 이와는 대조적으로, 병리학적 챌린지에 직면하여 잠복성 TGF-β가 훨씬 더 광범위하게 활성화될 수 있다. 예를 들어, 유선에 방사선을 조사하면, 상피, 상피 주변 간질 및 지방세포 간질에서 TGF-β의 광범위한 활성화가 유발되었다 [참고: Barcellos-Hoff et al., J. Clin. Invest., 93: 892-899 (1994)]. 유사하게, 배양 중인 대다수의 정상 세포는 주로 잠복성 TGF-β를 분비하였지만, 보다 진행된 종양으로부터의 세포는 활성 TGF-β를 다량 분비하였다. 중요하게는, 종양형성 유전자-형질전환된 섬유육종 세포주를 이용한 연구에서는, 활성 형태의 TGF-β를 훨썬 더 많이 분비함으로써 고도로 전이성인 섬유육종을 구별하긴 하였지만, 형질전환된 모든 세포주는 고수준의 총 TGF-β를 분비하였다 [참고: Schwarz et al., Growth Factors, 3: 115-127 (1990)].
2002년 11월 28일자로 공개된 미국 특허공개공보 제2002/0176758호, 및 미국 특허 제5,571,714호; 제5,772,998호; 제5,783,185호; 및 제6,090,383호에는 TGF-β 에 대한 모노클로날 항체 및 이러한 항체의 각종 용도가 기재되어 있다.
2003년 7월 3일자로 공재된 미국 특허공개공보 제2003/0125251호에는 TGF-β 길항제가 "병리학적" TGF-β를 선택적으로 중화시킨다고 기재되어 있다. 구체적으로 언급하면, 가용성 TGF-β 길항제 (SR2F)에 의해 전이를 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 길항제는 인간 IgG의 Fc 도메인과 융합시킨 유형 II TGF-β 수용체의 가용성 세포외 도메인으로 구성된다. 특히, 상기 출원은 TGF-β의 정상적인 생리학적 역할에는 전혀 영향을 미치지 않으면서 전이를 예방하기 위한 SR2F의 용도에 관한 것이다. 따라서, SR2F는 "병리학적" TGF-β 만이 SR2F의 투여에 의해 영향을 받는 방식으로 "생리학적" TGF-β와 "병리학적" TGF-β 간을 식별해준다. 상기 출원에는 또한, 가용성 TGF-β 길항제를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물이 기재되어 있는데, 바람직하게는 이러한 가용성 TGF-β 길항제가 상기 트랜스제닉 동물에서 종양의 전이를 방지시켜 준다.
2003년 2월 6일자로 공개된 미국 특허공개공보 제2003/0028905호는 정상 세포 및 종양 세포에서의 유전자 발현, 및 특히 모든 TGF-β 이소형과 결합하는 TGF-β II 수용체의 돌연변이체 형태에 관한 것이다. 상기 출원은 추가로, 돌연변이된 TGF-β 유형 II 수용체와 연관된 질환, 예를 들어 종양을 진단 및 치료하는데 유용한 진단 및 치료 방법; 및 TGF-β2 암호화 유전자의 제1 엑손 내에 cDNA를 암호화하는 TGF-β1 삽입물을 함유하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비-인간 동물에 관한 것이다.
폐와 결장에서의 탄성 섬유의 부재가 잠복성 TGF-β 결합성 단백질 (LTBP4) 의 구조적 요구를 강조하긴 하지만, 세포외 TGF-β의 결여가 TGF-β 신호 전달에 있어 LTBP4에 밀접한 영향을 끼친다. TGF-β는 특히 결장에서의 상피 세포 증식을 억제시키기 때문에, 결장성 ECM으로부터의 그의 부재가 마우스에서 결장암 발생에 대한 가장 그럴 듯한 발암성 촉발 요인이 된다고 결론지을 수 있다. 실제로, 몇 가지 연구는 TGF-β 신호 전달 상의 결함이 결장직장암과 연관이 있었다는 것을 보여준다. 예를 들어, TGF-β-신호-전달성 단백질 Smad 3에서의 기능없는 돌연변이를 수반한 마우스에게서, 3C7 마우스에서 성장하는 바와 유사한 종양이 발생하였다 [참고: Zhu et al., Cell, 94: 703-714 (1998)]. 더우기, TGF-신호-전달성 단백질 Smad 2 및 Smad 4에서의 돌연변이, 또는 TGF-β3 유형 II 수용체에서의 돌연변이는 인간 결장직장암에서 매우 흔한데, 이는 TGF-β3 및 그의 하단 표적이 종양 저해인자 기능을 지니고 있다는 것을 제안해주고 있다 [참고: Markowitz et al., Science, 268: 1336-1338 (1995); Riggins et al., Cancer Res., 57: 2578-2580 (1997); Zhou et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2412-2416 (1998)].
WO 2003/015505에는 TGF-β 결합성 단백질의 이중 기능을 입증해주는 동물 모델이 기재되어 있다. 이러한 동물 모델은 기능상 잠복성 LTBP를 생성시키지 않거나 또는 최적 수준 이하의 잠복성 전환 성장 인자 결합성 단백질 LTBP를 생성시킨다. 상기 참고 문헌에는 또한, 암, 폐기종 또는 심근병증을 진단하고, 암 및/또는 폐기종 및/또는 심근병증이 LTBP의 시차적 발현에 의해 유발되는지 아니면 LTBP-4 유전자 상의 결함에 의해 유발되는지를 분석하기 위한 방법 및 키트가 기재되어 있다. 상기 특허 출원에는 LTBP-4가 ECM의 원형 보존 (완전성)에 중요하고 발암성 형질전환, 암 세포 침습 및 전이성 확산을 예방시켜 준다고 보고되었다.
미국 특허 제6,455,757호 및 제6,175,057호는 알츠하이머병 (Alzheimer's disease) (AD) 및 CAA에 대한 비-인간 트랜스제닉 동물 모델에 주안점을 두었는데, 이러한 트랜스제닉 동물은 1) 생체활성 전환 성장 인자-β1 (TGF-β1)의 발현을 특징으로 하거나 또는 2) 생체활성 TGF-β1의 발현과 인간 아밀로이드 β 전구체 단백질 (APP) 유전자 생성물의 발현 둘 다를 특징으로 한다.
원발성 종양을 탐지하고 치료하는데 있어서의 기술적 진보로 인해, 암 환자 사망률이 이차 종양 (전이)의 존재 여부와 연계되는 비중이 증가하고 있다. 환자에게서 뼈 전이가 일어나면, 암은 치유 불가능한 것으로 여겨진다.
종양 세포가 일차 부위로부터 이차 부위로 전이되는 데에는 많은 단계가 관여한다. 원발성 종양과 이차 종양에 대한 각종 화합물의 효과를 이해하기 위해서는 동물 연구가 필수적이다. 불행하게도, 많은 종양 세포는 동물 모델에서 특히 뼈로 전이되지 않는다.
따라서, TGF-β의 성장 억제 활성과 프로-전이성 활성을 구별할 수 있게 해주는 동물 모델 시스템을 이용하여 스크리닝하는 방법이 요망된다.
추가로, 이차 종양을 치료하는데 적합한 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 검정을 개발하는 것이 요망된다.
또한, TGF-β 및 TGF-β 억제제 또는 길항제에 대한 상이한 유형과 기의 원발성 및 전이성 종양의 상이한 반응성을 인식하고 이에 역점을 두는, 암, 특히 진행된 전이성 암을 치료하기 위한 새로운 접근법을 개발하는 것이 요망된다. TGF- β 억제제 또는 길항제를 이용한 치료 (처치)에 잘 반응할 것으로 예상되는, 진행된 전이성 암으로 진단된 환자 집단을 확인하는 것이 특히 요망된다.
원발성 종양과 연관되거나 연관되지 않든 간에, 뼈 전이, 및 뼈 파괴 및/또는 뼈 손실에 대한 치료법을 개발하는 것이 추가로 요망된다.
발명의 요약
따라서, 본 발명은 청구된 바와 같다. 한 국면에서, 본 발명은 (1) 복수 개의 시험 물질을, 원발성 종양의 존재 또는 부재 하에 하나 이상의 연질 조직 또는 뼈 전이를 수반하는 비-인간 동계 면역적격한 동물 모델에게 투여하는 단계; (2) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 성장과, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한 상기 시험 물질의 효과를 결정하는 단계; 및 (3) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 상태에 대해서 유해한 효과를 나타내지 않으면서, 연질 조직의 성장 또는 뼈 전이를 억제하는 시험 물질을 확인하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은
(a) 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자로부터 수득한 암 세포의 TGF-β의 성장 억제 효과에 대한 민감성을 시험하는 단계;
(b) 상기 환자로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일을 수득하고, 이를 TGF-β 길항제를 이용한 치료에 대해 반응성인 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 환자로부터 수득한 암 세포가 TGF-β의 성장 억제 효과에 대해 민감하지 않고, 상기 치료에 대해 반응성인 상기 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다면, 이러한 환자는 TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것임을 확인하는 단계
를 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자가 TGF-β 길항제로의 치료로부터 이득이 있을 것인지를 결정하는 방법에 관한 것이다.
암이 원발성 및 전이성 유방암을 포함한 유방암인 경우에는, 전술된 예후 방법이 환자의 Her2 상태를 결정하는 단계 (Her2+ 환자는 항상은 아니지만 전형적으로, TGF-β 길항제 단독 치료에 반응하지 않거나 불충분한 수준으로 반응할 것으로 예상된다)를 부가적으로 포함할 수 있다.
TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것으로 예상되는 것으로 확인된 환자의 암을 이러한 길항제로 치료하는 방법 또한, 본 발명의 범위 내에 속한다.
추가의 국면에서, 본 발명은 포유류 환자에게 유효량의 TGF-β 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 이러한 포유류 환자에게서 종양 전이와 연관된 뼈 파괴 또는 뼈 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제의 병용 요법 유효량을 투여하고; 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는 (상기 병용 요법 유효량은 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합 보다 적다), 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 암이 전이성 유방암을 포함한 유방암인 경우에는, 화학요법제가 예를 들어, 탁소이드 (taxoid), 예를 들면, 파클리탁셀 [paclitaxel (Taxol®)] 또는 탁솔 유도체 [예: 독세탁셀 (doxetaxel) (Taxotere®)]일 수 있다.
화학요법제 또는 세포독성제 대신, 또는 이들 이외에도, 전이성 암이 있는 것으로 진단된 환자에게 TGF-β 길항제를 투여하고 방사선 요법에 노출시킬 수 있다. 구체적으로 언급하면, 본 발명은 또한, TGF-β 길항제와 방사선 요법의 병용 요법 유효량을, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 투여하는 것을 포함하는 (상기 병용 요법 유효량은 TGF-β 길항제와 방사선 요법을 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합 보다 적다), 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 암은 바람직하게 유방 또는 전이성 유방암 또는 결장직장암이고, 상기 방법은 항-혈관신생제를 환자에게 투여하는 것을 부가적으로 포함할 수 있다.
추가의 국면에서, 본 발명은 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 항-혈관신생제의 병용 요법 유효량을 투여하고; 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 항-혈관신생제가 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체이고/이거나 TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 바람직한 양태에서 는, 상기 방법은 환자에게 화학요법제 또는 세포독성제의 유효량을 투여하는 것을 부가적으로 포함한다. 또 다른 국면의 상기 방법에서는, 상기 병용 요법 유효량이 TGF-β 길항제와 항-혈관신생제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합 보다 적다.
추가의 국면에서, 본 발명은 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제의 병용 요법 유효량, 또는 TGF-β 길항제와 방사선 요법의 병용 요법 유효량을, 투여하고; 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단되고 TGF-β 길항제에 반응하지 않거나 불충분한 수준으로 반응하는 것으로 예정된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 암이 유방암이다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 화학요법제가 탁소이드이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 용기; TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 용기; 및 두 항체 모두를 포유류 환자의 암을 치료하는데 유효한 양으로 조합하여 사용하는 것에 관한 지시사항을 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1A 및 1B는 4T1 마우스 유방 암종(mammary carcinoma) 모델에서 원발성 종양 성장 (도 1A) 및 혈장 VEGF (도 1B) 수준에 대한 항-TGF-β 항체의 효과를 도시한 것이다.
도 2는 항-TGF-β 항체를 이용한 처치 후, 대조군과 비교한 4T1 마우스 유방 암종 모델에서의 이차 폐 종양의 조직학 스코어 (score)를 도시한 것이다.
도 3은 항-TGF-β 항체를 이용한 처치 후, 대조군과 비교한 4T1 마우스 유방 암종 모델에서의 이차 폐 종양의 조직 중량을 도시한 것이다.
도 4는 항-TGF-β 항체를 이용한 처치 후 (보다 짙은 막대), 대조군 (보다 흐린 막대)과 비교한 4T1 마우스 유방 암종 모델에서의 이차 폐 종양의 컴퓨터 단층촬영 (CT) 값을 도시한 것이다.
도 5A 및 5B는 4T1 마우스 유방 암종 모델에서 원발성 종양의 확산으로부터 비롯되는 뼈 전이 (도 5B) 및 정상적인 해면 뼈조직 (도 5A)의 마이크로CT (x-선 마이크로-단층촬영술) 영상을 도시한 것이다.
도 6은 트라스투주마브 [trastuzumab (HERCEPTIN®)]-민감성 Her2+ 유방암 (세포주 F2-1282)의 마우스 모델에서 원발성 종양 성장에 대한 항-TGF-β 항체 처치 효과를 도시한 것이다.
도 7은 트라스투주마브-민감성 Her2+ 유방암 (세포주 F2-1282)의 마우스 모델에서 혈장 VEGF 수준에 대한 항-TGF-β 항체 처치 효과를 도시한 것이다.
도 8은 트라스투주마브-내성 Her2+ 유방암 (세포주 Fo5)의 마우스 모델에서 원발성 종양 성장에 대한 항-TGF-β 항체 처치 효과를 도시한 것이다.
도 9는 트라스투주마브-내성 Her2+ 유방암 (세포주 Fo5)의 마우스 모델에서 혈장 VEGF 수준에 대한 항-TGF-β 항체 처치 효과를 도시한 것이다.
도 10 및 11은 항-TGF-β 항체를 이용한 처치가 2마리 흑색종 마우스 모델 (각각 F10 및 BL6)의 생존율을 증가시킨다는 것을 예시한 것이다.
도 12 및 13은 흑색종 마우스 모델에서 이차 폐 종양의 영상이다 (각각 마이크로CT 및 광 영상).
도 14 및 15는 흑색종 마우스 모델에서 이차 폐 종양의 영상이다 (각각 마이크로CT 및 광 영상).
도 16은 항-TGF-β 항체를 이용한 처치가 흑색종 마우스 모델에서 이차 폐 종양의 수를 감소시킨다는 것을 도시한 것이다.
도 17은 항-TGF-β 항체을 이용한 처치가 흑색종 마우스 모델에서 폐 종양의 발생수를 감소시킨다는 것을 도시한 것이다.
도 18A 및 18B는 IgG 대조군에 비해, PyMT 종양의 용적 (도 18A) 및 중량 (도 18B)에 대한 항-TGF-β 항체 처치 효과를 도시한 것이다. 도 18B에서, 우측 막대가 항-TGF-β 항체이고, 좌측 막대가 IgG 대조군이다.
도 19A 및 19B는 뮤린 모노클로날 항체 2G7의 가변 경쇄 (VL) (도 19A) 및 가변 중쇄 (VH) (도 19B) 도메인의 아미노산 서열 (각각 서열 1 및 2); 인간화 huxTGFB 버젼의 VL 및 VH 도메인 (V5H.V5L)의 아미노산 서열 (각각 서열 3 및 4); 및 인간 VL 및 VH 컨센서스 프레임워크 (hum κ1, 경쇄 카파 소그룹 I; humIII, 중쇄 소그룹 III)의 아미노산 서열 (각각 서열 5 및 6)의 정렬을 도시한 것이다. 별표는 인간화 huxTGFB와 뮤린 모노클로날 항체 2G7 간의 차이, 또는 인간화 huxTGFB 와 인간 컨센서스 프레임워크 영역 간의 차이를 확인시켜 준다. 상보성 결정 영역 (CDRs)이 밑줄쳐져 있고, 실제적 인간 생식세포계 서열의 CDRs은 비교를 위해 컨센서스 프레임워크 영역 아래에 있다 (서열 7 내지 10).
도 20은 다양한 CDR 영역 (서열 18 내지 24)을 암호화하는 DNA 서열 (서열 11 내지 17)을 도시한 것이다.
도 21은 709.landH.IgG1의 아미노산 서열 (서열 25); H2Nl.V5L의 아미노산 서열 (서열 26); V11H.V11L의 아미노산 서열 (서열 27); V5H.V5L의 아미노산 서열 (서열 28); chimL.chimH의 아미노산 서열 (서열 29); 및 V5H.glL2의 아미노산 서열 (서열 30)을 도시한 것이다.
도 22는 도 21의 서열을 암호화하는, 신호 서열을 수반하거나 수반하지 않는 핵산 서열 (서열 31 내지 42)을 도시한 것이다.
도 23은 실시예 2에 기재된 바와 같이 면역글로불린 경쇄를 발현시키기 위한 플라스미드 pDR1의 서열 (서열 44; 5391 bp)을 도시한 것이다. pDR1은 무관한 항체를 암호화하는 서열과, 인간화 항-CD3 항체 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)]의 경쇄를 함유하는데, 그에 대한 출발 및 중지 코돈이 진하게 밑줄쳐져 있다.
도 24는 실시예 2에 기재된 바와 같이 면역글로불린 중쇄를 발현시키기 위한 플라스미드 pDR2의 서열 (서열 45; 6135 bp)을 도시한 것이다. pDR2는 무관한 항체를 암호화하는 서열과, 인간화 항-CD3 항체 [Shalaby et al., 상기 참고]의 중쇄를 함유하는데, 그에 대한 출발 및 중지 코돈이 진하게 밑줄쳐져 있다.
I. 정의
본원에 사용된 바와 같은 "TGF-β"는 모든 이소형의 TGF-β를 지칭한다. 현재에는 5가지 이소형의 TGF-β(1-5)가 공지되어 있으며, 이들 모두는 상동성이고 (60 내지 80% 동일률) 약 25 KD의 동종-이량체를 형성하고 통상의 TGF-β 세포성 수용체 (유형 I, II 및 III) 상에서 작용한다. TGF-β의 유전적 및 분자 생물학은 당해 분야에 널리 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Roberts, Miner. Electrolyte and Metab., 24 (2-3): 111-119 (1998); Wrana, Miner. Electrolyte and Metab., 24 (2-3): 120-130 (1998)].
본원에 사용된 바와 같은 "생체활성 TGF-β1"은 모든 생물학적 활성 형태의 TGF-β1 폴리펩티드, 예를 들어 TGF-β1 프로-펩티드의 223 및 225 위치에서 시스테인 대신 세린을 갖는 TGF-β1 [참고: Samuel et al., EMBO J., 11: 1599-1605 (1992); Brunner, J. Biol. Chem., 264: 13660 (1989)], 또는 그들의 생물학적 활성 부분, 이소형, 동족체, 변이체 또는 유사체를 포괄한다.
용어 "길항제"는 "본래의" 또는 "천연" 화합물의 작용을 억제하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 길항제는 입체 형태, 전하 또는 기타 특징 측면에서 이들 천연 화합물과 상동성일 수 있거나 상동성이 아닐 수 있다. 따라서, 길항제는 효능제에 의해 인식되는 동일하거나 상이한 수용체에 의해 인식될 수도 있다. 길항제는 효능제의 작용을 방지시켜 주는 알로스테릭 (allosteric) 효과를 나타낼 수 있거나, 길항제는 효능제의 기능을 방지시킬 수 있다. 효능제와는 달리, 길항제 화합물은 세포 내에 생리학적 및/또는 생화학적 변화를 가져다 주지 않으므로, 이러한 세포는 천연 화합물이 존재하는 경우와 동일한 방식으로 길항제의 존재에 대해 반응한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "TGF-β 길항제"는 특정 세포 또는 생리학적 시스템 내에서, TGF-β의 양 또는 활성을 저하시킬 수 있는 모든 작용제 (예: 천연 또는 합성 작용제, 생체 분자 또는 유기 화합물 등)를 지칭한다. 바람직하게는, TGF-β 길항제가 TGF-β1, 2 또는 3의 양 또는 활성을 저하시키는 작용을 한다. 예를 들어, TGF-β 길항제는 전사, 해독, 프로세싱 또는 수송 수준에서 TGF-β의 발현을 억제하는 분자일 수 있거나; 이는 TGF-β의 안정성 또는 전구체 분자의 성숙한 활성 형태로의 전환에 영향을 미칠 수 있거나; 하나 이상의 세포성 수용체 (예: 유형 I, II 또는 III)와 결합할 수 있는 TGF-β의 능력에 영향을 미칠 수 있거나; 또는 TGF-β 신호 전달 경로를 특이적으로 억제함으로써, TGF-β 수용체의 수준에서 정상적으로 TGF-β-매개된 세포성 반응의 억제를 통하여 (예를 들어, 수용체에 대한 TGF-β 결합을 차단시키거나 또는 결합된 TGF-β에 의한 신호 전달 유도를 억제함으로써), TGF-β 신호 전달 경로에서 특정 인자와의 상호 작용을 통하여, 또는 TGF-β에 의해 정상적으로 매개된 세포성 반응 저하를 제공하기 위해 TGF-β 신호 전달 경로를 기타 방식으로 억제함으로써, TGF-β 신호 전달을 방해할 수 있다.
TGF-β 길항제에는 TGF-β의 하나 이상의 이소형, 예를 들어 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3에 대항하여 지시된 항체 [이에는 TGF-β의 하나 이상의 이소형에 대항하여 지시된 모노클로날 및 폴리클로날 항체 (참고: Dasch et al., U. S. Pat. No. 5,571,714; WO 97/13844 and WO 00/66631), 키메라, 인간화 및 인간 항체가 포함된다]; TGF-β와 결합하는 TGF-β 수용체, 예를 들어 우세 음성 TGF-β 및 그의 가용성 형태 및 단편, 특히 TGF-β 유형 II 수용체 (TGFBIIR) 또는 TGF-β 유형 III 수용체 (TGFBIIIR, 또는 베타글리칸) [이들은 예를 들면, TGFBIIR 또는 TGFBIIIR의 세포외 도메인을 포함한다], 가장 바람직하게는 재조합 가용성 TGF-β 수용체 (rsTGFBIIR orrsTGFBIIIR) [이들 모두는 본원에서 입증된 바와 같이, 유전자 전이를 통하여 효과적으로 도입될 수 있다]; TGF-β 수용체에 대항하여 지시된 항체 [참고: Segarini et al., U.S. Pat. No. 5,693,607; Lin et al., U.S. Pat. No. 6,001,969, U.S. Pat. No. 6,010,872, U.S. Pat. No. 6,086,867, U.S. Pat. No. 6,201,108; WO 98/48024; WO 95/10610; WO 93/09228; WO 92/00330]; SR2F 수용체 항체, 안티센스 TGF-β DNA; 잠복성 관련 펩티드 [참고: WO 91/08291]; 광범위한 잠복성 TGF-β [참고: WO 94/09812]; TGF-β-억제성 프로테오글리칸, 예를 들어 페투인 (fetuin) [참고: U.S. Pat. No. 5,821,227], 데코린 및 기타 프로테오글리칸, 예를 들어 비글리칸, 피브로모둘린, 루미칸 및 엔도글린 [참고: WO 91/10727; Ruoslahti et al., U.S. Pat. No. 5,654,270, U.S. Pat. No. 5,705,609, U.S. Pat. No. 5,726,149; Border, U.S. Pat. No. 5,824,655; WO 91/04748; Letarte et al., U.S. Pat. No. 5,830,847, U.S. Pat. No. 6,015,693; WO 91/10727; WO 93/09800; and WO 94/10187]; 소마토스타틴 (somatostatin) [참고: WO 98/08529]; 만노스-6-포스페이트 또는 만노스-1-포스페이트 [참고: Ferguson, U.S. Pat. No. 5,520,926]; 프롤락틴 (prolactin) [참고: WO 97/40848]; 인슐린-유사 성장 인자 II [참고: WO 98/17304]; IP-10 [참고: WO 97/00691]; 트리펩티드 arg-gly-asp 및 이러한 트리펩티드를 함유하는 펩티드 [참고: Pfeffer, U.S. Pat. No. 5,958,411; WO 93/10808]; 식물, 진균 또는 세균으로부터의 TGF-β-억제성 추출물 [참고: EP-A-813875; JP 8119984; and Matsunaga et al., U.S. Pat. No. 5,693,610]; 예를 들어, TGF-β 유전자 전사 또는 해독을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 [참고: Chung, U.S. Pat. No. 5,683,988; Fakhrai et al., U.S. Pat. No. 5,772,995; Dzau, U.S. Pat. No. 5,821,234, U.S. Pat. No. 5,869,462; and WO 94/25588]; SMADs (예: SMAD6 및 SMAD7) 및 MADs를 포함한, TGF-β 신호 전달에 관여한 단백질 [참고: EP-A-874 046; WO 97/31020; WO 97/38729; WO 98/03663; WO 98/07735; WO 98/07849; WO 98/45467; WO 98/53068; WO 98/55512; WO 98/56913; WO 98/53830; WO 99/50296 ; Falb, U.S. Pat. No. 5,834,248; Falb et al., U.S. Pat. No. 5,807,708; and Gimeno et al., U.S. Pat. No. 5,948,639]; Ski, 또는 Sno [참고: Vogel, Science, 286: 665 (1999); and Stroschein et al., Science. 286: 771-774 (1999)]; TGF-β의 활성을 억제시킬 수 있는 능력을 보유하고 있는, 상기 언급된 분자의 모든 돌연변이체, 단편 또는 유도체; 및 유기 소분자가 포함된다.
바람직하게는, TGF-β 길항제는 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3 길항제이다. 보다 바람직하게는, 상기 길항제는 TGF-β1 길항제이다. 바람직한 양태에서는, TGF-β 길항제는 그의 수용체에 대한 TGF-β 결합을 차단시키는 인간 모노클로날 항체, 또는 그의 단편, 예를 들어 F(ab)2 단편, Fv 단편, 단일 쇄 항체, 및 TGF-β와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 기타 형태의 "항체"이다. 한 가지 양태에서는, TGF-β 길항제가 파지 디스플레이 (phage display)에 의해 생성된 인간 항체이다 [참고: WO 00/66631]. 또 다른 바람직한 양태에서는, TGF-β 길항제가 그의 수용체에 대한 TGF-β 결합을 차단시키는 인간 또는 인간화 모노클로날 항체 [또는 그의 단편, 예를 들어 F(ab)2 단편, Fv 단편, 단일 쇄 항체, 및 TGF-β와 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있는 기타 형태의 항체 또는 단편]이다. 바람직한 모노클로날 항체는 본원의 실시예 1에 기재된 바와 같은 뮤린 모노클로날 항체 2G7 및 4A11 뿐만 아니라 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은 그의 인간 또는 인간화 형태, 및 하이브리도마 1D11.16 [ATCC 수탁 번호 HB 9849, 문헌 (참고: Dasch et al., U.S. Pat. No. 5,783,185)에 기재됨]으로부터 수득한 뮤린 모노클로날 항체이다. 보다 바람직한 것은 예를 들어, 본원의 실시예 2에 기재된 바와 같은, 상기 뮤린 항체의 인간 또는 인간화 형태이다. 관심있는 항체에 의해 결합된 TGF-β 상의 에피토프와 결합하는 항체에 대해 스크리닝하기 위해, 예를 들어 문헌 [참고: Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)]에 기재된 바와 같은 통상적인 교차-차단성 검정을 수행할 수 있다. 또 다른 한편 또는 부가적으로, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 에피토프 지도화를 수행할 수 있다 [예를 들어, 본원의 도 19A 및 19B 참고].
본 발명에 사용하기 적합한 TGF-β 길항제에는 전술된 TGF-β 길항제의 기능적 돌연변이체, 변이체, 유도체 및 유사체가 포함될 것인데, 단 이들은 TGF-β 양 또는 활성을 억제시킬 수 있는 능력을 보유하고 있어야 한다. 본원에 사용된 바와 같은 "돌연변이체, 변이체, 유도체 및 유사체"는 모 화합물과 유사한 외형 또는 구조를 지니고 있고 TGF-β 길항제로서 작용할 수 있는 능력을 보유하고 있는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 TGF-β 길항제들 중의 어떠한 것도 결정화할 수 있고, 유용한 유사체는 활성 부위(들)의 외형에 책임이 있는 배위를 기초로 하여 합리적으로 고안할 수 있다.
또 다른 한편, 당업자는 과도한 실험을 수행하지 않고서도, 공지된 길항제의 관능기를 변형시킬 수 있고, 증가된 활성, 반감기, 생체내 이용 효율 또는 기타 목적하는 특징들을 알아보기 위해 이러한 변형된 분자를 스크리닝할 수 있다. TGF-β 길항제가 폴리펩티드인 경우에는, 이러한 폴리펩티드의 단편 및 변형물 (예를 들면, 상기 논의된 바와 같은 인간화 항체 또는 기능적 항체 단편)을 생성시켜 전달의 용이성, 활성, 반감기 등을 증가시킬 수 있다. 합성 및 재조합 폴리펩티드 생성에 관한 당해 분야의 숙련된 기술 수준에서는, 이러한 변형을 과도한 실험없이 달성할 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 TGF-β 길항제의 활성 부위에 관한 지식 및/또는 결정 구조에 근거하여 신규한 억제제를 고안할 수도 있다.
용어 "물질"은 "화합물"과 동의어이고, 이는 특정 질환, 질병, 병 또는 신체 기능 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 모든 화학물질, 제약, 약물 등을 지칭한다. 화합물은 공지된 치료적 화합물과 잠재적 치료적 화합물 둘 다를 포함한다. 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하여 스크리닝함으로써 치료적인 것으로 결정할 수 있다. "공지된 치료적 화합물", 예를 들어 공지된 화학요법제 또는 세포독성제는 이러한 치료에 있어 유효한 것으로 밝혀진 (예를 들어, 동물 시도 통하여 또는 인간에 대한 투여를 미리 경험함으로써 밝혀짐) 치료적 화합물을 지칭한다. 달리 말하면, 공지된 치료적 화합물은 관여된 병리학적 인자, 예를 들어 TGF-β와 연관된 증상들을 치료하는데 있어 효능이 있는 화합물로만 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "시험 물질"은 본 발명의 스크리닝 검정 또는 동물 모델에서 유용하게 사용하기 위해 시험되는, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 및 유기 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 모든 물질을 지칭한다. 시험 물질에는 구체적으로, 항체 (이에는 뮤린, 키메라, 인간화 및 인간 항체가 포함된다)가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "원발성 종양"은 발생 순서 또는 시간상 제일 먼저 발생한 종양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "이차 종양"은 종양이 처음으로 나타난 기관 또는 위치로부터 신체의 또 다른 기관이나 또 다른 부분으로 확산된 (전이된) 종양을 지칭한다. 따라서, 뼈로 확산된 유방암은 골암이 아니라 이차 (전이된) 유방암인데, 이는 암 세포가 그들의 위치에 상관없이, 여전히 유방암 세포이기 때문이다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 암이 신체의 한 부분으로부터 또 다른 부분으로 확산되는 것을 지칭한다. 전이성 과정은 원위 전이가 수립되기 전에 암 세포에 의해 수행되어야만 하는, 침습, 혈관내 침입, 수송, 정지, 혈관외 유출 및 성장을 포함하는 일련의 단계들이다.
본원에 사용된 용어 원발성 종양의 "상태에 대한 유해한 효과"는 원발성 종양의 성장 또는 원발성 종양 세포의 이동 (확산)을 가져다 주는 모든 효과를 지칭한다.
본 발명의 "비-인간 동물"은 척추 동물, 예를 들어 설치류, 비-인간 영장류, 양, 소, 반추동물, 토끼목 (lagomorph), 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 조류 등을 포함한 모든 비-인간 동물을 포괄한다. 바람직한 비-인간 동물은 돼지 및 설치류, 예를 들어 뮤린 (예: 랫트 및 마우스), 가장 바람직하게는 설치류 (예: 마우스) 중에서 선택된다. 그러나, 본 발명은 어떠한 특정한 비-인간 동물로도 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포유류"는 특정한 치료 대상체인, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 포유류로서 분류된 모든 동물, 바람직하게는 본원에서의 비-인간 동물 모델 또는 인간을 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징적으로 나타내는 포유류의 생리적 상태를 지칭하거나 이를 서술한다. 암의 예에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 흑색종, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선 암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료 (처치)"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위한 시도로 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 과정 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질환 발병 또는 재발 예방, 증상 완화, 질환의 직접 또는 간접적 병리학적 결과 감소, 전이 예방, 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 고통완화, 및 차도 또는 개선된 예후가 포함된다. 따라서, 상기 용어는 병리학적 인자, 예를 들어 TGF-β와 연관된 증상들의 개선 및/또는 반전을 포괄한다. 본 발명의 비-인간 동물의 "생리학적 기능 개선"은 본원에 기재된 모든 측정법 뿐만 아니라 동물의 생존에 대한 모든 효과를 이용하여 평가할 수 있는데; 본원에 기재된 모든 검정을 이용하여, 처치된 동물과 처치되지 않은 동물의 반응을 비교한다. 본 발명의 스크리닝 방법에 사용된 경우에 TGF-β와 같은 병리학적 인자와 연관된 파라미터 상의 개선을 유발시키는 물질을 치료적 화합물로서 확인할 수 있다.
"유효량" 또는 "유효 용량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안, 목적하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성시켜 주는데 유효한 양을 지칭한다. 항체의 "치료적 유효량"은 개개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개개인에게서 목적하는 반응을 유도시킬 수 있는 항체의 능력과 같은 요인들에 따라서 다양할 수 있다. 치료적 유효량은 또한, 치료적으로 유리한 효과가 항체의 모든 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안, 목적하는 예방적 결과를 달성시켜 주는데 유효한 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 질환이 발병하기에 앞서 또는 질환 초기 단계에서 대상체에게 사용하기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량 보다 적을 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지시키고/시키거나 세포 파괴를 유발시키는 물질을 지칭한다. 이 용어에는 방사성 동위원소 (예: At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 및 독소, 예를 들어 세균성, 진균성, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (이에는 그의 단편 및/또는 변이체가 포함된다)가 포함된다.
"화학요법제"는 암을 치료하는데 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어, 티오테파 및 시클로포스파미드 (CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예를 들어, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성적으로 유사한 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카르마이신 (합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 엔디인 (enediyne) 항생제 [예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 γ1 1 및 칼리케아미신 θ1 1 (참고: Agnew, Chem Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994)); 디네미신 (디네미신 A 포함); 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 엔디인 항생제 발색단], 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사제, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 레티난; 로니다민; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® (크레스틴: krestin); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 크리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL®; 공급처: Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀 (TAXOTERE®; 공급처: Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; XELODA® (카페시타빈); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 언급된 제제의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 상기 정의에는 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하기 위해 작용하는 항호르몬제, 예를 들어 항에스트로겐, 예를 들면, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜 (FARESTON®); 및 항안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세릴린; 및 그들의 제약상 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "탁소이드" 또는 "탁산"은 태평양 주목 [탁수스 브레비폴리아 (Taxus brevifolia)] 의 나무껍질과 잎에 존재하는 복합 디테르펜 계열 및 그의 유도체를 지칭한다. 탁소이드 또는 탁산 계열 구성원에는 파클리탁셀 (TAXOL®) 및 그의 유도체, 예를 들어 박카닌 III, 세팔로만닌, 10-데아세틸박카틴 III, 10-데아세틸탁솔, 7-에피-10-데아세틸탁솔, 7-크릴로실-10-데아세틸탁솔, 7-에피-탁솔, 박카틴 V, 7-에피-10-데아세틸-박카틴 III, 독세탁셀 (TAXOTERE®), 2-데벤조일-2-(p-트리플루오로메틸벤조일)탁솔, 및 20-아세톡시-4-데아세틸-5-에피-20,O-세코탁솔이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "사이토킨"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개인자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 유전적 용어이다. 이러한 사이토킨의 예는 림포카인, 모노카인, 및 전통적 폴리펩티드 호르몬이다. 이러한 사이토킨에 포함되는 것은 특히, 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 난포 자극 호르몬 (FSH), 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 및 황체형성 호르몬 (LH); 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 물레리안-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관성 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴 (TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판 성장 인자; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴 (EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, -β 및 -γ; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 대식세포-CSF (M-CSF); 과립구-대식세포-CSF (GM-CSF); 및 과립구-CSF (G-CSF); 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-β; 및 기타 폴리펩티드 인자 [이에는 LIF 및 kit 리간드 (KL)가 포함된다]이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 사이토킨에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질, 및 본래 서열 사이토킨의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.
본원에 사용된 경우의 "성장 억제제"는 특정 세포, 특히 TGF-β-발현성 암 세포의 성장을 시험관내 또는 생체 내에서 억제시켜 주는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상에서의 TGF-β-발현성 세포의 비율을 상당히 감소시켜 주는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예에는 (S 상 이외의 위치에서) 세포-주기 진행을 차단시켜 주는 작용제, 예를 들어 G1 정지 및 M-상 정지를 유도시켜 주는 작용제가 포함된다. 전통적인 M-상 차단제에는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신이 포함된다. G1을 정지시켜 주는 작용제는 또한, S-상 정지를 유발시키는데, 이에는 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C가 포함된다. 추가의 정보는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p.13].
"성장 억제성" 항체의 예는 TGF-β와 결합하고, TGF-β를 과발현하는 암 세포의 성장을 억제시켜 주는 것이다. 바람직한 성장 억제성 항-TGF-β 항체는 약 0.5 내지 30 ㎍/ml의 항체 농도에서, 세포 배양 중인 SK-BR-3 유방 종양 세포의 성장을 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상 (예를 들어, 약 50% 내지 약 100%) 억제시켜 주는데, 이러한 성장 억제는 SK-BR-3 세포를 항체에 노출시킨지 6일 후에 결정한다 [1997년 10월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,677,171호 참고]. SK-BR-3 세포-성장 억제 검정이 상기 특허 및 다음에 보다 상세히 기재되어 있다.
"세포 사멸을 유도시키는" 항체는 생육 가능한 세포를 생육 불가능한 세포가 되도록 하는 것이다. 이 세포는 일반적으로, TGF-β 수용체를 발현하는 것인데, 특히 상기 세포는 TGF-β 수용체를 과발현한다. 바람직하게는, 상기 세포가 암 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서는 상기 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포일 수 있다. 시험관 내에서의 세포 사멸은, 항체 의존성 세포-매개성 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 의해 유도된 세포 사멸과 구별하기 위해 보체 및 면역 효과기 세포의 부재 하에서 결정할 수 있다. 따라서, 세포 사멸을 알아보기 위한 검정은 열-불활성화 혈청을 사용하고 (즉, 보체의 부재 하에) 면역 효과기 세포의 부재 하에 수행할 수 있다. 항체가 세포 사멸을 유도시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 처치되지 않은 세포와 비교해서 프로피듐 요오드 (PI), 트리판 블루 [참고: Moore et al., Cytotechnology, 17: 1-11 (1995)] 또는 7AAD의 흡수에 의해 평가된 바와 같은 막 원형 보존 상실을 평가할 수 있다. 바람직한 세포-사멸-유도성 항체는 BT474 세포에서의 PI 흡수 검정에서 PI 흡수를 유도시켜 주는 것이다 (하기 참고).
"아폽토시스를 유도시키는" 항체는 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 내형질 세망의 확장, 세포 단편화 및/또는 막 소포 (아폽토시스체로 불리움)의 형성에 의해 결정된 바와 같은 프로그램된 세포 사멸을 유도시키는 것이다. 세포는 통상적으로, TGF-β 수용체를 과발현하는 것이다. 바람직하게는, 세포가 종양 세포, 예를 들어 유방, 난소, 위, 자궁내막, 타액선, 폐, 신장, 결장, 갑상선, 췌장 또는 방광 세포이다. 시험관 내에서는 세포가 SK-BR-3, BT474, Calu 3 세포, MDA-MB-453, MDA-MB-361 또는 SKOV3 세포이다. 아폽토시스과 연관된 세포성 사건을 평가하기 위한 각종 방법이 현재 이용 가능하다. 예를 들어, 포스파티딜 세린 (PS) 전위는 아넥신 결합에 의해 측정할 수 있고; DNA 단편화는 DNA 래더링 (laddering)을 통하여 평가할 수 있으며; DNA 단편화를 수반하는 핵/염색질 응축은 저이배체 (hypodiploid) 세포 상의 증가에 의해 평가할 수 있다. 바람직하게는, 아폽토시스를 유도시키는 항체는 BT474 세포를 이용한 아넥신 결합 검정 (하기 참조)에서, 처리되지 않은 세포에 비해 약 2 내지 50배, 바람직하게는 약 5 내지 50배, 가장 바람직하게는 약 10 내지 50배 정도로 아넥신 결합을 유도시켜 주는 것이다. 때때로, 프로-아폽토시스성 항체는 TGF-β 결합을 추가로 차단시켜 주는 것인데 (예를 들어, 2G7 항체), 즉 이러한 항체는 TGF-β에 대한 항체와 생물학적 특징을 공유하고 있다. 기타 상황에서는, 항체가 TGF-β를 상당히 차단시키지 않는 것이다. 추가로, 항체는 아폽토시스는 유도시키지만, S기 세포 비율의 상당한 감소는 유도시키지 않는 것일 수 있다 (예를 들면, 이들 세포 비율을 대조군에 비해 약 0 내지 10% 정도만 감소시켜 주는 것이다).
용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 이에는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다가 항체, 다중-특이적 항체 (예: 이중-특이적 항체), 전장 항체, 및 항체 단편 (단, 이들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다)이 포함된다. 천연 발생적 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 2개의 동일한 중쇄 (H)와 2개의 동일한 경쇄 (L)를 포함하는데, 이들은 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH)과 중쇄 불변 영역으로 구성되는데, 그의 본래 형태에서는 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 영역과 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역이 산재된 초가변 영역 [이는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 명명된다]으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDRs과 4개의 FRs로 구성되는데, 이들은 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
그들의 중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라서, 항체 (면역글로불린)는 상이한 부류로 할당될 수 있다. 5가지 주요 부류의 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 가지는 아부류 (이소형), 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgA-1, IgA-2 등으로 추가로 분할될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불리운다. 상이한 부류의 면역글로불린의 소단위 구조와 3차원적 입체 배치는 널리 공지되어 있고, 일반적으로 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000)]. 모든 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로 하여, 명백하게 별개인 2가지 유형, 즉 카파 (κ)와 람다 (λ) 중의 하나에 할당될 수 있다. 바람직하게는, 본원에서의 항체가 면역글로불린 G, 보다 바람직하게는 인간 면역글로불린 G이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동질의 항체 집단으로부터 수득한 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 차지하고 있는 개개 항체는 미량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대항하여 지시된다. 더우기, 상이한 결정기 (에피토프)에 대항하여 지시된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대항하여 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 어떠한 특정한 방법에 의해 항체 생성을 요구하는 것으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [참고: Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 만들 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해서도 만들 수 있다 [참고: 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호]. "모노클로날 항체"는 다음 문헌에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수도 있다 [참고: Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) or Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)].
"전장 (full-length) 항체"는 천연상 발견될 수 있는 바와 같은, 단편이 아닌 본래의 항체를 지칭한다.
"항체 단편"은 일반적으로 본래 항체의 항원-결합 부위를 포함한, 본래 항체의 일부 만을 포함하므로, 항원과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있다. 본 발명의 정의에 의해 포괄되는 항체 단편의 예에는 다음이 포함된다: (i) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는, 즉 경쇄의 가변 영역 및 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 모두를 함유하는 Fab 단편; (ii) 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 몇 개의 잔기 (항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인(들) 포함)를 부가함으로써 Fab 단편과는 상이한 Fab' 단편; (iii) 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올기를 보유하고 있는 Fab' 단편인 Fab'-SH 단편; (iv) 항체의 단일 암 (arm)의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (v) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함한 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vi) 단일 쇄 항체 분자 (예: 단일 쇄 Fv; scFv) [참고: Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988)]; 및 (vii) 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 수반한 "디아보디 (diabody)" [참고: 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)].
"본래 (native)의 서열" 또는 "본래-서열"을 수반하는 항체 또는 그의 영역은 천연으로부터 유래된 항체의 상응하는 부분과 동일한 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 영역을 지칭한다. 따라서, 본래의 서열을 수반한 항체는 모든 포유류로부터의 천연 발생적 항체에 상응하는 항체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 본래의 서열을 수반한 항체는 천연으로부터 분리되거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성된 항체로부터 유래될 수 있다.
변이체 항체 또는 그의 영역은 본래의 서열을 수반한 상응하는 항체 또는 그의 영역과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일률을 나타내는 생물학적 활성 항체 또는 그의 영역을 의미한다. 이러한 변이체에는, 예를 들어 전장 항체, 항체 단편 또는 그의 경쇄 또는 중쇄 영역의 N- 또는 C-말단에서, 또는 상기 항체, 단편 또는 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가 또는 결실되는, 상기 전장 항체 및 항체 단편, 또는 그의 경쇄 또는 중쇄 영역이 포함된다. 통상적으로, 변이체는 본래의 서열을 수반한 상응하는 항체 또는 그의 영역과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일률, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 서열 동일률, 보다 더 바람직하게는 약 95% 이상의 아미노산 서열 동일률을 나타낼 것이다.
본원에서의 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 서열 동일성을 달성하며, 서열 동일성의 일부로서의 보존적 치환은 전혀 고려하지 않은 후에, 선별된 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기 비율 (%)로서 규정된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들면, BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 메갈라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 당해 분야의 기술 수준 내의 각종 방식으로 달성할 수 있다. 당업자는 정렬을 측정하기에 적당한 파라미터를 결정할 수 있는데, 이에는 비교하고자 하는 전장 서열 전반에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 모든 알고리듬이 포함된다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 (%) 값은 서열 비교용 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용함으로써 다음에 기재되는 바와 같이 수득한다. 제넨텍, 인코포레이티드 (Genentech, Inc.)에 의해 만들어진 ALIGN-2 서열 비교용 컴퓨터 프로그램은 미국 저작권국 (U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)에 사용자 문서로 출원되었는데, 이는 미국 저작 등록 번호 TXU510087로 등록되었고 제넨텍, 인코포레이티드 (소재지: South San Francisco, California)를 통하여 공개적으로 입수 가능하다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동 시스템, 바람직하게는 디지털 UNIX V4.0D 상에서 사용하도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터가 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 이는 달라지지 않는다.
본원의 목적상, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%) (달리 언급하면, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 이와의 또는 이에 대항한 특정의 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)은 다음과 같이 산정된다:
100 x 분획 X/Y
상기에서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 정합물 (match)로서 스코어링된 아미노산 잔기 수이고; Y는 B 중의 아미노산 잔기 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않는 경우에는, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 동등하지 않다는 것을 인지해야 할 것이다.
"기능적" 또는 "생물학적 활성" 항체는 구조적, 조절성, 생화학적 또는 생물물리학적 사건에서 그의 천연 활성들 중의 한 가지 이상을 발휘할 수 있는 것이다. 예를 들어, 기능적 항체는 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 지닐 수 있으므로, 이러한 결합은 궁극적으로 특정 세포성 또는 분자 사건, 예를 들어 신호 전달 또는 효소적 활성을 유발 또는 변경시킬 수 있다. 기능적 항체는 수용체의 리간드 활성화를 차단시킬 수도 있거나, 또는 효능제 항체로서 작용할 수도 있다. 그의 천연 활성들 중의 한 가지 이상을 발휘할 수 있는 항체의 능력은, 적당한 폴딩 및 폴리펩티드 쇄의 어셈블리를 포함한 몇 가지 요인들에 의해 좌우된다. 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 기능적 항체는 전형적으로, 다중 디설파이드 결합에 의해 서로 연결되어 있고 적당한 수준으로 폴딩된 2개의 동일한 L 쇄와 2개의 동일한 H 쇄를 갖는다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 "다가 항체"란 표현은 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 의미한다. 다가 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 공학적으로 처리하는 것이 바람직하며, 이는 일반적으로 본래-서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.
본원의 항체에는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 (단, 이들은 목적하는 생물학적 활성을 나타내야 한다) "키메라" 항체가 포함된다 [참고: U.S. Patent No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)].
"인간화" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 지니고 있는 비-인간 종 (예: 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류)의 초가변 영역 (공여자 항체)로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체시킨다. 더우기, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정련시켜 준다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것인데, 여기서는 초가변 루프의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 면역글로불린의 초가변 루프에 상응하고 FRs의 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 임의로, 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부 (Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산되고/되거나 본원에 기재된 바와 같이 인간 항체를 제조하기 위한 모든 기술을 사용하여 제조한 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고 있는 것이다. 이러한 인간 항체의 정의에는 구체적으로, 비-인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체가 배제된다. 인간 항체는 당해 분야에 공지된 각종 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다. 한 가지 양태에서는, 인간 항체를 파지 라이브러리로부터 선별하는데, 여기서는 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현한다 [참고: Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314 (1996): Sheets et al., PNAS (USA), 95: 6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. 인간 항체는 또한, 내인성 면역글로불린 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시킨 트랜스제닉 동물 (예: 마우스) 내로 인간 면역글로불린 유전자자리를 도입함으로써 만들 수 있다. 챌린지시, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리, 및 항체 레퍼토리 (repertoire)를 포함한 모든 측면에 있어서 인간에게서 관찰된 것과 밀접하게 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, and in Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]. 또 다른 한편, 인간 항체는 표적 항원에 대항하여 지시된 항체를 생산하는 인간 B-림프구의 불멸화를 통하여 제조할 수 있다 (이러한 B-림프구는 특정 개개인으로부터 회수할 수 있거나 시험관 내에서 면역시킬 수도 있었다) [참고: 예를 들어, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991); and US Pat No. 5,750,373].
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 간의 서열에 있어 광범위하게 상이하고, 이러한 부분은 특정한 각 항체가 그의 특정한 항원에 대한 특이성과 결합을 위해 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 균등한 수준으로 분포되지는 않는다. 이는 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘 다 내에 초가변 영역으로 불리우는 3가지 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분이 프레임워크 영역 (FRs)으로 지칭된다. 본래 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FRs을 포함하는데, 이는 베타-시트 구조를 연결하고 몇몇 경우에는 이러한 베타-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 베타-시트 입체 배치를 상당 부분 채택하고 있다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 상기 FRs에 의해 아주 근접하여 결합되어 있고, 다른 쇄로부터의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 [참고: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]. 불변 영역은 항원에 대한 항체 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 각종의 효과기 기능, 예를 들어 항체-의존적 세포-매개성 세포독성 (ADCC)에 있어서의 항체 참여를 나타낸다.
"친화성-성숙된 (affinity-matured)" 항체는 변경(들)을 나타내지 않는 상응하는 모 항체와 비교해서 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시켜 주는, 그의 하나 이상의 CDRs에서의 한 가지 이상 변경을 나타내는 항체이다. 바람직한 친화성-성숙된 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰 친화도를 지닐 것이다. 친화성-성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 과정에 의해 생성된다. 문헌 [참고: Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]에는 VH 및 VL 도메인 셔플링 (shuffling)에 의한 친화성 성숙이 기재되어 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol., 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154 (7): 3310-3319 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)].
"분리된 (isolated)" 또는 "회수된" 항체는 그의 천연 환경 성분으로부터 확인되어 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질이며, 이에는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 양태에서는, 항체를 (1) 로우리법 (Lowry method)에 의해 결정된 바와 같이, 폴리펩티드 중량의 95% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과가 되도록 정제하거나, (2) 스피닝-컵 서열 분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제하거나, 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue), 또는 바람직하게는 은 염색을 이용하여 환원성 또는 비-환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질해지도록 정제할 것이다. 분리된 또는 회수된 항체에는 재조합 세포 내의 계내 항체가 포함되는데, 이는 항체 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 분리된 또는 회수된 항체는 한 가지 이상 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
용어 "항원"은 당해 분야에 널리 알려져 있고, 이에는 면역원성인 물질, 즉 면역원 뿐만 아니라 면역학적 무반응 또는 알레르기 (allergy)를 유도시키는 물질, 즉 알레르겐 (allergen)이 포함된다. 항원이 폴리펩티드인 경우에는, 이것이 막관통 분자 (예: 수용체) 또는 리간드 (예: 성장 인자)일 수 있다. 항원의 예에는 다음이 포함된다: 레닌과 같은 분자; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 및 소의 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 및 폰 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예를 들어 우로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신 (bombesin); 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (정상적으로 발현되고 분비된 T-세포 활성화시 조절됨); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민; 뮐레리안 (Muellerian)-억제성 물질; 렐락신 (relaxin) A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 성선자극 호르몬-관련 펩티드; 미생물성 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈 (inhibin); 악티빈 (activin); 혈관성 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 향신경성 인자, 예를 들어 뼈-유래된 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합성 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타, 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면-막 단백질; 붕괴-가속 인자; 바이러스성 항원, 예를 들어 AIDS 외피 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체 (homing receptor); 아드레신 (addressin); 조절성 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 열거된 폴리펩티드들 모두의 단편.
본 발명의 방법에 사용된 항체에 대해 특이적이거나 지시되는 바람직한 항원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, TGF-β5, IFN-γ, FGF, EGF 뿐만 아니라 본래의 TGF-β 폴리펩티드의 수용체, 예를 들어 TGFβ-RI 및 TGFβ-RII이다. 기타 바람직한 항원은 TGF-β 신호 전달 경로에 존재하는 항원, 예를 들어 Smad2, Smad3, Smad2/3, Smad 4, Smad 7, JNK, p38 MAPK, erk MAPK, TAK1/MEKK1, Ras, RhoA, PP2A, MKK3/6, MKK4, p160Rock, 및 S6K이다.
명세서 전반에 걸친 용어 "ErbB2", "ErbB2 수용체", "c-erb-B2", "HER2" 및 "Her2"는 상호 교환적으로 사용되고, 달리 지시되지 않는 한 본래-서열 ErbB2 인간 폴리펩티드, 또는 그의 기능적 유도체를 지칭한다. "Her2", "erbB2" 및 "c-erb-B2"는 상응하는 인간 유전자를 지칭한다. 이러한 맥락에서 용어 "본래-서열" 또는 "본래의"는 그의 제조 방식에 상관없이, 천연 발생적 폴리펩티드의 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 본래-서열 폴리펩티드는 천연으로부터 분리할 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해, 또는 이들 방법이나 유사한 방법을 병용해서 생성시킬 수 있다.
인간화 항-ErbB2 항체에는 미국 특허 제5,821,337호 (본원에 참고로 도입된다)의 표 3에 기재된 바와 같은, huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 [트라스투주마브 (HERCEPTIN®)]; 인간화 520C9 [참고: W0 93/21319] 및 인간화 2C4 항체가 포함된다.
용어 "Her2-발현성 암 (종양)" 및 "Her2+ 암 (종양)"은 상호 교환적으로 사용되고, 이는 그들의 세포 표면에 존재하는 Her2 단백질을 갖는 세포를 포함하는 암 (종양)을 지칭한다. "Her2-발현성 암"은 그의 세포 표면에 충분한 수준의 Her2를 생성시키는 것인데, 이로써 항-Her2 항체가 그와 결합하고 암에 대해 치료적 효과를 지닐 수 있다. Her2- 또는 Her2-음성 암 (종양)은 그들의 세포 표면에 존재하는 Her2 단백질을 갖지 않는 세포를 포함하는 종양이다.
"트라스투주마브-내성 종양"은 승인된 동물 모델이나 인간 임상 시도에서 위약을 이용하여 치료하거나 전혀 치료하지 않은 경우와 비교해서 트라스투주마브 (HERCEPTIN®) 치료에 반응하여 통계상 유의적 개선을 나타내지 않거나, 또는 트라스투주마브를 이용한 초기 치료에는 반응하지만 치료가 지속됨에 따라 (종양이) 커지게 된다. 이와는 달리, "트라스투주마브-반응성" 또는 "트라스투주마브-민감성" 종양은 승인된 동물 모델이나 인간 임상 시도에서 위약을 이용하여 치료하거나 전혀 치료하지 않은 경우와 비교해서 트라스투주마브 치료에 반응하여 통계상 유의적 개선을 나타낸다.
달리 지시되지 않는 한, "모노클로날 항체 2G7"이란 표현은 다음 실시예의 뮤린 2G7 항체의 항원 결합성 잔기 또는 뮤린 2G7 항체로부터 유래된 항원 결합성 잔기를 갖는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로날 항체 2G7은 뮤린 모노클로날 항체 2G7, 또는 뮤린 모노클로날 항체 2G7의 항원 결합성 아미노산 잔기를 보유하고 있는 그의 변이체, 예를 들어 인간화 항체 2G7일 수 있다.
다음 실시예 2에는 TGF-β와 결합하는 예시 인간화 항-TGF-β 항체의 생성 방법이 기재되어 있다. 이러한 인간화 항체는 인간 가변 중쇄 도메인 내로 혼입된 비-인간 초가변 영역 잔기를 포함하고, 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78로 이루어진 군 중에서 선택된 위치 [카바트 (Kabat) 등의 문헌 (상기 참고)에 기재된 가변 도메인 넘버링 시스템을 활용함]에서 프레임워크 영역 (FR) 치환을 추가로 포함한다. 한 가지 양태에서는, 인간화 항체가 위치 48, 49, 67, 69, 71, 73, 및 78 중의 2군데 이상에서 FR 치환을 포함하고; 기타 양태에서는, 상기 위치의 3군데 또는 4군데 이상에서 FR 치환을 포함한다. 바람직한 양태에서는, 상기 항체가 위치 49, 67 및 71, 위치 48, 49 및 71, 또는 위치 49, 69 및 71, 또는 위치 49, 69, 71 및 73, 또는 위치 49, 71 및 73, 또는 위치 49, 71 및 78에서 FR 치환을 포함한다. 면역원성을 최소화하기 위해서는 많은 프레임워크 치환 보다는 오히려 더 적은 수의 치환이 바람직하지만, 효능도 매우 중요하게 고려해야 한다. 실제적으로 치환된 아미노산은 면역원성 또는 효능을 변화시키지 않도록 바람직하게 보존된 것이다. 위치 48에서의 변화는 바람직하게는, 발린으로부터 이소루이신으로의 변화이고, 위치 49에서의 변화는 바람직하게는, 알라닌으로부터 글리신으로의 변화이며, 위치 67에서의 변화는 바람직하게는, 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 변화이고, 위치 69에서의 변화는 바람직하게는, 페닐알라닌으로부터 알라닌으로의 변화이며, 위치 71에서의 변화는 바람직하게는, 아르기닌으로부터 알라닌으로의 변화이고, 위치 73에서의 변화는 바람직하게는, 아스파라긴으로부터 리신으로의 변화이며 위치 78에서의 변화는 바람직하게는, 루이신으로부터 알라닌으로의 변화이다.
본원에서 관심있는 예시 인간화 항체는 가변 중쇄 도메인 상보성-결정 잔기 GYAFTNYLIE (서열 21); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 22) 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및/또는 SGGFYFDY (서열 23)을 포함하는데, 이는 예를 들어, 항체의 친화성을 본질적으로 유지시키거나 개선시키는 경우에는, CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함한다. 예를 들어, 관심있는 항체 변이체는 상기 가변 중쇄 도메인 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개, 또는 약 5개 아미노산 치환물을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 친화성 성숙에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게는, 잔기가 GYAFTNYLIE (서열 21); VNNPGSGGSNYNEKFKG (서열 22) 또는 VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및/또는 SGGFYFDY (서열 23) 중의 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개이다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 4 내의 가변 중쇄 도메인 아미노산 서열, 또는 GYAFTNYLIE (서열 21); VINPGSGGSNYNEKFKG (서열 43); 및 SGGFYFDY (서열 23)을 수반한 것이다.
인간화 항체는, 예를 들어 앞서 단락에서의 가변 중쇄 도메인 CDR 잔기 이외에도, 가변 경쇄 도메인 상보성-결정 잔기 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 18) 또는 RASQGISSYLA (서열 7); WASTRES (서열 19) 또는 YASSLQS (서열 8); 및/또는 HQYLSSDT (서열 20)을 포함할 수 있다. 이러한 인간화 항체는, 예를 들어 항체의 친화성을 본질적으로 유지시키거나 개선시키는 경우에는, 상기 CDR 잔기의 아미노산 변형을 임의로 포함한다. 예를 들어, 관심있는 항체 변이체는 상기 가변 경쇄 CDR 서열 내에 약 1 내지 약 7개, 또는 약 5개 아미노산 치환물을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들어, 다음에 기재되는 바와 같은 친화성 성숙에 의해 제조할 수 있다. 바람직하게는, 잔기가 RASQSVLYSSNQKNYLA (서열 18); WASTRES (서열 19); 및/또는 HQYLSSDT (서열 20) 중의 2개 이상, 가장 바람직하게는 3개 모두이다. 가장 바람직한 인간화 항체는 서열 3 내의 가변 경쇄 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본원은 또한, TGF-β와 결합하는 친화성 성숙된 항체를 고려한다. 모 항체는 인간 항체 또는 인간화 항체, 예를 들어 각각 서열 3 및 4의 가변 경쇄 및/또는 중쇄 서열을 포함하는 것일 수 있다 (즉, 버젼 5). 친화성 성숙된 항체는 바람직하게는, 뮤린 2G7 또는 변이체 5에 비해 탁월한 친화성으로 TGF-β와 결합한다 [예를 들어, TGF-β-세포외 도메인 (ECD) ELISA를 이용하여 평가된 바와 같이, 친화성이 약 2배 또는 약 4배 내지 약 100배 또는 약 1000배 개선되었다).
"TGF-β 길항제를 이용한 치료에 반응하지 않거나 또는 불충분한 수준으로 반응하는 것으로 예정된" 환자는 승인된 시험관내 또는 동물 모델이나 인간 임상 시도에서 환자의 종양 반응성을 시험할 경우에, 위약을 이용하여 치료하거나 전혀 치료하지 않은 경우와 비교해서 TGF-β 길항제 치료에 반응하여 통계상 유의적 개선을 나타내지 않거나, 또는 상기 환자가 TGF-β 길항제를 이용한 초기 치료에는 반응하지만, 이 반응이 일시적이고 치료가 지속됨에 따라 종양이 커지게 된다.
"항-혈관신생제"는 혈관의 발생을 어느 정도 차단시키거나 방해하는, TGF-β 길항제 이외의 화합물을 지칭한다. 항-혈관형성 인자는, 예를 들어, 혈관형성을 증진시키는데 관여하는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체와 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 한 예가 혈관성 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 길항제, 예를 들어 VEGF와 특이적으로 결합하는 항체 [예: 베바시주마브 (bevacizumab) (AVASTIN®)]이다.
II. 본 발명을 수행하는 방식
앞서 논의된 바와 같이, TGF-β는 발암 현상에 있어 복합적인 역할을 한다. TGF-β 경로는 상피 세포 발암 현상의 초기 단계에서는 종양 저해인자로서 작용한다. 전암성 세포와 암성 세포의 유전적 및 후성적 (epigenetic) 맥락에서의 변화가 일어나면, 세포의 TGF-β 반응성은 감퇴되고, TGF-β 발현/활성화 증가가 관찰되는데, 이러한 관찰은 종양 발생 후기의 전이 이전 단계 및 침습성 전이성 암에서 TGF-β 경로의 프로-종양형성 역할이 지배적인 것으로 될 때까지 지속된다. 추가의 상세 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Roberts and Wakefield, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (15): 8621-8623 (2003)]. 몇몇 종양, 예를 들어 각종 암종은 TGF-β 수용체에서의 돌연변이를 불활성화시킨 결과로서 TGF-β에 의한 세포 성장 억제를 교묘하게 피하는 것으로 공지되어 있다. TGF-β (및 TGF-β 경로의 기타 구성원들)가 종양 증진인자로서 직접적으로 작용할 수 있다는 사실은, 많은 종양이 불활성화 TGF-β 수용체를 갖고 있지 않다는 것에 의해 뒷받침되므로; 이러한 종양의 형성과 확산이 돌연변이 불활성화에 따른 결과로서 TGF-β 세포 성장 억제를 교묘하게 회피하는 것에 의해 설명될 수 없다.
수 많은 종양 세포 모델 시스템에서, 정제된 TGF-β로 전처리하거나 TGF-β1 cDNA로 형질감염시키면 전이 가능성이 증가하게 된다. 역으로 말하면, TGF-β에 대한 종양 세포 반응성을 차단시키거나 TGF-β 생성을 중화시키면 생체내 전이 효율이 저하된다. 이는 TGF-β가 전이를 촉진시킬 수 있다는 사실을 강력히 뒷받침해준다. 그에 대한 명백한 증거를 획득한 가능한 기전에는 (i) 면역 감시의 저해; (ii) 침습력과 운동성의 촉진; 및 (iii) 혈관신성의 촉진이 포함된다. 그러나, 본 발명을 이용하기 위해 상기 기전을 이해하는 것이 반드시 필요하지는 않다. 실제로, 본 발명은 특정한 어떠한 기전들로 제한되지 않는다.
본 발명은 자발적 종양으로부터의 세포주를 사용할 뿐만 아니라 종양형성 유전자-구동된 종양으로부터 제조된 원발성 세포를 사용함으로써 생성된 것을 포함한, 몇 가지 동물 모델에서 항-TGF-β 항체를 시험함으로써 수득한 실험적 데이터에 기초한 것이다. 인간 종양에서 관찰된 이질성과 유사하게, 동물 모델은 TGF-β 길항제, 예를 들어 항-TGF-β 항체를 이용한 치료에 대해 다양한 반응을 나타낸다. 이들 동물 모델에서 발생한 정보는 종양 세포에 대한 각종의 TGF-β-유도된 활성들을 구별할 수 있게 해주고, 기타 유형의 암, 각종 아유형의 유방암 등에 비해 특정 유형, 기 또는 형태의 암, 예를 들어 이차 (전이성) 종양, 유방암을 우선적으로 치료하기 위한 물질을 확인하는데 있어 중요한 영향을 미친다. 그 결과, 본 발명의 근간이 되는 상기 실험적 데이터는 인간 환자의 암 요법을 개인화하는데 중요한 정보를 제공해 준다. 전이성 암이 고형 종양 환자에 대한 주요 사망 요인이기 때문에, 본 발명의 한 국면은 이차 종양을 치료하는데 유효한 물질을 확인하는데 초점을 맞추고 있다.
따라서, 한 양태에서는 본 발명이 (1) 복수 개의 시험 물질을, 원발성 종양의 존재 또는 부재 하에 하나 이상의 연질 조직 또는 뼈 전이를 수반하는 비-인간 동계 면역적격한 동물 모델에게 투여하는 단계; (2) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 성장과, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한 상기 시험 물질의 효과를 결정하는 단계; 및 (3) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 상태에 대해서 유해한 효과를 나타내지 않으면서, 연질 조직의 성장 또는 뼈 전이를 억제하는 시험 물질을 확인하는 단계를 포함하는, 암에 대한 치료적 활성을 지니고 있는 물질을 스크리닝하는 방법이다.
이러한 방법의 한 변수에서는, 시험 물질의 투여를, 암, 특히 전이성 암 치료를 위한 기타 표준 요법, 예를 들어 방사선 요법과 병용한다.
한 양태에서, 상기 동물에게 투여된 시험 물질에는 공지된 화학요법제 또는 세포독성제 (예: 탁소이드)가 포함된다. 이 방법의 바람직한 양태에서는, 하나는 TGF-β 길항제이고, 다른 하나는 화학요법제 또는 세포독성제인 2가지 시험 물질을 동물에게 투여하고, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한, 그리고 원발성 종양이 존재하는 경우에는 원발성 종양 성장에 대한 상기 2가지 시험 물질의 병용 효과를 결정한다. 보다 바람직한 양태에서는, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체이고 화학요법제 또는 세포독성제가 탁소이드이다.
이러한 생체내 스크리닝 검정에 사용된 동물은 인간을 제외한 어떠한 종류의 동물일 수도 있는데, 이러한 동물의 바람직한 예에는 설치류, 예를 들어 마우스 및 랫트, 토끼, 소형 돼지, 및 돼지, 보다 바람직하게는 마우스가 포함된다.
본 발명에 유용한 몇몇 동물 모델은 전이된 말기 암, 예를 들어 유방암 또는 흑색종에 대해 특이적인 병리 상태를 나타내므로, 이러한 침습성이 강한 말기 암을 치료 (연질 조직 및 뼈 전이의 치료를 포함함)하는데 있어 이점을 제공해주는 물질, 예를 들어 화학요법제 및/또는 세포독성제를 확인하는데 사용할 수 있다.
종양 전이 동물 모델을 생성시키기 위해서는, 종양 세포를 해당 동물에게 주사하면, 재현 가능한 타이밍 패턴의 원발성 및 이차 종양 외관을 지닌 원발성 종양과 이차 종양 둘 다가 형성되어야만 하고; 시스템이 동계여야만 하며; 이차 종양이 진짜 전이성이어야만 하는데, 즉 원발성 종양 세포로 구성되어야만 한다. 또한, 시험관내 주사에 사용된 종양 세포를 배양하고 합리적인 형질감염 효율을 획득하는 것이 가능해야 한다.
바이러스성 프로모터의 제어 하에 형질전환 유전자를 수반하는 트랜스제닉 동물은 자발적으로 발생하는 원발성 종양을 갖는 동물을 제공한다. 그러나, 이러한 동물은 전형적으로, 이차 종양을 형성하는 범발성 종양 세포 때문이라기 보다는 큰 덩어리의 (중증의) 원발성 종양으로 인해 사망하기 때문에, 전이성 암을 연구하는데 있어 최적의 모델은 아니다. 그러나, 이들 동물은 적당한 동물 모델을 발생시키기 위해 또 다른 동물에게 주사하기 위한 종양 세포의 공급원으로서 제공될 수 있다.
따라서, BALB/c-유래된 이식 가능한 4T1 마우스 유방 암종이 전이성 암 연구를 위해 확립된 모델이다 [참고: Aslakson and Miller, Cancer Res., 52. 1399-1405 (1992); Pulaski and Ostrand-Rosenberg, Cancer Res., 58: 1486-1493 (1998); and Pulasky et al., Cancer Res., 60: 2710-2715 (2000)]. 4T1 종양 세포를 수용자 마우스의 유방 지방체에 접종한 후, 원발성 종양 성장이 점진적이고도 자발적으로 폐, 간 및 기타 연질 조직, 및 뼈로 전이된다. 인간 유방암, 특히 침습성이 강한 선암종과 유사하게, 전이성 세포는 원발성 종양의 존재 하에 멀리 떨어진 부위에서 증식하고, 원발성 종양을 외과적으로 제거한 후에도 지속적으로 증식한다. 따라서, 4T1 모델은 원발성 종양의 존재 하에 및 원발성 종양을 외과적으로 제거한 후에 종양 전이를 연구하는데 있어 적합하다.
Her-2/neu 발현성 전이성 유방암에 대한 각종 시험 물질의 효과를 연구하기 위해, Her-2/neu 과발현성 인간 유방암 세포를 수용자 마우스의 유방 지방체에 접종하고, 시험 물질로 처리할 수 있다. 또 다른 한편, 종양을 수용자 마우스에게 이식할 수 있다. 이러한 모델 시스템은 트라스투주마브-내성 유방암과 트라스투주마브-반응성 (트라스투주마브-민감성) 유방암 둘 다를 연구할 수 있게 해준다. 트라스투주마브-내성 유방암을 치료하기 위한 작용제를 시험하는데 특히 적합한 또 다른 동물 모델이 미국 특허 제6,632,979호 (2003년 10월 14일자로 허여됨) (그 전문이 본원에 참고로 도입된다)에 기재되어 있다.
종양 진행과 전이를 연구하는데 적합한 또 다른 동물 모델은 유방 상피에서 폴리오마 중앙 T 종양단백질 (PyMT)의 발현에 의해 유발된 유방암의 마우스 모델이다. 이러한 PyMT 종양은 Her-2+ 종양과는 조직학적으로 상이하고, 전악성기 또는 악성기로부터 높은 빈도로 발생하는 전이까지, 명백하게 확인 가능한 별개의 종양 발생 기를 진행한다. PyMT 종양은 불량한 예후와 연관된, 특정의 침습성이 강한 형태의 인간 유방암과 형태학적 유사성을 나타내므로, 이러한 암을 치료하기 위한 후보 약물을 연구 및 확인하는데 있어 탁월한 모델을 제공해준다 [참고: 예를 들어, Lin et al., Am J. Pathol., 163 (5): 2113-2126 (2003)].
전이성 유방암의 추가의 동물 모델에 관한 추가의 논의는 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Heppner et al., Breast Cancer Res., 2(5): 331-334 (2000)].
예를 들어 인간 대응물과 극히 유사한, 침습성이 강한 형태의 흑색종이 발생하는 신클레어 (Sinclair) 소형 돼지 (공급처: Sinclair Research Center, Inc.)의 아균주에서 전이성 흑색종을 연구할 수 있다. 이러한 침습성이 강한 흑색종은 완전한 전이 단계 후에 자발적으로 퇴행하는 독특한 특징을 지니고 있으므로, 전이성 흑색종의 발생과 퇴행을 연구하는데 있어 특히 적합하다.
또한, 마우스 흑색종 세포주 B16, K1735 및 클로우드만 (Cloudman) S91-M3 (및 각종 아세포주)가 흑색종 모델 발생에 자주 사용된다. 흑색종의 전이를 연구하는데 적합한 동물 모델에 관한 추가의 상세 내역은 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: 예를 들어, Gattoni-Celli et al., Pigment Cell Res., 6(6): 38-34 (1993) and Rusciano et al., Invasion Metastasis, 14 (1-6): 349-361 (1994-95)].
본 발명의 동물 모델을 사용하여 연질 조직 및/또는 뼈 전이를 예방 또는 치료하는데 유용한 물질 (이는 부가적으로, 원발성 종양을 치료하는데 유효할 수 있다)을 스크리닝할 수 있다. 유용한 약물을 스크리닝하는 것은 일정 용량 범위에 걸친 시험 물질을 동물 모델에게 투여하고, 존재하는 원발성 및 이차 종양의 상태에 대한 상기 물질의 효과에 대해 각종 시점에서 검정하는 것을 포함한다.
한 양태에서는, 시험 물질을 일정 용량 범위에 걸쳐 동물에게 투여하고, 일정 시간에 따른 상기 화합물에 대한 동물의 생리학적 반응을 평가함으로써, 상기 시험 물질을 스크리닝한다. 투여는 평가하고자 하는 화합물의 화학적 특성에 따라서 경구이거나, 또는 적합한 주사일 수 있다. 몇몇 경우에는, 상기 화합물을, 이러한 화합물의 효능을 증강시킬 수 있는 조인자와 연계해서 투여하는 것이 적당할 수 있다.
특정 질병이나 질환을 치료하는데 사용하기 위한 약물을 스크리닝하는 것 이외에도, 본 발명의 방법은 특정 약물의 작용 기전 또는 효능을 연구하고/하거나 상기 질병이나 질환을 예방 또는 치료할 목적으로 치료적 섭생을 고안하는데 있어 또한 유용하다. 예를 들어, 특정 질병이나 질환이 발병하기 이전, 발병과 동시에 또는 발병 후에, 특정한 식이, 정기적인 운동, 방사선 치료, 화학요법 및/또는 본원에서 확인된 하나 이상의 화합물을 병용해서 동물을 치료할 수 있다. 이러한 전반적인 요법 또는 섭생은 질병이나 질환과 싸우는데 있어 화합물 단독을 이용한 치료 보다 더 유효할 수 있다.
본 발명의 트랜스제닉 동물을 사용하는 스크린은 동물 모델에서 용이하게 평가할 수 있는 암과 연관된 모든 현상을 이용할 수 있다. 원발성 종양 성장, 및 연질 조직 및 뼈 전이에 대한 시험 물질의 개별적 효과는 당해 분야에 널리 공지된 기술 (이에는 일차 및 이차 종점이 포함된다)에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 원발성 또는 이차 종양에 대한 시험 물질의 효과는 종양 크기, 종양 발생수 (수) 및 지향성 (부위)을 측정하고; 시험 물질로 처리하기 전, 동안 및/또는 후에 종양 세포에 의한 내인성 TGF-β 생성을 측정하며; 시험 물질로 처리하기 전, 동안 및/또는 후에 혈청 TGF-β 수준을 결정하고; 조직학적으로 스코어링한 다음, 각종 영상화 기술 [마이크로컴퓨터 단층촬영술 (마이크로-CT; μCT) 영상화 포함]에 의해 영상화함으로써 모니터링할 수 있다. 연질 조직에서는 다수의 조직 박편을 제조하고 이를 개별적으로 검사하는 시간-소모적 공정을 사용하지 않고서는 작은 전이성 종양을 탐지하고 이를 정량화하는 것이 어렵기 때문에, 이러한 전이 뿐만 아니라 뼈 전이에 대해서도 마이크로-CT가 특히 유용하다.
마이크로-CT (x-선 미세단층촬영술)는 크기가 수 밀리미터인 표본의 2D 및 3D X-선 감쇠 지도를 창출시키기 위해 사용되는 비-파괴적 기술이다. 마이크로-CT 기술을 사용하여 폐를 생체외에서 영상화하기 위해, 폐를 ISOVIEW™ 시약 (CT 조영제, 요오드 당)에 적실 수 있다. 이어서, 대두유를 서서히 주입하여 상기 조영제를 기도로부터 제거한다. 영상을 각종 해상도로 생기게 할 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 대부분의 영상은 16-μ 해상도로 생기게 한 것이다. 이러한 기술은 조직학과 부합되고, 3차원적 가시화 소프트웨어는 판독자가 덩어리를 가능한 종양으로서 인정하거나 거부할 수 있게 해준다.
생체 내에서 수행할 수 있는 또 다른 영상화 기술은 루시퍼라제 활성의 생물발광 영상화에 의존한다. 생체내 생물발광 기술은 널리 공지되어 있고 광범위하게 사용되고 있는 영상화 기술이다. 이 기술은 루시퍼라제 단백질을 발현하는 세포의 비-침윤성 영상화 및 정량화를 가능케 한다. 이러한 검정에 사용된 주요 루시퍼라제는 초파리 (phytonis pyralis)로부터의 것이다. 이 효소는 짧은 시험관내 반감기 (37℃ 하에서 대략 3분)와 생체내 반감기 (대략 90분)를 갖는다. 반감기가 보다 긴 돌연변이체가 또한 시판되고 있다. 종양을 생체내 영상화하기 위해, 종양 세포, 예를 들어 유방 종양 세포를 루시퍼라제로 형질감염시키고, 이를 수용자 동물 (예: 마우스)에 이식한다. 이식 후, 종양 형성에 충분한 시간이 경과한 후, 루시페린을 종양-보유 동물 (예: 마우스)에게 복강내 주사한다. 루시퍼라제 효소의 존재 하에 루시페린, ATP 및 산소의 반응에 의해 생성된 생물발광을 CCD 카메라로 사진찍을 수 있다.
전이성 암을 형광성 단백질을 이용하여 생체내 영상화하는 것에 관한 설명은, 예를 들어 다음 문헌을 참고할 수 있다 [참고: Hoffman, Cell Death and Differentiation, 9: 786-789 (2002)].
시험 물질은 특별히 제한되지 않지만, 그의 예에는 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, 비-펩티드 유기 소분자, 합성 화합물, 발효 생성물 및 세포 추출물이 포함된다.
후보 물질에는 수 많은 화학적 부류가 포괄되지만, 전형적으로 이들 물질은 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 50 이상 약 2,500 달톤 미만인 작은 유기 화합물이다. 후보 작용제는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 관능기를 포함하고, 이에는 전형적으로, 적어도 아민, 카보닐, 히드록실 또는 카복실기, 바람직하게는 화학적 관능기들 중의 2개 이상이 포함된다. 후보 작용제는 종종, 사이클릭 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및/또는 상기 관능기들 중의 하나 이상에 의해 치환된 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 후보 작용제는 또한, 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리디민, 그들의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 생체 분자들 중에서 발견되기도 한다.
후보 물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 광범위한 공급원으로부터 수득한다. 예를 들어, 광범위한 유기 화합물 및 생체 분자를 무작위 및 유도 합성하는데 이용 가능한 수 많은 수단이 있고, 이에는 무작위화 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현이 포함된다. 또 다른 한편, 세균성, 진균성, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 입수 가능하거나 용이하게 생성된다. 부가적으로, 천연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통하여 용이하게 변형시키고, 이를 사용하여 조합적 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 공지된 약리학적 작용제를 대상으로 하여, 유도 또는 무작위 화학적 변형, 예를 들어 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등을 수행하여 구조적 유사체를 생성시킬 수 있다.
후보 물질에는 구체적으로, 항체, 예를 들어 항-TGF-β 항체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
몇 가지 TGF-β1 서열이 분리, 클로닝 및 서열 분석되었다. 본 발명을 실시하는데 있어서, 예를 들어 TGF-β1 길항제를 생성시키는데 사용하기 적합할 수 있는 TGF-β1 서열 목록 뿐만 아니라 이러한 서열과 관련된 유전자은행 승인 번호가 제공된다:
인간 TGF-βl AA459172
소의 TGF-β1 M36271
전구체 인간 TGF-βl E00973; X02812;
양 (Ovis) X76916; J05114; M38449;
TGF-β1 L36038 M55656
돼지의 TGF-βl M23703; X12373
개의 TGF-βl L34956
햄스터 TGF-β1 X60296
랫트 TGF-β1 X52498
뮤린 TGF-βl M13177.
본원에서의 항체는 단일-특이적, 이중-특이적 또는 삼중-특이적, 또는 그 이상의 다중-특이성을 지닐 수 있다. 다중-특이적 항체는 단일 분자의 상이한 에피토프에 대해 특이적일 수 있거나 [예: F(ab')2 이중-특이적 항체], 또는 상이한 분자 상의 에피토프에 대해 특이적일 수 있다. 다중-특이적 항체의 고안 및 제조 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983); Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992); and WO 93/17715]. 삼중-특이적 항체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)].
특히, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [참고: Brennan et al., Science. 229: 81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질분해적으로 절단시켜 F(ab')2 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시킨다. 이어서, 이로써 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 다음, Fab'-TNB 유도체들 중의 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰 량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중-특이적 항체를, 효소를 선택적으로 고정화시키기 위한 작용제로서 사용할 수 있다. 추가의 양태에서는, 이. 콜라이 (E. coli)로부터 직접적으로 회수한 Fab'-SH 단편을 시험관 내에서 화학적으로 커플링시켜 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)].
재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체를 직접적으로 제조 및 분리하기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 루이신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생성시켰다 [참고: Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 이러한 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시켰다. 이 방법을 또한, 항체 동종-이량체 생성을 위해 활용할 수 있다. 문헌 [참고: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 기전을 제공해 주었다. 이 단편은 동일한 쇄 상에서 다음 2개의 도메인들 간에 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또 다른 전략이 또한 보고된 바 있다 [참고: Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)]. 또 다른 한편, 이중-특이적 항체는 문헌 [참고: Zapata et al., Protein Eng., 8 (10): 1057-1062 (1995)]에 기재된 바와 같이 생성된 "선형 항체"일 수 있다.
이중-특이적 항체에는 가교 결합되거나 또는 "이종-접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종-접합체 내의 항체들 중의 하나를 아비딘과 커플링시킬 수 있고, 다른 하나는 바이오틴과 커플링시킨다. 이종-접합체 항체는 통상적인 모든 가교 결합 방법을 이용하여 만들 수 있다. 적합한 가교 결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 수 많은 가교 결합 기술과 함께, 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.
항체에 대한 기타 변형이 고려된다. 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 유효성을 증강시키도록 효과기 기능 측면에서 항체를 변형시키는 것이 요망될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역 내로 도입함으로써, 이러한 영역 내에 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 발생된 동종-이량체성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개성 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 지닐 수 있다 [참고: Caron et al., J. Exp Med.. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)]. 항종양 활성이 증강된 동종-이량체성 항체는 다음 문헌에 기재된 바와 같이 이종-이관능성 가교 결합제를 사용하여 제조할 수도 있다 [참고: Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)].
항체를 생성시키기 위한 각종 기술이 개발되었다. 전통적으로, 항체 단편은 본래 항체의 단백질분해적 분해를 통하여 유래되었다 [참고: 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science. 229: 81 (1985)]. 그러나, 이들 단편 뿐만 아니라 전장 항체 및 기타 항체는 현재, 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생성될 수 있는데, 여기서는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 서열을 수득한다. 항체-생산 세포 (예: 하이브리도마 세포)로부터 목적하는 DNA 서열을 분리한 다음, 이를 서열 분석할 수 있다. 또 다른 한편, 뉴클레오티드 합성기 또는 PCR 기술을 이용하여 DNA를 합성할 수 있다. 일단 수득되면, 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNAs를, 원핵성 또는 진핵성 숙주에서 이종 폴리뉴클레오티드를 복제, 발현 및 분비할 수 있는 재조합 벡터 내로 삽입한다. 예를 들어, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수할 수 있고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)]. 또 다른 양태에서는, F(ab')2 분자의 어셈블리를 촉진시키는 루이신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')2를 형성시킨다. 또 다른 접근법에 따르면, 전장 항체 또는 Fab 또는 F(ab')2 단편 또는 기타 항체를 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 분리할 수 있다. 당해 분야에서 입수 가능하고 공지되어 있는 많은 벡터를 본 발명의 목적을 위해 사용할 수 있다. 적당한 벡터의 선택은 주로, 삽입하고자 하는 핵산의 크기와, 벡터로 형질전환시키고자 하는 특정한 숙주 세포에 좌우될 것이다.
일반적으로, 숙주 세포와 상용성인 종으로부터 유래되는 제어 서열 및 레플리콘을 함유하는 재조합 벡터를, 본 발명의 특이적 벡터 구축을 위한 모 벡터로서 사용한다. 이러한 벡터는 통상적으로, 주쇄 성분으로서 복제 기점 부위를 수반하고 있을 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공해줄 수 있는 서열을 만든다. 복제 기점 부위는 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 해주는 핵산 서열이다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서는 상기 서열이, 벡터가 숙주 염색체성 DNA와는 비-의존적으로 복제할 수 있게 해주는 것이며, 이에는 복제 기점 또는 자기 복제성 서열이 포함된다. 이러한 서열은 각종 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 세균에 적합하다.
발현 및 클로닝 벡터는 선별성 마커로 지칭되기도 하는 선별 유전자를 함유할 수 있다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 영양요구성 결핍증을 보충해 주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터는 입수 가능하지 않은 결정적 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 암호화한다. 선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 활용한다. 이종 유전자로 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 단백질을 생산하므로, 선별 계획에도 불구하고 살아 남는다. 이. 콜라이 형질전환에 적합한 플라스미드 벡터의 예는 pBR322이다. pBR322는 앰피실린 (Amp) 및 테트라사이클린 (Tet) 내성을 암호화하는 유전자를 함유하므로, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공해준다. pBR322 또는 기타 미생물성 플라스미드 또는 박테리오파지의 유도체를 모 벡터로서 사용할 수도 있다. 특별한 항체의 발현을 위해 사용된 pBR322 유도체의 예가 다음 문헌에 상세히 기재되어 있다 [참고: Carter et al., U.S. Patent No. 5,648,237].
또한, 숙주 유기체와 상용성인 제어 서열 및 레플리콘을 함유하는 파지 벡터를, 이들 숙주와 연계해서 형질전환 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 감수성 숙주 세포 (예: 이. 콜라이 LE392)를 형질전환시키는데 사용할 수 있는 재조합 벡터를 제조하는데 있어 박테리오파지, 예를 들면, λGEM.TM.-11을 활용할 수 있다.
한 가지 바람직한 양태에서는, 상기 과정이 항체의 경쇄 부분과 중쇄 부분의 발현을 일시적으로 격리시킨다. 특히, 이러한 과정은 바람직하게는, 중쇄와 경쇄를 각각 암호화하는 2개의 별도의 해독 단위로 숙주 세포를 형질전환시키고; 경쇄와 중쇄가 순차적 방식으로 발현되도록 하는데 적합한 조건 하에 상기 세포를 배양함으로써, 경쇄와 중쇄 생성을 일시적으로 격리시키며; 경쇄와 줄쇄를 기능적 항체 내로 어셈블리할 수 있게 하는 것을 포함한다.
상기 양태의 한 가지 바람직한 국면에서는, 경쇄와 중쇄를 별개로 제어하는 2개의 상이한 프로모터 (이러한 상이한 프로모터는 상이한 조건 하에 활성화된다)를 활용함으로써, 경쇄와 중쇄의 일시적으로 격리된 발현을 실현시킨다. 예를 들어, 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNAs를 단일 플라스미드 벡터 내로 혼입시키지만, 2개의 해독 단위 (이들 각각은 상이한 프로모터에 의해 제어된다)로 나누어진다. 하나의 프로모터 (예를 들어, 제1 프로모터)는 구성성 또는 유도성일 수 있는 반면, 다른 프로모터 (예를 들어, 제2 프로모터)는 유도성이다. 따라서, 이러한 벡터로 형질전환시킨 숙주 세포를 하나의 프로모터 (예를 들어, 제1 프로모터)를 활성화시키는데 적합한 조건 하에 배양하는 경우에는, 1개의 쇄 (예: 경쇄) 만이 발현된다. 그 다음, 제1 쇄 (예: 경쇄)의 목적하는 발현 기간 후, 배양 조건을 다른 프로모터 (예를 들어, 제2 프로모터)의 활성화에 적합한 조건으로 변화시키므로, 제2 쇄 (예: 중쇄)의 발현을 유도시킨다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 경쇄를 먼저 발현시킨 다음, 중쇄를 발현시킨다. 또 다른 양태에서는, 중쇄를 먼저 발현시킨 다음, 경쇄를 발현시킨다.
구체적으로 언급하면, 한 가지 바람직한 양태에 따르면 재조합 벡터는 적어도 2개의 해독 단위를 포함하는데, 하나는 경쇄 발현을 위한 것이고 다른 하나는 중쇄 발현을 위한 것이다. 더우기, 경쇄와 중쇄에 대한 2개의 해독 단위는 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 그의 발현을 제어하는 암호화 서열 (일반적으로, 약 100 내지 1000 bp)의 출발점에 대해 하단 (5')에 위치한 비해독 서열이다. 이러한 프로모터는 전형적으로 2가지 부류, 즉 유도성 및 구성성으로 나누어진다. 유도성 프로모터는 배양 조건 상의 몇 가지 변화, 예를 들어 영양분의 존재 또는 부재, 또는 온도나 pH 상의 변화에 반응하여 그들의 제어 하에 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시시키는 프로모터이다.
이러한 양태의 목적상, 제1 쇄 발현을 때 맞추어 제어하는 제1 프로모터로서 구성성 또는 유도성 프로모터를 사용할 수 있고, 후속 제2 쇄 발현을 제어하는 제2 프로모터로서 유도성 프로모터를 사용한다. 바람직한 양태에서는, 제1 프로모터와 제2 프로모터 둘 다가 엄격한 조절 하에 있는 유도성 프로모터이다. 각종의 잠재적 숙주 세포에 의해 인식된 수 많은 프로모터가 널리 공지되어 있다. 선별된 프로모터 서열은 제한 효소 분해를 통하여 공급원 DNA로부터 분리할 수 있고, 이를 본 발명의 벡터 내로 삽입할 수 있다. 또 다른 한편, 선별된 프로모터 서열은 합성할 수 있다. 본래의 프로모터 서열과 많은 이종 프로모터 둘 다를 사용하여 표적 유전자의 증폭 및/또는 발현을 지시할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가 바람직한데, 이는 이들이 일반적으로, 본래의 표적 폴리펩티드 프로모터와 비교해서 보다 큰 전사 수준을 허용해주고, 발현된 표적 유전자를 보다 높은 수율로 산출시키기 때문이다.
원핵성 숙주의 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 또는 trc 프로모터가 포함된다. 그러나, 세균에서 기능적인 기타 프로모터 (예를 들어, 기타 공지된 세균성 또는 파지 프로모터)가 또한 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열이 공개되었기 때문에, 당업자는 목적하는 어떠한 제한 부위도 공급해주는 적응인자 또는 링커를 사용하여 표적 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 해독 단위에 상기 서열을 작동적으로 연결시킬 수 있다 [참고: Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)]. 바람직한 프로모터는 phoA, tacI, tacII, lpp, lac-lpp, lac, ara, trp, trc 및 T7 프로모터이다. 본 발명에 사용하기 보다 바람직한 프로모터는 phoA 프로모터 및 tacII 프로모터이다. 진핵성 숙주 세포에서 기능적인 프로모터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제6,331,415호에 기재되어 있다. 이러한 프로모터의 예에는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 또는 원숭이 바이러스 40 (SV40)으로부터 유래된 것이 포함될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 각 해독 단위는 삽입된 유전자의 충분한 발현에 필요한 부가의 비해독 서열을 함유한다. 이러한 재조합 벡터의 필수 서열은 당해 분야에 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 출발 코돈에 대해 5'에 위치한 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno) 영역, 및 해독 단위의 3'-말단에 위치한 전사 종결인자 (예: λt0)가 포함된다.
재조합 벡터의 각 해독 단위는 추가로, 발현된 쇄 폴리펩티드가 막을 가로질러 분비되도록 지시하는 신호 서열 성분을 포함한다. 일반적으로, 분비 신호 서열은 벡터의 한 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 표적 폴리펩티드 DNA의 일부일 수 있다. 본 발명의 목적상 선택된 분비 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이여야 한다. 이종 폴리펩티드에 대한 본래의 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 않는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열-안정한 장독소 II (STII) 리더, LamB, PhoE, PelB, OmpA 및 MBP로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열로 치환시킨다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 발현 시스템의 양 해독 단위에 사용된 신호 서열이 STII 신호 서열 또는 그의 변이체이다. 바람직하게는, 이러한 신호 서열을 암호화하는 DNA를 판독 프레임 내에서, 경쇄 또는 중쇄를 암호화하는 DNA의 5'-말단에 연결시켜 융합 폴리펩티드를 생성시킨다. 숙주 세포의 세포질로부터 일단 분비되면, 신호 펩티드 서열은 성숙한 폴리펩티드로부터 효소적으로 절단 제거된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 국면에서는, 발현 타이밍 이외에도, 경쇄 발현과 중쇄 발현의 정량적 비를 또한 조정하여, 분비되어 정확하게 어셈블리된 항체의 수율을 최대화한다. 이러한 조정은 재조합 벡터 상의 경쇄와 중쇄에 대한 해독 강도를 동시에 조정함으로써 수행한다. 해독 강도를 조정하기 위한 한 가지 기술이 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Simmons et al. U.S. Pat. No. 5,840,523]. 간략하게 언급하면, 상기 접근법은 해독 단위 내의 해독 개시 영역 (TIR)의 변이체를 활용한다. 소정의 TIR에 대해서는, 일정 범위의 해독 강도를 지닌 일련의 아미노산 또는 핵산 서열 변이체를 창출시킴으로써, 특이적 쇄의 목적하는 발현 수준을 위해 상기 인자를 조정시킬 수 있는 편리한 수단을 제공할 수 있다. TIR 변이체는 아미노산 서열을 변경시킬 수 있는 코돈 변화를 가져다 주는 통상적인 돌연변이 유발 기술에 의해 생성시킬 수 있긴 하지만, 뉴클레오티드 서열 상의 침묵 변화 (다음에 기재되는 바와 같음)가 바람직하다. TIR 내에서의 변경에는, 예를 들어 신호 서열 상의 변경과 함께, 샤인-달가르노 서열의 수 또는 공간 상의 변경이 포함될 수 있다.
돌연변이체 신호 서열을 생성시키기 위한 한 가지 바람직한 방법은 신호 서열의 아미노산 서열은 변화시키지 않는 (즉, 변화는 침묵 변화이다) 암호화 서열의 맨 처음에 "코돈 뱅크"를 생성시키는 것이다. 이는 각 코돈의 제3의 뉴클레오티드 위치를 변화시킴으로써 달성시킬 수 있으며; 부가적으로, 루이신, 세린 및 아르기닌과 같은 몇몇 아미노산은 상기 뱅크를 만드는데 있어 복잡성을 부가해줄 수 있는 다중 제1 및 제2 위치를 갖는다. 이러한 돌연변이 유발 방법은 문헌 [참고: Yansura et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4: 151-158 (1992)]에 상세히 기재되어 있다.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 상기 언급된 고등 진핵생물이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물에는 유박테리아 (eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들면, 엔테로박테리아세애 (Enterobacteriaceae), 예를 들어, 에스케리챠 (Escherichia) (예: 이. 콜라이), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 쉬겔라 (Shigella) 뿐만 아니라 바실루스, 예를 들면, 비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예: 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들면, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)가 포함된다. 한 가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 기타 균주, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 단지 예시적이며, 이에 제한되지 않는다.
원핵생물 이외에도, 필라멘트상 진균 또는 효모와 같은 진핵성 미생물이 항체-암호화 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 하등 진핵성 숙주 미생물 중에서는, 삭카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 제빵 효모가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 수 많은 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 입수 가능하고 본원에 유용한데, 예를 들면, 쉬조삭카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미이 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 더모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토르스 (Pichia pastors) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어, 쉬와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 팔라멘트상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실륨 (Penicillium), 톨리포클라듐 (Tolypocladium), 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니거 (A. niger)가 있다.
항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포에는 또한, 무척추동물 세포, 예를 들어 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수 많은 바쿨로바이러스성 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충: caterpillar), 애데스 애깁티 (Aedes aegypti) (모기: mosquito), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노개스터 (Drosophila melanogaster) (초파리: fruitfly), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 상응하는 증식 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염시키기 위한 각종 바이러스성 세균, 예를 들어, 아우토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수 가능하고, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따르는 바이러스로서 사용할 수 있다. 면, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 활용할 수도 있다.
유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 현탁 배양 하에 성장하도록 아클로닝된 인간 배아 신장주 293 세포 [참고: Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)]; 유아 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO; 참고: Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포 [TM4; 참고: Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개의 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [참고: Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 주 (Hep G2)이다.
항체 생성을 위해 숙주 세포를 상기 언급된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환시키고; 프로모터를 유도시키거나, 형질전환체를 선별하거나 또는 목적하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키는데 적당한 바와 같이 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양한다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성시키기 위해 사용된 원핵성 세포는 당해 분야에 공지되어 있고 선별된 숙주 세포의 배양을 위해 적합한 배지에서 성장시킨다. 적합한 배지의 예에는 필수 영양분 보충물이 부가된 루리아 육즙 (LB)이 포함된다. 바람직한 양태에서는, 상기 배지가 또한, 발현 벡터 구축을 기초로 하여 선택된 선별 작용제를 함유하여, 이러한 발현 벡터를 함유하는 원핵성 세포의 성장을 선택적으로 허용해 준다. 예를 들어, 앰피실린-내성 유전자를 발현하는 세포의 성장을 위해 앰피실린을 배지에 가한다. 탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 모든 필수 보충물이, 단독으로 도입되거나 또는 또 다른 보충물 또는 배지 (예: 복합 질소원)과의 혼합물로서 도입된 적당한 농도로 포함될 수 있다. 임의로, 배양 배지가 글루타치온, 시스테인, 시스타민, 티오글리콜레이트, 디티오에리트리톨 및 디티오트레이톨로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 환원제를 함유할 수 있다.
원핵성 숙주 세포를 적합한 온도 하에 배양한다. 예를 들어, 이. 콜라이 성장에 바람직한 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 39℃, 보다 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 37℃, 보다 더 바람직하게는 약 30℃이다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라서 약 5 내지 약 9 범위 내의 모든 pH 값일 수 있다. 이. 콜라이의 경우, pH가 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.4, 보다 바람직하게는 약 7.0이다.
본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 진핵성 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 각종 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 시판용 배지, 예를 들면 햄스 (Ham's) F10 (공급처: Sigma), 최소 필수 배지 [(MEM); 공급처: Sigma], RPMI-1640 (공급처: Sigma), 및 둘벡코 변형 이글 배지 [(DMEM); 공급처: Sigma]가 포유류 진핵성 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 다음 문헌에 기재된 배지 중의 어떠한 것도 숙주 세포에 대한 배양 배지로서 사용할 수 있다 [참고: Ham and Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979); Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102: 255 (1980); U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; or 4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Pat. Re. 30,985; or U.S. 5,122,469]. 이들 배지 모두는 필요에 따라, 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (예: 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제 (예: HEPES), 뉴클레오시드 (예: 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예: 젠타마이신), 미량 원소 (마이크로몰 범위의 최종 농도로 통상 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가 에너지원으로 보충시킬 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
숙주 세포가 일단 특정 밀도로 성장하게 되면, 배양 조건을 변형시켜 단백질(들)의 합성을 촉진시킨다. 유도성 프로모터(들)가 상기 언급된 바와 같은 이중-프로모터 벡터에 사용되는 경우에는, 이러한 프로모터의 활성화에 적합한 조건 하에서 단백질 발현을 유도시킨다. 바람직한 양태에서는, 양 프로모터가 유도성이다. 보다 바람직하게는, 이중 프로모터가 각각 phoA 및 tacII이다. 예를 들어, phoA 프로모터가 경쇄의 전사를 제어하는데 사용되고 tacII 프로모터가 중쇄의 전사를 제어하는데 사용되는 벡터를 만들 수 있다. 제1 유도 단계 동안에는, 이러한 phoA/tacII 이중 프로모터 벡터로 형질전환시킨 원핵성 숙주 세포를, phoA 프로모터의 유도와 경쇄의 발현을 위해 인산염-제한 배지에서 배양한다. 경쇄 발현을 위한 목적하는 시간이 지난 후, 충분한 양의 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 상기 배양물에 가하여 tacII 프로모터를 유도시키고 중쇄를 생성시킨다.
한 국면에서, 세균성 세포가 숙주 세포로서 이용되는 경우에는, 항체가 세포질에서 발현될 수 있다. 각종 방법을 사용하여 이. 콜라이 세포질에서 가용성 및 기능적 항체의 생성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, trxB 유전자가 결핍된 이. 콜라이 균주가 세포질에서의 디설파이드 결합 형성을 증강시키므로, 이것이 세포질에서 적당한 디설파이드 결합 형성을 나타내는 기능적 항체 분자의 발현을 증진시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다 [참고: Proba et al., Gene, 159: 203-207 (1995)]. 항체 변이체가 VH와 VL 모두에서 디설파이드 결합 형성을 요구하지 않도록 하기 위해, 시스테인 잔기를 대체하기 위한 항체 변이체를 만들 수 있으며, 따라서 이러한 항체 변이체 [때때로, "인트라보디 (intrabody)"로서 지칭됨]는 효율적인 디설파이드 브릿지 형성과 부합되지 않은 환원성 조건, 예를 들어 세균 세포질에서 만들 수 있다 [참고: Proba et al., J. Mol. Biol., 275: 245-253 (1998)].
분비 신호 서열이 사용된 경우에는, 발현된 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드가 숙주 세포의 원형질막 주위공간 (periplasm) 내로 분비되어, 이로부터 회수된다. 단백질 회수는 전형적으로, 미생물을 일반적으로 삼투압 쇽, 초음파 처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 붕괴시키는 것을 포함한다. 세포가 일단 붕괴되면, 세포 부스러기 또는 완전 세포를 원심분리 또는 여과함으로써 제거할 수 있다. 단백질을, 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피함으로써 추가로 정제할 수 있다. 또 다른 한편, 단백질을 배양 배지 내로 수송하고, 이 안에서 분리시킬 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상등액을 여과시킨 다음, 생성된 항체의 추가 정제를 위해 이를 농축시킬 수 있다. 발현된 항체를 추가로 분리시키고, 통상적으로 공지된 방법, 예를 들어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 웨스턴 블롯 (Western blot) 검정을 이용하여 확인할 수 있다.
항체를 발효 공정에 의해 대량으로 생성시킬 수 있다. 각종 대규모 공급-배치식 발효 과정이 재조합 단백질 생성을 위해 이용 가능하다. 대규모 발효기는 용량이 1000 리터 이상, 바람직하게는 약 1,000 내지 100,000 리터이다. 이들 발효기는 진탕기 임펠러, 또는 산소 및 영양분, 특히 글루코스 (바람직한 탄소/에너지원)을 분배시키기에 적합한 기타 수단을 이용한다. 소규모 발효는 일반적으로, 용적이 대략 100 리터 이하인 발효기 내에서의 발효를 지칭하는데, 이는 약 1 리터 내지 약 100 리터 범위일 수 있다.
발효 공정에서는, 단백질 발현 유도가 전형적으로, 세포를 적합한 조건 하에 목적 밀도, 예를 들어 약 180 내지 270의 OD550으로 성장시킨 후에 개시된다. 당해 분야에 공지되어 있고 상기 언급된 바와 같이, 이용된 벡터 구조물에 따라서 각종 유도제를 사용할 수 있다. 유도시키기에 앞서, 세포를 보다 단기간 동안 성장시킬 수 있다. 세포를 통상적으로 약 12 내지 50 시간 동안 유도시키지만, 보다 길거나 짧은 유도 시간을 사용할 수도 있다.
본원 항체의 생산 수율과 질을 추가로 개선시키기 위해, 각종 발효 조건을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 분비된 항체의 적당한 어셈블리와 폴딩을 개선시키기 위해, 샤프롱 (chaperone) 단백질, 예를 들어 Dsb 단백질 (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD 및/또는 DsbG) 또는 FkpA (샤프롱 활성을 지니고 있는 펩티딜프로필 시스,트랜스-이소머라제)를 과발현하는 부가의 벡터를 사용하여 숙주 원핵성 세포를 동시-형질전환시킬 수 있다. 샤프롱 단백질은 세균성 숙주 세포에서 생성된 이종 단백질의 적당한 폴딩과 용해도를 촉진시키는 것으로 입증되었다 [참고: Chen et al., J. Bio. Chem., 274: 19601-19605 (1999); U.S. Pat. Nos. 6,083,715 and 6,027,888; Bothmann and Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17100-17105 (2000); Ramm and Pluckthun, J. Biol. Chem., 275: 17106-17113 (2000); Arie et al., Mol. Microbiol., 39: 199-210 (2001)].
예를 들어, 원핵성 숙주 세포에서 발현된 이종 단백질 (특히, 단백질분해적으로 민감한 단백질)의 단백질분해를 최소화하기 위해서는, 단백질분해적 효소가 결핍된 특정 숙주 균주를 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 원핵성 숙주 세포 균주를 변형시켜, 공지된 세균성 프로테아제, 예를 들어 프로테아제 III, OmpT, DegP, Tsp, TonA, PhoA, 프로테아제 I, 프로테아제 Mi, 프로테아제 V, 프로테아제 VI 및 그들의 조합물을 암호화하는 유전자에서 유전적 돌연변이(들)를 수행할 수 있다. 몇몇 이. 콜라이 프로테아제-결핍성 균주가 입수 가능하고, 이는 예를 들어, 문헌 [참고: Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 2773-2777 (1998); U.S. Pat. Nos. 5,264,365 and 5,508,192; Hara et al. Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)]에 기재되어 있다. 가장 바람직하게는, 이것이 △ptr 또는 △prc prc-저해인자를 함유하는 유전형을 갖는다.
특정 양태에서는, 세포독성제와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체를 만들고, 이를 사용한다. 바람직하게는, 면역접합체 및/또는 이와 결합되는 항원을 세포에 의해 내재화시키면, 그와 결합되는 표적 세포를 사멸시키는데 있어서의 면역접합체의 치료적 효능이 증가된다. 바람직한 양태에서는, 세포독성제가 표적 세포 내의 핵산을 표적으로 하거나 이를 방해한다.
특정 항체와, 하나 이상의 소분자 독소, 예를 들어 칼리케아미신 (calicheamicin), 마이탄신 (maytansine) [참고: 미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 (trichothene) 및 CC1065와의 접합체가 또한 본원에 고려된다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태에서는, 항체를 하나 이상의 마이탄신 분자와 접합시킨다 (예를 들어, 항체 분자당 약 1 내지 약 10개의 마이탄신 분자). 마이탄신은 예를 들어, May-SS-Me로 전환시킬 수 있고, 이를 환원시켜 May-SH3를 수득하고 이를 변형된 항체 [참고: Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]와 반응시켜 마이탄신-항체 면역접합체를 생성시킬 수 있다.
관심있는 또 다른 면역접합체는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된 항체를 포함한다. 칼리케아미신 계열의 항생제는 이본쇄 DNA 절단물을 피코몰 이하 농도로 생성시킬 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체에는 γ1 I, α2 I, α3 I, N-아세틸-γ1 I, PSAG 및 θI 1이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다 [참고: Hinman et al., Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993) and Lode et al., Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998); U.S. Patent Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; and 5,773,001].
사용될 수 있는 효소적 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄 [슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨], 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모노르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신 (curcin), 크로틴 (crotin), 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다 [참고: 1993년 10월 28일자로 공개된 WO 93/21232].
본 발명은 특정 항체와, 핵산분해 활성을 지닌 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 간에 형성된 면역접합체를 추가로 고려한다.
각종 방사성 동위원소가 방사성접합된 항체 생성을 위해 이용 가능하다. 이의 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.
각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들어, N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예를 들면, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디석신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 [예: 비스 (p-아지도벤조일)헥산디아민], 비스-디아조늄 유도체 [예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민], 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여, 항체와 세포독성제의 접합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌 [참고: Vitetta et al., Science. 238: 1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)이, 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이트제의 한 예이다 [참고: WO 94/11026]. 이러한 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시켜 주는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드 함유 링커 [참고: Chari et al., Cancer Research, 52: 127-131 (1992)]를 사용할 수 있다.
또 다른 한편, 항체와 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 만들 수 있다.
또 다른 양태에서는, 항체를 종양 예비표적화에 활용하기 위해 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 접합시킬 수 있는데, 이러한 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 다음, 제거제 (clearing agent)를 사용하여 결합되지 않은 접합체를 순환시 제거하고, 이어서 세포독성제 (예: 방사성핵종)와 접합되는 "리간드" (예: 아비딘)을 투여한다.
프로드럭 (prodrug)을 활성 항암 약물로 전환시켜 주는 프로드럭-활성화 효소 (예: 펩티딜 화학요법제; 참고: W0 81/01145)에 항체를 접합시킴으로써, 항체를 ADEPT에 사용할 수도 있다 [참고: 예를 들어, WO 88/07378 및 U.S. Pat. No. 4,975,278].
ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분에는, 프로드럭이 그의 보다 활성인 세포독성 형태로 전환되도록 하는 방식으로 프로드럭 상에서 작용할 수 있는 모든 효소가 포함된다.
ADEPT 방법에 유용한 효소에는 포스페이트-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 더모리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화 프로드럭을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 탄수화물-절단성 효소, 예를 들어 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화시킨 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 β-락타마제; 및 그들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸기로 각각 유도체화시킨 약물을 자유 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들어 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 또 다른 한편, 당해 분야에서 "아브자임 (abzyme)"으로서 공지되기도 한, 효소적 활성을 지닌 항체를 사용하여 본 발명의 프로드럭을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [참고: 예를 들어, Massey, Nature, 328: 457-458 (1987)]. 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위하여, 항체-아브자임 접합체를 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 상기 논의된 이종-이관능성 가교결합 시약을 사용함으로써, 효소를 본원의 항체에 공유적으로 결합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분과 연결된, 본 발명의 항체의 적어도 항원 결합성 영역을 포함하는 융합 단백질을, 당해 분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 구축할 수 있다 [참고: Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)].
본원의 항체를 사용하여 종양 침투를 증가시킬 수 있다. 이러한 경우, 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 재이용 (salvage) 수용체 결합성 에피토프를 항체 내로 혼입시킴으로써 (예를 들면, 항체 내의 적당한 영역을 돌연변이시킴으로써 또는 에피토프를 펩티드 태그 내로 혼입한 다음, 이를 어느 한 말단 또는 중앙에서, 예를 들어 DNA 또는 펩티드 합성에 의해 항체에 융합시킴으로써) 달성할 수 있다 [참고: 1996년 10월 17일자로 공개된 WO 96/32478].
재이용 수용체 결합성 에피토프는 일반적으로, Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 항체의 유사한 위치에 전달한 영역으로 구성된다. 보다 더 바람직하게는, Fc 도메인의 1개 또는 2개 루프로부터의 3개 이상의 아미노산 잔기를 전달한다. 보다 더 바람직하게는, 에피토프를 Fc 영역 (예를 들면, IgG의 Fc 영역)의 CH2 도메인으로 부터 취하고, 이를 항체의 CH1, CH3, 또는 VH 영역, 또는 이러한 영역 하나 이상에 전달한다. 또 다른 한편, 에피토프를 Fc 영역의 CH2 도메인으로 부터 취하고, 이를 항체의 CL 영역 또는 VL 영역, 또는 둘 다 영역에 전달한다.
본원 항체의 공유적 변형 또한, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이는 적용 가능한 경우, 항체를 효소적 또는 화학적으로 절단하거나, 또는 화학적 합성에 의해 만들 수 있다. 항체의 기타 유형의 공유적 변형은, 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제를 항체의 표적화 아미노산 잔기와 반응시킴으로써, 해당 분자 내로 도입시킨다.
폴리펩티드의 공유적 변형의 예가 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다. 항체의 바람직한 유형의 공유적 변형은 항체를 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 기재된 방식으로, 각종 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 연결시키는 것을 포함한다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 또한, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 (예: 인간) 환자가 TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것인지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은
(a) 상기 환자로부터 수득한 암 세포의 TGF-β의 성장 억제 효과에 대한 민감성을 시험하는 단계;
(b) 상기 환자로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일을 수득하고, 이를 TGF-β 길항제를 이용한 치료에 대해 반응성인 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 환자로부터 수득한 암 세포가 TGF-β의 성장 억제 효과에 대해 민감하지 않고, 상기 치료에 대해 반응성인 상기 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다면, 이러한 환자는 TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것임을 확인하는 단계를 포함한다.
본원의 목적상, "유사한"이란 다음에 추가로 상세히 기재되는 바와 같이, 유전자 발현 프로파일을 측정하기 위해 사용된 검정 또는 기술에 따라서 양 또는 기타 측정 가능한 발현 파라미터에 있어 약 80 내지 100% 동일한, 보다 바람직하게는 약 90 내지 100% 동일한, 보다 바람직하게는 약 95 내지 100% 동일한 발현 패턴을 보여줌으로써, 발현 프로파일이 한 가지 이상 방식에서 서로 닮거나 연속되는 것을 의미한다. 환자로부터의 암 세포의 유전자 발현 프로파일과, 동물 모델로부터의 암 세포의 유전자 발현 프로파일은 일반적으로, 그들의 비교를 촉진시키기 위해 동일한 기술 또는 검정에 의해 수득한다.
각종 TGF-β 길항제 및 그들의 생성 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 보다 더 많은 것들이 현재 개발중이다 [참고: 예를 들어, Dennis et al., U.S. Pat. No. 5,821,227]. 이용된 특정의 TGF-β 길항제로만 제한되지 않고; 본원에 규정된 바와 같은 유효한 모든 TGF-β 길항제가 본 발명의 방법 및 조성물, 예를 들어 본원에 제공된 정의 내의 실시예들에서 유용하다.
이상적인 한 가지 TGF-β 길항제는 TGF-β에 대한 친화성이 높고, 생체내 및 시험관 내에서의 장기간 사용에도 안정적이며, 질병 과정을 유발 또는 악화시키는데 관여하는 "병리학적" TGF-β와, 다중 기관 시스템에서 정상적인 생체 항상성과 세포성 기능을 유지시키는데 관여하는 "생리학적" TGF-β 간을 몇몇 방식으로 식별해줄 수 있다. 본 발명을 사용하기 위해 기전(들)을 완전히 이해하는 것이 반드시 필요한 것은 아니지만, 본 발명의 한 양태에서는, 병리학적 과정이 TGF-β의 보다 광범위한 활성화와 연관이 있긴 하지만, TGF-β가 정상적인 생체 항상성을 유지시키는데 요구되고, 생성 부위에서 국소적으로 활성화되며 세포로부터 방출되지 않으면서 근처의 수용체와 신속하게 결합하는 경우에는, 세포-표면 결합성 도메인을 갖고 있지 않는, 상기 논의된 SR2F와 같은 비교적 거대한 길항제가 세포-관련 "생리학적 TGF-β"에 대한 불량한 접근을 나타낼 수 있지만, "병리학적" TGF-β를 효과적으로 중화시킬 수는 있다. 그러나, 본 발명은 특정한 기전으로만 제한되지 않는다.
암이 원발성 및 전이성 유방암을 포함한 유방암인 경우에는, 전술된 예후 방법이 부가적으로, 환자의 Her2 상태를 결정하는 단계를 부가적으로 포함할 수 있는데, 여기서 Her2+ 환자는 항상은 아니지만 전형적으로, TGF-β 길항제 단독 치료에 대해 반응하지 않거나 불충분한 수준으로 반응할 것으로 예상된다.
환자가 TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것으로 예상되는 경우에는, 전술된 단계에 이어, 유효량의 TGF-β 길항제를 단독으로 또는 유효량의 모든 화학요법제 및/또는 세포독성제 및/또는 기타 치료 양식 (방사선 요법 포함)과 병용해서 투여할 수도 있다.
유전자 발현 프로파일링 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 혼성화 분석 또는 폴리뉴클레오티드의 서열 분석에 기초한다. 특정 샘플에서 mRNA 발현을 정량화하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있고 가장 흔히 사용되는 방법에는 노던 블롯팅 (northern blotting) 및 계내 혼성화 [참고: Parker and Barnes, Methods in Molecular Biology, 106: 247-283 (1999)]; RNAse 보호 검정 [참고: Hod, Biotechniques, 13: 852-854 (1992)]; 및 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) [참고: Weis et al., Trends in Genetics, 8: 263-264 (1992)]이 포함된다. 또 다른 한편, 특이적 이중 나선, 예를 들어 DNA 이중 나선, RNA 이중 나선, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중 나선 또는 DNA-단백질 이중 나선을 인식할 수 있는 항체를 이용할 수 있다. 서열 분석에 의거하여 유전자 발현을 분석하기 위한 대표적인 방법에는 일련의 유전자 발현 분석 (SAGE), 및 대규모 병렬식 서명 서열 분석 (MPSS)에 의한 유전자 발현 분석이 포함된다. 이들 방법 모두, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법을 사용하여, 특정 환자 (예: 인간 환자), 및 TGF-β 길항제에 대해 반응성인 암 모델로서 제공되는 동물 (예: 마우스 모델)로부터 수득한 종양 세포의 유전자 발현 프로파일을 결정할 수 있다. 인간 환자의 경우에는, 종양 세포 공급원이 신선하거나, 동결되거나 고정되고 파라핀-봉매된 조직 샘플일 수 있는데, 이로부터 mRNA를 추출하고 이를 대상으로 하여 유전자 발현 분석을 수행할 수 있다.
또 다른 한편, 프로테오믹 (proteomic) 기술을 사용하여 인간 암 세포와 기준 (예: 마우스) 암 세포의 발현 프로파일을 비교할 수도 있다. 프로테오믹 프로파일은 생물학적 샘플 (예: 암 조직) 내에서의 복수 개의 단백질의 발현 패턴을 표현한 것이다. 발현 프로파일은, 예를 들어 질량 스펙트럼으로서 표현될 수 있지만, 단백질의 물리화학적 또는 화학적 특정에 기초한 기타 표현도 또한 포함된다. 따라서, 발현 프로파일은, 예를 들어 2차원적 겔 전기영동 (예: 2-D PAGE)에 의해 결정된 바와 같이, 단백질의 전기영동적 특성 상의 차이에 의거할 수 있고, 이는 예를 들어, 2차원적 전기영동 겔 내의 복수 개의 반점으로서 표현될 수 있다. 프로테오믹 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice), M.R. Wilkins et al., eds., Springer Verlag, 1007; 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link, editor, Humana Press, 1999; Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud editor, Springer Verlag, 2000; Proteome Research: Mass Spectrometry (Principles and Practice), P. James editor, Springer Verlag, 2001; Introduction to Proteomics, D.C. Liebler editor, Humana Press, 2002; Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R. Westermeier et al., eds., John Wiley & Sons, 2002].
추가의 국면에서, TGF-β 길항제를 이용한 치료에 반응하지 않거나 불충분한 수준으로 반응하는 환자는, 단독으로 투여되는 경우에는 상당한 항종양 효과를 나타내지 않지만, 유효량의 한 가지 이상의 화학요법제 또는 세포독성제 및/또는 방사선 요법과 병용되는 경우에는 종양에 대항하여 유효한 용량의 TGF-β 길항제를 투여하는 것을 포함하는 병용 요법으로 치료할 수도 있다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 포유류 (예: 인간) 환자에게 유효량의 TGF-β 길항제를 투여함으로써 이러한 환자에게서 종양 전이와 연관된 뼈 파괴 또는 뼈 손실을 치료하는 것에 관한 것이다. 이러한 뼈 파괴 또는 뼈 손실은 뼈에 침윤되는 원발성 및 이차 암을 포함한 여러 가지 이유로 인해 발생할 수 있다. 치료에는 뼈 파괴 또는 뼈 손실을 역전시키고, 뼈 파괴 또는 뼈 손실의 병리학적 과정을 중지 또는 느리게하는 것이 포함된다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제의 병용 요법 유효량을, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 투여하고, 임의로 유효 용량의 방사선 요법으로 치료하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자의 치료법을 제공해준다. 상기 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링한다. 병용 요법 유효량은, 상기 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여한 경우의 그들 각각의 유효량의 합 보다 적다. 상기 암이 바람직하게는, 유방암 (예: 전이성 유방암), 또는 결장직장암이다. 화학요법제는 바람직하게 탁소이드이다.
또 다른 국면에서, 본 발명은 TGF-β 길항제와 방사선 요법의 병용 요법 유효량을, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 투여하고, 임의로 항-혈관신생제 (예를 들어, VEGF와 특이적으로 결합하는 항체)로도 치료하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자의 치료법을 제공해준다. 상기 병용 요법 유효량은, TGF-β 길항제와 방사선 요법을 단일 작용제로서 개별적으로 투여한 경우의 그들 각각의 유효량의 합 보다 적다. 상기 암이 바람직하게는, 유방암 (예: 전이성 유방암), 또는 결장직장암이다.
추가 국면에서, 본 발명은 TGF-β 길항제와 항-혈관신생제의 병용 요법 유효량을, 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 투여하고, 임의로 유효량의 화학요법제 또는 세포독성제로도 치료하며; 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자의 치료법을 제공해준다. 항-혈관신생제는 바람직하게는, VEGF와 특이적으로 결합하는 항체이다. 한 국면에서, 상기 병용 요법 유효량은, TGF-β 길항제와 항-혈관신생제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여한 경우의 그들 각각의 유효량의 합 보다 적다.
본원의 TGF-β 길항제는 단독으로 사용하거나 또는 기타 요법의 조성물과 병용할 수 있다. 예를 들어, 상기 길항제는 TGF-β 이외의 기타 종양 관련 항원에 대항한 항체, 예를 들어 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 또는 VEGF 항원과 결합하는 하나 이상의 항체, 화학요법제(들) (화학요법제의 칵테일 포함), 세포독성제(들), 항-혈관신생제(들), 사이토킨, 및/또는 성장 억제제(들)과 함께 투여할 수 있다. 종양 성장을 또한 억제하는 한 가지 이상의 기타 요법제(들)과 항체를 병용하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 환자에게 병용 방사선 요법 (예: 방사성 표지된 작용제, 예를 들어 항체를 이용한 요법 또는 외부 빔 조사)을 적용할 수 있다. 이러한 병용 요법에는 병용 투여 (여기서는, 2가지 이상 작용제가 동일하거나 별도의 제형 내에 포함된다) 및 별도 투여 (여기서는, 상기 길항제의 투여를 부가 요법(들) 투여 이전, 및/또는 투여 후에 수행할 수 있다)가 포함된다. 성장 억제제에 대해 적합한 투여량이 현재 사용되고 있는 양이고, 이는 TGF-β 길항제와 함께 이용된 기타 작용제(들)의 상승 작용이 존재하는 경우에는 보다 적을 수 있다.
TGF-β 길항제 (및 부가 치료제)는 적합한 어떠한 수단에 의해서도 투여하는데, 이에는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원할 경우에는, 병변내 투여가 포함된다. 비경구 주입에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 상기 길항제를, 특히 이러한 길항제의 용량을 감소시키면서 펄스 주입함으로써 투여하는 것이 적합하다. 투여가 단시간 또는 장기간에 걸친 것인지에 따라서, 바람직하게는 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사함으로써 투약한다.
길항제 조성물은 우수한 의료 행위에 일관되는 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려해야 하는 요인에는 치료하고자 하는 특정 질환, 치료하고자 하는 특정 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 질병의 원인, 길항제 전달 부위, 길항제 유형, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의사에게 공지된 기타 요인들이 포함된다. 본 발명의 길항제를, 문제의 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 한 가지 이상 작용제와 함께 반드시 제형화할 필요는 없지만, 임의로 제형화할 수 있다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 길항제의 유형과 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 요인들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로, 전술된 바와 동일한 투여량과 투여 경로로 사용되거나, 또는 지금까지 이용된 투여량의 약 1 내지 99%이다.
질병을 예방 또는 치료하는데 적당한 항체 투여량 (단독으로 사용되거나, 또는 상기 인지된 바와 같은 화학요법제, 세포독성제, 성장 억제제 또는 항-혈관신생제, 또는 상이한 항원 또는 사이토킨에 대한 항체와 같은 기타 작용제와 병용하는 경우에 적당한 투여량)은 치료하고자 하는 질병의 유형, 길항제의 유형, 질병의 중증도 및 과정, 길항제가 예방적 용도로 투여되는지 아니면 치료적 용도로 투여되는지의 여부, 기존의 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 길항제는 환자에게 1회 투여하거나 일련의 치료 기간 내내 투여하는 것이 적합하다. 질병의 유형과 중증도에 따라서, 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 간에, 길항제가 특히 항체인 경우에는 약 1 ㎍/kg 내지 약 15 mg/kg (예: 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 투여량 후보이다. 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라서 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일에 걸쳐 반복 투여하는 경우에는, 질환에 따라서 목적하는 질병 증상 억제가 나타날 때까지 치료를 지속한다.
길항제, 특히 항체의 바람직한 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그들의 조합량) 용량을 1회분 이상 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주 마다 투여할 수 있다 (예를 들면, 환자에게 항체를 약 2 내지 20회분, 예를 들면, 약 6회분으로 투여할 수 있다). 초기에는 보다 많은 용량을 투여한 다음, 그 보다 적은 용량을 1회분 이상 투여할 수 있다. 예시 투약 섭생은 항체를 초기 부하 용량 약 4 mg/kg으로 투여한 다음, 매주 약 2 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 기타 투여량 섭생도 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행 과정은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.
목적하는 순도를 지닌 길항제를 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써, 이러한 길항제의 치료적 제형을 저장을 위해, 수성 용제, 동결건조 또는 기타 건조 제형 형태로 제조한다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에는 완충제, 예를 들어 인산염, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기 산; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예: 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량 (약 10개 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물 (이에는 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함된다); 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염 형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.
상기 인지된 바와 같이, 본원의 제형은 치료하고자 하는 특정한 적응증에 대한 필요에 따라 한 가지 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 지닌 화합물을 함유할 수도 있다. 이러한 분자는 의도한 목적에 유효한 양으로 조합하여 존재하는 것이 적합하다.
활성 성분은, 예를 들어 액적형성 (coacervation) 기술이나 계면 중합 반응에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐 내에 각각 포착시킬 수 있거나, 콜라이드상 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 마이크로에멀션, 나노-입자 및 나노-캡슐) 또는 매크로에멀션 내에 포착시킬 수 있다. 이러한 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]. 구체적으로 언급하면, 길항제 함유 리포솜을 다음 문헌에 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조할 수 있다 [참고: Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77: 4030 (1980); and U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545]. 순환 시간이 증가된 리포솜이 미국 특허 제5,013,556호에 기재되어 있다.
특히 유용한 리포솜은, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포솜을 규정된 공극 크기의 필터 내로 압출시켜, 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 수득한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을, 디설파이드 교환 반응을 통하여 다음 문헌에 기재된 바와 같이 리포솜에 접합시킬 수 있다 [참고: Martin et al., J. Biol.Chem., 257: 286-288 (1982)]. 화학요법제 (예: 독소루비신)가 리포솜 내에 임의로 함유된다 [참고: Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81 (19): 1484 (1989)].
생체내 투여에 사용하고자 하는 제형은 멸균성이어야만 한다. 이는 멸균성 여과 막을 통하여 여과시킴으로써 용이하게 달성한다.
지속 방출식 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출식 제제의 적합한 예에는 본 발명의 길항제를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 조형품, 예를 들어 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출식 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 [예: 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)], 폴리락티드 [참고: 미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT™ (락트산-글리콜산 공중합체와 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사제 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체가 100일 간에 걸친 분자 방출을 가능케 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 단기간 동안 단백질을 방출한다. 피막화된 항체가 체내에 장시간 동안 존재할 경우, 이들은 37℃ 하 수분에 대한 노출 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성이 상실될 수 있고 면역원성 상의 변화가 가능해진다. 관련 기전에 따라서, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적당한 부가제를 사용하며 특이적 중합체 매트릭스 조성을 전개함으로써, 안정화를 달성시킬 수 있다.
본 발명은 가용성 TGF-β 길항제를 이용한 치료와 연계해서 세포독성 화학요법을 사용하는 것을 포함한다. 이 양태에는 적극적으로 순환하는 세포, 예를 들어 골수와 소화관을 수반한 조직 구획 내에 용량-제한성 독성을 나타내는 세포-주기 활성제 (예: 5-플루오로우라실)을 사용하는 것이 포함된다. 본 발명을 사용하기 위해 기전(들)을 완전히 이해하는 것이 반드시 필요한 것은 아니지만, TGF-β는 줄기 세포를 정지 상태로 유지시킨다. 줄기 세포 증식을 증강시키고, 이로써 조혈 회복을 증강시키기 위해, 화학요법을 적용한 후에 가용성 TGF-β 길항제를 투여하는 것이 고려된다 [참고: Sitnicka et al., Blood, 88: 82-88 (1996)]. 가용성 TGF-β 길항제와 화학요법제의 병용 요법으로 인해, TGF-β 길항제의 독립적인 치료 효과에 덧붙여, 화학요법제의 독성이 저하되었다.
본 발명은 또한, 면역요법과 연계한, 가용성 TGF-β 길항제를 이용한 치료법을 포함한다. 본 발명을 사용하기 위해 기전(들)을 완전히 이해하는 것이 반드시 필요한 것은 아니지만, 종양에 의한 면역계 억제제의 분비는 면역 인식 증강과 종양 파괴를 목표로 하는 면역요법 접근법의 효능을 제한하는 것으로 고려된다 [참고: de Visser and Kast, Leukemia, 13: 1188-1199 (1999)]. TGF-β는 종양에 의해 고도로 분비되는 면역억제제이다. 본 발명의 양태에는 TGF-β 길항제를 면역요법 접근법 (예: 항종양 백신 접종, 양자 면역요법)과 병용해서 사용하여, TGF-β 길항제의 항-전이성 효과와 면역요법의 효능 증강 간에 상승 작용이 일어나게 하는 것이 포함된다.
본 발명의 추가 상세 내역이 다음 실시예에 제공된다. 다음 실시예는 본 발명의 실시를 단지 예시하는 것이며, 이로써 제한되지 않는다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 기술 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
실시예 1
모노클로날 항체 2G7 및 4A11의 생성 및 성상 확인
A. 검정 과정
I. ELISA 결정
96-웰 폴리스티렌 검정용 판을 pH 9.6 탄산염 완충액 중의 1 ㎍/ml에서 100 ㎕/웰의 정제된 TGF-β1로 4℃ 하에 18시간 동안 피복시켰다. 이와 같이 피복시킨 판을 22℃에서 1시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 0.5% 소 혈청 알부민 (BSA) (BPBS로 칭해짐)으로 차단시키고, PBS 중의 0.05% TWEEN20™ (PBST으로 칭해짐)으로 세척한 다음, 100 ㎕의 하이브리도마 상등액과 함께 22℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 PBST로 세척하고, 결합된 항체를, 퍼옥시다제와 접합된 염소 항-마우스 IgG (공급처: Tago, Burlingame, CA)를 이용하여 탐지하였다. 판을 PBST로 세척하고, o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 기질을 100 ㎕/웰로 가하였다. 15분 후에 반응을 중지시키고, UVMAX™ 판 판독기 (공급처: Molecular Devices, Palo Alto, CA) 상에서 492 nm 하의 광학 밀도를 결정하였다.
II. rTGF-β1의 요오드화
정제된 TGF-β1를 변형된 CHLORAMINE T™ [실험식: C7H7SO2N NaCl (3H2O)] 과정에 의해 요오드화시켰다 [참고: Greenwood et al., Biochem. J., 89: 114 (1963)]. 간략하게 언급하면, 10 ㎍의 정제된 rTGF-β1을, 2분 항온 배양 간격을 둔 20 ㎕의 0.1 mg/ml CHLORAMINE™ 3가지 순차적 부가물을 이용하여 얼음 상에서 1 mCi의 Na1251로 표지시켰다. 20 ㎕의 50 mM N-아세틸 티로신, 1 M 요오드화칼륨에 이어, 200 ㎕의 8 M 우레아를 순차적으로 부가하여 상기 반응을 중지시켰다. C18 칼럼과 트리플루오로아세트산/아세토니트릴 구배를 이용하여 HPLC함으로써, 요오드화 rTGF-β1를 자유 Na1251로부터 격리시키고, 주요 피크를 함유하는 분획을 풀링한 다음, -70℃ 하에 저장하였다 (특이 활성 112 μCi/㎍).
III. 항원 포획 방사성면역검정
IMMUNLON™ 2 "REMOVAWELL"™ 스트립 (공급처: Dynatech, Chantily, VA)를 4℃에서 18시간 동안, pH 9.6 탄산염 중의 5 ㎍/ml 염소 항-마우스 IgG (공급처: Boehringer Mannheim)로 피복시켰다. 웰을 PBST로 세척하고, 0.1% 젤라틴을 함유하는 PBS (PBSG로 칭해짐)으로 차단시키며, PBST로 세척한 다음, 22℃에서 4시간 동안 하이브리도마 상등액과 함께 항온 배양하였다. 웰을 PBST로 세척하고, PBST 중의 100 ㎕의 0.1% 젤라틴 중에서 대략 75,000 CPM/웰의 1251-rTGF-β1을 가하고, 22℃에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 상기 판을 PBST로 세척하고, 결합된 1251-rTGF-β1을 GAMMAMASTER™ 계수기 (공급처: LKB, Sweden) 상에서 정량화하였다.
IV. 1251-rTGF-β의 면역침전
항-TGF-β 모노클로날 항체의 특이성은 또한, 1251-rTGF-β1 또는 돼지의 혈소판-유래된 1251-TGF-β2 (공급처: R & D Systems, Minneapolis, MN; 특이 활성 103.4 μCi/㎍)를 면역침전시킬 수 있는 그들의 능력에 의해 평가하였다. 2 ㎍의 정제된 모노클로날 항체를 22℃에서 2시간 동안, 5 x 104 CPM의 1251-rTGF-β1 또는 1251-TGF-β2와 함께 항온 배양하였다. 면역복합체를 토끼 항-마우스 IgG (공급처: Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)로 피복시킨 단백질 A-SEPHAROSE™ 비드-형성된 아가로스-이용 겔 여과 매트릭스 (공급처: Repligen, Cambridge, MA)으로 펠릿화하고, 연속해서 PBST로 3회 세척하였다. 환원성 샘플 완충액을 이용하여, 상기 복합체를 단백질 A-SEPHAROSE™ 비드-형성된 아가로스-이용 겔 여과 매트릭스로부터 해리시키고 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 (SDS-PAGE) 내로 전기영동시킨 다음, 자가방사선 촬영하였다.
V. TGF-β 모노클로날 항체의 친화성 결정
문헌 [참고: Mariani et al., J. Immunol. Methods. 71: 43 (1984)]에 기재된 고체 상 방사성면역 검정 과정을 사용하여 TGF-β-특이적 모노클로날 항체의 친화성을 결정하였다. 간략하게 언급하면, 정제된 항-TGF-β 모노클로날 항체를 4℃에서 18시간 동안 pH 9.6 탄산염 완충액 중의 IMMUNLON™ 2 "REMOVAWELL"™ 스트립 상에서 피복시켰다. 웰을 상기 언급된 바와 같이 세척 및 차단시켰다. 50 ㎕ PBSG 중의 40,000 CPM/웰의 1251-rTGF-β1 또는 돼지의 1251-TGF-β2 (공급처: R & D Systems)를, 50 ㎕ PBSG 중의 2500 내지 9.7 ng/웰 범위의 비-표지된 rTGF-β1 또는 돼지의 TGF-β2의 일련의 2배 희석물에 가하였다. 이로써 생성된 혼합물을 4℃에서 18시간 동안 항온 배양하였다. 웰을 상기 언급된 바와 같이 세척 및 계수하고, 문헌 [참고: Antoni and Mariani, J. Immunol. Meth., 83: 61 (1985)]의 비-선형 회귀 분석과 유사한 결과를 제공해주는 스카챠드 (Scatchard) 분석 [참고: Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980)]에 의해 친화성 상수를 결정하였다.
VI. 복수액으로부터 모노클로날 항체의 정제
상기 검정에서 양성인 항체를 분비하는 모 하이브리도마 배양물을 제한 희석에 의해 클로닝하고, PRISTANE™ 프라이머로 프라이밍시킨 Balb/c 마우스 [참고: Potter et al., JNCI, 49: 305 (1972)]의 복수액에서 성장시켰다. 단백질 A-SEPHAROSE™ 비드-형성된 아가로스-이용 겔 여과 매트릭스 상에서 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제하고, 확립된 과정 [참고: Goding, J. Immunol. Methods, 20: 241 (1978)]을 이용하여 0.1 M 아세트산, 0.5 M NaCl, pH 2.4에서 용출시킨 다음, 4℃ 하에 PBS 중에서 멸균 저장하였다.
VII. 시험관내 TGF-β 특이 활성의 모노클로날 항체 중화
시험관내 TGF-β 검정은 밍크 (mink) 폐 섬유아세포 세포주 Mv-3D9 [Mv1Lu로부터 아클로닝됨; American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 ATCC No. CCL-64로서 입수 가능함]를 이용하였다. 간략하게 언급하면, 정제된 항-TGF-β 모노클로날 항체 및 대조군을 4℃에서 18시간 동안 1000 내지 2000 pg/ml의 최종 농도로 rTGF-β1, 본래의 돼지 TGF-β2 (공급처: R & D Systems), 또는 rTGF-β3 [참고: Derynck et al., Nature 316: 701-705 (1985)]와 함께 항온 배양하였다. 이들 혼합물 50 ㎕를 96-웰 미세역가 판에 가한 다음, 2 mM 글루타민과 5% 태아 소 혈청을 함유하는 50 ㎕의 최소 필수 배지 중의 1 x 104 Mv-3D9 세포에 가하고, 5% C02 중에서 37℃ 하에 18 내지 24시간 동안 항온 배양하였다. 웰을 20 ㎕ 중의 1 μCi의 3H-티미딘으로 펄싱하고, 37℃ 하에 4시간 후에 수거한 다음, 신틸레이션 계수기로 계수하였다. TGF-β 표준의 각 희석물에 대한 3H-티미딘 흡수 억제율 (%)을 사용하여 음성 대조군 모노클로날 항체 및 TGF-β-특이적, 모노클로날 항체-처리된 샘플의 TGF-β 활성을 pg/ml로 산정하였다.
VIII. 모노클로날 항체의 이소형별 검사
PANDEX™ 형광 스크린 기계 기술을 이용하여, TGF-β1-반응성 모노클로날 항체의 이소형별 검사를 수행하였다. 랫트 항-마우스 IgG 항혈청-피복된 폴리스티렌 입자를 사용하여, PANDEX™ 96-웰 검정용 판에 분배된 배양 상등액으로부터 모노클로날 항체를 결합시켰다. 이 판을 세척하고 FITC-접합된 랫트 모노클로날 항-마우스 이소형 특이적 시약 (공급처: Becton Dickinson Monoclonal Center)을 가하였다. 결합된 형광을 PANDEX™ 형광 스크린 기계 기술에 의해 정량화하였다.
IX. 에피토프 분석
정제된 항-rTGF-β1 모노클로날 항체를 문헌 [참고: Nakane and Kawaoi, J. Histochem. Cytochem, 22: 1084 (1974)]의 방법에 의해 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 커플링시켰다. rTGF-β1-피복된 판을 22℃에서 2시간 동안, PBS 중의 50 ㎍/ml의 정제된 항-rTGF-β1 또는 음성 대조군과 함께 항온 배양하였다. 그 다음, 항-rTGF-β 모노클로날 항체-HRP 접합체의 예정된 희석물을 판에 가하고, 22℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 판을 세척하고 기질을 가한 다음, 상기 언급된 바와 같이 반응성을 정량화하였다. 이종 항-rTGF-β1 모노클로날 항체의 차단율 (%)을 자기 유래의 양성 차단성 대조군과 비교하였다.
X. 면역블롯 분석
1 ㎍/레인의 rTGF-β1을, 비-환원성 샘플 완충액을 이용하여 12% SDS-PAGE에서 전기영동시켜, 이량체 형태의 rTGF-β1과 각종 모노클로날 항체의 반응성을 결정하였다. 펩티드를 니트로셀룰로스 종이 상으로 트랜스블롯팅하고, HRP와 접합된 적당한 모노클로날 항체로 프로빙하였다. 불용성 기질 4-클로로-1-나트톨 (공급처: Kirkegaard and Perry, Gathersburg, MD)를 사용하여, 결합된 항체를 가시화하였다. 증류수로 소모적 세척함으로써 15분 후에 상기 반응을 중지시키고, 면역블롯을 건조시킨 다음, 사진을 찍었다.
B. 항-TGF-β1- 및 항-TGF-β2-특이적 모노클로날 항체의 생성
초기 면역 프로토콜에서는, 각종 면역원 제제, 용량 및 스케쥴을 사용하고 완전 프로인트 아주반트 (Freund's adjuvant)와 불완전 프로인트 아주반트를 사용 하여, Balb/c 마우스를 피하 및 복강내 경로에 의해 rTGF-β1 [문헌 (Derynck et al., Nature 상기 참고)에 기재된 바와 같이 생성 및 정제됨]으로 면역시켰다. 이러한 면역 스케쥴을 대략 11주 동안 지속하였다. 몇 마리 마우스는 측정할 만한 수준으로 반응하였지만, 낮은 항-rTGF-β1 역가를 나타내었고, 이들 마우스 중의 2마리는 희생시켜 이들의 비장을 주입용으로 사용하였다. 1152개 모 배양물 중에서 단지 84개 만이 항-TGF-β 양성 상등액인 것으로 탐지되었다. 이들 하이브리도마 중의 10개를 클로닝하였는데, 이로써 친화도가 낮은 모노클로날 항체가 생성되었으며, 이는 검정 개발이나 정제를 위해 사용할 수 없었다.
대체 전략으로서, 10마리 Balb/c 암컷 마우스 군 (공급처: Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, MA)에게 0, 3, 7, 10 및 14일째에, 100 ㎕ DETOX™ 아주반트 (공급처: RIBI ImmunoChem Res. Inc., Hamilton, MT) 중의 (1회분당) 5 ㎍의 정제된 TGF-β1를 뒷 발바닥에 주사하였다. 17일째에 동물을 희생시키고, 그들에게서 유출되는 서혜부 (inguinal) 및 오금 (popliteal) 림프절을 제거하고, 스텐레스-강 메쉬를 사용하여 림프절 간질로부터 림프구를 해리시켰다. 10마리 마우스 모두로부터의 림프구 현탁물을 풀링하고, 확립된 과정 [참고: Oi and Herzenberg, in Selected Methods in Cellular Immunology, B. Mishel and S. Schiigi, eds., (W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, 1980), p.351]에 의해 50% 폴리에틸렌 글리콜 4000을 사용하여 마우스 골수종 주 X63-Ag8.653 [참고: Kearney et al., J. Immunol. 123: 1548 (1979)]와 융합시켰다. 이와 같이 융합시 킨 세포를 2 x 105개 세포/웰 밀도로 총 1344개 96-웰 미세역가 판에 도말한 다음, 주입 후 1일째에 HAT 선별하였다 [참고: Littlefield, J.W., Science 145: 709 (1964)].
상기 웰 중의 1190개가 ELISA 시험에서 고정화 재조합 TGF-β1와 반응성이었다. 팽창되었을 때 이들 배양물 중의 18개가 안정한 채로 유지되었고, 세포주를 냉동 보존하였다. 이들 모 배양물을 대상으로 하여 이소형별 검사하고, 1251-rTGF-β1을 포획할 수 있는 그들의 능력과 시험관내 TGF-β1 활성을 중화시킬 수 있는 그들의 능력을 알아보기 위해 검정하였다. rTGF-β1를 중화시키는 것을 알아보기 위해 검정하고 후속 이소형별 검사를 수행한 18개 모 배양물로부터, 2개가 IgG1 카파 이소형이었고; 나머지는 IgG2b 카파 이소형이었다. IgG1 아부류에 속하는 모노클로날 항체 만이 시험관 내에서 rTGF-β1 억제 (중화) 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 고 친화성 항-TGF-β 모노클로날 항체를 분비하는 3개의 안정한 하이브리도마를 선별하였다. 이들 항체의 성상 확인이 다음에 추가로 상세히 기재되어 있다.
C. 방사성 요오드화 TGF-β의 면역침전
TGF-β1을 인식하고 이를 용액 중에 침전시킬 수 있는 3가지 모노클로날 항체의 능력을 결정하기 위한 면역침전 실험을 수행하였다. 자가방사선상은 항-TGF-β 모노클로날 항체 2G7, 4A11, 및 12H5가 등량의 1251-rTGF-β1를 면역침전시킨 반면, 대조군 모노클로날 항체 6G12는 음성이었다는 것을 나타내었다. 면역침전된 밴드는 겉보기 분자량이 대략 14.5 kD였다. 경쟁적 억제 검정을 사용하여 TGF-β1과 각 모노클로날 항체 간의 상호 작용의 친화도를 결정하였다. 모노클로날 항체 2G7 및 4A11은 동등한 수준으로 보다 높은 친화도를 지녔는데, 이는 1.2 x 108 l/mole이었다.
TGF-β2를 인식하고 이를 용액 중에 침전시킬 수 있는 것으로 선별된 모노클로날 항체의 능력을 결정하기 위한 면역침전 실험을 또한 수행하였다. 자가방사선상은 rTGF-β1과는 달리, 단지 항체 2G7 만이 1251-TGF-β2를 측정 가능한 정도로 면역침전시켰다는 것을 나타내었다. 4A11 및 12H5를 음성 대조군과 비교한 결과, 특이적 침전이 거의 없는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 교차-차단 실험 결과, 4A11 및 2G7이 인간 rTGF-β1에 대한 서로의 결합을 억제할 수 있었다는 사실이 밝혀졌다는 측면에서 보면 놀라운 것이었다 (표 1 참고).
Figure 112006040910914-PCT00001
취합해 보면, 상기 데이터는 이들 2개의 모노클로날 항체에 의해 인식된 에피토프는 별개의 것이지만, 서로 근접해 있거나 멀리서 서로의 결합에 대해 어떻게든지 영향을 미친다. 면역침전 실험과 교차-차단 실험 둘 다로부터, 12H5는 별개의 에피토프인 것으로 여겨지지만, 몇몇 차단이 관찰되었다. 이러한 결론은 또한, 다음의 중화 데이터에 의해 뒷받침된다.
D. rTGF-β1를 이용한 면역블롯 분석
활성 형태의 TGF-β는 동종-이량체이기 때문에, 면역블롯을 수행하여 모노클로날 항체가 이러한 형태를 인식하였는지를 결정하였다. 항체 2G7, 4A11 및 12H5는 모두 간접 면역블롯에서 TGF-β1 이량체 (비환원됨) 형태와 반응하였다. 2G7은 4A11 또는 12H5 보다 훨씬 더 강력한 밴드를 제공해주었다. 면역침전 실험에서와 같이, 대조군 항체 6G12는 음성이었다. 이러한 패턴의 반응성은 직접 웨스턴 블롯에서, 이들 모노클로날 항체의 HPR 접합체를 이용한 경우에도 관찰되었다.
요약하면, 유출되는 림프절의 융합과 연계된 발바닥 면역을 이용하는 프로토콜은, 완전 및 불완전 프로인트 아주반트를 이용한 Balb/c 및 C3H 마우스에서의 각종의 면역 과정과 투약 스케쥴을 사용하여 rTGF-β1에 대한 파단 내성에 있어 성공적이지 못한 다수의 시도 후에 수행하였다. 일반적으로, 이러한 과정은 Balb/c 마우스에서 면역원으로서 프로인트 아주반트 중의 정제된 소 뼈-유래 TGF-β2를 사용하여 TGF-β1- 및 TGF-β2-중화성 모노클로날 항체를 생성시킨 것으로 문헌 [참고: Dasch et al., J. Immunol. 142: 1536-1541 (1989)]에 보고된 것과는 대조적으로, 상기 약한 면역원에 대하여 극히 높은 친화도로 신속하게 반응하는데 유용한 것으로 밝혀졌다.
3가지 모노크로날 항체 모두는 면역블롯, ELISA, 교차-차단성 및 면역침전 검정에서 rTGF-β1와 결합하였다. 항-rTGF-β 항체 중의 2개가 시험관 내에서 rTGF-β1 활성을 중화시킨 반면, 이러한 2개 중의 1개 만이 밍크 폐 섬유아세포 세포 검정에서 TGF-β2 활성과 TGF-β3 활성 모두를 중화시켰다. TGF-β1-중화성 항체는 또한, 방사성수용체 검정에서 방사성요오드화 rTGF-β1 결합을 차단시켰는데, 이는 rTGF-β1 활성의 시험관내 중화가 수용체 차단에 기인될 수 있다는 것을 지시해준다.
실시예 2
인간화 2G7 항체
뮤린 모노클로날 항체 2G7의 가변 도메인을 먼저, 마우스/인간 키메라 Fab 단편의 생성을 허용해 주는 벡터 내로 클로닝하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 STRATAGENE™ RNA 추출용 키트를 사용하여, 총 RNA를 하이브리도마 세포로부터 분리하였다. 이러한 가변 도메인을 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 겔 정제한 다음, 기존 문헌 [참고: Carter et al,. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4285 (1992) and U.S. Pat. No. 5,821,337]에 기재된 바와 같이 인간 카파 불변 도메인과 인간 CH1 도메인을 함유하는 pUC119-이용 플라스미드의 유도체 내로 삽입하였다. 이로써 생성된 플라스미드를, Fab 단편의 발현을 위해 이. 콜라이 균주 16C9 내로 형질전환시켰다. 배양물의 성장, 단백질 발현 유도 및 Fab 단편의 정제는 기존 문헌 [참고: Werther et al,. J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996); Presta et al., Cancer Research. 57: 4593-4599 (1997)]에 기재된 바와 같이 하였다.
키메라 클론을 DNA 서열 분석하여, CDR 잔기를 확인할 수 있었다 [Kabat et al., 상기 참고]. 올리고뉴클레오티드 부위-지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 이들 CDR 영역 6개 모두를, 문헌 [참고: Presta et al., Cancer Research, 57: 4593-4599 (1997)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 VX4를 함유한 완전 인간 프레임워크 (VL 카파 아군 I 및 VH 아군 III) 내로 도입하였다. 이로써 생성된 "CDR-교환 (swap)"으로부터의 단백질을 상기 언급된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 결합 연구를 수행하여 두 버젼을 비교하였다. 간략하게 언급하면, NUNC MAXISORP™ 판을 4℃ 하에 밤새, 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 1 마이크로그램/ml의 TGF-β 세포외 도메인 (ECD; WO 90/14357에 기재된 바와 같이 생성됨)으로 피복시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 ELISA 희석제 (0.5% BSA, 0.05% POLYSORBATE™ 20, PBS)로 차단시켰다. ELISA 희석제 중의 일련의 샘플 희석물을 상기 판 상에서 2시간 동안 항온 배양하였다. 세척 후, 결합된 Fab 단편을 바이오티닐화 뮤린 항-인간 카파 항체 (ICN 634771)로 탐지한 다음, 스트렙타비딘-접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제 (공급처: Sigma) 및 기질로서 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (공급처: Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD)을 사용하여 탐지하였다. 450 nm에서의 흡광도를 판독하였다. CDR-교환 Fab의 결합은 키메라 Fab 단편의 결합과 비교해서 상당히 감소되었다.
인간화 Fab의 결합을 복원하기 위해, 주형으로서 CDR-교환으로부터의 DNA를 사용하여 돌연변이체를 구축하였다. 컴퓨터 생성된 모델을 이용하여, 변화가 CDR 입체 형태 또는 항체-항원 계면에 영향을 미칠 수도 있는 위치에서 그들의 뮤린 대응물에 대한 인간 프레임워크 영역 잔기가 변화하도록 이들 돌연변이를 계획하였다. 돌연변이체가 표 2에 나타나 있다 [주: 모든 아미노산 넘버링은 문헌 (Kabat et al., 상기 참고)에서와 같이 표현되었다]. 서열에 대해서는, 도 19 내지 22를 참고할 수 있다.
Figure 112006040910914-PCT00002
버젼 3 및 4는 나중 번호를 갖는 인간화 Fab 버젼을 수득하기 위한 중간체로서 사용되었다. 변화물 AlaH49Gly, PheH67Ala, 및 ArgH71Ala를 수반하는 버젼 5는 버젼 709 및 11과 마찬가지로, 본래의 키메라 2G7 Fab 단편의 것에 대해 복원된 결합을 지니고 있는 것으로 여겨진다. 버젼 710 및 712는 키메라 단편에 대한 유사한 결합을 나타내는 것으로 예상되지만, 버젼 712는 면역원성 증가 가능성 때문에 바람직하지 않을 수도 있는 부가의 프레임워크 돌연변이를 수반한다. 부가의 FR 또는 CDR 잔기, 예를 들어 L3, L24, L54, 및/또는 H35를 변형시킬 수 있다 (예를 들어, 다음과 같이 치환된다: GlnL3Met, ArgL24Lys, ArgL54Leu, GluH35Ser). 안정성을 증강시키는데 바람직할 수도 있는 치환은, 메티오닌을 루이신 또는 이소루이신으로 치환시켜 산화 반응을 저하시키거나, 또는 CDRs 내의 아스파라긴을 다른 잔기로 변화시켜 탈아미드화 가능성을 감소시키는 것이다. 또 다른 한편, 또는 부가적으로, 인간화 항체를 친화성 성숙시켜 (상기 참고) 그의 친화성 및/또는 기타 생물학적 활성을 추가로 개선 또는 정련시킬 수 있다.
키메라 2G7 Fab 뿐만 아니라 인간화 Fab 버젼 5, 709, 및 11의 VL 및 VH 도메인을, 포유류 세포 발현을 위해 앞서 기재된 pRK 벡터 [참고: Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech., 2: 3-10 (1990)] 내로 아클로닝함으로서, 전장 IgG의 발현을 위한 플라스미드를 구축하였다. 간략하게 언급하면, 각 Fab 구조물을 EcoRV 및 BlpI로 분해시켜 VL 단편을 절제한 다음, 완전한 경쇄 (VL-CL 도메인)의 발현을 위해 이를 플라스미드 pDR1의 EcoRV/BlpI 부위 (도 23 참고) 내로 클로닝하였다. 부가적으로, 각 Fab 구조물을 PvuII 및 ApaI로 분해시켜 VH 단편을 절제한 다음, 완전한 중쇄 (VH-CH1-CH2-CH3 도메인)의 발현을 위해 플라스미드 pDR2의 PvuII/ApaI 부위 (도 24 참고) 내로 클로닝하였다.
각 IgG 변이체에 대해, 경쇄 발현성 플라스미드와 중쇄 발현성 플라스미드를 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293 내로 동시-형질감염시킴으로써 일시적 형질감염을 수행하였다 [참고: Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-74, (1977)]. 간략하게 언급하면, 293 세포를 형질감염시키기 전날 분할시키고, 혈청 함유 배지에 도말하였다. 그 다음 날, 경쇄 및 중쇄의 이본쇄 DNA로부터 인산칼슘 침전물을 PADVANTAGE™ DNA (공급처: Promega, Madison, WI)와 함께 제조하고, 상기 판에 적가하였다. 세포를 37℃ 하에 밤새 항온 배양한 다음, PBS로 세척하고 혈청-무함유 배지에서 4일 동안 배양하였는데, 이때 적응용 배지 (conditioned medium)를 수거하였다. 단백질 A-SEPHAROSE CL-4B™ 비드-형성된 아가로스-이용 겔 여과 매트릭스를 사용하여 배양 상등액으로부터 항체를 정제한 다음, 완충제를 10 mM 나트륨 석시네이트, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 교환하고, CENTRICON-100® 원심분리성 필터 장치 (공급처: Amicon)를 사용하여 농축시켰다. 280 nm에서의 흡광도를 측정하거나 정량적 아미노산 분석함으로써 단백질 농도를 결정하였다.
CDRs이 결합에 기여하였는지, CDRs이 활성 상실 없이 인간 생식세포계 카파 유전자자리의 서열로 복귀될 수 있었는지, 또는 항체의 안정화에 대해 명확하기 위해, hu2G7 버젼 5 IgG에 대한 부가의 변형을 만들었다. 이들은 표 3에 나타낸 바와 같이 "중쇄.경쇄"로서 명명되었고, 버전 5와 이들 버젼들 간의 아미노산 차이가 제공된다:
인간화 2G7 CDR 돌연변이물의 명칭
돌연변이체 번호 인간 항-TGF-β 버젼 5와 비교한 바와 같은 CDR 치환물
버젼 5 (V5H.V5L)
H2N1.V5L Asn51이 CDR H2에서 Ile으로 변하는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
V5H.glL2 CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 8)로 복귀되는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
V5H.glL1glL2 CDR L1이 인간 생식세포계 카파 유전자자리 L8/L9의 서열: RASQGISSYLA (서열 7)로 복귀 되고, CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 8)로 복귀되는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
H2Nl.glL1glL2 CDR L1이 인간 생식세포계 카파 유전자자리 L8/L9의 서열: RASQGISSYLA (서열 7)로 복귀 되고, CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리 L8/L9/L14/L15의 서열: YASSLQS (서열 8)로 복귀되며, Asn51이 CDR H2에서 Ile으로 변하는 것을 제외하고는 버젼 5와 동일함
CDR L1에 사용된 생식세포계 서열에 대한 명칭은 문헌 [참고: Cox et al., Eur. J. Immunol., 24: 827-836 (1994)]의 도 4, 및 문헌 [참고: Schable and Zachau, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 374: 1001-1022 (1993)]의 도 2e에 기재된 바와 같은 L8/L9이다. CDR L2에 대해 사용된 생식세포계 서열은 L8/L9/L14/L15이다 [Cox et al, 상기 참고 및 Schable and Zachau, 상기 참고].
인간 생식세포계 (gl) 카파 유전자자리의 서열로의 복귀는 모든 CDR's에서 이루어졌지만, 상기 제시된 생식세포계 복귀 돌연변이체 만이 결합을 나타내었다. CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리의 서열로 복귀된 V5H.glL2는 TGF-β 뿐만 아니라 V5H.V5L과도 여전히 결합되었다. 2가지 버젼 V5H.g1L1g1L2 및 H2N1. g1L1g1L2 뿐만 아니라 H2Nl.V5L은 상기 뿐만 아니라 키메라와도 결합하지 않았다.
마우스 혈관사이 세포 증식 검정을 사용하여 대조군 항체 및 몇 가지 인간화 항체 (V5H.V5L, V5H.glL2, H2N1.V5L, V5H.glL1glL2, 및 H2N1.glL1glL2)를 시험하였다. 그 프로토콜은 다음과 같다:
1일 째: 마우스 혈관사이 세포를 배지 (95%-태아 소 혈청-5%-14 mM HEPES 완충제가 보충된 햄스 F12 배지와 둘벡코 변형 이글스 배지의 3:1 혼합물)에서 96-웰 판에 도말하고 밤새 성장시켰다.
2일 째: 3가지 상이한 농도 (100 ng, 10 ng 및 1 ng)를 지닌 TGF-β, 및 5가지 상이한 유형의 인간화 TGF 항체 (20 ㎍/ml)를 혈청 무함유 배지에서 희석시키고 세포에 가하였다. 마우스 TGF 항체를 대조군으로서 사용하였다 (2G7).
4일 째: 48시간 항온 배양 후, 20 ㎕의 반응 완충액 [테트라졸륨 화합물 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부 염, 및 전자 커플링 시약 (페나진 에토설페이트)을 함유하는 CELLTITER 96® AQUEOUS ONE SOLUTION REAGENT ™ (공급처: Promega Inc. Cat number G3580)]을 상기 판의 각 웰에 가하고 2시간 동안 항온 배양하였다. 490 nm에서 흡광도 (OD)를 측정하였다.
H2Nl.V5L (20 ㎍/ml)은 1 ng/ml 수준의 TGF-β에 의해 유도된 세포 억제를 완전히 차단시켰는데, 이는 키메라 마우스 대조군을 이용한 바와 동일한 결과이다. 버젼 5 (V5H.V5L) 역시 대조군과 유사하게 세포 억제를 차단시켰다.
각종 인간화 항체를 대상으로 하여, 시험관 내에서 3개의 TGF-β 중의 하나로 자극시킨 해체된 스위스산 마우스 배아의 섬유아세포로부터의 3T3 세포주를 사용하여 각종 TGF-β 대 2G7를 중화시키는데 있어서의 그들의 활성을 알아보기 위해 시험한 다음, 그들의 증식을 활성으로서 측정하였다. 인간화 항체 H2Nl.V5L은 대조군 2G7 항체에 비해 활성 면에서 다소 탁월하였다. 시험된 기타 인간화 항체인 H2Nl.glL2 (CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리의 서열로 복귀되었다) 및 V5H.glL2 (CDR L2가 인간 생식세포계 카파 유전자자리의 서열로 복귀되었다)는 필적하는 활성을 보여주었는데, V5H.glL2가 TGF-β1 내지 TGF-β3 모두에 대해 최소한 유효하였다.
요약하면, 인간화 항체 V5H.V5L, V5H.glL2, H2Nl.V5L, H2Nl.glL2, 및 버젼 709, 710 및 711이 가장 바람직한 인간화 버젼인데, 이는 이들이 키메라 항체 (chimH.chimL; 2G7 Fab 단편)로서 거의 동등하게 TGF-β와 결합하고/하거나 TGF-β를 중화시키거나 또는 시험관 내에서 TGF-β에 의해 유도된 세포 억제를 차단시키며, 시험된 인간화 항체 모두의 가장 적은 수의 프레임워크 변화를 나타내는데, 이것이 환자에게서 면역 반응의 위험을 최소화시킬 수 있기 때문이다. 또한, H2Nl.V5L이 특히 바람직한 항체인데, 이는 CDR H2 상의 변화로 인해 개선된 안정성을 가질 수도 있고 중화 활성이 명백하게 탁월하기 때문이다.
실시예 3
전이성 유방암 마우스 모델에서 종양 전이에 관한 연구
A. 4T1 모델
제1 세트 실험에서는, BALB/cfC3H 마우스로부터 자발적으로 발생하는 단일 유방 종양으로부터 4T1 세포를 유래시켰다. 원발성 4T1 종양 세포를 면역적격한 BALB/c 마우스의 유방 지방체에 주사하였다. 주사한지 1주 후, 촉진할 수 있는 (손으로 만질 수 있는) 원발성 종양이 관찰되었다. 종양은 폐 (주사한지 대략 2주 후), 간 및 비장 (주사한지 대략 3주 후), 및 뼈 (주사한지 대략 4 및 5주 후)로 자발적으로 전이되었다.
이들 동물을 15 mg/kg, 25 mg/kg 및 43 mg/kg 용량의 항-TGF-β 항체 (2G7)로 처치하였다. 암 세포를 주사한 후 0일, 1일, 2일, 1주 및 2주 째에 시험을 수행하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 43-mg/kg 용량으로의 처치는 원발성 종양 크기를 일시적으로 감소시키고, VEGF의 전신 수준을 감소시켰다. 25-mg/kg 용량은 15-mg/kg 용량 보다 더 우수한 결과를 제공해주는 것으로 밝혀진 반면, 25-mg/kg 용량을 이용하여 수득한 결과와 43-mg/kg 용량을 이용하여 수득한 결과 간에는 유의적 차이가 없었다 (15 mg/kg 및 25 mg/kg 용량에 대한 데이터는 나타내지 않았다).
도 2, 3 및 4에 도시된 바와 같이, 항-TGF-β 항체로의 조기 처치 (세포를 주사한지 5주 후)는 이차 폐 종양의 조직학 스코어 [병에 걸린 엽 (lobes)의 등급과 수], 중량 및 용적을 감소시켰다. 다음 스케일을 이용하여 조직학 스코어를 결정하였다: 여기서, "%"는 종양 세포로 구성된 조직의 비율이고, "침습"은 종양 세포가 혈관 및/또는 림프절에서 인지되었는 지의 여부를 나타내는 지표이다:
정상: 침윤이 최소이고; % 1-33; 침습 없음.
등급 II: 적당한 수준의 침윤; % 34-66; 일부 침습이 나타남.
등급 III: 중증의 (심각한) 침윤; % 67-100; 많은 침습이 나타남.
도 5는 정상적인 해면 뼈와 뼈 전이의 마이크로CT 영상을 비교함으로써 뼈 파괴를 도시한 것이다.
뼈 파괴의 정량적 분석 결과가 다음 표 4에 나타나 있다:
Figure 112006040910914-PCT00003
항-TGF-β 항체 + 세포 = 종양 세포가 주사되고 항-TGF-β 항체로 처치한 마우스
BV = 뼈 용적
TV = 총 용적
BS = 뼈 표면
표 4에 제시된 결과는 항-TGF-β 항체 (2G7)로의 조기 처치 (종양 세포를 주사한지 5주 후)가 유방 종양-유도된 뼈 파괴의 특정 파라미터를 억제하였다는 것을 보여준다.
B. Her2+ 유방 종양으로부터의 세포
트라스투주마브-민감성 (F2-1282) 및 트라스투주마브-내성 (Fo5) 종양 세포주로부터의 상피 세포를 면역적격한 마우스의 유방 지방체에 주사하였다. 도 6와 7, 및 8과 9에 각각 도시된 바와 같이, 0일 째 (종양 세포를 주사한 날)에 25 mg/kg 용량의 항-TGF-β 항체 (2G7)로 처치하면, 원발성 종양 크기가 증가하였고 종양의 트라스투주마브-반응성과 비-의존적으로 전신 VEGF 수준이 증가하였다.
4T1 상피 세포와는 달리, Her2+ 상피 세포는 고수준의 TGF-β를 합성하지 않았고, TGF-β에 의해 성장 억제되었으며, 시험관내와 생체내 둘 다에서 서서히 성장하였다. 이러한 세포로부터의 전이는 비-표면 폐 종양 (영상은 제시되지 않음)을 생성시켰는데, 그의 발생수와 성장은 항-TGF-β 항체 처치에 의해 억제되지 않았다.
C. PymT 종양
이는 유방 상피에서 폴리오마 중앙 T 종양단백질 (PyMT)의 발현에 의해 유발된 유방암의 마우스 모델이다. PyMT 종양으로부터의 원발성 종양 세포를 수용자 마우스의 유방 지방체에 주사하였다 (2백만 또는 5백만개 세포). 이어서, 발생된 종양을 다수의 추가 마우스에서 계대접종(passage)하였다. 도 18에 도시된 데이터는 항-TGF-β 항체 (2G7)로의 처치가 원발성 종양 성장을 저하시켰다는 것을 입증해준다.
실시예 4
전이성 흑색종 마우스 모델에서 종양 전이에 관한 연구
본 연구는 면역적격한 마우스 내로 피하 주사된 B16-F10 및 B16-BL6 전이성 흑색종 아세포주를 사용하여, 원발성 및 이차 흑색종에 대한 항-TGF-β 항체 (2G7)의 효과를 시험하였다. 특히, C57Black 6 마우스에게 500,000개 종양 세포를 피하 주사하였다. 발생된 원발성 종양을 14일 째에 제거하고, 마우스를 대략 28일 째에 희생시켰다. 항-TGF-β 항체 농도는 대략 30 mg/kg이었다. B16-F10 아세포주는 (피하 주사 결과로서가 아닌) 직접적인 주사에 의해 뼈 내로 도입된 경우에는, 뼈에 집락을 형성할 수 있는 것으로 공지되어 있다. B16-BL6 아세포주는 폐에 전이성이다.
도 10 (F10) 및 11 (BL6)에 도시된 바와 같이, 항-TGF-β 항체 2G7 (약 30 mg/kg)로의 처치는 흑색종 마우스의 생존율을 증가시켰다.
도 12 내지 15는 CT 분석과 광 영상화를 포함한, 흑색종 폐 전이물의 각종 표현들이다.
도 16 및 17에 도시된 바와 같이, 항-TGF-β 항체 2G7로의 처치는 상기 모델에서 전이성 폐 종양의 발생 빈도와 발생수를 상당히 감소시켰다.
본 실험에서 사용되지는 않았지만, B16의 추가 아세포주가 이용 가능하고, 이를 유사한 실험에 사용할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 이러한 추가의 아세포주에는, 예를 들어 FO (전이성이 아님), F1 (전이성이 낮음; 약 30 %); 및 G3.26 (고도로 전이성임)이 포함된다.
실시예 3 및 4에 기재된 동물 모델은, 예를 들어 혈관형성 및/또는 간질 동원을 증강시킴으로써 원발성 및/또는 이차 종양의 성장에 관여하거나 또는 이를 억제할 수도 있는 새로운 분자를 확인하기 위한 스크리닝 검정에 있어서의 추가의 용도를 나타내긴 하지만, 이들 검정의 용도가 확인된 분자의 작용 기전에 의해서만 제한되지 않는다.
전술된 내용이 특정 양태를 지칭하고 있긴 하지만, 본 발명이 이들로써 제한되지 않는다는 것을 인지해야 할 것이다. 당업자에게는 본 발명의 전반적인 개념으로부터 벗어나지 않고서도 본원에 기재된 양태들에 대한 각종 변형이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 속한다.
<110> FILVAROFF, ELLEN H. <120> SCREENING ASSAYS AND METHODS OF TUMOR TREATMENT <130> P2068R1 <140> US 10/981,356 <141> 2004-11-04 <150> US 60/520,398 <151> 2003-11-13 <150> US 60/557,951 <151> 2004-03-31 <160> 45 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu 20 25 30 Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 50 55 60 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr 65 70 75 Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala 80 85 90 Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Asp Thr Phe Gly Gly 95 100 105 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 110 115 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> Xaa <222> 3 <223> Unknown amino acid <220> <221> Xaa <222> 5 <223> Unknown amino acid <400> 2 Gln Val Xaa Leu Xaa Gln Ser Gly Ala Glu 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350 agcctccacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga 400 gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 450 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt 500 gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca 550 gcgtggtgac tgtgccctct agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc 650 caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac 700 tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 750 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag 800 ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg 850 tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa 950 ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga 1000 aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1050 ctgcccccat cccgggaaga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg 1100 cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca 1150 atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt 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cgccctccaa 1450 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac 1500 ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 1550 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc 1600 acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa gcttggccgc catggcccaa 1650 cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 1700 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 1750 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg atcgatcggg aattaattcg 1800 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt 1850 accttctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1900 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 1950 tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 2000 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 2050 cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 2100 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc 2150 tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 2200 aggcttttgc aaaaagctgt taacagcttg gcactggccg tcgttttaca 2250 acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag 2300 cacatccccc cttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 2350 cgcccttccc aacagttgcg tagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg 2400 gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa 2450 gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 2500 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2550 cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2600 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 2650 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg 2700 ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 2750 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 2800 cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 2850 ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 2900 attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 2950 ccgcatagtt aagccaactc cgctatcgct acgtgactgg gtcatggctg 3000 cgccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3050 ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat 3100 gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgagg cagtattctt 3150 gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 3200 ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 3250 cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 3300 tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 3350 agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc 3400 attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3450 atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3500 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 3550 gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgatg 3600 acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 3650 ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac 3700 agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 3750 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3800 ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 3850 gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgccagcag 3900 caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 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gtggacgtga 1800 gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1850 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta 1900 ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 1950 aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 2000 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 2050 cctgccccca tcccgggaag agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct 2100 gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 2150 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc 2200 cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 2250 ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 2300 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagtgcg 2350 acggccctag agtcgacctg cagaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 2400 ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 2450 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 2500 catcaatgta tcttatcatg tctggatcga tcgggaatta attcggcgca 2550 gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga ggaacttggt taggtacctt 2600 ctgaggcgga aagaaccatc tgtggaatgt gtgtcagtta gggtgtggaa 2650 agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 2700 tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag 2750 tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa 2800 ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc 2850 catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 2900 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct 2950 tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 3000 gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 3050 ccccccttcg ccagttggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 3100 ttcccaacag ttgcgtagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 3150 ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac 3200 catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt 3250 acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 3300 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 3350 ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 3400 ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc 3450 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attcattaat 5950 ccaactggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 6000 gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 6050 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 6100 acacaggaaa cagctatgac catgattacg aatta 6135

Claims (68)

  1. (1) 복수 개의 시험 물질을, 원발성 종양의 존재 또는 부재 하에 하나 이상의 연질 조직 또는 뼈 전이를 수반하는 비-인간 동계 면역적격한 동물 모델에게 투여하는 단계; (2) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 성장과, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한 상기 시험 물질의 효과를 결정하는 단계; 및 (3) 존재하는 경우에는 원발성 종양의 상태에 대해서 유해한 효과를 나타내지 않으면서, 연질 조직의 성장 또는 뼈 전이를 억제하는 시험 물질을 확인하는 단계를 포함하는 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 연질 조직 전이가 폐 및 간 조직으로 이루어진 군 중에서 선택된 조직 내에 존재하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뼈 전이로 인해 뼈 파괴가 일어나는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 모델이 연질 조직 및 뼈 전이 둘 다를 수반하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 모델이 원발성 종양을 보유하고 있는 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 원발성 종양을 동물로부터 외과적으로 제거시킨 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 설치류인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스 또는 랫트인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 마우스인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 원발성 종양이 유방 종양인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 유방 종양이, 자발적 마우스 유방 암종(mammary carcinoma)으로부터 유래된 세포로부터 발생된 방법.
  12. 제11항에 있어서, 세포가 4T1 마우스 유방 암종 세포인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 원발성 유방 종양이, Her2+ 종양으로부터 생성되거나 Her2+ 종양의 계대접종(passage)으로부터 생성된 상피 세포로부터 발생된 Her2+인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 원발성 유방 종양이 트라스투주마브 (trastuzumab)-내성인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 원발성 유방 종양이 트라스투주마브-반응성인 방법.
  16. 제10항에 있어서, 원발성 유방 종양이, PymT 종양으로부터 생성되거나 PymT 종양의 계대접종으로부터 생성된 상피 세포로부터 발생된 PymT 종양인 방법.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 원발성 종양이 흑색종인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 흑색종이 B16 아세포주 (subline)의 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 확인된 시험 물질이, 분비된 분자의 길항제인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 확인된 시험 물질이 전환 성장 인자-베타 (TGF-β) 길항제인 방법.
  21. 제20항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, TGF-β 길항제가 뼈 전이를 억제하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 길항제가 뼈 파괴 또는 뼈 손실을 감소시키는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 동물에게 투여된 시험 물질에 공지된 화학요법제 또는 세포독성제가 포함되는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 화학요법제 또는 세포독성제가 탁소이드 (taxoid)인 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나는 TGF-β 길항제이고 다른 하나는 화학요법제 또는 세포독성제인 2가지 시험 물질을 동물에게 투여하고, 연질 조직 또는 뼈 전이에 대한, 그리고 원발성 종양이 존재하는 경우에는 원발성 종양 성장에 대한 상기 2가지 시험 물질의 병용 효과를 결정하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체이고, 화학요법제 또는 세포독성제가 탁소이드인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 유효 용량의 방사선 요법에 부가적으로 노출되는 방법.
  29. (a) 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자로부터 수득한 암 세포의 TGF-β의 성장 억제 효과에 대한 민감성을 시험하는 단계;
    (b) 상기 환자로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일을 수득하고, 이를 TGF-β 길항제를 이용한 치료에 대해 반응성인 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 환자로부터 수득된 암 세포가 TGF-β의 성장 억제 효과에 대해 민감하지 않고, 상기 치료에 대해 반응성인 상기 동물 모델로부터 수득한 암 세포의 유전자 발현 프로파일과 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다면, 이러한 환자는 TGF-β 길항제를 이용한 치료로부터 이득이 있을 것임을 확인하는 단계
    를 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자가 TGF-β 길항제로의 치료로부터 이득이 있을 것인지를 결정하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 암이 전이성 유방암인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 환자로부터 수득한 유방암 세포의 Her2 상태를 결정하는 단계, 및 상기 세포가 Her2 음성인 경우에는 상기 환자가 TGF-β 길항제를 이용한 치료에 반응할 것임을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 인간인 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 연질 조직 전이를 수반하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 연질 조직 전이에 폐 전이 및 간 전이 중의 적어도 하나가 포함되는 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 환자가 부가적으로 뼈 전이를 수반하는 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 환자가 뼈 파괴 또는 뼈 손실 을 나타내는 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는데 유효한 양의 TGF-β 길항제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 치료가 원발성 유방암의 외과적 제거 후에 수행되는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 암을 치료하는데 유효한 양의 화학요법제 또는 세포독성제, 또는 유효 용량의 방사선 요법을 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 화학요법제가 탁소이드인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, Her2와 특이적으로 결합하는 항체를 암을 치료하는데 유효한 양으로 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 항체가 트라스투주마브인 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료하는데 유효한 양의 항-혈관신생제를 환자에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 항-혈관신생제가, 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  47. 포유류 환자에게 유효량의 TGF-β 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류 환자에게서 종양 전이와 연관된 뼈 파괴 또는 뼈 손실을 치료하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  49. 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제의 병용 요법 유효량을 투여하고, 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하며, 상기 병용 요법 유효량은 TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합보다 적은 것인, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 암이 유방암 또는 결장직장암인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 암이 전이성 유방암인 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제가 탁소이드인 방법.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 유효 용량의 방사선 요법을 부가적으로 적용하는 방법.
  54. 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 방사선 요법의 병용 요법 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 병용 요법 유효량은 TGF-β 길항제와 방사선 요법을 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합보다 적은 것인, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 암이 결장직장암인 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 항-혈관신생제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 항-혈관신생제가, 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  60. 암이 있는 것으로 진단된 포유류 환자에게 TGF-β 길항제와 항-혈관신생제의 병용 요법 유효량을 투여하고, 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 상기 포유류 환자를 치료하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 항-혈관신생제가, 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, TGF-β 길항제가 TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 유효량의 화학요법제 또는 세포독성제를 투여하는 것을 부가적으로 포함하는 방법.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병용 요법 유효량이 TGF-β 길항제와 항-혈관신생제를 단일 작용제로서 개별적으로 투여하는 경우에 이들 각각의 유효량의 합 보다 적은 방법.
  65. TGF-β 길항제와 화학요법제 또는 세포독성제 또는 방사선 요법의 병용 요법 유효량을, 암이 있는 것으로 진단되고 TGF-β 길항제에 대해 반응하지 않거나 또는 불충분한 수준으로 반응하는 것으로 예정된 포유류 환자에게 투여하고, 이러한 병용 요법에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것을 포함하는, 상기 포유류 환자를 치료하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 암이 유방암인 방법
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 화학요법제가 탁소이드인 방법.
  68. 혈관성 내피 성장 인자와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 용기, TGF-β와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 용기, 및 두 항체 모두를 포유류 환자의 암을 치료하는데 유효한 양으로 병용 사용하는 것에 관한 지시사항을 포함하는 키트.
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