KR20230150779A - 중쇄-단독 항체 - Google Patents
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Abstract
내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자좌 내에 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 도입함으로써 B 세포가 중쇄-단독 항체 (HCAb)의 다양한 레퍼토리를 발현하는 마우스를 생산하는 방법으로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 방법.
Description
본 발명의 분야
본 발명은 중쇄-단독 항체(heavy chain-only antibody) (HCAb) 작제물(construct), HCAb를 발현하는 트랜스제닉 마우스(transgenic mouse), 및 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 이를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경
항체는 (i) 다양한 분자 형태의 항원을 표적화할 수 있는 정교한 결합 특성을 나타내고, (ii) 치료받은 인간 및 동물에서 우수한 내약성을 갖도록 하는 바람직한 약동학적 성질을 가진 생리학적 분자이고, (iii) 자연적으로 감염체(infectious agent)를 막는 강력한 면역학적 특성과 연관이 있기 때문에 중요한 생물학적 약제로 부상하였다. 추가로, 실험실 동물로부터 항체를 신속하게 단리시키기 위한 확립된 기술이 존재하며, 이는 신체에 본래 존재하지 않는 거의 모든 외부 물질에 대한 특정 항체 반응을 쉽게 시작할 수 있다.
가장 기본적인 형태의 항체는 각각 동일한 경쇄 (L)와 쌍을 형성하는 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된다. H 및 L 쇄, 둘 모두의 N-말단은 함께 쌍형성한 H-L 쇄에 고유한 항원 결합 특이성을 제공하는 가변 도메인(domain) (각각 VH 및 VL)으로 구성된다. 항체 VH 및 VL 도메인을 코딩하는(encoding) 엑손은 생식계열 DNA에 존재하지 않는다. 대신, 각 VH 엑손은 H 쇄 유전자좌(locus) (Igh)에 존재하는 무작위로 선택된 V, D, 및 J 유전자 세그먼트(segment)의 재조합에 의해 생성되고; 유사하게, 개별 VL 엑손은 경쇄 유전자좌 (Igl) 중 무작위로 선택된 V 및 J 유전자 세그먼트의 염색체 재배열에 의해 생산된다 (마우스 Igh 유전자좌, Igl 카파 유전자좌 (Igk 또는 Iκ) 및 Ig 람다 유전자좌 (Igl 또는 Igλ)의 개략도, 도 1 참조) (문헌 [Tonegawa, Nature, 302:575, 1983; Bassing, et al., Cell, 109 Suppl:S45, 2002]). 마우스 게놈은 H 쇄를 발현할 수 있는 2개의 대립유전자 (각 모체로부터 한 대립유전자), 카파 (κ) L 쇄를 발현할 수 있는 2개의 대립유전자, 및 람다 (λ) L 쇄를 발현할 수 있는 2개의 대립유전자를 함유한다. H 쇄 유전자좌에는 다중 V, D, 및 J 유전자 세그먼트가 존재할 뿐만 아니라, 두 L 쇄 유전자좌에 모두 다중 V 및 J 유전자가 존재한다. 각 면역글로불린(immunoglobulin) (Ig) 유전자좌에서 J 유전자의 하류에는 항체의 불변 영역 (C)을 코딩하는 하나 이상의 엑손이 존재한다. 중쇄 유전자좌에 상이한 항체 클래스 (이소타입)의 발현을 위한 엑손 또한 존재한다. 마우스에서, 코딩된 이소타입은 IgM, IgD, IgG1, IgG2a/c, IgG2b, IgG3, IgE, 및 IgA이고; 인간에서는 IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA1, 및 IgA2이다.
태아 간 및 성인 골수에서 B 세포 발생 동안, 유전자 재배열은 H 쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트를 포함하는 2개의 상동성 염색체 중 하나에서 먼저 발생한다. 이어서, 프리-B 세포에서 생성된 VH 엑손은 RNA 수준에서 μH 쇄의 불변 영역을 코딩하는 엑손으로 스플라이싱된다. 프리-B 세포에 의해 합성된 대부분의 μH 쇄는 소포체 (ER)에 남아 있고, μH 쇄 부분적으로 언폴딩된 CH1 도메인과 상주하는 ER 샤페론 BiP 사이의 비공유적인 상호작용에 기인하여 결국에는 분해된다 (문헌 [Haas and Wabl, Nature, 306:387-9, 1983; Bole, et al., J Cell Biol. 102:1558, 1986]). 그러나, μ 쇄의 작은 분획은 불변 λ5 및 V프리B 단백질로 구성된 대리 경쇄 복합체와 회합하여 BiP를 대체하고, Igα/β 신호전달 분자와 함께 μH 쇄/λ5/V프리B 복합체가 프리B 세포 수용체 (프리BCR)로서 ER을 빠져나가게 하고, 분비 경로를 통해 원형질막으로 이동할 수 있게 한다 (문헌 [Ubelhart, et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393:3, 2016]).
이어서, VJ 재배열은 기능성 L 쇄가 생산될 때까지 한 번에 하나의 L 쇄 대립유전자에서 발생하고, 그 후, L 쇄 폴리펩티드는 BiP를 완전히 대체하고, μH 쇄와 회합하여 항원에 대한 완전한 기능성 B 세포 수용체 (BCR)를 형성하고, 이로써, 미성숙한 B 세포가 형성된다.
불완전하게 어셈블리된 Ig 분자의 세포 표면 발현 또는 분비를 막는 ER 품질 제어 메커니즘은 매우 엄격한 바, 이에 예컨대, HL, HHL 또는 HH와 같은 분자는 일반적으로 ER에 유지되고, 어셈블리에 의해 완전한 H2L2 구조로 구조되지 않는다면 분해된다. (이 시스템은 주로 Ig H 쇄의 보유에 초점을 맞추고 있는 바; 이에, 유리 L 쇄가 때때로 분비될 수 있다). 그러나, 유리 모노클로날 H 쇄는 중쇄 질환 (HCD)으로 불리는 희귀 B 세포 증식성 장애에서 분비될 수 있다는 것이 수십 년 동안 알려져 왔다 (문헌 [Franklin, et al., Am. J. Med., 37:332, 1964]). HCD 중 H 쇄는 말단절단(truncated)되고, 후속 구조 연구에서는 CH1 도메인이 거의 항상 결실된 것으로 나타났다 ((문헌 [Corcos, et al., Blood, 117:6991, 2011]). 기계적으로, CH1 결실은 BiP와의 억제 상호작용으로부터 H 쇄를 자유롭게 하여 이의 분비를 허용하고, 또한 L 쇄와의 이황화결합 매개 공유 결합을 막음에 따라, 이로써, HCD 단백질은 HH 이량체이다. 중쇄-단독 Ab (HCAb)는 또한 비질환 맥락에서도 살펴볼 수 있다. i) 정상 낙타의 혈청 IgG 중 대략 75%는 CH1 도메인이 결여되어 있고, VL 도메인과의 효과적인 회합을 방지하는 구조적으로 변경된 VH 도메인을 갖는 HCAb로 구성되어 있다 (문헌 [de los Rios, et al., Cur. Opin. Struct. Biol., 33:27, 2015]). ii) κ 및 λ L 쇄 유전자 유전자좌, 둘 모두가 불활성화된 마우스는 혈청 IgG를 여전히 생산하지만, 이러한 항체 생산을 위해서는 B 세포 DNA에서 CH1 도메인 코딩 엑손의 결실을 초래하는 클래스 스위치 재조합 (CSR) 오류가 요구된다 (문헌 [Zou, et al., J. Exp. Med., 204:3271, 2007]).
HCAb는 매우 안정적이고, 기존의 면역글로불린보다 작기 때문에 치료제로서 관심의 대상이 된다. VL 항원 결합부와는 상관없이, 분자의 VH 항원 결합부는 효소 활성 부위 및 다르게는 종래 Ab는 접근이 불가능한 바이러스 및 G-커플링된 단백질 수용체 상의 에피토프를 포함하는 단백질 구조의 포켓 내의 에피토프를 인식할 수 있다. 예컨대, 내인성 VH 유전자가 낙타 VH 유전자로 대체되고, CH1-코딩 엑손이 결실된 마우스로부터 유래된 낙타 기반 HCAb는 상기 항체의 잠재적 공급원이다. 그러나, 이들은 낙타 VH 도메인이 치료제로 사용될 수 있는 인간 및 다른 동물에서 면역원성을 띤다는 단점이 있다. 내인성 VH 유전자가 이의 인간 대응물(counterpart)에 의해 대체되고, κ 및 λ L 쇄 유전자좌의 불활성화와 함께 조합되어 있는 마우스가 존재하며, 이는 HCAb의 공급원이 될 수 있다. 그러나, 상기와 같은 항체의 생산은 면역 반응 동안 비교적 드문 CSR 오류에 의존하는 바, 효율적이지 않다.
쌍형성된 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)가 있는 종래 항체의 결합 부위의 크기는 너무 커서 표적 에피토프의 홈 또는 틈새에 피팅될 수 없다. HCAb의 결합 부위의 너비 감소는 예컨대, 효소의 활성 부위와 같은 "난해한" 에피토프에 접근하는 데 도움이 될 수 있다. 또 다른 용도에서, HCAb는 이중특이적(bispecific) 항체의 생산을 촉진시킨다. L 쇄의 부재는 "L-쇄 스크램블링"을 막음에 따라 특이성은 상실된다. L 쇄 없이 H 쇄로 구성된 (인간) 면역글로불린을 생산하는 트랜스제닉 마우스는 원하는 항원 특이성을 가진 상기 항체를 발견하는 데 유용하다.
그러나, 상기 기술된 바와 같이, 경쇄 부재하에서, 천연 중쇄는 형질 세포(plasma cell)에 의해 분비되지 않는다. 이는 H 쇄의 CH1 도메인이 샤페론 단백질 BiP에 의해 결합되어 소포체의 내강에 그대로 남아 있게 되기 때문이다. 예컨대, 중쇄 질환에서 또는 조작에 의한 CH1 결실을 통해 H 쇄는 이황화 연결된 이량체로서 분비될 수 있다.
이소타입 스위칭, 이소타입 교환 또는 클래스-스위치 재조합 (CSR)으로도 알려진 면역글로불린 클래스 스위칭은 B 세포가 면역글로불린 생산을 한 이소타입에서 또 다른 이소타입으로, 예컨대, 이소타입 IgM에서 이소타입 IgG로 바꾸는 생물학적 메커니즘이다. 이 프로세스 동안, 항체 중쇄의 불변 영역 부분은 변화하지만, 중쇄의 가변 영역은 동일하게 유지된다. 가변 영역이 변경되지 않기 때문에, 클래스 스위칭은 항원 특이성에는 영향을 미치지 않는다. 대신, 항체는 동일한 항원에 대한 친화성은 유지하지만, 이의 Fc 영역을 통해 상이한 이펙터 분자와 상호작용할 수 있다.
클래스 스위칭은 이의 막 결합 항체 분자 (B 세포 수용체, BCR)를 통해 성숙한 B 세포가 활성화된 후에 발생하고, 이로써, 상이한 클래스의 항체가 생성되는데, 이들은 모두 V(D)J 재조합 프로세스의 결과로서 미성숙한 B 세포에 의해 발현된 원래의 항체와 동일한 가변 도메인을 갖지만, 이의 중쇄에는 뚜렷이 다른 불변 도메인을 가지고 있다.
나이브() 야생형 성숙한 B 세포는 IgM (Cμ)과 IgD (Cδ), 둘 모두 생산하는데, 이는 야생형 면역글로불린 유전자좌에서 처음의 두 중쇄 세그먼트이다. 항원에 의해 활성화된 후, 상기 B 세포는 증식한다. 상기 활성화된 B 세포가 CD40 및 사이토카인 수용체 (둘 모두 T 헬퍼 세포에 의해 조정)를 통해 특정 신호전달 분자를 만나면, 항체 클래스 스위칭을 거쳐 IgG, IgA 또는 IgE 항체를 생산한다. 클래스 스위칭 동안, 면역글로불린 중쇄의 불변 영역은 변경되지만, 가변 영역, 따라서, 항원 특이성은 동일하게 유지된다. 이를 통해 동일의 활성화된 B 세포로부터의 상이한 딸 세포가 상이한 이소타입 또는 서브타입 (예컨대, IgG1, IgG2 등)의 항체를 생산할 수 있다.
세포 배양물에서의 HCAb 생산을 위해 다양한 면역글로불린 변형을 구상하고, 조작할 수 있지만, 중쇄-단독 (HCO) 트랜스제닉 마우스의 경우, B 림프구 발생을 염두에 두어야 한다. B 세포는 조혈 줄기 세포의 프로-B, 프리-B 및 미성숙한 B 세포로의 분화에 의해 매일 생성된다. 변형된 면역글로불린이 이러한 분화 순서를 지원하지 않는다면, B 세포는 생성되지 않을 것이다.
라마, 트랜스제닉 마우스 및 래트에서의 HCO 항체에 대한 보고는 H 쇄가 L 쇄와 쌍을 형성하지 않는 B 세포가 발생할 수 있다는 것을 시사하였다. 그러나, CH1은 결실되어야 하고, 라마에서, L 쇄가 없는 H 쇄는 정규 VH 영역과 다른 VH 구조를 갖는다. 후자의 사실은 모든 인간 VH 도메인이 HCO B 세포 발생을 지원하는 것은 아니라는 것을 시사하였다.
WO2019018770 A1에는 VH 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인 CL 및 CH1로 구성된 항원 결합부를 포함하는 단일 쇄 VH 항체가 개시되어 있다.
WO2014/141192A2에는 중쇄 단독 항체 및 이를 생산하는 트랜스제닉 비인간 동물 생성이 개시되어 있다. 상기 항체에는 CH1 도메인이 결여되어 있다.
US8754287B2에는 CH1 도메인이 결여되어 있는 중쇄 항체를 생산하는 마우스, 및 CH1 도메인을 코딩하는 핵산을 결실시키는 생식계열 변형을 포함하는 트랜스제닉 마우스가 개시되어 있다.
VJCL 녹아웃 닭에서 회합된 경쇄가 없는 중쇄-단독 항체의 발현은 문헌 [Schusser et al. (Eur. J. Immunol., 46:2137, 2016)]에 기술되어 있다.
문헌 [Klein et al. (Biochemistry, 18:1473, 1979)]에는 경쇄의 단리된 가변 및 불변 도메인과 면역글로불린 G의 Fd' 단편의 상호작용이 기술되어 있다.
WO2011/072204A1에는 기능성 Cμ 세그먼트를 포함하는 트랜스제닉 마우스가 개시되어 있다. 결과적으로, 정규 IgM을 항원 수용체로 포함하는 성숙한 B 세포가 정상적으로 발생한다. 그러나, 게놈의 하류 Cγ 세그먼트에는 CH1 도메인이 결여되어 있다. 면역 반응 동안, 항체 클래스가 (원하는) γ 쇄로 스위치될 때, 상기 쇄는 L 쇄와 쌍을 형성할 수 없다. H 쇄 클래스 스위치, VH는 유지되는 반면, CH는 교환된다. 이는 두 가지 효과를 가질 것이다: (i) 특이성이 H와 L 쇄의 조합에 의해 정의된 항체를 가진 세포는 더 이상 자극을 받지 않고, 사멸될 것이다. 또한, (ii) 특이성이 주로 H 쇄에 의해 정의된 세포는 쌍을 형성하지 않은 VH가 구조적으로 생존할 수 없기 때문에 사멸할 수 있다. 따라서, 이 마우스에서, VH 선택은 즉, 면역 반응 동안 "백로딩된다."
WO2007096779A2에는 트랜스제닉 마우스가 1 초과의 이종성 VH 중쇄 유전자좌를 포함하고, 여기서, 각각의 VH 중쇄 유전자좌는 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트, 및 발현시, CH1 도메인을 포함하지 않는 중쇄 불변 영역을 코딩하는 유전자 세그먼트를 포함하는 것인, 클래스 특이적 중쇄-단독 항체 생산을 위한 트랜스제닉 마우스의 용도가 기술되어 있다.
WO2009013620A2에는 인간 V 세그먼트를 마우스 중쇄 유전자좌 내로 도입함으로써 완전 인간, 가용성 VH 도메인을 제조하는 것으로, 여기서, 마우스 V, D 및 J 유전자 세그먼트는 인간 기원의 V, D 및 J 세그먼트에 의해 대체되고, 면역글로불린 중쇄 이펙터 불변 영역은 CH1이 결여된 면역글로불린 중쇄 이펙터 불변 영역에 의해 대체되는 것이 기술되어 있다.
WO2015143414A2에는 중쇄 불변 영역 유전자 서열의 면역글로불린 불변 영역 CH1 유전자에서의 결실, 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 세그먼트에 의한 하나 또는 모든 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 세그먼트의 교체를 포함하는 마우스가 기술되어 있다.
WO2019184014A1에는 내인성 Cμ 유전자 세그먼트 대신 내인성 Cμ 유전자 세그먼트가 도입되어 있고, CH1 도메인의 결실을 포함하는 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스가 기술되어 있다 (도 1 참조). EP2411408B1 및 US9353179B2에는 무작위로 통합된 VH 및 VHH 유전자좌를 포함하는 트랜스제닉 마우스가 기술되어 있다. 비생리학적 수준의 발현 및 삽입된 트랜스진의 불안정성 (기능 상실 침묵화)이라는 무작위로 통합된 면역글로불린 (및 다른) 유전자좌의 문제는 지난 세기의 80년대 이후 문서화되었다.
HCAb의 안정적인 제조를 위한 효율적이고, 비용면에서 효과적인 방법이 요구되고 있다. 더욱 특히, 항원 특이적 HCAb를 생산할 수 있는 트랜스제닉 비인간 동물이 요구되고 있다.
본 발명의 요약
본 요약은 하기 상세한 설명에서 추가로 설명되는 간략화된 형태로 개념의 선택을 소개하기 위해 제공된 것이다. 본 요약은 청구된 주제의 중요하거나, 또는 본질적인 특징을 확인하기 위한 것도 아니고, 청구된 주제의 범주를 제한하기 위해 사용하고자 하는 것도 아니다. 청구된 주제의 다른 특징, 세부 사항, 유용성 및 장점은 첨부된 도면에 예시되고, 첨부된 청구범위에 정의된 측면을 포함하여, 하기 서면 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
본 발명의 목적은 트랜스제닉 동물에서, 또는 시험관내 세포 배양물에서 중쇄-단독 항체 (HCAb) 및 다양한 상기 HCAb를 발현하는 B 세포 레퍼토리(repertorie)의 효율적이고, 용이한 제조를 위한 수단, 작제물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 목적은 본원에 추가로 기술된 바와 같이 본 청구범위의 주제에 의해 해결된다.
본 발명에 따라, 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자좌 내에 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 도입함으로써 B 세포가 중쇄-단독 항체 (HCAb)의 다양한 레퍼토리를 발현하는 마우스를 제조하는 방법으로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 마우스를 항원으로 면역화시키면, 마우스는 다양한 항원 특이적 HCAb를 분비하는 B 세포 레퍼토리를 발현한다. 구체적으로, 마우스를 항원으로 면역화시키면, 항원 특이적 B 세포는 항원 특이적 HCAb를 분비하는 형질 세포로 분화된다.
구체적으로, 항원으로 면역화시키면, 마우스는 항원 특이적 B 세포를 활성화시키고, 다양한 항원 특이적 HCAb를 분비하는 형질세포(plasmacyte)로의 이의 분화를 유도한다.
구체적으로, 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자좌 내에 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 도입함으로써, 항원으로 면역화시키면, 다양한 항원 특이적 HCAb를 분비하는 B 세포 레퍼토리를 발현하는 마우스를 제조하는 방법으로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
야생형 B 세포에서, IgM 및 IgD는 공동 발현되지만, 이는 말초 (비장 등) 중 성숙한 B 세포에서 발생하지만, 골수 중의 발생 B 세포에서는 일어나지 않는다. 불활성화된 Cμ 유전자 세그먼트의 하류에 위치하는 Cγ 유전자 세그먼트는 B 세포 발달 동안 발현되지 않을 수 있다. B 세포 발생을 위해서는 Ig 중쇄가 필요하기 때문에, 불활성화된 Cμ 유전자 세그먼트 하류에 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스는 B 세포를 전혀 만들지 못할 수 있다. Cμ 유전자 세그먼트 대신 Cγ 유전자 세그먼트가 Ig 중쇄 유전자좌에 도입되면, 소포체 (ER) 중에 미스폴딩된 델타 중쇄가 존재할 수 있기 때문에, 경쇄에 의존하는 IgD의 공동 발현은 B 세포에 해로울 수 있다. 이는 ER 스트레스로 이어져 단백질 항상성 복원을 목표로 하는 언폴딩된 단백질 반응 (UPR)을 활성화시킬 수 있고, 복원되지 않으면, B 세포는 아폽토시스(apoptosis) 세포 사멸을 겪게 될 것이다. 구체적으로, Cγ 유전자 세그먼트를 Cμ 유전자 세그먼트의 내인성 위치 상류에 위치화시킴으로써, 프리-B 세포는 Cγ 함유 프리BCR을 발현할 것이다. 이는 경쇄 없이 안정적으로 발현될 수 있는 VH-Cγ 중쇄에 대한 양성 선택이 있을 것이라는 상당한 이점을 갖는다. 경쇄와의 이량체화 없이는 불안정한 버전의 VH-Cγ 중쇄를 발현하는 프리-B 세포는 프리BCR을 형성할 수 없으므로 선택되어 IgG 타입의 다양한 HCAb를 발현하는 개선된 B 세포 레퍼토리를 제공한다.
구체적으로, 마우스는 상기 B 세포 레퍼토리를 생산할 수 있는 상기 재조합 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 세포를 포함한다.
구체적으로, 적어도 결실된 CH1 도메인의 상기 부분은 CH1 도메인의 전부 또는 일부, 특히, CH1 도메인을 코딩하는 전체 뉴클레오티드 서열의 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 100% 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 구체적으로, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부의 결실을 포함하며, 이 부분은 샤페론-결합 도메인(chaperone-binding domain)이고, 구체적으로, 상기 부분은 BiP에 의해 결합된 하나 이상의 아미노산이다.
한 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 HCAb에는 CH1 도메인이 결여되어 있고, 특히, IgG CH1 도메인이 결여되어 있다. 비록 마우스가 CH1 도메인의 일부를 발현할 수 있지만, 한 구체적인 실시양태에 따라, 그 일부는 CL 도메인과 쌍을 형성할 수 있는 기능성 CH1 도메인을 포함하지 않는다.
추가의 구체적인 실시양태에 따라, 본원에 기술된 HCAb는 샤페론-결합 도메인, 구체적으로, BiP 샤페론-결합 도메인이 결여된 CH1 도메인을 포함한다. 구체적으로, 마우스는 적어도 CH1 도메인의 상기 샤페론-결합 도메인이 결실된 HCAb를 발현하도록 조작된다.
본원에 기술된 마우스의 세포에 의해 분비된 HCAb는 가용성이거나, 또는 막 결합일 수 있다. CH1 도메인의 전체 또는 적어도 일부를 결실시킴으로써, 발현된 HCAb는 전형적으로 중쇄 단독 항체 작제물의 세포 표면 발현 또는 분비를 막는 ER 품질 제어 메커니즘에 의해 소포체 (ER)에 유지되지 않는다. 구체적으로, ER 샤페론 BiP는 ER에 본 발명의 HCAb를 보유하지 않는다.
구체적으로, Cγ 유전자 세그먼트는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중의 Eμ 주요 인트론 인핸서(major intron enhancer)의 하류에, 바람직하게, 구체적으로, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 J 코딩 서열(coding sequence) 하류에 위치하는, 서열 번호: 7을 포함하는 내인성 마우스 Eμ 주요 인트론 인핸서의 하류에 위치한다.
본원에 기술된 바와 같이, Cγ 유전자 세그먼트는 돌연변이화되거나, 돌연변이화될 수 없는, Cμ 유전자 세그먼트 상류에 위치할 수 있다. 구체적으로, Cγ 유전자 세그먼트는 Cμ 유전자 세그먼트가 야생형 중쇄 유전자좌 중에 위치하는 위치의 상류에 위치한다. 구체적으로, Cγ 유전자 세그먼트는 본원에 기술된 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트의 상류 및 JH 유전자 세그먼트의 하류에 있다.
나이브 야생형 성숙한 B 세포는 IgM (Cμ)과 IgD (Cδ), 둘 모두 생산하는데, 이는 야생형 면역글로불린 유전자좌에서 처음의 두 중쇄 세그먼트이다. 본원에 기술된 바와 같은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 Cγ 유전자 세그먼트를 위치화함으로써, 본원에 기술된 마우스의 나이브 성숙한 B 세포는 IgG 타입의 HCAb를 생산하고, 항원에 의해 활성화된 후, 상기 B 세포는 증식한다. 놀랍게도, 본원에 기술된 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 B 세포는 정상적으로 발생하고, IgG 타입의 막 결합 또는 가용성 HCAb를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 IgG 타입의 다양한 HCAb를 발현하는 개선된 B 세포 레퍼토리를 제공한다.
구체적으로, IgG 타입의 HCAb는 IgG 프레임워크(framework), 특히, 인간 또는 뮤린(murine) 프레임워크를 포함하는 VH 도메인, 및/또는 IgG 항체의 것인 항체 불변 도메인을 특징으로 한다. 구체적으로, IgG 타입의 HCAb는 임의의 IgG 서브타입의 것, 예컨대, 마우스 IgG1, IgG2a/c, IgG2b, 또는 IgG3 서브타입 중 임의의 것, 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입 중 임의의 것이다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에, 및 Cγ 유전자 세그먼트가 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트의 하류에 위치하는 야생형 세포에서 이의 각 위치와 상이한 위치에 통합된다.
한 구체적인 실시양태에서, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 내인성 핵산 서열로부터 유래되고, 구체적으로, 마우스 Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실에 의해 변형되고, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내에서, 자연적으로는 발견되지 않는 위치에, 즉, 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 도입된다.
상이한 구체적인 측면에 따라, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 예컨대, 합성 핵산과 같은 외인성 핵산이고, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 통합되어 있다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 포유동물 기원의 것이고, 바람직하게, 설치류 기원의 것이고, 가장 바람직하게, 마우스 기원의 것이다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 인간 기원의 것이다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 트랜스제닉 Cγ1, Cγ2a/c, Cγ2b, 또는 Cγ3 유전자 세그먼트를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 트랜스제닉 Cγ1, Cγ2, Cγ3, 또는 Cγ4 유전자 세그먼트를 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 트랜스제닉 마우스 또는 인간 Cγ1 유전자 세그먼트이다.
구체적으로, 본원에 기술된 마우스의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 구체적으로, 마우스 게놈 내의 내인성 위치의 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌이다.
본원에 제공된 방법의 구체적인 측면에 따라, 본원에 기술된 마우스 또는 본원에 기술된 B 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중의 Cμ 유전자 세그먼트는 불활성이다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 기능 상실 돌연변이(loss-of-function)에 의해, 예컨대, 정지 코돈(stop codon), 또는 Cμ 유전자 세그먼트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부의 결실을 도입함으로써 불활성이다. 바람직하게, Cμ 유전자 세그먼트는 완전히 결실되지 않고, 오직 이의 일부만이 결실된다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 CH1, CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인의 결실에 의해 불활성이다.
특정 경우에서, VDJ 엑손은 유전자좌가 전사될 때, Cμ 유전자 세그먼트로 스플라이싱된다. 이로써, 경쇄에 의존하는 μ 중쇄가 생성될 수 있다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트를 불활성화함으로써, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리의 품질은 추가로 개선된다.
구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 내인성 Cμ 유전자 세그먼트를 코딩하는 전체 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 서열의 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 중 적어도 어느 하나인 이의 일부의 결실에 의해 불활성이다.
구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 바람직하게, 이의 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 어느 하나 또는 그들 모두에 기능 상실 돌연변이, 결실 또는 불활성화 돌연변이, 바람직하게, 정지 코돈의 도입을 포함한다. 바람직하게, Cμ 유전자 세그먼트는 CH1, CH2 및 CH3 도메인 중 정지 코돈을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 구체적인 측면에 따라, 본원에 기술된 마우스 또는 본원에 기술된 B 세포의 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 μ 스위치 (S) 영역은 불활성이다. 구체적으로, 본원에 기술된 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 전형적으로 내인성 Igh 유전자좌에 존재하는 μ 스위치 (S) 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 기능 상실 돌연변이, 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 구체적으로, 기능성 S 영역을 포함하지 않는 Igh 유전자좌에서는 이소타입 스위칭이 수행되지 않을 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 B 세포에서 이소타입 스위칭이 수행된다면, 경쇄에 의존하는 중쇄 이소타입 IgG, IgA 또는 IgE가 생성될 수 있다. 이를 통해 본원에 기술된 바와 같은 B 세포는 사멸될 수 있다. 따라서, 이소타입 스위칭을 방지함으로써, B 세포 레퍼토리는 추가로 개선될 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 추가 중쇄 이소타입의 CH 도메인은 바람직하게, 기능 상실 돌연변이, 결실 또는 불활성화 돌연변이의 도입에 의해 불활성화된다. 구체적으로, 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 불변 영역 유전자 세그먼트는 바람직하게, 이의 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 어느 하나 또는 그들 모두에 기능 상실 돌연변이, 결실 또는 불활성화 돌연변이, 바람직하게, 정지 코돈의 도입을 포함한다.
구체적인 측면에 따라, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 마우스는 불활성화되거나, 또는 결실된 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스는 내인성 카파 또는 람다 경쇄 유전자좌 중 임의의 것, 또는 그 둘 모두 내에 기능 상실 돌연변이, 또는 이의 결실을 포함한다. 상기 마우스는 경쇄를 포함하지 않는 HCAb를 발현하는 것을 특징으로 한다.
한 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열, 및 VH, D 및 JH 코딩 서열의 발현을 제어하기 위해 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 구체적으로, 발현 제어 서열은 뮤린의 것이다.
본원에 제공된 방법의 구체적인 측면에서, B 세포 발생 동안, 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 VH, D 및 JH 코딩 서열은 재조합하여 VH 결합 부위를 발현하는 VDJ 코딩 서열을 형성한다. 각 발생 B 세포는 HCAb로서의 재조합 및 발현을 위해 하나의 VH, 하나의 D 및 하나의 JH 유전자 세그먼트를 무작위로 선택할 것이다. 성숙화되고 나면, 마우스 중의 수백만 개의 B 세포는 각각 특정 항원을 인식하고, 해당 항원을 만나면 활성화될 것이다.
구체적으로, VH, D 및 JH 코딩 서열은 재조합되어 항원을 특이적으로 인식하는 VH 결합 부위를 발현하는 VDJ 코딩 서열을 형성함으로써 재조합된 VH 코딩 서열에 의해 코딩된 항원 특이적 VH 결합 도메인을 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비할 수 있는 주어진 B 세포에서 재조합된 VH 코딩 서열을 수득한다.
구체적으로, VH, D 및 JH 코딩 서열은 재조합되어 항원을 특이적으로 인식하는 VH 결합 부위를 발현하는 VDJ 코딩 서열을 형성함으로써, 자손이 재조합된 VH 코딩 서열에 의해 코딩된 항원 특이적 VH 결합 도메인을 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비할 수 있는 것인 B 세포에서 재조합된 VH 코딩 서열을 수득한다.
구체적으로, VH, D 및 JH 코딩 서열은 재조합되어 항원을 특이적으로 인식하는 VH 결합 부위를 발현하는 VDJ 코딩 서열을 형성함으로써, 형질 세포, 구체적으로, 형질세포로의 분화시, 재조합된 VH 코딩 서열에 의해 코딩된 항원 특이적 VH 결합 도메인을 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비할 수 있는 것인 B 세포에서 재조합된 VH 코딩 서열을 수득한다.
본원에 제공된 방법의 구체적인 측면에서, 본원에 기술된 마우스를 항원으로 면역화한 후, 항원을 특이적으로 인식하는 VH 결합 부위를 발현하는 B 세포는 활성화되고, 항원 특이적 VH 결합 도메인을 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비할 수 있는 형질 세포로 분화될 것이다.
구체적으로, 본원에 기술된 마우스의 B 세포에 의해 분비된 HCAb는 항원 특이적 VH 결합 도메인, 및 CH1 도메인이 결여되거나, 또는 오직 CH1 도메인 부분만을 포함하거나, 또는 그로 구성된 IgG 불변 영역을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 구체적으로, CH1 도메인의 상기 부분에는 샤페론-결합 도메인이 결여되어 있고, 바람직하게, CH1 도메인에는 BiP 샤페론-결합 도메인이 결여되어 있다.
본원에서는 IgG 타입의 다양한 HCAb를 발현하는 B 세포 레퍼토리를 추가로 제공한다. 구체적으로, B 세포 레퍼토리는 본원에 기술된 방법에 의해 수득된 마우스로부터 유래된 IgG 타입의 다양한 HCAb를 발현한다. 본원에 기술된 마우스는 상기 B 세포 레퍼토리를 포함할 수 있거나, 또는 B 세포 레퍼토리는 마우스로부터 단리될 수 있다. B 세포 레퍼토리는 B 세포의 라이브러리, 또는 상기 B 세포 레퍼토리로부터 유래된 핵산 분자의 라이브러리 형태로 제공될 수 있다. 항원 결합 특성을 발현하는 분자의 스크리닝을 허용하는 디스플레이 시스템을 사용하는 각각의 라이브러리가 제공될 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 분자의 라이브러리는 다양한 HCAb, 또는 상기 HCAb의 VH 결합 부위를 포함하는 각각의 항원 결합 분자를 코딩한다. 구체적인 측면에 따라, 상기 핵산 분자의 라이브러리는 이의 VH 항원 결합 부위 또는 결합 특성이 상이한 VH 도메인을 포함하거나, 또는 그로 구성된 항원 결합 분자의 라이브러리를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리는 이의 (VH) 항원 결합 부위가 상이한 다양한 HCAb를 발현할 수 있고, 예컨대, 이로써, 다양한 항원 결합 분자, 예컨대, 항체의 제조를 허용하고, 상기 다양성은 동일한 항원 또는 에피토프를 인식하고, 예컨대, 친화도 성숙 또는 다르게는 최적화된 항체 변이체를 제조하거나; 또는 표적 항원, 그러나, 상기 표적 항원의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 제조할 수 있다.
구체적인 측면에 따라, 본원에 기술된 라이브러리, 예컨대, B 세포의 라이브러리 또는 핵산 분자의, 또는 항원 결합 분자의 각 라이브러리는 적합하게 스크리닝될 수 있고, 라이브러리 구성원은 원하는 구조적 또는 기능적 특성에 따라 선택될 수 있고, 이로써, 선택된 라이브러리 구성원의 VH 결합 부위를 포함하는 항원 결합 분자를 확인하고 제조할 수 있다. 본원에 기술된 상기 라이브러리는 적합하게 스크리닝될 수 있고, 개별 라이브러리 구성원은 원하는 구조적 또는 기능적 특성에 따라 선택될 수 있고, 이로써, 항원 결합 분자, 특히 항체 생성물을 제조할 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리는 이의 VH 도메인이 상이한 다양한 항원 특이적 HCAb를 발현할 수 있다.
구체적인 측면에서, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리는 다양한 항체 또는 항체 단편, 구체적으로, 본원에 기술된 HCAb를 발현하고, 상기 다양성은 각각이 동일한 표적 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인식하는 것인 다양한 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 구체적으로, B 세포 레퍼토리는 항원으로의 본원에 기술된 마우스의 면역화 후, 항원 특이적 항체 또는 항체 단편을 발현한다. 구체적인 측면에 따라, 본원에서는 동일한 표적 항원 또는 에피토프를 인식하는 다양한 항체를 포함하거나, 또는 포괄하는 항체 라이브러리를 제공한다.
구체적인 측면에서, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리는 다양한 항체 또는 항체 단편, 구체적으로, 본원에 기술된 HCAb를 발현하고, 상기 다양성은 상이한 표적 항원을 인식하는 다양한 항체를 포함한다. 상기 레퍼토리는 복합, 다성분 항원, 예컨대, 각각이 다중 에피토프를 갖는 것인 다수의 상이한 표적 항원을 갖는 바이러스 또는 박테리아로의 면역화에 의해 수득될 수 있다. 구체적인 측면에 따라, 본원에서는 상이한 표적 항원을 인식하는 다양한 항체를 포함하거나, 또는 포괄하는 항체 라이브러리를 제공한다.
구체적인 측면에 따라, 본 발명은 임의의 경쇄가 결여된 다양한 항체 또는 항체 단편을 발현하는 B 세포 레퍼토리를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 각각이 동일한 표적 항원 또는 상이한 표적 항원을 특이적으로 인식하는 본원에 기술된 다양한 HCAb를 발현하는 B 세포 레퍼토리를 제공한다. 구체적으로, 본원에서는 본원에 제공된 방법에 의해 수득가능하거나, 또는 수득된 B 세포 레퍼토리를 제공한다. 구체적으로, B 세포 레퍼토리는 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스에 의해 발현된다.
구체적으로, 예컨대, 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리 또는 각 라이브러리의 본원에서 언급된 다양한 항원 결합 분자는 102, 103, 104, 105 또는 106개 중 적어도 어느 하나의 다양한 항원 특이적 분자, 예컨대, 항체 또는 HCAb를 포함하거나, 또는 포괄한다.
B 세포 레퍼토리의 다양성은 예컨대, B 세포 레퍼토리에 의해 발현되는 HCAb의 다양성을 나타내는 상이한 VDJ 배열의 수를 결정하는 딥 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다.
본원에 기술된 B 세포 레퍼토리는 본원에 기술된 마우스에 의해 생산된 B 세포에서 재조합된 VH 서열의 시퀀싱에 의해 수득가능하거나, 또는 수득된 핵산 서열의 레퍼토리로서 제공될 수 있다. 상기 시퀀싱은 예컨대, 차세대 시퀀싱 (NGS)과 같은 딥 시퀀싱 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 딥 시퀀싱은 게놈 영역을 다회에 걸쳐, 때로는 수백 회 또는 심지어는 수천 회에 걸쳐 수행되는 시퀀싱을 지칭한다. 본 NGS 접근법을 통해 다양한 VH 도메인 핵산 또는 아미노산 서열을 제공할 수 있다.
구체적인 측면에 따라, HCAb의 항체 라이브러리로서,
a) 상기 항체를 코딩하는 유전자가 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리로부터 유래되거나, 또는
b) 항체가 바람직하게, 설치류 기원, 특히, 마우스 기원의 포유동물 형질세포에 의해 분비되는 것인 항체 라이브러리를 제공한다.
구체적으로, 라이브러리는 본원에 기술된 B 세포 레퍼토리의 B 세포로부터 상기 항체 레퍼토리를 코딩하는 유전자를 클로닝함으로써, 또는 다양한 포유동물 형질세포에 의해 항체를 분비함으로써 수득가능하다. 구체적으로, 포유동물 형질세포에 의해 분비된 항체는 포유동물 포유동물 형질세포 원 종의 특징인 글리코실화 패턴을 특징으로 한다
그러므로, 본 발명은 본원에 기술된 항체, 및 구체적으로, 본원에 기술된 항체 레퍼토리를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 포유동물 형질세포는 설치류, 바람직하게, 마우스로부터 유래된 것이다.
본원에 기술된 항체는 예컨대, 비-마우스 동물을 포함하는 마우스 이외의 다른 종, 또는 인간 기원, 또는 이의 임의의 조합의 각 서열 중 하나 이상의 것, 예를 들어, 각 인간 항체 도메인을 코딩하는 인간 핵산 서열을 사용하여 제조될 수 있다는 것이 잘 이해된다.
인간 항체 불변 도메인의 서열은 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국 국립 생물공학 정보 센터(The National Center for Biotechnology Information: NCBI) 및 ImmunoGeneTics (IMGT)를 포함하는 다양한 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 인간 IgG1 불변 도메인 엑손 CH1, CH2 및 CH3-S (S, γ1 HC의 분비형 형태를 코딩하는 CH3 엑손의 3' 부분)의 예시적인 서열은서열 번호: 16-18로 식별된다.
인간 항체 도메인의 서열 중 임의의 것은 단지 예시일 뿐이라는 것이 잘 이해된다. 대안적으로, 각각의 상이한 대립유전자의 인간 항체 도메인의 서열이 사용될 수 있다.
항체 도메인을 코딩하는 동물 또는 인간 기원의 뉴클레오티드 서열, 또는 동물 또는 인간 아미노산 서열에 대한 대안으로서, 변형된 (인공) 뉴클레오티드 서열 및 각각의 아미노산 서열, 예컨대, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성 중 적어도 어느 하나를 포함하는 각각의 서열이 사용될 수 있되, 단, 각각의 항체 도메인이 본원에 기술된 바와 같이 각각의 항체 구조 내에서 쌍을 형성하고, 연결되는 기능성을 보인다면 그러하다.
한 구체적인 실시양태에 따라, 항체는 숙주 세포에서 (시험관내) 또는 비인간 동물 숙주, 구체적으로, 마우스에서 (생체내) 제조된다.
본원에 기술된 예시적인 HCAb의 구조는 도 3b에 도시되어 있다.
VH 항원 결합부는 구체적으로 VH 도메인의 3개의 CDR 루프, 즉, VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 항원 결합부는 CDR 루프 중 하나 이상의 것의 변이에 의해 친화성 성숙화되어 표적 항원 결합 친화성을 최적화하거나 증가시킬 수 있다. 상기 변이는 예컨대, 생체내 프로세스에 의해 또는 시험관내 돌연변이유발 기술에 의해 임의의 또는 각각의 CDR 서열에서 하나 이상의 점 돌연변이, 예컨대, 1, 2, 3개 이상의 점 돌연변이에 의해 수득함으로써 친화성 성숙화된 항원 결합 부위를 수득할 수 있다.
구체적으로, HCAb는 각각 항체 불변 도메인 CH2 및 CH3에 융합된 VH 도메인을 포함하는 2개의 동일한 중쇄로 구성된 분자이다. 구체적으로, 항체 불변 도메인은 IgG 불변 도메인이다. 두 중쇄 모두, 이의 CH2 도메인과 CH3 도메인의 쌍형성시, HCAb는 2개의 VH 도메인과 Fc 영역을 포함하게 된다.
본원에 기술된 HCAb의 Fc 영역은 구체적으로 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한, 항체의 불변 영역을 포함한다. "Fc 영역"은 전형적으로 IgG, IgA 또는 IgD의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인과 이들 도메인에 대한 N-말단의 가요성 힌지 영역, 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭한다. 구체적으로, 힌지는 IgG, IgA 또는 IgD 항체의 것이다.
IgG 타입의 HCAb의 경우, Fc는 구체적으로 Cγ 면역글로불린 도메인 CH2 및 CH3, 및 임의적으로 Fc 도메인과 VH 아암의 항체 도메인(들) 사이, 또는 VH와 CH2 사이의 힌지 영역을 포함하거나, 또는 그로 구성된다. IgG 타입의 HCAb의 Fc 영역은 구체적으로 CH1 도메인을 포함하지 않거나, 또는 샤페론 결합 서열이 결여된 CH1 도메인의 일부를 포함한다. Fc 영역은 또한 예컨대, 자연적으로 발생된 항체 도메인과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 각각의 자연적으로 발생된 항체 도메인의 인공 변이체 형태의 CH2 또는 CH3 도메인을 포함할 수 있다.
특히, 본원에 기술된 Fc 영역은 도메인이 항체 중쇄 (HC)의 일부인 CH2 및 CH3 도메인의 이량체를 포함하거나, 또는 그로 구성되며, 여기서, 제1 HC의 CH2 도메인은 제2 HC의 CH2와 쌍을 형성하고, 제1 HC의 CH3 도메인은 제2 HC의 CH3과 쌍을 형성한다. 상기 이량체는 동종이량체, 즉, 동일한 아미노산 서열의 2개의 CH2-CH3 도메인 쇄로 구성된 동종이량체, 또는 이종이량체, 즉, 각각 상이한 아미노산 서열을 갖는 2개의 CH2-CH3 도메인 쇄로 구성되고, 예컨대, Fc를 안정화하기 위한 상이한 CH3 아미노산 서열을 포함하는 이종이량체일 수 있다.
구체적인 측면에서, HCAb는 Fc 영역의 CH2-CH3 도메인 쇄를 VH 도메인에 연결하는 힌지 영역을 포함한다. 구체적으로, HCAb는 VH 도메인과 항체 불변 도메인을 연결하는 힌지 영역을 포함한다. 구체적으로, 힌지 영역은 CH1 도메인의 C-말단을 CH2 도메인의 N-말단에 연결하는 종래 항체 중쇄 힌지 영역으로부터 유래된다. 대안적으로, 대략 동일한 길이의 임의의 다른 천연 또는 인공 링커가 사용될 수 있다. 적합한 힌지 영역은 천연 (자연적으로 발생, 예컨대, 인간 또는 마우스) IgG 또는 IgA 중쇄 힌지 영역, 또는 임의적으로 하나 이상, 최대 5개 이하의 점 돌연변이를 포함하는, 동일한 길이 +/- 1 또는 2개의 아미노산의 기능적 변이체이다. 힌지 영역은 전형적으로 두 HC를 연결하는 것과 같이 HCAb에서 이황화 브릿지를 생성하기 위한 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다.
구체적으로, HCAb에 포함된 두 HC (본원에서는 또한 제1 및 제2 HC로도 지칭)의 아미노산 서열은 동일하다. 대안적으로, 두 HC의 아미노산 서열은 상이하고, 이로써, 예컨대, VH 도메인의 항원 결합 부위는 상이하다.
예를 들어, 제1 HC는 제1 VH를 포함하고, 제2 HC는 제2 VH를 포함한다. 제1 및 제2 VH는 동일하거나, 또는 상이한 항원 결합 부위, 예컨대, 2개의 상이한 표적 항원을 특이적으로 인식하는 부위를 포함할 수 있다. 따라서, HCAb는 단일특이적, 2가 또는 이중특이적일 수 있다.
예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 마우스와 같은 트랜스제닉 비인간 동물에 의해 생산된 항체는 일반적으로 자연 또는 천연 항체로 이해된다. 상기 자연 항체는 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이 트랜스제닉 마우스에 의해 생산된, 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 레퍼토리로부터 유래될 수 있다.
구체적인 측면에 따라, 항체 또는 항체의 레퍼토리는 생체내에서 친화성 성숙화될 수 있고, 그 결과로 예컨대, 10-7 M 미만, 예컨대, 10-7 내지 10-10 M의 KD로 특정 표적 항원에 결합하는 고친화성 항체가 생성될 수 있다.
예컨대, 무작위 돌연변이유발 및/또는 라이브러리 기술을 사용하는 것과 같은 시험관내 돌연변이유발 방법에 의해 제조된 친화성 성숙화된 항체는 예컨대, 10-8 M 미만, 예컨대, 10-11 M 미만의 KD로 훨씬 더 높은 친화성을 초래할 수 있다.
자연 항체는 유리하게는 VH-CDR 서열의 천연 입체형태를 특징으로 한다. 상기 천연 입체형태는 항원 결합 부위의 자연적으로 발생된 1차 구조 및/또는 전장 VH 도메인의 자연적으로 발생된 1차 구조를 특징으로 한다.
HCAb를 제조할 때, 선택된 항체 도메인 및/또는 힌지 영역은 인간, 인공 또는 비인간 동물 기원의 것일 수 있다. 예를 들어, HCAb는 인간 및 마우스 서열을 포함하는 트랜스제닉 마우스에서 생산된다.
본원에 기술된 HCAb는 가용성 형태, 예컨대, 약제학적 제제에서 적합하게 사용되는 농도의 수용성 형태로 제공된다. 구체적으로, 본원에서는 본원에 기술된 HCAb를 단리된 형태, 예컨대, 이를 생산하는 동물의 혈청 또는 혈액 분획으로부터 단리된, 또는 세포 배양 분획물로부터 단리된 형태로 포함하는 가용성 제제를 제공한다.
본원에서는 본원에 기술된 방법에 의해 수득가능하거나, 또는 수득된 마우스를 추가로 제공한다. 구체적으로, 본원에서는 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를 제공한다. 구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 이의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함한다.
구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 이의 게놈 중에 변형된 면역글로불린 대립유전자 또는 다른 트랜스진을 포함한다. 구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 이의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중에 적어도 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 따라서, 트랜스제닉 동물이다.
한 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 마우스는 인간 면역글로불린 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 신약 개발 목적으로 부분적 또는 완전 인간 항체를 생성하기 위해 내인성 마우스 면역글로불린 영역을 인간 면역글로불린 서열로 대체하기 위한 수많은 방법이 개발되었다. 상기 마우스의 예로는 예컨대, 미국 특허 번호 7,145,056; 7,064,244; 7,041,871; 6,673,986; 6,596,541; 6,570,061; 6,162,963; 6,130,364; 6,091,001; 6,023,010; 5,593,598; 5,877,397; 5,874,299; 5,814,318; 5,789,650; 5,661,016; 5,612,205; 및 5,591,669에 기술되어 있는 것을 포함한다.
구체적인 측면에 따라, 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 키메라 유전자 세그먼트를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 예컨대, US 2013/0219535에 기술된 것과 같은 키메라 면역글로불린 세그먼트, 구체적으로, 상응하는 마우스 비코딩 및 조절 서열에 내장된 인간 IGH (VH, D, JH) 코딩 서열을 포함한다. 인간 면역글로불린 코딩 서열 및 뮤린 발현 제어 서열을 포함하는 면역글로불린 유전자 세그먼트는 또한 본원에서 "키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트"로 지칭된다.
구체적으로, 상기 트랜스제닉 마우스는 부분적으로 인간인 도입된 외인성 면역글로불린 영역을 갖고, 여기서, 도입된 영역은 인간 가변 영역 코딩 서열, 및 마우스 기원의 것이거나, 또는 마우스의 내인성 게놈의 것이고, 키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트 또는 키메라 면역글로불린 유전자 유전자좌의 도입에 의해 마우스 게놈으로 녹킹되는 것인, 인간 서열의 발현을 제어하는 뮤린 비코딩 조절 서열을 포함한다. 특히, 뮤린 서열, 구체적으로, 뮤린 비코딩 및 조절 서열은 상응하는 마우스 내인성 서열, 즉, 내인성 야생형 면역글로불린 유전자좌의 서열과 동일한 서열을 기반으로 한다.
인간 면역글로불린 유전자 서열을 발현시키기 위한 목적의 본원에 기술된 바와 같은 뮤린 발현 제어 서열은 구체적으로 프로모터, 전사 개시 및 정지 서열, 인핸서 및 활성인자 서열, 리보솜 결합 부위로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 발현 제어 서열의 구체적인 예는 코딩 서열 측면에 위치하는 서열이고, 이는 프로모터, 5' 비번역 서열, 리더 펩티드의 코딩 서열을 개재하는 인트론, 재조합 신호 서열(들) (RSS) 및 스플라이스 부위를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내에 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열, 및 VH, D 및 JH 코딩 서열의 발현을 제어하도록 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 VH 중쇄 유전자좌를 포함한다. 구체적으로, VH 중쇄 유전자좌는 VH 중쇄 유전자좌의 발현 제어 서열은 뮤린의 것, 바람직하게, 내인성 발현 제어 서열인 키메라이다.
구체적으로, VH 중쇄 유전자좌는 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열의 레퍼토리를 포함한다. 구체적으로, 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개의 VH 코딩 서열, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개의 D 코딩 서열 및 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 JH 코딩 서열, 구체적으로, 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열이다. 구체적으로, 최대 120개의 VH 코딩 서열, 최대 40개의 D 코딩 서열 및 최대 20개의 JH 코딩 서열이다. 구체적으로, VH 중쇄 유전자좌는 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열의 전체 레퍼토리를 포함한다.
구체적으로, VH 중쇄 유전자좌의 VH, D 및 JH 코딩 서열은 재조합되어 항원을 특이적으로 인식하는 VDJ 코딩 서열을 형성하고, 여기서, 재조합된 VH 중쇄 유전자좌를 함유하는 B 세포는 항원 특이적 VH 결합 도메인 및 CH1 도메인이 결여되거나, 또는 CH1 도메인의 적어도 일부가 결여된 IgG 불변 영역을 포함하는 HCAb를 발현한다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 핵산 작제물에 포함된다.
한 구체적인 실시양태에서, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트는 적어도 하나의 면역글로불린 유전자 세그먼트 코딩 서열, 특히, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 JH 유전자 세그먼트 코딩 서열, 바람직하게, 적어도 JH2-6 유전자 세그먼트의 코딩 서열을 포함하는 핵산 작제물에 포함된다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트, 및 상응하는 마우스 비코딩 및 조절 서열에 내장된 인간 IGH 코딩 서열, 바람직하게, 적어도 인간 IGH J 코딩 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 작제물은 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류의, 및 마우스의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 일부를 대체하는 외인성 핵산 작제물 또는 요소로서 마우스 게놈 내로 도입될 수 있다. 구체적으로, 핵산 작제물은 인간 IGH VH, D 및 JH 코딩 서열을 포함한다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트, 상응하는 마우스 비코딩 및 조절 서열에 내장된 인간 IGH 코딩 서열, 바람직하게, 적어도 인간 IGH J 코딩 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트, 및 본원에 기술된 바와 같은 불활성 Cμ 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 작제물은 내인성 Cδ 유전자 세그먼트의 상류의, 및 마우스의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 적어도 일부를 대체하는 외인성 핵산 작제물 또는 요소로서 마우스 게놈 내로 도입될 수 있다. 구체적으로, 핵산 작제물은 인간 IGH VH, D 및 JH 코딩 서열을 포함한다.
대안적으로, 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트 및 임의적으로 불활성 Cμ 유전자 세그먼트는 마우스 게놈 내에서 면역글로불린 유전자 유전자좌로 노킹(knocking)된다.
또 다름 바람직한 측면에서, WO2017035252A1에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 마우스의 게놈 함량은 변형되고, 이로써, 이의 B 세포는 세포당 1 초과의 기능성 VH 도메인을 발현할 수 있고, 즉, 세포는 이중특이적 항체를 생산한다.
구체적으로, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트는 불활성이다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 기능 상실 돌연변이, Cμ 유전자 세그먼트의 결실에 의해, 또는 하나 이상의 정지 코돈을 도입하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성이다.
구체적으로, 본원에서는 Cμ 유전자 세그먼트의 5'에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 본원에 기술된 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 상기 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 기술한다.
한 구체적인 실시양태에서, Cμ 유전자 세그먼트는 본원에 기술된 마우스의 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 내인성 유전자 세그먼트이다.
한 구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 Cμ 유전자 세그먼트는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트를 대체하고, 하나 이상의 불활성화 돌연변이를 포함하는 트랜스제닉 유전자 세그먼트이다.
구체적으로, 트랜스제닉 Cμ 유전자 세그먼트는 기능 상실 돌연변이에 의해, 또는 부분적으로, 예컨대, 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 중 어느 하나만큼 Cμ 유전자 세그먼트의 결실에 의해, 또는 Cμ 유전자 세그먼트 중, 바람직하게, CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 임의의 하나 이상의 것 중 외인성 정지 코돈의 도입에 의해 불활성이다.
구체적으로, 본원에 기술된 Cμ 유전자 세그먼트는 야생형 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트의 자연 위치에 위치한다.
구체적으로, 본원에 기술된 마우스는 본원에 기술된 이의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중에 변형을 포함한다.
구체적으로, 본원에 기술된 유전자좌는 마우스로부터 유래되되, 천연적으로는 유전자좌의 조절 요소와 회합되지 않은, 적어도 하나의 외인성 요소, 예컨대, 하나 이상의 외인성 중쇄 영역, 예컨대, CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 결실을 포함하는 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 재조합 (예컨대, "키메라") 유전자좌이다.
구체적으로, 부위 특이적 레콤비나제 기술, 또는 CRISPR/Cas9 기술을 이용하여 적합한 유전자 표적화 기술, 예컨대, 예컨대, 지정 상동 재조합에 의해 마우스를 처리하여 유전자 서열을 면역글로불린 중쇄 유전자좌 내로 도입한다.
구체적으로, 마우스는 내인성 카파 및/또는 람다 유전자좌가 결실 또는 침묵화되거나, 또는 다르게는 기능 상실을 위해 돌연변이화되어 있기 때문에, 내인성 카파 및/또는 람다 유전자좌를 발현하지 않는다.
한 구체적인 실시양태에 따라, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 제조하는 방법은 본원에 기술된 마우스를 항원으로 면역화하여 마우스의 B 세포 레퍼토리에 포함된 항원 특이적 B 세포에 의해 상기 항원에 대한 면역 반응이 유도되도록 하는 단계를 추가로 포함한다. 반응하는 B 세포는 궁극적으로 면역화 항원에 특이적인 HCAb를 분비하는 형질 세포로 분화될 것이다.
항원은 애주번트(adjuvant)와 함께 또는 이의 부재하에 임의의 편리한 방식으로 마우스에 투여될 수 있고, 미리 결정된 스케줄에 따라 투여될 수 있다.
구체적으로 본원에서는
a) 트랜스제닉 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계로서, 상기 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 단계,
b) 항원 특이적 VH 및 IgG 불변 영역을 포함하는 HCAb를 발현하는 단계;
c) 상기 항원 특이적 VH를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 단리시키는 단계, 및
d) 상기 항원 특이적 VH를 포함하는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 제조하는 단계를 포함하는, 항원 특이적 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본원에서는
a) 마우스를 항원으로 면역화시켜 항원 특이적 HCAb를 발현하는 세포의 레퍼토리를 제공하는 단계로서, 상기 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 단계,
b) 항원 특이적 VH를 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 발현하는 세포를 상기 레퍼토리로부터 선택하는 단계;
c) 상기 항원 특이적 VH를 코딩하는 핵산 서열을 상기 HCAb로부터 결정하는 단계, 및
d) 상기 항원 특이적 VH를 포함하는 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함하는,
항원 특이적 VH 도메인을 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 모노클로날 항체는 전장 면역글로불린, 이의 항원 결합 항체 단편, 또는 적어도 가변 중쇄 (VH) 항체 도메인, 또는 단일 VH 도메인을 포함하는 임의의 다른 항체 작제물, 예컨대, IgG 타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 항체의 하나 이상의 단일 도메인 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv, 또는 전장 항체를 포함하는 항체 중 임의의 것일 수 있다. 특정 실시양태는 중쇄 단독 항체, 예컨대, 본원에 기술된 HCAb이다.
구체적으로, 상기 항원 특이적 VH를 코딩하는 핵산 서열은 본원에 기술된 마우스에 의해 생산된 B 세포에서 재조합된 VH 서열의 시퀀싱에 의해 결정된다. 상기 시퀀싱은 예컨대, 차세대 시퀀싱 (NGS)과 같은 딥 시퀀싱 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위해, 항체 생산 세포, 예컨대, 비장 및/또는 림프절 세포는 면역화된 트랜스제닉 마우스로부터 단리될 수 있고, 하이브리도마 제조를 위해 형질전환된 세포주와의 세포 융합에 사용될 수 있거나, 항체를 코딩하는 cDNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 클로닝되고, 형질감염된 세포에서 발현된다. 모노클로날 항체를 제조하는 절차는 당업계에 잘 확립되어 있다.
구체적으로, 상기 방법은 하이브리도마를 제조하는 단계 및 항체 생산 세포, 특히, 표적 항원을 특이적으로 인식하는 세포를 생산 및 스크리닝하는 단계를 추가로 포함한다.
구체적으로, 본원에서는
a) 마우스를 항원으로 면역화시키는 단계로서, 상기 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 것인 단계,
b) 상기 트랜스제닉 마우스로부터 비장 및/또는 림프절 세포를 단리시키는 단계;
c) 상기 비장 및/또는 림프절 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계;
d) 항원 특이적 하이브리도마를 선택하는 단계;
e) 상기 하이브리도마로부터 항원 특이적 VH를 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비하는 단계; 및
f) 배양 상청액으로부터 상기 모노클로날 HCAb를 단리시키는 단계를 포함하는, 항원 특이적 VH 도메인을 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 방법은 상기 하이브리도마로부터 상기 항원 특이적 VH를 코딩하는 핵산 서열을 결정하는 단계, 및 상기 항원 특이적 VH를 포함하는 재조합 모노클로날 항체를 제조하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 본 방법은 세포 배양물에서 특정 항체, 또는 이의 단편, 특히, 항원 결합 단편을 제조하기 위해 면역화된 마우스로부터 핵산 서열을 단리시키는 단계를 포함한다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본원에서 과다면역 항체로 이해된다.
본원에서는 추가로 본원에 기술된 마우스로부터, 또는 본원에 기술된 바와 같은 각각의 B 세포 레퍼토리로부터 유래된 다양한 VH 결합 부위를 포함하는 항원 결합 분자의 라이브러리를 제조하는 방법에서의 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스의 용도를 제공한다. 구체적으로, 본원에서는 VH 도메인의 레퍼토리 (예컨대, VH 라이브러리) 또는 VH 포함 분자의 레퍼토리 (또는 각각의 라이브러리), 특히, HCAb의 레퍼토리 (또는 HCAb 라이브러리)를 제공한다.
본원에서는 또한
a) 뮤린 배아 줄기 세포를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 발현 카세트(expression cassette)에 본원에 기술된 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트 및 임의적으로, 본원에 기술된 불활성 Cμ 유전자 세그먼트를 포함하는 하나 이상의 벡터(vector) (이는 또한 표적화 벡터로도 지칭)를 제공하는 단계;
c) 상기 하나 이상의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계;
d) b)의 서열이 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 유전자좌에서 (돌연변이화되거나, 돌연변이화될 수 없는) 내인성 Cμ 유전자 세그먼트 상류에, 또는 벡터가 내인성, Cμ를 대체하는 불활성 Cμ를 포함한다면, 내인성 Cδ 유전자 세그먼트 상류에의 표적화된 통합(targeted integration)에 의해 트랜스제닉 세포(transgenic cell)의 세포 게놈 내로 도입된 것인 트랜스제닉 세포를 선택하는 단계; 및
e) 상기 트랜스제닉 세포를 이용하여 상기 트랜스제닉 세포로부터 유래된 트랜스제닉 마우스를 생성하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 마우스를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 내인성 Cμ 유전자 세그먼트는 바람직하게, 기능 상실 돌연변이, Cμ 유전자 세그먼트의 결실에 의해, 또는 정지 코돈을 도입하는 돌연변이에 의해 불활성화된다.
구체적으로, 마우스는 본원에 기술된 바와 같은 HCAb를 발현한다. 구체적으로, 마우스는 오직 중쇄 항체만을 발현하고/거나, VL 도메인을 포함하는 임의의 항체 작제물을 발현하지 않는다.
구체적으로, 1개의 마커(marker), 또는 1 초과의 마커가 상기 하나 이상의 벡터의 세포 게놈 내로의 성공적인 통합을 나타내기 위해 사용된다. 구체적으로, 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 선별이 용이하게 이루어질 수 있도록 허용하는, 숙주에서 발현될 수 있는 선별가능한 마커가 사용된다.
선별가능한 마커의 예로는 예컨대, 항미생물제 (예컨대, 퓨로마이신, 하이그로마이신, 블레오마이신 또는 클로람페니콜) 또는 항바이러스제 (예컨대, 간시클로비르)에 대한 내성을 부여하는 단백질, 숙주 세포에 영양상의 이점과 같은 대사적 이점을 부여하는 단백질 뿐만 아니라, 세포에 기능적 또는 표현형상의 이점 (예컨대, 세포 분열)을 부여하는 단백질을 포함한다.
한 구체적인 실시양태에서, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 유전자는 표적화 벡터가 이의 게놈 내에 통합된 세포의 선택을 위해 간시클로비르 및/또는 퓨로마이신 내성 유전자를 사용하는 음성 선택에 사용된다.
구체적으로, 벡터는 코딩 핵산 서열이 진핵 세포에 핵산 서열을 도입할 수 있는 수단에 의해 세포 내로 삽입되도록 도입되며, 여기서, 핵산 서열은 일시적으로 세포에 존재할 수 있지만, 바람직하게, 세포의 게놈 (특히, 염색체) 내로 도입되거나, 또는 안정적으로 통합된다.
구체적으로, 상기 하나 이상의 벡터는 임의의 표적화된 재조합 방법, 예컨대, 상동 재조합에 의해 또는 부위 특이적 재조합 기술에 의해 표적 부위에 상기 마우스 세포의 세포 게놈 내로 통합된다. 구체적으로, CRISPR/Cas9 게놈 편집 시스템은 표적화된 재조합에 사용될 수 있다 (문헌 [He, et al., Nuc. Acids Res., 44:e85, 2016]).
한 구체적인 실시양태에 따라,
a) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 유전자좌의 내인성 Cδ 유전자 세그먼트의 5'인 위치에 표적 부위를 포함하는 마우스 세포를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 발현 카세트 중 CH1 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 Cγ 유전자 세그먼트, 및 임의적으로, 적어도 하나의 불활성화 돌연변이를 포함하는 Cμ 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 서열로서, 여기서, 핵산 서열은 상기 표적 부위와 상동성인 DNA 서열 측면에 위치하는 것인 핵산 서열, 및 벡터의 세포 게놈 내로의 표적화된 상동 재조합에 대해 선택하는 하나 이상의 마커를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공하는 단계;
c) 상기 하나 이상의 벡터를 상기 마우스 세포 내로 도입하는 단계;
d) 상기 핵산 서열을 상기 마우스 세포의 게놈 내로 도입하고, 상기 핵산 서열이 상기 세포의 세포 게놈 내로 상기 표적 부위에 통합된 트랜스제닉 세포를 선택하는 단계; 및
e) 상기 트랜스제닉 세포를 이용하여 상기 트랜스제닉 세포를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스를 생성하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 표적화 서열을 코딩하는 핵산, 부위 특이적 재조합 부위, 및 임의적으로, 선별가능한 마커 유전자을 포함하는 벡터인 상동성 표적화 벡터 또는 "표적화 벡터"가 사용될 수 있으며, 이는 숙주 세포에서 상동성 매개 재조합, 구체적으로, 상동 재조합을 사용하여 내인성 면역글로불린 영역을 변형시키는 데 사용된다. 구체적인 예에서, 상동성 표적화 벡터는 부위 특이적 재조합 부위를 추가로 포함할 수 있고, 부위 특이적 재조합 부위를 숙주 세포 게놈의 특정 영역 내로 도입시키는 데 사용될 수 있다.
구체적으로, 숙주 세포의 형질감염시 숙주 세포 게놈과 재조합되는 표적화 벡터가 사용되고, 생산적 VDJ 재배열 후, 코딩된 항체가 발현되어 원형질막으로 삽입되고/되거나, 숙주 세포에 의해 분비된다. 구체적으로, 벡터는 조절 요소가 항체 코딩 서열에 천연적으로는 회합되어 있지 않은 것인, 항체 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 외인성 또는 이종성 조절 요소, 예컨대, 인핸서 또는 프로모터를 포함한다.
또 다른 구체적인 실시양태에 따라,
a) 마우스 세포를 제공하고, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 유전자좌의 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 5' 및 3'인 위치에 부위 특이적 레콤비나제에 대한 인식 서열이 측면에 위치하는 2개의 레콤비나제 매개 카세트 교환 (RMCE) 표적 부위를 통합시키는 단계;
b) 하나 이상의 발현 카세트 중 CH1 도메인 중 적어도 일부 또는 그들 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 Cγ 유전자 세그먼트, 및 임의적으로, 적어도 하나의 불활성화 돌연변이를 포함하는 Cμ 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 서열로서, 여기서, 핵산 서열은 부위 특이적 레콤비나제에 대한 추가 인식 부위 측면에 위치하는 것인 핵산 서열, 및 벡터의 마우스 게놈 내로의 표적화된 통합에 대해 선택하는 하나 이상의 마커를 포함하는 하나 이상의 벡터를 제공하는 단계로서, 여기서, 추가 인식 부위는 상기 RMCE 표적 부위와 조합될 수 있는 것인 단계;
c) 상기 하나 이상의 벡터 및 상기 RCME 표적 부위 및 추가 인식 부위를 인식하는 부위 특이적 레콤비나제를 상기 마우스 세포 내로 도입하는 단계;
d) 상기 핵산 서열을 상기 마우스 세포의 게놈 내로 도입하고, 상기 핵산 서열이 상기 세포의 세포 게놈 내로 상기 RMCE 표적 부위에 통합된 트랜스제닉 세포를 선택하는 단계; 및
e) 상기 트랜스제닉 세포를 이용하여 상기 트랜스제닉 세포를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 생성하는 단계를 포함하는, 본원에 기술된 마우스를 생성하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 부위 특이적 레콤비나제에 대한 상기 인식 부위 중 임의의 것은 레콤비나제 인식 부위 (예컨대, Cre/lox, Flp-FRT 등)이고, 여기서, 레콤비나제는 이의 두 인식 부위 사이의 DNA 서열을 절제할 수 있다.
구체적인 측면에 따라, 본원에서는
a) 마우스에서 재조합 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 발현하는 단계로서, 유전자좌는
i) 각 VH, D 및 JH 유전자 세그먼트 중 하나 이상의 것을 포함하고, 바람직하게, 마우스 조절 서열 중에 내장된 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역,
ii) 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 불변 중쇄 영역로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인 중 적어도 일부 또는 그들 모두를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하고, 여기서, 임의적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 불활성인 것인 불변 중쇄 영역, 및
iii) 연결 부분을 포함하고,
상기 영역은 본원에 기술된 HCAb를 발현하도록 조작되고, 위치화되고,
여기서, 마우스는 내인성 카파 및/또는 람다 유전자좌를 발현하지 않는 것인 단계, 및
b) 상기 HCAb인 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 중쇄-단독 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
한 구체적인 실시양태에 따라, 본원에 기술된 항체는 적합한 생산 숙주 세포주를 사용하여 세포 배양물에서 제조된다. 구체적으로, 제조는 박테리아, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포 배양물을 사용한다. 구체적으로, 숙주 세포는 본원에 기술된 항체를 코딩하는 각각의 핵산 분자의 도입시 사용된다. 특히, 임의의 포유동물 숙주 세포: BHK, CHO, HeLa, HEK293, MDCK, NIH3T3, NS0, PER.C6, SP2/0 또는 VERO 세포가 유리하게 사용된다.
구체적인 측면에 따라, 본 발명은 예컨대, 적어도 VH 결합 부위를 포함하는 HCAb 항체, 또는 이의 단편과 같은, 적어도 VH 결합 부위 또는 각각의 VH 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 예컨대, 항체 라이브러리, 또는 상기 라이브러리를 코딩하거나, 또는 발현하는 핵산 서열의 라이브러리를 제조하기 위한 본원에 기술된 마우스의 용도를 제공한다.
본원에 기술된 트랜스제닉 세포는 예컨대, US20170226162A1에 기술된 바와 같이, 예컨대, B 세포로부터 항체를 코딩하는 유전자를 클로닝함으로써, 또는 형질 세포막 상에 항체를 발현하는 조작된 마우스에서 정의된 특이성을 갖는 형질 세포를 선택함으로써 관심 항체를 확인하기 위해 발현 라이브러리를 제조하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 형질 세포에 의해 발현된 항원 특이적 항체를 확인하기 위한 세포 기술을 이용하여 제조된 항체 라이브러리를 포함한다.
구체적인 실시양태는 본원에 기술된 유전적으로 변형된 마우스의 조작된 부분으로부터 면역글로불린 중쇄 유전자로부터 전사된 면역글로불린 단백질의 일부 또는 전체; 및 유전적으로 변형된 마우스의 세포로부터 유래된 조작된 면역글로불린 단백질의 일부 또는 전체를 포함한다.
본 발명의 상기 측면 및 다른 측면, 목적 및 특징은 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
도면
도 1: 마우스 생식계열 Igh 유전자좌 (상단) [V (IghV), D (IghD), J (IghJ), 및 C (IghC) 유전자 세그먼트 포함; 상이한 Ig H 쇄 이소타입을 코딩하는 다중 IghC 엑손이 존재], Igκ 유전자좌 (Igk, 중간) [V (IgkV), J (IgkJ), 및 C (IgkC) 유전자 세그먼트 포함] 및 Igλ 유전자좌 (하단) [V (IglV), J (IglJ), 및 C (IglC) 유전자 세그먼트 포함]를 도시한 것이다. (1) VDJ 재배열에서 원위 VH 유전자 세그먼트가 확실히 사용될 수 있도록 하는 Igh 루핑에 중요한 시스-조절 서열인 PAIR 요소, (2) Adam6a 수컷 생식능 가능화 유전자, (3) Igh 유전자좌의 정렬된 계통 특이적 재배열을 조절하는 부위를 포함하는, 유전자간 제어 영역 1 (IGCR1), (4) Eμ, iEκ 및 Eλ2-4, 중쇄, κ 및 λ 경쇄 인트론 인핸서, (5) 3 'Eκ, Eλ 및 Eλ3-1, κ 및 λ 경쇄 3' 인핸서, (6) μ 스위치 영역인 Sμ, 및 (7) 이소타입 스위칭을 제어하는 시스-작용 요소인 3' 조절 영역 (3'RR) 또한 제시되어 있다.
도 2: HCO Ab 제조를 위해 마우스 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트를 상동 재조합에 의해 Ighm 상류 내인성 마우스 Igh 유전자좌 내로 도입하기 위한 표적화 벡터. 본 도면 및 도 3에서, "내인성 마우스 Igh 유전자좌"는 와블(Wabl) 및 킬린(Killeen)의 US 20130219535A1에 기술된 부분적 인간 인간 IGH 유전자좌를 함유하는 ES 세포에 존재한다.
도 3: (a) 중쇄 단독 (HCO) 항체 (ΔCH1 HCO IgG1)를 코딩하기 위해 도 2에 제시된 벡터로 표적화된 내인성 마우스 Igh 유전자좌를 도시한 것이다. CH1 엑손이 결실된 마우스 Cγ1 유전자를 Eμ 및 Ighm 사이 마우스 Igh 유전자좌 내로 삽입하였고, 정지 코돈 (TGA, 별표로 표시)은 μ 중쇄 (HC)의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 각 엑손 내로 삽입하였다. 야생형 마우스에서, 발생 B 세포에서 VDJH 재조합 후, 경쇄 (LC) 의존성 μHC가 생성된다. 여기 도시된 돌연변이화된 Igh 유전자좌에서는 LC 비의존성 ΔCH1 γ1 HC가 대신 생성된다. IgG1 HCO 항체의 막횡단 (M) 분비된 (S) 형태, 둘 모두 상기 변형된 Igh 유전자좌에 의해 코딩된다. γ1m 전사체는 M1 및 M2 엑손을 포함하도록 선택적 스플라이싱에 의해 생성되고, γ1s는 CH3 엑손의 3' 말단에 위치하는 S 엑손을 포함하도록 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다. CH1 결실을 통해 HC는 대리 또는 기존 (κ 또는 λ) LC와 회합될 필요 없이 원형질막으로 이동할 수 있거나 (γ1m), 또는 분비될 수 있다 (γ1s). VDJH 엑손이 Cγ1ΔCH1 대신에 Cμ로 직접 스플라이싱되는 경우, Cμ 중 3개의 정지 코돈이 LC 의존성 μHC의 발현을 막는다. (b)는 가변 (VH), CH2, CH3, 및 M 도메인을 포함하되, CH1 도메인은 결여되어 있는, IgG1 HCO 항체 단백질의 막횡단 형태의 개략도이다. HC는 비공유 상호작용에 의해 및 쇄간 이황화결합 (VH와 CH2 도메인 사이에 위치하는 수평선으로 표시)에 의해 함께 결합된 이량체로 존재하고, 이의 M 도메인에 의해 원형질막으로 삽입된다. IgG1 HCO 항체의 분비형 형태 (제시되지 않음)에는 M 도메인이 결여되어 있고, 대신 단백질의 COOH 말단에 짧은 분비 (S) 도메인이 있다. 이는 B 세포 활성화 및 형질모세포/형질 세포로의 분화 후에 발현된다.
도 4: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 골수에서의 B 세포 발생을 도시한 것이다. TRN11/2/5 마우스에서, 내인성 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌는 각각 인간 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌 코딩 서열로 대체되었고, 이 측면에는 마우스 조절 서열이 위치하였다. TRN34/29/30 마우스에서, VH, D 및 JH 유전자 세그먼트는 TRN11과 동일하지만, Igh 유전자좌 중 나머지는 IgG1 HCO 항체를 코딩하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이 변형되었다. Vκ 및 Vλ 유전자좌는 각각 TRN29 및 TRN30 대립유전자에서 불활성화되었다. 골수 세포를 명시된 CD 항원에 특이적인 형광 접합된 모노클로날 항체 (mAb)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다. B 세포 발생 단계 또한 제시되어 있다. 성숙한 recirc. B, 골수에서 생성되고, 말초에서, 예컨대, 비장에서 이의 성숙화를 완료하고, 혈류를 통해 BM으로 다시 재순환하는 B 세포.
도 5: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 비장에서의 B 세포 분화를 도시한 것이다. 비장 세포를 명시된 CD 항원에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다. B 세포 발생 단계 또한 제시되어 있다. Fo. B, 여포성 B 세포; MZ B, 변연부 B 세포; T, 이행; Mat, 성숙.
도 6: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 비장 변연부 및 여포성 B 세포에서의 표면 IgG1 발현. MZ (상단) 및 Fo. (하단) B 세포에서 게이팅된 비장 세포를 γ1 HC의 세포 표면 발현에 대해 분석하였다.
도 7: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 림프절에서의 B 세포 분화 및 표면 IgG1 발현을 도시한 것이다. 림프절 세포를 명시된 CD 항원 및 γ1 HC에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다.
도 8: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 복강에서의 B 세포 분화 및 표면 IgG1 발현을 도시한 것이다. 복강 세포를 명시된 CD 항원 및 γ1 HC에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다.
도 9: 면역화되지 않은 면역화되지 않은 TRN11/2/5 (오픈형 동그라미) 및 TRN34/29/30 HCO (필드형 동그라미) 마우스에서 혈청 IgG1 및 IgM을 검출하는 ELISA 검정법을 도시한 것이다. 광학 밀도는 Y축에 표시되어 있고, 혈청 희석률은 X축에 표시있다. 표준화 (오픈형 박스)를 위해, 100 ug/ml의 모노클로날 IgG1 (좌측) 및 IgM (우측) 또한 연속 희석시켰다.
도 10: 면역화되지 않은 TRN11/2/5 (오픈형 동그라미) 및 TRN34/29/30 HCO (필드형 동그라미) 마우스에서 혈청 IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 검출하는 ELISA 검정법을 도시한 것이다. 광학 밀도는 Y축에 표시되어 있고, 혈청 희석률은 X축에 표시있다. 표준화 (오픈형 박스)를 위해, 100 ug/ml의 모노클로날 IgG2b (좌측), IgG2c (중간) 및 IgG3 (우측) 또한 연속 희석시켰다.
도 11: 본원에서 언급된 뉴클레오티드 서열.
도 1: 마우스 생식계열 Igh 유전자좌 (상단) [V (IghV), D (IghD), J (IghJ), 및 C (IghC) 유전자 세그먼트 포함; 상이한 Ig H 쇄 이소타입을 코딩하는 다중 IghC 엑손이 존재], Igκ 유전자좌 (Igk, 중간) [V (IgkV), J (IgkJ), 및 C (IgkC) 유전자 세그먼트 포함] 및 Igλ 유전자좌 (하단) [V (IglV), J (IglJ), 및 C (IglC) 유전자 세그먼트 포함]를 도시한 것이다. (1) VDJ 재배열에서 원위 VH 유전자 세그먼트가 확실히 사용될 수 있도록 하는 Igh 루핑에 중요한 시스-조절 서열인 PAIR 요소, (2) Adam6a 수컷 생식능 가능화 유전자, (3) Igh 유전자좌의 정렬된 계통 특이적 재배열을 조절하는 부위를 포함하는, 유전자간 제어 영역 1 (IGCR1), (4) Eμ, iEκ 및 Eλ2-4, 중쇄, κ 및 λ 경쇄 인트론 인핸서, (5) 3 'Eκ, Eλ 및 Eλ3-1, κ 및 λ 경쇄 3' 인핸서, (6) μ 스위치 영역인 Sμ, 및 (7) 이소타입 스위칭을 제어하는 시스-작용 요소인 3' 조절 영역 (3'RR) 또한 제시되어 있다.
도 2: HCO Ab 제조를 위해 마우스 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트를 상동 재조합에 의해 Ighm 상류 내인성 마우스 Igh 유전자좌 내로 도입하기 위한 표적화 벡터. 본 도면 및 도 3에서, "내인성 마우스 Igh 유전자좌"는 와블(Wabl) 및 킬린(Killeen)의 US 20130219535A1에 기술된 부분적 인간 인간 IGH 유전자좌를 함유하는 ES 세포에 존재한다.
도 3: (a) 중쇄 단독 (HCO) 항체 (ΔCH1 HCO IgG1)를 코딩하기 위해 도 2에 제시된 벡터로 표적화된 내인성 마우스 Igh 유전자좌를 도시한 것이다. CH1 엑손이 결실된 마우스 Cγ1 유전자를 Eμ 및 Ighm 사이 마우스 Igh 유전자좌 내로 삽입하였고, 정지 코돈 (TGA, 별표로 표시)은 μ 중쇄 (HC)의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 코딩하는 각 엑손 내로 삽입하였다. 야생형 마우스에서, 발생 B 세포에서 VDJH 재조합 후, 경쇄 (LC) 의존성 μHC가 생성된다. 여기 도시된 돌연변이화된 Igh 유전자좌에서는 LC 비의존성 ΔCH1 γ1 HC가 대신 생성된다. IgG1 HCO 항체의 막횡단 (M) 분비된 (S) 형태, 둘 모두 상기 변형된 Igh 유전자좌에 의해 코딩된다. γ1m 전사체는 M1 및 M2 엑손을 포함하도록 선택적 스플라이싱에 의해 생성되고, γ1s는 CH3 엑손의 3' 말단에 위치하는 S 엑손을 포함하도록 선택적 스플라이싱에 의해 생성된다. CH1 결실을 통해 HC는 대리 또는 기존 (κ 또는 λ) LC와 회합될 필요 없이 원형질막으로 이동할 수 있거나 (γ1m), 또는 분비될 수 있다 (γ1s). VDJH 엑손이 Cγ1ΔCH1 대신에 Cμ로 직접 스플라이싱되는 경우, Cμ 중 3개의 정지 코돈이 LC 의존성 μHC의 발현을 막는다. (b)는 가변 (VH), CH2, CH3, 및 M 도메인을 포함하되, CH1 도메인은 결여되어 있는, IgG1 HCO 항체 단백질의 막횡단 형태의 개략도이다. HC는 비공유 상호작용에 의해 및 쇄간 이황화결합 (VH와 CH2 도메인 사이에 위치하는 수평선으로 표시)에 의해 함께 결합된 이량체로 존재하고, 이의 M 도메인에 의해 원형질막으로 삽입된다. IgG1 HCO 항체의 분비형 형태 (제시되지 않음)에는 M 도메인이 결여되어 있고, 대신 단백질의 COOH 말단에 짧은 분비 (S) 도메인이 있다. 이는 B 세포 활성화 및 형질모세포/형질 세포로의 분화 후에 발현된다.
도 4: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 골수에서의 B 세포 발생을 도시한 것이다. TRN11/2/5 마우스에서, 내인성 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌는 각각 인간 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌 코딩 서열로 대체되었고, 이 측면에는 마우스 조절 서열이 위치하였다. TRN34/29/30 마우스에서, VH, D 및 JH 유전자 세그먼트는 TRN11과 동일하지만, Igh 유전자좌 중 나머지는 IgG1 HCO 항체를 코딩하기 위해 도 3에 도시된 바와 같이 변형되었다. Vκ 및 Vλ 유전자좌는 각각 TRN29 및 TRN30 대립유전자에서 불활성화되었다. 골수 세포를 명시된 CD 항원에 특이적인 형광 접합된 모노클로날 항체 (mAb)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다. B 세포 발생 단계 또한 제시되어 있다. 성숙한 recirc. B, 골수에서 생성되고, 말초에서, 예컨대, 비장에서 이의 성숙화를 완료하고, 혈류를 통해 BM으로 다시 재순환하는 B 세포.
도 5: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 비장에서의 B 세포 분화를 도시한 것이다. 비장 세포를 명시된 CD 항원에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다. B 세포 발생 단계 또한 제시되어 있다. Fo. B, 여포성 B 세포; MZ B, 변연부 B 세포; T, 이행; Mat, 성숙.
도 6: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 비장 변연부 및 여포성 B 세포에서의 표면 IgG1 발현. MZ (상단) 및 Fo. (하단) B 세포에서 게이팅된 비장 세포를 γ1 HC의 세포 표면 발현에 대해 분석하였다.
도 7: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 림프절에서의 B 세포 분화 및 표면 IgG1 발현을 도시한 것이다. 림프절 세포를 명시된 CD 항원 및 γ1 HC에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다.
도 8: TRN11/2/5 및 TRN34/29/30 마우스의 복강에서의 B 세포 분화 및 표면 IgG1 발현을 도시한 것이다. 복강 세포를 명시된 CD 항원 및 γ1 HC에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다.
도 9: 면역화되지 않은 면역화되지 않은 TRN11/2/5 (오픈형 동그라미) 및 TRN34/29/30 HCO (필드형 동그라미) 마우스에서 혈청 IgG1 및 IgM을 검출하는 ELISA 검정법을 도시한 것이다. 광학 밀도는 Y축에 표시되어 있고, 혈청 희석률은 X축에 표시있다. 표준화 (오픈형 박스)를 위해, 100 ug/ml의 모노클로날 IgG1 (좌측) 및 IgM (우측) 또한 연속 희석시켰다.
도 10: 면역화되지 않은 TRN11/2/5 (오픈형 동그라미) 및 TRN34/29/30 HCO (필드형 동그라미) 마우스에서 혈청 IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 검출하는 ELISA 검정법을 도시한 것이다. 광학 밀도는 Y축에 표시되어 있고, 혈청 희석률은 X축에 표시있다. 표준화 (오픈형 박스)를 위해, 100 ug/ml의 모노클로날 IgG2b (좌측), IgG2c (중간) 및 IgG3 (우측) 또한 연속 희석시켰다.
도 11: 본원에서 언급된 뉴클레오티드 서열.
상세한 설명
달리 명시 또는 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어는 당업계에서 통상적인 의미를 가지며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 표준 핸드북, 예컨대, 문헌 [Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]; [Lewin, "Genes IV," Oxford University Press, New York, (1990)], 및 [Janeway et al., "Immunobiology" (5th Ed., 또는 더 최근 판), Garland Science, New York, 2001]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, "포함하다(comprise)," "함유하다," "가지다" 및 "포함하다(include)"라는 용어는 동의어로 사용될 수 있고, 추가 구성원 또는 부품 또는 요소를 허용하는 열린 정의로 이해되어야 한다. "~로 구성된"은 구성 정의 특징의 추가 요소 없이 가장 가까운 정의로 간주된다. 따라서, "~을 포함하는"은 더 광범위하고, "구성" 정의를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 동일한 값 또는 주어진 값의 +/-5%만큼 차이가 나는 값을 의미한다.
본 발명자들은 선행 기술의 한계를 극복하고, 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 5'에의 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트의 표적화된 통합에 의해 트랜스제닉 마우스를 생성하여 B 세포에 의해 발현되고, 형질 세포에 의해 분비되는 중쇄-단독 항체 (HCAb)를 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 보여주었다. 이어서, 예컨대, 확립된 하이브리도마 기술을 이용하여 HCAb, 또는 이의 항원 결합 단편을 안정적으로 공급하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 HCAb로 지칭되는 항체 작제물 및 본원에 기술된 레퍼토리 및 본원에 제공된 라이브러리는 인공 작제물이다. 본 발명의 물질, 방법 및 용도, 예를 들어, 구체적으로, 단리된 핵산 서열, 아미노산 서열, 발현 작제물, 형질전환된 숙주 세포, 트랜스제닉 동물 및 재조합 항체에 관한 것은 "인공" 또는 합성인 것이고, 따라서, "천연 생성물" 또는 "자연 법칙"의 결과로 간주되지 않다는 것이 잘 이해된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 면역글로불린의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 및/또는 가변 도메인으로 이해되는 항체 도메인을 다양한 조합 또는 구축으로 포함하거나, 또는 그로 구성된 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭할 것이다. 루프 서열에 의해 연결된 항체 도메인 구조의 적어도 2개의 베타-가닥으로 구성된 베타-배럴 구조를 포함하는 경우, 폴리펩티드는 항체 도메인으로 이해된다. 항체 도메인은 천연 구조의 것이거나, 또는 항원 결합 특성 또는 임의의 다른 특성, 예컨대, 안정성 또는 기능성 특성, 예컨대, Fc 수용체, Fcμ, Fcα/μ, Fcα, Fcε, 및/또는 Fcγ 수용체 (예컨대, 마우스에서 FcRn, FcγRI, FcγRIIB, FcγRIII, 또는 FcγRIV)에의, 또는 중합체 Ig 수용체 (pIgR)에의 결합을 변형시키기 위해 돌연변이유발 또는 유도체화에 의해 변형될 수 있다.
본원에서, 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 특히, 항원 결합 부위, 특히, VH 도메인의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 작제물을 지칭하여야 한다. 구체적인 실시양태는 예컨대, 임의적으로, 하나 이상의 연결 서열(들) 또는 힌지 영역(들)과 함께 하나 이상의 다른 가변 도메인 및/또는 불변 항체 도메인과 조합하여 (또는 그에 융합된) VH를 단일 가변 항체 도메인으로서 포함하거나, 또는 그로 구성된 항체, 예컨대, 1 또는 2개의 단일 쇄로 구성된 중쇄 항체로서, 여기서, 각 단일 쇄는 불변 도메인에 연결된 가변 중쇄 영역 (또는 VH)를 포함하거나, 또는 그로 구성된 것인 중쇄 항체를 지칭한다.
본원에서 언급된 특정 항체는 전장 항체 또는 이의 항원 결합 항체 단편, 또는 적어도 가변 중쇄 (VH) 항체 도메인, 또는 단일 VH 도메인을 포함하거나, 또는 그로 구성된 임의의 다른 항체 작제물, 예컨대, 하나 이상의 단일 도메인 항체, Fab, F(ab'), (Fab)2, scFv, Fd, Fv를 포함하거나, 또는 그로 구성된 항체일 수 있다. 예시적인 항체는 본원에 추가로 기술된 임의의 HCAb를 포함하거나, 또는 그로 구성된다. 본원에 기술된 항체는 특정 면역글로불린 타입일 수 있다. 특정 항체는 항체 불변 도메인, 구체적으로, IgG 타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM 타입, 또는 이의 뮤린 대응물, IgG1, IgG2a/c, IgG2b, IgG3, IgA, IgD, IgE 또는 IgM의 것인 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 바람직하게, 본원에 기술된 항체는 IgG 타입 (예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 서브타입)의 것인 불변 항체 도메인을 포함한다.
이에 따라, 항체는 전형적으로 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 단백질 (또는 단백질 복합체)로 이해된다. 인식되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라, 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄 (LC)는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄 (HC)는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 이는 차례로 각각 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 정의한다.
전형적인 IgG 항체 구조에서, HC 또는 LC는 각각 서로 연결된 적어도 2개의 도메인을 포함하여 한 쌍의 결합 부위 도메인을 생성한다. 특정 경우에, 중쇄는 LC 불변 도메인을 포함할 수 있지만, 여전히, 예컨대, 경쇄 가변 도메인 또는 영역이 결여된 HC로 간주된다.
항체의 HC는 항체의 1 또는 2개의 항원 결합 아암을 Fc 부분에 연결하는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 힌지 영역은 면역글로불린, 예컨대, IgG1 또는 IgG3의 자연적으로 발생된 중쇄 힌지 영역, 또는 자연적으로 발생된 것과 길이가 대략 동일한 (+/- 20%, 또는 +/-10%) 다수의 연속 아미노산을 포함하거나, 또는 그로 구성된 인공 힌지 영역일 수 있다. 바람직한 힌지 영역은 또 다른 힌지 영역에의 이황화 브릿지를 형성하여 이량체 작제물을 수득할 수 있는 하나 이상, 예컨대, 2, 3, 또는 4개의 시스테인 잔기를 포함한다.
본원에 기술된 항체는 예컨대, 연결 서열 또는 링커를 사용하여 단축되거나 연장된 하나 이상의 항체 도메인을 포함할 수 있다. 상기 연결은 구체적으로 재조합 융합 또는 화학적 연결에 의해 이루어진다. 특정 연결은 한 도메인의 C-말단을 또 다른 도메인의 N-말단에 연결시킴으로써 이루어질 수 있고, 예컨대, 여기서, 말단 영역 중의 하나 이상의 아미노산 잔기는 결실되어 도메인 크기를 단축시키거나, 또는 연장되어 도메인의 가요성을 증가시킨다.
구체적으로, 단축된 도메인 서열은 예컨대, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개, 최대 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산을 결실시키는, C-말단 및/또는 N-말단 영역의 결실을 포함한다.
링커에 의한 도메인 연장은 예컨대, 도메인 사이에 천연 연접부를 포함하도록 도메인에 천연적으로 인접하게 위치할 면역글로불린 도메인의 N- 또는 C-말단 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 통해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 링커는 힌지 영역으로부터 유래된 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 그러나, 링커는 예컨대, 복수의 Gly 및 Ser 아미노산이 풍부하거나, 또는 그로 구성된 인공 서열일 수도 있다.
본원에 기술된 바, 용어 "항원 결합 분자"는 항체의 최소 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 포함하거나, 또는 그로 구성된 임의의 단백질 또는 단백질 복합체 (예컨대, 복합체 형태에 결합된 1 초과의 폴리펩티드 쇄로 구성)를 지칭한다. 추가로, 항원 결합 분자는 항체 부분에 융합되거나, 또는 복합체로 된 하나 이상의 요소를 추가로 포함하여 예컨대, 융합 단백질과 같은 항체 유도체를 제공할 수 있다.
용어 "항원 결합 부위" 또는 "결합 부위"는 항원 결합에 참여하는 항체의 일부를 지칭한다. 자연 항체 중의 항원 결합 부위는 중쇄 ("H") 및/또는 경쇄 ("L")의 N-말단 가변 ("V") 영역, 또는 이의 가변 도메인의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는 중쇄 (및 임의적으로 경쇄)의 V 영역 내의 3개의 고도의 가변 스트레치는 프레임워크 영역으로 공지된 더 보존되는 플랭킹 스트레치 사이에 개재된다. 항원 결합 부위는 결합된 에피토프(epitope) 또는 항원의 3차원 표면에 대해 상보적인 표면을 제공하며, 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. CDR에 포함된 결합 부위 또한 본원에서 "CDR 결합 부위"로 불린다.
구체적으로, 본원에 기술된 HCAb의 항원 결합 부위는 중쇄 ("H")의 N-말단 가변 ("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다.
용어 "CDR 영역" 또는 각각의 서열은 항원과 결합 상호작용이 가능한 다양한 구조를 포함하는 VH 도메인과 같은 가변 항체 도메인의 가변 항원 결합 영역을 지칭한다. CDR 영역을 포함하는 항체 도메인은 그 자체로 사용되거나, 또는 더 큰 단백질성 작제물 내에 통합되어 결합 기능이 있는 상기 작제물의 특정 영역을 형성할 수 있다. 다양한 구조는 예컨대, 면역글로불린과 같은 결합 단백질의 자연 레퍼토리로부터, 구체적으로, 항체 또는 면역글로불린 유사 분자로부터 유래될 수 있다. 다양한 구조는 또한 무작위화 기술, 특히, 본원에 기술된 것에 의해 생산될 수 있다. 이는 항체 가변 도메인의 돌연변이화된 CDR 루프 영역, 특히, 면역글로불린의 CDR 루프 영역을 포함한다.
전형적으로, 특정 CDR 구조를 포함하는 항원 결합 부위를 갖는 항체는 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 즉, 한 쌍의 VH 도메인의 CDR 루프를 통해 상기 표적 항원을 특이적으로 인식할 수 있다.
HC 항체에서, 항원 결합 부위는 VH-CDR1, VH-CDR2 및 VH-CDR3 루프로만 구성된 특정 CDR 구조를 특징으로 한다. 상기 항원 결합 부위는 동물, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 경우, 천연이거나, 또는 천연 구조 및/또는 입체형태의 것으로 이해된다. 항원 결합 부위는 예컨대, 새 구조를 합성하는 재조합 기술에 의해 조작되기 때문에 인공적으로 생산될 수 있지만, 각각의 항체를 코딩하는 각각의 유전자를 트랜스제닉 비인간 동물에 도입하면 천연 입체형태를 갖는 새 합성 항체가 생성된다.
상기 천연 입체형태는 임의의 생체내 또는 시험관내 친화성 성숙화 기술에 의해 추가로 친화성 성숙화될 수 있고, 이로써, 천연 입체형태를 특징으로 하고, 추가로, 이의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 높은 친화성을 특징으로 하는 인공 항원 결합 부위를 포함하는 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체가 생산될 수 있다.
용어 "항체"는 예컨대, 인간, 뮤린, 토끼, 래트를 비롯한 포유동물, 또는 조류, 예컨대, 닭과 같은 동물 기원의 항체에 적용되며, 상기 용어는 특히 동물 기원의 서열, 예컨대, 마우스 서열에 기반한 재조합 항체를 포함한다.
용어 "항체"는 완전 인간 항체에도 적용된다.
면역글로불린과 관련하여 사용되는 용어 "완전 인간"은 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 이해된다. 인간 항체는 예를 들어, CDR에 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예컨대, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 또는 항체 라이브러리로부터, 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉인 동물로부터 단리된 항체를 포함한다.
인간 면역글로불린은 바람직하게, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 그로부터 유래된다.
뮤린 면역글로불린은 바람직하게, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 및 IgM으로 구성된 군으로부터 선택되거나, 또는 그로부터 유래된다.
용어 "항체"는 추가로 예컨대, 뮤린 및 인간 기원의 서열과 같이, 상이한 종으로부터 유래된 혼합된 서열을 갖는 키메라 항체에도 적용된다.
구체적으로, 용어 "항체"는 트랜스제닉 비인간 동물에 의해, 예컨대, 마우스로부터 생산된, 인간 항원 결합 영역 및 비인간, 예컨대, 뮤린, 불변 영역 또는 프레임워크 서열을 포함하는 항체에 적용된다.
면역글로불린 또는 항체와 관련하여 사용되는 용어 "키메라"는 항체 쇄의 한 부분은 특정 종으로부터 유래되거나, 또는 특정 클래스에 속하는 면역글로불린 중의 상응하는 서열과 상동성인 반면, 쇄의 남은 세그먼트는 또 다른 종 또는 클래스에서의 상응하는 서열과 상동성인 분자를 지칭한다. 전형적으로, 가변 영역은 한 종의 포유동물로부터 유래된 면역글로불린의 가변 영역을 모방하는 반면, 불변 부분은 또 다른 종으로부터 유래된 면역글로불린의 서열과 상동성이다. 한 예에서, 가변 영역은 예컨대, 비인간 세포 제제로부터 유래된 불변 영역과 조합된 인간 숙주 유기체로부터 쉽게 이용가능한 B 세포를 사용하여 현재 공지된 공급원으로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 키메라 항체 또는 항체 단편은 인간 가변 영역 코딩 서열 (또는 각각의 가변 항체 도메인) 및 마우스 불변 영역 코딩 서열 (또는 각각의 불변 영역 항체 도메인)을 포함하는 트랜스제닉 마우스, 예컨대, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스에 의해 생산될 수 있다.
용어 "항체"는 추가로 모노클로날 항체, 구체적으로, 재조합 항체에도 적용되며, 상기 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 타입의 항체 및 항체 구조체, 예컨대, 상이한 기원의 유전자 또는 서열을 포함하는, 예컨대, 인간을 비롯한 포유동물과 같은 동물로부터 유래된 항체, 예컨대, 키메라, 인간화 항체, 또는 하이브리도마 유래 항체를 포함한다. 추가 예는 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 단리된 항체, 또는 항체 또는 항체 도메인의 재조합 조합 라이브러리로부터 분리된 항체, 또는 항체 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 지칭한다.
용어 "항체"는 신규 또는 기존 (본원에서 "모체"로 지칭) 분자, 예컨대, 자연적으로 발생된 면역글로불린의 기능적으로 활성인 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 본 용어는 항체 변이체를 포함하고, 상기 분자의 유도체 또한 포함하여야 하는 것으로 이해된다. 유도체는 항체의 임의의 도메인, 예컨대, VH 도메인의 항원 결합 부위를 포함하는 항체 도메인, 또는 VH 도메인이 임의의 위치에서 하나 이상의 다른 단백질에, 예컨대, 다른 항체에, 예컨대, CDR 루프를 포함하는 결합 구조체, 수용체 폴리펩티드에 뿐만 아니라, 다른 리간드, 효소, 독소 등에 융합될 수 있는 하나 이상의 항체의 임의의 조합 및 또는 융합 단백질이다. 본원에 기술된 바와 같은 항체는 구체적으로 단리된 폴리펩티드로서, 또는 예컨대, 다른 펩티드 또는 폴리펩티드와의 재조합, 융합 또는 접합 기술을 통해 조합 분자로서 사용될 수 있다.
항체의 유도체는 또한 예컨대, 공유 결합, 정전기적 상호작용, 이황화결합 등과 같은 다양한 화학적 기술에 의해 다른 물질에의 회합 또는 결합에 의해 수득될 수 있다. 항체에 결합된 다른 물질은 지질, 탄수화물, 핵산, 유기 및 무기 분자, 또는 이의 임의의 조합 (예컨대, PEG, 프로드럭 또는 약물)일 수 있다. 유도체는 또한 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 완전히 또는 부분적으로 비천연 또는 화학적으로 변형된 아미노산으로부터 생성된 항체를 포함할 수 있다. 한 구체적인 실시양태에서, 항체는 생물학적으로 허용되는 화합물과의 특이적 상호작용을 허용하는 추가 태그를 포함하는 유도체이다. 면역글로불린의 이의 표적에의 결합에 부정적인 영향을 미치지 않거나, 또는 허용할 수 있는 정도의 부정적인 영향을 미치는 한, 본 발명에서 사용될 수 있는 태그와 관련하여 특정 제한은 없다. 적합한 태그의 예로는 His-태그, Myc-태그, FLAG-태그, Strep-태그, 칼모듈린-태그, GST-태그, MBP-태그 및 S-태그를 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 항체는 표지를 포함하는 유도체이다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "표지"는 "표지된" 항체를 생성하기 위해 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지, 예컨대, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나, 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물의 화학적 변경을 촉매화할 수 있다.
항체의 유도체는 예컨대, 모체 항체 또는 항체 서열, 예컨대, 모체 항원 결합 (예컨대, CDR) 또는 프레임워크 (FR) 서열로부터 유래되는 것이고, 예컨대, 인 실리코 또는 재조합 조작에 의해, 또는 화학적 유도체화 또는 합성에 의해 수득되는 돌연변이체 또는 변이체이다.
용어 "변이체"는 구체적으로 기능적으로 활성인 변이체를 포함할 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 항체의 기능적 변이체는 특히 항원 결합의 특이성과 관련하여 기능성이다.
용어 "변이체"는 특히 예컨대, 불변 도메인에서 개선된 항체 안정성, 증진된 이펙터 기능 또는 반감기를 위해 조작하기 위하여, 또는 가변 도메인에서는 예컨대, 당업계에서 이용가능한 친화성 성숙화에 의해 항원 결합 특성을 조정하기 위하여 특히, 결실시키거나, 교환하거나, 인서트 또는 결실을 특정 항체 아미노산 서열 또는 영역으로 도입하거나, 또는 아미노산 서열을 화학적으로 유도체화하는 돌연변이유발 방법에 의해 수득된 항체, 예컨대, 돌연변이체 항체 또는 항체의 단편을 지칭한다. 예컨대, 무작위화 기술, 또는 HCAb 조작을 위해 사용된 바와 같은 도메인 결실에 의해 수득된, 원하는 위치에서의 점 돌연변이를 비롯한, 임의의 공지된 돌연변이유발 방법이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 위치는 임의의 가능한 아미노산 또는 항체 서열을 무작위화하기 위한 바람직한 아미노산의 선택과 함께 무작위로 선택된다. 용어 "돌연변이유발"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 변경하기 위한 당업계에서 인정받은 임의의 기술을 의미한다. 바람직한 타입의 돌연변이유발은 오류 유발 PCR 돌연변이유발, 포화 돌연변이유발 또는 다른 부위 지정 돌연변이유발을 포함한다.
항원 결합 측면에서 항체의 기능적 활성은 항원이 세포 표면 또는 세포내 또는 마이크로비드, 예를 들어, 루미넥스(Luminex)에서 발현될 때, 전형적으로 ELISA 검정법, BIA코어(BIAcore) 검정법, 옥테트(Octet) BLI 검정법, 또는 유세포 분석법-기반 검정법으로 측정된다.
기능적으로 활성인 변이체는 예컨대, 임의의 항체 도메인을 변형시켜 특정 돌연변이를 도입하기 위해, 또는 모체 분자의 단편을 생성하기 위해 예컨대, 모체 항체, 예컨대, 면역글로불린의 특정 천연 구조, 예컨대, IgG1 구조를 갖는 모노클로날 항체의 서열을 변이시켜 표적 항원을 인식하는 데 있어 동일한 특이성을 갖되, 모체 구조와는 상이한 구조를 갖는 변이체를 수득함으로써 수득할 수 있다.
특정 기능적으로 활성인 변이체는 하나 이상의 기능적으로 활성인 CDR 변이체 또는 모체 항체를 포함하고, 이는 각각 모체 CDR 서열 중 적어도 하나의 점 돌연변이를 포함하고, 모체 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성, 바람직하게, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 그로 구성된다.
특정 변이체는 예컨대, 모체 항체의 기능적으로 활성인 변이체이고, 여기서, 모체 CDR 서열은 인간 프레임워크 서열 내로 도입되고, 여기서, 임의적으로, 각 모체 CDR 서열의 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 잔기는 모체 항체 또는 인간화 항체의 안정성, 특이성 및 친화도를 개선시키기 위해 점 돌연변이를 도입함으로써 추가로 돌연변이화될 수 있다.
구체적으로, 항체는 모체 항체의 임의의 CDR 서열의 기능적으로 활성인 CDR 변이체를 포함할 수 있고, 여기서, 기능적으로 활성인 CDR 변이체는
a) 모체 CDR 서열 중 1, 2, 또는 3개의 점 돌연변이, 바람직하게, 여기서, 각 CDR 서열 중 점 돌연변이의 개수는 0, 1, 2, 또는 3개인 것; 및/또는
b) 모체 CDR 서열의 4개의 C-말단 또는 4개의 N-말단, 또는 4개의 중심 아미노산 위치 중 임의의 것에서의 1 또는 2개의 점 돌연변이; 및/또는
c) 모체 CDR 서열과 적어도 60%의 서열 동일성 중 적어도 하나를 포함한다.
바람직하게, 여기서, 기능적으로 활성인 변이체 항체는 본원에 기술된 바와 같은 기능적으로 활성인 CDR 변이체 중 적어도 하나를 포함한다. 구체적으로, 기능적으로 활성인 CDR 변이체 중 하나 이상의 것을 포함하는 기능적으로 활성인 변이체 항체는 모체 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 특이성을 갖는다.
구체적인 측면에 따라, 점 돌연변이는 하나 이상의 아미노산의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입 중 임의의 것이다.
항체 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는 당업계에 널리 공지된 방법, 예컨대, CLUSTALW (문헌 [Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31:3497, 2003])에 따라, 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 최대 서열 동일성(%)을 달성하기 위해 갭을 도입한 후, 및 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서, 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 중의 동일한 아미노산 잔기의 백분율(%)로서 정의된다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
항체 변이체는 구체적으로 예컨대, 당조작(glycoengineering)에 의해 생산되고, 기능성이며, 기능성 등가물로서 작용할 수 있고, 예컨대, 특정 표적에 결합하고, 상이한 기능성 특성을 포함하는, 특정 글리코실화 패턴을 갖는 호몰로그(homolog), 유사체, 단편, 변형 또는 변이체를 포함하는 것으로 이해된다. 항체는 글리코실화되거나, 또는 글리코실화되지 않은 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 재조합 항체는 항체를 발현하는 숙주 세포에 의해 결정되는 바와 같이 분자의 특이적 글리코실화를 허용하도록 적절한 포유동물 세포에서 발현될 수 있거나, 또는 글리코실화 기구가 결여된 원핵 세포에서 발현되고, 그 결과로 글리코실화되지 않은 단백질이 생성될 수 있다.
항체 도메인, 특히, 불변 항체 도메인의 "베타 시트" 또는 "베타 가닥"이라는 용어는 본원에서 하기 방식으로 이해된다. 항체 도메인은 전형적으로 적어도 2 또는 3개의 백본 수소 결합에 의해 측면으로 연결된 적어도 2개의 베타 가닥으로 구성되어 일반적으로 꼬이고 주름진 시트를 형성한다. 베타 가닥은 상기와 같은 확장된 입체형태를 채택하고, 적어도 하나의 다른 가닥에의 백본 수소 결합에 관여하여 베타 시트를 형성하는, 전형적으로 3 내지 10개의 아미노산 길이의 아미노산의 단일 연속 스트레치이다. 베타 시트에서, 대부분의 베타 가닥은 다른 가닥에 인접하게 배열되어 있고, 이의 이웃과 광범위한 수소 결합 네트워크를 형성하고, 여기서, 한 가닥의 백본에 있는 N-H 기는 인접한 가닥의 백본에 있는 C=O 기와 수소 결합을 확립한다.
항체 불변 도메인, 예컨대, CL (Cκ, Cλ), CH1, CH2 또는 CH3 도메인의 구조는 루프로 연결된 베타 가닥으로 구성된 가변 도메인의 구조와 유사하며, 그 중 일부는 짧은 알파-나선 스트레치를 포함한다. 다양한 Fc 결정 구조의 x선 결정학적 B 계수로부터 알 수 있는 바와 같이, 프레임워크는 대부분 강성이고, 루프는 비교적 더 큰 가요성을 띤다. 항체 불변 도메인은 전형적으로 베타-시트를 형성하는 7개의 베타 가닥을 갖고 (A-B-C-D-E-F-G), 여기서, 베타 가닥은 루프를 통해 연결되고, 3개의 루프는 도메인의 N-말단 팁에 위치하고 (A-B, C-D, E-F), 추가로 3개의 루프는 도메인의 N-말단 끝에 위치한다 (B-C, D-E, F-G). 도메인의 "루프 영역"은 베타 가닥의 영역 사이에 위치하는 단백질 부분을 지칭한다 (예를 들어, 각 CH3 도메인은 N-말단에서 C-말단으로 방향으로 A에서 G까지 7개의 베타 시트를 포함한다).
특정 실시양태에서, 항체 도메인은 야생형 아미노산 서열, 예컨대 동물 (인간 포함) 기원의 것, 또는 인공 포함 돌연변이를 포함할 수 있고, 예컨대, 또 다른 도메인, 예컨대, 항체 도메인의 베타-시트 영역을 연결하는 도메인간 이황화 브릿지와의 쌍형성을 촉진시키는 돌연변이, 놉 및/또는 홀 돌연변이, 또는 가닥 교환을 포함하기 위해 이종성 서열로 대체된 하나 이상의 베타 가닥 중 적어도 일부를 가질 수 있다.
특정 도메인 돌연변이는
a) 추가의 도메인내 이황화결합에 의한 항체 도메인, 및/또는
c) 추가의 쇄간 이황화 브릿지에 의한 항체 도메인의 2개의 쇄를 안정화시키기 위해 추가의 도메인간 또는 쇄간 이황화 브릿지를 형성할 수 있는, 예컨대, Cys 잔기과 같은 새 (추가) 아미노산 잔기의 도입을 포함할 수 있다.
이황화결합은 일반적으로 두 시스테인의 티올 기 또는 아미노산을 형성하는 다른 티올의 산화로부터, 또는 아미노산 측쇄의 S 원자를 연결하여 인공 이황화 브릿지를 형성하는 아미노산 유사체의 티올 기의 산화로부터 형성된다. 구체적으로, 시스테인은 추가 시스테인 변형을 보장하는 한 쌍의 도메인 사이에 (추가 아미노산 또는 아미노산 치환으로서) 삽입되어 이황화결합 형성에 의해 안정화된 도메인 쌍을 생산할 수 있다.
항체는 항체 라이브러리의 각 결합 부위에 있는 CDR 서열이 폴딩되어 형성된 항원 결합 부위를 1차 스크리닝하여 특정 바인더를 선택함으로써 제조될 수 있다. 다음 단계로서, 선택된 라이브러리 구성원은 모든 종류의 항체 작제물, 예컨대, 전장 면역글로불린 또는 이의 항원 결합 단편을 조작하는 데 사용될 수 있는 CDR 서열의 공급원 (또는 항원 결합 및 심지어 표현형 특성을 조정하기 위해 추가로 변형될 수 있는 모체 CDR 서열)으로서 작용할 수 있다.
항체 라이브러리 (예컨대, 동일한 표적 항원을 인식하는 특정 항체 작제물의 레퍼토리, 또는 특정 동물 또는 품종, 예컨대, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 항체의 나이브 라이브러리를 포함, 상기 라이브러리는 상이한 표적 항원을 인식하는 항체의 레퍼토리 포함)는 각 항체가 선택된 디스플레이 시스템 또는 격납 장치에 적절하게 제시되는 것인 항체 (예컨대, 본원에 기술된 HCAb) 세트 또는 컬렉션을 지칭한다.
특정 디스플레이 시스템은 주어진 단백질, 예컨대, 항체, 예컨대, 본원에 기술된 HCAb를 이의 코딩 핵산, 예컨대, 이의 코딩 mRNA, cDNA 또는 유전자와 커플링시킨다. 따라서, 라이브러리의 각 구성원은 그 위에 제시되는 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 디스플레이 시스템은 제한 없이, 세포, 바이러스, 예컨대, 파지, 리보솜, 진핵 세포, 예컨대, 효모, 플라스미드를 포함한 DNA, 및 mRNA를 포함한다.
임의의 항체 유전자 다양성 라이브러리는 상기 목적을 위해 사용될 수 있으고, 예컨대, 다수의 개별 라이브러리 구성원을 포함하여 항체 서열의 다양성을 생성하거나, 예컨대, 안정화되거나, 또는 기능적으로 활성인 라이브러리 구성원이 풍부한 미리 선택된 라이브러리를 사용한다. 예를 들어, 디스플레이 시스템은 특정 표적에 결합하는 라이브러리 구성원으로 풍부해질 수 있다.
라이브러리는 예를 들어, 쇄 셔플링 방법을 포함하는 널리 공지된 기술에 의해 구축될 수 있다. 중쇄 셔플링을 위해, 항체는 예컨대, 인간 VH 유전자 레퍼토리를 포함하는 벡터로 클로닝되어 파지 항체 라이브러리 형질전환체를 생성한다. 추가 방법은 항체의 CDR의 부위 지정 돌연변이유발, 또는 NNK 코돈-함유 돌연변이성 올리고뉴클레오티드의 적용과 함께 표적화된 잔기의 전체 무작위화, 또는 간명한 돌연변이유발을 이용하는 표적화된 잔기의 부분적 무작위화를 이용하여 부분 또는 전체 CDR이 무작위화되는 CDR 무작위화를 포함하고, 여기서, 표적화된 아미노산 잔기를 코딩하는 위치에 있는 올리고뉴클레오티드는 원래의 뉴클레오티드 염기 쪽으로 편향된 혼합물을 포함한다. 대안적으로, 라이브러리는 PCR 반응에서 dNTP 유사체, 오류 유발 폴리머라제, 또는 Mn2+ 이온 첨가를 적용하여 오류 유발 PCR을 사용함으로써 구축될 수 있다.
인간 항체 라이브러리 작제의 디자인을 코딩하는 유전자의 제조에 다양한 기술이 이용가능하다. 서열이 오버랩핑 단편으로 나누어진 후, 이어서, 합성 올리고뉴클레오티드로 제조되는 것인 완전한 합성 접근법에 의해 DNA를 제조할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드를 함께 혼합하고, 먼저 약 100℃로 가열하고, 이어서, 주변 온도로 천천히 냉각시킴으로써 서로 어닐링시킨다. 상기 어닐링 단계 후, 합성에 어셈블리된 유전자를 직접 클로닝하거나, 또는 클로닝 전에 PCR에 의해 증폭시킬 수 있다. 이는 특히 대규모 단일 포트 인간 라이브러리가 바람직하고, 작제 프로세스에 방대한 리소스가 이용가능할 때 바람직하다.
특정 방법은 직접 바인더 선택 및 내재화 파지 항체 선택을 위해 파지, 파지미드 및/또는 효모 라이브러리를 사용한다. 예컨대, 쿤켈(Kunkel) 방법 (문헌 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 82:488, 1985]), 또는 DpnI 방법 (문헌 [Weiner, et al., Gene 151:119, 1994])과 같은 부위 지정 돌연변이유발을 위한 추가 방법이 라이브러리 인서트 생성을 위해 사용될 수 있다.
"항원 특이적 라이브러리"는 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 항체의 존재에 대해 심문된 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드)의 라이브러리를 지칭한다. 상기 라이브러리는 임의의 항원 군에 대해, 또는 특정 항원에 대해 특이성을 갖는 항체 서열로 한정되거나, 또는 다르게는 그로 편형되거나, 또는 농축될 수 있다. 예시적인 항원 특이적 라이브러리는 항체 "최적화 라이브러리" (예컨대, "성숙화 라이브러리" 또는 "친화성 성숙화 라이브러리")이다.
본원에 기술된 구체적인 실시양태는 항원으로 면역화되기 전에 면역전 라이브러리를 포함하거나, 또는 발현하는 마우스를 기반으로 한다. 면역전 라이브러리는 상기 자연적으로 발생된 서열에 대해 항원 선택이 수행되기 전의 자연적으로 발생된 항체 서열과 유사한 서열 다양성을 갖는 나이브 라이브러리일 수 있다. 면역전 라이브러리는 면역전 레퍼토리를 반영하거나, 또는 모방하도록 디자인 및 제조될 수 있고/거나, V, D, J 유전자 컬렉션, 및 중쇄 서열 (예컨대, 공개적으로 공지된 생식계열 서열)의 다른 대규모 데이터베이스에 의해 정보를 얻은 합리적 디자인을 기반으로 디자인 및 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 인간 또는 비인간 레퍼토리에서 발견되는 가능한 V, D 및 J 다양성 뿐만 아니라, 연접부 다양성 (즉, N1 및 N2)을 나타내는 카세트는 단일 또는 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로서 드 노보 합성된다.
"최적화 라이브러리" 또는 "성숙화 라이브러리"는 항원에 대해 특이성을 갖는 항체 서열의 존재에 대한 라이브러리, 예컨대, 나이브 라이브러리 또는 면역전 라이브러리 심문시 확인되는 항체 서열의 적어도 하나의 특징을 증진 또는 개선시키기 위해 디자인된 라이브러리를 지칭한다. 상기 성숙화 라이브러리는 나이브 라이브러리로부터 수득되거나, 또는 나이브 라이브러리 심문시 확인되는, 하나 이상의 CDR; 하나 이상의 항원 결합 영역; 하나 이상의 VH 영역; 및/또는 하나 이상의 중쇄에 상응하는 핵산 서열을 시험관내 또는 생체내에서 추가로 돌연변이화하기 위해 디자인된 라이브러리 내로 도입하여 초기 (모체) 항체와 관련하여 도입된 다양성을 갖는 라이브러리를 생성함으로써 생성될 수 있다.
어레이 기술의 다른 예로서, B 세포 어레이의 수동 또는 컴퓨터 어드레싱가능한 위치에서 본원에 기술된 항체 작제물을 코딩하는 유전자를 생성하는 B 세포 클로닝이 사용될 수 있다. 로봇 또는 수동 방법을 사용하여 특정 타입의 항체 및/또는 특정 표적을 특이적으로 인식하는 것을 발현하는 세포만 다시 어레이하기 위해 상기 어레이를 조작할 수 있다.
특정 실시양태에서, 예컨대, 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된, 적합하게 면역화된 비인간 트랜스제닉 동물, 예컨대, 본원에 기술된 마우스로부터의 B 세포 클로닝, 또는 포유동물 세포 발현 라이브러리가 사용되거나, 또는 대안적으로, 안정적으로 형질전환된 포유동물 세포의 큰 집단은 항체 및 단백질 조작의 표준 방법 및 로봇 도구에 의해 생성된다. 개별 클론은 적합한 인큐베이터 중에서 및/또는 예컨대, -135℃에서의 보관하에 액체 질소 중 동결 세포 현탁액을 포함할 수 있는 장기간 보관 조건하에서, 또는 보관된 세포주의 회복을 가능하게 하는 다른 허용되는 조건하에서 플레이트 상에 어레이된 어드레싱가능한 웰에서 생존가능하게 유지된다.
항체와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "레퍼토리"는 다양한 표적 에피토프 또는 항원 특이성을 특징으로 하는 변이체와 같은 변이체 컬렉션을 지칭할 것이다. 전형적으로, 항체의 구조 (이는 또한 "스캐폴드"로도 불림)는 상기 레퍼토리에서 동일하지만, 다양한 CDR 서열을 가지고 있다.
당업계에 널리 공지된 바와 같이, 특정 결합 특징 및 친화성을 갖는 단백질을 확인 및 단리시키는 데 사용될 수 있는 다양한 디스플레이 및 선택 기술이 존재하며, 예를 들어, 디스플레이 기술, 예컨대, 세포 및 비세포 방법, 및 특히, 동원된 디스플레이 시스템을 포함한다. 세포 시스템 중에서, 파지 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 효모 또는 다른 진핵 세포 디스플레이, 예컨대, 포유동물 또는 곤충 세포 디스플레이가 사용될 수 있다. 동원 시스템은 예컨대, 시험관내 디스플레이 시스템과 같이, 가용성 포맷의 디스플레이 시스템, 그들 중에서 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 핵산 디스플레이에 관한 것이다.
표적에 결합할 수 있는 항원 결합 구조를 디스플레이하는 라이브러리 구성원에 대한 라이브러리 스크리닝은 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 스크리닝 단계는 1회 또는 여러 라운드의 선택을 포함할 수 있다.
표적 항원에 결합할 수 있는 항체를 확인하는 데 적합한 임의의 스크리닝 방법이 사용될 수 있다. 특히, 선택 라운드는 상기 항원 또는 이의 에피토프에 결합하는 항체를 선택하기 위해 상기 표적의 존재하에 라이브러리를 인큐베이션시키는 것을 포함할 수 있다.
일단 원하는 구조를 가진 항체를 확인하고 나면, 예를 들어, 하이브리도마 기술 또는 재조합 DNA 기술을 비롯한, 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 상기 항체를 생산할 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 적절한 비인간 숙주 동물, 예컨대, 본원에 기술된 마우스를 면역화시켜, 면역화에 사용되는 항원에 특이적으로 결합하게 되는 항체를 생산하거나, 또는 생산할 수 있는 림프구를 활성화시킨다. 대안적으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 형질세포종 세포와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다.
하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지는 항원에 대한 모노클로날 항체 생산을 위해 검정된다. 바람직하게, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 유세포 분석법, 면역침전법에 의해 또는 시험관내 결합 검정법, 예컨대, 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)에 의해 결정된다.
또 다른 구체적인 예에 따라, 재조합 모노클로날 항체는 필요한 항체 쇄를 코딩하는 DNA를 단리시키고, 널리 공지된 재조합 발현 벡터, 예컨대, 본원에 기술된 항체 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 또는 발현 카세트(들)를 이용하여 발현을 위해 코딩 서열로 재조합 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 재조합 숙주 세포는 원핵 및 진핵 세포일 수 있다.
구체적인 측면에 따라, 코딩 뉴클레오티드 서열은 항체를 인간화하거나, 또는 항체의 친화성 또는 다른 특징을 개선시키기 위해 유전자 조작하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 인간 불변 영역과 유사하도록 조작될 수 있다. 표적 항원에 대한 더 큰 친화도를 얻기 위해 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 변이가 항체에 이루어질 수 있고, 표적 (에피토프 또는 항원)에 대한 이의 결합 능력을 여전히 유지할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
다양한 수단에 의한 항체 분자의 생산은 일반적으로 잘 이해되고 있다. 항체 생산과 관련된 다양한 기술은 예컨대, 문헌 [Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2014)]에 제공되어 있다.
모노클로날 항체는 예컨대, 배양물 중에서 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 제조하는 적합한 방법의 예는 문헌 [Kohler, et al., Nature 256:495, 1975]의 하이브리도마 방법 및 인간 B 세포 하이브리도마 방법 (문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133:3001, 1984]; 및 [Brodeur, et al., 1987, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, LB Schook, ed., (Marcel Dekker, Inc., New York), pp. 51-63]을 포함한다.
용어 "B 세포"는 (T 세포에 의해 지배되는 세포 매개 면역 반응과는 대조적으로) 체액성 면역 반응에서 큰 역할을 하는 림프구 타입을 지칭한다. B 세포의 주요 기능은 항원에 대한 항체를 생성하는 것, 구체적으로, 특정 항원에 특이적인 (BCR 복합체 형성하는) 세포 표면 항체를 발현하고, 항원 제시 세포 (APC)의 역할을 수행하고, 결국 항원 상호작용에 의한 활성화 후에는 항체를 분비하는 형질 세포 및 기억 B 세포로 발생한다. B 세포는 적응 면역계의 필수 성분이다. 구체적으로, 항원에 노출되면, B 세포는 활성화되고, 면역글로불린 발현 B 세포 변이체, 예컨대, 형질세포로도 불리는 형질 세포, 및 기억 세포로 분화된다.
본원에서 "B 세포 레퍼토리"로도 또한 지칭되는, 본원에서 B 세포와 관련하여 사용되는 용어 "레퍼토리"는 다양한 표적 에피토프 또는 항원 특이성을 포함하는 면역글로불린의 발현을 특징으로 하는 B 세포 변이체와 같은 변이체 컬렉션을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "표적"은 에피토프 또는 항원을 지칭할 것이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 특히 항원의 동물의 면역계에의, 또는 항체의 라이브러리에의 결과로서 항체의 결합 부위 (적어도 하나의 파라토프(paratope))에 의해 인식되는 것으로 나타난 모든 항원 및 표적 분자를 포함한다. 구체적으로, 본원에 기술된 항체에 의해 표적화된 바람직한 항원은 면역학적 또는 치료학적으로 관련이 있는 것으로 이미 입증되었거나, 면역학적 또는 치료학적으로 관련될 수 있는 분자, 특히, 임상 효능이 시험된 분자이다.
용어 "항원"은 전체 표적 분자 또는 상기 분자의 단편, 특히, 하부구조, 예컨대, 표적의 폴리펩티드 또는 탄수화물 구조를 설명하는 데 사용된다. 때때로 "에피토프," 예컨대, B 세포 에피토프, T 세포 에피토프로 지칭되는 상기 하부구조는 면역학적으로 관련될 수 있고, 즉, 천연 또는 모노클로날 항체에 의해 인식될 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "에피토프"는 특히 항원과 특정 항체 사이의 계면에 존재하는 분자 구조를 지칭할 것이고, 여기서, 에피토프와 상호작용하는 항체 표면은 "파라토프"로 지칭된다. 화학적으로, 에피토프는 탄수화물 서열 또는 구조, 불연속 에피토프 내의 펩티드 서열 또는 서열 세트, 지방산 또는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 항원 분자가 유기, 생화학적 또는 무기 물질인 경우, 이는 "합텐(hapten)"으로 지칭된다. 에피토프 또는 합텐은 유도체 또는 상기 물질의 임의 조합으로 구성될 수 있다. 에피토프가 폴리펩티드인 경우, 이는 일반적으로 펩티드에 적어도 3개의 아미노산, 바람직하게, 8 내지 50개의 아미노산, 더욱 바람직하게, 약 10-20개의 아미노산을 포함할 것이다. 에피토프는 선형 또는 불연속 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 또는 탄수화물 쇄의 1차 서열의 단일 세그먼트로 구성된다. 선형 에피토프는 연속적이거나, 오버랩핑될 수 있다. 불연속 에피토프는 폴리펩티드를 폴딩하여 3차 구조를 형성함으로써 결합하는 아미노산 또는 탄수화물로 구성되며, 아미노산은 선형 서열에서 서로 반드시 인접할 필요는 없다. 구체적으로, 에피토프는 진단 관련 분자의 적어도 일부이고, 즉, 샘플 중 에피토프의 부재 또는 존재는 질환, 또는 환자의 건강 상태 또는 제조 공정 상태 또는 환경 및 식품 상태와 정질적 또는 정량적인 상관관계를 갖는다. 에피토프는 또한 치료 관련 분자, 즉, 질환 과정을 변화시키는 특정 결합 도메인에 의해 표적화될 수 있는 분자의 적어도 일부일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "특이성" 또는 "특이적 결합"은 이종성 분자 집단 중 관심의 대상이 되는 동족 리간드를 결정짓는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예컨대, 면역검정 조건) 하에서 항체는 이의 특정 표적에 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 분자에는 상당한 양으로 결합하지 않는다. 특이적 결합이란, 표적 동일성, 높거나, 중간 정도이거나, 또는 낮은 결합 친화도 또는 결합력의 관점에서 선택에 따라 결합이 선택적인 것을 의미한다. 선택적 결합은 일반적으로 결합 상수 또는 결합 역학적 성질이 샘플 중 경쟁 표적과 적어도 10배 다른 경우, 바람직하게, 그 차이가 적어도 100배, 더욱 바람직하게, 적어도 1000배인 경우 달성된다.
특이적 결합은 유사한 항원, 또는 다른 종의 동일한 항원 (유사체)와의 특정 교차 반응성을 배제하지 않는다. 예를 들어, 결합 엔티티는 또한 바람직하게 임상전 동물 연구를 용이하게 하는 인간 표적과 유사한 설치류 또는 영장류 표적과 교차 반응할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "유전자좌"는 발현된 생성물을 코딩하는 DNA 코딩 서열 또는 DNA의 세그먼트, 즉, 게놈 서열, 예컨대, 숙주 유기체의 게놈의 일부, 또는 예컨대, 표적 부위에, 예컨대, 정의된 제한 부위 또는 상동성 영역에 통합되는 벡터의 일부를 지칭한다.
제한 부위는 적절한 리딩 프레임에 발현 카세트를 삽입하도록 디자인될 수 있다. 전형적으로, 외래 (본원에서는 외인성으로도 또한 지칭) DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에 삽입되고, 벡터에 의해 전달가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포로 운반된다.
전형적으로, 유전자좌는 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 유전자 또는 하나 이상의 유전자 세그먼트(들)를 포함한다. 용어 "유전자좌"는 유전자가 능동적으로 전사되거나, 또는 무손상이라는 것을 암시하지 않는다. 불활성화된 유전자가 포함될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "면역글로불린 중쇄 유전자좌"는 하나 이상의 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트를 포함하는 VH 도메인을 코딩하는 유전자좌에 관한 것이다. 바람직하게, 본원에서 언급된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 적어도 하나의 트랜스제닉 핵산 서열을 포함하는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 구체적으로, 본원에 기술된 Cγ 유전자 세그먼트이다. 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 V, D 및 J 유전자 세그먼트는 각각 VH, D 및 JH 코딩 서열, 및 VH, D 및 JH 코딩 서열 각각의 발현을 제어하도록 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 한 구체적인 실시양태에 따라, VH, D 및 JH 코딩 서열은 인간의 것이고, VH 중쇄 유전자좌의 발현 제어 서열은 뮤린의 것이고, 바람직하게, 내인성 발현 제어 서열이며, 따라서, 키메라 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 제공한다.
V 유전자 세그먼트 복잡성은 유전자좌에 존재하는 V 유전자 세그먼트의 개수를 증가시킴으로써, 또는 각각이 상이한 V 유전자 세그먼트를 포함하는 것인 상이한 유전자좌를 사용함으로써 증가될 수 있다.
바람직하게, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역은 임의의 척추동물 종으로부터 유래되거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 키메라인, 5 내지 120개 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120개) 또는 그 초과의 상이한 V 유전자 세그먼트를 포함한다.
바람직하게, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역은 2 내지 40개 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30 또는 40개) 또는 그 초과의 D 유전자 세그먼트를 포함한다. D 유전자 세그먼트는 임의의 척추동물 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 키메라일 수 있다.
바람직하게, 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 가변 영역은 2 내지 20개 (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 또는 20개) 또는 그 초과의 J 유전자 세그먼트를 포함한다. J 유전자 세그먼트는 임의의 척추동물 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 키메라일 수 있다.
V 유전자 세그먼트는 DNA 수준에서 D 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트와 재조합하여 기능성 VDJ 엑손을 형성할 수 있어야 한다. 전사 및 RNA 스플라이싱 후, VDJ 엑손 및 중쇄 불변 (이펙터) 영역 (수개의 엑손 포함 가능)은 mRNA 전사체에서 인접하게 되고, 번역을 위해 기능성을 띠고; 본 발명에 따라, 핵산 발현시, 중쇄-단독 항체를 생성하게 된다.
작동상, 중쇄 불변 영역은 B 세포에서 VDJ 엑손과 함께 발현될 수 있는, 자연적으로 발생되거나, 또는 조작된 유전자 세그먼트에 의해 코딩된다.
항체는 이소타입 또는 클래스로 공지된 다양한 변종으로 발생할 수 있다. 태반 포유동물에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 공지된 5개의 항체 이소타입이 존재한다. 이는 각각 면역글로불린 (때때로 항체와 상호교환적으로 사용되는 명칭)을 나타내는 "Ig" 접두사로 명명되고, 이의 생물학적 특성, 기능적 위치 및 다른 항원을 처리하는 능력에서 상이하다. 항체 이소타입의 다른 접미사는 항체가 포함하는 상이한 타입의 중쇄를 나타내며, 각 중쇄 클래스는 알파벳순으로 명명된다: α (알파), γ (감마), δ (델타), ε (엡실론) 및 μ (뮤). 이는 각각 IgA, IgG, IgD, IgE 및 IgM을 생성한다.
본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 중쇄 불변 영역은 적어도, IgG 타입의 중쇄-단독 항체가 생성될 수 있도록 기능성 CH1 도메인 없이 발현되는 것인, 본원에 기술된 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함한다. 각각의 중쇄 불변 영역은 또한 Cδ, Cμ, Cε 및 Cα 유전자 세그먼트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 중쇄 불변 영역 유전자 세그먼트를 포함할 수 있다. 중쇄 불변 영역 유전자 세그먼트는 요구되는 바람직한 클래스 또는 항체 클래스의 혼합물에 따라 선택된다.
예를 들어, CH1 도메인의 전부 또는 일부의 결실을 포함하는 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 이종성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 전부 또는 일부의 발현은 임의적으로, 조작된 Igh 유전자좌에 존재하는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 이소타입에 의존하는 일부 또는 모든 IgG 이소타입을 생성할 것이다.
대안적으로, 선택된 항체 혼합물이 수득될 수 있다. 예를 들어, IgA 및 IgM은 중쇄 불변 영역이 Cα 및 Cμ 유전자 세그먼트를 포함하는 경우에 추가로 수득될 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실, 예를 들어, CH1 엑손의 결실을 포함한다. 상기 결실은 CH1 도메인의 기능을 박탈하는 한, CH1 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부분적 결실일 수 있다. 바람직하게는, 부분 결실은 샤페론-결합 도메인, 구체적으로, BiP 샤페론-결합 도메인을 제거하거나 불활성화시킨다.
임의적으로, 이종성 중쇄 유전자좌는 Cμ-결핍이거나, 불활성인 Cμ 유전자 세그먼트를 포함한다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 기능 상실 돌연변이, 예컨대, 정지 코돈 도입, 또는 Cμ 유전자 세그먼트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부의 결실에 의해 불활성이다. 구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 CH1, CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인의 결실에 의해 불활성이다.
구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 Cμ 유전자 세그먼트를 코딩하는 전체 뉴클레오티드 서열의 결실에 의해, 또는 상기 서열의 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99% 중 적어도 어느 하나의 결실에 의해 불활성이다.
구체적으로, Cμ 유전자 세그먼트는 이의 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 중 어느 하나 또는 그들 모두에 기능 상실 돌연변이, 결실 또는 불활성화 돌연변이, 바람직하게, 정지 코돈 도입을 포함한다. 바람직하게, Cμ 유전자 세그먼트는 CH1, CH2 및 CH3 도메인에 정지 코돈을 포함한다.
구체적인 예에서, 인간에서 치료적 적용을 위해 사용되는 HCAb의 유도를 위해, 유전자좌 중에 존재하는 VDJ 코딩 서열은 인간 생식계열 서열로부터 유래되고, 임의적으로 변형될 것이고, 불변 영역은 숙주 동물이 설치류, 예를 들어, 마우스인 경우, 설치류 기원의 것이 될 수 있다. 이어서, 가용성 인간 VH 결합 도메인 및 설치류 불변 이펙터 영역을 포함하는 선택된 중쇄-단독 항체를 클로닝하고, 설치류 이펙터 영역을 선택된 인간 불변 이펙터 영역으로 대체하거나, 또는 가용성 VH 도메인을 사용하여 대안적 VH 융합 단백질, VH 도메인 항체 복합체 등을 유도할 수 있다.
중쇄-단독 항체가 수의학적 또는 대안적 목적을 위해 사용되는 또 다른 구체적인 예에 따라, V, D 및 J 코딩 서열은 바람직하게, 의도된 목적에 최상으로 적합화된 척추동물 또는 포유동물로부터 유래된다. 예를 들어, V 유전자 세그먼트 및 D 및 J 유전자 세그먼트는 예컨대, 수의학, 산업, 농업, 진단 또는 시약 적용과 같은 의도된 용도에 의존하여 다른 포유동물 (예컨대, 마우스, 래트, 돼지, 소, 염소, 양, 낙타, 말 등)로부터 유래될 수 있다.
"중쇄 불변 영역 엑손" ("CH 엑손")은 자연적으로 발생된 척추동물, 그러나, 특히, 포유동물의 CH 엑손의 서열을 포함한다. 이는 클래스 특이적 방식에 따라 달라진다. 예를 들어, IgG 및 IgA에는 자연적으로 CH4 도메인이 결여되어 있다. 용어 "CH 엑손"은 또한 CH 엑손이 중쇄 불변 영역의 성분일 때, 본원에 정의된 바와 같은 기능성 HCAb를 형성할 수 있는 한, 이의 범주 내에 이의 유도체, 상동체 및 단편을 포함한다.
본원에 기술된 구체적인 실시양태에서, 트랜스제닉 마우스의 내인성 카파 및 람다 경쇄 유전자좌는 하나 이상의 변형, 예컨대, 기능 상실 돌연변이, 또는 내인성 κ 및/또는 λ 경쇄 유전자좌, 또는 이의 일부의 결실에 의해 비기능성이다.
예시적인 적합한 변형은 하기와 같이 이해된다. 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키기 위해, 가장 Cκ 원위 Vκ 유전자 세그먼트인 Vκ2-137과 가장 Cκ 근위 Jκ인 Jκ5 사이의 전체 3.2 Mb 게놈 영역을 레콤비나제 매개 카세트 교환 (RMCE) 전략법에 의해 결실시킨다. Vκ2-137 상류 및 Jκ5 하류의 적절한 표적화 서열의 삽입, 이어서, 개재 게놈 영역의 시험관내 Cre 매개 결실에 의해 수행된다. 유사한 전략법을 사용하여 람다 쇄 유전자좌를 불활성화시킨다. 마우스 람다 V 유전자 세그먼트 (IglV)를 포함하는 전체 194 Kb 영역을 RMCE에 의해 결실시킨다. 이러한 경우에서, 적절한 표적화 서열은 IglV2 상류 및 IglV1 하류에 삽입되고, 이어서, 개재 게놈 영역의 시험관내 Cre 매개 결실이 이루어진다.
유전자좌는 예컨대, 본원에 추가로 기술된 바와 같은 항체를 코딩하는 엑손을 발현 또는 함유하도록 조작될 수 있다.
재조합 유전자좌는 부위 특이적 편집 및/또는 재조합을 위한 다양한 종래 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직하게, 변형된 유전자좌는 유전자 세그먼트를 포함하는 DNA 조각 (본원에서 "공여자 DNA"로 지칭)을 변형된 버전의 비인간 동물 면역글로불린 유전자좌, 예컨대, 숙주 유기체의 중쇄 유전자좌 (본원에서 "수용자 대립유전자"로 지칭) 내로 삽입함으로써 생성된다. 수용자 대립유전자는 부위 특이적 DNA 레콤비나제, 예컨대, Cre 레콤비나제에 대한 인식 부위 (loxP 부위 또는 돌연변이화된 버전의 loxP 부위)를 함유할 수 있다. 공여자 DNA는 동일한 Cre 레콤비나제 인식 부위 측면에 (5'-말단 및 3'-말단, 양측 모두, 예컨대, loxP 부위가 있는 한쪽에, 및 돌연변이화된 버전의 loxP 부위가 존재하게 되는 나머지 다른 한쪽에) 위치할 수 있다. Cre 레콤비나제는 공여자 DNA의 수용자 대립유전자 내로의 삽입을 촉매화시키는 데 사용될 수 있다.
대안적인 실시양태에서, 유전자 세그먼트는 배타적이지는 않더라도, 주로 상동 재조합에 의해 면역글로불린 유전자좌 내로 도입된다. 상기 실시양태에서, 항체 코딩 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 서열 (즉, 표적 서열과 상동성이고, 하이브리드화할 수 있는, 5'-말단 및 3'-말단, 둘 모두의 뉴클레오티드 서열) 측면에 위치하는 게놈 표적화 상동성 아암으로 구성된 표적화 서열 또는 벡터가 사용된다. 상기 게놈 상동성 아암은 예컨대, 면역글로불린 중쇄를 코딩하는 DNA와 같은 DNA를 면역글로불린 유전자좌 내로의 삽입을 촉진한다. 표적화 서열은 변형시키고자 하는 면역글로불린 유전자 유전자좌의 영역 측면에 위치하거나, 또는 그에 인접하게 존재하는 세포 게놈 중의 DNA 서열에 상동성인 서열을 지칭한다. 측면에 위치하거나, 또는 인접한 서열은 그 자체로 유전자좌 내에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 세포의 게놈 중 코딩 서열의 상류 또는 하류에 존재할 수 있다. 표적화 서열은 세포 게놈 내로 삽입시키고자 하는 서열, 예컨대, 재조합 부위의 서열이 벡터의 표적화 서열 측면에 위치하도록 세포 형질감염에서 사용하기 위한 재조합 DNA 벡터 내로 삽입된다.
예컨대, 삽입 또는 결실과 같은 게놈의 유전적 변이를 달성하기 위해 상동 재조합이 사용되는 많은 경우에, 추가 변형은 원하는 결과가 달성될 수 있는 가능성을 증가시키기 위해 조작된 부위 특이적 엔도뉴클레아제의 사용을 포함할 것이다. 상기 엔도뉴클레아제는 표적 게놈의 고유한 서열에 대해 고도의 특이성을 갖도록 조작될 수 있고, 그가 인식하는 부위에서 이중 가닥 DNA 파단(double-stranded DNA break)을 일으키기 때문에 가치가 있다. 이중 가닥 파단은 파단 바로 옆 인근에서 DNA와의 표적 상동성을 보유하는 표적 벡터와의 상동 재조합을 촉진한다. 따라서, 표적화 벡터와, 벡터에 의해 표적화되는 영역 내의 또는 그에 근접한 DNA를 절단하는 부위 특이적 엔도뉴클레아제의 조합은 전형적으로 표적화 벡터 단독의 사용보다 훨씬 더 높은 상동 재조합 효율을 가져온다. 추가로, 하나 이상의 부위 특이적 엔도뉴클레아제, 및 하나의 아암(arm)은 결실시키고자 하는 영역의 한쪽을 표적화하고, 다른 하나는 나머지 다른 한쪽을 표적화하는 2개의 표적화 상동성 아암으로 구성된 표적화 벡터를 사용하여 게놈 결실 생성을 촉진시킬 수 있다.
부위 특이적 재조합은 레콤비나제 인식에 필요한 짧은 특정 DNA 서열이 재조합이 일어나는 유일한 부위라는 점에서 일반 상동 재조합과 다르다. 부위 특이적 재조합은 부위를 인식하고, 이들 부위에서 재조합을 촉매화하기 위해 특화된 레콤비나제를 필요로 한다. 각각 레콤비나제 및 특정 동족 표적 부위를 포함하는 다수의 박테리오파지 및 효모 유래 부위 특이적 재조합 시스템은 DNA 통합의 목적을 위해 진핵 세포에서 작동하는 것으로 나타났으며 따라서 본원에 기술된 바와 같은 사용에 적용가능하다. 이는 박테리오파지 P1 Cre/lox, 효모 FLP-FRT 시스템 및 티로신 패밀리의 부위 특이적 레콤비나제의 Dre 시스템을 포함한다. 상기 시스템 및 사용 방법은 선행 기술에 잘 설명되어 있다. 레콤비나제 매개 카세트 교환 (RMCE) 절차는 적절한 레콤비나제 (예컨대, Cre 또는 Flp)와 함께 야생형 및 돌연변이 loxP (또는 FRT 등) 부위의 조합 사용 및 음성 및/또는 양성 선택에 의해 촉진된다. RMCE는 사용 부위가 서로 동일하거나, 선택 부재하에서 발생하겠지만, 삽입 반응보다 절제 반응이 선호되고, (양성 선택을 통합하지 않고) 적절하게 돌연변이화된 세포에 대한 농축이 없기 때문에, 프로세스의 효율은 감소된다.
예컨대, 박테리오파지 람다 Int 인테그라제, HK2022 인테그라제와 같은 티로신 패밀리의 다른 시스템 및 추가로, 예컨대, 박테리오파지 phiC31, R4Tp901 인테그라제와 같은 별도의 세린 패밀리의 레콤비나제에 속하는 시스템은 이의 각각의 재조합 부위를 사용하여 포유동물 세포에서 작동하는 것으로 알려져 있고, 이 또한 본원에 기술된 바와 같은 사용에 적용가능하다.
본원에 기술된 방법은 구체적으로 동일한 레콤비나제를 이용하지만, 부위 사이의 재조합을 촉진시키지 않는 부위 특이적 재조합 부위를 이용한다. 예를 들어, loxP 부위 및 돌연변이화된 loxP 부위는 숙주의 게놈 내로 통합될 수 있지만, Cre를 숙주에 도입해도 두 부위가 재조합되지는 않고; 오히려, loxP 부위는 또 다른 loxP 부위와 재조합할 것이고, 돌연변이화된 부위는 오직 유사하게 돌연변이화된 또 다른 loxP 부위와 유일하게 재조합할 것이다.
레콤비나제 매개 카세트 교환을 촉진시키는 데 두 클래스의 변이체 레콤비나제 부위가 이용가능하다. 하나는 부위의 8 bp 스페이서 영역 내에 돌연변이를 보유하고, 다른 하나는 13 bp 역반복부에 돌연변이를 갖는다.
스페이서 돌연변이, 예컨대, lox511 (문헌 [Hoess, et al., Nucleic Acids Res., 14:2287, 1986]), lox5171 및 lox2272 (문헌 [Lee and Saito, Gene, 216:55, 1998]), m2, m3, m7, 및 mil (문헌 [Langer, et al., Nucleic Acids Res., 30:3067, 2002])은 그 자신과 쉽게 재조합하지만, 현저히 감소된, 야생형 부위와의 재조합률을 보인다. 레콤비나제 매개 카세트 교환에 의한 DNA 삽입을 위한 상기 종류의 돌연변이 부위의 사용에 관한 예는 문헌 [Baer and Bode, Curr. Opin. Biotechnol., 12:473, 2001]에서 살펴볼 수 있다.
역반복 돌연변이는 제2 부류의 변이체 레콤비나제 부위를 나타낸다. 예를 들어, loxP 부위는 좌측 역반복부 (LE 돌연변이) 또는 우측 역반복부 (RE 돌연변이)에 변경된 염기를 포함할 수 있다. LE 돌연변이 lox71은 좌측 역반복부의 5' 말단에 야생형 서열에서 TACCG로 변이된 5 bp를 갖는다 (문헌 [Araki, Nucleic Acids Res., 25:868, 1997]). 유사하게, RE 돌연변이 lox66은 CGGTA로 변이된 5개의 3'-최단 염기를 갖는다. 역반복 돌연변이는 플라스미드 인서트를 염색체 DNA 내로 통합하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, LE 돌연변이는 "공여자" RE 돌연변이체가 그 내로 재조합되는 "표적" 염색체 loxP 부위로 사용될 수 있다. 재조합 후, RE 부위를 포함하는 DNA의 공여자 조각은 (LE 및 RE 역반복 돌연변이, 둘 모두를 포함하는) 이중 돌연변이 부위가 한쪽 측면에 위치하고, 나머지 다른 한쪽에는 야생형 부위가 측면에 윈치하는 게놈에 삽입되어 있는 것을 보게 될 것이다 (문헌 [Lee and Sadowski, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 80:1, 2005]). 이중 돌연변이는 야생형 부위와 충분히 다르기 때문에 Cre 레콤비나제에 의해 인식되지 않는 바, 따라서, 삽입된 세그먼트는 두 부위 사이의 Cre 매개 재조합에 의해 절제될 수 없다.
특정 측면에서, 부위 특이적 재조합 부위는 코딩 핵산 영역 또는 조절 서열과는 반대로 인트론 또는 유전자간 영역에 도입될 수 있다. 이는 동물 세포의 게놈에 부위 특이적 재조합 부위를 삽입할 때 적절한 유전자 발현에 필요한 임의의 조절 서열 또는 코딩 영역을 우발적으로 방해하는 것을 방지할 수 있다.
부위 특이적 재조합 부위의 도입은 종래 상동 재조합 기술에 의해 달성될 수 있다. 상기 기술은 참고문헌, 예컨대, 문헌 [Sambrook and Russell (2001) Molecular cloning: a laboratory manual, 3d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 및 [Nagy, (2003) Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3d ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press)]에 기술되어 있다.
게놈 내로의 특이적 재조합은 당업계에 공지된 바와 같이 양성 또는 음성 선택을 위해 디자인된 벡터를 사용하여 촉진될 수 있다. 대체 반응이 이루어진 세포의 식별을 용이하게 하기 위해, 적절한 유전자 마커 시스템이 사용될 수 있고, 예컨대, 선택 배지의 사용에 의해 세포가 선택될 수 있다. 그러나, 게놈 서열에는 실질적으로 대체 간격의 두 종점에, 또는 그에 인접하게 외부 핵산 서열이 확실히 없도록 하기 위해, 바람직하게, 마커 시스템/유전자는 대체된 핵산을 포함하는 세포의 선택 후에 제거될 수 있다.
레콤비나제는 정제된 단백질로 제공될 수 있거나, 레콤비나제 활성을 제공하기 위해 세포 내에서 일시적으로 발현되는 작제물로부터 발현될 수 있다. 대안적으로, 세포는 마커 유전자 및 연관된 재조합 부위가 결여된 자손을 생산하기 위해 상기 레콤비나제를 발현하는 동물과 교배될 수 있는 트랜스제닉 동물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 유전자와 관련하여 "내인성"이라는 용어는 유전자가 세포에 고유하다는 것, 즉, 유전자가 변형되지 않은 세포의 게놈에서 특정 유전자좌에 존재한다는 것을 나타낸다. 내인성 유전자는 (자연에서 발견되는) 야생형 세포의 해당 유전자좌에 존재하는 야생형 유전자일 수 있다. 내인성 유전자는 그가 게놈 중에 야생형 유전자와 동일한 유전자좌에 존재한다면, 변형된 내인성 유전자일 수 있다. 상기 변형된 내인성 유전자의 예로는 그 서열 내에 결실을 포함하거나, 외래 핵산이 삽입된 유전자가 있다. 내인성 유전자는 핵 게놈, 미토콘드리아 게놈 등에 존재할 수 있다. 구체적으로, 본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 본원에 기술된 바와 같은 변형을 포함하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자좌이다.
본원에 기술된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체적인 실시양태에서, 내인성 Cμ 유전자 세그먼트는 불활성으로 변형되지만, Cμ 유전자 세그먼트는 유전자좌 중 야생형 마우스에서와 동일한 위치에 존재한다.
대안적인 실시양태에서, 유전자 세그먼트는 전형적으로 본 시스템과 함께 사용되는 상동성 지정 수복에 의해서보다는 비-상동 말단 연결 접근법을 사용하는 CRISPR/Cas9 기술에 의해 면역글로불린 유전자좌에 도입된다 (예컨대, 문헌 [He, et al., Nuc. Acids Res., 44:e85, 2016] 참조).
본 발명의 맥락에서, 용어 "이종성"은 그가 위치하는 포유동물에 내인성이 아닌 본원에 기술된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 또는 유전자좌, 또는 내인성 서열의 대체 또는 제거에 의해 변형된 내인성 유전자좌를 의미한다.
본원에서, 핵산 요소, 예컨대, 핵산 작제물 예컨대, 면역글로불린 유전자 세그먼트, 또는 비코딩 또는 코딩 유전자 서열, 예컨대, 유전자, 또는 유전자좌와 관련된 용어 "트랜스제닉"은 유전자, 유전자 세그먼트, 및 유전자좌가 각각 세포에 고유하지 않거나 (즉, 동일한 종의 야생형 세포에서 세포 게놈 내의 동일한 위치에서 천연적으로 발생하지 않거나), 또는 세포에 대해 외래의 것으로 재조합 세포를 생산하고, 즉, 핵산 요소가 야생형 세포가 아닌 변형된 (재조합) 세포의 게놈에 존재한다는 것을 나타낸다. 트랜스제닉 유전자 세그먼트는 야생형 세포의 각각의 유전자좌 또는 위치와 상이한 유전자좌 또는 위치에 존재하는 야생형 유전자 세그먼트일 수 있다 (따라서, 동일한 유전자좌에서 자연적으로 발견되지 않는다). 트랜스제닉 유전자 세그먼트는 야생형 유전자 또는 유기체에서 발견되는 것과 다른 게놈의 다른 유전자좌에 존재한다면, (변형 또는 비변형된) 내인성 코딩 서열 또는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 트랜스제닉 핵산 요소의 예로는 변형된 내인성 핵산 요소, 예컨대, CH1 도메인에 결실 또는 변형을 포함하고, 이 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트 상류에, 따라서, 야생형 세포에서의 이의 각 위치와 상이한 위치에 통합되고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 Cμ 유전자 세그먼트 하류에 위치하는 것인 본원에 기술된 Cγ 유전자 세그먼트가 있다.
용어 "트랜스진"은 본원에서 세포, 특히, 숙주 동물의 세포의 게놈 내로 인공적으로 삽입되었거나, 또는 삽입될 예정인 유전 물질을 설명하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "트랜스진"은 핵산 분자 또는 요소, 예컨대, 숙주의 게놈 내로 도입되고, 포함될 수 있는 발현 작제물 및/또는 표적화 벡터에 포함된 핵산, 예컨대, 예를 들어, 이의 CH1 도메인 중 결실을 포함하는 본원에 기술된 Cγ 유전자 세그먼트를 지칭한다. 이로써, 숙주 유기체 (예컨대, 마우스)는 "트랜스제닉" 숙주로 조작된다.
용어 "재조합"은 숙주 세포에서 자연적으로는 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 재조합 또는 트랜스제닉 분자는 자연적으로는 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 자연적으로 발생된 서열을 포함할 수 있다. 재조합 또는 트랜스제닉 세포는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 세포가 트랜스제닉 또는 재조합 핵산을 수용하는 경우, 핵산은 세포에 대해 "외인성"이다.
용어 "재조합"은 특히, "유전 공학에 의해 제조되거나, 또는 이의 결과"라는 것을 의미한다. 대안적으로, "조작된"이라는 용어가 사용된다. 예를 들어, 항체 또는 항체 도메인은 조작된 항체 또는 도메인을 생성하기 위해 각각의 모체 서열을 조작함으로써 변이체를 생성하도록 변형될 수 있다. 재조합 숙주는 구체적으로 발현 벡터 또는 표적화 벡터를 포함하거나, 또는 특히, 숙주에 대해 외래인 뉴클레오티드 서열을 사용하여 재조합 핵산 서열을 함유하도록 유전적으로 조작되었다. 재조합 단백질은 각각의 재조합 핵산을 숙주에서 발현시켜 생산된다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "재조합 항체"는 면역글로불린, 및 특히, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체, 예컨대,
a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물 (예컨대, 마우스와 같은 비인간 동물), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체,
b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예컨대, 트랜스펙토마로부터 단리된 항체,
c) 재조합, 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및
d) 예컨대, 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 항체는 예를 들어, 항체 성숙 동안 발생하는 재배열 및 돌연변이를 포함하도록 조작된 항체를 포함한다
본 실시양태의 특정 측면에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 인간 면역글로불린 영역을 추가로 포함한다. 예를 들어, 신약 개발 목적으로, 부분 또는 완전 인간 항체를 생성하기 위해 내인성 마우스 면역글로불린 영역을 인간 면역글로불린 서열로 대체하기 위한 수많은 방법이 개발되었다. 상기 마우스의 예로는 예를 들어, 미국 특허 번호 7,145,056; 7,064,244; 7,041,871; 6,673,986; 6,596,541; 6,570,061; 6,162,963; 6,130,364; 6,091,001; 6,023,010; 5,593,598; 5,877,397; 5,874,299; 5,814,318; 5,789,650; 5,661,016; 5,612,205; 및 5,591,669에 기술되어 있는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트"는 인간 면역글로불린 유전자 세그먼트 코딩 서열, 구체적으로, 인간 IGH (VH, D 및 JH) 코딩 서열, 및 뮤린 발현 제어 서열을 포함하는 면역글로불린 유전자 세그먼트를 지칭하는 것으로 사용된다. 상기 키메라 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스는 부분적으로 인간인 도입된 외인성 면역글로불린 영역을 포함하는 게놈을 갖고, 여기서, 도입된 영역은 인간 가변 영역 코딩 서열, 및 도입된 영역은 인간 가변 영역 코딩 서열, 및 마우스 기원의 것이거나, 또는 마우스의 내인성 게놈의 것이고, 키메라 면역글로불린 유전자 세그먼트 또는 키메라 면역글로불린 유전자 유전자좌의 도입에 의해 마우스 게놈으로 녹킹되는 것인, 인간 서열의 발현을 제어하는 뮤린 비코딩 조절 서열을 포함한다. 특히, 뮤린 서열, 구체적으로, 뮤린 비코딩 및 조절 서열은 상응하는 마우스 내인성 서열, 즉, 내인성 야생형 면역글로불린 유전자좌의 서열과 동일한 서열을 기반으로 한다.
인간 면역글로불린 유전자 서열을 발현시키기 위한 목적의 본원에 기술된 바와 같은 뮤린 발현 제어 서열은 구체적으로 프로모터, 전사 개시 및 정지 서열, 인핸서 및 활성인자 서열, 또는 리보솜 결합 부위로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 발현 제어 서열의 구체적인 예는 코딩 서열 측면에 위치하는 서열이고, 이는 프로모터, 5' 비번역 서열, 리더 펩티드의 코딩 서열을 개재하는 인트론, 재조합 신호 서열(들) (RSS) 및 스플라이스 부위를 포함할 수 있다.
특히 바람직한 측면에서, 본원에 기술된 트랜스제닉 마우스는 와블 및 킬린의 미국 공개 번호 2013/0219535에 기술된 바와 같은 키메라 면역글로불린 세그먼트를 포함한다. 상기 트랜스제닉 마우스는 도입된 부분적 인간 면역글로불린 영역을 포함하는 게놈을 갖고, 여기서, 도입된 영역은 인간 가변 영역 코딩 서열, 및 마우스의 내인성 게놈에 기초한 비코딩 가변 서열을 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 트랜스제닉 세포 및 마우스는 내인성 면역글로불린 영역의 일부 또는 전부가 제거된 게놈을 갖는다.
또 다름 바람직한 측면에서, WO2017035252A1에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 마우스의 게놈 함량은 변형되고, 이로써, 이의 B 세포는 세포당 1 초과의 기능성 VH 도메인을 발현할 수 있고, 즉, 세포는 이중특이적 항체를 생산한다.
본원에서 사용되는 "벡터"는 클로닝된 재조합 뉴클레오티드 서열, 즉, 재조합 유전자의 전사 및 적합한 숙주 유기체에서의 이의 mRNA 번역에 필요한 DNA 서열로 정의된다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 자가 복제 여부에 관계없이 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키는 데 사용할 수 있는 임의의 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 벡터는 자율 복제 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 게놈 통합 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 추가로 숙주 세포 또는 게놈 통합 부위에서의 자율 복제를 위한 기점, 하나 이상의 선별가능한 마커 (예컨대, 아미노산 합성 유전자 또는 예컨대, 퓨로마이신, 제오신(Zeocin)™, 카나마이신, G418, 또는 히그로마이신과 같은 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자), 다수의 제한 효소 절단 부위, 적합한 프로모터 서열 및 전사 종결인자를 포함하고, 이들 성분들은 작동가능하게 함께 연결되어 있다.
일반적인 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 일반적으로 추가 (외래) DNA를 쉽게 수용할 수 있고, 적합한 숙주 세포로 쉽게 도입될 수 있는 자가 유지 이중 가닥 DNA 분자이다. 플라스미드는 때때로 코딩 DNA 및 프로모터 DNA를 포함하고, 외래 DNA를 삽입하기에 적합한 하나 이상의 제한 부위를 가지고 있다. 구체적으로, 용어 "플라스미드"는 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현 (예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해 DNA 또는 RNA 서열 (예컨대, 외래 유전자)을 숙주 세포에 도입시킬 수 있는 비히클을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "숙주 세포"는 특정 재조합 단백질, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 항체를 제조하기 위해 형질전환된 최초 대상 세포, 및 이의 임의의 자손을 지칭할 것이다. (의도적 또는 부주의한 돌연변이 또는 환경의 차이로 인해) 모든 자손이 모체 세포와 정확히 동일하지는 않다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 그러한 변경된 자손은 자손이 원래 형질전환된 세포와 동일한 기능을 유지하는 한 상기 용어에 포함된다. 용어 "숙주 세포주"는 재조합 유전자를 발현시켜 재조합 폴리펩티드, 예컨대, 재조합 항체를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포의 세포주를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "세포주"는 장기간에 걸쳐 증식하는 능력을 획득한 특정 세포 타입의 확립된 클론을 지칭한다. 상기 숙주 세포 또는 숙주 세포주는 재조합 폴리펩티드를 생산하도록 세포 배양물에서 유지될 수 있고/거나, 배양될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 핵산, 항체 또는 다른 화합물과 관련하여 용어 "단리된" 또는 "단리"는 "실질적으로 순수한" 형태로 존재하도록 자연적으로 회합될 환경으로부터 충분히 분리된 상기 화합물을 지칭할 것이다. "단리된"은 다른 화합물 또는 물질과의 인공 또는 합성 혼합물, 또는 기본적인 활성을 방해하지 않거나, 또는 예를 들어, 불완전한 정제로 인해 존재할 수 있는 불순물의 존재의 배제를 반드시 의미하지는 않는다. 특히, 본원에 기술된 단리된 핵산 분자는 또한 화학적으로 합성된 것을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 기술된 핵산과 관련하여, "단리된 핵산"이라는 용어가 때때로 사용된다. 본 용어는 DNA에 적용될 때, 그가 유래된 유기체의 자연적으로 발생된 게놈에서 바로 인접한 서열로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, "단리된 핵산"은 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 삽입되거나, 또는 원핵 또는 진핵 세포 또는 숙주 유기체의 게놈 DNA 내로 통합된 DNA 분자를 포함할 수 있다. RNA에 적용될 때, 용어 "단리된 핵산"은 주로 상기 정의된 바와 같은 단리된 DNA 분자에 의해 코딩되는 RNA 분자를 지칭한다. 대안적으로, 본 용어는 이의 자연 상태에서 (즉, 세포 또는 조직에서) 회합될 다른 핵산으로부터 충분히 분리된 RNA 분자를 지칭할 수 있다. "단리된 핵산" (DNA 또는 RNA)은 추가로 생물학적 또는 합성 수단에 의해 직접 제조되고, 이의 제조 중에 존재하는 다른 성분으로부터 분리된 분자를 나타낼 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질, 예컨대, 단리된 항체와 관련하여, "단리된"이라는 용어는 화합물에는 자연적으로 회합되는 물질, 예컨대, 이의 천연 환경, 또는 그와 함께 이의 천연 환경에서, 또는 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시되는 재조합 DNA 기술에 의해 이루어질 때, 제조가 이루어지는 환경, 예컨대, 세포 배양물에서 발견되는 다른 화합물이 없거나, 또는 실질적으로 없다는 것을 지칭할 것이다. 단리된 화합물은 희석제 또는 보조제와 함께 제제화될 수 있고, 추가로 실용적인 목적을 위해 단리될 수 있고 - 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 진단 또는 요법에 사용될 때 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 혼합될 수 있다.
본원에 기술된 항체는 특히 상이한 표적 항원에 대해 지시되고/거나, 항체 도메인의 상이한 구조적 배열을 포함하는 다른 항체가 실질적으로 없는 단리된 형태로 제공된다. 추가로, 단리된 항체는 단리된 항체, 예컨대, 상이한 특이성을 갖는 모노클로날 항체 또는 항체 단편과 같은 적어도 하나의 다른 항체와의 조합을 함유하는 조합 제제에 포함될 수 있다.
구체적으로, 본원에 기술된 바와 같은 항체는 실질적으로 순수한 형태로 제공된다. 본원에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한" 또는 "정제된"이라는 용어는 적어도 50% (w/w), 바람직하게, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 화합물, 예컨대, 핵산 분자 또는 항체 중 어느 하나를 포함하는 제제를 지칭할 것이다. 순도는 화합물에 적합한 방법 (예컨대, 크로마토그래피 방법, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, HPLC 분석 등)에 의해 측정된다.
"부위 특이적 재조합"은 하기 3개의 이벤트 중 임의의 것을 포함하는 양립가능한 두 재조합 부위 사이의 재조합 프로세스를 지칭한다:
a) 재조합 부위가 측면에 위치하는 미리 선택된 핵산의 결실;
b) 재조합 부위가 측면에 위치하는 미리 선택된 핵산의 뉴클레오티드 서열의 역위, 및
c) 상이한 핵산 분자 상에 위치하는 재조합 부위에 근접한 핵산 영역의 상호 교환. 핵산 분자 중 하나 또는 그 둘 모두가 고리형인 경우, 상기 핵산 세그먼트의 상호 교환을 통해 통합 이벤트가 이루어진다는 것을 이해하여야 한다.
상기 설명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 단지 본 발명의 하나 이상의 실시양태를 실시하는 방법을 대표할 뿐이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 중쇄 -단독 ( HCO ) Ab 생산을 위하여 Ighm 상류 내인성 마우스 Igh 유전자좌 내로 마우스 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트를 도입하기 위한 상동 재조합의 용도
HCO Ab (또는 HCAb) 생성을 위하여 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트를 도입하기 위한 예시적인 방법이 도 2 및 3에 도시되어 있다.
상동 재조합 표적화 벡터 (도 2)의 두 필수 성분은 짧은 상동성 아암 (SHA) 및 긴 상동성 아암 (LHA)으로, 이는 변형되는 내인성 유전자좌의 영역 측면에 위치하는 상동성 DNA 세그먼트와 서열 동일성을 공유한다. 이러한 경우, SHA는 상응하는 마우스 Jh 비코딩 서열이 측면에 위치하는 인간 JH2-JH6 유전자 세그먼트로 구성된다 (서열 번호: 2). LHA는 5' 인트론에서 시작하여 3' 인트론에서 종결되는, 전체 Ighm 유전자로 구성된다 (서열 번호: 12). 5' 말단에서 시작하는 표적화 벡터의 다른 주목할 만한 특징은 하기를 포함한다: 1) Pgk_TK_pA (서열 번호: 1), 포스포글리세레이트 키나제 프로모터 (Pgk)에 의해 구동되고, 폴리A 부위 (pA)를 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 유전자. 상기 요소는 상동 재조합이 아닌 표적화 벡터를 통합한 세포에 대해 이루어지는 간시클로비르를 이용한 음성 선택에 사용된다. 상동 재조합 및 비상동 동안, SHA의 5' (또는 LHA의 3')의 DNA는 제거될 것이다 (도 2). 본 경우에서, 벡터가 상동 재조합을 통해 통합되면, HSV-TK 유전자는 결실된다. 상동 재조합을 통해 벡터를 통합하지 않은 임의의 모든 세포는 HSV-TK 유전자를 보유할 것이며, 사멸된다. 2) T3 박테리오파지 RNA 폴리머라제를 위한 T3 프로모터 (서열 번호: 3). 상기 DNA 의존성 RNA 폴리머라제는 T3 파지 프로모터에 대해 매우 특이적이다. 99 KD 효소는 시험관내 RNA 합성을 촉매화하고, 이를 통해 소수의 B 세포 또는 하이브리도마로부터 VDJ 재배열이 빠르게 클로닝될 수 있다. 3) CAG_PuroR_pA, 강력한 CAG 프로모터에 의해 구동되고, 폴리A 부위를 포함하는 퓨로마이신 내성 유전자 (서열 번호: 5). 상기 요소는 퓨로마이신 내성을 기반으로 표적화 벡터를 통합한 세포의 양성 선택에 사용된다. 4) 상동 재조합에 의해 표적화 벡터를 이의 게놈 내로 안정적으로 통합한 세포는 간시클로비르 및 퓨로마이신, 둘 모두에 대해 내성을 갖게 된다는 점에 유의한다. 5) CAG_PuroR_pA 요소는 적절하게 표적화된 ES 세포 클론 확인 후, Flp 레콤비나제를 공급함으로써 시험관내 또는 생체내에서 상기 요소를 제거하기 위해 사용될 수 있는 FRT 부위 (서열 번호: 4 및 서열 번호: 6) 측면에 위치한다는 점에 유의한다. Eμ 인핸서 (서열 번호: 7)는 유전자좌의 전사를 촉진시키기 위해 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트의 상류에 포함된다. 이어서, 표적화 벡터 중에 Ighg1 5' 인트론 부분의 서열 (서열 번호: 8), Ighg1 힌지 5' 인트론 부분의 서열 (서열 번호: 9), Ighg1 ΔCH1 유전자 (서열 번호: 10) 및 인간 성장 호르몬 1 폴리아데닐화 신호 서열 (hGH1 pA, 서열 번호: 11)이 존재한다. 바로 하류에 LHA (서열 번호: 12)가 존재한다. 이는 Ighm 5' 인트론 부분의 서열 (서열 번호: 13) 및 Ighm 유전자 (서열 번호: 14)로 구성되고, 상기 Ighm 유전자는 3' UTR을 포함하고, 이어서, Ighm 3' 인트론 부분의 서열 (서열 번호: 15)이 존재한다. VDJH 엑손이 Ighg1 ΔCH1 유전자 대신 Cμ로 직접 스플라이싱되는 경우, LC-의존성 μ HC의 발현을 막기 위해 정지 코돈 (TGA)을 CH1, CH2 및 CH3 Ighm 엑손 내로 도입하였다. 표적화 벡터에는 내인성 Igh 유전자좌에 존재하는 μ 스위치 (S) 영역이 결여되어 있고, 이로써, 표적화된 유전자좌에도 또한 S 영역은 결여되어 있을 것이고, 따라서, 이소타입 스위칭은 이루어질 수 없을 것이다. 표적화 벡터는 전기천공에 의해 ES 세포에 도입된다. 세포를 간시클로비르 및 퓨로마이신으로 보충된 배지 중에서 성장시킨다. 이어서, 새로 도입된 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트 내의 5' 및 3'에 위치하는 프라이머를 사용하여 널리 실시되는 유전자 표적화 전략법을 이용하여 게놈 PCR에 의해 성공적인 유전자 표적화에 대해 생존한 단리된 ES 세포 클론을 모니터링한다. 표적화 카세트의 적절한 통합은 SHA의 5'측 측면에 위치하는 DNA 서열에 매핑되는 프로브, LHA의 3'측 측면에 위치하는 DNA 서열에 매핑되는 제2 프로브 및 벡터 중 게놈 아이덴티티의 두 아암 사이의 신규한 DNA 내에 매핑되는 제3 프로브를 이용하여 게놈 서던 블롯에 의해 추가로 확인한다 (올바른 표적화된 유전자좌의 구조는 도 3에 도시되어 있으며, 이하 HCO 유전자좌로 지칭된다).
ES 세포의 PCR 및 서던 블롯 확인된 클론의 핵형은 마우스 ES 세포에서 발생하는 가장 일반적으로 발생하는 염색체 이상을 구별하기 위해 디자인된 동소 형광 하이브리드화 절차를 사용하여 분석한다. 상기 이상이 있는 클론은 추가 사용에서 배제된다. PCR 및 서던 블롯 데이터를 기반으로 예상되는 올바른 게놈 구조를 갖는 것으로 판단되고, 핵형 분석을 기반으로 검출가능한 염색체 이상을 갖지 않는 ES 세포 클론을 추가 사용을 위해 선택한다.
마우스 중쇄 유전자좌 중 적절하게 표적화된 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트를 보유하는 ES 세포 클론을 표준 절차에 따라 계통 DBA/2로부터의 마우스 배반포로 미세주입하여 부분 ES 세포 유래 키메라 마우스를 생성한다. 코트에 대한 ES 세포 유래 기여도가 가장 높은 수컷 키메라 마우스를 암컷 마우스와의 교배를 위해 선택한다. 여기서 선택된 암컷 마우스는 C57B1/6NTac 계통으로, 이는 이의 생식계열 중 Flp 레콤비나제를 코딩하는 트랜스진을 보유한다. 상기 교배로부터 수득된 자손을 Ighg1 ΔCH1 유전자 카세트의 존재 및 FRT-측면 퓨로마이신 내성 유전자의 손실에 대해 분석한다 (도 3). TRN0034 또는 TRN34로 명명되는, 올바르게 표적화된 마우스를 사용하여 마우스 콜로니를 확립한다.
실시예 2: HCO 마우스의 골수 (BM)에서의 B 세포 발생.
선행 기술 (예컨대, WO2011/072204A1 참조)에서는 기능성 경쇄가 결여되어 있고, CH1 도메인이 결여된 재조합 Cγ 유전자 세그먼트 상류에 기능성 Cμ 유전자 세그먼트를 갖는 마우스에서 IgG 타입의 HCAb가 생산된다. 상기 마우스에서의 HCAb 생산에는 상당한 단점이 있다. 기능성 Cμ 유전자 세그먼트를 사용하면, 정규 IgM을 항원 BCR로 사용하는 성숙한 B 세포가 정상적으로 발생하게 된다. 그러나, 면역 반응 동안 항체 클래스는 (원하는) γ 쇄로 전환되고, 상기 쇄는 L 쇄가 없기 때문에 쌍을 형성할 수 없다. 이는 2가지 효과가 있을 것이다:
(i) H 쇄와 L 쇄의 조합에 의해 특이성이 정의된 항체가 있는 세포는 더 이상 자극을 받지 못하고, 사멸하게 될 것이고,
(ii) 특이성이 주로 H 쇄에 의해 정의된 세포는 쌍을 형성하지 않은 VH가 구조적으로 생존할 수 없기 때문에 사멸할 수 있다.
따라서, 선행 기술의 상기 마우스에서, VH 선택은 "백로딩되고(backloaded)," 즉, 면역 반응 동안 발생한다.
트랜스제닉 Cγ1 유전자 세그먼트를 Cμ 유전자 세그먼트 상류에 있는 내인성 면역글로불린 유전자좌에 통합함으로써, VH 선택은 "프론트로딩되고(frontloaded)," 즉, 개체 발생 동안 발생한다.
상기 마우스에서 B 세포가 정상적으로 발생한다는 것을 보여주기 위해, 골수 세포를 도 4에 제시된 CD 항원에 특이적인 mAb로 표면 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다. 대조군 TRN11/2/5 마우스에서, 와블 및 킬린의 미국 공개 번호 20130219535A1에 기술된 바와 같이, 내인성 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌를 각각 마우스 조절 서열 측면에 위치하는, 인간 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌 코딩 서열로 대체하였다. TRN34/29/30 마우스에서, VH, D 및 JH 유전자 세그먼트는 TRN11과 동일하지만, Igh 유전자좌 중 나머지는 도 3에 도시된 바와 같이 변형시켜 IgG1 HCO 항체를 코딩하였다. Vκ 및 Vλ 유전자좌는 TRN29 및 TRN30 대립유전자에서 각각 불활성화되었다. 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다.
TRN11 /2/5 마우스의 유전자 구성:
- 각각 마우스 조절 서열 측면에 위치하는, 인간 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌 코딩 서열로 대체된 내인성 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌
TRN34 /29/30 마우스의 유전자 구성:
- HCO 유전자좌: Ighg1 ΔCH1 및 정지 코돈 (TGA)은 CH1, CH2 및 CH3 Ighm 엑손 내로 도입되었고,
- 키메라 VH 유전자좌: 내인성 VH 유전자좌를 대체하는, 마우스 조절 서열 측면에 위치하는, 인간 VH, Vκ 및 Vλ 유전자좌 코딩 서열, 및
- 불활성화된 Vκ 및 Vλ 유전자좌.
B 세포 발생 단계 또한 제시되어 있다. 성숙한 recirc. B는 골수에서 생성되고, 말초에서, 예컨대, 비장에서 이의 성숙화를 완료하고, 혈류를 통해 BM으로 다시 재순환하는 B 세포를 나타낸다.
조기 B 계통 세포 (B220+CD23-)의 빈도는 두 마우스 계통에서 동일하지만, 대조군과 비교하여 HCO 마우스에서 프로-B 세포의 빈도는 증가하고, 이의 자손인 프리-B 세포의 빈도는 감소한다 (하단 패널). 이러한 감소는 말초의 이행 및 성숙 B 세포에서 (도 5, 7, 8) 및 BM의 성숙한 재순환 B 세포 (상단 패널)의 상응하는 감소를 초래한다. 프로- 및 프리-B 세포의 변경된 빈도에 대해서는 몇 가지 설명이 가능하다. 일반적으로, 프리-B 세포는 대리 경쇄 및 CD79A/B와 회합하고, 세포 표면에서 낮은 수준으로 발현되는 μHC를 합성한다. 이는 경쇄 유전자의 V→J 재배열 및 발현 전에 세포가 증식하도록 신호를 전달하는 데, 이는 미성숙한 B 세포 단계를 나타내는 것이다. HCO 마우스의 γ1 HC는 SLC와 회합하지 않고, 세포 표면에서 CD79A/B로 발현된다. 상기 프리-B 세포는 WT와 같은 정도로 증식하지 않을 수 있고, 미성숙 B 세포로 분화될 수 있고, LC 유전자 재배열에 대한 요구 사항이 없기 때문에 더 빨리 BM을 떠날 수 있다. 프로-B 세포의 증가는 프로-B에서 프리-B로의 발생 단계에서 병목 현상이 있을 수 있다는 것을 시사한다.
어느 경우에서든, 예상되는 모든 발생 단계의 B 계통 세포가 HCO 마우스에 존재한다.
실시예 3: HCO 마우스의 말초에서의 B 세포 분화 및 세포 표면 IgG1 발현
실시예 3에서와 동일한 마우스로부터의 비장 세포를 명시된 CD 항원에 특이적인 형광 접합된 mAb로 염색하고, 유세포 분석법으로 분석하였다 (도 5). 플로우 플롯에서 수치는 주어진 게이트에서의 세포 백분율(%)을 나타내는 것이다. BM에서 프리-B 세포 및 성숙한 재순환 B 세포의 감소된 빈도에 기초하여 예상된 바와 같이 (도 4), HCO 마우스의 비장 중의 모든 B 세포 서브세트에서 전반적인 감소가 이루어졌다. 분석된 서브세트는 전체 B, B1, B2, 이행 1 및 2 (T1 및 T2), 여포성 (Fo.) B, 및 변연부 (MZ) B를 포함하였다. 비록 이의 개수는 감소하였지만, 예상되는 모든 분화 단계의 세포는 HCO 마우스에 존재하였다.
다수의 비장 MZ (80%) 및 Fo. B (91%) 세포는 세포 표면 상에서 γ1 HC를 발현하였고 (도 6), 이는 HCO 유전자좌가 생체내에서 기능성이라는 것을 시사하는 것이다.
림프절 (LN, 도 7)에서, 전체 B 세포 (상단 패널) 및 성숙한 Fo. B 세포 (중간 패널)는 감소하였다. 비장 B 세포와 유사하게, HCO 마우스에서 LN B 세포 중 89%가 세포 표면 상에서 γ1 HC를 발현하였다 (하단 패널).
복강 (도 8)에서, 전체 B 세포 (상단 패널), Fo. B 세포 및 B1 B 세포 (중간 패널)는 감소하였다. 비장 및 LN B 세포와 유사하게, HCO 마우스에서 복막 B 세포 대부분은 세포 표면 상에서 γ1 HC를 발현하였다 (하단 패널).
요약하면, 모든 B 세포 발생 단계 및 서브세트의 빈도가 HCO 마우스의 BM 및 말초에서 감소하더라도 (BM에서 프로-B 세포 제외), 모든 B 세포 발생 단계 및 서브세트이 존재하고, γ1 HCO 유전자좌는 생체내에서 정상적인 작용을 한다.
실시예 4: HCO 마우스에서 혈청 면역글로불린 (Ig) 수준
도 9는 면역화되지 않은 TRN11/2/5 (오픈형 동그라미) 및 TRN34/29/30 HCO (필드형 동그라미) 마우스에서 혈청 IgG1 및 IgM을 검출하는 ELISA 검정법의 결과를 보여주는 것이다. 광학 밀도는 Y축에 표시되어 있고, 혈청 희석률은 X축에 표시있다. 표준화 (오픈형 박스)를 위해, 100 ug/ml의 모노클로날 IgG1 (좌측) 및 IgM (우측) 또한 연속 희석시켰다. TRN34/29/30 HCO 마우스의 혈청에서 상당한 수준의 중쇄-단독 IgG1이 검출되었고, 대조군 TRN11/2/5 혈청에서는 IgG1 (중쇄 및 경쇄 포함)보다 약간 적었다. 대조적으로, IgM은 HCO 마우스에서 배경 수준이었다. 유사한 ELISA 검정법을 사용하여 혈청 IgG2b, IgG2c 및 IgG3을 검출하였다 (도 10). TRN34/29/30 HCO 마우스에서는 3가지 Ig 이소타입 모두를 검출할 수 없었다.
본 결과는 TRN34/29/30 HCO 마우스에서 B 세포가 μ HC 오픈 리딩 프레임에 3개의 정지 코돈이 존재하기 때문에 IgM 분비 형질 세포로 분화할 수 없다는 것을 시사한다. 본 결과는 또한 HCO 마우스에서 Igh 유전자좌로부터의 μ 스위치 영역의 결실로 인해 상기 마우스에서 IgG2b, IgG2c 또는 IgG3으로의 이소타입 스위칭은 없다는 것도 시사한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Trianni, Inc.
<120> HEAVY CHAIN-ONLY ANTIBODIES
<130> TI108EP
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2182
<212> DNA
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<220>
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aggcagccgt ccccccgcgg acagccccga ggctggagag ggagaagggg acggcggcgc 1200
ggcgacgcac gaaggccctc cccgcccatt tccttcctgc cggcgccgca ccgcttcgcc 1260
ccgcgcccgc tagagggggt gcggcggcgc ctcccagatt tcggctccgc acagatttgg 1320
gacaaaggaa gtccctgcgc cctctcgcac gattaccata aaaggcaatg gctgcggctc 1380
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gcaactcggg gaggggggtg cagggggggt tgcagcccga ccgacgcgcc cacaccccct 1620
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tggggagggg ggggagatgg ggagagtgaa gcagaacgtg gggctcacct cgaccatggt 2340
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 6
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<211> 313
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 8
ttaaaaaaaa aaaaaaagga aagggacttc tctgtgtttg gcaacacaag tgcgatgcac 60
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
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cag 243
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 10
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<210> 11
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 12
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
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<213> Mus musculus
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agagtcagtc cttcccaaat gtcttccccc tcgtctcctg cgagagcccc ctgtctgata 60
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ggacaggggg caagtaccta gccacctcgc aggtgttgct gtctcccaag agcatccttg 240
aaggttcaga tgaatacctg gtatgcaaaa tccactacgg aggcaaaaac aaagatctgc 300
atgtgcccat tccaggtaag aaccaaaccc tcccagcagg ggtgcccagg cccaggcatg 360
gcccagaggg agcagcgggg tggggcttag gccaagctga gctcacacct tgacctttca 420
ttccagctgt cgcagagatg aaccccaatg taaatgtgtt cgtcccacca cgggatggct 480
tctctggccc tgcaccacgc aagtctaaac tcatctgcga ggccacgaac ttcactccaa 540
aaccgatcac agtatcctga ctaaaggatg ggaagctcgt ggaatctggc ttcaccacag 600
atccggtgac catcgagaac aaaggatcca caccccaaac ctacaaggtc ataagcacac 660
ttaccatctc tgaaatcgac tggctgaacc tgaatgtgta cacctgccgt gtggatcaca 720
ggggtctcac cttcttgaag aacgtgtcct ccacatgtgc tgccagtgag tggcctgggc 780
taagcccaat gcctagccct cccagattag ggaagtcctc ctacaattat ggccaatgcc 840
acccagacat ggtcatttgc tccttgaact ttggctcccc agagtggcca aggacaagaa 900
tgagcaatag gcagtagagg ggtgagaatc agctggaagg accagcatct tcccttaagt 960
aggtttgggg gatggagact aagctttttt ccaacttcac aactagatat gtcataacct 1020
gacacagtgt tctcttgact gcaggtccct ccacagacat cctaaccttc accatccccc 1080
cctcctttgc cgacatcttc ctcagcaagt ccgctaacct gacctgtctg gtctcaaacc 1140
tggcaaccta tgaaaccctg aatatctcct gagcttctca aagtggtgaa ccactggaaa 1200
ccaaaattaa aatcatggaa agccatccca atggcacctt cagtgctaag ggtgtggcta 1260
gtgtttgtgt ggaagactgg aataacagga aggaatttgt gtgtactgtg actcacaggg 1320
atctgccttc accacagaag aaattcatct caaaacccaa tggtaggtat ccccccttcc 1380
cttcccctcc aattgcagga cccttcctgt acctcatagg gagggcaggt cctcttccac 1440
cctatcctca ctactgtctt catttacaga ggtgcacaaa catccacctg ctgtgtacct 1500
gctgccacca gctcgtgagc aactgaacct gagggagtca gccacagtca cctgcctggt 1560
gaagggcttc tctcctgcag acatcagtgt gcagtggctt cagagagggc aactcttgcc 1620
ccaagagaag tatgtgacca gtgccccgat gccagagcct ggggccccag gcttctactt 1680
tacccacagc atcctgactg tgacagagga ggaatggaac tccggagaga cctatacctg 1740
tgttgtaggc cacgaggccc tgccacacct ggtgaccgag aggaccgtgg acaagtccac 1800
tggtaaaccc acactgtaca atgtctccct gatcatgtct gacacaggcg gcacctgcta 1860
ttgaccatgc tagcgctcaa ccaggcaggc cctgggtgtc cagttgctct gtgtatgcaa 1920
actaaccatg tcagagtgag atgttgcatt ttataaaaat tagaaataaa aaaaatccat 1980
tcaaacgtca ctggttttga ttatacaatg ctcatgcctg ctgagacagt tgtgttttgc 2040
ttgctctgca cacaccctgc atacttgcct ccaccctggc ccttcctcta ccttgccagt 2100
ttcctccttg tgtgtgaact cagtcaggct tacaacagac agagtatgaa catgcgattc 2160
ctccagctac ttctagatat atggctgaaa gcttgcctaa cctggtgcag gcagcattca 2220
ggcacatata tagacacaca tgcatttata catagatata taggtacaca tgtgtagaca 2280
catacatgaa tgtgtattca tggacacaca gacaaaggta cacatatata cacatgagtt 2340
catgcgcaca cacatgcatg gacacttaca aacgccttca gagacaaata ggcatagaca 2400
cacaaccact cacagaaaca gataccaata tgcatggtcc tgtgtacaca gaaacagact 2460
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ggactctgac cagggctgta atctccaagg ctcacggctc agagagccta cactaggctg 2640
ggtcactgat actcctcagg agcccactct atgattggga gagataaccc caggtacaaa 2700
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aaagttagcc ttggctgtgt ctccattaat agaacacctc agaagaccaa tgtgaaattg 2820
cctaacccac tcacacccac cctgatctcc agttcaaaat gcagaaaaca taatgcagtt 2880
gtccaaaaga tgccccaacc acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 2940
acacacacac acacacacac catcaaggag cctctgtaag gagtcaccac ccaataacac 3000
tgcctctttg ggctcatatc ctggacattc ttcatattca tatccatttg gggcctaggc 3060
tttagatatc cccaagggct catctttaca gggatcagag atcccaataa atgccctggt 3120
cccacagcct ccctcaggta tctgtctgtt tatctcttgg taccaagacc caacattgct 3180
ggcaggggta ggacaagcaa cgcacgggaa ctctgatcaa agaaagtcat gagatgcctg 3240
agtccttcag gaagtaagga gggacaacct ctggtatccc tgttcttatt gctaaagccc 3300
aagagacagg gagacctgct ctaaattctc agtctaaaca gcaccgatgg caccacctgc 3360
tcagggaaag tccagagcac accaatatca ttttgccaca gttcctgagt ctgcctttac 3420
ccaggtccat acattgcatc tgtcttgctt gctctgctgc cccagggctc ctggaacaaa 3480
ggctccaaat tagtgtgtcc tacagcttgg cctgttctgt gcctccgtct agcttgagct 3540
attaggggac cagtcaatac tcgctaagat tctccagaac catcagggca ccccaaccct 3600
tatgcaaatg ctcagtcacc ccaagacttg gcttgaccct ccctctctgt gtcccttcat 3660
agagggggag gtgaatgctg aggaggaagg ctttgagaac ctgtggacca ctgcctccac 3720
cttcatcgtc ctcttcctcc tgagcctctt ctacagcacc accgtcaccc tgttcaaggt 3780
agtgtggttg tggggctgag gacacagggc tgggacaggg agtcaccagt cctcactgcc 3840
tctacctcta ctccctacaa gtggacagca attcacactg tctctgtcac ctgcaggtga 3900
aatgactctc agcatggaag gacagcagag accaagagat cctcccacag ggacactacc 3960
tctgggcctg ggatacctga ctgtatgact agtaaactta ttcttacgtc tttcctgtgt 4020
tgccctccag cttttatctc tgagatggtc ttctttctag actgaccaaa gactttttgt 4080
caacttgtac aatctgaagc aatgtctggc ccacagacag ctgagctgta aacaaatgtc 4140
acatggaaat aaatacttta tcttgtgaac tcactttatt gtgaaggaat ttgttttgtt 4200
tttcaaacct ttcctgcggt gttgaca 4227
<210> 15
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide
<400> 15
gcccaaggat tatctgaata gagcttagga actggaaatg gaacag 46
<210> 16
<211> 294
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60
gcacagcagc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120
ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180
gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240
acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttg 294
<210> 17
<211> 330
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc 60
tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 120
ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc 180
cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc 240
aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc 300
ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag 330
<210> 18
<211> 320
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 18
ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga 60
accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt 120
gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg 180
acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 240
acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc 300
tctccctgtc tccgggtaaa 320
Claims (18)
- 내인성 면역글로불린(immunoglobulin) 중쇄 불변 영역 유전자좌(locus) 내에 내인성 Cμ 유전자 세그먼트(segment)의 상류에 트랜스제닉(transgenic) Cγ 유전자 세그먼트를 도입함으로써, B 세포가 중쇄-단독 항체(heavy chain-only antibody) (HCAb)의 다양한 레퍼토리(repertorie)를 발현하는 마우스(mouse)를 생산하는 방법으로서, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는(encoding) 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 항원을 사용한 면역화 시, 마우스가 항원 특이적 B 세포를 활성화시키고, 다양한 항원 특이적 HCAb를 분비하는 형질세포(plasmacyte)로의 이의 분화를 유도하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, Cγ 유전자 세그먼트가 Eμ 주요 인트론 인핸서(major intron enhancer)의 하류에, 바람직하게는, 서열 번호: 7을 포함하는 내인성 Eμ 주요 인트론 인핸서의 하류에 위치하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Cγ 유전자 세그먼트가 Cγ1 유전자 세그먼트를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CH1 도메인(domain)의 적어도 일부가 BiP 샤페론-결합 도메인(chaperone-binding domain)을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스가 불활성화된, 또는 결실된 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하고, 바람직하게는, 마우스가 내인성 카파 또는 람다 경쇄 유전자좌 중 임의의 것, 또는 이들 둘 모두 내에 기능 상실 돌연변이(loss-of-function), 또는 이의 결실을 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 Cμ 유전자 세그먼트가 불활성인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 Cμ 유전자 세그먼트가 기능 상실 돌연변이, Cμ 유전자 세그먼트의 일부의 결실에 의해, 또는 하나 이상의 정지 코돈(stop codon)을 도입하는 하나 이상의 돌연변이에 의해 불활성인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열(coding sequence), 및 VH, D 및 JH 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하고, 바람직하게는, 여기서, 발현 제어 서열은 뮤린(murine)인 방법.
- 제9항에 있어서, VH, D 및 JH 코딩 서열이 재조합되어 항원을 특이적으로 인식하는 VH 결합 부위를 발현하는 VDJ 코딩 서열을 형성함으로써, 형질 세포(plasma cell)로의 분화 시, 재조합된 VH 코딩 서열에 의해 코딩된 항원 특이적 VH 결합 도메인을 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 분비할 수 있는, 주어진 B 세포에서 재조합된 VH 코딩 서열을 수득하는 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 뮤린 배아 줄기 세포를 제공하는 단계;
b) 하나 이상의 발현 카세트(expression cassette)에 상기 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터(vector)를 제공하는 단계;
c) 상기 하나 이상의 벡터를 세포 내로 도입하는 단계;
d) b)의 서열이 내인성 Cμ 유전자 세그먼트 상류의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 유전자좌에서의 표적화된 통합(targeted integration)에 의해 트랜스제닉 세포(transgenic cell)의 세포 게놈 내로 도입된 트랜스제닉 세포를 선택하는 단계로서, 여기서, Cμ 유전자 세그먼트가 임의적으로 불활성인 단계; 및
e) 상기 트랜스제닉 세포를 이용하여 상기 트랜스제닉 세포로부터 유래된 트랜스제닉 마우스를 생성하는 단계를 포함하는 방법. - 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 이의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자좌 내에 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 마우스.
- 제12항에 있어서, 적어도 2개의 VH, 2개의 D 및 2개의 JH인 인간 VH, D 및 JH 코딩 서열의 레퍼토리를 포함하는 VH 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스.
- 제12항 또는 제13항에 있어서, 내인성 카파 또는 람다 경쇄 유전자좌 중 임의의 것, 또는 이들 둘 모두 내에 기능 상실 돌연변이, 또는 이의 결실을 포함하는 마우스.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 마우스로부터 유래되는, IgG 타입의 다양한 HCAb를 발현하는 B 세포 레퍼토리.
- 제15항에 있어서, 이의 VH 도메인이 상이한 다양한 항원 특이적 HCAb를 발현하는 B 세포 레퍼토리.
- a) 마우스를 항원으로 면역화시켜 항원 특이적 HCAb를 발현하는 세포의 레퍼토리를 제공하는 단계로서, 상기 마우스는 면역글로불린 중쇄 유전자좌 중 내인성 Cμ 유전자 세그먼트의 상류에 트랜스제닉 Cγ 유전자 세그먼트를 포함하고, 여기서, Cγ 유전자 세그먼트는 CH1 도메인의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 단계,
b) 항원 특이적 VH를 포함하는 IgG 타입의 HCAb를 발현하는 세포를 상기 레퍼토리로부터 선택하는 단계;
c) 상기 항원 특이적 VH를 코딩하는 핵산 서열을 상기 HCAb로부터 결정하는 단계, 및
d) 상기 항원 특이적 VH를 포함하는 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 생산하는 단계를 포함하는,
항원 특이적 VH 도메인을 포함하는 항체를 생산하는 방법. - B 세포 레퍼토리, 또는 VH 포함 분자의 레퍼토리를 생산하는 방법에서의, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 마우스의 용도.
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