TW201632558A - 與ｔｒａｉｌｒ２及ｐｓｍａ結合之雙專一性抗體 - Google Patents

與ｔｒａｉｌｒ２及ｐｓｍａ結合之雙專一性抗體 Download PDF

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Abstract

本發明係關於包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域的雙專一性抗體或該抗體片段、具有編碼該抗體或該抗體片段之鹼基序列的核酸、包含該核酸之重組載體、包含該重組載體之轉形株、使用該轉形株之該雙專一性抗體或該抗體片段之製造方法、以及包含該雙專一性抗體或該抗體片段之檢測或測定試劑、診斷藥及治療藥。

Description

與TRAILR2及PSMA結合之雙專一性抗體
本發明係關於一種包含與腫瘤壞死因子相關誘導細胞凋亡配體受體(Tumor necrosis factor-related apoptosis including ligand receptor 2，TRAILR2)結合之抗原結合區域及與攝護腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)結合之抗原結合區域的雙專一性抗體或該抗體片段、具有編碼該抗體或該抗體片段之鹼基序列的核酸、包含該核酸之重組載體、包含該重組載體之轉形株、使用該轉形株之該雙專一性抗體或該抗體片段之製造方法、以及包含該雙專一性抗體或該抗體片段之檢測或測定試劑、診斷藥及治療藥。
抗體係存在於所有哺乳動物之血清或組織體液中之糖蛋白質，於生物體內識別外來抗原(非專利文獻1)。抗體係經由補體系之活化、或與存在於細胞表面之受體(FcR)之結合，而將FcR表現細胞之吞噬能力、抗體依賴性細胞毒殺能力、媒介物之游離能力、及抗原呈現能力等效應器機能活化，從而與生物體防禦相關。1分子之抗體包含2條相同之輕鏈(L鏈)與2條相同之重鏈(H鏈)，而具備2個抗原結合部位。抗體之類型及亞型取決於H鏈，各類型及亞型具有不同之固有機能。人類抗體存在5個不同類型，即，IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。IgG進而分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之亞型，IgA進而分為IgA1及IgA2之亞型。
多價抗體係1分子內具備複數個抗原結合部位之抗體。作為多價 抗體之例，報告有：首先使用雜交融合瘤，而製作具有H鏈與L鏈作為與不同抗原結合之複數條不同多肽鏈的多價抗體(非專利文獻3)。然而，於本方法中，由於在1個細胞中表現兩種不同之H鏈及L鏈，故而產生抗體之H鏈與L鏈之組合10種左右。因此，具有所需之H鏈與L鏈之組合的多價抗體之生成量較低，又，難以將此種多價抗體選擇性地單獨分離精製，因而所需之抗體之產量減少。
為了克服該問題，報告有如下嘗試：藉由將複數個抗原結合部位連結而以單一之多肽鏈之形式進行表現，減少次單元間之組合之變異，而生產具有所需組合之抗體。作為一例，已知有包含將H鏈與L鏈之抗原結合部位以1個多肽之形式連結而成之單鏈Fv(scFv)的抗體(非專利文獻4)。進而，報告有使用IgG1之H鏈恆定區域之CH1區域或該區域之部分片段、及L鏈恆定區域或柔性連結子(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，使兩個抗原結合部位連結而成之抗體等(非專利文獻5、專利文獻1、專利文獻2)。該等先前之多價抗體具有容易凝集，而穩定性及生產性較低之缺點。但另一方面發現，單一之H鏈多肽中具有複數個抗原結合部位且抗原結合部位相互不接近之多價抗體於穩定性方面較高，生產性亦良好(專利文獻3)。
於生物體內，因正常細胞之世代交替引起之生理性細胞死亡被稱為細胞凋亡，區別於作為病理性細胞死亡之壞死(necrosis)(非專利文獻6)。細胞凋亡係於胚胎形成或淋巴細胞(T細胞及B細胞)之選擇等過程中通常可見之現象(非專利文獻7)。
作為與細胞凋亡相關之分子，已鑑定出腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)、Fas配體、CD40配體(CD154)等屬於腫瘤壞死因子家族(TNF家族)之分子。TNF家族分子會與細胞表面上之對應之特異性受體(TNF受體家族分子)結合，誘導該受體之三聚物化，藉此向細胞內傳遞訊號，而引起各種細胞之細胞凋亡(非專利文 獻8~11)。
TNF受體家族分子係根據細胞外區域之富半胱胺酸重複之存在而定義。其中，作為Fas配體及TNF-α之各自受體之Fas及TNFR1於細胞內具備稱為死亡區域之對於細胞凋亡之訊號傳遞而言為必須之區域。Fas之活化會促進包含死亡區域之轉接分子FADD/MORT1之締合，而引起與FADD/MORT1結合之半胱天冬酶-8(Caspase-8)之活化。活化之半胱天冬酶-8將下游之半胱天冬酶分子群依序活化，最後將細胞誘導至細胞凋亡(非專利文獻12)。藉由使對TNF受體家族分子具有特異性之抗體彼此交聯(crosslink)，而向細胞內傳遞訊號，因此認為訊號傳遞需要TNF受體家族分子之締合(非專利文獻13、14)。
TRAIL係誘導Wiley等人所發現之細胞凋亡的TNF家族分子，係TNF相關細胞凋亡誘導配體之簡稱(非專利文獻15)。本分子亦稱為Apo-2配體或Apo-2L(非專利文獻16)。TRAIL不同於Fas配體，於脾臟、肺、攝護腺、胸腺、卵巢、小腸、大腸、周邊血液淋巴細胞、胎盤、腎臟等眾多之人類組織中被檢測到有意義之水準，於若干細胞株中恆常地表現。TRAIL係與TRAIL受體結合，於與因Fas引起之死亡之訊號傳遞類似之時段，與TNF相比非常迅速地誘導細胞凋亡(非專利文獻17)。
作為TRAIL受體(TRAILR)，迄今為止已鑑定出5種蛋白質。其中2種受體TRAILR1(death receptor 4，亦稱為DR4)及TRAILR2(death receptor5，亦稱為DR5)均於細胞內區域具有死亡區域。TRAILR1之轉錄產物可見於包括脾臟、周邊血液白血球、小腸、胸腺之人類之眾多組織中，TRAILR2之轉錄產物可見於脾臟、周邊血液淋巴細胞、卵巢等眾多組織中(非專利文獻18~20)。TRAILR2係藉由選擇性剪接(alternative splicing)而具有2種形式之I型膜蛋白質，報告有於癌細胞中包含440個胺基酸殘基之形式之表現量較多(非專利文獻21、22)。 TRAILR2亦藉由TRAIL之結合而三聚物化，經由自身之死亡區域而誘導細胞死亡訊號，從而引起癌細胞之細胞凋亡(非專利文獻23)。
包含TRAIL之細胞外區域的重組人類TRAIL會誘導各種癌細胞之細胞凋亡(非專利文獻22)，並且於使用人類之大腸癌細胞及乳癌細胞之荷癌小鼠模型中，顯示出顯著之抗腫瘤效果(非專利文獻25)。又，TRAIL與同屬於TNF家族且具有細胞凋亡誘導活性之TNF-α或Fas配體不同，不會對小鼠及食蟹獼猴之正常組織產生傷害(非專利文獻26)。但另一方面，已知重組人類TRAIL於人類正常肝實質細胞或人類腦細胞中亦誘導細胞凋亡(非專利文獻28、32)。
報告有針對TRAILR1及TRAILR2之單株抗體與上述重組人類TRAIL同樣地誘導癌細胞之細胞凋亡(非專利文獻24、27、專利文獻4)。該等抗體於使用人類之大腸癌細胞等之荷癌小鼠模型中亦顯示出抗腫瘤效果(非專利文獻24、專利文獻4)。報告有，一般先前之針對TRAILR之抗體於活體外實驗中，於發揮出因誘導細胞死亡而產生之抗腫瘤活性時需要抗體間之交聯(非專利文獻24、27)。
作為抗體之抗腫瘤活性之主要機制，可列舉如下兩種機制：藉由補體依賴性細胞毒殺(CDC)或抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)等宿主免疫系統之排除；及經由癌細胞上之標靶分子而直接引起增殖之抑制或細胞死亡之誘導。例如關於抗CD20抗體及抗Her2/neu抗體，藉由使用小鼠模型之實驗，提示經由表現於免疫活性細胞上之Fc受體的ADCC發揮出抗體之抗腫瘤活性(非專利文獻24)。進而亦報告有，抗CD20抗體之抗腫瘤活性於將抗體交聯之情形時獲得增強，而產生癌細胞之增殖抑制效果(非專利文獻24)。
另一方面，PSMA係由包含19個胺基酸殘基之細胞內區域、包含24個胺基酸殘基之跨膜區域、及包含707個胺基酸殘基之細胞外區域所構成之合計包含750個胺基酸殘基之約110kDa之II型膜糖蛋白質。 PSMA係作為麩胺酸羧肽酶、N-乙醯基α鍵結酸性二肽酶及葉酸水解酶而發揮機能(非專利文獻29)。PSMA於生物體內表現於攝護腺上皮細胞中，其表現量於攝護腺癌症中上升，尤其於低分化型、轉移性、及激素抵抗性之腺癌症中明顯上升(非專利文獻30、31)。又，PSMA於小腸、唾液腺、十二指腸黏膜、近側迂迴小管及腦中少量表現(非專利文獻31)。進而，PSMA係與腫瘤之血管新生相關(非專利文獻31)，於與大腸癌、乳癌、膀胱癌、胰臟癌、腎癌及黑色素瘤之腫瘤相關之新生血管之上皮中亦進行表現(非專利文獻32)。
作為針對PSMA之抗體，已知有J591(ATCC寄存編號HB-12126)(專利文獻5)，利用177Lu(釕)或89Zr(鋯)等之放射性標記物作為癌症治療藥及診斷藥而被開發出。
先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：美國專利申請公開第2007/0071675號說明書
專利文獻2：國際公開第2001/077342號
專利文獻3：國際公開第2009/131239號
專利文獻4：國際公開第2002/094880號
專利文獻5：美國專利第5,773,292號說明書
非專利文獻
非專利文獻1：Charles A. J. et. al., Immunobiology, 1997, Current Biology Ltd/Garland Publishing Inc.
非專利文獻2：Emmanuelle Laffy et. al., Human Antibodies 14, 33-55, 2005
非專利文獻3：Suresh et. al., Methods Enzymol. 121, 210-228, 1986
非專利文獻4：Kranz et. al., J. Hematother Immunol. 5, 403-408, 1995
非專利文獻5：Wu et. al., Nat. Biothech. 25, 1290-1297, 2007
非專利文獻6：Kerr, et at., Br. J. Cancer 26, 239, 1972
非專利文獻7：Itoh, S., et al., Cell 66, 233-243, 1991
非專利文獻8：Schmid, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 1881, 1986
非專利文獻9：Dealtry et al., Eur. J. Immunol. 17, 689, 1987
非專利文獻10：Krammer, et al., Curr. Op. Immunol. 6, 279-289, 1994
非專利文獻11：Nagata, et al., Science 267, 1449-1456, 1995
非專利文獻12：Nagata et al., Cell, 88, 355-365, 1997
非專利文獻13：Chuntharapai A et. al., J. Immunol. 166 (8), 4891, 2001
非專利文獻14：Ashkenazi A et. al., Nat Rev Cancer 2, 420, 2002
非專利文獻15：Wiley et al., Immunity, 3, 673-682, 1995
非專利文獻16：Pitt, R. M., et al., J. Biol. Chem. 271, 12687-12690, 1996
非專利文獻17：Marsters, S. A., et al., Curr. Biol. 6, 750-752, 1996
非專利文獻18：Pan, G., et al., Science 276, 111-113, 1997
非專利文獻19：Pan, G., et al., Science 277, 815-818, 1997
非專利文獻20：Walczak, H., et al., EMBO J., 16, 5386-5397, 1997
非專利文獻21：Screaton, G. R., et al., Curr Biol., 7, 693-696, 1997
非專利文獻22：Arai, T., et al., Cancer Letters, 133, 197-204, 1998
非專利文獻23：Hymowitz S. G. et al., Mol Cell., 4, 563-71, 1999
非專利文獻24：Griffith, T. S., et al., Curr. Opin. Immunol., 10, 559-563, 1998
非專利文獻25：Walczak, H., et al., Nature Medicine 5, 2, 157-163, 1999
非專利文獻26：Ashkenazi, A., et al., J. Clin. Invest. 104, 155-162, 1999
非專利文獻27：Mori, E., et al, Cell Death and Differentiation, 11, 203-207, 2004
非專利文獻28：Jo, M., et al., Nature Medicine, 6, 564-567, 2000
非專利文獻29：Elsasser-Beile U. et al., Curr. Drug Targets, 10, 118-125, 2009
非專利文獻30：Gregorakis, A. K. et al., Semin. Urol, Oncol., 16, 2-12, 1998
非專利文獻31：Silver, D. A., Clin. Cancer Reseach, 3, 81-85, 1997
非專利文獻32：Chang, S.S., Curr. Opin. Invest. Drugs, 5, 611-615, 2004
本發明所欲解決之問題在於提供一種包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域的雙專一性抗體或該抗體片段、具有編碼該抗體或該抗體片段之鹼基序列的核酸、包含該核酸之重組載體、包含該重組載體之轉形株、使用該轉形株之該雙專一性抗體或該抗體片段之製造方法、以及包含該雙專一性抗體或該抗體片段之檢測或測定試劑、診斷藥及治療藥。
作為解決上述問題之技術手段，本發明提供一種包含與 TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域的雙專一性抗體或該抗體片段。
即，本發明係關於以下之(1)至(30)。
(1)一種雙專一性抗體或該抗體片段，其包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域。
(2)如(1)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其僅在與TRAILR2及PSMA結合時活化該TRAILR2。
(3)如(1)或(2)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其以雙價分別與TRAILR2及PSMA結合。
(4)如(1)至(3)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗原結合區域較與PSMA結合之抗原結合區域更位於N末端側。
(5)如(1)至(4)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗原結合區域為與TRAILR2結合之抗體之可變區域(V區域)，且與PSMA結合之抗原結合區域為與PSMA結合之抗體之V區域。
(6)如(5)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之單株抗體之重鏈可變區域(heavy chain variable region，以下記載為VH)之互補決定區域(complementarity determining region，CDR)1~3之胺基酸序列分別包含序列編號70~72所表示之胺基酸序列，且輕鏈可變區域(light chain variable region，以下記載為VL)之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列。
(7)如(5)或(6)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗體之VH之胺基酸序列包含序列編號118所表示之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序列。
(8)如(5)至(7)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與PSMA結合之抗體之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列，且VH之CDR1~3之胺基酸序列包含選自由以下之(a)~(d)所組成之群中之任一個胺基酸序列。
(a)序列編號78、82及84分別表示之胺基酸序列、(b)序列編號78、79及80分別表示之胺基酸序列、(c)序列編號78、82及80分別表示之胺基酸序列、及(d)序列編號96~98分別表示之胺基酸序列。
(9)如(5)至(8)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與PSMA結合之抗體之VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序列，且VH之胺基酸序列包含選自由以下之(e)~(o)所組成之群中之任一個胺基酸序列。
(e)序列編號122所表示之胺基酸序列、(f)序列編號120所表示之胺基酸序列、(g)序列編號128所表示之胺基酸序列、(h)序列編號123所表示之胺基酸序列、(i)序列編號127所表示之胺基酸序列、(j)序列編號124所表示之胺基酸序列、(k)序列編號125所表示之胺基酸序列、(l)序列編號129所表示之胺基酸序列、(m)序列編號121所表示之胺基酸序列、(n)序列編號126所表示之胺基酸序列、及(o)序列編號130所表示之胺基酸序列。
(10)如(5)至(9)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其包含如下重鏈，該重鏈包含將與TRAILR2結合之抗體之VH、和與PSMA結合之抗體之VH經由包含免疫球蛋白區域或該區域片段之連結 子連結而成之多肽。
(11)如(10)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中連結子為源自IgG4或IgM亞型之連結子。
(12)如(10)或(11)所記載之雙專一性抗體或該抗體片段，其中包含與TRAILR2結合之抗體之VH、連結子及與PSMA結合之抗體之VH的多肽之胺基酸序列為選自由以下之(A)~(M)所組成之群中之任一個胺基酸序列。
(A)序列編號131所表示之胺基酸序列、(B)序列編號132所表示之胺基酸序列、(C)序列編號133所表示之胺基酸序列、(D)序列編號134所表示之胺基酸序列、(E)序列編號135所表示之胺基酸序列、(F)序列編號136所表示之胺基酸序列、(G)序列編號137所表示之胺基酸序列、(H)序列編號138所表示之胺基酸序列、(I)序列編號139所表示之胺基酸序列、(J)序列編號140所表示之胺基酸序列、(K)序列編號141所表示之胺基酸序列、(L)序列編號142所表示之胺基酸序列、及(M)序列編號143所表示之胺基酸序列。
(13)一種核酸，其具有編碼如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段之鹼基序列。
(14)一種重組載體，其含有如(13)所記載之核酸。
(15)一種轉形株，其包含如(14)所記載之重組載體。
(16)一種如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段之製造方法，其包括：將如(15)所記載之轉形株於培養基中進行培 養，自培養上清液中採取雙專一性抗體或該抗體片段。
(17)一種用以檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之試劑，其包含如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段。
(18)一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷藥，其含有如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段。
(19)如(18)所記載之診斷藥，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
(20)一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療藥，其含有如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段作為有效成分。
(21)如(20)所記載之治療藥，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
(22)一種檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之方法，其使用如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段。
(23)一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷方法，其包括：使用如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段而檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者。
(24)如(23)所記載之診斷方法，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
(25)一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療方法，其使用如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段。
(26)如(25)所記載之治療方法，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
(27)一種如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段之用途，其用以製造與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷藥。
(28)如(27)所記載之用途，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
(29)一種如(1)至(12)中任一項所記載之雙專一性抗體或該抗體片段之用途，其用以製造與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療藥。
(30)如(29)所記載之用途，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段僅於與TRAILR2及PSMA結合時，誘導TRAILR2之活化所伴隨之各種反應。因此，本發明之雙專一性抗體或該抗體片段可用作TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療藥及診斷藥。
圖1係表示本發明之雙專一性抗體之結構的圖。粗線表示將2條VH連結之連結子。
圖2係利用流式細胞儀分析抗hPSMA單株抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體對hPSMA/L929細胞之結合性而獲得之結果。縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光強度。抗hPSMA單株抗體係使用2A10抗體或PI134抗體。hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體係使用E11-GL-PI134VH抗體、E11-CH1-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或E11-CH1-PN170VH抗體。實線表示上述各抗體之結合性，虛線表示用作陰性對照之公知之抗DNP單株抗體之結合性。
圖3係利用流式細胞儀分析抗hTRAILR2單株抗體、抗hPSMA單株抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體對hTRAILR2/L929細胞之結合性而獲得之結果。縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光強度。抗 hTRAILR2單株抗體係使用E11抗體。抗hPSMA單株抗體係使用PI134抗體。hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體係使用E11-CH1-PI101VH、E11-CH1-PN7VH抗體或E11-CH1-PN170VH抗體。實線表示上述各抗體之結合性，虛線表示用作陰性對照之抗DNP單株抗體之結合性。
圖4(A)及圖4(B)係表示PC3細胞[圖4(A)]及hPSMA/PC3細胞[圖4(B)]中之hTRAILR2或hPSMA之表現量的圖。縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光強度。各細胞係利用抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、抗hPSMA單株抗體PI134抗體、TRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、或作為陰性對照之抗DNP單株抗體進行染色。
圖5係表示LNCaP純系FGC細胞中之hTRAILR2或hPSMA之表現量的圖。縱軸表示細胞數，橫軸表示螢光強度。細胞係利用抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、抗hPSMA單株抗體2A10抗體、或作為陰性對照之抗DNP單株抗體進行染色。
圖6係表示針對PC3細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI134VH抗體或者E11-CH1-PI101VH抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖7係表示針對PC3細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E 11抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或者E11-CH1-PN170VH抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖8係表示針對hPSMA/PC3細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-GL-PI134VH 抗體或者E11-CH1-PI134VH抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖9係表示針對hPSMA/PC3細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或者E11-CH1-PN170VH抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖10係表示針對hPSMA/PC3細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體係使用E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PI105VH抗體、E11-CH1-PI108VH抗體、E11-CH1-PI115VH抗體、E11-CH1-PI118VH抗體、E11-CH1-PI127VH抗體、E11-CH1-PI143VH抗體或E11-CH1-PL223VH抗體。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖11係表示針對LNCaP純系FGC細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗體或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或者E11-CH1-PN170VH抗體的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示抗體濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖12(A)及圖12(B)係利用流式細胞儀檢測將hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、或TRAILR2配體TRAIL/Apo2添加至細胞時之活化半胱天冬酶而獲得之結果。縱軸表示細胞數，橫軸 表示螢光強度。圖12(A)表示使用PC3細胞時之結果，圖12(B)表示使用PSMA/PC3細胞時之結果。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖13係表示針對人類正常肝細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、或TRAILR2配體TRAIL/Apo2的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示蛋白質濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖14係表示針對人類正常肝細胞而使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7VH抗體、或TRAILR2配體TRAIL/Apo2的細胞增殖性試驗之結果的圖。縱軸表示細胞之存活率(%)，橫軸表示蛋白質濃度(ng/mL)。使用抗DNP單株抗體作為陰性對照。
圖15(A)~圖15(D)表示hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7VH抗體[圖15(A)]、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2[圖15(B)]及E11-CH1-PN7VH Fab[圖15(C)]、以及hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體[圖15(D)]之結構。圖15(A)~圖15(C)之結構中之粗線表示連結子。
圖16表示針對PC3細胞而使用各抗體或抗體片段的細胞增殖性試驗之結果。縱軸表示吸光度，橫軸表示抗體濃度(nM)。作為抗體或抗體片段，使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7VH抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2或者E11-CH1-PN7VH Fab或作為陰性對照之抗DNP單株抗體。
圖17表示針對hPSMA/PC3細胞而使用各抗體或抗體片段的細胞增殖性試驗之結果。縱軸表示吸光度，橫軸表示抗體濃度(nM)。作為抗體或抗體片段，使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7VH抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2或者E11-CH1-PN7VH Fab或作為陰性對照之抗DNP單株抗體。
本發明係關於一種包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域的雙專一性抗體或該抗體片段(以下，記載為本發明之雙專一性抗體或該抗體片段)。
於本發明中，與TRAILR2或PSMA結合之抗原結合區域只要為特異性地識別TRAILR2或PSMA並與之結合者，則可為任何者。例如可為抗體、配體、受體、及天然存在之相互作用分子等能夠藉由基因重組技術而製作之多肽、蛋白質分子及其片段、以及該蛋白質分子之低分子或與天然物之複合體等任一形態。
又，作為抗原結合區域，可為利用抗體、配體及受體等已知之結合分子之結合區域進行重組而成之結合蛋白質，具體可列舉包含與各抗原結合之抗體之CDR的重組蛋白質、包含CDR之抗體可變區域、包含與抗體可變區域及各抗原結合之配體之結合區域的重組蛋白質等。其中，於本發明中，抗原結合區域較佳為抗體可變區域。
作為本發明之雙專一性抗體或該抗體片段，可列舉僅在與TRAILR2及PSMA結合時活化該TRAILR2之雙專一性抗體或該抗體片段。
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段藉由與細胞上之TRAILR2及PSMA結合，將該TRAILR2三聚物化而將其活化，從而於TRAILR2 表現細胞內，引起經由死亡區域之轉接分子FADD/MORT1之締合、及半胱天冬酶8之活化等各種細胞反應。其結果為，針對該細胞，誘導細胞增殖之抑制、及細胞凋亡等細胞死亡等。
即，作為本發明之雙專一性抗體或該抗體片段，具體可列舉：僅在與TRAILR2及PSMA結合時，產生選自由TRAILR2表現細胞內之FADD/MORT1之締合、及半胱天冬酶8之活化、以及TRAILR2表現細胞之增殖抑制及細胞死亡之誘導所組成之群中之至少一種反應的雙專一性抗體或該抗體片段等。
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段可與同一細胞上所表現之TRAILR2及PSMA結合，亦可與不同之細胞上所表現之TRAILR2及PSMA結合。
又，於本發明中，所謂細胞死亡包括細胞凋亡與細胞壞死之任一者，較佳為細胞凋亡。
本發明之TRAILR2係作為與死亡受體(death receptor 5，DR5)、killer/dr5、及TRICK2相同之含義使用。作為TRAILR2，例如可列舉：包含NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中之NCBI寄存編號NP_003833所示之胺基酸序列的人類TRAILR2、及包含NCBI寄存編號NP_064671所示之胺基酸序列的小鼠TRAILR2等。又，例如可列舉：包含NCBI寄存編號NP_003833或NCBI寄存編號NP_064671所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上胺基酸之胺基酸序列，且具有TRAILR2之機能的多肽。
包含與NCBI寄存編號NP_003833或NCBI寄存編號NP_064671所示之胺基酸序列具有70%以上、較佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽，最佳為包含具有95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列且具有TRAILR2之機能的多肽亦包括在本發明之TRAILR2中。
具有於NCBI寄存編號NP_003833或NCBI寄存編號NP_064671所示之胺基酸序列中缺失、置換、或附加1個以上胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽可藉由使用部位特異性變異導入法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proceeding of the National Academy of Sciences in USA,82,488(1985)]等，對例如編碼NCBI寄存編號NP_003833或NCBI寄存編號NP_064671所示之胺基酸序列之DNA導入部位特異性變異而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為編碼TRAILR2之基因，例如可列舉：NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號所示之人類TRAILR2之鹼基序列、及NCBI寄存編號NM_020275所示之小鼠TRAILR2之鹼基序列等。又，例如包含編碼包含NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號之鹼基序列中缺失、置換或附加1個以上鹼基之鹼基序列且具有TRAILR2之機能之多肽之DNA的基因、包含編碼包含與NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號之鹼基序列具有較佳為60%以上之同源性之鹼基序列、更佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列且具有TRAILR2之機能之多肽之DNA的基因、以及包含編碼包含與NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號之DNA於嚴格條件下進行雜交之DNA且具有TRAILR2之機能之多肽之DNA的基因等亦包括在本發明之編碼TAILR2之基因中。
作為於嚴格條件下進行雜交之DNA，意指藉由例如使用具有NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號所示之鹼基序列之DNA作為探針的群落-雜交法、嗜菌斑-雜交法、南方墨點-雜交法、或DNA微陣列法等所獲得之能夠進行雜交之DNA。具體可列舉可藉由如下方式鑑定之DNA：使用固定有源自經雜交之菌落或者嗜菌斑之DNA、或具有該序列之PCR產物或者寡DNA的過濾器或載玻片，於0.7~1.0mol/L之氯化鈉之存在下，於65℃下進行雜交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)、DNA Cloning 1：Core Techniques,A Practical Approach,Second Edition,Oxford University(1995)]後，使用0.1~2倍濃度之SSC溶液(1倍濃度之SSC溶液之組成包含150mmol/L氯化鈉、15mmol/L檸檬酸鈉)，於65℃條件下洗淨過濾器或載玻片，藉此進行鑑定。作為能夠進行雜交之DNA，例如可列舉：與NCBI寄存編號NM_003842之第294號~第1616號所示之鹼基序列具有較佳為60%以上之同源性的DNA、更佳為具有80%以上之同源性的DNA、進而較佳為具有95%以上之同源性的DNA。
對於編碼真核生物之蛋白質的基因之鹼基序列，常常可見基因之多型。於本發明中所使用之基因內，由於此種多型而於鹼基序列產生小規模變異之基因亦包括在本發明之編碼TRAILR2之基因中。
本發明之同源性之數值除了特別明示之情形以外，亦可為使用從業者公知之同源性檢索程式而算出之數值，關於鹼基序列，可列舉於BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中使用預設之參數而算出之數值等，關於胺基酸序列，可列舉於BLAST2[Nucleic Acids Research,25,3389(1997)、Genome Research,7,649(1997)、http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] 中使用預設之參數而算出之數值等。
作為預設之參數，G(Cost to open gap，起始空位罰分)於鹼基序列之情形時為5，於胺基酸序列之情形時為11，-E(Cost to extend gap，延伸空位罰分)於鹼基序列之情形時為2，於胺基酸序列之情形時為1，-q(Penalty for nucleotide mismatch，核苷酸錯配罰分)為-3，-r(reward for nucleotide match，核苷酸匹配得分)為1，-e(expect value，期望值)為10，-W(wordsize，字長)於鹼基序列之情形時為11個殘基，於胺基酸序列之情形時為3個殘基，-y[Dropoff(X)for blast extensions in bits，blast延伸下降值]於blastn之情形時為20，於blastn 以外之程式時為7，-X(X dropoff value for gapped alignment in bits，空位比對下降值)為15，及-Z(final X dropoff value for gapped alignment in bits，最終空位比對下降值)於blastn之情形時50，於blastn以外之程式時為25(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
包含TRAILR2之胺基酸序列之部分序列的多肽可藉由從業者公知之方法而製作，例如可藉由使編碼NCBI寄存編號NP_003833所示之胺基酸序列之DNA之一部分缺失，並對導入有包含其之表現載體的轉形體進行培養而製作。又，基於藉由上述方法所製作之多肽或DNA，藉由與上述相同之方法，可獲得例如具有於NCBI寄存編號NP_003833所示之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽。進而，包含TRAILR2之胺基酸序列之部分序列之多肽、或具有於TRAILR2之胺基酸序列之部分序列中缺失、置換或附加1個以上胺基酸之胺基酸序列的多肽亦可藉由茀基甲氧基羰基(Fmoc)法、第三丁氧基羰基(tBoc)法等化學合成法而製造。
作為本發明之TRAILR2之細胞外區域，例如可列舉：對NCBI寄存編號NP_003833所示之人類TRAILR2之胺基酸序列使用公知之跨膜 區域預測程式SOSUI(http：//sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html)、TMHMM ver.2(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)或ExPASy Proteomics Server(http：//Ga.expasy.org/)等所預測之區域等。具體而言，可列舉NCBI寄存編號NP_003833所示之胺基酸序列中之第54號至第212號之胺基酸序列。
作為TRAILR2之機能，可列舉如下機能：若TRAIL(Apo-2L)配體與TRAILR2結合，則形成TRAILR2之三聚物化，經由細胞內之死亡區域而促進轉接分子FADD/MORT1之締合，引起與FADD/MORT1結合之半胱天冬酶-8(Caspase-8)之活化，結果對細胞誘導增殖抑制或細胞凋亡。
本發明之PSMA係作為與葉酸水解酶(folate hydrolase，FOLH)、麩胺酸羧肽酶II(glutamate carboxypeptidase II，GCP2)、攝護腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSM或PSMA)、N-乙醯基α鍵結酸性二肽酶1(N-acetylated alpha-linked acidic dipeptidase 1，NAALAD1)及NAALADase I相同含義而使用。
作為PSMA，例如可列舉：包含NCBI寄存編號NP_004467或者序列編號112所示之胺基酸序列的人類PSMA或包含NCBI寄存編號NP_058050所示之胺基酸序列的小鼠PSMA等。又，例如可列舉：包含NCBI寄存編號NP_004467、序列編號112或NCBI寄存編號NP_058050所示之胺基酸序列中缺失、置換或附加1個以上胺基酸之胺基酸序列且具有PSMA之機能的多肽。
包含與NCBI寄存編號NP_004467、序列編號112或NCBI寄存編號NP_058050所示之胺基酸序列具有較佳為70%以上、更佳為80%以上、進而較佳為90%以上之同源性之胺基酸序列的多肽、包含具有最佳為95%、96%、97%、98%及99%以上之同源性之胺基酸序列且具有 PSMA之機能的多肽亦包括在本發明之PSMA中。
具有於NCBI寄存編號NP_004467、序列編號112或NCBI寄存編號NP_058050所示之胺基酸序列中缺失、置換、或附加1個以上胺基酸殘基之胺基酸序列的多肽可藉由使用上述部位特異性變異導入法等，對例如編碼NCBI寄存編號NP_004467、序列編號112或NCBI寄存編號NP_058050所示之胺基酸序列的DNA導入部位特異性變異而獲得。缺失、置換或附加之胺基酸之數量並無特別限定，較佳為1個~數十個、例如1~20個，更佳為1個~數個、例如1~5個胺基酸。
作為本發明之編碼PSMA之基因，例如可列舉：包含NCBI寄存編號NM_004476或者序列編號64所示之鹼基序列的人類PSMA之基因或包含NCBI寄存編號NM016770所示之鹼基序列的小鼠PSMA之基因。又，例如包含編碼包含NCBI寄存編號NM_004476、序列編號64或NCBI寄存編號NM016770所示之鹼基序列中缺失、置換或附加1個以上鹼基之鹼基序列且具有PSMA之機能之多肽之DNA的基因、包含編碼包含與NCBI寄存編號NM_004476、序列編號64或NCBI寄存編號NM016770所示之鹼基序列具有60%以上之同源性之鹼基序列、較佳為具有80%以上之同源性之鹼基序列、進而較佳為具有95%以上之同源性之鹼基序列且具有PSMA之機能之多肽之DNA的基因、以及包含編碼包含與NCBI寄存編號NM_004476、序列編號64或NCBI寄存編號NM016770所示之DNA於嚴格條件下進行雜交之DNA且具有PSMA之機能之多肽之DNA的基因等亦視為本發明之編碼PSMA之基因。
作為PSMA之機能，可列舉作為麩胺酸羧肽酶、N-乙醯基α鍵結酸性二肽酶及葉酸水解酶而發揮機能。
於本發明中，所謂與TRAILR2結合係指識別TRAILR2之細胞外區域且與之結合。又，於本發明中，所謂與PSMA結合係指識別PSMA之細胞外區域且與之結合。
於本發明中，抗體或該抗體片段與TRAILR2及PSMA之至少一者結合之情況，例如可藉由如下方法而確認，即，使用公知之免疫學檢測法、較佳為螢光細胞染色法等而確認表現TRAILR2及PSMA之至少一者的細胞與抗體之結合性。又，亦可將公知之免疫學檢測法[Monoclonal Antibodies-Principles and Practice,Third Edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南、講談社科學(1987)]等組合而使用。
於本發明中，所謂抗體具有細胞凋亡活性係指藉由與細胞上之TRAILR2抗體而誘導細胞死亡。本發明之雙專一性抗體具有細胞凋亡活性可藉由以下方法而確認。例如，藉由將表現TRAILR2及PSMA之細胞接種至96孔培養盤中，添加抗體並培養一定期間後，使之與WST-8試劑(Dojindo公司製造)進行反應，利用讀板儀測定450nm之吸光度，而測定細胞之存活率。
所謂抗體係指源自如下基因(稱為「抗體基因」)之蛋白質，該基因編碼構成免疫球蛋白之重鏈之可變區域及重鏈之恆定區域、以及輕鏈之可變區域及輕鏈之恆定區域之全部或一部分。本發明之抗體亦包括具有任一者之免疫球蛋白型及亞型的抗體或抗體片段。
所謂H鏈係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中分子量較大之多肽。重鏈決定抗體之類型與亞型。IgA、IgD、IgE、IgG及IgM分別具有α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈作為重鏈，重鏈之恆定區域係以不同胺基酸序列而被賦予特徵。所謂輕鏈(L鏈)係指構成免疫球蛋白分子之2種多肽中分子量較小之多肽。於人類抗體之情形時，輕鏈存在κ鏈與λ鏈之2種。
所謂V區域通常指免疫球蛋白之N末端側之胺基酸序列內所存在之富於多樣性之區域。可變區域以外之部分由於具有多樣性較少之結 構，故而稱為恆定區域(constant region，C區域)。重鏈與輕鏈之各可變區域發生締合而形成抗原結合部位，從而決定抗體對抗原之結合特性。
於人類抗體之重鏈中，可變區域相當於Kabat等人之EU索引(Kab at et.al.,Sequences of proteins of immunological interest,1991 Fifth edition)中之第1號至第117號之胺基酸序列，恆定區域相當於第118號以後之胺基酸序列。於人類抗體之輕鏈中，Kabat等人之編號(Kabat numbering)中之第1號至第107號之胺基酸序列相當於可變區域，第108號以後之胺基酸序列相當於恆定區域。以下，將重鏈可變區域或輕鏈可變區域簡稱為VH或VL。
抗原結合部位係於抗體中識別抗原並與之結合之部位，係指形成與抗原決定位(抗原決定位)互補之立體結構的部位。抗原結合部位係於與抗原決定位之間產生較強之分子間相互作用。抗原結合部位係由包含至少3個CDR之VH及VL所構成。於人類抗體之情形時，VH及VL分別具有3個CDR。將該等CDR自N末端側起分別依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。
恆定區域中，重鏈恆定區域或輕鏈恆定區域分別表述為CH或CL。CH分為作為重鏈之亞型的α鏈、δ鏈、ε鏈、γ鏈及μ鏈。CH係由自N末端側起依序排列之CH1區域、鉸鏈區域、CH2區域、CH3區域所構成，將CH2區域與CH3區域併稱為Fc區域。另一方面，CL分類為稱為Cλ鏈及Cκ鏈之2種亞型。
於本發明中，所謂與TRAILR2結合之抗體係指識別TRAILR2之細胞外區域且與之結合之單株抗體。又，於本發明中，所謂與PSMA結合之抗體係指識別PSMA之細胞外區域且與之結合之單株抗體。又，於本發明中，所謂抗體亦包括多株抗體及寡株抗體。
單株抗體係保持單株性(monoclonality)之抗體產生細胞所分泌之 抗體，其識別單一之抗原決定位(亦稱為抗原決定位)。單株抗體分子彼此具有相同之胺基酸序列(1次結構)，而具有單一結構。所謂多株抗體係指不同純系之抗體產生細胞所分泌之抗體分子之群。所謂寡株抗體係指將複數個不同之單株抗體混合而獲得之抗體分子之群。
抗原決定位係指被抗體所識別並與之結合之抗原之結構部位。作為抗原決定位，例如可列舉：被單株抗體所識別並與之結合之單一之胺基酸序列、包含胺基酸序列之立體結構、結合有糖鏈之胺基酸序列及包含結合有糖鏈之胺基酸序列之立體結構等。
作為本發明之單株抗體，可列舉：由融合瘤所產生之抗體、及由在包含抗體基因之表現載體中進行轉形之轉形體所產生之基因重組抗體。
融合瘤例如可藉由如下方式製備，即，製備抗原，自免疫該抗原之動物取得具有抗原特異性之抗體產生細胞，進而使該抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合。藉由培養該融合瘤，或將該融合瘤投予至動物而使該融合瘤進行腹水癌化，並將該培養液或腹水分離、精製，可取得所需之單株抗體。作為免疫抗原之動物，只要能夠製作融合瘤，則可使用任何動物，適宜使用小鼠、大鼠、倉鼠及兔等。又，亦可自此種被免疫動物取得具有抗體產生能力之細胞，對該細胞於活體外實施免疫後，與骨髓瘤細胞融合，而製作融合瘤。
作為本發明之基因重組抗體，例如可列舉：重組小鼠抗體、重組大鼠抗體、重組倉鼠抗體、重組兔抗體、人類型嵌合抗體(亦稱為嵌合抗體)、人類化抗體(亦稱為CDR移植抗體)及人類抗體等藉由基因重組技術所製造之抗體。於基因重組抗體中，可根據設為對象之動物種類或目的，決定應用源自何種動物種類之重鏈及輕鏈之可變區域以及恆定區域。例如，於設為對象之動物種類為人類之情形時，可將可變區域設為源自人類或小鼠等非人類動物，將恆定區域及連結子設為 源自人類。
所謂嵌合抗體係指包含人類以外之動物(非人類動物)之抗體之VH及VL、與人類抗體之CH及CL的抗體。作為非人類動物，只要為小鼠、大鼠、倉鼠及兔等能夠製作融合瘤之動物，則可使用任何動物。嵌合抗體可藉由如下方式製造，即，自源自產生單株抗體之非人類動物之融合瘤取得編碼VH及VL之cDNA，插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體中，而構建嵌合抗體表現載體，並將該載體導入至動物細胞而使之表現。
所謂人類化抗體係指將非人類動物抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之對應之CDR而成之抗體。VH及VL之CDR以外之區域稱為構架區域(以下表述為FR)。人類化抗體可藉由如下方式製造，即，構建編碼包含非人類動物抗體之VH之CDR之胺基酸序列與任意之人類抗體之VH之FR之胺基酸序列的VH之胺基酸序列的cDNA、及編碼包含非人類動物抗體之VL之CDR之胺基酸序列與任意之人類抗體之VL之FR之胺基酸序列的VL之胺基酸序列的cDNA，並插入至具有編碼人類抗體之CH及CL之DNA的動物細胞用表現載體，而構建人類化抗體表現載體，並將該載體導入至動物細胞而使之表現。
人類抗體原本係指人類體內天然存在之抗體，但亦包括近來藉由基因工程學、細胞工程學、發生工程學之技術進步所製作之人類抗體噬菌體庫及由產生人類抗體之基因轉殖動物所獲得之抗體等。
人類體內天然存在之抗體例如可藉由如下方式取得，即，使人類周邊血液淋巴細胞感染EB病毒(epstein-barr virus，艾司坦氏-巴爾氏病毒)等使之不朽化，並進行選殖，將產生該抗體之淋巴細胞進行培養，自該培養上清液精製該抗體。
人類抗體噬菌體庫係藉由將由人類B細胞所製備之抗體基因插入 至噬菌體基因，使Fab、scFv等抗體片段於噬菌體表面進行表現而獲得之基因庫。可自該基因庫，以針對固定有抗原之受質的結合活性作為指標，而回收於表面表現有具有所需抗原結合活性之抗體片段的噬菌體。該抗體片段可進而藉由基因工程學方法轉化為包含2條完整H鏈及2條完整L鏈之人類抗體分子。
產生人類抗體之基因轉殖動物意指細胞內組入有人類抗體基因之動物。具體而言，例如可藉由向小鼠ES細胞中導入人類抗體基因，將該ES細胞移植至小鼠之早期胚後，使個體發育，而製作產生人類抗體之基因轉殖小鼠。源自產生人類抗體之基因轉殖動物之人類抗體可藉由如下方式製備，即，使用通常對於非人類動物所進行之融合瘤製作方法而取得融合瘤，並進行培養，於培養上清液中產生、蓄積抗體。
作為基因重組抗體之CH，只要屬於人類免疫球蛋白，則可為任何者，較佳為人類免疫球蛋白G(human immunoglobulin G，hIgG)型者。進而，亦可使用屬於hIgG型之hIgG1、hIgG2、hIgG3及hIgG4之亞型之任一者。又，作為基因重組抗體之CL，只要屬於人類免疫球蛋白，則可為任一者，可使用κ型或λ型者。
於本發明中，所謂雙專一性抗體係指具有特異性不同之2種抗原結合區域的抗體。雙專一性抗體之各自抗原結合區域可與單一抗原之不同之抗原決定位結合，亦可與不同抗原結合。
一分子之雙專一性抗體係與單一抗原之不同抗原決定位結合，或不同抗原各自之一個以上之抗原結合區域結合，即分別以一價以上進行結合。例如，於本發明中，一分子之雙專一性抗體各具有與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域之兩者之情形時，該雙專一性抗體分別以雙價與TRAILR2及PSMA結合。
於本發明中，每一分子之雙專一性抗體以何價與TRAILR2或 PSMA結合均可，較佳為以至少雙價分別與TRAILR2及PSMA結合。
又，包含經由包含免疫球蛋白區域或其片段之連結子等適當連結子而結合之複數個抗原結合區域的抗體亦包括在本發明之雙專一性抗體中。
於本發明之雙專一性抗體中，與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域之位置可適當選擇。
本發明之雙專一性抗體可藉由現有之製作技術([Nature Protocols,9,2450-2463(2014)]、國際公開第1998/050431號、國際公開第2001/7734號、國際公開第2002/002773號及國際公開第2009/131239號)等而製作。
於本發明之雙專一性抗體中，與TRAILR2結合之抗原結合區域可較與PSMA結合之抗原結合區域更位於N末端側，亦可較與PSMA結合之抗原結合區域更位於C末端側，較佳為較與PSMA結合之抗原結合區域更位於N末端側。
作為本發明之雙專一性抗體，可使用抗體之V區域作為抗原結合區域，例如可列舉：包含一條重鏈中包含複數條VH之重鏈的抗體、及包含兩條包含一條VH之重鏈的抗體等。
作為包含一條重鏈包含複數條VH之重鏈的雙專一性抗體，更具體而言，可列舉：包含使用包含免疫球蛋白區域或其片段之連結子結合而成之包含2條以上VH之重鏈的抗體。
於使3條以上VH結合之情形時，可使用不同之免疫球蛋白區域或其片段，亦可使用相同之免疫球蛋白區域或其片段。又，於使2條以上VH連結之情形時，可以各VH特異性地與抗原結合之方式改變免疫球蛋白區域或其片段之長度或種類。
本發明之雙專一性抗體具體而言具有下述(a)~(e)所示之至少1個特徵。
(a)1條重鏈多肽包含複數條(例如2~5條)不同VH，且VH相互分隔而不接近；(b)VH經由10個胺基酸以上之多肽連結子而串聯(縱列)地連結，更具體而言，使用例如包含免疫球蛋白區域之全部或一部分之胺基酸序列的連結子將VH連結；(c)輕鏈與重鏈締合，而形成抗原結合部位；(d)如圖1所示，具有包含2條重鏈多肽與至少4條輕鏈多肽之結構，且2條重鏈多肽間於鉸鏈區域以雙硫鍵連結，輕鏈多肽與重鏈多肽之間亦以雙硫鍵連結；及(e)重鏈之恆定區域包含例如天然型抗體重鏈之恆定區域之全部或一部分(例如CH1片段、CH1、CH2、CH3、CH1-鉸鏈、CH1-鉸鏈-CH2及CH1-鉸鏈-CH2-CH3等)。
於本發明中，雙專一性抗體所含之與TRAILR2結合之抗體之VH及與PSMA結合之抗體之VH之位置可適當選擇。例如，關於圖1所示之結構之雙專一性抗體，與TRAILR2結合之抗體之VH可較與PSMA結合之抗體之VH更位於N末端側，亦可較與PSMA結合之抗體之VH更位於C末端側，較佳為較與PSMA結合之抗體之VH更位於N末端側。
於本發明中，雙專一性抗體所含之VL為相同之VL或不同之VL均可。關於具有相同之VL並且可與兩個不同抗原或同一抗原上之兩個不同抗原決定位結合的雙專一性抗體之VH，只要為以各可變區域分別與特異性之抗原或抗原決定位結合之方式進行最佳化或改型之VH即可，例如可使用藉由胺基酸改型之篩選、或噬菌體顯示等方法而選擇適當之VH。
於本發明中，所謂連結子係指使複數個抗原結合區域結合之化學結構，較佳為多肽。作為本發明之雙專一性抗體所使用之連結子，例如可列舉：包含免疫球蛋白區域之全部或一部分之胺基酸序列的連 結子、及含有包含複數個免疫球蛋白區域之連結子之全部或一部分之胺基酸序列的連結子等。
作為包含免疫球蛋白區域之一部分之胺基酸序列的連結子，選自免疫球蛋白中之胺基酸序列可為斷續亦可為連續，較佳為連續之胺基酸序列。
於本發明中，所謂免疫球蛋白區域係將具有與免疫球蛋白類似之胺基酸序列，且包含存在至少2個半胱胺酸殘基之約100個胺基酸殘基之肽設為最小單位。於本發明中，免疫球蛋白區域亦包括包含複數個上述最小單位之免疫球蛋白區域之多肽。作為免疫球蛋白區域，可列舉：免疫球蛋白重鏈之VH、CH1、CH2及CH3，或免疫球蛋白輕鏈之VL及CL等。
免疫球蛋白之動物種類並無特別限定，較佳為人類。又，免疫球蛋白重鏈之恆定區域之亞型可為IgD、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2及IgE之任一者，較佳為源自IgG及源自IgM。又，免疫球蛋白輕鏈之恆定區域之亞型可為κ及λ之任一者。
又，免疫球蛋白區域於免疫球蛋白以外之蛋白質中亦存在，例如可列舉主要組織相容性抗原(MHC)、CD1、B7及T細胞受體(TCR)等屬於免疫球蛋白超級家族之蛋白質所包含之免疫球蛋白區域。作為本發明之雙專一性抗體所使用之免疫球蛋白區域，任一免疫球蛋白區域均可應用。
於人類抗體之情形時，CH1係指具有EU索引所示之第118號至第215號之胺基酸序列的區域。同樣地，鉸鏈區域係指具有Kabat等人之EU索引所示之第216號至第230號之胺基酸序列的區域，CH2係指具有Kabat等人之EU索引所示之第231號至第340號之胺基酸序列的區域，CH3係指具有Kabat等人之EU索引所示之第341號至第446號之胺基酸序列的區域。CH1與CH2之間存在稱為鉸鏈(hinge)區域之富於柔 軟性之胺基酸區域。
CL於人類抗體之κ鏈之情形時，係指具有Kabat編號所示之第108號至第214號之胺基酸序列的區域，於λ鏈之情形時係指具有第108號至第215號之胺基酸序列的區域。
作為本發明之雙專一性抗體所使用之連結子，可列舉：包含沿著N末端向C末端之方向依序排列之CH1-鉸鏈-CH2-CH3之免疫球蛋白區域、包含CH1-鉸鏈-CH2之免疫球蛋白區域、包含CH1-鉸鏈之免疫球蛋白區域、包含CH1之免疫球蛋白區域、CH1之N末端側之片段、包含第14號之胺基酸殘基為Cys之14個胺基酸殘基的CH1片段及包含自CH1之N末端起第1號~第14號之胺基酸殘基的CH1片段、以及於該等免疫球蛋白區域片段之胺基酸序列中改變1個以上胺基酸殘基者，但並不限定於該等。
又，於本發明中，作為連結子之一例，可將抗體之包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之全部或一部分之片段適當組合而使用。又，亦可使此等胺基酸序列部分地缺失，或調換順序而使用。又，連結子所使用之抗體之亞型並無特別限定，較佳為IgM或IgG4，更佳為IgG4。
於本發明中，作為具體之連結子之例，可列舉：包含序列編號11所表示之IgG4之CH1之N末端之第1號~第14號之14個胺基酸殘基的連結子、包含自序列編號12所表示之IgM之CH1之N末端起第1號~第14號之胺基酸殘基的連結子、及包含序列編號93所表示之IgG4之CH1的連結子等，更佳為包含序列編號93所表示之IgG4之CH1的連結子。
於構成本發明之雙專一性抗體或該抗體片段的胺基酸序列中缺失、附加、置換或插入1個以上胺基酸殘基且具有與上述抗體或其抗體片段相同之活性之抗體或其抗體片段亦包括在本發明之雙專一性抗體或其抗體片段中。
缺失、置換、插入及/或附加之胺基酸之數量為1個以上，其數量並無特別限定，為藉由Molecular Cloning,The Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,John Willy & Sons(1987-1997)、Nucleic Acids Research,10,6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982)、Gene,34,315(1985)、Nucleic Acids Research,13,4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985)等所記載之部位特異性變異導入法等公知技術而可缺失、置換、插入或者附加之程度之數量。例如為1個~數十個，較佳為1~20個，更佳為1~10個，進而較佳為1~5個。
於上述本發明之雙專一性抗體之胺基酸序列中，所謂缺失、置換、插入或附加1個以上胺基酸殘基係指如下。於同一序列中之任意且1個或者複數個胺基酸序列中，有1個或複數個胺基酸殘基之缺失、置換、插入或附加。又，亦有同時發生缺失、置換、插入或附加之情形，置換、插入或附加之胺基酸殘基亦有為天然型與非天然型之任一者之情形。
作為天然型胺基酸殘基，例如可列舉：L-丙胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬醯胺酸、L-麩醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-精胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯基丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸及L-半胱胺酸等。
以下，揭示能夠相互置換之胺基酸殘基之較佳例。同一群所含之胺基酸殘基能夠相互置換。
A群：白胺酸、異白胺酸、正白胺酸、纈胺酸、正纈胺酸、丙胺酸、2-胺基丁酸、甲硫胺酸、O-甲基絲胺酸、第三丁基甘胺酸、第三丁基丙胺酸、環己基丙胺酸
B群：天冬醯胺酸、麩胺酸、異天冬醯胺酸、異麩胺酸、2-胺基 己二酸、2-胺基辛二酸
C群：天冬醯胺、麩醯胺
D群：離胺酸、精胺酸、鳥胺酸、2,4-二胺基丁酸、2,3-二胺基丙酸
E群：脯胺酸、3-羥基脯胺酸、4-羥基脯胺酸
F群：絲胺酸、蘇胺酸、高絲胺酸
G群：苯基丙胺酸、酪胺酸
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段亦包括包含經轉譯後修飾之任何胺基酸殘基的抗體。作為轉譯後修飾，例如可列舉：H鏈之C末端之離胺酸殘基之缺失[離胺酸剪切(lysine clipping)]及多肽之N末端之麩醯胺殘基向焦麩醯胺(puroGlu)之轉化等[Beck et al,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。
作為本發明之雙專一性抗體，具體而言，可列舉選自由下述(1)~(3)所組成之群中之任一種雙專一性抗體等。
(1)包含與TRAILR2結合之抗體之V區域及與PSMA結合之抗體之V區域的雙專一性抗體、(2)包含與TRAILR2結合之抗體之VH之CDR1~3及VL之CDR1~3、以及與PSMA結合之抗體之VH之CDR1~3及VL之GDR1~3的雙專一性抗體、及(3)包含與TRAILR2結合之抗體之VH及VL、以及與PSMA結合之抗體之VH及VL的雙專一性抗體。
關於上述(2)所記載之雙專一性抗體，與TRAILR2結合之抗體之VL之CDR1~3和與PSMA結合之抗體之VL之CDR1~3分別可相同，亦可不同，較佳為相同。
又，關於上述(3)所記載之雙專一性抗體，與TRAILR2結合之抗體之VL和與PSMA結合之抗體之VL可相同，亦可不同，較佳為相 同。
作為本發明之雙專一性抗體，更具體而言，可列舉：與TRAILR2結合之抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號70~72所表示之胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的雙專一性抗體。
作為VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號70~72所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的與TRAILR2結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類TRAILR2單株抗體E11抗體等。
本發明之雙專一性抗體亦包括與TRAILR2結合之抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列及VL之CDR1~3之胺基酸序列與序列編號70~72分別表示之胺基酸序列及序列編號74~76分別表示之胺基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相同的雙專一性抗體。
又，作為本發明之雙專一性抗體之具體例，亦可列舉與TRAILR2結合之抗體之VH之胺基酸序列包含序列編號118所表示之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序列的雙專一性抗體。
作為VH之胺基酸序列包含序列編號118所表示之胺基酸序列且VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序列的與TRAILR2結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類TRAILR2單株抗體E11抗體等。
本發明之雙專一性抗體亦包括與TRAILR2結合之抗體之VH及VL之胺基酸序列與序列編號118所表示之VH之胺基酸序列及119所表示之VL之胺基酸序列具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至 少85%、至少90%、至少95%、至少99%相同的雙專一性抗體。
於本發明中，作為與TRAILR2結合之抗體，亦包括下述(1)~(3)之任一者所記載之抗體。
(1)為TRAILR2抗體單獨時不顯示出抑制細胞增殖活性及誘導細胞死亡活性之至少一者，但為結合有針對其他抗原之結合區域的雙專一性抗體時，首次顯示出抑制細胞增殖活性及誘導細胞死亡活性之至少一者的抗體。
(2)與分別包含序列編號70~72所表示之VH之CDR1~3之胺基酸序列且分別包含序列編號74~76所表示之VL之CDR1~3之胺基酸序列之抗體競爭而與TRAILR2結合之抗體。
(3)與和分別包含序列編號70~72所表示之VH之CDR1~3之胺基酸序列且分別包含序列編號74~76所表示之VL之CDR1~3之胺基酸序列之抗體相同之抗原決定位結合的抗體。
又，作為本發明之雙專一性抗體，可列舉：與PSMA結合之抗體之VH之CDR1~3之胺基酸序列包含選自由以下之(A)~(D)所組成之群中之任一個胺基酸序列，且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的雙專一性抗體。
(A)VH之CDR1~3之胺基酸序列分別由序列編號78、82及84表示之胺基酸序列、(B)VH之CDR1~3之胺基酸序列分別由序列編號78、79及80表示之胺基酸序列、(C)VH之CDR1~3之胺基酸序列分別由序列編號78、82及80表示之胺基酸序列、及(D)VH之CDR1~3之胺基酸序列分別由序列編號96~98表示之胺基酸序列。
因此，作為本發明之雙專一性抗體所具備之與PSMA結合之抗體 之可變區域，具體而言，可列舉：選自由以下之(a)~(d)所組成之群中之任一個VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列之VL。
(a)分別包含序列編號78、82及84所表示之胺基酸序列作為CDR1~3之VH、(b)分別包含序列編號78、79及80所表示之胺基酸序列作為CDR1~3之VH、(c)分別包含序列編號78、82及80所表示之胺基酸序列作為CDR1~3之VH、及(d)分別包含序列編號96~98所表示之胺基酸序列作為CDR1~3之VH。
作為包含CDR1~3分別包含序列編號78、82及84表示之胺基酸序列之VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列之VL的與PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PN7抗體等。
作為包含CDR1~3分別包含序列編號78、79及80表示之胺基酸序列之VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列之VL的與PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉：抗人類PSMA單株抗體PI134抗體、PI143抗體、PI105抗體、PI127抗體、PI108抗體、PI115抗體及PL223抗體等。
作為包含CDR1~3分別包含序列編號78、82及80表示之胺基酸序列之VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列之VL的與PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI101抗體及PI118抗體等。
作為包含CDR1~3分別包含序列編號96~98表示之胺基酸序列之VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列之VL 的與PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PN170抗體等。
本發明之雙專一性抗體亦包括包含如下VH及VL之雙專一性抗體，該VH及VL包含與作為與PSMA結合之抗體之VH的選自由上述(a)~(d)所組成之群中之任一個VH、及CDR1~3分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的VL之胺基酸序列分別具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相同之胺基酸序列。
又，作為本發明之雙專一性抗體所具備之與PSMA結合之抗體之可變區域，具體而言，可列舉選自由以下之(e)~(o)所組成之群中之任一個VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL。
(e)包含序列編號122所表示之胺基酸序列的VH、(f)包含序列編號120所表示之胺基酸序列的VH、(g)包含序列編號128所表示之胺基酸序列的VH、(h)包含序列編號123所表示之胺基酸序列的VH、(i)包含序列編號127所表示之胺基酸序列的VH、(j)包含序列編號124所表示之胺基酸序列的VH、(k)包含序列編號125所表示之胺基酸序列的VH、(l)包含序列編號129所表示之胺基酸序列的VH、(m)包含序列編號121所表示之胺基酸序列的VH、(n)包含序列編號126所表示之胺基酸序列的VH、及(o)包含序列編號130所表示之胺基酸序列的VH。
作為含有包含序列編號122所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PN7抗體等。
作為含有包含序列編號120所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI134抗體等。
作為含有包含序列編號128所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI143抗體等。
作為含有包含序列編號123所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI105抗體等。
作為含有包含序列編號127所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI127抗體等。
作為含有包含序列編號124所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI108抗體等。
作為含有包含序列編號125所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI115抗體等。
作為含有包含序列編號129所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PL223抗體等。
作為含有包含序列編號121所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI101抗體等。
作為含有包含序列編號126所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一 態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PI118抗體等。
作為含有包含序列編號130所表示之胺基酸序列之VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL的與人類PSMA結合之抗體之一態樣，可列舉抗人類PSMA單株抗體PN170抗體等。
本發明之雙專一性抗體亦包括包含如下VH及VL之雙專一性抗體，該VH及VL包含與作為與PSMA結合之抗體之VH的選自由上述(e)~(0)所組成之群中之任一個VH、及包含序列編號119所表示之胺基酸序列之VL之胺基酸序列分別具有至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%相同之胺基酸序列。
又，作為本發明之雙專一性抗體所使用之抗PSMA抗體，亦包括下述(1)或(2)所記載之抗體等。
(1)與VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號78、82及84所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號78、89及80所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號78、82及80所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、或VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號96~98所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體競爭而與PSMA結合之抗體。
(2)與和VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號78、82及84所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、VH之CDR1~3之胺基酸序 列分別包含序列編號78、89及80所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號78、82及80所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體、或VH之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號96~98所表示之胺基酸序列且VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列的抗體相同之抗原決定位結合之抗體。
於本發明之雙專一性抗體中，與TRAILR2結合之抗體之可變區域可相對於與PSMA結合之抗體之可變區域，經由連結子而位於N末端側，亦可位於C末端側，較佳為經由連結子而位於N末端側。作為與TRAILR2結合之抗體之可變區域較與PSMA結合之抗體之可變區域更位於N末端側之雙專一性抗體，可列舉：包含與TRAILR2結合之抗體之VH、連結子及與PSMA結合之抗體之VH的多肽之胺基酸序列為選自由以下之(A)~(M)所組成之群中之任一個胺基酸序列的雙專一性抗體。
(A)序列編號131所表示之胺基酸序列、(B)序列編號132所表示之胺基酸序列、(C)序列編號133所表示之胺基酸序列、(D)序列編號134所表示之胺基酸序列、(E)序列編號135所表示之胺基酸序列、(F)序列編號136所表示之胺基酸序列、(G)序列編號137所表示之胺基酸序列、(H)序列編號138所表示之胺基酸序列、(I)序列編號139所表示之胺基酸序列、(J)序列編號140所表示之胺基酸序列、 (K)序列編號141所表示之胺基酸序列、(L)序列編號142所表示之胺基酸序列、及(M)序列編號143所表示之胺基酸序列。
作為包含與TRAILR2結合之抗體之VH、連結子及與PSMA結合之抗體之VH的多肽之胺基酸序列為上述(A)~(M)所記載之胺基酸序列的與TRAILR2及PSMA結合之雙專一性抗體之一態樣，可列舉分別與人類TRAILR2及人類PSMA結合之雙專一性抗體E11-CH1-PI134抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PI105VH抗體、E11-CH1-PI108VH抗體、E11-CH1-PI115VH抗體、E11-CH1-PI118VH抗體、E11-CH1-PI127VH抗體、E11-CH1-PI143VH抗體、E11-CH1-PL223VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體、E11-CH1-PN170VH抗體、E11-GL-PI134VH抗體、及E11-ML-PI101VH抗體等。
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段亦包括具有效應活性之抗體或該抗體片段。
所謂效應活性係指經由抗體之Fc區域而引起之抗體依賴性之細胞毒殺活性，例如可列舉：抗體依賴性細胞毒殺活性(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity activity，ADCC活性)、補體依賴性細胞毒殺活性(Complement-Dependent Cytotoxicity activity，CDC活性)、巨噬細胞或樹狀細胞等吞噬細胞之抗體依賴性吞噬活性(Antibody-dependent cellular phagocytosis activity，ADCP活性)及噬菌素效果等。
於本發明中，ADCC活性及CDC活性可使用公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
所謂ADCC活性係指與標靶細胞上之抗原結合之抗體經由抗體之Fc區域而與免疫細胞之Fc受體結合，藉此活化免疫細胞(自然殺手細胞等)，而毒殺標靶細胞之活性。
Fc受體(FcR)係與抗體之Fc區域結合之受體，其藉由抗體之結合而誘發各種效應活性。各FcR對應於抗體之亞型，IgG、IgE、IgA、IgM分別與FcγR、FcεR、FcoR、FcμR特異性地結合。進而，FcγR存在FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16)之亞型，各亞型存在FcγRIA、FcγRIB、FcγRIC、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA及FcγRIIIB之同功異型體。該等不同之FcγR存在於不同之細胞上[Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)]。於人類體內，FcγRIIIB於嗜中性白細胞中特異性地表現，FcγRIIIA於單核球、自然殺手細胞(NK細胞)、巨噬細胞及一部分T細胞中表現。經由抗體與FcγRIIIA之結合，而誘發NK細胞依賴性之ADCC活性。
所謂CDC活性係指與標靶細胞上之抗原結合之抗體將包含血液中之補體相關蛋白質群的一系列級聯反應(補體活化途徑)活化，而毒殺標靶細胞之活性。又，藉由因補體之活化而產生之蛋白質片段，而誘導免疫細胞之趨化及活化。關於CDC活性之級聯反應，首先C1q與Fc區域結合，其次與2種絲胺酸蛋白酶即C1r及C1s結合，藉此開始形成C1複合體。
本發明之雙專一性抗體或該抗體片段之針對抗原表現細胞之CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
作為控制本發明之雙專一性抗體之效應活性的方法，已知有：對與和抗體之Fc區域(包含CH2及CH3區域之恆定區域)之第297號之天冬醯胺(Asn)結合之N-結合複合型糖鏈之還原末端所存在之N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)進行α-1,6鍵結之海藻糖(亦稱為核心海藻糖)之量進行控制的方法(國際公開第2005/035586號、國際公開第2002/31140號及國際公開第00/61739號)、或藉由抗體之Fc區域之胺基酸殘基之改型而進行控制之方法(國際公開第00/42072號)等。
藉由雙專一性抗體上所附加之海藻糖之量，可使抗體之ADCC活性增加或降低。例如，作為使與抗體之Fc結合之N-結合複合型糖鏈所結合之海藻糖之含量降低的方法，可藉由使用缺失α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞使雙專一性抗體表現，而取得具有較高之ADCC的雙專一性抗體。另一方面，作為使與雙專一性抗體之Fc結合之N-結合複合型糖鏈上所結合之海藻糖之含量增加的方法，可藉由使用導入有α1,6-海藻糖轉移酶基因之宿主細胞使抗體表現，而取得具有較低之ADCC活性之雙專一性抗體。
又，可藉由將雙專一性抗體之Fc區域之胺基酸殘基改型，而使ADCC活性或CDC活性增加或降低。例如，藉由使用美國專利申請公開第2007/0148165號說明書中所記載之Fc區域之胺基酸序列，可使雙專一性抗體之CDC活性增加。又，可藉由進行美國專利第6,737,056號說明書、美國專利第7,297,775號說明書或美國專利第7,317,091號說明書等所記載之胺基酸改型，而使ADCC活性或CDC活性增加或降低。
進而，藉由組合上述方法，亦可取得效應活性得到控制之雙專一性抗體。
本發明之雙專一性抗體之穩定性可藉由測定在精製過程或於一定條件下保存之樣品中所形成之凝集體(寡聚物)量而進行評價。即，將於相同條件下凝集體量降低之情形評價為抗體之穩定性提昇。凝集體量可藉由使用包括凝膠過濾層析法之適當之層析法，將凝集之抗體與未凝集之抗體分離而進行測定。
本發明之雙專一性抗體之生產性可藉由測定自抗體產生細胞產生至培養液中之抗體量而進行評價。更具體而言，可藉由HPLC法或ELISA法等適當方法測定自培養液去除產生細胞之培養上清液中所含之抗體之量，藉此進行評價。
於本發明中，所謂抗體片段係指包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域且具有抗原結合活性之抗體片段。於本發明中，作為抗體片段，可列舉：包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙功能抗體(diabody)、dsFv或CDR之肽等。
Fab係利用雙硫鍵(S-S鍵)將利用蛋白質分解酶木瓜酶處理IgG抗體而獲得之片段中(於H鏈之第224號之胺基酸殘基處切斷)之H鏈之N末端側約一半與L鏈整體結合而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
F(ab')2係較利用蛋白質分解酶胃蛋白酶處理IgG而獲得之片段中(於H鏈之第234號之胺基酸殘基處切斷)Fab經由鉸鏈區域之S-S鍵而結合者稍大的分子量約10萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
Fab'係將上述F(ab')2之鉸鏈區域之S-S鍵切斷而成之分子量約5萬之具有抗原結合活性之抗體片段。
scFv係使用12個殘基以上之適當之肽連結子(P)將1條VH與1條VL連結而成之VH-P-VL或VL-P-VH多肽，且係具有抗原結合活性之抗體片段。
雙價抗體係抗原結合特異性之相同或不同之scFv形成二聚物之抗體片段，且係具有針對相同抗原之2價抗原結合活性，或針對不同抗原分別具有特異性之抗原結合活性的抗體片段。
dsFv係指對於將VH及VL中之各1個胺基酸殘基置換為半胱胺酸殘基之多肽，經由該半胱胺酸殘基間之S-S鍵使之結合而成者。
包含CDR之肽係包含VH或VL之CDR之至少1個區域而構成。包含複數個CDR之肽可藉由使CDR彼此直接結合或經由適當之肽連結子進行結合而製作。包含CDR之肽可藉由構建編碼本發明之雙專一性抗體之VH及VL之CDR的DNA，將該DNA插入至原核生物用表現載體或真核生物用表現載體中，再將該表現載體導入至原核生物或真核生 物，使之表現而製造。又，包含CDR之肽亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製造。
本發明之雙專一性抗體之Fc與抗體片段結合而成之融合蛋白質、該Fc與天然存在之配體或受體結合而成之Fc融合蛋白質(亦稱為免疫黏附素)、及使複數個Fc區域融合而成之Fc融合蛋白質等亦包括在本發明中。又，包含以抗體之效應活性之增強或缺失、抗體之穩定化、及血漿半衰期之控制為目標之胺基酸殘基改型的Fc區域亦可用於本發明之雙專一性抗體。
作為本發明之雙專一性抗體或抗體片段，包括藉由化學或基因工程學方法使放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、蛋白質或抗體醫藥等與本發明之雙專一性抗體或其抗體片段結合而成之抗體之衍生物。
本發明之抗體之衍生物可藉由利用化學方法[抗體工程學入門、地人書館(1994)]使放射性同位素、低分子之藥劑、高分子之藥劑、免疫刺激劑、蛋白質或抗體醫藥等與本發明之雙專一性抗體或其抗體片段之H鏈或L鏈之N末端側或者C末端側、該抗體或其抗體片段中之適當之取代基或者側鏈、進而該抗體或其抗體片段中之糖鏈等結合而製造。
又，本發明之抗體之衍生物可藉由利用基因工程學方法，使編碼本發明之雙專一性抗體或抗體片段之DNA、與編碼所需之蛋白質或抗體醫藥之DNA連結，並插入至表現載體，再將該表現載體導入至適當之宿主細胞，使之表現而製造。
作為放射性同位素，例如可列舉：111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。放射性同位素可藉由氯胺T法等而與抗體直接結合。又，亦可使將放射性同位素螯合之物質與抗體結合。作為螯合劑，例如可列舉：1-異硫氰酸苄酯基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX- DTPA)等。
作為低分子之藥劑，例如可列舉：烷基化劑、亞硝基脲劑、代謝拮抗劑、抗生素、植物鹼、拓撲異構酶抑制劑、激素療法劑、激素拮抗劑、芳香環轉化酶抑制劑、P糖蛋白抑制劑、鉑錯合物衍生物、M期抑制劑或者激酶抑制劑等抗癌劑[臨床腫瘤學，癌與化學療法社(1996)]，氫化可體松或者潑尼松等類固醇劑，阿司匹林或者吲哚美辛等非類固醇劑，硫蘋果酸金或者青黴胺等免疫調節劑，環磷醯胺或者硫唑嘌呤等免疫抑制劑或馬來酸氯菲安明或者氯馬斯汀之類的抗組織胺劑等抗炎症劑[炎症與抗炎症療法、醫齒藥出版股份有限公司(1982)]等。
作為抗癌劑，例如可列舉：阿米福汀(氨磷汀)、順鉑、達卡巴仁(DTIC)、奇黴素、更生黴素(氮芥)、鏈脲菌素、環磷醯胺、異環磷醯胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿德力黴素)、表柔比星、吉西他濱(健擇)、唐黴素、甲芣肼、絲裂黴素、阿糖胞苷(cytarabine)、依託泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼、博來黴素(bleomycin)、道諾黴素(daunomycin)、培洛黴素、雌莫司汀、紫杉醇(紫杉醇鹼)、歐洲紫杉醇(克癌易)、普留淨(aldesleukin)、樂拿舒(asparaginase)、補束克(busulfan)、卡鉑、奧沙利鉑、奈達鉑(nedaplatin)、克拉屈濱(cladribine)、喜樹鹼、10-羥基-7-乙基喜樹鹼(SN38)、氟尿苷(floxuridine)、福達樂(fludarabine)、羥基脲、艾達黴素(idarubicin)、美司鈉(mesna)、抗癌妥(irinotecan)(CPT-11)、拓撲替康(nogitecan)、米托蒽醌、拓朴替康、柳菩林(leuprolide)、甲地孕酮、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、羥基碳醯胺、普卡黴素(plicamycin)、米托坦、培門冬酶、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、鏈佐星(streptozocin)、泰莫西芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、柳菩林 (leuprorelin)、氟他胺(flutamide)、替尼泊苷(teniposide)、睾內酯(testolactone)、硫鳥嘌呤、噻替派、尿嘧啶芥、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氫化可體松、潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍(prednisolone)、長春地辛(vindesine)、尼莫司汀(nimustine)、司莫司汀(semustine)、卡培他濱、Tomudex、阿紮胞苷(azacitidine)、UFT、奧沙利鉑、吉非替尼(艾瑞莎)、依麥替尼布(STI571)、埃羅替尼(Erlotinib)、FMS-樣酪胺酸激酶3(Flt3)抑制劑、血管內皮生長因子受體(VEGFR)抑制劑、纖維母細胞生長因子受體(FGFR)抑制劑、得舒緩等表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、根赤殼菌素(radicicol)、17-烯丙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素、雷帕黴素(rapamycin)、安吖啶(amsacrine)、全反式視黃酸、沙利竇邁(thalidomide)、來那度胺、阿那曲唑、法倔唑、來曲唑、依西美坦(exemestane)、硫蘋果酸金、D-青黴胺、布西拉明(bucillamine)、硫唑嘌呤、咪唑利賓(mizoribine)、環孢靈(cyclosporin)、雷帕黴素(rapamycin)、氫化可體松、貝沙羅汀(塔革雷汀)、他莫昔芬、地塞美松(dexamethasone)、黃體素類、雌激素類、安美達錠(anastrozole)(瑞甯得)、柳菩林(leuplin)、阿司匹林、吲哚美辛、塞來考昔(celecoxib)、硫唑嘌呤、青黴胺、硫蘋果酸金、馬來酸氯苯那敏、氯芬尼拉明、氯馬斯汀、全反式維生素A酸(tretinoin)、貝沙羅汀、砷、硼替左米(bortezomib)、安樂普諾(allopurinol)、卡奇黴素(calicheamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、塔革雷汀(targretin)、ozogamine、克拉黴素(clarithromycin)、亞葉酸(leucovorin)、酮康唑、氨苯哌酮(aminoglutethimide)、舒拉明(suramin)、甲胺喋呤或者maytansinoid或其衍生物等。
作為使低分子之藥劑與本發明之雙專一性抗體結合之方法，例如可列舉：經由戊二醛使藥劑與該抗體之胺基間結合之方法、或經由 水溶性碳二醯亞胺使藥劑之胺基與該抗體之羧基結合之方法等。
作為高分子之藥劑，可列舉：聚乙二醇(PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯馬來酸共聚物、聚乙烯基吡咯啶酮、吡喃共聚物、或羥丙基甲基丙烯醯胺等。藉由使該等高分子化合物與本發明之雙專一性抗體或抗體片段結合，可期待(1)提高針對化學、物理或者生物之各種因素之穩定性、(2)顯著延長血漿半衰期、或(3)抑制免疫原性之消失或者抗體產生等效果[Bioconjugate醫藥品、廣川書店(1993)]。
例如，作為使PEG與本發明之雙專一性抗體結合之方法，可列舉與PEG化修飾試劑進行反應之方法等[Bioconjugate醫藥品、廣川書店(1993)]。作為PEG化修飾試劑，可列舉：對離胺酸之ε-胺基之修飾劑(日本專利特開昭61-178926號公報)、對天冬醯胺酸及麩胺酸之羧基之修飾劑(日本專利特開昭56-23587號公報)、或對精胺酸之胍基之修飾劑(日本專利特開平2-117920號公報)等。
作為免疫刺激劑，可為作為免疫佐劑而已知之天然物，作為具體例，可列舉使免疫亢進之藥劑，即β(1→3)葡聚糖(例如香菇多糖或西佐糖)、或α半乳糖基腦醯胺(KRN7000)等。
作為蛋白質，例如可列舉：將NK細胞、巨噬菌體或嗜中性白細胞等免疫活性細胞活化之細胞激素或者增殖因子或毒素蛋白質等。
作為細胞激素或增殖因子，例如可列舉：干擾素(以下記為IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、介白素(以下記為IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、顆粒細胞菌落刺激因子(G-CSF)、顆粒細胞/巨噬細胞菌落刺激因子(GM-CSF)或巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)等。
作為毒素蛋白質，例如可列舉賴胺酸、白喉毒素或ONTAK(Denileukin Diftitox，地尼白介素)等，亦包括為了調節毒性而對蛋白質導入有變異之蛋白毒素。
與蛋白質或抗體醫藥之融合抗體可藉由使編碼蛋白質之cDNA與編碼本發明之雙專一性抗體或抗體片段之cDNA連結，而構建編碼融合抗體之DNA，將該DNA插入至原核生物或真核生物用表現載體，並將該表現載體導入至原核生物或真核生物，使之表現而製造。
於將上述抗體之衍生物用於檢測方法、定量方法、檢測用試劑、定量用試劑或診斷藥之情形時，作為與本發明之雙專一性抗體或其抗體片段結合之藥劑，可列舉通常之免疫學之檢測或測定法所使用之標記物。作為標記物，例如可列舉：鹼性磷酸酶、過氧化酶或者螢光素酶等酶、吖啶酯或者咯吩等發光物質、或螢光素異硫氰酸鹽(FITC)或者四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(RITC)、Alexa(註冊商標)Fluor 488、R-藻紅蛋白(R-PE)等螢光物質等。
本發明包括具有CDC活性或ADCC活性等細胞毒殺活性之雙專一性抗體及其抗體片段。本發明之雙專一性抗體或該抗體片段之針對抗原表現細胞之CDC活性或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行評價。
又，本發明係關於包含特異性地識別TRAILR2及PSMA並與之結合之雙專一性抗體或者其抗體片段的組合物、或含有該雙專一性抗體或者該抗體片段作為有效成分之與TRAILR2及PSMA之表現細胞相關之疾病之治療藥。
作為與TRAILR2及PSMA之表現細胞相關之疾病，例如只要為與表現TRAILR2及PSMA之細胞相關之疾病，則可為任何疾病，例如可列舉惡性腫瘤及癌症等。
於本發明中，作為惡性腫瘤及癌症，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色瘤(黑色素瘤)、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰臟癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮 癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、攝護腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、間皮瘤、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、寡樹突細胞瘤、髓母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠質母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀肉瘤及威爾姆斯腫瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或該抗體片段、或該等之衍生物的治療藥可為僅含有作為有效成分之該抗體或者該抗體片段、或該等之衍生物者，但通常較佳為以與藥理學上所容許之1種以上之載體一併混合，並藉由製劑學之技術領域公知之任意方法而製造之醫藥製劑之形式提供。
投予途徑較佳為使用治療時最有效者，例如可列舉：經口投予、或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌肉內或靜脈內等非經口投予。其中，較佳為靜脈內投予。
作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。
投予量或投予次數根據作為目標之治療效果、投予方法、治療期間、年齡及體重等而異，通常成人每1天為10μg/kg~10mg/kg。
進而，本發明係關於含有本發明之雙專一性抗體或其抗體片段的TRAILR2及PSMA之至少一者之免疫學之檢測用或者測定用試劑、或與TRAILR2及PSMA之表現細胞相關之疾病之診斷藥。又，本發明係關於使用本發明之雙專一性抗體或其抗體片段的TRAILR2及PSMA之至少一者之免疫學之檢測用或者測定用方法、或與TRAILR2及PSMA之表現細胞相關之疾病之診斷方法。
於本發明中，作為檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之量的方法，可列舉任意之公知方法。例如可列舉免疫學之檢測或測定方 法等。
所謂免疫學之檢測或測定方法係使用經標記之抗原或抗體而檢測或測定抗體量或抗原量之方法。作為免疫學之檢測或測定方法，例如可列舉：放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法(Iuminescent immunoassay)、西方墨點法或物理化學方法等。
藉由使用本發明之雙專一性抗體或該抗體片段而檢測或測定表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞，可診斷與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病。
表現TRAILR2及PSMA之至少一者之多肽的細胞之檢測可使用公知之免疫學檢測法，例如可列舉：免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。又，例如亦可列舉FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等螢光抗體染色法等。
於本發明中，作為成為檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之對象的生物樣本，例如只要為組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿、糞便、組織液或培養液等有可能包含表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞者，則無特別限定。
含有本發明之雙專一性抗體或者其抗體片段、或該等之衍生物的診斷藥根據作為目標之診斷法，亦可包含用以進行抗原抗體反應之試劑、該反應之檢測用試劑。作為用以進行抗原抗體反應之試劑，例如可列舉：緩衝劑、鹽等。
作為檢測用試劑，例如可列舉：與上述雙專一性抗體或者其抗體片段、或該等之衍生物結合之經標記之二次抗體、或與標記對應之受質等通常之免疫學之檢測或測定法所使用之試劑。
以下，對本發明之雙專一性抗體之製作方法、使用該抗體之 TRAILR2及PSMA之至少一者之測定方法、與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷方法及治療方法進行具體記載。
1.單株抗體之製作方法
本發明之單株抗體之製造方法包括下述作業步驟。即，(1)用作免疫原之抗原之精製及細胞表面過度表現抗原之細胞之製作之至少一步驟、(2)使抗原對動物免疫後，採取血液並檢驗其抗體效價，決定摘取脾臟等之時期，而製備抗體產生細胞的步驟、(3)骨髓瘤細胞(骨髓瘤)之製備、(4)抗體產生細胞與骨髓瘤之細胞融合、(5)產生作為目標之抗體的融合瘤群之篩選、(6)自融合瘤群分離單株(monoclonal)細胞(選殖)、(7)視情形為了大量製造單株抗體而進行之融合瘤之培養、或移植有融合瘤之動物之飼養、(8)如此製造之單株抗體之生理活性及其抗原結合特異性之研究、或作為標記試劑之特性之檢驗等。
以下，基於上述步驟對為了製作本發明之與TRAILR2及PSMA結合之雙專一性抗體而使用之與TRAILR2結合之單株抗體及與PSMA結合之單株抗體之製作方法進行詳細說明。該抗體之製作方法不受此限制，亦可使用例如脾臟細胞以外之抗體產生細胞及骨髓瘤。
(1)抗原之精製
表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞可藉由將包含編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之全長或其部分長度之cDNA的表現載體導入至大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等中而獲得。又，可自大量表現TRAILR2及PSMA之至少一者之各種人類腫瘤培養細胞或人類組織等而精製TRAILR2及PSMA之至少一者，而用作抗原。又，亦可將該腫瘤培養細胞或該組織等直接用作抗原。進而，亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製備具有TRAILR2及PSMA之至少一者之部分序列的合成肽，並用於抗原。
本發明所使用之TRAILR2及PSMA之至少一者可使用Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons(1987-1997)等中所記載之方法等，藉由例如以下之方法，使編碼該TRAILR2及PSMA之至少一者之DNA於宿主細胞中進行表現而製造。
藉由將包含編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之部分的全長cDNA插入至適當之表現載體之啟動子之下游，而製作重組載體。亦可使用基於全長cDNA所製備之包含編碼多肽之部分的適當長度之DNA片段代替上述全長cDNA。其次，藉由將所獲得之該重組載體導入至適合該表現載體之宿主細胞，而獲得產生TRAILR2及PSMA之至少一者之轉形體。
作為表現載體，只要為能夠組入至所使用之宿主細胞之自主複製或染色體中且於能夠轉錄編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之DNA的位置含有適當之啟動子者，則可使用任一者。
作為宿主細胞，例如只要為大腸桿菌等屬於埃希氏桿菌屬等之微生物、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等能夠表現作為目標之基因者，則可使用任一者。
於使用大腸桿菌等原核生物作為宿主細胞之情形時，重組載體較佳為包含能夠於原核生物中進行自主複製，並且啟動子、核糖體結合序列、包含編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之部分的DNA、以及轉錄終止序列的載體。又，該重組載體中，轉錄終止序列並非必須，較佳為於緊靠結構基因之下游配置轉錄終止序列。進而，該重組載體亦可包含控制啟動子之基因。
作為該重組載體，較佳為使用將作為核糖體結合序列之夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列與起始密碼子之間調節為適當距離(例如6~18個鹼基)之質體。
又，作為該編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之DNA之鹼基序列，可以成為最適合於宿主內之表現之密碼子之方式置換鹼基，藉此提高作為目標之TRAILR2及PSMA之至少一者之生產率。
作為表現載體，只要為能夠於所使用之宿主細胞中發揮機能者，則可使用任一者，例如可列舉：pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上為Roche Diagnostics公司製造)、pKK233-2(Pharmacia公司製造)、pSE280(Invitrogen公司製造)、pGEMEX-1(Promega公司製造)、pQE-8(QIAGEN公司製造)、pKYP10(日本專利特開昭58-110600號公報)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGHL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司製造)、pTrs30[由大腸桿菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)所製備]、pTrs32[由大腸桿菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)所製備]、pGHA2[由大腸桿菌IGHA2(FERM BP-400)所製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pGKA2[由大腸桿菌IGKA2(FERM BP-6798)所製備，日本專利特開昭60-221091號公報]、pTerm2(美國專利第4,686,191號說明書、美國專利第4,939,094號說明書、美國專利第5,160,735號說明書)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司製造)、pET系統(Novagen公司製造)或pME18SFL3(東洋紡公司製造)等。
作為啟動子，只要為於所使用之宿主細胞中發揮機能者，則可為任何啟動子。例如亦可列舉：trp啟動子(Ptrp)、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子或T7啟動子等源自大腸桿菌或噬菌體等之啟動子。又，例如亦可列舉：將2個Ptrp串聯而成之串聯啟動子、tac啟動子、lacT7啟動子、或let I啟動子等經人工設計改型之啟動子等。
作為宿主細胞，例如可列舉：大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌 XL2-Blue、大腸桿菌DH1、大腸桿菌MC1000、大腸桿菌KY3276、大腸桿菌W1485、大腸桿菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No.49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、或大腸桿菌DH5α等。
作為向宿主細胞中導入重組載體之方法，只要為向所使用之宿主細胞中導入DNA之方法，則可使用任一方法，例如可列舉：使用鈣離子之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)、Gene,17,107(1982)、Molecular & General Genetics,168,111(1979)]。
於使用動物細胞作為宿主之情形時，作為表現載體，只要為於動物細胞中發揮機能者，則可使用任一表現載體，例如可列舉：pcDNAI(Invitrogen公司製造)、pcDM8(Funakoshi公司製造)、pAGE107[日本專利特開平3-22979號公報；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本專利特開平2-227075號公報)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAl/Amp(Invitrogen公司製造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司製造)、pREP4(Invitrogen公司製造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3或pKANTEX93(國際公開第97/10354號)等。
作為啟動子，只要為於動物細胞中發揮機能者，則可使用任一啟動子，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之立即早期(immediate early，IE)基因之啟動子、SV40之初期啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子或莫洛尼小鼠白血病病毒之啟動子或者促進子。又，亦可將人類CMV之IE基因之促進子與啟動子一併使用。
作為宿主細胞，例如可列舉：人類伯奇氏淋巴瘤細胞Namalwa、源自非洲綠猴腎臟之細胞COS、源自中國倉鼠卵巢之細胞CHO、或人類白血病細胞HBT5637(日本專利特開昭63-000299號公報)等。
作為對於宿主細胞導入重組載體之方法，只要為向動物細胞中 導入DNA之方法，則可使用任一方法，例如可列舉：電穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、或脂質體轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
可藉由將源自如下微生物、或動物細胞等之轉形體於培養基中進行培養，使該TRAILR2及PSMA之至少一者生成蓄積於培養物中，並自該培養物進行採取，而製造TRAILR2及PSMA之至少一者，該微生物、或動物細胞等係藉由以上方式所獲得之保有組入有編碼TRAILR2及PSMA之至少一者之DNA之重組載體者。於培養基中培養該轉形體之方法可依據宿主之培養所使用之通常方法而進行。
於源自真核生物之細胞中進行表現之情形時，可獲得附加有糖或糖鏈之TRAILR2及PSMA之至少一者。
於培養利用使用誘導性啟動子之重組載體進行轉形之微生物時，視需要亦可向培養基中添加誘導物。例如於培養利用使用Iac啟動子之重組載體進行轉形之微生物之情形時向各培養基中添加異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷等，於培養利用使用trp啟動子之重組載體進行轉形之微生物之情形時，向各培養基中添加吲哚丙烯酸等。
作為將動物細胞設為宿主而培養所獲得之轉形體時之培養基，例如可列舉：一般使用之RPMI1640培養基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、Eagle之MEM培養基[Science,122,501(1952)]、杜貝可改良MEM培養基[Virology,8,396(1959)]、199培養基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]、Iscove改良杜貝可培養基(IMDM)、或向該等培養基中添加有胎牛血清(FBS)等之培養基等。培養通常於pH值6~8、30~40℃、5%CO2之存在下等條件下進行1~7天。又，培養過程中視需要亦可向培養基中添加康黴素、青黴素等抗生素。
作為編碼TRAILR2及PSMA之至少一者的基因之表現方法，除直接表現以外，亦可使用分泌生產或融合蛋白質表現等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]。作為TRAILR2及PSMA之至少一者之生產方法，例如可列舉生產於宿主細胞內之方法、分泌至宿主細胞外之方法、或生產於宿主細胞外膜上之方法，可改變所使用之宿主細胞、或所生產之TRAILR2及PSMA之至少一者之結構，而選擇適當方法。
例如可藉由製作對於編碼細胞外區域之胺基酸序列之DNA連結編碼抗體之Fc區域之DNA、編碼麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之DNA、或編碼FLAG標籤之DNA或編碼組胺酸標籤之DNA等而成之DNA，使之表現並進行精製，而製作抗原融合蛋白質。具體而言，例如可列舉：使TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞外區域與人類IgG之Fc區域結合而成之Fc融合蛋白質、TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞外區域與麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白質。
於使TRAILR及PSMA之至少一者生產於宿主細胞內或宿主細胞外膜上之情形時，可使用Paulson等人之方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、Lowe等人之方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本專利特開平05-336963號公報、或國際公開第94/23021號等中所記載之方法，使TRAILR2及PSMA之至少一者積極地分泌至宿主細胞外。又，亦可利用使用二氫葉酸還原酶基因等之基因擴增系(日本專利特開平2-227075號公報)，而提高TRAILR2及PSMA之至少一者之生產量。
所生產之TRAILR2及PSMA之至少一者例如可藉由以下方式進行單獨分離、精製。
於TRAILR2及PSMA之至少一者以溶解狀態於細胞內進行表現之情形時，於培養結束後藉由離心分離而回收細胞，並懸浮於水系緩衝 液中之後，使用超音波破碎機、弗氏細胞破碎儀、Manton-Gaulin均質機、或球磨機等將細胞破碎，而獲得無細胞萃取液。可將該無細胞萃取液離心分離，並單獨或組合使用通常之蛋白質之單獨分離精製法、即溶劑萃取法、利用硫酸銨等之鹽析法、脫鹽法、利用有機溶劑之沈澱法、使用二乙基胺基乙基(DEAE)-瓊脂糖、DIAION HPA-75(三菱化學公司製造)等樹脂之陰離子交換層析法、使用S-瓊脂糖FF(Pharmacia公司製造)等樹脂之陽離子交換層析法法、使用丁基瓊脂糖、苯基瓊脂糖等樹脂之疏水性層析法、使用分子篩之凝膠過濾法、親和層析法、層析聚焦法、或等電聚焦電泳等電泳法等方法，自所獲得之上清液獲得精製蛋白質。
於TRAILR2及PSMA之至少一者於細胞內形成不溶體而表現之情形時，與上述同樣地將細胞回收後加以破碎，並進行離心分離，藉此以沈澱組分之形式回收該TRAILR2及PSMA之至少一者之不溶體。將所回收之該TRAILR2及PSMA之至少一者之不溶體利用蛋白質改性劑進行可溶化。可藉由對該可溶化液進行稀釋或透析，使該TRAILR2及PSMA之至少一者恢復至正常立體結構後，藉由與上述同樣之單獨分離精製法，而獲得多肽之精製蛋白質。
於使TRAILR2及PSMA之至少一者或其糖修飾體等衍生物分泌至細胞外之情形時，於培養上清液中可回收該TRAILR2及PSMA之至少一者、或其糖修飾體等衍生物。可藉由與上述同樣地使用離心分離等方法對該培養上清液進行處理，而取得可溶性組分，並藉由使用與上述相同之單獨分離精製法自該可溶性組分獲得精製蛋白質。
又，本發明中所使用之TRAILR2及PSMA之至少一者亦可藉由Fmoc法或tBoc法等化學合成法而製造。具體而言，例如可利用Advanced Chemtec公司製造、PerkinElmer公司製造、Pharmacia公司製造、Protein Technology Instrument公司製造、Synthecell-Vega公司 製造、PerSeptive公司製造、或島津製作所公司製造等之肽合成機而進行化學合成。
(2)抗體產生細胞之製備步驟
對3~20週齡之小鼠、大鼠或倉鼠等動物免疫(1)中所獲得之抗原，並採取該動物之脾臟、淋巴節或周邊血液中之抗體產生細胞。 又，作為動物，例如可列舉富塚等人之文獻[Tomizuka.et al.,Proc Natl Acad Sci USA.,97、722,(2000)]中所記載之產生源自人類之抗體的基因轉殖小鼠、為了提高免疫原性之TRAILR2或PSMA之條件性剔除小鼠等作為被免疫動物。
免疫係藉由將抗原與Freund之完全佐劑、或氫氧化鋁凝膠與百日咳菌疫苗等適當佐劑一併投予而進行。小鼠免疫時之免疫原投予法可為皮下注射、腹腔內注射、靜脈內注射、皮內注射、肌肉內注射或足墊注射等之任一者，較佳為腹腔內注射、足墊注射或靜脈內注射。於抗原為部分肽之情形時，製作與BSA(牛血清白蛋白)、或KLH(Keyhole Limpet hemocyanin)等載體蛋白質之偶聯物，將其用作免疫原。
抗原之投予係於第1次投予後，每隔1~2週進行5~10次。於各投予後第3天~第7天自眼底靜脈叢採血，使用酶免疫測定法[Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等測定其血清之抗體效價。若使用上述血清對用於免疫之抗原顯示出充分抗體效價之動物作為融合用抗體之產生細胞之供給源，則可提高以後操作之效果。
於最終投予抗原後第3天~第7天，自經免疫之動物摘取脾臟等包含抗體產生細胞之組織，並採集抗體產生細胞。抗體產生細胞係形質細胞及作為其前驅細胞之淋巴細胞，其可自個體之任一部位獲得，一般可自脾臟、淋巴節、骨髓、扁桃體、周邊血液、或將該等適當組 合者等而獲得，最常使用脾臟細胞。於使用脾臟細胞之情形時，藉由將脾臟切細並擢碎後，進行離心分離，進而去除紅細胞，而取得融合用抗體產生細胞。
(3)骨髓瘤之製備步驟
作為骨髓瘤，可使用源自小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔或人類等哺乳動物之無自抗體產生能力之細胞，通常使用自小鼠獲得之株化細胞、例如8-氮鳥嘌呤耐性小鼠(源自BALB/c)骨髓瘤細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]、或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。該細胞株係於適當之培養基、例如8-氮鳥嘌呤培養基[添加有麩醯胺、2-巰基乙醇、建它黴素、FCS及8-氮鳥嘌呤之RPMI-1640培養基]、Iscove改良杜貝克培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，以下稱為「IMDM」)、或杜貝可改良伊格爾培養基(Dulbeeco's Modified Eagle Medium，以下稱為「DMEM」)等培養基中進行繼代培養。於細胞融合之3~4天前，將上述細胞株於正常培養基(例如包含10%FCS之DMEM培養基)中進行繼代培養，於進行融合當天確保2×107個以上之細胞數。
(4)細胞融合
將(2)中所獲得之融合用抗體產生細胞與(3)中所獲得之骨髓瘤細胞利用最低必需培養基(Minimum Essential Medium，MEM)或PBS(磷酸氫二鈉1.83g、磷酸二氫鉀0.21g、食鹽7.65g、蒸餾水1升、pH值7.2)進行充分洗淨，以成為融合用抗體產生細胞：骨髓瘤細胞=5：1~10：1之方式進行混合，並進行離心分離後，去除上清液。將沈澱之細胞聚塊充分擢碎後，將聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培養基 及二甲基亞碸之混合液一邊於37℃下進行攪拌一邊添加。進而，每1~2分鐘添加1~2mL之MEM培養基數次後，添加MEM培養基，而使總量成為50mL。離心分離後，去除上清液，將沈澱之細胞聚塊輕緩地擢碎後，將細胞輕緩地懸浮於HAT培養基[添加有次黃嘌呤、胸苷及胺基喋呤之正常培養基]中。將該懸浮液於5%CO2培養箱中，於37℃下培養7~14天。
又，亦可藉由以下方法進行細胞融合。將脾臟細胞與骨髓瘤細胞利用無血清培養基(例如DMEM)、或磷酸緩衝生理食鹽液(以下稱為「磷酸緩衝液」)充分洗淨，以脾臟細胞與骨髓瘤細胞之細胞數之比成為5：1~10：1左右之方式進行混合，並離心分離。去除上清液，將沈澱之細胞聚塊充分擢碎後，一邊攪拌一邊滴加包含1mL之50%(w/v)聚乙二醇(分子量1000~4000)之無血清培養基。其後，於緩慢地添加10mL之無血清培養基後，進行離心分離。再次棄去上清液，將沈澱之細胞懸浮於包含適量之次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(HAT)液及人類介白素-2(IL-2)之正常培養基(以下稱為HAT培養基)中，並分注至培養用培養盤(以下稱為培養盤)之各孔中，於5%二氧化碳氣體之存在下，於37℃下培養2週左右。中途適當補充HAT培養基。
(5)融合瘤群之選擇
於用於融合之骨髓瘤細胞為8-氮鳥嘌呤耐性株之情形時，即為次黃嘌呤-鳥嘌昤-磷酸核糖轉移酶(HGPRT)缺失株之情形時，未融合之骨髓瘤細胞及骨髓瘤細胞彼此之融合細胞於HAT培養基中無法存活。另一方面，抗體產生細胞彼此之融合細胞及抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤於HAT培養基中無法存活，抗體產生細胞彼此之融合細胞不久便達到壽命。因此，藉由繼續進行於HAT培養基中之培養，僅抗體產生細胞與骨髓瘤細胞之融合瘤存活，結果可取得融合瘤。
針對已生長為菌落狀之融合瘤，可將培養基更換為自HAT培養基 去除胺基喋呤之培養基(以下稱為HT培養基)。其後，採取培養上清液之一部分，使用下述抗體效價測定法，而選擇產生抗體之融合瘤。作為抗體效價之測定方法，例如可列舉放射性同位素免疫定量法(RIA法)、固相酶免疫定量法(ELISA法)、螢光抗體法及被動血球凝集反應法等各種公知技術，就檢測感度、迅速性、精確性及操作之自動化之可能性等觀點而言，較佳為RIA法或ELISA法。
藉由測定抗體效價，將已判明產生所需抗體之融合瘤轉移至另一培養盤進行選殖。作為該選殖法，例如可列舉：以培養盤之1孔中包含1個細胞之方式進行稀釋並培養之極限稀釋法、於軟瓊脂培養基中進行培養並回收菌落之軟瓊脂法、利用顯微操作儀單獨分離1個細胞之方法、利用細胞分選儀單獨分離1個細胞之方法等。
針對可見抗體效價之孔，反覆進行例如藉由極限稀釋法之選殖2~4次，將穩定可見抗體效價者選作產生針對人類TRAILR2或PSMA之單株抗體的融合瘤株。
(6)單株抗體之製備
對於經姥鮫烷處理[腹腔內投予2,6,10,14-四甲基十五烷(Pristane)0.5mL，並飼養2週]之8~10週齡之小鼠或裸小鼠腹腔內注射(5)中所獲得之單株抗體產生融合瘤。於10~21天，融合瘤腹水癌化。自該小鼠採取腹水，進行離心分離而去除固形物成分後，利用40~50%硫酸銨進行鹽析，進行辛酸沈澱法、利用DEAE-瓊脂糖管柱、蛋白A管柱或凝膠過濾管柱之精製，收集IgG或IgM組分，而製成精製單株抗體。又，藉由在同系統之小鼠(例如BALB/c)或者Nu/Nu小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠或兔等之腹腔內使該融合瘤增殖，可獲得大量包含與TRAILR2或PSMA結合之單株抗體的腹水。
將(5)中所獲得之單株抗體產生融合瘤於添加有10%FBS之RPMI 1640培養基等中進行培養後，藉由離心分離去除上清液，並懸浮於添 加有GIT培養基、或5%DaigoGF21之融合瘤SFM培養基等中，藉由燒瓶培養、旋轉培養或後培養等而培養3~7天。亦可將所獲得之細胞懸浮液離心分離，自所獲得之上清液進行利用蛋白A管柱或蛋白G管柱之精製，收集IgG組分，而獲得精製單株抗體。作為精製之簡便方法，亦可利用市售之單株抗體精製套組(例如MAbTrap GII套組，Amersham Pharmacia Biotec公司製造)等。
抗體之亞型之確定係使用亞型鑑定試劑盒藉由酶免疫測定法而進行。蛋白量之定量可藉由洛利法及根據280nm下之吸光度[1.4(OD280)=免疫球蛋白1mg/mL]進行計算之方法而進行。
(7)針對TRAILR2或PSMA之單株抗體之結合分析
針對TRAILR2或PSMA之單株抗體之結合活性可藉由歐氏(Ouchterlony)法、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶結合免疫吸附分析)法、RIA(Radio immunoassay orradioimmunoassay，放射免疫分析)法、流式細胞儀法(FCM)或表面離體子共振法(SPR)等結合分析系進行測定。
歐氏法雖然簡便，但於抗體濃度較低之情形時需要濃縮操作。另一方面，於使用ELISA法或RIA法之情形時，藉由使培養上清液直接與抗原吸附固相進行反應，進而使用與各種免疫球蛋白同型、亞型對應之抗體作為二次抗體，能夠鑑定抗體之同型、亞型，並且測定抗體之結合活性。
作為順序之具體例，使經精製或部分精製之重組TRAILR2及PSMA之至少一者吸附至ELISA用96孔培養盤等固相表面，進而利用與抗原無關之蛋白質、例如牛血清白蛋白(BSA)對未吸附抗原之固相表面進行阻斷。將ELISA培養盤利用包含磷酸鹽緩衝液(PBS)及0.05%Tween20之PBS(Tween-PBS)等進行洗淨後，使之與經連續稀釋之第1抗體(例如小鼠血清、培養上清液等)進行反應，而使抗體與於 培養盤中固定化之抗原結合。其次，分注生物素、酶(辣根過氧化酶(horse radish peroxidase，HRP)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等)、經化學發光物質或放射線化合物等標記之抗免疫球蛋白抗體作為第2抗體，使第2抗體與培養盤中所結合之第1抗體進行反應。於利用Tween-PBS進行充分洗淨後，進行與第2抗體之標記物質相應之反應，選擇與標靶抗原特異性地進行反應之單株抗體。
於FCM法中，可測定抗體對抗原表現細胞之結合活性[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]。抗體與細胞膜上所表現之膜蛋白質抗原結合意味著該抗體會識別天然存在之抗原之立體結構並與之結合。
作為SPR法，可列舉藉由利用Biacore所進行之動態分析。例如，使用Biacore T100而測定抗原與受檢物之間之結合之動態，並利用機器附帶之分析軟體對其結果進行分析。作為順序之具體例，藉由胺偶合法將抗小鼠IgG抗體固定於感測片CM5上之後，流入融合瘤培養上清液或精製單株抗體等受檢物質而結合適當量，進而流入濃度已知之複數種濃度之抗原，測定結合及解離。其次，針對所獲得之資料，使用機器附帶之軟體，進行1：1結合模型之動態分析，取得各種參數。或者，於將TRAILR2及PSMA之至少一者藉由例如胺偶合法固定於感測片上之後，流入濃度已知之複數種濃度之精製單株抗體，測定結合及解離。針對所獲得之資料，使用機器附帶之軟體，進行利用雙價結合模型之動態分析，取得各種參數。
又，於本發明中，與針對TRAILR2或PSMA之抗體競爭而與TRAILR2或PSMA結合之抗體可藉由在上述結合分析系中共存受檢抗體進行反應而選擇。即，藉由篩選於添加受檢抗體時與抗原之結合受到抑制之抗體，可獲得與上述所取得之抗體競爭而與TRAILR2或PSMA結合之抗體。
(8)針對TRAILR2或PSMA之單株抗體之抗原決定位之鑑定
於本發明中，被抗體識別並結合之抗原決定位之鑑定可藉由以下方式進行。
例如，製作抗原之部分缺失體、於種間將不同胺基酸殘基改型之變異體、或將特定區域改型之變異體，若抗體針對該缺失體或變異體之反應性降低，則明確缺失部位或胺基酸改型部位為該抗體之抗原決定位。此種抗原之部分缺失體及變異體可使用適當之宿主細胞、例如大腸桿菌、酵母、植物細胞或哺乳動物細胞等，以分泌蛋白質之形式取得，亦可表現於宿主細胞之細胞膜上以抗原表現細胞之形式製備。於膜型抗原之情形時，為了於保持抗原之立體結構之狀態下進行表現，較佳為表現於宿主細胞之膜上。又，亦可製作模擬抗原之1次結構或立體結構之合成肽，而確認抗體之反應性。關於合成肽，可列舉使用公知之肽合成技術而製作其分子之各種部分肽的方法等。
例如，針對人類及小鼠之TRAILR2或PSMA之細胞外區域，可製作將構成各區之區域適當組合而成之嵌合蛋白質，並確認針對該蛋白質之抗體之反應性，而鑑定抗體之抗原決定位。其後，更詳細而言，可藉由使用從業者周知之寡肽合成技術而合成其對應部分之寡肽、或該肽之變異體等，並確認針對該肽之抗體之反應性，而特定抗原決定位。作為用以獲得多種寡肽之簡便方法，亦可利用市售之套組[例如，SPOTs套組(Genosys Biotechnologies公司製造)、使用多中心合成法之一系列多中心肽合成套組(Chiron公司製造)等]。
所結合之抗原決定位和與TRAILR2或PSMA結合之抗體所結合之抗原決定位相同之抗體可藉由如下方式取得，即，鑑定上述結合分析系中所獲得之抗體之抗原決定位，製作該抗原決定位之部分合成肽、模擬該抗原決定位之立體結構之合成肽、或該抗原決定位之重組體等，並進行免疫。
例如，若抗原決定位為膜蛋白質，則可藉由製作將全細胞外區域或一部分細胞外區域與適當之標籤、例如FLAG標籤、組胺酸標籤、GST蛋白質或抗體Fc區域等連結之重組融合蛋白質，並將該重組蛋白質進行免疫，而更有效率地製作該抗原決定位特異性抗體。
2.基因重組抗體之製作
作為基因重組抗體之製作例，於P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997WILEY、P.Shepherd and C.Dean.Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS及J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies：principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS等中有所概述，以下揭示嵌合抗體、人類化抗體及人類抗體之製作方法。又，關於基因重組小鼠、大鼠、倉鼠及兔抗體，亦可藉由相同方法而製作。
(1)自融合瘤取得編碼單株抗體之V區域之cDNA
編碼單株抗體之VH及VL之cDNA之取得可藉由例如以下方式進行。
首先，自產生單株抗體之融合瘤萃取mRNA，並合成cDNA。其次，將所合成之cDNA選殖於噬菌體或質體等載體上，而製作cDNA庫。使用編碼抗體之C區域部分或V區域部分之DNA作為探針，自該基因庫分別單獨分離具有編碼VH或VL之cDNA的重組噬菌體或重組質體。確定所單獨分離之重組噬菌體或重組質體內之VH或VL之全鹼基序列，根據該鹼基序列推測VH或VL之全胺基酸序列。
作為用於製作融合瘤之非人類動物，使用小鼠、大鼠、倉鼠或兔等，但只要能夠製作融合瘤，則任何動物均可使用。
自融合瘤製備總RNA係使用硫氰酸胍-三氟乙酸銫法[Methods in Enzymol.,154,3(1987)]、或RNA簡單套組(QIAGEN公司製造)等套組等。
自總RNA製備mRNA係使用寡(dT)固定化纖維素管柱法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]、或寡dT30<Super>mRNA精製套組(Takara Bio公司製造)等套組等。又，亦可使用Fast Track mRNA分離套組(Invitrogen公司製造)或QuickPrep mRNA精製套組(Pharmacia公司製造)等套組，而製備mRNA。
cDMA之合成及cDNA庫之製作係使用公知之方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]或cDNA合成及質體選殖用之SuperScript質體系統(Invitrogen公司製造)或者ZAP-cDNA合成套組(Stratagene公司製造)等套組等。
作為於製作cDNA庫時組入將自融合瘤萃取之mRNA設為模板而合成之cDNA的載體，只要為組入該cDNA之載體，則可使用任何載體。
例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript IISK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司製造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning：A Practical Approach,I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司製造)、λExCell、pT7T3-18U(Pharmacia公司製造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
關於導入利用噬菌體或質體載體所構建之cDNA庫的大腸桿菌，只要為能夠導入、表現及維持該cDNA庫者，則可使用任何者。例如使用XL1-Blue MRF'[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]、或 JM105[Gene,38,275(1985)]等。
自cDNA庫選擇編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA純系係使用利用經同位素或者螢光標記之探針之菌落-雜交法、或嗜菌斑-雜交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]等。
又，亦可藉由製備引子，將由mRNA所合成之cDNA或cDNA庫設為模板，進行聚合酶鏈反應法[以下，記為PCR法，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Current Protocols in Molecular Biology,Supplement 1,John Wiley & Sons(1987-1997)]，而製備編碼VH或VL之cDNA。
將所選擇之cDNA利用適當之限制酶等切斷後，選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體上，藉由通常使用之鹼基序列分析方法等而確定該cDNA之鹼基序列。例如，於進行雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反應後，使用A.L.F.DNA定序儀(Pharmacia公司製造)等鹼基序列自動分析裝置等進行分析。
根據所確定之全鹼基序列分別推測VH及VL之全胺基酸序列，與已知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，藉此確認所取得之cDNA是否編碼包括分泌訊號序列在內之抗體之VH及VL各自之完整胺基酸序列。
關於包含分泌訊號序列之抗體之VH及VL各自之完整胺基酸序列，可與已知之抗體之VH及VL之全胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較，而推測分泌訊號序列之長度及N末端胺基酸序列，進而可 鑑定此等所屬之亞群。
又，VH及VL之各CDR之胺基酸序列可藉由與已知之抗體之VH及VL之胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]進行比較而推測。
又，關於所獲得之VH及VL之完整胺基酸序列，例如可藉由使用SWISS-PROT或PIR-蛋白質等任意資料庫進行藉由BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等之同源性檢索，而確認該VH及VL之完整胺基酸序列是否為新穎者。
(2)基因重組抗體表現用載體之構建
基因重組抗體表現用載體可藉由在動物細胞用表現載體上選殖編碼人類抗體之CH及CL之至少一者之DNA而構建。
作為人類抗體之C區域，可使用任意之人類抗體之CH及CL，例如可使用人類抗體之γ1亞型之CH及κ型之CL等。作為編碼人類抗體之CH及CL之DNA係使用cDNA，亦可使用包含外顯子與內含子之染色體DNA。
作為動物細胞用表現載體，只要為可組入編碼人類抗體之C區域之基因而進行表現者，則可使用任何者，例如可使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]、或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]、INPEP4(Biogen-IDEC公司製造)、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
作為動物細胞用表現載體之啟動子與促進子，可使用SV40之初期啟動子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]、CMV啟動子 (美國專利第5,168,062號說明書)或免疫球蛋白H鏈之啟動子[Cell,41,479(1985)]與促進子[Cell,33,717(1983)]等。
關於基因重組抗體之表現，就載體之構建之容易程度、向動物細胞之導入之容易程度、細胞內之抗體H鏈及L鏈之表現量之均衡性等觀點而言，使用搭載有抗體H鏈及L鏈兩基因之載體(串聯型載體)[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，亦可將分別搭載有抗體H鏈與L鏈之各基因的複數種載體(分離型載體)組合使用。
作為串聯型之基因重組抗體表現用載體，使用pKANTEX93(國際公開第97/10354號)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]、N5KG1val(美國專利第6,001,358號說明書)、Tol2轉位子載體(國際公開第2010/143698號)等。
(3)嵌合抗體表現載體之構建
可藉由在(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人類抗體之CH或CL之基因之各自上游分別選殖(1)中所獲得之編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA，而構建嵌合抗體表現載體。
首先，為了將編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA之3'末端側、與編碼人類抗體之CH或CL之5'末端側連結，而製作以連結部分之鹼基序列編碼適當之胺基酸且成為適當之限制酶識別序列之方式設計之VH及VL之cDNA。其次，於(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人類抗體之CH或CL之基因之各自上游，以所製作之VH及VL之cDNA以適當形式進行表現之方式分別選殖此等，而構建嵌合抗體表現載體。
又，亦可藉由使用兩端具有適當之限制酶之識別序列的合成DNA並藉由PCR法分別擴增編碼非人類抗體之VH或VL之cDNA，並選殖於(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體上，而構建嵌合抗體表現載體。
(4)編碼人類化抗體之V區域之cDNA之製作
編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA可藉由以下方式製作。首先，分別選擇欲移植(1)中所獲得之非人類抗體之VH或VL之CDR之胺基酸序列的人類抗體之VH或VL之構架區域(以下記為FR)之胺基酸序列。
關於所選擇之FR之胺基酸序列，只要為源自人類抗體者，則可使用任一者。例如使用Protein Data Bank等資料庫中所登記之人類抗體之FR之胺基酸序列、或人類抗體之FR之各亞群之通用胺基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]等。為了抑制抗體之結合活性之降低，而選擇與原非人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列具有儘可能高之同源性(60%以上)之人類FR之胺基酸序列。
其次，於所選擇之人類抗體之VH或VL之FR之胺基酸序列上分別移植原非人類抗體之CDR之胺基酸序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列。藉由將所設計之胺基酸序列在考慮於抗體基因之鹼基序列中可見之密碼子之使用頻率[Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)]之基礎上轉換為DNA序列，而分別設計人類化抗體之VH或VL之cDNA序列。
基於所設計之cDNA序列，而合成包含100~150個鹼基左右之長度的數條合成DNA，並使用此等進行PCR反應。於該情形時，就PCR反應之反應效率及能夠進行合成之DNA長度之觀點而言，較佳為對於H鏈及L鏈各設計4~6條合成DNA。又，亦可合成可變區域全長之合成DNA而使用。
進而，可藉由在位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，而於(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體上容易地 選殖編碼人類化抗體之VH或VL之cDNA。於PCR反應後，將擴增產物分別選殖於pBluescript SK(-)(Stratagene公司製造)等質體上，藉由與(1)所記載之方法相同之方法確定鹼基序列，而取得具有編碼所需之人類化抗體之VH或VL之胺基酸序列之DNA序列的質體。
(5)人類化抗體之V區域之胺基酸序列之改型
人類化抗體於僅將非人類抗體之VH及VL之CDR移植至人類抗體之VH及VL之FR時，其抗原結合活性低於原非人類抗體[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。因此，可藉由鑑定人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸序列中直接和與抗原之結合相關之胺基酸殘基、與CDR之胺基酸殘基相互作用之胺基酸殘基、及維持抗體之立體結構而間接地和與抗原之結合相關之胺基酸殘基，並將此等胺基酸殘基置換為原非人類抗體之胺基酸殘基，而使降低之人類化抗體之抗原結合活性上升。
為了鑑定與抗原結合活性相關之FR之胺基酸殘基，可藉由使用X射線結晶分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或電腦模擬[Protein Engineering,7,1501(1994)]等，而進行抗體之立體結構之構建及分析。又，可藉由對於各抗體製作數種改型體，反覆研究與各抗原結合活性之相關性，進行錯誤嘗試，而取得具有所需之抗原結合活性的改型人類化抗體。
人類抗體之VH及VL之FR之胺基酸殘基可藉由使用改型用合成DNA進行(4)所記載之PCR反應而進行改型。針對PCR反應後之擴增產物，藉由(1)所記載之方法而確定鹼基序列，從而確認實施有目標之改型。
(6)人類化抗體表現載體之構建
可於(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，分別選殖編碼所構建之人類化抗體之VH或 VL之cDNA，而構建人類化抗體表現載體。
例如，藉由在構建(4)及(5)中所獲得之人類化抗體之VH或VL時所使用之合成DNA中位於兩端之合成DNA之5'末端導入適當之限制酶之識別序列，而在(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體內之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，以此等以適當形式進行表現之方式分別進行選殖。
(7)人類抗體表現載體之構建
於使用產生人類抗體之動物作為被免疫動物而建立產生單株抗體之融合瘤之情形時，於(1)中，可獲得人類抗體之VH及VL之胺基酸序列及cDNA序列。因此，可藉由在(2)中所獲得之基因重組抗體表現用載體之編碼人類抗體之CH或CL之各基因之上游，分別選殖編碼(1)中所獲得之人類抗體之VH或VL之基因，而構建人類抗體表現載體。
(8)基因重組抗體之瞬時表現
可使用(3)、(6)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現載體、或將此等改型而成之表現載體，使基因重組抗體瞬時表現，而有效率地評價所獲得之多種基因重組抗體之抗原結合活性。
關於導入表現載體之宿主細胞，只要為能夠表現基因重組抗體之宿主細胞，則可使用任何細胞，例如使用COS-7細胞[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CRL1651]。向COS-7細胞中導入表現載體係使用DEAE-聚葡萄糖法[Methods in Nucleic Acids Res.,CRC press(1991)]、或脂質體轉染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
於導入表現載體後，使用酶免疫抗體法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、單株抗體實驗指南、講談社科學(1987)]等而測定培養上清液 中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性。
(9)基因重組抗體之穩定表現株之取得與基因重組抗體之製備
可藉由將(3)、(6)及(7)中所獲得之基因重組抗體表現載體導入至適當宿主細胞中，而獲得穩定地表現基因重組抗體之轉形株。
作為向宿主細胞中導入表現載體，例如可列舉：電穿孔法[日本專利特開平2-257891號公報、Cytotechnology,3,133(1990)]、鈣離子法、電穿孔法、球形質體法、乙酸鋰法、磷酸鈣法、脂質體轉染法等。又，作為對下述動物導入基因之方法，例如可列舉：顯微注射法、使用電穿孔或脂質體轉染法向ES細胞中導入基因之方法、及核移植法等。
作為導入基因重組抗體表現載體之宿主細胞，只要為能夠使基因重組抗體表現之宿主細胞，則任何細胞均可使用。例如使用小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、中國倉鼠CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5細胞(ATCC CCL-1781)、CHO-S細胞(Life Technologies、Cat No.11619)、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)缺失之CHO細胞(CHO/DG44細胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、獲得了凝聚素耐性之Lec13細胞[Somatic Cell and Molecular genetics,12,55(1986)]、α1,6-海藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC編號：CRL1662)等。
又，亦可使用與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖之合成相關之酶等蛋白質、與於N-糖苷結合複合型糖鏈之還原末端之N-乙醯基葡糖胺之6位α鍵結海藻糖之1位之糖鏈修飾相關之酶等蛋白質、或與細胞內糖核苷酸GDP-海藻糖向高爾基體之輸送相關之蛋白質等之活性降低或缺失之宿主細胞、例如α1,6-海藻糖轉移酶基因缺失之CHO細胞(國際 公開第2005/035586號、國際公開第02/31140號)等。
於導入表現載體後，藉由在包含G418硫酸鹽(以下記為G418)等藥劑之動物細胞培養用培養基中進行培養，而選擇穩定地表現基因重組抗體之轉形株(日本專利特開平2-257891號公報)。
動物細胞培養用培養基係使用RPMI1640培養基(Invitrogen公司製造)、GIT培養基(日本製藥公司製造)、EX-CELL301培養基(JLH公司製造)、EX-CELL302培養基(JLH公司製造)、EX-CELL325培養基(JLH公司製造)、IMDM培養基(Invitrogen公司製造)或者融合瘤-SFM培養基(Invitrogen公司製造)、或向該等培養基中添加有FBS等各種添加物之培養基等。藉由將所獲得之轉形株於培養基中進行培養，而使基因重組抗體表現、蓄積於培養上清液中。培養上清液中之基因重組抗體之表現量及抗原結合活性可藉由ELISA法等進行測定。又，可利用DHFR擴增系(日本專利特開平2-257891號公報)等，而使轉形株所產生之基因重組抗體之表現量上升。
基因重組抗體可使用蛋白A管柱自轉形株之培養上清液中精製[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]。又，亦可將凝膠過濾、離子交換層析法及超濾等用於精製蛋白質之方法組合而進行精製。
所精製之基因重組抗體之H鏈、L鏈或抗體分子整體之分子量可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳法[Nature,227,680(1970)]、或西方墨點法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、Antibodies-A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]等進行測定。
3.雙專一性抗體之製作
本發明之雙專一性抗體例如可藉由如下方式製作，首先，使用 上述1.中所記載之方法取得與不同抗原決定位結合之複數種單株抗體，其次，使用上述2.中所記載之方法確定各抗體之VH及VL之cDNA序列，而設計將各抗體之抗原結合部位連結而成之抗體。
具體而言，可藉由合成將各抗體之抗原結合部位與連結子適當組合之DNA，將其組入至上述2.(2)中所記載之基因重組抗體表現載體中，使該雙專一性抗體進行表現而製作。更具體而言，可藉由合成編碼經由連結子將各抗體之VH連結而成之多肽的DNA，並且合成編碼各抗體之VL之DNA，將該等DNA組入至上述2.(2)中所記載之基因重組抗體表現載體中，使該雙專一性抗體進行表現而製作。
抗原結合部位除了上述1.中所記載之使用融合瘤之方法以外，亦可使用噬菌體顯示法、酵母顯示法等技術進行單獨分離而取得[Emmanuelle Laffy et.al.,Human Antibodies 14,33-55,(2005)]。
連結子係某抗原結合區域與另一抗原結合區域之間連結之肽，通常為包含10個胺基酸殘基以上之多肽者。於本發明中，作為連結子之一例，可將包含抗體之CH1、鉸鏈、CH2及CH3之胺基酸序列之全部或一部分片段適當組合而使用。又，亦可使此等胺基酸序列部分地缺失、或調換順序而使用。
連結子所使用之抗體之動物種類並無特別限定，較佳為人類。又，連結子所使用之抗體之亞型並無特別限定，較佳為IgM或IgG4，更佳為IgG4。
於本發明中，作為具體之連結子之例，可列舉：包含自序列編號11所表示之IgG4之CH1之N末端起至第14號為止之14個胺基酸殘基的連結子、包含自序列編號12所表示之IgM之CH1之N末端起至第14號為止之胺基酸殘基的連結子、及包含序列編號93所表示之IgG4之CH1的連結子等，較佳為包含序列編號93所表示之IgG4之CH1的連結子。
又，於製作包含複數條VH與單一VL之雙專一性抗體之情形時，以雙專一性抗體所含之各抗原結合部位與各特異性抗原反應之方式進行使用噬菌體顯示法等之篩選，而選擇最適合單一VL之各VH。
具體而言，首先，使用上述1.中所記載之方法，利用第1抗原對動物免疫並由其脾臟製作融合瘤，而選殖編碼第1抗原結合部位之DNA序列。其次，利用第2抗原對動物免疫，並由其脾臟製備cDNA庫，自該庫藉由PCR而取得編碼VH之胺基酸序列之DNA。
繼而，製作表現將藉由第2抗原之免疫所獲得之VH與第1抗原結合部位之VL連結而成之scFv的噬菌體庫，藉由使用該噬菌體庫之篩選，而選擇呈現與第2抗原特異性地結合之scFv的噬菌體。由所選擇之噬菌體選殖編碼第2抗原結合部位之VH之胺基酸序列的DNA序列。
進而，可藉由設計編碼將第1抗原結合部位之VH與第2抗原結合部位之VH經由上述連結子連結而成之多肽之胺基酸序列的DNA序列，並將該DNA序列與編碼單一VL之胺基酸序列之DNA序列插入至例如上述2.(2)中所記載之基因重組抗體表現載體中，而構建本發明之雙專一性抗體之表現載體。
4.本發明之雙專一性抗體或其抗體片段之活性評價
所精製之抗體或其抗體片段之活性評價可藉由以下方式進行。
本發明之雙專一性抗體針對表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞株之結合活性可使用上述之1.(7)中所記載之結合分析系進行測定。
針對表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞的CDC活性、或ADCC活性可藉由公知之測定方法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]進行測定。
本發明之雙專一性抗體之誘導細胞死亡活性可藉由如下方法進行測定。例如，將細胞接種至96孔培養盤中，添加抗體並培養一定期 間後，使之與WST-8試劑(Dojindo公司製造)進行反應，利用培養盤讀取器測定450nm之吸光度，而測定細胞之存活率。
5.使用本發明之雙專一性抗體或其抗體片段之疾病之治療方法
本發明之雙專一性抗體或其抗體片段可用於與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療。作為與TRAILR2及PSMA相關之疾病，例如可列舉惡性腫瘤及癌症等。
作為惡性腫瘤及癌症，例如可列舉：大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、神經膠質瘤、惡性黑色瘤(黑色素瘤)、甲狀腺癌、腎細胞癌、白血病、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、胃癌、胰臟癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、攝護腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、胸膜瘤、雄胚瘤、子宮內膜增生、子宮內膜症、胚組織瘤、纖維肉瘤、卡波西氏肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、血管母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、星狀細胞瘤、神經纖維瘤、寡樹突細胞瘤、髓母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠瘤、橫紋肌肉瘤、神經膠質母細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀肉瘤及威爾姆斯腫瘤等。
含有本發明之雙專一性抗體或其抗體片段、或該等之衍生物的治療藥可為僅包含作為有效成分之該抗體或者該抗體片段、或該等之衍生物者，但通常以與藥理學上所容許之1種以上之載體一併混合並藉由製劑學之技術領域中公知之方法所製造之醫藥製劑之形式提供。
作為投予途徑，例如可列舉：經口投予、或口腔內、呼吸道內、直腸內、皮下、肌肉內或者靜脈內等非經口投予。作為投予形態，例如可列舉：噴霧劑、膠囊劑、錠劑、散劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、栓劑、注射劑、軟膏或貼劑等。各種製劑可使用通常使用之賦形劑、增量劑、黏合劑、浸潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、分散劑、緩衝劑、保存劑、溶解助劑、防腐劑、著色料、香味劑、及穩 定化劑等並藉由常法而製造。
作為賦形劑，例如可列舉：乳糖、果糖、葡萄糖、玉米澱粉、山梨糖醇、結晶纖維素、滅菌水、乙醇、甘油、生理食鹽水及緩衝液等。作為崩解劑，例如可列舉：澱粉、海藻酸鈉、明膠、碳酸鈣、檸檬酸鈣、糊精、碳酸鎂及合成矽酸鎂等。
作為黏合劑，例如可列舉：甲基纖維素或其鹽、乙基纖維素、阿拉伯膠、明膠、羥丙基纖維素及聚乙烯基吡咯啶酮等。作為潤滑劑，例如可列舉：滑石粉、硬脂酸鎂、聚乙二醇及硬化植物油等。
作為穩定化劑，例如可列舉：精胺酸、組胺酸、離胺酸、甲硫胺酸等胺基酸、人類血清白蛋白、明膠、聚葡萄糖40、甲基纖維素、亞硫酸鈉、偏亞硫酸鈉等。
作為其他添加劑，例如可列舉：糖漿、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、檸檬酸、氯化鈉、亞硝酸鈉及磷酸鈉等。
作為適於經口投予之製劑，例如可列舉：乳劑、糖漿劑、膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等。
乳劑或糖漿劑之類的液體製備物係使用水、蔗糖、山梨糖醇或者果糖等糖類、聚乙二醇或者丙二醇等二元醇類、芝麻油、橄欖油或者大豆油等油類、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑、或草莓香料或者薄荷等香料類等作為添加劑而製造。
膠囊劑、錠劑、散劑或顆粒劑等係使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或者甘露糖醇等賦形劑、澱粉或者海藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂或者滑石粉等潤滑劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素或者明膠等黏合劑、脂肪酸酯等界面活性劑、或甘油等塑化劑等作為添加劑而製造。
作為適於非經口投予之製劑，例如可列舉：注射劑、栓劑或噴霧劑等。注射劑係使用鹽溶液、葡萄糖溶液、或包含此兩者之混合物之載體等而製造。
栓劑係使用可可脂、氫化脂肪或羧酸等載體而製造。噴霧劑係使用不會刺激接受者之口腔及呼吸道黏膜且使本發明之單株抗體或其抗體片段以微細粒子之形式分散，而使吸收變得容易之載體等而製造。作為載體，例如可列舉：乳糖或甘油等。又，亦可以氣霧劑或乾粉劑之形式製造。進而，於上述非經口劑中，亦可添加適於經口投予之製劑中作為添加劑而例示之成分。
本發明之雙專一性抗體之有效量與以與適當之稀釋劑及藥理學上可使用之載體之組合之形式投予之有效量每1次每1kg體重為0.0001mg~100mg，以2天至8週為間隔進行投予。
6.使用本發明之雙專一性抗體或其抗體片段之疾病之診斷方法
藉由使用本發明之雙專一性抗體或該抗體片段，檢測或測定表現TRAILR2及PSMA之至少一者之細胞，而診斷與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病。
作為與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病的惡性腫瘤或癌症之診斷例如可如以下般檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者而進行。
首先，針對自複數名健康者之生物體採取之生物樣本，使用本發明之雙專一性抗體或者該抗體片段、或該等之衍生物，並使用下述免疫學方法，進行TRAILR2及PSMA之至少一者之檢測或測定，而調查健康者之生物樣本中之TRAILR2及PSMA之至少一者之存在量。
其次，針對被試驗者之生物樣本中，亦同樣地調查TRAILR2及PSMA之至少一者之存在量，將其存在量與健康者之存在量加以比較。於被試驗者之TRAILR2及PSMA之至少一者之存在量較健康者增加之情形時，診斷該被試驗者罹患癌症。關於其他與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷，亦可藉由相同方法進行診斷。
所謂免疫學方法係使用經標記之抗原或抗體，而檢測或測定抗體量或抗原量之方法。例如可列舉：放射性物質標記免疫抗體法、酶 免疫測定法、螢光免疫測定法、發光免疫測定法、西方墨點法或物理化學方法等。
作為放射性物質標記免疫抗體法，例如可列舉：對於抗原或表現抗原之細胞等，使本發明之雙專一性抗體或該抗體片段與之反應，進而使經放射線標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段與之反應後，利用閃爍計數器等進行測定之方法。
作為酶免疫測定法，例如可列舉：對於抗原或表現抗原之細胞等，使本發明之雙專一性抗體或該抗體片段與之反應，進而使經標記之抗免疫球蛋白抗體或結合片段與之反應後，利用吸光光度計測定顯色色素之方法。例如可列舉三明治ELISA法等。
作為酶免疫測定法所使用之標記物，可使用公知之酶標記[酶免疫測定法、醫學書院(1987)]。例如使用鹼性磷酸酶標記、過氧化酶標記、螢光素酶標記、或生物素標記等。
三明治ELISA法係使抗體與固相結合後，捕獲作為檢測或測定對象之抗原，並使第2抗體與所捕獲之抗原進行反應之方法。於該ELISA法中，準備為與欲檢測或測定之抗原結合之抗體或抗體片段且抗原結合部位不同之2種抗體，其中，使第1抗體或抗體片段預先吸附於培養盤(例如96孔培養盤)，繼而利用FITC等螢光物質、過氧化酶等酶、或生物素等對第2抗體或抗體片段進行標記。對於吸附有上述抗體之培養盤，使自生物體內分離之細胞或者其破碎液、組織或者其破碎液、細胞培養上清液、血清、胸水、腹水、或眼液等與之反應後，使經標記之抗體或抗體片段與之反應，而進行與標記物質對應之檢測反應。根據將濃度已知之抗原連續地稀釋而製作之校準曲線，算出被試驗樣品中之抗原濃度。
作為三明治ELISA法所使用之抗體，可使用多株抗體或單株抗體之任一者，亦可使用Fab、Fab'、或F(ab)2等抗體片段。作為三明治 ELISA法所使用之2種抗體之組合，可為與不同抗原決定位結合之單株抗體或該抗體片段之組合，亦可為多株抗體與單株抗體或其抗體片段之組合。
作為螢光免疫測定法，例如係藉由文獻[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南、講談社科學(1987)]等中所記載之方法進行測定。作為螢光免疫測定法所使用之標記物，可使用公知之螢光標記[螢光抗體法、Soft Science公司(1983)]。例如使用FITC或RITC等。
作為發光免疫測定法，例如可列舉藉由文獻[生物發光與化學發光臨床檢査42、廣川書店(1998)]等中所記載之方法進行測定。作為發光免疫測定法所使用之標記物，可列舉公知之發光體標記，例如使用吖啶酯或咯吩等。
作為西方墨點法，藉由將抗原或表現抗原之細胞等藉由SDS(十二烷基硫酸鈉)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]進行區分後，將該凝膠印漬於聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝基纖維素膜上，使與抗原結合之抗體或抗體片段與該膜進行反應，進而與實施過FITC等螢光物質、過氧化酶等酶標記、或生物素標記等之抗IgG抗體或其抗體片段進行反應後，將該標記可見化而進行測定。將一例示於以下。
首先，將表現具有所需胺基酸序列之多肽的細胞或組織溶解，於還原條件下，將每條泳道之蛋白質量設為0.1~30μg，藉由SDS-PAGE法進行電泳。其次，將經電泳之蛋白質轉移至PVDF膜上，使之與包含1~10%BSA之PBS(以下記為BSA-PBS)於室溫下反應30分鐘，而進行阻斷操作。此處，與本發明之雙專一性抗體進行反應，利用包含0.05~0.1%之Tween-20之PBS(Tween-PBS)進行洗淨，使之與經過氧化酶標記之山羊抗小鼠IgG於室溫下反應2小時。藉由利用Tween-PBS 進行洗淨，使用ECL Western Blotting Detection Reagents(Amersham公司製造)等而檢測結合有該抗體之條帶，而檢測抗原。作為西方墨點之檢測所使用之抗體，使用能夠與未保持天然型之立體結構之多肽結合之抗體。
作為物理化學方法，例如藉由使作為抗原之TRAILR2及PSMA之至少一者與本發明之雙專一性抗體或其抗體片段結合，而形成凝集體，並檢測該凝集體。作為其他物理化學方法，亦可使用毛細管法、單向免疫擴散法、免疫比濁法或乳膠免疫比濁法[臨床檢査法提要、金原出版(1998)]等。
於乳膠免疫比濁法中，若使用使抗體或抗原致敏之粒徑0.1~1μm左右之聚苯乙烯乳膠等載體，利用對應之抗原或抗體引起抗原抗體反應，則反應液中之散射光增加，透過光減少。藉由將該變化設為吸光度或積分球濁度進行檢測，而測定被試驗樣品中之抗原濃度等。
另一方面，關於表現TRAILR2及PSMA之至少一者的細胞之檢測或測定，可使用公知之免疫學檢測法，較佳為使用免疫沈澱法、免疫細胞染色法、免疫組織染色法或螢光抗體染色法等。
作為免疫沈澱法，於使表現TRAILR2及PSMA之至少一者的細胞等與本發明之雙專一性抗體或其抗體片段進行反應後，添加對蛋白G瓊脂糖等免疫球蛋白具有特異性結合能力之載體，而使抗原抗體複合體沈澱。
或者，亦可藉由以下方法進行。首先，於ELISA用96孔培養盤上固定本發明之雙專一性抗體或其抗體片段後，藉由BSA-PBS進行阻斷。其次，棄去BSA-PBS並利用PBS進行充分洗淨後，使之與表現TRAILR2及PSMA之至少一者的細胞或組織之溶解液進行反應。自經充分洗淨後之培養盤，利用SDS-PAGE用樣品緩衝液萃取免疫沈澱物，藉由上述西方墨點法進行檢測。
所謂免疫細胞染色法或免疫組織染色法係對於表現抗原之細胞或組織等，視需要為了使抗體之透過性變得良好，而利用界面活性劑或甲醇等進行處理後，使之與本發明之雙專一性抗體進行反應，進而使之與實施過FITC等螢光標記、過氧化酶等酶標記或生物素標記等之抗免疫球蛋白抗體或其結合片段進行反應後，將該標記可見化，並利用顯微鏡進行顯微觀察之方法。又，可使螢光標記之抗體與細胞進行反應，藉由利用流式細胞儀進行分析之螢光抗體染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice,Third edition,Academic Press(1996)、單株抗體實驗指南、講談社科學(1987)]進行檢測。尤其是本發明之雙專一性抗體或其抗體片段可藉由螢光抗體染色法而檢測細胞膜上所表現之TRAILR2及PSMA之至少一者。
又，於螢光抗體染色法中，於使用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystems公司製造)等之情形時，可於不將所形成之抗體-抗原複合體、與和抗體-抗原複合體之形成無關之游離之抗體或抗原分離之情況下測定抗原量或抗體量。
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明並限定於下述實施例。
實施例 [實施例1]抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體之表現質體載體之構建
作為抗人類TRAILR2(hTRAILR2)抗體之陽性對照抗體，基於國際公開第2002/094880號所記載之0304純系之重鏈可變區域(VH)、輕鏈可變區域(VL)之胺基酸序列而製作抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體。
將KMDA2抗體之VH之全鹼基序列示於序列編號1，將包含根據該序列推測之訊號序列之VH之全胺基酸序列示於序列編號7，將自序 列編號7所示之胺基酸序列去除訊號序列之胺基酸序列示於序列編號114。又，將KMDA2抗體之VL之全鹼基序列示於序列編號2，將包含根據該序列推測之訊號序列之VL之全胺基酸序列示於序列編號8，將自序列編號8所示之胺基酸序列去除訊號序列之胺基酸序列示於序列編號115。藉由以下所記載之方法，構建KMDA2抗體之表現質體載體。
將KMDA2抗體之L鏈cDNA設為模板，使用以於VL之末端附加限制酶識別部位之方式設計之序列編號3及序列編號4所表示之引子，藉由PCR擴增該L鏈之前導序列及可變區域。藉由乙醇沈澱而回收該PCR片段後，利用限制酶BgIII及BsiWI進行消化，而獲得約400bp之DNA片段。
另一方面，利用限制酶BgIII及BsiWI將質體載體N5KG4PE(國際公開第2002/088186號所記載)消化後，利用鹼性磷酸酶(E.coli C75)(寶酒造公司製造)進行脫磷酸化處理，而獲得約未達9kb之DNA片段。將該等2個DNA片段利用T4 DNA連接酶加以連結，而獲得質體N5KG4PE-KMDA2L。
其次，利用限制酶NheI及SaII將N5KG4PE-KMDA2L消化而進行脫磷酸化，從而獲得約9.3kb之DNA片段。另一方面，將KMDA2抗體之H鏈cDNA設為模板，使用序列編號5及序列編號6所表示之引子，藉由PCR擴增KMDA2之H鏈之前導序列及可變區域。利用限制酶NheI及SaII將該PCR片段消化，而獲得約450bp之DNA片段。將該等2個DNA片段連結，而製作抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體之表現質體載體N5KG4PE_KMDA2。
藉由上述方法進行擴增之H鏈PCR片段包含H鏈之5'非轉譯區域、訊號序列、可變區域(VH)及恆定區域之一部分。同樣地，L鏈之PCR擴增片段包含L鏈之5'非轉譯區域、前導序列、可變區域(VL)及恆定區域之一部分。所謂前導序列係抗體之分泌訊號序列，係自成熟抗體 蛋白質切離之胺基酸序列。
[實施例2]抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之表現質體載體之構建
為了用於製作下述與hTRAILR2及hPSMA結合之雙專一性抗體，而製作抗hTRAILR2單株抗體E11抗體。E11抗體係基於國際公開第2002/094880號所記載之E-11-13純系之VH及VL之胺基酸序列而製作。將E11抗體之序列資訊示於表1。
表1中，將編碼抗體之VH或VL之胺基酸序列的全鹼基序列記載為編碼VH或VL(包含訊號序列)之鹼基序列，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列記載為VH或VL(包含訊號序列)之胺基酸序列，及將自該胺基酸序列去除訊號序列之胺基酸序列記載為VH或VL(去除訊號序列)之胺基酸序列。
又，將抗體之重鏈或輕鏈之CDR1~3之胺基酸序列分別記載為HCDR1~3或LCDR1~3之胺基酸序列。將編碼E11抗體之VH及VL之胺基酸序列的鹼基序列插入至質體載體N5KG1(美國專利第6,001,358號說明書所記載)、或N5KG4PE[R409K](國際公開第2002/088186號所記載)，而獲得作為人類IgG1型之抗hTRAILR2單株抗體之E11抗體之表現質體載體N5KG1_E11及變異人類IgG4(於恆定區域包含S228P、L235E及R409K之胺基酸改型的人類IgG4)型之抗hTRAILR2單株抗體的E11抗體之表現質體載體N5KG4PE[R409K]_E11。
[實施例3]抗hPSMA單株抗體之取得
(1)具有與抗hTRAILR2單株抗體E11抗體相同之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體之取得及該抗體之表現質體載體之製作
藉由以下所記載之方法，而取得具有與抗hTRAILR2單株抗體E11抗體相同之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體。
對於產生人類抗體之小鼠[Ishida & Lonberg,IBC's 11th Antibody Engineering,Abstract 2000；Ishida,I,et al.,Cloning & Stem Cells 4,85-96(2002)及石田功(2002)實驗醫學20、6、846-851]，腹腔內投予下述實施例5之FLAG-PSMA與Sigma Adjuvant System(Sigma-Aldrich公司製造)之混合物作為免疫原，而進行免疫。
自經免疫之小鼠外科摘取脾臟，將脾臟置於Streiner(Falcon公司製造)上，一邊利用矽棒輕輕地搗碎一邊將細胞轉移至試管中，進行離心分離使細胞沈澱後，使之與紅細胞去除試劑於冰中反應3分鐘，進而進行離心分離。
自所獲得之脾臟細胞使用ISOGEN(Nippon Gene公司製造)萃取RNA，利用SMARTer RACE cDNA擴增套組(Clontech公司製造)擴增cDNA，進而藉由PCR使VH基因片段擴增。將VH基因片段與表1所記載之E11之VL基因分別插入至噬菌粒pCANTAB 5E(Amersham Pharmacia公司製造)中，將大腸桿菌TG1(Lucigen公司製造)轉形而獲得質體。藉由使所獲得之質體感染M13KO7輔助噬菌體(Invitrogen公司製造)，而獲得VH基因經基因庫化之人類抗體M13噬菌體庫。
使用該人類抗體M13噬菌體庫及下述噬菌體顯示法，而取得具有與抗hTRAILR2單株抗體E11抗體相同之VL之胺基酸序列的抗hPSMA 單株抗體。將下述之實施例5之FLAG-PSMA固相化，使利用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo公司製造)將未結合有FLAG-PSMA之部位阻斷之MAXISORP STARTUBE(NUNC公司製造)、與人類抗體M13噬菌體庫於室溫下反應1小時，利用PBS洗淨5次後，利用0.1M之Gly-Hcl(pH值2.2)溶出噬菌體。
關於溶出之噬菌體，使之感染TG1勝任細胞，而擴增噬菌體。其後，再次與於MAXISORP STARTUBE中固相化之FLAG-PSMA進行反應，並實施洗淨及溶出。將該操作重複進行2次或3次，而將呈現與FLAG-PSMA特異性地結合之scFv的噬菌體加以濃縮。
將經濃縮之噬菌體進行單株化，藉由ELISA選擇具有與FLAG-PSMA之結合性的純系。ELISA係使用將下述實施例5之FLAG-PSMA進行固相化，並使用SuperBlock阻斷緩衝液(Thermo公司製造)將未結合有FLAG-PSMA之部位阻斷之MAXISORP(NUNC公司製造)。
向各孔中添加各噬菌體純系，於室溫下反應30分鐘後，將各孔利用含有0.1%Tween20之PBS(以下記載為PBS-T)洗淨3次。繼而，將經辣根過氧化酶標記之抗M13抗體(GE Healthcare公司製造)利用含有10%Block Ace(大日本製藥股份有限公司製造)之PBS-T稀釋至5000倍，將所獲得之溶液以50μL/孔添加至各孔中，並於室溫下培養30分鐘。
將微盤利用PBS-T洗淨3次後，向各孔中以50μL/孔添加TMB顯色受質液(DAKO公司製造)，於室溫下培養10分鐘。最後，向各孔中添加0.5M硫酸(50μL/孔)而停止顯色反應，利用微盤讀取器(1420 ARVO多標計數器：WALLAC公司製造)測定波長450nm(參考波長570nm)下之吸光度。
對與FLAG-PSMA結合之純系進行序列分析，取得表1所示之具有與抗hTRAILR2單株抗體E11抗體相同之VL之胺基酸序列的抗 hPSMA單株抗體PI134抗體、PI101抗體、PN7抗體、PI105抗體、PI108抗體、PI115抗體、PI118抗體、PI127抗體、PI143抗體、PL223抗體及PN170抗體。藉由與表1相同之表示方法，將各hPSMA單株抗體之重鏈之序列資訊示於表2。
製作合成編碼PI134抗體、PI101抗體、PI105抗體、PI108抗體、PI115抗體、PI118抗體、PI127抗體、PI143抗體、PL223抗體及PN170抗體之各VH及VL之胺基酸序列的鹼基序列，並藉由與實施例1相同之方法插入有質體載體N5KG1之表現質體載體，分別命名為N5KG1_E11VL_PI134、N5KG1_E11VL_PI101、N5KG1_E11VL_PI105、N5KG1_E11VL_PI108、N5KG1_E11VL_PI115、N5KG1_E11VL_PI118、N5KG1_E11VL_PI127、N5KG1_E11VL_PI143、N5KG1_E11VL_PL223、及N5KG1_E11VL_PN170。
又，製作合成編碼PN7抗體之VH及VL之胺基酸序列的鹼基序列，並藉由與實施例1相同之方法插入有質體載體N5KG4PE[R409K](國際公開第2002/088186號所記載)之表現質體載體，命名為N5KG4PE[R409K]_E11VL_PN7。
(2)抗hPSMA單株抗體2A10抗體之表現質體載體之製作
製作國際公開第2006/089230號所記載之抗hPSMA單株抗體2A10抗體作為抗hPSMA單株抗體之陽性對照抗體。將2A10抗體之VH之全鹼基序列示於序列編號23，將根據該序列推測之包含訊號序列之VH之全胺基酸序列示於序列編號24，將自序列編號24所示之胺基酸序列去除訊號序列之胺基酸序列示於序列編號116。
又，將2A10抗體之VL之全鹼基序列示於序列編號25，將根據該序列推測之包含訊號序列之VL之全胺基酸序列示於序列編號26，將自序列編號26所示之胺基酸序列去除訊號序列之胺基酸序列示於序列編號117。藉由以下所記載之方法，製作2A10抗體之表現質體載體。
合成編碼2A10抗體之VL之胺基酸序列的基因，次選殖於質體載體N5KG1之BgIII-BsiWI位點，而獲得N5KG1_2A10VL。其次，合成編碼2A10之VH的基因並設為模板，使用序列編號27及序列編號28所表示之引子、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR而擴增VH區域之基因片段。PCR係將包含於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行45秒鐘之反應實施25個循環。
將所獲得之VH區域之基因片段設為模板，使用序列編號29及序列編號28所表示之引子、以及KOD聚合酶，藉由PCR而擴增訊號序列與VH區域連結之基因片段。PCR係將包含於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行90秒鐘之反應實施25個循環。將所獲得之基因片段插入至N5KG1_2A10VL載體之SaII-NheI位點，而獲得抗hPSMA單株抗體2A10抗體之表現質體載體N5KG1_2A10。
[實施例4]與hTRAILR2及hPSMA結合之雙專一性抗體之表現載體之構建
藉由以下方法而製作具有圖1所記載之結構的與hTRAILR2及hPSMA結合之雙專一性抗體(以下，記載為hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體或簡稱為雙專一性抗體)。該雙專一性抗體之重鏈係自圖1之N末端側起依序包含抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之VH、連結子、及 抗hPSMA單株抗體之VH之胺基酸序列，該抗體之4條輕鏈均包含E11抗體之VL之胺基酸序列。將如該雙專一性抗體般不同之兩個抗原結合部位之VL通用之抗體稱為輕鏈通用型之雙專一性抗體。
將hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之名稱、用於製作該抗體之抗TRAILR2單株抗體之純系名、連結子之結構、抗hPSMA單株抗體之純系名及該雙專一性抗體之表現質體載體之名稱示於表3。又，關於該雙專一性抗體，將包含E11抗體之VH、連結子及抗hPSMA單株抗體之VH(以下，亦簡稱為VH-連結子-VH)的多肽之胺基酸序列及編碼該胺基酸序列之鹼基序列示於表4。
(1)具有人類IgG4之CH1作為連結子之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之表現質體載體之製作
關於表3及表4所記載之雙專一性抗體中具有人類IgG4之CH1作為連結子之雙專一性抗體，藉由以下所記載之方法而製作表現質體載體。將該連結子之胺基酸序列示於序列編號93。
將人類IgG4之恆定區域之鹼基序列設為模板，使用序列編號30及序列編號31所表示之引子、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR使連結子部分之基因片段擴增。另一方面，使用表5所示之VH擴增用模板載體、VH擴增用引子及KOD聚合酶，藉由PCR使各抗hPSMA單株抗體之VH區域之基因片段擴增。PCR均係將包含於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68下進行45秒鐘之反應實施25個循環。
其次，將上述之連結子部分及各抗hPSMA單株抗體之VH區域之各基因片段設為模板，使用表5所示之VH-連結子結合用引子、及KOD聚合酶，藉由PCR使連結子部分與各抗hPSMA單株抗體之VH區域連結而成之基因片段擴增。
PCR係將包含於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行90秒鐘之反應實施25個循環。藉由將經擴增之基因片段與利用NheI裂解而成之N5KG1_E11、或N5KG4PE[R409K]_E11連結，而獲得表5所示之各hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之表現質體載體。
(2)具有自人類IgG4之CH1之N末端起至第14號為止之胺基酸序列作為連結子(GL連結子)的hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之表現質體載體之製作
藉由以下所記載之方法而製作表3及表4所示之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-GL-PI1134VH抗體之表現質體載體。該雙專一性抗體之連結子係自序列編號11所表示之人類IgG4之CHM之N末端起至第14號為止之胺基酸序列。將質體載體N5KG1_E11VL_PI134設為模板，使用序列編號57及序列編號33所表示之引子、以及KOD聚合酶，藉由PCR使抗hPSMA單株抗體PI134抗體之VH區域之基因片段擴增。
PCR係將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行45秒鐘之反應實施25個循環。藉由將該基因片段與利用限制酶NheI裂解而成之N5KG1_E11連結，而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-GL-PI1134VH抗體之表現質體載體N5KG1__E11VL_E11-GL-PI134VH。
(3)具有自人類IgM之CH1之N末端起至第14號為止之胺基酸序列作為連結子(ML連結子)的hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之表現質體載體之製作
以下所記載之方法而製作表3及表4所示之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-ML-PI101VH抗體之表現質體載體。該雙專一性抗體之連結子係自序列編號12所表示之人類IgM之CH1之N末端起至第14號為止之胺基酸序列。藉由將N5KG1_E11設為模板，使用序列編號 59及序列編號60所表示之引子、以及KOD聚合酶，藉由PCR使抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之VH區域之基因片段擴增。
PCR係將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行45秒鐘之反應實施25個循環。另一方面，將N5KG1_E11VL_PI101設為模板，使用序列編號61及序列編號62所表示之引子、以及KOD聚合酶，藉由PCR使抗hPSMA單株抗體PI101抗體之VH區域之基因片段擴增。PCR係將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行45秒鐘之反應實施25個循環。
其次，藉由將上述之E11抗體之VH區域及PI101抗體之VH區域之基因片段插入至利用限制酶SaII及NheI裂解而成之N5KG1中，而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-ML-PI101VH抗體之表現質體載體N5KG1_E11VL_E11-ML-PI101VH。
[實施例5]可溶性hPSMA抗原之製備
藉由以下所記載之方法製作N末端附加有FLAG標籤之hPSMA之細胞外區域蛋白質作為人類攝護腺特異性膜抗原(hPSMA)之可溶性抗原。將編碼hPSMA之胺基酸序列之鹼基序列示於序列編號64，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號112。
合成hPSMA之細胞外區域之基因序列，將其插入至插入有FLAG_tag之N5(IDEC公司製造)載體之SpeI-BamHI位點，而製作表現於N末側附加有FLAG標籤之hPSMA之細胞外區域的質體載體N5/FLAG-hPSMA。將FLAG-hPSMA之鹼基序列示於序列編號92，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號113。
使用FreeStyle(商標)293表現系統(Invitrogen公司製造)，將N5/FLAG-hPSMA導入至浮游性293細胞中並進行培養，而以瞬時表現系使蛋白質表現。於載體導入7天後，回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾。
將該培養上清液注入FLAG融合蛋白質精製用之ANTI-FLAG M2親和凝膠(管柱體積2mL)(SIGMA Aldrich公司製造)中，利用PBS(-)洗淨後，利用溶出液[20mM之檸檬酸、50mM之NaCl(pH值3.4)]進行溶出，並回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
其次，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超濾，將溶出液之溶劑置換為PBS後，利用孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV、MILLIPORE公司製造)進行過濾滅菌，而獲得FLAG融合蛋白質溶液。精製FLAG-hPSMA融合蛋白質之濃度係根據280nm之吸光度而測定。
[實施例6]膜型hPSMA之表現質體載體之製作
藉由以下所記載之方法，使用延伸PCR，而製作於hPSMA之N末端側附加有訊號序列與膜結合部位之膜型hPSMA表現質體載體。
藉由將hPSMA基因(序列編號64)之合成DNA設為模板，使用序列編號65及序列編號66所表示之引子、以及KOD聚合酶，將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行3分鐘之反應實施25個循環，而進行PCR擴增。
藉由將該PCR產物設為模板，使用序列編號67及序列編號66所表示之引子、以及KOD聚合酶，將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行3分鐘之反應實施25個循環，而進行PCR擴增。
進而，藉由將該PGR產物設為模板，使用序列編號68及序列編號66所表示之引子、以及KOD聚合酶，將於94℃下進行30秒鐘、於58℃下進行30秒鐘、於68℃下進行3分鐘之反應實施25個循環，而進行PCR擴增。
藉由使用pEF6/V5-His TOPO TA表現套組(Invitrogen公司製造)，對該擴增產物進行TOPO選殖，並選擇正確插入有hPSMA基因之純系，而獲得膜型hPSMA之表現質體載體pEF6-hPSMA全長。
[實施例7]抗hTRAILR2單株抗體、抗hPSMA單株抗體及hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之製備
將實施例1至實施例4中所製作之各種抗體之表現質體載體利用FreeStyle(商標)293表現系統(Invitrogen公司製造)基因導入至浮游性293細胞中，以瞬時表現系使抗體表現。自導入載體起7天後，回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(MILLIPORE公司製造)進行過濾後，使用蛋白A樹脂(MabSeIect、GE Healthcare Bioscience公司製造)對抗體進行親和精製。使用磷酸緩衝液作為洗淨液。
利用溶出液[20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.4)]將吸附至蛋白A上之抗體溶出，並回收至包含1M磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。其次，藉由使用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)之超濾，將溶出液之溶劑置換為PBS。
進而，利用AKTA FPLC(GE Healthcare公司製造)，使用Superdex高效管柱(GE Healthcare公司製造)，自該抗體溶液分取單體組分，利用孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV、MILLIPORE公司製造)進行過濾滅菌。藉由利用AKTA系統孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV、MILLIPORE公司製造)進行過濾滅菌，而獲得目標之精製抗體溶液。藉由測定抗體溶液之280nm之吸光度，並將濃度1mg/mL換算為1.40最佳密度，而算出精製抗體之濃度。
[實施例8]表現hPSMA之L929及PC3之製備
將實施例6中所獲得之膜型hPSMA之表現質體載體，使用HilyMax(同仁化學公司製造)導入至源自小鼠結締組織之纖維芽細胞L929[American Type Culture Collection(ATCC)編號：CCL-1]及人類攝護腺癌細胞PC3[ATCC編號：CRL-1435]細胞中。
利用抗生素殺稻瘟菌素(Invitrogen公司製造)而選拔導入基因後之細胞後，藉由極限稀釋法進行選殖，而獲得於細胞表面表現hPSMA 之L929細胞(以下，簡稱為hPSMA/L929)及PC3細胞(以下，簡稱為hPSMA/PC3)。
[實施例9]利用流式細胞儀所進行之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體針對hTRAILR2及hPSMA之結合性之評價
依據以下順序，藉由流式細胞儀對實施例7中所獲得之各種hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之與hTRAILR2及hPSMA之結合性進行評價。
使用實施例7中所獲得之各種hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體、抗hPSMA單株抗體或抗hTRAILR2單株抗體，藉由FACS分析針對hTRAIL2/L929細胞(國際公開第2002/094880號中所記載)及實施例8中所獲得之hPSMA/L929細胞之結合性。
將細胞以1×106細胞/mL之濃度懸浮於染色緩衝液[含有0.1%NaN3、1%FBS之PBS]中，並以100μL/孔分注至96孔圓底培養盤(Becton Dickinson公司製造)中。於離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，向所獲得之顆粒物中添加實施例7中所獲得之各抗體並使之懸浮後，於冰溫度下靜置30分鐘。
進而進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)，去除上清液，將所獲得之顆粒利用200μL/孔之染色緩衝液洗淨2次後，以50μL/孔添加1μg/mL之RPE螢光標記小鼠抗人類抗體(鉸鏈區域)純系4E3抗體(Southern Bioblot公司製造)，於冰溫度下培養30分鐘。利用染色緩衝液洗淨2次後，懸浮於200μL/孔之染色緩衝液中，利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。將所獲得之結果示於圖2及圖3。
細胞係使用hTRAILR2/L929細胞(國際公開第2002/094880號所記載)及實施例8中所獲得之hPSMA/L929細胞。hTRAILR2/L929細胞係利用抗hPSMA單株抗體2A10抗體或者PI134抗體、或hTRAILR2- hPSMA雙專一性抗體E11-GL-PI134VH抗體、E11-CH1-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或者E11-CH1-PN170VH抗體進行染色。將所獲得之結果示於圖3。
hPSMA/L929細胞係利用抗TRAILR2單株抗體E11抗體、抗hPSMA單株抗體PI134抗體、或hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體或者E11-CH1-PN170VH抗體進行染色。將所獲得之結果示於圖2。
圖3所示，對於hTRAILR2/L929細胞，結合有抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、以及hTRIALR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體，另一方面，未結合抗hPSMA單株抗體PI134抗體。
由此明確，hTRAILR2/L929細胞表現hTRAILR2，不表現hPSMA。又，顯示出作為hTRIALR2-hPSMA雙專一性抗體之E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體具有與hTRAILR2之結合性。
如圖2所示，對於hPSMA/L929細胞，結合有作為抗hPSMA單株抗體之2A10抗體及PI134抗體、以及hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI134VH抗體、E11-GL-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體之全部。
由此顯示，hPSMA/L929細胞表現hPSMA，hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI134VH抗體、E11-GL-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體具有與hPSMA之結合性。
關於表3所示之其他hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體，藉由與上述相同之方法，確認到其與PC3細胞(表現TRAILR2)及實施例8中所製作之hPSMA/PC3細胞(表現hPSMA、TRAILR2兩者)之兩者結合(未揭 示資料)。關於hPSMA/PG3細胞，其PSMA之表現量高於TRAILR2，關於任一抗體，hPSMA/PC3細胞之螢光強度均高於PC3細胞之螢光強度。
據此顯示，本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體與hTRAILR2及hPSMA之任一者均結合。
[實施例10]利用流式細胞儀所進行之PC3細胞、hPSMA/PC3細胞及LNCaP純系FGC細胞之抗原表現分析
藉由以下順序，藉由FACS法，對PC3細胞、實施例8中所製作之hPSMA/PC3細胞及人類攝護腺癌細胞株LNCaP純系FGC(CRL-1740)中有無表現hTRAILR2或hPSMA進行評價。
將PC3細胞、hPSMA/PC3細胞或LNCaP純系FGC細胞以1×106細胞/mL之濃度懸浮於染色緩衝液(包含0.1%NaN3及1%FBS之PBS)中，並以100μL/孔分注至96孔圓底培養盤(Becton Dickinson公司製造)中。於離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，對所獲得之顆粒添加實施例7中所獲得之各抗體，進行懸浮後，於冰溫度下靜置30分鐘。
進而，進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)，去除上清液，將所獲得之顆粒利用200μL/孔之染色緩衝液洗淨2次後，以50μL/孔添加1μg/mL之RPE螢光標記小鼠抗人類抗體(鉸鏈區域)純系4E3(southern Bioblot公司製造)，於冰溫度下培養30分鐘。利用染色緩衝液洗淨2次後，懸浮於200μL/孔之染色緩衝液中，利用流式細胞儀FAGSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。
抗體係使用抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、抗hPSMA單株抗體2A10抗體或者PI134抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體或作為陰性對照之公知之抗DNP單株抗體。將所獲得之 結果示於圖4(A)及圖4(B)、以及圖5。
如圖4(A)所示，對於PC3細胞，結合有抗hTRAILR2單株抗體E11抗體及雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體，未結合抗hPSMA單株抗體PI134抗體。
如圖4(B)所示，對於hPSMA/PC3細胞，結合有E11抗體、E11-CH1-PI101VH抗體及PI134抗體。進而顯示，與E11抗體相比，P1134抗體及E11-CH1-PI101VH抗體具有更強之結合活性。
根據該結果顯示，PC3細胞不表現hPSMA，僅表現hTRAILR2，及hPSMA/PC3細胞表現hTRAILR2及hPSMA之兩抗原。
如圖5所示，對於LNGaP純系FGC，結合有抗hTRAILR2單株抗體E11抗體及抗hPSMA單株抗體2A10抗體。根據該結果顯示，LNCaP純系FGC表現hTRAILR2及hPSMA之兩抗原。
[實施例11]使用hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之PC3細胞及hPSMA/PC3細胞之增殖性試驗
使用實施例7中所獲得之各種抗體，藉由以下方式對PC3細胞及實施例8中所獲得之hPSMA/PC3細胞之增殖性進行評價。由此可確認，實施例7中所獲得之抗體是否對上述細胞抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。
根據實施例10到PC3細胞係表現hTRAILR2且不表現hPSMA之細胞，hPSMA/PC3細胞係表現hTRAILR2及hPSMA之細胞。
抗體係使用抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體、E11-CH1-PN170VH抗體、E11-GL-PI134VH、E11-CH1-PI105VH抗體、E11-CH1-PI108VH抗體、E11-CH1-PI115VH抗體、E11-CH1-PI118VH抗體、E11-CH1-PI127VH抗體、E11-CH1-PI143VH抗體或者E11-CH1- PL223VH抗體、或作為陰性對照抗體之公知之抗DNP單株抗體。
將2~10×104細胞/mL之細胞以50μL/孔接種至平底96孔培養盤中，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養16小時。添加調整為各種濃度之上述抗體，設為總量100μL/孔，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養72小時後，將細胞計數套組-8(WST-8)(同仁化學公司製造)以10μL/孔添加至各孔中。於各條件下，使用4個獨立之孔進行評價。
進而，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養4小時後，添加0.1M之HCl而停止反應，利用微盤讀取器(1420 ARVO多標計數器：WALLAC公司製造)測定波長450nm(參考波長630nm)下之吸光度。
根據下述式算出各孔之細胞之存活率：存活率(%)=100×(a-b)/(c-b)
(式中，a表示受檢孔之吸光度，b表示無細胞孔之吸光度，c表示未添加抗體孔之吸光度)。
將所獲得之結果示於圖6~10。將針對PC3細胞之結果示於圖6及圖7，將針對hPSMA/PC3細胞之結果示於圖8~10。如圖7及圖9所示，抗hTRAILR2單株抗體E11抗體對於任一細胞均與抗DNP單株抗體同等地未降低細胞之存活率。另一方面，如圖6~圖10所示，抗TRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體對於任一細胞均與抗DNP單株抗體相比更加降低細胞之存活率。
如圖6及圖7所示，hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體對於PC3細胞均與抗DNP單株抗體同等地未降低細胞之存活率。
另一方面，如圖8~圖10所示，針對hPSMA/PC3細胞，hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-GL-PI134VH抗體、E11-CH1- PI134VH抗體、E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體、E11-CH1-PN170VH抗體、E11-CH1-PI105VH抗體、E11-CH1-PI108VH抗體、E11-CH1-PI115VH抗體、E11-CH1-PI118VH抗體、E11-CH1-PI127VH抗體、E11-CH1-PI143VH抗體及E11-CH1-PL223VH抗體均與抗DNP單株抗體相比更加降低細胞之存活率。
又，抗hPSMA單株抗體2A10抗體、PI134抗體、PN7抗體單獨對於任一細胞均與抗DNP單株抗體同等地未降低細胞之存活率(未揭示資料)。
即，本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體對於表現hTRAILR2且不表現hPSMA之細胞，不降低細胞之存活率，對於表現hTRAILR2與hPSMA兩者之細胞，降低細胞之存活率。
因此，顯示出本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體僅憑與hTRAILR2結合，不會抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡，而於與hTRAILR2及hPSMA結合時，誘導上述反應。
又，顯示出作為本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之親本抗體的抗hTRAILR2單株抗體E11抗體對於表現hTRAIL2且不表現hPSMA之細胞、及表現hTRAILR2及hPSMA之細胞之任一者均不降低細胞之存活率。
因此，本發明所使用之抗TRAILR2單株抗體藉由製成與針對PSMA之結合區域結合之雙專一性抗體，而首次明確抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。
[實施例12]使用hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之癌細胞之增殖性試驗
使用實施例7中所獲得之各種抗體，藉由以下方式對LNCaP純系FGC細胞(ATCC、CRL_1740)之增殖性進行評價。抗體係使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗 體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體、或者E11-CH1-PN170VH抗體、或作為陰性對照抗體之公知之抗DNP單株抗體。藉由實施例10確認LNCaP純系FGC細胞表現hTRAILR2與hPSMA兩者。
將4×104細胞/mL之LNCaP純系FGC細胞以50μL/孔接種至平底96孔培養盤中，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養16小時。添加調整為各種濃度之上述抗體，設為總量100μl/孔，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養72小時後，將細胞計數套組-8(WST-8)(同仁化學公司製造)以10μL/孔添加至各孔中。
於各條件下，使用4個獨立之孔進行評價。進而，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養4小時後，添加0.1M之HCl而停止反應，利用微盤讀取器(1420ARVO多標計數器：WALLAC公司製造)測定波長450nm(參考波長630nm)下之吸光度。
根據下述式算出各孔之細胞之存活率：存活率(%)=100×(a-b)/(c-b)
(式中，a表示受檢孔之吸光度，b表示無細胞孔之吸光度，c表示未添加抗體之孔之吸光度)。
將所獲得之結果示於圖11。如圖11所示，對於LNCaP純系FGC細胞，抗hTRAILR2單株抗體E11抗體與抗DNP單株抗體同等地未降低細胞之存活率。另一方面，抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體以及hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體EI1-CH1-PI101VH抗體、E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN170VH抗體與抗DNP單株抗體相比，更加降低LNCaP純系FGC細胞之存活率。
根據該結果顯示，本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體即便對於並非強制表現株之通常細胞株，只要為表現hTRAILR2與hPSMA之細胞，則對該細胞抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。
[實施例13]利用流式細胞儀所進行之半胱天冬酶之檢測
藉由以下所記載之方式，使用流式細胞儀及FAM-FLICA半胱天冬酶檢測套組(ImmunoChemistry公司製造)而檢測活化半胱天冬酶，從而確認實施例7中所獲得之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-GH1-PI101VH抗體對於PC3細胞及hPSMA/PC3細胞是否誘導細胞凋亡。藉由實施例10確認，PC3細胞係表現hTRAILR2且不表現hPSMA之細胞，hPSMA/PC3細胞係不表現hTRAILR2及hPSMA之細胞。
將PC3細胞或hPSMA/PC3細胞以5×104細胞/孔分注至96孔圓底培養盤(Becton Dickinson公司製造)中。於離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)後，去除上清液，對於所獲得之顆粒物，將陰性對照抗體(抗DNP單株抗體)、E11-CH1-PI101VH抗體或TRAILR2配體TRAIL/Apo2(R&D systems公司製造)利用培養基稀釋為最終濃度1μg/mL而添加，並於37℃下培養6小時。於進行離心分離(2000rpm、4℃、2分鐘)並去除上清液後，以50μL/mL添加利用培養基進行稀釋之套組附帶之FLICA，於37℃下培養30分鐘。
其後，利用套組附帶之細胞凋亡沖洗緩衝液洗淨4次後，以100μL/孔懸浮於細胞凋亡沖洗緩衝液中，並利用流式細胞儀FACSCANTO II(Becton Dickinson公司製造)測定各細胞之螢光強度。將所獲得之結果示於圖12(A)及圖12(B)。
如圖12(A)所示，於PC3細胞中，活化半胱天冬酶於添加E11-CH1-PI101VH抗體時未檢測到，僅於添加TRAIL時檢測到。另一方面，如圖12(B)所示，於hPSMA/PC3細胞中，於添加E11-CH1-PI101VH抗體及TRAIL之任一者時均於細胞內檢測到活化半胱天冬酶。
根據該結果明確，E11-CH1-PI101VH抗體對於表現hTRAILR2且不表現hPSMA之細胞，不誘導細胞凋亡，對於表現hTRAILR2及 hPSMA兩者之細胞，特異性地誘導細胞凋亡。
又，於對hPSMA/PC3細胞添加E11-CH1-PI101VH抗體時，與添加TRAILR2配體TRAIL時同樣地檢測到活化半胱天冬酶。
因此，顯示出本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體僅與hTRAILR2結合時不誘導細胞凋亡，於與hTRAILR2及hPSMA結合時，誘導細胞凋亡。又，顯示出該細胞凋亡係經由TRAILR2而產生。
[實施例14]藉由正常肝細胞之增殖性試驗所進行之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之安全性評價
使用實施例7中所獲得之各種抗體，藉由以下方式評價正常肝細胞(Celsis IVT公司、IVT-M00995-P)之增殖性。藉此，可確認實施例7中所獲得之各種抗體對於正常肝細胞是否誘導細胞增殖之抑制及細胞死亡之至少一者。
抗體係使用抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體、抗hTRAILR2單株抗體E11抗體、hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體或者E11-CH1-PN7VH抗體、或作為陰性對照抗體之公知之抗DNP單株抗體。又，亦使用TRAILR2配體TRAIL/Apo2代替抗體作為陽性對照。
將2×104細胞/mL之正常肝細胞細胞以50μL/孔接種至平底96孔培養盤中，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養16小時。添加調整為各種濃度之上述抗體，將總量設為100μl/孔，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養72小時後，將細胞計數套組-8(WST-8)(同仁化學公司製造)以10μL/孔添加至各孔中。於各條件下，使用4個獨立之孔進行評價。
進而，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養4小時後，添加0.1M之HCl而停止反應，利用微盤讀取器(1420ARVO多標計數器：WALLAC公司製造)測定波長450nm(參考波長630nm)下之吸光度。
根據下述式算出各孔之細胞之存活率：存活率(%)=100×(a-b)/(c-b)
(式中，a表示受檢孔之吸光度，b表示無細胞孔之吸光度，c表示未添加抗體之孔之吸光度)。
將所獲得之結果示於圖13及圖14。如圖13及圖14所示，抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體及TRILR2配體TRAIL/Apo2與抗DNP單株抗體相比，更加降低正常肝細胞之存活率，相對於此，抗hTRAILR2單株抗體E11抗體以及hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PI101VH抗體及E11-GH1-PN7VH抗體與抗DNP單株抗體同等地未降低正常肝細胞之存活率。
根據該結果顯示，本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體對於正常肝細胞不抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。
因此，顯示出本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體大幅度降低因抗TRAILR2促效性單株抗體或TRAIL/Apo2引起之針對正常肝細胞之毒性。
[實施例15]hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體或該抗體片段之表現質體載體之構建
為了針對實施例11所測得之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體所具有之抑制細胞增殖活性及誘導細胞死亡活性之至少一者，調查其與雙專一性抗體之結構之關係，而製作圖15(B)~圖15(D)各自所示之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2及E11-CH1-PN7VH Fab以及hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體，並對其抑制細胞增殖活性及誘導細胞死亡活性之至少一者進行評價。
(1)hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2之表現質體載體之構建
E11-CH1-PN7VH F(ab')2係使實施例4及7中所製作之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7 VH之CH2及CH3缺失之雙專一性抗體片段[圖15(B)]。
藉由下述方法而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2之表現質體載體。該雙專一性抗體片段之重鏈自N末側起依序包含抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之VH、連結子(人類IgG4之CH1區域)、及抗hPSMA單株抗體PN7抗體之VH之胺基酸序列，且於C末端包含FLAG標籤及His標籤作為精製用之標籤。進而，該雙專一性抗體片段之輕鏈均包含E11抗體之VL之胺基酸序列。E11-CH1-PN7VH F(ab')2利用鉸鏈區域內之半胱胺酸形成二聚物，以2價分別與hTRAILR2及hPSMA結合[圖15(B)]。
將人類IgG4之恆定區域之鹼基序列設為模板，使用引子33(序列編號144)及引子34(序列編號145)、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR擴增連結子部分之基因片段。又，將實施例3中所記載之N5KG4PE[R409K]_E11VL_PN7載體設為模板，使用引子35(序列編號146)及引子36(序列編號147)、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR擴增PN7抗體之VH區域之基因片段。進而，將人類IgG4之恆定區域之鹼基序列設為模板，使用引子37(序列編號148)及引子38(序列編號149)、以及KOD聚合酶，藉由PCR擴增CH1及鉸鏈區域部分之基因片段。
藉由將利用PCR反應而擴增之該基因片段與利用限制酶NheI及BamHI裂解而成之實施例2中所記載之N5KG1_E11載體連結，而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2之表現質體載體N5KG_E11VL_E11-CH1-PN7VH F(ab')2。
E11-CH1-PN7VH F(ab')2之重鏈之去除訊號序列之鹼基序列示於序列編號150，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號 151。
(2)hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH Fab之表現質體載體之構建
藉由下述方法而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH Fab之表現質體載體。E11-CH1-PN7VH Fab係自(1)所記載之E11-CH1-PN7VH F(ab')2缺失鉸鏈區域之結構，且以1價分別與hTRAILR2及hPSMA結合[圖15(C)]。
將人類IgG4之恆定區域之鹼基序列設為模板，使用引子33(序列編號144)及引子34(序列編號145)、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR擴增連結子部分之基因片段。又，將實施例3中所記載之N5KG4PE[R409K]_E11VL_PN7載體設為模板，使用引子35(序列編號146)及引子36(序列編號147)、以及KOD plus DNA聚合酶(東洋紡公司製造)，藉由PCR擴增抗hPSMA單株抗體PN7抗體之VH區域之基因片段。進而，將人類IgG4之恆定區域之鹼基序列設為模板，使用引子37(序列編號148)及引子39(序列編號152)、以及KOD聚合酶，藉由PCR擴增CH1部分之基因片段。
藉由將利用PCR反應而擴增之該基因片段連結於利用限制酶NheI及BamHI裂解而成之N5KG1_E11載體，而製作hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH Fab之表現質體載體N5KG_E11VL_E11-CH1-PN7VH Fab。
將E11-CH1-PN7 VH Fab之重鏈之去除訊號序列之鹼基序列示於序列編號153，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號154。
(3)hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體之表現質體載體之構建
藉由以下方法而製作hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體 E11_PN7異種抗體之表現質體載體。該雙專一性抗體係包含抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之VH的重鏈、與包含抗體hPSMA單株抗體PN7抗體之VH的重鏈形成異源二聚物，以1價分別與hTRAILR2及hPSMA結合之抗體。
該雙專一性抗體之一條重鏈係包含E11抗體之VH之胺基酸序列及導入有K409R之胺基酸變異之人類IgG1之恆定區域之胺基酸序列的重鏈(以下，記載為E11 K409R)，另一條重鏈係包含PN7抗體之VH之胺基酸序列及導入有F405L之胺基酸變異之人類IgG1之恆定區域之胺基酸序列的重鏈(以下，記載為PN7 F405L)。
藉由使E11 K409R及PN7 F405L分別包含K409R及F405L之胺基酸變異，而促進該等重鏈間之異源二聚物之形成[Nature Protocols,9,2450-2463(2014)][圖15(D)]。又，該抗體之VL[圖15(D)之E11 VL及PN7 VL]均相同，包含序列編號119所表示之胺基酸序列。
E11_PN7異種抗體之製作方法係藉由實施例16而詳細說明，首先分別製作包含重鏈為E11 K409R且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hTRAILR2單株抗體、及包含重鏈為PN7 F405L且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體。其次，藉由將該等兩種抗體混合，進行還原反應，而可製作各抗體之重鏈E11 K409R及PN7 F405L形成異源二聚物之E11_PN7異種抗體。
包含重鏈為E11 K409R且輕鏈為E11之VL之胺基酸序列的抗hTRAILR2抗體之表現質體載體N5KG1_E11VL_E11VH K409R係藉由將導入有K409R之胺基酸變異之人類IgG1重鏈恆定區域基因片段與利用限制酶NheI及BamHI裂解而成之人類IgG1型抗hTRAILR2單株抗體E11抗體之表現質體載體N5KG1_E11連結而製作。
包含重鏈為PN7 F405L且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體之表現質體載體N5KG1_E11VL_PN7VH F405L係藉 由將導入有F405L之胺基酸變異之人類IgG1重鏈恆定區域基因片段與利用限制酶NheI及BamHI裂解而成之變異人類IgG4型抗hPSMA單株抗體PN7抗體之表現質體載體N5KG4PE[R409K]_E11VL_PN7連結而製作。
將E11 K409R之去除訊號序列之鹼基序列示於序列編號155，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號156。將PN7 F405L之去除訊號序列之鹼基序列示於序列編號157，將根據該鹼基序列推測之胺基酸序列示於序列編號158。
[實施例16]hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體或該抗體片段之製備
(1)hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2及E11-CH1-PN7VH Fab之製備
將實施例15中所製作之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段之表現質體載體N5KG_E11VL_E11-CH1-PN7VH F(ab')2或N5KG_E11VL_E11-CH1-PN7VH Fab利用Expi293(註冊商標)表現系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)基因導入至浮游性Expi293F(註冊商標)細胞中，而使E11-CH1-PN7VH F(ab')2或E11-CH1-PN7VH Fab瞬時表現。
自導入基因起4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(Thermo Scientific公司製造)進行過濾。將該培養上清液注入FLAG融合蛋白質精製用之ANTI-FLAG M2 Affinity Gel(管柱容積2mL)(SIGMA Aldrich公司製造)中，利用PBS(-)洗淨後，利用溶出緩衝液[20mM之檸檬酸、50mM之NaCl(pH值3.4)]進行溶出，並回收至包含200mM之磷酸鈉緩衝液(pH值7.0)之試管中。
其次，將該溶出液利用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，並利用NAP(註冊商標)管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)將溶劑置換為PBS。進而，利用AKTA Explore(GE Healthcare公司製造)，使用Superdex高效管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)，自 該溶出液分取對應於E11-CH1-PN7VH F(ab')2或E11-CH1-PN7VH Fab之分子量之組分，並利用孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV、MILLIPORE公司製造)進行過濾滅菌，藉此獲得包含hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2或E11-CH1-PN7VH Fab之抗體溶液。
藉由SDS-PAGE法確認到所獲得之抗體溶液中之E11-CH1-PN7VH F(ab')2或E11-CH1-PN7VH Fab均為95%以上之純度。利用流式細胞儀確認到該雙專一性抗體片段均具有與hTRAILR2及hPSMA之結合活性。
(2)hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體之製備
將實施例15中所製作之表現質體載體N5KG1_E11VL_E11VH K409R利用Expi293(註冊商標)表現系統(Thermo Fisher Scientific公司製造)基因導入至浮游性Expi293F(註冊商標)細胞中，而使包含重鏈為E11 K409R且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hTRAILR2單株抗體瞬時表現。
實施例15中所製作之表現質體載體N5KG1_E11VL_PN7VH F405L亦藉由同樣方法基因導入至浮游性Expi293F(註冊商標)細胞中，而使包含重鏈為PN7 F405L且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體瞬時表現。
針對各基因導入細胞，自導入基因起4天後回收培養上清液，利用孔徑0.22μm之膜濾器(Thermo Scientific公司製造)進行過濾，並使用蛋白A樹脂(MabSelect、GE Healthcare Bioscience公司製造)對抗體進行親和精製。使用磷酸緩衝液作為洗淨液。
將吸附於蛋白A之抗體利用溶出緩衝液[20mM之檸檬酸鈉、50mM之NaCl緩衝液(pH值3.4)]進行溶出，並回收至包含200M磷酸鈉緩 衝液(pH值7.0)之試管中。其次，將溶出液利用VIVASPIN(Sartrius stealin公司製造)進行濃縮，並利用NAP(商標)管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)將溶劑置換為PBS。
藉此，獲得含有包含重鏈為E11 K409R且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hTRAILR2單株抗體或包含重鏈為PN7 F405L且輕鏈為E11抗體之VL之胺基酸序列的抗hPSMA單株抗體的抗體溶液。
其次，使用上述兩種抗體溶液，進行依據Nature Protocols,9,2450-2463(2014)之以下反應，而製作hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體hE11_PN7異種抗體。
將上述之抗hTRAILR2單株抗體溶液及抗hPSMA單株抗體溶液混合，利用75mM之2-MEA、PBS進行90分鐘還原反應。將所獲得之反應溶液之溶劑利用NAP(註冊商標)管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)置換為PBS，於4℃下培養16小時。藉此，各抗體之重鏈E11 K409R及PN7 F405L形成異源二聚物。
進而，藉由利用AKTA Explore(GE Healthcare公司製造)，使用Superdex高效管柱(GE Healthcare Bioscience公司製造)，自反應溶液分取E11_PN7異種之組分，並利用孔徑0.22μm之膜濾器(Millex-GV、MILLIPORE公司製造)進行過濾滅菌，而獲得包含hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體之抗體溶液。
所獲得之抗體溶液中之E11_PN7異種抗體係藉由SDS-PAGE法而確認到純度為95%以上。又，利用流式細胞儀確認到E11_PN7異種抗體具有與hTRAILR2及hPSMA之結合活性。
[實施例17]使用hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體之PC3細胞及hPSMA/PC3細胞之增殖性試驗
使用實施例7中所製作之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體E11-CH1-PN7VH抗體、及實施例16中所製作之hTRAILR2-hPSMA雙專一 性抗體片段E11-CH1-PN7VH F(ab')2及E11-CH1-PN7VH Fab、以及hTRAILR2-hPSMA異種雙專一性抗體E11_PN7異種抗體，藉由以下方式對PC3細胞及實施例8中所獲得之hPSMA/PC3細胞之增殖性進行評價。
藉此，可確認上述抗體針對PC3細胞及hPSMA/PC3細胞，是否抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。又，使用公知之抗DNP單株抗體作為陰性對照。
藉由實施例10確認，PC3細胞中表現hTRAILR2，不表現hPSMA，hPSMA/PC3細胞中表現hTRAILR2及hPSMA。
將2~10×104細胞/mL之細胞以50μL/孔接種至平底96孔培養盤中，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養16小時。添加調整為各種濃度之抗體，設為總量100μL/孔，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養72小時後，將細胞計數套組-8(WST-8)(同仁化學公司製造)以每孔10μL添加至各孔中。於各條件下，使用4個獨立之孔進行評價。
進而，於37℃、5.0%二氧化碳氣體之條件下培養4小時後，添加0.1M之HCl而停止反應，利用微盤讀取器(1420 ARVO多標計數器：WALLAC公司製造)測定波長450nm(參考波長630nm)下之吸光度。將所獲得之結果示於圖16及17。抗體濃度以莫耳濃度計一致。所獲得之吸光度之值係反映各孔中之細胞數。
將針對PC3細胞之結果示於圖16，將針對hPSMA/PC3細胞之結果示於圖17。如圖16及圖17所示，於添加有10nM之抗hTRAILR2促效性單株抗體KMDA2抗體之孔中，任一孔之細胞數均較添加有抗DNP單株抗體之孔略微降低。於添加有其他抗體或抗體片段之孔中，任一者於PC3細胞方面均顯示出與添加有抗DNP單株抗體之孔同等之細胞數。
關於hPSMA/PC3細胞，於添加有E11-CH1-PN7VH抗體或E11-CH1-PN7VH F(ab')2之孔中，細胞數較添加有KMDA2抗體之孔降低。另一方面，於添加有E11-CH1-PN7VH Fab及E11_PN7異種抗體之孔中，顯示出與添加有抗DNP單株抗體之孔同等之細胞數。
由此明確，E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN7VH F(ab')2針對表現hTRAILR2且不表現hPSMA之細胞，不會抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡，而針對表現hTRAILR2及hPSMA之細胞，會抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡。另一方面，明確E11-CH1-PN7VH Fab及E11_PN7異種抗體對於表現hTRAILR2及hPSMA之細胞亦不會誘導上述反應。
E11-CH1-PN7VH抗體、E11-CH1-PN7VH F(ab')2、E11-CH1-PN7VH Fab及E11_PN7異種抗體均係使用相同之抗hTRAILR2單株抗體E11抗體與抗hPSMA單株抗體PN7抗體之可變區域所製作，但就各抗體或抗體片段之結構方面而言，E11-CH1-PN7VH抗體及E11-CH1-PN7VH F(ab')2係以2價分別與hTRA1LR2及hPSMA結合，E11-CH1-PN7VH Fab及E11_PN7異種抗體係以1價分別與hTRAILR2及hPSMA結合。
據此顯示，本發明之hTRAILR2-hPSMA雙專一性抗體或該抗體片段於以2價與hTRAILR2及hPSMA結合時，會抑制細胞增殖及/或誘導細胞死亡，於以1價與各抗原結合，不會產生上述反應。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供包含與TRAILR2結合之抗原結合區域及與PSMA結合之抗原結合區域之雙專一性抗體或該抗體片段、具有編碼該抗體或該抗體片段之鹼基序列的核酸、包含該核酸之重組載體、包含該重組載體之轉形株、使用該轉形細胞之該雙專一性抗體或該抗體片段之製造方法、以及包含該雙專一性抗體或該抗體片段之檢測或測 定試劑、診斷藥及治療藥。
以上，使用特定態樣對本發明進行了詳細說明，但從業者明瞭可在不脫離本發明之意圖與範圍之情況下進行各種變更及變化。再者，本申請案係基於2015年1月8日提出申請的美國臨時申請案(62/101042號)，藉由引用而援用其全部內容。
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序列編號158-人工序列之說明：合成構建物之胺基酸序列
<110> 日商協和醱酵麒麟有限公司
<120> 與TRAILR2及PSMA結合之雙專一性抗體
<130> W519750
<150> US62/101,042
<151> 2015-01-08
<160> 158
<170> PatentIn第3.3版
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之說明：引子6
<400> 28
<210> 29
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子7
<400> 29
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子8
<400> 30
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子9
<400> 31
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子10
<400> 32
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子11
<400> 33
<210> 34
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI134_VH之核苷酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子12
<400> 35
<210> 36
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI101_VH之核苷酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子13
<400> 37
<210> 38
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子14
<400> 38
<210> 39
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI105_VH之核苷酸序列
<400> 39
<210> 40
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI108_VH之核苷酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI115_VH之核苷酸序列
<400> 41
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子15
<400> 42
<210> 43
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI118_VH之核苷酸序列
<400> 43
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子16
<400> 44
<210> 45
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI127_VH之核苷酸序列
<400> 45
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子17
<400> 46
<210> 47
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子18
<400> 47
<210> 48
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI143_VH之核苷酸序列
<400> 48
<210> 49
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子19
<400> 49
<210> 50
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子20
<400> 50
<210> 51
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1_PL223_VH之核苷酸序列
<400> 51
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子21
<400> 52
<210> 53
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN7_VH之核苷酸序列
<400> 53
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子22
<400> 54
<210> 55
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子23
<400> 55
<210> 56
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN170_VH之核苷酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子24
<400> 57
<210> 58
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-GL-PI134_VH之核苷酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子25
<400> 59
<210> 60
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子26
<400> 60
<210> 61
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子27
<400> 61
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子28
<400> 62
<210> 63
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-ML-PI101_VH之核苷酸序列
<400> 63
<210> 64
<211> 2253
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
<210> 65
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子29
<400> 65
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子30
<400> 66
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子31
<400> 67
<210> 68
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子32
<400> 68
<210> 69
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH之胺基酸序列
<400> 69
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_HCDR1之胺基酸序列
<400> 70
<210> 71
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_HCDR2之胺基酸序列
<400> 71
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_HCDR3之胺基酸序列
<400> 72
<210> 73
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VL之胺基酸序列
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_LCDR1之胺基酸序列
<400> 74
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_LCDR2之胺基酸序列
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_LCDR3之胺基酸序列
<400> 76
<210> 77
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI134_VH之胺基酸序列
<400> 77
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI134 PI143 PI105 PI127 PI108 PI115 PL223 PN7
PI101 PI118_HCDR1之胺基酸序列
<400> 78
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI134 PI143 PI105 PI127 PI108 PI115 PL223_HCDR2之胺基酸序列
<400> 79
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI134 PI143 PI105 PI127 PI108 PI115 PL223 PI101 PI118_HCDR3之胺基酸序列
<400> 80
<210> 81
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI101_VH之胺基酸序列
<400> 81
<210> 82
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI101 PN7 P1118_HCDR2之胺基酸序列
<400> 82
<210> 83
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN7_VH之胺基酸序列
<400> 83
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN7_HCDR3之胺基酸序列
<400> 84
<210> 85
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI105_VH之胺基酸序列
<400> 85
<210> 86
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI108_VH之胺基酸序列
<400> 86
<210> 87
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI115_VH之胺基酸序列
<400> 87
<210> 88
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI118_VH之胺基酸序列
<400> 88
<210> 89
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI127_VH之胺基酸序列
<400> 89
<210> 90
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI143_VH之胺基酸序列
<400> 90
<210> 91
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PL223_VH之胺基酸序列
<400> 91
<210> 92
<211> 2214
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：N_FLAG-PSMA_ECD之核苷酸序列
<400> 92
<210> 93
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：IgG4_CH1_連結子之胺基酸序列
<400> 93
<210> 94
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_VH之核苷酸序列
<400> 94
<210> 95
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_VH之胺基酸序列
<400> 95
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_HCDR1之胺基酸序列
<400> 96
<210> 97
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_HCDR2之胺基酸序列
<400> 97
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_HCDR3之胺基酸序列
<400> 98
<210> 99
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI134_VH之胺基酸序列
<400> 99
<210> 100
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI101_VH之胺基酸序列
<400> 100
<210> 101
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI105_VH之胺基酸序列
<400> 101
<210> 102
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI108_VH之胺基酸序列
<400> 102
<210> 103
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI115_VH之胺基酸序列
<400> 103
<210> 104
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI118_VH之胺基酸序列
<400> 104
<210> 105
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI127_VH之胺基酸序列
<400> 105
<210> 106
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI143_VH之胺基酸序列
<400> 106
<210> 107
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PL223_VH之胺基酸序列
<400> 107
<210> 108
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN7_VH之胺基酸序列
<400> 108
<210> 109
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN170_VH之胺基酸序列
<400> 109
<210> 110
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-GLPI134_VH之胺基酸序列
<400> 110
<210> 111
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-ML-PI101_VH之胺基酸序列
<400> 111
<210> 112
<211> 750
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
<210> 113
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：N_FLAG-hPSMA_ECD之胺基酸序列
<400> 113
<210> 114
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：KMDA2_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 114
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：KMDA2_VL之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 115
<210> 116
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：2A10_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 116
<210> 117
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：2A10_VL之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 117
<210> 118
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 118
<210> 119
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VL之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 119
<210> 120
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI134_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 120
<210> 121
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI101_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 121
<210> 122
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN7_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 122
<210> 123
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI105_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 123
<210> 124
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI108_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 124
<210> 125
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI115_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 125
<210> 126
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI118_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 126
<210> 127
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI127_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 127
<210> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PI143_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 128
<210> 129
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PL223_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 129
<210> 130
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN170_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 130
<210> 131
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI134_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 131
<210> 132
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI101_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 132
<210> 133
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI105_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列-
<400> 133
<210> 134
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI108_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 134
<210> 135
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI115_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 135
<210> 136
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI118_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 136
<210> 137
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI127_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 137
<210> 138
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PI143_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 138
<210> 139
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PL223_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 139
<210> 140
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN7_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 140
<210> 141
<211> 337
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-CH1-PN170_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 141
<210> 142
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-GL-PI134_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 142
<210> 143
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11_VH-ML-PI101_VH之除訊號序列以外之胺基酸序列
<400> 143
<210> 144
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子33
<400> 144
<210> 145
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子34
<400> 145
<210> 146
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子35
<400> 146
<210> 147
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子36
<400> 147
<210> 148
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子37
<400> 148
<210> 149
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子38
<400> 149
<210> 150
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11-CH1-PN7VH F(ab')2之核苷酸序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1380)
<400> 150
<210> 151
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 151
<210> 152
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：引子39
<400> 152
<210> 153
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11-CH1-PN7CH Fab之核苷酸序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1344)
<400> 153
<210> 154
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 154
<210> 155
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：E11 K409R之核苷酸序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1347)
<400> 155
<210> 156
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 156
<210> 157
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工序列之說明：PN7 F405L之核苷酸序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1350)
<400> 157
<210> 158
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構建物
<400> 158

Claims (30)

  1. 一種雙專一性抗體或該抗體片段，其包含與腫瘤壞死因子(TNF)相關誘導細胞凋亡配體受體2(TRAILR2)結合之抗原結合區域及與攝護腺特異性膜抗原(PSMA)結合之抗原結合區域。
  2. 如請求項1之雙專一性抗體或該抗體片段，其僅在與TRAILR2及PSMA結合時活化該TRAILR2。
  3. 如請求項1或2之雙專一性抗體或該抗體片段，其以雙價分別與TRAILR2及PSMA結合。
  4. 如請求項1至3中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗原結合區域較與PSMA結合之抗原結合區域更位於N末端側。
  5. 如請求項1至4中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗原結合區域為與TRAILR2結合之抗體之可變區域(V區域)，且與PSMA結合之抗原結合區域為與PSMA結合之抗體之V區域。
  6. 如請求項5之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗體之重鏈可變區域(heavy chain variable region，以下記載為VH)之互補決定區域(complementarity determining region，CDR)1~3之胺基酸序列分別包含序列編號70~72所表示之胺基酸序列，且輕鏈可變區域(light chain variable region，以下記載為VL)之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列。
  7. 如請求項5或6之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與TRAILR2結合之抗體之VH之胺基酸序列包含序列編號118所表示之胺基酸序列，且VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序 列。
  8. 如請求項5至7中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與PSMA結合之抗體之VL之CDR1~3之胺基酸序列分別包含序列編號74~76所表示之胺基酸序列，且VH之CDR1~3之胺基酸序列包含選自由以下之(a)~(d)所組成之群中之任一個胺基酸序列，(a)序列編號78、82及84分別表示之胺基酸序列、(b)序列編號78、79及80分別表示之胺基酸序列、(c)序列編號78、82及80分別表示之胺基酸序列、及(d)序列編號96~98分別表示之胺基酸序列。
  9. 如請求項5至8中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段，其中與PSMA結合之抗體之VL之胺基酸序列包含序列編號119所表示之胺基酸序列，且VH之胺基酸序列包含選自由以下之(e)~(o)所組成之群中之任一個胺基酸序列，(e)序列編號122所表示之胺基酸序列、(f)序列編號120所表示之胺基酸序列、(g)序列編號128所表示之胺基酸序列、(h)序列編號123所表示之胺基酸序列、(i)序列編號127所表示之胺基酸序列、(j)序列編號124所表示之胺基酸序列、(k)序列編號125所表示之胺基酸序列、(l)序列編號129所表示之胺基酸序列、(m)序列編號121所表示之胺基酸序列、(n)序列編號126所表示之胺基酸序列、及(o)序列編號130所表示之胺基酸序列。
  10. 如請求項5至9中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段，其包含如下重鏈，該重鏈包含將與TRAILR2結合之抗體之VH、和與 PSMA結合之抗體之VH經由包含免疫球蛋白區域或該區域片段之連結子連結而成之多肽。
  11. 如請求項10之雙專一性抗體或該抗體片段，其中連結子為源自IgG4或IgM亞型之連結子。
  12. 如請求項10或11之雙專一性抗體或該抗體片段，其中包含與TRAILR2結合之抗體之VH、連結子及與PSMA結合之抗體之VH的多肽之胺基酸序列為選自由以下之(A)~(M)所組成之群中之任一個胺基酸序列，(A)序列編號131所表示之胺基酸序列、(B)序列編號132所表示之胺基酸序列、(C)序列編號133所表示之胺基酸序列、(D)序列編號134所表示之胺基酸序列、(E)序列編號135所表示之胺基酸序列、(F)序列編號136所表示之胺基酸序列、(G)序列編號137所表示之胺基酸序列、(H)序列編號138所表示之胺基酸序列、(I)序列編號139所表示之胺基酸序列、(J)序列編號140所表示之胺基酸序列、(K)序列編號141所表示之胺基酸序列、(L)序列編號142所表示之胺基酸序列、及(M)序列編號143所表示之胺基酸序列。
  13. 一種核酸，其具有編碼如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段之鹼基序列。
  14. 一種重組載體，其含有如請求項13之核酸。
  15. 一種轉形株，其包含如請求項14之重組載體。
  16. 一種如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段之製 造方法，其包括將如請求項15之轉形株於培養基中進行培養，自培養上清液中採取雙專一性抗體或該抗體片段。
  17. 一種用以檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之試劑，其包含如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段。
  18. 一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷藥，其含有如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段。
  19. 如請求項18之診斷藥，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
  20. 一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療藥，其含有如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段作為有效成分。
  21. 如請求項20之治療藥，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
  22. 一種檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者之方法，其使用如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段。
  23. 一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷方法，其包括使用如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段而檢測或測定TRAILR2及PSMA之至少一者。
  24. 如請求項23之診斷方法，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
  25. 一種與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療方法，其使用如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段。
  26. 如請求項25之治療方法，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
  27. 一種如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段之用途，其用以製造與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之診斷 藥。
  28. 如請求項27之用途，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
  29. 一種如請求項1至12中任一項之雙專一性抗體或該抗體片段之用途，其用以製造與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病之治療藥。
  30. 如請求項29之用途，其中與TRAILR2及PSMA表現細胞相關之疾病為惡性腫瘤及癌症。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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EP1651663B1 (en) * 2003-08-08 2017-05-17 Immunomedics, Inc. Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells
US8029783B2 (en) * 2005-02-02 2011-10-04 Genentech, Inc. DR5 antibodies and articles of manufacture containing same
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