Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Čištěná protilátka a polypeptid, prostředek selektivně indukující buněčnou smrt, neukleová kyselina, vektor s jejím obsahem, kultivovaná buňka, kit pro indukci apoptosy, transformovaná E. coli, způsob produkce a použití
CZ304614B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Tong Zhou Kimihisa Ichikawa Robert P. Kimberly William J. Koopman
Description
translated from
Čištěná protilátka a polypeptid, prostředek selektivně indukující buněčnou smrt, nukleová kyselina, vektor s jejím obsahem, kultivovaná buňka, kit pro indukci apoptosy, transformovaná E. coli, způsob produkce a použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká čištěné protilátky, která specificky váže TRIAL receptor, prostředku selektivně indukujícího buněčnou smrt cílových buněk exprimujících DR5, izolované nukleové kyseliny, která kóduje řetězec imunoglobulinu uvedené protilátky, vektoru obsahujícího takovou nukleovou kyselinu, kultivované buňky s obsahem zmíněného vektoru, čištěného polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci řetězce imunoglobulinové protilátky, jakož i komerčního kitu pro indukci apoptosy a způsobu produkce výše zmíněné protilátky.
Dosavadní stav techniky
TRAIL je členem TNF rodiny proteinů, kam též patří TNF-alfa a Fas ligand (1). Tyto proteiny jsou silnými induktory apoptosy. Dosud bylo identifikováno pět receptorů pro TRAIL, z nichž dva, DR4 (TRAIL-R1) a DR5 (TRAIL-R2) (2-7), jsou schopné přenášet signál pro apoptosu, zatímco další tři DcRl (TRA1L-R3), DcR2 (TRAIL-R4) a osteoprotegrin (OPG) nepřenášejí signál pro apoptosu (8-12). Všech pět receptorů pro TRAIL vykazuje značnou homologii v extracelulámích doménách pro vazbu ligandu. Podobně jako Fas a TNF receptor I (dále „TNFRI“) obsahují intracelulámí segmenty DR4 a DR5 detah doménu a přenášejí signál pro apoptosu prostřednictvím drah, na kterých se podílejí Fas-asociované proteiny s detah doménou (dále „FADD“) a caspasa 8 (6,7). Kromě přenosu signálu pro apoptosu mohou DR4 a DR5 receptory také aktivovat dráhy zahrnující NFkappab (6,7).
Biologické funkce TRAIL které byly prokázány, zahrnují schopnost TRAIL selektivně indukovat apoptosu transformovaných nádorových buněk, kde normální buňky jsou relativně resistentní na apoptosu zprostředkovanou TRAIL (13-15). Tato selektivita naznačuje, že o proti Fas ligandu je podání TRAIL asociované s velmi slabou toxicitou, jak bylo prokázáno při systémovém podání TRAIL navržen jako účinné činidlo indukující apoptosu, které by mohlo být vhodným terapeutickým činidlem pro léčbu nádorů a jiných onemocnění spojných s abnormální buněčnou proliferaci. TRAIL byl také navržen jako účinné činidlo indukující apoptosu, které by mohlo být vhodným terapeutickým činidlem pro léčbu autoimunních a zánětlivých onemocnění. Bylo prokázáno, že apoptosa zprostředkovaná TRAIL se podílí na aktivaci indukované smrti T—lymfocytů, čímž účinkuje, jako alternativní mechanismus k Fas ligandu (16,17). TRAIL-zprostředkovaná apoptosa se také může podílet na indukci apoptosy T-lymfocytů ajiných zánětlivých buněk (18), a á roli v zabíjecí aktivitě NK buněk (19-2 1), a v imunomodulační funkci dendritických buněk (22,23). Tak může apoptosa zprostředkovaná TRAIL mít roli také v imunotoleranci a imunitním dohledu.
TRAIL receptorový systém je komplexní a zahrnuje alespoň dva death receptory, DR4 a DR5, a alespoň dva non-apoptogenní receptory, DcRl a DcR2. Všechny tyto receptory nejen sdílejí vysokou homologii aminokyselinové sekvence, ale také vykazují podobnou vazebnou afinitu k TRAIL (2-12). Schopnost DcRl a DcR2 receptorů soutěžit o vazbu TRAIL bez indukce apoptosy naznačuje, že mohou účinkovat jako vychytávací receptory, které blokují nebo modulují aktivitu TRAIL ligandu. Dále bylo popsáno, že netransformované buňky exprimují vyšší koncentrace těchto vychytávacích receptorů než transformované buňky. Tak bylo navrženo, že rozdílná modulace exprese death a vychytávacích receptorů může představovat klíčový regulační mechanismus, který určuje citlivost buněk na apoptosu zprostředkovanou TRAIL, v důsledku chybění protilátek specifických pro receptor (2). Ačkoliv byla exprese a funkce DR4 a DR5 studována podrobně, byl pokrok omezen chyběním monoklonálních protilátek specifických pro receptor. Exprese DR5 na povrchu buněk nebyla popsána. Bylo popsáno, že byl připraven panel
- 1 CZ 304614 B6 protilátek proti TRAIL receptoru, které jsou schopné indukovat apoptosu melanomových buněk in vitro, ale pouze po imobilizaci protilátek, podpoření zesítění a, v některých případech, po kultivaci buněk s actinomycinem D (24). Bylo připraveno několik anti-DR5 protilátek (24). Nicméně, tyto dříve připravené anti-DR5 monoklonální protilátky mají in vitro nízkou aktivitu v indukci apoptosy, i za podmínek zesítění. Nebyla popsána žádná aktivita in vivo. Tyto protilátky nebyly použity pro testování exprese TRAIL receptorů na povrchu buněk (24). Proto existuje potřeba pro monoklonální protilátky selektivní pro každý specifický TRAIL receptor, které se nejen váží na receptoiy na povrchu buněk, ale také silně indukují apoptosu v různých typech abnormálních buněk, včetně nádorových buněk, jak in vivo, tak in vitro, bez nutnosti zesítění nebo imobilizace. Takové protilátky nebudou pouze potenciálními terapeutickými činidly, ale též diagnostickými prostředky pro funkční analýzu TRAIL receptoru. Existuje zejména potřeba protilátek specifických pro každý z apoptosu indukujících receptorů DR4 a DR5.
Při vývoji nebo progresi mnoha onemocnění se často stává, že nedochází k depleci buněk. Při mnoha autoimunitních onemocněních a zánětlivých onemocněních ohrožuje přežívání aktivovaných buněk normální tkáně nebo buňky. Dále, progrese nádorů a proliferace s tvorbou panu při revmatoidní arthritidě jsou charakterizovány nekontrolovanou proliferaci buněk. Tak vede nedostatečná apoptosa k vzniku onemocnění a použití apoptosu-indukujícího ligandu nebo agonistické monoklonální protilátky pro zesílení apoptosy se považuje za potenciální terapeutickou strategii pro eliminaci nežádoucích buněk.
Například, revmatoidní arthritida (dále „RA“) je běžným lidským autoimunitním onemocněním. Současné znalosti o patofyziologii RA jsou takové, že autoimunitní T-lymfocyty a B lymfocyty iniciují zánětlivou reakci v kloubech, která způsobí hyperproliferaci synoviocytů. V důsledku hyperproliferace synoviálních buněk jsou nadprodukovány metaloproteinasy (dále „MMP“), které potom způsobují erosivní destrukci chrupavek a kostí, která je charakteristická pro RA (25). Proto je kontrola hyperproliferace zánětlivých synoviálních buněk klíčovým krokem v léčbě RA. Molekulární mechanismy vedoucí k hyperproliferaci synoviálních buněk jsou dosud neznámé. Ačkoliv jsou hyperproliferující synoviální buňky nemaligní a netransformované, mnohé práci ukazují, že vykazují společné charakteristiky s transformovanými buňkami (46). Tyto buňky, takzvané „transformované synoviocyty“, jsou charakterizované densním hrubým endoplasmatickým retikulem, množstvím nepravidelných jader, a změnami cytoskeletu. Bylo navrženo, že inkorporace jader, a změnami cytoskeletu. Bylo navrženo, že inkorporace onkogenů a virových genů může být primárním spouštěcím mechanismem pro transformaci RA synoviálních buněk (46).
Alespoň dva aspekty RA naznačují, že dysregulovaná apoptosa může přispívat k onemocnění a že terapeutická indukce apoptosy může být účinnou léčbou: selhání deplece aktivovaných T-lymfocytů naznačuje, že došlo k selhání aktivací indukované smrti těchto T-lymfocytů, což je proces, na kterém se podílí Fas—zprostředkovaná apoptosa a TRAIL—zprostředkovaná apoptosa, a hyperproliferativní charakteristiky těchto RA synoviálních buněk jsou přispívajícími faktory v pozdějších stadiích patofyziologie RA. Dále bylo prokázáno, že podání anti-Fas protilátky do zánětem postižených kloubů inhibuje vznik chronické artritidy u tax transgenních myší, které jsou zvířecím modelem lidské RA (26). Nicméně, lokalizovaná transdukce genem pro fas ligand pomocí adenovirového vektoru je účinná v prevenci arthritidy indukované kolagenem (27). Inhibice proliferace zánětlivých synoviálních buněk zesílením Fas-zprostředkované apoptosy je pozorováno v obou případech. Ačkoliv je Fas ligand silným induktorem apoptosy u RA synoviálních buněk, je použití Fas ligandem-zprostředkované apoptosy jako terapie u člověka limitováno letální jatemí toxicitou. Tak představuje TRAIL receptorem indukovaná apoptosa bezpečnější a účinnější terapii RA než Fas-ligandem indukovaná apoptosa.
TRAIL receptorem indukovaná apoptosa také představuje bezpečnější a účinnější terapii pro léčbu nádorů než Fas-ligandem indukovaná apoptosa. TRAIL-zprostředkovaná apoptosa specificky indukuje apoptosu transformovaných nádorových buněk bez postižení normálních buněk. Bylo prokázáno, že systémové podání trimerizovaného solubilního TRAIL není toxické u experi-2CZ 304614 B6 mentálních zvířat a zároveň umožňuje indukci regrese implantovaných nádorů (13,28). Její potenciál jako pomocné léčby k tradičním způsobům léčby byl snížen nedávnými zjištěními, že exprese DR5 a citlivost na TRAIL-indukovanou apoptosu buněk karcinomu prsu je zesílena radiací, což naznačuje, kombinací s radiací bude účinnost TRAIL v protinádorové léčbě zvýšena (29).
Dále, gen kódující TRAIL receptor DR5 byl lokalizován na chromosom 8p21-22, lokus s vysokou frekvencí mutací v některých nádorových buňkách (30). Bylo popsáno, že alespoň dva druhy nádorových buněk, buňky malobuněčného karcinomu plic (31) a nádorů hlavy a krku (32), mají mutace v death doméně DR5 genu. Proto existuje potřeba anti-DR5 protilátky ve výzkumu nádorů pro určení efektu variací epitopu receptoru na vývoj a progresi nádorů. Dále, funkce mutací TRAIL receptoru poskytují použitelný klinický diagnostický nástroj při použití s dalšími biomarkery pro časnou detekci nádorů a v predikci agresivity nádorů.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je čištěná protilátka, která specificky váže TRIAL receptor DR5, která ve své rozpustné formě má tumoricidní aktivitu in vivo v nádorových buňkách exprimujících DR5 a aktivitu in vitro indukující buněčnou smrt při koncentracích nižších než 1 pg/ml v cílových buňkách exprimujících DR5, a kde tato protilátka naváže TRIAL receptor DR4, DcRl nebo DcR2 a kde tato protilátka má stejnou specificitu epitopu jako monoklonální protilátka produkované myším-myším hybridomem TRA-8, který má ATCC přírůstkové číslo PTA-1428.
Zvláště vhodným provedením tohoto vynálezu je svrchu popsaná protilátka, kterou je monoklonální protilátka, která je produkována myším-myším hybridomem TRA-8 majícím ATCC přírůstkové číslo PTA-1428.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití uvedené protilátky pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5.
Předmětem tohoto vynálezu je dále prostředek selektivně indukující buněčnou smrt cílových buněk exprimujících DR5, jehož podstata spočívá vtom, že obsahuje farmaceuticky účinné množství svrchu popsané protilátky a farmaceuticky přijatelný nosič.
Předmětem tohoto vynálezu je také použití svrchu popsané protilátky pro výrobu terapeutického činidla pro selektivní usmrcování buněk vybraných z cílových buněk nebo buněk s poruchou regulace.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž použití svrchu opsané protilátky pro výrobu farmaceutického prostředku s účinkem selektivní indukce buněčné smrti cílových buněk dosahované:
(a) transfekci cílových buněk vektorem obsahujícím exprimovatelnou nukleovou kyselinu kódující DR5 pro TRAIL receptor, (b) expresí TRAIL receptoru DR5 na uvedených buňkách; a (c) kontaktováním uvedených buněk se svrchu popsanou protilátkou, která indukuje buněčnou smrt.
-3 CZ 304614 B6
Předmětem tohoto vynálezu je taktéž izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje těžký řetězec imunoglobulinu svrchu popsané protilátky, schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 31 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 56 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 59 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 60 nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 61 nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje těžký řetězec imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559) nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je vektor obsahující nukleovou kyselinu popsanou v předchozím odstavci a regulační element operativně navázaný na uvedenou nukleovou kyselinu.
Předmětem tohoto vynálezu je dále kultivovaná buňka, která obsahuje svrchu popsaný vektor.
Předmětem tohoto vynálezu je také čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 31 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 56 nebo jeho funkční ekvivalent,
-4CZ 304614 B6 (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 59 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 60 nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 61 nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je také čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pEIC10 (FERM BP-7557) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559) nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je dále izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje lehký řetězec imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, kteiý sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 46 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 72 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 73 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 74 nebo jeho funkční ekvivalent, (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 75 nebo jeho funkční ekvivalent, a (f) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 76 nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje lehký řetězec imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specific-5CZ 304614 B6 ky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu, který je vybrán ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5cc/pHSG/M2-l-4 (FERM BP-7563) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2 (FERM BP-7562) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M6-l-4-l (FERM BP-7566) nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je dále čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 46 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 72 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 73 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 74 nebo jeho funkční ekvivalent, (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 75 nebo jeho funkční ekvivalent, a (f) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 76 nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu svrchu popsané protilátky schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu je vázán ke konstantnímu regionu, který je vybrán ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M2-l^t (FERM BP-7563) nebo jeho funkční ekvivalent,
-6CZ 304614 B6 (b) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2 (FERM BP-7562) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5cc/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1 (FERM BP-7566) nebo jeho funkční ekvivalent.
Předmětem tohoto vynálezu je rovněž způsob produkce svrchu popsané protilátky, prováděný in vitro, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kroky:
(a) transformování hostitelské buňky prvním vektorem kódujícím lehký řetězec imunoglobulinu protilátky, těžký řetězec imunoglobulinu protilátky nebo oba řetězce, (b) popřípadě transformování hostitelské buňky druhým vektorem kódujícím lehký nebo těžký řetězec z kroku (a), pokud libovolný z nich není přítomen v uvedeném prvním vektoru, (c) inkubaci transformované hostitelské buňky za podmínek, které dovolují expresi lehkého řetězce imunoglobulinu nebo těžkého řetězce imunoglobulinu, a (d) izolaci protilátky z hostitelské buňky nebo média pro hostitelskou buňku.
Předmětem tohoto vynálezu je taktéž komerční kit pro indukci apoptosy, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje svrchu popsanou protilátku v zásobníku.
Předmětem tohoto vynálezu je konečně transformovaná E. coli, která je vybrána ze souboru sestávajícího zE. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556), E.coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555), E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557), E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) a E: coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559), jakož i transformovaná E. coli, která je vybrána ze souboru sestávajícího z E. coli DH5a/pHSG/M2-l-A (FERM BP-7563), E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2 (FERM BP-7562), E. coli DH5a/pHSG/M33-22 (FERM BP-7564), E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) a E. coli DH5a/pHSG/M6-1-4-1 (FERM BP-7566).
Dále se uvádí detailní popis předmětného řešení, stejně jako další údaje vhodné pro porozumění celé šíři předmětného vynálezu a možnostem jeho aplikace.
Vynález popisuje protilátku, která rozpoznává TRAIL receptor DR5 a která indukuje apoptosu v buňkách exprimujících DR5 in vivo. Dále vynález popisuje protilátku, která rozpoznává DR5, ale ne DR4, DcRl ani DcR2. Specificky je popsána monoklonální protilátka produkovaná hybridomem.
Způsob podle předkládaného vynálezu umožňuje inhibici proliferace buněk tím, že buňky vystaví terapeutickému množství protilátky schopné vazby na DR5.
-7CZ 304614 B6
Vynález také popisuje farmakologický prostředek, který obsahuje terapeutické množství monoklonální protilátky aktivní proti DR5, farmaceuticky přijatelný nosič a popřípadě zásobník na protilátku a nosič. Vynález dále poskytuje použití protilátky rozpoznávající DR5 pro přípravu terapeutického činidla pro selektivní apoptosu abnormálních nebo dysregulovaných buněk.
Protilátka podle předkládaného vynálezu interaguje s ligandem receptoru faktoru nekrózy nádorů, jako je DR4, DR5, DcRl, DcR2 a OPG, indukuje apoptosu v buňkách exprimujících takový receptor. Protilátka podle předkládaného vynálezu je schopná selektivně se vázat na agonistický nebo antagonistický epitop ligandu receptoru faktoru nekrózy nádorů.
S využitím předmětného vynálezu je možná léčba onemocnění spojených s apoptosou způsobem, který zahrnuje exponování cílových tkání s onemocněním spojeným s apoptosou terapeutickému množství protilátky podle předkládaného vynálezu.
Vynález dále popisuje fúzní protein, který obsahuje antigenní aminokyselinovou sekvenci TRAIL receptoru tvořenou alespoň deseti bázemi, navázanou na imunoglobulinový protein nebo jeho fragment schopný vyvolat imunitní reakci u jedince.
Předkládaný vynález umožňuje způsob pro genovou terapii, při kterém je cílová buňka transfektována sekvencí nukleové kyseliny TRAIL receptoru v expresním vektoru tak, že TRAIL receptor je exprimován na cílové buňce. Cílová buňka je potom vystavena působení protilátky, která se selektivně váže na TRAIL receptor.
Vynález poskytuje sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence kódující těžké a lehké řetězce imunoglobulinů protilátky selektivní pro DR5. Vynález také popisuje vektory, které obsahují sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu a hostitelské buňky transformované vektorem podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález poskytuje hostitelské buňky produkující humanizované TRA-8.
Vynález dále popisuje způsob pro produkci humanizované DR5 protilátky, ve kterém je hostitelská buňka transformována sekvencí nukleové kyseliny kódující humanizované lehké řetězce imunoglobulinu a humanizované těžké řetězce imunoglobulinu a potom je inkubována po předem určenou dobu.
S aplikací tohoto vynálezu je možné také dosáhnout způsobu pro inhibici buněčné proliferace, který zahrnuje kontaktování cílové buňky s farmaceuticky účinným množstvím humanizované DR5 protilátky.
Tento vynález konečně poskytuje komerční kit pro indukci smrti buněk, který obsahuje humanizované TRA-8 protilátky selektivní pro DR5; které jsou balené ve vhodném zásobníku společně s návodem pro použití.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. Charakterizace TRA-8. (a) Vazebná specificita TRA-8: Westernová hybridizace (horní panel): Rekombinantní fúzní proteiny TNFR rodiny sondované TRA-8 nebo anti-lidským IgG. Dráha 1: DR5/hIgGl fúzní protein (imunogen); Dráha 2: DR4/hIgGl (TRAIL-R1); Dráha 3:DR5/hlgGl; Dráha 4: TRAIL-R3 (DcR-l)/hIgGl; Dráha 5: TRAIL-R4 (DcR-2)/hlgGl; Dráha 6: CD95/hIgGl; Dráha 7: solubilní TNFRI. ELISA analýza (dolní panel): Čísla jamek odpovídající číslům v Westernové hybridizaci s výjimkou jamky 8, která je myší DR5/hIgGl fúzní protein, (b.) Vazebná aktivita solubilních TRAIL a TRA-8 k DR5 a DR4: ELISA plotny se potáhly DR5/hIgGl (levý panel) nebo DR4IhIgGl (střední panel) a potom se inkubovaly
-8CZ 304614 B6 s TRAIL nebo TRA-8. (c.) Analýza průtokovou cytometrií povrchové exprese DR5. Cos-7 buňky tmsfektované pcDNA3 expresním vektorem obsahujícím kompletní DR5 cDNA (plný histogram), DR4 cDNA (prázdný histogram, plná čára) nebo prázdným vektorem (prázdný histogram, čárkovaná čára). 48 hodin po transfekci se buňky barvily TRA-8 a potom PE-konjugovaným anti-myším IgGl. (d.) Imunohistochemická reaktivita pro DR5 in sítu. Cytospin řezy Cos-7 buněk transfektovaných DR5 expresním nebo kontrolním vektor se barvily TRA-8 ve 48 hodině po transfekci. (e.) Smrtící aktivita TRA-8: Jurkat buňky se inkubovaly s uvedenými koncentracemi TRA-8. Životaschopnost buněk se stanovila ATPLite, MIT a Pl testy po kultivaci přes noc. Výsledky ATPLite a MIT testů jsou prezentovány v procentech vzhledem ke kontrolnímu médiu, a výsledky PT testu jsou prezentovány jako procento Pl negativních buněk (f.). Westernová hybridizace aktivace caspas: Jurkat buňky se inkubovaly s 500 ng/ml TRA-8 po uvedenou dobu. Buněčné lyzáty se separovaly 15% SDS-PAGE, přenesly se na membránu a sondovaly se protilátkami proti caspase. Šipky ukazují odštěpené podjednotky každé caspasy. (g.) Test inhibice caspas: Jurkat buňky se inkubovaly přes noc s 50 ng/ml TRA-8 za přítomnosti různých koncentrací uvedených inhibitorů caspas. Životaschopnost buněk se určila ATPLite testem.
Obr. 2. Exprese DR5 na povrchu buněk a citlivost na DR5-zprostředkovanou apoptosu. Normální T a B lymfocyty, čerstvě izolované z periferní krve, T lymfocyty (a a a'), gliomové buňky (b a b'), buňky karcinomu prostaty (c) a B lymfocyty (d) se inkubovaly s TRA-8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou a potom s anti-myším IgGl konjugovaným sPE. Prázdné histogramy reprezentují kontrolní isotypové protilátky a plné histogramy reprezentují TRA-8 barvení. Apoptosa byla stanovena ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka), jak je uvedeno na a, b' a d.
Obr. 3a': T lymfocytámí linie U937 se inkubovala s TRA-8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou. Apoptosa se stanovila ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka).
Obr. 3: Gliomová buněčná line (b) a buněčná linie karcinomu prostaty (c) se inkubovaly s TRA8 nebo myší IgGl kontrolní protilátkou. Apoptosa se stanovila ATPLite testem po inkubaci přes noc se solubilním TRAIL (prázdná kolečka) nebo TRA-8 (plná kolečka).
Obr. 4 je série grafů ukazující životaschopnost buněk pro lidské Jurkat-buňky po expozici uvedeným koncentracím (A) protilátkám TRA-1, -8 a -10 a (B) TRAIL za přítomnosti fixních koncentrací protilátek podle předkládaného vynálezu dle obr. 4A;
Obr. 5. Exprese DR5 v normální a nádorové tkáni: Homogenizáty normálních a nádorových tkání se sondovaly TRA-8 a vyvíjely se pomocí chemiluminiscence, (a.) Westernová hybridizace DR5 proteinu v normálních tkáních: dráha 1: játra, dráha 2: mozek, dráha 3: plíce, dráha 4: ledviny, dráha 5: slezina, dráha 6: varlata, dráha 7: vaječníky, dráha 8: srdce, dráha 9: pankreas. b. Westernová hybridizace DR5 proteinu v nádorových tkáních. Membrány pro nádorové tkáně obsahovaly nádory vaječníků (dráha 1), plic (dráha 2), jater (dráha 3), rekta (dráha 4), čípku děložního (dráha 5), kůže (dráha 6), varlat (dráha 7), štítné žlázy (dráha 8), dělohy (dráha 10), žaludku (dráha 11), laryngofaryngu (dráha 12) a pankreasu (dráha 13). In sítu imunohistochemické vyšetření normálních lidských tkání (c) a nádorových tkání (d.). Zmrazené řezy byly imunobarveny TRA-8.
Obr. 6. Tumoricidní aktivita TRA-8. SCID myším se podkožně inokulovaly 132INI buňky. Myším se intravenózně podala jedna dávka 100 pg TRA-8 druhý den po naočkování nádoru (a.), nebo se jim podaly tři dávky 100 pg TRA-8 od 7 dne po naočkování nádoru (b). Růst nádoru se stanovil zvážením a histologickým vyšetřením za použití H&E barvení. Fotografie ukazují růst nádorů u kontrolních myší, ale ne u myší léčených TRA-8 (c., horní panel), a H&E barvení nádoru (c., dolní panel). SCID myši se injekčně intravenózně podalo 106 Jurkat-buněk a léčily se
-9CZ 304614 B6 jednou dávkou TRA-8 v den 2 po injekci. O sedm dnů později se odebraly buňky sleziny, nabarvily se protilátkou proti lidskému CD3 a analyzovaly se průtokovou cytometrií (d.), nebo imunohistochemicky (e).
Obr. 7 ukazuje povrchovou expresi DR5 u RA (A) a OA (B) synoviálních buněk, 1 X 106 primárně kultivovaných synoviálních buněk se barvilo afinitně-přečištěným TRA-8 a potom kozí anti-myší IgGl protilátkou konjugovanou na PE. 10000 živých buněk se analyzovalo FACSvantage.
Obr. 8 je série fotografií ukazujících životaschopnost buněk jako funkci TRAIL a TRA-8 indukované apoptosy reprezentativních kmenů RA (A) a OA (B) synoviálních buněk s různými koncentracemi rekombinantního solubilního TRAIL (prázdná kolečka) nebo afinitně-přečištěným TRA-8 (plná kolečka). Životaschopnost buněk je procento cpm ošetřených buněk versus cpm neošetřených buněk.
Obr. 9 je série grafů ukazujících závislost DR5-zprostředkované apoptosy RA synoviálních buněk na caspase. RA synoviální buňky (RA5 12) se inkubovaly s 50 ng/ml solubilního Fas ligandu (prázdné čtverečky), anti-Fas protilátky (CH-11) (plné čtverečky), solubilního TRAIL (prázdná kolečka), nebo anti-DR5 protilátky (TRA-8) (plná kolečka) za přítomnosti různých koncentrací inhibitorů caspas. Po kultivaci přes noc se životaschopnost buněk stanovila pomocí ATPLite.
Obr. 10A je test posunu v elektroforetickém gelu ukazující aktivaci Nfkappa-b. RA1016 buňky se inkubovaly s 20 ng/ml TNF-a, 50 ng/ml solubilního TRAIL nebo 50 ng/ml TRA-8 po uvedenou dobu před tím, než se zpracovaly elektroforézou. Obr. 10B a C jsou grafy ukazující produkci MMP-1 na MMP-3. 1 X 106/ml uvedených RA synoviálních buněk se inkubovalo uvedenými koncentracemi TNF-a (prázdná kolečka), TRAIL (prázdné trojúhelníčky) nebo TRA-8 (plná kolečka). Po kultivaci přes noc se odebraly supematanty kultur. Koncentrace MMP v supematantech kultur se určily ELISA.
Obr. 11. TRA-8 neindikuje hepatocelulámí toxicitu, (a.) Normální jatemí tkáně neexprimují DR5. Parafínové řezy dvou normálních jatemích tkání, jednoho hepatocelulámího karcinomu a cytospinový přípravek HepG2 buněk se připravily pro H&E barvení, a příslušné zmrazené řezy se barvily TRA-8 (b.) analýza průtokovou cytometrií povrchové exprese DR5. Hepatocyty, izolované ze dvou normálních jatemích tkání a z tkáně hepatocelulámího karcinomu a HepG2 buňky se barvily TRA-8, anti-Fas protilátkou (DX2) nebo isotypovou kontrolní protilátkou. Plné histogramy ukazují TRA-8 nebo DX2 barvení, a prázdné histogramy jsou příslušné isotypové kontroly.
Obr. 12. TRAIL, ale ne TRA-8, indukuje hepatocelulámí toxicitu. Čerstvé normální lidské hepatocyty se kultivovaly v Hepatocyte Kultury Medium, (a.) Apoptosa hepatocytů se indukovala 1 pg/ml solubilního TRAIL plus zesíťovací činidlo nebo TRA-8 po uvedenou dobu. Životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite. Výsledky jsou uvedeny jako procento životaschopných buněk ve srovnání kontrolním médiem. Srafované sloupce ukazují TRAIL a plné sloupce ukazují TRA-8. (b.) Kondenzovaná jádra hepatocytů se barvila Hoechst 33352 a analyzovala se průtokovou cytometrií. (c.) Efekt cykloheximidu na apoptosu hepatocytů. Hepatocyty se kultivovaly v kontrolním médiu nebo s 1 pg/ml TRAIL nebo TRA-8 za přítomnosti (plné sloupce) nebo nepřítomnosti (prázdné sloupce) 1 pg/ml cykloheximidu po dobu 8 hodin. Životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite. Výsledky jsou uvedeny jako průměr + SEM pro tři kultury ve dvou pokusech, (d.) Srovnání citlivosti normálních hepatocytů na DR5 a Fas-zprostředkovanou apoptosu. Čerstvě izolované hepatocyty se inkubovaly s uvedenými koncentracemi solubilního TRAIL, TRA-8, solubilního FasL nebo s anti-Fas mAb CH11 po dobu 6 hodin. Životaschopnost buněk se stanovila pomocí ATPLite testu. Výsledky jsou uvedeny jako procento životaschopných buněk ve srovnání s kontrolním médiem. Pro normální hepatocyty jsou uvedeny průměr + SEM pro čtyři normální jedince. Výsledky pro buňky hepato- 10CZ 304614 B6 celulámího karcinomu od jednoho jedince a pro HepG2 buňky jsou uvedeny jako průměr pro tři kultury.
Obr. 13. TRAIL indukuje hepatitidu. B6 myši se intravenózně naočkovaly 109 pfu adenovirového vektoru kódujícího kompletní lidský TRAIL pod kontrolou „Tet-on“ transkripčního elementu. TRAIL exprese se indukovala uvedenými dávkami tetracyklinu. (a.) Northemova hybridizace lidské TRAIL exprese v játrech. 24 hodin po naočkování vektoru a indukci tetracyklinem se celková RNA izolovala z jater a sondovala se lidskou TRAIL cDNA nebo 3-aktinem. (b.) Sérové koncentrace AST. 24 hodin po transdukci TRAIL se určily sérové koncentrace AST. (c.) TRAIL-zprostředkovaná smrt hepatocytů infikovaných adenovirovým vektorem: B6 myši se intravenózně naočkovaly tetracyklinem-indukovatelným adenovirovým vektorem. 48 hodin po naočkování se hepatocyty od naočkovaných a nenaočkovaných kontrolních myší izolovaly a inkubovaly se s uvedenými koncentracemi TRAIL po dobu 8 hodin (levý panel). Životaschopnost hepatocytů se stanovila pomocí ATPLite testu. Myším, naočkovaným adenovirovým vektorem stejně jako výše, se o 48 později intravenózně podalo 10 pg solubilního lidského TRAIL 48 hodin. Sérové koncentrace AST se měřily za 24 hodin po injekci TRAIL (pravý panel), (d. a e.) Histologická analýza jatemího poškození indukovaného TRAIL. Játra se odebrala za 24 hodin (d.) nebo 7 dnů (e.) po transdukci TRAIL. Parafínové řezy se barvily H&E a fotografovaly se při 100X (horní panel) a 400X (dolní panel) zvětšení.
Obr. 14 je série grafů ukazujících, že aktivované T lymfocyty a B lymfocyty přečištěné z lidských PBMC exprimují zvýšené koncentrace DR5, jak bylo zjištěno průtokovou cytometrií pro klidové (prázdné) a aktivované (šrafované) buňky.
Obr. 15 je graf životaschopnosti v závislosti na koncentraci TRA-8 pro přečištěné T lymfocyty aB lymfocyty z obr. 14, které byly stimulovány po dobu 48 hodin s anti-CD3 nebo anti-u, s aktivovanými buňkami a blasty odebranými podle různé density v Ficoll-Paque. Životaschopnost se určila pomocí ATPLite testu.
Obr. 16 je histogram a graf průtokové cytometrie ukazující CD3 expresi v lymfocytámí populaci pro NOD/SCID myši bez NK buněk, kterým byly injekčně podány lidské PBMC a TRA-8 nebo IgG (kontrola).
Obr. 17 ukazuje CD3 a TUNEL barvené buněčné mikrofotografie pro tkáně myší sleziny z příkladu 13.
Obr. 18 ukazuje grafy cytotoxicity pro buňky chronické lymfolytické leukemie (CCL) a normální lidské B lymfocyty za přítomnosti TRA-8, BIS VIII, a jejich kombinace.
Podrobný popis vynálezu
Selhávání deplece buněk je způsobeno defekty systémů indukujících apoptosu, například defekty v expresi nebo funkci ligandu, receptoru nebo intracelulámích regulačních nebo efektorových molekul. Předkládaný vynález poskytuje způsob pro korekci defektních systémů indukce apoptosy, stejně jako způsob pro hodnocení specifických defektů v daných defektních systémech indukce apoptosy.
Předkládaný vynález se týká nové třídy monoklonálních protilátek, které mají selektivní in vivo a in vitro aktivitu indukující apoptosu proti specifickým TRAIL receptorům, včetně DR5, DR4, DcRl a DcR2. Předkládaný vynález je použitelný jako činidlo pro výzkum signalizace při apoptose, stejně jako v terapii při ovlivnění buněk exprimujících TRAIL receptoiy, mezi které patří například různé nádorové buňky a synoviální buňky při autoimunitních onemocněních s dysregulací systémů apoptosy a abnormální proliferací. Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou specifické ve vazbě na určité typy TRAIL receptorů navzdory homologii mezi těmito
-11 CZ 304614 B6 protilátkami. Protilátky podle předkládaného vynálezu by měly indukovat apoptosu pouze buněk exprimujících cílový TRAIL receptor, nebo alternativně, měly by blokovat TRAIL apoptosu buněk exprimujících cílový receptor.
Anti-DR5 monoklonální protilátky podle předkládaného vynálezu slouží jako účinný induktor apoptosy buněk exprimujících DR5 in vitro a jako účinný induktor apoptosy in vivo. Humanizované fragmentámí CDR sekvence přenesené na humanizované protilátkové skelety a fuzní protein anti-DR5 protilátek podle předkládaného vynálezu vykazují podobné apoptotické vlastnosti.
Dosud nejsou dostupné žádné monoklonální protilátky, které by se vázaly na povrchové DR5 a indukovaly apoptosu buněk exprimujících DR5 in vitro a in vivo za nepřítomnosti zesíťovacího činidla. Předkládaný vynález zahrnuje anti-DR5 protilátky účinné jako terapeutické činidlo ve zvířecích modelech onemocnění, jako jsou zvířata s xenotransplantáty, nebo in vivo. Ačkoliv byl solubilní TRAIL prokázán jako účinný v indukci apoptosy nádorových buněk in vivo, byla apoptotická aktivita velmi nízká a bylo nutné opakované podání vysokých dávek (13). TRA-8, jedna ze série anti-DR5 protilátek podle předkládaného vynálezu, je farmaceuticky účinná u zvířat nesoucích lidský DR5 transgen a také je použitelná při přípravě modelu pro výzkum úlohy DR5 a TRAIL.
Protilátka podle předkládaného vynálezu namířená proti TRAIL receptoru je v předkládaném vynálezu získána z pokusného zvířete. Humanizací protilátky podle předkládaného vynálezu s cílem zachování vazebné aktivity pro receptor za snížení imunitní reakce u člověka se získá humanizovaná protilátka proti TRAIL receptoru použitelná jako terapeutické agonistické nebo antagonistické činidlo pro daný TRAIL receptor. Protilátka podle předkládaného vynálezu je použitelná jako in vivo terapeutické činidlo, protože není nutné sekundární zesítění anti-TRAIL receptorové protilátky.
Předkládaný vynález není omezen na jedinou anti-TRAIL receptorovou protilátku mající agonistický nebo antagonistický apoptotický účinek. Místo toho se použijí dvě nebo více anti-TRAIL receptorových protilátek, které se aplikují do buněčné kultury in vitro nebo do jedince in vivo pro dosažení synergního účinku. Například, gliomová buněčná linie U87 a hematopoetické buněčné linie U937 a Molt-4 reagují na synergní aplikaci agonistických anti-DR4 a anti-DR5 protilátek, zatímco agonistická anti-DR5 protilátka samostatně má pouze omezený efekt v indukci apoptosy.
Dále, antagonistické anti-TRAIL receptorové protilátky hlavní význam v předkládaném vynálezu tehdy, když se protilátka specificky váže na falešné receptory DcRl, DcR2 nebo OPG. Selektivní blokování falešných receptorů protilátkou podle předkládaného vynálezu má vliv na buňky exprimující falešné receptory tím, že posouvá vazebnou rovnováhu TRAIL směrem ke TRAIL receptorům schopným přenosu apoptotického signálu. Tak v jiné kombinované terapii podle předkládaného vynálezu protilátky vážící se na falešné receptory sensitizují exprimující buňky na agonistický apoptotický signál vzešlý z vazby na TRAIL receptor.
V jiném provedení poskytuje předkládaný vynález způsob pro hodnocení agonistických a antagonistických epitopů daného TRAIL receptoru. Dále, polymorfismy mezi jedinci asociované s daným TRAIL receptorem mohou být hodnoceny podle předkládaného vynálezu za použití panelu monoklonálních protilátek majících různý variabilní nebo CDR region. Charakteristický panel monoklonálních protilátek poskytuje možnost definování agonistických a antagonistických epitopů a polymorfismů. Proto je panel monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu použitelný při vyhledávání léků a/nebo při testování jedinců na rizikovost vzniku onemocnění.
Ještě další provedení předkládaného vynálezu zahrnuje fúzní proteiny obsahující antigenní fragment TRAIL receptoru navázaný na imunoglobulinový protein, polypeptid nebo jeho fragment. Fragment TRAIL receptoru je definován jako fragment obsahující dostatečný počet bází pro
- 12CZ 304614 B6 vyvolání imunogenní reakce k přirozenému TRAIL receptoru exprimovanému na povrchu buněk jedince. Fragment TRAIL receptoru obsahuje alespoň deset aminokyselin. Imunoglobulinový fúzní protein nebo jeho fragment je zde definován jako fragment obsahující přirozený nebo syntetický proteinový nebo polypeptidový segment obsahující dostatečný počet aminokyselinových bází pro aktivaci imunogenní kaskády u jedince. Imunogen podle předkládaného vynálezu obsahující fúzi fragmentu TRAIL receptoru a imunoglobulinového fragmentu je použitelný při terapii in vivo pro indukci protilátek proti TRAIL receptoru u jedince in šitu.
V ještě dalším provedení je předkládaný vynález použitelný jako genová terapie. V genové terapii podle předkládaného vynálezu jsou cílové buňky transfektované vektorem s expresibilní sekvencí odpovídající TRAIL receptoru. Vektorem je běžný vektor a je vybrán podle citlivosti cílových buněk na vektor. Mezi příklady vektorů pro genovou terapii patří adenovirový vektor, pAdCMV5. Po cíleném podání do buněk nebo tkání exprimujících transfektovaný TRAIL receptor jsou buňky vystaveny protilátce podle předkládaného vynálezu specifické pro vazbu na transfektovaný TRAIL receptor. Předpokládá se, že anti-TRAIL receptorové protilátky jsou buď agonistické, nebo antagonistické, podle požadovaného terapeutického efektu.
Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné společně se senzibilizačním činidlem. Senzibilizátor je zde definován jako jakýkoliv stimul, který indukuje apoptosu, včetně ultrafialového záření, organických molekul, specificky z třídy bisindolmaleimidů, těžkých kovů a volných radikálů.
V kontextu s terapií malignit je TRA-8 schopna indukovat apoptosu většiny TRAIL-senzitivních nádorových buněk cestou závislou na caspasách za nepřítomnosti sekundárního zesítění. TRA-8 vykazuje silnou tumoricidní aktivitu in vivo. Schopnost TRA-8 indukovat apoptosu většiny TRAIL-senzitivních buněk potvrzuje, že DR5 samostatně je dostatečný pro spuštění apoptosy. Většina zde popsaných nádorových buněk exprimuje na svém povrchu DR5 a jejich citlivost na TRA-8 indukovanou apoptosu je paralelní s jejich citlivostí naTRAIL, což naznačuje, že DR5 je primární death receptor pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu ve většině nádorových buněk. Proto odlišná exprese DR5 v normálních a nádorových buňkách způsobuje selektivitu TRAILzprostředkované apoptosy. TRA-8 obchází falešné receptory za indukce TRAIL-zprostředkované apoptosy. Pouze menšina TRAIL resistentních nádorových buněk je senzitivní na TRA-8, což naznačuje, že falešné receptory nemají hlavní úlohu v resistenci nádorových buněk na TRAILzprostředkovanou apoptosu.
Ačkoliv dřívější pokusy ukázaly, že systémové podání solubilní formy TRAIL u zvířat indukuje regresi nádorů bez toxicity (3, 4, 22), membránová forma lidského TRAIL indukuje jatemí toxicitu u myší, jak je zde dokázáno. Nicméně, hepatální toxicita TRAIL je mnohem nižší než hepatální toxicita Fas ligandů, jak je demonstrováno nižší citlivostí normálních hepatocytů na TRAIL-indukované poškození ve srovnání s Fas ligandem a chyběním letality TRAIL in vivo. Proto je titrace TRAIL použitelná v protinádorové terapii.
Jakje zde popsáno, nepřítomnost významnější úrovně exprese DR5 proteinu v normálních hepatocytech je asociovaná s resistenci hepatocytů na TRA-8 indukovanou apoptosu. Zesítění DR5 pomocí monoklonální protilátky je nedostačující pro organizování homopolymemích forem death receptorů schopných spouštět apoptosu. Experimenty na kosmanech neukázaly žádnou hepatální toxicitu po podání TRA-8. Proto je agonistická monoklonální anti-DR5 protilátka pravděpodobně více selektivní a bezpečnější jako terapeutické činidlo než solubilní TRAIL.
Jako skríningový test je předkládaný vynález vhodný pro detekci malých ložisek maligních buněk, které mohou stále ještě mít normální morfologii. Barvení řezů lidských nádorových buněk, včetně karcinomu plic, prostaty a jater, značenou protilátkou podle předkládaného vynálezu, snadno identifikuje nádorové buňky. Bylo zjištěno, že tyto nádorové buňky exprimují velmi vysoké množství DR5 ve srovnání s normálními buňkami stejného typu. Tak je předkládaný vynález použitelný jako citlivá vyšetřovací metoda pro vyhledávání časných stadií maligních
- 13CZ 304614 B6 nádorů ve tkáních, včetně alespoň plic, prostaty a jater. Vynález popisuje terapeutický způsob pro inhibici abnormální buněčné proliferace spojené s nemoci, jako jsou některé nádory a lymfatické leukemie.
Předkládaný vynález je popsán podrobně zejména na anti-lidské DR5 monoklonální protilátce označené jako TRA-8, mající ATCC přírůstkové č. PTA-1428. Předpokládá se, že techniky a výsledky popsané pro agonistickou monoklonální protilátku proti lidskému DR5 označenou jako TRA-8 jsou aplikovatelné antagonistické DR5 protilátky, stejně jako na protilátky namířené proti DR4, DcRl a DcR2, působící agonisticky a antagonisticky.
Úroveň exprese apoptotických receptorů, jako je Fas, nekoreluje nutně s citlivostí buněk na apoptosu. Pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu se předpokládá, že exprese falešných receptorů pro TRAIL ovlivňuje citlivost buněk. Dále, předpokládá se, že DR5 musí být pro asociován s DR4 pro účinný přenos apoptotického signálu přes FADD a caspasu 8. Dostupnost agonistické monoklonální anti-DR5 protilátky umožňuje hodnocení regulace DR5 signalizace a její relativní úlohy v TRAIL-zprostředkované apoptose. Srovnání citlivosti buněk na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu sjejich citlivostí na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu umožňuje výzkum úlohy DR5 ve TRAIL-zprostředkované apoptose a mechanismů, které mohou ovlivňovat citlivost buněk.
Tato výhoda obecně platí pro humanizované anti-DR5 protilátky podle předkládaného vynálezu. Molekulární klon protilátka k DR-5 se připravil známými technikami, jak je podrobně popsáno v následujících příkladech. Rekombinantní DNA techniky (33) se použily pro přípravu konstruktu sekvence nukleové kyseliny kódující molekulu monoklonální protilátky nebo jejího regionu pro vazbu antigenu.
Předkládaný vynález umožňuje konstrukci humanizovaných anti-tratil receptorových protilátek, u kterých je nepravděpodobné, že by indukovaly lidské anti-myší protilátky (zde dále označované jako „HAMA“) (34), za zachování efektorových funkcí protilátky. Termín „lidské“ a „humanizované“, v souvislosti s protilátkami, označují jakékoliv protilátky, u u kteiých se předpokládá, že budou indukovat terapeuticky tolerovatelnou slabou imunogenní reakci u člověka.
Předkládaný vynález poskytuje anti-DR5 protilátky, humanizované anti-DR5 protilátky, těžké a lehké řetězce TRA-8 imunoglobulinů a humanizované těžké a lehké řetězce imunoglobulinů. Některé zkrácení těchto proteinů nebo genů je provedeno za účelem získání regulačních nebo enzymatických funkcí pro kompletní sekvenci proteinu nebo genu. Například, kódující sekvence nukleové kyseliny může být pozměněna substitucemi, adicemi, delecemi nebo multimemí expresí, za zisku funkčně ekvivalentních proteinů nebo genů. V důsledku degenerace kódujících sekvencí nukleové kyseliny mohou být v předkládaném vynálezu použity jiné sekvence, které kódují v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, jako jsou sekvence přirozených proteinů. Sem patří, například, sekvence nukleové kyseliny obsahující celou nebo část sekvence nukleové kyseliny kódující výše uvedení polypeptidy, které jsou pozměněny substitucemi různých kodonů, které kódují funkčně ekvivalentní aminokyselinové zbytky v sekvenci, čímž je dosaženo silentní změny. Předpokládá se, že nukleotidová sekvence imunoglobulinu podle předkládaného vynálezu toleruje variace v homologii sekvence až do 25 %, jak se vypočte za použití standardních způsobů („Current Methods in Sequence Comparison and Analysis“ Macromolecule Sekvenováním and Syntézy, Selected Methods and Applications, str. 127-149, 1998, Alan R. Liss, lne.), pokud taková varianta vytváří protilátky, které rozpoznávají TRAIL receptor DR5. Například, jeden nebo více aminokyselinových zbytků v polypeptidové sekvenci může být substituován jiným aminokyselinovým zbytkem s podobnou polaritou, který účinkuje jako funkční ekvivalent, což vede k silentní alteraci. Substituce v aminokyselinách v sekvenci mohou být vybrány z jiných členů ve skupinách, kam daná aminokyselina náleží. Například, mezi nepolární (hydrofobní) aminokyseliny patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. Mezi polární neutrální aminokyseliny patří glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin
- 14CZ 304614 B6 a glutamin. Mezi aminokyseliny s pozitivním nábojem (bazické) patří árginin, lysin a histidin. Mezi aminokyseliny s negativním nábojem (acidické) patří kyselina asparagová a kyselina glutamová. Předkládaný vynález také zahrnuje proteiny nebo jejich fragmenty nebo deriváty, které jsou odlišně modifikovány během nebo po translaci, například glykosylaci, proteolytickým štěpením, vazbou na protilátkovou molekulu nebo jiné buněčné ligandy, atd. Dále, rekombinantní vektor kódující sekvenci nukleové kyseliny anti-DR5 protilátky podle předkládaného vynálezu může být upraven tak, aby bylo modifikováno zpracování nebo exprese vektoru.
Dále, sekvence nukleové kyseliny kódující inhibitor může být mutována in vitro nebo in vivo pro vytvoření a/nebo narušení translace, iniciace, a/nebo terminace sekvence nebo pro vytvoření variací v kódujících regionech a/nebo pro vytvoření nových míst pro restrikční endonukleasy nebo pro zničení existujících míst, pro usnadnění dalších modifikací in vitro. Mohou být použity techniky pro mutagenesi známé v oboru, včetně in vitro místně cílené mutagenese, J. Biol. Chem. 253:6551, za použití Tab linkerů (Pharmacia), a podobně.
Data z rentgenové krystalografie ukazují, že protilátky se skládají do forem s dlouhou cylindrickou strukturou složenou ze dvou vrstev antiparalelních b—listů, který se každá skládá ze tří nebo čtyř b-řetězců. Ve variabilních regionech tvoří tři smyčky z každé V domény H a L řetězce dohromady vazebné místo pro antigen. Každá z těchto smyček se označuje jako region určující komplementaritu (CDR). CDR mají nejvyšší variabilitu v aminokyselinové sekvenci z protilátky. Části variabilního regionu, které nejsou částí CDR, se označují jako „pracovní regiony“ („FR“ regiony) a podílí se na zachování struktury CDR. Výhodně jsou všechny CDR z dané protilátky přeneseny na akceptorovou protilátku, pro zachování vazebného regionu pro epitop TRAIL receptoru. Předpokládá se, že přenesení části celkového počtu CDR do donoru je účinné. Je třeba si uvědomit, že přenesení znamená nahrazení, zbytku za zbytek, jedné aminokyseliny nebo regionu za jiný. Nicméně, příležitostně, zejména při přenášení regionu, může být jeden nebo více zbytků přidáno nebo vynecháno nebo substituováno, a takové delece a inserce, stejně jako vhodná náhrady a inverze, jsou v oboru známé.
Protilátka podle předkládaného vynálezu se získá, například, přenesením každého CDR L řetězce a H řetězce monoklonální protilátky proti TRAIL receptoru na příslušný CDR region lidské protilátky, čím se dosáhne humanizace myší monoklonální protilátky účinné proti TRAIL-receptoru.
Protilátkově fragmenty, které obsahují idiotyp molekuly, se také získají a použijí za použití známých technik. Například takové fragmenty obsahují anti-TRAIL receptorový (AB)2 fragment, který může být získán trávením molekuly protilátky pepsinem, AB' fragmenty protilátky proti TRAIL receptoru připravené redukcí disulfidových můstků fragmentu (AB')2 proti TRAIL receptor, a protilátkově fragmenty získané zpracováním protilátky papainem a redukčním činidlem.
Konkrétně, anti-DR5 monoklonální protilátka TRA-8 může být získána kultivací hybridomu, který může být získán imunizací myši lidským DR5 a následným fúzováním buněk sleziny nebo buněk lymfatické uzliny myši s myšími myelomovými buňkami.
Příprava monoklonální protilátky ilustrativně zahrnuje následující kroky:
a) přečištění biomakromolekuly pro použití jako antigen;
b) přípravu buněk produkujících protilátky, nejprve imunizací zvířat injekcí antigenů, potom odběrem krve od zvířete a testováním titru protilátek, pro určení doby odběru sleziny;
c) přípravu myelomových buněk;
d) fúzováním buněk produkujících protilátky a myelomových buněk;
-15CZ 304614 B6
e) selekci hybridomu produkujícího požadované protilátky;
f) přípravu jediného buněčného klonu (klonování);
g) volitelně kultivaci hybridomových buněk, nebo chov zvířat, kterým byly hybridomové buňky transplantovány, pro velkoobjemovou přípravu monoklonální protilátky; a
h) testování biologických aktivit a specificity, nebo testování vlastností jako markerového činidla, pro takto získanou monoklonální protilátku.
Postup přípravy anti-DR5 monoklonální protilátky je podrobně popsán dále s odkazem na výše uvedené kroky. Způsob přípravy protilátky podle předkládaného vynálezu je pouze ilustrativní a není limitující pro předkládaný vynález. Mohou být použity jiné postupy nebo modifikace způsobu, například za použití buněk produkujících protilátky jiných než jsou buňky sleziny a myelomu.
(a) Příprava antigenů
Rekombinantní protein (dále „rekombinantní lidský DR5“), účinný jako antigen se získá transfekcí QBI-293A buněk expresním vektorem pAdDR5-lgG pro fuzní protein obsahující extracelulámí doménu lidského DR5 a Fc region lidské IgGl protilátky (dále „IgG“), (cf. PTA-1428) a tento se exprimuje za použití ADENO-Quest kitu (Quantum Biotechnologies lne., Canada), a odběrem částečně přečištěného produktu exprese. Plasmid pAdDR5-IgG se konstruuje insercí DNA kódující lidský DR5 a lidský IgG fuzní protein do pAdCMV5, což je expresní vektor pro zvířecí buňky. Jiné materiály, jako je DNA kódující DR5, vektor, a hostitel, mohou být také použity.
Lidský DR5 a IgG fúzní protein produkovaný v supematantu kultury QBI-293A buněk transfektovaných vektorem pAdDR5-lgG může být částečně přečištěn ProteinA-Sepharosovou afinitní chromatografií nebo ProteinG-Sepharosovou afinitní chromatografií, nebo iontoměničovou chromatografií za použití Resource Q kolony (obchodní název; Pharmacia).
Alternativně se jako antigen použije přečištěný DR5 získaný z buněčných membrán lidské buněčné linie. Dále, protože primární struktura DR5 je známá (cf. PTA-1428), může být peptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No. 1 syntetizován chemicky za použití známých způsobů, jako je Sangerův způsob, a může být potom použit jako antigen.
(b) Příprava buněk produkuj ících protilátky
Myš se imunizuje imunogenem získaným v kroku (a), ve směsi s adjuvans, jako je Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans nebo kamenec. Mezi vhodná pokusná zvířata patří, například krysy, morčata, králíci, psi, kuřata, koně, prasata, krávy a ovce.
Mezi vhodné způsoby podání pro imunizaci pokusných zvířat patří subkutánní, intraperitoneální, intravenózní, intradermální a intramuskulámí injekce, kdy výhodné jsou subkutánní a intraperitoneální injekce.
Imunizace jsou výhodně provedeny podáním jedné dávky, nebo se podá několik dávek ve vhodných intervalech (výhodně 1 až 5 týdnů). Imunizovaná zvířata se sledují na titry protilátky v séru a zvíře s dostatečně vysokým titrem protilátek se vybere jako zdroj buněk produkujících protilátky. Výběr zvířete se vysokým titrem vede ke zvýšení účinnosti dalšího procesu. Buňky pro následnou fúzi se obvykle odeberou od zvířete 3 až 5 dnů po poslední imunizaci.
-16CZ 304614 B6
Způsoby pro testování protilátkových titrů zahrnují různé známé techniky, jako je radioimunotest (dále RIA), enzymový imunotest na pevné fázi (zde dále „ELISA“), fluorescentní protilátkový test a pasivní hemaglutinační test, kde RIA a ELISA jsou výhodné z důvodu senzitivity detekce, rychlosti a možnosti automatizace.
Stanovení protilátkových titrů může být provedeno, například ELISA, následujícím způsobem. Nejprve se přečištěná nebo částečně přečištěná DR5 adsorbuje na povrch pevné fáze, jako je 96-jamková ELISA plotna, potom se provede blokování jakéhokoliv zbývajícího povrchu, na který se DR5 nenavázal, proteinem nepříbuzným s antigenem, jako je hovězí sérový albumin (BSA). Po promytí se povrchy buněk kontaktují se sériově ředěnými vzorky myšího séra pro umožnění vazby anti-DRS protilátky ve vzorcích na antigen. Enzymem značená, anti-myší protilátka, jako sekundární protilátka, se přidá pro navázání na myší protilátku. Po promytí se přidá substrát po enzym a titr protilátky se hodnotí stanovením změny absorbance v důsledku vývoje barvy způsobeného alterací substrátu.
(c) Příprava myelomových buněk
Buňky ze zavedených myších buněčných linií slouží jako zdroj myelomových buněk, včetně například myší resistentních na 8-azaguanin, odvozených od BALB/c myelomových kmenů P3X63Ag8U.l (P3-U1) (35), P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1) (36), Sp2/0-Agl4 (SP-2) (37), P3X63Ag8.653 (653) (38) a P3X63Ag8 (X63) (39). Vybraná buněčná linie se sériově přenese do vhodného média, jako je 8-azaguaninové médium. 8-azaguaninové médium obsahuje Iscovem modifikované Dubleccovo médium (zde dále označované jako „IMDM“) nebo Dulbeccovo modifikované Eagle médium (zde dále označované jako „DMEM“), RPMI-1640 médium doplněné glutaminem, 2-merkaptoethanolem, gentamicinem, fetálním telecím sérem (zde dále označované jako „FCS“), a 8-azaguaninem. Buňky se potom přenesou do normálního média, jako je ASF 104 médium (Ajinomoto, K. K.) obsahující 10% FCS, 3 až 4 dnů před fúzí, pro zajištění toho, aby v den fúze bylo přítomno alespoň 2 x 107 buněk.
(d) Fúze buněk
Lymfocyty a plasmatické buňky získané z jakékoliv vhodné části zvířat jsou prekurzorové buňky pro produkci protilátky. Mezi ilustrativní zdroje lymfocytů nebo plasmatických buněk patří slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo jakákoliv vhodná kombinace těchto zdrojů, kde buňky sleziny jsou nejběžnějším zdrojem.
Po poslední dosycovací injekci se tkáň, ve které jsou přítomny buňky produkující protilátky, odstraní od myší majících předem určený titr protilátek. V současnosti doporučovaná technika pro fúzi buněk sleziny a myelomových buněk připravených v kroku c) využívá polyethylenglykol.
Technika fuze zahrnuje promytí slezinných a myelomových buněk bezsérovým médiem (jako je RPMI 1640) nebo fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (zde dále označovaným jako „PBS“) tak, že poměr počtu buněk sleziny kmyelomovým buňkám je přibližně mezi 5:1 a 10:1, a potom odstředění. Po odstranění supematantu a dostatečném rozvolnění peletovaných buněk se po kapkách za míšení přidá 1 ml bezsérového média obsahujícího 50 % (hmotn./obj.) polyethylenglykolu (molekulová hmotnost 1000 až 4000). Potom se pomalu přidá 10 ml bezsérového média a provede se odstředění. Supematant se opět odstraní a peleto váné buňky se suspendují ve vhodném množství HAT média obsahujícího roztok hypoxantinu, aminopterinu a thymidinu (zde dále označované jako „HAT“) a myší interleukin-2 (zde dále označovaný jako „IL-2“). Suspenze se potom rozdělí do jamek kultivačních ploten (též jednoduše „ploten“) a provede se inkubace za přítomnosti 5 % obj ./obj. CO2 při 37 °C po dobu přibližně 2 týdnů, s přidáváním HAT média podle potřeby.
- 17CZ 304614 B6 (e) Selekce hybridomů
Když je použitý myelomový kmen rezistentní na 8-azaguanin, tj., je deficitní v enzymu hypoxanthin-guanin-fosforibosyltransferase (HGPRT), jsou jakékoliv nefúzované myelomové buňky a jakékoliv myelom-myelom fúze nemohou přežívat v HAT médiu. Na druhé straně, vzájemné fúze buněk produkujících protilátky, stejně jako hybridomy buněk produkujících protilátky s myelomovými buňkami přežívat mohou, s tím, že poslední uvedené mají pouze omezenou dobu života. Proto pokračující inkubace v HAT médiu vede k selekci pouze požadovaných hybridomů.
Získané hybridomy se kultivují do kolonií, které se potom přenesou do HAT média bez aminopterinu (HI médium). Potom se odeberou podíly supematantu kultury pro určení titru anti-Fas protilátky, například pomocí ELISA. Když se výše uvedený fúzní protein použije jako ELISA antigen, je také nutné eliminovat klony produkující protilátku, která se specificky váže na Fc region lidského IgGl. Přítomnost nebo nepřítomnost takového klonu může být potvrzena například ELISA za použití Fas-IgGl nebo IgGl jako antigenů.
(f) Klonování
Hybridomy, u kterých byla prokázána produkce specifických protilátek, za použití způsobu podobného způsobu použitému v kroku b) pro stanovení titru protilátek, se potom přenesou na jinou plotnu pro klonování. Vhodné způsoby klonování zahrnují: techniku limitního ředění, ve které jsou hybridomy naředěny na jednu buňku na jamku plotny, a potom se provede kultivace; techniky měkkého agaru, ve které jsou kolonie získány po kultivaci v měkkém agaru; a působ využívající mikromanipulátoru pro separaci jednotlivých buněk pro kultivaci; a techniku „roztřiď a klonuj“, ve které jsou jednotlivé buňky separovány třídičem buněk.
Postup klonování pro, například, limitní ředění se opakuje 2 až 4krát pro každou jamku za určování titru protilátky a klony mající stabilní protilátkové titry se selektují jako hybridomy produkující anti-DR5 monoklonální protilátky. Hybridomy produkující anti-myší DR5 protilátky se selektují podobným způsobem za zisku buněčné linie produkující anti-DR5 monoklonální protilátky.
Myší-myší hybridom TRA-8, který je základem pro protilátky podle předkládaného vynálezu, byl uložen v American Type Culture Collection 1.3.2000, a má přírůstkové č. PTA-1428. Proto při přípravě protilátky za použití myšího-myšího hybridomu TRA-8 nebo jakéhokoliv již připraveného hybridomu lze použít postupu začínajícího od kroku (g), s vynecháním kroků (a) až (f).
(g) Kultivace hybridomu pro přípravu monoklonální protilátky
Hybridom získaný klonováním se potom kultivuje v normálním médiu, ne v HT médiu. Velkoobjemová kultura se připraví v kultivaci v otočném válci, za použití velkoobjemových nádob, nebo kultivací za odstřeďování. Potom se získá supematant z velkoobjemové kultury a ten se přečistí vhodným způsobem, jako je gelová filtrace, která je dobře známá odborníkům v oboru, za zisku anti-DR5 monoklonální protilátky, která je základem pro protilátky podle předkládaného vynálezu. Hybridom může být také kultivován intraperitoneálně v syngenních myších, jako jsou BALB/c myši nebo flu/flu myši, pro získání ascitu obsahujícího anti-DR5 monoklonální protilátky ve velkých množstvích. Komerčně dostupné kity pro přečištění monoklonálních protilátek (například, MAbTrap GII Kit; Pharmacia) se použijí pro přečištění získaných protilátek.
Monoklonální protilátky připravené výše uvedeným způsobem mají vysokou specificitu pro lidské DR5.
-18CZ 304614 B6 (h) Test pro monoklonální protilátky
Vhodné způsoby identifikace isotypu a podtřídy monoklonální protilátky zahrnují Ouchterlonyho metodu, ELISA a RIA. Výhodně se pro identifikaci použije komerční kit, jako je Mouše Typer Kit (obchodní název; BioRad).
Kvantifikace proteinu může být provedena za použití Folin-Lowryho způsobu, nebo výpočtem podle absorbance při 280 nm (1,4 (OD2go)= imunoglobulin 1 mg/ml).
Identifikace epitopu rozpoznávaného monoklonální protilátkou se provede následujícím způsobbem. Nejprve se připraví různé částečné struktury molekuly, kterou monoklonální protilátka rozpoznává. Částečné struktury se připraví způsobem, při kterém jsou různé částečné peptidy molekuly připraveny synteticky technikou oligopeptidové syntézy, nebo způsobem, ve kterém je DNA kódující požadovaný částečný polypeptid inkorporována do vhodného expresního plasmidu aje exprimována ve vhodném hostiteli, jako je E. coli, za produkce peptidů. Oba způsoby mohou být použity v kombinaci. Například mohou být známými technikami genového inženýrství připraveny série polypeptidů s vhodně redukovanou délkou, od C- nebo N-konce antigenního proteinu. Stanovením toho, které fragmenty reagují s protilátkou se získá přibližná představa o místě epitopu.
Epitop se přesněji identifikuje syntézou různých menších oligopeptidů nebo mutantních peptidů za použití techniky oligopeptidové syntézy pro určení vazebných vlastností peptidů vzhledem k anti-DR5 monoklonální protilátce, která je základem pro přípravu protilátek podle předkládaného vynálezu a kompetitivní inhibice vazby peptidů na antigen monoklonální protilátkou. Komerčně dostupné kity, jako je SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, Inc.) a série multihrotových kitů pro peptidovou syntézu založenou na technice multihrotové syntézy (Chiron Corp.) mohou být použity pro získání větších množství oligopeptidů.
Protilátka podle předkládaného vynálezu má různé funkční vlastnosti a) až f) popsané dále, které byly potvrzeny způsoby popsanými dále.
a) Specifická vazba TRA-8 na buňky exprimující lidské DR5.
Jedinečným rysem protilátek podle předkládaného vynálezu je schopnost vazby na buněčné povrchové DR5. Tato vlastnost je prokázána analýzou buněk exprimujících DR5 pomocí průtokové cytometrie. Nejprve se specifická vazba na DR5 na povrchu buněk potvrdí pomocí COS-7 buněk transfektovaných kompletní cDNA kódující lidské DR5. Přesněji, TRA-8 pouze rozpoznává COS-7 buňky transfektované DR5, ale ne prázdným kontrolním vektorem nebo vektorem kódujícím DR4. Za druhé se testují tři různé druhy lidských maligních nádorových buněk: hematopoetické, gliomové a karcinomu prostaty. Většina těchto transformovaných nádorových buněk exprimuje významné koncentrace DR5 na svém povrchu, ačkoliv se exprese značně liší. Za třetí se testují dva panely lidských primárních synoviálních fibroblastů od pacientů s RA a OA. Všechny RA synoviální buňky exprimují významně vyšší množství DR5 ve srovnání s O A buňkami.
b) Indukce apoptosy lidských maligních nádorových buněk in vitro za nepřítomnosti zesítění.
Schopnost protilátek podle předkládaného vynálezu rozpoznávat TRAIL receptor a přímo indukovat apoptosu maligních lidských nádorových buněk se určí testem životaschopnosti buněk (ATPLite) během in vitro kultivaci buněk s různými koncentracemi protilátky, zejména TRA-8. Většina nádorových buněk je citlivá na TRA-8 indulovanou apoptosu. Pro některé buňky vykazuje TRA-8 silnou proapoptotickou aktivitu, například je TRA-8 schopen indukovat apoptosu lidských Jurkat buněk v koncentracích v řádu pg/ml. Významné je to, že TRA-8 indukovaná apoptosa nevyžaduje zesítění, a u většiny buněk má TRA-8 silnější proapoptotickou aktivitu než rekombinantní solubilní TRAIL za přítomnosti zesilovače.
- 19CZ 304614 B6
c) Tumoricidní aktivita TRA-8 in vivo.
Tumoricidní aktivita TRA-8 se hodnotí ve dvou modelech SCID/lidské nádorové buňky. Za prvé, SCID myším se intravenózně naočkovaly lidské leukemické Jurkat buňky a aplikovala se jediná dávka (100 pg) TRA-8. Výsledky ukazují, že většina implantovaných Jurkat buněk byla eliminována z periferní krve a sleziny díky aplikaci TRA-8, jak bylo určeno analýzou průtokovou cytometrií a in sítu imunohistochemickým barvením Jurkat buněk. Za druhé, lidské astrocytomové buňky 1321N1 se podkožně naočkovaly SCID myši a myši s nádory se léčily jednou dávkou TRA-8. Růst implantovaných 132INI buněk je významně inhibován u myší léčených TRA-8, jak bylo určeno podle velikosti nádorů histologickou analýzou.
d) Identifikace RA synoviálních buněk pomocí TRA-8
Primární synoviální buňky izolované od 8 pacientů s RA a 4 s OA se testovaly na povrchovou expresi DR5. TRA-8 je schopna pozitivně barvit všechny RA buňky, ale nebarví OA buňky. Tak se RA odliší od OA podle povrchové exprese DR5, která se detekuje TRA-8.
e) Indukce apoptosy u RA synoviálních fibroblastů pomocí TRA-8
Schopnost TRA-8 indukovat apoptosu RA synoviálních buněk se určí testem životaschopnosti buněk během in vitro kultivace kultury za přítomnosti různých koncentrací TRA-8. Všechny RA buňky mají vysokou až střední úroveň citlivosti na 100 ng/ml TRA-8. Naopak, všechny O A buňky jsou v podstatě resistentní na apoptosu indukovanou TRA-8. Významné je, že TRA-8 vykazuje lepší proapoptotickou aktivitu u RA synoviálních buněk než solubilní TRAIL se zesilovacím činidlem. Dále, ve srovnání s anti-Fas protilátkou (CH-11) vykazuje TRA-8 lepší selektivitu pro RA synoviální buňky.
f) TRA-8 neindukuje produkci MMP v RA synoviálních buňkách
Protože je TRA-8 schopen indukovat aktivaci NF-kappab v RA synoviálních buňkách, stejně jako TNF-alfa, určil se vliv TRA-8 na produkci MMP1 a MMP3 synoviálními buňkami. Zatímco TNF-alfa indukuje zvýšení MMP závislé na dávce, je TRA-8 neschopen indukovat jakoukoliv produkci NMP, a v určitých koncentracích TRA-8 mírně snižuje produkci NMP v RA synoviálních buňkách.
g) TRA-8 indukuje aktivaci více caspas
Protože mají caspasy zásadní roli v indukci apoptosy, určovala se schopnost TRA-8 indukovat aktivaci caspas na lidských Jurkat buňkách. Když se Jurkat buňky inkubovaly s nízkou dávkou (50 ng/ml) TRA-8, tak se aktivace caspasy 8, caspasy 9 a caspasy 3 pozorovala již za 15 minut po inkubaci, jak bylo prokázáno Westernovou hybridizaci a analýzou štěpení caspas. Ve smyslu doby, množství a účinnosti v aktivaci caspas mají protilátky podle předkládaného vynálezu, včetně protilátky TRA-8, mnohem lepší aktivitu než jakékoliv jiné známé proapoptotické protilátky, jako je protilátka proti lidskému Fas (CH-11).
Proto je protilátka podle předkládaného vynálezu substance mající schopnost selektivně indukovat apoptosu patogenních buněk, jak je ukázáno v efektech (a) a (g). Proto je protilátka podle předkládaného vynálezu použitelná jako profylaktické a terapeutické činidlo pro léčbu onemocnění asociovaných s neadekvátním přežíváním buněk nebo nevhodnou proliferaci buněk, které souvisí s dysregulací systémů indukujících apoptosu, včetně Fas/Fas ligand systémů.
Schopnost protilátky podle předkládaného vynálezu indukovat apoptosu je potvrzena kultivací buněk, jako je buněčná linie lidské leukemie Jurkat (American Type Culture ě. TIB-152) a astro-20CZ 304614 B6 cytomová buněčná linie 132INI v médiu, do kterého se přidá testovaný vzorek, a určením přežívání buněk, například za použití ATPLite testu.
Protilátky podle předkládaného vynálezu, zejména anti-DR5 protilátky mající téměř stejnou imunogenicitu pro člověka jako lidské protilátky, se použijí jako činidla pro profylaxi nebo léčbu onemocnění asociovaných s nevhodným přežíváním nebo proliferaci buněk, včetně onemocnění spojených s dysregulací systémů indukujících apoptosu u autoimunních onemocnění, jako je systémový lupus erythematosus, Hashimotova nemoc, revmatoidní arthritis, reakce štěpu proti hostitely, Sjogrenův syndrom, pemiciosní anemie, Addisonova nemoc, sclerodermie, Goodpasterův syndrom, Crohnova nemoc, autoimunitní hemolytická anemie, sterilita, myasthenia gravis, roztroušená sklerosa, Basedowa nemoc, thrombopenická purpura, insulin-dependentní diabetes mellitus alergie; atopie; arteriosklerosa; myokarditida; kardiomyopatie; glomerulonefritida; hypoplastická anemie; rejekce po orgánové transplantaci a různé malignity plic, prostaty, jater, vaječníků, lymfatické tkáně a prsů.
Takové proiylaktické nebo terapeutické činidlo může být podáno v různých formách. Mezi vhodné způsoby podání patří orální podání, jako je podání ve formě tablet, kapslí, granulí, prášků a sirupů, nebo parenterální podání, jako je podání ve formě injekce, kapající infuse a čípků.
Protilátka nebo terapeutické činidlo může být podáno orálně, rektálně, intracistemálně, intraventrikulámě, intrakraniálně, intrathekálně, intravaginálně, parenterálně (intravenózně, intramuskulámě nebo podkožně), lokálně (ve formě zásypu, mastí nebo kapek), intraperitoneální injekcí, transdermálně, inhalačně nebo jako bukální nebo nasální spray. Přesná dávka protilátky nebo terapeutického činidla se může lišit mezi jedinci, podle věku, hmotnosti a celkového zdravotního stavu jedince, závažnosti léčeného onemocnění, lokalizaci a velikosti nádoru, konkrétní použité sloučeniny, způsobu podání, a podobně. Vhodná dávka může být určena odborníkem v oboru za použití pouze běžného experimentování. Typické jednotlivé dávky protilátky jsou v rozmezí 0,1 až 10,000 mikrogramů, výhodně mezi 1 a 100 mikrogramů. Obvyklé koncentrace protilátky v nosiči jsou v rozmezí od 0,2 do 2000 nanogramů na podaný mililitr.
Podle zamýšleného způsobu podání mohou být protilátky nebo terapeutického činidla ve farmaceutických prostředcích ve formě pevných, semi-solidních nebo kapalných dávkových forem, jako jsou například, tablety, čípky, pilulky, kapsle, prášky, kapaliny nebo čípky, výhodně ve formě dávkových jednotek vhodných pro podání přesné dávky. Prostředky budou obsahovat účinné množství vybraného substrátu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem a dále mohou obsahovat další lékařská činidla, farmaceutická činidla, mosiče nebo ředidla. Termín „farmaceuticky přijatelný“ označuje materiál, který není biologicky nebo jinak nežádoucí, který může být podán jedinci společně s vybraným substrátem bez toho, že by způsobil nežádoucí biologické reakce nebo že by interagoval škodlivým způsobem s jakoukoliv jinou složkou farmaceutického přípravku, ve kterém je obsažen.
Prostředky vhodné pro parenterální injekční podání mohou obsahovat fyziologicky přijatelné sterilní vodné nebo nevodné roztoky, disperze, suspenze nebo emulze, a sterilní prášky pro rekonstituci na sterilní injekční roztoky nebo disperze. Příklady vhodných vodných nebo nonvodných nosičů, ředidel, rozpouštědel nebo vehikul zahrnují vodu, ethanol, polyoly (propylenglykol, polyethylenglykol, glycerol, a podobně), jejich vhodné směsi, rostlinné oleje (jako je olivový olej) a injekčně organické estery, jako je ethylolecát. Správná tekutost může být udržována například pomocí potahovacích činidel, jako je lecitin dodržením správné velikosti částic v případě disperzí a použitím surfaktantů.
Prostředky mohou také obsahovat adjuvans, jako jsou konzervační, smáčivá, emulgační a dávkovači činidla. Prevence růstu mikroorganismů může být zajištěna pomocí různých antibakteriálních a antimykotických činidel, například, parabenů, chlorobutanolu, fenolu, kyseliny sorbové, a podobně. Může být také žádoucí použít činidla upravující izotonicitu, například, sacharidy, chlorid sodný a podobně. Prodloužená absorpce injekčních farmaceutických forem může být
-21 CZ 304614 B6 dosažena za použití činidel prodlužujících absorpci, jako je například aluminium-monostearát a želatina.
Mezi pevné dávkové formy pro orální podání patří kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takových dávkových formách je aktivní sloučenina smísena s alespoň jednou inertní běžnou přísadou (nebo nosičem), jako je natrium-citrát nebo fosforečnan vápenatý, nebo (a) plnivy nebo činidly zvětšujícími objem, jako je například škrob, laktosa, sacharóza, glukosa, manitol a kyselina křemičitá, (b) pojivá, jako je například, karboxymethylcelulóza, algináty, želatina, polyvinylpyrrolidon, sacharóza a arabská klovatina, (c) zvlhčovacími činidly, jako je například glycerol, (d) činidly podporujícími rozpadavost, jako je například agar-agar, uhličitan vápenatý, bramborový nebo tapiokový škrob, kyselina alginová, některé komplexní silikáty a uhličitan sodný, (e) činidly zpomalujícími tvorbu roztoku, jako je například parafin, (f) akcelerátory absorpce, jako jsou například kvartémí ammoniové sloučeniny, (g) smáčivými činidly, jako je například, cetylalkohol a glycerol-monostearát, (h) adsorbenty, jako je například kaolin a bentonit, a (i) lubrikačními činidly, jako je například talek, kalcium- stearát, síran hořečnatý, pevné polyethylenglykoly, lauryl síran sodný, nebo jejich směsi. V případě kapslí, tablet a pilulek mohou dávkové formy také obsahovat pufrovací činidla.
Pevné přípravky podobného typu mohou být také použity jako náplně do kapslí z tuhé a měkké želatiny, za použití přísad jako je laktosa nebo mléčný cukr, stejně jako polyethylenglykoly s vysokou molekulovou hmotností, a podobně.
Pevné dávkové formy, jako jsou tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule, mohou být připraveny také s potahy, jako jsou enterální potahy a jiné potahy dobře známé v oboru. Tyto potahy mohou obsahovat činidla zabraňující průniku světla a mohou mít také takové složení, že uvolňují aktivní sloučeninu nebo sloučeniny v některých částech zažívacího traktu kontrolovaným způsobem. Příklady přípravků, které mohou být použity pro tento účel, jsou polymemí substance a vosky. Aktivní sloučeniny mohou být také v mikroenkapsulované formě, s jednou nebo více zvýše uvedených přísad.
Kapalné dávkové formy pro orální podání zahrnují farmaceuticky přijatelné emulze, roztoky, suspenze, sirupy a elixíry. Kromě aktivní sloučeniny mohou kapalné dávkové formy obsahovat inertní ředidla běžně používaná v oboru, jako je voda nebo jiná rozpouštědla, solubilizační činidla a emulgační činidla, jako je například ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylkarbonát, ethylacetát, benzylalkohol, benzylalkohol, benzylbenzoát, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, dimethylformamide oleje, zejména olej z bavlníkových semen, podzemnicový olej, olej kukuřičných klíčků, olivový olej, ricinový olej a sezamový olej, glycerol, tetrahydrofurfuryl- alkohol, polyethylenglykoly a estery sorbitanu a mastných kyselin nebo směsi těchto substancí a podobně.
Kromě takových inertních ředidel mohou prostředky také obsahovat adjuvans, jako jsou smáčivá činidla, emulgační a suspendující činidla, sladidla, chuťová korigens a činidla upravující vůni.
Suspenze mohou, kromě aktivní sloučeniny, obsahovat suspendační činidla, jako jsou například ethoxylované isostearylalkoholy, polyoxyethylensorbitolové a sorbitanové estery, mikrokrystalická celulóza, metahydroxid hlinitý, bentonit, agar-agar a tragant, nebo směsi takových substancí, a podobně.
Prostředky pro rektální podání jsou výhodně čípky, které mohou být připraveny smísením sloučeniny podle předkládaného vynálezu s vhodnými nedráždivými přísadami nebo nosiči, jako je kakaové máslo, polyethylenglykol nebo vosk pro čípky, které jsou pevné při teplotě místnosti, ale kapalné při tělesné teplotě a proto tají v rektu nebo vagíně a uvolňují aktivní složku.
Dávkové formy pro lokální podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou masti, zásypy, spraye a inhalační prostředky. Aktivní složka se smísí za sterilních podmínek s fyziologicky
-22CZ 304614 B6 přijatelným nosičem a jakýmkoliv konzervačním činidlem pufrem nebo hnacím plynem. Oční přípravky, oční masti, prášky a roztoky také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Termín „farmaceuticky přijatelné soli, estery, amidy a proléčiva“ označuje karboxylatové soli, adiční soli s aminokyselinami, estery, amidy a proléčiva sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které jsou, podle lékařských znalostí, vhodné pro použití v kontaktu se tkáněmi pacientů bez toxicity, iritace, alergické reakce a podobně, za zajištění rozumného poměru přínos/riziko, a které jsou účinné pro zamýšlené použití, stejně jako obojetné formy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, pokud jsou možné. Termín „soli“ označuje relativně netoxické, anorganické a organické adiční soli sloučeniny podle předkládaného vynálezu s kyselinami. Soli mohou být připraveny in šitu během konečné izolace a přečištění sloučeniny nebo samostatně reakcí přečištěné sloučeniny ve formě volné báze s vhodnou organickou nebo anorganickou kyselinou a izolováním takto vzniklé soli. Reprezentativní soli jsou hydrobromid, hydrochlorid, síran, kyselý síran, nitrát, acetát, oxalát, valerát, oleát, palmitát, stearát, laurát, boritan, benzoát, laktát, fosfát, tosylát, citrát, maleát, fumarát, sukcinát, tartrát, naftylát, mesylát, glukoheptanoát, laktobionát, methansulfonát a laurylsulfonát, a podobně. Tyto soli mohou obsahovat kationty na bázi alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, jako je sodík, lithium, draslík, vápník, hořčík, a podobně, stejně jako netoxické amoniové, kvartémí ammoniové a aminové kationty, včetně například ammonia, tetramethylammonia, tetraethylammonia, methylaminu, dimethylaminu, trimethylaminu, triethylaminu, ethylaminu, a podobně. (Viz, například, S. M. Barge et al., „Pharmaceutical Salts,“ J. Pharm. Sci., 1977, 66: 1-19; zde uvedeno jako odkaz.)
Termín „proléčivo“ označuje sloučeniny, které jsou rychle transformované in vivo za vzniku původní sloučeniny výše uvedeného vzorce, například, hydrolýzou v krvi. Podrobný popis je uveden v I. Higuchi a V. Stella, „Pro-drugs as Novel Delivery Systems,“ Vol. 14 of A.C.S. Symposium Series, a v Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association a Pergamon Press, 1987.
Cílová buňka je buňka zvířete, jako je například člověk, primát jiný než člověk, krysa, myš, morče, králík, koza, ovce, kůň, kuře, prase, kosman a fretka.
Dále, protilátky nebo terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou existovat v nesolvatované, stejně jako v solvatované formě s farmaceuticky přijatelnými rozpouštědly, jako je voda, ethanol a podobně. Obecně jsou pro účely předkládaného vynálezu solvatované formy považovány za ekvivalentní nesolvatovaným formám.
Protilátkové molekuly jsou přečištěny známými technikami, mezi které patří například aminoabsorpce nebo amino-afinitní chromatografie, chromatografické techniky, jako je vysokotlaká kapalinová chromatografie, nebo jejich kombinace.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje farmaceutický produkt určený pro podání biologicky aktivní protilátky proti TRAIL receptoru nebo humanizované protilátky proti TRAIL receptoru obratlovci. Farmaceutický produkt obsahuje farmaceuticky účinné množství protilátky proti TRAIL receptoru nebo jejího fragmentu a farmaceuticky přijatelný nosič, a sterilní zásobník pro nosič a protilátku.
Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu inhibuje farmaceuticky účinné množství anti-DR5 protilátky proliferaci buněk po kontaktu s cílovou buňkou. Farmaceuticky účinným množstvím protilátky rozpoznávající DR5 nebo humanizované protilátky rozpoznávající DR5 je množství podané jedinci, které je dostatečné pro způsobení požadovaného účinku. Požadovanými účinky podání farmaceuticky účinného množství protilátek rozpoznávajících DR5 je smrt cílové buňky, inhibice růstu cílové buňky, stimulace DR5, vazba na DR5 a zvýšení koncentrace nebo aktivity NFkB v cílové buňce. Cílová buňka je buňka, která exprimuje DR5 a mohou jí být například abnormálně rostoucí buňky a nádory, jako jsou papillomy a bradavice; nádory prsu, střeva, hepatomy, leukemie, nádory plic, melanom, myelom, osteosarkom, nádor vaječníků, slinivky
-23CZ 304614 B6 břišní, hlavy a krku, štítné žlázy, dělohy a nádory mozku, jako jsou astrocytomy. In vivo je cílová buňka jedince s patologickým onemocněním, včetně těch, při kterých je buněčná proliferace abnormální nebo dysregulovaná, jako je tomu při maligních nebo benigních nádorech a revmatoidní artritidě.
V jiném výhodném provedení je cílová buňka také kontaktována s terapeutickým činidlem.
Terapeutickým činidlem je sloučenina nebo přípravek účinný ve zmírnění patologického stavu. Ilustrativním příkladem terapeutického činidla jsou protinádorové sloučeniny.
Protinádorová sloučenina je sloučenina nebo prostředek účinný v inhibici nebo blokování růstu abnormálně rostoucích buněk. Farmaceuticky účinným množstvím protinádorové sloučeniny je množství podané jedinci dostatečné pro způsobení inhibice nebo blokády růstu abnormálně rostoucích buněk. Příklady protinádorových sloučenin jsou: bleomycin, karboplatina, chlorambucil, cisplatina, kolchicin, cyklofosfamid, daunorubicin, dactinomycin, diethyslstilbestrol, doxorubicin, etoposid, 5-fluorouracil, floxuridin, melfalan, methotrexát, mitomycin, 6-merkaptopurin, teniposid, 6-thioguanin, vincristin a vinblastin. Další příklady protinádorových sloučenin a terapeutických činidel jsou uvedeny v Merck Manual of Diagnostis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, Rahway, N. J. a Sládek et al. Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs, 1987, Powis et al. eds., Taylor a Francis, New York, N.Y.
Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být dále kombinovány s jinými terapeutickými modalitami, jako je chemoterapie a radioterapie v léčbě nádorů, a terapeutická účinnost může být zesílena proapoptotickými sloučeninami, jako je bisindolylmaleimid VIII.
Ve srovnání s dříve publikovanou anti-DR5 protilátkou (24) je proapoptotická aktivita demonstrativní TRA-8 protilátky podle předkládaného vynálezu velmi silná a tato protilátka je schopna indukovat apoptosu Jurkat buněk v koncentracích v řádu pg/ml in vitro a vykazuje lepší in vivo tumoricidní aktivitu ve srovnání s dříve popisovaným solubilním TRAIL. Intravenózní podání jedné dávky TRA-8 je dostatečné pro inhibici růstu jak solidních nádorů, tak hematopoetických nádorových buněk, zatímco indukce regrese nádoru in vivo za použití solubilního TRAIL vyžaduje mnohem vyšší dávky (500 pg každý den po dobu 10 dnů). Protilátky proti TRAIL receptoru podle předkládaného vynálezu se zdají být stejně bezpečné jako solubilní TRAIL, protože příkladná protilátka TRA-8 neindukuje apoptosu netransformovaných fibroblastů.
Vektory podle předkládaného vynálezu obsahují sekvence nukleové kyseliny kódující těžké a lehké řetězce imunoglobulinu anti-DR5 protilátky operativně navázané na regulační element, jako je promotor nebo zesilovač transkripce. „Operativní vazba“ označuje uspořádání nukleotidových sekvencí tak, že tyto sekvence mohou provádět obvyklé funkce. Tak je regulační element operativně navázaný na nukleotidovou sekvenci kódující polypeptide schopen řídit transkripci, replikaci a/nebo translaci polypeptidu. Odborníkům v oboru bude jasné, že jediný vektor volitelně obsahuje kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec imunoglobulinu anti-DR5 protilátky.
Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci metod a výsledků předkládaného vynálezu. Tyto příklady nejsou limitující pro předkládaný vynález, ale pouze ilustrují reprezentativní způsoby a výsledky. Tyto příklady nevylučují ekvivalenty a varianty předkládaného vynálezu, které jsou zřejmé odborníkům v oboru.
-24CZ 304614 B6
Příklad 1. Příprava DR5 antigenů
1.1 Klonování DR5 cDNA
DNA kódující lidský DR5 protein se klonuje následující RT-PCR metodou za použití:
a) Templát
Celková RNA HeLa buněk se extrahuje za použití TRIzol Reagent (GIBCO BRL). Templátem pro PCR reakci je cDNA, která se získá za použití First-Strant kitu pro syntézu cDNA (Amersham Pharmacia Biotech) podle návodu výrobce kitu.
b) PCR primery
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEQ ID No. 1);
5'-ccactgggtgatgttggatggg-3' (DR5p2: SEQ ID No. 2);
Pokud není uvedeno jinak, syntetizují se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech za použití Lifetechnologies. Všechny oligonukleotidy se uskladní při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Složení roztoku pro PCR reakci:
templátová cDNA, 5 μΐ z celkového objemu reakce 33 μΐ;
primer DR5pl, 10 pmol;
primer DR5p2, 10 pmol;
x koncentrovaný PCR pufr (obsažený v kitu), 10 μΐ;
dNTP (každý 2,5 mM), 4 μΐ; a
Taq polymeráza (Promega), 5 jednotek.
Sterilní destilovaná voda se přidá do roztoku do celkového objemu 100 μΐ. Pokud není uvedeno jinak, jsou dNTP ekvimolámí směsí dATP, dCTP, dGTP a dTTP (2,5 mM každý).
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 2 minut, a potom se 40krát opakuje cyklus zahřívání při 94 °C na dobu 30 sec, 52 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 3 minut. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto získané amplifikované DNA fragmenty se separují na 1% agarosovém gelu obsahujícím 0,25 pg/ml ethidiumbromidu. Proužky obsahující požadované DNA fragmenty se vyříznou z gelu a DNA se žních získá za použití Gene Clean kitu (BIO 101). DNA fragment se klonuje za použití TA Cloning Kitu (Invitrogen, CA). Tato se provede následujícím způsobem.
DNA fragment získaný z PCR reakčního roztoku, spolu s 50 ng pCR2.1 vektoru, který je obsažen v Ta Cloning kitu, se smísí s 1 μΐ 10X ligasového reakčního pufru (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6mM chloridu hořečnatého, 5 mM chloridu sodného, 7 mM beta-merkaptoethanolu, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM speremidinu, a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu), do kterého byly přidány 4 jednotky T4 DNA ligasy (1 μΐ). Celkový objem směsi se upraví na 10 μΐ sterilní deionizovanou vodou, a získaný ligasový roztok se inkubuje při 14 °C po dobu 15 hodin. Po této
-25CZ 304614 B6 době se 2 μΐ ligasového reakčního roztoku přidají k 50 μΐ kompetentních E. coli kmene TOP 10F', který je obsažen v Ta Cloning kitu a který se uvede do kompetence podle návodu, a do této směsi se přidají 2 μΐ 0,5 M beta-merkaptoethanolu, a směs se udržuje na ledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund, a opět na ledu po dobu 5 minut. Potom se do kultury přidá 500 μΐ média obsahujícího 2 % obj./obj. tryptonu, 0,5 % hmotn./obj. kvasinkového extraktu, 0,05 % hmotn./obj. chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 1 mM chloridu hořečnatého a 20 mM glukosy (zde dále označované jako „SOC“ médium) a směs se inkubuje po dobu 1 hodiny při 370 °C za třepání. Po této době se kultura rozšíří na L-agarové plotně (1% obj./obj. trypton, 0,5% hmotn./obj. kvasinkový extrakt, 0,5% hmotn./obj. chlorid sodný, 0,1% hmotn./obj. glukosa a 0,6% hmotn./obj. bacto-agar (Difco)), obsahující 100 pg/ml. Kolonie resistentní na ampicilin objevivší se na plotně se selektují a seškrábnou se platinovou kličkou a kultivují se vL-bujonovém médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu při 370 °C, přes noc, za třepání při 200 r.p.m. Po inkubaci se buňky odeberou odstředěním a alkalickým způsobem se z nich získá plasmidová DNA. EcoRI-EcoRI DR5 cDNA fragment z takto získaného plasmidu se subklonuje do pcDNA3 plasmidu (Invitrogen, CA). Kompletní DR5 gen v pcDNA3 se sekvencuje a porovná se s publikovanou sekvencí. Takto získaný plasmid se označí jako plasmid pcDNA3-DR5.
1.2 Konstrukce DR5-IgG expresního vektoru
Pro získání solubilní formy lidského DR5 bez transmembránové domény se konstruoval expresní plasmidový vektor. Tento vektor se navrhl tak, aby kódoval fúzní protein obsahující extracelulámí doménu lidského DR5 fúzovanou na lidskou IgGl Fc DNA (41). DNA kódující lidský DR5 bez transmembránové domény se získal následující PCR reakcí.
a) Templát
Templát pro PCR reakci byl pcDNA3-DR5.
b) PCR primery
Následující oligonukleotidové primery se syntetizovaly pro PCR:
5'-gacgatgcccgatctactttaaggg-3' (DR5pl: SEQ ID No. 1);
5'-ggatccgtggacacattcgatgtc-3' (DRSp3: SEQ ID No. 3);
Pokud není uvedeno jinak, syntetizují se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech za použití Lifetechnologies. Všechny oligonukleotidy se uskladní při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Provede se PCR reakce a amplifíkované DNA se izolují způsobem podle příkladu 1.1 (c).
Takto získaný plasmid se označí jako plasmid pCR-DR5. BamlI-EcoRI fragment z lidského Fc fragmentu, který se získá z pmFas-hlgGÍFc se subklonuje do BamHI a EcoRI multi-klonovacích míst pcDNA3. Takto získaný plasmid se označí jako pcDNAFc. Dále, BamHI-BamHI fragment kódující lidský solubilní DR5 region, kteiý se získá z pCR-DR5, se subklonuje do BamHI místa pcDNAFc plasmidu. Takto získaný plasmid se označí jako plasmid pcDNADR5-Fc. EcoRI fragment kódující lidský solubilní DR5-lidský IgGFc region, který se získá zpcDNADR5-Fc plasmidu se opatří lepivými konci za použití Klenow fragmentu DNA polymerázy (GIBCO BRL) a potom se subklonuje do přenosového vektoru pAdCMV5 (Quantum Biotechnologies lne., Canada), kteiý se opatří lepivými konci po štěpení s BamHI. Takto získaný plasmid se označí pAdDR5-Fc.
-26CZ 304614 B6
1.3 Exprese a přečištění lidského DR5-IgG 1 fúzního proteinu
QBI-293A buňky (z ADENO-Quest Kitu) se ko-trasnfektují pAdDR5-Fc a QBI-virovou DNA (z ADENO-Quest Kitu) za použití ADENO-Quest kitu (Quantum Biotechnologies lne., Canada) podle návodu výrobce. Rekombinantní virové plaky se kultivují a testují se na expresi DR5-IgG fúzního proteinu ELISA analýzou supematantu. Pozitivní plaky se amplifikují v QBI-293A buňkách a uskladní se při -80 °C jako zásoba virů. 50 disků (150 mm) QBI-293A buněk se transfektuje pAdDR5-Fc rekombinantním virem při 10 m.o.i. (Multiplicity of Infection). Kultivační médium se odebere za 48 hodin po transfekci.
Transfektované buňky mající DR5-IgG gen se kultivují do hustoty buněk 1 χ 106 buněk/ml inkubací v 500 ml DMEM (GIBCO) médiu obsahujícím 10% obj./obj. FCS, při 37 °C v atmosféře 5% obj ./obj. CO2 po dobu 2 dnů. Kultura se potom odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a odebere se supematant. Přečištění DR5-IgG ze supematantu se provede za použití ProteinASepharosové CL-^1B afinitní chromatografie (Pharmacia) za následujících podmínek: kolona: ProteinA-Sepharosová CL-4B kolona (velikost kolony 2 ml; Pharmacia);
eluční pufr: 0,1 M glycin (pH 2,4), 0,15 M NaCl;
neutralizační pufr: 1M Tris-HCl (pH 8,5).
Po aplikaci veškerého supematantu do kolony se kolona promyje třikrát 20 ml PBS a potom se 1 Okřát přidá 1 ml elučního pufru. Změří se optická hustota každé eluované frakce (1 ml). Odebere se druhá až pátá frakce (s OD28o 0,1) a po přidání 100 μΐ neutralizačního pufru se eluáty umístí samostatně do dialyzačních zkumavek a eluát se dialyzuje proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C. Dialyzační pufr se vymění dvakrát.
Eluáty se potom testují na expresi DR5-IgG genového produktu pomocí ELISA. Nejprve se 100 μΐ každé frakce umístí samostatně do jamek 96-jamkové mikroplotny (Costar) a provede se inkubace při 37 °C po dobu 1 hodiny. Po této době se roztok z jamek odstraní a plotna se promyje 3krát 100 μΐ/jamku PBS obsahujícím 0,1% obj./obj. Tween 20 (zde dále označovaný jako „PBS-Tween“). Po promytí se PBS obsahující 2 % hmotn./obj. hovězího sérového albuminu (zde dále označovaný jako „BSA“) přidá v množství 100 μΐ/jamku a plotna se potom inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Po této době se jamky znovu promyjí 3krát 100 μΐ/jamku PBS-Tween, potom se do každé jamky přidá 100 μΐ/jamku roztoku monoklonální protilátky proti lidskému IgGl ředěné lOOOkrát s PBS-Tween a plotna opět inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jamky se potom promyjí 3krát 100 μΐ/jamku PBS-Tween. Potom se přidá 3,3,5,5-tetramethyl—benzidin (zde dále označovaný jako „TMB“) kapalný substrát (Sigma) v množství 100 μΐ/jamku a plotna se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut a potom se reakce ukončí přidáním 100 μΐ/jamku 0,2N H2S04. Absorbance každé jamky se odečítá při 450 nm pro určení koncentrace navázané protilátky, za použití absorbance při 650 nm jako kontrolního měření. Absorbance se měří za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices). Produkce DR5-IgGl se potvrdí za použití této ELISA techniky. Molekulová hmotnost exprimovaného DR5-IgGl fúzního proteinu se určí za použití westernové hybridizace, ve které se anti-lidský IgGl mAb (Sigma) použije pro detekci protilátky na gelu. Molekulová hmotnost exprimovaného DR5-IgGl fúzního proteinu je přibližně 50 kDa. Dosažená čistota je vyšší než 90 %, jak se zjistí analýzou na SDS-PAGE a detekcí proteinu barvením Coomassie modří.
-27CZ 304614 B6
Příklad 2. Příprava monoklonálních protilátek proti lidskému DR5
2.1 Imunizace
Samice Balb/c myší (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) stáří 6 až 8 týdnů se imunizují afinitně-přečištěným lidským DR5/hIgGl fúzním proteinem. Pro první imunizaci do tlapky se fúzní protein (50 pg) emulsifikuje ve Freundově kompletním adjuvans (Difco, Detroit, MI). Myším se potom podá dosycovací imunizace čtyři injekcemi 50 pg fúzního proteinu bez adjuvans každý druhý den. Tři dny po poslední injekci se lymfocyty z lokálních lymfatických uzlin fúzují sNS-1 myelomovými buňkami a hybridomy se kultivují ve F104 médiu doplněném 10% fetálním telecím sérem. Pozitivní F104 médiu doplněném 10% fetilním telecím sérem. Pozitivní hybridomy se selektují ELISA, při kterém se plotny potáhnou buď 1 pg/ml DR5/hIgGl, nebo stejným množstvím Fas/hlgGl jako kontrolou. Isotyp hybridomů se určí ELISA za použití panelu kozích protilátek specifických pro myší lg isotyp (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Monoklonální protilátky se přečistí afinitní chromatografií za použití imobilizovaného anti-myší IgGl nebo proteinu G (Sigma).
2.2 Fúze buněk
V den tři po dosycovací injekci se od myší odeberou lokální lymfatické uzliny a umístí se do 10 ml bezsérového RPMI 1640 média (GIBCO BRL) obsahujícího 50 jednotek/ml penicilinu, 50 pg/ml streptomycinu a 300 pg/ml kyseliny L-glutamové, a uzliny se rozruší protlačením přes síto (Cell Kmeneer; Falcon) za použití lžičky. Získaná buněčná suspenze se odstředí pro peletizaci buněk lymfatických uzlin, které se potom promyjí dvakrát bezsérovým RPMI médiem. Promyté buňky se potom resuspendují v bezsérovém RPMI médiu a spočítají se.
Mezitím se myelomové NS1 buňky (American Type Culture Collection TIB-18) kultivují do buněčné density 1 x 108 buněk/ml vASF104 médiem (Ajinomoto, K. K.) obsahujícím 10% obj./obj. FCS (Gibco BRL) („ASF médium se sérem“) při 37 °C pod 5% obj ./obj. CO2, a tyto buňky se podobným způsobem rozruší, promyjí se, resuspendují se a spočítají se.
Množství suspenze NS1 buněk obsahující 3 x 107 buněk se smísí s množstvím suspenze buněk sleziny obsahující 3 x 108 buněk. Získaná směs se odstředí a odstraní se supematant. Následující kroky fúze buněk se provedou vždy v plastové zkumavce obsahující peletu při 37 °C v lázni s teplou vodou.
ml 50% (hmotn./obj.) polyethylenglykolu 1500 (Boehringer Mannheim) se pomalu přidá do zkumavky, za míšení pelety za použití konce pipety. Potom se 1 ml bezsérového RPMI média, předem ohřátého na 37 °C, pomalu přidá ve dvou podílech, a potom se provede přidání dalších 7 ml bezsérového RPMI média. Získaná směs se potom odstředí, supematant se odstraní a za mírného míšení koncem pipety se přidá 10 ml HAT média obsahujícího 10% obj./obj. FCS a suspenze se rozdělí do 96-jamkových mikroploten pro kultivaci buněk při 100 μΐ/jamku a provede se inkubace při 37 °C v atmosféře 5% obj./obj. CO2. Po 7 nebo 8 dnech se 100 μΐ/jamku čerstvého HAT média použije pro nahrazení média v jamkách vykazujícího nažloutlou barvu. Fúzní buňky z těchto jamek se klonují limitním ředěním, které je popsáno dále.
2.3 Klonování limitním ředěním
Thymy od 4 až 10 týdenních samic BALB/c myší (od Japan SLC, lne.) se odeberou, rozruší se na sítu (Cell Kmeneer; Falcon) jak je popsáno výše, a rozrušené buňky se promyjí dvakrát HT médiem obsahujícím 10% obj./obj. FCS. Množství buněk thymu odpovídající množství od jedné myši se suspenduje v 30 ml HT média obsahujícího 10% obj./obj. FCS za zisku suspenze podpůrných buněk. Fúzní buňky připravené výše v příkladu 2.2 se naředí touto suspenzí podpůrných buněk 10- až 100-násobně a dále se ředí sériově suspenzí podpůrných buněk za zisku
-28CZ 304614 B6 suspenzí s hustotou fuzních buněk 5,1a 0,5 buněk/ml. Takto připravené vzorky se rozdělí do jamek 96-jamkových mikroploten pro kultivaci buněk při 100 μΐ/jamku a provede se inkubace po dobu 5 dnů při 37 °C v 5% obj./obj. CO2.
2.4 Skríning
Supematanty kultur hybridomů se testují ELISA za použití ploten potažených buď 1 pg/ml DR5/hIgGl, nebo stejným množstvím Fas/hlgGl (41) jako kontrolou. Navázané protilátky se detekují za použití anti-myších imunoglobulinů konjugovaných s křenovou peroxidasou (HRP) (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) s TMB (Sigma, St Louis, MI) jako substrátem. Přečištěný DR5-IgGl při koncentraci 1 pg/ml nebo stejné množství Fas-hlgGl se přidá do jamek 96-jamkové ELISA/RIA STRIP plotny (Costar, NY). Plotna se nechá stát při 4 °C přes noc pro umožnění adsorpce proteinu na povrch jamek. Po této době se roztok v jamkách odstraní a každá jamka se promyje 3-krát PBS-Tween. Potom se 100 μΐ PBS obsahujícího 1 % (hmotn./obj.) hovězího sérového albuminu (A3803, Sigma Chemicals Co.) přidá do každé jamky a plotna se inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny. Jamky se potom promyjí znova 3krát PBS-Tween, a potom se 50 μΐ supematantu každé kultury hybridomů přidá do každé jamky. Plotna se potom inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny a jamky se znovu promyjí 4krát PBS-Tween. Po promytí se 50 μΐ křenovou peroxidasou značené protilátky proti myšímu imunoglobulinu (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), ředěné lOOOkrát PBS, přidá na jamku, a plotna se znovu inkubuje při 37 °C po dobu 1 hodiny, a potom se jamky promyjí 4krát PBS-Tween. 3,3,5,5-tetramethyl-benzidinový (TMB) kapalný substrát (Sigma) se potom přidá v množství 100 μΐ/jamku a plotna se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut a potom se reakce ukončí přidáním 100 μΐ/jamku 0,2N H2SO4. Absorbance každé jamky při 450 nm (kontrolní při 650 nm) se měří za použití čtečky mikroploten (Molecular Devices) a fuzní buňky se selektují ze vzorku, který má absorbanci (450 nm-650 nm, OD hodnoty; > 0,5) jasně vyšší než je absorbance vzorků, které neobsahují supematant fuzních buněk (OD hodnoty; 0,03). Dále, supematanty kultur hybridomů se také funkčně testují měřením proapoptotické aktivity za použití Jurkat buněk. 50 μΐ RPMI média obsahujícího Jurkat buňky (1000 buněk na jamku) a 5 μΜ bisindolylmaleimidu VIII (BisVIII, Alexis, San Diego, CA) se přidá do 96-jamkových ploten za přítomnosti 50 μΐ supematantů kultur hybridomů. Buňky se kultivují ve zvlhčovaném inkubátoru při 37 °C přes noc. Apoptosa se určí testem na životaschopnost buněk za použití ATPLite kitu podle návodu výrobce (Packard Instruments) a vzorky se počítají za použití TopCounter (Packard Instruments).
2.5 ELISA vazba TRAIL a TRA-8 na receptory
ELISA plotny se potáhnou 2 pg/ml DR4-Ig nebo DR5-Ig fúzním proteinem pře noc. Po blokování 3% BSA se solubilní TRAIL-FLAG nebo TRA-8 přidá při uvedených koncentracích a provede se inkubace při 37 °C po dobu jedné hodiny. Vazba TRAIL nebo TRA-8 se detekuje za použití anti-Flag protilátky konjugované s HRP (Alexis) nebo anti-myšího IgGl konjugovaného s HRP (Southern Biotechnology), v příslušném pořadí. Reakce se vyvíjejí za použití TMB substrátového pufru a měří se Benchmark čtečkou mikroploten (BioRad). Kd hodnoty se určí jednocestným modelem vazby nelineární regrese za použití GraphPad Prism softwaru (GraphPad Software, San Diego, CA). Pro kompetitivní ELISA se přidá 100 ng/ml TRAIL-FLAG a provede se inkubace za přítomnosti různých koncentrací of TRA-8. Vazba TRAIL se určí způsobem uvedeným výše.
2.6 Klonování
Kroky popsané v příkladech 2.3 a 2.4 se opakují 5krát pro buňky selektované v 2.4, což umožní selekci několika hybridomních klonů, z nichž každý produkuje jednu protilátku, která se váže na DR5-IgG, ale ne na Fas-IgG. Takto se získá myší-myší hybridom, označený TRA-8 a produku-29CZ 304614 B6 jící protilátku vážící se na DR5-IgG, ale ne na Fas-IgG. Tento hybridom, TRA-8 se uložil v American Type Culture Collection 1.3.2000 a byl označen přírůstkovým číslem PTA-1428.
Podtřída protilátky produkované myším-myším hybridomem TRA-8 (dále „TRA-8“) byla určena jako IgGl, kappa, po testování za použití kitu pro izotypizaci monoklonální protilátky (Pierce).
Za použití našeho lidského DR5-IgGl fúzního proteinu jako imunogenu se sedm hybridomních klonů, získalo prvotním ELISA skríningem, z nichž všechny byly silně pozitivní na DR5-IgG ale ne na Fas-IgG fúzní protein, což ukazuje, že byly získány hybridomy produkující protilátky, které rozpoznávají extracelulámí část DR5, ale ne Fc část IgGl (data nejsou uvedena).
2.7 Westernová hybridizace
Filtry pro Westernovou hybridizaci homogenizátů normální lidské a nádorové tkáně se zakoupily od Geno Technology (St Louis, MO). Do každé dráhy se aplikovalo stejné množství proteinu, jak určeno protilátkou proti beta-aktinu. Skvrny se sondovaly 1 pg/ml TRA-8 přes noc, a potom HRP-konjugovaným kozím anti-myším IgGl (Southern Biotechnology) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny, a vyvíjely se chemiluminiscencí.
2.8 In šitu imunohistochemické vyšetření
Lidské tkáně se získaly od Tissue Procurement Center UAB. Zmrazené řezy se fixují v 70% ethanolu, blokují se 10% koňským sérem v PBS, a potom se provede inkubace sl0pg/ml afinitně-přečištěným TRA-8 při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Anti-myší IgG ABC kit s diaminobenzidinem (Vektor, Burlingame, CA) jako kolorimetrickým substrátem se použije pro visualizaci reaktivity.
2.9. Analýza aktivace caspas
Jurkat buňky (lxl06/ml) se inkubují s 500 ng/ml TRA-8. Podíly (30 pg proteinu) buněčného lyzátu se separují na 15% SDS-PAGE, přenesou se na nylonovou membránu, a skvrny se sondují protilátkami proti caspase 8, 9, a 3 (BD Pharmingen, San Diego, CA) a potom HRP-konjugovanou sekundární protilátkou a provede se chemiluminiscentní visualizace štěpených produktů. Sada inhibitorů caspas se zakoupí od R&D Systems (Minneapolis, MN). Každý inhibitor caspas se přidá do kultury v uvedené koncentraci.
Příklad 3. Přečištění TRA-8 monoklonální protilátky
Myší-myší hybridom, TRA-8, se kultivuje do hustoty buněk 1 χ 106 buněk/ml inkubací v 500 ml ASF média obsahujícího 10% obj./obj. FCS, při 37 °C v 5% obj./obj. CO2 po dobu 5 dnů. Kultura se potom odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a supematant se odebere. Přečištění TRA-8 ze supematantu se provede za použití ProteinG-Sepharosové CL-4B afinitní chromatografie (Pharmacia) za následujících podmínek:
kolona: ProteinG-sepharosová CL-4B kolona (velikost kolony 2 ml; Pharmacia);
eluční pufr: 0,1 M Glycin (pH 2,4), 0,15 M NaCl;
neutralizační: 1M Tris-HCl (pH 8,5).
Po aplikaci veškerého supematantu do kolony se 20 ml PBS promyje 3krát a potom se eluční pufr přidá v objemu 1 ml 1 Okřát. Změří se optická densita pro každou eluovanou frakci (1 ml). Frakce č. 2 až č. 5 (>OD280 = 0,1) se odeberou samostatně.
-30CZ 304614 B6
Po přidání 100 μΐ neutralizačního pufru se eluáty samostatně vloží do dialyzační zkumavky a eluáty se dialyzují proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C. Dialyzační pufr se vymění dvakrát. Tento vzorek se testuje na aktivitu anti-DR5 protilátky ELISA za použití lidského DR5-IgG fúzního proteinu připraveného výše za použití techniky popsané výše.
Příklad 4. Příprava DR4 antigenů, DR4-IgG expresního vektoru a anti-DR4 monoklonální protilátky
Postupy z příkladů 1 až 3 se opakují s DR4 templátovou cDNA a primery místo těch, které jsou uvedeny v příkladu 1, za zisku DR4 antigen, který se použije stejně jako v příkladech 1.2-3 pro získání monoklonální protilátky specifické pro DR4.
Příklad 5. Monoklonální protilátky pro DcRl a DcR2
Monoklonální protilátky jsou namířeny proti falešným receptorům DcRl a DcR2 pomocí substituce příslušné cDNA a primerů za zisku příslušných antigenů stejně jako v příkladu 1. Expresní vektory pro DcRl nebo DcR2-fúze s imunoglobulinem G a výsledné přečištěné monoklonální protilátky se připraví stejně jako v příkladech 2 a 3.
Příklad 6. Specifícita monoklonální protilátky
Protože všechny receptory pro TRAIL a jiné proteiny TNFR rodiny vykazují významnou homologií, určí se specifícita příkladné protilátky TRA-8 pro DR5 westernovou analýzou za použití dvou různých lidských DR5-IgG fúzních proteinů a solubilních, rekombinantních forem jiných příbuzných proteinů. První DR5-Ig fuzní protein se konstruuje fůzí cDNA ze zbytků 1-180 extracelulámí části DR5 a cDNA kódující konstantní region lidského IgGl. Fúzovaná cDNA se klonuje do rekombinantního adenovirového vektoru (Quantum Biotechnologies, lne., Montreal, Canada). Exprimovaný DR5/hIgGl fúzní protein, který má relativní molekulovou hmotnost 50 kDa, se přečistí za použití anti-lidský IgG afinitní kolony (Sigma, St Louis, MO). Pro westernovou analýzu specificky se druhý rekombinantní lidsky DR5/IgGl fúzní protein (aa. 52-212), stejně jako TRAIL-R1, R3 a R4 fúzní proteiny, zakoupí od Alexis. Solubilní formy lidského Fas a TNFR1 se získají od Dr. Carl Edwards z Amgen, lne., Thousands Oaks, CA, USA. Použité solubilní rekombinantní lidské DR4, Dcrl, DcR2, TNFR1, R4 a Fas molekuly jsou lidské IgGl fúzní proteiny. 0,5 pg každého proteinu se separuje pomocí 10% SDS-PAGE a přenese se na nitrocelulózovou membránu. Skvrny se blokují 5% sušeným mlékem v PBS při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a sondují se 1 pg/ml přečištěné monoklonální anti-DR5 protilátky (klon: TRA-8) nebo 0,1 pg/ml HRP-konjugované kozí anti-lidským IgG při 4 °C přes noc. Kozí anti-myší IgG konjugovaný s křenovou peroxidasou se použije jako sekundární protilátka pro detekci navázaného TRA-8. Skvrny se vyvíjejí chemiluminiscencí.
Cos-7 buňky transfektované pcDNA3 vektorem (Clontech, Palo Alto, CA) obsahujícím kompletní DR5 nebo DR4 nebo prázdným vektorem se použijí pro analýzu průtokovou cytometrií. Kompletní cDNA kódující lidský TRAIL nebo myší Fas ligand se klonuje do pTRE vektoru za tetracyklinem-řízený promotor (Clontech). Xhol-HindlII fragmenty pTRE-hTRAIL nebo pTRE-mFasL se potom klonují do adenovirového přenosového vektoru pAdBN (Quantum Biotechnologies, lne.). 293 hostitelské buňky s ko-transfektují linearizovaným pAd-TREhTRAIL nebo pAd-TRE-mFasL a velkým fragmentem DNA adenoviru. Exprese funkčního lidského TRAIL nebo myšího Fas ligandů z plaků rekombinantního viru, se testuje za použití a testu uvolňování 51Cr s Jurkat buňkami jako cíly.
TRA-8 reaguje silně s DR5-IgG fuzním proteinem (50 kDa), který se použije pro imunizaci, jak je uvedeno na obr. Ia, DR5, #1, a slabě s druhým DR5-IgG fuzním proteinem (60 kD), jak je
-31 CZ 304614 B6 uvedeno na obr. la, DR5, #2. Není pozorovatelná významná vazba TRA-8 na DR4, DcRl, DcR2, Fas (CD95) nebo TNFRI. Tyto výsledky naznačují, že TRA-8 rozpoznává epitopy, které jsou specifické pro DR5, ale nejsou přítomné vjiných členech rodiny.
TRA-8 nereaguje s jinými členy superrodiny TNF receptoru, jako je Fas (CD95) a TNF receptor I, ani nereaguje TRA-8 zkříženě s myším homologem DR5, jak je zřejmé z poměrů optické absorbance pro 450 nm a 650 nm, dolním panelu č 1 až 7 (obr. la, sloupec 8 dolního panelu). Solubilní TRAIL a TRA-8 se váží srovnatelně na imobilizovaný DR5 (obr. lb, levý panel). Naopak, TRAIL se váže na DR4, ale TRA-8 nevykazuje žádnou vazebnou aktivitu k DR4 (obr. lb, střední panel). Kd hodnoty pro vazbu TRAIL a TRA-8 na DRS jsou přibližně 59 nM a 3 nM, v příslušném pořadí. Významné je to, že TRA-8 významně soutěží s TRAIL o vazbu na DR5, ale ne o vazbu na DR4, jak je zřejmé z kompetitivního ELISA testu (obr. lb, pravý panel). Tyto výsledky ukazují na specificitu TRA-8 pro lidský DR5.
TRA-8 je schopen detekovat povrchovou buněčnou expresi DR5, a analýza průtokovou cytometrií ukazuje na specifickou vazbu na povrch Cos-7 buněk transfektováných kompletním lidským DR5, ale ne Cos-7 buněk transfektovaných DR4 nebo prázdným vektorem (obr. lc). Obdobně, in šitu imunohistochemické vyšetření s TRA-8 demonstruje reaktivitu s Cos-7 buňkami transfektovanými kompletní DR5 DNA, ale ne transfektovanými kontrolním vektorem (obr. ld). TRA-8 neindikuje apoptosu netransfektovaných Cos-7 buněk, a RT-PCR RNA z Cos-7 buněk za použití párových primerů kódujících lidské DR5 ukazuje, že nejsou přítomny žádné specifické PCR produkty. Další funkční analýza za použití lidských Jurkat buněk jako cílů ukazuje, že - za nepřítomnosti zesítění - TRA-8 silně indukuje smrt buněk, což bylo prokázáno třemi různými testy na životaschopnost buněk včetně ATPLine, MIT a Pl vylučování (obr. le). Více než 50 % Jurkat buněk je usmrceno nanogramovými koncentracemi TRA-8, jak bylo zjištěno pomocí ATPLife testu. Smrtící aktivita TRA-8 je specifická pro DRS, protože může být blokována DR5-Ig, ale ne DR4-Ig fúzním proteinem (data nejsou uvedena). Štěpení caspas 8, 9, a 3 může být detekováno westernovou analýzou již za 30 minut po aplikaci TRA-8 na Jurkat buňky (obr. lf), a smrt Jurkat buněk je zcela inhibována obecným inhibitorem caspas (Z-VAD) (obr. lg). Jednotlivé inhibitory pro caspasy 8, 3, 9, a 10 částečně inhibují buněčnou smrt, což dále dokazuje, že TRA-8-zprostředkovaná smrt buněk je primárně způsobena apoptotickým mechanismem závislým na caspasách.
Příklad 7. Analýza exprese DR5 na povrchu buněk za použití průtokové cytometrie: Hlavní death receptor na mnoha nádorových buňkách, ale ne na normálních buňkách
Schopnost vazby TRA-8 na DR5 exprimovaném na buněčném povrchu a specificita této reakce se potom hodnotí za použití COS-7 (American Type Culture Collection č. CRL-1651) buněk transfektovaných expresním vektorem obsahujícím kompletní lidské DR5 nebo DR4 cDNA nebo prázdným vektorem jako kontrolou. Anti-myší IgGl konjugovaný s fykoerythrinem (PE) (Pharmingen) se použije jako sekundární protilátka pro detekci vazby TRA-8. Fluorescence 1 X 104 buněk se měří za použití průtokového cytometru (FACSVantage) za následujících podmínek:
Excitační vlnová délka: 488 nm;
Detekční vlnová délka; 600 nm.
Analýza průtokovou cytometrií ukazuje, že TRA-8 barví přibližně 30 % COS-7 buněk transfektovaných DR5 vektorem, jak je uvedeno v plném histogramu na obr. lc. Toto procento odpovídá účinnosti transfekce, jak je určena analýzou transfekce za použití zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) (data nejsou uvedena). TRA-8 nebarví významně buňky transfektované buď DR4 (prázdný histogram), nebo kontrolním vektorem (tečkovaný histogram), což ukazuje, že TRA-8 je specifický pro DR5 na povrchu buněk.
-32CZ 304614 B6
Ačkoliv byla exprese DR5 v nádorových buňkách důkladně studována na úrovni mRNA (Rieger J. et al. 1: FEBS Lett 1998 May 1; 427(1):124-8), je povrchová exprese DR5 málo prozkoumána. Gibson S. B. et al. 1: Mol buňky Biol 2000 Jan; 20(1):205-12; Kim K. et al. 1: Clin Cancer Res 2000 Feb; 6(2):335-46. Proto umožňuje dostupnost monoklonální anti-DR5 protilátky zkoumat povrchové koncentrace DR5, a korelovat expresi s citlivostí buněk na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Následující panel buněk (1 x 106) se inkuboval s 10 pg/ml afinitně přečištěné TRA-8 při teplotě místnosti po dobu 30 minut a potom se provedlo barvení PE-konjugovaným anti-myším IgGl (Pharmingen) po dalších 30 minut. 10000 živých buněk se analyzovalo za použití FACS-vantage průtokového cytometru za následujících podmínek:
Excitační vlnová délka: 488 nm;
Detekční vlnová délka; 600 nm.
Pět testovaných hematopoetických buněčných linií jsou Jurkat, CEM-6, Molt-4, H-9 a U937 buňky. DR5 exprese je detekovatelná na povrchu Jurkat, CEM-6, H-9 a U937 buněk, ale je téměř nedetekovatelná na Molt-4 buňkách, jak je uvedeno na obr. 2a a 2a'. Ačkoliv byly dříve popsány vysoké úrovně exprese DR5 RNA (43), FACs analýza ukázala, že tyto buňky neexprimují vysoké koncentrace povrchových DR5. Tyto výsledky naznačují, že povrchová exprese DR5 nekoreluje s transkripční expresí DR5, což není neočekávané pro takový receptor. Povrchová exprese DR5 může být specifická pro buněčné linie, protože většina buněk hematopoetického původu exprimuje nízké hladiny, zatímco většina gliomových a prostatických buněk exprimuje vysoké koncentrace DR5.
TRA-8 monoklonální protilátka se použije pro určení role DR5 v indukci TRAIL-zprostředkované apoptosy testováním povrchové exprese TRAIL na panelu různých lidských nádorových buněk, stejně jako citlivosti těchto buněk na TRAIL a TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Primární T-lymfocyty periferní krve neexprimují významnější množství povrchových DR5 a jsou resistentní na TRAIL i TRA-8-zprostředkovanou apoptosu (Obr. 2a, 2a' a 3 a'). Ačkoliv všech pět testovaných lidských T-leukemických buněčných linií exprimuje detekovatelné, i když relativně nízké koncentrace povrchových DR5, jsou dvě z nich (Jurkat a CEM-6) vysoce citlivé na TRAIL-zprostředkovanou a TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že DR5 sám je dostačující pro indukci apoptosy těchto buněk. Molt-4 a U937 buňky jsou částečně citlivé na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, ale jsou relativně resistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že jiné TRAIL receptory se mohou podílet na přenosu apoptotického signálu. H-9 buňky jsou resistentní jak na TRAIL, tak na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, což ukazuje na blok v intracelulámí anti-apoptotické dráze.
Panel buněk zahrnuje lidské maligní gliomové buněčné linie, Hs683, U251MG, D37MG, D54MG, U373MG, CH235MG, U87 a normální lidské astrocyty, které jsou získány od Dr. Yancey Gillespie z Neurosurgery Department of University of Alabama v Birminghamu. Lidské buněčné linie karcinomu prostaty, Dul54, PC3 a LnCap, se získají od Dr. William Grizzle z Pathology Department of University of Alabama v Birminghamu, který má buněčné linie z American Type Culture Collection. Lidské leukemické T-lymfocytámí linie, B-lymfocytámí lymfomové buňky, HepG2 Jurkat (American Type Culture Collection TIB-1 52) a CCRF-CEM CEM-6 (American Type Culture Collection CCL-1 19); monocytámí buněčné linie, U937 (American Type Culture Collection CRL-2367); se získají od American Type Culture Collection. Všechny výše uvedené buněčné linie se kultivují v RPMI 1640 doplněném 10% FCS. Lidská astrocytomová buněčná line, 132INI, se získá od Dr. Richard Jope z Psychiatry Department of University of Alabama v Birminghamu, a kultivuje se v DMEM doplněném 5% FCS.
Solubilní rekombinantní lidský TRAIL, zakoupený od Alexis Corporation (San Diego, CA), je fuzní protein složený z extracelulámí domény lidského TRAIL (aa zbytků 95 až 281) fúzované N-koncem na FLAG-koncovku a 8 aminokyselinový spojovací peptid. Oproti dříve popsanému TRAIL s His koncovkou tento přípravek TRAIL neindukuje sám silnou apoptotickou odpověď
-33 CZ 304614 B6 v Jurkat buňkách a vyžaduje anti-FLAG protilátku jako zesíťovací činidlo pro zesílení apoptosy. Anti-FLAG protilátky byly také zakoupeny od Alexis.
Všech 10 testovaných lidských maligních gliomových buněk exprimuje detekovatelné množství DR5 na povrchu buněk. Většina buněk exprimuje vysoká množství DR5, jak je uvedeno na obr. 2b. Tři linie, D-54MG, U373MG a CH-235MG, exprimují vysoké koncentrace DR5, zatímco šest linií, Hs-683, U251-MG, D37-MG, U87, SMK1 a 1321N1, exprimuje střední koncentrace DR5. Pouze jedna buněčná linie, H-465, exprimuje nízké koncentrace DR5. Všechny tři buněčné linie karcinomu prostaty exprimují vysoké koncentrace DR5, jak je uvedeno na obr. 2c.
Stejně jako normální primární T-lymfocyty primární B lymfocyty neexprimují významné koncentrace DR5 a nepodléhají apoptose po ošetření TRAIL nebo TRA-8 (obr. 2d). Tři (SKW6.4, EB-3, a Ráji) ze čtyř testovaných B lymfomových buněčných linií exprimuje relativně vysoké koncentrace DR5 a jsou velmi citlivé na TRAIL i TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Čtvrtá buněčná linie, Daudi, exprimuje velmi nízké koncentrace DR5 a je mnohem méně citlivá na TRAIL nebo TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Ačkoliv primární astrocyty neexprimují detekovatelné koncentrace povrchových DR5 (obr. 2b'), exprimují všechny čtyři testované gliomové buněčná linie vysoké koncentrace DR5. Vyšší hladina exprese DR5 na gliomových buňkách než na T a B lymfocytech není doprovázena významně vyšší citlivostí na TRAIL a DR5-zprostředkovanou apoptosu, což naznačuje, že úroveň povrchové exprese DR5 nekoreluje nutně s úrovní apoptosy nádorových buněk. RT-PCR, provedená pro určení koncentrace mRNA DR4, DR5 a DcR2, detekovala mRNA u všech testovaných buněk (Tabulka 1). Nicméně, obecně, primární normální buňky exprimují relativně nízké koncentrace DR5 ve srovnání s transformovanými nádorovými buňkami.
Tabulka 1: RT-PCR analýza exprese TRAIL receptoru*
| Buňky | DR5 | DR4 | DcR2 |
| primární T-lymfocyty | <0.001 | <0.001 | 0.015 |
| Jurkat | 0.10 | <0.001 | 0.21 |
| CEM-6 | 0.50 | 0.59 | 0.25 |
| Molt-4 | 0.10 | <0.001 | 0.05 |
| H-9 | 0.73 | 0.61 | 0.07 |
| primární B lymfocyty | <0.001 | <0.001 | 0.024 |
| SKW6.4 | 0.95 | 0.66 | 0.45 |
| EB3 | 0.40 | <0.001 | 0.35 |
| Ráji | 0.55 | 0.11 | 0.45 |
| Daudi | 0.73 | 0.36 | 0.63 |
| Normální astrocyty | 0.05 | <0.001 | 0.12 |
| SH683 | 0.56 | 0.96 | 0.14 |
| U87 | 0.44 | 0.56 | 0.21 |
| D54 | 1.15 | 0.46 | 0.12 |
| 1321N1 | 0.25 | 0.35 | 0.05 |
* Celková RNA se izolovala z buněk a provedla se RT-PCR způsobem popsaným ve technikách. PCR produkty se separovaly na 3% agarosovém gelu a analyzovaly se pomocí Fluor-S MAX Multilmager System (BioRad). Hodnoty jsou uvedeny jako poměry vzhledem k beta-aktinu.
-34CZ 304614 B6
Příklad 8. Indukce apoptosy in vitro u maligních buněk
Pro stanovení toho, zda TRA-8 indukuje apoptosu transformovaných buněk in vitro, se všechny DR5-pozitivní nádorové buňky testovaly na jejich citlivost na apoptosu indukovanou TRA-8 nebo TRAIL.
Cílové buňky (1 χ 103 na jamku) se kultivují v 96-jamkových plotnách za přítomnosti uvedených koncentrací solubilního TRAIL plus zesíťovacího činidla (Alexis) nebo TRA-8 při 37 °C přes noc. Životaschopnost buněk se určí za použití (1) ATPLite kit podle návodu výrobce (Packard Instruments, Meride, Cl); (2) kitu pro hodnocení MTT lymfocytámí proliferace/ životaschopnosti (Sigma); nebo (3) PI barvení mrtvých buněk a analýzy průtokovou cytometrií. Na konci kultivace se buňky barví 10 pg/ml PI a PI negativní buňky se hodnotí jako živé buňky. Pro analýzu kondenzovaných jader hepatocytů se buňky barví 10 ng/ml Hoechst 33352 (Molecular Probes) a analyzují se průtokovou cytometrií.
TRA-8 protilátka je schopná indukovat apoptosu u většiny maligních lidských gliomových buněčných linií (9/10), u 2 ze 3 buněčných linií karcinomu prostaty, a u 2 ze 4 DR5-pozitivních hematopoetických buněčných linií. Neindukuje apoptosu u Molt-4 buněčné linie, která exprimuje téměř nedetekovatelné povrchové koncentrace DR5. Úroveň citlivosti buněk na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu se však významně liší mezi buněčnými liniemi.
Variabilita citlivosti buněk na TRA-8 protilátkou indukovanou apoptosu naznačuje, že ačkoliv je nutná minimální úroveň povrchové exprese DR5, není úroveň povrchové exprese DR5 nutně primární determinantou citlivosti a další faktory ovlivňují tento proces. Ačkoliv gliomové buňky obecně exprimují významně vyšší koncentrace povrchového DR5 než hematopoetické buňky, není citlivost gliomových buněk na apoptosu indukovanou TRA-8 poměrně zvýšena ve srovnání s hematopoetickými buňkami. Citlivost pěti gliomových buněčných linií, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MG a 1321N1, na TRA-8-indukovanou apoptosu, je vysoká aje ekvivalentní jejich citlivosti na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 3b. Dvě gliomové buněčné linie, H—456 a SMK1, jsou mnohem méně citlivé na apoptosu indukovanou TRA-8. V případě H-456 buněk je povrchová exprese DR5 nízká; nicméně, povrchová exprese DR5 na SMK1 je podobná jako u citlivější buněčné linie, což naznačuje, že i jiné mechanismy mohou ovlivňovat citlivost na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Ačkoliv všechny tři buněčné linie karcinomu prostaty exprimují vysoké koncentrace DR5, jsou Dul45 buňky nejvíce senzitivní na TRA-8-indukovanou apoptosu, PC3 buňky jsou částečně senzitivní, zatímco LnCAP buňky jsou zcela resistentní, jak je uvedeno na obr. 3c. Z hematopoetických buněk jsou Jurkat a CEM—6 velmi citlivé na TRA—8— apoptosu, jak je uvedeno na obr. 2a, ačkoliv bylo zjištěno, že obě tyto buněčné linie exprimují nízké koncentrace DR5. Ačkoliv je DR5 detekovatelný na U937 buňkách, jsou tyto buňky resistentní na TRA-8-indukovanou apoptosu. Obdobně, ačkoliv H-9 buňky exprimují detekovatelné koncentrace DR5, jsou H-9 buňky resistentní na apoptosu indukovanou TRA-8. Tyto výsledky ukazují na existenci regulačních mechanismů, které ovlivňují DR5-zprostředkovanou apoptosu.
Další vazba anti-DR5 protilátek na povrch buněk se provede postupem podle příkladů 1 až 3. Dvě další anti-DR5 protilátky označené TRA-1 a TRA-10 se testují společně s TRA-8 pro srovnání schopnosti indukovat apoptosu a tak působit jako agonisté nebo naopak blokovat TRAILzprostředkovanou apoptosu, a tak působit jako antagonisté. Lidské Jurkat buňky se použijí jako cíl pro určení agonistické a/nebo antagonistické aktivity tří anti-DR5 protilátek označených jako TRA-1, TRA-8 a TRA-10. Jak je uvedeno na obr. 4, je životaschopnost buněk přibližně 90%, 70% a 20% pro TRA-10, TRA-1 a TRA-8, v příslušném pořadí, po inkubaci přes noc s 2,5 pg na ml. TRA-8 indukuje silnou apoptotickou odpověď závislou na dávce, zatímco TRA-1 indukuje pouze středně silnou apoptotickou odpověď a TRA-10 indukuje pouze slabou odpověď. TRA-8 je proto klasifikována jako agonistická anti-DR5 protilátka. Na obr. 4 je ukázána životaschopnost lidských Jurkat buněk jako íunkce TRAIL-indukované apoptosy závislé na dávce. TRA-10 významně blokuje apoptosu lidských Jurkat buněk při testu TRAIL-indukované apop-35CZ 304614 B6 tosy za použití nízkých dávek. Proto je TRA-10 klasifikována jako antagonistická anti-DR5 protilátka. TRA-1 je uložena v American Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem PTA-1741. TRA-10 je také uložena v American Type Culture Collection pod přírůstkovým číslem PTA-1742.
Citlivost pěti gliomových buněčných linií, D-37MG, D54-MG, U373-MG, CH235-MH a 1321N1, na TRA-8-indukovanou apoptosu, je ekvivalentní jejich citlivosti na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 3b, což ukazuje, že TRAIL-indukovaná apoptosa těchto buněk je zprostředkovaná primárně DR5. Dále, dvě gliomové buněčné linie, Hs683 a U251-MG, jsou resistentní na TRAIL-indukovanou apopotosu, ale jsou částečně senzitivní na TRA-8-indukovanou apoptosu, což ukazuje, že v těchto buňkách jsou účinné falešné receptory a že použití TRA-8 protilátky překonává tento regulační mechanismus. V buněčných liniích karcinomu prostaty, přes různou senzitivitu na apoptosu indukovanou TRA-8, tato paralelní senzitivita buněk na apoptosu indukovanou TRAIL opět ukazuje, že DR5 má hlavní význam pro TRAIL-zprostředkovanou apoptosu v buňkách karcinomu prostaty. U hematopoetických buněk bylo zjištěno, že Jurkat a CEM-6 jsou velmi citlivé na TRA-8 i TRAIL-zprostředkovanou apopotosu. Úroveň apoptosy indukované TRA-8 je srovnatelná s úrovní indukovanou TRAIL, jak je uvedeno na obr. 2a a 3a'. Pouze jedna z gliomových buněčných linií, U87, a dvě hematopoetické buněčné linie, U937 a Molt-4, vykazují senzitivitu na TRAIL-indukovanou apoptosu, ale jsou méně citlivé nebo resistentní na TRA-8-indukovanou apoptosu. Jedna buněčná linie, H9 buněčná linie, exprimuje detekovatelné koncentrace DR5, ale je resistentní na apoptosu indukovanou TRA-8 nebo TRAIL. Ačkoliv jsou minimální úrovně exprese DR5 nutné pro TRA8-indukovanou apoptosu, neurčují úrovně exprese DR5 nutně citlivost buněk na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu; falešné receptory mají úlohu při modulování TRAIL-zprostředkované apoptosy v některých buňkách, ale nezdá se, že by měly hlavní úlohu u většiny dosud testovaných buněk; předpokládá se, že TRA-8 protilátka překonává efekt falešných receptorů; funkční mutace DRS receptoru mohou být přítomny v transformovaných buňkách; a, nakonec, intracelulámí regulační mechanismy mohou být také významné, nebo významnější, než falešné receptory, v definování citlivosti buněk na TRAIL a DR5-zprostředkovanou apoptosu.
Předchozí pokusy ukázaly, že mRNA pro DR5 je široce distribuována v normálních tkáních (7). Pro hodnocení exprese DR5 na proteinové úrovni se panel homogenizátů normálních lidských tkání (Geno Technology, st. Louis, MO) sonduje TRA-8 protilátkou ve westernové analýze. Z devíti normálních lidských tkání je mozková tkáň slabě pozitivní (obr. 5a, dráha 2). DR5 protein není detekovatelný TRA-8 reaktivitou vjátrech (dráha 1), plících (dráha 3), ledvinách (dráha 4), slezině (dráha 5), varlatech (dráha 6), vaječnících (dráha 7), srdci (dráha 8) nebo pankreasu (dráha 9). Naopak, všech třináct lidských nádorových tkání se barvilo pozitivně TRA-8 (Obr. 5b), včetně karcinomů vaječníků (dráha 1), plic (dráha 2), jater (dráha 3), rekta (dráha 4), čípku děložního (dráha 5), kůže (dráha 6), varlat (dráha 7), štítné žlázy (dráha 5), dělohy (dráha 10), žaludku (dráha 11), laryngofaryngu (dráha 12) a pankreas (dráha 13). Dále, in sítu imunohistochemické barvení normální a nádorové tkáně TRA-8 potvrdilo, že kromě několika rozptýlených pozitivních buněk ve slezině není DR5 exprese v normálním prsu, plících a slezině detekovatelná (Obr. 5c). Příslušné nádorové tkáně včetně infiltrujícího duktálního karcinomu prsu, malobuněčného karcinomu plic a lymfomu reagovalo pozitivně s TRA-8 (obr. 5d). Z celkem 22 vyšetřovaných nádorových tkání reagovalo 5 ze 6 nádorů prsu, 2 z 2 nádorů čípku děložního, 4 až 5 nádorů jater, 5 z 8 lymfomů, 2 z 2 karcinomů plic a 2 z 2 karcinomů prostaty pozitivně s TRA-8. Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky analýzy průtokovou cytometrií a ukazují, že nádorové tkáně exprimují vyšší koncentrace DR5 proteinu než normální tkáně.
Příklad 9. Tumoricidní aktivita TRA-8 in vivo
Z různých důvodů nemají mnohá činidla, která mají slibné výsledky v pokusech in vitro, účinnost in vivo. Pro tento účel se TRA-8 anti-lidská DR5 protilátka podá myším s lidskými xeno-36CZ 304614 B6 transplantáty, které exprimují lidskou DR5 molekulu. Použité myši jsou stáří 6 až 8 týdnů NOD/SCID myši (Jackson Laboratory), které mají podkožně naočkované lidské astrocytomové 1321N1 buňky (1x107), nebo intravenózně naočkované lidské leukemické Jurkat buňky (1x106). V den 2 po naočkování nádoru se myši naočkují intravenózně TRA-8 (100 pg). Pět dnů po aplikaci TRA-8 se růst 132INI nádoru určí podle velikosti a hmotnosti nádoru. Růst Jurkat buněk se určí podle hmotnosti sleziny a procenta lidských CD3-pozitivních Jurkat buněk ve slezině zvířat. Provedou se biopsie nádorové tkáně a tato tkáň se vyšetří histologicky.
Časná léčba jednou intravenózní dávkou 100 pg TRA-8 v den 1 po naočkování nádoru zcela inhibuje tvorbu solidního nádoru 132INI buněk (obr. 6a). Pozdější léčba třemi dávkami 100 pg TRA-8 první týden po naočkování nádoru redukuje 4-krát nebo vícekrát hmotnost nádoru (obr. 6b). Vznik nádoru není viditelný u zvířat léčených časně TRA-8 (obr. 6c, horní panel). Histologická analýza ukazuje dramaticky degenerovanou nádorovou tkáň u zvířat léčených TRA-8 (obr. 6c, dolní panel). Obdobně, léčba TRA-8 inhibovala slezinnou populaci Jurkat buněk, jak se to projevilo na malém počtu CD3-pozitivních Jurkat buněk ve slezině (obr. 6d, 6e).
Histologická analýza implantovaných nádorů ukázala několik nádorových buněk rozptýlených v měkkých tkáních u zvířat léčených TRA-8, zatímco u kontrol byla patrná tvorba solidních nádorů, jak je uvedeno na obr. 6c. V modelu Jurkat buněk je počet Jurkat buněk ve slezinách zvířat léčených TRA-8 menší než 2 %, ve srovnání s téměř 10 % ve slezinách kontrolních zvířat, jak bylo zjištěno analýzou průtokovou cytometrií uvedenou na obr. 6a a in sítu CD3 barvením na obr. 6c.
Tyto výsledky potvrzují nedávné pozorování, že systémové podání zesítěných rekombinantních TRAIL inhibuje růst nádoru in vivo (13). Tyto výsledky ukazují, že jediná dávka TRA-8 je vysoce účinná v eliminaci nádorových buněk in vivo.
Protože je anti-lidská protilátka použita na zvířecím modelu, nemůže být hodnocena toxicita podání TRA-8. Nicméně, pokusy s podáváním TRAIL in vivo ukázaly, že s touto léčbou není spojena žádná významná toxicita (13).
Příklad 10: RA synoviální buňky jsou citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu
Většina z předchozích prací týkajících se apoptosy zprostředkované TRAIL se zaměřila na maligní buňky. TRAIL-zprostředkovaná apoptosa podle předkládaného vynálezu je také terapeutická u autoimunitních a zánětlivých onemocnění, jako je RA.
10.1 Analýza povrchové exprese DR5 na RA synoviálních buňkách za použití průtokové cytometrie
Exprese DR5 na panelu 8 primárně kultivovaných synoviálních buněk od pacientů s RA se srovnávala s expresí na 8 primárně kultivovaných synoviálních buňkách od pacientů s osteoartritidou (zde dále OA). 8 kultur primárních RA synoviálních buněk RA-1014, RA-1016, RA1021, RA-512, RA-707, RA-811, RA-716 a RA929 se získaly od Dr. M. Ohtsuki (Sankyo Co., Ltd., Tokyo, Japan) a kultivovaly se vDMEM doplněném 10% FCS, penicilinem streptomycinem a glutamin. 7 kultur primárních OA synoviálních buněk se izolovalo ze synoviální tkáně od pacientů s OA za použití standardní kolagenásové metody a kultivovaly se za stejných podmínek. Počet pasáží všech primárních buněk je menší než 10. Exprese DR5 se určila FACs analýzou, jak je popsána v příkladu 5.
Všechny primární kultury RA buněk exprimují vysoké hladiny povrchových DR5 a mezi těmito buňkami izolovanými od různých pacientů je přítomna pouze malá variabilita v úrovních exprese, jak je uvedeno na obr. 7a. Naopak, povrchová exprese DR5 na povrchu synoviálních buněk izolovaných od pacientů s OA je velmi nízká nebo nedetekovatelná, jak je uvedeno na obr. 7b.
-37CZ 304614 B6
Bylo zjištěno, že SV-40 transformované synoviální buňky exprimují vysoké koncentrace DR5 ve srovnání s RA buňkami. Naopak, netransformované fibroblasty exprimují nízké hladiny DR5 ve srovnání s OA buňkami, jak je uvedeno na obr. 7b.
10.2 Citlivost RA buněk na apoptosu zprostředkovanou TRA-8 nebo TRAIL
Obecně, všechny synoviální buňky izolované od pacientů s RA jsou citlivé jak na TRAIL, tak na anti-DR5 protilátkami zprostředkovanou apoptosu, a všechny OA buňky jsou resistentní, jak na TRAIL, tak na anti-DR5 protilátkami zprostředkovanou apoptosu, jak je uvedeno na obr. 8a, b. Tyto pokusy naznačují, že TRA-8 protilátka se přednostně váže na pozměněné buňky ve srovnání s normálními buňkami. Dále, citlivost nebo resistence na apoptosu indulovanou TRAILkoreluje s apoptosou indulovanou anti-DR5, což naznačuje, že synoviální buňky primárně využívají DR5 pro spuštění TRAIL apoptosy.
Jak bylo popsáno pro maligní buňky, liší se citlivost na apoptosu indukovanou TRAIL nebo anti-DR5 protilátkou mezi RA synoviálními buňkami, ačkoliv exprimují podobné hladiny DR5. RA512 a RA-707 jsou nejcitlivější, protože více než 80 % buněk je usmrceno koncentracemi TRAIL nebo TRA-8 pod 20 ng/ml. RA-1014, RA-811, RA-716 a RA-929 mají střední citlivost na TRAIL nebo TRA-8, s téměř 100% usmrcením buněk za přítomnosti vysokých koncentrací (50 ng/ml) TRAIL nebo TRA-8. U RA-1016 a RA1021 buněk - ačkoliv je většina (více než 60 %) buněk usmrcena nízkou dávkou TRAIL nebo TRA-8 - část buněk přežívá za přítomnosti vysokých koncentrací TRAIL nebo TRA-8, což ukazuje, že subpopulace buněk je resistentní na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu. Naopak, všechny OA buňky jsou mnohem méně citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu. Ne více než 60 % buněk je usmrceno v OA52F a 0A69F, i za přítomnosti vysoké koncentrace TRAIL nebo TRA-8. OA72M buňky jsou zcela resistentní na TRAIL nebo TRA-8 indukovanou apoptosu. SV40 transformované synoviální buňky jsou také citlivé na TRAIL a TRA-8 indukovanou apoptosu (data nejsou uvedena). Naopak, netransformované fibroblasty se zdají být resistentní na TRAIL a TRA-8.
Již dříve bylo prokázáno, že DR5 využívá FADD/caspasa 8 dependentní dráhu pro spuštění apoptosy (44). Pro stanovení závislosti DR5-zprostředkované apoptosy na capsasách v RAsynoviálních buňkách se RA buňky kultivují s TRAIL nebo anti-DR5 protilátkou za přítomnosti specifických inhibitorů caspas. Z osmi testovaných inhibitorů caspas jsou inhibitory caspasy 6, 8 a 10 schopny inhibovat apoptosu RA synoviálních buněk indukovanou jak TRAIL, tak DR5, jak je uvedeno na obr. 9, což ukazuje, že tyto tři caspasy se podílejí na DR5-zprostředkované apoptose.
10.3 TRA-8 nebo TRAIL indukuje aktivaci NF-kappa-b v RA synoviálních buňkách bez zvýšení uvolňování MMP
Existují významné důkazy podporující předpoklad, že existuje těsná vazba mezi signalizací apoptosy a signalizací proliferace (45). Bylo zjištěno, že DR5 je schopen aktivovat NF-kappa-b dráhu, kromě přenosu signálu pro apoptosu, a že aktivace NF-kappa-b může přenášet antiapoptotický signál. Proto se provede test posunu na gelu. Buňky se stimulují 50 ng/ml rekombinantního solubilního TRAIL, Fas ligandů, za přítomnosti 1 mg/ml zesilovače, nebo 50 ng/ml TRA-8, po uvedenou dobu. Připraví se jaderné extrakty a provede se inkubace s dvojitě značenou [32P]-značenou oligo-DNA sondou. Výsledky se analyzují za použití cyklon phosphaimager (TopCounter NXT, Packard Instrument Company, CT). Po inkubaci RA synoviální buněk s TNF-alfa nebo TRAIL je NF-kappa-b aktivován v závislosti na čase. TRA-8 protilátka je schopna silně aktivovat NP-kappa-b. Naopak, Fas ligand je neschopen indukovat aktivaci NFkappa-b, jakje uvedeno na Obr. 10a.
Proto, ačkoli TRAIL a TRA-8 protilátky indukují silně apoptotickou odpověď u RA synoviálních buněk, mohou také aktivovat NF-kappa-b, a aktivace NF-kappab může přispívat k prozánětlivé úloze TNF-alfa u RA. Tak je možné, že TRAIL, stejně jako TNF-alfa, může účinkovat jako
-38CZ 304614 B6 prozánětlivý cytokin. Pro určení toho, zda existují podobné biologické následky aktivace NF-kappab indukované TRAIL a TNF-alfa se produkce MMP určí ELISA. Synoviální buňky se kultivují v médiu samotném nebo s 50 ng/ml interleukinu lb, 10 ng/ml TNF-alfa, 50 ng/ml TRAIL, nebo 50 ng/ml TRA-8, přes noc. Koncentrace MMP-1 a MMP-3 v supematantech kultur se určí za použití ELISA kitů.
Když se RA synoviální buňky inkubují s prozánětlivým cytokinem, TNF-alfa nebo II—lb, tak je produkce MMP-1, 3, a 13 zvýšena ve srovnání s kontrolním médiem, jakje uvedeno na obr. 10 b,c. Naopak, aplikace TRAIL nebo anti-DR5 protilátky není spojena s zvýšením uvolňování těchto MMP.
Příklad 11 A. Selhání indukce hepatocelulámí toxicity
Pro test 24-hodinové životaschopnosti buněk se čerstvé normální lidské hepatocyty v 96-jamkových plotnách získají od In Vitro Technology (Baltimore, MD). Hepatocyty se kultivují v Hepatocyte Kultury Medium obsahujícím 1 pg/ml buď solubilního TRAIL, nebo TRA-8. Pro test 6hodinové životaschopnosti se normální hepatocyty nebo buňky hepatocelulámího karcinomu izolují z čerstvých chirurgických vzorků odebraných v UAB Tissue Procurement Center. Všechna reakční činidla pro izolaci lidských hepatocytů, včetně hepatocytámího perfúzního pufru, trávicího média, promývacího média a vazebného média se získají od Gibco. Tkáňové řezy se tráví vHepatocyte Digest Medium při 37 °C za třepání (50 rpm) po dobu jedné hodiny. Izolované hepatocyty se získají odstředěním při nízké rychlosti (50 g, 3 mm), a promyjí se 6-krát hepatocytámím promývacím médiem. Suspenze jednotlivých hepatocytů se kultivuje v Attachment Medium obsahujícím 10% FCS v 96-jamkových Matrigel plotnách (BD) po dobu 6 hodin. Nenavázané hepatocyty se odstraní dvojím promytím předem zahřátým vazebným médiem. Navázané hepatocyty se dále inkubují s různými koncentracemi solubilního TRAIL nebo FasL za přítomnosti zesíťovacího činidla, nebo TRA-8 nebo CH11 po dobu 6 hodin.
TRAIL má alespoň dva receptory (DR4 a DR5), které jsou schopné indukovat apoptosu. TRA-8 se použije pro určení toho, zda zesítění DR5 samotného se schopné indukovat apoptosu normálních hepatocytů. DR5 exprese na proteinové úrovni se stanoví nejprve v pěti lidských jatemích tkáních a pěti tkání nádorů jater pomocí in šitu imunohistochemického vyšetření za použití TRA8. Řezy z normální jatemí tkáně vykazují normální architekturu a buněčnou morfologii při barvení H&E (obr. 11a, levé horní panely) za nepřítomnosti pozitivní reaktivity s TRA-8 na DR5 (obr. 11a, levé dolní panely). Naopak, tkáně lidských hepatocelulámích karcinomů reagují pozitivně s TRA-8 způsobem odpovídajícím přítomnosti DR5 na membráně a v cytoplasmě nádorových buněk. Lidské buněčná linie hepatocelulámího karcinomu HepG2 je také pozitivní na DR5. Tyto výsledky jsou v souladu s pěti normálními jatemími tkáněmi, a pouze jedna (jatemí adenom) z pěti jatemích nádorových tkání je DR5-negativní. Tyto výsledky jsou v souladu s daty z Westernové analýzy uvedenými na obr. 5a, to znamená, stejně jako jiné normální tkáně, normální lidské jatemí tkáně neexprimují významné koncentrace DR5 proteinu. Dále, Westernová analýza izolovaných, normálních lidských hepatocytů sondovaných TRA-8 neukazuje detekovatelné koncentrace DR5.
Povrchová exprese DR5 na lidských hepatocytech analyzovaná průtokovou cytometrií ukazuje, že čerstvě připravené normální hepatocyty neexprimují detekovatelné koncentrace povrchového DR5 (Obr. 11b, horní levé panely). Tato exprese není detekována ani na normálních lidských hepatocytech, které byly kryokonzervovány nebo krátkodobě kultivovány. Naopak, čerstvě izolované buňky hepatocelulámího karcinomu, stejně jako HepG2 buňky, exprimují povrchové DR5. Za použití Fas pro srovnání normální hepatocyty, buňky hepatocelulámího karcinomu a HepG2 buňky všechny exprimují ekvivalentní koncentrace Fas (obr. 11b, dolní panely). Tyto výsledky jsou v souladu s výsledky získanými za použití in šitu imunohistochemického vyšetření a Westernové analýzy a ukazují, že povrchové DR5 jsou značně exprimované v nádorových jatemích buňkách, ale ne na normálních hepatocytech. Přítomnost určitých koncentrací mRNA pro DR4,
-39CZ 304614 B6
DR5, DcRl a DcR2 v lidských hepatocytech prokázaná RT-PCR (23) naznačuje, že lidské hepatocyty mohou exprimovat velmi nízké koncentrace DR5 proteinu, které jsou pod prahem detekce pomocí TRA-8.
Pro určení toho, zda TRA-8 indukuje hepatocelulámí toxicitu, se testuje citlivost normálních lidských hepatocytů na apoptosu indukovanou TRA-8 a solubilním TRAIL plus zesíťovacím činidlem. Když se normální hepatocyty kultivují za přítomnosti vysoké koncentrace TRAIL, tak se pozoruje snížení životaschopnosti buněk závislé na čase pomocí AIPLite (obr. 12a) a MIT testů. TRAIL-zprostředkovaná apoptosa normálních hepatocytů může být pozorována již za 4 hodiny po přidání TRAIL. Na konci 24-hodinové kultivace je více než 80 % hepatocytů usmrceno TRAIL. Naopak, během stejného kultivačního období TRA-8 neindukují významnou apoptosu v normálních hepatocytech. Kondenzovaná jádra barvená Hoechst, a charakteristická pro apoptosu, se zvyšují u TRAIL-ošetřených, ale ne u TRA-8-ošetřených hepatocytů (obr. 12b). Počet apoptotických hepatocytů dobře koreluje se sníženou životaschopností buněk, jak je určena AIPLite testem, což naznačuje, že TRAIL-indukovaná smrt hepatocytů je zprostředkovaná apoptosou. Toto je potvrzeno schopností Z-VAD inhibovat TRAIL-zprostředkovanou toxicitu u hepatocytů. Protože je cykloheximid účinný zesilovač apoptosy, zkoumal se efekt této sloučeniny na TRAIL a TRA-8-ošetřené hepatocyty. Během 4-hodinové kultivace cykloheximid významně zesílil smrt hepatocytů indukovanou TRAIL, kdy bylo více než 70 % hepatocytů usmrceno TRAIL za přítomnosti cykloheximidu (obr. 12c). Nicméně, aplikace cyklohexímidu není schopna zesílit TRA-8-zprostředkovanou smrt hepatocytů. Pro srovnání charakteristik apoptosy indukované TRA-8 s apoptosou indukovanou TRAIL v hepatocytech se normální hepatocyty, stejně jako nádorové buňky inkubují s různými koncentracemi solubilního TRAIL se zesíťovacím činidlem nebo TRA-8. Během 6-hodinové kultivace TRAIL indukuje střední apoptotickou reakci v normálních hepatocytech. Více než 20 % hepatocytů je usmrceno za přítomnosti 500 ng/ml TRAIL (obr. 12d, horní levý panel). Ošetření normálních hepatocytů TRA-8 neindikuje během stejné doby žádnou významnou apoptotickou odpověď. Oproti normálním hepatocytům jsou buňky primárního hepatocelulámího karcinomu (obr. 12d, horní střední) a HepG2 buňky (obr. 12d, horní pravý) vysoce citlivé na apoptosu zprostředkovanou TRAIL nebo TRA-8. Více než 80 % buněk hepatocelulámího karcinomu a téměř 100 % HepG2 buněk je usmrceno během 8-hodinové kultivace. Tyto výsledky ukazují, že normální hepatocyty jsou zcela resistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, a jsou mnohem méně citlivé na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, než jsou jatemí nádorové buňky. Za použití Fas ligandu aanti-Fas protilátky (CH-ll) neexistuje významný rozdíl v citlivosti na Fas-zprostředkovanou apoptosu mezi normálními hepatocyty, buňkami hepatocelulámího karcinomu a HepG2 buňkami (obr. 12d, dolní panely).
Srovnávací příklad 1 IB. In vivo indukce hepatitidy lidským membránovým TRAIL až 10 týdnů starým B6 myším se intravenózně podá 109 pfu Ad/hTRAIL se stejným počtem Ad/Tet-on. Myším se potom podávají různé koncentrace tetracyklinu ve vodě k pití, bezprostředně po inokulaci adenovirovými vektory. Poškození jater se určí podle sérové koncentrace AST za použití AST diagnostického kitu (Sigma). Exprese TRAIL se určí by Northemovou analýzou.
Pro stanovení toho, zda membránová forma TRAIL indukuje poškození jater in vivo, se připraví rekombinantní adenovirový vektor kódující kompletní lidský TRAIL (Ad/hTRAIL), jehož exprese je řízena tetracyklinem-indukovatelným promotorem 24 hodin po intravenózní inokulaci B6 myší Ad/hTRAIL se tetracyklinem-indukovaná exprese lidského TRAIL pozoruje v játrech v závislosti na dávce, jak se zjistí Northemovou analýzou (obr. 13a). Úroveň exprese TRAIL dobře koreluje s poškozením jater, jak je patrné na zvýšení sérové koncentrace transaminas závislé na tetracyklinu, opět v závislosti na dávce (obr. 13b). Protože inokulace adenovirovým vektorem samotným může zvyšovat citlivost hepatocytů na TRAIL-zprostředkovanou apoptosu, izolují se hepatocyty od myší naočkovaných Ad/TRAIL a testují se na TRAIL-zprostředkovanou
-40CZ 304614 B6 smrt buněk. Není pozorována významně zvýšená smrt buněk u hepatocytů infikovaných Ad/TRAIL ve srovnání s hepatocyty od kontrolním myší (obr. 13 c, levý panel). Dále, Ad/TRAIL inokulované myši nevykazují vyšší poškození jater po intravenózní injekci solubilního lidského TRAIL. Proto se předpokládá, že hepatitida indukovaná Ad/TRAIL je zprostředkovaná vysokými koncentracemi exprese TRAIL v membránové formě. Histologická analýza jatemích řezů ukázala, že poškození hepatocytů je patrné již za 24 hodin po inokulaci vektoru (obr. 13d), a persistuje po alespoň 7 dnů (obr. 13e). Tyto patologické alterace jater jsou také závislé na tetracyklinu a na dávce. Časná fáze, během 24 hodin léčby, TRAIL-indukovaného poškození jater, je charakterizována ložisky nekrózy. V tomto stadiu není pozorována infiltrace zánětlivých buněk, ale jsou patrné hemorhagie, v den 7 po inokulaci je patrné difusní poškození jater s vyznačenou desintegrací lobulů, závažnou degenerací hepatocytů s nepravidelnou cytoplasmou a velkými čirými oblastmi, a s významnou apoptosou a nekrózou. Významný infiltrát mononukleámích buněk je charakteristickým rysem tohoto stadia. Tyto výsledky ukazují, že lidský TRAIL v membránové formě je schopen indukovat jatemí poškození in vivo. I přes značnou pravděpodobnost indukce závažné hepatitidy u myší lidským TRAIL neindukuje lidský TRAIL letální reakci. Naopak, myši naočkované podobnými tetracyklinem-kontrolovanými vektory kódujícími Fas ligand vykazují fulminantní hepatitidu s masivní apoptosou a nekrózou hepatocytů doprovázenou těžkou hemorhagií a mortalitou vyskytující se v závislosti na dávce tetracyklinu během 72 hodin po inokulaci. Mortalita dosahuje 100% během 48 hodin u podskupin s aplikací 3 mg/ml nebo více tetracyklinu. Naopak, všechny myši, kterým byl podán Ad/hTRAIL, bez ohledu na dávku tetracyklinu, jsou naživu za čtyři týdny po inokulaci. Proto se zdá, že in vivo je membránová forma TRAIL méně účinná v indukci hepatocelulámího poškození než Fas ligand. Dále se zdá, že TRAIL může indukovat poškození jater mechanismem, který je jiný než mechanismus odpovědný za toxicitu Fas ligandu.
Příklad 12. Aktivované lidské T a B lymfocyty exprimují zvýšené koncentrace DR5.
Pro určení toho, zda má DR5 úlohu v TRAIL-zprostředkované apoptose aktivovaných T lymfocytů a B lymfocytů, se testuje povrchová exprese DR5 na klidových a aktivovaných T a B lymfocytech za použití TRA-8. Nestimulované lidské T lymfocyty v PBMC neexprimují významné koncentrace DR5 (obr. 14). Za 48 hodin po stimulaci buď anti-CD3, nebo Con-A, se povrchová exprese DR5 významně zvýší. Obdobně, nestimulované B lymfocyty exprimují velmi nízké koncentrace DR5. Stimulace anti-u, ale ne LPS, vede ke zvýšení povrchové exprese DR5. Tyto výsledky ukazují, že aktivované T i B lymfocyty exprimují vysoké koncentrace povrchového DR5. Buňky se barví 20 pg/ml TRA-8 a PE anti-myší IgGl.
Příklad 13. Aktivované T a B lymfocyty jsou citlivé na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu
Pro stanovení toho, zda jsou aktivované T a B lymfocyty citlivé na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, se T lymfocyt a B lymfocyty lidských PBMC stimulují anti-CD3 nebo anti-u in vitro po dobu 48 hodin, v příslušném pořadí. Živé buňky a proliferující blasty se získají gradientovým odstředěním a provede se inkubace s různými koncentracemi TRA-8. Nestimulované T lymfocyty a B lymfocyty nejsou citlivé na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu (obr. 15). Celkově vykazovaly stimulované T-lymfocyty a B lymfocyty střední citlivost na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu, s 20 % buněk usmrcenými TRA-8 po kultivaci přes noc. Vysoce proliferující blastické T lymfocyty jsou ještě citlivější na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu. Více než 70 % blastických T lymfocytů může být usmrceno TRA-8. Blastické B lymfocyty jsou také více citlivé na TRA-8 zprostředkovanou apoptosu ve srovnání s ostatními B-lymfocyty. Tyto výsledky ukazují, že aktivované T a B lymfocyty jsou citlivé na DR5-zprostředkovanou apoptosu.
-41 CZ 304614 B6
Příklad 14. TRA-8 způsobuje depleci aktivovaných T-lymfocytů u lidí/SCID myší
Pro stanovení in vitro anti-T lymfocytámí účinnosti TRA-8 se NOD/SCID myším intravenózně injikovalo 1x108 lidských PBMC. Za normálních okolností jsou lidské T-lymfocyty u SCID myší rychle aktivované v reakci na xenogenní stimulaci. SCID myším s lidskými PBMC se intraperitoneálně podávalo 100 pg TRA-8 nebo kontrolního IgGl, od dne přenosu, jednou za tři dny. 5 dnů po přenosu se mononukleámí buňky izolovaly ze sleziny a barvily se anti-lidskou CD3 protilátkou, lymfocytámí populace se separovala průtokovou cytometrií, a analyzovaly se CD3 pozitivní lidské buňky. Přibližně 30 % lymfocytů sleziny jsou lidské T-lymfocyty, jak se určilo anti-lidskou CD3 protilátkou u myší léčených kontrolním přípravkem. Nicméně, pouze několik lidských T-lymfocytů (méně než 3 %) se pozorovalo v lymfocytech sleziny u myší léčených TRA-8 (obr. 16). Histologické vyšetření in šitu ukázalo, že ve slezině kontrolní myší jsou lidské T-lymfocyty repopulovány a je přítomno pouze několik apoptotických buněk, jak se určí TUNEL barvením. Naopak, repopulace živých lidských T-lymfocytů není pozorována ve slezinách myší léčených TRA-8 a místo toho jsou pozorovány apoptotické buňky (obr. 17), Tyto výsledky ukazují, že TRA-8 má anti-T-lymfocytámí aktivitu in vivo, a ukazují na použitelnost protilátek podle předkládaného vynálezu pro léčbu GVH nemoci.
Příklad 15. Protinádorová terapeutická aktivita TRA-8
15.1 Exprese a funkce DR5 v lidské nádorové tkáni a buněčných liniích
i) DR5 exprese v lidských nádorových tkáních stanovená in šitu barvením pomocí TRA-8. Pro stanovení toho, zda nádorové buňky a tkáně odlišně exprimují vyšší koncentrace DR5 se panel lidských nádorových tání, včetně více než 20 karcinomů prsu, 6 karcinomů vaječníků, 5 karcinomů tlustého střeva a 5 karcinomů prostaty, barvil TRA-8 pro imunohistochemické vyšetření. Většina z těchto nádorových tkání exprimovala detekovatelnou expresi DR5. Úroveň exprese DRS v těchto nádorových tkáních byla různá. Obecně, nádorové tkáně exprimují vyšší koncentrace DR5 než nenádorové tkáně. Dále, DR5 exprese nekoreluje s mutacemi p53.
ii) Exprese a funkce DR5 v lidských nádorových buněčných liniích (tabulka 2) lidských buněčných linií karcinomu prsu, 3 buněčné linie karcinomu ovaria, 3 buněčné linie karcinomu vaječníků a 3 buněčné linie karcinomu prostaty se testovaly na povrchovou expresi DR5 a citlivost na TRA-8-indukovanou apoptosu in vitro. 7 z 9 buněčných linií karcinomu prsu, 3 ze 3 buněčných linií karcinomu vaječníků, 3 ze 3 buněčných linií karcinomu tlustého střeva a 3 ze 3 buněčných linií karcinomu prostaty exprimují různé koncentrace povrchového DR5. Z 9 buněčných linií karcinomu prsu jsou tři velmi citlivé, tři středně citlivé a tři resistentní na TRA-8-zprostředkovanou apoptosu. Všechny tři buněčné linie karcinomu vaječníků jsou velmi citlivé. 1 až 3 buněčných linií karcinomu tlustého střeva je velmi citlivá, zatímco další dvě mají různou senzitivitu. 2 ze 3 buněčných linií karcinomu prostaty mají střední senzitivitu a jedna je resistentní.
-42CZ 304614 B6
Tabulka 2. Exprese a funkce DRS v lidských nádorových buněčných liniích
| Buněčná linie | Zdroj | Exprese 1 | Citlivost 1 |
| 2LMP | prs | + | 4444- |
| LCC6 | prs | +++ | 4-1 II |
| MB468 | prs | , LJ | 1 1-1' |
| MB231 | Prs _ .... | ++ | +++ |
| ZR-75-1 | prs | +++ | -H- |
| SKBR3 | prs | + | ‘ 4+ |
| MB453 | prs | ++ | 4- |
| BT474 | prs | 4* | - |
| DY36T2 | prs | - | - |
| Caov-3 | vaječník | + | 4444 |
| OVCAR-3 | vaječník | ++ | 4-1-1 1- |
| Skov-3 | vaječník | + | 14! |
| WiDR | tlusté střevo | +-H- | t t 1 1 II | i |
| HST29 | tlusté střevo | ++ | 444 |
| T84 | tlusté střevo | 4* | 44 |
| PC3 | prostata | -H4- | 44 |
| LnCap | prostata | +-H- | + |
| Du-145 | ^prostata | +++ | + |
Poznámky: (1) určeno průtokovou cytometrií, buňky barvené 20 pg/ml TRA-8 a srovnávány s kontrolní protilátkou. (2) určeno APLite testem. +++: více než 80 % usmrcení; +++ 60 až 80 % usmrcení; ++: usmrcení mezi 40 až 60 %; usmrcení mezi 20 až 40 %; -: bez usmrcení.
iii) Kombinovaná cytotoxicita TRA-8 s adriamycinem. Na několika buněčných liniích karcinomu prsu se testoval efekt adriamycinu na TRAS-indukovanou apoptosu. Vysoké dávky adriamycinu vykazovaly aditivní efekt. Nicméně, v některých TRA-8 resistentních liniích nízké dávky adriamycinu synergně zesilovaly TRA-8-indukovanou apoptosu.
iv) In vitro a in vivo vazebná aktivita TRA-8 na lidské nádorové buňky. Za použití radioizotopem značené TRA-8 se vazebná aktivita TRA-8 na buněčnou linii karcinomu prsu testuje in vitro a in vivo na SCID myších s implantovanými nádory. In vitro vazebná aktivita na nádorové buňky je Kd hodnota = nM, což je v souladu s dřívějšími testy za použití ELISA, a alespoň 50-krát vyšší než pro solubilní TRAIL. In vivo se TRA-8 lokalizuje do implantované nádorové tkáně.
15.2 Terapie chronické lymfatické leukemia u NOD/SCID myší pomocí TRA-8
Chronická lymfatická leukemie (CLL) je běžnou formou B lymfocytámí malignity. Většina maligních B lymfocytů u CLL má zralý fenotyp a jsou resistentní na většinu apoptotických stimulů. Testuje se exprese a funkce DR5 u B lymfocytů od pěti pacientů s CLL. Všichni pacienti mají vysoké hodnoty periferních B lymfocytů, jakje patrné z více než 95 % CD19+ B lymfocytů v PBMC. Ve srovnání s normálními primárními B lymfocyty mají CLL B lymfocyty od všech pacientů vyšší koncentrace povrchového DR5 a jsou více citlivé na TRA-8 indukovanou apoptosu in vitro. Zajímavé je, že CLL B lymfocyty jsou také senzitivní na bisindolmaleimidem VIII (BisVIII) indukovanou cytotoxicitu. Po kombinované aplikaci TRA-8 a BisVIII je téměř 50 % CLL B lymfocytů usmrceno, zatímco normální B lymfocyty zůstávají bez reakce (obr. 18). Transfer CLL B lymfocytů do NOD/SCID myši vede k repopulaci přibližně 25 až 30 % CD19+ B lymfocytů ve slezině myši 5 dnů po transferu. Nicméně, tři dávky 100 pg TRA-8 zcela eliminují CLL B lymfocyty u 4 z 5 pacientů ve slezině SCID myší. Proto je TRA-8 samostatně nebo společně s dalšími substancemi aktivní jako terapeutické činidlo pro léčbu chronické lymfatické leukemie.
-43CZ 304614 B6
Příklad 16. Klonování cDNA (1) Určení N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8
Pro získání cDNA těžkého a lehkého řetězce TRA-8 se N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 a klonované TRA-8 geny určí za použití známých technik.
pg roztoku obsahujícího protilátku TRA-8 proti lidskému DR5 se zpracuje na SDS-polyakrylamidové gelové elektroforéze („SDS-PAGE“) za použití koncentrace gelu 12%hmotn./obj., V konstantního napětí 100 V, během 120 minut. Po elektroforéze se gel ponoří do přenosového pufru 25mM Tris-HCl (pH 9,5), 20% methanol, 0,02% obj./obj. SDS, na dobu 5 minut. Po této době se protein obsažený v gelu přenese na polyvinyliden-difluoridovou membránu („PVDF membránu“; velikost pórů 0,45 pm; Millipore, Japan), předem namočenou v přenosovém pufru, za použití blotting přístroje (KS-S45 1; Marysol), za podmínek konstantní napětí 10 V, 4 °C, během 14 hodin.
Po této době se PVDF membrána promyje promývacím pufrem (25 mM NaCl, 10 mM pufr boritanu sodného) (pH 8,0), potom se barví v barvícím roztoku (50% obj./obj. methanol, 20% obj ./obj. kyselina octová a 0,05% hmotn./obj. Coomassie Brilliant Blue) po dobu 5 minut pro lokalizaci proteinových proužků. PVDF membrána se potom odbarví 90% obj./obj. vodným methanolem a proužky odpovídající těžkým řetězcům, proužky s malou mobilitou a lehké řetězce a proužky s vyšší mobilitou dříve lokalizované na PDVF membráně se vyříznou a promyjí se deionizovanou vodou.
N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce se určí Edmanovým automatizovaným způsobem (Edman, P., et al., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80) za použití proteinového sekvenátoru s plynnou fází (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.).
N-koncová aminokyselinová sekvence proužku odpovídajícímu těžkému řetězci se určí jako:
Glu-Val-Met-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Lys-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-LysLeu (SEQ ID No.4 seznamu sekvencí); a proužek odpovídající lehkému řetězci se určí jako:
Asp-Ile-Val-Met-Thr-Gln-Ser-His-Lys-Phe-Met-Ser-Thr-Ser-Val-Gly-Asp-Arg-Val-Ser (SEQ ID No. 5 seznamu sekvencí).
Srovnání této aminokyselinové sekvence s databází aminokyselinových sekvencí protilátek podle Kabat et al. (Kabat E. A., et al., (1991), v „Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. 11,“ U.S. Department of Health and Human Services) ukázalo, že těžké řetězce (gammal řetězce) a lehké řetězce (kappa řetězce) TRA-8 patří k podtypům 3d a 1, v příslušném pořadí.
(2) cDNA klonování
Podle výše uvedených zjištění se syntetizují oligonukleotidové primery, které budou hybridizovat na části 5'-netranslatovaných regionů a konce 3'-translatovaných regionů těchto genů náležících k těmto myším subtypům. Potom se cDNA kódující těžké a lehké řetězce TRA-8 klonují následující kombinací reverzní transkripce a PCR (RT-PCR):
a) Templát
Celková RNA TRA-8 hybridomu (ATCC č. PIA-1428) se extrahuje za použití TRIzol Reagent (GIBCO BRL). Jako templát pro PCR reakci se použije cDNA, která se získá za použití First-Strand cDNA Synthesis kitu (Amersham Pharmacia Biotech) podle návodu výrobce kitu.
-44CZ 304614 B6
b) PCR primery
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'-cagcactgaa cacggacccc-3' (H5NCS1: SEQ ID No.6 seznamu sekvencí);
5'-aaaggtaatt tattgagaag-3' (H5NCS2: SEQ ID No. 7 seznamu sekvencí);
5'-cctcaccatg aacttcgggc-3' (H5SS1: SEQ ID No. 8 seznamu sekvencí);
5'-ctgttgtatg cacatgagac-3' (H5552: SEQ ID No. 9 seznamu sekvencí);
5'-gaagtgatgc tggtggagtc-3' (H5CS1: SEQ ID No. 10 seznamu sekvencí);
5'-agtgtgaagt gatgctggtg-3' (H5CS2: SEQ ID No. 11 seznamu sekvencí);
5'-tttaccagga gagtgggaga g-3' (H3CR: SEQ ID No. 12 seznamu sekvencí);
5'-tgcagagaca gtgaccagag-3' (H3VR: SEQ ID No. 13 seznamu sekvencí);
5'-tgttcaggac cagcatgggc-3' (L5NCS1: SEQ ID No. 14 seznamu sekvencí);
5'-aagacatttt ggattctaac-3' (LSNCS2: SEQ ID No. 15 seznamu sekvencí);
5'-tatcatgaagtctttgtatg-3' (L5SS 1: SEQ ID No. 16 seznamu sekvencí);
5'-gatggagaca cattctcagg-3' (L5S52: SEQ ID No. 17 seznamu sekvencí);
5'-gacattgtga tgacccagtc-3' (LSCS: SEQ ID No. 18 seznamu sekvencí);
5'-ttaacactcattcctgttga-3' (L3CR: SEQ ID No. 19 seznamu sekvencí); a
5'-gactgggtca tcacaatgtc-3' (LCSR: SEQ ID No. 20 seznamu sekvencí).
Pokud není uvedeno jinak, tak se všechny oligonukleotidy v těchto příkladech syntetizují za použití Pharmacia Biotech. Všechny oligonukleotidy se uskladní se při -20 °C po rozpuštění v destilované vodě.
c) PCR reakce
Složení PCR reakčního roztoku:
templátová cDNA, 5 μΐ celkem 33 μΐ reakční směsi primer 1,10 pmol;
primer 2,10 pmol;
lOx koncentrovaný PCR pufr (obsažený v kitu), 10 μΐ;
dNTP (každý 2,5 mM), 4 μΐ; a
Taq polymeráza (Promega), 5 jednotek.
Sterilní destilované voda se přidá do roztoku do celkového objemu 100 μΐ. Pokud není uvedeno jinak, jsou dNTP ekvimolámí směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP (2,5 mM každý).
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 2 minut, potom se proved cyklus zahřívání na 94 °C na dobu 30 sekund, 52 °C na dobu 1 minuty
-45CZ 304614 B6 a 72 °C na dobu 3 minut, který se opakuje 40krát. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto získané amplifikované DNA fragmenty se separují na 1% agarosovém gelu obsahujícím 0,25 pg/ml ethidiumbromidu. Proužky obsahující požadované DNA fragmenty se vyříznou za použití čepelky a DNA se získá z těchto proužků za použití Gene Clean kitu (BIO1O1). DNA fragment se skloňuje za použití pGEM-T Easy vektoru (Promega). Toto se provede následujícím způsobem.
DNA fragment získaný z PCR reakčního roztoku, společně s 50 ng pGEM-I Easy vektoru (obsaženého v kitu), se smísí s 1 pl 10 X ligasového reakčního pufru (6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7mM beta-merkaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidinu a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu), do kterého se přidaly 4 jednotky 14 DNA ligasy (1 pl). Celkový objem směsi se upraví na 10 pl sterilní deionizovanou vodou a získaný ligasový roztok se inkubuje při 14 °C po dobu 15 hodin. Po této době se 2 pl ligasového reakčního roztoku přidají k 50 pl kompetentních E. coli kmene JM109 (obsažené v kitu a uvedené do kompetence podle návodu výrobce), do kterých se přidaly 2 pl 0,5 M betamerkaptoethanolu, a získaná směs se ponechá na ledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund a znovu na ledu po dobu 5 minut. Potom se do kultury přidá 500 pl média obsahujícího 2 % obj./obj. tryptonu, 0,5 % hmotn./obj. kvasinkového extraktu, 0,05 % hmotn./obj. chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 1 mM chloridu hořečnatého a 20 mM glukosy (zde dále označované jako „SOC“ médium) a směs se inkubuje rozšíří na L-bujonové agarové plotně (1 % obj./obj. trypton, 0,5 % hmotn./obj. kvasinkový extrakt, 0,5 % hmotn./obj. chlorid sodný, 0,1 % hmotn./obj. glukosa a 0,6 % hmotn./obj. bacto-agar (Difco)), obsahující 100 pg/ml. Kolonie resistentní na ampicilin objevivší se na plotně se selektují a seškrábnou se platinovou kličkou a provede se kultivace vL-bujonovém médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu při 37 °C, přes noc, za třepání při 200 r.p.m. Po inkubaci se buňky odeberou odstředěním a alkalickou technikou se z nich připraví plasmidová DNA. Získaný plasmid se označí jako plasmid pH62 pro těžké řetězce TRA-8 nebo pL2S pro lehké řetězce TRA-8. Transformované kmeny E. coli nesoucí tento plasmid, označené jako E. coli TM109/pH62 a E. coli JMI 09/pL28, se uložily v International Patent Organis Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, podle Budapešťské smlouvy pro ukládání mikroorganismů, a označily se přírůstkovými č. FELM BP-7560 a FERM BP-7561, v příslušném pořadí. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících těžké řetězce a lehké řetězce TRA-8 se potvrdily dideoxy technikou (Sanger, F. S„ et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Nukleotidové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny jako SEQ ID No. 21 a No.22 seznamu sekvencí, v příslušném pořadí. Aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny jako SEQ ID No. 23 a No. 24 seznamu sekvencí, v příslušném pořadí. N-koncové aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce TRA-8 uvedené výše přesně odpovídají. Dále, když jsou aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce srovnávány s databází aminokyselinové sekvence protilátek, zjistí se, že pro těžké řetězce tvoří nukleotidy 58 až 414 SEQ ID No. 21 variabilní region, zatímco nukleotidy 415 až 1392 SEQ ID No. 21 tvoří konstantní region. Pro lehké řetězce tvoří nukleotidy 64 až 387 SEQ ID No. 22 variabilní region, zatímco nukleotidy 388 až 702 SEQ ID No. 22 tvoří konstantní region. Umístění a sekvence CDR se také hodnotí srovnáním homologií s databází. Aminokyselinové sekvence CDR 1, CDR2 a CDR3 těžkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny v SEQ ID No. 25, No. 26 a No. 27, v příslušném pořadí. Aminokyselinové sekvence CDR1, CDR2, a CDR3 lehkého řetězce TRA-8 jsou uvedeny v SEQ ID No. 28, No. 29, a No. 30, v příslušném pořadí.
-46CZ 304614 B6
Příklad 17. Konstrukce humanizované verze TRA-8 protilátky (1) Molekulární modelování variabilního regionu TRA-8
Molekulární modelování variabilního regionu TRA-8 se provede způsobem obecně známým jako homologické modelování (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). Primární sekvence variabilních regionů lidského imunoglobulinu registrované v Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)), jejichž trojrozměrné struktury se určí rentgenovou krystalografií, se srovnávají s pracovními regiony TRA-8 určenými výše. Tak se selektují 1NCD a 1HIL jako sekvence mající nejvyšší homologii sekvence s pracovními regiony pro lehké a těžké řetězce TRA8, v příslušném pořadí. Trojrozměrné struktury pracovních regionů se získají kombinováním koordinátu 1NCD a 1HIL, které odpovídají lehkým a těžkým řetězcům TRA-8, za zisku „modelu pracovního rámce“. Za použití klasifikace definované Chothia et al. se CDR TRA-8 klasifikují následujícím způsobem; CDRL1, CDRL2, CDRH1 a CDRH2 náleží ke kanonickým třídám 2,1,1,3, v příslušném pořadí, zatímco CDRL3 nenáleží do žádné specifické kanonické třídy. CDR smyčky CDRL1, CDRL2, CDRH1, CDRH2 mají konformaci fixovanou na příslušné kanonické třídy a jsou integrovány do modelu pracovního rámce. CDRL3 je zařazen do konformační skupiny SA, podle klasifikace dle Thomton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)), a CDRH3 je klasifikován do k(8)C za použití H3 pravidla (FEBS Letter 455,188-197 (1999)). Potom se reprezentativní konformace pro CDRL3 a CDRH3 integrují do modelu pracovního rámce.
Nakonec se provede energetická kalkulace pro vyloučení nepříznivých inter-atomámích kontaktů, za zisku pravděpodobného molekulového modelu variabilního regionu TRA-8 ve smyslu energetického uspořádání. Výše uvedená procedura se provede za použití komerčně dostupného běžného systému pro molekulární modelování ABM (Oxford Molecular Limited, lne.). Pro získaný molekulový model se přesnost struktury dále hodnotí za použití softwaru PROCHECK (J. Appl. Cryst. (1993), 26,283-291).
(2) Konstrukce aminokyselinové sekvence pro humanizovanou TRA-8.
Konstrukce humanizovaných TRA-8 protilátek se provede způsobem obecně známým jako přenos CDR (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Akceptorová protilátka se vybere podle aminokyselinové homologie v pracovním regionu. Sekvence pracovního regionu TRA-8 se srovnávají se všemi lidskými pracovními sekvencemi v Kabat databasy aminokyselinových sekvencí protilátek (Nuc. Acid. Res. 29, 205-206 (2001)). Tak se selektuje mAB58'CL protilátka jako akceptor v důsledku vysoké homologie sekvence (80%) pro pracovní region. Aminokyselinové zbytky v pracovním regionu pro mAb58'CL se seřadí se zbytky pro TRA-8 a identifikují se pozice, ve kterých jsou různé aminokyseliny. Lokalizace těchto zbytků se analyzuje za použití trojrozměrného modelu TRA-8 připraveného výše a donorové zbytky, které mají být přeneseny na akceptor, se připraví podle kriterií uvedených v Queen et al., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Humanizované TRA-8 sekvence se připraví způsobem popsaným v následujícím příkladu pomocí přenosu několika donorových zbytků na akceptorovou protilátku, mAb58'CL.
Příklad 18. Konstrukce expresního vektoru pro těžké řetězce humanizované protilátky (1) Konstrukce plasmidu nesoucího DNA pro variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8
Pro stanovení aktivity humanizované TRA-8 se plasmid nesoucí těžké řetězce humanizované TRA-8 konstrukce Následujícím způsobem. Nicméně, humanizace TRA-8 není tímto příkladem omezena.
-47CZ 304614 B6
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 31 seznamu sekvencí, humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 13. Aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. Aminokyselinu (kyseliny glutamové), 44. aminokyseliny (argininu), 84. aminokyseliny (šeřinu), 88. Aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. Aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, asparaginem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Plasmidy nesoucí DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8 (SEQ ID No. 31 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
PCR se použije pro přípravu následujících DNA sekvencí, z nichž každá byla popsána výše: Syntetizuje se následujících 12 oligonukleotidů:
5'-ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEQ ID No. 32);
5'-tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-3' (B; SEQ ID No. 33);
5'-attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEQ ID No. 34);
5'-gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg3'(D; SEQ ID No. 35);
5'-tatctgeaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggtctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEQ ID No. 36);
5'-ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctc cacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEQ ID No. 37);
5'-ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3' (G; SEQ ID No. 38);
5'-tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgftg-3' (H; SEQ ID No. 39);
5'-tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' (I; SEQ ID No. 40);
5'-ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac tactaatggt tgcaacccac-3' (J; SEQ ID No. 41);
- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctcte agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEQ ID No. 42); a
5'-gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEQ ID No. 43).
Následující 2 PCR primery se syntetizují způsobem popsaným výše:
5'-ttggataagc ttggcttgac-3' (Pl; SEQ ID No. 44); a
-48CZ 304614 B6
5' gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEQ ID No. 45).
Syntéza DNA kódující polypeptidový řetězec obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilního regionu humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu se provede za použití příslušné kombinace PCR.
DNA fragment se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B, 10 pmol;
oligonukleotid C, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E, 10 pmol;
oligonukleotid F, 10 pmol;
oligonukleotid G, 10 pmol;
oligonukleotid H, 10 pmol;
oligonukleotid I, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K, 10 pmol;
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 μΜ;
oligonukleotidový primer P2, 2 μΜ;
10X Pyrobest pufr II, 10 μΐ;
dNTP směs, 8 μΐ;
Pyrobest DNA polymeráza, 0,5 μΐ; a
Redestilovaná voda do celkového objemu 50 μΐ.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se opakuje 7krát. Po dokončení tohoto postupu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Stejný objem fenol-chloroformu (50 % obj./obj. fenol nasycený vodou, 48 % obj./obj. chloroform, 2 % obj ./obj. isoamylalkohol) se přidá k 200 μΐ každého PCR produkty a směs se důkladně mísí po dobu 1 minuty. Po této době se směs odstředí při 10,000 X g, a odebere se vodná vrstva a smísí se se stejným objemem chloroformu-isoamylalkoholu (96 % obj ./obj. chloroformu a4%obj./obj. isoamylalkoholu), a směs se opět odstředí při 10,000Xg a odebere se vodná vrstva. Série uvedených kroků se označuje jako „fenolová extrakce“).
Potom se provede srážení získané vodné vrstvy ethanolem. Termín „srážení ethanolem“, jak je zde použit, označuje přidání, za míšení, 1/10 objemu 3M octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemů 100% ethanolu do roztoku, který je zpracováván, a zmrazení směsi za použití suchého ledu. Získaná směs se potom odstředí při 10,000 x g za zisku DNA ve formě sraženiny.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním objemu redestilované vody a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforéze se gel barví 1 pg/ml vodným roztokem ethidiumbromidu pro umožnění detekce DNA pomocí UV záření. DNA proužek odpovídající humanizované TRA-8 DNA se vyřízne za použití čepelky a eluuje se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7,500 X g, potom se provede srážení ethanolem a nakonec se DNA rozpustí v 5 μΐ destilované vody.
-49CZ 304614 B6
Potom se každá extrahovaná DNA klonuje za použití pGEM-T Easy vektoru (Promega) následujícím způsobem:
DNA fragment získaný z PCR reakce, 5 μΐ;
X Taq polymerázový pufr, 1 μΐ;
dNTP směs, 1 μΐ;
Taq polymeráza (5 jednotek/ml), 1 μΐ; a redestilovaná voda do konečného objemu 10 μΐ.
Poté, co každý roztok reaguje při 70 °C po dobu 30 minut, se každý DNA roztok a pGEM-T Easy vektor ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo C., Ltd.) podle návodu výrobce.
Po 4 hodinové inkubaci při 15 °C se 2 μΐ inkubovaného reakčního roztoku smísí s 100 μΐ kompetentních E. coli kmene JMI09 při hustotě buněk 1 až 2 x 109 buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), a směs se umístí na led na dobu 30 minut, potom se ponechá při 42 °C po dobu 30 sekund a znovu se umístí na led na dobu 1 minuty. Potom se do směsi přidá 500 μί SOC médium (2% obj ./obj. trypton, 0,5% hmotn./obj. kvasinkový extrakt, 0,05% hmotn./obj. chlorid sodný, 2,5 mM hmotn./obj. chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukosa) a provede se inkubace po dobu další hodiny, za třepání. Potom se izolují transformované kmeny a plasmidová DNA se připraví z těchto kmenů způsobem popsaným v „Molecular Cloning A Laboratory Manual“. Nukleotidová sekvence těchto DNA kódujících těžké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F. S„ et al„ (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Získané plasmidy se označený jako pHBI4 (plasmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8). Transformované E. coli kmene nesoucího tento plasmid, označené jako E. coli JM109/pHB14, se uložily v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, Podle Budapešťské smlouvy o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7556.
(2) Konstrukce expresních plasmidů nesoucích DNA pro variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8
Rekombinantní expresní vektory pro živočišné buňky se konstruují insercí DNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8 (klonované výše) následujícím způsobem.
pg plasmidu pSRHHH3 (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) nesoucího variabilní region těžkého řetězce humanizované anti—Fas monoklonální protilátky HFE7A a genomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl, expresní vektor pro savčí buňky, se tráví restrikčními enzymy HindHI a Apal, a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforézi se gel barví 1 pg/ml vodným roztok ethidium- bromidu pro umožnění detekce DNA pomocí UV světla. Proužky vektorové DNA obsahující genomovou DNA pro lidský IgGl konstantní region bez variabilního regionu těžkého řetězce humanizované HFE7A se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA potom zahustí odstředěním při 7,500 X g, potom se provede srážení ethanolem a nakonec se DNA rozpustí v 5 μί destilované vody a potom se defosforyluje za použití CIP. Získaný trávený, defosforylovaný plasmid (100 ng) se liguje s 1 pg pHB14 DNA fragmentu obsahujícím DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8, který se také tráví HindHI a Apal, za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co„ Ltd.). Ligační směs se potom použije pro transformaci E. coli JMI09, které se potom kultivují na LB agarových plotnách obsahujících 50 pg/ml ampicilinu.
-50CZ 304614 B6
Transformanty získané tímto způsobem se kultivují v 2 ml kapalného LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plasmidová DNA se potom extrahuje ze získané kultury metodou alkalické činidlo-SDS.
Extrahovaná plasmidová DNA se tráví HindlII a Apal a pracuje se elektroforézou na 3% hmotn./obj. agarosovém gelu pro potvrzení přítomnosti či nepřítomnosti insertu DNA kódujícího variabilní region těžkého řetězce humanizované TRA-8. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované TRA-8 se označí pHB14-l.
Příklad 19. Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (1) Konstrukce vektorů pro lehké řetězce humanizovaných verzí TRA-8 protilátky
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 46 seznamu sekvencí, při humanizaci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 označené TRA-8 se 8. aminokyselina (histidin), 9. aminokyselina (lysin), 10. aminokyselina (fenylalanin), 11. aminokyselina (methionin), 13. aminokyselina (threonin), 20. aminokyselina (serin), 42. aminokyselina (glutamin), 43. (serin), 60. aminokyselina (kyselina asparagová), 63. aminokyselina (threonin), TI. aminokyselina (asparagin), 78. aminokyselina (valin), 80. aminokyselina (serin), 83. Aminokyselina (leucin), 85. aminokyselina (kyselina asparagová), 87. aminokyselina (fenylalanin) a 99. aminokyselina (glycin), 103. aminokyselina (leucin) a 108. aminokyselina (alanin) zN-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 nahradí prolinem, serinem, serinem, leucinem, aíaninem, threoninen, lysinem, alaninen, serinem, serinem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninen, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM2.
Exprese plasmidů nesoucích tento typ aminokyselinové sekvence humanizované lehkého řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 se konstruuje následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované TRA-8
DNA kódující LM2 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 46 seznamu sekvencí), která je fůzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (K řetězce) se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47) a 7ALCN (SEQ ID No. 48), se následující oligonukleotidové primery syntetizují pro PCR:
5'- gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atcacaatgt caccagtgga-3' (HKSPR11; SEQ ID No. 49);
5'-ccaagttctt tgtctgcatc agtaggagac agggtcacca tcacctgc-3' (HKCDFL1; SEQ ID No. 50);
5'-agtgtgccgg gtggatgccc agtaaatcag tagtttagga gctttccctg gtttctg-3' (HKCDR12; SEQ ID No. 51);
5'-tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt-3' (HKCDF22; SEQ ID No. 52);
-51 CZ 304614 B6
5'-ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat ggt-3' (HKCDR22; SEQ ID NO. 53); a
5'-cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact gtg-3' (HKCF12; SEQ ID No. 54).
2) Konstrukce plasmidu pClt3.1/M2-l (klonování lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM2-DNA fragment definovaný v SEQ ID No. 55 seznamu sekvencí kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 46 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM2-F 1-DNA fragment kódující sekvenci pro sekreční signál a část FRL1 regionu s místem pro Hind III restrikční enzym přidaným na 5-konec se připraví za následujících podmínek. Templátové plasmidy, pHSGHMl 7 a pSRPDHH, se získají postupem podle Evropské patentové přihlášky EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pHSOHM17 DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al), 25 ng oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol) oligonukleotidový primer HKSPR11, 50 pmol dNTP koktail, 5 μΐ lOxPCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza (Perkin Elmer), 2,5 jednotky
Reakční roztok výše uvedeného složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRL1, FRL2, a CDRL2 se připraví za následujících podmínek. Složení reakčního roztoku:
plasmidová pL28 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF11, 50 pmol) oligonukleotidový primer HKCDR12, 50 pmol dNTP koktail, 5 μΐ
ÍOxPCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F3-DNA fragment kódující CDRL2, FRL3 a část CDRL3 se připraví za následujících podmínek.
-52CZ 304614 B6
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816
Al), 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF22, 50 pmol) oligonukleotidový primer HKCDR22, 50 pmol dNTP koktail, 5 μΐ lOxPCRpufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM2-F4-DNA fragment kódující CDRL3, FRI4 a konstantní region s místem pro EcoRI restrikční enzym na 3'-konci se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCF, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP koktail, 5 μΐ lOxPCRpufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforéze se nabarví 1 pg/ml ethidiumbromidu pro detekci získané DNA za použití UV světla. Příslušné DNA proužky se vyříznou z gelu za použití čepelky.
b) Druhý stupeň PCR
LM2-DNA, ve které jsou fúzovány výše popsané LM2-F1-DNA, LM2-F2-DNA, LM2-F3DNA a LM2-F4-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM2-F 1-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM2-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM2-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM2-F4—DNA připravený v prvním stupni PCR oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol
-53CZ 304614 B6 oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 μΐ
ÍOxPCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus zahřívání při 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se opakuje 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM2-DNA fragment se insertuje do plasmidové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic TA klonovacího kitu (Invitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. Coli TOPÍ OF' obsažených v kitu. Nukleotidová sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (AN PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Získané plasmidy se označený pCR3.1/M2-l (plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce variabilního regionu humanizované TRA-8 a konstantní region lidského lg lehkého řetězce).
Získaný plasmid pCR3.1/M2-l obsahující LM2-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje CIP. Získaná defosforylovaný pHSG399 DNA a LM2-DNA fragment, které byly natráveny restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu, a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plasmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM2-DNA fragment selektuje za použití elektroforézy na 1% agarosovém gelu.
V důsledku výše uvedeného postupu se získá plasmid pHSG/M2-l^t nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM2 TRA-8 a konstantní region lidského Ig-kappa řetězce. Transformovaný kmen E coli nesoucí tento plasmid, označený jako E. coli DH5alfa/pHSG/M2-l^t, se uložil v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Isukuba-shi, Ibarakiken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou pro ukládání mikroorganismů, a označil se přírůstkovým č. FERM BP-7563.
3) Konstrukce plasmidu pSR/M2-l (expresního plasmidu pro humanizované LM2 TRA-8 lehké řetězce)
Získaný plasmid pHSG/M2-l-4 nesoucí fuzní fragment variabilního regionu humanizovaného LM2 TRA-8 lehkého řetězce a konstantního regionu lidského Ig-kappa řetězce se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M2-l—4 se
-54CZ 304614 B6 ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (AN Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované TRA-8 se označí pSR/M2-l.
Příklad 20: Produkce humanizované protilátky
Transfekce COS-7 buněk, tj. buněčné linie odvozené z opičí ledviny, expresními plasmidy pro humanizované TRA-8 těžké řetězce a humanizované TRA-8 lehké řetězce získané výše se provede FUGENE6 technikou transfekce (Boehringer Mannheim Biochemica) podle návodu výrobce kitu.
COS-7 buňky (American Type Culture Collection No. CRL-1651) se kultivují do semikonfluentního stavu (3 x 106 buněk/plotnu) v kultivačních discích (plocha kultury: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) obsahujících Dulbeccovo modifikované Eagle médium (zde dále označované jako „D-MEM“; Gibco BRL) doplněné 10% fetálním telecím sérem (dále „FCS“; Moregate).
Mezitím se 10 pg/disk (celkem 5 disků) expresní plasmidové DNA pro humanizované DR5 těžké řetězce (pHA15-l) a 10 pg/disk expresní plasmidové DNA pro humanizované DR5 lehké řetězce připravených technikou alkalické činidlo-SDS a odstředěním s gradientem chloridu česného smísí a směs se vysráží ethanolem a potom se provede suspendování v 5 pl/disk dH20.
Po smísení 15 pl/disk FUGENE6 Transfection činidla se 180 pl/disk D-MEM bez FCS se tento FUGENE roztok (185 pl/disk) smísí s 5 pl/disk DNA roztoku obsahujícího 10 pg/disk humanizovaného expresní plasmidové DNA DR5 těžkého řetězce a 10 pg/disk expresní plasmidové DNA humanizovaného DR5 lehkého řetězce. Po 15 minutové inkubaci při teplotě místnosti se získaná suspenze plasmidů (200 pl) přidá do předem připravených COS-7 ploten. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 24 hodin se kultivační médium nahradí D-MEM bez FCS. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 72 hodin se supematant kultury odebere pro přečištění produktů exprese v supematantu. Způsobem popsaným výše se COS-7 buňky transfektují každou z následujících kombinací plasmidů:
(A) : žádná plasmidová DNA (B) : kontransfekce pHB14-l a pSR/M2-l
Kultura se potom se odstředí (1000 r.p.m., 5 minut) a odebere se supematant. Supematant se znovu odstředí (9800 r.p.m., 15 minut) a přefiltruje se přes 0,45 pm filtr (ADVANTEC TOYO DISMIC-25cs, kat # 25C5045 AS). Přečištění IgG z filtrátů se provede za použití Protein G-POROS afinitní chromatografie (Applied Biosystems) za následujících podmínek:
HPLC: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolona: ProteinCAD 700E (Applied Biosystems) kolona: ProteinG-ID sensorová náplň (velikost kolony : 2,1 mm LD) x 30 mm LD, objem lože:
0,1 ml; kat # 2-1002-00, Applied Biosystems) eluční pufr: 0,lM Glycin-HCl (pH 2,5) neutralizační pufr: 1M Tris-HCl (pH 8,5) detekce: 280 nm
-55CZ 304614 B6 průtok: 1 ml/min velikost frakce: 0,5 ml/0,5 min frakční zkumavka: 1,5 ml polypropylenová mikrozkumavka teplota: 4 °C
Po aplikaci veškerého filtrátu do kolony se 30 ml PBS (Sigma, kat # 1000-3) použije pro promytí kolony. Když se aplikuje eluční pufr, tak se zahájí odběr frakcí. Každá frakční mikrozkumavka nejprve obsahuje 55 μΐ 1M NaCl, 110 μΐ neutralizačního pufru a 74 μΐ 2 mg/ml hovězího sérového albuminu (Sigma, kat # A-7030) v PBS. Frakce č. 5 až č. 10 se odeberou a dialyzují se proti 1 litru PBS (pH 7,5) při 4 °C po dobu 1 dne za použití Slide-A lyzačního přístroje (Pierce, kat # 66450). Dialyzační pufr se vymění dvakrát.
Ověření exprese humanizované protilátky a kvantitativní test na expresní produkty v supernatantu kultur se provede ELISA s protilátkou proti lidskému IgG.
Do každé jamky 96-jamkové plotny (MaxiSorp, Nunc) se přidá 100 μΐ kozí specifické polyklonální protilátky proti Fc lidského IgG (Kappel) rozpuštěné v konečné koncentraci 0,5 pg/ml v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02% azid sodný, pH 9,6) a provede se inkubace plotny při 37 °C po dobu 2 hodin pro dosažení adsorpce protilátky. Potom se plotna promyje 5krát 350 μΐ PBS(-) obsahujícího 0,05% Tween-20 (BioRad) (zde dále označovaný jako „PBS-T“). Do jamek po promytí se přidá supematant kultury ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se do každé jamky přidá 100 μΐ alkalickou fosfatasou značené kozí specifické polyklonální protilátky proti Fc lidského IgG (Jackson Imuno Research Lab.) ředěné 10000-krát PBS-T a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytím PBS-T se podle návodu výrobce přidá roztok substrátu p-nitrofenylfosfátu z Alkaline Phosphatase Subtrate kitu (Bio Rad). Po inkubaci při 37 °C po dobu 0,5 až 1 hodiny se měří absorbance při 405 nm. V našich pokusech se lidský plasmatický imunoglobulin G podtřídy 1 (IgGl) (Biopure AG) ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS na určitou koncentraci použije jako referenční vzorek pro humanizované DR5 protilátky obsažené v supematantech kultury.
Nakonec se přečištěné produkty exprese v supemantatech kultur specificky detekují protilátkou proti lidskému IgG. Množství protilátky proti lidskému IgG je 8,96 pg (800 μΐ).
Příklad 21. Proapoptotická aktivita humanizované protilátky
Jurkat buňky (AICC No. TIB-152) se použijí pro stanovení proapoptotické aktivity přečištěné humanizované TRA-8 protilátky.
Jurkat buňky kultivované v RPMI1640 médiu s 10% FCS (Gibco BRL) při 37 °C po dobu 3 dnů za přítomnosti 5% CO2 se vnesou do každé jamky 96-jamkové mikroplotny (Sumitomo Bakelite) při 50 μΐ na jamku. Humanizovaná TRA-8 připravená v příkladu 20 se upraví na koncentraci konečného produktu 100 ng/ml za použití RPMI 1640 média obsahujícího 10% FCS, za použití stanovení jejich koncentrací v kapalině způsobem popsaným v příkladu 20. Každý z roztoků expresních produktů takto upravených na koncentraci 100 ng/ml se použije pro získání sériových ředění opakovaným 2-násobným naředěním RPMI1640 obsahujícím 10% FCS. Každý naředěný roztok humanizované TRA-8 se přidá do každé jamky při 50 μΐ na jamku. Po reakci při 37 °C po dobu 12 hodin se přidá 50 μΐ 25 pM PMS (fenazinmethosulfátu; Sigma Chemical Co.) obsahujícího 1 mg/ml XTT (2,3-bis[2-methoxy-A-nitro-5-sulfofenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxyamid, vnitřní sůl; Sigma Chemical Co.) (konečné koncentrace 250 pg/ml pro XTT a 5 μΜ pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro výpočet životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
-56CZ 304614 B6 životachopnost (%) = 100 x (a-b)/(c-b) kde „a“ je měření pro testovanou jamku, „b“ je měření pro jamku bez buněk a „c“ je měření jamek bez přidané protilátky.
Expresní produkt připravený v příkladu 20 (humanizovaná TRA-8) může indukovat apoptosu buněk T lymfomové buněčné linie exprimující lidský DR5 antigen.
Příklad 22. Reaktivita TRA-8 s různými DR5 molekulami
Pro stanovení reaktivity TRA-8 s různými DR5 molekulami se reaktivita TAR-8 testuje za použití aktivovaných lymfocytů následujícím způsobem.
Nejprve se vzorky periferní krve odeberou od člověka (30 ml), kosmana (3 ml) a makaka (20 ml). Do vzorků se přidá 1 ml heparinu (Novoheparin; Novo) a vzorky se potom pomalu převrství přes stejný objem Ficoll-Paque PLUS roztoku (Amersham Pharmacia Biotech.) specifická hmotnost: 1,077 pro všechny vzorky kromě vzorků od makaka, který má specifickou hmotnost 1,072) a odstředí se při 1700 r.p.m. po dobu 30 minut pro získání frakce mononukleámích buněk periferní krve. Tato frakce mononukleámích buněk se promyje dvakrát Hankovým vyváženým solným roztokem a potom se suspenduje v RPMI 1640 médiu s 10% obj ./obj. FCS na hustotu buněk 1 x 106 buněk/ml. Fytohemaglutinin-P (PHA-P, Sigma Chemicals, Co.) se přidá do získané suspenze v konečné koncentraci 5 pg/ml a provede se inkubace vzorku při 37 °C v 5% obj ./obj. CO2 po dobu 24 hodin. Po této době se buňky separují odstředěním, promyjí se a resuspendují se v RPMI 1640 médiu obsahujícím 10% obj ./obj. FCS. Potom se pro aktivaci získaných buněk přidá do suspenze interleukin-2 (Amersham Pharmacia Biotech.) v konečné koncentraci 10 jednotek/ml a provede se inkubace při 37 °C v 5% obj./obj. CO2 po dobu 72 hodin.
Množství aktivovaného přípravku vypočtené tak, aby obsahovalo 1 χ 106 aktivovaných lymfocytů, se umístí do testovací zkumavky a suspenduje se v 50 μΐ 0,5, 1,5, 10 μg/ml TRA-8 v PBS nebo 50 μΐ PBS samotného. Získaná suspenze se nechá stát na ledu po dobu 1 hodiny, potom se buňky promyjí 3krát podíly 500 μΐ PBS a potom se suspendují v 50 μΐ 20 pg/ml FITC-značené anti-myší IgG protilátky (Bioresource) v PBS. Za použití buněk suspendovaných v 500 μΐ PBS jako kontroly se měří intensity fluorescence, za použití průtokového cytometru (FACSCalibur; Becton Dickinson).
Získá se distribuce počtu buněk podle intenzity fluorescence a vypočtou se podíly počtu barvících se buněk k celkovému počtu buněk. Potom se vypočtou hodnoty Kd za použití koncentrace TRA-8 a podílu počtu barvících se buněk k celkovému počtu buněk. Frekvence reaktivity aktivovaných lymfocytů od člověka, kosmana a makaka je téměř stejná. Proto je TRA-8 je schopna vazby na různé primáti DR5 včetně lidských, proti kterým je TRA-8 původně připravena.
Příklad 23. Pokusy s eskalací dávky TRA-8 u kosmanů
Předběžná studie toxicity TRA-8 s eskalací dávky se provede za použití 1 samce a 1 samice kosmana. Aplikují se tři série jedné intravenózní dávky, separované 7-dny. Dávka TRA-8 je 50, 250 a 1250 pg/zvíře. 48 hodin po každé aplikaci se odebere krev z femorální žíly a připraví se plasma. Stanoví se aktivity plasmatické aspartat-aminotransferasy a alanin- aminotransferasy, za použití analyzátoru (FUJI DRJ-CHEM: Fuji Film Medical Co., Ltd.). Veškerá krev se odebere bez jakékoliv anestezie. Při biochemickém vyšetření plasmy se nepozorují žádné známky jatemího poškození.
-57CZ 304614 B6
Příklad 24. In vitro a in vivo farmakologická testy TRA-8 proti nádorovým buňkám
Pro stanovení toho, zda má TRA-8 terapeutickou účinnost v protinádorové terapii, se in vitro smrtící aktivita TRA-8 testovala za použití různých nádorových buněčných linií následujícím způsobem.
Různé nádorové buňky (2 až 8 χ 103 buněk/50 μΐ) kultivované v RPMI 1640 mediu (pro Jurkat), DMEM mediu (pro HCT-116), MEM-R (pro WiDr) nebo DMEM-F12 (pro COL2-Jck), které se získaly od Gibco BRL, s 10% FCS (Gibco BRL), při 37 °C za přítomnosti 5% CO2, se vloží do každé jamky 96-jamkové mikroplotny (Sumimoto Bakelite). TRA-8 se upraví tak, aby měla koncentraci konečného produktu 100 ng/ml za použití média obsahujícího 10% FCS. Roztok TRA-8 (100 ng/ml) se použije pro přípravu sériových ředění opakováním 2-násobného ředění médiem obsahujícím 10% FCS. Každý naředěný roztok TRA-8 se přidá do každé jamky při 50 μΐ na jamku a provede se inkubace při 37 °C. Po reakci při 37 °C po dobu 72 hodin se přidá 50 μΐ 25 pM PMS (fenazin- methosulfát; Sigma Chemical Co.) obsahujícího 1 mg/ml XTT (konečné koncentrace 250 pg/ml pro XTT a 5 pM pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro určení životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
Životachopnost (%) = 100 x (a-b) / (c-b) kde „a“ je měření pro testované jamky, „b“ je měření pro jamky bez buněk a „c“ je měření pro jamky bez přidané protilátky.
Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.
| Tabulka 3 | |
| Buňkv | ED50 (ue/ml) |
| Jurkat | 0,001 až 0,01 |
| HCT-116 | 0,004 až 0,02 |
| WiDr | 0,007 až 0,03 |
| COL2-Jck | 2,28 |
Různé nádorové buněčné linie jsou silně indukovány k apoptose prostřednictvím TRA-8 za podmínek in vitro.
Dále se určí in vivo protinádorové účinky TRA-8 u holých myší s transplantovanými WiDr buňkami, protože TRA-8 není zkříženě reaktivní a myším DR5.
TRA-8 protilátka proti lidskému DR5 se podá holým myším s lidské xenotransplantáty, které exprimují lidské DR5 molekuly. Použité myši jsou BALb/c nude/nude myši stáří 6 týdnů (samice, od Clea Japan lne.), kterým se transplantuje buněčná linie lidského karcinomu tlustého střeva WiDr (5 mm3). Od dne 1 po transplantaci nádoru se těmto myším s transplantovaným nádorem 14krát podá intraartikulámí injekce TRA-8 (5 pg/zvíře). Růst WiDr nádoru se denně měří podle velikosti nádorových hmot. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.
-58CZ 304614 B6
Tabulka 4
| 8 dnů | 11 dnů | 15 dnů | 18 dnů | 22 dnů | 25 dnů | |
| Kontrola (PBS) | 196 | 24 | 469 | 584 | 833 | 119 |
| SD | ±5 | ±7 | ±14 | ±23 | ±27 | ±41 |
| TRA-8 | 15 | 97 | 155 | 195 | 365 | 530 |
| SD | ±7 | ±3 | ±60 | +58 | ±91 | +13 |
V tomto modelu byl u všech neléčených zvířat pozorován růst nádoru, zatímco u zvířat léčených TRA-8 byl růst nádoru inhibován, jak bylo prokázáno podle velikosti nádoru. Výsledky ukazují, že TRA-8 je účinná v eliminaci nádorových buněk in vivo.
Příklad 25. Studie kombinací s TRA-8
Lidská buněčná linie karcinomu prostaty PC-3 se získá z m American Tissue Culture Collection (AICC) a kultivuje se v F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) obsahující 10% fetální hovězí sérum (FBS, Hyklon), 1% L-glutamin-200 mM (25030-149, Gibco BRL) a 0,5% roztok penicilinu-streptomycinu (P-7539, Sigma). RPMI1640 médium (MED-008, IWAKI) doplněné 10% FBS a 0,5% roztokem penicilinu-streptomycinu se použije v následujícím pokusu. Exponenciálně kultivované PC-3 buňky se získají trypsinizací a promyjí se dvakrát čerstvým médiem. Buňky se potom spočítají, resuspendují se v čerstvém médiu v hustotě 5 x 104 buněk/ml a distribuují se trojmo do 96-jamkových ploten s plochým dnem (3598, Coming-Coster) v celkovém objemu 100 μΐ/jamku jeden den před zahájením pokusu. Reprezentativní protinádorový lék, Paclitaxel (169-18611, Wako) rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (10 mg/ml), se naředí v čerstvém médiu a potom se přidá do 96-jamkových ploten obsahujících buňky při 50 μΐ/jamku. Konečné koncentrace dimethylsulfoxidu jsou menší než 0,1 %. Po inkubaci po dobu 24 hodin při 37 °C v atmosféře 5% CO2 se TRA-8-ředěná v čerstvém médiu přidá do jamek. Po inkubaci po dalších 24 hodin se do jamek přidá 50 μΐ Minimum Essential Media (11095-095, Gibco BRL) obsahujícího 1 mg/ml XTT a 25 mM PMS a plotny se inkubují po dobu 6 hodin. Potom se změří OD450 pomocí SPECTRA MAX 250 (Molecular Devices) a životaschopnost buněk se vypočítá následujícím způsobem.
Životaschopnost buněk (%) = (OD450 pro jamky obsahující buňky léčené Taxolem a/nebo TRA-8 - OD450 pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla) x 100 / (OD450 pro jamky obsahující buňky bez činidla - OD450 pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla)
Výsledky výše uvedeného testu pro TRA-8 v kombinaci s reprezentativním protinádorovým lékem, Paclitaxelem, jsou následující. Paclitaxel snižuje životaschopnost PC-3 buněk, ale více než 40% signálů naznačuje, že nádorové buňky přežívají při koncentracích až 200 nM. Významné je, že přidání 0,1 ng/ml TRA-8 značně snižuje životaschopnost nádorových buněk, až na 10 %, i když není žádná redukce životaschopnost buněk pozorována po jediné aplikaci TRA-8 v této koncentraci. Tyto výsledky jasně ukazující, že TRA-8 vykazuje synergní protinádorovou aktivitu v kombinaci s protinádorovými léky.
Příklad 26. Analýza jiných typů humanizovaných protilátek TRA-8 (1) Návrh humanizovaných protilátek
-59CZ 304614 B6
Konstrukce humanizované verze TRA-8 se provede způsobem obecně známým jako přenos CDR. mAB58'CL protilátka se použije jako akceptor, jak je popsáno v referenčním příkladu 2, a CDR regiony TRA-8 protilátky se přenesou na akceptorovou protilátku. V pracovním regionu se některé aminokyseliny přenesou na akceptor, buď z TRA-8, nebo z lidské konvenční sekvence podle kriterií uvedených v Queen et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, (1989)) a humanizované TRA-8 sekvence se konstruují způsobem popsaným dále.
(2) Konstrukce plasmidu nesoucího DNA pro variabilní region těžkého řetězce jiných typů humanizované nobo myší TRA-8
Jak je uvedeno v SEQ. ID NO. 56 seznamu sekvencí, H1 typ-humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 označené TRA-8 zahrnuje nahrazení 3. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 44. aminokyseliny (argininu), 84. aminokyseliny (šeřinu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, asparaginem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušém pořadí.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 59 seznamu sekvencí, H3 typ-humanizace aminokyselinové sekvence řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 TRA-8 zahrnuje nahrazení 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 40. aminokyseliny (threoninu), 42. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 44. aminokyseliny (argininu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, glycinem, glycinem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 60 seznamu sekvencí, H4 typ-humanizace aminokyselinové sekvence těžkého řetězce myší protilátky proti lidskému DR5 TRA-8 zahrnuje nahrazení 13. aminokyseliny (lysinu), 19. aminokyseliny (lysinu), 88. aminokyseliny (šeřinu), 93. aminokyseliny (methioninu), 114. aminokyseliny (threoninu), 115. aminokyseliny (leucinu) glutaminem, argininem, alaninem, valinem, leucinem a valinem, v příslušném pořadí.
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 61 seznamu sekvencí, plasmid nesoucí DNA pro variabilní region těžkého řetězce chimérické TRA-8 se označí jako „M typ“. Humanizované TRA-8 popsané v příkladech 17 a 18 se označí jako „H2 typ“.
Plasmidy nesoucí DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8 se konstruují následujícím způsobem.
PCR se použije pro přípravu následujících DNA sekvencí, které mají výše uvedené složení:
Syntetizuje se následujících 24 oligonukleotidů:
51 - ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag caacagctac aggtgtccac-3' (A; SEQ ID No. 32);
5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg-31 {B; SEQ ID No. 33);
-60CZ 304614 B6
5'- tctgaagtac agctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga ctctcctgtg cagectctgg-3' (B2; SEQ ID No. 57);
5'- tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa ctctcctgtg cagcctctgg-3' <B3; SEQ ID No. 66);
5'- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga gtgggttgca accattagta-3' (C; SEQ ID No. 34);
5’- attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga gtgggttgca accattagta-3' (C2; SEQ ID No. 64);
5'- gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacaccctg-3' (D; SEQ ID No. 35);
5'- tatctgcaaa tgaacagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E; SEQ ID No. 36);
5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E2; SEQ ID No. 62); 5'- tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg ggtgactcta tgattacgac-3' (E3; SEQ ID No. 67);
5'- ggactactgg ggccaaggga ccctggtcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F; SEQ ID No. 37);
5’- ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacc aagggcccat cggtc-3' (F2; SEQ ID No. 68);
5'- ctaccaagaa gaggatgata cagctccatc ccatggtgag gtcaagccaa gcttatccaa-3’ {U; SEQ ID No. 38);
5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H; SEQ ID No. 39);
5'- tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H2; SEQ ID No. 58);
5’- tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg-3' (H3; SEQ ID No. 69);
5'- tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3’ (I; SEQ ID No.40);
5'- tccagcctct tctctggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat ccagaggctg cacaggagag-3' {12; SEQ ID No. 65);
5’- ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa
-61 CZ 304614 B6 ctaccaccac tactaatggttgcaacccac-3' (J; SEQ ID No.41);
5’- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K; SEQ ID No. 42);
5'- ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K2; SEQ ID No. 63);
5'- ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata cagggtgttc ttggcattgt-3' (K3; SEQ ID No. 70);
5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L; SEQ ID No.43) a 5'- gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta gtccgtcgta atcatagagt cacc-3' (L2; SEQ ID No.71).
Následující 2 PCR primery se syntetizují způsobem popsaným výše:
5'- ttggataagc ttggcttgac-3' (Pl; SEQ ID No. 44); a 5'- gaccgatggg cccttggtgg a-3' (P2; SEQ ID No. 45).
Syntéza HI typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 5 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
HI typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B2,10 pmol;
oligonukleotid C, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E, 10 pmol;
oligonukleotid F, 10 pmol;
oligonukleotid U, 10 pmol;
oligonukleotid H2, 10 pmol;
oligonukleotid I, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K, 10 pmol;
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 μΜ;
oligonukleotidový primer P2, 2 μΜ;
10X Pyrobest pufr II, 10 μΐ;
dNTP směs, 8 μΐ;
Pyrobest DNA polymeráza, 0,5 pl; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7krát. Po dokončení tohoto cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu.
-62CZ 304614 B6
Po elektroforéze se gel barví vodným roztokem (1 pg/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající Hl typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 pl destilované vody.
Syntéza H3 typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
H3 typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B, 10 pmol;
oligonukleotid C, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E2, 10 pmol;
oligonukleotid F, 10 pmol;
oligonukleotid O, 10 pmol;
oligonukleotid H2, 10 pmol;
oligonukleotid I, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K2, 10 pmol;
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 μΜ;
oligonukleotidový primer P2, 2 μΜ;
10X Pyrobest pufr II, 10 μΑ;
dNTP směs, 8 μΐ;
Pyrobest DNA polymeráza, 0,5 1; μΐ; a
Redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7krát. Po dokončení tohoto cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforéze se gel barví vodným roztokem (1 μg/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající H3 typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 μΐ destilované vody.
Syntéza H4 typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region humanizovaného TRA-8 těžkého řetězce a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
H4 typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
-63 CZ 304614 B6
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B, 10 pmol;
oligonukleotid C2, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E2, 10 pmol;
oligonukleotid F, 10 pmol;
oligonukleotid 0, 10 pmol;
oligonukleotid H, 10 pmol;
oligonukleotid 12, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K2, 10 pmol;
oligonukleotid L, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 μΜ;
oligonukleotidový primer P2, 2 μΜ;
10X Pyrobest pufr II, 10 μΐ;
dNTP směs, 8 μΐ;
Pyrobest DNA polymeráza, 0,5 1; μΐ; a
Redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7krát. Po dokončení tohoto cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilovaná vody a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforéze se gel barví vodným roztokem (1 μg/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající H4 typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu (BIO 101, CA, USA). Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 μΐ destilované vody.
Syntéza M typu DNA kódující polypeptidové řetězce obsahující sekvenci sekrečního signálu, variabilní region těžkého chimérické TRA-8 a 8 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl regionu, se provede za použití kombinace PCR v příslušném pořadí.
M typ-DNA fragmentu se připraví následujícím způsobem.
Složení PCR reakčního roztoku:
oligonukleotid A, 10 pmol;
oligonukleotid B3, 10 pmol;
oligonukleotid C2, 10 pmol;
oligonukleotid D, 10 pmol;
oligonukleotid E3, 10 pmol;
oligonukleotid 0, 10 pmol;
oligonukleotid H3, 10 pmol;
oligonukleotid 12, 10 pmol;
oligonukleotid J, 10 pmol;
oligonukleotid K3, 10 pmol;
oligonukleotid L2, 10 pmol;
oligonukleotidový primer Pl, 2 μΜ;
-64CZ 304614 B6 oligonukleotidový primer P2, 2 μΜ;
10X Pyrobest pufr II, 10 pí;
dNTP směs, 8 μΐ;
Pyrobest DNA polymeráza, 0,5 1; μΐ; a
Redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.
PCR reakce se provede následujícím způsobem. Roztok se nejprve zahřívá při 94 °C po dobu 5 minut, potom se provede cyklus zahřívání při 98 °C po dobu 10 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, který se provede 7krát. Po dokončení cyklu se reakční roztok zahřívá při 72 °C po dobu 15 minut.
Po fenolové extrakci a srážení ethanolem se získaná DNA sraženina suší ve vakuu, rozpustí se v minimálním množství redestilované vody a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforéze se gel barví vodným roztokem (1 pg/ml) ethidiumbromidu, aby se umožnila detekce DNA za použití UV světla. DNA proužky odpovídající M typu-DNA se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, a potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 μΐ destilované vody.
Získaná extrahovaná DNA (H1 type, H3 typ, H4 typ a M typ) se klonuje za použitím pGEM-T Easy vektoru (Promega) následujícím způsobem:
DNA fragment získaný z PCR reakce (Hl, H3, H4 nebo M), 5 μΐ;
x Taq polymerázový pufr, 1 μΐ;
dNTP směs, 1 μΐ;
Taq polymeráza (5 jednotek/ml), 1 μΐ; a redestilovaná voda do konečného objemu 10 μΐ.
Po reakci výše uvedeného roztoku při 70 °C po dobu 30 minut se každý DNA roztok a pGEM-T Easy vektor ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) za použití protokolu výrobce.
Po 4 hodinové inkubaci při 15 °C se 2 μΐ inkubovaného reakčního roztoku smísí s 100 μΐ kompetentních E. coli kmene JMI09 při hustotě buněk 1 až 2 χ 109 buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.), a směs se ponechá na ledu po dobu 30 minut, potom při 42 °C po dobu 30 sekund, a znovu na ledu po dobu 1 minuty. Potom se do směsi přidá 500 μΐ SOC média (2% obj./obj. trypton, 0,5% hmotn./obj. kvasinkový extrakt, 0,05% hmotn./obj. chlorid sodný, 2,5 mM hmotn./obj. chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukosa) a provede se inkubace po dobu další hodiny, střepáním. Transformované kmeny se potom izolují a plasmidová DNA se připraví z těchto kmenů, jak je popsáno v „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“. Nukleotidová sekvence této DNA kódující těžké řetězce humanizované nebo myší TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem, v příslušném pořadí (Sanger, F. S., Et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sd. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Získaný plasmid se označí pHA15 (plasmid nesoucí cDNA kódující Hl-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), pHCIO (plasmid nesoucí cDNA kódující H3-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), pHD21 (plasmid nesoucí cDNA kódující H4-typ těžkého řetězce humanizované TRA-8), a pMll (plasmid nesoucí cDNA kódující těžké řetězce chimérické
TRA-8). Transformované E coli kmeny nesoucí tyto plasmidy, označené jako E. coli
JM109/pH15, E. coli JM109/pHClO, E. coli JMlO9/pHD21 a E. coli JMlO9/pMll, se uložení v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi I chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001,
-65CZ 304614 B6 v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým ě. FERM BP-7555, FERM EP-7557, FERM BP-7558, a FERM BP-7559, v příslušném pořadí (3) Konstrukce expresních plasmidů nesoucích DNA pro variabilní region těžkého řetězce několika typů humanizované nebo myší TRA-8
Rekombinantní expresní vektory pro živočišné buňky se konstruují insercí DNA kódující těžké řetězce Eli-typu, H3 typu a H4 typu humanizované nebo M typu chimérické TRA-8 (klonované výše) následujícím způsobem.
pg plasmidů pSRHEIH3 (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) nesoucí DNA pro variabilní region těžkého řetězce humanizované anti-Fas monoklonální protilátky HFE7A agenomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl, expresní vektor pro savčí buňky, se tráví restrikčními enzymy HindlII a Apal, a separuje se elektroforézou na 3% agarosovém gelu. Po elektroforéze se gel barví vodným roztokem (1 pg/ml) ethidium- bromidu pro umožnění detekce DNA za použití UV světla. Proužky vektorové DNA obsahující genomovou DNA pro konstantní region lidského IgGl bez variabilního regionu těžkého řetězce humanizované HFE7A se vyříznou za použití čepelky a eluují se z gelu za použití Geneclean Spin Kitu. Po fenolové extrakci se eluovaná DNA zahustí odstředěním při 7500 x g, potom se provede srážení ethanolem, a nakonec se rozpustí v 5 μΐ destilované vody a potom se defosforyluje za použití CIP. Získaný trávený, defosforylovaný plasmid (100 ng) se liguje s 1 pg DNA fragmentu pH15, pHCIO, pHD21, nebo pMll obsahujícím DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8, který se také tráví HindlII a Apal, za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Ligační směs se potom použije pro transformování E. coli JM109, které se potom kultivují na LB agarových plotnách obsahujících 50 pg/ml ampicilinu.
Transformanty získané tímto způsobem se kultivují ve 2 ml kapalného LB média obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu při 37 °C přes noc a plasmidová DNA se potom extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS.
Extrahovaná plasmidová DNA se tráví HindlII a Apal zpracuje se elektroforézou na 3% (hmotn./obj.) agarosovém gelu pro potvrzení nebo nepotvrzení přítomnosti insertu DNA kódující variabilní region těžkého řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems). Získané expresní plasmidy nesoucí cDNA kódující těžké řetězce humanizované nebo chimérické TRA-8 se označený pHA15-l, pHC10-3, pHD21-l, a pMll-Ι, v příslušném pořadí.
(4) Konstrukce vektorů pro humanizované lehké řetězce (4.1) Konstrukce expresního vektoru pro lehký řetězec humanizované protilátky (LM1 typ)
Jakje uvedeno v SEQ ID No. 72 seznamu sekvencí, další humanizace (LM1 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje 3. aminokyseliny (valinu), 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 60. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 63. aminokyseliny (threoninu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 85. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 87. aminokyseliny (fenylalaninu) a 99. aminokyseliny (glycinu), 103. aminokyseliny (leucinu a 108. aminokyseliny (alaninu) zN-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 glutaminem, prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem alaninem, serinem, serinem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threo-66CZ 304614 B6 ninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM1.
Expresní plasmidy nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence pro humanizované lehké řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LML typ, SEQ ID NO. 72 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ)
DNA kódující LM1 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 72 seznamu sekvencí), kde každá z nich je fůzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 (LM1 typ) a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), HKCDF1 1 (SEQ ID No. 50), HKCDR12 (SEQ ID No. 51), HKCDF22 (SEQ ID No. 52), HKCDR22 (SEQ ID No. 53) a HKCEI2 (SEQ ID No. 54).
Následující oligonukleotidové primery se syntetizují pro PCR:
5'-gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atetgaatgt caccagtgga-3' (HKSPR12; SEQ ID No. 77).
2) Konstrukce plasmidu pCR3.1/LMl-2 (klonování humanizovaného lehkého řetězce typu LM1 TRA-8)
LM1-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID No. 72 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli. a) První stupeň PCR
LM1-F1-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu a a část FRL1 regionu s místem pro štěpení Hind III restrikčním enzymem přidaným na 5 -konci se připraví za následujících podmínek. Templářové plasmidy, pHSGHMI7 a pSRPDHH, se získají způsobem podle Evropské patentová přihlášky EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pHSGHM17 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer HKSPR12, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μί
10X PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza (PerkinElmer), 2,5 jednotek
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 Pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM1-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2 se připraví za následujících podmínek.
-67CZ 304614 B6
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pL28 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF11, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR12, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
10X PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LMI-F3-DNA fragment kódující CDRL2, FRL23 a část CDRL3 se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCDF22, 50 pmol oligonukleotidový primer HKCDR22, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
10X PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM1-F4-DNA fragment kódující CDRL3, FRL4 a konstantní region a místem pro EcoRI restrikční enzym přidaným na 3-konci, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer HKCF12, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
10X PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
-68CZ 304614 B6
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforéze se barví ethidiumbromidem (1 pg/ml) pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Takto detekované příslušné DNA proužky se vyříznou čepelkou, b) Druhý stupeň PCR
LM1-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM1-F1-DNA, LM1-F2-DNA, LM1-F3DNA a LM1-F4-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM1-F1-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM1-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM1-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment LM1-F4DNA připravený v prvním stupni PCR oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 pl
ÍOxPCR pufr, 5,0 pl ampliTag DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LMI-DNA fragment se insertuje do plasmidové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOP10F' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ) se potvrdí dideoxy způsobem (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosystems, Japan).
Získané plasmidy se označí pCR3.1/LMl-2 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované TRA-8 (LM1 typ) a konstantní region lehkého řetězce lidského lg).
Získané plasmidy se označí pCR3.1/LMl-2 obsahující LMI-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy HindlII a EcoRI.
pg klonovacího plasmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforylují pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LMI-DNA fragment, který byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS způsob. Extrahovaná plasmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LMI-DNA fragment selektuje elektroforézou na 1% agarosovém gelu.
-69CZ 304614 B6
V důsledku výše uvedeného postupu se získá plasmid pHSG/M 1-2-2 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM1 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa. Transformovaný E. coli kmen nesoucí tento plasmid, označený jako E. coli DH5a/PHSG/M1-2-2, se uloží v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým číslem FERM BP-7562.
3) Konstrukce plasmidu pSR/LMI-2 (expresní plasmid pro humanizované LM1 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plasmid pHSG/Ml-2-2 nesoucí fuzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM1 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hodin III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pSRIPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/Ml-2-2 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu, a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadované DNA fragmentu v pSRPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence.
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM1 TRA-8 se označí pSR/LMl-2.
(4.2) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM3 typ)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí, další humanizace (LM3 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 85. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 87. aminokyseliny (fenylalaninu), 99. aminokyseliny (glycinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) na N-konci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, tyrosinem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM3.
Expresní plasmid nesoucí tento typ aminokyselinových sekvencí humanizovaného lehkého řetězce protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM3 typ, SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8
DNA kódující LM3 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 73 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského lg (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
-70CZ 304614 B6
Kromě 7ALIP (SEQ ID No. 47) a 7ALCN (SEQ ID No. 48) se následující oligonukleotidové primery syntetizují pro PCR:
5'- atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt ccagg-3' (MOD1F1; SEQ ID No. 78);
5'- cagcacccat agcaggattg tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt cttaagctt-3’ (M0D1R1; SEQ ID No. 79);
5’- ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga cagggtc-3' (MOD1F22; SEQ ID No. 80);
51 - acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag-3'(MOD1R22; SEQ ID No. 81);
5'- accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgetg tagcctggta ccaacagaaa ccaggaa-3' (MOD1F3; SEQ ID No. 82);
5'- tacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaaga-3' (MOD1R3; SEQ ID No. 83);
5'- aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt ttacaggcag t-3' (MOD1F42; SEQ ID No. 84);
5'- cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgettttc ctggtttctg ttggtaccag gc-3' (M0D1R4; SEQ ID No. 85);
5'- gggtctggga cagacftcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc tat-3'(MOD1F5; SEQ ID No. 86);
5'- actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac-3’ (MOD1R52; SEQ ID No. 87);
51 - tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F6; SEQ ID No. 88);
5'- cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac-3' (MOD1R6; SEQ ID No. 89)
5'- aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g-3' (MOD1F7; SEQ ID No. 90);
5'- gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc gaa-3' (MOD1R7; SEQ ID No. 91); a
5'- agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa (LR17; SEQ ID No. 101).
2) Konstrukce plasmidu pCR3.l/LM3-3-44 (klonování lehkého řetězce typu LM3 humanizované TRA-8)
LM3-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 73 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR o
LM3-F31B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s místem pro Hind III restrikční enzym přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2, FRI3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
-71 CZ 304614 B6
Složení reakčního roztoku:
oligonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F42, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R4, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F5, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F6, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer MOD 1R7, 5 pmol oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer LR1 7, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
Οχ PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM3-F31C-DNA fragment kódující část konstantního regionu sEco RI restrikčním místem přidaným na 3'-konci se připraví za následujících podmínek.
Templátový plasmid, pSRPDHH, se získá způsobem popsaným v Evropské patentové přihlášce EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty po PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel se po elektroforéze nebarví 1 pg/ml ethidiumbromidu pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné DNA proužky se excidují čepelkou.
-72CZ 304614 B6
b) Druhý stupeň PCR
LM3-DNA ve výše popsané LM3-F31B-DNA a LM3-F31C-DNA fragmenty se fúzují za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM3-F31B-DNA připravený v prvním stupni PCR, Gelový fragment
LM3-F31C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM3-DNA fragment se insertuje do plasmidové pCR3.1DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOPÍ OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované LM3 TRA-8 se potvrdí za použití dideoxy způsobu (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzeru (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosytems, Japan).
Získaný plasmid se označí pCR3.1/LM3-3-44 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM3-3-44 obsahující LM3-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM3-DBNA fragment, kteiý byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidové DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plasmidové DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM3-DNA fragment selektuje elektroforézou na 1% agarosovém gelu.
Takto se získá plasmid pHSG/M3-3-22 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa. Transformované E. coli kmene nesoucího tento plasmid, označené jako E. coli DH5alfa/pHSG/M3-3-22, se uložily v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7564.
-73CZ 304614 B6
3) Konstrukce plasmidu pSRILM3-3^14-10 (expresního plasmidu pro humanizované LM3 TRA-8 lehké řetězce)
Získaný plasmid pHSG/M3-3-22 nesoucí fúzní fragment variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM3 TRA-8 a konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlIl-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M3-3-22 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRIPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM3 TRA-8 se označí pSR/LM3-3-44-10.
(4.3) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM4 typ)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí, další humanizace (LM4 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8. aminokyseliny (histidinu), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 85. aminokyseliny (kyseliny asparagové), 99. aminokyseliny (glycinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) z N-konci aminokyselinové sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, threoninem, glutaminem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM4.
Expresní plasmid nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM4 typ), (SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů pro lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8
DNA kódující LM4 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 74 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), MOD1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1F5 (SEQ ID No. 86), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) a MOD1R7 (SEQ ID No. 91), LR17 (SEQ ID No. 101) se syntetizují následující oligonukleotidové primery pro PCR:
5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggteaag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F62; SEQ ID No. 92)
-74CZ 304614 B6
5'-cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R62; SEQ ID No. 93)
2) Konstrukce plasmidů pCR3.1ILM4-5-3 (klonování typu LM4 lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM4-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 74 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM4-F41B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s Hind III restrikčním místem přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
oligonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F42, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R4, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F5, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F62, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R62, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer MOD1R7, 5 pmol oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer LRJ7, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM4-F41C-DNA fragment kódující část konstantního regionu s Eco RI restrikčním místem přidaným na 3'-konci se připraví za následujících podmínek.
Templátový plasmid, pSRPDHH, se získá způsobem popsaným v Evropské patentové přihlášce EPO 909 816 Al.
-75CZ 304614 B6
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty pro PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforéze se barví 1 pg/ml ethidiumbromidem pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné detekované DNA proužky se vyříznou čepelkou.
b) Druhý stupeň PCR
LM4-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM4-F41B-DNA a LM-F41C-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM4-F41B-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM4-F41C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 μΐ lOx PCR pufr, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM4-DNA fragment se insertuje do plasmidové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOP10F' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8 se potvrdí za použití dideoxy způsobu (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití 3700 DNA Analyzer (ABI PRISM; Perkin Elmer Applied Biosytems, Japan).
Získaný plasmid se označí pCR3.1/LM4-5-3 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LM4 TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM4-5-3 obsahující LM4-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
-76CZ 304614 B6 pg klonovací plasmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM4-DBNA fragment, který byl tráven restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plasmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM4-DNA fragment selektuje elektroforézou na 1% agarosovém gelu.
Takto se získá plasmid pHSG/M4-5-3-l nesoucí fůzi fragmentu variabilního regionu lehkého řetězce humanizované LM4 TRA-8 a konstantního regionu lidského IgK řetězce. Transformovaný E. coli kmen nesoucí tento plasmid, označený jako E. coli DH5alfa/pHSG/M4-5-3-l, se uložil v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7565.
3) Konstrukce plasmidu pSR/LM4-5-3-3 (expresní plasmid pro humanizované lehké řetězce LM4 TRA-8)
Získaný plasmid pHSG/M4-5-3-l nesoucí fúzi fragmentu variabilního regionu lehkého řetězce LM4 humanizované TRA-8 a konstantního regionu lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 816 Al) se tráví restrikčními enzymy hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M4-5-3-l se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRIPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM4 TRA-8 se označí pSR/LM4-5-3-3.
(4.4) Konstrukce expresního vektoru pro lehké řetězce humanizované protilátky (LM5 typu)
Jak je uvedeno v SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí, další humanizace (LM5 typ) aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 zahrnuje nahrazení 8. aminokyseliny (histidinů), 9. aminokyseliny (lysinu), 10. aminokyseliny (fenylalaninu), 11. aminokyseliny (methioninu), 13. aminokyseliny (threoninu), 20. aminokyseliny (šeřinu), 42. aminokyseliny (glutaminu), 43. aminokyseliny (šeřinu), 77. aminokyseliny (asparaginu), 78. aminokyseliny (valinu), 80. aminokyseliny (šeřinu), 83. aminokyseliny (leucinu), 103. aminokyseliny (leucinu) a 108. aminokyseliny (alaninu) z N-konce aminokyselina sekvence lehkého řetězce TRA-8 prolinem, serinem, serinem, leucinem, alaninem, threoninem, lysinem, alaninem, serinem, leucinem, prolinem, fenylalaninem, valinem a threoninem, v příslušném pořadí. Získaná sekvence se označí LM5.
Expresní plasmidy nesoucí tento typ aminokyselinové sekvence lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM5 typ), (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí) se konstruuje následujícím způsobem.
-ΊΊ CZ 304614 B6
1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních regionů lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8
DNA kódující LM5 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce humanizované protilátky TRA-8 proti DR5 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), MOD1F1 (SEQ ID No. 78), MOD1R1 (SEQ ID No. 79), MOD1F22 (SEQ ID No. 80), MOD1R22 (SEQ ID No. 81), MOD1F3 (SEQ ID No. 82), MOD1R3 (SEQ ID No. 83), MOD1F42 (SEQ ID No. 84), MOD1R4 (SEQ ID No. 85), MOD1R52 (SEQ ID No. 87), MOD1F7 (SEQ ID No. 90) a LR16 (SEQ ID No. 101), se syntetizují následující oligonukleotidové primery pro PCR:
5'-gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat tat-3' (MOD1F52; SEQ ID NO. 94)
5'-ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc-3' (MOD1F63; SEQ ID No. 95)
5'-cgtccgatag crtgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag-3' (MOD1R63; SEQ ID No. 96)
5'-gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccace gaa-3' (MOD1R72; SEQ ID No. 102)
2) Konstrukce plasmidu pCRS.l/LMS-3-42 (klonování typu LM5 typu lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM5-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID No. 75 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli. a) První stupeň PCR
LMS-F51B-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu s Hind III restrikčním místem přidaným na 5'-konci, FRL1, CDRL1, FRL2 a CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
oligonukleotidový primer MOD1F1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R1, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R22, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R3, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F42, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R4, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R52, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F63, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1R63, 5 pmol oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer MOD1R72, 5 pmol oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol
-78CZ 304614 B6 oligonukleotidový primer LR17, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
ÍOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LMS-F51C-DNA fragment kódující část konstantního regionu sEco Rl restrikčním místem přidaným na 3 -konci se připraví za následujících podmínek. Templátový plasmid, pSRPDHH, se získá způsobem popsaným v Evropské patentové přihlášce EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MOD1F7, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ
ÍOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pl přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifíkované DNA fragmenty pro PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforéze se barvi 1 pg/ml ethidiumbromidem pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné detekované DNA proužky se vyříznou za použiti čepelky, b) Druhý stupeň PCR
LM5-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM5-F51B-DNA a LM5-F51C-DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM5-F51B-DNA připravený v prvním stupni PCR,
Gelový fragment LM5-F51C-DNA připravený v prvním stupni PCR, oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 μΐ
ÍOx PCR pufr, 5,0 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
-79CZ 304614 B6
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM5-DNA fragment se insertuje do plasmidové pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (InVitrogen) podle návodu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOPÍ OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované LM5 TRA-8 se potvrdí za použití dideoxy způsobu (Sanger, F. S., et al., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467) za použití DNA analyzátoru.
Získaný plasmid se označení pCR3.1/LM5-3-42 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce humanizované LMS TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského
Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LMS-3-42 obsahující LM5-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM5-DNA fragment, který se trávil restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury za použití techniky alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plasmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM5-DNA fragment selektuje elektroforézou na 1% agarosovém gelu.
Takto se získá plasmid pHSG/M5-3-27 nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8 a fragmentu pro konstantní region lidského Igkappa řetězce.
3) Konstrukce plasmidu pSR/LM5-3-27-l (expresního plasmidu pro humanizovaný LM5 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plasmid pHSG/M5-3-27 nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce humanizované LM5 TRA-8 a fragmentu pro konstantní region lidského Ig-kappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidové pSRPDHH DNA (Evropská patentová přihláška EP 0 909 516 Al) se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/M5-3-27 se ligují za použití DNA Ligation Kit Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru. Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu v pSRIPDHH vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence (ABI Prism 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems).
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce humanizované LM5 TRA-8 se označí pSR/LM5-3-27-l.
-80CZ 304614 B6 (4.5) Konstrukce expresního vektoru pro lehký řetězec humanizované protilátky (chimérický typ)
Sekvence uvedená v SEQ ID No. 76 seznamu sekvencí, aminokyselinová sekvence lehkého řetězce chimérické TRA-8, se označí LM6.
Expresní plasmidy nesoucí tento typ humanizovaného lehkého řetězce aminokyselinové sekvence protilátky TRA-8 proti lidskému DR5 (LM6 typ), (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí) se konstruují následujícím způsobem.
1) Syntézy primerů pro přípravu variabilního a konstantního regionu lehkého řetězce humanizované LM6 TRA-8
DNA kódující LM6 polypeptidový řetězec (SEQ ID No. 75 seznamu sekvencí), z nichž každá je fúzí variabilního regionu lehkého řetězce (LM 6 typu) myší anti-DR5 protilátky TRA-8 a konstantního regionu lehkého řetězce lidského Ig (kappa řetězce), se v příslušném pořadí syntetizují za použití kombinací PCR.
Kromě 7AL1P (SEQ ID No. 47), 7ALCN (SEQ ID No. 48), se pro PCR syntetizují následující oligonukleotidové primery:
5'- tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a-3' (HKSPR13; SEQ ID No. 97);
5'- tgggttccag gctceactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c-3' (MVFll; SEQ ID No. 98);
5’- aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagcttggtgcctc-3' (MVRll;
SEQ ID No. 99); a
5'- aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc-3' (MCF 11; SEQ ID No. 100).
2) Konstrukce plasmidů pCR3.1/LM6-l-16 (klonování typu LM6 lehkého řetězce humanizované TRA-8)
LM6-DNA fragment kódující aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID No. 75 se připraví provedením 2-stupňové PCR, insertuje se do plasmidového vektoru a klonuje se v E. coli.
a) První stupeň PCR
LM6-F1-DNA fragment kódující sekvenci sekrečního signálu a a část FRL1 regionu s místem pro Hind III restrikční enzym přidaným na 5 -konci se připraví za následujících podmínek. Templátové plasmidy, pHSGHM17 a pSRPDHH, se získají způsobem uvedeným v Evropské patentové přihlášce EP 0 909 816 Al.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pHSGHM17 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer HKSPR13, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza (PerkinElmer), 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
-81 CZ 304614 B6
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 30krát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM6-F2-DNA fragment kódující část FRL1, CDRLI, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantního regionu se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pL28 DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MVF11, 50 pmol oligonukleotidový primer MVR12, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 pí přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
LM6-F3-DNA fragment kódující for a část FRL4 a konstantní region s místem pro EcoRI restrikční enzym přidaným na 3'-konci se připraví za následujících podmínek.
Složení reakčního roztoku:
plasmidová pSRPDHH DNA, 25 ng oligonukleotidový primer MCF11, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5 μΐ lOx PCR pufr, 5 μΐ ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μΐ přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Amplifikované DNA fragmenty pro PCR se separují elektroforézou na 5% polyakrylamidovém gelu. Gel po elektroforéze se barví ethidiumbromidem (1 pg/ml) pro detekci produkované DNA za použití UV světla. Příslušné takto detekované DNA proužky se vyříznou čepelkou, b) Druhý stupeň PCR
LM6-DNA, ve které jsou fúzované výše popsané LM6-F 1-DNA, LM6-F2-DNA a LM6-F3DNA fragmenty, se připraví za následujících podmínek.
-82CZ 304614 B6
Složení reakčního roztoku:
Gelový fragment LM6-F1-DNA připravený v prvním stupni PCR;
Gelový fragment LM6-F2-DNA připravený v prvním stupni PCR;
Gelový fragment LM6-F3-DNA připravený v prvním stupni PCR;
oligonukleotidový primer 7AL1P, 50 pmol oligonukleotidový primer 7ALCN, 50 pmol dNTP kokteil, 5,0 μί lOx PCR pufr, 5,0 μί ampliTaq DNA polymeráza, 2,5 jednotky
Reakční roztok mající výše uvedené složení se upraví na konečný objem 50 μί přidáním redestilované vody a použije se v PCR.
PCR termální podmínky: Zahřívání při 94 °C po dobu 2 minut, potom se provede termální cyklus 94 °C po dobu 1 minuty, 55 °C po dobu 1 minuty a 72 °C po dobu 2 minut, který se provede 3 Okřát, a potom se provede zahřívání při 72 °C po dobu 10 minut.
Takto připravený LM6-DNA fragment se insertuje do plasmidová pCR3.1 DNA za použití Eukaryotic Ta Cloning Kitu (Invitrogen) podle protokolu výrobce a vnese se do kompetentních E. coli TOPÍ OF' obsažených v kitu. Nukleotidové sekvence těchto DNA kódujících lehké řetězce humanizované TRA-8 se potvrdí dideoxy způsobem za použití DNA analyzátoru.
Získaný plasmid se označení pCR3.1/LM6-l-16 (plasmid nesoucí cDNA kódující variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a konstantní region lehkého řetězce lidského Ig).
Získaný plasmid pCR3.1/LM6-l-16 obsahující LM6-DNA fragment se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.
pg klonovací plasmidová pHSG399 DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná pHSG399 DNA a LM6-DNA fragment, který se trávil restrikčními enzymy Hind III a EcoRI, se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agarovém médiu obsahujícím 0,1 mM IPTG, 0,1% X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu (konečné koncentrace). Získané bílé transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Extrahovaná plasmidová DNA se tráví Hind III a EcoRI a potom se klon nesoucí LM6-DNA fragment selektuje elektroforézou na 1% agarosovém gelu.
Takto se získá plasmid pHSG/M6-l—4-1 nesoucí fúzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a pro konstantní region lidského Igkappa řetězce. Transformovaný kmen E. coli nesoucí tento plasmid, označený jako E. coli DH5alfa/pHSG/M6-l^l-l, se uložil v International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 1-1, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-5466, Japan, 20.4.2001, v souladu s Budapešťskou smlouvou o ukládání mikroorganismů, pod přírůstkovým č. FERM BP-7566.
3) Konstrukce plasmidu pSR/LM6-l-4-6 (expresní plasmid pro chimérický LM6 TRA-8 lehký řetězec)
Získaný plasmid pHSG/LM6-l-4-l- nesoucí fůzi fragmentu pro variabilní region lehkého řetězce myší TRA-8 a pro konstantní region lidského Igkappa řetězce se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. 1 pg klonovací plasmidová pSR/PDHH DNA se tráví restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a potom se defosforyluje pomocí CIP. Získaná defosforylovaná
-83 CZ 304614 B6 pSRPDHH DNA a HindlII-EcoRI DNA fragment získaný z pHSG/LM6-l-4-l se ligují za použití DNA Ligation Kitu Verze 2.0 (Takara Syuzo, Co. Ltd.). Potom se E. coli DH5alfa transformují ligovanou DNA a kultivují se na LB agaru . Získané transformanty se kultivují v kapalném LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA se extrahuje ze získané kultury technikou alkalické činidlo-SDS. Inserce a orientace požadovaného DNA fragmentu ve vektoru se potvrdí DNA sekvenováním za použití analyzátoru genové sekvence.
Získaný expresní plasmid nesoucí cDNA kódující lehké řetězce TRA-8 (chimérický typ) se označí pSR/LM6-1^1-6.
(5) Produkce několika typů humanizovaných nebo chimérických TRA-8 protilátek
Transfekce COS-7 buněk se provede technikou využívající FUGENE6 (Boehringer Mannheim Biochemica) podle návodu výrobce kitu.
COS-7 buňky (American Type Culture Collection č. CRL-1651) se kultivují do semikonfluentního stavu (3 χ 106 buněk/disk) v kultivačních discích (plocha kultury: 57 cm2; Sumitomo Bakelite) obsahujících Dulbeccovo Modifikované Eagle médium (zde dále označované jako „D-MEM“; Gibco BRL) doplněné 10% fetálním telecím sérem (dále „FCS“; Moregate).
Mezitím se smísí 10 pg/disk (celkem 5 disků) expresní plasmidové DNA pro těžký řetězec humanizované DR5 (pHA15-l) a 10 pg/disk expresní plasmidové DNA pro lehký řetězec humanizované DR5 připravené technikou alkalické činidlo-SDS a odstředěním s gradientem chloridu česného a potom se provede vysrážení ethanolem a suspendování v 5 pl/disk dH20.
Po smísení 15 pl/disk FUGENE6 Transfection činidla se 180 pl/disk D-MEM bez FCS se tento FUGENE roztok (185 pl/disk) smísí s 5 pl/disk DNA roztoku obsahujícího 10 pg/disk expresní plasmidové DNA pro humanizované DR5 těžké řetězce a 10 pg/disk expresní plasmidové DNA pro humanizované DR5 lehké řetězce. Po 15 minutové inkubaci při teplotě místnosti se získaná plasmidová suspenze (200 pl) přidá na předem připravené COS-7 plotny. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 24 hodin se kultivační médium nahradí D-MEM bez FCS. Po inkubaci v 5% CO2 při 37 °C po dobu 72 hodin se odebere supematant kultury pro přečištění produktů exprese v supematantu. Způsobem popsaným výše COS-7 buňky transfektují každou z následujících kombinací plasmidů:
(A) : kotransfekce pHA15-l a pSR/LMl-2 (H1L1) (B) : kotransfekce pHB14-l a pSR/M2 (H2L2) (C) : kotransfekce pHB14-l a pSR/LM3-3^14-l0 (H2L3) (D) : kotransfekce pHB14-l a pSR/LM4-5-3-3 (H2L4) (E) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/M2-l (H3L2) (F) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/LM3-3-44-10 (H3L3) (G) : kotransfekce pHC10-3 a pSR/LM4-5-3-3 (H3L4) (H) : kotransfekce pHD21-l a pSR/LM5-3-27-l (H4LS) (I) : kotransfekce pMl 1-1 a pSR/LM6-l-4-6 (Chiméra)
Kultura se potom odstředí (3500 r.p.m., 15 minut) a odebere se supematant. Supematant se přefiltruje přes 0,45 pm filtr (ADVANCED TOYO DISMIC-25cs, kat # 25C5O45 AS). Přečištění IgG z filtrátu se provede za použití Protein G-POROS afinitní chromatografie (Applied Biosystems) za následujících podmínek:
HPLC systém: BioCAD 700E (Applied Biosystems) kolona: ProteinG-ID sensorová náplň (velikost kolony: 2,1 mm ID x 30 mm LD, objem lože: 0,1 ml; Applied Biosystems) eluční pufr: 0,1 M Glycin-HCl (pH 2,5)
-84CZ 304614 B6 neutralizační pufr: 0,1 m Glycin-HCl (pH 2,5) neutralizační pufr: 1 M Tris-HCl (pH 8,5) detekce: 280 nm průtok: 1 ml/min velikost frakce: 0,5 ml/0,5 mm zkumavka pro frakce: 1,5 ml polypropylenová mikrozkumavka teplota: 4 °C
Po aplikaci veškerého filtrátu do kolony se 50 ml PBS (Sigma, kat # 1000-3) použije pro promytí kolony. Když se aplikuje eluční pufr, tak se začnou odebírat frakce. Každá mikrozkumavka pro frakce na začátku obsahuje 55 μΐ 1 M NaCl, 110 μΐ neutralizačního pufru a 74 μΐ 2 mg/ml hovězího sérového albuminu (Sigma, kat. # A-7030) v PBS. Odeberou se frakce č. 7 až č. 8.
Potvrzení exprese humanizovaných protilátek a kvantitativní test na produkty exprese v supematantu kultury se provede pomocí ELISA za použití protilátky proti lidskému IgG.
Do každé jamky 96-jamkové plotny (MaxiSorp, Nunc) se přidá 100 μΐ kozí protilátky specifické pro Fc lidského IgG (Kappel) rozpuštěné v konečné koncentraci 0,5 pg/ml v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02% azid sodný, pH 9,6) a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin pro dosažení adsorpce protilátky. Potom se plotna promyje 5-krát 350 μΐ PBS-T. Do jamky se po promytí přidá supematant kultury ředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se do každé jamky přidá 100 μΐ alkalickou fosfatasou značené kozí polyklonální protilátky specifické pro lidský IgG Fc (Jackson Imuno Research Lab.) naředěné lOOOOkrát PBS-T a provede se inkubace při 37 °C po dobu 2 hodin. Po dalším promytí PBS-T se přidá roztok substrátu (p-nitrofenylfosfát z Alkaline Phosphatase Substráte kit (Bio Rad)) podle návodu výrobce kitu. Po inkubaci při 37 °C po dobu 0,5 až 1 hodiny se měří absorbance při 405 nm. V těchto pokusech se lidský plasmatický imunoglobulin G podtřídy 1 (IgGl) (Biopure AG) naředěný D-MEM obsahujícím 10% FCS na určité koncentrace použije jako referenční vzorek pro určitou koncentraci humanizovaných DR5 protilátek obsažených v supematantech kultury.
Takto se exprimované a přečištěné produkty v supematantech kultury specificky detekují pomocí protilátky proti lidskému lg. Konečná koncentrace lidské IgG protilátky je 44,03 pg/ml, (H1L1), 39,8 pg/ml (H2L2), 26,7 pg/ml (H2L3), 41,0 pg/ml (H2L4), 39,3 pg/ml (H3L3), 24,7 pg/ml (H3L3), 21,5 pg/ml (H3L4), 16,7 pg/ml (H4L5) a 18,3 pg/ml (chiméra), v příslušném pořadí.
(6) Proapoptotická aktivita několika humanizovaných protilátek nebo chimérické protilátky
Jurkat buňky (ATCC č. TIB-152) se použijí pro určení proapoptotické aktivity přečištěné humanizované TRA-8 protilátky.
Jurkat buňky kultivované v RPMI1640 médiu s 10% FCS (Gibco BRL) při 37 °C po dobu 3 dnů za přítomnosti 5% CO2 se rozdělí do každé jamky 96-jamková mikroplotny (Sumimoto Bakelite) při 50 pl na jamku. Humanizované TRA-8 připravené v příkladu 26 se upraví tak, aby měly koncentrace konečného produktu 100 ng/ml pomocí RPMI 1640 média obsahujícího 100 FCS, za hodnocení jejich koncentrací v kapalině podle způsobu popsaného v příkladu 26. Každý z takto získaných roztoků produktů exprese se upraví na koncentraci 100 ng/ml a použije se pro přípravu sériového ředění za použití opakovaného 2-násobného ředění RPMI1640 obsahujícím 10% FCS. Každý roztok ředěné humanizované TRA-8 (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L3, H3L4 nebo H4L5) se přidá do každé jamky při 50 pl na jamku. Po reakci při 37 °C po dobu 12 hodin se přidá 50 pl 25 pM PMS obsahujícího 1 mg/ml XII á (konečná koncentrace 250 pg/ml pro XII a 5 pM pro PMS). Po inkubaci po dobu 3 hodin se měří absorbance každé jamky při 450 nm pro vypočtení životaschopnosti buněk za použití redukční schopnosti mitochondrií jako indexu.
-85CZ 304614 B6
Životaschopnost buněk v každé jamce se vypočte podle následujícího vzorce:
životaschopnost (%) = 100 x (a—b) / (c—b) kde „a“ je měření pro testované jamky, „b“ je měření pro jamky bez buněk a „c“ je měření pro jamky bez přidané protilátky.
Výsledkem pokusu bylo, že testované humanizované protilátky jsou schopné indukovat apoptosu buněk T lymfocytové buněčné linie exprimujících lidský DRS antigen.
Dále se testovala proapoptotická aktivita humanizované TRA-8 pro PC-3 s přidáním taxolu podle způsobu popsaného v příkladu 25.
Lidská buněčná linie karcinomu prostaty PC-3 (ATCC č. CRL-1435) se získá od American Tissue Culture Collection (ATCC) a kultivuje se v F-12K Nutrient Mixture (21127-022, Gibco BRL) obsahující 10% fetální hovězí sérum (FBS, Hyklon), 1% L-Glutaminu-200 mM (25030149, Gibco BRL) a 0,5% roztok penicilinu-streptomycinu (P-7539, Sigma). RPMI1640 médium (MED-008, IWAKJ) doplněné 10% FBS a 0,5% roztokem penicilin-streptomycin se použije v následujícím pokusu. Exponenciálně rostoucí PC-3 buňky se odeberou trypsinizací a promyjí se dvakrát čerstvým médiem. Buňky se potom spočítají, resuspendují se v čerstvém médiu v hustotě 5 x 104 buněk/ml a rozdělí se trojmo do 96-jamkových ploten s plochým dnem (3598, Coming-Coster) v celkovém objemu 100 μΐ/jamku jeden den před zahájením pokusu. Reprezentativní protinádorové léčivo, Paclitaxel (169-18611, Wako), rozpuštěný v dimethylsulfoxidu (10 mg/ml), se naředí v čerstvém médiu a potom se přidá do 96-jamkových ploten obsahujících buňky při koncentraci 50 μΐ/jamku. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu je menší než 0,1%. Po inkubaci po dobu 24 hodin při 37 °C v atmosféře 5% CO2 se humanizované TRA-8 protilátky (H1L1, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4 nebo H4L5) ředěné v čerstvém médiu přidají do jamek. Po inkubaci po dobu dalších 24 hodin se do jamek přidá 50 μΐ Minimálního esenciálního média (11095-098, Gibco BRIL) obsahujícího 1 mg/ml XTT a 25 mM PMS a plotny se inkubují po dobu 6 hodin. OD450 se potom měří za použití ARVO HIS 1420 Multilabel Counter (Wallac Berthold) a životaschopnost buněk se vypočte následujícím způsobem.
Životaschopnost buněk (%) = (OD450 pro jamky obsahující buňky léčené Taxolem a humanizovanou TRA-8 (činidla) - OD450 pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla) x 100 / (OD450 pro jamky obsahující buňky bez činidla - OD450) pro jamky neobsahující ani buňky, ani činidla)
Výsledkem pokusu je, že testované humanizované protilátky jsou schopny indukovat apoptosu u lidských buněk karcinomu prostaty exprimujících lidský DR5 antigen.
Jakékoliv patenty nebo publikace uvedené v předkládaném vynálezu popisují stav oboru, kterého se vynález týká. Tyto patenty a publikace jsou uvedeny v celém rozsahu jako odkazy.
Předkládaný vynález není omezen v rozsahu výše uvedenými uloženými mikroorganismy nebo provedeními popsanými v příkladech, které jsou určeny pro ilustraci několika aspektů vynálezu a jakákoliv provedení, která jsou funkčně ekvivalentní, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Různé modifikace vynálezu zřejmé odborníkům v oboru spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.
Odkazy
1. Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, Din WS, Huang CP, Nicholl JK, Sutherland OR, Smith, ID, Rauch C, Smith CA, et al. Imunity 1995 Dec; 3 (6):673-52
2. Pan G, 0'Rourke K, Chinnaiyan AM, Gentz R, Ebner R, Ni J, Dixit VM Science 1997 Apr 4; 276(5309):111-3
-86CZ 304614 B6
3. Walczak H, Degli-Esposti MA, Johnson RS, Smolak PJ, Waugh JY, Boiani N, Timour MS, Gerhart MJ, Schooley KA, Smith CA, Goodwin RG, Rauch Cl. EMBO J 1997 Sep 1; 16(17):5386-97
4. MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasuia SM, Femandes-Alnemri I, Cohen GM, Alnemri ES. J Biol Chem 1997 Oct 10; 272(41):25417-20,
5. Degli-Esposti MA, Dougall WC, Smolak Pt Waught JY, Smith CA, Goodwin RG. Imunity
1997 Dec; 7(6):813-20
6. Chaudhary PM, Eby M, Jasmín A, Bookwalter A, Murray J, Hood L. Immunity 1997 Dec; 7(6):821-30
7. Schneider P, Thome M, Bums K, Bodmer JL, Hoflnann, K, Kataoka I, Holler N, Ischopp 3. Immunity 1997 Dec; 7(6):831-6
8. Degli-Esposti MA, Smolak PJ, Walczak H, Waugh 3, Huang CP, DuBose RF, Goodwin RG, Smith CA. J Exp Med 1997 Oct 6; 186(7):1 165-70
9. Sheridan JP, Marstgers SA, Pit RM, Gumey A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Science 1997 Aug 8; 277(5327):81 8-21
10. Pan G, Ni 3, Wei YE, Yu 0, Gentz R, Dixit VM. Science 1997 Aug 8; 277(5327);815-818
11. Marsters SA, Sheridan JP, Pitti RM, Huangg A, Skubatch M, Baldwin D, Yuan 3, Gumey A, Goddard AD, Godowski P, Ashkenazi A. Curr Biol 1997 Dec 1; 7(12):1003-6
12. Emery JG, McDonnell P, Burke MB, Deen KC, Lyn S, Silverman C, Dul E, Appelbaum ER, Eichman C, DiPrinzio R, Dodds RA, James IE, Rosenberg M, Lee JC, Young PR. J Biol Chem
1998 Jun 5;273(23): 14363-7
13. Walczak H, Miller RE, Ariail K, Gliniak B, Griffith IS, Kubin M, Chin W, Jones J, Woodward A, Le I, Smith C, Smolak P, Goodwin RG, Rauch Cl, Schuh JC, Lynch DH. Nat Med
1999 Feb; 5(2): 157-63
14. Gazitt Y. Leukemia 1999 Nov; 13(11): 1817-24
15. Rieger 3, Neumann U, Glaser I, Ashkenazi A, Weller M. FEBS Lett. 1998 May 1; 427(1):124-8
16. Jeremiáš I, Hen I, Boehler I, Debatin KM. Eur J Immunol 1998 Jan; 28(1): 143-52
17. Martinez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Pineiro A, Naval J, Anei A. Eur J Immunol 1998 Sep; 28(9):2714-25
18. Phillips IA , Ni S, Pan U, Ruben SM, Wei YE, Páce IL, Hunt JS. J Immunol 1999 May 15; 162(10): 6053-9
19. Kayagaki N, Yamaguchi N, Nakayama M, Iakeda K, Akiba H, Isutsui H, Okamura H, Nakanishi K, Okumura K, Yagita H. J. Immunol 1999 Aug 15; i63(4): 1906-13
20. Johnsen AC, Haux J, Steinkjer B, Nonstad U, Egeberg K, Sundán A, Ashkenazi A, Espevik I. Cytokine 1999 Sep; 11(9):664-72
21. Zamai L, Ahmad M, Bennett IM, Azzoni L, Alnemri ES, Perussia B. J Exp Med 1998 Dec 21; 188(12):2375-80
22. Fanger NA, Maliszewski CR, Schooley K, Griffith IS. J Exp Med 1999 Oct 18; 190(8): 155-64
23. Griffith IS, Wiley SR, Kubin MZ, Sedger LM, Maliszewsko CR, Fanger NA. J Exp Med 1999 Apr 19; 189(8):1343-54
24. Griffith IS, Rauch Cl, Smolak PS, Waugh JY, Boiani N, Lynch DH, Smith CA, Goodwin RG, Kubin MZ. J. Immunology 1999 162: 2597-2605
25. Albani S a Carson DA, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rhematology, 13. edition, volume 2, 979-992.
26. Fujisawa K, Asahara H, Okamoto K, Aono H, Hasunuma I, Kobata I, Iwakura Y, Yonehara 5, Sumida I, aNishioka K. J. Clin. Invest. 1996 98(2): 271-278
-87CZ 304614 B6
27. Zhang H, Yang Y, Horton IL, Samoilova EB, Judge IA, Iurka LA, Wilson 3M, a Chen Y. 1997 J. Chin. Invest. 100(8), 1951-1957.
28. Roth W, Isenmann 5, Naumann U, Kugler S, Bahr M, Dichgans J, Ashkenazi A, Weller M. Locoregional. Biochem Biophys Res Commun 1999 Nov 19; 265(2): 479-83
29. Chinnaiyan AM, Prasad U, Shankar 5, Hamstra DA, Shanaiah M, Chenevert IL, Ross BD, Rhemtulia A. Proč. Nati. Acad. Sci. 2000 Feb 15; 97(4):1754-1759
30. Arai I, Akiyama Y, Okabe 5, Saito K, Iwai I, Yuasa Y. Cancer Lett 1998 Nov 27; 133(2):197-204
31. Lee SH, Shin MS, Kim HS, Lee HK, Park WS, Kim SY, Lee JH, Han SY, Park JY, Oh RR, Jang JJ, Han TI, Lee JY, Yoo NJ. Cancer Res 1999 Nov 15; 59(22):5683-5686
32. Pai SI, Wu GS, Ozoren N, Wu L, Jen 3, Sidransky D, El-Deiry WS. 1998 Cancer Res Aug 15; 58(16):3513-3518
33. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
34. Schroffet al., 1985 Cancer Res., 45, 879-885.
35. Yelton, D. E., et al., 1978 Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7
36. Kohler, U., et al., 1976 European J. Immunology, 6, 511-519
37. Shuhnan, M., et al., 1978 Nátuře, 276, 269-270
38. Keamey, J. F., et al., 1979 J. Immunology, 123, 1548-1550
39. Horibata, K. a Harris, A. W., 1975 Nátuře, 256, 495-497
40. Sheridan JP, Marsters SA, Pitti RM, Gumey A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishinan, Gray CL, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P. a Ashkenazi A, 1997 Science, 277, 818-821.
41. Cheng J et al., 1994 Science, 263, 1759-1762
42. Bendele AM et al., 1999 Clin Exp Rheumatol, 17(5), 553-560
43. Sheridan JP, Marsters AS, Pitti RM, Gumey A, Skubatch M, Baldwin D, Ramakrishnan L, Gray CJ, Baker K, Wood WI, Goddard AD, Godowski P. a Ashkenazi A. 1997 Science, 277, 818-821.
44. Schneider P, Thome M, Bums K, Bodmer JL, Hofmann K, Kataoka I, Holler N, Tschopp J., 1997 Immunity Dec; 7(6): 831-836.
45. Kennedy NJ, Kataoka I, Tschopp J, a Budd RC. 1999 J. Exp. Med. 1891-1896.
46. Miller-Ladner U, Gay RE, a Gay S, 1997 Arthritis and allied conditions, a textbook of rhemuatology, 13th edition. Volume 1, 243-254.
Seznam sekvencí
| <120> | Protilátka selektivní pro receptor faktoru nekrózy nádorů indukující apoptosu a její použití |
| <130> | UAB-17552/22 |
| <160> | 102 |
| <170> | Patentln verze 3.0 |
| <210> | 1 |
| <211> | 25 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
-88CZ 304614 B6
| <400> | 1 |
| gacgatgccc gatctacttt 25 | |
| <210> <211> <212> <213> | 2 22 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 2 |
| ccactgggtg atgttggatg 22 | |
| <210> <211> <212> <213> | 3 24 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 3 |
ggatccgtgg acacattcga tgtc 24
| <210> | 4 | ||
| <211> | 20 | ||
| <212> | DNA | ||
| <213> | syntetický konstrukt | ||
| <400> | 4 | ||
| Glu | Val Met Leu Val | Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys | Pro Gly Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
| Ser | Leu Lys Leu | ||
| 20 |
| 25 | <210> <211> <212> <213> | 5 20 PRT Mus musculus | ||
| 30 | <400> | 5 | ||
| Asp 1 | Ile Val Met | Thr Gin Ser His Lys 5 | Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 10 15 | |
| Arg Val Ser |
-89CZ 304614 B6
| <210> | 6 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 6 |
cagcactgaa cacggacccc 20
| <210> | 7 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 7 |
| aaaggtaatt tattgagaag 20 |
| <210> | 8 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 8 |
| cctc | accatg aacttcgggc 2 0 |
| <210> | 9 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 9 |
| ctgtt | gtatg cacatgagac 20 |
| <210> | 10 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 10 |
gaagtgatgc fcggtggagtc 20
-90CZ 304614 B6 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 11 agtgtgaagt gatgctggtg 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 12 tttaccagga gagtgggaga g
| 21 | |
| <210> <211> <212> <213> | 13 20 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 13 |
| tgcagagaca gtgaecagag 20 | |
| <210> <211> <212> <213> | 14 20 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 14 |
| tgttcaggac cagcatgggc 20 | |
| <210> <211> <212> <213> | 15 20 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 15 |
aagacatttt ggattctaac 20
-91 CZ 304614 B6
| <210> | 16 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 23 |
| tatcatgaag tctttgtatg 20 |
| <210> | 17 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 17 |
| gatggagaca cattctcagg 20 |
| <210> | 18 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 18 |
gacattgtga tgacccagtc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 19 ttaacactca ttcctgttga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 20 gactgggtca tcacaatgtc 20
-92CZ 304614 B6
| <210> | 21 |
| <211> | 1398 |
| <212> | DNA |
| <213> | Mus musculus |
| <400> | 21 |
| atgaacttcg 60 | ggctcagctt | gattttcctt | gtccttgttt | taaaaggtgt | ccagtgtgaa |
| gtgatgctgg 120 | tggagtctgg | gggaggctta | gtgaagcctg | gagggtccct | gaaactctcc |
| tgtgcagcct 180 | ctggattcac | tttcagtaqc | tatgtaatgt | cttgggttcg | ccagactccg |
| gagaagaggc 240 | tggagtgggt | cgcaaccatt | agtagtggtg | gtagttacac | ctactatcca |
| gacagtgtga 300 | aggggcgatt | caccatctcc | agagacaatg | ccaagaacac | cctgtacctg |
| G cLcLcttS clCf C B 360 | gtctgaggtc | tgaggacacg | gccatgtatt | actgtgcaag | acggggggac |
| tctatgatta 420 | cgscggacta | ctggggccaa | ggc ac c a cfcc | ccacaytctc | ctcagccaaa |
-93CZ 304614 B6
| acgacacccc 480 | catctgtcta | tccactggcc | cctggatctg | ctgcccaaac | taactccatg |
| gtgaccctgg 540 | gatgcctggt | caagggctat | ttccctgagc | cagtgacagt | gacctggaac |
| tctggatccc 600 | tgtccagcgg | tgtgcacacc | ttcccagctg | tcctgcagtc | tgacctctac |
| actctgagca 660 | gctcagtgac | tgtcccctcc | agcacctggc | ccagcgagac | cgtcacctgc |
| aacgttgccc 720 | acccggccag | cagcaccaag | gtggacaaga | aaattgtgcc | cagggattgt |
| gattgtaagc 780 | cttgcatatg | tacagtccca | gaagtatcat | ctgtcttcat | cttcccccca |
| aagcccaagg 840 | atgtgctcac | cattactctg | a.ctcctaagg | tcacgtgtgt | tgtggtagac |
| atcagcaagg 900 | atgatcccga | ggtccagttc | agctggtttg | tagatgatgt | ggaggtgcac |
| acagctcaga 960 | cgcaaccccg | ggaggagcag | ttcaacagca | ctttccgctc | agtcagtgaa |
| cttcccatca 1020 | tgcaccagga | ctggctcaat | ggcaaggagt | tcaaatgcag | ggtcaacagt |
| gcagctttcc 1080 | ctgcccccat | cgagaaaacc | atctccaaaa | ccaaaggcag | accgaaggct |
| ccacaggtgt 1140 | acaccattcc | acctcccaag | gagcagatgg | ccaaggataa | agtcagtctg |
| acctgcatga 1200 | taacagactt | cttccctgaa | gacattactg | tggagtggca | gtggaatggg |
| cagccagcgg 1260 | agaactacaa | gaacactcag | cccatcatgg | acacagatgg | ctcttacttc |
| gtctacagca 1320 | agctcaatgt | gcagaagagc | aactgggagg | caggaaatac | tttcacctgc |
| tctgtgttac | atgagggcct | gcacaaccac | catactgaga | agagcctctc | ccactctcct |
1380
-94CZ 304614 B6 ggtaaaaatc actagtga 1398
| <210> | 22 |
| <211> | 705 |
| <212> | DNA |
| <213> | Mus musculus |
| <400> | 22 |
atgaagtctt tgtatgtgtt agtgtataca cattatctgt tfcctgtttgc 60 ggagacattg tgatgaccca gtctcacaaa ttcatgtcca catcagtagg 120 agcatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggfcactgctg tagcctggta 180 ccagggcaat ctcctaaact actgatttac tgggcatcca cccggcacac 240 gatcgcttca caggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccattag 300 tctgaagact tggcagatta tttctgtcag caatatagca gctatcggac 360 ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat 420 tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa 480 cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa 540 aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag 600 ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac 660 tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttaa 705 aggtgttgaa agacagggtc tcaacagaaa tggagtccct caatgtgcag gttcggtgga cttcccacca caacttctac tggcgtcctg caccctcacg tcacaagaca io <210> 23 <211> 464
-95CZ 304614 B6
| <212> | PRT | ||||||||||||||
| <213> | Mus musculus | ||||||||||||||
| <400> | 23 | ||||||||||||||
| Met | Asn | Phe | Gly | Leu | Ser | Leu | Ile | Phe | Leu | Val | Leu | Val | Leu | Lys | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Val | Gin | Cys | Glu | Val | Met | Leu | Val | Glu | Ser | Gly | Gly | Gly | Leu | Val | Lys |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Pro | Gly | Gly | Ser | Leu | Lys | Leu | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Tyr | Val | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Thr | Pro | Glu | Lys | Arg | Leu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Glu | Trp | Val | Ala | Thr | Ile | Ser | Ser | Gly | Gly | Ser | Tyr | Thr | Tyr | Tyr | Pro |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Asp | Ser | Val | Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Ala | Lys | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Tyr | Leu | Gin | Met | Ser | Ser | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp | Thr | Ala | Met |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Tyr | Tyr | Cys | Ala | Arg | Arg | Gly | Asp | Ser | Met | Ile | Thr | Thr | Asp | Tyr | Trp |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | Gin | Gly | Thr | Thr | Leu | Thr | Val | Ser | Ser | Ala | Lys | Thr | Thr | Pro | Pro |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ser | Val | Tyr | Pro | Leu | Ala | Pro | Gly | Ser | Ala | Ala | Gin | Thr | Asn | Ser | Met |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Val | Thr | Leu | Gly | Cys | Leu | Val | Lys | Gly | Tyr | Phe | Pro | Glu | Pro | Val | Thr |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Val | Thr | Trp | Asn | Ser | Gly | Ser | Leu | Ser | Ser | Gly | Val | His | Thr | Phe | Pro |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ala | Val | Leu | Gin | Ser | Asp | Leu | Tyr | Thr | Leu | Ser | Ser | Ser | Val | Thr | Val |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Pro | Ser | Ser | Thr | Trp | Pro | ser | Glu | Thr | Val | Thr | Cys | Asn | Val | Ala | His |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Pro | Ala | Ser | Ser | Thr | -/s | Val | Asp | Lys | Lys | Ile | Val | Pro | Arg | Asp | Cys |
| 225 | 230 | 235 | 24 0 |
-96CZ 304614 B6
| Gly | Cys | Lys | Pro | Cys 245 | Ile | Cys | Thr | Val | Pro 250 | Glu | Val | Ser | Ser | Val 255 | Phe |
| Ile | Phe | Pro | Pro 260 | Lys | Pro | Lys | Asp | val 265 | Leu | Thr | Ile | Thr | Leu 270 | Thr | Pro |
| Lys | Val | Thr 275 | Cys | Val | Val | Val | Asp 230 | Ile | Ser | Lys | Asp | Asp 285 | Pro | Glu | Val |
| Gin | Phe 290 | Ser | Trp | Phe | Val | Asp 295 | Asp | Val | Glu | Val | His 300 | Thr | Ala | Gin | Thr |
| Gin 305 | Pxo | Arg | Glu | Glu | Gin 310 | Phe | Asn. | Ser | Thr | Phe 315 | Arg | Ser | Val | Ser | Glu 320 |
| Leu | Pro | Ile | Met | His 325 | Gin | Asp | Trp | Leu | Asn 330 | Gly | Lys | Glu | Phe | Lys 335 | Cys |
| Arg | Val | Asn | Ser 340 | Ala | Ala | Phe | Pro | Ala 345 | Pro | Ile | Glu | Lys | Thr 350 | Ile | Ser |
| Lys | Thr | Lys 355 | Gly | Arg | Pro | Lys | Ala 360 | Pro | Gin | Val | Tyr | Thr 365 | Ile | Pro | Pro |
| Pro | Lys 370 | Glu | Gin | Met | Ala | Lys 375 | Asp | Lys | Val | Ser | Leu 380 | Thr | Cys | Met | Ile |
| Thr 385 | Asp | Phe | Phe | Pro | Glu 390 | Asp | Ile | Thr | Val | Glu 395 | Trp | Gin | Trp | Asn | Gly 400 |
| Gin | Pro | Ala | Glu | Asn 405 | Tyr | Lys | Asn | Thr | Gin 410 | Pro | Ile | Met | Asp | Thr 415 | Asp |
| Gly | Ser | Tyr | Phe 420 | Val | Tyr | Ser | Lys | Leu 425 | Asn | Val | Gin | Lys | Ser 430 | Asn | Trp |
| Glu | Ala | Gly 435 | Asn | Thr | Phe | Thr | Cys 440 | Ser | Val | Leu | His | Glu 445 | Gly | Leu | His |
| Asn | His 450 | His | Thr | Glu | Lys | Ser 455 | Leu | Ser | His | Ser | Pro 460 | Gly | Lys | Asn | His |
| <210> | 24 |
| <211> | 234 |
| <212> | PRT |
| <213> | Mus musculus |
| <400> | 24 |
-97CZ 304614 B6
Met
Ala
Ser
Asp
Pro 6 5
Asp
Ser
Ser
Ala
Leu
14S
Pro
Asn
Tyr
His
Ile
225 <210> <211> <212>
Lys Ser Leu Tyr Val Leu Val 5
Gly Val Glu Gly Asp Ile Val 20
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val 35 40
Val Gly Thr Ala Val Ala Trp 50 55
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala 70
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser 85
Asn Val Gin Ser Glu Asp Leu 100
Ser Tyr Arg Thr Phe Gly Gly 115 120
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser 130 135
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val 150
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp 165
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr 180
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr 195 200
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala 210 215
Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn 230
PRT
Tyr Thr His Tyr Leu Phe Leu Phe 10 15
Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met 25 30
Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin 45
Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser 60
Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro 75 80
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 90 95
A.la Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr 105 110
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 125
Ile Phe Pro.Pro Ser Ser Glu Gin 140
Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 155 160
Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gin 170 175
Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 185 ISO
Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 205
Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 220
Glu Cys <213> Musmusculus <400> 25
Ser Tyr Val Met Ser 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Musmusculus <400> 26
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Musmusculus <400> 27
Arg Gly Asp Ser Met Ile Thr Thr Asp Tyr 15 10
| <210> | 28 | ||
| <211> | 11 | ||
| <212> | PRT | ||
| <213> | Mus musculus | ||
| <400> | 28 | ||
| Lys . | Ala Ser Gin | Asp Val | Gly Thr Ala Val Ala |
| 1 | 5 | 10 |
| <210> | 29 | |
| <211> | 7 | |
| <212> | PRT | |
| <213> | Mus musculus | |
| <400> | 29 | |
| Trp | Ala Ser Thr | Arg His Thr |
| 1 | o |
-99CZ 304614 B6 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30
Gin GLn Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr 1 5
| <210> <211> <212> <213> | 31 119 PRT syntetický konstrukt |
| <400> | 31 |
| Glu | Val Met Leu Val Glu Ser Gly |
| 1 | 5 |
| Ser | Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala |
| 20 | |
| Val | Met Ser Trp Val Arg Gin Ala |
| 35 40 | |
| Ala | Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser |
| 50 55 | |
| Lys | Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg |
| 65 | 70 |
| Leu | Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala |
| 85 | |
| Ala | Arg Arg Gly Asp Ser Met Ile |
| 100 | |
| Thr | Leu Val Thr Val Ser Ser |
| 115 | |
| <210> | 32 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 32 |
ttggataagc ttggcttgac ctcaccatgg
| Gly | Gly 10 | Leu | Val | Gin | Pro | Gly 15 | Gly |
| Ser 25 | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser 30 | Ser | Tyr |
| Pro | Gly | Lys | Gly | Leu 45 | Glu | Trp | Val |
| Tyr | Thr | Tyr | Tyr 60 | Pro | Asp | Ser | Val |
| Asp | Asn | Ala 75 | Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr 80 |
| Glu | Asp 90 | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr 95 | Cys |
| Thr 105 | Thr | Asp | Tyr | Trp | Gly 110 | Gin | Gly |
gatggagctg tatcatcctc ttcttggtag
- 100CZ 304614 B6 caacagctac aggtgtccac
| 80 | |
| <210> | 33 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 33 |
tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga 60 ctctcctgtg cagcctctgg
| 80 | |
| <210> | 34 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 34 |
attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag gcaccaggga agggtctgga 60 gtgggttgca accattagta 80 <210> 35 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 35 gtggtggtag ttacacctac tatccagaca gtgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 60 acaatgccaa gaacaccctg
| 80 | |
| <210> | 36 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
- 101 CZ 304614 B6 <400> 36
| tatctgcaaa tgaacagtct 60 ggtgactcta tgattacgac 80 | gagagcagag | gacacggctg | tttattactg | tgcaagaagg | ||
| <210> | 37 | |||||
| <211> | 64 | |||||
| 5 | <212> | DNA | ||||
| <213> | syntetický konstrukt | |||||
| <400> | 37 | |||||
| ggactactgg ggccaaggga | ccctggtcac | agtctcctca | gcctccacca | agggcccatc | ||
| 60 | ||||||
| ggtc | 64 | |||||
| 10 | <210> | 38 | ||||
| <211> | 60 | |||||
| <212> | DNA | |||||
| <213> | syntetický konstrukt | |||||
| 15 | <400> | 38 | ||||
| ctaccaagaa gaggatgata | cagctccatc | ccatggtgag | gtcaagccaa | gcttatccaa | ||
| 60 |
| <210> | 39 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 39 |
tctcagggac cctccaggct 60 gtactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga gtggacacct gtagctgttg 80 <210> 40 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt
-102CZ 304614 B6 <400> 40 tccagaccct tccctggtgc ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag
| 80 | |
| <210> | 41 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 41 |
ctctggagat ggtgaatcgg cccttcacac tgtctggata gtaggtgtaa ctaccaccac 60 tactaatggt tgcaacccac 80 <210> 42 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 42 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 <210> 43 <211> 84 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 43 gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgacc agggtccctt ggccccagta 60 gtccgtcgta atcatagagt cacc 84 <210> 44
- 103 CZ 304614 B6 <211> 20 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 44 ttggataagc ttggcttgac
| 20 | |
| <210> | 45 |
| <211> | 21 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 45 |
gaccgatggg cccttggtgg a 21 <210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 46
| Asp 1 | Ile | Val | Met | Thr 5 | Gin | Ser | Pro | Ser | Ser 10 | Leu | Ser | Ala | Ser | Val 15 | Gly |
| Asp | Arg | Val | Thr 20 | Ile | Thr | Cys | Lys | Ala 25 | Ser | Gin | Asp | Val | Gly 30 | Thr | Ala |
| Val | Ala | Trp 35 | Tyr | Gin | Gin | Lys | Pro 40 | Gly | Lys | Ala | Pro | Lys 45 | Leu | Leu | Ile |
| Tyr | Trp 50 | Ala | Ser | Thr | Arg | His 55 | Thr | Gly | Val | Pro | Ser 60 | Arg | Phe | Ser | Gly |
| Ser 65 | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp 70 | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile 75 | Ser | Ser | Leu | Gin | Pro 80 |
| Glu | Asp | Phe | Ala | Thr 85 | Tyr | Tyr | Cys | Gin | Gin 90 | Tyr | Ser | Ser | Tyr | Arg o c: | Thr |
| Phe | Gly | Gin | Gly 100 | Thr | Lys | Val | Glu | Ile 105 | Lys | Arg | Thr | Val | Ala 110 | Ala | Pro |
| Ser | Val | Phe | Ile | Phe | Pro | Pro | Ser | Asp | Glu | Gin | Leu | Lys | Ser | Gly | Thr |
115 120 125
- 104CZ 304614 B6
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 ~ 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
| <210> | 47 |
| <211> | 34 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 47 |
cccaagctta agaagcatcc 34 tctcatctag ttct
| <210> | 48 |
| <211> | 45 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 48 |
cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctctt.t gtgac
| 45 | |
| <210> | 49 |
| <211> | 60 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 49 |
gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc 6 0 atcacaatgt caccagtgge
- 105CZ 304614 B6
| <210> | 50 | |
| <211> | 48 | |
| <212> | DNA | |
| c | <213> | syntetický konstrukt |
| 3 | <400> | 50 |
| ccaagttctt tgtctgc 48 | ||
| <210> | 51 | |
| <211> | 57 | |
| 10 | <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt | |
| <400> | 51 | |
| agtgtgccgg gtggatgc 57 | ||
| 15 | <210> | 52 |
| <211> | 48 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | syntetický konstrukt | |
| 20 | <400> | 52 |
tgggcatcca cccggcacac tggggtccca agcaggttta gtggcagt
| 48 | |
| <210> | 53 |
| <211> | 63 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 53 |
ataactacta tattgctgac agtaataggt tgcaaaatcc tccggctgca gactagagat 60 ggt
| <210> | 54 |
| <211> | 63 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 54 |
- 106CZ 304614 B6 cagcaatata gcagctatcg gacgttcggt caaggcacca aggtggaaat caaacggact 60 gtg <210> <211> <212>
<213>
711
DNA syntetický konstrukt <400> 55
| atggagacag 60 | acacaatccfc | gctatgggtg | ctgctgctct | gggttccagg | ctccactggt |
| gacattgtga 120 | tgacccaatc | tccaagttct | ttgtctgcat | ctgtggggga | cagggtcacc |
| atcacctgca 180 | aggccagtca | ggatgtgggt | actgctgtag | cctggtatca | acagaaacca |
| gggaaagctc 240 | ctaaactact | gatttactgg | gcatccaccc | ggcacactgg | ggtcccaagc |
| aggtttagtg 300 | gcagtgggtc | tgggacagac | ttcaccctca | ccatctctag | tctgcagccg |
| gaggattttg 360 | caacctatta | ctgtcagcaa | tatagtagtt | atcggacgtt | Cggtcaaggc |
| accaaggtgg 420 | aaatcaaacg | gactgtggct | gcaccatetg | tcttcatctt | cccgccatct |
| gatgagcagt 4 80 | tgaaatctgg | aactgcctct | gttgtgtgcc | tgctgaataa | cttctatccc |
| agagaggcca 540 | aagtacagtg | gaaggtggat | aacgccctcc | aatcgggtaa | ctcccaggag |
| agtgtcacag 600 | agcaggacag | caaggacagc | acctacagcc | tcagcagcac | cctgacgctg |
| agcaaagcag 660 | actacgagaa | acacaaagtc | tacgcctgcg | aagtcaccca | tcagggcctg |
| agctcgcccg 711 | tcacaaagag | cttcaacagg | ggaga‘gtgtt | agtaagaatt | c |
-107CZ 304614 B6 <210> 56 <211> 119 <212> PRT <213 > syntetický konstrukt <400> 56
| Glu 1 | Val | Gin | Leu | Val 5 | Glu | Ser | Gly |
| Ser | Leu | Arg | Leu 20 | Ser | Cys | Ala | Ala |
| Val | Met | Ser 35 | Trp | Val | Arg | Gin | Ala 40 |
| Ala | Thr 50 | Ile | Ser | Ser | Gly | Gly 55 | Ser |
| Lys 65 | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile 70 | Ser | Arg |
| Leu | Gin | Met | Asn | Ser 85 | Leu | Arg | Ala |
| Ala | Arg | Arg | Gly 100 | Asp | Ser | Met | Ile |
| Thr | Leu | Val | Thr | Val | Ser | Ser |
| Gly | Gly 10 | Leu | Val | Gin | Pro | Gly 15 | Gly |
| Ser 25 | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser 30 | Ser | Tyr |
| Pro | Gly | Lys | Gly | Leu 45 | Glu | Trp | Val |
| Tvr ~ J. “ | Thr | Tvr — J — | Tyr 60 | Pro | Asp | Ser | Val |
| Asp | Asn | Ala 75 | Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr 80 |
| Glu | Asp 90 | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr 95 | Cys |
| Thr 105 | Thr | Asp | Tyr | Trp | Gly 110 | Gin | Gly |
lis
| <210> | 57 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 57 |
tctgaagtac agctggtgga gtctggggga 60 ctctcctgtg cagcctctgg 80 ggcttagtac agcctggagg gtccctgaga <210> 58 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt
-108CZ 304614 B6 <400> 58 tctcagggac cctccaggct gtactaagcc tcccccagac tccaccagct gtacttcaga 60
| gtggacacct gtagctgttg | |||
| 80 | |||
| <210> | 59 | ||
| <211> | 119 | ||
| <212> | PRT | ||
| <213> | syntetický konstrukt | ||
| <400> | 59 | ||
| Glu | Val Met Leu Val Glu | Ser Gly Gly Gly Leu Val | Gin Pro Gly Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
| Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Tyr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Ala | Pro | Gly | Lys | Gly | Leu | Glu | Trp | Val |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ala | Thr | Ile | Ser | Ser | Gly | Gly | Ser | Tyr | Thr | Tyr | Tyr | Pro | Asp | Ser | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Ala | Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Gin | Met | Ser | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Ašp | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ala | Arg | Arg | Gly | Asp | Ser | Met | Ile | Thr | Thr | Asp | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Val | Thr | Val | Ser | Ser |
115 <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 60
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
- 109CZ 304614 B6
| Ser | Leu | Arg | Leu | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser | Ser | Tyr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Met | Ser | Trp | Val | Arg | Gin | Thr | Pro | Glu | Lys | Arg | Leu | Glu | Trp | Val |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ala | Thr | Ile | Ser | Ser | Gly | Gly | Ser | Tyr | Thr | Tyr | Tyr | Pro | Asp | Ser | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile | Ser | Arg | Asp | Asn | Ala | Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Gin | Met | Ser | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Asp | Thr | Ala | Val | Tyr | Tyr | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ala | Arg | 7\ ΛΑ. | Gly | Asp | Ser | Met | Ile | Thr | Thr | A3P | Tyr | Trp | Gly | Gin | Gly |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Leu | val | Thr | Val | Ser | Ser |
115 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213 > syntetický konstrukt <400> 61
| Glu 1 | Val | Met | Leu | Val 5 | Glu | Ser | Gly | Gly | Gly. 10 | Leu | Val | Lys | Pro | Gly 15 | Gly |
| Ser | Leu | Lys | Leu 20 | Ser | Cys | Ala | Ala | Ser 25 | Gly | Phe | Thr | Phe | Ser 30 | Ser | Tyr |
| Val | Met | Ser 35 | Trp | Val | Arg | Gin | Thr 40 | Pro | Glu | Lys | Arg | Leu 45 | Glu | Trp | Val |
| Ala | Thr 50 | Ile | Ser | Ser | Gly | Gly 55 | Ser | Tyr | Thr | Tyr | Tyr 60 | Pro | Asp | Ser | Val |
| Lys 6 5 | Gly | Arg | Phe | Thr | Ile 70 | Ser | Arg | Asp | Asn | Ala 75 | Lys | Asn | Thr | Leu | Tyr 80 |
| Leu | Gin | Met | Ser | Ser 85 | Leu | Arg | Ser | Glu | Asp 90 | Thr | Ala | Met | Tyr | Tyr 95 | Cys |
| Ala | Arg | Arg | Gly 100 | Asp | Ser | Met | Ile | Thr 105 | Thr | Asp | Tyr | Trp | Gly 110 | Gin | Gly |
-110CZ 304614 B6
Thr Thr Leu. Thr Val Ser Ser
| 115 | |
| <210> | 62 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 62 |
tatctgcaaa tgagcagtct gagagcagag gacacggctg tttattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 80 <210> 63 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 63 ccttcttgca cagtaataaa cagccgtgtc ctctgctctc agactgttca tttgcagata 60 cagggtgttc ttggcattgt 80 <210> 64 <211> 80 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 64 attcactttc agtagttatg taatgtcttg ggttcggcag actccagaga agaggctgga 60 gtgggttgca accattagta
| 8 0 | |
| <210> | 65 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 65 |
- 111 CZ 304614 B6 tccagcctct tctcfcggagt ctgccgaacc caagacatta cataactact gaaagtgaat 60 ccagaggctg cacaggagag 80
| <210> <211> <212> 5 <213> | 66 80 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 66 |
tctgaagtaa tgctggtgga gtctggggga ggcttagtaa agcctggagg gtccctgaaa 60 ctctcctgtg cagcctctgg 80
| <210> | 67 |
| ío <211> <212> <213> | 80 DNA syntetický konstrukt |
| <400> | 67 |
tatctgcaaa tgagcagtct gagatctgag gacacggcta tgtattactg tgcaagaagg 60 ggtgactcta tgattacgac 80
| <210> <211> <212> <213> 20 <400> | 68 64 DNA syntetický konstrukt 68 |
ggactactgg ggccaaggga ccactctcac agtctcctca gcctccacca agggcccatc 60 ggtc <210> 69 <211> 80 <212> DNA
-112CZ 304614 B6 <213> syntetický konstrukt <400> 69 tttcagggac cctccaggct ttactaagcc tcccccagac tccaccagca ttacttcaga 60 gtggacacct gtagctgttg
| 80 | |
| <210> | 70 |
| <211> | 80 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 70 |
ccttcttgca cagtaataca tagccgtgtc ctcagatctc agactgctca tttgcagata 60 cagggtgttc t.tggcattgt
| 80 | |
| <210> | 71 |
| <211> | 70 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 71 |
gaccgatggg cccttggtgg aggctgagga gactgtgaga gtggtccctt ggccccagta 60 gtccgtcgta
| <210> | 72 | |||||||||||
| <211> | 212 | |||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||
| <213> | syntetický konstrukt | |||||||||||
| <400> | 72 | |||||||||||
| Asp | Ile Gin Met Thr | Gin | Ser | Pro | Ser | Ser | Leu | Ser | Ala | Ser | Val | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||
| Asp | Arg Val Thr Ile | Thr | Cys | Lys | Ala | Ser | Gin | Asp | Val | Gly | Thr | Ala |
25 30
- 113CZ 304614 B6
| Val | Ala | Trp 35 | Tyr | Gin | Gin | Lys | Pro 40 | Gly | Lys | Ala | Pro | Lys 45 | Leu | Leu | Ile |
| Tyr | Trp 50 | Ala | Ser | Thr | Arg | His 55 | Thr | Gly | Val | Pro | Ser 60 | Arg | Phe | Ser | Gly |
| Ser 65 | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp 70 | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile 75 | Ser | Ser | Leu | Gin | Pro 80 |
| Glu | Asp | Phe | Ala | Thr 85 | Tyr | Tyr | Cys | Gin | Gin 90 | Tyr | Ser | Ser | Tyr | Arg 95 | Thr |
| Phe | Gly | Gin | Gly 100 | Thr | Lys | Val | Glu | Ile 105 | Lys | Arg | Thr | Val | Ala 110 | Ala | Pro |
| Ser | Val | Phe 115 | Ile | Phe | Pro | Pro | Ser 120 | Asp | Glu | Gin | Leu | Lys 125 | Ser | Gly | Thr |
| Ala | Ser 130 | Val | Val | Cys | Leu | Leu 135 | Asn | Asn | Phe | Tyr | Pro 140 | Arg | Glu | Ala | Lys |
| Val 145 | Gin | Trp | Lys | Val | Asp 150 | Asn | Ala | Leu | Gin | Ser 155 | Gly | Α3Π | Ser | Gin | Glu 160 |
| Ser | Val | Thr | Glu | Gin 165 | Asp | Ser | Lys | Asp | Ser 170 | Thr | Tyr | Ser | Leu | Ser 175 | Ser |
| Thr | Leu | Thr | Leu 180 | Ser | Lys | Ala | Asp | Tyr 185 | Glu | Lys | His | Lys | Val 190 | Tyr | Ala |
| Cys | Glu | Val 195 | Thr | His | Gin | Gly | Leu 200 | Ser | Ser | Pro | Val | Thr 205 | Lys | Ser | Phe |
Asn Arg Gly Glu 210
| <210> | 73 | ||||||||||
| <211> | 213 | ||||||||||
| <212> | PRT | ||||||||||
| <213> | syntetický konstrukt | ||||||||||
| <400> | 73 | ||||||||||
| Asp | Ile Val Met Thr | Gin Ser | Pro | Ser | Ser | Leu | Ser | Ala | Ser | Val | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||
| Asp | Arg Val Thr Ile | Thr Cys | Lys | Ala | Ser | Gin | Asp | Val | Gly- | Thr | Ala |
| 20 | 25 | 30 |
- 114CZ 304614 B6
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro
70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
90 95
Phe Glv Gin Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
| <210> | 74 |
| <211> | 213 |
| <212> | PRT |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 74 |
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala
- 115CZ 304614 B6
| Val | Ala | Trp 35 | Tyr Gin | Gin | Lys | Pro Gly 40 | Lys Ala | Pro | Lys 45 | Leu | Leu | Ile | |||
| Tyr | Trp | Ala | Ser | Thr | Arg | His | Thr | Gly | Val | Pro | Asp | Arg | Phe | Thr | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Ser | Gly | Thr | Asp | Phe | Thr | Leu | Thr | Ile | Ser | Ser | Leu | Gin | Pro |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
| Glu Asp Phe | A.la | Thr 85 | Tyr | Phe | Cys Gin Gin 90 | Tyr | Ser | Ser | Tyr | Arg 95 | Thr | ||||
| Phe | Gly | Gin | Gly | Thr | Lys | Val | Glu | Ile | Lys | Arg | Thr | Val | Ala | Ala | Pro |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ser | Val | Phe | Ile | Phe | Pro | Pro | Ser | Asp | Glu | Gin | Leu | Lys | Ser | Gly | Thr |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ala | Ser | Val | Val | Cys | Leu | Leu | Asn | Asn | Phe | Tyr | Pro | Arg | Glu | Ala | Lys |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Val | Gin | Trp | Lys | Val | Asp | Asn | Ala | Leu | Gin | Ser | Gly | Asn | Ser | Gin | Glu |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Val | Thr | Glu | Gin | Asp | Ser | Lys | Asp | Ser | Thr | Tyr | Ser | Leu | Ser | Ser |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Thr | Leu | Ser | Lys | Ala | Asp | Tyr | Glu | Lys | His | Lys | Val | Tyr | Ala |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Cys | Glu | Val | Thr | His | Gin | Gly | Leu | Ser | Ser | Pro | Val | Thr | Lys | Ser | Phe |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Asn | Arg | Gly | Glu | Cys |
210 <210> 75 <211> 213 <212> PRT <213> syntetický konstrukt <400> 75
| Asp 1 | Ile | Val | Met | Thr 5 | Gin | Ser | Pro | Ser | Ser 10 | Leu | Ser | Ala | Ser | Val 15 | Gly |
| Asp | Arg | Val | Thr 20 | Ile | Thr | Cys | Lys | Ala 25 | Ser | Gin | Asp | Val | Gly 30 | Thr | Ala |
- 116CZ 304614 B6
Val Ala
Tyr Trp 50
Ser Gly 65
Glu Asp
Phe Gly
Ser Val
Ala Ser 130
Val Gin 145
Ser Val
Thr Leu
Cys Glu
Asn Arg 210
Trp Tyr Gin Gin Lys 35
Ala Ser Thr Arg His 55
Ser Gly Thr Asp Phe 70
Phe Ala Asp Tyr Phe 85
Gly Gly Thr Lys Val 100
Phe Ile Phe Pro Pro 115
Val Val Cys Leu Leu 135
Trp Lys Val Asp Asn 150
Thr Glu Gin Asp Ser 165
Thr Leu Ser Lys Ala 180
Val Thr His Gin Gly 195
Gly Glu Cys
Pro
Thr
Thr
Cys
Glu
Ser
120
Asn
Ala
Lys
Asp
Leu
200
Gly
Gly
Leu
Gin
Ile
105
Asp
Asn
Leu
Asp
Tyr
185
Ser
Lys
Val
Thr
Gin
Lys
Glu
Phe
Gin
Ser
170
Glu
Ser
Ala Pro
Pro Asp 60
Ile Ser 75
Tyr Ser
Arg Thr
Gin Leu
Tyr Pro 140
Ser Gly 155
Thr Tyr
Lys His
Pro Val
Lys Leu 45
Arg Phe
Ser Leu
Ser Tyr
Val Ala 110
Lys Ser 125
Arg Glu
Asn Ser
Ser Leu
Lys Val 190
Thr Lys 205
Leu Ile
Thr Gly
Gin Pro 80
Arg Thr 95
Ala Pro
Gly Thr
Ala Lys
Gin Glu 160
Ser Ser 175
Tyr Ala
Ser Phe <210> <211> <212>
<213>
213
PRT syntetický konstrukt <400> 76
Asp
Ile Val
Met Thr Gin Ser
Asp Arg Val
Ser Ile Thr 20
Cys
His
Lys
Lys
Phe
Met Ser
Ala
Ser
Gin Asp
Thr Ser
Val Gly 30
Val Gly 15
Thr Ala
-117CZ 304614 B6
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gin Ser
70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Ser Ser Tyr Arg Thr
90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro 100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140
Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Gly Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys 210
| <210> | 77 |
| <211> | 60 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 77 |
gtcccccaca gatgcagaca aagaacttgg agattgggtc atctgaatgt caccagtgga 60 <210> 78 ío <211> 65 <212> DNA
- 118CZ 304614 B6 <213> syntetický konstrukt <400> 78 atctagttct cagagatgga gacagacaca atcctgctat gggtgctgct gctctgggtt 60 ccagg
| <210> | 79 |
| <211> | 69 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 79 |
cagcacccat agcaggattg 60 cttaagctt tgtctgtctc catctctgag aactagatga gaggatgctt <210> 80 <211> 67 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 80 ctccactggt gacattgtga tgacccaatc tccaagttct ttgtctgcat ctgtggggga 60 cagggtc <210> 81 <211> 54 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 81 acttggagat tgggtcatca caatgtcacc agtggagcct ggaacccaga gcag
| 25 | 54 | |
| <210> | 82 | |
| <211> | 67 | |
| <212> | DNA |
- 119CZ 304614 B6 <213 > syntetický konstrukt <400> 82 accatcacct gcaaggccag tcaggatgtg ggtactgctg tagcctggta ccaacagaaa 50 ccaggaa
| <210> | 83 |
| <211> | 72 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 83 |
fcacagcagta cccacatcct gactggcctt gcaggtgatg gtgaccctgt cccccacaga tgcagacaaa ga
| 72 | |
| <210> | 84 |
| <211> | 71 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 84 |
aagcacccaa actcctcatc tattgggcat ccacccggca cactggggtc ccagataggt 60 ttacaggcag t
| 71 | |
| <210> | 85 |
| <211> | 72 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 85 |
cccagtgtgc cgggtggatg cccaatagat gaggagtttg ggtgcttttc ctggtttctg 60 ttggtaccag gc 72
- 120CZ 304614 B6
| <210> | 86 |
| <211> | 63 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 86 |
gggtctggga cagacttcac cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcaacc 60 tat <210> 87 <211> 60 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 87 actagagatg gtgagggtga agtctgtccc agacccactg cctgtaaacc tatctgggac 60 <210> 88 <211> 57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 88 tactgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc 57 <210> 89 <211> 57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 89 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagta ataggttgca aaatcctccg gctgcac
| 57 | |
| <210> | 90 |
| <211> | 51 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 90 |
- 121 CZ 304614 B6 aaacggactg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc catctgatga g
| 51 | |
| <210> | 91 |
| <211> | 63 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 91 |
gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgccttgacc 60
Cf 33
| 10 | <210> | 92 |
| <211> | 57 | |
| <212> | DNA | |
| <213> | syntetický konstrukt | |
| 15 | <400> | 92 |
| ttctgtcagc aatatagcag | ||
| 57 | ||
| <210> | 93 | |
| <211> | 57 | |
| <212> | DNA | |
| 20 | <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 93 | |
| cgtccgatag ctgctatatt | ||
| 57 | ||
| <210> | 94 | |
| 25 | <211> | 63 |
| <212> | DNA | |
| <213> | syntetický konstrukt | |
| <400> | 94 | |
| gggtctggga cagacttcac | ||
| 60 | ||
| tat | ||
| 30 | 63 |
ctatcggacg ttcggtcaag gcaccaaggt ggaaatc gctgacagaa ataggttgca aaatcctccg gctgcag cctcaccatc tctagtctgc agccggagga ttttgcagat
- 122CZ 304614 B6 <210> 95 <211> 57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 95 ttctgtcagc aatatagcag ctatcggacg ttcggtggag gcaccaaggt ggaaatc 57 <210> 96 <211> 57 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 96 cgtccgatag ctgctatatt gctgacagaa ataatctgca aaatcctccg gctgcag
| 57 | |
| <210> | 97 |
| <211> | 51 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 97 |
tgatgtggac atgaatttgt gagactgggt catcacaatg tcaccagtgg a
| 51 | |
| <210> | 98 |
| <211> | 51 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 98 |
tgggttccag gctccactgg tgacattgtg atgacccagt ctcacaaatt c
| 51 | |
| <210> | 99 |
| <211> | 49 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 99 |
aagacagatg gtgcagccac agcccgtttg atttccagct tggtgcctc 49
-123CZ 304614 B6
| <210> | 100 |
| <211> | 45 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 100 |
aagctggaaa tcaaacgggc tgtggctgca ccatctgtct tcatc 45 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> syntetický konstrukt <400> 101 agatttcaac tgctcatcag atggcgggaa 30
| <210> | 102 |
| <211> | 63 |
| <212> | DNA |
| <213> | syntetický konstrukt |
| <400> | 102 |
gaagatgaag acagatggtg cagccacagt ccgtttgatt tccaccttgg tgcctccacc
Claims (102)
Hide Dependent
translated from
Claims (102)
Hide Dependent
translated from
1. Čištěná protilátka, která specificky váže TRIAL receptor DR5, která ve své rozpustné formě má tumoricidní aktivitu in vivo v nádorových buňkách exprimujících DR5 a aktivitu in vitro indukující buněčnou smrt při koncentracích nižších než 1 pg/ml v cílových buňkách exprimujících DR5, a kde tato protilátka neváže TRIAL receptor DR4, DcRl nebo DcR2 a kde tato protilátka má stejnou specificitu epitopu jako monoklonální protilátka produkovaná myším-myším hybridomem TRA-8, který má ATCC přírůstkové číslo PTA-1428.
2. Čištěná protilátka podle nároku 1, která indukuje buněčnou smrt in vitro v nepřítomnosti sekundárního zesítění protilátky.
3. Čištěná protilátka podle nároku 1, která neindukuje signifikantně buněčnou smrt netransformovaných buněk fibroblastů.
4. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde aktivita indukující buněčnou smrt je charakterizována méně než 40% životaschopností cílových buněk při koncentracích protilátky 0,1 až 5 pg/ml.
- 124CZ 304614 B6
5. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedená protilátka je monoklonální.
6. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde DR5 je lidský DR5.
7. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenými cílovými buňkami jsou zánětlivé synoviální buňky.
8. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenými cílovými buňkami jsou rakovinné buňky.
9. Čištěná protilátka podle nároku 1, kde uvedenými cílovými buňkami jsou aktivované imunitní buňky.
10. Čištěná protilátka podle nároku 9, kde uvedenými cílovými buňkami jsou aktivované lymfocyty.
11. Čištěná protilátka podle nároku 1, který neindukuje signifikantně buněčnou smrt normálních hepatocytů.
12. Čištěná protilátka podle nároku 1, která neindukuje signifikantně buněčnou smrt synoviálních buněk subjektu s onemocněním osteoartritidou.
13. Protilátka podle nároku 1, kterou je monoklonální protilátka, která je produkována myším-myším hybridomem TRA-8 majícím ATCC přírůstkové číslo PTA-1428.
14. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5.
15. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5 při kontaktování in vitro.
16. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou rakovinné buňky.
17. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou zánětlivé synoviální buňky.
18. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou aktivované imunitní buňky.
19. Použití protilátky podle nároku 18 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde imunitními buňkami jsou aktivované lymfocyty.
20. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt normálních hepatocytů.
21. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt synoviálních buněk při onemocnění osteoartritidou.
- 125CZ 304614 B6
22. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti v cílových buňkách exprimujících DR5, při kontaktování cílových buněk s terapeutickým množstvím takové protilátky.
23. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici proliferace cílových buněk exprimujících DR5, při kontaktování buněk s terapeutickým množstvím takové protilátky.
24. Použití podle nároku 22, kde kontaktování je in vitro.
25. Použití podle nároku 23, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou rakovinné buňky.
26. Použití podle nároku 23, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou zánětlivé synoviální buňky.
27. Použití podle nároku 23, kde cílovými buňkami exprimujícími DR5 jsou aktivované imunitní buňky.
28. Použití podle nároku 23, kde aktivovanými imunitními buňkami jsou aktivované lymfocyty.
29. Použití podle nároku 23, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt normálních hepatocytů.
30. Použití podle nároku 23, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt synoviálních buněk subjektu s onemocněním osteoartritidou.
31. Použití podle nároku 23, které dále zahrnuje kontaktování cílových buněk s terapeutickým činidlem.
32. Použití podle nároku 23, kde terapeutickým činidlem je chemoterapeutické činidlo.
33. Použití podle nároku 23, kde terapeutické činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího bleomycin, karboplatinu, chlorambucil, cisplatinu, kolchicin, cyklofosfamid, daunorubicin, actinomycin, diethylstilbestrol, doxorubicin, etoposid, 5-fluoruracil, floxuridin, melfalan, methotrexát, mitomycin, 6-merkaptopurin, paclitaxel, teniposid, 6-thioguanin, vincristin a vinblastin.
34. Použití podle nároku 31, kde terapeutickým činidlem je doxorubicin, methotrexát nebo paclitaxel.
35. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici proliferace cílových buněk exprimujících DR5 při kontaktováním těchto buněk s terapeutickým množstvím protilátky podle nároku 13.
36. Použití podle nároku 35, které dále zahrnuje kontaktování cílové buňky s terapeutickým činidlem.
37. Prostředek selektivně indukující buněčnou smrt cílových buněk exprimujících DR5, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství protilátky podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
38. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu terapeutického činidla pro selektivní usmrcování buněk vybraných z cílových buněk s poruchou regulace.
39. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu terapeutického prostředku proti onemocnění spojenému s apoptosou.
- 126CZ 304614 B6
40. Použití protilátky podle nároku 13 pro výrobu terapeutického prostředku proti onemocnění spojenému s apoptosou.
41. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu terapeutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti rakovinných buněk.
42. Použití podle nároku 41, které dále zahrnuje podávání druhé protilátky, která zvyšuje buněčnou smrt rakovinných buněk.
43. Použití podle nároku 41, které dále zahrnuje podávání terapeutického činidla.
44. Použití podle nároku 43, kde terapeutickým činidlem je chemoterapeutické činidlo.
45. Použití podle nároku 43, kde terapeutické činidlo je vybráno ze souboru zahrnujícího bleomycin, karboplatinu, chlorambucil, cisplatinu, kolchicin, cyklofosfamid, daunorubicin, actinomycin, diethylstilbestro, doxorubicin, etoposid, 5-fluoruracil, floxuridin, melfalan, methotrexát, mitomycin, 6-merkaptopurin, paclitaxel, teniposid, 6-thioguanin, vincristin a vinblastin.
46. Použití podle nároku 43, kde terapeutickým činidlem je doxorubicin, methotrexát nebo paclitaxel.
47. Použití podle nároku 41, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt normálních hepatocytů.
48. Použití podle nároku 41, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt synoviálních buněk subjektu s onemocněním osteoartritidou.
49. Použití podle nároku 41, která dále zahrnuje radiáční terapií.
50. Použití podle nároku 41, které dále kombinuje terapeutické činidlo a radiační terapii.
51. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti cílových buněk, které mají DR5 receptory, v případě zánětlivé choroby nebo choroby autoimunity.
52. Použití podle nároku 51, kde cílovými buňkami jsou aktivované imunitní buňky.
53. Použití podle nároku 52, kde aktivovanými imunitními buňkami jsou aktivované lymfocyty.
54. Použití podle nároku 51, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt normálních hepatocytů.
55. Použití podle nároku 51, kde protilátka neindukuje signifikantně buněčnou smrt synoviálních buněk v případě onemocnění osteoartritidou.
56. Použití podle nároku 51, kde cílovými buňkami jsou zánětlivé synoviální buňky.
57. Použití podle nároku 51, které dále zahrnuje druhou protilátku pro zvýšení buněčné smrti cílových buněk.
58. Použití podle nároku 51, které zahrnuje další terapeutické činidlo.
59. Použití podle nároku 58, kde terapeutickým činidlem je bisindolylmaleimid nebo methotrexát.
- 127CZ 304614 B6
60. Použití podle nároku 51, kde zánětlivou chorobou nebo chorobou autoimunity je reumatoidní artritida.
61. Použití protilátky podle nároku 13 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti cílových buněk, proti zánětlivé chorobě nebo chorobě autoimunity.
62. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku s účinkem selektivní indukce buněčné smrti cílových buněk dosahované:
(a) transfekcí cílových buněk vektorem obsahujícím exprimovatelnou nukleovou kyselinu kódující DR5 pro TRAIL receptor, (b) expresí TRAIL receptoru DR5 na uvedených buňkách; a (c) kontaktováním uvedených buněk s protilátkoupodle nároku 1, která indukuje buněčnou smrt.
63. Použití protilátky podle nároku 1 pro výrobu farmaceutického prostředku s účinkem selektivní indukce buněčné smrti cílových buněk dosahované:
(a) transfekcí cílových buněk vektorem obsahujícím exprimovatelnou nukleovou kyselinu kódující DR5 pro TRAIL receptor, (b) expresí TRAIL receptoru DR5 na uvedených buňkách; a (c) kontaktováním uvedených buněk s protilátkou podle nároku 13.
64. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje těžký řetězec imunoglobulinu protilátky podle nároku 1, schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 31 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 56 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 59 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 60 nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 61 nebo jeho funkční ekvivalent.
65. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 64, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu G1 těžkého řetězce.
66. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje těžký řetězec imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
- 128CZ 304614 B6 (a) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHMll (FERM BP-7559) nebo jeho funkční ekvivalent.
67. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 66, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu G1 těžkého řetězce.
68. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 64 nebo 66 a regulační element operativně navázaný na uvedenou nukleovou kyselinu.
69. Kultivovaná buňka, která obsahuje vektor podle nároku 68.
70. Čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 31 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 56 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 59 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 60 nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 61 nebo jeho funkční ekvivalent.
71. Čištěný polypeptid podle nároku 70, ve kterém těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu G1 těžkého řetězce.
72. Čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) nebo jeho funkční ekvivalent,
- 129CZ 304614 B6 (c) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559) nebo jeho funkční ekvivalent.
73. Čištěný peptid podle nároku 72, ve kterém těžký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu GI těžkého řetězce.
74. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje lehký řetězec imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 46 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 72 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 73 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 74 nebo jeho funkční ekvivalent, (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 75 nebo jeho funkční ekvivalent, a (f) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 76 nebo jeho funkční ekvivalent.
75. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 74, ve které lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa řetězce.
76. Izolovaná nukleová kyselina, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje lehký řetězec imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu, který je vybrán ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M2-l-4 (FERM BP-7563) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M 1-2-2 (FERM BP-7562) nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5ot/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) nebo jeho funkční ekvivalent,
-130CZ 304614 B6 (d) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M6-l^l-l (FERM BP-7566) nebo jeho funkční ekvivalent.
77. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 76, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa řetězce.
78. Vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 74 nebo 76 a regulační element operativně navázaný na uvedenou nukleovou kyselinu.
79. Kultivovaná buňka, která obsahuje vektor podle nároku 78.
80. Čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje variabilní region vybraný ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 46 nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 72 nebo jeho funkční ekvivalent, (c) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 73 nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 74 nebo jeho funkční ekvivalent, (e) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 75 nebo jeho funkční ekvivalent, a (f) variabilní region, který sestává z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 76 nebo jeho funkční ekvivalent.
81. Čištěný peptid podle nároku 80, ve kterém lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa řetězce.
82. Čištěný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci lehkého řetězce imunoglobulinu protilátky podle nároku 1 schopné specificky vázat TRIAL receptor DR5, kde lehký řetězec imunoglobulinu je vázán ke konstantnímu regionu, který je vybrán ze souboru zahrnujícího:
(a) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M2-l-4 (FERM BP-7563) nebo jeho funkční ekvivalent, (b) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/Ml-2-2 (FERM BP-7562) nebo jeho funkční ekvivalent,
- 131 CZ 304614 B6 (c) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) nebo jeho funkční ekvivalent, (d) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) nebo jeho funkční ekvivalent, a (e) variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M6-l^l-l (FERM BP-7566) nebo jeho funkční ekvivalent.
83. Čištěný polypeptid podle nároku 82, kde lehký řetězec imunoglobulinu obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa řetězce.
84. Způsob produkce protilátky podle nároku 1, prováděný in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
(a) transformování hostitelské buňky prvním vektorem kódujícím lehký řetězec imunoglobulinu protilátky, těžký řetězec imunoglobulinu protilátky nebo oba řetězce, (b) popřípadě transformování hostitelské buňky druhým vektorem kódujícím lehký nebo těžký řetězec z kroku (a), pokud libovolný z nich není přítomen v uvedeném prvním vektoru, (c) inkubaci transformované hostitelské buňky za podmínek, které dovolují expresi lehkého řetězce imunoglobulinu nebo těžkého řetězce imunoglobulinu, a (d) izolaci protilátky z hostitelské buňky nebo média pro hostitelskou buňku.
85. Komerční kit pro indukci apoptosy, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 1 v zásobníku.
86. Komerční kit pro indukci apoptosy, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 13 v zásobníku.
87. Použití protilátky podle nároku 1, pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvýšení hladin NFkappaB v buňkách.
88. Použití protilátky podle nároku 13, pro výrobu farmaceutického prostředku pro zvýšení hladin NFkappaB v buňkách.
89. Protilátka podle nároku 1, která obsahuje:
(a) těžký řetězec, který zahrnuje variabilní region vybraný ze souboru sestávajícího z aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 31 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 56 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 59 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 60 nebo jeho funkčního ekvivalentu, a aminokyselinových zbytků 1 až 119 SEQ ID No: 61 nebo jeho funkčního ekvivalentu, a (b) lehký řetězec, který zahrnuje variabilní region vybraný ze souboru sestávajícího z aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 46 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 72 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 73 nebo jeho funkčního ekvivalentu, aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 74 nebo jeho funkčního ekvivalentu, a aminokyselinových zbytků 1 až 108
- 132CZ 304614 B6
SEQ ID No: 75 nebo jeho funkčního ekvivalentu, a aminokyselinových zbytků 1 až 108 SEQ ID No: 76 nebo jeho funkčního ekvivalentu.
90. Protilátka podle nároku 89, ve které těžký řetězec obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu G1 těžkého řetězce, ve které lehký řetězec obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa lehkého řetězce.
91. Čištěná protilátka podle nároku 1, která obsahuje:
(a) těžký řetězec, který zahrnuje variabilní region vybraný ze souboru obsahujícího variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHClO (FERM BP-7557) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) nebo jeho funkční ekvivalent, a variabilní region kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559) nebo jeho funkční ekvivalent, a (b) lehký řetězec, který zahrnuje variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu vybranému ze souboru zahrnujícího variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovaný nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M2-l-4 (FERM BP-7563) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5cc/pHSG/Ml-2-2 (FERM BP-7562) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564) nebo jeho funkční ekvivalent, variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) nebo jeho funkční ekvivalent, a variabilní region vázaný ke konstantnímu regionu kódovanému nukleotidovou sekvencí insertu vektoru neseného E. coli DH5a/pHSG/M6-l^l—l (FERM BP-7566) nebo jeho funkční ekvivalent.
92. Čištěná protilátka podle nároku 91, ve které těžký řetězec obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu G1 těžkého řetězce, ve které lehký řetězec obsahuje konstantní region lidského imunoglobulinu kappa lehkého řetězce.
93. Použití protilátky podle nároku 89 pro výrobu farmaceutického prostředku pro selektivní indukci buněčné smrti cílových buněk exprimujících DR5.
94. Použití podle nároku 89 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici proliferace cílových buněk exprimujících DR5.
95. Použití podle nároku 89 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení onemocnění spojeného s apoptosou.
96. Použití podle nároku 89 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení rakoviny, které je selektivně indukováno buněčnou smrtí rakovinných buněk.
97. Použití podle nároku 89 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení zánětlivé choroby nebo choroby autoimunity, které je selektivně indukování buněčnou smrtí cílových buněk.
98. Transformovaná E. coli, která je vybrána ze souboru sestávajícího zE. coli JM109/pHB14 (FERM BP-7556), E. coli JM109/pHA15 (FERM BP-7555), E.coli JM109/pHC10 (FERM BP-7557), E. coli JM109/pHD21 (FERM BP-7558) a E. coli JM109/pHMl 1 (FERM BP-7559).
- 133 CZ 304614 B6
99. Vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující variabilní region těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž tento vektor je přítomen v transformované E. coli podle nároku 98.
100. Transformovaná E. coli, která je vybrána ze souboru sestávajícího z E. coli DH5a/pHSG/M2-l^l (FERM BP-7563), E. coli DH5ot/pHSG/Ml-2-2 (FERM BP-7562), E.coli DH5a/pHSG/M3-3-22 (FERM BP-7564), E. coli DH5a/pHSG/M4-5-3-l (FERM BP-7565) a E. coli DH5a/pHSG/M6-W-l (FERM BP-7566).
101. Vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující variabilní region těžkého řetězce imunoglobulinu, přičemž tento vektor je přítomen v transformované E. coli podle nároku 100.
102. Čištěná protilátka podle nároku 1, která obsahuje:
(a) těžký řetězec imunoglobulinů, kde těžký řetězec obsahuje variabilní region mající obecný vzorec úseku základní struktury regionu 1-CDR 1-úseku základní struktury regionu 2-CDR2úseku základní struktury regionu 3-CDR3-úseku základní struktury regionu 4, přičemž CDR1 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 5 SEQ ID No: 25, CDR2 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 17 SEQ ID No: 26, a CDR3 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 10 SEQ ID No: 27, a (b) lehký řetězec imunoglobulinů, kde lehký řetězec obsahuje variabilní region mající obecný vzorec úseku základní struktury regionu 5-CDR4-úseku základní struktury regionu 6-CDR5úseku základní struktury region 7-CDR6-úseku základní struktury region 8, přičemž CDR4 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 11 SEQ ID No: 28, CDR5 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 7 SEQ ID No: 29, a CDR6 obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 8 SEQ ID No: 30.