TW200526957A - Screening assays and methods of tumor treatment - Google Patents

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200526957 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於治療腫瘤（包括腫瘤轉移）之候選分子之篩 選，及使用該分子之治療方法。 【先前技術】 腫瘤與癌症 高等生物之發育以在時間及空間上巧妙地調控細胞分裂 為特徵。細胞分裂之正常生理作用被擾亂幾乎無可避免地 會造成傷害。該擾亂之一類型為癌症，其為從一系列基因 事件引起之疾病。 癌症細胞由兩種可遺傳之性質規範：不受控制之生長及 對正常組織之不受控制之侵襲。癌細胞可以違反正常細胞 生長規則之方式分裂’導致產生局部生長或腫瘤。此外， 有些癌細胞亦具有從原發部位轉移，侵襲病患其他健康組 織之能力。由於兼具這兩種特徵，使得癌細胞格外危險。 人類之癌症係經由—種多步驟之過程進展，其顯示必須發 生多種？文變才會使I常細胞轉變為具有惡性表型 ㈣_ Phenotype)之細胞。一類與其有關之基因包括細 =致癌基因（o_gene)，當其因突變而活化時或不適當表 =將駕馭正常細胞之控制機構，並促成無法掌控之細 胞增殖。 . …心吁析形成腫瘤或贅瘤‘ 要e g瘤保召在單一定點 脾兮邱办丨饭稱為良性，全部治療J 夺以4位Μ外科手術移除。 腫瘤或贅瘤如為惡性，亦艮 97062.doc 200526957 果其細胞有能力侵襲周圍組織，則被歸類為癌症。當該等 細胞穿過基底層而開始侵襲在其下方之結締組織時，真性 惡性化於焉開始。當細胞具有從腫瘤主體脫離，進入血流 或淋巴管以及在身體中其他部位形成繼發性腫瘤或轉移之 能力時，即稱之為惡性。腫瘤轉移越廣，越難以根除及治 療。 根據流行病學及臨床研究，大多數癌症皆係從溫和良性 以緩慢的數個階段演化為惡性腫瘤。惡性腫瘤通常開始時 為具有不正常生長特性之良性定域性細胞群，稱為「發育 異常（dysplasia)」。異常細胞獲得異常生長特性，形成以細 胞群局部生長及腫脹為特徵之贅瘤。如果未治療，原位贅 瘤可進展為惡性贅瘤。從發育異常之初次徵候至出現完全 成熟之惡性癌症可能歷經數年或數十年。在許多種癌症中 均可發現此種特別過程。 轉形性生長因 TGF-β為涉及果蠅乃至人類等廣泛生物之各種生物過程 之凋節之超大豕族生長因子（細胞激素）中之一員（Grande，
Pn>c· Soc· Exp· Biol· Med·，214 (1): 27-40 (1997))。此種過 耘包括細胞增殖及分化、細胞外基質代謝、骨形成作用、 黏著、細胞凋亡、細胞移行、胚胎生成、組織修復及免疫 系統凋卽。實際上身體中每個細胞（例如表皮、内皮、造血、 神經το及結締組織細胞）均會產生TGF_p並具有TGF-p之受 體。 在直系TGF十家族中有多種異構型（isoform)，如TGF-β 1、 97062.doc 200526957 TGF-P2、TGFJ3、TGF-P4及TGFJ5，而哺乳類異構型為 TGF-βΙ、TGFj2及TGFJ3。各異構型係以不同之基因編 碼，並以組織特異性及由成長調節之方式表現。例如， TGF-βΙ mRNA廣泛地於表皮、内皮、造血及結締組織細胞 中表現’而TGF-02 mRNA主要於表皮及結締組織細胞中表 現’以及TGF-p3 mRNA主要於間葉細胞中表現。哺乳類異 構型於種與種之間被向度保留，顯示各個異構型具有重要 生物功能。此等異構型儘管具有相似性，但在對於tgf_p 受體之結合親和性上互有差異。 三種哺乳類TGF-β異構型TGF-βΙ、TGFJ2及TGF-β於剔 除時之表型均不同且未重疊。TGF-βΙ基因剔除小鼠（null mice)罹患類似自身免疫之發炎疾病，TGF-β基因剔除小鼠 (knockout mice)呈現圍產期死亡及嚴重發育缺陷，又 TGF-P3人缺小鼠（deficient mice)罹患顆裂及肺部發育缺陷。 此顯示該等配體具有異構型.特異性活性（is〇f〇rm-specific activity)，無法由其他家族成員代償。 TGF-β家族成員藉由與三種高親和性受體，即第〗、η及η工 型受體，結合而發動其之細胞作用（内皮因子（end〇gH幻為另 一種TGF-β受體，富含於内皮細胞上）。第m型受體（亦稱為 β聚糖）為量最多之類型，當其存在時，藉由與所有三種 TGF-β異構型結合而發揮功能，繼而將其等提供給傳信受 體，即第ί型及第Η型受體。第则受體之可溶性細胞夕口卜區 域之作用如同TGF-β拮抗劑。（VUchis Lander〇s以^， BiMhem· J·，355: 5-222 (2001))。第 j型及第 n型受體之細 97062.doc 200526957 胞内區域含有絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶，其藉由將數個被 稱為「SMADs(此術語係從線蟲（Caen〇rhabdhis elegans)及 果蠅（Drosophila melanogaster)鑑定出之 Sma&MAD基因同 源物衍生而成）」之信號·轉導蛋白質磷酸化，而發動細胞内 之傳信。雖然TGF-β可與第ΠΙ型受體結合，並將TGF_p呈獻 給第I型及第II型受體，但TGF-βΙ及TGF-p3亦能與第π型受 體直接結合。在配體與第Π型受體結合後，第η型受體聚 集、結合並將第I型受體轉磷酸化，藉此刺激此等受體之蛋 白質激酶活性。TGF-β以此種通用方式發動信號轉導。 TGF-βΙ就量而言為主要的異構型，然而實質上每個組織 均會表現此三種異構型中之一種或多種，以及其之同源受 體。此三種異構型之表現模式在時空上互異，在發育期及 成熟動物中’均顯示其等扮演要角。此可由該三種異構型 之基因剔除小鼠具有未重疊之表型譜系支持。顯然所有此 二種TGF-β在發育中均很重要，因為剔除此等基因之任一 者，均會造成某些胚胎期或圍產期死亡。彼等在成熟動物 中之額外角色可從TGF-β之表現方式（在未被干擾之動物中 之表現及回應挑釁時之表現），TGF — β功能不良（經由基因處 理或施用TGF-β拮抗劑）之小鼠之表型，以及顯示丁(}17_0對 不同特化細胞類型之影響之活體外研究推測。因此，TGF-β 在調節細胞增殖、分化及規劃性細胞死亡、免疫系統功能、 血管新生及組織修補中擔任關鍵角色。所以，許多疾病過 私與異常之TGF-β功能有關。喪失TGF-β功能涉及癌症之發 病、動脈硬化及自身免疫疾病，而過量之產生則涉及 97062.doc 200526957 纖維增生性異常，寄生生物誘發之免疫抑制，及轉移（參考 ^[列 士口 Roberts and Sporn， The Transforming Growth
Factor s-β，in Sporn and Roberts (eds·)，Handbook of Experimental Pharmacology: Peptide Growth Factors and Their Receptors，Springer Verlag，Berlin (1990)，at page 419-472 ; Flanders and Roberts, Transforming Growth
Factor-β, in Oppenheim and Feldmann, Cytokine Reference, Academic Press, London (2000) ； Dunker and Krieglstein,
Eur. J. Biochem·，267: 6982-6988 (2000) ; Branton and · Kopp, Microbes Infect., 1: 1349-1365 (1999);及 Chen and Wahl，Mircrobes Infect·，1: 1367-1380 (1999))。 TGF-β之增加及減少與許多疾病相關，此等疾病包括動脈 硬化及腎、肝及肺之纖維化疾病。TGF-β之基因突變、其受 體及/或細胞内傳信分子與TGF-β結合在病理過程中亦很重 要，尤其在癌症及遺傳性出血性微血管擴張症上特別重要。 TGF-β異構型在各種腫瘤之腫瘤發生過程中扮演複雜的 角色。在許多情況，腫瘤細胞變得對TGF-β有抗性，其通常 _ 由於編碼（a)受體、（b)直接參與傳信之分子（SMADS)、或（c) 在細胞週期之控制中扮演關鍵性角色之下游蛋白質（例如 CDK-抑制劑或Rb蛋白質等）之基因發生突變。再者，數個 研究報導TGF-β在腫瘤細胞中之分泌增加將使相鄰組織之 增殖受到抑制。該TGF_P之分泌增加亦可促進血管新生（刺 激VEGF之產生）。此二作用均會刺激腫瘤生長。 TGF-β是一種多效細胞激素’其可直接（藉由影響細胞生 97062.doc 200526957 長及分化）或間接（藉由調控免疫系統、細胞外基質更新及血 官新生）影響腫瘤生長。先前數據顯示腫瘤細胞可改變其對· TGF-β之反應，從早期腫瘤之生長抑制至後期腫瘤之轉移促 進（pro-metastatic)。TGF-β傳信途徑被認為兼具腫瘤抑制者 途徑及腫瘤惡化與侵襲之促進者（可參考例如Derynck以 al.，Nat· Genet·，29 (2): 117-129 (2001))。 在正常細胞中，TGF_p可藉由抑制細胞增殖及/或藉由促 進細胞分化或凋亡，作為腫瘤抑制者。在腫瘤生成之過程 中，許多細胞喪失經由TGF-β媒介之生長抑制。在對TGF-p 修 之生長抑制作用產生抗性後，腫瘤細胞及腫瘤内之基質細 胞常增加其之TGF-β生產。該增加之丁(317_0生產與腫瘤對遠 方器官之侵襲性及轉移性增加有關，至少一部份係由於經 由TGF-β媒介之血管新生刺激、細胞運動、免疫抑制及腫瘤 細胞與細胞外間質之交互作用改變。因此，腫瘤細胞對 TGF-β之抵抗性及伴隨之TGF_p配體過量生產導腫瘤形成 增加，且此等腫瘤細胞更具侵襲性。事實上，TGF-β及相關 受體在健康狀態與疾病中皆扮演非常重要之角色。 ⑩ TGF-β為上皮細胞增殖之強力抑制劑，且TGF_p系統在許 多組織中具有腫瘤抑制之活性（參考例如G〇id，crit. Rev· Oncol., 10： 303-360 (1999)； Massague et al.5 Cell, 103: 295-309 (2000);及 Akhurst及 Balmain，J· Pathol·，187: 82-90 (1999))。TGF-β受體或其下游傳信成分之減少或喪失可在 許多人類腫瘤類型（包括胃腸道、乳房及前列腺之腫瘤）中發 * 現。使用基因工程小鼠模型或經基因處理之腫瘤細胞株之 97062.doc -10- 200526957 異種移植體（xenograft)之研究已確認TGF-p功能降低與腫 瘤發生增加間之因果關係。然而，TGF-β在腫瘤生成中角色 甚為複雜，如許多晚期人類腫瘤顯示TGF-β之表現增加，此 與增加之轉移及預後（prognosis)變差有關聯。由此顯示 TGF-β功能在腫瘤生成之初期為腫瘤抑制者，然而在後期其 為致癌因子，並促進急速轉移性疾病之演進。促進轉移之 機構可研判包括增強之腫瘤細胞侵襲性、增強之血管新生 及對免疫監督系統之抑制。TGF-β 1為於人類後期癌症中最 常調升（upregulated)之異構型，惟TGF_P2及TGFJ3在某些 情況中亦有參與。 TGF-β之表現在許多惡化之人類癌症中增高，且與侵襲性 及/或轉移增強有關。TGF-βΙ及TGF-p3為經常有關之異構 型。通常，病情惡化之癌症病患之TGF-β血漿濃度亦增加， 顯示腫瘤分泌顯著量之TGF-β於循環系統中。呈現TGF-p表 現長:局之腫瘤包括乳癌、結腸癌、胃癌、肝癌、胰臟癌、 前列腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌及鼻咽癌、黑素瘤、軟骨 肉瘤及骨腫瘤。 對TGF-βΙ之免疫組織化學染色與人類乳癌病情惡化有關 (Gorsch et al·，Cane· Res·，52: 6949-6952 (1992))，並與淋 巴結陽性及轉移有關（Walker & Dearing，Eur· J. Cane.，28: 641_644 (1992))。分泌至細胞外之TGF-βΙ蛋白質在原發性 人類乳癌之前期及淋巴結轉移中增加（Dalai et ai.，Am· j.
Pathol·，143·· 381-389 (1993))。TGF-βΙ在 81%之剛診斷出之 乳癌患者之血漿中增加，而在經外科切除術成為淋巴結陰 97062.doc 200526957 性之患者中回復到正常程度，但在淋巴結陽性患者中則 否’此暗示原發性腫瘤及轉移分泌顯著量之TGF-βΙ於循環 系統中（Kong et al·，Ann· Surg·，222: 155-162 (1995))。亦 曾發現於具有陽性淋巴結之乳癌患者中TGF-p3之血漿濃度 增加（Li et al·，Inti· J· Canc·，79:45 5-459 (1998))，又已知 在侵襲性腫瘤中若合併淋巴結參與及陽性TGF-P3表現，預 後（prognosis)將不良（Ghellal et al·，Anticancer Res·，20: 4413-4418 (2000)) 〇 對結腸癌患者而言，在切除之原發腫瘤中TGF-β 1染色增 強與疾病向轉移進展有密切關聯（Friedman et al.，Canc.
Epidemiol· Biomarkers Prev·，4: 549-554 (1995))。再者， 在侵襲局部淋巴結之癌細胞中曾發現TGF- β 1之染色程度， 與原發性腫瘤相較，顯示提高，並且在75%之受檢病例中 於轉移過程出現TGF-β 1升高（PiC0n et al·，Cane. Epidemiol· Biomarkers Prev·，7·· 497-5 04 (1998))。直腸結腸癌病患中 TGF-βΙ及TGF-P2之血漿濃度增加，並且在疾病更惡化時更 高（Tsushima et al·，Gastroenterol·，110: 375-382 (1996)); 及 Bellone et al·，Eur· J· Canc·，37: 224-233 (2001)。同樣地 於肝細胞癌患者中TGF-β 1血漿濃度增加，以及切除腫瘤後 濃度正常化，顯示腫瘤為TGF-βΙ之來源（Shirai et al.，Jpn. Cane· Res” 83: 676-679 (1992))。在胃癌組織中之 TGF-βΙ 陽性染色與漿膜侵襲及淋巴結轉移密切相關（Maehara et al·，J· Clin· Oncol·，17: 607-614 (1999))，並且 TGF-βΙ 之血 清中濃度增加與淋巴結轉移及預後不良相關（Saito et al·， 97062.doc -12- 200526957
Anticancer Res·，20, 4489-4493 (2000))。再者，TGF_pi、2 及3之mRNA在50%胰臟癌病例中增加，且其增加之表現與 存活率降低相關（Fdess et al·，Gastroentero丨·，105: 1846_ 1856 (1993))。 在別列腺癌病患中，TGF-β 1染色增加與較高腫瘤等級及 轉移有關（Wikstrom et al·，prostate，37·· 19-29 (1998))。 TGF-βΙ染色增加為患者存活之負面預期因子（Strav〇dim〇s et al·，Anticancer Res·，20: 3823-3828 (2000))。已轉移之原 發腫瘤比未轉移者呈現較高程度之TGF_pi染色（Eastham以 al·，Lab· Invest·，73·· 628-635 (1995))。再者，血漿 TGF-pi 浪度在臨床上出現明顯轉移之患者（Adler et al.，J. Urol,， 161: 182-187 (1999))或原發性第ιπ/IV期疾病之患者 (Ivanovic et al·，Nat· Med·，1: 282-284 (1995))中顯著增加。 曾發現在肺癌病患之原發腫瘤中，有淋巴結轉移者與無 轉移者相較，可萃取之TGF-βΙ蛋白質增加（Hasegawaetal.， Cane·，91: 964-971 (2001))。在瀰漫性而非局部區域性之黑 素瘤病患中發現血·漿中TGF-βΙ濃度提高而TGF-P2濃度減 少（Krasagakis et al·，Br· J· Canc·，77: 1492-1494 (1998))。 在骨腫瘤中，TGF-βΙ或TGF-03之免疫組織化學染色升高與 後來肺癌轉移比率較高有關（Yang et al·，J· Exp· Med·，184: 133-142 (1998))。在軟骨肉瘤病患中血漿TGF-βΙ濃度亦有 意義地升咼（Gridley et al.，Cane· Detect· Prev·，22: 20-29 (1998)) ’ 腎細胞癌患者亦然（Wunderlich et al·，Urol· IntL， 60: 205-207 (1998)及 Junker et al·，Cytokine，8: 794-798 97062.doc 200526957 (1996)) ’此暗示此等類型腫瘤分泌大量之。在侵襲 性而非表淺性膀胱癌患者中發現血清TGF-βΙ濃度提高，惟 在轉移之患者中未見進一步提高（Edel> et al·，j Ur〇l·，156: 953-957 (1996))。血清濃度在與伊普斯坦-巴病毒 (Epstem-Barr virus)有關之鼻咽癌中提高，於復發腫瘤病患 中尤然（Xu et al·，Inti· J· Canc·，84: 396-399 (1999))。 曾發現若將大鼠乳房腺癌細胞株之無血清培養物用 TGF-βΙ預處理，則在注射於同源大鼠後造成肺轉移數量顯 著增加（Welch et al·，Proe· Natl· Acad· Sci· USA，87: 7678_7682 (1990))。亦曾發現將原發人類前列腺腫瘤細胞 用TGF-βΙ基因轉染（transfecti〇n)，並原位植入SCID小鼠後 可刺激轉移（Stearns et al·，Cane· Res·，5: 71 1-720 (1999)) 〇 大鼠前列腺癌細胞（Steiner & Barrack，Moh Endocrinol·，6: 15-25 (1992))及中國倉鼠卵細胞（Ueki et al·，Jpn. J. Cane·
Res·，84·· 589-593 (1993)可得類似結果。 曾發現若用針對TGF-β 1、2及3之中和性抗體處理無胸腺 小鼠（athymic mice)，則在腹腔内接種人類乳癌細胞株 MDA-MB-231後’可抑制肺轉移之形成（Arteaga et al.，J. Clin· Invest·，92: 2569-2576 (1993))。相同抗體，在將 b 16F1 黑素瘤庄射於同源小鼠之尾靜脈時，使形成之轉移數量減 少 3倍（Wojtowicz-Praga et al·，J· Immunother· Emphasis
Tumor Immunol·，19: 169-175 (1996))。在其他報告中，發 現將人類癌細胞株皮下植入無胸腺小鼠後，抗TGF_p丨單株 抗體會減少轉移之發生（Hoefer & Anderer，Cam Immun此 97062.doc -14- 200526957
Immiinother·，41·· 302-308 (1995))。在所有這三項研究中， TGF-β對於宿主動物之先天殺手細胞、單核細胞或淋巴激素 活化殺手細胞之免疫監控機制（immun〇surveiUance)之抑制 效果為轉移效率增咼之原因之一。再者，使用對於TGF-β 1 之特異性反義寡核苷酸（antisense 0〗ig0nuc〗e〇tide)處理惡 性小鼠纖維肉瘤細胞可顯著降低此等細胞之轉移性質，此 暗示腫瘤細胞本身產生之TGF_p對促進轉移甚為重要 (Spearman et al·，Gene，149: 25_29 (1994)) 〇 在三個不同之實驗系統中，藉由轉染顯性抑制（d〇minant negative)第II型TGFJ受體，可干擾乳房腫瘤細胞株對 TGF-β之反應，使得此等細胞轉移效率顯著降低 (McEarchem et al.5 Int. J. Canc.? 91: 76-82 (2001) ； Oft et al·，Ciirr· Biol·，8·· 1243-1252 (1998);及 Yin et al·，j· Clin· Inveat·，103: 197-206 (1999))。在人類乳房癌細胞株 MDA-MB-23 1之情況，於使用無胸腺小鼠之異種器官移植 (xenograft)模型中，骨轉移顯著降低且存活期延長（γίη以 al·，supra)。此等結果暗示，至少在乳癌中，直接作用於腫 瘤細胞之T G F - β可增加轉移效率。其機制包括增強侵襲性及 k咼副甲狀腺素（parathyroid hormone)相關胜肽之產生。 然而TGF-β並非一律為轉移促進性（pr〇_metastatie)，曾有 報導使用TGF-β預治療可抑制中國倉鼠軟骨肉瘤造成之肺 轉移形成（Fujisawa et aU j· Εχρ· Med·，187: 2〇3_213 (2000)) ’用TGF-p3轉染可降低大鼠口腔癌細胞株之轉移性 散佈（Davies et al.，J· 〇ral· Path〇1 Med 29· 232 24〇 97062.doc -15- 200526957 (2000))’第II型TGF-β受體之滿疮 $度表現會降低經κ -ras-轉形 之甲狀腺細胞之轉移潛力（Tu 0 et al·，inti· j· Canc·，80: 8 5-91 (1999))。此暗示TGF〇促 P從進轉移之能力隨腫瘤類型而 異0 既然TGF-β在許多器官系統中扮演維持正常細胞怪定狀 態之重要角色，使請ρ_β拮抗劑以治療tgf韻成之病症 之關鍵性觀念問題，為不希望在正常細胞造成副作用，此 等副作用包括（但+限於）由於在許多上皮而批腫瘤抑 制功旎喪失所導致之異常細胞增生及腫瘤形成增加，及由 於免疫系統失調造成之問題（例如多病灶性炎症、自體免疫 徵狀及骨髓增生）。根據對於以實驗方法造成TGF_p功能不 良之小鼠之研究，可預測此等病理現象。 有Rag2基因剔除背景而能延長存活之Τ(3ρ·β基因剔除小 鼠發生非轉移性結腸癌（Engie et ai” cane. Res” 59: 33 79-33 86 (1999))，此與内源性TGF_p在結腸上皮中有腫瘤 抑制功能之觀念相符合。只具有一個功能性TGFj丨等位基 因（allele)之 TGF-βΙ+Λ 小鼠顯示胃腺體（glandular st〇mach) 增生（Boivin et al·，Lab· Invest·，74: 513-518 (1996))，以及 在肝及肺中對於致癌物誘發之腫瘤形成之感受性增加 (Tang et al·，Nat· Med·，4: 802-807 (1998))。相似地，干擾 顯性抑制之TGF-β受體針對目標之過度表現產生之TGF-β 反應性，造成增生及對皮膚及乳腺中致癌物誘發腫瘤發生 之感受性增加（Amendt et al·，Oncogene，17: 25-34 (1998); 及 Bottinger et al·，Cane· Res·，57: 5564-5570 (1997))，以及 97062.doc -16- 200526957 自然發生之乳房腫瘤增加（Gorska et al.，Proc. Am. Assoc. Cane· Res·，42: 422 (2001))。 在斷奶後，TGF-β基因剔除小鼠很快死於快速衰竭症候 群，其與多病灶性炎症反應導致之淋巴細胞及巨噬細胞大 里浸潤至許多器官（尤其心及肺）有關（Shull et al·，Nature， 359: 693-699 (1992)及 Kulkarni et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，90: 770-774 (1993))。該症候群有許多自體免疫 疾病之特性證據，包括針對核抗原之循環性抗體、免疫複 合物沉積及主要組織相容複合抗原（MHCI及MHCII)之表現 增加（Dang et al·，J· Immunol·，155: 3205-3212 (1995))。在 mch不足之背景中（其中發炎受到抑制），出現骨髓增生 (Letterio et al·，J· Clin· Invest·，98: 2109-2119 (1996))。此 等研究暗示TGF-β 1在免疫系統之多個環節維持正常恆定性 上具有關鍵性角色。與此相符之例子為：在CD4 +及CD8+ T-細胞中因顯性抑制（dominant negative)TGF_p受體之基因轉 移所造成之TGF-β反應性降低，使得τ細胞分化成效應τ細 胞（effector T-cell)，此亦導致自體免疫樣症候群（Gorelik & Flavell，lmmun·，12: 171-181 (2000))，而在早期 τ細胞中顯 性抑制受體之表現造成CD8+ T細胞之淋巴增生性失調，導 致類淋巴器官之大幅擴大（Lucas et al·，J. Exp. Med·，191: 1187-1196 (2000)) 〇 TGF-β拮抗劑（抗體、下述之SR2F、反義TGF_p DNA及顯 性抑制TGF-β受體）先前在許多動物模型系統中，已被使用 於治療TGF-β造成之疾病，尤其是纖維化。然而，此等通常 97062.doc 17 200526957 為相當短期之實驗，常涉及拮抗劑之局部輸送，而未評估 長期暴露於TGF-β拮抗劑之結果，尤其是關於致癌作用及免 疫系統功能方面。 TGF-β之過度表現參與許多疾病之致病過程，尤其是纖維 化性異常及末期癌症。使用TGF_P拮抗劑之初期研究係使用 抗-TGF-β抗體或天然產生之TGF-β結合性蛋白質。例如， 抗體及蛋白聚糖修飾素（pr〇te〇giycan —〇如)（其 為一種TGF-β結合蛋白質）於大鼠模型中均曾保護大鼠，免 於發生實驗性腎臟纖維化（Border et al.，Nature，360: 361-364 (1992);及 Border et al·，Nature，364: 371-374 (1990)) 〇 TGF-β係以生物性潛在複合體之形式被合成，其必須在與 傳仏受體複合體結合之前被活性化。潛伏性係由β前胜 肽（pro-peptide)之斷裂先質（precursor)前區與成熟TGF-β之 非共價締合造成。該先質前區亦被稱為潛伏性-相關胜肽 (LAP) ’且純化TGF-β 1 LAP具有做為所有三種TGF-p異構型 之拮抗劑之功能（Bottinger et al.，Proc. Nat丨· Acad· Sci. USA, 93: 5877 (1996)) 〇 一般而言，抗體與結合性蛋白質系拮抗劑具有相當低的 親和性。第II型TGF-β受體之細胞外配體-結合區域（d〇main) 具有對於TGF-βΙ及TGF-P3有高親和性之結合部位 (〇fConnor-McCourt et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 766: 300-302 (1995))。當可溶性細胞外配體_結合區域與人類免 疫球蛋白之Fc區域融合，親和性將進一步增高，造成配體_ 97062.doc -18· 200526957 結合區域之二聚化（dimerization)。將Fc區域加至可溶性細 胞激素受體亦將增加其在活體内之半衰期（Cap〇n et ai.，
Nature，337: 525-531 (1989))。可溶性TGF-β受體-Fc融合蛋 白質（SR2F)已在許多實驗室中合成，並已成功地使用於封 阻或降低大鼠中由二甲基亞硝基胺或總膽管結紮所誘發之 肝臟纖維化，在實驗性絲球體腎炎模型中之纖維化，在小 鼠中放射線誘發之腸病變，在倉鼠中博萊黴素（ble〇mycin) 誘發之肺纖維化，及在大鼠汽球導管剝裸模型中之外膜纖 維化及内膜相傷之形成（Ueno et al·，Hum. Gene Ther.，11: 33-42 (2000) ; George et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，96: 12719-12724 (1999) ; Isaka et al·，Kidney Inti” 55: 465-475 (1999) ’ Zheng et al·，Gastroenterol·，110: 1286-1296
(2000) ; Wang et al·，Thorax，54: 805-812 (1999)及 Smith et al·，Circ· Res·，84·· 1212-1222 (1999))。在大多數情況，sR2F 拮抗劑係以注射純化蛋白質之方式供給，雖然有兩案例其 係以基因治療途徑將cDNA導入肌肉中（Ueno et al.，supra ; 及Isaka et al·，supra)。未有任何作者對副作用有所說明， 然而此等研究均為相當短時間之研究。 TGF-β係以生物學上潛伏形式合成，其必須在該TGF_p與 受體結合及引起生物反應之前予以活化（Munger et al.，
Kidney Intl·，51: 1376_1382 (1997))。由於難以將活性與潛 伏性TGF-β區別及實驗上定量，因此對於tgFj在身體中活 化之機構及環境所知相當少。使用免疫螢光技術區分在冷 ;東組織部分中之活性及潛伏性TGF-p最近已應用在乳腺方 97062.doc -19- 200526957 面，潛伏性TGF-β之活化在正常組織之上皮中係以一個細胞 接一個細胞之方式非常局部地發生（Barcellos-Hoff &
Ewan，Breast Cane· Res·，2: 92-99 (2000)) 0 相對地，在面 臨病理性挑戰時，潛伏性TGF-β之活化可能遠比正常狀況時 廣泛。舉例言之，以放射線照射乳房造成在上皮、鄰近上 皮之基質及脂肪組織基質中TGF-β之廣泛性活化 (Barcellos-Hoff et al·，J· Clin· Invest·，93: 892_899 (1994))。同樣地，培養物中大部分的正常細胞主要分泌潛 伏性TGF-β，惟來自較惡化腫瘤之細胞分泌較大量之活性 鲁 TGF-β。重要地，在使用經致癌基因-轉形之纖維肉瘤細胞 株之研究中，高度轉移纖維肉瘤藉由分泌較高比率之活性 形式TGF-β來區別，惟所有轉形株分泌之TGF-β總量均相當 大（Schwarz et al·，Growth Factors，3: 115-127 (1990))。 美國專利申請案公告第2002/0176758號（公告日期2002年 11月28日），及美國專利第5,571，714號、第5,772,998號、第 5,783，185號及第6,〇9〇,3 83號揭示針對丁〇?-0之單株抗體及 此等抗體之各種用途。 籲 美國專利申請案公告第2003/0125251號（公告日期2003年 7月3日）揭示TGF-β拮抗劑選擇性地中和「病理性」T(}F-p。 特定而言，其提供藉由可溶性TGF-p拮抗劑（311217)抑制轉移 之方法與組合物。該拮抗劑係由第II型TGF-β受體之可溶性 細胞外區域（與人類IgG2Fc區域融合所組成。該申請案尤 * 其關於使用SR2F來防止轉移，但不影響TGF_p之正常生理 - 學上之角色。因此，SR2F可區分「生理性」「病 97062.doc -20- 200526957 理性」TGF-β，以致只有「病理性」TGF-β受到SR2F投予的 影響。其亦揭示一種包含可溶性TGF-β拮抗劑之基因轉移 (transgenic)非人類動物，其中該可溶性TGF-β拮抗劑以能防 止該基因轉移動物中之腫瘤轉移為更佳。 美國專利申請案公告第2003/0028905號（公告日期2003年 2月6曰），係關於正常細胞及腫瘤細胞中之基因表現，尤其 關於與所有TGF-β異構型結合之TGF-β II受體之突變型。其 尚關於用於診斷及治療與TGF-β第π型受體（例如腫瘤）相關 之疾病之診斷及治療方法，以及關於一種以「在TGFJ2編 碼基因之第一個外顯子中含有TGF-β 1編碼CDNA之插入段」 為特徵之基因轉移非人類動物。 肺及結腸中缺少彈性纖維加強對潛伏性TGF-β結合蛋白 夤（LTBP4)之結構上需求，然而缺乏細胞外TGF-β與TGF-β 傳信中之LTBP4有關。由於TGF-β抑制上皮細胞增殖，在結 腸尤然，因此可結論如下：其在結腸ECM中之缺乏為激發 小鼠發生結腸癌之關鍵。事實上，數個報告認為TGF-β傳信 之缺陷與直腸癌有關聯。例如，在TGF-β-信號-轉導換蛋白 質（Smad3)具基因剔除性突變之小鼠中，出現與在3C7小鼠 中生長之腫瘤類似之腫瘤（Zhu et al·，Cell, 94: 703-714 (1998))。再者，TGF-信號-轉導蛋白質smad 2及Smad 4中之 突變，或蛋白質TGF-p3第II型受體中之突變，在人類結腸 直腸癌中很普遍，此暗示TGF-p3及其下游目標物具有抑制 腫瘤之功能（Markowitz et al·，Science，268: 1336-1338 (1995) ； Riggins et al., Cancer Res., 57： 2578-2580 (1997)； 97062.doc -21 - 200526957
Zhou et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，95: 2412-2416 (1998)) 〇 WO 2003/015505揭示一種動物模型，其呈現TGF-β結合 蛋白質之雙向功能。此種動物模型並不製造功能性潛伏 LTBP或製造未達最佳濃度之潛伏性轉形生長因子結合蛋 白質LTBP。此項參考文獻同時揭示診斷癌症、肺氣腫或心 肌病變之方法及套組，並分析癌症及/或肺氣腫及/或心肌病 變是否由於LTBP之差異表現而引起，或由KLTBp_4基因中 之缺陷而引起。該專利申請案報導LTBP-4對ECM之完整很 重要，並防止致癌病變、癌細胞侵襲及轉移散佈。 美國專利第6,455,757號及6，175,057號提出阿茲海默病 (AD)及CAA之非人類基因轉移動物模型，其中基因轉移動 物之特性為· 1)生物活性轉形生長因子_β 1 (TGF_β 1)之表 現，或2)所有生物活性TGF_P1之表現及人類甲狀腺β先質蛋 白（ΑΡΡ)基因產物之表現。 隨著鑑定及治療原發性腫瘤之進展，癌症病患之死亡率 愈來愈傾向於與繼發性腫瘤（轉移）之存在相關。一般相信只 要病患有骨轉移，癌症即無法治療。 腫瘤細胞從原發部位轉移至繼發部位包含許多個步驟。 為了解各種化合物對原發性及繼發性腫瘤之影響，必須進 行動物研究。遺慽地，許多腫瘤細胞在動物模型中並不轉 移’尤其不轉移至骨骼。 因此，目前對於使用動物模型系統篩選，以區分TGF_p 之生長抑制活性及促進轉移活性之方法有所需求。 97062.doc -22- 200526957 亦需要開發一種鑑別適合治療繼發性腫瘤之分子之篩選 分析法。 另外’亦而要開發-種治療癌症，尤其是惡化之轉移性 癌症之新途徑，其能識職處理不同類型及階段之原發性 及繼發性腫瘤對TGF-β及TGF_p抑制劑或拮抗劑之反應 性。尤其需要在被診斷為罹患惡化及轉移性癌症之病患 中，鑑別出何者對於使用TGF_p抑制劑或拮抗劑之反應性良 好。 再者，需要開發一種治療骨轉移，以及骨破壞及/或骨損 失（無論疋否與原發性腫瘤有關）之方法。 【發明内容】 因此，本發明如申請專利範圍所列。本發明之一態樣係 關於-種筛選方法，其包含下列步驟：⑴將複數個受試物 質杈予於至少具有一種軟組織或骨轉移之非人類同基因免 疫活性動物模型，該動物模型存在或不存在原發性腫瘤； (2)測定該受試物質對於軟組織或骨轉移之生長及原發性腫 瘤（如果存在）之生長之影響；及（3)鑑定出可抑制軟組織或 骨之轉移而對原發性腫瘤（如果存在）之狀態無不利作用之 受試物質。 在另一態樣中，本發明係關於一種測定被診斷為罹患癌 症之哺乳類病患是否可能因使用TGF-β拮抗劑治療而獲益 之方法，其包含： 又凰 (a)測試從病患取得之癌細胞對TGF-β之生長抑制作用 之敏感性； 97062.doc -23- 200526957 (b)製作-從病患而來之癌細胞之基因表現圖譜，並與 從對使用TGF-β持抗劑治療有反應性之動物模 細胞之基因表現圖譜加以比較；以及 (C)如果得自病患之癌細胞對Τ〇}ρ_β之生長抑制作用不 敏感，並且所具有之基因表現圖譜與該從對該治療有反應 性之動物模型而來之癌細胞之基因表現圖譜類似，則將該 病患鑑定為可從使用TGF-β拮抗劑治療獲益之病患。 如果該癌症為乳癌，包括原發性及轉移性乳癌，上述預 後方法可另外包括測定該病患之Her2狀態之步驟，其中
Her2 +病患通常（雖非皆是）對於使用T(JF邛拮抗劑單獨治療 不反應或反應性差。 在被鑑定為可從使用TGF-β拮抗劑治療獲益之病患中以 該拮抗劑治療癌症之方法亦包括於本發明之範圍中。 在另一態樣中，本發明係關於治療哺乳類病患中與腫瘤 轉移有關之骨骼破壞或骨骼損失之方法，其包含對該病患 投與有效量之TGF-β拮抗劑。 在又一態樣中，本發明係關於治療被診斷為癌症之哺乳 類病患之方法’其包含對該病患投予有效量之TGF-β拮抗劑 與化學治療劑或細胞毒劑之組合，並監測該病患對該組合 之反應，其中該組合之有效量低於該TGF-β拮抗劑與化學治 療劑或細胞毒劑單獨投與（為單劑）時有效量之總和。如果該 癌症為乳癌（包括轉移之乳癌），該化學治療藥劑可為例如紫 杉雙巾S類類（taxoid) ’如紫杉醇（paciitaxel)(商品名：太癌勝 (Taxol®))或紫杉醇衍生物（例如多西他賽（d〇xetaxel)(商品 97062.doc -24- 200526957 名：克癌易（Taxotere®))。 對於被診斷為轉移性癌症之病患，可投予TGF_p拮抗劑以 取代或加入該化學治療劑或細胞毒劑，並付諸於放射線治 療。特定而言，本發明係關於治療被診斷為癌症之哺乳類 病患之方法，其包含對該病患投予有效量之TGF-β拮抗劑與 放射線治療之組合，其中該組合之有效量低於該TGF_p拮抗 劑及放射線治療單獨投予（為單劑）時有效量之總和。如果該 癌症為乳癌（或轉移性乳癌）或直腸癌，該方法可另包含對該 病患投予一種抗血管新生劑。 g 在再一態樣中，本發明係關於治療被診斷為癌症之哺乳 類病患之方法，其包含對該病患投予有效量之TGF_p拮抗劑 與抗血管新生劑之組合，並監測該病患對該組合之反應。 在一較佳具體例中，該抗血管新生劑係能特異性地與血管 内皮生長因子結合之抗體，及/或該TGF-β括抗劑係能特異 I4生地與TGF-β結合之抗體。在另一較佳具體例中，該方法另 包含對該病患投予有效量之化學治療劑或細胞毒劑。在另 態樣中’該方法所用組合劑之有效量低於該TGF-β拮抗劑鲁 及該抗血管新生劑單獨投予（為單劑）時有效量之總和。 在再一態樣中，本發明係提供一種治療被診斷為癌症並 預先測知其對於TGF-β拮抗劑無反應或反應性差之病患之 方法’該方法包含對該病患投予有效量之TGF-β拮抗劑與化 學治療劑或細胞毒劑之組合，或TGF-β拮抗劑與放射線治療 ， 之組合，並監測該病患對該組合之反應。在一較佳具體例 - 中’该癌症為乳癌。在另一較佳具體例中，該化學治療藥 97062.doc -25- 200526957 劑為紫杉雙萜類類（taxoid)。 又，在另一態樣中，本發明係關於一種套組，其包含一 含有可與血管内皮生長因子特異性結合之抗體之容器，及 一含有可與TGF-β特異性結合之抗體之容器，以及有關以有 效量合用此二抗體以治療哺乳類病患之癌症之指南。 【貫施方式】 較佳具體例之詳細說明 I.定義 本文所使用之「TGF-β」係指所有TGF-β異構型。目前已 知TGF-p(l_5)有5種異構型，彼等均具有同源性（6〇-8〇%相 同），且均形成約25 KD之同元二聚體（hom〇dimer)，並對共 有之TGF-β細胞受體（第I、π及III型）作用。TGF-β之基因及 分子生物性質在本技藝中已為人所熟知（參考例如R〇berts， Miner. Electrolyte and Metab·, 24 (2-3): 111-1 19 (1998)；
Wrana, Miner. Electrolyte and Metab.5 24 (2-3): 120-130 (1998)) 〇 本文所使用之「生物活性TGF-β」意指包含TGF-βΙ多肽 之任何生物活性形式，例如在TGF_p丨原肽（pr〇邛eptide)之第 223及225位置上以絲胺酸取代半胱胺酸而成之(參 考 Samuel et al·，EMBO J·，11: 1599_16〇5 (1992) ; Brunner， J· Biol· Chem” 264: 13660 (1989)，或其之生物活性部分、 異構型、同源物、變異型或類似物。 術語「拮抗劑」意指抑制「原始」或「天然」化合物之 作用之分子或化合物。拮抗劑可與此等天然化合物在構形 97062.doc -26 - 200526957 (conformation)、電荷或其他特性方面不具類似性。因此， 月&谶別抬抗劑之受體可與激動劑（ag〇nist)所識別之受體相 同或不同。拮抗劑可具有變構效應（aUosteric effect)，該效 應可防止激動劑作用。或者，拮抗劑可阻止激動劑發揮功 能。與激動劑相反，拮抗劑在細胞内不會造成生理上及/或 生物化學上之改變’因此細胞對拮抗劑存在之反應與對天 然化合物存在之反應一樣。 本文所使用之術語「TGF-β拮抗劑」意指任何能在細胞中 或生理系統中降低TGF-β之量或活性之物質（例如天然或合 _ 成物質，生物分子或有機化合物等）。TGF-p拮抗劑以能降 低TGF-βΙ、2或3之量或活性為較佳。例如，TGF_p拮抗劑 可為在轉錄（transcription)、轉譯（translati〇n)、加工 (processing)或輸送（transport)過程中抑制TGF_p之表現；影 響TGF-β之安定性或先質分子轉化為活，性、成熟形式之過 程；影響TGF-β與-或多種細胞受體（例如第卜π或ιπ型） 結合之能力；藉由特異性抑制TGF_p之傳信途徑而干擾 TGF-β之傳信，特異性抑制TGF_p之傳信途徑係經由在籲 TGF-β受體層級抑制通常由而侧介之細胞反應（例如阻 擾TGF-β與受體結合或抑制藉由結合TGF_p造成之信號誘 導），或經由與TGF-β傳信途徑中之某一個因子交互作用，· 或者藉由抑制該TGF-β傳信途徑以使正常經由扣 介 之細胞反應降低。 ’ . TGF-β拮抗劑包括對抗Τ(}ρ_β之一或多種異構型 (TGF，、咖，及/或τ.β3)之抗體，包括對抗π"之 97062.doc -27- 200526957 一或多種異構型之單株或多株抗體（Dasch et al·，美國專利 _ 第 5,571，714 號，亦可參考 WO 97/13844 及 WO 00/66631)、 嵌合體、人型化或人類抗體；TGF-β受體諸如顯性抑制 TGF-β受體及其可溶形式及可與TGF-β結合之片段，尤其是 TGF-β第II型受體（TGFBIIR)或TGF-β第III型受體 (TGFBIIIR或β聚糠），包含例如TGFBIIR或TGFBIIIR之細胞 外區域，而以重組之可溶性TGF-β受體（rsTGFBIIR或 rsTGFBIIIR)為最佳，如本文所例示者，彼等均可經由基因 轉移有效地導入；對抗TGF-β受體之抗體（Segarini等，美國 鲁 專利第5,693,607號；Lin等，美國專利第6,001，969號、美國 專利第6,010,872號、美國專利第6,086,867號及美國專利第 6,201，108號；WO 98/48024 ; WO 95/10610 ; WO93/09228 及WO 92/003 3 0) ; SR2F受體抗體；反義TGF-β DNA ;潛伏 性相關肽（WO 91/08291);大型潛伏性TGF-P(W0 94/09812) ; TGF-β抑制性蛋白聚糖例如胎球蛋白（fetuin)(美 國專利第5,821，227號）、修飾素（decorin)及其他蛋白聚糖例 如雙糖素（biglycan)、纖維調節素（fibromodulin)、魯米康 ® (lumican)及内皮因子（endoglin)(WO 91/10727 ; Ruoslahti 等，美國專利第5,654,270號、美國專利第5,705,609號、美 國專利第5,726，149號；Border等，美國專利第5,824,655號； WO 91/04748 ; Letarte等，美國專利第5,830,847號、美國專 利第 6,015,693 號；WO 91/10727; WO 93/09800;及 WO 94/10187);生長抑素（somatostatin)(WO 98/08529);甘露糖- # 6-磷酸或甘露糖-1-磷酸（Ferguson，美國專利第5,520,926 97062.doc -28- 200526957 號）；催乳素（pr〇lactin)(WO 97/40848);類胰島素生長因子 ^ II (WO 98/17304) ; IP-ίο (WO 97/00691);三肽 arg-gly-asp 及含有該三肽之胜肽（Pfeffer，美國專利第5,958,41 1號；WO 93/10808);得自植物、真菌或細菌之TGF-β-抑制性萃取物 (EP-A-813875 ; JP 81 19984 ;及 Matsunaga等，美國專利第 5,693,61〇號）；反義寡核酸苷例如抑制丁〇?-0基因轉錄或轉 譯（Chung，美國專利第5,683,988號；Fakhrai等，美國專利 第5,772,995號；Dzau，美國專利第5,821，234號、美國專利 第5,869,462號；及WO 94/25588);參與TGF-β傳信之蛋白 修 質，包括 SMADs(例如 SMAD6 及 SMAD7)及 MADs(EP-A-874 046 ； WO 97/31020 ； WO 97/38729 ； WO 98/03663 ； WO 98/07735 ； WO 98/07849 ； WO 98/45467 ； WO 98/53068 ； WO 98/55512； WO 98/56913 ； WO 98/53 830； WO 99/50296； Falb ^ 美國專利第5,834,248號；Falb等，美國專利第5,807,708號； Gimeno 等，美國專利第 5,948,639 號）；Ski 或 Sno(Vogel， Science，286: 665 (1999) ； Stroschein et al.，Science，286: 771-774 (1999));任何維持抑制TGF-β活性之能力之上述分 _ 子之突變體、片段或衍生物；及小型有機分子。 其中，該TGF-β拮抗劑以TGF-βΙ、TGFJ2或TGFJ3拮抗 劑為較佳。以TGF-β 1拮抗劑為更佳。在一個較佳具體例中， TGF-β拮抗劑為封阻TGF-β與其受體結合之人類單株抗 體，或其片段例如F(ab)2片段、Fv片段、單鏈抗體及其他保 有與TGF-β結合能力之「抗體」形式。在一具體例中，TGF-β · 拮抗劑為藉由噬菌體呈現（phage display)製造之人類抗體 97062.doc -29- 200526957 (WO 00/66631)。在另一較佳具體例中，TGF-β拮抗劑為封 阻TGF-β與其受體結合之人類或人型化單株抗體（或其片段 例如F(ab)2片段、Fv片段、單鏈抗體及其他保有與TGF-β結 合能力之抗體形式或片段）。較佳單株抗體為如實施例1所 述之鼠單株抗體2G7及4A11，及如實施例2所述之其之人類 或人型化形式，以及得自融合瘤（hybridoma)lDl 1 · 1 6之鼠單 株抗體（ATCC登錄編號HB 9849，如Dasch等，美國專利 5,783，185號中所說明者）。其中以該鼠單株抗體之人類或人 型化形式（例如實施例2中陳述者）為更佳。為篩選與感興趣 _ 抗體結合之TGF-β之抗原決定部位（epit〇pe)結合之抗體，可 施行如Antibodies，A Laboratory Manua卜冷泉港實驗室，
Ed Harlow及David Lane (1988)所述之例行交叉封阻分析法 (cross-blocking assay)。另一方面（或進一步地），可採行此 技藝中已知之抗原決定部位定位法（epit〇pe mapping)(參照 例如本文之圖19A及19B)。 適用於本發明之TGF-β拮抗劑亦包括上述TGF-β拮抗劑 之功能性突變體（mutants)、變異體（variants)、衍生物及類鲁 似物，只要彼等保有抑制TGF_P之量或活性之能力即可。本 文中所使用之「突變體、變異體、衍生物及類似物」意指 與母化合物之形狀或構造相似，且保有做為tgf_P拮抗劑功 旎之分子。例如，本文揭示之所有TGF_p拮抗劑可被結晶 並且依據迨成活性部位（active sites)之形狀之配位合理 設計有用的類似物。 _ 另方面，本領域之一般技術人員可在無需過度實驗下 97062.doc •30- 200526957 修改已知拮抗劑之官能基，並篩選能提高活性、半減期、 生物可利用性或其他需要之特性之經修改分子。當TGF-β 拮抗劑為一種胜肽，亦可製造該胜肽之片段及修改物以提 南輸送之容易度、活性、半減期等（例如上述之人型化抗體 或功能性抗體片段）。只要對合成及重組胜肽之製造技藝有 相當熟悉度，該項修改即可在無需過多實驗下達成。熟習 此技藝之人士亦可基於此處說明之TGF_p拮抗劑之結晶構 造及/或活性部位之知識而設計新穎之抑制劑。 術語「物質（substance)」與「化合物」同義，係指可使 用以治療或預防疾病、病症、身體不適或功能失調之任何 化學物質、藥劑、藥物及類似物。化合物包含已知及有潛 力之治療用化合物。一種化合物可藉由使用本發明之篩選 方法筛選以測定是否具有醫療價值。「已知之治療化合物」 例如已知之化學治療劑或細胞毒劑，意指已被證實如經 由動物實驗或先前對人類投予之經驗）對此種治療有效之 治療化合nm ’治療用化合物並不限定於對相關 之病理因子(例如TGF-β)有關症狀之治療有效之化合物。 此處使用之術語「受試物質」意指在本發明之篩°選分析 或動物模型中接受測試以決定是否有用之任何化合物，包 括但不限定於多肽、蛋白質、胜肽及小型有機分子。該受 试物質尤其包括抗體’纟包括鼠類、嵌合體、人型化及人 類抗體。 」忍扣在順序或時間上第 此處使用之術語「原發性腫瘤 一個發病之腫瘤。 97062.doc -31 - 200526957 此處使用之術語「繼發性腫瘤」意指腫瘤從其第一個出 現之器官或部位散佈（轉移）至身體中其他器官或部位之腫 瘤。因此’散佈於骨赂之乳癌並非骨癌，而為繼發性（轉移 性）乳癌，因為癌細胞仍為乳癌細胞之故，而與其位置無關。 本文所用之術語「轉移」意指癌症從身體之一部份轉移 至其他部分。轉移之過程係經由一系列之步驟，包括侵襲、 内滲（intravasation)、輸送、抑制（arrest)、外滲（extravasati〇n) 及生長等，此必須由癌細胞在遠距轉移確立之前達成。 本文所用之有關原發性腫瘤之術語「對狀態之不利影響」 意指導致原發性腫瘤之生長或原發性腫瘤細胞之散佈（轉 移）之任何影響。 本發明之「非人類動物」包含任何非人類，包括脊椎動 物例如齧齒類、非人之靈長類、羊類、牛類、反离類、兔 類、豬類、山羊類、馬類、犬類、貓類、鳥類等。其令較 佳之非人類動物係選自豬類（例如豬）及齧齒類之鼠類（例如 大鼠及小鼠），其中以齧齒類例如小鼠為最佳。然而，本發 明並不受限於任何特殊之非人類動物。 本文所使用之術語「哺乳類」意指被歸類為哺乳類之任 何動物，包括但不限定於人類、非人之靈長類、齧齒類等， 其為特定治療之接受者，其中以非人類動物模型或人類為 較佳。 … 術語「癌症」或「癌症的」意指或說明哺乳類之生理狀 況，其具有不規則細胞生長之典型特性。癌症之實例包括 仁不限於腺癌、淋巴瘤、母細胞瘤（blast〇ma)、肉瘤（SW⑶ma) 97062.doc 200526957 及白血病。此等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細 胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝 細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤 (glioblastoma)、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌 (hepatoma)、黑素瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌 或子呂癌、月思腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲 狀腺癌、肝癌（hepatic carcinoma)及各種類型之頭部及頸部 癌症。 在本文中所使用之術語「治療（treatment)」意指臨床措施 (clinical intervention)，意圖改變接受治療之個體或細胞之 自然過私，以及為了預防或於臨床病程中實施。所需求之 治療效果包括預防疾病之發生或復發，緩和症狀，消除該 疾病之任何直接或間接之病理結果，預防轉移，降低該疾 病惡化之速率，改善或減輕該疾病之狀況，以及緩解或改 善預後（prognosis)。因此，此術語包含與病理因子（例如 TGF-β)有關之症狀之改善及/或回復。本發明之非人類動物 之「生理功能之改善」可使用本文說明之任何量測方法及 對動物存活之任何影響進行評價；治療動物與未治療動物 之反應係使用任何本文說明之分析法進行比較。一種物質 田用於本發明之篩選方法時，造成與病理因子（例如 相關參數之改善，可因而被稱為治療用化合物。 「有效量」或「有效劑量」意指在一定劑量及所需時間 能有效地達到期望之治療或預防結果之量。抗體之「治療 有效劑量」可隨例如病況、年齡、性別、及患者重量及抗 97062.doc -33- 200526957 體在患者中引導出所期望反應之能力等因素而改變。治療 有效量亦是抗體之治療效益超過抗體之毒性或有害影響之 量。「預防有效量」意指在一定劑量及所需時間能有效地達 到期望之預防結果之量。典型地，由於預防劑量主要使用 於疾病發生之前或早期，預防有效量低於治療有效量。 本文所使用之術語「細胞毒劑」係抑制或防止細胞功能 及/或造成細胞破壞之物質。該術語傾向於包括放射線活性 同位素（例如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、 Bi212、P32及Lu之放射線同位素），及毒素，例如來自細菌、 真菌、植物或動物之小分子毒素或酵素活性毒素，包括其 等之片段及/或變異體。 「化學治療劑」為一種使用於治療癌症之化合物。化學治 療劑之例子包括烧化劑例如塞替派（thiotepa)及環磷醯胺 (C YT0XANtm);績S复烧S旨例如白消安（busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan)及旅泊舒凡（piposulfan);氮丙唆類（aziridines) 例如苯梭多帕（benzodopa)、卡波S昆（carboquone)、美托瑞朵 帕（meturedopa)及優雷多帕（uredopa);伸乙亞胺及甲基三聚 氰胺類包括六甲密胺（altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三 伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺； 乙醯生合成物（acet〇genins)(尤其布拉塔辛（bullatacin)及布 拉塔辛嗣（bullatacinone)); —種喜樹驗（camptothecin)(包括 合成類似物拓樸替康（topotecan));珊蝴蟲素（bryostatin); 訊瑞斯坦，;丁（callystatin) ; CC-1065 (包括其之阿多來新 (adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin) 97062.doc -34- 200526957 類似物）；奎脫費新（cryptophycins)(尤其奎脫費新1及奎脫 費新8);多拉斯塔汀（dolastatin);多卡黴素（duocarmycin) (KW-2189 CBI-TMI);艾榴素（eleutherobin);潘奎提斯塔 汀（pancratistatin);薩可迪泰因（sarcodictyin);海綿素 (spongistatin)；苯丁 酸氮芥（chlorambucil)、萘氮芬 (chlornaphazine)、氣填醢胺（cholophosphamide)、雌莫司汀 (estramustine)、異環鱗醢胺（ifosfamide)、美克瑞塔明 (mechlorethamine)、氧化美克瑞塔明鹽酸鹽（mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法余（melphalan)、新氮芥 (novembichin)、膽固醇對苯乙酸氮芥（phenesterine)、潑尼 氮芥（prednimustine)、曲填酸（trofosfamide)、烏拉莫司汀 (uracil mustard);石肖脲（nitrosureas)例如卡莫司汀 (carmustine)、0比葡亞硝脲（chlorozotocin)、福莫司汀 (fotemustine)、洛莫司汀（lomustine)、尼莫司汀（nimustine)、 雷莫司汀（ranimustine);抗生素例如安奈德尼（enediyne)抗 生素（例如卡奇黴素（calicheamicin)，（尤其如卡奇黴素-I1及 卡奇黴素-\，參考例如 Agnew，Chem Inti· Ed· Engl·，33: 183-186 (1994);達奈黴素（dynemicin)，包括達奈黴素A; 艾斯坡拉黴素（esperamicin);新制癌菌素（neocarzinostatin) 發色團（chromophore)及相關之色蛋白（chromoprotein)安奈 德林抗生素發色團）、阿拉黴素（aclacinomysins)、放線菌素 (actinomycin)、奥斯拉黴素（authramycin)、重氮乙醢絲胺酸 (azaserine)、平 陽黴素（bleomycins)、放線黴素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、卡米諾黴素 97062.doc -35- 200526957 (carminomycin)、卡利諸菲林（carzinophilin)、色黴素 (chromomycins)、更生黴素（dactinomycin)、柔紅黴素 (daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5,酮基-L-正白胺酸、羥柔紅黴素（doxorubicin)(包括嗎福琳基-羥柔紅 黴素、氰嗎福啉基-羥柔紅黴素、2-吡咯啉基-羥柔紅黴素及 去氧羥柔紅黴素）、表阿黴素（epirubicin)、伊索比星 (esorubicin)、去甲氧柔紅黴素（idarubicin)、麻西羅黴素 (marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycins)、霉紛酸 (mycophenolic acid)、諾拉黴素（nogalamycin)、橄欖黴素 (olivomycins)、培洛黴素（peplomycin)、波法洛黴素 (potfiromycin)、嘌呤黴素（puromycin)、阿黴素 (quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鏈脲菌素（streptozocin)、殺結核菌素 (tubercidin)、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、 佐柔比星（zorubicin);抗代謝劑例如甲胺喋吟 (methotrexate)及 5 -氟尿哺嘴（5-fluorouracil)(5-FU);葉酸類 似物例如二曱葉酸（denopterin)、甲胺碟吟（methotrexate)、 σ禁羅吟（pteropterin)、曲美托嗪（trimetrexate);嘌吟類似物 例如氟達拉賓（fludarabine)、6-疏基嘌呤、硫咪嘌吟 (thiamiprine)、硫鳥σ票吟（thioguanine);癌咬類似物例如安 西他賓（ancitabine)、阿扎胞苷（azacitidine)、6-氮尿苷 (6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞普（cytarabine)、 二去氧尿普（dideoxyuridine)、去氧氟尿普（doxifluridine)、 依諾他濱（enocitabine)、氟尿喊咬脫氧核苷（floxuridine)及 97062.doc -36- 200526957 5·FU ;雄激素（androgens)例如卡普睪酮（calusterone)、屈他 雄酉旨酮（dromostanolone)丙酸鹽、環硫雄醇（epitiostanol)、 美雄烧（mepitiostane)、睪内脂（testolactone);抗腎上腺素 (anti-adrenals) 例如胺基谷露他斯醮亞胺 (aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦 (trilostane);葉酸補充劑（replenisher)例如扶洛里尼克酸 (frolinic acid);醋葡酸内S旨（aceglatone);酸填酿胺配糖體 (aldophosphamide glycoside);胺基乙醢丙酸（aminolevulinic acid);安 °丫 σ定（amsacrine);倍斯拉布息耳（bestrabucil);比 生群（bisantrene);艾德崔謝特（edatraxate);狄佛費敏 (defofamine)；秋水仙胺（demecolcine);地 σ丫酉昆 (diaziquone);艾佛而十辛（elfornithine);依利醋銨（elliptinium acetate);埃坡黴素（epothilone);依託格魯（etoglucid);石肖 酸鎵；羥基尿素；香菇多糖（lentinan);伊歐尼達敏 (lonidamine);美登素類（maytansinoids)例如美登素 (maytansine)及安絲菌素（ansamitocins)；米托脈月宗 (mitoguazone);米托蒽酿i (mitoxantrone);莫派達醇 (mopidamol)；二胺硝 口丫唆（nitracrine);喷司他丁 (pentostatin);蛋胺氮芬（phenamet) ; σ比柔比星 (pirarubicin);足葉草酸（podophyllinic acid); 2-乙基醯（2-ethylhydrazide)；甲基苄（procarbazine) ; PSK® 克素鎮粉 (krestin);雷佐生（razoxane);利索辛（rhizoxin);西佐糖 (sizoHran);錯螺胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸 (tenuazonic acid);三亞胺 S昆（triaziquone) ; 2,2’，2”-三氣三 97062.doc -37- 200526957 乙胺；單端孢黴稀族化合物（trichothecenes)(尤其如T-2毒 素、斐拉苦林（verracurin Α)、桿孢菌素（roridin Α)及安噎淀 (anguidine);烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine);氮晞 口米胺（dacarbazine);甘露醇氮芥（mannomustine);二漠、甘露 醇（mitobronitol);二溴衛矛醇（mitolactol) ; 口辰泊溴烧 (pipobroman);加赛脫辛（gacytosine);阿糖胞苷 (arabinoside)(「Ara-C」）；環磷醯胺；三乙烯硫代鱗醯胺 (thiotepa)；紫杉雙萜類類（taxoids)例如紫杉醇 (paclitaxel)(TAXOL®，Bristol-Myers Squibb Oncology，普 林斯頓，NJ)及多西他赛（doxetaxel) (TAXOTERE®， Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法國）；苯丁 酸氮芬 (chlorambucil)；健擇（gemcitabine) ; 6-疏基鳥糞嘌呤 (6-thioguanine);疏基口票 口令；滅殺除癌（methotrexate);始類 似物例如順氣胺始（cisplatin)及卡翻（carboplatin);長春花 驗（vinblastine) ; I白；依託泊（etoposide) (VP-16);匹服平 (ifosfamide)；絲裂黴素（mitomycin C)；米托蒽覼 (mitoxantrone)；長春新鹼（vincristine);長春瑞賓鹼 (vinorelbine);溫諾平（navelbine);諾凡特龍（novantrone); 替尼泊苷（teniposide);正定黴素（daunomycin);胺甲嗓吟 (aminopterin); (XELODA® 截瘤達（capecitabine));伊拜構 酸鹽（ibandronate) ; CPT-11 ;拓樸異構酶（topoisomerase)抑 制劑RFS 2000 ;二氟甲基鳥胺酸（DMFO);視黃酸（retinoic acid);截瘤達（capecitabine);及上述之任何藥學上可容許 之鹽或衍生物。此定義亦包括調節或抑制激素對腫瘤作用 97062.doc -38- 200526957 之抗激素劑’例如抗動情素類（anti-estrogens)，包括例如他 莫西芬（tamoxifen)、雷諾昔紛（raloxifene)、芳香環轉化酶 (aromatase)抑制4(5)-咪唑 、4-羥基他莫西芬 (4-hydroxytamxifen)、曲沃昔芬（trioxifene)、雷諾昔紛 (keoxifene)、LY117018、奥納司酮（onapristone)及托瑞米芬 (toremifeneKFARESTON®);及抗雄性激素（anti-andr〇gens) 例如氟他胺（flutamide)、尼魯米特（nilutamide)、白卡羅他 邁（bicalutamide)、醋酸亮丙瑞林（ieupr〇lide)及戈舍瑞林 (goserelin);及上述之任何藥學上可容許之鹽或衍生物。 此處所使用之「紫杉雙萜類（taxoid)」或「紫杉院（taxane)」 係指存在於太平洋紫杉樹（Tbjrws 之樹皮及葉子 之複合雙萜烯類之家族及其衍生物。紫杉雙萜類（taxoid)或 紫杉烷（taxane)家族成員包括（但不限定於）紫杉醇 (TAXOL®)及其衍生物’例如巴卡亭（baccatin) III、三尖杉 寧鹼（cephalomannine)、10-去乙醯基巴卡亭in、1〇_去乙醯 基紫杉醇、7-表-10-去乙醯基紫杉醇、7_木糖基-1〇_去乙醯 基紫杉醇、7-表-紫杉醇、巴卡亭v、7_表_10_去乙醯基_巴 卡亭III、多西他赛（doxetaxel)(TAXOTERE®)、2_去节醯基_ (對三氟甲基苄醯基）紫杉醇、及20-乙醢氧基-4-去乙醯基-5-表-20,0-斷紫杉醇。 術語「細胞激素（cytokine)」為由某細胞群體釋放而作用 於其他細胞以做為細胞間傳媒之蛋白質之通稱。此等細胞 激素之例子如淋巴激素（lymph〇kines)、單核球動力素 (monokines)及習知聚肽類激素。包括於此等細胞激素者有 97062.doc -39- 200526957 生長激素例如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類生長激素 及牛類生長激素；副甲狀腺激素；甲狀腺素；胰島素；前 胰島素；鬆弛素（relaxin);原鬆弛素（prorelaxin);醣蛋白激 素例如濾泡-刺激性激素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)及促黃 體激素（lutenizing hormone)(LH);肝細胞生長因子；纖維 母細胞生長因子，催乳素（prolactin);胎盤催乳素（placental lactogen);腫瘤壞死因子-α及-β ;米勒氏（muuerian)抑制物 質’小鼠促性腺激素-相關性胜狀；抑制素（inhibin);啟動 素（activin);血管内皮生長因子；整合蛋白（integrin);促血 小板生成素（thrombopoietin)(TPO);神經生長因子例如 NGF-β ;血小板生長因子；類胰島素生長因子“及a ;促紅 血球生成素（erythropoietin)(EPO);骨誘導因子；干擾素類 例如干擾素-α、-β及-γ ;細胞群落刺激因子（CSFs)例如巨噬 細胞-CSF(M-CSF)、顆粒性白血球-巨嗤細胞-CSF (GM-CSF)、及顆粒性白血球-CSF(G_CSF);介白素 (interleukinsKILs)例如 IL-1、IL-Ια、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ;腫瘤壞死 因子例如TNF-a或TNF-β ;及其他聚肽因子包括LIF及套組 配位子（kit ligand，KL)。此處使用之術語「細胞激素」包 括從自然來源或重組細胞培養而來之蛋白質，及原生序列 細胞激素之生物活性同等物。 本文使用之「生長抑制劑」意指可在活體外或活體内抑 制細胞（尤其TGF-β·表現性癌細胞）生長之化合物或組合 物。因此，生長抑制劑可為一種在s期顯著降低TGF_p_表現 97062.doc -40- 200526957 性細胞之百分率之物質。例如，生長抑制劑包括阻止細胞 週期進行（s期以外之階段）之物質，例如可誘導G1停滯及 期停滯之物質。典型之M期封阻劑包括長春花生物鹼 (vincas)(長春新鹼（vincristine)及長春花鹼（vinbiastine》、紫 杉烧（taxanes)及topo II抑制劑例如羥基柔紅黴素 (doxorubicin)、表阿黴素（epirubicin)、達見黴素 (daunorubicin)、依託泊苷（etop〇side)及博來黴素 (bleomycin)。此等終止⑴之藥劑亦會使s期終止，例wDNA 烷化劑如他莫西芬（tamoxifen)、強的松（prednisone)、氮烯籲 口米胺（dacarbazine)、甲氣乙胺（mechlorethaniine)、順氯胺鉑 (cisplatin)、胺甲嗓呤（methotrexate)、5-氟尿喊咬 (5-fluorouracil)及 ara-C。進一步資料可參考 The Molecular
Basis of Cancer, Mendelsohn & Israel, eds., Chapter 15 entitled ’’Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia，1995)，尤其 ρ·13。 「生長抑制性」抗體之例子為與TGF-β結合並抑制過度表 _ 現TGF-β之癌細胞之生長者。較佳之生長抑制性抗-TGF_p 抗體為於抗體》辰度約0 · 5至3 0 μ g / m 1下，可使細胞培養物中 SK-BR-3乳房腫瘤細胞之生長抑制20%以上者，以抑制5〇% 以上（例如從5 0 %至約1 〇 〇 %)者為較佳，其中之生長抑，制度 係在將SK-BR-3細胞暴露於抗體六日後測定（參考美國專利 第5,677，171號，頒授日期1997年10月14日）。SK-BR-3細胞 ’ 生長抑制分析在該專利及下文中被更詳細地說明。 97062.doc -41 · 200526957 誘導細胞死亡」之抗體係一種造成活性細胞變成不活 性細胞之抗體。該細胞通常為表現TGF_p受體之細胞，尤其 為過度表現TGF-β受體之細胞。其中該細胞以癌細胞為較 佳’例如乳房、卵巢、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎、 結腸、甲狀腺、胰臟或膀胱細胞。在活體外，此等細胞可 能為 SK-BR晴3、BT474、Calu 3、MDA-MB-45 3、MDA-MB-3 61 或SKOV3細胞。活體外細胞死亡可在補體及免疫促進細胞 不存在下測定，以區分係藉由抗體依存性細胞_媒介之細胞 毒性（ADCC)所誘發之死亡抑或補體依存性細胞毒性（CDc) 誘發之細胞死亡。因此，細胞死亡之分析可使用以熱去活 化之血清（亦即補體不存在）及在免疫效應細胞（immune effector cell)不存在下進行。為測定抗體是否可誘導細胞死 亡’藉由評估換化丙錠（pr〇pidium iodide，PI)、錘蟲藍（trypan blue)(參考 Moore et al·，Cytotechnology，17: 1-1 1 (1995))或 7AAD之攝取量並與未處理之細胞比較，來評估膜完整性之 減損。較佳之細胞死亡誘導抗體為在BT474細胞（如以下說 明）中進行PI攝取分析時會誘導？1攝取者。 「誘發細胞凋亡（apoptosis)」之抗體係一種誘發規劃性細 胞死亡（programmed cell death)之抗體，可藉由與膜聯蛋白 V(annexin V)之結合、DNA分段、細胞收縮、内質網膨脹、 細胞碎裂及/或形成膜泡（被稱為細胞凋亡體）而測定。該細 胞通常為過度表現TGF-β受體之細胞。其中該細胞以癌細胞 為較佳’例如乳房、卵巢、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、 腎、結腸、甲狀腺、胰臟或膀胱細胞。在活體外，此等細 97062.doc -42- 200526957 胞可能為 SK-BR-3、BT474、Calu 3細胞、MDA-MB-453、 MDA-MB-361或SKOV3細胞。現有各種方法評估與細胞凋 亡有關之細胞事件。舉例言之，可藉由膜聯蛋白結合量測 定構脂醯絲胺酸（PS)轉位；DNA分段可經由DNA梯形化法 而評估；以及核/染色質濃縮與DNA分段可藉由亞二倍體 (hypodiploid)細胞之任何增加而評估。較佳之細胞洞亡誘導 抗體為在BT474細胞（見下文）中進行膜聯蛋白結合分析 時，誘發約為未處理細胞之2至50倍（以約5至50倍為較佳， 以約10至50倍為更佳）之膜聯蛋白結合者。有時該促進細胞修 凋亡之抗體為亦能封阻TGF-β結合者（例如2G7抗體）；亦即 該抗體兼有TGF-β抗體之生物特性。在其他情況下，該抗體 不會顯著封阻TGF-β。再者，該抗體可為雖然誘發細胞凋 亡，但不會使S期細胞之百分率大幅降低者（例如，只使此 等細胞之百分率與對照組相較降低〇_1〇%之抗體）。 術語「抗體」係廣義使用，包括單株抗體、多株抗體、 多價抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、全長抗體及 抗體段片，只要其呈現所需要之生物活性即可。天然產生 包含四個多肽鍵：二相同重（H)鏈及藉由二硫鍵結交
，稱為框架區 97062.doc 互補決定區（CDR)，其間散佈之較保守區 -43- 200526957 (framework region，FR)。各 VhAVl 由三個 CDRs 及四個 FRs 組成，從胺基終端至羧基終端以下列順序排列：FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。 抗體（免疫球蛋白）依據其重鏈之恆定區域之胺基酸序 列，可被區分為不同類別。免疫球蛋白可被分為五大類： IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中數個被細分為亞類（異 構型）：例如IgG_l、IgG-2、IgA-Ι及IgA-2等。與此等不同 類別免疫球蛋白對應之重鏈恆定區域被分別稱為α、δ、ε、 γ及μ。不同類別之免疫球蛋白之亞單元構造及三次元構形 已為人所熟知且被概述於例如Abbas et al.，Cellular and Mo丨· Immunology，4th ed· (2000)中。來自任何脊椎動物之 抗體之輕鏈，可依據其恆定區域之胺基酸序列，歸類為兩 種明顯不同之類型（稱為κ型及λ型）之一。本發明之抗體以 免疫球蛋白G為較佳，而以人類免疫球蛋白g為更佳。 本文所用之術语「早株抗體」意指從實質上同源之抗體 家族（亦即除可能天然產生之突變（以少量存在）之外，包含 之個別抗體均相同之群體）得到之抗體。單株抗體具有高特 異性且對抗單一抗原。再者，相對於多株抗體製劑包括對 抗不同決定因子（determinant^抗原決定部位）之不同抗 體’各單株抗體只對抗抗體上之單一抗原決定部位。修改 之「單株」並非需要特殊之抗體製造方法才能建構。例如， 本發明所使用之單株抗體可藉由首先由Kohler et al。 Nature，256: 495 (1975)記載之融合瘤方法而製造，或藉由 重組DNA方法而製造（參考美國專利第4,8 16,567號）。「單株 97062.doc -44· 200526957 抗體」亦可使用例如 Clackson et al.，Nature，352: 624-628 (1991)或 Marks et al·，J· Mol· Biol·，222: 581-597 (1991)記 載之方法從噬菌體抗體庫分離而得到。 「全長抗體」意指完整抗體’可在自然界發現而非一片 段。 抗體片段」只包含元整抗體之一部份，通常包括該完 整抗體之抗原-結合部位，因此保有與抗原結合之能力。本 定義所涵蓋之抗體片段之例子包括：⑴具有VL、CL、VH 及CH1區域之Fab片段’亦即含有輕鍵之可變區及怪定區域 二者及重鏈之第一恆定區域（CH1)之Fab片段；（ii)Fab，片 段，其與Fab片段不同之處，係在重鏈CH1區域之羧基端加 入數個殘基，包括來自抗體絞鏈區之一或多個半胱胺酸； (iii)Faiy-SH片段，其係Faiy片段中怪定區域之半胱胺酸殘 基具有一個游離酼基者；（iv)具有抗體單臂之VL及VH區域 之Fv片段；（v)F(ab*)2片段，其係在絞鏈區藉由二硫鍵連接 之兩個Fabf片段所成之二價片段；（Vi)單鏈抗體分子（例如單 鏈 Fv，scFv)(Bird et al·，Science，242: 423·426 (1988);及 Huston et al·，Proc· Natl· Acad· Sci USA，85: 5879-5883 (1988)) ’以及（vii)具有兩個抗原連結部位之「雙功能抗體 (diabody)」，包含在同一肽鏈中與輕鏈可變區域（VL)連接之 重鏈可變區域（VH)(參考例如EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 及 Hollinger et al·，Proc· Natl· Acad· Sci· USA，90: 6444-6448 (1993))。 具有「天然序列」之抗體或其之區段，或稱為r天然序 97062.doc -45- 200526957 列型」抗體或其之區段，意指具有與從自然界衍生之抗體 之對應部分相同之胺基酸序列之抗體或區段。因此，具有 天然序列之抗體可具有與從任何哺乳類而來之天然抗體對 應之胺基酸序列。此等具有天然序列之抗體可衍生自從自 然界單離之抗體，亦可藉由重組或合成方法製造。 變異抗體或其之區段意指與具有天然序列之對應抗體或 其之區段有至少約80°/。胺基酸序列相同性之抗體或其之區 段。此荨變異體之例子，包括例如全長抗體及抗體片段或 其之輕鏈或重鏈區中，在該抗體、片段或區段之N_4C_終 端或者在該抗體、片段或區段之内增加或刪除一個或數個 胺基酸殘基所成者。一般而言，變異體與包含天然序列之 對應抗體或其之區段至少有約80%之胺基酸序列相同性， 以至少有約90%之胺基酸序列相同性為較佳，以至少有約 95%之胺基酸序列相同性為更佳。 在本文中，「胺基酸序列相同百分率（％)」意指在將序列 對準並導入間隙後，候選序列之胺基酸殘基與所選序列之 胺基酸殘基相同之百分率，其中如需要，以使序列相同性 達最大百分率之方式對準’且不將任何保守性取代視為序 列相同性之一部份。為決定胺基酸序列相同百分率所採取 之對準（alignment)可用此領域中各種方式達成，例如使用 公開之現有電腦軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、 ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等軟體。熟悉此技藝者可 決定量測對準率用之適當之參數’包括達到與供比較之全 長序列最大對準率所需之計算法。然巾，就在本發明中之 97062.doc -46- 200526957 目的而言’胺基酸序列相同％值係藉由使用下述序列比較 用電腦程式ALIGN-2而得到。該基因技術公司（Genentech Inc·)創作之ALIGN-2序列比較用電腦程式已在美國著作權 公署（US Copyright Office)(華盛頓特區2〇559號）建檔使用 者指南，註冊號碼為美國著作權註冊第TXU 5 10087號，並 經由基因技術公司（南舊金山，加州）公開發行。該AligN-2 程式必須配合UNIX作業系統使用，而以使用數位unix V4.0D為較佳。所有序列比較參數均係由aligN-2程式設定 且不可改變。 就此處之目的而言，某胺基酸序列A與某胺基酸序列b之 胺基酸序列相同％(換言之，某胺基酸序列A具有或包含與 某胺基酸序列B之胺基酸序列相同％)可依照以下方式計 算：
100乘以X/Y 其中，X為在A與B之程式對準中，由序列對準程式ALIGN_2 汁分為相同殘基配對（identical matches)之胺基酸殘基之數 目，Y為在B中胺基酸殘基之總數。須知當胺基酸序列八之 長度不等於胺基酸序列B之長度時，A相對於B之胺基酸序 列相同％並不等於B相對於a之胺基酸序列相同％。 「功能性」或「生物活性」抗體係在結構、調節、生物 化學或生物物理事件上能發揮其天然活性中之一項或多項 之抗體例如，功能性抗體可具有與抗原特異性結合之能 力’而該結合最終激發或改變細胞或分子事件，例如信號 轉導或it活性。功能性抗體亦可封阻受體之配體活化，或 97062.doc 200526957 作用如激動劑類抗體。抗體發揮天然活性之—種或多種之 能力取決於數個因素，包括適當之多肽鏈之摺疊及組合。 在本文中，揭示之方法產生之功能性抗體通常具有兩個相 同之L鏈及兩個相同之H鏈，其間藉由多個二硫鍵連結並適 當地摺疊。 除非另有指示，術語「多價抗體」在本說明書中係使用 於表示包含三個或更多抗原結合部位之抗體。該多價抗體 車父佳被加工成具有三個或更多抗原結合部位，且通常並非 天然序列之IgM或IgA抗體。 在本文中之抗體特別包括「嵌合（chimeric)」抗體，只要 其呈現所需之生物活性即可，在該嵌合抗體中一部份重鏈 及/或輕鏈與衍生自特殊物種之抗體或屬於特定抗體類別 或亞類之抗體中之對應序列相同或同源（類似），而該鏈之其 餘部分與衍生自另一物種之抗體或屬於另一抗體類別或亞 類中抗體中之對應序列相同或同源（美國專利第4,816,567 號及 Morrison et al·，Proc· Natl” Acad· Sci· USA，81: 6851-6855 (1984)) 〇 「人型化」抗體為包含少量衍生自非人類免疫球蛋白序 列之嵌合抗體。大部分人型化抗體為人類免疫球蛋白（接受 者抗體），其中衍生自該接受體之超可變區之殘基係被衍生 自非人類物種（供給者抗體）（例如小鼠、大鼠、兔或非人靈 長類等具有所需之特異性、親和性及能力者）之超可變區之 殘基取代。在有些情況，人類之免疫球蛋白之框架區 (framewofk i*egi〇n)(FR)殘基被對應之非人類殘基取代。再 97062.doc -48- 200526957 者’人型化抗體可包含於接受者抗體或供給者抗體中為曾 被發現之殘基。此等修改可進一步改善抗體之功效。一般 而言，人型化抗體可包含至少一種（通常為兩種）可變區域之 實質全區，其中超可變環區（l〇0p)之全區或實質全區對應於 非人類免疫球蛋白者’以及FRs之全區或實質全區為人類免 疫球蛋白者。該人型化抗體亦選擇性地包含至少一部份免 疫球蛋白恆定區（Fc)，典型地其為人類球蛋白者。關於此之 詳細資料，請參見 Jones et al·，Nature，321:522_525 (1986) ; Riechmann et al·，Nature，332:323-329 (1988);及 Presta，Curr· Op· Struct· Biol·，2:593-596 (1992)。
「人類抗體」為一種具有相當於人類製造之抗體及/或使 用任何本文揭示之製造人類抗體之技術所製造之抗體之胺 基酸序列之抗體。該人類抗體之定義特別排除包含非人類 抗原_結合性殘基之人型化抗體。人類抗體可使用此技藝中 各種技術而製造。在一個具體例中，人類抗體選自噬菌體 庫其令5亥兔菌體庫表現人類抗體（Vaughan et al.，Nature Biotechnology, 14:309-314 (1996)； Sheets et aL, PNAS (USA), 95: 6157-6162 (1998) ; Hoogenboom & Winter，J·
Mol. Bi〇I.? 227: 381 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 5 8 1 (199 1))。人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座 引進基因轉移動物（例如内在免疫球蛋白基因已被部份或 全部去活化之小鼠）而製造。於遭到抗原挑釁時，可見到產 生人類抗體，其在各方面非常近似在人體中所見到之抗 體包括基因重排、組合及產生之抗體種類。此研究已被 97062.doc 200526957 記載於例如美國專利第5,545,807、5,545,806、5,569,825、 5,625，126、5,633,425、5,661，016 號；及 Marks et al·， Bio/Technology，1〇: 779-783 (1992); Lonberg et al·，Nature， 368: 856-859 (1994) i Morrison, Nature, 368:812-813 (1994) ； Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-5 1 (1996) ； Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)； Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol·, 13:65-93 (1995) 。另一方面，人類抗體可藉由將製造抗目標抗原之抗 體之人類B淋巴細胞（該B淋巴細胞可從個體中回收或在活 體外免疫）予以不死化（immortalization)而製備。參考例如
Cole et al·，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，
Alan R. Liss, p. 77 (1985) > Boerner et al., J. Immunol·, 147 (1 ): 86-95 (1991);及美國專利第 5,750,373號。 術語「可變」意指可變區域之某部分序列在各抗體之間 大不相同，以及用於特殊抗體對其特殊抗原之結合性及特 異性。然而，邊可變能力並非在整個抗體之可變區域中均 勻分布。其集中在輕鏈及重鏈可變區域中三個被稱為超可 變區（hypervariable region)之片段。可變區域之較高度保留 部分被稱為框架區（framework region)(FRs)。天然重鍵及幸<τ< 鏈之可變區域各包含四個FRs，此等FRs大部分採取β片狀構 形’並藉由三個超可變區連接，其形成環形連接（i〇〇ps connecting)，在一些情況形成β片狀構造之一部分。各鏈之 超可變區藉由FRs而靠攏在一起，且與來自其他鏈之超可變 區共同形成抗體之抗原結合部位（參考Kabat et ^ 97062.doc -50- 200526957
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。恆定區並不直接參與抗體與抗原之 結合，但顯示各種效應器（effector)功能，例如參與抗體依 存性且由細胞-媒介之細胞毒性（ADCC)。 「親和性成熟」之抗體意指在抗體之一個或多個CDRs中 具有一種或多種改變，以致抗體對抗原之親和性與不具有 此等改變之對應母抗體相較時顯得增進者。較佳之親和性 成熟抗體對於目標抗原具有毫微莫耳或甚至微微莫耳級之 親和性。親和性成熟抗體藉由此技藝中已知之方法製造。 Marks et al·，Bio/Technology，10: 779-783 (1992)記載藉由 VH及VL區域改組而使親和性成熟。CDR及/或框架殘基之 隨機突變記載於Barbas et al·，Proc· Nat. Acad. Sci，USA， 91:3809-3813 (1994) ; Schier et al·，Gene，169: 147-155 (1995) ; Yelton et al·，J· Immunol” 155:1994-2004 (1995); Jackson et al·，J· Immunol·，154(7):33 10-33 19 (1995);及 Hawkins et al·，J· Mol· Biol·，226:889-896 (1992)。 「被單離」或「被回收」之抗體為從天然環境之成分中 被鑑定出及分離及/或回收之抗體。其天然環境之污染成分 為會干擾抗體之診斷或治療用途之物質，可包括酵素、激 素及其他蛋白質或非蛋白質類溶質。在較佳具體例中，此 抗體可被純化至：（1)為多肽之95重量％以上（藉由乙〇〜巧法 測定），以99重量％以上為最佳，（2)使用旋轉杯定序儀 (sPinning-cup sequenat〇r)定序時足以得到N_終端或内部胺 97062.doc -51 - 200526957 基酸序列之至少15個殘基之程度，或者（3)在還原或非還原 條件下使用考馬斯藍（coomassie blue)或更佳之銀染色時， 藉由SDS-PAGE可達到均一性。分離或回收之抗體包括含在 重組細胞中之抗體，因為該抗體之天然環境之至少一成分 不存在。然而通常分離或回收之抗體係藉由至少一個純化 步驟製備。 術浯「抗原」為本領域所熟知者，其包括免疫原性物質（亦 即免疫原），及無免疫回應性（unreSp〇nsiveness)或無反應性 (anergy)物質（亦即無反應原）。當抗原為多肽時，其可為跨 膜分子（transmembrane molecule)(例如受體）或配體例如生 長因子。抗原之例子包括諸如腎素（renin)等分子、生長激 素（包括人類生長激素及牛生長激素）、生長激素釋放因子、 副曱狀腺激素、甲狀腺刺激激素、脂蛋白、α_1β抗胰蛋白 酶、胰島素-Α-鏈、胰島素_Β-鏈、原胰島素、濾泡刺激激 素、抑鈣素（calcitonin)、促黃體激素（luteinizing hormone)、 升糠素（glucagon)、凝血因子例如因子vine、因子ΐχ及溫 韋伯氏因子（von Willebrands factor)、抗凝血因子例如蛋白 質C、心房利鈉尿因子（atrial natriuretic factor)、肺界面活 性劑、血纖維蛋白溶原（plasminogen)活化劑例如尿激酶 (urokinase)或人類尿或組織型血纖維蛋白溶原活化因子 (t-PA)、虫圭皮素（bombesin)、凝血酶（thrombin)、造血生長因 子（hemopoietic growth factor)、腫瘤壞死因子-α 及-/5、腦 啡肽酶（enkephalinase)、RANTES(調節激活之正常Τ細胞之 表現及分泌之蛋白）、人類巨噬細胞發炎蛋白質（MIP-1-α)， 97062.doc -52- 200526957 血清白蛋白例如人類血清白蛋白’苗勒氏（Muellerian)抑制 物質；鬆弛素（relaxin)A鏈；鬆弛素B鏈；原鬆弛素 (prorelaxin);小鼠促性腺激素-相關性胜肽；微生物蛋白 質，例如β-内醯胺酶；DNase ; IgE ;細胞毒性T-淋巴細胞 相關抗原（CTLA)，例如CTLA-4 ;抑制素（inhibin);啟動素 (activin);血管内皮生長因子（VEGF);激素或生長因子之 受體；蛋白質A或D ;類風濕因子（rheumatoid factor);神經 營養因子例如骨衍生之神經營養因子（BDNF)、神經營養素-3、-4、-5 或-6 (NT-3、NT-4、NT-5 或 NT-6)、或神經生長因 子例如NGF-β ;血小板衍生之生長因子（PDGF);纖維母細 胞生長因子例如aFGF及bFGF ;表皮生長因子（EGF);轉形 生長因子（TGF)諸如TGF_a及TGF-β，包括TGF-βΙ、 TGF-p2、TGF-P3、TGF-P4 或 TGF-P5 ;類騰島素生長因子-I 及-II (IGF-I及 IGF-II) ; des(l-3)-IGF-I (腦 IGF-I);類胰島素 生長因子結合性蛋白質；CD蛋白質諸如CD3、CD4、CD8、 CD 19及CD20 ;促紅血球生成素（erythropoietin);骨質誘導 因子；免疫毒素；骨形態發生蛋白質（bone morphogenetic protein)(BMP);干擾素類諸如干擾素-α、-β及-γ ;細胞群落 刺激因子（CSFs)例如M_CSF、GM-CSF及G-CSF ;介白素 (interleukins)(ILs)例如 IL-1 至 IL-10;超氧化歧化酶；T-細 胞受體；表面膜蛋白質；衰退加速因子；病毒抗原例如AIDS 被膜之一部分；輸送蛋白質；歸巢受體（homing receptor); 位址素（addressin);調節蛋白質；整合蛋白（integrin)例如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA-4及 VCAM ; 97062.doc -53- 200526957 腫瘤-相關抗原例如HER2、HER3或HER4受體；以及任何上 述所列多肽之片段。 本發明方法所用抗體特異性對抗或針對之較佳抗原為 TGF-β卜 TGF-p2、TGF-P3、TGF-P4、TGF-05、IFN-γ、FGF、 EGF以及天然TGF-β多肽之受體，諸如TGFp-RI及 TGFp-RII 〇其他較佳抗原為出現於TGF-β信號途徑之抗 原，例如 Smad2、Smad3、Smad2/3、Smad4、Smad7、JNK、 p38 MAPK、erk ΜΑΡΚ、TAK1/MEKK卜 Ras、RhoA、PP2A、 MKK3/6、MKK4、pl60Rock及 S6K> 在所有揭示文獻中，術語「ErbB2」、「ErbB2受體」、 「c-erb-B2」、「HER2」及「Her2」可交互使用，且除非另 有指示，意指天然序列ErbB2人類多肽，或其功能性衍生 物。「Her2」、「erbB2」及「c-erb-B2」意指相關之人類基因。 術語「天然序列」或「天然」於本說明書中係指具有天然 產生之多肽之序列之多肽，而無關其製造模式。此種天然 序列多肽可從自然界分離，或藉由重組或合成方法或者此 等方法之組合或類似方法製造。 人型化抗ErbB2抗體包括 huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、 huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、 huMAb4D5-7 及 huMAb4D5-8(搓杜滋美（trastuzumab)(商品 名：贺癌平（HERCEPTIN®)))(如美國專利第5,821，337號中 表3所記載，其全文以參考文獻方式納入本文），人型化 520C9(WO93/21319)及人型化 2C4 抗體。 術語「Her2-表現性癌症（腫瘤）」及「Her2 +癌症（腫瘤）」 97062.doc -54- 200526957 可又互使用，意指在其細胞表面具有如^蛋白質存在之癌 症（腫瘤）。「Her2_表現性癌症（腫瘤）」為可在其細胞表面產 生足夠量之Her2蛋白質，因此抗Her2抗體可與其結合，而 對孩癌症有治療效果。Her2•或]^[“2_陰性癌症（腫瘤）為包含 表面不存在Her2蛋白質之細胞之腫瘤。 「搓杜滋美（trastuzumab)抗性腫瘤」係指在公認之動物 模型或人類臨床試驗中，以搓杜滋美商品 名··贺癌平（HERCEPTIN⑧））治療者，與未治療者或使用安 慰劑治療者相較，未呈現統計學上有意義的改善，或者用 搓杜滋美治療時，初期有反應，然而持續治療時仍繼續生 長之腫瘤。相反地，「搓杜滋美反應性」或「搓杜滋美敏感 性」腫瘤係在公認之動物模型或人類臨床試驗中，以搓杜 滋美治療者與未治療或使用安慰劑治療者相較，確實呈現 統計學上有意義之改善。 除非另有指示，術語「單株抗體2G7」意指具有以下實例 之鼠類2G7抗體之抗原結合性殘基或從其衍生之抗體。例 如’單株抗體2G7可為鼠類單株抗體2G7或其變異體，諸如 具有鼠類2G7抗體之抗原結合性胺基酸殘基之人型化抗體 2G7 〇 以下實例2舉例說明與TGF-β結合之人型化抗_TGF-p抗 體。其中該人型化抗體包含導入人類可變重鏈區域之非人 類超可變區殘基，並在選自48、49、67、69、71、73及78 所成組群中之位置包含框架區（FR)取代（使用如上述Kabat 專所δ己載之可變區域編號系統）。在一具體例中，人型化抗 97062.doc -55- 200526957 體在位置48、49、67、69、71、73及78中之二個或以上位 置包含FR取代；在其他具體例中，在此等位置之3、4或以 上個位置包含該FR取代。在較佳具體例中，該抗體包含之 FR取代在位置49、67及71，位置48、49及71，或位置49、 69及71，或者位置49、69、71及73，或位置49、71及73， 或位置49、71及78。其中以框架區取代少者比多者為佳， 以使免疫反應生成性（immiunogenicity)減至最低，不過效力 亦為非常重要之考量。實際上取代之胺基酸以保守者為較 佳，以致不會改變免疫生成性或效力。在位置48以從纈胺 酸改變為異白胺酸為較佳，在位置49以從丙胺酸改變為甘 胺酸為較佳，在位置67以從苯丙胺酸變為丙胺酸為較佳， 在位置69以從苯丙胺酸改變為丙胺酸為較佳，在位置7 1以 從精胺酸改變為丙胺酸為較佳，在位置73以從精胺酸改變 為離胺酸為較佳，以及在位置78以從白胺酸改變為丙胺酸 為較佳。 一種該人型化抗體之例子包含可變重鏈區域互補決定殘 基 GYAFTNYLIE (序列編號：41)，VNNPGSGGSNYNEKFKG (序列編號·· 42)或 VINPGSGGSNYNEKFKG (序列編號：43) 及/或SGGFYFDY (序列編號·· 44)，選擇性地包含此等CDR 殘基之胺基酸修改，例如當修改為必須以維持或改善抗體 之親和性時。例如，該抗體變異體可在上述可變重鏈區域 CDR序列中具有約1至約7個（或約5個）胺基酸取代。此等抗 體變異體可藉由親和性成熟化（affinity maturation)(例如以 下所述）而製備。其中此等殘基較佳為GYAFTNYLIE (序列 97062.doc -56- 200526957 編號：41)，VNNPGSGGSNYNEKFKG (序列編號：42)或 VINPGSGGSNYNEKFKG (序列編號：43)及 / 或 SGGFYFDY (序列編號：44)中之二個或以上，又以所有三個為更佳。最 佳之人型化抗體包含在序列編號·· 4中之可變重鏈·區域胺 基酸序列，或具有GYAFTNYLIE (序列編號：41)、 VINPGSGGSNYNEKFKG (序列編號：43)及 SGGFYFDY (序 列編號：44)者。 人型化抗體，例如除了包含上段所述之可變重鏈CDR殘 基之外，尚可包含可變輕鏈區域互補決定殘基 RASQSVLYSSNQKNYLA (序列編號：36)或 RASQGISSYLA (序列編號：37)，WASTRES (序列編號：38)或YASSLQS (序 列編號·· 39)及/或HQYLSSDT (序列編號·· 40)。此等人型化 抗體選擇性地包含上述CDR殘基之胺基酸修改，其中該修 改例如主要維持或改善抗體之親和性。舉例言之，令人感 興趣之抗體變異體在上述可變輕鏈區域CDR序列中具有約 1至約7個（或約5個）胺基酸取代。此等抗體變異體可藉由親 和性成熟化（例如以下所述）而製備。此等殘基較佳為 RASQSVLYSSNQKNYLA (序列編號：36)，WASTRES (序列 編號·· 38)及/或HQYLSSDT (序列編號：40)中之二個或以 上，以所有三個為最佳。最佳之人型化抗體包含序列編號： 3中之可變輕鏈區域胺基酸序列。 本發明申請案亦涵蓋與TGF-β結合之親和性成熟型抗 體。其母抗體可能為人類抗體或人型化抗體，例如分別包 含序列編號3及4之可變輕鏈及/或重鏈序列者（亦即變體 97062.doc -57- 200526957 5 )。該親和性成熟型抗體與T G F _ β結合之親合性較佳優於鼠 2G7或變異體5者（例如，使用Τ(}ρ_β細胞外區域（ecd)elisa 汗估時，親合性改善約2倍或約4倍，甚至約1〇〇倍或約ι〇⑽ 倍）。 病患「預先測知對於使用TGF_p拮抗劑治療無反應或反應 不佳」係指在公認之活體外或動物模型或人類臨床試驗 中，使用TGF-β拮抗劑治療者與未治療者或使用安慰劑治療 者相杈’未呈現統計學上有意義之改善，或者用拮抗 劑治療時初期有反應，但反應為暫時性且持續治療時腫瘤 仍繼續生長。 「抗血管生成劑（anti_angi〇genic agent)」意指能以某種 程度封阻或干擾血管生成之化合物。舉例而言，抗血管生 成因子可為在促進血管新生時與生長因子或生長因子受體 結合之小分子或抗體。其之一例為血管内皮生長因子 (VEGF)之拮抗劑，例如與VEGF特異性結合之抗體，例如截 瘤達（bevacizumab)(AVASTIN®)。 Π·實施本發明之模式 如先前所討論，TGF-β在致癌過程中擔任複雜角色。該 TGF-β途徑在上皮細胞癌症生成之早期擔任腫瘤抑制者角 色。隨著前-癌細胞及癌細胞之基因及基因前驅物之改變， 細胞對於TGF-β之反應性減低，且觀察到直至腫瘤發育末期 之前轉移階段之前TGF-β之表現/活化增加，以及在侵襲性 轉移細胞中’ TGF-β途徑之促進癌生成（pro-oncogenic)角色 變得居於優勢。進一步詳細說明請參考R〇berts & 97062.doc -58 - 200526957
Wakefield, Proc. Natl., Acad. Sci USA mn, USA, 100(15):8621-8623 (2003)已知有些腫瘤諸如各種腺癌，因TGFj受體之去活 化突變，致使細胞生長得以規避TGF_p之抑制e「TGF-以及 其他TGF-β途徑中之其他成員）可直接做為腫瘤促進者」之 事實可由「許多腫瘤不具失活^TGF_p受體」支持；因此， 此等腫瘤之形成及分布無法藉由「去活化突變致使細胞生 長規避TGF-β之抑制」解釋。 在許多腫瘤細胞模型系統中，用純化丁(}1?_(3預治療或用 TGF’ eDNA轉染導致轉移潛力增加。相反地，封阻腫瘤 細胞對TGF-β之反應性，或中*TGF_p之產生，將降低在活 體中之轉移效率。此強烈地暗示TGFj能促進轉移。已經得 到證據之可能機制包括：⑴抑制免疫監控，（ii)促進侵襲性 及移動性，及（iii)促進血管新生。不過，若只為使用本發明， 不必對其機構進行了解。事實上，本發明並不被任何特殊 機構所限定。 本發明係基於藉由抗- TGF-β抗體在數個動物模型中實驗 所得到之數據，此等動物模型包括藉由使用得自天然腫瘤 之細胞株，及從致癌基因驅動之腫瘤所製備之原發性腫瘤 細胞所建立者。與在人類腫瘤中觀察到之異質性一樣，動 物模型對於使用TGF-β拮抗劑（例如抗-TGF-β抗體）治療呈 現不同的反應性。在此等動物模型中產生之資料容許TGF-β 誘生之各種對腫瘤細胞之活性間存在差異，並且對於何種 物質能對癌症之特定類型、階段或形式（例如繼發性（轉移） 腫瘤、乳癌vs.其他類型癌症、乳癌之各種亞類等）提供較佳 97062.doc -59- 200526957 冶療有重要的暗示。結果，依照本發明獲得之實驗數據可 提供人類患者之個人化癌症治療之重要資料。由於轉移癌. 症為羅患固體腫瘤之病患之主要致死原因，本發明之一雜 樣即係鏗別出在治療繼發性腫瘤上有效之物質。 、 因此，在本發明之一具體例中，提供—種篩選具有癌症- 療活性之物質之方法’其包含下列步驟：⑴將複數個受 試物質投予於至少具有-種軟組織或骨之轉移之非人類同 基因（syngeneic)免疫活性動物模型（其存在或不存在原發性 腫瘤）中；（2)測定該受試物質對軟組織或骨之轉移及原發性籲 腫瘤（如果存在）之生長之影響；及（3)鑑別可抑制軟組織或 骨之轉移而對原發性腫瘤（如果存在）之狀態無不利作用之 受試物質。 在該方法之一個變型中，投予該受試物質時係與其他標準 治療癌症（尤其轉移癌症）之治療法合併，例如放射線療法。 在一個具體例中’投予於該動物之受試物質包括已知之 化學治療劑或細胞毒劑’例如紫杉雙箱類（加。叫。在本方 法之-較佳態樣中，將兩種受試物質投予動物，其中一種籲 為TGF-β拮抗劑’而另-種為化學治療劑或細胞毒劑，測定 該兩種受試物質對軟組織或骨之轉移及原發性腫瘤（如果 原發性腫瘤存在)生長之合併影響。在一更佳具體例中，該 TGF-β括抗劑為與TGF-β特異性結合之抗體，而該化學治療 劑或細胞毒劑為紫杉雙萜類（tax〇id)。 " 使用於該活體内筛選分析之動物可為除人類以外之任何* 動物’其中較佳動物之例子包括齧齒類（例如小鼠及大鼠）' . 97062.doc •60- 200526957 兔類、迷你豬及豬，而以小鼠為更佳。 於本發明中有用之-些動物模型顯示對於晚期、已轉移 之癌症（例如乳癌或黑素瘤）有特異性之病理變化，因此可用 於鑑定在治療此種侵襲性末期癌症(包括治療軟組織及骨 轉移）上有用之物質，例如化學治療劑及/或細胞毒劑。 為建立腫瘤轉移之動物模型，注入動物中之腫瘤細胞必 須能導致原發性及繼發性腫瘤之形成，且原發性及繼發性 腫瘤出現之時間必須有再現性；該系統必須為同源性，且 繼發性腫瘤必須為真性轉移，亦即其必須為原發性腫瘤細 胞所形成。再者，必須可用於活體外培養供注射用之腫瘤 細胞，並且能保有合理之轉染效率。 攜帶在病毒啟動子控制下之轉形基因之基因轉移動物可 提供自然發生原發性腫瘤之動物。然而，此等動物通常死 於大篁原發性腫瘤，而非散佈腫瘤細胞，形成繼發性腫瘤， 因此並非研究轉移性癌症之最佳模型。然而，其可做為注 射於另一動物中之腫瘤細胞之來源，以建立適當之動物模 型。 因此，衍生自BALB/c之可移植4T1小鼠乳癌係可用於轉 移性癌症研究之有用模型。參考例如Aslaks〇I1 & Miller， Cancer Res., 52: 1399-1405 (1992) ； Pulaski & Ostrand-Rosenberg，Cancer Res·，58: 1486-1493 (1998);及 pulasky 以 al·，Cancer Res·，60: 2710-2715 (2000)。將 4T1 腫瘤細胞接 種於接受小鼠之乳脂肪襯層，原發性腫瘤快速地生長且自 然地轉移至肺、肝及其他軟組織，並轉移至骨骼。類似人 97062.doc -61 - 200526957 類乳癌（尤其疋知襲性腺癌），於原發性腫瘤存在下，轉移細 胞在遠處增殖，且在原發性腫瘤藉由外科手術切除後，仍 繼績增殖。因此’該4T1模型在研究原發性腫瘤存在下之腫 瘤轉移及用外科手術切除後之腫瘤轉移上皆適用。 為研究各種受試物質對表現Her-2/neu之轉移性乳癌之影 響，可將過度表現Her-2/neu之人類乳癌細胞接種於接受小 鼠之乳脂肪襯層，並用該受試物質治療。另一方面，該腫 瘤可移植至接受小鼠。此模型系統可同時用於搓杜滋美 (trastuziimab)-抗性及搓杜滋美-反應性（搓杜滋美_敏感性） 乳癌之研究。另一種特別適合測試治療搓杜滋美_抗性乳癌 之試劑之動物模型如美國專利第6,632,979號（2〇〇3年1〇月 14曰授予）所記載，其之全部揭示揭示内容以參考文獻之方 式納入本文。 另一種適合做為研究腫瘤惡化及轉移之之動物模型為於 乳房上皮中表現多形瘤中間T癌蛋白（p〇iy0nia middle T oncoprotein)(PyMT)所造成之乳癌之動物模型。PyMT腫瘤 在組織學上不同於Her-2+腫瘤，且腫瘤從前惡性贅瘤期（或 惡性贅瘤階段）進展至轉移期（發生頻率高）之各階段皆分 明、可以識別。PyMT腫瘤與預後不良之人類乳癌之某些侵 襲性類型在型態上類似，因此可做為研究及鑑別治療此種 癌症之候選藥物之優良模型，參考例如Lin et ai.，Am· j Pathol” 163(5): 2113-2126 (2003) ° 轉移乳癌之另外動物模型之討論，參考例如Heppner et al·，Breast Cancer Res·，2(5): 331-334 (2000) 〇 97062.doc -62- 200526957 轉移性黑素瘤可用辛克萊小豬（辛克萊研究中心）亞種進 灯研九，其可產生與人類黑素瘤非常類似之侵襲性黑素 瘤。此種侵襲性黑素瘤具有在完全轉移期後自然消退之獨 特性負，因此特別適合做為轉移性黑素瘤發生與消退之研 究。 再者，小鼠黑素瘤細胞株B16、K1735及Cloudman S91-M3 (及各種亞株）經常被使用於黑素瘤模型之開發。適於用來研 究黑素瘤轉移之動物模型之詳細資料，請參考例如 Gattoni-Celli et al.? Pigment Cell Res.5 6(6): 38-34 (1993) 及 Rusciano et al·，Invasi〇n 驗“化…，i4(i 6》349 36i (1994-95) 〇 本發明之動物模型可用於篩選在軟組織及/或骨轉移之 預防或治療上有用之物質，其另外在治療原發性腫瘤上有 效。有用藥物之篩選包括將受試物質以某一範圍之劑量投 予於動物模型，並在不同時間點分析該物質對存在之繼發 性及原發性腫瘤狀態之影響。 在一具體例中，受試物質係藉由將其以某一範圍之劑量 投予於動物，並評估該動物對該化合物經時之生理反應。 投予可為口服或適當之注射方式，此取決於被評估之化合 物之性質。在某些情況，可能適宜將該化合物與共因子 (co-factor)合併投予，以加強該化合物之效力。 除篩選使用於治療疾病或病症之藥物以外，本發明之方 法亦可使用於研究特殊藥物之作用之效力或機制，及/或針 對預防或治療疾病或狀況設計治療方法。例如，該動物可 97062.doc •63- 200526957 在疾病或狀況發作前、中或後合併使用特定飲食、例行運 動放射線治療、化學治療及/或此處鑑定之一種或多種化 合物進行治療。此種綜合治療法或養生法在對抗疾病或病 症上比以单獨一種化合物治療更有效。 本發明之使用基因轉移動物之篩選法可採用任何在動物 模型可予以評估之任何癌症現象。受試物質對原發性腫瘤 及軟組織及骨之轉移之個別影響可使用在本技藝中熟知之 技術加以監測，包括原發期及繼發期終點。舉例言之，受 試物質對原發性或繼發性腫瘤之影響，可藉由量測腫瘤大 小、腫瘤發生率（數量）及向性（部位），在用受試物質治療 前、中及/或後量測腫瘤細胞製造之内生性TGF-β，在用受 試物質治療前、中及/或後測定血清中TGF-β含量，使用組 織學計分法及各種照相技術，包括微電腦斷層（micr〇_CT ; μ(：Τ)照相，以進行監測。既然在軟組織中，小型轉移腫瘤 右' 不使用耗時之製備程序及個別檢查大量組織切片將難以 檢測及定量’微電腦斷層（micro-CT)對此種轉移及骨轉移將 特別有用。 顯微-CT(x光顯微斷層術）係一種非破壞性技術，可用於 創建數微米尺寸檢體之2D及3D X-光衰減圖（x-ray attenuation map)。為使用顯微-CT技術從活體外進行肺部攝 影，可將肺部浸於ISOVIEWTM試劑（CT對比劑，破糖）中。 繼而緩慢注入大豆油以從導氣管（airway)除去對比劑。影像 可以各種解析度產生。因此’在本發明中提供之大部分多 像係以16- #解析度產生。本技術係與組織學可配合，且二 97062.doc -64- 200526957 次7L顯像軟體讓讀取者接受或否定該硬塊為可能之腫瘤。 另外一種可在活體中進行之顯像技術係依賴蟲螢光素酶 (lucnferase)活性之生物發光顯像。活體中之生物發光為已 知且廣泛應用之顯像技術。本技術可進行非侵襲性顯像， 且將表現蟲螢光素酶蛋白質之細胞定量。使用於此種分析 之主要蟲螢光素酶來自螢火蟲（phyt〇nis pyralis)。此種酵素 在活體外半衰期短（在37°C約3分鐘），在活體中約9〇分鐘。 具有較長半衰期之突變種已有市售。為了在活體中將腫瘤 顯像，將腫瘤細胞（例如乳房腫瘤細胞）用蟲螢光素酶轉染， 然後移植到接受動物，例如小鼠。移植後，等待足夠時間 讓腫瘤形成，再將蟲螢光素酶注入發生腫瘤動物（例如小鼠） 之腹膜内。於蟲螢光素酶存在下蟲螢光素、ATP與氧之反應 所產生之生物發光，可使用CCD攝影機進行攝影。 關於使用螢光蛋白質將轉移腫瘤在活體中顯像之說明， 可參考 Hoffman，Cell Death and Differentiation 9: 786 789 (2002) 〇 受試物質並無特別限定，然而其之例子包括多肽、蛋白 質、胜肽、非肽類小型有機分子、合成化合物、發酵產物 及細胞萃取物。 候選物質包含各種化學物質，其通常為有機分子，以具 有分子量大於50而小於約2,500道爾頓之小型有機化合物 為較佳。候選物質包含與蛋白質進行結構性交互作用（尤其 氫鍵）所需之官能基，通常至少包括胺基、羰基、經基或叛 基，而以包含至少兩種化學官能基為較佳。候選物質經常 97062.doc -65- 200526957 包含被一個或多個上述官能基取代之碳環或雜環結構及/ 或芳香族或聚芳香族結構。候選物質亦常為生物分子，包 括（但不限定於）胜肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶 及彼等之衍生物、結構類似物或彼等之組合。 候選物質得自廣泛之來源，包括合成或天然化合物庫。 例如，現有各種方法進行廣泛有機化合物及生物分子之隨 機性及指向性合成，包括隨機募核苷酸及募肽之表現。另 方面，以細菌、真菌、植物及動物萃取物形式存在之天 然化合物庫已有供應或已被製造。再者，天然或合成方法 製造之化合物庫及化合物易經由習知之化學、物理及生物 方法修飾，並能被使用於製造組合庫。已知之藥劑可接受 指向性或隨機性化學修改，例如醯化、烷化、酯化、醯胺 化等，以製造結構類似物。 候選物質特別包括（但不限定於）抗體，例如抗抗 體。 數種TGF-βΙ序列已被分離、選殖及定序。現提供下列可 能適合用於製造實施本發明用之TGF-βΙ拮抗劑之TGF-h 序列，同時提供此等序列之基因銀行登錄編號： 人類 TGF-βΙ AA459172 牛 TGF-βΙ M36271 前驅人類 TGF-βΙ E00973 ; X02812 ; 綿羊（羊類）X76916 ; J05114 ; M38449 ; TGF-βΙ L36038 M55656 豬 TGF-βΙ M23703 ; X12373 97062.doc -66- 200526957 犬 TGF-βΙ L34956 倉鼠 TGF-βΙ X60296 大鼠 TGF-βΙ X52498 鼠 TGF-βΙ M13177 本文中之抗體可為單特異性、雙特異性、或三特異性或 更多特異性。多特異性抗體可對單一分子之不同抗原決定 部位（epitope)(例如F(ab，）2雙特異性抗體）或不同分子之抗 原決定部位具特異性。設計及製造多特異性抗體之方法在 本技藝中為已知。參考例如Millstein et al.，Natufe， 537-539 (1983)； Kostelny et al5 J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992);及WO 93/17715。三特異性抗體可根據Tutt et al·，J· Immunol·，147: 60 (1991)記載之方法製備。 尤其’雙特異性抗體可使用化學鍵結之方法製備。
Brennan et al·，Science，229: 81 (1985)記載一種步驟，其中 完整之抗體可藉由蛋白質水解方式裂解而產生F(ab，）2片 段。此等片段在二硫醇錯合劑亞坤酸納存在下還原以使鄰 接之二硫醇安定化並防止分子間形成二硫鍵。繼而產生之 Fab’片段轉形為硫硝基苄酸鹽（TNB)衍生物。繼而該 Fab’-TNB衍生物之一藉由使用巯基乙胺還原再轉變為Fab，_ 硫醇，並與等莫耳量之其他Fabf-TNB衍生物混合，形成雙 特異性抗體。該生成之雙特異性抗體可做為使酵素選擇性 固定（immobilization)之物質。又在另一具體例中，直接從 大腸菌（E. coli)回收之Fab’-SH片段可在活體外進行化學偶 合以形成雙特異性抗體。Shalaby et al·，J· Exp. Med·，175: 97062.doc -67- 200526957 217-225 (1992)。 直接從重組細胞培養物製造及分離雙特異性抗體之各種 技術已被揭示。例如雙特異性抗體可使用白胺酸拉鍊 (zipper)製造。如 Kostelny et al·，J· Immunol·，148(5): 1547-1553 (1992)。來自Fos及Jun蛋白質之該白胺酸拉鍊胜 肽可藉由基因融合，與兩個不同抗體之Fab，部分連結。抗體 同元二聚物在絞鏈區域被還原以形成單體，繼而再氧化以 形成抗體雜二聚體。此方法亦可被用於製造抗體同元二聚 體。Hollinger et al·，Proc· Natl· Acad· Sci. USA，90· 6444-6448 (1993)揭示之「雙功能抗體（diabody)」可提供製 造雙特異性抗體片段之另一機制。該片段包含藉由連結子 (linker)與輕鏈可改變區（vL)連結之重鏈可改變區域（VH)， 該連結子太短以致無法使同一鏈上之兩區域（domain)進行 配對（pairing)。因此，一個片段之vH及VL區域被迫與另一 片段之互補VL& VH區域配對，藉此形成二抗體結合部位。 另外，亦曾報導使用單鏈Fv(sFv)二聚物以製造雙特異性抗 體片段之策略。參考 Gruber et al·，J. Immunol·，152: 5368 (1994)。另一選擇為，雙特異性抗體可為「直鏈性抗體」， 如 Zapata et al·，Protein Eng·，8(10): 1057-1062 (1995)記載 之方法所製造者。 雙特異性抗體包括交聯或「雜共輛（heteroconjugate)」抗 體。舉例言之，雜共軛抗體中之抗體之一可與抗生蛋白 (avidin)偶合’而另一抗體可與生物素（biotin)偶合。雜共輛 抗體可使用任何簡便之交聯方法製造。適合之交聯劑在本 97062.doc • 68 _ 200526957 技藝中為已知，如美國專利第4,676,980號所揭示，其中並 含有許多交聯技術。 其他對抗體之修飾亦被考量。例如，可能期望修改抗體 在效應器（effector)方面之功能，以增強該抗體在治療例如 癌症時之有效性。例如，可在Fc區域引進半胱胺酸殘基， 藉此在該區域形成鏈間之二硫鍵結。由此生成之同元二聚 抗體可改善内化能力及/或增加補體媒介之細胞殺傷力及 抗體依存性細胞毒性（ADCC)。參考Caron et al·，j· Exp
Med·，176. 1191-1195 (1992)及 Shopes，J· Immunol·，148: 2918_2922 (1992)。具有增強之抗腫瘤活性之同元二聚抗體 亦可使用雜雙官能交聯-連結子製備，參考w〇lff et al·，
Cancer Research， 53: 2560-2565 (1993) 〇 已開發各種製造抗體之技術。傳統上，抗體片段係經由 元整抗體之蛋白水解消化後衍生而得（參考例如Morimoto et al,, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24: l〇7_117 (1992)及 Brennan et al·，Science，229: 81 (1985))。然而，此等片段及全長抗體及其他抗體目前可直 接藉由重組宿主細胞製造，其中編碼抗體之輕鏈及重鏈之 DNA序列係使用標準重組DNA技術而得到。所需求之DNA 序列可從製造抗體之細胞例如融合瘤（hybridoma)細胞中單 離及定序。另一選擇為DNA可使用核苷酸合成器或PCR技 術合成。一旦得到編碼輕及重鏈之DNA，將其插入能在原 核細胞或真核細胞之宿主中進行複製、表現及分泌異源聚 核苷酸之重組載體（vector)中。例如，Fab’-SH片段可直接從 97062.doc -69- 200526957 大腸菌（Ε· c〇ii)回收，並進行化學偶合以形成F(ab，）2片段 (Carter et al·，Bio/Technology，10: 163-167 (1992))。在另一 具體例中’ F(ab，）2係使用白胺酸拉鍊GCN4以促進F(ab，）2分 子組合而形成。根據另一個途徑，全長抗體Fab或F(ab，)2片 段或其他抗體可直接從重組宿主細胞培養物甲分離。許多 現成且在本技藝中已知之載體（vector)可被使用於本發明 中。選擇適當之載體主要取決於欲插入之核酸大小，以及 用載體所轉形之特殊宿主細胞。 一般而言，含有複製子及控制序列（衍生自與宿主細胞相 容之品種）之重組載體可被使用做為本發明中建構特異性 載體之母載體。該載體通常具有複製起點及在轉形細胞中 。複製起點
蘭氏陰性細菌。 。從質體PBR322而來之複製原點適用於大部分革 能提供表型選擇之標記序列以做為其骨架成分 為核fee序列，其能使載體在一個或多個經選擇 中複製。一般而言，在撰豬恭艘由，# 士 μ ’亦稱為選擇標記。
菌屬之D-丙胺酸消旋酶之基 因）°選擇方法之例係 表現及選殖用載體可包含選擇基因 典型之選擇基因編碼下列蛋白質：（a 毒素（例如胺必西林、新黴素、T胺蝶 環素）之抗性，（b)補充營卷缺陷 97062.doc -70- 200526957 !木用阻止宿主細胞生長之藥物。此等被異源基因成功地轉 形之細胞製造賦予藥物抗性之蛋白f，因此於選擇培養基 中可以存活。一個適合大腸菌轉形之質體載體之例子為 pBR322 pBR322含有編碼胺必西林（Amp)及四環素（丁^)抗 性之基13，因此提供鑑定經轉形細胞之簡易方法。pBR如 衍生物或其他微生物質體或噬菌體亦可使用做為母載體。 用於特定表現抗體之PBR322衍生物之例子在Carter等之美 國專利第5,648,237號中被詳細說明。 、 再者，含有與宿主微生物互容之複製子及控制序列之噬 菌體載體可被作為此等宿主之轉形載體。例如，噬菌體諸 如λΟΕΜ·ΤΜ·-11可被用於製造重組載體，其可被用於轉形 易感受性宿主細胞，諸如大腸菌LE392。 在一較佳具體例中，該方法係將抗體之輕鏈及重鏈部分 之表現暫時分開。尤其’該方法最好包含以兩種分別編碼 輕鏈及重鏈之分開轉譯單元將宿主細胞轉形；在適當條件 下培養細胞致使該輕鏈及重鏈以接續方式表現，藉此暫時 分開輕鏈及重鏈之製造；以及使該輕鏈及重鏈組裝成功能 性抗體。 此具體例之一較佳方面，該輕鏈及重鏈之暫時分開表現 藉由使用分別控制輕鏈及重鏈之兩種不同啟動子而實現， 其中該不同啟動子係於不同條件下活化。例如，編碼輕鍵 及重鏈之DNA可被導入單一質體載體中，但被分開為兩個 轉譯單元，各分別被不同啟動子控制。其中—個啟動子（例 如第一啟動子）為構成者或誘發者，而另一個啟動子（例如第 97062.doc -71 - 200526957 啟動子）為誘發者。因此，去 右、商入 田用此種載體轉形之宿主細胞 在適a將一個啟動子（例 口 罘啟動子）活化之條件下培養 ㈣1 鍵（例如輕鍵）被表現。繼而，在該第一種鏈（例 ϋ工’）表現之所需期間後’培養條件轉變為適合將另一個 啟動子(例如第二啟動子)活化之條件，由此而誘導第二種鏈 (例如重鏈）。在_較佳具體例巾，輕鏈首先表現繼而重鍵再 表現在另—具體例巾，重鏈首先表現繼而輕鏈表現。 更特定而言，根據一較佳具體例，重組載體至少包含兩 種轉澤單元’-種針對輕鏈之表現，而另—種針對重鍵之 表現。再者，此兩種針對輕鏈及重鏈之編碼單元係在不同 啟動子控制之下。啟動子為位於編碼序列起點之（5，）上游控 制編碼序列表現之非編碼序列（一般為約100至1000 bp)。此 種啟動子通常分為兩類，包括可誘發者及構成者。可誘發 啟動子係能回應培養條件之某些改變（例如某種營養素存 在或不存在，或溫度或pH之改變）而開始增加在其控制下從 DNA轉錄之程度之啟動子。 為達到此具體例目的，無論構成性或可誘發性啟動子均 可被使用做為限時控制第一鏈表現之第一啟動子，而誘發 性因子可被使用做為控制隨後之第二鏈表現之第二啟動 子。在一較佳具體例中，第一啟動子及第二啟動子均為嚴 格控管下之誘發性啟動子。能被各種宿主細胞識別之許多 啟動子已為人所熟知。此等被選擇之啟動子序列可經由限 制酵素消化從來源DNA單離，並插入本發明之載體令。另 外’該被選擇之啟動子序列可被合成。原生啟動子序列及 97062.doc -72- 200526957 許多異源性啟動子可被用於指引目標基因之擴增及/或表 現。然而，以異源性啟動子為較佳，因其等與原生目伊、夕 肽啟動子比較’通常允許目標基因之較高度轉錄及較高產 率。 - 適於原核細胞宿主使用之啟動子包括ph〇 A啟動子、卜内 -醯胺酶及乳糖啟動子系統、色胺酸（trp)啟動子系統及雜交 啟動子例如tac或trc啟動子。然而，其他在細菌中具功能性 之啟動子（例如其他已知之細菌或噬菌體啟動子）亦適合。其 等之核苷酸序列已被公開，藉此可使熟習此技藝者將其使 _ 用連結子（linker)或接頭（adaptor)連結於編碼目標輕鏈及重 鏈之轉譯單元，以提供任何需要之限制酶切割位置 (Siebenlist et al·，Ce丨丨，20: 269 (1980))。較佳之啟動子為 phoA、tael、tacll、lpp、lac-lpp、iac、ara、trp、卜。及丁7 啟動子。使用於本發明之更佳啟動子為phoA啟動子及tacH 啟動子。在真核宿主細胞中具功能之啟動子於此技藝中已 為人所熟知，例如美國專利第6,331，415號所記載。此等啟 動子之例子可包括從多瘤細胞（P〇ly〇ma)、腺病毒修 2(Adenovirus 2)或猿猴病毒 4〇(Simian Virus 40，SV40)衍生 者。 本發明之重組載體之各個轉譯單元包含充分表現該插入 基因所需之額外非編譯序列。重組載體之此等不可或缺之 序列在此技藝中為已知，包括例如位於起密碼子之5,端之薩 恩達爾加諾（Shine-Dalgarno)區域，以及位於該轉譯單元之 端之轉錄終結子（例如λί。）。 97062.doc -73- 200526957 、重組載體之各個轉譯單元尚包含信號序列成分，其指引 、表見之鏈夕肽分泌至細胞臈外。一般而言，該分泌信號 序列可為載體之-成分，或者可為被插人載體中之目標多 肽DNA之一部份。就本發明目的所使用之分泌信號序列應 為一種可被宿主細胞識別及加工者（亦即被信號肽酶裂解 者）。對於無法識別及加工異源性多肽之天然信號序列之原 核侣主細胞而言’將該信號序列用選自例如含有鹼性磷醯 酶、青黴素酶、、或熱安定性腸毒素II(STII)前導序列、 LamB、PhoE、pem、〇mpA及MBp組成之原核細胞信號序 歹J取代。在一本發明之較佳具體例中，於表現系統之二轉 澤單70中所用之信號序列為STn信號序列或其變異體。較 佳將編碼該信號序列之DNA連結於編碼輕鏈或重鏈之DNA 之5’-端之譯碼區，以生成融合多肽。一旦被從宿主細胞之 細胞質分泌出來’該信號序列即藉由酵素從成熟之多肽裂 解出來。 在本發明之另一較佳方面，除表現之時機之外，亦將輕 鍵與重鏈表現之比率調節成使被分泌及正確組合之抗體之 產率達到最大。此種調節藉由在重組載體上同時調節輕鏈 與重鏈之轉譯強度而達成。調節轉譯強度之一技術記載於 Simmons等人之美國專利第5,840,523號中。簡言之，此途 徑係利用轉譯單元中轉譯起始區（TIR)之變異體。對一既定 TIR而言，可以創建一系列具有某一範圍轉譯強度之胺基酸 或核酸序列變異體，藉此可提供一種藉由調整TIR而達到特 定鏈之所需表現度之方便方法。TIR變異體可藉由一般之突 97062.doc -74- 200526957 變誘發（mutagenesis)技術（其導致可改變胺基酸序列之密碼 子改變）產生，雖然以在核苷酸序列（如以下說明）中之緘默 型改變（不活動型改變，silent change)為較佳。TIR之改變 可包括例如在薩恩-達爾加諾（Shine-Dalgarno)序列之數量 或空間之改變，連同信號序列之改變。 一種產生突變信號序列之較佳方法為製造不會改變信號 序列之胺基酸序列之編碼序列起始處之「密碼子庫（codon bank)」（亦即該改變係緘默型）。其可藉由改變各個密碼子 之第三個核苷酸位置而完成，再者，有些胺基酸例如白胺 酸、絲胺酸及精胺酸，具有多個第一及第二位置，會增加 製作密碼子庫時之複雜性。詳細之突變誘發技術記載於 Yansura et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymol·， 4: 151-158 (1992)。 適於選殖或表現在本發明載體中之dna之宿主細胞為上 述之原核細胞、酵母菌或較高等真核細胞。適合上述目的 之原核細胞包括真性細菌例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性微 生物’例如腸桿菌科（Enterobacteriaceae)如埃希氏菌屬 (Escherichia)例如大腸菌、腸細菌、歐文氏克雷白菌（Erwinia klebsiella)、變形菌（proteuS)、沙門式菌屬（salmonella)例如 鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)，沙雷氏菌屬 (Serratia)例如黏質沙雷氏菌（serratia marcescane)及志贺氏 菌屬（Shigella)，以及桿菌（Bacilli)例如枯草芽孢桿菌（Β· 311131:川3)及地衣牙孢桿菌（2」1〇|:^11^〇1>11118)(例如00 266,710 號（1989年4月12日公告）揭示之地衣芽孢桿菌4 1Ρ)、假單胞 97062.doc -75- 200526957 菌（Pseudomonas)例如銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)及鏈黴 菌（Streptomyces)。較佳之大腸菌選殖宿主為大腸菌 294(ATCC 31，446)，雖然其他菌種例如大腸菌B、大腸菌 X1776 (ATCC 31，537)及大腸菌 W3110 (ATCC 27,325)亦適 合。此等實例為說明而非限定。 除原核細胞外，真核細胞微生物例如絲狀真菌或酵母菌 亦為編碼抗體之載體之適當選殖或表現宿主。食用酵母 (Saccharomyces cerevisiae)或通常之烘培酵母菌，為最常被 使用之低等真核細胞宿主微生物。然而，在本發明中亦可 使用許多其他現有之屬、種及菌株，例如栗酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌屬 (Kluyveromyces)宿主例如乳酸克魯維酵母菌（K· lactis)、脆 弱克魯維酵母菌（K. fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亞克魯 維酵母菌（K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、威氏克魯維酵母菌 (K. wickeramil)(ATCC 24，178)、瓦氏克魯維酵母菌（K. waltii)(ATCC 56,500)、 果蠅克魯維酵母菌（Κ· drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母菌（Κ· thermotolerans)及馬氏克魯維酵母菌（Κ· marxianus)，亞羅 酵母菌（yarrowia)(EP 402,226)、巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris)(EP 183,070)、念珠菌、理氏木黴（Trichoderma reesia)(EP 244,234)，紅色麵包黴（Neurospora crassa)，許旺 酵母屬（Schwanniomyces)例如許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)，及絲狀真菌例如麵包黴（Neurospora)、青黴 (Penicillium)、彎頸黴（Tolypocladium)及曲黴屬（Aspergillus) 97062.doc -76 - 200526957 宿主例如構巢曲黴（A· nidulans)及黑曲黴（A.niger)。 做為抗體表現之適當宿主細胞亦包括無脊椎動物細胞例 如植物及昆蟲細胞。許多桿狀病毒菌株及變異體及來自宿 主例如草地夜蛾（Spodoptera frugiperda)(鱗翅目）、埃及黑斑 蚊（Aedes aegypti)(蚊類）、白斑蚊（Aedes albopictus)(蚊 類）、黃猩猩果蠅（果蠅）及中國桑蠶（Bombyx mori)之相關可 容許昆蟲宿主細胞已被鑑定出。轉染用之各種病毒株為已 公開可供使用者，例如加州苜蓿丫紋夜蛾（Autographa californica) NPV之L-1變異體及中國桑蠶NPV之Bm-5菌 株，且此等病毒可使用做為本發明所用之病毒，尤其做為 草地夜蛾轉染用。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、喇叭花、 蕃％及煙草之植物細胞培養物亦可被利用做為宿主。
有用之哺乳類宿主細胞株之例子如s V40轉形之猴腎CV1 細胞株（COS-7，ATCC CRL 1651)，人類胚胎腎細胞株（293 或分段選殖做為懸浮培養之293細胞（Graham et al·，J· Gen Virol·，36: 59 (1977)));幼小倉鼠腎細胞（ΒΗΚ，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵細胞/-01^尺（(1：110，111*1旺1^61&1.，？1*〇匕 Natl· Acad· Sci· USA, 77M216 (1980));小鼠足細胞（TM4， Mather，Biol· Reprod·，23: 243-251 (1980));猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-15 87);人類頸部癌細胞（HELA，ATCC CCL 2);狗腎 細胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛大鼠（buffalo rat)肝細胞 (BRL 3A，ATCC CRL 1442);人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人類肝細胞（Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤（MMT 97062.doc -77- 200526957 060562, ATCC CCL 51); TRI細胞（Mather et al·，Annals Ν·Υ· Acad· Sci·，383: 44_68 (1982)) ; MRC 5細胞；FS4細胞；及 人類肝癌細胞株（Hep G2)。 將宿主細胞用上述製造抗體之表現或之選殖載體轉形， 並在適合誘發啟動子、選擇轉形株（transformant)或擴增編 碼所需序列之基因之習知營養素培養基中培養。 用於製造本發明多肽之原核細胞係在本技藝中已知且適 合培養經選擇之宿主細胞之培養基中培養。適當之培養基 之例子包括陸氏培養液（luria broth，LB)加上所需之營養補 充劑。在較佳具體例中，該培養基亦含有選擇用試劑，該 選擇用試劑係依據表現載體之構成而選出，以選擇性地使 否有表現載體之原核細胞生長。例如，將胺节西林 (ampicillin)加至供培養表現胺苄西林抗性基因之細胞之培 養基中。亦可包括任何除碳、氮及無機磷酸鹽源以外之必 /員補充劑’其可以適當濃度單獨加入，亦可以與其他補充 劑或培養基（例如複合氮原）之混合物加入。該培養基視情況 了含有一種或多種從榖胱甘肽（glutathione)、半胱胺酸、胱 私：（cystamine)、硫乙醇酸鹽（thioglycollate)、二硫赤蘚糖醇 (dithioerythdtol)及二硫蘇來醇（dithi〇threit〇1)組成之群中 選出之還原劑。 原核宿主細胞係在適當溫度培養。例如大腸菌之培養， 較佳溫度範圍從約2(TC至約39t：，而以約25ι至約37亡為 更佳，以約30°C為特佳。培養基之ρΗ值可為約5至約9之口^ 範圍主要取決於宿主微生物。對大腸菌而言，pH以從約 97062.doc -78- 200526957 6.8至約7.4為較佳，而以約7.〇為更佳。 用於製造本發明抗體之真核宿主細胞可在本技藝中已知 之各種培養基中培養。例如，市售之培養基如Ham，s F10 (Sigma) ’ 最低需求培養基（Minimal Essential Medium) ((MEM) ’ Sigma)，RPMI-1640 (Sigma)及杜白可修改伊格氏 培養基（Dulbecco，s Modified Eagle,s Medium) ((dmem)，
Sigma)均可適合培養哺乳類真核宿主細胞。再者，任何記 載於 Ham & Wallace，Meth· Enz” 58: 44 (1979) ; Barnes & Sato’ Anal· Bioehem·，102: 255 (1980);美國專利第 4,767,704號’第 4,657,866號，第 4,927,762 號或第 4,560,655 號，WO 90/03430 , WO 87/00195 ; U.S. Pat· Re. 30,985 或 美國專利第5,122,469號中之培養基亦可使用做為宿主細胞 之培養基。任何此等培養基可依照需要添加激素及/或其他 生長因子（例如胰島素、運鐵蛋白（transferrin)或表皮生長因 子）、鹽類（例如氣化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝劑（例如 HEPES)、核苷類（例如腺苷及胸腺嘧啶核苷）、抗生素（例如 建大徽素（gentamycin))、微量元素（定義為通常最後濃度呈 現在微莫耳範圍之無機化合物）及葡萄糖或同等之能源。亦 可包括適當量之熟習此技藝者熟知之任何其他補充劑。培 養條件例如溫度、pH等，為先前為使選擇之宿主細胞表現 所使用者，對一般熟習之業者而言知之甚詳。 一旦宿主細胞被培養至某種密度，將培養條件被修改成 可促進蛋白質之合成。如果在上述雙重啟動子載體中使用 可誘發之啟動子，則在適合活化啟動子之條件下誘發蛋白 97062.doc •79- 200526957 質之表現。在一較佳具體例中，該二啟動子均被誘發。該 雙重啟動子以分別為phoA及tacll為更佳。例如，可製造一 種載體’其中使用pho A啟動子來控制輕鏈之轉錄，及使用 tacll促進劑來控制重鏈之轉錄。在誘發之第一階段，以該 phoA/tacll雙重啟動子載體轉形之原核宿主細胞在磷酸鹽_ 限制性培養基中培養，以誘發phoA啟動子及進行輕鏈表 現。經過輕鏈表現所需要之時間後，於培養基中添加足夠 量之異丙基-β-D-硫代半乳π比喃糖苷（IPTG)，以誘發…丨丨啟 動子及製造重鏈。 一方面，如果細菌被使用做為宿主細胞，則抗體可在細 胞質中表現。可使用各種方法以改良大腸菌細胞質中可溶 性及功能性抗體之製造。例如’已發現缺少trxB基因之大 腸菌菌株可加強細胞質中二硫鍵之形成，因此可用於促進 在細胞質中具有適當二硫鍵形成之功能性抗體之表現。 Proba et al·，Gene，159: 203-207 (1995)。可以製造抗體變異 體’其中半胱胺酸殘基被取代以致變異體在VH及VL二者中 均無需二硫鍵之形成，此種抗體變異體（有時亦稱為「胞内 抗體（intrabodies)」），因此可在不適合有效形成二硫架橋之 還原環境（例如細菌細胞質）中製造。Proba et al·，J. Mol· Bi〇l·，275: 245-253 (1998) 當使用分泌信號序列時，經表現之輕及重鍵多肽被分泌 於宿主細胞之細胞周質（periplasm)中，並從該處回收。蛋 白質回收典型地包括將微生物裂解，通常藉由諸如滲透壓 衝擊、超音波或溶解等方法。一旦細胞被裂解，細胞碎片 97062.doc -80- 200526957 或整個細胞可藉由離心或過濾除去。蛋白質尚可純化，例 如藉由親和性樹脂層析法。另一方面，蛋白質可輸送至培 養基中並在該處分離。可將細胞從培養基中除去，並將培 養基之上清液過濾及濃縮，以將製造之抗體進一步純化。 表現之抗體可進一步使用通常公知之方法（例如聚丙烯醯 胺凝膠電泳（PAGE)及西方吸乾法（Western bl〇t assay))分離 及鑑別。 抗體可藉由發酵方法大量製造。目前有現成之各種大規 模批次進料之發酵步驟，適合重組蛋白質之生產。大規模 發酵具有至少1000公升之產能，而以約1，〇〇〇至1〇〇,〇〇〇公升 產能為較佳。此等發酵槽使用攪拌葉片或其他適當之方法 進行氧及營養物質（尤其為碳源/能源之葡萄糖）之分配。小 規模發酵通常意指在發酵槽中進行之發酵低於約100公升 容量之產能，其範圍可從約i公升至約1 〇〇公升。 在發酵方法中，蛋白質表現之誘導通常係在將細胞培養 至所需要之密度（例如〇D55〇約180-270)之條件後開始。根據 所使用之載體構築體（如本技藝所熟知者及上述者），可使用 各種誘發劑。細胞在誘發之前可培養較短期間。通常誘發 細胞約12-50小時，惟亦可使用較長或較短之誘發時間。 為進一步改良本發明抗體之生產率及品質，可修正各種 發酵條件。例如，為改良分泌之抗體之適當組合及摺疊方 式可另外使用過度表現伴隨蛋白（chaperone)(例如Dsb蛋 白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及 /或 DsbG)或 FkpA(具有伴
Ik蛋白活性之肽脯胺醯基順，反-異構酶））之載體，以共轉形 97062.doc -81- 200526957 宿主原核細胞。已證明該伴隨蛋白質在細菌宿主細胞中能· 促進所製造之異源性蛋白質之適當摺疊及溶解度。chen以 al·，J· Bio. Chem·，274: 19601-19605 (1999);美國專利第 M83,715號及 6,027,8 88號；Bothmann & Pluckthun，J·
Chem., 275: 17100-17105 (2000) ; Ramm & Pluckthunj ^
Biol· Chem·，275·· 17106-17113 (2000); Arie et al·，Mol·
Microbiol·，39: 199-210 (2001) 〇 為盡篁減少在原核宿主細胞中經表現之異源性蛋白質 (尤其為蛋白水解敏感性者）之水解，可在本發明中使用例如_ 含有缺少蛋白水解酶之宿主菌株。例如，可修改原核宿主 細胞株以促進在編碼已知細菌蛋白酶（例如蛋白酶πι '
OmpT、DegP、Tsp、TonA、PhoA、蛋白酶！、蛋白酶Mi、 蛋白酶V、蛋白酶VI及其組合）基因中之基因突變。有些大 腸菌蛋白缺少菌株為現有’例如J〇ly al.，
Acad· Sci· USA，95: 2773-2777 (1998);美國專利第 5,264,365號及第 5,508，192號；Hara et al·，Microbial Drug
Resistance，2: 63_72 (1996)中所記載。再者，以含有Aptr鲁 或△ prc prc•抑制子之基因型為最佳。 在某些具體例中，製造及使用包含與細胞毒劑連結之免 疫結合物（immunoconjugate)。該免疫結合物及/或其所結合 之抗原被細胞内化，導致免疫結合物在殺滅其所結合之目 標細胞時之治療效果提高。在一較佳具體例中，該細胞毒 劑尋找並干擾目標細胞中之核酸。 抗體之結合物及一種或多種小分子毒素，例如卡奇徽素 97062.doc -82- 200526957 (calicheamicin)，美登素（maytansine)(美國專利第 5,2〇8,〇2〇 · 號），鐮刀黴菌毒素（trichothene)及CC1065。 在本發明之一較佳具體例中，抗體係與一個或多個美登 素分子（例如每一抗體分子約1至10個美登素分子）結合。舉 例而言’美登素可轉變為May-SS-Me，其可再被還原成 May-SH3 並與修正之抗體（Chari et al.，Cancer Researeh， 52: 127-131 (1992))反應，生成美登素_抗體結合物。 另一種相關之免疫結合物包含連結於一個或多個卡奇黴 素之抗體。抗生素之卡奇黴素族群能在低於微微莫耳 _ (sub-picomolar)濃度下製造雙股DNA斷片。可使用之卡奇黴 素之結構類似物包括（但不限定於）^1、□/、口3!、乙醢基、 PSAG及-、(Hinman et al·，Cancer Research，53: 3336-3342 (1993)及 Lode et al·，Cancer Research，58:2925-2928 (1998))。亦參考美國專利第5,714,586號、第5,712,374號、 第 5,264,586號及第 5,773,001 號。 酵素活性毒素及其片段可被使用於包括白喉A鏈、白喉毒 素之非結合活性片段、外毒素A鏈（從銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素（ricin)A毒素、雞母珠 蛋白（abrin)A鏈、莫迪素（modeccin)A鏈、α -核糖毒素（α -sarcin)、油桐（Aleuritesfordii)蛋白質、二黃素（dianthin)蛋 白、美洲尚陸（Phytolaca americana)蛋白質（PAPI、PAPII及 PAP-S)、苦瓜（momordica charantia)抑制劑、痲瘋樹毒 (curcin)、巴豆毒素（crotin)、肥皂草（saponaria officinalis) 抑制劑、白樹素（gelonin)、米陀傑林（mitogellin)、局限曲 97062.doc -83- 200526957 菌素（restrictocin)、紛諾黴素（phenomycin)、伊諾黴素 (enomycin)及鐮刀黴菌毒素（tricothecenes)。例如參考1993 年10月28日公開之WO 93/21232。 本發明尚關於抗體與具有核酸分解活性之分子之間形成 之免疫結合物（例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶例如去 氧核糖核酸酶，DNase)。 現有多種放射線活性適合做為放射性結合抗體。例如包 括 At211、I131、I125、γ90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32 及Lu之放射性同位素。 抗體與細胞毒劑之結合物可使用各種雙官能性蛋白偶合 劑例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇）丙酸酯 (SPDP)、琥珀酿亞胺基_4-(]^_馬來醯亞胺甲基）環己烧q-緩 酸醋、Μ醇亞胺（iminothiolane，IT)、醢亞胺醋之雙官能性 衍生物（例如己二醯亞胺酸二曱酯鹽酸鹽）、活性酯類（例如 辛二酸二琥珀醯亞胺酯）、醛類（例如戊二醛）、貳-疊氮化合 物（例如貳（對疊氮苄醯基）己二胺）、貳-重氮鏘衍生物（例如 貳（對-重氮鏽苄醯基）_伸乙二胺）、二異氰酸酯類（例如甲苯 基2,6-二異氰酸酯）及貳活性氟化合物（例如1，5-二氟-2,4-二 碗基苯）。例如，一種蓖麻免疫毒素可藉由Vitetta et al.， Scienee，238: 1098 (1987)記載之方法製造。碳14標記之i- 異硫氰酸节基-3·甲基二伸乙基三胺五醋酸（MX_DTPA)為將 放射性核酸苷與抗體結合之螯合劑例子。參考WO 94/11026。連結子為能促進細胞毒素藥物在細胞中釋放之 「可裂解連結子」。例如，可使用對酸不安定之連結子、肽 97062.doc 200526957 酶敏感性連結子、二甲基連結子或含二硫鍵之連結子（Chari et al·，Cancer Research，52: 127-131 (1992)) 〇 另一方面，包含抗體及細胞毒劑之融合蛋白質可藉由例 如重組技術或肽合成法而製造。 在另一具體例中，抗體可與「受體」（例如鏈黴抗生物素 蛋白（streptavidin))結合，使用於腫瘤預插靶（pretargeting)， 其中將該抗體-受體結合物投予於病患，繼而藉由使用清除 劑（clearing agent)從循環中除去未結合之結合物，繼而投予 和細胞毒劑（例如放射性核素（radi〇nucnde))結合之「配位 子」（例如抗生物素蛋白（avidin))。 該抗體亦可使用於ADEPT，藉由將抗體與可將原藥（例如 肽基化學治療劑，參考W0 81/01145)轉變為活性抗癌藥物 之原藥活化酶結合。參考例如W〇 88/07378及美國專利第 4,975,278 號。 使用於ADEPT之免疫結合物之酵素成分包括任何能將原 藥轉形為更活性細胞毒性方式之酵素。 使用於ADEPT法之酵素包括（但不限定於）：使用於將含 鱗酸鹽之原藥轉變為游離藥物之鹼性磷酸酶，使用於將含 硫酸鹽之原藥轉形為游離藥物之芳基硫酸酶Μ吏用於將無 毒性5-氟胞嘧啶轉變為抗癌藥物(5_氟尿嘧啶)之胞嘧啶去 胺酶，使用於將含肽原藥轉變為游離藥物之蛋白酶(例如沙 雷氏菌蛋白酶（serratia pr〇tease)、冑熱菌蛋白酶 (加011015^111)、栝草菌素酶㈣bUlisin)、羧肽酶及半胱胺酸 酶（CathePSln)(例如半胱胺酸酶B及L))，用於將含D-胺基酸 97062.doc 200526957 取代基之原藥轉變之〇_丙胺酸基鲮基肽酶，使用於將糖化 原藥（glycosylated prodrug)轉變為游離藥物之碳水化合物 裂解酶（例如β-半乳糖苷酶及神經胺酸酶），使用於將^内醯 胺衍生之原藥轉變為游離藥物之β_内醯胺酶，以及使用於 將其胺基氮分別衍生為苯氧乙醯基或苯乙醯基之原藥轉形 為游離藥物之青黴素醯胺水解酶，例如青黴素ν醯胺水解酶 或青黴素G醯胺水解酶。另一方面，亦可使用具有酵素活性 之抗體（在此技藝中亦稱為「抗體酶」），將本發明之原藥轉 變為游離活性藥物（參考例如Massey，Nature，328: 457_458 (1 98 7))。抗體-抗體酶結合物可藉由此處記載之方法製備， 並將該抗體酶運送至腫瘤細胞族群。 酵素可藉由此技藝中熟知之技術，例如使用上述之雜二 官能性交聯劑，以共價方式與抗體結合。另一方面，至少 含有本發明抗體之抗體結合區及至少含有本發明酵素之功 能活性部分之融合蛋白質，可使用此技藝中熟知之重組 DNA技術構成（參考例如 Neuberger et ai.，Nature，312: 604-608 (1984))。 可使用本發明之抗體增加腫瘤穿透性。在此種情況，宜 修改抗體以增加血清半衰期。此可藉由於抗體中例如導入 抗原結合部位（epitope)之補救受體（saivage receptor)而達 成’例如藉由在抗體中適當區之突變，或藉由將抗原決定 部位導入肽標籤中，然後將該肽標籤，例如藉*DNA或肽 合成’與抗體在末端或中間融合。參考1996年1〇月17曰公 開之 W0 96/32478。 97062.doc -86 - 200526957 補救欠體結合性抗原決定部位通常構成一個區，其中從 Fc區域之一個或多個環部而來之一個或多個胺基酸殘基被 移轉至抗體中之類似位置。更佳者為&Fc區域之一個或二 個環部而來之三個或更多個殘基被移轉。特佳者為該抗原 決定部位係取自Fc區之CH2區域（例如為][gG)，並移轉至該 抗體之CHI、CH3或VH區，或一個以上該區。另一方面， 該抗原決定部位係取自Fc區之CH2區域，並移轉為抗體之 Cl區或VY區或兩者。 本發明抗體之共價修改亦包括於本發明之範圍中。其可 藉由化學合成或藉由抗體（如果使用）之酵素或化學裂解。抗 體之其他共價修改類型可藉由抗體之標的胺基酸殘基與能 和選出之侧鏈或Ν-或C-末端殘基反應之有機衍生劑反應而 導入分子中。 多肽之共價修改之例子如美國專利第5,534,615號所記 載。抗體之共價修改之較佳類型包含將抗體與各種非蛋白 質類聚合物（例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧伸烷基）之一連 結’其方式如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第 4,301，144號、第 4,670,417號、第 4,791，192 號或第 4，179,337 號所記載。 另一方面，本發明係關於一種測定罹患癌症之哺乳類（例 如人類）病患是否能從使用TGF-β拮抗劑治療獲益之方法。 此方法包含下列步驟： (a)測試從病患取得之癌細胞對TGF-β之生長抑制作用 之敏感性； 97062.doc -87- 200526957 (b) 製作一個得自病患之癌細胞之基因表現圖譜，並與 付自對使用TGF-β拮抗劑治療有反應之動物模型之癌細胞 之基因表現圖譜加以比較；以及 (c) 如果得自病患之癌細胞對TGF-β之生長抑制作用不 敏感’並且所具有之基因表現圖譜與從對該治療有反應之 動物模型之癌細胞而來之基因表現圖譜類似，則將該病串、 鑑定為可能從使用TGF-β拮抗劑治療獲益者。 就此目的而言，「類似」意指表現圖譜在一種或多種方式 上彼此相似或擬似，亦即顯示在數量上或在用於量測基因 表現圖譜之分析法或技術所得到之其他可量測表現參數 (詳細如以下所述）上有約80%至100%相等（以約9〇至1〇〇% 相等為較佳，以約95至100%相等為更佳）之表現模式。從患 者及從動物模型得到之癌細胞之基因表現圖譜通常係藉由 相同技術或分析法得到，以利比較。 各種TGF-β拮抗劑及其等之製造方法在本技藝中為已 知，並且目前有許多仍在開發中（參考例如]〇如114等之美國 專利5,821，227號）。所使用之特異性TGF-β拮抗劑非一限定 性特徵，在本文中定義之有效TGF_P拮抗劑於本發明之方法 及組合物中皆有用，諸如在本文提供之定義中之例子。 一種理想之TGF-β拮抗劑對於TGF-β具有高度親和性，在 活體内及活體外可長期使用，並能在某些方面區別「病理 性」TGF-β(其涉及造成或促進疾病過程之惡化）及「生理性」 TGF-β(其涉及在多器官系統中正常恆定狀態及細胞功能之 維持）。雖然就使用本發明而言，並不需要了解其機制，然 97062.doc -88 - 200526957 而在本發明之一個具體例中考量到··如果需要TGF_p來維持 正$丨亙疋狀態，將其在製造部位局部活化，並快速與鄰近 受體結合以避免被從細胞釋放出去；然而若病理過程與較 廣泛之TGF-β活化有關，則上述相對大型之拮抗劑例如 SR2F(無細胞表面結合區域）將較不易達到細胞締合性「生 理性TGF-β」處，但能有效地中和「病理性tgf_p」。不過， 此並非意圖將本發明限於某些特殊機制。 如果该癌症為乳癌，包括原發性及轉移性乳癌，上述預 後方法可再包括測定該病患之Her2狀態之步驟，其中+ 病患對於TGF-β拮抗劑單獨治療通常（雖然非總是）不反應 (或反應不佳）。 如果该病患可能從使用TGF-β拮抗劑治療獲益，則在上述 步驟之後，單獨投予有效量之TGF-β拮抗劑，或與有效量之 化學治療劑及/或細胞毒劑及/或其他治療方法（包括放射性 治療）合用。 製作基因表現圖谱之方法在本技藝中為人所熟知且通常 係依據聚核酸苷之雜交分析或聚核苷酸之定序。在此技藝 中最常使用來將檢體中之mRNA表現定量之方法包括：北方 轉潰法（northern blotting)及試管内雜交法（Parker & Barnes， Methods in Molecular Biology, 106: 247-283 (1999))； RNAse保護分析（Hod，Biotechniques，13: 852-854 (1992)); 及反向轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)(Weis et al.，Trends in Genetics，8: 263-264 (1992))。另一方面，可使用抗體以 識別特定雙螺旋，包括DNA雙螺旋、rnA雙螺旋及 97062.doc -89- 200526957 DNA-RNA混合雙螺旋或DNA_蛋白質雙螺旋。基於定序之 基因表現分析之代表方法包括基因表現之系列性分析 (SAGE)及藉由大規模平行信號定序（Mpss)之基因表現分 析。任何此等方法或其他此技藝中已知之方法，可被使用 以測定得自病患之腫瘤細胞之基因表現圖譜，該病患如人 類病患及做為癌症對TGF-β拮抗劑反應之模型之動物，例如 小机模型。在人類病患之情況，腫瘤細胞之來源可為新鮮、 冷珠或藉由石蠟包埋之組織檢體，可從其中萃取mRNA並付 諸於基因表現分析。 另一方面’亦可使用蛋白質體學（pr〇te〇JniCS)技術來比較 人類及對照（例如小鼠）癌細胞之表現圖譜。蛋白質體學圖譜 為在生物檢體（例如癌組織）中複數種蛋白質表現圖譜之代 表。該表現圖譜可藉由例如質譜呈現，其他呈現方式亦可 包括基於蛋白質之物理化學或生物化學性質者。舉例而 言，表現圖譜可基於蛋白質電泳性質之差異，如藉由二次 元凝膠電泳法（例如2-D PAGE)測定，並可以例如在二次元 電泳凝膠上之複數個點表現。蛋白質體學技術在本技藝中 為人熟知，並被記載於例如以下之書籍：Prote〇me Research: New Frontiers in Functional Genomics (Principles and Practice)，M.R. Wikins et al·，eds·，Springer
Verlag, 1007 ； 2-D Proteome Analysis Protocols, Andrew L Link, editor, Humana Press, 1999 ； Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice), T. Rabilloud editor, 97062.doc -90- 200526957
Springer Verlag, 2000 ； Proteome Research: Mass
Spectrometry (Principles and Practice)，P. James editor， Springer Verlag, 2001 ； Introduction to Proteomics, D.C. Liebler editor, Humana Press, 2002Ϊ Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis, R.
Westermeier et al·，eds·，John Wiley & Sons，2002。 又另一方面，對使用TGF-β拮抗劑治療沒有反應或反應不 佳之病患亦可使用合併療法治療：包括投予一定劑量之 TGF-β拮抗劑，其單獨投予時無明顯之抗腫瘤效果，但在合 併有效量之一種或多種化學治療劑或細胞毒劑及/或放射 性治療時，對抗腫瘤有效。 本發明之另一態樣係關於藉由對病患投予有效量之 TGF-β枯抗劑以治療哺乳類（例如人類）病患中與腫瘤轉移 相關之骨骼破壞或骨質流失。此等骨骼破壞或骨質流失可 由"午夕原因引起，包括滲透至骨骼之原發性及繼發性癌 症。治療包括骨骼破壞或骨質流失之回復，及停止或減緩 骨骼破壞或骨質流失之病 理過程。 類病患之方法，其 其包含對該病患投予有效量之TGF-β拮抗劑
量之總和。 在另一方面，本發明提供一種治療被診斷為癌症之哺乳 ^ 予治療劑或細胞毒素劑單獨投予（為單劑）時有效 總和。分·、广 μ癌症以乳癌（例如轉移性乳癌）或直腸癌為較 97062.doc 200526957 佳。該化學治療藥劑以紫杉雙祐類（taxoid)為較佳。 本务明另-態樣提供-種治療被診斷為癌症之哺乳類病 患之方法’其包含對該病患投予有效量之⑽·师抗劑及放 射線治療劑之組合劑，視情況亦可併用抗A管新生劑，例· 如特異地與VEGF結合之抗體。該方法為監測該組合劑之有· 效里疋否低於該TGF-β拮抗劑與該放射線治療劑單獨投予 (為單诏）時有效$之總和。該癌症以乳癌（例如轉移性乳癌） 或直腸癌為較佳。 又另一方面，本發明提供一種治療被診斷為癌症之哺乳籲 類病患之方法，其包含對該病患投予有效量之TGF_p拮抗劑 及抗血管新生劑之組合劑，視情況亦可併用有效量之化學 治療劑或細胞毒素劑，並監測該病患對該組合劑之反應。 該抗血管新生劑以特異性地與VeGF結合之抗體為較佳。在 一態、樣中，該方法為監測該組合劑之有效量是否低於該 TGF-β拮抗劑與該抗血管新生劑單獨投予（為單劑）時有效 量之總和。 此處之TGF-β拮抗劑在治療中可單獨使用或與其他組合春 物合併使用。例如，該拮抗劑可與對抗腫瘤相關抗原（TGF-p 以外）之抗體共同投予，該抗體例如為一或多種與eGFr、
ErbB2、ErbB3、ErbB4或VEGF抗原結合之抗體，化學治療 劑（包括化學治療劑之雞尾酒療法），細胞毒劑，抗血管新生 劑’細胞激素及/或生長抑制劑。尤其期望將該抗體與一或 多種抑制腫瘤生長之其他治療劑合用。該病患亦可改用或 加用放射線治療（例如外來光束放射線或放射活性標記之 97062.doc -92- 200526957 治療劑(例如抗體))。上述合併治療法包括合併投予(其中括 二種或以上藥劑被包括在相同或分開之調配物中)及分開 投予(在此種情況，拮抗劑之投予可在投予輔助治療劑之前 及/或之後進行）。生長抑制劑之適當劑量為目前所使用者，· 並可在所用之其他藥劑與TGF_P拮抗劑合用具有增效作用. (synergy)時減低劑量。 TGF-β拮抗劑（及輔助治療劑）可藉由任何適當方法投 予，包括非經腸道投予、皮下投予、腹膜内投予、肺^ 予及鼻腔内投予，以及如果期望局部治療，投予至損傷處眷 内。非經腸道投予包括肌肉注射、靜脈 腹膜内注射或皮下注射投予。再者，該拮抗劑適合藉；；脈 波輸液法（pulse infusion)投予，尤其使用逐減劑量之拮抗 劑。該劑量以藉由注射給予為較佳，又以靜脈注射或皮下 注射為更佳，部分取決於該投予是否方便或是否為慢性。 拮抗劑組合物可以與良好醫療實務一致之方式進行調 配、決定劑量及投予。在此過程中考慮之因素包括待治療 之特定異常、待治療之特定哺乳動物、病患個體之臨床狀_ 況、異常之原因、拮抗劑之輸送部位、拮抗劑之類型、投 予方法、投予之時間表及醫療人員上已知之其他因素。該 拮抗劑非必須，但可選擇性地與一或多種經常用於預防或 治療該異常之藥劑合用。此等其他藥劑之有效量取決於存 在於配方中之拮抗劑類型及含量、異常或治療之類型及其 他上述之因素。一般而言，其所使用之劑量與先前投予途 位所使用之劑量相同’或者為先前所使用劑量之1至99%。 97062.doc -93- 200526957 為預防或治療疾病，抗體（單獨使用或與上述其他藥劑例 如化學治療劑、細胞毒劑、生長抑制劑、或抗血管新生劑= 或對抗不同抗原之抗體或細胞激素合併使用）之適當劑量 取決於欲治療之疾病類型、拮抗劑類型、疾病之嚴^性: 進程（course)、投予拮抗劑之目的為預防或治療、先前治療 方式、病患之臨床病史及對拮抗劑之反應、以及參與之内 科醫師之意見等。該拮抗劑適合對病患以一次投予或以一 個治療系列投予。視疾病之類型與嚴重性，投予於病患之 起始候選劑量為約1叫/kg至15 mg/kg(例如〇1 mg/kg i〇 mg/kg)之拮抗劑（尤其如果其為抗體），該劑量可一次或分為 多次投予，或連續輸入。一曰劑量之範圍通常為約i 至100 mg/kg或以上，視上述因素而定。重複投予數日或更 久（取決於上述情況），治療需持續，直到對疾病症狀產生所 需之抑制。 該拮抗劑（尤其抗體）之較佳劑量在約〇.〇5 mg/kg至約1〇 mg/kg之範圍。因此，可對病患投予—次或多次約〇.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.〇 mg/k“1〇 mg/kg(或其等之任何組 〇)之劑里。此等劑量可間歇投予，例如每週或每三週（例如 因此該病患接受約2至約20個（例如約6個）劑量之抗體p可 在開始投予較高之負荷劑量（loading d〇se)，繼而投予一次 或夕•人車又低劑虿。給藥法之一例子包含開始投予約4 之負荷劑量，繼而每週維持約2mg/kg劑量之抗體。然而， 亦可使用其他給藥法。此種治療之進展可容易地藉由一般 技術及分析加以監測。 97062.doc -94- 200526957 此拮抗劑之治療調配物可藉由將具有所需純度之拮抗劑 選擇性地與生理學上可容許之載體、賦形劑或安定劑混合 (Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed· (198G))，形成水溶液、冷綠燥或其他乾燥之調配 物。可容許之載體、賦形劑或安定劑對接受者而言在使用 之劑量及濃度下為無毒性，並包括緩衝劑（例如磷酸鹽、檸 檬酸鹽、組胺酸及其他有機酸）、抗氧化劑（包括抗壞血酸及 甲硫胺酸)、保存劑(例如十八烷基二曱基苄基銨氣化物、六 甲銨氣化物（hexamethonium chl〇ride)、苯烷基銨氣化物、 苯乙銨氣化物、酚、丁醇或苄醇、對羥苯甲酸烷酯⑷㈣ paraben)例如對羥苯甲酸甲酯或丙酯、鄰苯二酚、間苯二 酚、ί哀己醇、3-戊醇及間甲酚）、低分子量（少於約1〇個殘基） 多肽、蛋白質（例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）、親水 性聚合物（例如聚乙埽基吡咯啶酮）、胺基酸（例如甘胺酸、 榖胺酸、天冬胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸）、單糖、雙 糖及其他碳水化合物（包括葡萄糖、甘露糖或糊精”螯合劑 (例如EDTA)、糖類（例如蔗糖、甘露糖、海藻糠或山梨醇）、 形成鹽之平衡離子（例如鈉）、金屬錯合物（例如ζ卜蛋白質錯 合物）及/或非離子界面活性劑（例如tweentm、 PLURONICSTM或聚乙二醇（pEG))。 如以上說明，此處之調配物於待治療之特定適應症需要 時，亦可含有一種以上活性化合物，其中以使用具有互補 活性且對於彼此無不利影響者為較佳。此等分子宜以達到 所需目的之量存在於組合物中。 97062.doc -95- 200526957 此等活性成分亦可包藏於例如藉由凝聚（coaeervati〇n)技 術或界面聚合而製備之微膠囊（分別例如羥甲基纖維素或 明膠-微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯）微膠囊），或膠體藥物 運送系統（例如，微脂體（liposome)、白蛋白微球體、微乳 液、奈米粒子及奈米膠囊）或於巨乳液（macroeniulsion)中。 此等技術記載於 Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A· Ed. (1980)中。尤其，含有拮抗劑之微脂體 可藉由在 Epstein et al.，Proc· Natl. Acad· Sci· USA，82: 3688 (1985) ； Hwang et al.5 Proc· Natl. Acad. Sci. USA, 77： 4030 (1980);及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中 記載之方法製備。具有加強循環時間之微脂體如美國專利 第5,013,556號所揭示。 特別有用之微脂體可藉由使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇 及PEG衍生之磷脂醯基乙醇胺（pEG-pE)之脂肪組合物之逆 相蒸發法而產生。微脂體係經由具有設定孔徑大小之過濾 器押出，以產生具有所需直徑之微脂體。本發明之抗體之 Fal^片段可經由二硫鍵交換反應與如Martin et al.，J. Biol. Chem·，257: 286-288 (1982)中所記載之微脂體結合。化學 治療劑（例如阿黴素（doxorubicin))可選擇性地包含於該微 脂體中。請參考 Gabizonetal.，J.NationalCancerInst.，81 (19): 1484 (1989)。 使用於活體投予之調配物必須經過滅菌。其易藉由通過 無菌過濾膜過濾而達成。 可製備持續-釋放製劑。持續-釋放製劑之適當例子包括 97062.doc -96- 200526957 含有該拮抗劑之固體疏水性聚合物之半透過性基質，今& 質係定形物體之形式，例如薄膜或微膠囊。持續_釋放基f 之例子包括聚酯、水凝膠（例如聚（甲基丙烯酸2-經乙g旨）咬 聚（乙烯醇））、聚交酯（polylactide)(例如美國專利第 3,773,919號）、1^榖胺酸與1^榖胺酸丫乙酯之共聚物、非降 解性（non-degradable)乙烯·醋酸乙烯酯共聚物、非降解性乳 酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT™(由乳酸-乙醇酸共 聚物及亮丙瑞林（leuprolide)醋酸酯組成）及聚經美 丁酸。聚合物例如乙烯_醋酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸可釋放分 子超過100日，而某些水凝膠以較短週期釋放蛋白質。當被 包藏之抗體在身體中停留長時間，其暴露於37^濕氣下而 可能變質或結塊（aggregate)，導致生物活性喪失及免疫原性 (immunogenicity)可能改變。合理之對策可依據涉及之機制 來設計。例如，如果結塊機制被發現係經由分子内之硫醇-二硫（disulfide)互換形成S-S鍵，則可藉由修改巯殘基、從 酸性溶液冷凍乾燥、控制濕氣含量、使用適當添加劑及開 發特定聚合物基質組合物而安定化。 本發明包括使用細胞毒性化學治療與可溶性TGF-β拮抗 劑之組合。具體例包括使用細胞週期活性劑（例如5_氟尿嘧 咬）’其對具有活性週期變化之細胞之組織（例如骨趙及内 臟）呈現劑量限制性毒性。雖然使用本發明時無需了解其作 用機制，但已知TGF-β使幹細胞處於靜止狀態。在一輪化學 治療後投予可溶性TGF-β拮抗劑，預期可增強幹細胞增生， 並因此恢復造金功能（Sitnicka et al·，B1〇〇d，88: 97062.doc -97- 200526957 (1996))。使用可溶性抗劑與化學治療劑之組合療 法，除了可獨立地發揮丁(}]^|3拮抗劑之治療效果外，還可使 化學治療劑之毒性減少。 本發明亦包括使用可溶性TGF邛拮抗劑與免疫療法之組 合療法。雖然使用本發明並不需要了解其機制，然而預期 腫瘤分泌之免疫系統抑制因子將限制針對強化免疫識別及 摧毀腫瘤之免疫治療手段之效力（de Visser & Kast，
Leukemia，13: 1188_1199 (1999))。TGF-β為由腫瘤大量分 泌之免疫抑制劑。本發明之具體例包括合用TGF_P抑制劑及 免疫療法（例如接種抗腫瘤疫苗、過繼性（adoptive)免疫療 法）’其在該TGF-β抑制劑之抗轉移效果與該免疫療法效力 增強之間具有增效作用（Synergisrn)。 本發明之進一步詳細說明於以下實施例中提供。以下之 實施例僅說明本發明之實用性，而非給予其任何限制。此 處所引用之專利及科學文獻係引用其全文做為參考。 實施例1 單株抗體2G7及4A11之製造及特徵鑑定 A·分析步称 I· ELISA測定 將96孔聚苯乙烯分析平板用於pH 9.6碳酸鹽緩衝溶液中 之純化TGF-βΙ 1 gg/ml塗佈（1〇〇 μΐ/孔）並置於於4。(：18小 時。將塗布之平板用於磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS)中之0.5%牛 血清白蛋白（BSA)(稱為BPBS)封阻，並置於22°C 1小時，然 後用0.05% TWEEN 20TM2PBS溶液（稱為PBST)清洗，並與 97062.doc -98- 200526957 100 μΐ融合瘤上清液在22°c培養1小時。將該平板用PBST清 ， 洗，該結合之抗體用結合有過氧化酶之山羊抗小鼠IgG (Tago公司，Burlingame，CA)進行檢測。將該平板用PBST 清洗，並添加鄰伸苯基二胺二鹽酸鹽受質100 μΐ/孔。此反 應在15分鐘後停止，且在讀取機（Molecular Devices公司，Palo Alto，CA)上測定於492 nm之光學密度。 II. rTGF-βΙ 之碘化 將純化之TGF-βΙ藉由經修正之CHLORAMINE TTM(實驗 式：C7H7S02N NaCl(3H20))步驟碘化（Greenwood et al·， _ Biochem· J·，89: 114 (1963))。簡言之，將在冰上用 1 mCi 之Na45I標記10 gg經純化之rTGF-βΙ(依序添加20 μΐ之0.1 mg/ml CHLORAMINE ΤΤΜ三次，其間以2分鐘培養分開）。 此反應藉由依序添加20 μΐ之50 mM Ν-乙醯基酪胺酸、1 Μ 碘化鉀，及200 μΐ之8 Μ尿素而停止。將該碘化rTGF-βΙ藉 由HPLC(使用C18管柱及三氟乙酸/乙腈梯度溶析）與游離之 Nak5I分開，並將含有主吸收峰之部分匯集且貯存於70°C φ (比活性 112 pCi/pg)。 III. 抗原捕捉放射性免疫分析 將 IMMUNLONtm 2，丨REMOVAWELL，，tm 帶（Dynatech 公 司，Chantily，VA)用於pH 9.6碳酸鹽中之山羊抗小鼠 IgG(Boehringer Mannheim公司）塗佈並置於4°C 18小時。將 · 各孔用PBST清洗，用含有0.1%明膠之PBS(稱為PBSG)封 阻，用PBST清洗，並與融合瘤上清液在22°C培養4小時。 ， 將各孔用PBST清洗，及添加於100 μΐ之0.1%明膠/PBST中之 ， 97062.doc -99- 200526957 bSI-rTGF-pipS’OOO CPM/孔），並在22QC 培養 2小時。將該 平板用PBST清洗，且在GAMMAMASTERtm計數器（LKB公 司，瑞典）上定量結合之kSI-rTGF-pi。 IV. tSI-rTGF-p之免疫沉澱 抗TGF-β單株抗體之特異性亦藉由其免疫沉澱 bSI-rTGF-pi 或豬血小板衍生之 125I_TGF_P2(R&D Systems 公司，Minneapolis，MN ;比活性103.4 pCi/pg)之能力而評 估。將2 pg純化之單株抗體與5xl04CPM之kSI-rTGF-pi或 kSI-TGF-pS在22°C培養2小時。將此免疫複合物經由通過 以蛋白質A-SEPHAROSETM珠粒形成之瓊脂糖為主體並用 兔抗小鼠 IgG(Boehringer Mannheim Biochemicals公司， Indianapolis，IN)包覆之凝膠過遽基質（Repligen公司， Cambridge，ΜΑ)製成片粒，隨後用PBST清洗三次。使用還 原性檢體緩衝液將該複合物從以蛋白質A-SEPHAROSEtm 珠粒所形成之瓊脂糖為主體之凝膠過濾基質中分離出，並 於12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE)上電泳及予以自 動放射線顯影。 V· TGF-β單株抗體之親和性測定 使用 Mariani et al·，J· Immunol· Methods，71: 43 (1984) 記載之固相放射性免疫分析步驟測定TGF-β特異性單株抗 體之親和性。簡單而言，將純化之TGF-β單株抗體塗布於 IMMUNLONtm2 （於 pH 9·6 碳酸鹽中
並在4°C經1 8小時）。將各孔依上述方式清洗及封阻。將於 50 μΐ PBSG 中之 kSI-rTGF-pi 或豬 kSI-TGF-p〗（R & D 97062.doc -100- 200526957
Systems公司）（40,000 CPM/孔）之任一者，加至於50 μΐ之 PBSG中之未標記rTGF-βΙ或豬TGF-P2之二倍系列稀釋液 (範圍從2500至9.7 ng/孔）。將生成之混合物在4°C培養18小 時。將各孔依照上述方式清洗及記數，並藉由施卡查德 (Scatchard)分析測定親和性常數（Munson & Pollard，Anal· Biochem·，107: 220 (1980))，其與使用 Antoni & Mari an i，J· Immunol· Meth·，83: 61 (1985)之非線性回歸分析得到之結 果近似。 VI. 從腹水（Ascites Fluid)純化單株抗體 將在上述分析中為陽性之母融合瘤培養液分泌之抗體藉 由限制稀釋法（limiting dilution)選殖，並在Balb/c小鼠之腹 水中培養（Potter et al·，JNC1，49: 305 (1972))，並用 PRISTANEtm引子作為引子。將該單株抗體藉由以蛋白質 A_SEPHAROSETM珠粒所形成之瓊脂糖為主體之凝膠過濾 基質純化，並使用確立之步驟（〇0〇1丨11§，111111111111〇1· Methods，20: 241 (1978))以 0.1 Μ 乙酸，0.5 M NaCl(pH 2.4) 溶析，再在4°C下於PBS中無菌貯存。 VII. 在活體外TGF-β比活性之單株抗體中和 活體外之TGF-β活性分析係使用鼬鼠肺纖維母細胞株 Mv-3D9(從MvlLu分段選殖，得自美國菌種保藏中心 (American Type Culture Collection)，Manassas，VA，登錄 號碼ATCC No.CCL-64)進行。簡言之，將純化之抗TGF-β 單株抗體及對照組與rTGF-βΙ、天然豬TGF-P2(R & D Systems 公司）或 rTGF-P3(Derynck et al·，Nature，316: 97062.doc -101 - 200526957 701-705 (1985))在最終濃度 1000-2000 pg/m卜 4°C 下培養 18 小時。將此等混合物50 μΐ加入96孔微滴定平板，繼而添加 在50 μΐ最少需求培養基（含有2 mM榖胺酸及5%牛胎兒血 清）中之lxlO4 Mv-3D9細胞，並在37°C，5% C02下培養18-24 小時。將各孔用1 pCi之3H-胸腺嘧啶20 μΐ處理，並置於3 7 °C 4小時後收取，再在37°C用閃爍記數器記數。使用TGF-β 標準液之各稀釋液之3H-胸腺嘧啶攝取量之抑制百分率來 計算以陰性對照單株抗體處理之檢體及以TGF-β特異性單 株抗體處理之檢體之TGF-β活性（單位為pg/ml)。 VIII. 單株抗體之異構型鑑定（isotyping) TGF-β 1反應性單株抗體之異構型鑑定係使用PANDEXtm 螢光幕機技術而進行。使用以大鼠抗小鼠IgG抗血清 (antisera)塗佈之聚苯乙烯顆粒與得自培養上清液且被分配 於PANDEXTM2 96孔分析平板中之單株抗體結合。將平板清 洗，並添加與FITC結合之大鼠單株抗小鼠異構型特異性試 劑（Becton Dickinson單株保藏中心）。將結合之螯光藉由 PANDEXTM2螢光幕機技術定量。 IX. 抗原決定部位分析 將純化之抗-rTGF-βΙ單株抗體藉由Nakane & Kawaoi，J· Histochem. Cytochem·，22: 1084 (1974)之方法與山葵過氧 化酶（HRP)偶合。將以rTGF-βΙ塗佈之平板與於PBS中之50 pg/ml純化抗rTGF-βΙ或陰性對照在22°C培養2小時。繼而將 預先稀釋之抗rTGF-β單株抗體-HRP結合物加入該等平板 中並在22°C培養1小時。清洗此等平板並加入受質，並如同 97062.doc -102- 200526957 上述定量反應性。此異源性抗rTGF-β 1單株抗體之封阻百分 率與自體之陽性封阻對照組比較。 X·免疫轉潰（immunoblot)分析 將1 pg/行之rTGF-βΙ使用非還原性檢體緩衝液在12% SDS-PAGE中電泳，測定各種單株抗體與rTGF-βΙ二聚體形 式之反應性。將此等胜肽轉潰至硝化纖維紙上，並用與HRP 結合之適當單株抗體探測。使用不溶性受質4-氣-1-萘酚 (Kirkegaard & Perry 公司，Gathersburg，MD)可使結合之抗 體顯現。1 5分鐘後，藉由使用蒸餾水充分清洗以使反應停 止，將免疫轉潰物乾燥並予以顯像。 B·抗-TGF-βΙ-及抗-TGF_02-特異性單株抗體之製造 在初始免疫規程（immunization protocol)中，以 rTGF-βΙ(以 如Derynck et al·，Nature，supra所述之方法製造及純化）使 Balb/c小鼠免疫，其中使用各種免疫原製劑、劑量及時程， 並使用完全及不完全弗氏佐劑（FreuncTs adjuvant)，藉由皮 下及腹膜投予途徑投予。該免疫時程持續11週。數隻小鼠 以呈現可量測但低量之抗rTGF-βΙ滴度回應，將此等小鼠中 之兩隻宰殺，並使用其脾臟進行融合。1152個母培養液中 只有84個被檢測到為陽性抗TGF-β上清液。選殖此等融合瘤 中之10個以及生成低親和性單株抗體，其無法被用於分析 或純化。 另外一種策略為將一群10隻Balb/c雌性小鼠（Charles River實驗室，Wilmington，ΜΑ)於第0、3、7、10 及14 日在 後足底肉墊注射5 pg/劑之純化TGF-βΙ (於100- μΐ DETOXtm 97062.doc -103 - 200526957 佐劑（RIBI免疫化學研究公司，Hamilton，MT))。在第17曰 將該動物宰殺，將其之引流腹股溝及胭窩淋巴結移出，並 使用不錄鋼篩將淋巴細胞從淋巴結基質（no(le stroma)分 離。將從此等來自1 〇隻小鼠之淋巴細胞懸浮液匯集，並與 小鼠骨魅瘤細胞株X63-Ag8.653融合（Kearney et al·，J.
Immunol·，123: 1548 (1979))，其中使用 50%聚乙二醇4000 並根據已確立之步驟（〇i & Herzenberg，in Selected
Methods in Cellular Immunology，Β· Mishel & S· Schiigi， eds·，（W.J. Freeman Co.，San Francisco, CA，1980)，ρ·351) 進行。在融合後第1日，將融合之細胞移入總數1344之96 孔微滴定平板，密度2χ1〇5細胞/孔，繼而進行HAT選擇 (Littlefield, J.W·，Science，145: 709 (1964))。 在ELISA測試中有119〇孔與固定之重組TGF-βΙ有反應 性。其中1 8個培養物在擴增並將細胞株冷藏時保持安定。 將此等母培養物進行異構型鑑定，並分析其等捕捉 25I_rTGF-pi之能力，及中和活體外TGF-βΙ之活性。將該 18個母培養物進行中和之分析，繼而進行異構型鑑 定，其中兩個為IgGl-κ異構型，其餘者為IgG2b-K異構型。 只有屬於IgGl亞類之單株抗體被發現在活體外呈現 fTGF-βΙ抑制（中和）活性。選出三個穩定融合瘤，其分泌高 親和性抗-TGF-β單株抗體。此等抗體之特性鑑定如以下進 一步說明。 C·放射性碘化TGF_p之免疫沉澱 進行免疫沉殿實驗以測定該三種單株抗體在溶液中識別 97062.doc 200526957 及將TGF-βΙ沉澱之能力。自動放射線顯影（aut〇radi〇graph) 顯示抗TGF-β單株抗體2G7、4A11及12H5可將等量之 ^I-rTGFjl免疫沉澱，而對照之單株抗體6G12則為陰 性。免疫沉澱帶具有擬似分子量約14 · 5 kD。使用競爭性抑 制分析（competitive inhibition assay)測定 TGF-βΙ 與各個軍 株抗體間交互作用之親和性。單株抗體2G7及4A11具有同 專之較而親和性，其約為1 · 2 X108 1 /mο 1 e。 亦進行免疫沉澱實驗以測定選出之單株抗體在溶液中識 別及將TGF-P2沉澱之能力。自動放射線顯影顯示，與對 rTGF-β 1相對地’只有抗體2G7將125-TGF-p2免疫沉殿達可 量測之程度。從4A11及12H5與陰性對照組相較顯示極微之 特異性沉澱。此等結果令人驚訝之處在於交叉封阻實驗顯 示4A11及2G7可抑制彼此與人類rTGF-βΙ之結合。參考表i。 表1 結合單 Mab對TGF-β 1封阻單株抗體之交叉封阻百公士 株抗體 2G7 4A11 12H5 456* 2G7 100 74 32 1.9 4A11 96 100 19 1.5 12H5 28 12 100 3.4 *Mab 456為與CD4反應之對照抗體。 將此等數據合起來觀之，顯示被此二種單株抗體識別之 抗原決定部位不同，但不是極為相似性，就是從遠處多少 〜響彼此之結合。從免疫沉殿及交叉封阻實驗可知12H5似 乎係針對不同的抗原決定部位，惟發現其與2G7及4An有 97062.doc -105- 200526957 某些交叉封阻。此種結論亦可被下述中和數據支持。 D·使用rTGF-βΙ之免疫轉溃分析 由於該TGF-β之活性形式為同元二聚體（h〇m〇dimer)，進 行免疫轉潰以測定該單株抗體是否識別此形式。在間接免 疫轉潰中’抗體2G7、4A11及12H5全部與TGF-βΙ二聚體（未 還原）形式反應。2G7產生遠強於4A11或12H5之帶。如同在 免疫沉澱實驗中，對照組抗體6G12為陰性。於用此等單株 抗體之HRP結合物之直接西方轉潰法（westeni b丨ot)中，亦 觀察到此等反應性模式。 _ 總言之’在Balb/c及C3H小鼠中使用各種免疫方法及給藥 時矛王’並使用元全及不元全弗氏佐劑（Freuncj，s adjuvant)， 以圖打破對於YTGF-βΙ之耐性而不成功之後，進行足墊免疫 加上引流（draining)淋巴結之融合之規程（pr〇t〇c〇i)。結果發 現該方法對於此等微弱免疫原可產生具有極高親和性抗體 之快速反應，對照於 Dasch et al.，J. Immunol.，142: 153 6-1541 (1989)之經驗，則是在Balb/c小鼠中使用從純化 _ 牛骨衍生且於弗氏佐劑中之TGF-p2來產生TGF-βΙ-及 TGF-P2-中和性單株抗體。 所有三種抗體在免疫轉潰、ELISA、交又封阻及免疫沉 澱分析中皆可與rTGF_pi結合。兩種此等抗rTGF_p抗體在活 體外中和rTGF-β 1活性，而兩種中只有一種在鼬鼠肺纖維母 ， 細胞分析中同時中和TGF-P2及TGF-P3活性。TGF-βΙ中和抗 體於放射性受體分析中亦封阻放射性碘化rTGF-β 1之結 _ 合’顯示rTGF-βΙ活性在活體外之中和可能係由於受體封 97062.doc -106- 200526957 阻。 實施例2 人型化2G7抗體 首先將鼠類單株抗體2G7之可變區域選殖入能製造小鼠/ 人類嵌合體Fab片段之載體中。使用STRATAGENEtm RNA 萃取套組並依照製造商之規程，將所有RNA從融合瘤細胞 分離。將該可變區域藉由RT-PCR擴增，以凝膠純化，並如 先前所記載插入含有人類κ恆定區域及人類ch1區域之以 pUC119為基礎之質體衍生物中（Carter et al·，Proc· Natl· Acad. Sci. (USA)，89: 4285 (1992)及美國專利第 5,821，337 號）。用得到之質體轉形大腸菌株16C9中，以表現Fab片段。 培養物之生長、蛋白質表現之誘發及Fab片段之純化如先前 所記載（Werther et al·，J. Immunol·，157: 4986-4995 (1996) ; Presta et al·，Cancer Research, 57: 4593-4599 (1997) ) 〇 該嵌合純株之DNA定序以鑑定出CDR殘基（Kabat et al·， supra)。藉由使用募核皆酸點突變，將所有6個此等CDR區 域引進上述質體 VX4(Presta et al·，Cancer Research，57: 4593-4599 (1997))所包含之完全人類框架（VL-/C亞群I及VH 亞群III)中。從生成之「CDR-swap」而來之蛋白質如上述 表現及純化。進行結合研究以比較此兩種型。簡言之，將 NUNC ]^1人又1801〇>1^平板用於50 mM碳酸鹽緩衝液中之 丁0?七細胞外區域斤€0，如賈0 90/14357記載之方式製 造）（1微克/毫升）(pH 9.6)塗佈，並在4°C經過一夜，繼而使 97062.doc -107- 200526957 用 ELISA稀釋液（〇·5% BSA，0.05% POLYSORBATEtm 20， PBS)在室溫封阻1小時。試樣於ELISA稀釋中之連績稀釋物 於培養皿上培育2小時。清洗後，將結合型Fab片段使用生 物素化鼠類抗人類/C抗體（ICN 634771)及結合有鏈黴抗生 物素蛋白（streptavidin)之辣根過氧化酶（Sigma公司）相繼檢 測，並使用3,3’，5,5’-四甲基聯苯胺（Kkkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)做為受質，進行檢測。讀 取在450 nm之吸光度。與嵌合體Fab片段之結合相較， CDR-swap Fab之結合有意義地降低。 為恢復人型化Fab之結合，使用來自CDR-swap之DNA作 為模板構築突變體。使用電腦產生之模型，設計此等突變 體以將人類框架區殘基變為其在該位置之鼠對等殘基，在 該位置之改變可能影響CDR構形或抗體-抗原界面。變異體 如表2所示。（注意所有胺基酸編號如同Kabat et al·，supra. 表示者）。關於序列，請參考圖19-22。 表2 人型化2G7 FR突變醴之命名 變異體編號 與人類抗TGF-β普遍序列（序列編號6) 相較下之框架區（FR)取代 變型3 ArgH71Ala 變型4 ArgH71Ala，AlaH49Gly 變型5 ArgH71Ala，AlaH49Gly，PheH67Ala 變型6 ArgH71Ala，AlaH49Gly，LeuH78Ala 變型709 ArgH71Ala，AlaH49Gly，ValH48Ile 97062.doc -108- 200526957 變型710 ArgH71Ala，AlaH49Gly，IleH69Leu 變型11 ArgH71Ala，AlaH49Gly，AsnH73Lys 變型712 ArgH71Ala，AlaH49Gly，IleH69Leu， AsnH73Lys 變型3及變型4係使用做為中間體以得到具有較後編號之 人型化Fab變型。具有 AlaH49Gly、PheH67Ala 及 ArgH71Ala 之變型5，如同變型709及11，顯示回復原始嵌合體2G7 Fab 片段之結合能力。預期變型710及712具有與嵌合體片段類 | 似之結合能力，然而變型712具有額外的框架突變，由於該 突變可能會提高免疫產生之可能性，因此不宜。額外的之 FR或CDR殘基例如L3、L24、L54及/或H3 5可被修改（例如 如下述取代：ClnL3Met、ArgL24Lys、ArgL54Leu 及 GluH35Ser)。可能會增強安定性之取代為以白胺酸或異白 胺酸取代甲硫胺酸以減少氧化，或者將CDR中之天冬胺酸 改變為其他殘基以減少去醯胺化之可能性。另一方面（或另 外地），該人型化抗體可被親和性成熟化（如上述）以進一部 _ 改善或提升其親和性及/或其他生物活性。 表現全長IgG之質體係藉由將嵌合體2G7 Fab及Fab變型 5、709及11之VL及VH區域分段選殖入上述供進行哺乳類細 胞表現之pRK載體中而建構（Gormanetal·，DNAProt·EIlg· Tech·，2: 3-10 (1990))。簡言之，將各個Fab構造用五及 ’ 消化以切除VL片段，再將其選殖於質體PDR1之 五部位（如圖23)進行完全輕鏈（VL-CL區域）之表 -現。再者，將各個Fab構造用PvuII及Apal消化以切除VH片 ， 97062.doc -109- 200526957 段，再將其選殖於質體pDR2之PvuII/Apal位置（如圖24)進行 完全重鏈（VH-CH1-CH2-CH3區域）之表現。 對各個IgG變異體而言，暫時性轉染（transient transfection)藉由將表現輕鏈之質體及表現重鏈之質體共 轉染入以腺病毒轉形之人類胚胎腎細胞株293中而進行 (Graham et al·，J. Gen· Virol” 36: 59-74 (1977))。簡言之， 將293細胞在轉染前日分開，接種於含血清之培養基中。翌 日，使用 PADVANTAGEtm DNA (Promega公司，Madison， WI)，從輕鏈及重鏈雙螺旋DNA製備磷酸鈣沉澱物，並逐滴 加入平板中。將細胞在37°C培養一夜，並用PBS清洗，及在 無血清培養基中培養4日，此時回收條件培養基。使用以蛋 白質A-SEPHAROSE CL-4BTM珠粒所形成之瓊脂糖為主體 之凝膠過濾基質將抗體從培養基上清液純化，繼而將緩衝 液交換為10 mM琥珀酸鈉，140 mM NaCl，pH 6.0，並使用 CENTRICON-10⑧離心過濾裝置（Amicon公司）濃縮。藉由量 測在280 nm之吸光度或藉由胺基酸之定量分析測定蛋白質 之濃度。 進行對於hu2G7變型5 IgG之另外修改，以釐清哪一個 CDR提供結合，哪一個可被回復為人類種株/C -基因座而不 減失活性，或可安定化抗體。其等如表3所示命名為「重鏈· 輕鏈」，且列出變型5與此等變型間之胺基酸差異。 200526957 表3 人型化2G7 CDR變異體之命名 變異體編號 與人類抗TGF-β變型5比較之CDR取代 變型5 (V5H.V5L) ---- H2N1.V5L -—-- 除CDRH2中之Asn51改變為lie之外，與 變型5相同 V5H.glL2 除CDR L2回復為人類種株/c-基因座 L8/L9/L14/L15之序列：YASSLQS(序列 編號：39)之外，與變型5相同 V5H.glLlgIL2 除將CDR L1回復為人類種株κ-基因座 L8/L9之序列：RASQGISSYLA(序列編 號：37)且將CDR L2回復為人類種株/c-基因座L8/L9/L14/L15之序列：YASSLQS (序列編號：39)之外，與變型5相同 H2NI.glLlgIL2 除將CDR L1回復為人類種株κ-基因座 L8/L9之序列：RASQGISSYLA(序列編 號：37)且將CDR L2回復為人類種株κ-基因座L8/L9/L14/L15之序列：YASSLQS (序列編號：39)，且將CDR H2中之Asn51 改變為Ile5之外，與變型5相同。 97062.doc -111 - 200526957 CDR L1之種株序列名稱為L8/L9，如Cox et al·，Eur· J· Immunol·，24·· 827-836 (1994)之圖 4及 Schable & Zachau， Biol· Chem. Hoppe-Seyler，374: 1001-1022 (1993)之圖 2e 所 記載。CDR L2種株序列則稱為L8/L9/L14/L15(參考Cox et al_，supra及 Schable & Zachau，supra) 〇 將所有CDR回復為人類種株（gl)/c-基因座之序列，只有 上述種株回復體呈現結合能力。具有CDR L2之V5H.glL2 回復為人類種株κ-基因座之序列後，仍與TGF-β及V5H.V5L 結合。此二變型 V5H.glLlgIL2 及 H2NI.glLlgIL2，以及 H2NI.V5L並不結合，嵌合體亦同。 使用小鼠間質細胞增殖分析以測試對照抗體及數個人型 化抗體（V5H.V5L、V5H.gIL2、H2NI.V5L、V5H.gILlgIL2 及H2N1. gILlgIL2)。其規程如下： 第1日：將小鼠間質細胞接種於96孔之培養基（杜白可修 改伊格氏培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)與漢 姆氏（Ham’s)F12培養基之3:1混合物-95%_牛胎兒血清 -5%-14 mM HEPES緩衝液上清部分）中並生長一晚。 第2曰：將具有三種濃度（100 ng、10 ng及1 ng)之TGF-β 及五種不同類型之人型化TGF抗體（20 pg/ml)在無血清之培 養基中稀釋，並加入細胞中。使用小鼠TGF抗體做為對照 (2G7)。 第4日：經48小時培養後，添加20 μΐ反應緩衝液 (CELLTITER 96® AQUEOUS ONE SOLUTION REAGENTtm， 含有四唑鏽鹽化合物3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-(3-羧基曱 97062.doc -112- 200526957 氧苯基）-2-(4-磺酸苯基）-2H-四唑鏽内鹽及電子偶合試劑 (乙硫吩嗓（phenazineethosulfate))(Promega公司，变錄編號 G3580))加入該平板之各孔並將其培養2小時。在490 nm測 量吸光度（OD)。 H2NI_V5L(20 pg/ml)在1 g/ml濃度下完全封阻TGF-β誘發 之細胞抑制，其與使用嵌合體小鼠對照之結果相同。變型 5(V5H.V5L)亦類似對照組封阻細胞抑制。 使用從解聚之瑞士小鼠胚胎（在活體外用三種TGF-β之一 刺激）之纖維母細胞而來之3T3細胞系測試各種人型化抗體 中和各種TGF-β vs 2G7之活性，繼而量測其等之增殖 (proliferation)做為活性指標。人型化抗體H2NI.V5L在活性 方面遠優於對照之2G7抗體。其他受試之人型化抗體， H2NI.gIL2(將CDR L2回復為人類種株/c -基因座之序列）及 V5H.gIL2(將CDR L2回復為人類種株/c -基因座之序列）呈 現相當之活性，其中V5H.gIL2對所有TGF-βΙ至-β3之效力最 差。 總之，人型化抗體 V5H.V5L、V5H.gIL2、H2NI.V5L、 H2NI.gIL2及變型709、710及711為最佳之人型化變型，因 為其與TGF-β結合之能力與嵌合抗體（chimH.chimH，2G7 Fab片段）相當，及/或在活體外能中和TGF-β或封阻TGF-β 誘發之細胞抑制，並在所有受試之人型化抗體中具有最少 之框架改變，此將使病患發生免疫反應之風險減至最低。 再者，H2NI.V5L為特佳抗體，因為其在中和活性方面明顯 較優，且由於在CDR H2中之改變而可能改良安定性。 97062.doc -113- 200526957 實施例3 轉移乳癌之小鼠模型之腫瘤轉移研究 A. 4T1模型 在第一階段實驗中，從來自BALB/cfC3H小鼠之自然發生 乳房腫瘤衍生4T1細胞。將原發之4T1腫瘤細胞注入免疫活 性BALB/c小鼠之乳脂肪墊層。注射後一週，觀察到可感知 之原發腫瘤。該腫瘤自然轉移至肺（約注射後二週）、肝及脾 (約注射後三週）及骨胳（約注射後四至五週之間）。 將該動物用15 mg/kg、25 mg/kg及43 mg/kg等劑量之抗-TGF-β抗體（2G7)治療。此等測試在注射癌細胞〇、1、2曰及 1及2週後進行。如圖1所示，用43 mg/kg劑量治療暫時性地 減少原發性腫瘤之大小，並降低系統性VEGF含量。又發現 該25 mg/kg劑量比15 mg/kg劑量具有更佳之效果，不過25 mg/kg及43 mg/kg劑量所得之結果並無有意義之差異（15 mg/kg及25 mg/kg劑量之數據未顯示）。 如圖2、3及4顯示，用抗-TGF-β抗體之早期治療（注射細 胞5週後）降低繼發性肺腫瘤之組織學記分（受犯肺葉之等級 及數目）、重量及體積。組織學記分係使用以下尺度量測， 其中「％」為包含腫瘤細胞之組織之百分率，且「侵襲」 係指示腫瘤細胞是否在血管及/或淋巴結中被觀察到·· 正常··浸潤極微；1 _33% ;無侵襲性。 等級II ·•中度浸潤；34-66% ;有些侵襲。 等級III :嚴重浸潤；67-100%，·許多侵襲。 圖5藉由比較正常小樑骨及骨轉移之Micr〇cT影像顯示骨 97062.doc -114- 200526957 質破壞。 骨質破壞之定董分析結果如下表4所示。 ___表 4 小樑骨 數目 小樑f 厚度J BV/TV BS/BV 礦物密度 抗 TGF-β -2.8%* Ns -4.8% ns ns 抗體 +細胞 -7.2%* -22.5% -28.2% +28.6% -15.9% 抗-TGF-β +6.5%** + 7.2% + 14.3% -6.6% +6.3% 抗體+細胞 *相對於無腫瘤之對照小鼠 **相對於有腫瘤而用對照抗體治療之小鼠 +細胞=注射腫瘤細胞之小鼠 抗-TGF-β抗體+細胞=注射腫瘤細胞並用抗-TGF-p抗體治 療之細胞 BV=骨體積 TV=總體積 BS=骨表面 表4呈現之結果顯示使用抗-TGF-β抗體（2G7)早期治療 (注射腫瘤細胞5週後）可抑制乳房腫瘤誘發之骨破壞之某此 參數。 B.來自Her2 +乳房腫瘤之細胞 將從搓杜滋美（trastuzumab)-敏感性（F2-1282)及搓杜滋 美-抗性（Fo5)腫瘤細胞株而來之上皮細胞注入免疫活性小 鼠之乳脂肪墊層。分別如圖6與7,及8與9所示，在第〇日（注 97062.doc -115- 200526957 射腫瘤細胞之日）用25 mg/kg劑量之抗-TGF-β抗體（2G7)治 療，增加原發腫瘤大小以及全身性VEGF濃度，此不受腫瘤 之搓杜滋美反應性之影響。 不似4T1上皮細胞，Her2+上皮細胞並不合成高含量 TGF-β ’其生長受TGF-β抑制，且在試管及活體中均生長緩 慢。此等細胞之轉移造成非表面肺腫瘤（未出示影像），其出 現率及生長並不被抗-TGF-β抗體之治療抑制。 C· PymT腫瘤 此係藉由在乳上皮中多瘤中間T致癌蛋白質（PyMT)之表 現所造成之小鼠乳癌模型。將從PyMT腫瘤而來之原發性腫 瘤（2百萬或5百萬細胞）注入受體小鼠之乳脂肪墊層。繼而將 發生之腫瘤移至許多其他小鼠。圖18中顯示之數據指出使 用抗-TGF-β抗體（2G7)減少原發性腫瘤之生長。 實施例4 在轉移黑素瘤之小鼠棋型中腫瘤轉移之研究 本研究使用B16-F10及B16_BL6轉移黑素瘤亞株，以皮下 注射注入免疫活性小鼠，測試抗矸(}17_|3抗體（2G7)對原發性 及繼發性黑素瘤之作用。更特定而言，將€57黑6小鼠從皮 下注射500，000腫瘤細胞。將產生之原發性腫瘤在第14曰移 出’並將該小鼠在約第28日宰殺。抗-TGF-p抗體濃度約為 30mg/kg。已知該B16-F10亞株如果被直接注射注入骨中， 可在骨中繁殖（不似皮下注射之結果）。該B16-BL6亞株轉移 至肺。 如圖10(F10)及圖11(BL6)所示，使用抗-TGFj抗體 97062.doc •116- 200526957 (2G7)(約30 mg/kg)治療增加具有黑素瘤之小氣之存活率。 圖12-15為黑素瘤肺轉移之各種代表圖，包括(：了分析及光 顯影。 如圖16及圖17所示，使用抗-丁印^抗體（2G7)治療有咅義 地減少轉移性肺腫瘤在此模型中之數目及發生率。 注意，其他B16亞株雖然未被用於此實驗，但現已可以_ 得，且可使用於其他實驗中。此等其他亞株包括例如f〇(非 轉移性）、F1(低轉移性，約3〇%)&G3.26(高轉移性）。 貫施例3及4所述之動物模型另外於鑑定新分子是否參與 或可抑制原發性及/或繼發性腫瘤之生長，例如藉由增強血 笞新生及/或基質新生（stromal recruitment)之篩選分析方法 中亦有用，惟此等分析方法之利用並不受所鑑定之分子之 動作機制限定。 雖然以上參照特定實施例說明，然而需了解此並不意指 本發明爻其限制。對熟習本技藝者而言，當可思及在不偏 離本發明之整體概念下進行對所揭示之具體例之各種修 改。因此所有此等修改均涵蓋於本發明之範圍中。 【圖式之簡單說明】 圖1A及1B表示抗-TGF-β抗體在4T1小鼠乳房腺癌模型中 對於原發腫瘤之生長（圖1A)及血漿VEGF(圖1B)濃度之影 響。 〜 圖2表示在4T1小鼠乳房腺癌模型中繼發性肺腫瘤用抗_ TGF-β抗體治療後之組織學計分，並與對照組比較。 圖3表不在4T1小鼠乳房腺癌模型中繼發性肺腫瘤用抗_ 97062.doc -117- 200526957 TGF-β抗體治療後之組織重量，並與對照組比較。 圖4表示在4T1小鼠乳房腺癌模型中繼發性肺腫瘤使用抗_ TGF-β抗體治療後之電腦斷層掃描（CT)數據（深色柱），並與 對照組比較（淺色柱）。 圖5 A及5B表示在4T1小鼠乳房腺癌模型中，正常小樑骨 (圖5A)及原發性腫瘤擴散造成之骨轉移（圖5B)之MicroCT (X射線顯微電腦斷層掃描）圖。 圖6顯示在搓杜滋美（trastuzumab)(商品名：賀癌平 (HERCEPTIN®))敏感性Her2+乳癌（細胞株F2-1282)之小鼠 模型中，抗-TGF-β抗體治療對於原發性腫瘤生長之影響。 圖7顯示在搓杜滋美敏感性Her2 +乳癌（細胞株F2-1282)之 小鼠模型中，抗·TGF-β抗體對於血漿VEGF濃度之影響。 圖8顯示在搓杜滋美抗性Her2 +乳癌（細胞株Fo5)之小鼠模 型中，抗-TGF-β抗體對於原發性腫瘤生長之影響。 圖9顯示在搓杜滋美抗性Her2 +乳癌（細胞株Fo5)之小鼠模 型中，抗-TGF-β抗體對於血漿VEGF濃度之影響。 圖10及11係例示說明在黑素瘤之二小鼠模型（分別為F10 及BL6)中，用抗-TGF-β抗體治療增加存活率。 圖12及13係例示說明在黑素瘤之小鼠模型中，繼發性肺 腫瘤之影像（分別為MicroCT及光照影像）。 圖14及1 5為在黑素瘤之小鼠模型中，繼發性肺腫瘤之影 像（分別為MicroCT及光圖像）。 圖16顯示在黑素瘤之小鼠模型中，用抗_丁〇?_0抗體治療 降低繼發性肺腫瘤之數量。 97062.doc -118- 200526957 圖1 7顯示在黑素瘤之小鼠模型中，用抗_Tgf-P抗體治療 減少肺腫瘤之發生率。 圖18A及18B顯示用抗-TGF-β抗體治療對於pyMT腫瘤之 體積（圖18A)及重量（圖18B)之影響，並與igG對照組比較。 在圖18B中右柱為抗-TGF-β抗體而左柱為igG對照組。 圖19A及19B係顯示鼠單株抗體2G7(分別為序列編號1及 2)之可變輕鏈區域（vL)(圖19A)及可變重鏈區域（VH)(圖 19B)、人型化huxTGFB變體之VL及VH區域（V5H.V5L)(分別 為序列編號3及4)及人類Vl及Vh普遍框架區（hum κ 1，輕鍵 亞群I ; humlll，重鏈亞群111)(分別為序列編號5及6)之胺基 酸序列之對準圖。星號係指示人型化huxTGFB與鼠單株抗 體2G7間之差異，或人型化huxTGFB與人類普變框架區域間 之差異。將互補決定區（complementarity Determining Regions)(CDRs)加底線，實際人類生殖細胞株（germ line) 序列在普遍框架區下方以供比較（序列編號7至11)。 圖20表示編碼各種CDR區（序列編號18-23)之DNA序列 (序列編號12-17)。 圖 21 表示 709.landH.IgGl(序列編號 24)、H2N1.V5L(序列 編號25)、V11H.V11L(序列編號26)、V5H.V5L(序列編號 27)、chimL.chimH(序列編號 28)及 V5H.glL2(序列編號 29) 之胺基酸序列。 圖22表示有及無編碼圖21(序列編號30-35)之序列之信號 序列之核酸序列。 圖23表示表現實施例2所述之免疫球蛋白輕鏈之質體 97062.doc -119- 200526957 pDRl(序列編號45 ; 5391 bp)之序列。pDRl含有編碼不相關 抗體及人型化抗CD3抗體之輕鏈之序列（Shalaby et al·，J· Exp. Med·，175: 217-225 (1992))，其之起始與終止密碼子 均以粗字體及加底線表示。 圖24表示表現實施例2所述之免疫球蛋白重鏈之質體 pDR2(序列編號46; 6135 bp)之序列。PDR2含有編碼不相關 抗體及人型化抗CD3抗體之重鏈之序列（Shalaby et al·， supra)，其之起始與終止密碼子均以粗字體及加底線表示。 97062.doc 120-

Claims (1)

  1. 200526957 十 ι· 2. 3. 4· 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 、申請專利範圍： 一種筛選方法’其包含下列步驟：（1)將複數個受試物質 投予於至少具有一種軟組織或骨轉移之非人類同基因 (syngeneic)免疫活性動物模型中，該動物模型存在或不存 ~ 在原發性腫瘤；（2)測定該受試物質對於軟組織或骨之轉 · 移及原發性腫瘤（如果存在）之生長之影響；及鑑定出 可抑制軟組織或骨轉移之生長，而對原發性腫瘤（如果存 在）之狀態無不利作用之受試物質。 如請求項1之方法，其中該軟組織轉移係出現在選自肺及_ 肝組織所成組群中之組織。 如請求項1或2之方法，其中該骨轉移造成骨破壞。 如請求項1或2之方法，其中該動物模型具有軟組織及骨 之轉移。 如凊求項1或2之方法，其中該動物模型具有原發性腫瘤。 如請求項1或2之方法，其中該原發性腫瘤已藉由外科手 術從動物移除。 如請求項1或2之方法，其中該動物為餐齒類。 _ 如清求項1或2之方法，其中該動物為小鼠（m〇use)或大鼠 (rat)。 如叫求項1或2之方法，其中該動物為小鼠。 如％求項1或2之方法，其中該原發性腫瘤為乳房腫瘤。 如π求項10之方法，其中該乳房腫瘤從來自天然小鼠乳 房腺癌衍生之細胞演變而成。 如叫求項11之方法，其中該細胞為4T1小鼠乳房腺癌細 97062.doc 200526957 胞。 13·如請求項1〇之方法，其中該原發性乳房腫瘤為Her2+，其 係從Her2 +腫瘤產生之上皮細胞或從Her2 +腫瘤之繼代移 植物（passage)演變而成。 14·如請求項13之方法，其中該原發性乳房腫瘤為搓杜滋美 (trastuzumab)抗性。 15·如請求項13之方法，其中該原發性乳房腫瘤為搓杜滋美 反應性。 16.如請求項10之方法，其中該原發性乳房腫瘤為pymT腫 瘤，其係從PymT腫瘤產生之上皮細胞或從PyniT腫瘤之繼 代移植物演變而成。 17·如請求項i或2之方法，其中該原發性乳房腫瘤為黑素瘤。 18·如請求項17之方法，其中該黑素瘤為b16亞株。 19·如請求項！或2之方法，其中該被鑑定之受試物質為分泌 型分子之拮抗劑。 20.如請求項1或2之方法，其中該被鑑定之受試物質為轉形 生長因子-P(TGF-P)拮抗劑。 2 1.如明求項20之方法，其中該TGF-β拮抗劑為與特異 性結合之抗體。 22·如請求項20之方法，其中該TGF-β拮抗劑抑制骨轉移。 23·如請求項20之方法，其中該TGF_w#抗劑減少骨破壞或骨 損失。 24·如請求項1之方法，其中投予於該動物之受試物質包括已 知之化學治療劑或細胞毒劑。 97062.doc 200526957 25. 如請求項24之方法，其中該化學治療劑或細胞毒劑為紫 杉雙萜類（taxoid)。 26. 如請求項24或25之方法，其中對該動物投予兩種受試物 質，一種為TGF-β拮抗劑，另一種為化學治療劑或細胞毒 劑，且測定該兩種受試物質對於軟組織或骨之轉移及原 發性腫瘤之生長（如果原發性腫瘤存在）之合併影響。 27·如請求項26之方法，其中該TGF-β拮抗劑為與TGF-β特異 性結合之抗體，且該化學治療劑或細胞毒劑為紫杉雙萜 類（taxoid)。 28.如請求項1或2之方法，其中該動物另外暴露於有效劑量 之放射線治療。 29· —種在活體外測定被診斷為罹患癌症之哺乳類病患是否 可從使用TGF-β拮抗劑治療獲益之方法，其包含： (a) 測試從病患取得之癌細胞對TGF-β之生長抑制作用之 敏感性； (b) 製作從病患而來之癌細胞之基因表現圖譜，並與從對 使用TGF-β拮抗劑治療有反應性之動物模型而來之癌 細胞之基因表現圖譜加以比較；以及 (0如果得自病患之癌細胞對TGF-β之生長抑制作用不敏 感’並且所具有之基因表現圖譜與該從對該治療有反 應性之動物模型而來之癌細胞之基因表現圖譜類 似’則將該病患鑑定為可從使用TGF-β拮抗劑治療獲 益之病患。 30·如請求項29之方法，其中該癌症為乳癌。 97062.doc 200526957 3 1 ·如请求項29或30之方法，其中該癌症為轉移性乳癌。 32. 如請求項3G之方法，其中另包含測定得自該病患之乳癌 細胞之Her2狀態之步驟，若該細胞為Her2陰性，則將該 病患鑑定為可能會對TGF_p拮抗劑治療有反應者。 33. 如請求項29或30之方法，其中該病患為人類。 34. 如請求項29或30之方法，其中該TGF-p拮抗劑為與TGF_p 特異性結合之抗體。 35. 如請求項29或30之方法，其中該病患具有軟組織轉移。 36·如請求項35之方法，其中該軟組織轉移包括肺或肝轉移 中之至少一種。 37.如請求項35或36之方法，其中該病患另外患有骨轉移。 3 8.如請求項29或30之方法，其中該病患呈現骨破壞或骨損 失。 39. —種治療哺乳類病患中與腫瘤轉移相關之骨破壞或骨損 失之醫藥組合物，其包含有效量之TGF-β拮抗劑。 40·如請求項39之醫藥組合物，其中該TGF_p拮抗劑為與 TGF-β特異性結合之抗體。 41 · 一種治療被診斷為癌症之哺乳類病患之醫藥組合，其包 含有效量之TGF-β拮抗劑與化學治療劑或細胞毒劑之組 合，其中該組合之有效量低於該TGF-β拮抗劑與化學治療 劑或細胞毒劑單獨投予（為單劑）時有效量之總和。 42.如請求項41之醫藥組合，其中該癌症為乳癌或結腸直腸 癌。 43·如請求項41或42之醫藥組合，其中該癌症為轉移性乳癌。 97062.doc 200526957 44.如請求項41或42之醫藥組合’其中該化學治療劑為紫杉 雙萜類（taxoid)。 45 ·如請求項41或42之醫藥組合，其中該病患另外使用有效 量之放射線治療劑治療。 46· —種治療被診斷為癌症之哺乳類病患之醫藥組合，其包 含有效量之TGF-β拮抗劑與放射線治療之組合，其中該組 合之有效量低於該TGF_β拮抗劑與放射線治療單獨投予 (為單劑）時有效量之總和。 47·如請求項46之醫藥組合，其中該癌症為乳癌。 48·如請求項46之醫藥組合，其中該癌症為結腸直腸癌。 49·如請求項46至48中任何一項之醫藥組合，其包含對病患 投予抗血管新生劑。 5〇.如請求項49之醫藥組合，其中該抗企管新生劑為與血管 内皮生長因子特異性結合之抗體。 如凊求項46至48中任何一項之醫藥組合， 拮抗劑為與TGF-β特異性結合之抗體。 一種治療被診斷為癌症之哺乳類病患之 之醫藥組合，
    内皮生長因子特異性結合之抗體。 其中該TGF-β拮抗劑為與 54.如請求項52或53之醫藥組合，其 TGF-β特異性結合之抗體。 其另包含對病患投予有效 55.如請求項52或53之醫藥組合，其 量之化學治療劑或細胞毒劑。 97062.doc 200526957 5 6·如請求項52或53之醫藥組合，其中該組合之有效量低於 該TGF-β拮抗劑與該血管新生劑單獨投予（為單劑）時有 效量之總和。 57. —種治療被5乡斷為羅患癌症且預先測知對丁结抗劑 無反應或反應差之哺乳類病患之醫藥組合，其包含有效 量之TGF-β拮抗劑與化學治療劑或細胞毒劑或放射線治 療之組合。 5 8·如請求項57之醫藥組合，其中該癌症為乳癌。 59·如請求項57或58之醫藥組合，其中該化學治療劑為紫杉 雙萜類。 60. —種套組，其包含含有與血管内皮生長因子特異性結合 之抗體之容器，及含有與TGF-β特異性結合之抗體之容 菇’以及有關以有效量合用此二抗體以治療哺乳類病患 之癌症之指南。 97062.doc
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