CZ9903452A3 - Polidštěná molekula typu protilátky proti FAS, molekula typu protilátky s vybraným jedním nebo více těžkými řetězci a lehkými řetězci, profylaktický a léčebný přípravek, DNA kódující protilátku, rekombinantní DNA vektor, transformovaná hostitelská buňka, způsob výroby protilátky proti FAS, transformační kmen E. COLI, polypeptid, jeho kódující DNA, rekombinantní DNA vektor a transformovaná hostitelská buňka - Google Patents

Abstract

Polidštěná molekula typu protilátky proti Fas zahrnuje vybrané podjednotky těžkého a lehkého řetězce, které se skládají z vybraných sekvencí. Profylaktický a léčebný přípravek zahrnuje danou protilátku, která se používá pro výrobu léku pro lidské použití pro léčbu stavu zahrnujícího abnormalitu v systému Fas/Fas ligand. DNA kódující danou protilátku je použita pro přípravu rekombinantního vektoru, kterýmje transformována hostitelská buňka produkující protilátku proti Fas. DNA kódující polypeptid o vybrané aminokyselinové sekvenci je použita pro přípravu rekombinantního vektoru. Tímto vektoremjsou transformovány savčí hostitelské buňky

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se vztahuje k protilátkám a jejich fragmentům, zvláště polidštěným protilátkám, které rozpoznávají Fas antigen, k DNA kódující takovéto protilátky nebo jejich části a k přípravkům zahrnujícím tyto protilátky, které jsou určeny pro profylaxi a/nebo léčbu stavů, způsobených abnormalitami v systému Fas/Fas ligand.

Dosavadní stav techniky

Fyziologická smrt buněk v živém organizmu v přirozeném sledu událostí je známa pod pojmem apoptóza a odlišuje se od patologické smrti buněk, např. nekrózy [Kerr a kol., (1972), Br. J. cancer, 26, 239]. Apoptóza je příkladem programované buněčné smrti, při které jsou určité buňky předem naprogramované na zánik v živém organizmu v přirozeném sledu událostí, coby provedení předem určené funkce. Apoptóza je charakterizována morfologickými změnami, jako je mimo jiné zakřivený povrch buněk, zhuštěný jaderný chromatin a fragmentovaná chromozomální DNA.

Apoptóza hraje roli v diferenciaci lymfocytů (T buněk a B buněk) odstraněním buněk, které rozpoznávají autoantigen. V této souvislosti bylo zjištěno, že 95 % či ještě více buněk, které reagují s autoantigeny, jsou eliminovány v thymu během zrání T lymfocytů [Shikegazu Nagata, Tanpakushitsu Kakusan Koso, (1993), 38, 2208-2218]. Nejsou-li tyto buňky eliminovány apoptózou, způsobují pravděpodobně autoimunitní onemocnění vzhledem k přítomnosti zralých, autoreaktivních lymfocytů v systému [Nakayama a kol., (1995), Mebio, 12(10), 79-86].

• · · · • · • · · · • · · · . ......

Byla identifikována řada molekul, které se účastní apoptózy, včetně: Fas [Yonehara, S., a kol., (1989), J. Exp. Med., 169, 1747-1756]; receptorů faktoru nekrotizujícího nádor [Loetcher, H., a kol., (1990), Cell, 61, 351-359]; CD40 [Tsubata, T., a kol., (1993), Nátuře, 364, 645-648]; a perforin/granzymu A [Jenne, D.E., a kol., (1988), Immunol. Rev. 103, 53-71].

Fas je transmembránový protein přítomný na povrchu buněk. Vazba jeho extracelulámí domény na protein, obecně známý jako Fas ligand, který je exprimován na povrchu jiných buněk, indukuje apoptózu v buňce exprimující Fas. Abnormality v systému Fas/Fas ligand vedou k různým poruchám tím, že selhává odstranění buněk, které by mohly být škodlivé pro homeostázu a které by měly být eliminovány apoptózou nebo případně indukcí apoptózy v buňkách, které nejsou jinak předurčeny k eliminaci a které by mohly být nezbytné pro zachování homeostázy. Za tyto poruchy jsou považovány stavy způsobené abnormalitami v systému Fas/Fas ligand.

V průběhu vývoje nebo progrese onemocnění, vzniklého z abnormalit systému Fas/Fas ligand, nastává často případ, že abnormální buňky, které exprimují Fas a které však přesto zůstávají neodstraněny (abnormální buňky), buď atakují normální tkáně nebo buňky nebo dále abnormálně proliferují a způsobují tak poruchy v tkáních nebo buňkách, které vedou k vlastním symptomům onemocnění. V některých případech mohou tyto poruchy vzniknout nebo se mohou aktivovat expresí Fas na abnormálních buňkách a tím mohou stimulovat apoptózu v normálních tkáních nebo buňkách. Specifické příklady onemocnění spojených s abnormalitami systému Fas/Fas ligand jsou následující.

Autoimunitní onemocnění

Spojitosti mezi různými lidskými autoimunitními chorobami (Hashimotova choroba, systémový lupus erythematodes, Sjogrenův syndrom, zhoubná anémie, Addisonova choroba, inzulín-dependentní diabetes mellitus, sklerodermie, Goodpastureův syndrom, Crohnova choroba, autoimunitní hemolytická anémie, sterilita, myasthenia gravis, roztroušená skleróza, Basedowova nemoc, purpurózní trombopenie, revmatoidní artritida) a abnormalitami v systému Fas/Fas ligand byly mnohokrát popsány.

U myší jsou známy různé genetické abnormality systému Fas/Fas ligand, včetně lpr (lymfoproliferace), gld (generalizované lymfoproliferativní onemocnění) a lpr^cg (kde lpr gen doplňuje gld gen) mutace. Myši, které mají tyto genetické abnormality, vykazují různé autoimunitní symptomy, doprovázené charakteristickým systémovým otokem lymfatických uzlin.

MRL-lpr/lpr myš, jakožto myší model spontánního lidského systémového lupusu erythematodes, vykazuje značný nárůst masy lymfatických uzlin a produkuje autoprotilátky, které způsobují nefritidu díky tvorbě imunitních komplexů. Existují spekulace o tom, že tato myš vykazuje tuto patologii jako důsledek mutace Fas genu, vedoucí k absenci imunologické snášenlivosti autoantigenu, která je způsobena selháním Fas-indukované apoptózy v periferním systému a dlouhodobou akumulací aktivovaných autoreaktivních T buněk [Strasser, A., Nátuře, 373, 385 (1995)].

U lidí bylo popsáno několik případů, včetně dvou pediatrických případů, zahrnujících otok lymfatických uzlin, hyper γ-globulinémii a značný nárůst CD4CD8' T buněk [Sneller, MC., a kol., (1992), J. Clin. Invest., 90, 334], Tyto případy byly popsány jako založené na abnormalitách ve Fas genu [Fisher, G.H., a kol., (1995), Cell, 81, 935; a Rieux-Laucat, F., a kol., (1995), Science, 268, 1347] a byly označeny jako autoimunitní lymfoproliferativní syndrom (ALPS). S ohledem na tyto poznatky se přepokládá, že systém indukující apoptózu prostřednictvím Fas, je do značné míry zahrnut v tvorbě a zachování samo-snášenlivosti a to nejen u myší, ale také u lidí a poruchy tohoto systému indukují různá autoimunitní onemocnění.

Je také známo, že revmatoidní artritida má autoimunitní prvek. Základem tohoto poznatku je fakt, že velká většina T buněk, které napadají postižené oblasti u pacientů s revmatoidní artritidou a způsobují poškození tkáně, exprimují Fas [Hoa, T.T.M., a kol., (1996), J. Rheumatol., 23, 1332-1337],

Mnoho případů inzulín-dependentního diabetů mellitus je výsledkem kritického snížení sekrece inzulínu díky destrukci pankreatických beta buněk autoreaktivními T buňkami. Proto je eliminace autoreaktivních T buněk důležitá v radikální léčbě určitých forem inzulíndependentního diabetů mellitus.

Při onemocněních, kdy dochází k odmítnutí transplantátu hostitelským organizmem, jako např. po transplantaci kostní dřeně, narůstá exprese Fas v poškozeném orgánu. Existuje zde přímá korelace mezi stupněm nárůstu Fas exprese a poškozením cílového orgánu [Chu, J.L a kol., (1995), J. Exp. Med., 181, 393]. Proto je cílem při prevenci a léčbě tohoto onemocnění blokování apoptózy v buňkách cílového orgánu a snížení počtu buněk napadajících cílový orgán.

Alergická onemocnění

Zánětlivé buňky zahrnuté v alergických onemocněních jsou normálně aktivovány a napadají postižená místa. Zánětlivé buňky se akumulují v poškozeném místě a jsou schopny fungovat dlouhodobě, protože jejich život je prodloužen potlačením apoptózy. Na experimentálním modelu, ve kterém je u myší indukován acidofilní zánět dýchacích cest, bylo prokázáno, že podávání protilátky proti Fas, která vykazuje apoptotickou indukční aktivitu, do dýchacích cest vede k vymizení napadení acidofily pod sliznicí, které je běžně viditelné po inhalaci alergenu [Tsuyuki, S., a kol., (1995), J. Clin. Invest., 69, 2924], Proto je možno indukcí apoptózy v zánětlivých buňkách zmírnit symptomy alergického zánětu.

Revmatoidní artritida

Nehledě na výše popsaný autoimunitní aspekt revmatoidní artritidy je známo, že abnormálně proliferující synoviální buňky v místě zranění exprimují Fas [Hoa, T.T.M., a kol., (1996), J. Rheumatol., 23, 1332]. Apoptóza může být indukována stimulací synoviálních buněk z takovýchto míst poškození protilátkou proti Fas, která má apoptotickou indukční aktivitu [Nakajima, T., a kol., (1995), Arthr. Rheum., 38, 485]. Jinými slovy lze říci, že systém Fas/Fas ligand u pacientů s revmatoidní artritidou správně nepracuje v ohniscích onemocnění a i přestože exprimují Fas, nejsou ani autoreaktivní T buňky ani abnormálně proliferující synoviální buňky eliminovány.

Arterioskleróza

Přestože konečnou diagnózou buněčné smrti v centru arteriosklerotických poškození je nekróza, byla popsána účast apoptózy v procesech progrese a degenerace [Kenji Harada (1997), Gendai Iryou, 29, 109]. Sledování míst poškození v elektronovém mikroskopu ukazuje apoptózu buněk hladkého svalstva, charakterizovanou jaderným zhuštěním [Isner, J.M., a kol., (1995), Circulation, 91, 2703]. Dále bylo prokázáno, že pěnivé buňky, kterými jsou makrofágy hromadící se ve vnitřní vrstvě arterie a začleňující lipidy v místech časných arteriosklerotických poškození, exprimují Fas a díky přirozeně se vyskytujícím, apoptózu indukujím anti-Fas

protilátkám podstupují apoptózu [Richardson B.C., a kol., (1994), Eur. J. Immunol., 24, 2640]. Arteriosklerotická poškození jsou často spojena s infiltrací lymfocytů. To předpokládá možnost, že Fas ligand T buněk spolu s Fas makrofágů je zodpovědný za kontrolu arteriosklerózy [Kenji Harada (1997), Gendai Iryou, 29,106].

Myokarditida a kardiomyopatie

Systém Fas/Fas ligand je pravděpodobně zahrnut v pathogenezi autoimunitních srdečních onemocnění, jako je ischemická choroba srdeční, virové srdeční onemocnění, dilatovaná kardiomyopatie a chronická kardiomyopatie. Myokarditida je zánět srdečního svalu způsobený převážně viry, jako je coxsackie virus, a vyznačuje se typickou bolestí v hrudi, arytmií, srdečním selháním nebo šokem, a symptomy podobnými nachlazení.

Kardiomyopatie je definována jako onemocnění srdečního svalu s neznámou příčinou, přestože za jeho příčinu je také považována virová infekce. Ve studiích na myším modelu myokarditidy se srdečním selháním byly v myším srdci po inokulaci viru pozorovány apoptotické buňky (doložené zhuštěním a/nebo fragmentací jader). V myším srdci bylo také pozorováno zvýšení exprese Fas, což vedlo ke spekulaci, že tento stav byl jako výsledek apoptózy indukované Fas ligandem, odvozen od infiltruj ících zánětlivých buněk, převážně lymfocytů [Takehiko Yamada, a kol., Gendai Iryou, (1997), 29, 119]. Je známo, že apoptóza je v kulturách krysích buněk srdečního svalu indukována ischemií současně se zvýšením hladiny mRNA kódující Fas v buňkách [Tanaka M., a kol., (1994), Circ. Res. 75, 426].

Renální onemocnění

U mnoha chronických renální ch onemocnění vede rekonstituce tkáně v glomerulech k nahromadění extracelulámích substrátů uvnitř glomerulů a tím k nastolení sklerózy glomerulů, která vede k patologické ztrátě filtrovací funkce a případně k chronickému selhání ledvin. Na modelu progresivní glomerulosklerózy vykazovaly sklerotické oblasti typický apoptotický výskyt na úrovni elektronového mikroskopu a bylo pozorováno zvýšení apoptózy v glomerulech v souladu s poklesem počtu glomerulámích buněk spojených s progresí sklerózy [Sugiyama H., a kol., (1996), Kidney Int., 49, 103]. Je známo, že akutní glomerulámí nefritida je zmírněna apoptotickým snížením počtu abnormálně proliferuj ících mesangiálních buněk [Shimizu A., a kol., (1995), Kidney Int., 47, 114 a Baker A.J., a kol, (1994), J. Clin. Invest, 94, 2105]. U ···· ♦

• · k ·· • · ·· · onemocnění, jako je purpurózní nefřitida a lupus nephritis, bylo popsáno značné zvýšení počtu buněk, exprimujících Fas v glomerulech [Takemura T., a kol., (1995), Kidney Int., 48, 1886].

Hypoplastická anémie

Na povrchu hematopoietických prekursorových buněk pacientů s hypoplastickou anémií je exprese Fas výrazně zvýšena v porovnání s normálními jedinci. Proto se předpokládá účast Fas na poklesu hematopoietických kmenových buněk u těchto pacientů [Maciejewski, J.P., a kol., (1995), Br. J. Haematol., 91, 245].

Hepatitida

U fulminantní hepatitidy je známo, že apoptóza je indukována v mnoha hepatocytech. Rozsáhlá smrt hepatocytů, podobně jako je tomu u fulminantní hepatitidy, je pozorována při intraperitoneálním podávání protilátky proti Fas Jo2 myším. Proto je pravděpodobné, že pathogeneze fulminantní hepatitidy zahrnuje Fas-induko vanou apoptózu hepatocytů [Kamogawa, Y., a kol., (1996), Molecular Medicine, 33, 1284; a Ogasawara, J., a kol., (1993), Nátuře, 364, 806]. V imunohistochemických studiích byla pozorována zvýšená exprese Fas v cytoplazmě hepatocytů v oblastech, vykazujících vysoké hladiny hepatocytové nekrózy, jako např. v místě poškození při chronické hepatitidě a na buněčné membráně hepatocytů při jatemích onemocněních, jako je steatóza jater [Hiramatsu N., a kol., (1994), Hepatology, 19, 1354 a Takatani, M., a kol., (1996), International Hepatology Commun., 4, 334].

Fas je dále exprimován v místech poškození při chronické persistentní hepatitidě C a chronické aktivní hepatitidě. Oba případy ukazují rozptýlené barvení hepatocytů obklopených infiltrují čími lymfocyty, kterými jsou cytotoxické T buňky [Mita, E., a kol., (1994), Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, 468], Funkcí cytotoxických T buněk je indukce apoptózy v infikovaných buňkách prostřednictvím Fas ligandu, exprimováném na jejich povrchu. Podobně indukují apoptózu v normálních buňkách, které se nachází v blízkosti. Toto působení na okolní normální buňky, nazývané doprovodná porucha, je výsledkem toho, že mnoho buněk v těle exprimuje Fas buď po své vlastní infekci nebo po infekci sousedních buněk. V případech chronické hepatitidy, kde hladina RNA viru hepatitidy C je výrazně snížena po podávání interferonu, exprese Fas v jatemí tkáni výrazně klesá.

• flfl· ·· ·· _ř * * z ► · · t flflfl ··· fl· flfl

Ί

Hepatocyty u pacientů s akutním jatemím selháním mají zvýšené množství Fas na povrchu buněk a jsou-li vystaveny apoptózu indukujícím protilátkám proti Fas, procházejí apoptózou. Dále u alkoholické hepatitidy je Fas ligand exprimován na hepatocytech samých v pseudoacinu [Galle, p.R., a kol., (1995), J. Exp. Med., 182,1223]. Ve studiích, zahrnujících in šitu hybridizaci exprese genu Fas ligandů, byla exprese zjištěna jak v jatemích infiltruj ících lymfocytech v případech akutního hepatického selhání, tak také v hepatocytech samých v pseudoacinu v případech alkoholické cirhózy (viz. výše). Proto existují spekulace, že apoptóza je indukována odlišnými mechanizmy u virové cirhózy a alkoholické cirhózy, avšak v obou případech je systém Fas/Fas ligand abnormální. Na myším modelu hepatitidy bylo zjištěno, že jatemí porucha je inhibována podáváním látky, schopné inhibovat vazbu Fas ligandů na Fas [Kondo, T., a kol., (1997), Nátuře Medicine, 3,409],

Syndrom získané imunodeficience (AIDS)

Imunodeficience u pacientů infikovaných virem lidské imunodeficience (HIV) je výsledkem, alespoň částečně, apoptotické buněčné smrti množství imunitních buněk neinfikovaných HIV. Pomocné T buňky umírají při kontaktu s HIV. Protože růstový faktor z pomocných T buněk je nezbytný pro potlačení apoptózy v cytotoxických T buňkách, vyčerpání pomocných T buněk vede k apoptóze cytotoxických T buněk. Dále je považováno za pravděpodobné, že k apoptóze imunitních buněk u HlV-infikováných pacientů dochází vzhledem k abnormalitám v systému Fas/Fas ligand. Tento předpoklad je založen na poznatcích, že exprese Fas v periferních krevních lymfocytech HlV-infiko váných pacientů dobře koreluje s patologickou progresí onemocnění [Dhein, J., a kol., (1995), Behring Inst. Mitt., 96, 13 a McCloskey, T.W., a kol., (1995), Cytometry, 22, 111], Fas-pozitivní periferní krevní lymfocyty z neinfikovaných jedinců nepodstupují rychle apoptózu stimulací Fas, zatímco periferní krevní lymfocyty infikovaných pacientů podstupují Fas-indukovanou apoptózu během krátké doby [Owen-Schaub, L.B., a kol., (1992), Cell Immunol., 140,197],

Snaha o vypuzení orgánu po transplantaci

Snaha o vypuzení orgánu po transplantaci má určité podobnosti s autoimunitními chorobami, s výjimkou toho, že transplantovaný orgán je atakován cytotoxickými T buňkami donora. Proto lze očekávat zmírnění symptomů, jsou-li potlačeny funkce cytotoxických T buněk.

• ·

99#· • ····

9· ·· „ » * · * ; # · ·

9·· ··* • · **

Pro výše uvedená onemocnění jsou účinnými prostředky jejich léčby způsoby, které eliminují abnormální buňky (např. autoreaktivní T buňky u autoimunitních onemocnění, pěnové buňky u arteriosklerózy, mesangiální buňky u akutní glomerulonefritidy, infikované buňky u virových infekcí a synoviální buňky u revmatoidní artritidy), a/nebo chrání normální tkáně nebo buňky.

Problém spočívá ve skutečnosti, že přípravky, které jsou schopny pouze indukovat apoptózu prostřednictvím Fas, způsobí s velkou pravděpodobností poruchy normálních tkání, i přestože jsou abnormální buňky eliminovány. Na druhé straně, přípravky schopné pouze inhibovat Fas-indukovanou apoptózu nemohou eliminovat abnormální buňky, i když mohou být schopny chránit normální buňky. Např., monoklonální protilátka Jo2 proti myšímu Fas má apoptotickou indukční aktivitu, ale způsobuje fulminantní hepatitidu u myší [Ogasawara, J., a kol., (1993), Nátuře, 364, 806-809].

Dosud není známa protilátka proti Fas, která může být použita v léčbě a/nebo profylaxi kteréhokoli z výše uvedených onemocnění a která není zároveň spojena s žádnými nežádoucími vedlejšími účinky.

Imunoglobulin G (IgG) je složen ze dvou lehkých polypeptidových řetězců (L řetězce), každý z nich o molekulové hmotnosti asi 23 000 kD, a ze dvou těžkých polypeptidových řetězců (H řetězce), každý z nich o molekulové hmotnosti asi 50 000 kD. H i L řetězce se skládají z neměnné oblasti aminokyselin, obsahující asi 110 zbytků. Tato oblast se zde nazývá doména a tvoří základní trojrozměrnou strukturní jednotku IgG. H i L řetězce se skládají ze čtyř, resp. dvou po sobě jdoucích domén.

Při porovnání aminokyselinových sekvencí protilátek bylo zjištěno, že aminokoncová doména jak H tak L řetězců je variabilnější než jiné domény. Proto se nazývá variabilní doména (V doména). V domény H a L řetězců jsou spolu navzájem spojeny svou komplementární povahou a tvoří variabilní oblasti na amino-koncích molekul IgG. Další domény jsou spojeny za tvorby konstantních oblastí. Sekvence konstantních oblastí jsou charakteristické pro dané druhy. Např., konstantní oblasti myšího IgG se liší od lidského IgG a molekula myšího IgG je rozpoznána lidským imunitním systémem jako cizorodý protein. Podávání molekuly myšího IgG lidskému jedinci vede k tvorbě odezvy lidské anti-myší protilátky (dále nazývané HAMA) [Schroff a kol., (1985), Cancer Res., 45, 879-885]. Proto nemůže být myší protilátka • «4 99 99

9·9 9 9 99 · • · · 9 9 9

9 9 99· 999 • 9 9 9 • 999999 99 99 opakovaně podávána lidskému jedinci. Pro účinné podávání musí být protilátka modifikována, aby se zabránilo indukci HAMA odezvy, a současně musí být zachována specifita protilátky.

Výsledky rentgenové krystalografické analýzy ukazují, že imunoglobulinové svinutí obecně tvoří dlouhou cylindrickou strukturu, obsahující dvě vrstvy antiparalelních β-pásů, každý z nich obsahující tři nebo čtyři β-řetězce. Ve variabilní oblasti se shlukují dohromady tři smyčky z každé V domény H a L řetězců a vytváří vazebné místo pro antigen. Každá z těchto smyček je nazývána oblast určující komplementaritu (CDR). CDR oblasti mají nejvyšší variabilitu aminokyselinové sekvence. Části variabilní oblasti, které nejsou součástí CDR, se nazývají rámcové oblasti (FR oblasti) a obecně hrají roli při zachování struktury CDR oblastí.

Kabat a spolupracovníci porovnali primární sekvence mnoha variabilních oblastí H a L řetězců a identifikovali domnělé CDR nebo rámcové oblasti na základě homologie sekvencí (E.A. kabat a kol., Sequences of immunological interest, 5^th edition, NIH Publication, 91-3242). Autoři dále klasifikovali rámcové oblasti do několika podskupin, které mají společné aminokyselinové sekvence. Také identifikovali rámcové oblasti, které jsou společné pro myší a lidské sekvence.

Studie strukturní charakteristiky molekul IgG vedly k vývoji způsobů přípravy polidštěných protilátek, které nevyvolávají HAMA odezvu - viz. dále.

Počáteční předpoklady byly směrovány k přípravě chimérické protilátky spojením variabilní oblasti myší protilátky s konstantními oblastmi lidského původu [Morrison, S.L., akol., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, p6851-6855]. Tato chimérická protilátka však stále obsahuje mnoho nelidských aminokyselinových zbytků a může proto způsobit HAMA odezvu, zvláště je-li podávána delší dobu [Begent a kol., (1990), br. J. Cancer, 62, p 487].

Poté bylo navrženo zavedení samotných CDR segmentů do lidské protilátky, aby se dále snížil počet nelidských aminokyselinových sekvencí, které vyvolávají HAMA odezvu [Jones, P.T., a kol., (1986), Nátuře, 321, 522-525]. Zavedení samotných CDR částí však bylo obecně shledáno nedostatečným pro zachování aktivity imunoglobulinu proti antigenu.

Na základě dat rentgenové krystalografie Chothia a spolupracovníci [Chothia a kol., (1987), J. Mol. Biol., 196, 901-917] určili, že:

φφφ · · · · · φ φ · · · * φ · φ ··· ·ΦΦ φ φ · φ •ΦΦΦΦΦΦ φφ φφ

1. CDR má oblast, která se podílí na vazbě antigenů, a oblast, která se účastní zachování struktury samotné CDR. Možné trojrozměrné struktury CDR mohou být klasifikovány do několika tříd s charakteristickými rysy (kanonické struktury); a

2. Třídy kanonických struktur jsou určeny nejenom CDR sekvencemi, ale také charakterem aminokyselin na specifických místech v rámcových oblastech.

Výsledkem byl předpoklad, že technika zavádění CDR by měla zahrnovat také zavedení určitých aminokyselinových zbytků z rámcových oblastí do kostry lidské protilátky [Queen a kol., International Patent Publication č. W090/07861].

V souvislosti s výše uvedenými fakty je protilátka z nelidského savce, ze které jsou získány CDR oblasti pro zavedení, dále nazývána donorová molekula. Lidská protilátka, do které jsou CDR oblasti zaváděny, je dále nazývána akceptorová molekula.

Při zavádění CDR by struktury CDR oblasti měly být v ideálním případě neměnné a aktivita molekuly imunoglobulinů by měla být zachována. Proto mohou být relevantní následující faktory:

1. podskupina akceptoru; a

2. charakter aminokyselinových zbytků, které jsou převáděny z rámcových oblastí donora.

Queen a kol. [International Patent Publication č. W090/07861] navrhli způsob rozhodování, bude-li aminokyselinový zbytek z donorové FR zaveden spolu s CDR sekvencí. Podle této metody je aminokyselinový zbytek z FR oblasti zaveden na akceptor spolu s CDR sekvencí, splftuje-li tento zbytek alespoň jedno z následujících kritérií:

1. Aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptoru se zřídka nachází v této pozici akceptoru, zatímco odpovídající aminokyselina v donoru je běžně k nalezení na této pozici v akceptoru.

2. Aminokyselina se nachází v těsné blízkosti jedné z CDR; a

3. Aminokyselina má atom postranního řetězce max. 3 Á od CDR, jak bylo určeno na trojrozměrném modelu imunoglobulinů, a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo s CDR polidštěné protilátky.

Nikdo však nezískal úspěšně polidštěnou protilátku proti Fas typu IgG, která má apoptotickou indukční aktivitu.

• · · · • Β

Β Β · · Β Β Β ΒΒΒΒ • · Β Β Β Β β Β

Β ΒΒ Β ΒΒ ΒΒΒΒΒΒ

ΒΒΒ Β Β Β Β

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je poskytnout polidštěnou protilátku s apoptotickou indukční aktivitou.

Monoklonální protilátky, které se specificky váží na lidský Fas a které mají také apoptotickou indukční aktivitu, jsou známy, ale žádná z nich není schopna vázat myší Fas. Stejně tak monoklonální protilátky, které váží myší Fas jsou známy, ale žádná z nich není schopna vázat lidský Fas. Proto dosud nebylo možné vytvořit myší model k vyhodnocení farmaceutické účinnosti monoklonálních protilátek proti lidskému Fas.

Proto v prvním aspektu předmětný vynález poskytuje polidštěnou protilátku proti Fas, která je schopna

1. indukovat apoptózu v abnormálních buňkách, zvláště jak bylo popsáno výše, vazbou Fas antigenů na buněčném povrchu, a

2. zabránit apoptóze v normálních buňkách, která by jinak byla indukována v důsledku vazby Fas ligandu na Fas antigen.

Přednostněji poskytuje předmětný vynález protilátku proti Fas, která zahrnuje jednu nebo více podjednotek těžkého řetězce mající převážně aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se z:

aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 143;

aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 145;

aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 147; a aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 157;

na seznamu sekvencí.

Ještě přednostněji má protilátka jednu nebo více podjednotek lehkého řetězce mající převážně aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se z:

aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 107;

aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID ě. 127;

aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID ě. 129; a aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 131;

• 4 na seznamu sekvencí.

Z výše upřednostňovaných protilátek je výhodnou skupinou ta, jejíž těžký řetězec se skládá hlavně z aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí a dále je upřednostňováno, aby se lehký řetězec skládal hlavně z aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí.

Další upřednostňovanou kategorií jsou protilátky, kde jedna nebo více podjednotek lehkého řetězce má převážně aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se z: aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 127;

aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 129; a aminokyselinové sekvence 1 až 218 o SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí; a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce má převážně aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se z:

aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID ě. 143;

aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID ě. 145; a aminokyselinové sekvence 1 až 451 o SEQ ID č. 147 na seznamu sekvencí.

Bude oceněno, že termín převážně je zde použit s odkazem na možnost změny dané sekvence. Tato změna se může uskutečnit např vložením, vymazáním, vložením nebo převrácením, bude však obecně omezena v rozsahu, aby byl zachován charakter dané sekvence.

Jako alternativní aspekt poskytuje předmětný vynález polidštěnou protilátku proti Fas, která je schopna vázat jak lidský tak myší Fas antigen.

Dále je poskytován přípravek pro profylaxi a/nebo léčbu stavů, zahrnujících poruchu Fas, který zahrnuje jako účinnou složku protilátku proti Fas nebo jí podobné molekuly.

Dále jsou poskytovány způsoby léčby stavů, zahrnujících poruchy Fas. Tyto způsoby zahrnují podávání netoxických nebo převážně netoxických dávek protilátek podle předmětného vynálezu zvířatům a zvláště lidem, kteří je potřebují.

Přehled obrázků ve výkresech · 0 0 0 0 · 0 0

0 • · «·

Obrázek 1 je diagram, znázorňující konstrukci phFas-AIC2;

Obrázek 2 je diagram, znázorňující konstrukci pME-H a pME-L;

Obrázek 3 je obrázek, ukazující výsledky ELISA pro stanovení epitopu rozpoznaného HFE7A protilátkou;

Obrázek 4 je obrázek, ukazující výsledky kompetitivního stanovení pro určení epitopu rozpoznaného HFE7A protilátkou;

Obrázek 5 je obrázek, ukazující výsledky testování toxicity HFE7A;

Obrázek 6 je obrázek, ukazující výsledky testování na modelu fulminantní hepatitidy;

Obrázek 7 je obrázek, ukazující výsledky testování zabránění artritidy indukované kolagenem; Obrázek 8 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci VHH-DNA;

Obrázek 9 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci VHH-DNA;

Obrázek 10 je shrnutí třetího kroku PCR pro produkci VHH-DNA;

Obrázek 11 je shrnutí konstrukce expresního plasmidu, nesoucího fragment VHH-DNA;

Obrázek 12 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci VHM-DNA;

Obrázek 13 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci VHM-DNA;

Obrázek 14 je shrnutí konstrukce expresního plasmidu, nesoucího fragment VHM-DNA;

Obrázek 15 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci VMM-DNA;

Obrázek 16 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci VMM-DNA;

Obrázek 17 je shrnutí třetího kroku PCR pro produkci VMM-DNA;

Obrázek 18 je shrnutí konstrukce expresního plasmidu, nesoucího fragment VMM-DNA;

Obrázek 19 ukazuje pozice, na které se váží sekvenační primery lehkého řetězce;

Obrázek 20 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci VD-DNA;

Obrázek 21 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci VD-DNA;

Obrázek 22 je shrnutí třetího kroku PCR pro produkci VD-DNA;

Obrázek 23 je shrnutí konstrukce expresního plasmidu, nesoucího fragment VD-DNA;

Obrázek 24 je shrnutí konstrukce DNA (IG5'-DNA) fragmentu, zahrnujícího CH1 oblast lidského IgGl a intron;

Obrázek 25 je shrnutí konstrukce fragmentu genomické DNA (IG3'-DNA), zahrnujícího stěžejní oblast, CH2 oblast, CH3 oblast a introny lidského IgGl;

Obrázek 26 je shrnutí konstrukce expresního plasmidu pEg7AH-H;

Obrázek 27 ukazuje pozice, ve kterých se váží sekvenační primery těžkého řetězce;

Obrázek 28 je graf, znázorňující vazebnou aktivitu polidštěných protilátek proti Fas k lidskému Fas fuznímu proteinu;

φ ·· «· ·· • · · · · ·· « • · · · · ♦ • · · ······ • · « · ······· ·· · ·

Obrázek 29 ukazuje kompetitivní inhibici HFE7A a polidštěných protilátek proti Fas pro lidský Fas fúzní protein;

Obrázek 30 ukazuje cytotoxicitu polidštěného HFE7A vzhledem k WR19L12a;

Obrázek 31 ukazuje nástin prvního kroku PCR pro přípravu LPDHH-DNA;

Obrázek 32 ukazuje nástin druhého kroku PCR pro přípravu LPDHH-DNA;

Obrázek 33 ukazuje nástin třetího kroku PCR pro přípravu LPDHH-DNA;

Obrázek 34 ukazuje nástin konstrukce expresního plasmidu, nesoucího fragment LPDHH-DNA; Obrázek 35 ukazuje nástin prvního kroku PCR pro přípravu LPDHM-DNA;

Obrázek 36 ukazuje nástin druhého kroku PCR pro přípravu PDHM-DNA;

Obrázek 37 ukazuje nástin třetího kroku PCR pro přípravu LPDHM-DNA;

Obrázek 38 ukazuje nástin konstrukce plasmidu, nesoucího fragment LPDHM-DNA;

Obrázek 39 ukazuje nástin prvního kroku PCR pro přípravu HPD1;2-DNA;

Obrázek 40 ukazuje nástin druhého kroku PCR pro přípravu HPD1 ;2-DNA;

Obrázek 41 ukazuje nástin konstrukce plasmidu, nesoucího fragment HPD1;2-DNA;

Obrázek 42 ukazuje, kde se váží primery pro sekvenování pEgPDHV3-21;

Obrázek 43 ukazuje konstrukci vysokoúčinných expresních vektorů pro polidštěné lehké řetězce; Obrázek 44 ukazuje konstrukci vysokoúčinných expresních vektorů pro polidštěné těžké řetězce; Obrázek 45 ukazuje vazebnou aktivitu pro lidský Fas fúzní protein pro supematanty v Příkladu 12;

Obrázek 46 ukazuje výsledky kompetitivní inhibice HFE7A protilátky prostřednictvím supematantů v Příkladu 12;

Obrázek 47 ukazuje výsledky indukce apoptózy v T buňkách prostřednictvím supematantů kultivační tekutiny v Příkladu 12;

Obrázek 48 ukazuje porovnání FR-aminokyselinových sekvencí HFE7A, každý lidský akceptor a lehký řetězec každé polidštěné protilátky;

Obrázek 49 ukazuje porovnání FR-aminokyselinových sekvencí HFE7A, každý lidský akceptor a těžký řetězec každé polidštěné protilátky;

Obrázek 50 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci LEU 1-DNA;

Obrázek 51 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci LEU 1-DNA;

Obrázek 52 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci LEU2-DNA;

Obrázek 53 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci LEU2-DNA;

Obrázek 54 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci LEU3-DNA;

Obrázek 55 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci LEU3-DNA;

* 9 · · * • · · · <

Φ · » Φ «

Φ · ΦΦΦ · · 1

Obrázek 56 ukazuje nástin konstrukce expresního plasmidu, nesoucího DNA, která kóduje Eu typ polidštěného lehkého řetězce;

Obrázek 57 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci HEU1HA-DNA;

Obrázek 58 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci HEU1HA-DNA;

Obrázek 59 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci HEU2HA-DNA;

Obrázek 60 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci HEU2HA-DNA;

Obrázek 61 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci HEU3HA-DNA;

Obrázek 62 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci HEU3HA-DNA;

Obrázek 63 ukazuje nástin konstrukce expresního plasmidu, nesoucího DNA, která kóduje Eu typ polidštěného těžkého řetězce;

Obrázek 64 ukazuje vazebnou aktivitu lidského Fas íuzního proteinu pro supernatanty kultury transformovaných COS-7 buněk;

Obrázek 65 ukazuje výsledky kompetitivní inhibice HFE7A protilátky prostřednictvím supematantů kultury transformovaných COS-7 buněk;

Obrázek 66 ukazuje výsledky indukce apoptózy v WR19L12a prostřednictvím supematantů kultivační tekutiny kultury transformovaných COS-7 buněk;

Obrázek 67 je shrnutí prvního kroku PCR pro produkci HHHV-DNA;

Obrázek 68 je shrnutí druhého kroku PCR pro produkci HHHV-DNA;

Obrázek 69 ukazuje nástin konstrukce plasmidu, nesoucího HHHV-DNA;

Obrázek 70 ukazuje pozici, ve které se váží sekvenační primery pro HHH typ polidštěného těžkého řetězce;

Obrázek 71 ukazuje nástin konstrukce expresního plasmidu, nesoucího HHHV-DNA;

Obrázek 72 ukazuje vazebnou aktivitu v lidském Fas fuzním proteinu pro supernatanty kultury transformovaných COS-1 buněk; a

Obrázek 73 ukazuje výsledky kompetitivní inhibice vazby lidského Fas fuzního proteinu na HFE7A protilátku prostřednictvím supematantů kultur transformovaných COS-1 buněk.

Detailní popis vynálezu

Obzvláštní výhodou protilátek podle předmětného vynálezu je fakt, že jsou schopny nejen indukovat apoptózu v abnormálních buňkách exprimujících Fas, ale jsou také schopny inhibovat apoptózu v normálních buňkách.

Jak bylo popsáno výše, žádná známá protilátka, která váže lidský Fas a která má apoptotickou indukční aktivitu, není schopna vázat myší Fas. Monoklonální protilátky, které váží myší Fas, jsou známy, ale žádná z nich neváže lidský Fas. Proto nemohou být na myším modelu onemocnění hodnoceny žádné známé protilátky proti Fas. Naproti tomu protilátky podle předmětného vynálezu mohou být hodnoceny na myším modelu onemocnění a tím poskytují prostředky pro zajištění farmaceutické účinnosti a pro vytvoření modelu pro výzkum obecné role Fas.

Předpokládá se, že výhody protilátek podle předmětného vynálezu pochází z jejich schopnosti rozpoznat neměnný epitop Fas antigenu. Fas je běžná molekula, ale liší se druh od druhu. Předpokládá se, že existuje alespoň jedna neměnná oblast Fas, která je společná pro všechny savce a která je nezbytná pro to, aby měl Fas apoptotickou indukční funkci. Molekuly podle předmětného vynálezu rozpoznají neměnný Fas epitop. Při porovnání např. myšího a lidského Fas nemusí být zmíněný epitop zcela identický v obou molekulách za předpokladu, že oblast vazby epitopu v molekule je schopna rozpoznat oba dva. Obecně však bude epitop přesně stejný.

Je známo mnoho protilátek proti Fas, včetně takových, které jsou schopny indukovat apoptózu, avšak dosud nebyla získána taková, která váže jakoukoli shodnou sekvenci. Naproti tomu protilátky podle předmětného vynálezu váží shodnou sekvenci. Proto lze teorii rozšířit a říci, že místo pouhého působení ve smyslu vyřazení nebo interference prostřednictvím vazby na Fas, které může mít nebezpečné a nečekané účinky, jako v případě Jo2 a fulminantní hepatitidy u myší, protilátky podle předmětného vynálezu vlastně působí v aktivním místě Fas a tím napodobují přirozený ligand, místo aby se pouze nespecificky vázaly na Fas antigen.

Je-li normální laboratorní myš, jako je BALB/c myš, imunizována lidským Fas, budou buňky produkující protilátky, které váží jak lidský tak myší Fas, eliminovány v thymu běžným postupem eliminačních autoreaktivních protilátek. Aby tedy byla získána myší monoklonální protilátka, která je namířena proti epitopu neměnnému u myší a lidí a která proto váže jak lidský Fas tak myší Fas, je nezbytné použít myš, u které byla takováto eliminace částečně nebo zcela porušena.

Existují spekulace, že systém Fas/Fas ligand je začleněn v eliminačním procesu autoreaktivních T buněk v thymu [Shin Yonehara (1994) Nikkei Science Bessatsu, 110, 66-77].

• «·· · * «· ·· ·· ·· · ·<♦· · · · « • · · · · ♦ « · • · · · · · «····· • · · · · · · «·· ♦ · «·· ♦··· ♦· ♦·

Proto imunizací myši, která má mutaci v systému Fas/Fas ligand (na takovouto myš je zde dále odkazováno jako na myš s vyřazeným Fas nebo Fas/Fas ligand deficientní myš), např. takovou, že není schopna exprimovat gen kódující Fas, lze získat protilátky, které váží myší Fas i lidský Fas.

Protilátky proti Fas mohou být obecně získány podáváním imunogenně účinného množství látky, zahrnující imunogenní epitop heterologního Fas, zvířeti, které je alespoň částečně deficientní v apoptotické eliminaci autoreaktivních T buněk, a následnou izolací protilátek ze zvířete.

Látka nesoucí Fas epitop může být samotný Fas nebo to může být jiná vhodná látka, jako je fúzní protein.

Izolace příslušné protilátky spadá do znalostí odborníků v dané oblasti techniky a je doložena níže uvedenými příklady. Zejména je upřednostňováno použití imunizovaného zvířete podle způsobu předmětného vynálezu pro získání alespoň jedné monoklonální protilátky, která je získatelná způsoby známými v dané oblasti techniky.

Dále bude též oceněno, že pro snadnější manipulaci je upřednostňováno, že zvíře je myš, přestože lze použít i jiné druhy hlodavců, jako jsou králíci, a jiní savci obecně, jako kozli a makakové. Tyto systémy však nejsou tak dobře charakterizovány jako myš. Bude též oceněno, že je upřednostňováno, že Fas použitý pro podávání je lidský, přestože, je-li to nutné, lze protilátky podle vynálezu získat pro jiné savce. Obecně se však počítá s tím, že díky sdílení společného epitopu mají protilátky podle předmětného vynálezu univerzální použití.

Za použití výše zmíněné metody byl připraven hybridom, který produkuje novou monoklonální protilátku proti Fas, která váže lidský i myší Fas. Myš s vyřazeným Fas byla imunizována lidským Fas, slezinné buňky byly fúzovány s myšími myelomovými buňkami a monoklonální protilátky byly izolovány ze supematantu kultury.

Nové monoklonální protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu indukovaly apoptózu v T buňkách myší a jiných nelidských primátů, které exprimují Fas. Předmětný vynález tak demonstruje, že existuje společný epitop, alespoň u Fas primátů (včetně lidí) a hlodavců (alespoň • · · · • · • · · · * ·♦···· • · · » · * myší), který může být rozpoznán protilátkou podle předmětného vynálezu a který má schopnost indukovat apoptózu, váže-li se na něj protilátka podle předmětného vynálezu.

Protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu se ukázaly být účinné při zmírnění závažnosti symptomů na myším modelu autoimunitního onemocnění. Navíc bylo demonstrováno, že tyto protilátky neindukují jatemí poruchy, které dříve představovaly značný problém.

Aby byly získány aminokyselinové sekvence CDR oblastí, byly klonovány a sekvenovány odpovídající geny pro oba řetězce získaných protilátek. Pro produkci rekombinantích protilátek proti Fas byly konstruovány expresní vektory, zahrnující odpovídající geny pro těžké a lehké řetězce. Bylo demonstrováno, že tyto rekombinantní protilátky, získané ze supematantu kultivační tekutiny kultury zvířecích buněk transfektováných těmito vektory, reagují s Fas.

Takto získané protilátky proti Fas a jejich klony rekombinantních protilátek jsou schopny chránit játra před fulminantní hepatitidou indukovanou Fas a jsou též účinné při prevenci a léčbě revmatoidní artritidy.

Proto bylo nyní demonstrováno, že je možné poskytnout protilátky, které jsou schopny indukovat apoptózu prostřednictvím Fas v abnormálních buňkách a inhibovat Fas-indukovanou apoptózu v normálních buňkách a které jsou proto účinné při prevenci, léčbě a/nebo profylaxi onemocnění, spojených s abnormalitami v systému Fas/Fas ligand.

Způsob získání protilátek podle předmětného vynálezu zahrnovalo zavedení CDR aminokyselinových sekvencí myších monoklonální ch protilátek proti Fas do lidské protilátky. Byly úspěšně získány rekombinantní protilátky, které nebyly imunogenní pro lidské jedince, ale přesto měly Fas vazebnou aktivitu.

Předmětný vynález umožňuje konstrukci polidštěných protilátek, které představují minimální riziko indukce HAMA odezvy při současném zachování si účinné efektorové funkce protilátky.

Homologie vazebné oblasti nebo epitopu se vztahuje k sekvenci oblasti. Obecně jsou samozřejmě aminokyselinové sekvence v okolí epitopu často neměnné u různých zvířat pro

antigeny vázané společnou monoklonální protilátkou, která rozpoznává homologní proteiny. V mnoha případech je homologie aminokyselinové sekvence v oblasti vysoká. Epitop, na který je vázána protilátka podle předmětného vynálezu, není omezen na tuto oblast. Homologie v primární struktuře není neměnná, spíše je však zachována homologie vyšších struktur. Proto epitopy, které jsou neměnné mezi primáty a neprimáty, zahrnují odkaz na oblasti s vysokou homologii vyšších struktur proteinů, zvláště těch, které mohou být rozpoznány jednou monoklonální protilátkou.

Používané termíny lidský a polidštěný ve vztahu k protilátkám se vztahují na jakoukoli protilátku, u které se očekává malá nebo žádná imunogenní odezva u lidského objektu, ať již jedince či skupiny.

Bude oceněno, že je obecně upřednostňováno, že všechny CDR oblasti z dané protilátky jsou zavedeny do akceptorové protilátky, aby byla chráněna vazebná oblast pro Fas epitop nebo vazebná oblast pro epitop, jak je zde na ni obecně odkazováno. Mohou se však vyskytnout příležitosti, kdy je vhodné nebo žádoucí zavést do donoru méně než celkové množství CDR oblastí, a ty jsou doloženy v předmětném vynálezu. Dále bude také rozuměno, že zavedení obecně vyžaduje nahrazení, zbytek za zbytek, jedné aminokyseliny nebo oblasti za jinou. Příležitostně však, zvláště při přenosu oblasti, může být dle požadavků jeden nebo více zbytků přidán nebo vynechán, a tyto delece a inzerce, stejně jako příslušná nahrazení a převrácení, jsou v rámci dovednosti odborníků v dané oblasti techniky.

Oblast vazby epitopu v předmětném vynálezu je oblast molekuly, která odpovídá vazebnému místu epitopu v protilátce. Oblast vazby epitopu nemusí pocházet přímo z určité protilátky nebo páru protilátek a nemusí připomínat žádnou zvláštní oblast vazby epitopu. Jediným požadavkem je, aby oblast vazby epitopu připomínala rozpoznávací místo protilátky, pokud je schopna vázat antigen, v tomto případě Fas epitop. Přestože oblast vazby epitopu může být konstruována pomocí CDR oblastí ze známé protilátky, jsou-li tyto oblasti poté zavedeny do lidské protilátky, výsledná oblast vazby epitopu nemusí nezbytně připomínat oblast známé protilátky, i když je z hlediska zachování vazebné specifity žádoucí vysoký stupeň podobnosti.

Zvláště upřednostňujeme to, aby byly všechny CDR oblasti z nelidské protilátky zavedeny do lidské protilátky, přestože jsme ustanovili, že není nutné vložit rámcové oblasti do akceptorové protilátky (je zde na ně též odkazováno jako na lidskou protilátku).

• φφ · ·· φφφφ

Při vkládání CDR oblastí do lidské protilátky nastává za normálních okolností případ, že nelidská CDR nahradí odpovídající lidskou CDR jako celek, zvláště mají-li obě oblasti stejnou délku. Může však nastat i případ, že je nahrazena pouze část lidské CDR nebo je vložena pouze část nelidské CDR, obě možnosti jdou obvykle ruku v ruce.

Bude též oceněno, že pro nahrazení odpovídajících CDR oblastí v lidské protilátce by obecně měly být použity CDR oblasti z nelidské protilátky. V situaci, kdy je použita kostra lidského lehkého nebo těžkého řetězce, který má pozice pro vložení CDR oblastí spíše než samotné CDR oblasti, platí podobné úvahy.

Bude také rozuměno, že lidské těžké a lehké řetězce nemusí nezbytně pocházet ze stejné lidské protilátky, dokonce ani ze stejné třídy. Důležité je to, že sekvence vybraného donoru odpovídá co nejvíce sekvenci nelidské protilátky. Důležitost faktu, že si dva řetězce odpovídají (lehký/lehký nebo těžký/těžký) spočívá v tom, že výsledná protilátka by měla mít oblast vazby epitopu co nejvíce připomínající tuto oblast původní nelidské protilátky, aby byla zajištěna co nejlepší vazba. Předmětný vynález tak dokládá také možnost použití sekvencí, které si neodpovídají úplně přesně, u kterých existuje důvodný předpoklad, že výsledná rekombinantní protilátka bude sloužit požadovanému účelu.

Molekuly podle předmětného vynálezu jsou přednostně protilátky, i když to není nezbytné, za předpokladu, že oblast vazby epitopu váže Fas epitop. Tak mohou být např. izolovaná a stabilizovaná vazebná místa navázána na purifikační kolonu afinitní chromatografie nebo může způsob zahrnovat např. adjuvantní molekulu nosiče, na kterou jsou připevněny oblasti vazby epitopu podle vynálezu. Pro zjednodušení odkazu zde budou molekuly předmětného vynálezu obecně nazývány protilátky, avšak tento odkaz zahrnuje všechny molekuly vynálezu, není-li uvedeno jinak.

Je-li molekula podle vynálezu protilátka, bude oceněno, že může být napodoben nebo použit jakýkoli vhodný typ protilátky, jako je IgG, IgA, IgE a IgM, přičemž IgG je obecně upřednostňován.

Budou-li zde diskutovány molekuly a protilátky, bude rozuměno, že podobné úvahy platí také pro jakékoli sekvence nukleových kyselin, které je kódují.

• β · ·

• fc ·· • fcfc · • · · fc • ·· · fcfcfc * fc • fc fcfc

Určitá výhodná provedení předmětného vynálezu jsou následující.

Je upřednostňováno, aby protilátka podle vynálezu vázala peptid, zahrnující aminokyselinovou sekvenci o SEQ ID č. 1 na seznamu sekvencí.

Je též poskytována DNA kódující protilátky podle předmětného vynálezu, stejně jako rekombinantní DNA vektory zahrnující tuto DNA a hostitelské buňky transformované těmito vektory. Hostitel je přednostně transformován samostatným vektorem pro každý kódovaný těžký a lehký řetězec, proto většinou obsahuje dva vektory, i když předmětný vynález také dokládá hostitele transformovaného pouze jedním expresním vektorem, kódujícím všechny sekvence, které mají být exprimovány. Takováto hostitelská buňka je přednostně savčí.

Každý z následujících transformovaných kmenů začleňuje zvláště upřednostňované plasmidy předmětného vynálezu a každý z nich je upřednostňován: (lehké řetězce) E. coli pHSGMMÓ SANK73697 (FERM BP-6071), E. coli pHSGHM17 SANK73597 (FERM BP6072), E. coli pHSGHH7 SANK73497 (FERM BP-6073), E. coli pHSHM2 SANK 70198 a E. coli pHSHH5 SANK 70398 (FERM BP-6272); (těžké řetězce) E. coli pgHSL7A62 (FERM BP6274) SANK73397 (FERM BP-6074) a£ coli pgHPDHV3 SANK 70298 (FERM BP-6273).

Předmětný vynález také poskytuje způsob produkce polidštěné protilátky proti Fas, zahrnující kultivaci výše uvedených hostitelských buněk a poté izolaci polidštěné protilátky proti Fas z kultury buněk.

Dále je poskytován přípravek pro profylaxi nebo léčbu onemocnění, spojených s abnormalitami systému Fas/Fas ligand, zahrnující jako aktivní složku protilátku podle předmětného vynálezu, zvláště pro níže definovaná onemocnění. Cílovými onemocněními jsou autoimunitní choroby (systémový lupus erythematodes, Hashimotova choroba, revmatoidní artritida, snaha o vypuzení orgánu po transplantaci, Sjógrenův syndrom, zhoubná anémie, Addisonova choroba, sklerodermie, Goodpastureův syndrom, Crohnova choroba, autoimunitní hemolytická anémie, sterilita, myasthenia gravis, roztroušená skleróza, Basedowova nemoc, purpurózní trombopenie nebo inzulín-dependentní diabetes melittus). Samostatné přípravky jsou také doloženy pro: alergie; revmatoidní artritidu; arteriosklerózu; myokarditidu nebo • »· ·

99

9 9 9

9 9 9 kardiomyopatii; glomerulonefritidu; hypoplastickou anémii; hepatitidu (hepatitidu C, hepatitidu B, hepatitidu D) nebo alkoholickou hepatitidu); a snahu o vypuzení orgánu po transplantaci.

Rámcové oblasti (FR) jsou přítomny ve variabilní oblasti podjednotky H nebo L řetězce v molekule imunoglobulinů. Např., FRHi představuje rámcovou oblast, která se nachází na nejzažší N-koncové pozici ve variabilní oblasti podjednotky H řetězce a FRH4 představuje čtvrtou rámcovou oblast od N-konce variabilní oblasti podjednotky L řetězce. Podobně např. CDRHi představuje CDR oblast, přítomnou na nejzažší N-koncové pozici ve variabilní oblasti podjednotky H řetězce a CDRH3 představuje třetí CDR oblast od N-konce variabilní oblasti podjednotky L řetězce. FR oblasti lemují CDR oblasti v jakémkoli těžkém nebo lehkém řetězci.

Bude oceněno, že protilátky podle předmětného vynálezu mohou být získány např. zavedením každé CDR oblasti z podjednotky L a H řetězce monoklonální protilátky HFE7A proti Fas do odpovídající CDR oblasti lidské protilátky a tím ji polidšťují.

V jednom provedení může být získána monoklonální protilátka proti Fas, vhodná pro přípravu polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu, kultivací vhodného hybridomu, který může být získán imunizací myši s vyřazeným Fas pomocí lidského Fas, a následnou fúzí slezinných buněk myši s myšími myelomovými buňkami.

Příprava monoklonální protilátky běžně zahrnuje následující kroky:

a) purifikaci biomakromolekuly pro použití coby imunizačního antigenů;

b) přípravu buněk produkujících protilátky po imunizaci příslušného zvířete pomocí injekcí antigenů, odběru krve zvířete a stanovení titru protilátky, aby se určil okamžik odebrání sleziny;

c) přípravu myelomových buněk;

d) fúzování buněk produkujících protilátky a myelomových buněk;

e) výběr hybridomu produkujícího požadovanou protilátku;

f) přípravu samostatného buněčného klonu (klonování);

g) případně kultivaci hybridomových buněk nebo pěstování zvířat, kterým byly transplantovány hybridomové buňky, pro přípravu monoklonální protilátky ve velkém měřítku; a

h) testování biologických aktivit a specifity nebo stanovení znakových vlastností takto připravené monoklonální protilátky.

·♦·· • ·* ΒΒ ΒΒ • Β · · · ♦ « » » · · • B ) ·♦···

B Β · Β · Β ·Β · ΒΒΒ • Β Β Β Β · ·

ΒΒΒ ΒΒ ··♦ 9-999 ΒΒ ΒΒ

Obecný postup přípravy monoklonální protilátky proti Fas je níže detailněji popsán v souladu s výše popsanými kroky. Bude však oceněno, že níže popsaný způsob představuje pouze jednu cestu přípravy vhodné protilátky, a mohou být prováděny i jiné postupy, jako např. použití jiných buněk produkujících protilátky než jsou slezinné buňky a použití jiné buněčné kultury než myelomové.

a) Příprava antigenů

Rekombinantní protein (na který je zde odkazováno jako na rekombinantní lidský Fas), účinný coby Fas antigen, může být získán transfekci opičí buněčné linie COS-1 expresním vektorem pME18S-mFas-AIC, který kóduje íuzní protein zahrnující extracelulární doménu lidského Fas a extracelulární doménu myšího receptorů interleukinu-3 [IL3R - Nishimura, Y., a kol., (1995), J. Immunol., 154, 4395-4403], a sběrem a částečnou purifikací produktu exprese. Plasmid phFas-AIC2 byl konstruován vložením DNA kódující lidský Fas a myšího IL3R fuzního proteinu do pME18S, který je expresním vektorem pro zvířecí buňky. Jak bylo výše poznamenáno, použité materiály, jako je DNA kódující Fas, vektor a hostitel, nejsou omezeny pouze na tyto uvedené.

Výsledný fúzní protein lidského Fas a IL3R, na který je zde odkazováno jako na rekombinantní lidský Fas, shromážděný ze supematantu kultury transformovaných COS-1 buněk, může být částečně vyčištěn vhodnou metodou, jako je ionexová chromatografie za použití kolony Resource Q (obchodní název; Pharmacia).

Jako vhodná alternativa může být coby antigen použit purifikovaný Fas, získaný z buněčných membrán lidských buněčných linií. Protože je známa primární struktura Fas [Itoh, N., a kol., (1991), Cell, 66, 233-243], může být peptid, zahrnující vhodnou část aminokyselinové sekvence lidského Fas, jako je ta o SEQ ID č. 1 na seznamu sekvencí, chemicky syntetizován jakýmkoli vhodným způsobem a může být použit coby antigen.

b) Příprava buněk produkujících protilátky

Experimentální zvíře je imunizováno imunogenem vyrobeným v kroku a), vhodně smíchaným s adjuvans, jako je Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, a kamencem.

9999 • · · 9 9 9 9 >9 · 9 9 · 9 9 } 9 9 9 9 9 ♦ · ·· 9 999

9 9 9 «··«««· ·· 99

V prezentovaném případě se jedná o myš s vyřazeným Fas, která může být připravena metodou podle Senju a kol. [Senju, S., a kol., (1996), International Immunology, 8,423].

Vhodné způsoby imunizace myši zahrnují podkožní, intraperitoneální, intravenózní, intradermální a intramuskulámí injekční aplikaci. Upřednostňované jsou podkožní a intraperitoneální injekce.

Imunizace může být provedena jedinou dávkou nebo, přednostně, několika opakovanými dávkami ve vhodných intervalech (přednostně 1 až 5 týdnů). Imunizované myši jsou sledovány z hlediska aktivity protilátky proti Fas v séru a zvíře s dostatečně vysokým titrem protilátky je vybráno jako zdroj buněk produkujících protilátku. Výběr zvířete s vysokým titrem zajišťuje účinnější další postup. Buňky pro následnou fúzi jsou obecně získány ze zvířete 3 až 5 dní po poslední imunizaci.

Způsoby stanovení titru protilátky zahrnují různé dobře známé techniky, jako je radioimuno-stanovení (RIA), enzymové imunostanovení v pevné fázi (ELISA), fluorescenční stanovení protilátky a pasivní hemaglutinační stanovení. RIA a ELISA jsou výhodné z důvodů detekční citlivosti, rychlosti, přesnosti a možnosti automatizace.

Určení titru protilátky může být provedeno např. pomocí ELISA techniky, jak je dále popsáno. Nejprve je vyčištěný nebo částečně vyčištěný Fas navázán na povrch pevné fáze, jako je např. ELISA mikrotitrační deska s 96 jamkami. Následuje zablokování jakéhokoli zbylého povrchu, na který se nenavázal Fas, pomocí proteinu, který se nevztahuje k antigenu, např. hovězího sérového albuminu (BSA). Po promytí jsou jamky uvedeny do kontaktu se sériově naředěnými vzorky přípravků protilátky, které mají být testovány (např. myší sérum), aby byla umožněna vazba protilátky proti Fas ve vzorcích na antigen. Dále je přidána enzymaticky značená sekundární anti-myší protilátka, která se naváže na myší protilátku. Po promytí je přidán substrát pro enzym a vazebná aktivita protilátky proti Fas může být stanovena určením příslušné změny, např. absorbance při vývoji barevné reakce.

c) Příprava myelomových buněk

Obecně slouží jako zdroj myelomových buněk buňky ze zavedených myších buněčných linií. Vhodné buněčné linie zahrnují: myší myelomové kmeny rezistentní k 8-azaguaninu

fe fe (pochází z BALB/c), P3X63Ag8U.l (P3-U1) [Yelton, D.E., a kol., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7, (1978)], P3/NSI/l-Ag4-l (NS-1) [Kohler, G., a kol., European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], Sp2/O-Agl4(SP-2) [Shulman, M., a kol., Nátuře, 276, 269-270 (1978)], P3X63Ag8.653 (653) [Keamey, J.F., a kol., J. Immunology, 123, 15481550 (1979)] a P3X63Ag8 (X63) [Horibata, K. a Harris, A.W., Nátuře, 256, 495-497 (1975)]. Vybraná buněčná linie je postupně převedena do příslušného média, jako je 8-azaguaninové médium [RPMI-1640 médium obohacené o glutamin, 2-merkaptoetanol, gentamicin, zárodečné telecí sérum (FCS) a 8-azaguanin], Iscove modifikované Dulbecco médium (IMDM) nebo Dulbecco modifikované Eagle médium (DMEM). 3 až 4 dny před fůzí jsou buňky převedeny do normálního média, jako je ASF104 médium (Ajimoto, K.K.) obsahující 10% FCS, aby bylo zajištěno, že v den fuze bude připraveno alespoň 2 χ 10⁷ buněk.

d) Fúze buněk

Buňky produkující protilátku, které jsou použity pro fúzi, jsou plazmatickými buňkami a jejich prekurzorovými buňkami, lymfocyty, které mohou být získány z kterékoli vhodné části zvířete. Typickými oblastmi jsou slezina, lymfatické uzliny, periferní krev nebo jakákoli jejich vhodná kombinace. Nej běžněji jsou používány slezinné buňky.

Po poslední imunizační injekci je tkáň, ve které se nacházejí buňky produkující protilátku, např. slezina, vyjmuta z myši s předem stanoveným titrem protilátky. V současné době nej používanější technika pro fúzi slezinných buněk, připravených postupem v kroku c), využívá polyetylenglykol, který má poměrně malou cytotoxicitu a postup fúze je jednoduchý. Příklad této techniky následuje.

Slezinné a myelomové buňky jsou promyty médiem bez séra (např. RPMI 1640) nebo fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS), smíchány tak, aby početní poměr slezinných buněk k myelomovým buňkám byl přibližně mezi 5:1 a 10:1, a odstředěny. Po slití supernatantu a dostatečném uvolnění peleto váných buněk je za stálého míchání po kapkách přidáno vhodné množství, obecně 1 ml, média bez obsahu séra a obsahujícího 50% polyetylenglykoiu (molekulová hmotnost 1000 až 4000). Dále je pomalu přidáno 10 ml média bez obsahu séra a směs je odstředěna. Supernatant je znovu slit a peletované buňky jsou rozpuštěny ve vhodném množství HAT média [roztok hypoxantinu, aminopterinu a thymidinu (tyto tři látky dohromady jsou též známy jako HAT) a myšího interleukinu-2 (IL-2)]. Suspenze

9999

9 9 · • 9 9 9

999 999

9

99 je nalita na kultivační misky (je na ně zde odkazováno prostě jako na misky) a inkubována za přítomnosti pěti objemových procent CO₂ při 37 °C po dobu asi 2 týdnů za dodatečného přidávání HAT média.

e) Výběr hybridomů

Je-li použitý myelomový kmen rezistentní k 8-azaguaninu, tzn. že je deficientní z hlediska hypoxantin-guanin-fosforibosyltransferázy (HGPRT), jakékoli nefuzované myelomové buňky a produkty fuze myelom-myelom nejsou schopny přežít v HAT médiu. Na druhé straně, vzájemně fúzované buňky produkující protilátky a hybridomy buněk produkujících protilátky s myelomovými buňkami přežívají; prvně zmíněné mají pouze omezenou životnost. Výsledkem pokročilé inkubace v HAT médiu je proto výběr pouze žádoucích hybridomů.

Výsledné hybridomy jsou dále pěstovány ve formě kolonií v HAT médiu bez aminopterinu (HT médium). Poté jsou odejmuty alikvotní podíly kultivačního supernatantu pro stanovení titru protilátky proti Fas, např. ELISA stanovením. Je-li jako antigen při ELISA stanovení použit výše zmíněný rekombinantní Fas fuzní protein, je také nezbytné vyloučit klony, produkující protilátku, která specificky váže extracelulární doménu myšího IL3 receptoru. Přítomnost nebo absence takového klonu může být ověřena např. ELISA stanovením za použití myšího IL3 receptoru nebo jeho extracelulární domény coby antigenu.

Přestože je výše uvedený selekční postup doložen při použití buněčné linie rezistentní vůči 8-azaguaninu, bude oceněno, že mohou být použity jiné buněčné linie s vhodnými selekčními znaky a s příslušnými modifikacemi použitého média.

f) Klonování

Hybridomy, u kterých byla prokázána produkce specifických protilátek proti Fas použitím způsobu podobného jako v kroku b) k určení titru protilátek, jsou dále převedeny na jinou misku ke klonování. Vhodné klonovací metody zahrnují: metodu limitujícího ředění, při které jsou hybridomy ředěny tak dlouho, až obsahují 1 buňku na jamku destičky, a kultivovány; metodu měkkého agaru, při které jsou kolonie získány po kultivaci v měkkém agarovém médiu; použití mikromanipulátoru při oddělení jednotlivých buněk pro kultivaci; a třídění klonu, při kterém ·· ·· ·· • · · · · • · · · · • » ·· · ··· • · · ··· ·· ·· ·*· · jsou jednotlivé buňky separovány třídičem buněk. Obecně nejjednodušším a běžně používaným způsobem je limitující ředění.

Hybridom myš-myš HFE7A byl vybrán pomocí výše uvedených technik. Jeho specifická příprava je popsána v Příkladech. HFE7A je buněčná linie produkující monoklonální protilátky proti Fas. Je vhodným základem pro přípravu polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu a byla 19. února 1997 uložena v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo podle Budapešťské dohody o ukládání mikroorganizmů a bylo jí přiděleno přístupové ěíslo FERM BP-5828. Při přípravě protilátek za použití HFE7A hybridomu myš-myš proto může příprava probíhat podle postupu začínajícího krokem g), s vynechanými kroky a) až f).

g) Kultivace hybridomu při přípravě monoklonální protilátky

Hybridom získaný v předchozích krocích je dále kultivován spíše v normálním médiu než v HT médiu. Kultivace ve velkém měřítku může být prováděna ve válcovém kultivátoru za použití velkých kultivačních lahví nebo ve spinovém kultivátoru. Supernatant z kultivace ve velkém měřítku je potom sklizen a čištěn vhodným postupem, jako je gelová filtrace, která je dobře známa odborníkům v dané oblasti techniky, aby byla získána monoklonální protilátka proti Fas. Hybridom může být také pěstován intraperitoneálně v syngenní myši, jako je BALB/c myš nebo Nu/Nu myš. Vzniká ascitická tekutina, obsahující velké množství monoklonální protilátky proti Fas. Při čištění sklizených protilátek je výhodné použít komerčně vyráběné sady pro purifikaci monoklonálních protilátek (např. MabTrap GII Kit; Pharmacia).

Monoklonální protilátky připravené výše uvedeným postupem, které byly vytříděny podle specifity k lidskému a myšímu Fas, mají vysokou specifitu k lidskému a myšímu Fas.

h) Stanovení monoklonální protilátky

Určení izotypu a podtřídy získané monoklonální protilátky může být provedeno následovně. Vhodné identifikační metody zahrnují Ouchterlonyho metodu, ELISA a RIA stanovení. Ouchterlonyho metoda je jednoduchá, ale vyžaduje koncentrování použitých roztoků, je-li nízká koncentrace monoklonální protilátky. Je-li použito ELISA nebo RIA stanovení pro identifikaci izotypu a podtřídy monoklonální protilátky, může kultivační supernatant reagovat přímo s antigenem adsorbovaným na pevnou fázi a se sekundárními protilátkami, které mají • ·· · • » · · *······· ··· ♦· ♦ ·

..........*.....

specifitu pro různé imunoglobulinové izotypy a podtřídy. Obecně je však upřednostňováno použití komerční sady pro identifikaci, jako je Mouše Typer Kit (obchodní značka; BioRad).

Kvantifikace proteinu může být prováděna metodou Folin/Lowryho, např. výpočtem z absorbance při 280 nm [1.4 (OD₂8o) = Imunoglobulin 1 mg/ml].

Identifikace epitopu Fas, který monoklonální protilátka rozeznává, může být provedena následovně. Nejprve jsou připraveny různé dílčí struktury Fas. Dílčí struktury mohou být připraveny synteticky, např. syntézou oligopeptidů, nebo in vivo za použití vhodného hostitele, např. E. coli, který byl transformován vhodným vektorem se zabudovanou DNA kódující požadované fragmenty. Obě metody jsou často používány v kombinaci pro identifikaci epitopu, který je rozpoznáván oblastí vazby epitopu. Např. řada polypeptidů o zkrácené délce, které pracují od C- nebo N-konce antigenového proteinu, může být připravena technikami genového inženýrství, které jsou dobře známy odborníkům v dané oblasti techniky. Určením, které fragmenty reagují s protilátkou, lze získat přibližnou představu o epitopovém místě.

Epitop může být ještě blížeji identifikován syntézou řady menších oligopeptidů, které odpovídají částem nebo mutantům peptidu, nebo peptidú, rozpoznaných protilátkou. Pro přípravu těchto menších fragmentů je obecně používána syntéza oligopeptidů. Identifikace epitopu může být potom provedena pomocí studií vazeb nebo studiemi o kompetitivní inhibici s rekombinantním lidským Fas fuzním proteinem v ELISA stanovení. Vhodně mohou být použity komerčně vyráběné sady, jako je SPOTs Kit (Genosys Biotechnologies, Inc.) a řada sad na multipinovou peptidovou syntézu, založenou na metodě syntézy multipinu (Chiron Corp.).

DNA kódující těžké a lehké řetězce výše připravené monoklonální protilátky proti Fas může být získána přípravou mRNA z hybridomových buněk, produkujících monoklonální protilátky proti Fas, konverzí mRNA do cDNA reverzní transkripcí a izolací DNA kódující těžké a/nebo lehké řetězce protilátky. Tato DNA může být použita pro tvorbu polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu.

Extrakce mRNA může být provedena za použití např. systému thiokyanát-horký fenol nebo guanidinium thiokyanát-guanidinium HCI, avšak upřednostňuje se použití systému guanidinium thiokyanát-chlorid česný. Příprava mRNA z buněk je obecně prováděna nejprve přípravou celkové RNA a poté purifikací mRNA z celkové RNA za použití poly(A)⁺RNA

• 0· 00 00

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 ·

0 0 000 »0« • 0 0 0 0000000 00 ·· purifikační matrice, jako jsou oligo(dT) celulóza a oligo(dT) latexová zrnka. mRNA může být případně připravena přímo z lyzátu buněk za použití takovéto matrice. Způsoby přípravy celkové RNA zahrnují: odstředění v zásaditém sacharózovém hustotním gradientu [Dougherty, W.G. a Hiebert, E., (1980), Virology, 101,466-474]; způsob za použití systému guanidinium thiokyanátfenol; způsob za použití systému guanidinium thiokyanát-trifluorocesium; a způsob fenolové lýze. Způsob, který je v současné době nejvíce upřednostňován, používá guanidinium thiokyanát a chlorid česný [Chirgwin, J.M., a kol., (1979), Biochemistry, 18, 5294-5299].

Takto získaná poly(A)⁺RNA může být použita jako templát v reakci reverzní transkripce při přípravě jedno vláknové cDNA [(ss) cDNA]. (ss) cDNA, získaná použitím reverzní transkriptázy (viz. výše), může být dále převedena na dvouvláknovou (ds) cDNA. Vhodné způsoby získání ds cDNA zahrnují použití Sl nukleázy [Efstratiadis, A., a kol., (1976), Cell, 7, 279-288], metodu Gubler-Hoffmana [Gubler, U. a Hoffman, B.J., (1983), Gene, 25, 263-269] a metodu Okayama-Bergovu [Okayama, H. a Berg, P., (1982), Mol. Cell. Biol., 2, 161-170]. V současnosti upřednostňovaný způsob však zahrnuje polymerázovou řetězovou reakci [PCR Saiki, R.K., a kol., (1988), Science, 239, 487-491, začleněno zde v odkazech], která používá jedno vlákno vou cDNA jako templát. Proto je upřednostňovaný postup označován jako RTPCR, protože zahrnuje reverzní transkripci a PCR.

Výše získaná dvouvláknová cDNA může být dále integrována do klonovacího vektoru a výsledný rekombinantní vektor může být potom použit pro transformaci vhodného mikroorganizmu, např. E. coli. Transformant může být selektován za použití standardní metody, jako je selekce na tetracyklinovou nebo ampicilinovou rezistenci, kódovanou rekombinantním vektorem. Je-li použita E. coli, může být transformace provedena Hanahanovou metodou [Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580, začleněno zde v odkazech]. Rekombinantní vektor může být případně zaveden do kompetentních buněk, připravených spolupůsobením chloridu vápenatého a buď chloridu hořečnatého nebo chloridu rubného. Je-li jako vektor použit plasmid, je vysoce žádoucí, aby plasmid nesl gen pro rezistenci na lék, jak bylo zmíněno výše, aby byla usnadněna selekce. Selekce hrubou silou je možná, ale nedoporučuje se. Přestože byly diskutovány plasmidy, bude oceněno, že mohou být použity i jiné klonovací nosiče, jako jsou lambda fágy.

Pro výběr těch transformantů, které nesou cDNA kódující podjednotku požadované protilátky proti lidskému Fas, mohou být použity různé způsoby, jako např. ty níže popsané. Je-li • fl flfl

flflfl flflflfl • flfl · • flfl fl ·« · flflfl flfl požadovaná cDNA specificky amplifikována pomocí RT-PCR, mohou vynechány.

být tyto kroky (1) Testování pomocí polymerázové řetězové reakce

Byla-li objasněna celá aminokyselinová sekvence nebo její část, mohou být syntetizovány kódující a komplementární oligonukleotidové primery k odděleným nepřilehlým částem aminokyselinové sekvence. Tyto primery mohou být použity při polymerázové řetězové reakci [Saiki, R.K., a kol. (1988), Science, 239, 487-491] k amplifikaci požadovaného fragmentu DNA, kódujícího podjednotku myší monoklonální protilátky proti lidskému Fas. Templát DNA použitý při PCR může být např. cDNA syntetizovaná reverzní transkripcí z mRNA hybridomu, produkujícího monoklonální protilátku HFE7A proti lidskému Fas (FERM BP-5828).

Takto syntetizovaný fragment DNA může být buď přímo integrován do plasmidového vektoru, např. použitím komerční sady, nebo může být označen např. ³²P, ³⁵S nebo biotinem a dále použit jako próba pro hybridizaci kolonií nebo polí, ze kterých se získá požadovaný klon.

Sklizení DNA kódující každou podjednotku monoklonální protilátky proti lidskému Fas z výše získaného příslušného transformantu může být provedeno známými technikami, jak je popsáno Maniatisem, T., a kol. [v Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982), začleněno zde v odkazech], Např. oblast DNA kódující požadovanou podjednotku může být odstraněna z plasmidové DNA po oddělení frakce odpovídající vektorové DNA od transformantu, který nese nezbytný plasmid.

(2) Testování pomocí syntetické oligonukleotidové próby

Byla-li objasněna celá aminokyselinová sekvence požadovaného proteinu nebo její část, může být pro konstrukci oligonukleotidové próby použita kratší přilehlá sekvence, která je též reprezentantem požadovaného proteinu. Próba kóduje aminokyselinovou sekvenci, ale díky degeneraci genetického kódu může být připraven velký počet prób. Proto bude normálně vybrána aminokyselinová sekvence, která může být kódována pouze omezeným počtem oligonukleotidů. Počet oligonukleotidů, které je nezbytné vyrobit, může být dále snížen nahrazením inosinu tam, kde lze použít kteroukoli ze čtyř normálních bází. Próba je dále vhodně označena, např. ³²P, ³⁵S nebo biotinem, a je s ní provedena hybridizace denaturované, ···· • ·· ·· ·· *· * ··· ·»·· t « · »···· • · · · · » ·· ··· ··· ·· · . · ··· “ ........ ‘· transformované DNA z transformantů, která byla imobilizována na nitrocelulózový filtr. Pozitivní kmeny se objeví při detekci značení na próbě.

Kdykoli je to vhodné, mohou být DNA sekvence sekvenovány různými technikami známými v dané oblasti techniky, např. technikou chemické modifikace podle Maxama a Gilberta [Maxam, A.M. a Gilbert, W. (1980) v Methods in Enzymology 65, 499-276] a dideoxy- řetězcovou terminační metodou za použití Ml 3 fágu [Messing, J. a Vieira, J. (1982), Gene, 19, 269-276]. V poslední době byla široce akceptována další metoda sekvenování DNA, která zahrnuje použití fluorogenního barviva místo běžného radioizotopu u dideoxy-metody. Celý postup je řízen počítačem, včetně čtení nukleotidové sekvence po elektroforéze. Vhodným přístrojem pro tento způsob je např. Perkin-Elmer Sequence robot CATALYST 800 a PerkinElmer model 373A DNA sekvenátor. Použití této techniky činí stanovení DNA nukleotidové sekvence jak účinným tak bezpečným.

Použitím takových technik, jaké byly popsány výše, může být stanovení DNA sekvence prováděno účinně a bezpečně. Na základě dat takto určených nukleotidových sekvencí DNA podle předmětného vynálezu a odpovídajících N-koncových aminokyselinových sekvencí těžkých a lehkých řetězců mohou být určeny celé aminokyselinové sekvence těžkých a lehkých řetězců monoklonální protilátky podle předmětného vynálezu.

Např. monoklonální protilátka HFE7A, která je vhodná pro poskytování CDR oblastí pro začlenění do polidštěné protilátky podle předmětného vynálezu, je molekula imunoglobulinu G1 (IgGl) a je tak komplexem, složeným z podjednotek yl těžkého řetězce a κ lehkého řetězce. Výhodné způsoby určení částečné aminokyselinové sekvence těchto podjednotek zahrnují např. izolaci podjednotek vhodnými technikami, jako je elektroforéza nebo kolonová chromatografie, a dále analýzu podjednotek pomocí např. automatizovaného sekvenátoru proteinů (např. PPSQ10, Shimadzu Seisakusyo, K.K.).

Těžké a lehké řetězce imunoglobulinu se skládají z variabilní oblasti a konstantní oblasti; variabilní oblast každého řetězce se skládá ze tří CDR oblastí a čtyř rámcových oblastí lemujících CDR oblasti.

Aminokyselinová sekvence konstantní oblasti je konstantní pro jakoukoli danou podtřídu, bez ohledu na rozpoznávaný antigen. Na druhé straně, aminokyselinová sekvence variabilní ···· • ·· ·· ·· ·· · ···· · · · · • · · ····· • · · · · · ··· ··· • · · · · · ·

................

oblasti, alespoň pro CDR oblasti, je specifická pro každou protilátku. Srovnávacími studiemi za použití dat aminokyselinových sekvencí početných protilátek však bylo zjištěno, že jak pozice CDR oblastí tak délky rámcových sekvencí jsou zhruba podobné mezi podj ednotkami protilátek, které patří do stejné podskupiny [Kabat, E.A., a kol., (1991), v Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II, U.S. Department of Health and Human Services, začleněno zde jako odkaz]. Proto mohou být porovnáním aminokyselinových sekvencí těžkých a lehkých řetězců monoklonální protilátky HFE7A proti Fas se známými aminokyselinovými sekvencemi určeny v každé z výše stanovených aminokyselinových sekvencích např. CDR oblasti a rámcové oblasti, stejně jako pozice konstantní oblasti.

Příležitostně bylo zjištěno, že délka FRHi, tzn. nejvíce N-koncová rámcová oblast těžkých řetězců, byla kratší než normální délka 30 aminokyselin. Např. nejkratší známý FRHi v myším IgGl stejného podtypu jako HFE7A má délku pouhých 18 aminokyselin [Kabat a kol., ibid.]. Proto bude u protilátky podle předmětného vynálezu oceněno, že délka části celé molekuly, která odpovídá FRHi, může mít vhodnou délku, obvykle mezi 18 a 30 aminokyselinami, ale výhodněji asi 30 aminokyselin, za předpokladu, že nezbytná vazebná aktivita Fas není ztracena. Zjistili jsme, že aktivita může zůstat zachována i bez začlenění FR do polidštěné protilátky.

Trojrozměrná struktura Fas vazebné oblasti je převážně určena sekvencemi ve variabilních oblastech, podporovanými konstantními oblastmi. Rámcové oblasti poskytují strukturu CDR oblastem, ketré jsou chemicky a strukturně konfigurovány tak, aby interagovaly s antigenem. Proto může být existující protilátka nebo její část, která rozpozná jiný antigen než Fas, vybrána a modifikována vhodnou změnou CDR oblastí v souladu s výše uvedenými návody tak, aby rozpoznala Fas (viz. např. U.S. patent publication 5,331,573). Aby bylo zachováno co nejvíce vazebné aktivity, je obecně upřednostňován výběr akceptorových řetězců, které mají největší podobnost s donorovými řetězci. Takto modifikované peptidy jsou užitečné v předmětném vynálezu pro prevenci nebo léčbu onemocnění spojených s abnormalitami systému Fas/Fas ligand.

Konstrukce mutantu, kde je jedna nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci odstraněno, může být prováděna např. kazetovou mutagenezí (Toshimitsu Kishimoto, ShinSeikagaku jikken Kouza 2; Kakusan III Kumikae DNA Gijutsu, 242-251).

DNA sekvence mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem, je jich známo mnoho. Vhodnou technikou, zvláště pro kratší sekvence, je chemická syntéza za použití běžného způsobu, jako je metoda triesteru kyseliny fosforité [Hunkapiller,, M., a kol., (1984), Nátuře, 310, 105-111]. Výběr kodónů pro jakoukoli aminokyselinu může být proveden z kterýchkoli rozpoznaných kodónů, odpovídajících požadované aminokyselině a tento výběr může být náhodný nebo může být brána v úvahu četnost daného kodónů v hostiteli nebo protože je možné vytvořit restrikční místo vhodnou selekcí bez nutné změny aminokyselinové sekvence. Částečná modifikace nukleotidové sekvence může být dosažena běžnými technikami pro místně specifickou mutagenezi za použití syntetických oligonukleotidových primerů, kódujících požadované modifikace [Mark, D.F., a kol., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666].

Hybridizace DNA pomocí DNA, kódující těžký nebo lehký řetězec monoklonální protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu, může být provedena např. za použití vhodného fragmentu DNA podle vynálezu, značeného např. (a-³²P) dCTP, jako próby metodou náhodného primeru [Feinberg, A.P. a Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem., 132, 6-13] nebo metodou vrubového překladu [Maniatis, T., a kol., (1982), v Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY], Vhodná technika je následující.

Nejprve je potenciálně hybridizující DNA adsorbována na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu a, je-li to nezbytné, vystavena alkalickému působení, a poté je fixována zahřátím nebo ozářením UV světlem. Při výhodném způsobu je membrána dále ponořena do prehybridizačního roztoku, obsahujícího 6 x SSC (1 x SSC ve vodném roztoku 0.15 M NaCl a 0.015 M trisodnou sůl kyseliny citrónové), 5 objem. % Denhardtova roztoku a 0.1 objem. % dodecylsulfátu sodného (SDS), a inkubována při 55 °C po dobu 4 h nebo více. Dále je předem připravená próba rozpuštěna v podobném prehybridizačním roztoku na konečnou specifickou aktivitu 1 x 10⁶ cpm/ml a inkubována při 60 °C přes noc. Membrána je poté opakovaně promyta při laboratorní teplotě pomocí 6 x SSC po dobu 5 minut, dále 2 x SSC po dobu 20 minut a je podrobena autoradiografii.

Pomocí této techniky je DNA hybridizovatelná pomocí DNA, kódující těžký nebo lehký řetězec monoklonální protilátky proti Fas, která může sloužit jako základ pro polidštěnou protilátku proti Fas podle předmětného vynálezu, izolovatelná z jakékoli cDNA knihovny nebo genomické knihovny [Maniatis, T., a kol., (1982), v Molecular Cloning A Laboratory Manual

Cold Spring Harbor Laboratory, NY]. Taková DNA je tvořena v rozsahu předmětného vynálezu, • · · · · · · ··· ·· ........* ** základními parametry hybridizace jsou 6 x SSC a 55 °C, výhodněji 60 °C a ještě výhodněji 70 °C.

Integrace takto získané DNA podle předmětného vynálezu do expresního vektoru umožňuje transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Takovéto expresní vektory budou typicky obsahovat vhodné promotory, replikační místa a sekvence zahrnuté v expresi genu a tím umožňují expresi DNA v hostitelské buňce.

Vhodné prokaryotické hostitelské buňky zahrnují např. E. coli (Escherichia coli) a Bacillus subtilis. Aby byl požadovaný gen exprimován v takovéto hostitelské buňce, mohou být hostitelské buňky transformovány plasmidovým vektorem obsahujícím replikon, který pochází z druhu kompatibilního s hostitelem a má počátek replikace a promotorovou sekvenci, jako je lac UV5. Tyto vektory mají přednostně sekvence schopné udělit transformované buňce selekční fenotyp.

Vhodným kmenem E. coli je kmen JM109, odvozený od E. coli K12. Vhodné vektory zahrnují pBR322 a pUC řady plasmidů. Vhodné promotory zahrnují laktózový promotor (lac), tryptofan laktózový promotor (trc), tryptofanový (trp) promotor, lipoproteinový (lpp) promotor, lambda (λ) PL promotor a promotor elongačního faktoru polypeptidového řetězce Tu (tufB). Obecně bude oceněno, že předmětný vynález není omezen na použití těchto vektorů, promotorů atd., jak je zde doloženo, a že je dle potřeby možno použít jakýkoli vhodný systém.

Vhodným preferovaným kmenem Bacillus subtilis je kmen 207-25 a upřednostňovaným plasmidem je pTUB228 [Ohmura, K., a kol., (1984), J. Biochem., 95, 87-93], Vhodným promotorem je regulační sekvence α-amylázového genu v Bacillus subtilis. Je-li to žádoucí, může být DNA sekvence, kódující signální peptidovou sekvenci α-amylázy, napojena na DNA podle předmětného vynálezu, aby byla umožněna extracelulární sekrece.

Eukaryotické buňky zahrnují hostitelské buňky z druhů obratlovců a kvasinek. Příkladem použitých buněk obratlovců je opičí buněčná linie COS-1 [Gluzman, Y., (1981), Cell, 23, 175182]. Vhodné kvasinkové hostitelské buňky zahrnují pekařské kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), methylotropní kvasinku (Pichia pastoris) a dělící kvasinku (Schizosaccharomyces pombe). Bude oceněno, že mohou být dle potřeby použity také jiné hostitelské buňky.

• · ··· ·

Obecně je požadováno, aby vhodné expresní vektory pro buňky obratlovců zahrnovaly: promotor, obvykle v pozici upstream exprimovaného genu; místo sestřihu RNA; polyadenylační místo; a transkripční terminační sekvenci, stejně jako jakákoli jiná požadovaná funkční místa, jako např. počátek replikace. Vhodným plasmidem je pSV2dhfř, obsahující SV40 ranný promotor [Subramani, S., a kol., (1981), Mol. Cell. Biol., 1, 854-884], Odborníkům vdané oblasti je však známo mnodo dalších plasmidů.

Vhodnými eukaryotickými mikroorganizmy jsou kvasinky, jako S. cerevisiae a vhodnými expresními vektory pro kvasinky jsou pAH301, pAH82 a Yep51. Vhodné vektory obsahují např. promotor genu pro alkoholdehydrogenázu [Bennetzen, J.L. a Halí, B.D., (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018-3025] nebo karboxypeptidázový Y GAL 10 promotor [Ichikawa, K., a kol., (1993), Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1686-1690]. Je-li to žádoucí, může být DNA sekvence kódující signální peptidovou sekvenci karboxypeptidázy Y napojena na např. DNA, která má být exprimována, aby byla umožněna extracelulární sekrece.

Jsou-li jako hostitel použity COS buňky, zahrnují vektory vhodně SV40 počátek replikace, umožňující autonomní replikaci, transkripční promotor, transkripční terminační signál a místo sestřihu RNA. Expresní vektory mohou být použity pro transformaci buněk jakoukoli vhodnou metodou, např. metodou DEAE-dextran [Luthman, H. a Magnusson, G., (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308], precipitační metodou pomocí fosforečnanu vápenatého [Graham, F.L. a Van der Eb, A.J., (1973), Virology, 52, 456-457] a metodou elektroporace elektrickými pulzy [Neumann, E., a kol., (1982), EMBO J., 1, 841-845],

V upřednostňovaném provedení jsou COS buňky transfektovány dvěma expresními vektory - jedním obsahujícím DNA kódující protein, zahrnující alespoň variabilní oblast těžkého řetězce HFE7A protilátky, přednostně jako část celého polidštěného těžkého řetězce, a druhým obsahujícím DNA kódující protein, zahrnující alespoň variabilní oblast lehkého řetězce HFE7A protilátky, přednostně jako část celého polidštěného lehkého řetězce. Tyto vektory jsou exprimovány současně za vzniku polidštěné rekombinantní protilátky proti lidskému Fas.

Transformanty podle předmětného vynálezu mohou být kultivovány za použití běžných způsobů, požadované proteiny jsou exprimovány buď intra- nebo extracelulámě. Vhodná kultivační média zahrnují různá běžně používaná média a budou obecně vybrána podle zvoleného hostitele. Např., vhodná média pro COS buňky zahrnují RPMI-1640 a Dulbecco • · modifikované Eagle minimální nezbytné médium (DMEM), která mohou být dle potřeby obohacena o zárodečné hovězí sérum (FBS).

Kultivační teplota může být jakákoli vhodná teplota, která výrazně nesnižuje buněčnou schopnost syntézy proteinů a pohybuje se přednostně mezi 32 a 42 °C, nejpřednostněji 37 °C, zvláště pro savčí buňky. Je-li to žádoucí, mohou být kultury vystaveny atmosféře s obsahem 1 až 10 objem. % CO2.

Kmeny transformantů E. coli pME-H a E. coli pME-L, každý z nich transformovaný rekombinantním DNA vektorem pro expresi ve zvířecích buňkách DNA kódující těžké a lehké řetězce monoklonální protilátky proti Fas, užitečné pro přípravu polidštěných protilátek proti Fas podle předmětného vynálezu, byly uloženy 12. března 1997 vKogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou a obdržely přístupová čísla FERM BP-5868 a BP-5867. Proto může být transformací zvířecích buněčných kultur jako je COS-1 rekombinantními vektory, izolovanými z uložených kmenů a kultivovaných buněk transformantů, produkována v kultuře rekombinantní protilátka proti Fas.

Protein exprimovaný transformanty podle předmětného vynálezu může být izolován a purifikován různými známými způsoby dělení podle toho, zdaje protein exprimován intra- nebo extracelulámě a v závislosti na takových parametrech, jako jsou fyzikální a chemické vlastnosti proteinu. Vhodné specifické způsoby dělení zahrnují: působení běžně používaných srážecích činidel pro proteiny; různé způsoby chromatografie, např. ultrafiltraci, chromatografii na molekulovém sítu (gelová filtrace), adsorpční chromatografii, chromatografii na iontoměniči, afinitní chromatografii a kapalinovou chromatografii v uspořádání HPLC; dialýzu; a jejich kombinace.

Použitím výše popsaných způsobů může být požadovaný protein získán ve velkém výtěžku a ve vysoce čisté formě.

Pro optimální polidštění, v tomto případě myší, monoklonální protilátky proti Fas je výhodné začlenit variabilní oblasti do lidské protilátky alespoň tak, že každá celá CDR oblast je inkorporována do lidské protilátky, a přednostně také tak, že významné zbytky FR sekvencí jsou, je-to žádoucí, začleněny do lidské protilátky, aby se zachovalo co nejvíce struktury vazebného místa. Toho může být dosaženo kterýmkoli z následujících tří způsobů:

1. použitím těžkých a lehkých řetězců ze stejné známé lidské protilátky; nebo

2. použitím těžkých a lehkých řetězců, pocházejících z různých lidských protilátek, které mají vysokou homologii sekvencí nebo sdílejí shodné sekvence s řetězci donora, a současně zachováním kombinace podskupin akceptorových řetězců; nebo

3. výběrem FR oblastí těžkých a lehkých řetězců, které vykazují nej vyšší homologii s FR oblastmi donora, z knihovny primárních sekvencí lidských protilátek bez ohledu na kombinaci podskupin.

Takováto samotná selekční metoda, založená na sekvenční homologii, bez dalších omezení umožňuje donoru a akceptoru sdílet alespoň 70 % identických aminokyselin vFR částech. Uznáním tohoto přístupu je s ohledem na známé způsoby možné snížit počet aminokyselin vyčleněných z donora a tím minimalizovat vyvolání HAMA odezvy.

Bude oceněno, že roli aminokyselinových zbytků, které se zřídka vyskytují v donorové podskupině, nelze zcela určitě definovat, protože techniky pro předvídání trojrozměrné struktury molekuly protilátky z její primární sekvence (zde je na ně odkazováno jako na „molekulární modelování“) mají omezenou přesnost. Známé metody, jako je metoda Queena a spolupracovníků (Queen a kol.), neindikují, zda by měly být aminokyselinové zbytky donora nebo akceptora vybrány v takovéto pozici. Výběr akceptorové molekuly na základě samotné sekvenční homologie může výrazně snížit nutnost tohoto typu výběru.

V předmětném vynálezu jsou konstruovány různé polidštěné protilátky. Každý používá jako výchozí bod HFE7A protilátku coby donora. Přesný druh zbytků přenesených do akceptorové molekuly se však liší případ od případu.

Při konstrukci polidštěné protilátky, ve které je jako akceptor použita lidská monoklonální protilátka Eu, je použita výše zmíněná metoda 1) s přenášenými FR oblastmi.

Dále jsme objevili další vylepšení této metody poskytnutím dalšího selekčního postupu, určeného k identifikaci aminokyselin zFR oblastí donora, které jsou důležité při zachování struktury a funkce CDR oblastí donora.

Jakmile je vybrána lidská akceptorová molekula pro daný řetězec, je prováděn následujícím způsobem výběr aminokyselinových zbytků z FR donora, které budou začleněny.

• · · · • · *

Aminokyselinové sekvence donora a akceptora jsou seřazeny. Liší-li se na kterékoli pozici seřazené aminokyselinové zbytky FR oblastí, je nezbytné rozhodnout, které zbytky by měly být vybrány. Vybraný zbytek by neměl interferovat s trojrozměrnou strukturou CDR oblastí pocházejících z donora nebo by na ni měl mít minimální účinek.

Queen a kol. [International Patent Publication č. W090/07861, začleněný zde jako odkaz] navrhl způsob rozhodování o tom, zda bude aminokyselinový zbytek z FR donora začleněn spolu sCDR sekvencí. Podle této metody je aminokyselinový zbytek zFR oblasti začleněn do akceptora spolu s CDR sekvencí, jestliže splňuje alespoň jedno z následujících kritérií:

1. aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptora se zřídka nachází na této pozici v akceptoru, zatímco odpovídající aminokyselina v donoru se běžně nachází na této pozici v akceptoru;

2. aminokyselina se nachází v blízkosti jedné z CDR oblastí; a

3. aminokyselina má atom postranního řetězce přibližně 3 Á od CDR, jak je určeno trojrozměrným modelem imunoglobulinu, a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo CDR polidštěné protilátky.

Zbytek určený výše uvedeným kritériem 2) často zobrazuje charakter kritéria 3). Proto je v předmětném vynálezu kritérium 2) vynecháno a jsou zavedena dvě nová kritéria. Proto by v předmětném vynálezu, kde je začleňován aminokyselinový zbytek z donorové FR spolu s CDR, mělo být splněno alespoň jedno z následujících kritérií:

a) aminokyselina v lidské rámcové oblasti akceptora se zřídka nachází na této pozici v akceptoru, zatímco odpovídající aminokyselina v donoru se běžně nachází na této pozici v akceptoru;

b) aminokyselina má atom postranního řetězce přibližně 3 Á od CDR, jak je určeno trojrozměrným modelem imunoglobulinu, a je potenciálně schopna interagovat s antigenem nebo CDR polidštěné protilátky.

c) aminokyselina se nachází na pozici, která se podílí na určení struktury kanonické třídy CDR;

d) pozice aminokyseliny se nachází na kontaktním povrchu těžkých a lehkých řetězců.

S ohledem na kritérium (a) je aminokyselina definována jako „běžná“, nachází-li se na stejné pozici v 90 % nebo více protilátek stejné podtřídy [Kabat a kol.]. Aminokyselina je definována jako „vzácná“, nachází-li se v méně než 10 % protilátek stejné podtřídy.

····

S ohledem na kritérium (c) může být pozice determinant kanonické třídy jednoznačně určena podle informace poskytnuté Chothiou a spolupracovníky [Chothia a kol.].

S ohledem na kritéria (b) a (d) je nezbytné předem provést molekulární modelování variabilních oblastí protilátky. Přestože může být použit jakýkoli komerčně dostupný software pro molekulární modelování, my upřednostňujeme použití AbM softwaru [Oxford Molecular limited, lne.].

Předpovědi provedené na základě molekulárního modelování mají omezenou přesnost. Proto byla v předmětném vynálezu předpověď struktury získaná molekulárním modelováním porovnána s výsledky rentgenové krystalografie variabilních oblastí různých protilátek.

Je-li použit strukturní model vytvořený molekulárním modelováním (např. AbM software), předpokládá se, že dva atomy jsou ve vzájemném kontaktu prostřednictvím Van der Waalsových sil, je-li vzdálenost mezi dvěma atomy menší než suma jejich Van der Waalsových poloměrů plus 0,5 Á. Vodíková vazba je předpokládána, je-li vzdálenost mezi polárními atomy, jako je amid dusíku a karbonyl kyslíku hlavních a postraních řetězců, kratší než 2,9 Á (průměrná délka pro vodíkovou vazbu) plus 0,5 Á. Je-li vzdálenost mezi dvěma opačně nabitými atomy kratší než 2,85 Á plus 0,5 Á, předpokládá se, že tvoří iontový pár.

Pozice aminokyselin v FR oblasti, které často kontaktují CDR, byly identifikovány na základě dat rentgenové krystalografie variabilních oblastí různých protilátek. Tyto pozice byly určeny bez ohledu na podskupiny. Pro lehké řetězce jsou tyto pozice 1, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36, 46, 48, 49, 58, 69, 71 a 88, pro těžké řetězce 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94 a 103. Výše uvedené číslování aminokyselin je definováno podle Kabata a kol. Tohoto systému číslování je zde dále používáno. Byla-li analyzována stejná data molekulárním modelováním, ukázalo se, že zbytky aminokyselin v těchto pozicích jsou v kontaktu se zbytky aminokyselin CDR oblastí ve dvou třetinách zkoumaných variabilních oblastí protilátek.

Tato zjištění byla použita při definování výše uvedeného kritéria (b). Specificky, je-li jak molekulárním modelováním tak experimentálně rentgenovou krystalografickou analýzou předpovězeno, že pozice aminokyseliny v FR kontaktuje CDR, potom je začlenění • ·· · «9· 999 ·

99 aminokyselinového zbytku donora prioritní. V kterémkoli jiném případě není kritérium (b) zvažováno.

Podobně s ohledem na kritérium (d) indikují data rentgenové krystalografie variabilních oblastí mnoha protilátek, že aminokyselinové zbytky na pozicích 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87 a 98 v lehkých řetězcích a zbytky na pozicích 37, 39, 45, 47, 91, 103 a 104 v těžkých řetězcích se často podílejí na kontaktu mezi těžkými a lehkými řetězci. Je-li molekulárním modelováním předpovězeno, že kterákoli z těchto aminokyselin se podílí na kontaktu mezi těžkými a lehkými řetězci, potom je začlenění aminokyselinového zbytku donora prioritní. V kterémkoli jiném případě není kritérium (d) zvažováno.

Při konstruování polidštěné protilátky na základě akceptora 8E10’CL v příkladech 9-15 je jak těžký tak lehký řetězec protilátky podle předmětného vynálezu tvořen tak, že mohou být začleněny pouze CDR oblasti z HFE7A coby donora. Proto nejsou zvažovány požadavky výše popsané a) až d).

DNA, kódující variabilní oblasti H a L řetězců polidštěné protilátky proti lidskému Fas podle předmětného vynálezu, může být připravena mnoha způsoby.

Podle jednoho způsobu mohou být syntetizovány polynukleotidové fragmenty o délce mezi 60 a 70 nukleotidy, které představují částečné nukleotidové sekvence požadované DNA. Postup syntézy je postaven tak, že konce fragmentů kódujícího vlákna se střídají s konci komplementárního vlákna. Výsledné polynukleotidové fragmenty mohou být navzájem spojeny DNA ligázou. Touto cestou může být získán požadovaný fragment DNA kódující variabilní oblasti H a L řetězců polidštěné protilátky proti lidskému Fas.

Případně může být z lidských lymfocytů izolována DNA kódující celou variabilní oblast akceptoru. Pro zavedení restrikčních míst do oblastí kódujících CDR oblasti donora může být použita např. místně cílená mutageneze. CDR oblasti mohou být potom z akceptora vyštěpeny pomocí vhodného restrikčního enzymu. DNA kódující CDR oblasti donora může být poté syntetizována a připojena do akceptorové molekuly pomocí DNA ligázy.

My upřednostňujeme, aby DNA kódující variabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců požadované polidštěné protilátky proti lidskému Fas byla získána technikou PCR s ··· ·

překrývajícími se prodlouženými konci [Horton, a kol., (1989), Gene, 77, 61-68, zahrnuto zde jako odkaz].

PCR s překrývajícími se prodlouženými konci umožňuje spojit dva DNA fragmenty, z nichž každý kóduje požadovanou aminokyselinovou sekvenci. Pro příklad jsou zde dva fragmenty označeny jako (A) a (B). Je syntetizován kódující primer (C) o 20 až 40 nukleotidech k 5’-oblasti (A), a komplementární primer (D) o 20 až 40 nukleotidech ke 3’-oblasti (B). Jsou nutné dva další primery. Za prvé, chimérický kódující primer (E) o 20 až 30 nukleotidech z 3’oblasti (A) připojený k 20 až 30 nukleotidům z 5’-oblasti (B). Za druhé, je nutný komplementární primer (F), doplňkový ke kódujícímu primeru.

PCR reakce může být prováděna za použití primerů (C) a (F) v kombinaci sDNA templátem, obsahujícím fragment A. To umožní vyrobit DNA produkt, zahrnující 20 až 30 nukleotidů 5’-oblasti (B) napojených na 3’-konec (A). Tento fragment je pojmenován fragment (G).

Podobně může být PCR prováděno za použití primerů (D) a (E) v kombinaci sDNA templátem, obsahujícím fragment B. To umožňuje vyrobit DNA produkt, zahrnující 20 až 30 nukleotidů 3’-oblasti (A) napojených na 5’-konec (B). Tento fragment je pojmenován fragment (H).

Fragmenty (G) a (H) nesou komplementární sekvence 40 až 60 nukleotidů v 3’-oblasti (G) a 40 až 60 nukleotidů v 5’-oblasti (H). PCR reakce může být provedena za použití směsi fragmentů (G) a (H) coby templátu. V prvním denaturačním kroku se DNA stává jedno vlákno vou. Většina DNA se vrací do původní formy v následujícím ochlazovacím kroku. Avšak část DNA utváří heterologní DNA duplex díky spojení (G) a (H) fragmentů v oblasti překryvu sekvencí. V následujícím prodlužovacím kroku jsou přečnívající jednovláknové části opraveny a výsledkem je chimérická DNA, která představuje spojení (A) a (B). Na tento fragment DNA je zde odkazováno jako na (I). Fragment (I) může být namnožen za použití primerů (C) a (D).

V provedení předmětného vynálezu mohou fragmenty (A) a (B) představovat DNA kódující CDR oblasti H a L řetězců myší polidštěné monoklonální protilátky proti lidskému Fas,

DNA kódující FR oblasti lidského IgG nebo DNA kódující sekreční signál lidského IgG.

Kodón nebo kodóny, které odpovídají požadované aminokyselině, jsou známy. Při vytváření DNA sekvence, ze které bude produkován protein, může být vybrán kterýkoli vhodný kodón. Např. může být vybrán kodón na základě použití kodónu hostitele. Částečná modifikace nukleotidové sekvence může být docílena např. standardní technikou místně cílené mutageneze, využívající syntetické oligonukleotidové primery kódující požadované modifikace [Mark, D.F., a kol., (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666]. Použitím vybraných primerů při zavedení specifické bodové mutace nebo mutací může být získána DNA, kódující variabilní oblasti H a L řetězců jakékoli požadované polidštěné protilátky proti lidskému Fas.

Integrace takto získané DNA podle předmětného vynálezu do expresního vektoru umožňuje transformaci prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk. Tyto expresní vektory budou typicky obsahovat vhodné promotory, replikační místa a sekvence, které se podílejí na expresi genu. Tím bude umožněna exprese DNA v hostitelské buňce.

Obecně řečeno, tři kmeny transformantů, nesoucí DNA, která kóduje variabilní oblasti lehkých řetězců polidštěných protilátek proti Fas zmíněné v předmětném vynálezu, ale zde uvedené pouze jako odkaz, kde je lidská monoklonální protilátka 8E10 použita jako akceptor, a to E. coli pHSGMMÓ SANK 73697, E. coli pHSGHM17 SANK 73597, E. coli pHSGHH7 SANK 73497, stejně jako kmen transformantů, nesoucí DNA, která kóduje variabilní oblast těžkého řetězce stejné polidštěné protilátky proti Fas, a to E. coli pgHSL7A62 SANK 73397, byly 22. srpna 1997 uloženy vKogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou a byla jim přidělena přístupová čísla FERM BP-6071, FERM BP-6072, FERM BP-6073 a FERM BP-6074. Dále byly dva kmeny transformantů nesoucí DNA, kódující lehké řetězce stejných polidštěných protilátek proti Fas, stejného E. coli pHSHM2 SANK 70198 a E. coli pHSHH5 SANK 70398, a kmen transformantů nesoucí DNA, kódující těžký řetězec stejné polidštěné protilátky proti Fas, a to E coli pgHPDHV3 SANK 70298, uloženy 26. února 1998 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou a byla jim přidělena přístupová čísla FERM-6272, FERM6274 a FERM BP-6273. Proto může být získána DNA, kódující každou podjednotku proteinu polidštěné protilátky proti Fas, např. izolací plasmidů z těchto uložených kmenů nebo provedením PCR za použití extraktu z uložených kmenů coby templátu. Protilátka podle předmětného vynálezu může být vyrobena expresí DNA, získané modifikací výše uvedených DNA pomocí např. PCR s překrývajícími se prodlouženými konci (viz. výše).

···· ·· · ···

Tři kmeny transformantů, nesoucí DNA, která kóduje variabilní oblasti lehkých řetězců polidštěných protilátek proti Fas podle předmětného vynálezu, a to E. coli pHSGLEU 15-29-1 SANK 72598, E. coli pHSGLEU21-28-8 SANK 72698, E. coli pHSGLEU31-6-2 SANK 72798, stejně jako tři kmeny transformantů nesoucí DNA, kódující variabilní oblast těžkého řetězce stejné polidštěné protilátky proti Fas, a to E. coli pHSGAB580-3-21 SANK 72898, E. coli pHSGHEU222-l-2 SANK 73098, E. coli pHSGHEU223-30-l SANK 72998 byly uloženy 18. září 1998 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou a byla jim přidělena přístupová čísla FERM BP-6512, FERM BP-6511 a FERM BP-6513, FERM BP-6515, FERM BP-6514 a FERM BP-6516. Proto může být získána DNA, kódující každou podjednotku proteinu polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu, např. izolací plasmidu z těchto uložených kmenů nebo provedením PCR za použití extraktu z uložených kmenů coby templátu. Další kmen transformantů nesoucí DNA, kódující těžké řetězce polidštěných protilátek proti Fas podle předmětného vynálezu, a to E coli pgHSHHHl SANK 72198, byl uložen 18. září 1998 v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6510.

Pomocí výše popsané metodologie může být ve vysokých výtěžcích produkována rekombinantní protilátka proti Fas o vysoké čistotě.

Pro kontrolu, zda výše připravená rekombinantní protilátka proti Fas specificky váže Fas, může být provedeno ELISA stanovení v podobném uspořádání, jak bylo výše popsáno pro hodnocení titrů protilátek v imunizovaných myších.

HFE7A protilátka a polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu mají různé funkční vlastnosti a) až f) (viz níže). Každá z nich může být ověřena např. popsanou metodou.

Indukce apoptózy v T buňkách exprimujícíeh Fas

Apoptotická indukční aktivita v T buňkách exprimujícíeh Fas může být stanovena odstraněním thymu myši, které byla podána polidštěná protilátka proti Fas podle předmětného vynálezu (dále je na ni odkazováno jako na „protilátku“), rozrušením thymu, kontaktováním ·· ·· • * · · ··♦ · získaných buněk s T buňkami a protilátkou specifickou pro myší Fas a měřením průtokovou cytometrií poměru buněk, na které se váží obě protilátky.

Zlepšení autoimunitních symptomů u MRL gld/gld myší.

Protilátka je intraperitoneálně podána MRL gld/gld myši. Tyto myši nesou mutaci v genu kódujícím Fas ligand a vykazují symptomy podobné autoimunitním onemocněním [Shin Yonehara (1994), Nikkei Science Bessatsu, 110, 66-77). Protilátka je schopna v mnoha případech zabránit nebo alespoň zlepšit otok končetin, který je jedním ze symptomů podobných autoimunitním chorobám.

Selhání indukce jatemích poruch

Periferní krev je odebrána BALB/c myši, které byla podána protilátka, a jsou měřeny krevní hladiny enzymů transaminázy přeměňující glutamovou kyselinu na oxalacetát (GOT) a transaminázy přeměňující glutamovou kyselinu na pyruvát (GPT) pomocí automatizovaného analyzátoru (např. Model 7250; Hitaschi Seisakusyo, K.K.) s reagencií pro analyzátor (např. transamináza-HRII; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Selhání vyvolávání zvýšené hladiny GOT a GPT v krvi indikuje, že protilátka neindukuje jatemí poruchy při podávání in vivo.

Terapeutický nebo profylaktický účinek na fulminantní hepatitidu

V experimentálním systému, ve kterém je u myši indukována fulminantní hepatitida podáváním monoklonální protilátky Jo2 proti myšímu Fas, mohou být zkoumány účinky podávání výše uvedené protilátky současně s Jo2 nebo po podání Jo2. Protilátky podle vynálezu mohou zabránit do značné míry všem účinkům Jo2 na myš a tím prokazují ochranný účinek na játra.

Preventivní účinek na počátek artritidy indukované kolagenem

Jsou studovány účinky podávání protilátky na myším modelu revmatoidní artritidy vyvolané podáváním emulze obsahující kolagen a Freundovo kompletní adjuvans. Protilátka má profylaktické vlastnosti.

Β Β Β ·

Β Β · Β

ΒΒΒ ΒΒΒ

Β Β

ΒΒ ΒΒ

Indukce apoptózy v synoviálních buňkách pacientů s revmatoidní artritidou

Synoviální buňky, získané z postižené oblasti pacienta s revmatoidní artritidou, jsou kultivovány a je studována životaschopnost buněk za přítomnosti zmíněné protilátky v kultivačním médiu. Překvapivě je inhibována proliferace synoviálních buněk.

Proto protilátky podle předmětného vynálezu, na rozdíl od předchozích známých monoklonálních protilátek proti Fas, nejenom chrání normální buňky, ale také zabíjejí abnormální buňky. Proto jsou užitečnými profylaktickými a terapeutickými prostředky pro onemocnění spojená s abnormalitami systému Fas/Fas ligand.

Schopnost proteinů podle předmětného vynálezu indukovat apoptózu může být vytvořena např. kultivací buněk, jako je buněčná linie lidských lymfocytů HPB-ALL [Morikawa, S., a kol., (1978), Int. J., Cancer, 21, 166-170] nebo Jurkat (American Type Culture č. TIB-1520), v médiu, do kterého byl nebo bude přidán pokusný vzorek. Rychlost přežívání může potom být stanovena pomocí např. MTT stanovení [Green, L.M., a kol., (1984), J. Immunological Methods, 70, 257268].

Protilátky podle předmětného vynálezu mohou být použity v různých farmaceutických přípravcích s ohledem na různá onemocnění spojená s abnormalitami systému Fas/Fas ligand, jako jsou nemoci výše uvedené.

Takový profylaktický nebo terapeutický přípravek může být podáván v různé formě. Vhodné způsoby podávání zahrnují orální podávání ve formě tablet, kapslí, granulí, prášků nebo sirupů, nebo parenterální podávání, jako např. jakoukoli vhodnou formou injekce, včetně intravenózní, intramuskulární a intradermální, infúze nebo čípky. Předmětný vynález proto poskytuje způsoby a terapeutické prostředky pro léčbu výše uvedených stavů. Tyto prostředky typicky zahrnují terapeuticky účinné množství proteinu podle předmětného vynálezu ve směsi s farmaceuticky akceptovatelným nosičem a mohou být podávány jakýmkoli vhodným způsobem, jako je parenterální, intravenózní, podkožní nebo místní podání.

V případě, že daný stav je léčen místně, je upřednostňována aplikace proteinu co nejblíže danému místu. Např., vyskytuje-li se závažná revmatická bolest v hlavních kloubech, může být na těchto místech aplikován protein.

·· ♦· • · » · · • 9 · · * • · 999 999 · · ····

Systémově podávané proteiny podle předmětného vynálezu jsou zvláště výhodně podávány ve formě nepyrogenního, terapeuticky, zejména parenterálně akceptovatelného vodného roztoku. Příprava takových farmaceuticky akceptovatelných proteinových roztoků s ohledem na aspekty, jako je pH, izotonicita, stabilita apod., je dobře známa odborníkům v dané oblasti techniky. Prostředky podle předmětného vynálezu mohou dále zahrnovat další složky, které jsou považovány za vhodné, j ako j sou látky zpožďuj ící růst buněk a j iné léky.

Bude oceněno, že dávkování se bude lišit v závislosti na faktorech, jako je stav, věk a tělesná hmotnost pacienta. Obvykle se však dávkování pro orální podání u dospělých pohybuje mezi 0,1 mg a 1000 mg denně. Tato dávka může být podána jednorázově nebo může být rozdělena do několika dávek. Dávkování pro parenterální podání se typicky pohybuje mezi 0,1 mg a 1000 mg a dávky lze podat ve formě podkožní, intramuskulámí nebo intravenózní injekce (nebo injekcí).

Vhodnou formou orálního podání polidštěné protilátky proti Fas podle předmětného vynálezu je ampule sterilního roztoku nebo suspenze ve vodě nebo farmaceuticky akceptovatelného roztoku. Případně může být do ampulí naplněn sterilní prášek (přednostně připravený lyofilizací polidštěné protilátky proti Fas) a dále pro použití naředěn farmaceuticky akceptovatelným roztokem.

Díky faktu, že protilátky podle předmětného vynálezu používané při léčbě lidí, byly polidštěny, je jejich toxicita velmi nízká.

Předmětný vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady. Bude rozuměno, že rozsah předmětného vynálezu není omezen těmito příklady.

Příklady provedení vynálezu

Odkazový příklad 1

Příprava Fas antigenů

Pro zisk rozpustné verze lidského Fas bez transmembránové domény byl zkonstruován expresní vektor. Tento vektor byl vytvořen tak, aby kódoval fuzní protein (Fas fuzní protein), *· • · • * ··· ···· ·· ·· • · · · • · · • · ·♦· zahrnující extracelulámí doménu lidského Fas fúzovanou s extracelulámí doménou myšího receptorů interleukinu 3 (IL3) [Gorman, D.M., a kol., (1990), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 5459-5463]. DNA kódující lidský Fas luzní protein byla připravena z tohoto vektoru technikou PCR. Konstrukce vektoru a příprava DNA byly následující.

a) Templát

Templáty použité pro PCR při konstruování insertu kódujícího fuzní protein byly dva plasmidy. První plasmid, pME18S-mFas-AIC [Nishimura, Y., a kol., (1995), J. Immunol. 154, 4395-4403], byl DNA expresní plasmidový vektor kódující fuzní protein, zahrnující extracelulámí doménu myšího Fas a extracelulámí doménu myšího receptorů IL3. Druhý plasmid, pCEV4 [Itoh, N., a kol., (1991), Cell, 66, 233-243], nesl cDNA kódující lidský Fas.

b) PCR primery

Byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery:

5'-GGGGAATTCC AGTACGGAGT TGGGGAAGCT CTTT-3' (NI: SEQ ID č. 12 na seznamu sekvencí);

5'-GTTTCTTCTG CCTCTGTCAC CAAGTTAGAT CTGGA-3' (C3N: SEQ ID č. 13 na seznamu sekvencí);

5’-TCCAGATCTA ACTTGGTGAC AGAGGCAGAA GAAAC-3' (N3N: SEQ ID č. 14 na seznamu sekvencí); a

5'-CCCTCTAGAC GCGTCACGTG GGCATCAC-3’ (CTN2: SEQ ID č. 15 na seznamu sekvencí).

Není-li specifikováno jinak, byly všechny oligonukleotidy uvedené v těchto příkladech syntetizovány pomocí automatizovaného DNA syntetizátoru (Model 380B; Perkin Elmer Japan, Applied Biosystems Division) podle instrukcí poskytnutých v návodu [Matteucci, M.D. a Caruthers, M.H., (1981), J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191]. Po syntéze byl každý oligonukleotid (primer) odstraněn z držáku, byl zbaven ochrany a výsledný roztok byl lyofilizován na prášek. Tento prášek byl poté rozpuštěn v destilované vodě a byl skladován při 20 °C až do použití.

c) První fáze PCR «· ·· ·· • · · · · · • · · · · • t ··· ··· • · · ···· ·· ·· ·♦··

i) Fragment DNA, označený HFAS a kódující extracelulámí doménu lidského Fas, byl připraven následovně. PCR byla prováděna za použití LA (Long and Accurate) PCR sady (Takara Shuzo Co., Ltd., Japonsko).

Složení PCR reakčního roztoku:

templát pCEV4 DNA, 20 ng;

primer NI, 0,5 pg;

primer C3N, 0,5 pg;

lOx koncentrovaný LA PCR pufr (dodán se sadou), 25 pl;

dNTP (dodány se sadou), 25 pl; a

LA Taq polymeráza (dodána se sadou), 12,5 jednotek.

Sterilní destilovaná voda byla přidána k roztoku na konečný objem 250 pl. Není-li uvedeno jinak, byly dNTP poskytnuty jako ekvimolární směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP.

PCR reakce probíhala následovně. Roztok byl nejdříve zahříván 2 minuty při 94 °C. Poté byl 30krát opakován cyklus zahřátí 1 minutu při 94 °C, 1 minutu při 55 °C a 2 minuty při 72 °C. Po dokončení tohoto postupu byl reakční roztok zahříván 10 minut při 72 °C (ve všech PCR reakcích popsaných v odkazových příkladech byla teplota regulována pomocí GeneAmp PCR systém 9600; Perkin Elmer, Japonsko).

ii) Fragment DNA, označený MAIC a kódující extracelulámí doménu myšího receptoru IL3, byl připraven následovně.

Složení PCR reakčního roztoku:

templát pME18S-mFas-AIC DNA, 20 ng;

primer A3N, 0,5 pg;

primer CTN2, 0,5 pg;

lOx koncentrovaný LA PCR pufr, 25 pl;

dNTP, 25 pl;

LA Taq polymeráza, 12,5 jednotek a

Sterilní destilovaná voda na doplnění na konečný objem 250 pl.

• ·· · · · · ·· · · · · · ?

• · ·»*· • · » *·· *·· • fcfcfc *

• · »«· ·«·· ► · ·»

PCR reakce probíhala stejně jako bylo popsáno výše.

Takto získané namnožené fragmenty HFAS a MAIC byly odděleně podrobeny nejdříve extrakci fenolem, potom srážení ethanolem [tyto dva postupy jsou definovány níže v příkladu 2 (2) 3) a)] a poté byly purifikované fragmenty podrobeny elektroforéze v 5 %ním polyakrylamidovém gelu. Gel byl obarven ethidium bromidem (1 pg/ml), aby byla DNA viditelná pod UV světlem. Proužky, které obsahovaly požadované fragmenty DNA, byly žiletkou vyříznuty z gelu a DNA byla elektroeluována za použití přístroje Amicon Centriruter vybaveným odstřeďovací zkumavkou s ultrafiltračním zařízením Centricon-10 (Amicon). Po elektroeluci byl eluát z jednotky Centricon-10 slit a DNA byla koncentrována odstředěním 1 hodinu při 7500 g. DNA byla srážena ethanolem a poté rozpuštěna ve 20 μΐ destilované vody.

d) Druhá fáze PCR

Fragment DNA, označený FASAIC a kódující lidský Fas fuzní protein (lidský Fas/myší IL3 receptor), byl připraven následovně.

Složení PCR reakčního roztoku:

templát DNA roztok HFAS, 20 μΐ;

templát DNA roztok MAIC, 20 μΐ;

primer NI, 0,5 pg;

primer CTN2, 0,5 pg;

Ox koncentrovaný LA PCR pufr, 25 pl;

dNTP, 25 pl;

LA Taq polymeráza, 12,5 jednotek a

Sterilní destilovaná voda na doplnění na konečný objem 250 pl.

PCR reakce probíhala stejně jako bylo popsáno v bodě c).

Takto získaný namnožený fragment FASAIC byl nejdříve podroben extrakci fenolem, potom srážení ethanolem a poté byl purifikovaný fragment podroben elektroforéze v 1 %ním polyakrylamidovém gelu. Gel byl obarven ethidium bromidem (1 pg/ml), aby byla DNA viditelná pod UV světlem. Proužek, který obsahoval požadovaný fragment DNA, byl žiletkou vyříznut z gelu a DNA byla elektroeluována za použití přístroje Amicon Centriruter vybaveným ···· • *· • · • <· * • · #··> ·♦·· ·· ·· • « · · • * · · ··· »·· • · · ·» • · • * • ·· zařízením Centricon-10 (viz. výše). Po elektroeluci byl eluát z jednotky Centricon-10 slit a DNA byla koncentrována odstředěním 1 hodinu při 7500 g. DNA byla srážena etanolem a poté rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

e) Konstrukce vektorů

Celá FASAIC DNA získaná v kroku d) byla rozštěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal, extrahována směsí fenol/chloroform (50 obj. % fenolu saturovaného vodou, 48 obj. % chloroformu, 2 obj. % isoamylalkoholu) a srážena etanolem. Výsledná sraženina byla rozpuštěna ve 2 μΐ sterilní deionozované vody.

Dva mikrogramy plasmidu pME18S-mFas-AIC byly rozštěpeny restrikčními enzymy EcoRI a Xbal a defosforylovány [postup defosforylace je definován níže v příkladech 2 (2) 3) a)]. Výsledný fragment DNA byl napojen na výše získanou FASAIC DNA rozštěpenou restrikčními enzymy za použití ligační sady (Takara Shuzo Co., Ltd.). Produkt ligace byl dále použit při transformaci kmene E. coli DH5a (Gibco BRL), jak popsal Hanahan [Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580]. Plasmid byl poté získán z transformovaného kmene E. coli metodou alkalické lýze [Maniatis, T., a kol., (1989), v Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory, NY]. Takto získaný plasmid byl označen phFasAIC2.

Tento plasmid byl poté dále čištěn za použití sady pro přípravu plasmidu ve velkém měřítku (MaxiPrep DNA purification systém, Promega). 20 pg vyčištěné plasmidové DNA bylo sráženo etanolem a sraženina byla rozpuštěna ve 20 μΐ sterilního Dulbecco PBS(-) média (dále je na něj odkazováno jako na PBS; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.).

f) Exprese

COS-1 buňky (American Type Culture Collection CRL-1650) byly pěstovány do semikonfluence v kultivační baňce (kultivační plocha: 225 cm ; Sumitomo Bakelite, K.K.), obsahující Dulbecco modifikované Eagle médium (DMEM; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japonsko) obohacené o 10 obj. % zárodečného telecího séra (FCS; Gibco), při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 obj. % plynného CO2. Růstové médium bylo slito, do baňky byly přidány 3 ml vodného roztoku 5 g/l trypsinu a 2 g/l ethylendiamintetraoctové kyseliny (roztok trypsin-EDTA;

• · · · • · · · · • · ··· ··· • · • · · · · · ·

Sigma Chemicals, Co.) a baňka byla inkubována 3 min. při 37 °C, aby se buňky oddělily od stěny baňky.

Sklizené buňky byly rozpuštěny v PBS, dvakrát promyty PBS a upraveny pomocí PBS na koncentraci 6 χ 10⁷ buněk/ml. 20 μΐ výsledné suspenze buněk (1,2 χ 10⁶ buněk) bylo smícháno s 20 μΐ výše připraveného roztoku plasmidu. Směs byla umístěna do nádoby s elektrodami vzdálenými od sebe 2 mm (Shimadzu Seisakusyo, K.K.). Nádoba byla vložena do aparatury pro genovou transfekci (GTE-1; Shimadzu Seisakusyo, K.K.) a v intervalu 1 s byly aplikovány pulsy o 600 V v trvání 30 ps. Směs buněk a DNA byla přidána k 10 ml DMEM obohaceného o 10 obj. % FCS a inkubována v kultivační baňce (kultivační plocha: 75 cm²) pod atmosférou 7,5 obj. % plynného CO2 při 37 °C po dobu 24 h. Poté byl kultivační supernatant slit a buňky byly promyty DMEM bez obsahu séra. Následně bylo k promytým buňkám přidáno 10 ml DMEM bez séra a směs byla dále inkubována pod 7,5 obj. % plynného CO2 při 37 °C po dobu 24 h. Po této době byl získán supernatant.

Získaný supernatant byl dialyzován proti 10 mM Tris-HCl (pH 8, v dialyzační zkumavce (vyloučení molekulové hmotnosti 12000 až 14000; Gibco BRL) a lidský Fas fuzní protein byl poté dále částečně čištěn za použití FPLC aparatury Pharmacia za následujících podmínek: Kolona: Resource Q column (obchodní značka; průměr (0) 6,4 x 30 mm; Pharmacia)

Eluent: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0);

Průtoková rychlost: 5 ml/min.;

Eluce: NaCl 0,1 M až 0,3 M, lineární gradient ve 30 min.

Eluát byl sbírán v 5 ml frakcích a ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) testem v nich byl stanoven produkt exprese Fas genu, viz. níže. Nejprve bylo 100 μΐ každé frakce odděleně umístěno do jamek mikrotitrační desky s 96 jamkami (Costar) a inkubováno při 37 °C po dobu 1 h. Potom byl roztok odstraněn a destička byla třikrát promyta PBS obsahujícím 0,1 obj. % Tween 20 (PBS-Tween) v množství 100 μΐ na jamku. Po promytí byl přidán PBS, obsahující 2 % hovězího sérového albuminu (BSA), v množství 100 μΐ/jarnku a destička byla inkubována při 37 °C po dobu 1 h.

Po této době byly jamky promyty ještě třikrát PBS-Tween v množství 100 μΐ/jamku, poté bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ roztoku monoklonální protilátky HC proti podjednotce β myšího IL-3 receptoru (1 mg/ml; Igaku Seibutsugaku Kenkyujo, K.K.), zředěné 1:100 roztokem • · · · • · • ··· · · «φ · φ · · φ φ · · ·· · · · ΦΦ····

PBS-Tween a deska byla znovu inkubována při 37 °C po dobu 1 h. Jamky byly třikrát promyty 100 μΐ/jamku roztokem PBS-Tween a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku protilátky proti myšímu imunoglobulinu značené křenovou peroxidázou (Amersham), zředěné 1:2000 roztokem PBS-Tween. Deska byla inkubována při 37 °C po dobu 1 h, poté byla každá jamka znovu třikrát promyta 100 μΐ roztoku PBS-Tween. Potom byl přidán substrát pro křenovou peroxidázu (BioRad) v množství 100 μΐ/jamku a deska byla ponechána stát 5 min. Po této době byla měřena absorbance při 415 nm za použití spektrofotometru pro mikrotitrační desky (Model 450; BioRad). Frakce 19 až 23 včetně, které vykazovaly vysokou absorbanci při této vlnové délce, byly použity pro přípravu surového vzorku lidského Fas fúzního proteinu.

Odkazový příklad 2

Imunizace myší a příprava hybridomu (2-1) Imunizace

Ke vzorku 1 ml roztoku surového lidského Fas fúzního proteinu, získanému výše v odkazovém příkladu 1 (celkové množství proteinu: 100 pg), bylo přidáno 25 μΐ 2 N HCI, 250 μΐ 9 % síranu hlinito-draselného (konečná koncentrace: 1,1 %) a 25 μΐ 2 N NaOH. Výsledná směs byla upravena na pH mezi přibližně 6,5 a 7,0 přídavkem asi 120 μΐ vodného roztoku 10 % hydrogenuhličitanu sodného a ponechána při laboratorní teplotě po dobu asi 30 min. Potom bylo ke směsi přidáno 200 μΐ usmrcené kultury Bordetella pertussis (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; 1,2 x 10¹¹ buněk/ml), aby došlo k aktivaci T buněk. Tato směs byla intraperitoneálně aplikována myši s vyřazeným Fas. Použitá myš byla připravena v souladu s postupem, popsaným Senju a kol. [Senju, S. a kol., (1996), International Immunology, 8, 423]. Po dvou týdnech dostala myš intraperitoneálně druhou injekci pouze surového lidského Fas fúzního proteinu (20 pg proteinu/myš).

(2-2) Fúze buněk

Třetí den po druhé injekci byla myši odebrána slezina, byla vložena do 10 ml média RPMI 1640 bez obsahu séra, (10,4 g/1 RPMI 1640 Nussui 1; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), obsahujícího 20 mM HEPES pufr (pH 7,3), 350 mg/ml hydrogenuhličitanu sodného, 0,05 mM βmerkaptoethanol, 50 jednotek/ml penicilinu, 50 pg/l streptomycinu a 300 pg/ml L-glutamové kyseliny, a byla rozrušena propasírováním orgánu přes síto (Cell Strainer; Falcon) za použití

• · ·

53.....

laboratorní špachtle. Výsledná suspenze buněk byla odstředěna a peletované slezinné buňky byly dvakrát promyty RPMI médiem bez obsahu séra. Promyté buňky byly poté rozpuštěny v médiu RPMI bez obsahu séra a spočítány.

Mezitím byly myelomové buňky NS1 (American Type Culture Collection TIB-18) nakultivovány na buněčnou hustotu nepřesahující lxlO⁸ buněk/ml v médiu ASF104 (Ajimoto,

K.K.), obsahujícím 10 obj. % FCS (Gibco BRL) (ASF médium s obsahem séra), při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Tyto buňky byly také rozrušeny, promyty, rozpuštěny a spočítány.

Množství buněčné suspenze NS1 vypočítané tak, aby obsahovalo 3x10⁷ buněk, bylo smícháno se suspenzí slezinných buněk v množství 3x10⁸ buněk. Výsledná směs byla odstředěna a supernatant byl slit. Během všech následujících kroků fuze buněk byla plastová zkumavka obsahující peletu udržována při teplotě 37 °C v kádince s teplou vodou.

ml 50 % polyethylenglykolů 1500 (Boehringer Manheim) byl pomalu přidán do zkumavky za stálého míchání pelety pomocí špičky pipety. Poté byl pomalu ve dvou dávkách přidán 1 ml média RPMI bez obsahu séra, předem zahřátého na 37 °C, a 7 ml média RPMI bez obsahu séra. Výsledná směs byla poté odstředěna, supernatant slit a za stálého jemného míchání špičkou pipety bylo přidáno 10 ml hypoxanthin-aminopterin-thymidinového média (HAT médium; Boehringer Manheim), obsahujícího 10 obj. % FCS. Bylo přidáno dalších 20 ml HAT média, obsahujícího 10 obj. % FCS, suspenze byla nalita do mikrotitrační desky s 96 jamkami v množství 100 μΐ/jamku a inkubována při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Po 7 nebo 8 dnech bylo médium v jamkách, které vykazovaly nažloutlé zbarvení, nahrazeno 100 μΐ/jamku čerstvého HAT média. Fúzní buňky z těchto jamek byly testovány limitujícím ředěním, jak je popsáno níže.

(2-3) Limitující ředění

Thymy ze 4 až 10 týdnů starých samic BALB/c myší (Japan SLC, Inc.) byly odebrány, rozrušeny na sítu (Cell strainer; Falcon) viz. výše, a rozrušené buňky byly dvakrát promyty hypoxanthin-thymidinovým médiem (ΉΤ médium; Boehringer Manheim), obsahujícím 10 obj. % FCS. Množství thymových buněk, odpovídající množství z jedné myši, bylo rozpuštěno ve 30 ml HT média, obsahujícího 10 obj. % FCS, aby se vytvořila dávkovači buněčná suspenze. Výše • · ·

54.....

získaný (2-2) přípravek fózních buněk byl ředěn touto dávkovači buněčnou suspenzí 10- až 100krát a dále sériově ředěn dávkovači buněčnou suspenzí tak, aby vznikly suspenze s hustotou íuzních buněk 5, 1 a 0,5 buněk/ml. Takto připravené vzorky byly umístěny do jamek mikrotitrační desky v množství 100 μί/jamku a inkubovány 5 dní při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO₂.

(2-4) Testování

WR19L12a buňky [Itoh, N., a kol., (1991), Cell, 66, 233-243] byly namnoženy inkubací v médiu RPMI 1640, obsahujícím 10 obj. % FCS, při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO₂. WR19L12a buňky pochází z myších buněk T lymfomu WR19L (American Type Culture Collection TIB-52) a byly modifikovány tak, aby exprimovaly gen kódující lidský Fas. Suspenze namnožených WR19L12a buněk byla upravena na hustotu lxlO⁷ buněk/ml, stejné podíly 50 μί/jamku byly umístěny do jamek mikrotitrační desky se dnem ve tvaru písmene U (Nunc) a deska byla odstředěna (90 x g, 4 °C, 10 min.). Supernatant byl slit a do jamek bylo za stálého míchání přidáno 50 μί/jamku kultivačního supematantů získaného z kultivace fózních buněk v bodu 2-3.

Výsledné směsi byly ponechány v ledu po dobu 1 h, potom byly odstředěny (90 x g, 4 °C, 10 min.) a supernatant odstraněn. Pelety byly dvakrát promyty pufrem pro průtokovou cytometrii [PBS obsahující 5 obj. % FCS a 0,04 % azidu sodného] v množství 100 μί/jamku. Sekundární protilátka [50 μί fluorescein-5-isothiokyanátem (FITC) značené IgG frakce kozlí protilátky proti myšímu IgG (Organon Technika), 500-krát ředěné] byla přidána k promytým buňkám a směs byla ponechána v ledu po dobu 1 h. Po dalším odstředění (90 x g, 4 °C, 10 min.) a odstranění supematantů byla peleta dvakrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii v množství 100 μί/jamku a buňky byly fixovány přídavkem 50 μί 3,7 %ního roztoku formaldehydu a ponecháním v ledu po dobu 10 min. Po odstředění (90 x g, 4 °C, 10 min.) a odstranění supematantů byly pelety znovu dvakrát promyty pufrem pro průtokovou cytometrii v množství 100 μί/jamku a rozpuštěny v pufru pro průtokovou cytometrii v množství 100 μί/jamku. Takto byly připraveny vzorky pro průtokovou cytometrii.

Intenzita FITC fluorescence buněk v každém vzorku byla měřena v průtokovém cytometru (Epics Elitě; Coulter; excitační vlnová délka: 488 nm; detekční vlnová délka: 530 nm) a fózní buňky byly vybrány ze vzorků, které vykazovaly jasně vyšší intenzitu FITC fluorescence • · · · • ·

• · ·

55.....

(intenzity FITC fluorescence asi 100 až 1000) než kontrolní vzorky WR19L12a buněk, ke kterým nebyl přidán žádný supernatant fúzních buněk (intenzita FITC fluorescence asi 0,3).

(2-5) Klonování

Kroky popsané v kapitole (2-3) a (2-4) byly opakovány 5-krát pro buňky vybrané v postupu (2-4). Tím bylo umožněno vybrat více hybridomových klonů, z nichž každý produkoval jednu protilátku vážící WR19L12a, ale nevážící WR19L. Vazba těchto protilátek na myší Fas byla testována za použití podobného stanovení, jako bylo popsáno v kap. (2-4), ale za použití L5178YA1 buněk. L5178YA1 buněčná linie exprimuje myší Fas. L5178YA1 je buněčná linie, připravená transfekcí L5178Y buněk expresním vektorem myšího Fas. L5178Y buňky (American Type Culture Collection CRL-1722) neexprimují téměř žádný Fas.

Výsledkem tohoto selekčního postupu bylo získání hybridomu myš-myš, nazvaného HFE7A a produkujícího protilátku, která se váže na L5178YA1 buňky, ale ne na L5178Y buňky. Tento hybridom HFE7A byl uložen 20. února 1997 v Kogyo Gijutsuin Seimei Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganizmů a bylo mu přiděleno přístupové ěíslo FERM BP-5828.

Testováním izotypizační sadou monoklonální ch protilátek (Pierce) bylo prokázáno, že podtřída protilátky produkované HFE7A hybridomem myš-myš (zde dále nazývána jednoduše HFE7A),jeIgGl,K.

Odkazový příklad 3

Purifikace HFE7A monoklonální protilátky

Myš-myš hybridom HFE7A získaný v odkazovém příkladu 2 (FERM BP-5828) byl nakultivován na buněčnou hustotu lxlO⁶ buněk/ml inkubací v 1 1 ASF média, obsahujícím 10 obj. % FCS, při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Kultura byla dále odstředěna (1000 rpm, 2 min.) a supernatant byl slit. Peleta buněk byla jednou promyta ASF médiem bez obsahu séra, rozpuštěna v 1 1 ASF média bez obsahu séra a inkubována 48 h při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Potom byla kultura odstředěna (1000 rpm po dobu 2 min.) a byl získán supernatant. Tento supernatant byl umístěn do dialyzační zkumavky (vyloučení molekulové hmotnosti: 12000 až 14000; Gibco BRL) a byl dialyzován proti desetinásobku objemu 10 mM pufru fosforečnanu

···· • · ·

56.....

sodného (pH 8,0). Částečné purifikace IgG z vnitřního roztoku bylo dosaženo za použití zařízení pro kapalinovou chromatografii v uspořádání FPLC (FPLC; Pharmacia) za následujících podmínek:

kolona: DEAE-Sepharose CL-6B (objem kolony 10 ml; Pharmacia);

eluent: 10 mM pufr fosforečnanu sodného (pH 8,0);

průtoková rychlost: 1 ml/min.;

eluce: lineární gradient 1 M NaCl (0 až 50 %, 180 min.).

Eluát byl sbírán v 5 ml frakcích a v každé frakci byl ELISA testem stanoven titr protilátek proti Fas za použití výše připraveného lidského Fas fuzního proteinu.

Nejprve byl roztok surového lidského Fas fuzního proteinu, připraveného v odkazovém příkladu 1, umístěn v množství 100 μΐ/jamku do jamek mikrotitrační desky pro ELISA stanovení. Po inkubaci 1 h při 37 °C byl roztok odstraněn a jamky byly třikrát promyty roztokem PBS-Tween v množství 100 μΐ/jamku. Potom byl přidán PBS, obsahující 2 % BSA, v množství 100 μΐ/jamku a deska byla inkubována 1 h při 37 °C. Potom byly jamky třikrát promyty roztokem PBS-Tween v množství 100 μΐ/jamku, do jamek byly přidány vzorky frakcí a deska byla inkubována 1 h při 37 °C. Po dalším trojnásobném promytí roztokem PBS-Tween v množství 100 μΐ/jamku byla přidána protilátka proti myšímu imunoglobulinu značená křenovou peroxidázou (Amersham), ředěná 1:2000 roztokem PBS-Tween, v množství 100 μΐ/jamku. Směs byla ponechána reagovat 1 h při 37 °C. Potom byla každá jamka třikrát promyta roztokem PBSTween v množství 100 μΐ/jamku. Byl přidán substrát pro křenovou peroxidázu (BioRad) v množství 100 μΐ/jamku a směs byla ponechána 5 min. před čtením absorbance v každé jamce při 415 nm.

Frakce 21 až 30 včetně, které vykazovaly nejvyšší hodnoty absorbance, byly spojeny a aplikovány na dvě purifikační kolony afinitní chromatografie pro protilátky (HighTrap Protein G column, objem kolony 5 ml; Pharmacia). Po promytí kolon ekvilibračním pufrem [20 mM pufr fosforečnanu sodného (pH 7,0), 25 ml/kolonu] byla protilátka eluována elučním pufrem [0,1 M glycin-HCl (pH 2,7)] v množství 15 ml/kolonu. Eluát byl sbírán do zkumavek, z nichž každá obsahovala 1,125 ml 1 M Tris-HCl (pH 9,0), a okamžitě po dokončení eluce byl odstředěn při 3000 x g při 4 °C po dobu 2 h v horní části odstřeďovacího zařízení pro ultrafiltraci (CentriPrep 10; Grace Japan, K.K.). Filtrát získaný na dně zařízení byl slit, do horní části bylo přidáno 15 ml PBS a přípravek byl znovu odstředěn při 3000 x g při 4 °C po dobu 2 h. Stejné kroky byly • · · · ·· · ··· opakovány pětkrát. Páté odstředění bylo zastaveno, když objem roztoku zbývajícího v horní části dosáhl 0,5 ml. Tento objem byl zadržen coby vzorek HFE7A.

Odkazový příklad 4 cDNA klonování (4-1) Příprava poly(A)⁺ RNA

Buňky HFE7A hybridomu myš-myš (FERM BP-5828) získané v odkazovém příkladu 2 byly nakultivovány na buněčnou hustotu lxlO⁶ buněk/ml inkubací v 1 1 ASF média, obsahujícím 10 obj. % FCS při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Tyto buňky byly sklizeny odstředěním a lýzou v přítomnosti roztoku guanidinium thiokyanátu [4 M guanidinium thiokyanát, 1 % Sarcosyl, 20 mM EDTA, 25 mM citrát sodný (pH 7,0), 100 mM 2merkaptoethanol, 0,1 % Antifoam A] a byl získán lyzát. Izolace poly(A)⁺ RNA byla provedena přesně podle návodu popsaném v Molecular Cloning A Laboratory Manual [Maniatis, T., a kol., (1982), 196-198]. Specifičtěji byl postup následující.

Získaný buněčný lyzát byl několikrát nasát a vypuštěn 10 ml injekční stříkačkou s jehlou tloušťky 21. Buněčným lyzátem byly převrstveny 3 ml vodného roztoku 5,7 M chloridu česného, 0,1 M EDTA (pH 7,5) v polyalomemí odstřeďovací zkumavce, pasující do rotoru RPS-40T (Hitachi Seisakusyo, K.K.). Lyzát byl odstředěn při 30000 rpm při 20 °C po dobu 18 h a výsledná peleta byla rozpuštěna ve 400 μΐ destilované vody a podrobena etanolovému srážení. Výsledná sraženina byla znovu rozpuštěna ve 400 μΐ destilované vody, smíchána se stejným objemem směsi chloroform a 1-butanol (4:1). Po dalším odstředění při 5000 rpm po dobu 10 min. byla získána vodná fáze. Tato vodná fáze byla znovu srážena etanolem a sraženina byla rozpuštěna v 600 μΐ destilované vody. Výsledný roztok byl použit jako vzorek celkové RNA.

Poly(A)⁺ RNA byla purifikována z 600 pg (sušiny) výše získaného vzorku celkové RNA chromatografií na oligo(dT) celulóze.

Specifičtěji, celková RNA byla rozpuštěna ve 200 μΐ adsorpěního pufru [0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,1 obj. % dodecylsulfátu sodného (SDS)], zahřáta při 65 °C po dobu 5 min. a aplikována na kolonu oligo(dT) celulózy (Typ 7; Pharmacia), která byla promyta adsorpěním pufrem. Poly(A)⁺ RNA byla eluována z kolony eluěním pufrem [10 mM • 9 • · · · · · • 9 · 9 9

9 999 999

9 9

9999 9· 99

Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05 obj % SDS], Tímto postupem bylo získáno celkem 100 pg frakce poly(A)⁺ RNA.

(4-2) Určení N-koncové aminokyselinové sekvence těžkých a lehkých řetězců HFE7A μΐ roztoku obsahujícího HFE7A protilátku proti lidskému Fas, získanou v odkazovém příkladu 3, bylo podrobeno elektroforéze v SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) za použití koncentrace gelu 12 hmotn. %, konstantního napětí 100 V po dobu 120 min. Po elektroforéze byl gel na 5 min. ponořen do přenosového pufru [25 mM Tris-HCl (pH 9,5), 20 % metanol, 0,02 obj. % SDS]. Potom byly proteiny z gelu přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu (PVDF membrána; velikost pórů 0,45 pm; Millipore, Japonsko), předem inkubovanou v přenosovém pufru, za použití blotovacího zařízení (KS-8451; Marysol) při konstantním napětí 10 V, 4 °C, po dobu 14 h.

Po uplynutí této doby byla PVDF membrána promyta promývacím pufrem [25 mM NaCl, 10 mM pufr boritanů sodného (pH 8,0)], barvena v barvícím roztoku (50 obj. % metanolu, 20 obj. % kyseliny octové a 0,05 % Coomassie Brilliant Blue) po dobu 5 min., aby se vyvinuly proteinové proužky. PVDF membrána byla dále odbarvena roztokem 90 obj. % metanolu a proužky, odpovídající těžkému řetězci (proužek s menší pohyblivostí) a lehkému řetězci (proužek s vyšší pohyblivostí), které byly předem lokalizovány na PVDF membráně, byly vyříznuty a promyty deionizovanou vodou.

N-koncová aminokyselinová sekvence těžkých a lehkých řetězců mohla být nyní určena Edmanovou automatizovanou metodou [Edman, P., a kol., (1967), Eur. J. Biochem., 1, 80] za použití proteinového sekvenátoru s plynnou fází (PPSQ-10; Shimadzu Seisakusyo, K.K.).

Byla určena následující N-koncová aminokyselinová sekvence proužku odpovídajícímu těžkému řetězci:

Gln-Xaa-Gln-Leu-Gln-Gln-Pro-Gly-Ala-Glu-Leu (SEQ ID č. 16 na seznamu sekvencí); a N-koncová aminokyselinová sekvence proužku odpovídajícímu lehkému řetězci: Asp-Ile-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-Gly-Gln-Arg-Ala-Thr-Ile-Ser (SEQ ID č. 17 na seznamu sekvencí).

·· 000·

000 · · ·· ·

0 0 0 0 0

0 0 00· ···

0 ·· • 00 0000 00 00

Porovnání těchto aminokyselinových sekvencí s databází aminokyselinových sekvencí protilátek provedené Kabatem a kol. [Kabat E.A., a kol., (1991), v Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II U.S. Department of Health and Human Services] odhalilo, že těžký řetězec (yl řetězec) a lehký řetězec (k řetězec) HFE7A patřily k podtypům 2b a 3. Na základě těchto objevů byly syntetizovány oligonukleotidové primery, u kterých se dalo předpokládat, že budou hybridizovat s částmi 5'-nepřekládaných oblastí a s konci 3'překládaných oblastí genů, patřících k těmto myším podtypům [Kabat a kol.; Matti Kartinen a kol., (1988), 25, 859-865; a Heinrich, G. A kol., (1984), J. Exp. Med., 159,417-435]: 5'-GACCTCACCA TGGGATGGA-3' (Hl: SEQ ID č. 18 na seznamu sekvencí);

5'-TTTACCAGGA GAGTGGGAGA-3' (H2: SEQ ID č. 19 na seznamu sekvencí);

5'-AAGAAGCATC CTCTCATCTA-3' (LI: SEQ ID ě. 20 ne seznamu sekvencí);

a

5'-ACACTCATTC CTGTTGAAGC-3' (L2: SEQ ID č. 21 na seznamu sekvencí).

(4-3) Klonování cDNA cDNA, kódující těžké a lehké řetězce myší monoklonální protilátky HFE7A proti lidskému Fas, byla klonována kombinací reverzní transkripce a PCR (RP-PCR). Amplifikace byla prováděna na frakci poly(A)⁺ RNA získané z hybridomových buněk produkujících HFE7A, jak bylo popsáno v kap. (4-1). RT-PCR reakce byla prováděna za použití RNA PCR sady (AMV) verze 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.).

a) Reakce s reverzní transkriptázou

Sady oligonukleotidových primerů (5'-koncové a 3'-koncové primery) syntetizovaných v bodě (4-2) byly použity jako páry primerů pro RT-PCR reakci pro těžké a lehké řetězce.

Složení reakční směsi:

poly(A)⁺ RNA (těžký nebo lehký řetězec), 1 pg; 3'-primer (H2 nebo L2), 0,3 pg;

Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM; chlorid draselný, 50 mM; dNTP, 1 mM;

chlorid hořečnatý, 5 mM;

·· · · » · « 4 • · ♦ · « · • · · · « ·* ·« • · · ··· *· inhibitor RNázy (poskytnut se sadou), 0,5 jednotky; reverzní transkriptáza (poskytnuta se sadou), 0,25 jednotky; a redestilovaná voda na doplnění celkového objemu na 20 μΐ.

Reakční směs byla inkubována při 55 °C po dobu 30 min., při 99 °C po dobu 5 min. a při 5 °C po dobu 5 min. Takto zpracovaná RT směs byla dále použita v následující PCR fázi.

b)PCR

Složení reakční směsi:

reakční roztok s reverzní transkriptázou, 20 μΐ;

10-krát koncentrovaný RNA PCR pufr (poskytnut se sadou), 10 μΐ;

roztok chloridu hořečnatého (poskytnut se sadou), 10 μΐ;

Taq polymeráza (poskytnuta se sadou), 2,5 jednotek;

5'-primer (H1 nebo LI), konečná koncentrace 0,2 μΜ; a sterilní deionizovaná voda na doplnění celkového objemu na 100 μΐ.

Roztok PCR reakce byl zahříván 2 min. při 94 °C, potom následoval cyklus 30 s při 94 °C, 30 s při 60 °C a 1,5 min. při 72 °C, opakovaný 28-krát.

Po PCR reakci byly stejné podíly reakčních roztoků podrobeny elektroforéze v 1,5 %ním agarózovém gelu. Bylo zjištěno, že došlo k amplifikaci proužků o velikosti asi 1,4 kbp a 0,7 kbp v reakční směsi při použití primerů pro těžký řetězec a primerů pro lehký řetězec. To potvrdilo, že byla podle předpokladu amplifikována cDNA kódující těžký a lehký řetězec. Proto mohly být amplifíkované PCR reakční roztoky použity v dalším kroku ke klonování amplifikovaných cDNA pomocí TA klonovací sady (Invitrogen). To bylo provedeno následovně.

Odpovídající PCR reakční směs byla spolu s 50 ng pCRII vektoru (poskytnut s TA klonovací sadou) smíchána v 1 μΐ lOx ligázového reakčního pufru [6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidin a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu], do kterého byly přidány 4 jednotky T4 DNA ligázy (1 μΐ). Celkový objem směsi byl upraven sterilní deionizovanou vodou na 10 μΐ a výsledná ligační směs byla inkubována 15 h při 14 °C.

φφφφ •φφ φφφ

Po uplynutí této doby byly přidány 2 μΐ ligační reakční směsi k 50 μΐ kompetentních buněk kmene E. coli TOPÍ OF' (poskytnuty s TA klonovací sadou a nastolení kompetence v souladu s návodem k sadě), do kterých byly přidány 2 μΐ 0,5 M β-merkaptoetanolu. Výsledná směs byla ponechána v ledu po dobu 30 min., potom 30 s při 42 °C a znovu v ledu po dobu 5 min. Potom bylo ke kultuře přidáno 500 μΐ SOC média (2 obj. % tryptonu, 0,5 % kvasničný extrakt, 0,05 % chlorid sodný, 2,5 mM chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukóza) a směs byla inkubována 1 h při 37 °C za stálého míchání.

Kultura byla rozetřena na Petriho misky s L-živným agarem [1 obj. % tryptonu, 0,5 % kvasničný extrakt, 0,5 % chlorid sodný, 0,1 % glukóza a 0,6 % bacto-agar (Difco)], obsahující 100 pg/ml ampicilinu, a misky byly inkubovány přes noc při 37 °C. Jednotlivé kolonie rezistentní vůči ampicilinu byly vybrány, setřeny z misky platinovým očkem a kultivovány přes noc v L-živném médiu, obsahujícím ampicilin v množství 100 pg/ml, při 37 °C za stálého třepání při 200 rpm. Po inkubaci byly buňky sklizeny odstředěním a metodou alkalické lýze byla připravena plasmidová DNA. Takto získané plasmidy byly nazvány pCR-H plasmid (plasmid nesoucí cDNA kódující těžký řetězec HFE7A) nebo pCR-L (plasmid nesoucí cDNA kódující lehký řetězec HFE7A).

(4-4) Analýza nukleotidové sekvence

Nukleotidové sekvence obou cDNA, kódujících těžký řetězec HFE7A (1,4 kbp) a lehký řetězec HFE7A (0,7 kbp), obsažené v plasmidech pCR-H a pCR-L získaných výše v bodu (4-3), byly určeny dideoxy metodou [Sanger, F.S., a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467] za použití analyzátoru genových sekvencí (Model 310 Genetic Analyzer; Perkin Elmer, Japonsko).

Takto určené cDNA nukleotidové sekvence těžkého a lehkého řetězce HFE7A jsou uvedeny jako SEQ ID č. 8 a 10 na seznamu sekvencí. Kompletní aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce HFE7A, kódované cDNA, jsou uvedeny jako SEQ ID č. 9 a 11 na seznamu sekvencí. N-koncová aminokyselinová sekvence HFE7A těžkého řetězce, stanovená výše v bodu (4-1) (SEQ ID č. 16 na seznamu sekvencí), skvěle odpovídala sekvenci aminokyselin č. 1 až 11 v SEQ ID č. 9, s výjimkou jednoho nejistého zbytku. N-koncová aminokyselinová sekvence HFE7A lehkého řetězce (SEQ ID č. 17 na seznamu sekvencí) přesně odpovídala sekvenci aminokyselin č. 1 až 22 v SEQ ID č. 11. Bylo tedy demonstrováno, že NΒΒ ·· ·· ·· Β ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ • Β Β Β Β Β Β Β • ΒΒΒ Β Β ΒΒΒ ΒΒΒ

ΒΒΒ Β Β Β Β

ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ΒΒΒΒ ·· ΒΒ konce zralých proteinů těžkého a lehkého řetězce HFE7A jsou aminokyseliny č. 1 až 11 a č. 1 až 22 v SEQ ID ě. 9 a 11.

Při porovnání aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce s databází aminokyselinových sekvencí protilátek [Kabat E.A., a kol., (1991), v Sequences of Proteins of Immunological Interest Vol. II, U.S. Department of Health and Human Services] bylo zjištěno, že variabilní oblast u těžkého řetězce tvoří aminokyseliny č. 1 až 121 v SEQ ID č. 9, zatímco aminokyseliny č. 122 až 445 tvoří konstantní oblast. U lehkého řetězce tvoří variabilní oblast aminokyseliny ě. 1 až 111 v SEQ ID č. 11, zatímco aminokyseliny č. 112 až 218 tvoří konstantní oblast.

Pozice a sekvence CDR oblastí v aminokyselinových sekvencích variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce HFE7A, jak byly urěeny výše, byly také objasněny porovnáním homologie se stejnou databází aminokyselinových sekvencí protilátek [Kabat E.A., a kol., (1991)]. V této publikace bylo stanoveno, že délky rámcových oblastí ve variabilních oblastech jsou v podstatě stejné a že aminokyselinové sekvence sdílejí stejný charakter s různými protilátkami stejného podtypu. Proto bylo možné porovnáním aminokyselinových sekvencí těžkého a lehkého řetězce HFE7A se sekvencemi stejných podtypů v Kabátově práci identifikovat CDR oblasti HFE7A.

Bylo tedy stanoveno, že v těžkém řetězci HFE7A (SEQ ID ě. 9 na seznamu sekvencí) tvoří aminokyseliny č. 31 až 35 CDRHi, aminokyseliny č. 50 až 66 CDRH2 a aminokyseliny ě. 99 až 110 CDRH3. CDR oblasti lehkého řetězce HFE7A (SEQ ID č. 11 na seznamu sekvení) byly identifikovány jako aminokyseliny ě. 24 až 38 (CDRLi), aminokyseliny č. 54 až 60 (CDRL2) a aminokyseliny č. 93 až 101 (CDRL3).

Odkazový příklad 5

Příprava rekombinantní protilátky (5-1) Konstrukce expresního plasmidu

Rekombinantní expresní vektory pro živočišné buňky byly konstruovány vložením cDNA, kódujících těžký a lehký řetězec HFE7A (klonované v odkazovém příkladu 4), do expresního vektoru pMS18S [Hara, T., a kol., (1992), EMBO J., 11,1875]. Postup byl následující.

• · · ·

• fc· ·* ·· fc·· · · ·· · • · fcfc·· • · · ·«· ··· • · · · ·«····· · * · ·

Nejprve byly syntetizovány oligonukleotidové primery:

5'-GGGGAATTCG ACCTCACCAT GGGATGGA-3' (H3: SEQ ID č. 22 na seznamu sekvencí) a

5'-GGGTCTAGAC TATTTACCAG GAGAGTGGGA-3' (H4: SEQ ID č. 23 na seznamu sekvencí)

Tyto primery sloužily pro zavedení rozpoznávacího místa pro restrikční enzym EcoRI, rozpoznávacího místa pro restrikční enzym Xbal a zavedení terminačního kodónu na 5'-konci a 3'-konci těžkého řetězce cDNA, obsaženého v plasmidu pCR-H.

Byly též syntetiozovány oligonukleotidové primery:

5'-GGGGAATTCA AGAAGCATCC TCTCATCTA-3' (L3: SEQ ID č. 24 na seznamu sekvencí) a

5'-GGGGCGGCCG CTTACTAACA CTCATTCCTG TTGAAGC-3' (L4: SEQ ID č. 25 na seznamu sekvencí).

Tyto primery sloužily pro zavedení rozpoznávacího místa pro restrikční enzym EcoRI, rozpoznávacího místa pro restrikční enzym Notl a zavedení terminačního kodónu na 5'-konci a 3'-konci lehkého řetězce cDNA, obsaženého v plasmidu pCR-L.

Za použití těchto primerů pro těžký a lehký řetězec byla provedena PCR následujícím způsobem.

Složení reakční směsi:

templát (pCR-H nebo pCR-L), 1 pg;

5'-primer (H3 nebo L3), 40 pmol;

3'-primer (H4 nebo L4), 40 pmol;

Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM;

chlorid draselný, 10 mM;

síran amonný, 6 mM;

chlorid hořečnatý, 2 mM;

Triton X-100, 0,1 %;

hovězí sérový albumin, bez obsahu nukleázy, 10 pg/ml;

směs dNTP, 0,25 mM;

nativní Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 5 jednotek; a • •«fl redestilovaná voda na doplnění celkového objemu na 100 μΐ.

PCR teplotní podmínky:

Počáteční zahřátí reakční směsi bylo 2 min. při 94 °C, potom následoval 28-krát teplotní cyklus 30 s při 94 °C, 30 s při 60 °C a 1,5 min. při 75 °C.

Výsledná amplifikovaná DNA byla rozštěpena restrikčními enzymy EcoRI a Xbal (pro těžký řetězec) nebo EcoRI a Notl (pro lehký řetězec) a smíchána s expresním plasmidem pro živočišné buňky pME18S [Hara, T., a kol., (1992), EMBO J., 11, 1875], který byl rozštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Xbal (pro těžký řetězec) nebo EcoRI a Notl (pro lehký řetězec) a defosforylován pomocí CIP [jak je popsáno níže v příkladu 2 (2) 3) c)]. Jeden mikrolitr se 4 jednotkami T4 DNA ligázy byl přidán k 8 μΐ výsledné směsi. Potom byl ke směsi přidán ještě 1 μΐ lOx ligačního reakčního pufru [6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM chlorid hořečnatý, 5 mM chlorid sodný, 7 mM β-merkaptoetanol, 0,1 mM ATP, 2 mM DTT, 1 mM spermidin a 0,1 mg/ml hovězího sérového albuminu] a směs byla inkubována 15 h při 14 °C.

μΐ inkubované ligační reakční směsi byly smíchány s 50 μΐ kompetentních buněk kmene E. coli JM109 o buněčné hustotě 1-2 x 10⁹ buněk/ml (Takara Shuzo Co., Ltd.) a směs byla ponechána v ledu po dobu 30 min., potom 30 s při 42°C a znovu v ledu po dobu 5 min. Potom bylo ke směsi přidáno 500 μΐ SOC média [2 obj. % tryptonu, 0,5 % kvasničný extrakt, 0,05 % chlorid sodný, 2,5 mM chlorid draselný, 1 mM chlorid hořečnatý a 20 mM glukóza] a směs byla inkubována za stálého míchání další hodinu. Potom byly izolovány kmeny transformantů a z nich byla připravena plasmidová DNA podle postupů popsaných v odkazovém příkladu 4 (4-3).

Výsledné plasmidy byly označeny pME-H (expresní plasmidový vektor nesoucí cDNA, která kóduje těžký řetězec HFE7A) a pME-L (expresní plasmidový vektor nesoucí cDNA, která kóduje lehký řetězec HFE7A). Transformantní kmeny E. coli obsahující tyto plasmidy byly označeny jako E. coli pME-H a E. coli pME-L, byly uloženy 12. března 1997 v Kogyo Gijutsuin Seimei-kogaku Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganizmů a byla jim přidělena přístupová čísla FERM BP-5868 a FERM BP-5867.

(5-2) Exprese v COS-7 buňkách ····

4 4 • 9 4

9 4

444 44

4944

Transfekce COS-7 buněk expresními plasmidy pME-H a pME-L získanými v bodu (5-1) byla provedena elektroporací za použití zařízení pro genovou transfekci (ECM600; BTX).

COS-7 buňky (American Type Culture Collection CRL-1651) byly kultivovány do semikonfluentního stavu v kultivační baňce (kultivační plocha: 225 cm²; Sumitomo bakelite, K.K.), obsahující DMEM obohacené o 10 obj. % FCS. Médium bylo slito, k buňkám byly přidány 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma Chemicals Co.) a buňky byly inkubovány 3 min. při 37 °C. Tímto postupem uvolněné buňky byly sklizeny, dvakrát promyty PBS a upraveny pomocí PBS na hustotu 5 x 10⁶ buněk/ml.

Mezitím bylo 20 pg každého z plasmidů pME-H a pME-L, připravených pomocí sady pro přípravu plasmidů ve velkém měřítku (MaxiPrep DNA Purification System; Promega), odděleně sráženo etanolem a rozpuštěno ve 20 pl sterilního PBS. V případě, kdy byly COS-7 buňky transfektovány současně oběma plasmidy, bylo použito 20 pg každého z plasmidů a ty byly rozpuštěny dohromady ve 20 pl sterilního PBS.

pl výše připravené buněčné suspenze (1,2 x 10⁶ buněk) a 20 pl odpovídajícího roztoku plasmidu bylo smícháno a převedeno do nádoby s elektrodami, nastavenými od sebe na vzdálenost 2 mm (BTX). Nádoba byla umístěna do zařízení pro genovou transfekci a byl aplikován puls o 10 ms při 150 V, aby byl poskytnut celkový náboj 900 pF. Směs buněk a DNA v nádobě byla přidána ke 40 ml DMEM obohacenému 10 obj. % FCS a inkubována v plastových miskách pro buněčné kultury pod atmosférou 5 obj. % CO₂ při 37 °C po dobu 24 h. Kultivační supernatant byl slit a buňky byly promyty DMEM médiem bez obsahu séra. Potom bylo do každé plastové misky přidáno 40 ml DMEM média bez obsahu séra a po kultivaci buněk pod atmosférou 5 obj. % CO₂ při 37 °C po dobu 72 h byl získán supernatant.

Za použití výše popsané metody byly získány COS-7 buňky, transfektované buď jedním nebo oběma plasmidy (viz. níže) a byl získán supernatant každého z transformantů:

(A) : pouze pME-H;

(B) : pouze pME-L; a (C) : transfekce pME-H i pME-L.

(5-3) Detekce protilátky proti Fas v supematantu transformantní kultury

Exprese protilátky proti Fas v kultivačních supematantech získaných v (5-2) byla stanovena pomocí ELISA testu způsobem, podobným postupu v odkazovém příkladu 3, a za použití lidského Fas fuzního proteinu coby antigenu. Bylo zjištěno, že produkce protilátky, reagující s lidským Fas fuzním proteinem v kultivačním supematantu, nastane pouze tehdy, jsouli pro transfekci COS-7 buněk použity jak pME-H tak pME-L. [5-2 (C)].

Odkazový příklad 6

Určení epitopu (6-1) ELISA

Fmoc syntézou v tuhé fázi [Carpino, L.A. a Han, G.Y., (1970), J. Am. Chem. Soc., 92, 5748-5749] za použití automatizovaného peptidového syntetizátoru (Model 430A; Perkin Elmer, Japonsko, Applied Biosystems Division) byly syntetizovány následující peptidy:

Arg-Leu-Ser-Ser-Lys-Ser-Val-Asn-Ala-Gln-Val-Thr-Asp-Ile-Asn-Ser-Lys-GlyLeu (Pi: seq xd č. 26 na seznamu sekvencí);

Val-Thr-Asp-Ile-Asn-Ser-Lys-Gly-Leu-Glu-Leu-Arg-Lys-Thr-Val-Thr-Thr-ValGlu (P2: seq id č. 27 na seznamu sekvencí);

Glu-Leu-Arg-Lys-Thr-Val-Thr-Thr-Val-Glu-Thr-Gln-Asn-Leu-Glu-Gly-Leu-HisHis-Asp (P3: seq id č. 28 na seznamu sekvencí);

Thr-Gln-Asn-Leu-Glu-Gly-Leu-His-His-Asp-Gly-Gln-Phe-Cvs-His-Lys-Pro-CysPro-Pro (P4: seq id č. 29 na seznamu sekvencí);

Gly-Gln-Phe-Cys-His-Lys-Pro-Cys-Pro-Pro-Gly-Glu-Arg-Lys-Ala-Arg-Asp-CysThr-val (P5: seq id č. 30 na seznamu sekvencí);

Gly-Glu-Arg-Lys-Ala-Arg-Asp-Cys-Thr-Val-Asn-Gly-Asp-GIu-Pro-Asp-Cys-ValPro-Cys-Gin (P6: seq id č. 31 na seznamu sekvencí);

Asn-Gly-Asp-Glu-Pro-Asp-Cys-Val-Pro-Cys-Gln-Glu-Gly-Lvs-Glu-Tyr-Thr-AspLys-Aia (P7: seq id g 32 _na seznamu sekvencí);

Glu-Gly-Lys-Glu-Tyr-Thr-Asp-Lys-Ala-His-Phe-Ser-Ser-Lys-Cys-Arg-Arg-CysArg (P8: seq id č. 33 na seznamu sekvencí);

His-Phe-Ser-Ser-Lys-Cys-Arg-Arg-Cys-Arg-Leu-Cys-Asp-Glu-Gly-His-Gly-LeuGiu-vai (P9: seq id & 34 na seznamu sekvencí);

Leu-Cys-Asp-Glu-Gly-His-Gly-Leu-Glu-Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-GlnAsn-Thr (pio: seq id č. 35 na seznamu sekvencí);

Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Pheδ?.·

Phe-Cys (Pii: seq idč. 36 na seznamu sekvencí);

Lys-Cys-Arg-Cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-CysAsp-Pro (Pi2: seq id č. 37 na seznamu sekvencí);

Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp-Pro-Cys-Thr-Lys-Cys-Glu-His-Gly-Ileile-Lys (P13: seq id č. 38 na seznamu sekvencí);

Cys-Thr-Lys-Cys-Glu-His-Gly-Ile-Ile-Lys-Glu-Cys-Thr-Leu-Thr-Ser-Asn-ThrLys-Cys (Pi4: seq id č. 39 na seznamu sekvencí);

GlU“Cys-Thr-Iieu-Thr-Ser-Asn-Thr-Lys-Cys-Lys-Glu-Glu-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn (Pis: seq id č. 40 na seznamu sekvencí); a

Ser-Ser-Gly-Lys-Tyr-Glu-Gly-Gly-Asn-Ile-Tyr-Thr-Lys-Lys-Glu-Ala-Phe-Asnval-Glu (Pi6: seq id č. 41 na seznamu sekvencí);

Pl až Pl5 jsou částečné sekvence aminokyselinové sekvence č. 1 až 157 extracelulární domény lidského Fas s navzájem se překrývajícími aminokyselinovými zbytky mezi 9 a 11. P16 je negativní kontrola, která nevykazuje žádnou homologii s lidským Fas.

Pl až P16 byly rozpuštěny ve 48 μΐ dimethylsulfoxidu (DMSO) a každý z nich byl upraven na konečný objem 0,8 ml přídavkem 752 μΐ PBS obsahujícím 1 mM β-merkaptoetanol.

Každý z výše uvedených peptidů odpovídá části extracelulární domény molekuly lidského Fas, avšak s karboxylovou skupinou přidanou na C-konec. Každý z peptidů byl naředěn na 50 pg/ml 0,05 M karbonát-bikarbonátovým pufrem (pH 9,6), obsahujícím 10 mM 2merkaptoetanol, a 50 μΐ každého z nich bylo převedeno do jamky mikrotitrační desky pro ELISA stanovení (Nunc). Destička byla ponechána stát při 4 °C přes noc, aby mohlo dojít k adsorpci peptidů na povrch jamky.

Roztok v jamkách byl slit a každá jamka byla promyta čtyřikrát roztokem PBS-Tween. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ PBS, obsahujícího 1 % hovězího sérového albuminu (A3803; Sigma Chemicals Co.), a destička byla inkubována 1 h při 37 °C. Jamky byly promyty ještě čtyřikrát roztokem PBS-Tween a potom bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ HFE7A nebo CH11 upravených na koncentraci 5 pg/ml v PBS. Destička byla inkubována 1 h při 37 °C a potom byly jamky znovu čtyřikrát promyty roztokem PBS-Tween. Po promytí bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ křenovou peroxidázou značené kozlí protilátky proti myšímu imunoglobulinu (Amersham), naředěné pomocí PBS 1:1000, a deska byla znovu inkubována 1 h φ φ · «φφφ φ · « « • · φ «φφφφ • φφ φ φ φ φφφφφφ • · · φ φ φ φ ••*68.............

při 37 °C. Potom byly jamky čtyřikrát promyty roztokem PBS-Tween. Byl přidán substrát pro křenovou peroxidázu (BioRad) v množství 100 μΐ/jamku a deska byla ponechána stát při laboratorní teplotě po dobu 15 min. před odečtením absorbance každé jamky při 415 nm ve spektrofotometru pro mikrotitrační desky (Corona). Jako pozitivní kontrola sloužil lidský Fas fuzní protein, připravený v odkazovém příkladu 1, použitý namísto syntetického peptidů.

Použitím výše popsaných postupů bylo stanoveno, že pouze jamky s naadsorbovaným Pil vykazovaly vysoké hodnoty absorbance. Tím bylo demonstrováno, že HFE7A specificky váže aminokyselinovou sekvenci obsaženou v Pl 1 (obrázek 3).

(6-2) Identifikace epitopu rozpoznaného HFE7A v Pl 1 pomocí kompetitivního stanoveni

Byly syntetizovány následující peptidy:

His-Gly-Leu-Glu- Val-Glu-Ile-Asn-Cys-Thr (P95: SEQ ID č. 42 na seznamu sekvencí);

Glu-Ile-Asn-Cys-Thr-Arg-Thr-Gln-Asn-Thr (P100: SEQ ID č. 43 na seznamu sekvencí);

Arg-Thr-Gln-Asn-Thr-Lys-Cys-Arg-Cys-Lys (P105: SEQ ID č. 1 na seznamu sekvencí);

Lys-Cys-Arg-cys-Lys-Pro-Asn-Phe-Phe-Cys (Pl 10: SEQ ID č. 44 na seznamu sekvencí);

Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys-Glu-His-Cys-Asp (Pl 15L: SEQ ID č. 45 na seznamu sekvencí); a

Gly-Lys-Ile-Ala-Ser-Cys-Leu-Asn-Asp-Asn (D355-364: SEQ ID č. 46 na seznamu sekvencí).

P95, P100, P105 a P110 jsou částečné 10-ti zbytkové lemující sekvence oblasti (odpovídající aminokyselinám 95 až 128 extracelulární domény lidského Fas) aminokyselinové sekvence, odpovídající Pil v extracelulární doméně lidského Fas, z nichž každý má 5 aminokyselinových zbytků překrývajících se s dalším v pořadí.

Požadovaný peptid Pl 15

Pro-Asn-Phe-Phe-Cys-Asn-Ser-Thr-Val-Cys (Pl 15: aminokyseliny č. 1 až 10 v SEQ ID č. 45 na seznamu sekvencí) • · ·· ·

59·· se překrývá pěti zbytky s 10-ti zbytkovým peptidem P110. Protože se však předpokládala jeho špatná rozpustnost, byly na C-konec Pl 15 přidány 4 zbytky, aby vznikl Pl 15L.

Jako negativní kontrola byl použít peptid D355-364, který nevykazuje žádnou homologii s lidským Fas.

Každý peptid, kromě P115L, byl zcela rozpuštěn v 16 μΐ DMSO a objem byl upraven na 0,8 ml přídavkem 784 μΐ PBS obsahujícího 1 mM 2-merkaptoetanol. P115L byl zcela rozpuštěn ve 48 μΐ DMSO a upraven na konečný objem 0,8 ml přídavkem PBS obsahujícího 1 mM 2merkaptoetanol.

Každý z výše uvedených peptidových roztoků (odpovídajících 200 pg peptidů) byl smíchán s 0,25 pg HFE7A v mikrozkumavce a objem byl upraven na 100 pl přídavkem PBS obsahujícího 1 mM 2-merkaptoetanol. Směs byla inkubována 2 h při 37 °C za stálého míchání při 10 až 20 rpm. Dále následoval přídavek FCS na konečnou koncentraci 5 % a tím byla získána směs peptid-protilátka.

WR19L12a buňky byly kultivovány metodou podobnou postupu popsanému v odkazovém příkladu 2. Buňky byly získány odstředěním a upraveny na hustotu 1 χ 10⁷ buněk/ml RPMI médiem bez obsahu séra. Buněčná suspenze byla převedena na mikrotitrační desku s 96 jamkami se dnem ve tvaru U v množství 100 μΙ/jamku. Deska byla odstředěna při 1000 rpm po dobu 3 min. při 4 °C za použití otočného rotoru pro mikrotitrační desky a po odstředění byl slit supematant. Ke každé peletě bylo přidáno 100 μΐ směsi peptid-protilátka a obsah byl několikrát zamíchán pipetou, jak bylo popsáno výše. Deska byla poté ponechána stát při 4 °C po dobu 30 min. a potom byla odstředěna a supematant slit. Peleta byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ FITC-značené kozlí protilátky proti myšímu IgG (Kappel), ředěné 1:250 pufrem pro průtokovou cytometrii. Obsah jamek byl jemně promíchán pipetováním.

Deska byla ponechána 30 min. ve tmě při 4 °C a poté byla odstředěna a supematant slit. Peleta byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii, který obsahoval 10 hmotn. % neutrálního pufrovaného roztoku formaldehydu (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pro fixaci tkáně. Tento roztok byl desetkrát naředěn PBS, přidán v množství 50 μΙ/jamku a promíchán

lehkým pipetováním. Potom byla deska ponechána ve tmě při 4 °C po dobu 12 h, aby došlo k fixaci buněk.

Buňky byly rozpuštěny v pufru pro průtokovou cytometrii v množství 100 μΙ/jamku, odstředěny a supernatant byl odstraněn. Peleta byla třikrát promyta pufrem pro průtokovou cytometrii a rozpuštěna ve stejném pufru v množství 500 μΙ/jamku. Výsledná suspenze byla analyzována průtokovou cytometrii (Cytoace-150; Nippon Buňko, K.K. - excitační vlnová délka: 488 nm; detekční vlnová délka: 530 nm) a byly vypočteny průměrné intenzity FITC fluorescence na buňku. Průměrné intenzity FITC fluorescence pro každý vzorek byly vypočteny tak, že hodnota bez směsi peptid-protilátka byla brána jako 0 % a hodnota vzorku obsahujícího D355364 jako 100%.

Výše popsaným postupem bylo zjištěno, že P105 je schopen silně inhibovat vazbu mezi HFE7A a buňkami WR19L12a a že P100 a P110, jejichž aminokyselinové sekvence se z 50 % překiývají s P105, inhibují vazbu mezi HFE7A a buňkami WR19L12a asi o 50 % a 60 %. Při použití P95 a P115L, které nemají žádné překrývající se segmenty s P105, nebyla pozorována žádná inhibice (obrázek 4). Na základě těchto výsledků bylo stanoveno, že P105 představuje aminokyselinovou sekvenci, která je schopna inhibovat vazbu mezi HFE7A a lidským Fas a že se tudíž musí epitop pro HFE7A nacházet uvnitř aminokyselinové sekvence reprodukované v P105. Tato aminokyselinová sekvence epitopu je oblastí, která zůstává neměnná u lidského a myšího Fas.

Odkazový příklad 7

Vazba HFE7A na opičí Fas

Aby bylo zjištěno, zda je HFE7A schopna vázat Fas antigen z různých druhů primátů, byl proveden následující test.

Byly odebrány vzorky periferní krve šimpanze (Sanwa Kagaku kenkyujo Kumamoto Primates Park, 40 ml), 20 ml od japonské opice (Macaca fuscatá) nebo opice živící se kraby (Macaca irus) a 3 ml od opice kosmana (čeledi Hapalidaé). Do krevních vzorků byl přidán 1 ml heparinu (Novoheparin; Novo), vzorky byly pomalu převrstveny přes stejný objem Ficol Paque roztoku [(Pharmacia) specifická hustota: 1,077 pro všechny s výjimkou vzorku opice živící se kraby, který měl specifickou hustotu 1,072] a odstředěny při 1700 rpm po dobu 30 min., aby ·· ·· » ♦ · ·

I · · · ·· · ··· • · • · ··

7Γ· byla získána frakce periferních krevních mononukleámích buněk. Tato frakce byla dvakrát promyta Hanksovým vyváženým solným roztokem a rozpuštěna v médiu RPMI 1640 s obsahem 10 hmotn. % FCS na buněčnou hustotu 1 χ 10⁶ buněk/ml. Do výsledné suspenze byl přidán fytohemaglutinin-P (Sigma Chemicals, Co.) na konečnou koncentraci 5 pg/ml a vzorek byl inkubován při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2 po dobu 24 h. Buňky byly dále získány odstředěním, promyty a rozpuštěny v RPMI 1640 médiu, obsahujícím 10 obj. % FCS. Aby došlo k aktivaci získaných buněk, byl k suspenzi přidán interleukin-2 (Amersham) na konečnou koncentraci 10 jednotek/ml. Vzorek byl inkubován při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2 po dobu 72 h.

Množství aktivovaného přípravku vypočtené tak, aby obsahovalo 1 χ 10⁶ aktivovaných lymfocytů, bylo umístěno do zkumavky a rozpuštěno bud’ v 50 μΐ HFE7A (20 μg/ml) nebo v 50 μΐ samotného PBS. Výsledná suspenze byla ponechána stát v ledu po dobu 1 h. Poté byly buňky třikrát promyty 500 μΐ PBS a znovu rozpuštěny v 50 μΐ FITC-značené protilátky proti myšímu IgG (Bioresource) v PBS (20 μg/ml). Tato suspenze byla nechána v ledu po dobu 30 min. a potom byla třikrát promyta 500 μΐ PBS. Za použití buněk suspendovaných v 500 μΐ PBS jako kontrol, byly průtokovým cytometrem (Cytoace; Nippon Buňko, K.K.) měřeny fluorescenční intenzity.

Z fluorescenční intenzity bylo získáno rozmístění počtů buněk a byly vypočteny poměry počtů obarvených buněk k celkovým buňkám. Výsledkem bylo, že pro všechny druhy ve vzorcích bez HFE7A tvořily obarvené buňky méně než 3 %. Avšak ve vzorcích zpracovaných pomocí HFE7A došlo k obarvení alespoň 17 % buněk, maximálně 82 %. HFE7A je tudíž schopna vázat široké spektrum Fas primátů, včetně lidského, proti kterému byla HFE7A původně vytvořena.

Odkazový příklad 8

Apoptotická indukční aktivita HFE7A na myších T buňkách in vivo

500 μΐ samotného PBS nebo 0,05 nebo 0,1 mg HFE7A monoklonální protilátky (v 500 μΐ

PBS) bylo intraperitoneálně podáno skupinám (po třech) 6-týdenních samic C3H/HeJ myší (Japan Clea). 42 h po podání byly myši uspány éterem a byly jim vyjmuty thymy. Thymy byly promyty RPMI médiem obsahujícím 10 obj. % FCS a rozrušeny na sítu pomocí špachtle (Cell • · · · · • · ·· « 999 • 9 9

999 99 999 9999 99 99

Strainer; Falcon). Rozrušené buňky (které prošly sítem) byly dvakrát promyty RPMI 1640 médiem obsahujícím 10 obj. % FCS.

Je-li ve kterémkoli z příkladů odkazováno na promytí více než jednou, není-li uvedeno jinak, rozumí se, že médium, se kterým je promývání prováděno, je vždy nahrazeno čerstvým médiem pro každé promytí.

Výše získané promyté buňky byly spočítány a upraveny na hustotu 1 x 10⁶ buněk v 50 μΐ RPMI 1640 média obsahujícího 10 obj. % FCS. Každá z výsledných suspenzí byla převedena do jamek mikrotitrační desky se dnem ve tvaru U a deska byla odstředěna (90 x g, 4 °C, 10 min.).

Supematanty byly slity a do každé jamky byl přidán jeden z následujících dvou roztoků fluorescenčně značené protilátky v PBS, (a) nebo (b).

(a) 10 μΐ 0,5 mg/ml FITC-značené protilátky proti myšímu CD95 (Fas) (Jo2; PharMingen) a 10 μΐ 0,5 mg/ml fykoerythrinem (PE) značené protilátky proti myšímu CD90 (Thy-1.2; Cedarlane; CD90 je buněčný povrchový antigen exprimovaný pouze na T buňkách);

(b) 10 μΐ 0,5 mg/ml FITC-značené protilátky proti myšímu CD4 (L3T4; PharMingen) a 10 μΐ 0,2 mg/ml fykoerythrinem (PE) značené protilátky proti myšímu CD8 (Ly-2; PharMingen).

Po přidání směsi protilátek byla desky jemně protřepána, aby byl obsah dobře promíchán, a ponechána před odstředěním (90 x g, 4 °C, 10 min.) 1 h v ledu. Po slití supematantu a dvojím promytí buněk pufrem pro průtokovou cytometrii v množství 100 μΐ/jamku byly buňky fixovány přídavkem 3,7 obj. % roztoku formaldehydu v množství 50 μΐ/jamku a deska byla ponechána v ledu po dobu 10 min. Po dalším odstředění (90 x g, 4 °C, 10 min.) byl slit supernatant, pelety buněk byly znovu promyty pufrem pro průtokovou cytometrii v množství 100 μΐ/jamku a rozpuštěny v pufru pro průtokovou cytometrii v množství 100 μΐ/jamku. Takto získané buněčné suspenze z každé jamky byly použity jako vzorky a průtokovým cytometrem (Epics Elitě; Coulter) byla měřena fluorescence vzorků o hustotě 1 x 10⁴ buněk za následujících podmínek: Excitační vlnová délka: 488 nm;

Detekční vlnová délka: 530 nm (FITC) nebo 600 nm (PE).

Bylo připraveno rozmístění fluorescence FITC a PE pro populace buněk v každém vzorku. U vzorků, ke kterým byla přidána směs protilátek (a), byl vypočten poměr počtu buněk, které byly pozitivní na Fas a CD90 (je na ně odkazováno jako na Fas CD90 ), k celkovému poctu • ·· · ··· ·· ··· *♦·* ·* ·· buněk. Podobně u vzorků, ke kterým byla přidána směs protilátek (b), byl vypočten poměr počtu buněk, které byly pozitivní na CD4 a CD8 (je na ně odkazováno jako na CD4⁺CD8⁺) nebo které byly pozitivní na CD4 a negativní na CD8 (CD4⁺CD8‘), k celkovému počtu buněk.

Výsledky jsou ukázány v procentech v tabulce 1.

Tabulka 1

Buňka	Fas+CD90+	CD4+CD8+	CD4CD8
Pouze PBS	76,2	62,6	11,7
HFE7A 0,05 mg	2,3	1,9	1,2
HFE7A 0,1 mg	L7	2,8	0,7

V porovnání se skupinou, které byl podán pouze PBS, byly poměry T buněk exprimujících Fas (Fas⁺CD90⁺) v thymových buňkách myší ze skupin, kterým byla podána HFE7A, výrazně sníženy u obou dávek. Populace buněk CD4⁺CD8⁺ a CD4⁺CD8', u kterých je známa výrazná exprese Fas, byly také výrazně sníženy po podání HFE7A v porovnání se skupinou, která dostala samotný PBS.

Z těchto závěrů bylo tedy odvozeno, že monoklonální protilátka HFE7A proti Fas má apoptotickou indukční aktivitu in vivo na T buňkách exprimujících Fas.

Odkazový příklad 9

Účinky HFE7A na model autoimunitního onemocnění

Účinky podávání monoklonální protilátky HFE7A proti Fas na symptomy autoimunitního onemocnění byly testovány na MRL gld/gld myších. Tyto myši nesou rnutant genu pro Fas ligand a slouží jako zvířecí model autoimunitního onemocnění podobného systémovému lupusu erythematodes.

týdnů starým MRL gld/gld myším (Japan SLC, K.K.) byla intraperitoneálně apl^pvána jedna dávka 0,2 nebo 0,5 mg HFE7A monoklonální protilátky, připravené v odkazovém příkladu (v 500 μΐ PBS), nebo 500 μΐ samotného PBS.

···· * · · · · · · · * · · · ······»« • · · » * · · ··· ·· ··· *··* ·· φφ

U každé pokusné myši byl sledován otok kotníků coby symptomu autoimunitního onemocnění. Stupeň otoku byl vyhodnocen a byl zaznamenáván po celou dobu pokusu u každé skupiny [Shin Yonehara, (1994), Nikkei Science Bessatsu, 110, 66-77], Bylo zjištěno, že po podání HFE7A výrazně klesl stupeň otoku kotníků.

Pokusným myším byly vyjmuty thymy a způsobem popsaným v odkazovém příkladu 8 byly určeny části T buněk, které exprimovaly Fas v thymech. Výsledky ukázaly v souladu s výsledky v odkazovém příkladu 8, že počet T buněk exprimujících Fas v thymech byl po podání HFE7A výrazně snížen.

Odkazový příklad 10

Testování hepatotoxicity

BALB/c myším byla intraperitoneálně aplikována dávka jedné z následujících látek:

i) 0,2 mg HFE7A v 500 μί PBS;

ii) 0,5 mg HFE7A v 500 μΐ PBS;

iii) 0,1 mg Jo2 (Pharmingen) v 500 μΐ PBS; a iv) 500 μΐ samotného PBS

Jo2 je známá protilátka proti myšímu Fas, která má apoptotickou indukční aktivitu. Krev byla myším odebrána ze zadní aorty v intervalech po 8 h, 24 h nebo 72 h po podání. U myší, kterým byla podána Jo2, byla krev odebrána 3 h po podání, dokud byly ještě naživu. Krev byla vždy odebírána v lehké éterové narkóze. Hladiny transaminázy přeměňující kyselinu glutamovou na oxalacetát (GOT) a transaminázy přeměňující kyselinu glutamovou na pyruvát (GPT) v krvi byly měřeny v každém vzorku krve pomocí automatizovaného analyzátoru (Model 7250; Hitachi Seisakusyo, K.K.) s příslušnou reagencií pro analyzátor (Transaminase-HRII; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Skupina, které byla podána Jo2, vykázala rychlé zvýšení hladin GOT a GPT po 3 h, zatímco odpovídající hodnoty u skupin s HFE7A prokázaly malou změnu, stejně jako skupina, které byl podán samotný PBS (obrázek 5). Na základě těchto výsledků bylo stanoveno, že HFE7A neindukovala akutní jatemí poruchy.

Odkazový příklad 11

Účinky na model fulminantní hepatitidy ···· ·· · · · · · «·«<

* · · · · · · · • · ♦ · · · *·· ··« • ♦ · · · · I ··· ·♦ ··· ···· »« ··

Je známo, že u myši se po intraperitoneálním podání protilátky Jo2 proti myšímu Fas rozvine fulminantní hepatitida a že během několika hodin zahyne [Ogasawara, J., a kol., (1993), Nátuře, 364, 806], Aby se tudíž vyhodnotily účinky HFE7A na jatemí poruchy indukované Jo2, byla testována životaschopnost myší při podávání HFE7A současně s podáním Jo2 nebo následně po něm.

6-týdenním samicím BALB/c myší (tři myši v každé skupině; z Japan SLC) byl intraperitoneálně podán následující přípravek protilátky:

(A) 0,1 mg Jo2 v 0,5 ml PBS;

(B) 0,01 mg Jo2 v 0,5 ml PBS;

(C) 0,1 mg Jo2 a 0,5 mg HFE7A v 0,5 ml PBS (současné podání);

(D) 0,1 mg Jo2 a 0,05 mg HFE7A v 0,5 ml PBS (současné podání);

(E) 0,01 mg Jo2 v 0,2 ml PBS a po 20 min. 0,1 mg HFE7A v 0,2 ml PBS;

a myši byly pozorovány. Výsledky jsou ukázány na obrázku 6.

Při podání samotného Jo2 uhynuly všechny myši během 9 h, bez ohledu na to, bylo-li jim podáno 0,1 mg nebo 0,01 mg Jo2. To znamená, že myši ve skupině (A) a (B) všechny uhynuly během 9 h po podání. Byla-li však současně s Jo2 podána také HFE7A (jak 0,5 mg/myš tak 0,05 mg/myš), tzn. skupiny (C) a (D), neprojevily se u myší žádné poruchy dokonce ani po několika týdnech po podání. Bylo tedy prokázáno, že podání HFE7A může blokovat vývoj fulminantní hepatitidy. Myši navíc zůstaly normální, bez zjevných symptomů i v případě, že byla HFE7A podána 20 min. po podání Jo2.

HFE7A má tedy ochranné a terapeutické účinky na různá onemocnění, zahrnující poruchy normální tkáně, které jsou zprostředkovány systémem Fas/Fas ligand, jak v játrech tak v jiných orgánech.

Odkazový příklad 12

Účinky na revmatoidní artritidu

1) Preventivní účinek na rozvoj artritidy vyvolané kolagenem • · · · • ·

• · · · · · • · · · · • · ··· ··· • · · ···· ·· · ·

F1 myši získané pářením samic BALB/c myší a samců DBA/1J myší (CD1F1 myši, 6týdenní samice, Japan Charles River, K.K.) byly ochočeny během 1 týdne. Po této době jim byl aplikován kolagen, který vyvolá artritidu.

Detailněji, metoda byla založena na postupu popsaném v literatuře [Phadke, K., (1985), Immunopharmacol., 10, 51-60], 0,3 % roztok hovězího kolagenu typu II (Collagen Gijutsu Kensyukai, dodávaný v 50 mM roztoku kyseliny octové) byl naředěn na 0,2 % (2 mg/ml) pomocí 50 mM kyseliny octové a poté emulzifikován stejným objemem Freundova kompletního adjuvans (Difco). Tato emulze byla intradermálně podávána v množství 100 μΐ (odpovídá 100 pg hovězího kolagenu typu II) pomocí 1 ml plastové stříkačky s tuberkulinovou jehlou do proximální části ocasu, který byl uchycen v držáku pro aplikaci intravenózních injekcí. 1 týden po této počáteční injekci byla zvířatům stejným způsobem aplikována druhá dávka.

Současně s druhou dávkou bylo intraperitoneálně podáno 100 pg buď HFE7A nebo kontrolního myšího IgG v 0,5 ml PBS (6 myší v každé skupině). Počínaje pěti týdny po počáteční injekci byly vizuálně monitorovány otoky končetin. Stupeň otoku kloubů končetin byl hodnocen stupnicí podle Wooda, F.D., a kol. [Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., (1969), 35, 456-467], Při výpočtu skóre pro každou končetinu byla použita následující kritéria:

Skóre

0: bez symptomů;

1: otok a zarudnutí pouze jednoho z malých kloubů, např. prstu

2: otok a zarudnutí 2 nebo více malých kloubů nebo jednoho relativně velkého kloubu, jako je kotník; a

3: otok a zarudnutí celé končetiny

Maximálního skóre 12 je tedy u zvířete dosaženo při otoku všech čtyřech končetin. Zvíře, u kterého bylo skóre alespoň 1 pro všechny čtyři končetiny, bylo označeno jako postižená myš. Výsledky jsou ukázány na obrázku 7.

V kontrolní skupině, které byl podán nespecifický myší IgG, byly všechny myši postiženy během 7 týdnů po počáteční injekci, zatímco ve skupině, která dostala HFE7A, nevykázala během 8 týdnů polovina myší žádné zarudnutí kloubů (obrázek 7A). Navíc měla skupina léčená HFE7A nižší průměrné skóre v porovnání s kontrolní skupinou (obrázek 7B).

• ·

2) Indukce apoptózy v synoviálních buňkách revmatických pacientů

Byly hodnoceny účinky HFE7A na životaschopnost synoviálních buněk u pacientů s revmatoidní artritidou. Postup je popsán níže s použitím redukční síly mitochondrií jako indexu.

Synoviální tkáň získaná z postižené oblasti pacienta s revmatoidní artritidou byla nůžkami nastříhána na malé kousky v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu (Gibco) obohaceném o 10 obj. % FCS (Summit). Byl odstraněn tuk, potom byla přidána kolagenáza (Sigma Chemical Co.) do konečné koncentrace 5 pg/ml a směs byla inkubována 90 min. při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Výsledné inkubované buňky sloužily po zbytek experimentu jako synoviální buňky.

Takto získané synoviální buňky byly rozděleny na jednotlivé buňky zpracováním s 0,05 % vodným roztokem trypsinu při 37 °C po dobu 2 min. a byly rozpuštěny v Dulbecco modifikovaném Eagle médiu, obsahujícím 10 obj. % FCS, na buněčnou hustotu 1 x 10⁵/ml. Tato suspenze buněk byla nalita do jamek mikrotitrační desky v množství 2 χ 10⁴ buněk/200 μΐ na jamku a inkubována 6 dní při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Kultivační supernatant byl slit a buňky byly třikrát promyty Hanksovým pufrem (Gibco). Po promytí bylo do každé jamky přidáno 200 μΐ Dulbecco modifikovaného Eagle média, obsahujícího 10 obj. % FCS a mezi 10 a 1000 ng/ml HFE7A (sériová desetinásobná ředění). Destička byla inkubována 20 h při 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CO2. Dále bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ vodného roztoku 1 mg/ml XTT (vnitřní sůl 2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxanilidu; Sigma Chemical Co.) a 25 μΜ PMS (fenazin methosulfát; Sigma Chemical Co.) (konečná koncentrace: 250 pg/ml XTT a 5 μΜ PMS). Po dalších 4 h inkubace pri 37 °C pod atmosférou 5 obj. % CCEbyla v každé jamce odečtena absorbance při 450 nm.

Životaschopnost buněk v každé jamce byla vypočtena podle následujícího vzorce:

Životaschopnost (%) = 100 x (a-b) / (c-b),

Kde a je absorbance pokusné jamky, b je absorbance jamky bez buněk a c je absorbance jamky bez přidané protilátky.

Výsledky jsou ukázány v tabulce 2. HFE7A inhibovala přežívání synoviálních buněk od pacientů s revmatizmem v závislosti na dávce.

Tabulka 2

Koncentrace HFE7A (ng/ml)	Průměrná životaschopnost (%)
0	100
10	91
100	77
1000	42

Odkazový příklad 13

Navržení polidštěné verze protilátky HFE7A (1) Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A

Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A bylo prováděno metodou obecně známou jako homologní modelování [Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)].

Primární sekvence variabilních oblastí lidského imunoglobulinu v Protein Data Bank (zde je na ni dále odkazováno jako na PDB; Chemistry Department, Building 555, Brookhaven National Laboratory, P.O. Box 5000, Upton, NY 11973-5000, USA), pro které byla zpracována rentgenová krystalografie, byly porovnány s výše určenými rámcovými oblastmi HFE7A. Výsledkem bylo vybrání 1GGI a 2HFL, které vykazovaly nejvyšší homologii s trojrozměrnými strukturami rámcových oblastí lehkého a těžkého řetězce. Trojrozměrné struktury rámcových oblastí byly vytvořeny kombinováním vlastností 1GGI a 2HFL a výpočtem vlastností oblastí HFE7A a byl tak získán rámcový model.

Pomocí klasifikace popsané Chothiou a kol. byly CDR oblasti HFE7A klasifikovány následovně: CDRL₂, CDRL₃ a CDRHj všechny náleží do kanonické třídy 1, zatímco CDRL_b CDRH₂ a CDRH₃ nespadají do žádné specifické kanonické třídy. CDR smyčkám CDRL₂, CDRL₃ a CDRHi byly přičteny základní konformace jejich odpovídajících kanonických tříd a potom byly začleněny do rámcového modelu. CDRLi byla připsána konformace shluku 15B v souladu s klasifikací Thomtona a kol. [J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)]. Pro CDRH₂ a CDRH₃ byly konformace sekvencí s vysokou homologii vybrány z PDB a tyto byly potom kombinovány s výsledky energetických výpočtů. Konformace CDR smyček s nejvyšší pravděpodobností byly potom začleněny do rámcového modelu.

> · · φ » φ φ φ φφφ φφφ φ φ • · · φ

Aby byl získán celkový molekulární model HFE7A, byly prováděny energetické výpočty za účelem odstranění nežádoucího kontaktu mezi nepatřičnými atomy, ve smyslu energie. Tento postup byl prováděn za použití komerčně dostupného běžného systému molekulárního modelování, AbM (Oxford Molecular Limited, lne.). Může však být použit jakýkoli jiný vhodný systém.

Pro získaný molekulární model byla vyhodnocena přesnost struktury pomocí softwaru PROCHECK [J. Appl. Cryst., (1993), 26, 283-291] a byl vypočten stupeň povrchového vystavení každého zbytku, aby mohlo být určeno, které povrchové atomy a skupiny interagovaly.

(2) Výběr akceptorů

Porovnání shodných sekvencí odpovídajících podskupin lidských protilátek ukázalo, že podskupiny lehkého a těžkého řetězce HFE7A sdílely identitu ze 79 % se podskupinou kIV a také ze 79 % s podskupinou I. Nebyla zde však žádná lidská protilátka mající kombinaci kIV lehkého řetězce a těžkého řetězce podskupiny I. Proto byla jako lidská protilátka, která má lehký a těžký řetězec vykazující identitu vyšší než 70 % s lehkým a těžkým řetězcem HFE7A, vybrána 8E10'CL, která má lehký řetězec podskupiny κΙΙΙ a těžký řetězec podskupiny I, vykazující sekvenční identitu 72 % a 77 % s lehkým a těžkým řetězcem HFE7A.

(3) Výběr donorových zbytků, které mají být začleněny do akceptorů

Pomocí softwaru Cameleon (Oxford Molecular Limited, lne.) byly aminokyselinové sekvence každého lehkého a těžkého řetězce HFE7A seřazeny do řady se sekvencemi odpovídajícího řetězce 8E10'CL a polidštěné sekvence variabilních oblastí byly vytvořeny podle popisu v následujících příkladech v souladu s obecnými pokyny uvedenými v výše bodě a) až e). Byly konstruovány plasmidy, které mohly sloužit jako rekombinantní vektory zahrnující DNA nukleotidové sekvence kódující polidštěné protilátky proti lidskému Fas.

Odkazový příklad 14

Příprava DNA kódující polidštěný lehký řetězec (1) Klonování cDNA kódující kompletní lidský lehký řetězec (κ řetězec) »· «♦ • · · · · • · · · · • · · · · · ♦ · » · ·

Před polidštěním aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky HFE7A proti lidskému Fas bylo nejprve provedeno klonování cDNA pro lehký řetězec lidského imunoglobulinu zahrnující konstantní oblast.

1) Syntéza primerů

Separace cDNA kódující lidský lehký řetězec byla provedena pomocí PCR. Pro PCR byly syntetizovány následující dva primery:

5'-GCGAATTCTG CCTTGACTGA TCAGAGTTTC CTCA-3' (HVKII5-4: SEQ ID č. 47 na seznamu sekvencí); a

5-GCTCTAGATG AGGTGAAAGA TGAGCTGGAG GA-3' (HKCL3-3: SEQ ID č. 48 na seznamu sekvencí).

2) Konstrukce plasmidu obsahujícího cDNA pro lehký řetězec lidského imunoglobulinu

Pomocí PCR byla připravena cDNA kódující kompletní lehký řetězec lidského imunoglobulinu. cDNA byla vložena do plasmidu a klonována do E. coli.

Za následujících podmínek byl připraven HL-DNA fragment kódující kompletní lehký řetězec lidského imunoglobulinu:

Složení PCR reakční směsi:

lidská lymfocytová cDNA knihovna (Life Technologies), 25 ng;

oligonukleotidový primer HVKII5-4, 50 pmol;

oligonukleotidový primer HKCL3-3, 50 pmol;

mM směs dNTP, 10 pl;

100 mM Tris-HCl pufr (pH 8,5), 10 μΐ;

M chlorid draselný (KC1), 5 μΐ;

mM chlorid hořečnatý (MgCE), 10 μΐ;

Taq DNA polymeráza (Perkin Elmer Japan), 1 jednotka;

Redestilovaná voda na doplnění objemu na 100 μΐ.

• · · · · · ·· ·· · · • · · · · · · · · · · • · · ····· • · « · · · ··· ··· • · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

PCR reakce probíhala následovně. Roztok byl nejprve zahříván 2 min. při 94 °C. Potom následoval cyklus zahřívání 2 min. při 94 °C, 1 min. při 55 °C a 2 min. při 72 °C, opakovaný třicetkrát. Po dokončení tohoto postupu byla reakční směs zahřívána 10 min. při 72 °C.

Takto připravený fragment HL-DNA (DNA pro lidský lehký řetězec) byl vložen do plasmidu pCR3DNA za použití eukaryotní TA klonovací sady (Invitrogen) podle protokolu uvedeného výrobcem a zaveden podle návodu do kompetentních E. coli TOPÍ OF' buněk, obsažených v sadě. Tím byl získán plasmid pHL 15-27 nesoucí HL-DNA fragment, tzn. cDNA pro lehký řetězec lidského imunoglobulinu.

(2) Konstrukce expresních vektorů pro lehké řetězce polidštěných verzí protilátky HFE7A

1) Konstrukce expresních plasmidových vektorů pro lehký řetězec polidštěné HFE7A

Polidštění aminokyselinové sekvence lehkého řetězce myší protilátky HFE7A proti lidskému Fas znamenalo nahrazení 47. aminokyseliny (prolinu) a 49. aminokyseliny (lysinu) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce (dále je zde na ni odkazováno jako na oblast I) alaninem a argininem. Alanin (47) a arginin (49) jsou zachovány v lidském lehkém řetězci (k řetězec). Bylo provedeno další polidštění, které znamenalo nahrazení 80. aminokyseliny (histidinu), 81. aminokyseliny (prolinu), 82. aminokyseliny (valinu), 84. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 85. aminokyseliny (kyseliny glutamové), 87. aminokyseliny (alaninu) a 89. aminokyseliny (threoninu) (dále je zde na tuto část odkazováno jako na oblast II) serinem, argininem, leucinem, prolinem, alaninem, fenylalaninem a valinem. Tyto aminokyseliny jsou také zachovány v lidském lehkém řetězci (k řetězci).

Byly-li polidštěny obě oblasti I a II, byla sekvence označena jako HH typ.

Byla-li polidštěna pouze oblast I, byla sekvence označena jako HM typ.

Nebyla-li polidštěna žádná oblast, byla sekvence označena jako MM typ.

Expresní plasmidy, nesoucí tyto 3 typy aminokyselinových sekvencí polidštěného lehkého řetězce z protilátky HFE7A proti lidskému Fas, byly konstruovány následovně.

............

2) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních oblastí lehkého řetězce polidštěné HFE7A

Pro konstruování následujících DNA sekvencí, z nichž každá zahrnuje buď HH, HM nebo MM sekvence spolu s konstantní oblastí lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (k řetězce), bylo použito PCR:

DNA (SEQ ID č. 49 na seznamu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec HH typu (SEQ ID č. 50 na seznamu sekvencí);

DNA (SEQ ID ě. 51 na seznamu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec HM typu (SEQ ID č. 52 na seznamu sekvencí); a

DNA (SEQ Π) č. 53 na seznamu sekvencí) kódující polypeptidový řetězec MM typu (SEQ ID č. 54 na seznamu sekvencí).

Bylo syntetizováno následujících 13 oligonukleotidových PCR primerů:

5'-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC TCTCATCTAG TTCT-3' (7AL1P; SEQ ID Č. 55) .

5'-GAGAGGGTGG CCCTCTCCCC TGGAGACAGA GACAAAGTAC CTGG-3' (7AL1N; SEQ ID č. 56) ;

5'-CCAGGTACTT TGTCTCTGTC TCCAGGGGAG AGGGCCACCC TCTC-3 ' (7AL2P; SEQ ID č. 57);

5'-GATTCGAGAT TGGATGCAGC ATAGATGAGG AGTCTGGGTG CCTG-3' (7AL2N; SEQ ID Č. 58);

5'-GCTGCATCCA ATCTCGAATC TGGGATCCCA GACAGGTTTA GTGGC-3' (7AL3PA; SEQ ID č. 59) ;

5'-AAAATCCGCC GGCTCCAGAC GAGAGATGGT GAGGGTGAAG TCTGTCCCAG (7AL3N; SEQ ID č. 60) ;

5'-CTCGTCTGGA GCCGGCGGAT TTTGCAGTCT ATTACTGTCA GCAAAGTAAT (7AL4P; SEQ ID č. 61);

5'-TGAAGACAGA TGGTGCAGCC ACAGTCCGTT TGATTTCCAG CCTGGTGCCT (7AL4N; SEQ ID Č. 62);

5'-GGTCAAGGCA CCAGGCTGGA AATCAAACGG ACTGTGGCTG CACCATCTGT (7ALCP; SEQ ID č. 63);

5'-CCCGAATTCT TACTAACACT CTCCCCTGTT GAAGCTCTTT GTGAC-3' (7ALCN; SEQ ID č. 64);

5·-TCTGTCCCAG ACCCACTGCC ACTAAACCTG TCTGGGATCC CAGATTCGAG (M7AL2N; SEQ ID Č. 65);

AC-3'

GAGGATCC-3'

TGACC-3'

CTTCA-3'

ATTGG-3' • · · · ♦ • · · · · • ··· · ·· ···· • ·· · ·· · ·

3) Konstrukce plasmidu p7AL-HH (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu HH)

VHH-DNA fragment (SEQ ID č. 49 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 50 na seznamu sekvencí, byl připraven 3 fázovou PCR, dále byl vložen do plasmidového vektoru a klonován v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu VHH-DNA je ukázán na obr. 8.

L7A1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a část FRLi oblasti, upravené tak, aby obsahovala místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III na 5-konci, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ

PCR reakce byla prováděna následovně. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení tohoto procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

► · · · * · • · · · · • · ··· ··· ···· • ·

L7A2-DNA fragment, kódující část FRLi, připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL2P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer M7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím postupem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

L7A3-DNA fragment, kódující CDRL2 a část FRL₃, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím postupem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

CDRLi, FRL2 a část CDRL2 oblasti, byl

L7A4-DNA fragment, kódující část FRL₃, CDRL₃, FRL4 a část konstantní oblasti, byl připraven následovně.

• · » « » « • · I • · · · ♦ ·· · • ·

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL4P, 80 pmol; oligonukleotidový primer 7AL4N, 80 pmol; směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

L7A5-DNA fragment, kódující část FRL4 a konstantní oblast, upravenou tak, aby měla místo pro štěpení restrikčním enzymem EcoRI na 3 -konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHL15-27, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7ALCP, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Piu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Do 200 μΐ každého z produktů PCR byl přidán stejný objem směsi fenol-chloroform (50 obj. % fenolu, nasyceného vodou, 48 obj. % chloroformu, 2 obj. % isoamylalkoholu) a roztok byl 1 min intenzivně míchán. Po této době byla směs odstředěna při 10 000 x g a získaná vodná vrstva byla smíchána se stejným objemem směsi chloroform - isoamylalkohol (96 obj. % ·· • · · .···· • · · · · » ······ ··· ·· · · ··· ·. ······· ·· ·· oO chloroformu a 4 obj. % isoamylalkoholu) a směs byla znovu 1 min. intenzivně míchána. Vznikající směs byla odstředěna při 10 000 x g a byla získána vodná fáze (soubor kroků, uvedených v tomto odstavci je dále označován jako „fenolová extrakce“).

Získaná vodná fáze byla srážena etanolem. „Etanolové srážení“, jak je zde použito a dále označováno, se skládá z přidání jedné desetiny objemu 3 M octanu sodného (pH 5,2) a 2,5 objemů 100 %ního etanolu do roztoku, který má být srážen, zamíchání a zmrazení směsi v suchém ledu. Vznikající směs je potom odstředěna při 10 000 x g a DNA je získána ve formě sraženiny.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení byla vznikající sraženina DNA vakuově vysušena, rozpuštěna v minimálním objemu redestilované vody a rozdělena elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu.

Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl gel po elektroforéze fixován vodným roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužky, odpovídající L7A1DNA, L7A2-DNA, L7A3-DNA, L7A4-DNA a L7A5-DNA, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla poté koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a nakonec byla DNA rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu VHH-DNA je ukázán na obr. 9.

L7A1.2-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané L7A1-DNA a L7A2-DNA fragmenty, byla připravena následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok L7A1-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 pl;

Roztok L7A2-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 pl;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a » > · · · · ·· · ·«·· »»»· • · · ····· « · · · · · ·♦· ·** ··· ·· ·.·

.........*......

redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

L7A4.5-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané L7A4-DNA a L7A5-DNA fragmenty, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok L7A4-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok L7A5-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL4P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfit DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

L7A1.2-DNA a L7A4.5-DNA fragmenty, amplifikované PCR, byly nejdříve extrahovány fenolem a potom bylo provedeno etanolové srážení. Tyto fragmenty byly dále separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován v roztoku ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužky, detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu pomocí zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7500 x g, etanolovým srážením a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

c) Třetí fáze PCR

Nástin třetí fáze PCR pro přípravu VHH-DNA je ukázán na obr. 10.

φφφφ «· φφ φφ « φφφφ φφφ· « · · · φ φ • · · φ · ·Φ· ··· φφφ · ·

ΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ·Φ 99

VHH-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané L7A1.2-DNA a L7A4.5DNA fragmenty a L7A3-DNA, byl připraven následujícím postupem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok L7A1.2-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok L7A4.5-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok L7A3-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

VHH-DNA fragment, amplifikovaný PCR, byl před separací elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení. Po elektroforéze byl gel fixován v roztoku ethidium bromidu o koncentraci lpg/ml a VHH-DNA proužek, detekovaný po UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu pomocí zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla poté koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla nakonec rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce expresního plasmidu, nesoucího VHH-DNA fragment, je nastíněna na obr. U.

VHH-DNA fragment, získaný výše uvedeným postupem, byl dále purífikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.

Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl štěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován s alkalickou fosfatázou (odvozenou od

··

9 9

* 9 9 9

9 9 9 • ··· «·· • · r· střeva telete; dále zkráceno jako CEP). Vznikající defosforylovaná DNA plasmidů pHSG399 a naštěpený VHH-DNA fragment byly použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Byl použit postup, uvedený ve výrobním protokolu.

Ligovaná DNA, získaná etanolovým srážením, byla rozpuštěna v 5 μΐ redestilované vody a smíchána s E. coli JM109 ElectroCell (Takara Shuzo Co., Ltd.). Směs byla převedena do zařízení Gene Pulser/ E. coli Pulser Cuvette, 0,1 cm (BioRad) a ligovaná směs byla poté použita pro transformaci E. coli JM 109. Transformace probíhala podle výrobního protokolu v zařízení Gene Pulser II (BioRad) (soubor kroků v tomto odstavci je dále označován jako „transformace“).

Po transformaci byly buňky rozetřeny na agarové LB médium [Bacto-tryptone (Difco) 10 g, Bacto-yeast extrakt (Difco) 5 g, NaCl 10 g, Bacto-agar (Difco) 15 g; rozpuštěno v destilované vodě, doplněno do 1 1], obsahující konečné koncentrace. 1 mM IPTG (isopropylthio-P-Dgalaktosid; Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,1 hmotn./obj. % X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-3-Dgalaktosid; Takara Shuzo Co., Ltd.) a 50 pg/ml chloramfenikolu. Misky byly inkubovány přes noc při 37 °C s cílem získat transformanty E. coli.

Jakékoliv získané bílé transformanty byly pěstovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook, J., a kol., (1989), v „Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition)“, Cold Spring Harbor Laboratory Press],

Vznikající extrahovaná plasmidová DNA byla štěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a klon, nesoucí VHH-DNA fragment, byl dále selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Takto byl získán plasmid pHSGHH7, nesoucí fuzní fragment variabilní oblasti lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu HH a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinů. Transformant E. coli pHSGHH7 SANK 73497, obsahující plasmid pHSGHH7, byl 22. srpna 1997 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6073.

·· · · · · · ···· • · · ····· • · · « * « ··· ··· • · · · · · ·

9b*..............

Použitím výše popsaného plasmidu pHSGHH7 bylo možno zkonstruovat expresní vektorový plasmid p7AL-HH, nesoucí DNA o SEQ ID č. 49 na seznamu sekvencí, která kóduje polypeptid o SEQ ID č. 50 na seznamu sekvencí lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu HH.

Jeden pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl štěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a poté byl defosforylován použitím CIP. Vznikající naštěpená, defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg pHSGHH7 DNA fragmentu, který byl také štěpen s Hind ΙΠ a EcoRI. Ligační směs byla použita pro transformaci E. coli JM109 (jak je popsáno výše), která pak byla rozetřena na misky s LB agarem, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu. Plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze.

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. To umožnilo izolaci plasmidu p7AL-HH, který obsahuje fuzní fragment, mající variabilní oblast lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu HH a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je lokalizován v downstream oblasti promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

4) Konstrukce plasmidu P7AL-HM (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu HM)

VHM-DNA fragment o SEQ ID č. 51 na seznamu sekvencí, kódující aminokyselinovou sekvenci o SEQ ID č. 52 na seznamu sekvencí, byl připraven 3 fázovou PCR, byl začleněn do plasmidového vektoru a klonován v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu VHM-DNA fragmentu je ukázán na obr. 12.

• · · · • · · · · · • · · · · • · ··· · · · • · · ···· · · ··

V tomto postupu byly použity L7A1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a část FRLi, mající místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5-konci, L7A2DNA fragment, kódující část FRLi, CDRLi, FRL2 a část CDRL2 a L7A5-DNA fragment, kódující část FRL4 a konstantní oblast, mající EcoRI místo přidané na 3 -konec. Tyto fragmenty byly získány při přípravě VHH-DNA fragmentu ve výše uvedeném bodu 2).

ML7A3-DNA fragment, kódující CDRL2, FRL3, CDRL3, FRL4 a část konstantní oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci.

DNA plasmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL4NA, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Piu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Produkty PCR byly nejdříve podrobeny fenolové extrakci a etanolověrnu srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 μg/ml a DNA proužek, detekovaný pod UV světlem, odpovídající ML7A3-DNA, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla poté koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu VHM-DNA je ukázán na obr. 13.

VHM-DNA fuzní fragment, obsahující výše uvedené L7A1.2-DNA, ML7A3-DNA a L7A5-DNA fragment, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci.

Roztok L7A1.2-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok ML7A3-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok L7A5-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikovaný VHM-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekovaný VHM-DNA proužek byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce expresního plasmidu, nesoucího VHM-DNA fragment, je nastíněna na obr. 14.

VHM-DNA, získaná výše uvedeným postupem, byla dále purifikována fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.

Jeden μg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná pHSG399 DNA byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) iigována s VHM-DNA, která byla rovněž naštěpena Hind III a EcoRI. E. coli JM109 byla potom , transformována s ligovanou DNA a rozetřena na LB agarové médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 μg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla poté naštěpena Hind III a EcoRI a klon, nesoucí VHM-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Byl tak získán plasmid pHSGHM17, nesoucí fuzní fragment variabilní oblasti lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu HM a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského Ig. Transformant E. coli pHSGHM17 SANK 73597, obsahující plasmid pHSGHM17, byl 22. srpna 1997uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6072.

Použitím výše popsaného plasmidu pHSGHM17 byl zkonstruován expresní vektorový plasmid p7AL-HM tak, že nesl DNA o SEQ ID č. 51 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID č. 52 na seznamu sekvencí, tvořící lehký řetězec polidštěné HFE7A typu HM.

Jeden pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající naštěpena defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) Iigována s 10 pg pHSGHM17-DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09 (jak je popsáno výše), která byla potom rozetřena na misky s LB agarem, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze.

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného inzertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Tím byla umožněna izolace plasmidu p7AL-HM, který obsahuje fuzní fragment, mající variabilní oblast lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu HM a DNA, kódující • · · · · · konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je lokalizován v downstream oblasti promotora cytomegalovira (CMV) ve správné orientaci.

5) Konstrukce plasmidu P7AL-MM (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu MM)

VMM-DNA fragment o SEQ ID č. 53 na seznamu sekvencí, kódující aminokyselinovou sekvenci o SEQ ID č. 54 na seznamu sekvencí, byl připraven 3 fázovou PCR, začleněn do plasmidového vektoru a klonován v J5. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu VMM-DNA je ukázán na obr. 15.

L7A1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a část FRLi, mající místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'-konci a L7A5-DNA fragment, kódující část FRL₄ a konstantní oblast, mající EcoRI restrikční místo přidané na 3 -konec, byly stejné jako ty, získané při přípravě VHH-DNA fragmentu, ve výše uvedeném bodě 2). Tyto fragmenty byly použity v první fázi PCR při konstrukci VMM-DNA.

ML7A2M-DNA fragment, kódující část FRLi, CDRLi, FRL2, CDRL2 a část FRL3, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci.

DNA plasmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL2P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer M7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μί;

x Pfu pufr, 20 μί;

Piu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μί.

• ·· · • ·

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

ML7A3M-DNA fragment, kódující část FRL₃, CDRL₃, FRL₄ a část konstantní oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci.

DNA plasmidu pME-L, 200 ng;

oligonukleotidový primer M7AL3PA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL4NA, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Piu pufr, 20 μΐ;

Přu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Produkty PCR byly nejdříve podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a DNA proužky, odpovídající ML7A2M-DNA a ML7A3M-DNA a detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluované DNA byly poté koncentrovány odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženiny byly rozpuštěny v 50 μΐ destilované vody.

2) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu VMM-DNA je ukázán na obr. 16.

ML7A1.2-DNA fúzní fragment, obsahující výše uvedené ML7A1-DNA a ML7A2M-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

·*·

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok L7A1-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok ML7A2M-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AL2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Piu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikovaný ML7A1.2-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 Rg/ml a detekovaný proužek fuzní DNA byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

c) Třetí fáze PCR

Nástin třetí fáze PCR pro přípravu VMM-DNA je ukázán na obr. 17.

VMM-DNA fragment, obsahující produkt fuze výše uvedených ML7A1.2-DNA, ML7A3M-DNA a L7A5-DNA fragmentu, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci.

Roztok ML7A1.2-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok ML7A3M-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok L7A5-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

* • · · · · · • · · · · · • · ♦ * · • · · · · ··« • · · • ••φ · · · · oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol; oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol; směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Piu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikovaný VMM-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekovaný proužek VMM-DNA byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-15, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce plasmidu, nesoucího VMM-DNA fragment, je nastíněna na obr. 18.

Výše získaná VMM-DNA byla dále purifikována fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.

Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná pHSG399 DNA byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s VMM-DNA, která byla rovněž naštěpena Hind III a EcoRI. E. coli JMI 09 byla poté transformována s ligovanou DNA a rozetřena na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM DPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla poté naštěpena Hind III a EcoRI a klon,

• fcfc· • · ·

98.....

nesoucí VMM-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Byl tak získán plasmid pHSGMMÓ, nesoucí fuzní fragment variabilní oblasti lehkého řetězce HFE7A typu MM a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSGMMó SANK 73697, obsahující plasmid pHSGMMÓ, byl 22. srpna 1997 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6071.

Použitím výše popsaného plasmidu pHSGMMÓ byl konstruován expresní vektorový plasmid p7AL-MM, nesoucí DNA o SEQ ID č. 53 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid lehkého řetězce HFE7A typu MM o SEQ ID č. 54 na seznamu sekvencí.

Jeden pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl naštěpen restrikčními enzymy Elind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající naštěpená, defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg pHSGMM6-DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09 (jak je popsáno výše), která byla potom rozetřena na misky s LB agarem, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze.

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Tím byla umožněna izolace plasmidu p7AL-MM, který obsahuje fuzní fragment, mající variabilní oblast lehkého řetězce HFE7A typu MM a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je lokalizován V downstream oblasti promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

6) Ověření nukleotidových sekvencí ···· • · · · fl • · fl·· ··· ····· flfl ··

Pro ověření, že DNA inzerty plasmidů p7AL-HH, p7AL-HM a p7AL-MM mají žádoucí nukleotidové sekvence, byly u DNA inzertů stanoveny nukleotidové sekvence. Oligonukleotidové primery, připravené pro nukleotidové sekvenování, byly následující:

-CCCAAGCTTA AGAAGCATCC-3 5 - ATCTATGCTG CATCCAATCT - 3' 5GTTGTGTGCC TGCTGAATAA - 3' 5 '- CCCGAATTCT TACTAACACT - 3 5'- TTATTCAGCA GGCACACAAC - 3' 5AGATTGGATG C AGCATAGAT - 3' (SPI; SEQ ID č. 68); (SP2; SEQ ID č 69); (SP3; SEQ ID ě. 70); (SP4; SEQ ID č. 71); (SP5; SEQ ED č. 72); a (SP6; SEQ ID č. 73).

Pozice, do kterých se každý primer váže, jsou ukázány na obr. 19. Stanovení nukleotidových sekvencí bylo provedeno metodou řetězové dideoxynukleotidové terminace [Sanger, F. S. a kol., (1977), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 5463]. Použité templáty odpovídaly plasmidovým DNA, purifikovaných metodou alkalické lýze a metodou s použitím chloridu česného [Sambrook, I. a kol. (1989), v ,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition“ Cold Spring Harbor Laboratory Press, pro obě metody].

Specifičtěji popsáno: 3 pg purifikované plasmidové DNA byly rozpuštěny ve 13 μΐ redestilované vody, následoval přídavek 2 μΐ 2 mM EDTA a 2 μΐ 2 N NaOH a směs byla ponechána stát při teplotě místnosti po dobu 5 min.. Dále byly přidány 4 μΐ roztoku 10 M octanu amonného a 100 μΐ 100 % etanolu, vše bylo smícháno a směs byla umístěna na 10 min. do suchého ledu. Po této době byla směs odstředěna při 15 000 x g a získaná peleta byla promyta 80 obj. %ním vodným etanolem a pak vakuově vysušena. Vzniklá, vysušená DNA byla rozpuštěna v 7 μΐ redestilované vody a byla použita pro nukleotidové sekvenování.

Nukleotidové sekvenování bylo provedeno pomocí soupravy 7-Deaza-Sequenase, Version 2.0 (pro dCTP; Amersham). Byla připravena směs, obsahující 7 μΐ výše popsaných roztoků plasmidů, 1 pmol primerů, který byl syntetizován předem a 1 μΐ reakčního pufru (poskytován v soupravě) a tato směs byla inkubována 2 min. při 65 °C. DNA byla spojena s primerem postupným ochlazováním na laboratorní teplotu, následovalo značení [α- P] dCTP (Amersham). Reakční produkt byl podroben elektroforéze v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 8 M močovinu, v 1 x TBE pufru (100 mM Tris, 100 mM kyselina boritá, 1 mM EDTA, pH 8,3). Po vysušení byly sekvence na gelu přečteny

44 4«

4 4 · « 4

4 4 4 4

4 444 444

4 4

4444 44 44 autoradiograficky, Pokud nebylo jinak specifikováno, bylo celé nukleotidové sekvenování provedeno stejně jako je uvedeno výše.

Závěrem bylo zjištěno, že DNA inzerty plasmidů p7AL-HH, p7AL-HM a p7AL-MM měly očekávané nukleotidové sekvence a to:

SEQ ID č. 49, kódující sekvenci polypeptidu o SEQ ID č. 50; SEQ ID č. 51, kódující sekvenci polypeptidu o SEQ ID ě. 52 a SEQ ID č. 53, kódující sekvenci polypeptidu o SEQ ID č. 54 na seznamu sekvencí.

Odkazový příklad 15

Konstrukce expresního vektoru pro těžký řetězec polidštěné verze HFE7A protilátky (1) Konstrukce plasmidu, nesoucího DNA pro variabilní oblast těžkého řetězce polidštěné HFE7A

1) Syntéza primerů pro přípravu variabilní oblasti polidštěného těžkého řetězce

Syntéza DNA (SEQ ID č. 74 na seznamu sekvencí), kódující polypeptidový řetězec, obsahující variabilní oblast těžkého řetězce polidštěné protilátky HFE7A proti Fas a 5 aminokyselinových zbytků na N-konci IgG-CHl oblasti (SEQ ID ě. 75 na seznamu sekvencí), byla provedena použitím kombinace PCR.

Pro PCR bylo výše popsaným postupem syntetizováno následujících 8 primerů.

-GGGAAGCTTG GCTTGACCTC ACCATGGAT GGAGCTGTAT -3' (7AH1P; SEQ ID č. 76);

5'- TGAAGCCCCA GGCTTCTTGA CCTCAGCCCC AGTTGGAC-3' (7AH1NNEW, SEQ ID č. 77);

5TCCACTCAAG CCTCTGTCCA GGGGCCTGTT TTACCC-3' (7AH2N; SEQ ID č. 78)

-GTCTGGGGCT GAGGTCAAGA AGCCTGGGGC TTAGTGAAG GTGTCCTGCA AG-3' (7AH2PNEW; SEQ ID č. 79);

5-CAGGCCCCTG GACAGAGGCT TGAGTGGATG GGAGAGATT-3 • fc ♦ β ιοΓ • fc fcfc fcfc · • · · • fcfc fcfcfc fc · • fc fcfc (7AH3P; SEQ ID č. 80);

5'-TCAGATCTCA GGCTGCTGAG CTCCATGTAG GCTGTGCTAG CGGATGTGTC-3' (7AH3N; SEQ ID č. 81);

5-TGGAGCTCAG CAGCCTGAGA TCTGAGGACA CGGCGGTCTA TTAC-3' (7AH4P; SEQ ID č. 82); a

5'-GATGGGCCCT TGGTGGAGGC TGAGGAGACG GTGACCAGGG TCCCTTCGCC CCAGT-3' (7AH4N; SEQ ID č. 83).

2) Konstrukce plasmidů pBL7A27

VD-DNA fragment (SEQ ID č. 74 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 75 na seznamu sekvencí, byl připraven 3 fázovou PCR, poté byl začleněn do plasmidů a klonován v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu VD-DNA je ukázán na obr. 20.

H7A1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a N-koncovou část FRHi a mající místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol; oligonukleotidový primer 7AH1NNEW, 80 pmol; směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

·*»· • 9 ♦ · *·

9 99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 999

9 9 ·9 9 9 _<Λ ·99 99 999 9999 *· ·*

102

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

H7A2-DNA fragment, kódující část FRHi, CDRHj a část FRH₂, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH2N, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH2PNEW, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Přu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. pří 72 °C.

H7A3-DNA fragment, kódující část FRH₂, CDRH₂ a část FRH3, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min.

při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

• φ φ φ φ · · · · · · φ φ φ φφφφ· φ φ φ · · · ··· ··· φφφ φ φ · ·

103 ................

H7A4-DNA fragment, kódující část FRH₃, CDRH₃, FRH₄ a 5 N-koncových aminokyselinových zbytků CH1 oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pME-H, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AE14P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Piu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Produkty PCR byly nejdříve podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 μg/ml a DNA proužky, odpovídající H7A1-DNA, H7A2-DNA, H7A3-DNA a H7A4-DNA, detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla poté koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu VD-DNA je ukázán na obr. 21.

H7A1.2-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané H7A1-DNA a H7A2DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok H7A1-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok H7A2-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

• · • ·

104 • φ • φ φ φφφφ oligonukleotidový primer 7ΑΗ1Ρ, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μί;

x Piu pufr, 20 μί;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μί.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

H7A3.4-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané H7A3-DNA a H7A4DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok H7A3-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μί;

Roztok H7A4-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μί;

oligonukleotidový primer 7AH3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μί;

x Pfu pufr, 20 μί;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μί.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikované H7A1.2-DNA a H7A3.4-DNA fragmenty byly nejdříve podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byly gely fixovány s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekované odpovídající proužky byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše.

• · · · • ·

105

Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

c) Třetí fáze PCR

Nástin třetí fáze PCR pro přípravu VD-DNA je ukázán na obr. 22.

VD-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané H7A1.2-DNA a H7A3.4-DNA fragmenty, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok H7A1.2-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

Roztok H7A3.4-DNA, připravený ve druhé fázi PCR, 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7AH4N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifíkovaný VD-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekovaný proužek VD-DNA byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce plasmidu, nesoucího VD-DNA fragment, je nastíněna na obr. 23.

• · · · · · · ···· • · fe ····· · · · · · ·····» • · · · · · ·

106 ................

Výše získaná VD-DNA byla dále purifikována fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a Apal.

Jeden pg DNA plasmidového vektoru pBLUESCRIPT-II SK+ (Stratagene) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apa I a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA a 100 ng VD-DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen s Hind III a Apa I, byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Vznikající ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09, která byla rozetřena na misky s LB agarem, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml ampicilinu. Jakékoliv vzniklé bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla poté ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Vznikající plasmid byl naštěpen Hind III a Apa I a podroben elektroforéze v agarózovém gelu s cílem potvrdit přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného inzertu. Byl tak získán plasmid pBL7A27 s VD-DNA inzertem.

(2) Konstrukce plasmidu, nesoucího genomovou DNA pro konstantní oblast lidského IgGl

1) Syntéza primerů pro přípravu 5'-koncového fragmentu genomové DNA pro lidský IgGl

5'-koncový fragment genomové DNA pro lidský IgGl byl syntetizován pomocí PCR. Za tímto účelem byly připraveny následující 2 oligonukleotidové primery:

5'-GGGAAGCTTC CGCGGTCACA TGGCACCACC TCTCTTGCA - 3' (5'Hind: SEQ ID č. 84 na seznamu sekvencí); a

5'- GCTCTGCAGA GAGAAGATTG GGAGTTACTG GAATC - 3' (IGGCPSTN: SEQ ID č. 85 na seznamu sekvencí).

2) Konstrukce plasmidu pIG5'03

Genomová DNA, obsahující CH1 oblast lidského IgGl a intron, který následuje za sekvencí pro štěpení Hind III, byla separována a amplifikována pomocí PCR za použití lidské genomové DNA jako templátu. Poté byla DNA vložena do plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a klonována v E. coli. Příprava této DNA (dále označované jako „IG5'-DNA“) je nastíněna na obr. 24.

107

IG5'-DNA fragment byl připraven následovně

Složení roztoku pro PCR reakci:

lidská genomová DNA (Clonetech), 2 pg;

oligonukleotidový primer 5 'Hind, 80 pmol;

oligonukleotidový primer IGGCPSTN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikovaný IG5'-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a poté byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekovaný proužek, odpovídající IG5'-DNA, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jakje popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Takto získaný IG5'-DNA fragment byl dále purifikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Pst I.

Jeden pg DNA plasmidů pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Pst I a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována se 100 ng IG5'-DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen s Hind III a Pst I. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09, která byla rozetřena na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Jakékoliv získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 • · · ·

• · · · · • · · · · • · · · · · · • · • · · · · ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného inzertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena Hind III a Pst I a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Byl tak získán plasmid pIG5'03, obsahující jako inzert IG5'-DNA fragment.

(3) Konstrukce plasmidu, nesoucího genomovou DNA pro konstantní oblast lidského IgGl

1) Syntéza primerů pro přípravu 3'-koncového fragmentu genomové DNA pro lidský IgGl

3'-koncový fragment genomové DNA pro lidský IgGl byl syntetizován pomocí PCR. Za tímto účelem byly připraveny následující 2 primery:

5'-TCTCTGCAGA GCCCAAATCT TGTGACAAAA CTCAC- 3' (IGGCPSTP: SEQ ID č. 86 na seznamu sekvencí); a

5'- GGGGAATTCG GGAGCGGGGC TTGCCGGCCG TCGCACTCA- 3' (Eco3': SEQ ID č. 87 na seznamu sekvencí).

2) Konstrukce plasmidu pIG3 '08

DNA, obsahující sekvence: intron z lidského IgGl; stěžejní oblast; intron z lidského IgGl; CH2 oblast; intron z lidského IgGl; CH3 oblast; a sekvenci pro štěpení EcoRI, byla separována a amplifikována pomocí PCR za použití lidské genomové DNA jako templátu. DNA byla poté vložena do plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) a klonována v E. coli. Příprava výše uvedené DNA (dále označované jako „IG3'-DNA“) je nastíněna na obr. 25.

IG3 '-DNA byla připravena následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

lidská genomová DNA (Clonetech), 2 pg;

oligonukleotidový primer IGGCPSTP, 80 pmol;

oligonukleotidový primer Eco3', 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

109 • · · · · · • · · · · • · ·· · ·· · • · · • · · · ·· · ·

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Vznikající amplifikovaný IG3'-DNA fragment byl nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a detekovaný proužek, odpovídající IG3'-DNA, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Takto získaný IG3'-DNA fragment byl dále purifikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Pst I.

Jeden μg DNA plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a Pst I a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA byla poté pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 100 ng IG3'-DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen s EcoRI a Pst I. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09, která byla potom rozetřena na LB agarové médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 μg/ml chloramfenikolu. Jakékoliv bílé kolonie byly selektovány a byl získán plasmid pIG3'O8, obsahující inzert IG3'-DNA.

(4) Konstrukce expresního vektorového plasmidu pro těžký řetězec polidštěné HFE7A

Expresní plasmidový vektor pEg7AH-H, nesoucí DNA o SEQ ID č. 88 na seznamu sekvencí a kódující polypeptid těžkého řetězce polidštěné HFE7A o SEQ ID č. 89 na seznamu sekvencí, byl konstruován pomocí výše popsaných plasmidů pBL7A27, pIG5'03 a pIG3'08. Postup je nastíněn na obr. 26.

• · · · • · · · · · • · · · · · ·· 9 99 9 · · ····· · · 99

110

Jeden pg DNA plasmidů pIG5'03, obsahující CHI oblast těžkého řetězce lidského IgGl a intron, byl štěpen restrikčními enzymy Apa I a Κρη I. Dále byl také naštěpen restrikčními enzymy Apa I a Κρη I 1 pg DNA pBL7A27, který poté byl defosforylován použitím CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidů pBL7A27 (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg naštěpené, defosforylované DNA pIG5'03. Ligační směs byla potom použita pro transformaci E. coli JMI09, která byla rozetřena na misky s LB médiem, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Vznikající transformanty byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byl plasmid naštěpen s Apa I a Κρη I nebo s Hind III a Pst I a podroben elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Takto byl získán plasmid pBL7AF184, obsahující VD-DNA fragment polidštěné HFE7A, spojený s IG5'-DNA fragmentem.

pg takto získaného plasmidů pBL7AF184 bylo dále štěpeno restrikčními enzymy Hind III a Pst I. 1 pg DNA výše uvedeného plasmidů pIG3'08 byl naštěpen s Hind III a Pst I a defosforylován použitím CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidů pIG3'08 (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg naštěpené DNA pBL7AF184. E. coli JMI09 byla transformována s ligační směsí a potom byla rozetřena na LB médium, obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Vznikající transformanty byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost požadovaného inzertu, byl plasmid naštěpen s Hind III a Pst I nebo s Hind III a EcoRI a podroben elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Byl získán plasmid pgHSL7A62, obsahující VD-DNA fragment polidštěné HFE7A, spojený s fragmentem genomové DNA, kódující konstantní oblast lidského IgGl. Transformant E. coli pgHSL7A62 SANK 73397, obsahující plasmid pgHSL7A62, byl 22. srpna 1997 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6074.

Deset pg takto získané DNA plasmidů pgHSL7A62 bylo štěpeno restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a 1 pg DNA expresního plasmidů pEE.6.1 byl štěpen s Hind III a EcoRI a byl

0 0 00000

0 0 0 0 0 00· 000 0 0 0 ·· · · • 00 00 000 0000 0· ··

111 defosforylován použitím CIP. Vznikající, defosforylovaná DNA plasmidu pEE.6.1 (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) Iigována s 10 pg naštěpené pgHSL7A62 DNA. E. coli JMI 09 byla transformována s ligační směsí a byla rozetřena na LB médium, obsahující 50 pg/ml ampicilinu. Vzniklé transformanty byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byl plasmid štěpen s Hind III a EcoRI a podroben elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Vzniklý plasmid pEg7AH-H, obsahující fuzní fragment, skládající se ze spojených VDDNA fragmentu polidštěné HFE7A a fragmentu genomové DNA, kódující konstantní oblast lidského IgGl, byl začleněn do downstream oblasti promotoru CMV ve správné orientaci.

(5) Ověření nukleotidové sekvence

Pro ověření, že DNA inzert pEg7AH-H měl očekávanou nukleotidovou sekvenci, byl DNA inzert analyzován a byla stanovena nukleotidová sekvence. Pro tento účel byly syntetizovány následující primery:

5'-ACAGCCGGGA AGGTGTGCAC-3' (IG01: SEQ ID č. 90); 5'-AGACACCCTC CCTCCCTGTG-3’ (IG02: SEQ ID č. 91);

5-GTGCAGGGCC TGGGTTAGGG-3' (IG03: SEQ ID č. 92); 5'-GCACGGTGGG CATGTGTGAG-3' (IG04: SEQ ID č. 93); 5'-GTTTTGGGGG GAAGAGGAAG-3' (IG05: SEQ ID ě. 94); 5'-CCAGTCCTGG TGCAGGACGG-3' (IG06: SEQ ID č. 95);

5-CCTGTGGTTC TCGGGGCTGC-3' (IG07: SEQ ID č. 96); 5'-CGTGGTCTTG TAGTTGTTCT-3' (IG08: SEQ ID č. 97); 5'-CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC-3' (IGP5: SEQ ID č. 98); 5'-CCGTCCTGCA CCAGGACTGG-3' (IGP6: SEQ ID č. 99); 5-GCAGCCCCGA GAACCAC AGG-3' (IGP7: SEQ ID č. 100); 5'-AGAACAACTA CAAGACCACG-3' (IGP8: SEQ ID č. 101); 5'-GCCTGACATC TGAGGACTC-3' (H5+: SEQ ID č. 102); 5'-GAGTCCTCAG ATGTCAGGC-3' (H5-: SEQ ID č. 103); 5'-GAGCAGTACT CGTTGCTGCC GCGCGCGCCA-3' (PEEF: SEQ ID č. 104); a • · fc · • · · fcfc fcfc · • fcfc · ········ • fcfc fcfc · · • fcfc fc* fcfcfc ···· fcfc fcfc

112

5'-GGTATGGCTG ATTAATGATC AATG-3' (PEEB: SEQ ID č. 105);

Pozice, do kterých se každý primer váže, jsou ukázány na obr. 27. Stanovení nukleotidové sekvence bylo uskutečněno metodou řetězové dideoxynukleotidové terminace s použitím jednotlivých plasmidů, purifikovaných metodou alkalické lýze a pomocí chloridu česného, jako templátů. Bylo potvrzeno, že pEg7AH-H měl nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 88 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID č. 89 na seznamu sekvencí.

Odkazový příklad 16

Exprese v COS-1 buňkách

COS-1 buňky (odvozené od ledviny opice) byly transfektovány s expresními plasmidy pro těžký řetězec polidštěné HFE7A a s expresními plasmidy pro každý z lehkých řetězců polidštěné HFE7A, které byly získány výše uvedeným postupem. Transfekce byla uskutečněna elektroporací v zařízení pro genovou transfekci GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, K. K.), vybaveného nádobkou FCT-13, která má elektrody ve vzdálenosti 2 mm (Shimadzu Seisakusyo, K. K.).

COS-1 buňky (American Type Culture Collection No. CRL-1650) byly pěstovány do semikonfluentní fáze v kultivační nádobě (kultivační plocha: 225 cm²; Sumitomo Bakelite), obsahující Minimal Essential a medium [„a(+)MEM“; Gibco BRL], doplněné 10 obj. % FCS (Moregate). Médium nebylo dále používáno a COS-1 buňky byly odebrány působením 3 ml roztoku tiypsin-EDTA (Sigma Chemicals Co.) při 37 °C po dobu 3 min.. Oddělené buňky byly sklizeny odstředěním 2 min. při 800 rpm, supematant byl odložen a buňky byly dvakrát promyty fosfátovým pufrem (0,02 hmotn./obj. % chlorid draselný [KC1], 0,02 hmotn./obj. % dihydrogenfosforečnan draselný [KH2PO4], 0,8 hmotn./obj. % chlorid sodný [NaCl], 1,15 hmotn./obj. % hydrogenfosforečnan sodný [Na2HPO4]; dále označovaný jako „PBS (-) pufr“; Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). Promyté COS-1 buňky byly suspendovány v PBS (-) pufru tak, o

aby výsledná hustota buněk byla 1x10 buněk/ml.

pg expresní plasmidové DNA pro těžký řetězec polidštěné HFE7A byly smíchány se 4 pg expresní plasmidové DNA pro lehký řetězec polidštěné HFE7A, z nichž každá byla purifikovaná metodou alkalické lýze a odstředěním v hustotním gradientu chloridu česného.

• · · · · · ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · • · · · · · · · • ·· · ········ • · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

113

Vzniklá směs byla podrobena etanolovému srážení a poté byla sraženina suspendována ve 20 μΐ PBS (-) pufru. Míchání, srážení a resuspendace byly prováděny ve stejné zkumavce. Vzniklá suspenze plasmidu (20 pl) byla smíchána s 20 μΐ předem připravené suspenze buněk COS-1 (2 χ 10⁶ buněk) a směs byla převedena do FCT-13 elektroporační nádobky (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.) s elektrodami ve vzdálenosti 2 mm. Nádobka byla dána do přístroje pro transfekcí genů GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.). Aby došlo k transformaci COS-1 buněk s plasmidovou DNA, byly dvakrát v intervalu 1 s aplikovány pulsy o 600 V, každý 50 pF. Po elektroporaci byla směs buňka-DNA v nádobce suspendována ve 20 pl a(+)MEM, doplněného o 10 obj. % FCS a převedena do kultivační baňky (plocha kultivace 75 cm²; Sumimoto Bakelite). Po inkubaci při 37 °C, 72 hod. pod 5 obj. %ním CO2 byl získán supernatant a byla provedena jeho analýza s cílem stanovit, které produkty exprese jsou přítomny.

Použitím výše uvedené metody, odpovídajícím způsobem modifikované, byly COS-1 buňky různě transfektovány s každým z následujících plasmidů nebo s kombinací plasmidů:

(A) : bez plasmidové DNA (B) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-MM (C) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-HM (D) : kotransfekce pEg7AH-H a p7AL-HH

Odkazový příklad 17

Kvantifikace produktů exprese metodou ELISA

Ověření a kvantitativní stanovení exprese polidštěných protilátek v supematantech kultury, připravených v odkazovém příkladu 16, byly uskutečněny metodou ELISA s použitím protilátek proti lidskému IgG.

Kozlí specifická polyklonální protilátka proti lidskému IgG Fc (Kappel) byla rozpuštěna v adsorpčním pufru (0,05 M hydrogenuhličitan sodný, 0,02 hmot./obj. % azid sodný, pH 9,6) na konečnou koncentraci 1 pg/ml a do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami (MaxiSorb, Nunc) byly přidány 100 pl alikvotní podíly. Aby byla podpořena adsorpce protilátky, byla mikrotitrační destička inkubována 2 h při 37 °C. Poté byla každá jamka 4 x promyta 350 pl PBS-T [PBS(-), obsahujícího 0,05 hmotn./obj. % Tween-20 (BioRad)]. Po • · · · · · · ♦ • · · · «······· • · · · · · · ··» ·· ······· ·· ··

114 promytí byl do jamek přidán supernatant kultury, naředěný a(+)MEM, které obsahuje 10 obj. % FCS a mikrotitrační destička byla dále inkubována 2 h při 37 °C.

Po této době byly jamky znovu 4 x promyty PBS-T a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ alkalickou fosfatázou značené kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc (Caltag Lab.), 5 000 krát naředěné PBS-T pufrem. Mikrotitrační destička byla inkubována 2 hod při 37 °C. Každá jamka byla poté znovu 4 x promyta PBS-T a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu (1 mg/ml p-nitrofenylfosfát, připravený v 10 obj. %ním dietanolaminu (pH 9,8). Po inkubaci 0,5 h až 1 h při 37 °C byla měřena absorbance při 405 nm.

Aby byly poskytnuty koncentrační referenční vzorky protilátek polidštěné HFE7A, obsažených v supematantu kultury, byly v uváděných experimentech použity IgG podtřídy 1 lidské plazmy (IgGl; Biopure AG), naředěné na určité žádoucí koncentrace a(+) MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS.

Podle očekávání bylo zjištěno, že každý ze supematantů transformantú (B), (C) a (D) exprimuje lidskou protilátku, což bylo detekováno pomocí protilátky proti lidskému IgG. Negativní kontrola, (A), neukazovala žádnou expresi lidské protilátky.

Odkazový příklad 18

Měření vazebné aktivity Fas

Měření vazebné aktivity Fas v supematantech buněčné kultury, které byly připraveny v odkazovém příkladu 16, bylo provedeno metodou ELIS A následovně.

Adsorpěním pufrem 5 krát naředěný supernatant z kultury COS-1 buněk, které exprimují lidský Fas fuzní protein, získaný ve výše uvedeném odkazovém příkladu 1, byl rozdělen do jamek mikrotitrační destičky s 96 jamkami (MaxiSorb; Nunc) po 50 μΐ do jamky. Aby bylo dosaženo adsorpce lidského Fas fuzního proteinu na povrch jamek, byla mikrotitrační destička inkubována přes noc při 4 °C. Každá jamka byla 4 krát promyta 350 μΐ PBS-T. Po promytí bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ PBS-T, obsahujícího 5 obj. % BSA (hovězí sérový albumin; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Aby byl blokován zbytek povrchu každé jamky, byla mikrotitrační destička inkubována 1 h při 37 °C. Jamky byly potom opět 4 krát promyty PBS-T.

···· • · · ···· · · · · • · · · · · · · • ·· · · · ······ • · · · · · · ··· ·« ··· ·«·· ·« ··

115

Supematanty, získané v odkazovém příkladu 16, byly upraveny tak, že měly konečnou koncentraci sledovaného produktu 100 ng/ml v oc(+)MEM, které obsahuje 10 obj. % FCS. Koncentrace byly stanoveny metodou, popsanou v odkazovém příkladu 17. Každý ze vzniklých roztoků o koncentraci 100 ng/ml byl použit pro pravidelné zřeďování řadou 2 násobných ředění a(+)MEM mediem, obsahujícím 10 obj. % FCS. 50 μΐ každého ze vznikajících ředění každého produktu exprese bylo přidáno do jamky, připravené výše uvedeným způsobem a aby proběhla reakce, byla mikrotitrační destička inkubována 2 h při 37 °C.

Po této době byly jamky znovu 4 x promyty PBS-T a poté bylo do každé jamky dáno 50 μΐ 10 000 x naředěné PBS-T pufřem, alkalickou fosfatázou značené kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc, (Caltag Lab.). Reakce probíhala 2 h při 37 °C.

Jako kontrola (IgGl) byla použita HFE7A, purifikovaná z HFE7A myššího hybridomu, a byla detekována pomocí 5 000 krát zředěné PBS-T, alkalickou fosfatázou značené kozlí protilátky proti myšším IgG + IgA + IgM (Gibco BRL) místo alkalickou fosfatázou značené kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc.

Jamky byly opět 4 x promyty PBS-T a poté bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ roztoku substrátu [1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu v 10 obj. %ním diethanolaminu (pH 9,8)]. Mikrotitrační destička byla inkubována 0,5 až 1 h při 37 °C. Vazebná aktivita produktu exprese, obsaženého v supernatantu každé kultury, s lidským Fas íuzním proteinem, byla zjištěna odečtením absorbance každé jamky při 405 nm.

Vazebná aktivita lidského Fas fúzního proteinu byla podle očekávání zjištěna pro supematanty (B), (C) a (D) (obr. 28).

Odkazový příklad 19

Kompetitivně inhibující vazba HFE7A na Fas

Polidštěné protilátky proti Fas, uvedené v příkladech, by měly inhibovat vazbu HFE7A na Fas, protože byly odvozeny od HFE7A. Proto byla měřena schopnost produktů exprese,

0» 00 • 0000 ···· • 0 · 0 0 · 0

0 · 4 0 ··· 000 • 0 0 0 0 0 0 00 000 0000 ·· 00

116 získaných v odkazovém příkladu 16, kompetitivně inhibovat vazbu HFE7A na lidský Fas fúzní protein.

Jedem mg purifikované monoklonální protilátky HFE7A, získané v odkazovém příkladu 3, byl označen alkalickou fosfatázou použitím komerčně dostupné soupravy pro značení (ImmunoLink AP a APL Labeling Kit; Genosis) a s použitím protokolu, dodávaného spolu se soupravou. Vznikající značená protilátka je dále také označována jako „AP-HFE7A“.

Supernatant buněčné kultury COS-1 buněk, obsahující lidský Fas fuzní protein, jak byl získán v odkazovém příkladu 1, byl pro luminiscenční detekování (Luminescent Solid Assay Plate, high binding property; Costar) 5 x naředěn adsorpěním pufrem a rozdělen po 50 μΐ do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Aby bylo dosaženo adsorpce lidského Fas fuzního proteinu na povrch jamek, byla poté mikrotitrační destička inkubována přes noc při 4 °C.

Po této době byla každá jamka 4 krát promyta 350 μΐ PBS-T a potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ PBS-T, obsahujícího 5 obj. % BSA. Aby byl blokován zbytek povrchu každé jamky, byla mikrotitrační destička inkubována 1 h při 37 °C. Jamky byly potom opět 4 krát promyty PBS-T.

Supernatanty, získané v odkazovém příkladu 16, byly pomocí postupu z odkazového příkladu 17, upraveny na konečnou koncentraci protilátky 1 pg/ml v oc(+)MEM, obsahujícím 10 obj. % FCS. Každý vzniklý roztok produktů exprese byl použit pro pravidelné zřeďování sérií 2 násobných ředění a(+)MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS. AP-HFE7A byla ot(+) MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS, naředěna na koncentraci 50 ng/ml a 25 μΐ vznikajícího roztoku bylo smícháno se stejným objemem každého z připravených ředění.

Každá jamka byla opět 4 x promyta PBS-T a poté bylo do jednotlivých jamek přidáno 50 μΐ každé vznikající směsi protilátek. Mikrotitrační destička byla ponechána přes noc při teplotě místnosti. Po 4 násobném promytí každé jamky PBS-T bylo do každé jamky dáno 100 μΐ CDPstar pufru (9,58 ml dietanolaminu, 0,2 g chloridu hořečnatého, 0,25 g azidu sodného, pH 8,5) a mikrotitrační destička byla ponechána 10 min. při teplotě místnosti. Po této době byl odstraněn CDP-star pufr a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ CDP-star substrátu [1,2 ml sapphire II (Tropix), 200 μΐ CDP-star (Tropix), doplnit do 12 ml CDP-star pufrem] a mikrotitrační destička byla ponechána dalších 40 min. při teplotě místnosti.

117 • ΦΦ«· Y ·· ΦΦ ·· «Φ Φ ΦΦ Φ Φ · « 4 Φ

Φ Φ Φ Φ « · Φ Φ φ · Φ · Φ Φ Φ·Φ «ΦΦ

Φ * Φ Φ Φ Φ Φ • Φφ ΦΦ ·♦· ΦΦΦΦ ΦΦ *Φ

Kompetitivní inhibice produktů exprese z odkazového příkladu 16 vazby HFE7A na lidský Fas fuzní protein byla stanovena měřením intenzity luminiscence pomocí zařízení Luminoscan (Titertech).

Závěrem bylo ověřeno, že produkty exprese, připravené v odkazovém příkladu 16, specificky inhibovaly vazbu HFE7A na lidský Fas fuzní protein (obr. 29).

Odkazový příklad 20

Aktivita, indukující apoptózu

Pro zkoumání aktivity, indukující apoptózu, v supernatantu kultury COS-1 buněk z odkazového příkladu 16, byly použity buňky WR19L12a (Itoh, N. a kol.).

WR19L12a buňky byly kultivovány v médiu RPMI 1640 s 10 obj. % FCS (Gibco BRL) 3 dny při 37 °C a pod 5 obj. % CO₂ a do každé jamky míkrotitrační destičky s 96 jamkami (Sumitomo Bakelite) bylo dáno 50 μΐ (1 χ 10⁵ buněk) vznikající kultury. Supematanty kultury, získané v odkazovém příkladu 16, byly upraveny tak, že konečná koncentrace protilátky v RPMI 1640 médiu, obsahujícím 10 obj. % FCS, byla 100 ng/ml. Koncentrace byly stanoveny metodou, uvedenou v odkazovém příkladu 17. Každý z upravených roztoků produktů exprese byl použit pro přípravu pravidelných ředění sérií 2 násobných ředění roztokem RPMI 1640, obsahujícího 10 obj. % FCS. Každé vznikající ředění roztoku každého produktu exprese bylo přidáno po 50 μΐ do každé jamky a míkrotitrační destička byla inkubována 1 h při 37 °C. Po této době byly buňky v každé jamce 4 x promyty RPMI 1640, které obsahuje 10 obj. % FCS a poté byly promyté buňky v každé jamce suspendovány v 75 μΐ RPMI 1640, obsahujícím 10 obj. % FCS.

Následně bylo do každé jamky přidáno 75 μΐ roztoku kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc (Kappel) v RPMI 1640 médiu, obsahujícího 10 obj. % FCS. Koncentrace protilátky byla 1,25 pg/ml a protilátka byla přidána jako sekundární protilátka. Míkrotitrační destička byla ponechána stát 12 h při 37 °C a poté bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 25 μΜ PMS (fenazinmetosulfát; Sigma Chemical Co.), obsahujícího 1 mg/ml XXT [2,3bis(2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxyanilidová vnitřní sůl, Sigma Chemical Co.], konečné koncentrace byly 250 pg/ml pro XXT a 5 μΜ pro PMS. Míkrotitrační

ιιδ...........

destička byla inkubována 3 h při 37 °C a byla měřena absorbance každé jamky při 450 nm. Z toho pak byla s použitím redukční síly mitochondrie jako indexu, spočítána životaschopnost buňky.

Životaschopnost buněk v každé jamce byla spočítána podle následujícího vztahu:

Životaschopnost (%) = 100 x (a-b) / (c - b) kde „a“ je absorbance testovací jamky, „b“ je absorbance jamky bez buněk a „c“ je absorbance jamky bez přidání protilátky.

Podle očekávání bylo zjištěno, že každý produkt exprese (B), (C) a (D) z odkazového příkladu 16, indukoval apoptózu v T buňkách, exprimuj ících lidský Fas antigen (obr. 30).

Odkazový příklad 21

Příprava DNA, kódující polidštěný lehký řetězec (1) Konstrukce vektorů pro lehké řetězce polidštěné verze protilátky HFE7A

Aby byla polidštěna aminokyselinová sekvence lehkého řetězce myšší protilátky HFE7A proti lidskému Fas, byly 1 aminokyselina (asparágová kyselina), 85 aminokyselina (alanin) a 107 aminokyselina (arginin) z N-konce aminokyselinové sekvence lehkého řetězce typu HH nahrazeny glutamovou kyselinou, glutamovou kyselinou a lysinem. Tyto nahrazující zbytky jsou v lidském lehkém řetězci (k řetězec) neměnné. Vznikající sekvence byla označena jako „PDHH typ“. Pro sekvenci HM lehkého řetězce byly nahrazeny 1 aminokyselina (asparágová kyselina) a 107 aminokyselina (arginin), počítané z N-konce aminokyselinové sekvence, neměnnými zbytky glutamové kyseliny a lysinu. Vznikající sekvence byla označena jako „PDHM typ“.

Expresní plasmidy, odděleně nesoucí tyto 2 typy aminokyselinových sekvencí (PDHH a PDHM) polidštěného lehkého řetězce, byly konstruovány následovně.

1) Syntéza primerů pro přípravu variabilních a konstantních oblastí lehkého řetězce polidštěné

HFE7A

11ST

DNA (SEQ ID č. 106 na seznamu sekvencí), kódující PDE1H typ polypeptidového řetězce (SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí) a DNA (SEQ ID č. 108 na seznamu sekvencí), kódující PDHM typ polypeptidového řetězce (SEQ ID č. 109 na seznamu sekvencí), byly připraveny pomocí PCR. Každá z těchto sekvencí je produktem fuze jedné z polidštěných verzí variabilní oblasti lehkého řetězce HFE7A s konstantní oblasti lehkého řetězce (κ řetězec) lidského Ig.

Pro PCR byly rovněž syntetizovány 7AL1P (SEQ ID ě. 55), 7ALCN (SEQ ID č. 64) [výše uvedené odkazové příklady 2 (2) 2)] a následující oligonukleotidové primery:

5'-GGTGAGATTG TGCTCACCCA ATCTCCAGG-3' (LPD1P; SEQ ID č. 110);

5'-CCTGGAGATT GGGTGAGCAC AATCTCACC-3' (LPD1N; SEQ ID ě. 111);

5'-CC ATCTCTCG TCTGGAGCCG GAGGATTTTG-3' (LPD2P; SEQ ID č. 112);

5'-GCAAAATCCT CCGGCTCCAG ACGAGAGATG-3' (LPD2N; SEQ ID č. 113);

5'-CAAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAACGGACT-3' (LPD3P; SEQ ID č. 114); a

5-CAGTCCGTTT GATTTCCAGC TTGGTGCCTT G-3' (LPD3N; SEQ ID č. 115);

2) Konstrukce plasmidu pLPDHH75 (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu PDHH)

LPDHH-DNA (konstantní oblast lehkého řetězce fúzovaná s PDHH DNA), jak je definována v SEQ ID č. 106 na seznamu sekvencí, kódující aminokyselinovou sekvenci, na seznamu sekvencí jako SEQ ID č. 107, byla připravena 3 fázovou PCR, byla začleněna do plasmidového vektoru a klonována v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu LPDHH-DNA je ukázán na obr. 31.

·· · · · ·

*.·* ...........

120

LPD1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a část FRLi, která má však místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LPDHH1-DNA fragment, kódující část FRLi, CDRLi, FRL2, CDRL2 a část oblasti FRL3, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LPDHH2-DNA fragment, kódující část FRL3, CDRL3 a FRL4, byl připraven následovně.

·· ·· ·· • · · · · · • · · · ♦ • · ··· ··* • · · • ·«·· ·· ·*

121 »·<·

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD2P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LPDC-DNA fragment, kódující část FRL4 a konstantní oblast lehkého řetězce HFE7A, který však má místo pro štěpení restrikčním enzymem EcoRI přidané na 3'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pHSGHH7, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD3P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byly amplifikované DNA fragmenty podrobeny nejdříve fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a DNA proužky, detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a ·«··

Ur’** ’* eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla potom koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a nakonec byla sraženina rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu LPDHH-DNA je ukázán na obr. 32.

LPDHH1.2-DNA, ve kterém jsou fúzovány výše popsané LPD1-DNA, LPDHH1-DNA a LPDHH2-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok LPD1-DNA (z první fáze PCR), 10 μΐ;

Roztok LPDHH1-DNA (z první fáze PCR), 10 μΐ;

Roztok LPDHH2-DNA (z první fáze PCR), 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný LPDHH1.2 fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a poté byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek, odpovídající fúzní DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a nakonec byla sraženina rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

• · • · · • · · · • ·

123

c) Třetí fáze PCR

Nástin třetí fáze PCR pro přípravu LPDHH-DNA je ukázán na obr. 33.

LPDHH-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané LPDHH1.2-DNA a LPDC-DNA fragmenty, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok LPDHH1.2-DNA (z druhé fáze PCR), 10 μΐ;

Roztok LPDC-DNA (z první fáze PCR), 10 μΐ;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný LPDHH-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce expresního plasmidu, nesoucího LPDHH-DNA fragment, je nastíněna na obr. 34.

Výše získaný LPDHH-DNA fragment byl dále purifikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.

• ·

124

Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná pHSG399 DNA byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s LPDHHDNA fragmentem, který byl rovněž předtím naštěpen s Hind III a EcoRI. E. coli JMI 09 byla poté transformována s ligační směsí a byla rozetřena na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena Hind III a EcoRI a klon, nesoucí LPDHH-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Byl tak izolován plasmid pHSHH5, nesoucí fuzní inzert, skládající se z variabilní oblasti polidštěné LPDHH DNA a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSHH5 SANK 70398, obsahující plasmid pHSHH5, byl 26. února 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou o ukládání mikroorganismů a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6274.

Použitím plasmidu pHSHH5 byl připraven expresní vektorový plasmid pLPDHH75, nesoucí DNA fragment o SEQ ID č. 106 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu PDHH o SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí.

Jeden pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající naštěpená, defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg pHSHH5 DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JM109 (jak je popsáno výše), která byla potom rozetřena na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze.

• · φ φ φ φφφφφ φ φφ φ φ φ φφφφφφ • · · · · φ ·

125 ................

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. To umožnilo izolaci plasmidu pLPDHH75, který obsahuje fúzní fragment, který má variabilní oblast lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu PDHH a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fúzní fragment je lokalizován v downstream oblasti promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

3) Konstrukce plasmidu pLPDHM32 (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu PDHM)

LPDHM-DNA fragment (SEQ ID ě. 108 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID ě. 107 na seznamu sekvencí, byl připraven 3 fázovou PCR, fragment byl poté začleněn do plasmidového vektoru a klonován v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu LPDHM-DNA je ukázán na obr. 35.

LPD1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a ěást FRLi, mající místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'-konci a LPDC-DNA fragment, kódující ěást FRL4 a konstantní oblast, mající místo pro štěpení restrikčním enzymem EcoRI přidané na 3'konci, byly stejné jako ty, získané při přípravě LPDHH-DNA fragmentu [viz „2) Konstrukce plasmidu pLPDHH75 (expresní plasmid pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu PDHH)“ a ,,a) První fáze PCR“].

LPDHM1-DNA fragment, kódující část CDRLi, FRL2, CDRL2, FRL3, CDRL3 a FRL4, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHM17, 200 ng;

oligonukleotidový primer LPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

• · • ·

126 • · · · • » · · • · · · · · · • ·

9 · ·

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byly amplifikované LPD1, LPDHM1 a LPDC-DNA fragmenty podrobeny nejdříve fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužky fuzní DNA, detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a nakonec byla sraženina rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu PDHM-DNA je ukázán na obr. 36.

LPDHM1.2-DNA, ve které byly fúzovány výše popsané LPD1-DNA a LPDHM1-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok LPD1-DNA (z první fáze PCR), 10 pl;

Roztok LPDHM1-DNA (z první fáze PCR), 10 pl;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer LPD3N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

127

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný LPDHM1.2-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a nakonec byla sraženina rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

c) Třetí fáze PCR

Nástin třetí fáze PCR pro přípravu LPDHM-DNA je ukázán na obr. 37.

LPDHM-DNA fragment, obsahující fúzované výše popsané LPDHM1.2-DNA a LPDCDNA fragmenty, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok LPDHM1.2-DNA (z druhé fáze PCR), 10 pl;

Roztok LPDC-DNA (z první fáze PCR), 10 pl;

oligonukleotidový primer 7AL1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer 7ALCN, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

• ·

• · · · · ·

9 9 9 9 • · ··· ··· • · · • · · 9 · · ··

Po PCR byl amplifikovaný LPDHM-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a poté byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce plasmidu, nesoucího LPDHM-DNA fragment, je nastíněna na obr. 38.

Výše získaná LPDHM-DNA byla dále purifikována fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI.

Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná pHSG399 DNA byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s LPDHMDNA fragmentem, který byl rovněž předtím naštěpen s Hind III a EcoRI. E. coli JMI09 byla poté transformována s ligační směsí a byla rozetřena na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena Hind III a EcoRI a klon, nesoucí LPDHM-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Výsledkem výše zmíněného postupu byl plasmid pHSHM2, nesoucí fuzní inzert, skládající se z variabilní oblasti lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu PDMM a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského Ig. Transformant E. coli pHSHM2 SANK 70198, obsahující plasmid pHSHM2, byl 26. února 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou o ukládání mikroorganismů a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6272.

Použitím výše uvedeného plasmidu pHSHM2 byl zkonstruován plasmid pLPDHM32, nesoucí DNA o SEQ ID č. 108 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu PDHM o SEQ ID č. 109 na seznamu sekvencí.

• ·

129

Jeden pg pEE.12.1 DNA (Lonza), expresního vektoru pro savčí buňky, byl naštěpen restrikčními enzymy Elind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající naštěpená, defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg pHSHM2 DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JM109 (jak je popsáno výše), která byla potom rozetřena na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze.

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. To umožnilo izolaci plasmidů pLPDHM32, který obsahuje fuzní fragment, mající variabilní oblast lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu PDHM a DNA, kódující konstantní oblast κ řetězce lidského imunoglobulinu. Bylo zjištěno, že fuzní fragment je lokalizován v downstream oblasti promotoru cytomegaloviru (CMV) ve správné orientaci.

(4) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, že DNA inzerty plasmidů pLPDHH75 a pLPDHM32 mají očekávané nukleotidové sekvence, byly DNA inzerty analyzovány a byly stanoveny jejich nukleotidové sekvence. Oligonukleotidově primery, použité pro nukleotidové sekvenování, byly SPI (SEQ ID č. 68), SP2 (SEQ ID č. 69), SP3 (SEQ ID č. 70), SP4 (SEQ ID č. 71), SP5 (SEQ ID č. 72) a SP6 (SEQ ID č. 73).

Pozice, do kterých se každý primer váže, jsou ukázány na obr. 19. Stanovení nukleotidové sekvence bylo provedeno metodou řetězové dideoxynukleotidové terminace. Jako templáty byly použity plasmid, obsahující sekvenci, která má být potvrzena a plasmid, purifikovaný metodou alkalické lýze a metodou s chloridem česným. Podle očekávání bylo potvrzeno, že pLPDHH75 má nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 106 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID • · · «···« • ·· · ········ • · · » · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

130

č. 107 a že pLPDHM32 měl nukleotidovou sekvenci SEQ ID č. 108 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID č. 109.

Odkazový příklad 22

Příprava DNA, kódující polidštěný těžký řetězec (1) Konstrukce vektoru pro těžký řetězec polidštěné verze protilátky HFE7A

V dalším polidšťování byly aminokyselinové sekvence SEQ ID č. 75 na seznamu sekvencí (polidštěný těžký řetězec myšší protilátky HFE7A proti lidskému Fas), 44 aminokyselina (arginin) a 76 aminokyselina (alanin) v aminokyselinové sekvenci SEQ ID č. 75 nahrazeny glycinem a threoninem, Tyto zbytky jsou v lidském těžkém řetězci neměnné. Vznikající sekvence byla označena jako „HV typ“.

Expresní plasmidy, nesoucí aminokyselinové sekvence HV typu polidštěného těžkého řetězce protilátky HFE7A proti lidskému Fas, byly konstruovány následovně.

(1) Syntéza primerů pro přípravu variabilní oblasti polidštěného těžkého řetězce

Syntéza DNA (SEQ ID č. 116 na seznamu sekvencí), kódující těžký řetězec polidštěné protilátky HFE7A proti Fas (SEQ ID č. 117 na seznamu sekvencí), byla provedena kombinací jednotlivých kroků PCR

Kromě primerů 7AH1P (SEQ ID č. 76) byly pro PCR syntetizovány následující 3 primery.

5'-CAGGCCCCTG GACAGGGCCT TGAGTGGATG-3' (HPD1P; SEQ ID č. 118)

5'-CATCCACTCA AGGCCCTGTC CAGGGGCCTG-3' (HPD1N; SEQ ID č. 119); a

5'-GCTGAGCTCC ATGTAGGCTG TGCTAGTGGA TGTGTCTAC-3' (HPD2N; SEQ ID č. 120)

2) Konstrukce plasmidu pgHPDHV3 • · · · · · • · · · · » • « * · · • · ··· · · · ··» ·

131 • · · · · · · φ · · ·· ··

HPD1.2-DNA fragment, kódující aminokyseliny č. -19 až +84 o SEQ ID č. 117 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR, poté byl začleněn do plasmidů a klonován v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu HPD1.2-DNA je ukázán na obr. 39.

HPD1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a FRHi, CDRHi a část FRH2 s místem pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidaným na 5'-konec, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHSL7A62, 200 ng;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD1N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HPD2-DNA fragment, kódující část FRH2, CDRH3 a část FRH3, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHSL7A62, 200 ng;

oligonukleotidový primer HPD1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

• ···· · ·· ·· ·· • · · ·· · · · · · · • · · ····« • · · · ········ • · · · · · · ··· ·· ······· ·· ··

132

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byly amplifikované HPD1 a HPD2 DNA fragmenty nejdříve podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a poté byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a DNA proužky, detekované pod UV světlem, byly žiletkou vyříznuty a eluovány z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla nakonec rozpuštěna v 50 pl destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu HPD1.2-DNA je ukázán na obr. 40.

HPD1.2-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané HPD1-DNA a HPD2DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Složení roztoku pro PCR reakci:

Roztok HPD1-DNA (z první fáze PCR), 10 pl;

Roztok HPD2-DNA, (z první fáze PCR), 10 pl;

oligonukleotidový primer 7AH1P, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HPD2N, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

• ·· ·

Φ· ♦ ·· · · · · · · • · · · · · · · • · · · ···♦·♦·· • · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

133

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný HPD1.2-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Konstrukce plasmidu, nesoucího HPD1.2-DNA fragment, je nastíněna na obr. 41.

Výše získaný HPD1.2-DNA fragment byl dále purifikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Sací.

Dále bylo 10 pg DNA plasmidu pgHSL7A62 naštěpeno restrikčními enzymy Hind III a Sací a defosforylováno pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pgHSL7A62 (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg HPD1.2-DNA, která byla předtím rovněž naštěpena s HindlII a Sací. Ligační směs byla klonována v E. coli JMI09. Jakékoliv vznikající transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze.

Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího inzertu, byl extrahovaný plasmid naštěpen HindlII a Sací a podroben elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Byl tak získán plasmid pgHPDHV3, nesoucí fúzní inzert, skládající se z DNA fragmentu, kódujícího variabilní oblast těžkého řetězce polidštěné HFE7A typu HV a fragmentu genomové DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl. Transformant E. coli pgHPDHV3 SANK 70298, obsahující plasmid pgHPDHV3, byl 26. února 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou o ukládání mikroorganismů a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6273.

···· ·· · ·· · · · · · · • · · ····♦ • · · · ···»··· 9 • · · · · · * ·9· ·· ··· ···♦ 99 99

134

Deset pg takto získané DNA plasmidu pgHPDHV3 bylo štěpeno restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. Současně byl naštěpen 1 pg DNA savčího expresního plasmidu pEE.6.1 s Hind III a EcoRI a byl defosforylován použitím CIP. Vznikající, defosforylovaná DNA plasmidu pEE.6.1 (100 ng) byla použitím soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg naštěpené pgHPDHV3 DNA a klonována v E. coli JMI09. Jakékoliv vzniklé transformanty byly kultivovány přes noc při 37 °C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byl plasmid štěpen s Hind III a EcoRI a podroben elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Tak byl získán plasmid pEgPDHV3-21, obsahující fuzní inzert, skládající se z DNA fragmentu, kódujícího variabilní oblast těžkého řetězce polidštěné HFE7A typu HV a fragmentu genomové DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl. Inzert byl lokalizován v downstream oblasti CMV promotoru a ve správné orientaci.

(3) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, že DNA inzert plasmidu pEgPDHV3-21 měl žádoucí nukleotidovou sekvenci, byl DNA inzert analyzován a byla stanovena nukleotidové sekvence. Pro sekvenování byly použity primery PEEF (SEQ ID č. 104), HPD1P (SEQ ID č. 118), HPD1N (SEQ ID č. 119) a HPD2N (SEQ ID č. 120).

Pozice, do kterých se primery vážou, jsou ukázány na obr. 42. Stanovení nukleotidových sekvencí bylo uskutečněno metodou řetězové dideoxynukleotidové terminace. Jako templáty byly použity plasmidy, obsahující sekvence, které mají být potvrzeny, purifikované metodou alkalické lýze a metodou s chloridem česným.

Podle očekávání bylo potvrzeno, že pEgPDHV3-21 měl nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.

116 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID č. 117.

Odkazový příklad 23

Konstrukce vysokoúčinných expresních vektorů, optimalizovaných pro COS-1 buňky »»·· • · · · · • · · · · • · · · ···♦♦··· » · 9 * · · ·

135 ................

Vysokoúčinné expresní vektory, optimalizované pro COS-1 buňky, byly konstruovány použitím výše popsaných vektorů p7AL-HH, p7AL-HM, p7AL-MM, pLPDHH75, pLPDHM32, pEg7AH-H a pEgPDHV3-21.

(1) Vysokoúčinné expresní vektory pro polidštěné lehké řetězce

Konstrukce vysokoúčinných expresních vektorů pro polidštěné lidské řetězce je nastíněna na obr. 43.

1) Syntéza primerů pro přípravu DNA fragmentu SR a promotoru

DNA fragment SR a promotoru byl pro začlenění do expresních vektorů polidštěných lehkých řetězců syntetizován pomocí PCR.

Pro PCR byly syntetizovány následující 2 oligonukleotidové primery:

'-TGCACGCGTG GCTGTGGAAT GTGTGTCAGT TAG-3' (MLUA: SEQ ID č. 121); a

5'-TCCGAAGCTT TTAGAGCAGA AGTAACACTT C-3' (HINDB: SEQ ID č. 122)

2) Konstrukce plasmidů

Po syntéze byl DNA fragment SR ct promotoru inzertován do vektorů p7AL-HH, p7ALHM, p7AL-MM, pLPDHH75 nebo pLPDHM32 a poté byl klonován v E. coli.

LSR α-DNA fragment, skládající se z SR a promotoru s místem pro štěpení restrikčním enzymem Mlul přidaným na 5'-konec a s místem pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidaným na 3'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME18S, 200 ng;

oligonukleotidový primer MLUA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HINDB, 80 pmol;

• fefefefe · ·· fefe fefe •« fe · · fe · fefefefe • · · fefe fefe · • · · · fefefe····· • fefe fefe fefe • fefe fefe ··· fefe·· fefe fefe

136 směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný LSR α-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a poté byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Jeden pg DNA plasmidu p7AL-HH, p7AL-HM, p7AL-MM, pLPDHH75 nebo pLPDHM32 byl naštěpen restrikčními enzymy Mlul a HindlII a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla poté pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 μΐ roztoku, obsahujícího LSR α-DNA fragment, který byl rovněž naštěpen s Mlul a HindlII. E. coli JM109 byla poté transformována s ligační směsí a rozetřena na agarové LB médium, obsahující 50 pg/ml amplicilinu. Získané transformanty byly kultivovány při 37 °C přes noc ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla štěpena Mlul a Hind III a klon, nesoucí LSR α-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Výše uvedeným postupem byly získány vysokoúčinné expresní vektorové plasmidy pSRHH (HH typ), pSRHM (HM typ), pSRMM (MM typ), pSRPDHH (PDHH typ) a pSRPDHM (PDHM typ).

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 000 000

0 0

0000 00 00

137

0 (2) Vysokoúčinné expresní vektory pro polidštěné těžké řetězce

Konstrukce vysokoúčinných expresních vektorů pro polidštěné těžké řetězce je nastíněna na obr. 44.

1) Syntéza primerů pro přípravu DNA fragmentu SR a promotoru

DNA fragment SR a promotoru byl pro začlenění do expresních vektorů pro polidštěné těžké řetězce syntetizován pomocí PCR.

Kromě HINDB (SEQ ID č. 122) byl pro PCR syntetizován následující oligonukleotidový primer:

5'- AAAGCGGCCG CTGCTAGCTT GGCTGTGGAA TGTGTG -3' (NOTA: SEQ ID č. 123).

2) Konstrukce plasmidů

DNA fragment SR a promotoru byl syntetizován pomocí PCR, inzertován do výše popsaného vektoru pEg7AH-H nebo pEgPDHV3-21 a poté byl klonován v E. coli.

HSR α-DNA fragment, zahrnující SR oc promotor s místem pro štěpení restrikčním enzymem Notl přidaným na 5'-konec a s místem pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidaným na 3 'konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pME18S, 200 ng;

oligonukleotidový primer NOTA, 80 pmol;

oligonukleotidový primer HINDB, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

• ΦΦΦ

Φ » 4

Φ φφ φφ • φ φ · φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ • Φ φφ

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po PCR byl amplifikovaný HSR α-DNA fragment nejdříve podroben fenolové extrakci a etanolovému srážení a potom byl separován elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a proužek DNA, detekovaný pod UV světlem, byl žiletkou vyříznut a eluován z gelu použitím zařízení Centriruter a Centricon-10, jak je popsáno výše. Eluovaná DNA byla koncentrována odstředěním při 7 500 x g, následovalo etanolové srážení a sraženina byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

Jeden μg DNA plasmidu pEg7AH-H nebo pEgPDHV3-21 byl naštěpen restrikčními enzymy Notl a HindlII a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla poté pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 μΐ roztoku, obsahujícího HSR α-DNA fragment, který byl rovněž naštěpen s Notl a HindlII. E. coli JMI 09 byla transformována s ligační směsí a rozetřena na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 1 mM IPTG, 0,1 hmotn./obj. % X-Gal a 50 pg/ml amplicilinu. Získané bílé transformanty byly kultivovány při 37 °C přes noc ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Extrahovaná plasmidová DNA byla štěpena Notl a Hind III a klon, nesoucí HSR α-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu.

Výše uvedeným postupem byly získány vysokoúčinné expresní vektorové plasmidy pSRg7AH a pSRgPDH (HV typ).

Odkazový příklad 24

Exprese v COS-1 buňkách

Transfekce COS-1 buněk s vysokoúčinnými expresními plasmidy pro každý z těžkých řetězců polidštěné HFE7A a pro každý z lehkých řetězců polidštěné HFE7A, které byly získány

« ·· ·· ·· ·· · · · · · * • S · · · · • 4 · ·<··«« · · · »»♦ ···· 4· *· výše, byla uskutečněna elektroporací a to způsobem, který je podobný tomu, popsanému v odkazovém příkladu 16.

COS-1 buňky byly kultivovány do semikonfluentní fáze v kultivační baňce (kultivační plocha: 225 cm²), obsahující oc(+)MEM, doplněné o 10 obj. % FCS. Médium nebylo dále používáno a COS-1 buňky byly odebrány z baňky prostřednictvím působení 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma Chemicals Co.) při 37 °C po dobu 3 min.. Oddělené buňky byly poté sklizeny odstředěním 2 min. při 800 rpm a byly dvakrát promyty PBS(-) pufrem. Promyté COS1 buňky byly naředěny PBS (-) pufrem na hustotu buněk 1 x 10⁸ buněk/ml a tím vznikla buněčná suspenze buněk COS-1.

Současně byly smíchány 4 pg expresní plasmidové DNA těžkého řetězce polidštěné HFE7A a 4 pg expresní plasmidové DNA lehkého řetězce polidštěné HFE7A, připravených metodou alkalické lýze a odstředěním v hustotním gradientu chloridu česného. Vzniklá směs byla srážena etanolem a poté byla sraženina suspendována ve 20 pl PBS (-) pufru. Celý tento proces byl prováděn ve stejné zkumavce. Vzniklá suspenze plasmidu (20pl) byla smíchána s 20 pl předem připravené suspenze buněk COS-1 (2 x 10⁶ buněk) a směs byla převedena do FCT-13 elektroporační nádobky (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.) s elektrodami ve vzdálenosti 2 mm. Nádobka pak byla dána do přístroje pro transfekci genů GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.). Aby došlo k transformaci COS-1 buněk s plasmidovou DNA, která je předmětem zájmu, byly dvakrát v intervalu 1 s aplikovány 2 pulsy, každý 600 V, 50 pF.

Po elektroporací byla směs buňka-DNA, umístěná v nádobce, suspendována v kultivační baňce (plocha kultivace 25 cm²; Sumimoto Bakelite) v 5 ml a(+)MEM, doplněného o 10 obj. % FCS a inkubována při 37 °C, 72 hod. pod 5 obj. % CO₂. Po této době byl supernatant odebrán a byly analyzovány produkty exprese.

Použitím výše uvedené metody byly získány COS-1 buňky, transfektované s každou z následujících plasmidových kombinací:

(A) : bez plasmidové DNA (B) : kotransfekce pSRgPDH a pSRPDHH;

(C) : kotransfekce pSRgPDH a pSRPDHM;

(D) : kotransfekce pSRg7AH a pSRHH;

(E) : kotransfekce pSRg7AH a pSRHM; a • · • · · · · · ·

............

(F): kotransfekce pSRg7AH a pSRMM.

Odkazový příklad 25

Stanovení vazebné aktivity Fas

Stanovení vazebné aktivity Fas v supernatantu buněčné kultury, připraveného v odkazovém příkladu 24, bylo provedeno metodou ELISA následovně.

Adsorpčním pufrem 5 krát naředěný supernatant kultury COS-1 buněk, exprimujících lidský Fas fuzní protein, jak byl získán ve výše uvedeném odkazovém příkladu 1, byl rozdělen do jamek mikrotitrační destičky s 96 jamkami (MaxiSorb; Nunc) po 50 μΐ do jamky. Aby bylo dosaženo adsorpce lidského Fas fuzního proteinu na povrch jamek, byla mikrotitrační destička inkubována přes noc při 4 °C. Poté byla každá jamka 4 krát promyta 350 μΐ PBS-T. Po promytí bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ PBS-T, obsahujícího 5 obj. % BSA (hovězí sérový albumin; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Aby byl blokován zbytek povrchu každé jamky, byla mikrotitrační destička inkubována 1 h při 37 °C. Jamky byly poté opět 4 krát promyty PBS-T.

Supematanty kultury, získané v odkazovém příkladu 16, byly upraveny tak, že měly konečnou koncentraci sledovaného produktu 100 ng/ml v a(+)MEM, které obsahuje 10 obj. % FCS. Koncentrace byly stanoveny metodou, popsanou v odkazovém příkladu 17. Každý ze vzniklých roztoků o koncentraci 100 ng/ml byl použit pro pravidelné zřeďování sérií 2 násobných ředění a(+)MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS. 50 μΐ každého ze vznikajících ředění každého produktu exprese bylo přidáno do jamky, připravené výše uvedeným způsobem a aby proběhla reakce byla mikrotitrační destička inkubována 2 h při 37 °C.

Po této době byly jamky znovu 4 x promyty PBS-T a poté bylo do každé jamky dáno 50 μΐ alkalickou fosfatázou značené kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc, (Caltag Lab.), která byla 10 000 x naředěna PBS-T. Reakce probíhala 2 h při 37 °C.

Jako kontrola (IgGl) byla použita HFE7A, purifikovaná z HFE7A myššího hybridomu a byla detekována pomocí 5 000 krát zředěné PBS-T pufrem, alkalickou fosfatázou značené kozlí

141 • · · · · · • · · · · • · ··· ·· · • · · ····· ·· ·· protilátky proti myšším IgG + IgA + IgM (Gibco BRL) místo alkalickou fosfatázou značené kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc.

Jamky byly opět 4 x promyty PBS-T, poté bylo do každé jamky přidáno 50 μί roztoku substrátu [1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu v 10 obj. %ním diethanolaminu (pH 9,8)] a mikrotitrační destička byla inkubována 0,5 až 1 h při 37 °C. Vazebná aktivita produktu exprese, obsaženého v supematantů každé kultury, s lidským Fas fuzním proteinem, byla zjištěna odečtením absorbance každé jamky při 405 nm.

Vazebná aktivita pro lidský Fas fuzní protein byla podle očekávání zjištěna pro supernatanty kategorií (B), (C), (D), (E) a (F), z výše uvedeného odkazového příkladu 24, a je ukázána na obr. 45.

Odkazový příklad 26

Kompetitivní inhibice vazebné aktivity Fas protilátky HFE7A

Polidštěné protilátky proti Fas, získané v odkazovém příkladu 24, by měly inhibovat vazbu HFE7A na Fas, protože byly odvozeny od HFE7A. Proto byla měřena schopnost produktů exprese, získaných v odkazovém příkladu 24, kompetitivně inhibovat vazbu HFE7A na lidský Fas fuzní protein.

Pro luminiscenční detekování (Luminescent Solid Assay Plate, high binding property; Costar) byl supernatant buněčné kultury COS-1 buněk, obsahující lidský Fas fuzní protein, jak byl získán v odkazovém příkladu 1, 5 x naředěn adsorpčním pufrem a rozdělen po 50 μί do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Aby bylo dosaženo adsorpce lidského Fas fúzního proteinu na povrch jamek, byla mikrotitrační destička inkubována přes noc při 4 °C.

Po této době byla každá jamka 4 krát promyta 350 μί PBS-T a poté bylo do každé jamky přidáno 100 μί PBS-T, obsahujícího 5 obj. % BSA. Pro blokování zbytku povrchu každé jamky, byla mikrotitrační destička inkubována 1 h při 37 °C. Jamky byly potom opět 4 krát promyty PBS-T.

• ·

Supematanty, získané v odkazovém příkladu 24, byly postupem z odkazového příkladu 17 upraveny na konečné koncentrace protilátky 1 pg/ml v a(+)MEM, které obsahuje 10 obj. % FCS. Každý ze vzniklých roztoků produktů exprese byl použit pro pravidelné zřeďování sérií 2 násobných ředění a(+)MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS. AP-HFE7A byla naředěna α(+) MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS, na koncentraci 50 ng/ml a 25 pl vznikajícího roztoku bylo smícháno se stejným objemem každého z připravených ředění.

Každá jamka byla opět 4 x promyta PBS-T, poté bylo do jednotlivých jamek přidáno 50 pl každé vznikající směsi protilátek a mikrotitrační destička byla ponechána přes noc při teplotě místnosti. Po 4 násobném promytí každé jamky PBS-T bylo do každé jamky dáno 100 pl CDPstar pufru (9,58 ml dietanolaminu, 0,2 g chloridu hořečnatého, 0,25 g azidu sodného, pH 8,5) a mikrotitrační destička byla ponechána 10 min. při teplotě místnosti. Po této době byl odstraněn CDP-star pufr, do každé jamky bylo přidáno 50 pl CDP-star substrátu [1,2 ml sapphire II (Tropix), 200 pl CDP-star (Tropix), doplněno do 12 ml CDP-star pufrem] a mikrotitrační destička byla ponechána dalších 40 min. při teplotě místnosti.

Kompetitivní inhibice produktů exprese z odkazového příkladu 24 vazby HFE7A na lidský Fas fuzní protein byla stanovena měřením intenzity luminiscence pomocí zařízení Luminoscan (Titertech).

Podle očekávání bylo ověřeno, že každý produkt exprese supematantů (B), (C), (D), (E) a (F), získaných v odkazovém příkladu 24, specificky inhiboval vazbu protilátky HFE7A na lidský Fas fúzní protein. Výsledky jsou ukázány na obr. 46.

Odkazový příklad 27

Aktivita, indukující apoptózu

Apoptózu indukující aktivita produktů exprese v supematantu kultury, získaných v odkazovém příkladu 24, byla testována způsobem, podobným tomu, popsanému v odkazovém příkladu 20.

WR19L12a buňky byly kultivovány v médiu RPMI 1640 s 10 obj. % FCS (Gibco BRL) 3 dny při 37 °C a pod 5 obj. % CO2 a do každé jamky mikrotitrační destičky s 96 jamkami

-η₃·· (Sumitomo Bakelite) bylo dáno 50 μΐ (1 x 10⁵ buněk) vznikající kultury. Supernatanty kultury, získané v odkazovém příkladu 24, byly upraveny na konečnou koncentraci protilátky 100 ng/ml v RPMI 1640 médiu, obsahujícím 10 obj. % FCS. Koncentrace byly stanoveny metodou, uvedenou v odkazovém příkladu 17. Každý z upravených roztoků produktů exprese byl použit pro přípravu pravidelných ředění sérií 2 násobných ředění roztokem RPMI 1640, který obsahuje 10 obj. % FCS. Každé vznikající ředění roztoku každého produktu exprese bylo přidáno po 50 μΐ do každé jamky a mikrotitraění destička byla inkubována 1 h při 37 °C. Po této době byly buňky v každé jamce 1 x promyty RPMI 1640 médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS a poté byly promyté buňky v každé jamce suspendovány ve 100 μΐ roztoku kozlí specifické polyklonální protilátky proti lidskému IgG Fc (Kappel) v RPMI 1640, obsahujícího 10 obj. % FCS.

Mikrotitraění destička byla ponechána stát 12 h při 37 °C a poté bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 25 μΜ PMS (fenazinmetosulfát; Sigma Chemical Co.), obsahujícího 1 mg/ml XXT [2,3-bis(2-metoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxyanilidová vnitřní sůl, Sigma Chemical Co.] do konečných koncentrací 333 μg/ml pro XXT a 8,3 μΜ pro PMS. Mikrotitraění destička byla inkubována 3 h při 37 °C a byla měřena absorbance každé jamky při 450 nm. Z té pak byla s použitím redukční síly mitochondrie jako indexu, spočítána životaschopnost buňky.

v

Životaschopnost buněk v každé jamce byla spočítána podle následujícího vztahu:

životaschopnost (%) = 100 x (a-b) / (c - b) kde „a“ je absorbance testovací jamky, „b“ je absorbance jamky bez buněk a „c“ je absorbance jamky bez přidání protilátky.

Jak bylo očekáváno, každý z expresních produktů supematantu (B), (C), (D), (E) a (F), získaných v odkazovém příkladu 24, indukoval apoptózu v T buňkách této linie buněk lymfomu, exprimujících lidský Fas antigen (obr. 47).

Příklad 1

Navrhování polidštěné protilátky HFE7A typu Eu • · · ···· · · · · • · · · · · · · • ·· · · · ······ • · · · · · · *144.............

Ve výše uvedených odkazových příkladech byla jako akceptor vybrána lidská protilátka 8E10'CL. V alternativním přístupu předmětného vynálezu byla pro přípravu polidštěné protilátky (dále je polidštěná protilátka nebo její podjednotka, jak byla připravena v odkazových příkladech, označována jako „8E10 typ“, zatímco polidštěná protilátka HFE7A nebo její podjednotka, mající Eu jako akceptor, je označována jako „Eu typ“) vybrána jako akceptor lidská protilátka Eu.

(1) Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A

Molekulární modelování variabilních oblastí HFE7A bylo uskutečněno metodou obecně známou jako modelování homologie [Methods in Enzymology, 203,121 až 153, (1991)].

Primární sekvence variabilních oblastí lidských imunoglobulinů, registrovaných v proteinové databance Protein Data Bank (dále označovaná jako „PDB“; Chemistry Department, Building 555, Brookhaven National Laboratory, P.O. Box 5000, Upton, NY 11973-5000, USA), pro které byla udělána rentgenová krystalografie, byly srovnány s rámcovými oblastmi HFE7A, které byly stanoveny výše. V závěru byly vybrány 1GGI a 2HFL, protože vykazují nejvyšší homologii trojrozměrných struktur rámcových oblastí pro lehké a těžké řetězce. Trojrozměrné struktury rámcových oblastí byly vytvářeny kombinováním vlastností 1GGI a 2HFL a kalkulací vlastností oblastí HFE7A, jak je popsáno níže, a tím byl získán „rámcový model“.

Použitím klasifikace, popsané autory Chothia a kol., byly CDR v HFE7A klasifikovány následovně: CDRL2, CDRL3 a CDRHi jako patřící ke kanonické třídě 1, zatímco CDRLi, CDRH2 a CDRH3 se nejevily jako patřící k jakékoliv specifické kanonické třídě. CDR smyčky CDRL2, CDRL3 a CDRH] byly připsány konformacím, které jsou typické pro jejich odpovídající kanonické třídy, a byly integrovány do rámcového modelu. CDRLi byla určena jako konformace svazku 15B v souladu s klasifikací autorů Thomton a kol. [J. Mol. Biol., 263, 800 až 815, (1996)]. Pro CDRH2 a CDRH3 byly z PDB vybrány konformace sekvencí s vysokými homologiemi a tyto byly kombinovány s výsledky energetických výpočtů. Poté byly vzaty konformace CDR smyček s nejvyššími pravděpodobnostmi a byly integrovány do rámcového modelu.

Aby byl eliminován nežádoucí kontakt mezi nevhodnými atomy, ve smyslu energie, byly nakonec provedeny energetické výpočty s cílem získat molekulární model EÍFE7A. Výše zmíněný postup byl proveden pomocí komerčně běžně dostupného molekulárního modelovacího systému, AbM (Oxford Molecular Limited, lne.), ačkoli by mohl být použit jakýkoliv další odpovídající systém.

Správnost struktury získaného molekulámého modelu byla dále vypočítána pomocí PROCHECK softwaru [J. Appl. Cryst., (1993), 26, 283 až 291] a byl spočítán stupeň povrchového vlivu každého zbytku s cílem stanovit, které povrchové atomy a skupiny interagovaly.

(2) Výběr akceptoru

Srovnáním se shodnými sekvencemi odpovídajících podskupin lidských protilátek bylo zjištěno, že podskupiny lehkých a těžkých řetězců HFE7A sdílely identitu ze 79 % s podskupinou kIV a ze 79 % s podskupinou I. Nebyla zde však žádná lidská protilátka, mající tuto kombinaci podskupin. Lidská protilátka Eu byla vybrána jako protilátka, ve které byly lehký a těžký řetězec ze stejné protilátky a která vykazovala nejvyšší možnou homologii s HFE7A.

Protilátka Eu byla běžně používána k polidštění protilátek (pro aminokyselinovou sekvenci Eu, viz Kabat, E. A., a kol.). Lehký řetězec protilátky Eu patří do podskupiny κΐ a a těžký řetězec do podskupiny I.

(3) Výběr donorových zbytků, které budou začleněny do akceptoru

Aminokyselinová sekvence každého z lehkých a těžkých řetězců HFE7A byla linearizována se sekvencí odpovídajícího řetězce akceptoru a v souladu s obecnými pokyny, které jsou uvedeny výše v a) až d), byly navrženy polidštěné sekvence variabilních oblastí, jak je popsáno v následujících příkladech.

Plasmidy, které byly konstruovány, mohly sloužit jako rekombinantní vektory, obsahující nukleotidové sekvence DNA, kódující polidštěné protilátky typu Eu proti Fas. Jako templáty byly použity vektory, obsahující DNA, kódující polidštěný lehký řetězec typ 8E10 a těžké řetězce, připravené v odkazovém příkladu 14 a 15, a byly modifikovány tak, že aminokyselinová sekvence v FR oblasti byla Eu typu (obr. 48 a 49).

146

DNA, kódující konstantní oblast lehkého řetězce, která byla získána klonováním, byla ligována s DNA, kódující variabilní oblast. Konstantní oblast těžkého řetězce typu 8E10 byla použita bez modifikování, protože byla stejná jako oblast těžkého řetězce typu Eu.

Příklad 2

Konstrukce expresního vektoru lehkého řetězce polidštěné protilátky HFE7A typu Eu (1) Klonování cDNA, kódující lidský lehký řetězec (podskupina κ řetězce typu I)

Před přípravou lehkého řetězce polidštěné protilátky HFE7A typu Eu bylo provedeno klonování cDNA lidského lehkého řetězce podskupiny κ řetězce typu I.

1) Syntéza primeru

Syntéza primeru cDNA, kódující lidský lehký řetězec (podskupina κ řetězec typu I), byla uskutečněna pomocí PCR. Pro PCR byl syntetizován následující oligonukleotidový primer:

5'- AAGCTTATGG ACATGAGGGT CCCCGCTCTG CTCC-3' (FHKI: SEQ ID č. 124 na seznamu sekvencí) a byl použit v kombinaci s 7ALCN (SEQ ID č. 64 na seznamu sekvencí).

2) Konstrukce plasmidu

SpHE fragment, kódující celý lehký řetězec lidského imunoglobulinu, mající podskupinu κ řetězce typu I ve variabilní oblasti, byl připraven za následujících podmínek:

Složení roztoku pro PCR reakci:

knihovna cDNA lidské sleziny (Life Technologies), 25 ng;

primer FHKI (10 μΜ), 5 μΐ;

primer 7ALCN (10 μΜ), 5 μΐ;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

mM Tris-HCl pufr (pH 8,2), 5 μΐ;

• · · ·

147 • · 4 » · · » · · • · · 4 • · 4

M chlorid draselný, 2,5 μΐ;

mM chlorid hořečnatý, 5 μΐ;

Taq DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Takto připravený fragment SpHE-DNA byl, pomocí sady Eukaryote TA Cloning Kit (Invitrogen) a s použitím výrobního protokolu, inzertován do plasmidů pCR3.1 a včleněn do kompetentní E. coli TOPIOF', která je součástí sady. Tím byl získán plasmid pKISp35, nesoucí SpHE-DNA fragment, který je cDNA lehkého řetězce lidského imunoglobulinu, majícího podskupinu κ řetězce typu I ve variabilní oblasti.

3) Analýza nukleotidové sekvence

Nukleotidové sekvence SpHE-DNA fragmentu, který nesou plasmidy pKISp35, získané ve výše uvedeném bodě (2), byly stanoveny metodou dideoxidové terminace [Sanger, F.S., a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 až 5467] použitím analyzátoru genových sekvencí (Model 310 Genetic Analyzer; Perkin Elmer Japan). Výsledkem bylo získání nukleotidové sekvence SEQ ID č. 125, na seznamu sekvencí. Sekvence odpovídala nukleotidové sekvenci cDNA, kódující lehký řetězec lidského Ig, majícího podskupinu κ řetězce typu I ve variabilní oblasti.

(2) Konstrukce expresních plasmidových vektorů pro lehký řetězec polidštěné HFE7A typu Eu cDNA byly připraveny tak, že kódují tři typy aminokyselinových sekvencí polidštěného lehkého řetězce typu Eu, modifikované tak, že FR lehkého řetězce polidštěné HFE7A byly podobné řetězcům molekuly Eu typu (podkupina typu I), jak je ukázáno na obr. 48 (dále označené jako „LEU1 typ“, „LEU2 typ“ a „LEU3 typ“). cDNA byly připraveny podle následující metody a každá z nich byla inzertována do plasmidů.

(1) Syntéza primerů ns

I ·· · • · » · • · • · · · » · · « » · · · • · · · · ·

Pro konstrukci následujících sekvencí DNA byla použita PCR. Každá sekvence obsahovala variabilní oblast lehkého řetězce polidštěné HFE7A typu Eu a konstantní oblast lehkého řetězce lidského imunoglobulinu (κ řetězec):

DNA (SEQ ID č. 126 na seznamu sekvencí), kódující LEU1 typ polypeptidového řetězce (SEQ ID č. 127 na seznamu sekvencí);

DNA (SEQ ID č. 128 na seznamu sekvencí), kódující LEU2 typ polypeptidového řetězce (SEQ ID č. 129 na seznamu sekvencí); a

DNA (SEQ ID č. 130 na seznamu sekvencí), kódující LEU3 typ polypeptidového řetězce (SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí).

Kromě primeru 7ALCN (SEQ ID č. 64 na seznamu sekvencí) a primem 7AL1P (SEQ ID ě. 55 na seznamu sekvencí) bylo pro PCR syntetizováno následujících 10 oligonukleotidových primerů:

5'-AGGGAGGATG GAGATTGGGT GAGCACAATG TCACCAGTGG A-3' (7ALR2; SEQ ID č. 132);

5'-ATTGTGCTCA CCCAATCTCC ATCCTCCCTG TCTGCATCT-3' (7ALF12; SEQ ID č. 133);

'-ATCAACACTT TGGCTGGCCT TGCAAGTGAT GGTGACTCTG TC-3' (7ALR33; SEQ ID č. 134);

5'-CCATCACTTG CAAGGCCAGC CAAAGTGTTG ATTATGATGG-3' (7ALF2; SEQ ID č. 135);

5'-AGTTTCGCGA TTGGATGCAG CATAGATGAG GAGTTTGGGT GCCTTTCC-3' (7ALR45; SEQ ID č. 136);

5'-CCCAAGCTCC TCATCTATGC TGCATCCAAT TTGGAAAGTG GGGTC-3' (7ALF33; SEQ ID č. 137);

5'-TTGGCCGAAC GTTCGAGGAT CCTCGTTACT CTGTTGACAG TAGT-3' (7ALR53; SEQ ID č. 138);

5'-ACTACTGTCA ACAGAGTAAC GAGGATCCTC GAACGTTCGG CCAA-3' (7ALF53; SEQ ID č. 139);

5'-CTCATCTATG CTGCATCCAA TTTGGAAAGT GGGATCCCAT CAAGG-3' (7ALF34; SEQ ID č. 140); a

5'-ATTGGATGCA GCATAGATGA GGAGCTTGGG TGCCTGTCCT GGTTT-3' ··*·

149 *· • 9 » 9 ) · ··· * · ) 9 » · • 99 (7ALR44; SEQ ID č. 141).

(2) Příprava DNA, kódující LEU1 typ lehkého řetězce

1) Příprava LEU1 DNA fragmentu

LEU1-DNA fragment (SEQ ID č. 126 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 127 na seznamu sekvencí, byla připravena 2 fázovou PCR, poté byla začleněna do plasmidového vektoru a klonována v E. coli.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu LEU1-DNA je ukázán na obr. 50.

LEUA21-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci a část FRLi oblasti, pozměněné tak, že obsahuje místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'konci, byl připraven následovně. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pHSGHM17, připravený v odkazovém příkladu 14.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHM17, 25 ng;

primer 7AL1P, 5 pmol;

primer 7ALR2, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LEUB21-DNA fragment, kódující část FRLi oblasti a část CDRLi oblasti, byl připraven následovně.

·«» · ·» ·« «« • · · « · *· • · t · · • · ··· ·«« « 9 »

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pKISp35, 25 ng;

primer 7ALF12, 5 pmol;

primer 7ALR33, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LEUC31 DNA fragment, kódující část FRLi oblasti, CDRLi oblast, FRL₂ oblast a CDRL₂ oblast, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHM17, 25 ng;

primer 7ALF2, 5 pmol;

primer 7ALR45, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LEUD21-DNA fragment, kódující část FRL₂ oblasti, CDRL₂ oblast, FRL3 oblast, CDRL3 oblast a část FRL4 oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

··· ··· • · • · · ·

151

DNA plasmidu pKISp35, 25 ng;

primer 7ALF33, 5 pmol;

primer 7ALR53, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

LEUE21-DNA fragment, kódující část FRL3 oblasti, CDRL3 oblast, FRL4 oblast a konstantní oblast, upravenou tak, že má místo pro štěpení restrikčním enzymem EcoRI na 3 'konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pKISp35, 50 ng;

primer 7ALF53, 5 pmol;

primer 7ALCN, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 50 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého produktu, amplifikováného PCR, byla každá vznikající sraženina DNA podrobena separaci elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze, aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA • · • · proužky, odpovídající LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC31-DNA, LEUD21-DNA a LEUE21-DNA, byly žiletkou vyříznuty.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu LEU1-DNA je ukázán na obr. 51.

LEU 1-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC31-DNA, LEUD21-DNA a LEUE21-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

Složení PCR reakce:

kousek gelu, obsahující LEUA21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUB21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUC31-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUD21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUE21-DNA;

primer 7AL1P, 10 pmol;

primer 7ALCN, 10 pmol;

směs dNTP, 10 μΐ;

x Pfu pufr, 10 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 2 jednotky; a redestilovaná voda do konečného objemu 100 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifikované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a • 9

· 9 · • 9 9 9

9·9 999 ·

9 9 9 sledován pod UV světlem. Proužek, odpovídající LEU1-DNA, byl žiletkou z gelu vyříznut a DNA byla z vyříznutého proužku eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Takto eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, etanolovým srážením a poté byla DNA rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

2) Příprava plasmidu

LEU 1-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí, etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. Jeden μg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 (Takara Shuzo Co., Ltd.) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pHSG399 a naštěpený LEU1-DNA fragment byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit Version 2.0 (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09 (Takara Shuzo Co., Ltd.). Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 0,1 mM IPTG, 0,1 % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu a misky byly přes noc inkubovány při 37 °C s cílem získat transformanty E. coli. Jakékoliv získané bílé transformanty byly kultivovány přes noc při 37°C ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu. Plasmidová DNA byla ze vznikajících kultur extrahována metodou alkalické lýze (Sambrook a kol.).

Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a klon, nesoucí LEU 1-DNA fragment, byl identifikován a selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu.

Byl tak získán plasmid pHSGLEU 15-29-1, nesoucí DNA, která kóduje fuzní polypeptid variabilní oblasti polidštěného lehkého řetězce typu LEU 1 a konstantní oblasti κ řetězce lidského imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSGLEU 15-29-1 SANK 72598, obsahující plasmid pHSGLEUl5-29-1, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP6512.

3) Konstrukce expresního vektoru

154

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidu, nesoucího DNA, kódující LEU-1 typ polidštěného lehkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodu 2), je ukázán na obr. 56.

Jeden pg plasmidu pSRPDHM, připraveného v odkazovém příkladu 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pSRPDHM (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit Iigována s 10 pg pHSGLEU 15-29-1 DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI a poté byla použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a byly inkubovány při 37 °C.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook a kol.]. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Gel byl fixován v roztoku ethidium bromidu. To umožnilo identifikaci a izolaci plasmidu pLEUX 15-29-5, obsahujícího DNA, kódující LEU1 typ polidštěného lehkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

(3) Příprava DNA, kódující LEU2 typ lehkého řetězce

1) Příprava LEU2-DNA fragmentu

LEU2-DNA fragment (SEQ ID č. 128 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 129 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR. Vznikající produkt PCR byl poté začleněn do plasmidového vektoru a klonován v E. coli. Jako templát byl použit plasmid pHSGHM17, zkonstruovaný v odkazovém příkladu 14.

První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu LEU2-DNA je ukázán na obr. 52.

• · ·

155 .....

LEUA21-DNA fragment, LEUB21-DNA fragment, LEUD21-DNA fragment a LEUE21DNA fragment byly amplifíkovány PCR v souladu s postupem (1), popsaným výše.

LEUC211-DNA fragment, kódující část FRLj oblasti, CDRLi oblast, FRL₂ oblast a část CDRL₂ oblasti byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pHSGHM17,25 ng; primer 7ALF2, 5 pmol; primer 7ALR44, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Piu pufr, 5 μΐ;

Piu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého produktu, amplifikovaného PCR, byla vznikající sraženina DNA separována elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužky, odpovídající LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC211-DNA, LEUD21-DNA a LEUE21-DNA, byly žiletkou vyříznuty.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu LEU2-DNA fragmentu je ukázán na obr. 53.

LEU2-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC211-DNA, LEUD21-DNA a LEUE21-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

• ·

Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

Složení PCR reakce bylo následující:

kousek gelu, obsahující LEUA21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUB21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUC211-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUD21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUE21-DNA;

primer 7AL1P, 10 pmol;

primer 7ALCN, 10 pmol;

směs dNTP, 10 μί;

x Pfu pufr, 10 pl;

Pfu DNA polymeráza, 2 jednotky; a redestilovaná voda do konečného objemu 100 μί.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifikované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly poté separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl akrylamidový gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a analyzován pod UV světlem. Gel s proužkem, odpovídajícím LEU2-DNA, byl žiletkou vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, poté byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μί destilované vody.

2) Příprava plasmidu

LEU2-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí a etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a poté byl defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pHSG399 a • · « ► · ·

I · · • · · 4

157 naštěpený LEU2-DNA fragment byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 0,1 mM IPTG, 0,1 % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu. Jakékoliv získané bílé transformanty byly kultivovány ve 2 ml kapalného LB média, obsahujícího 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Vzniklá plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a klon, nesoucí LEU2-DNA fragment, byl po analýze elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu, selektován.

Byl tak získán plasmid pHSGLEU21-28-8, nesoucí DNA, kódující fuzní polypeptid variabilní oblasti polidštěného lehkého řetězce typu LEU2 a konstantní oblasti κ řetězce lidského imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSGLEU21-28-8 SANK 72698, obsahující plasmid pHSGLEU21-28-8, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP6511.

3) Konstrukce expresního vektoru

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidu, nesoucího DNA, kódující LEU-2 typ polidštěného lehkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodu (2), je ukázán na obr. 56.

Jeden pg plasmidu pSRPDHM, připraveného v odkazovém příkladu 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná plasmidová DNA (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit ligována s 10 pg pHSGLEU21-28-8 DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a EcoRI. Vzniklá ligovaná DNA byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a byly inkubovány při 37 °C.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena analýze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu. Gel byl po elektroforéze fixován v roztoku

• · * · · · • · · · · « • · · · · • · · · · · · · • · · ···· ·· · · ethidium bromidu a pozorován pod UV světlem. To umožnilo izolaci plasmidu pLEUX22-7-l, který obsahuje DNA, kódující LEU2 typ polidštěného lehkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci (4) Příprava DNA, kódující LEU3 typ lehkého řetězce

1) Příprava LEU3-DNA fragmentu

LEU3-DNA fragment (SEQ ID č. 130 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR. Takto získaný produkt PCR byl poté inzertován do plasmidového vektoru a klonován v E. coli. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pHSGHM17, zkonstruovaný v odkazovém příkladu 14.

První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu LEU3-DNA fragmentu je ukázán na obr. 54.

LEUA21-DNA fragment, LEUB21-DNA fragment, LEUC31-DNA fragment a LEUE21DNA fragment byly amplifikovány PCR v souladu s popsaným postupem (1).

LEUD31-DNA fragment, kódující část FRL2 oblasti, CDRL2 oblast, FRL3 oblast, CDRL3 oblast a ěást FRL4 oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pKISp35, 25 ng;

primer 7ALF34, 5 pmol;

primer 7ALR53, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

• · · · • · · 9

9 9 ·

999 999

9

9 9 9

159

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého z produktů, amplifikovaných PCR, byla vznikající sraženina DNA separována elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. Gel s proužky, odpovídajícími LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC31-DNA, LEUD31-DNA a LEUE2ΙΩΝΑ, byl žiletkou vyříznut.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu LEU3-DNA fragmentu je ukázán na obr. 55 .

LEU3-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány LEUA21-DNA, LEUB21-DNA, LEUC31-DNA, LEUD31-DNA a LEUE21-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem.

Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

Složení PCR reakce:

kousek gelu, obsahující LEUA21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUB21-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUC31-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUD31-DNA;

kousek gelu, obsahující LEUE21-DNA;

primer 7AL1P, 10 pmol;

primer 7ALCN, 10 pmol;

směs dNTP, 10 pl;

x Pfu pufr, 10 pl;

Pfu DNA polymeráza, 2 jednotky; a redestilovaná voda do konečného objemu 100 pl.

• · ♦ · • · · ·· · ·

160

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifikované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly dále separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a analyzován pod UV světlem. Gel s proužkem, odpovídajícím LEU3-DNA, byl žiletkou z vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, poté byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

2) Příprava plasmidu

LEU3-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí a etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI. Jeden pg DNA klonovacího plasmidu pHSG399 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a byl defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pHSG399 a naštěpený LEU3-DNA fragment byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány.

Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace: 0,1 mM IPTG, 0,1 % X-Gal a 50 pg/ml chloramfenikolu a misky byly inkubovány při 37 °C s cílem získat transformanty E. coli. Jakékoliv získané bílé transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook a kol.]. Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a klon, nesoucí LEU3-DNA fragment, byl identifikován a selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu.

Byl tak získán plasmid pHSGLEU31-6-2, nesoucí DNA, kódující íuzní polypeptid variabilní oblasti polidštěného lehkého řetězce typu LEU3 a konstantní oblasti κ řetězce lidského • 4· 44*

161 imunoglobulinu. Transformant E. coli pHSGLEU31-6-2 SANK 72798, obsahující plasmid pHSGLEU31-6-2, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové ěíslo FERM BP6513.

3) Konstrukce expresního vektoru

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidu, nesoucího DNA, kódující LEU-3 typ polidštěného lehkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodu 2), je ukázán na obr. 56.

Jeden pg plasmidu pSRPDHM, připraveného v odkazovém příkladu 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a EcoRI a defosforylován pomocí CIP. 100 ng defosforylované DNA plasmidu pSRPDHM bylo pomocí soupravy DNA Ligation Kit ligováno s LEU3-DNA, která byla rovněž naštěpena Hind III a EcoRI. Ligaění produkt byl poté použit pro transformaci E. coli JMI 09. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a byly kultivovány při 37 °C.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a EcoRI a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu. To umožnilo izolaci plasmidu pLEUX31-6-2, obsahujícího DNA, kódující LEU3 typ polidštěného lehkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

(5) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, že DNA inzerty plasmidů, získané ve výše zmíněných bodech (2) až (4) mají žádoucí nukleotidové sekvence, byly DNA inzerty analyzovány a byly stanoveny nukleotidové sekvence. Pro tento úěel byly jako sekvenační primery použity primery 7AL1P a 7ALCN:

····

• · · · • » » * • · * · • · · · · · • · « · 9 9

Výsledkem bylo zjištění, že plasmidy pLEUX15-29-5, pLEUX22-7-l a pLEUX31-6-2 měly nukleotidové sekvence SEQ ID č. 126, SEQ ID č. 128 a SEQ ID č. 130 na seznamu sekvencí.

Příklad 3

Konstrukce expresního vektoru polidštěného těžkého řetězce typu Eu

Těžký řetězec protilátky HFE7A, polidštěné použitím akceptoru 8E10 z odkazového příkladu 15, byl modifikován pomocí PCR primerů tak, že FR oblast 8E10 byla nahrazena Eu typem s cílem připravit polidštěný těžký řetězec typu Eu, jak je popsán níže (obr. 49).

aminokyselina (Arg) a 76 aminokyselina (Ala), počítané od N-konce aminokyselinové sekvence těžkého řetězce polidštěné HFE7A, byly nahrazeny Gly a Thr, které jsou přítomny v Eu. 113 aminokyselina (Glu) byla nahrazena Gin, který je v těžkém řetězci lidského Ig podskupiny I neměnný. Vzniklá aminokyselinová sekvence byla označena jako „ HEU1 typ“.

aminokyselina (Arg) a 76 aminokyselina (Ala), počítané od N-konce, byly nahrazeny Gly a Thr a 113 aminokyselina (Glu) byla nahrazena Gin, který je v lidském H řetězci podskupiny I neměnný. 70 aminokyselina (Leu) byla nahrazena Ile, který je přítomen v Eu. Vzniklá aminokyselinová sekvence je označena jako „ HEU2 typ“.

aminokyselina (Arg) a 76 aminokyselina (Ala), počítané od N-konce aminokyselinové sekvence těžkého řetězce polidštěné HFE7A, připravené v odkazovém příkladu 15 (SEQ ID č. 89 na seznamu sekvencí), byly nahrazeny Gly a Thr, 113 aminokyselina (Glu) byla nahrazena Gin a 38 aminokyselina (Lys) byla nahrazena Arg, který je přítomný v Eu. Vzniklá aminokyselinová sekvence je označena jako „ HEU3 typ“.

Příslušné expresní plasmidy, nesoucí tyto 3 typy aminokyselinových sekvencí polidštěného těžkého řetězce typu HEU z protilátky proti Fas, byly konstruovány následovně.

(1) Syntéza primerů ·· 0· « · 0 0

0 0 0 0 · 000 «*0 • 0000

0 · • · • 0

163

Pro konstrukci následujících sekvencí DNA, kódujících každý typ polidštěného těžkého řetězce typu HEU, navržených dříve, byla použita PCR.

DNA (SEQ ID č. 142 na seznamu sekvencí), kódující HEU1 typ těžkého řetězce (SEQ ID č. 143 na seznamu sekvencí);

DNA (SEQ ID č. 144 na seznamu sekvencí), kódující HEU2 typ těžkého řetězce (SEQ ID č. 145 na seznamu sekvencí); a

DNA (SEQ ID č. 146 na seznamu sekvencí), kódující HEU3 typ těžkého řetězce (SEQ ID ě. 147 na seznamu sekvencí).

Byly syntetizovány následující oligonukleotidové PCR primery:

5'-CCAAGCTTGG CTTGACCTCA CCATGGGATG GAGCTGTA-3' (7AH1P; SEQ ID č. 148);

5'-AGTGGGTAAA ACAGGCCCCT GGACAGGGAC TTGAGTGGAT-3' (HEU16F; SEQ ID č. 149);

5'-ATCCACTCAA GTCCCTGTCC AGGGGCCTGT TTTACCCACT-3' (HEU16R; SEQ ID ě. 150);

5'-AAGACCGATG GGCCCTTGGT GGAGGCTGAG GAGACGGTGA CCAGTGTACC TTGGCCCCAG ACAT-3' (HEU28R; SEQ ID č. 151);

5'-GTTCAAGGGC AAGGCCACAA TAACTGTAGA CACATCCGC-3' (HEU25F; SEQ ID č. 152);

5'-GCGGATGTGT CTACAGTTAT TGTGGCCTTG CCCTTGAAC-3' (HEU25R; SEQ ID ě. 153);

5'-AGTGGGTACG ACAGGCCCCT GGACAAGGAC TTGAGTGGAT-3' (HEU36F; SEQ ID č. 154); a

5'-ATCCACTCAA GTCCTTGTCC AGGGGCCTGT CGTACCCACT-3' (HEU36R; SEQ ID č. 155);

(2) Příprava DNA, kódující HEU1 typ těžkého řetězce

1) Příprava HEU 1-DNA fragmentu • · · ·

164 ·· ·· • ♦ · ♦ • v · · ··« · ·· • · • · ··

HEU1HA-DNA fragment, obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyseliny 1 až 125 v SEQ ID č. 143 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR. Produkt byl poté začleněn do plasmidového vektoru a klonován v E. coli. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pgHSL7A62, připravený v odkazovém příkladu 15.

První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu HEU1HA-DNA je ukázán na obr. 57.

HEU161A-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci, FRHi oblast, CDRHi oblast a část FRL2 oblasti, pozměněné tak, že obsahuje místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III přidané na 5'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHSL7A62, 50 ng;

primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU16R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HEU161B2-DNA fragment, kódující FRH₂ oblast, CDRH₂ oblast, FRH₃ oblast, CDRH₃ oblast, FRH4 oblast a část konstantní oblasti těžkého řetězce lidského Ig, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHSL7A62, 50 ng;

primer HEU16F, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

• ·

165 * fl • · fl · flfl • · fl • flflfl • fl flfl • flfl · • flfl · • flfl flflfl fl · • fl ··

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého z produktů, amplifikovaný ch PCR, byla vznikající sraženina DNA separována elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužky, odpovídající HEU161A-DNA a HEU161B2-DNA, byly žiletkou vyříznuty.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu HEU1HA-DNA je ukázán na obr. 58.

HEU1HA-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány výše popsané HEU161A-DNA a HEU161B2-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem. Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

Složení PCR reakce:

kousek gelu, obsahující HEU161A-DNA; kousek gelu, obsahující HEU161B2-DNA; primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

• 999

9· ··

9 >9 9 9 *99·

9 9 *9999

99 9 · · 999999 * 9 9 9 9 9

166 ··’ ·♦ ...........

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifíkované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly dále separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 μg/ml a analyzován pod UV světlem. Gel v místě proužku, který odpovídá HEU1HA-DNA, byl žiletkou vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, dále byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

2) Příprava plasmidu

HEU1HA-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí a etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg DNA plasmidu pgHSL7A62 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pgHSL7A62 a naštěpený HEU1HA-DNA fragment byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09.

Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující 50 pg/ml chloramfenikolu a misky byly inkubovány při 37 °C s cílem získat transformanty E. coli. Získané transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze (Sambrook a kol.). Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a Apal a klon, nesoucí HEU1HA-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu.

Byl tak získán plasmid pHSGAB580-3-21, nesoucí DNA, která kóduje fuzní polypeptid variabilní oblasti polidštěného těžkého řetězce typu HEU1 a konstantní oblasti lidského IgGl. Transformant E. coli pHSGAB580-3-21 SANK 72898, obsahující plasmid pHSGAB580-3-21, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6515.

·«··

167

ΦΦ φφ • ·· φ φ · · · · • · · · · · · • φ φ φ · φφφφφφ « φ φ φ φ φ • φφ φφφ φφφφ φφ φφ

3) Konstrukce expresního vektoru

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidů, nesoucího DNA, která kóduje HEU1 typ polidštěného těžkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodě 2), byl ukázán na obr. 63.

Deset pg DNA plasmidů pHSGAB580-3-21 bylo naštěpeno restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg plasmidů pSRgPDH, připraveného v odkazovém příkladu 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. 100 ng vznikající defosforylované DNA plasmidů pSRgPDH bylo pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligováno s 10 pg HEU1-DNA fragmentu, naštěpeného Hind III a Apal a poté byla směs použita pro transformaci E. coli JM109. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a inkubovány při 37 °C.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla následně ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook a kol.}. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a Apal a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu. Tím byla umožněna izolace plasmidů pHEUX 580-3-23, který obsahuje DNA, kódující HEU1 typ polidštěného těžkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

(3) Příprava DNA, kódující HEU2 typ těžkého řetězce

1) Příprava HEU2-DNA fragmentu

HEU2HA-DNA fragment, obsahující nukleotidovou sekvenci, kódující aminokyseliny 1 až

125 v SEQ ID č. 145 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR. Produkt byl poté inzertován do plasmidového vektoru a klonován v E. coli. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pgHSL7A62, připravený v odkazovém příkladu 15.

První fáze PCR

9 9 9

168 • 99 9 9 9 9 9 9 · · · · · · • · · 9 9 9999*9

9 9 9 · • 9 999 9999 9* 99

Nástin první fáze PCR pro přípravu HEU2HA-DNA fragmentu je ukázán na obr. 59.

HEU261A-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci, FRHi oblast, CDRHi oblast a část FRH₂ oblasti, pozměněné tak, že obsahuje místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III na 5 '-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHSL7A62, 50 ng;

primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU16R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HEU261B-DNA fragment, kódující FRH₂ oblast, CDRH₂ oblast a část FRH3 oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHSL7A62, 50 ng;

primer HEU16F, 5 pmol;

primer HEU25R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

»··0 • ·· 99 99

1 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 999 999

9 9 9

999 9999 91 11

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HEU261C2-DNA fragment, kódující část CDRH2 oblasti, FRH3 oblast, CDRH3 oblast, FRH4 oblast a část konstantní oblasti těžkého řetězce lidského Ig, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHSL7A62, 50 ng;

primer HEU25F, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 pl;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza (Stratagene), 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého z produktů, amplifikovaných PCR, byla vznikající sraženina DNA separována elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužky, odpovídající HEU261A-DNA a HEU261B-DNA a HEU261C2-DNA, byly žiletkou vyříznuty.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu HEU2HA-DNA fragmentu je ukázán na obr. 60.

HEU2HA-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány HEU261 A-DNA, HEU261B-DNA a HEUC261C2-DNA fragmenty, byl připraven následujícím způsobem. Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

170 • · 9 · · • · · · · • 9 · 9 · · · • 9 • ·· ··

Složení PCR reakce:

kousek gelu, obsahující HEU261A-DNA;

kousek gelu, obsahující HEU261B-DNA;

kousek gelu, obsahující HEUC261C2-DNA;

primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifikované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a sledován pod UV světlem. Gel v místě proužku, který odpovídá HEU2HA-DNA, byl žiletkou vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, dále byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

2) Příprava plasmidu

HEU2HA-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí a etanolovým srážením a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg DNA plasmidu pgHSL7A62 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pgHSL7A62 a HEU2HA-DNA fragment, naštěpený restrikčními enzymy, byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující konečné koncentrace 50 pg/ml chloramfenikolu a byly kultivovány při 37 °C. Vznikající transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová • ·»·· » »9 99 99 • 9 9 99 99 9*99 · 9 99999

99 9 99999999

9 9 9 9 9 9

171 .........*......

DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze (Sambrook a kol.). Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a Apal a klon, nesoucí HEU2HA-DNA fragment, byl poté selektován elektroforézou v agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu.

Byl tak získán plasmid pHSGHEU223-30-l, nesoucí fragment DNA, který kóduje polypeptid, ve kterém jsou ligovány variabilní oblast polidštěného těžkého řetězce typu HEU2 a DNA, kódující konstantní oblast lidského IgGl. Transformant E. coli pHSGHEU223-30-l SANK 72998, obsahující plasmid pHSGHEU223-30-l, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6516.

3) Konstrukce expresního vektoru

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidu, nesoucího DNA, která kóduje HEU-2 typ polidštěného těžkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodě 2), je ukázán na obr. 63.

Deset pg plasmidu pHSGHEU223-30-l bylo naštěpeno restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg plasmidu pSRgPDH, připraveného v odkazovém příkladu 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. 100 ng vznikající defosforylované plasmidové DNA bylo pomocí soupravy DNA Ligation Kit ligováno s 10 pg HEU2-DNA fragmentu, naštěpeného Hind III a Apal. Poté byla směs použita pro transformaci E. coli JM109. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a inkubovány při 37 °C.

Transformanty, získané touto metodou, byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook a kol.}. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost sledovaného insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a Apal a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu. To umožnilo izolaci plasmidu pHEUX222-l-4, který obsahuje DNA, kódující HEU2 typ polidštěného těžkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

• ••Φ ·· ·· · ·· · Φ • · · · • · « · · • · · ♦ · ·· · ·« ··· ·* »· ·· ·· * · » · • · · · ··· ·«· ♦ · ·· (4) Příprava DNA, kódující HEU3 typ těžkého řetězce

1) Příprava HEU3-DNA fragmentu

HEU3HA-DNA fragment, obsahující nukleotidovou sekvenci, kódující aminokyseliny 1 až 125 v SEQ ID č. 147 na seznamu sekvencí, byl připraven 2 fázovou PCR. Produkt byl poté začleněn do plasmidového vektoru a klonován v E. coli. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pgHSL7A62, připravený v odkazovém příkladě 15.

První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu HEU3HA-DNA je ukázán na obr. 61.

HEU361A-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci, FRHi oblast, CDRHi oblast a část FRH₂ oblasti, pozměněné tak, že obsahuje místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III na 5'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHSL7A62, 50 ng;

primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU36R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μί;

x Pfu pufr, 5 μί;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μί.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HEU361B2-DNA fragment, kódující FRH₂ oblast, CDRH₂ oblast, FRH3 oblast, FRH4 oblast a část konstantní oblasti těžkého řetězce lidského Ig, byl připraven následovně.

173

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHSL7A62, 50 ng;

primer HEU36F, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 1 jednotka; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min, při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po fenolové extrakci a etanolovém srážení každého produktu, amplifikovaného PCR, byla vznikající sraženina DNA separována elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/mi. Gel s proužky, které odpovídají HEU361A-DNA a HEU361B2-DNA, byl žiletkou vyříznut.

Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu HEU3HA-DNA fragmentu je ukázán na obr. 62.

HEU3HA-DNA fragment, ve kterém byly fúzovány HEU361A-DNA a HEU361B2-DNA, byl připraven následujícím způsobem. Gel po elektroforéze, který byl vyříznut v první fázi PCR, byl přidán do reakčního roztoku bez extrakce.

Složení PCR reakce:

kousek gelu, obsahující HEU361 A-DNA; kousek gelu, obsahující HEU361B2-DNA; primer 7AH1P, 5 pmol;

primer HEU28R, 5 pmol;

2,5 mM směs dNTP, 5 μΐ;

x Pfu pufr, 5 μΐ;

»· · ·

174

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 50 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Fragmenty, amplifikované PCR, byly podrobeny fenolové extrakci a etanolovému srážení a tyto fragmenty byly dále separovány elektroforézou v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Po elektroforéze byl gel fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml a analyzován pod UV světlem. Gel v místě proužku, který odpovídal HEU3HA-DNA, byl žiletkou vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, dále byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

2) Příprava plasmidu

HEU3HA-DNA fragment, získaný ve výše uvedeném bodě 1), byl dále purifikován fenolovou extrakcí a etanolovým srážením. Purifikovaný fragment byl poté naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg DNA plasmidu pgHSL7A62 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pgHSL7A62 a naštěpený HEU3HA-DNA fragment, byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI 09. Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující 50 pg/ml chloramfenikolu a byly inkubovány při 37 °C. Vznikající transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze (Sambrook a kol.). Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a Apal a klon, nesoucí HEU3HA-DNA fragment, byl poté selektován elektroforézou v agarózovém gelu.

Byl tak získán plasmid pHSGHEU222-l-2, který nese DNA, kódující polypeptid, ve kterém jsou ligovány variabilní oblast polidštěného těžkého řetězce typu HEU3 a konstantní oblast lidského IgGl. Transformant E. coli pHSGHEU222-l-2 SANK 73098, obsahující plasmid pHSGHEU222-l-2, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu

175

Kenkyujo, v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové ěíslo FERM BP6514.

3) Konstrukce expresního vektoru

Nástin postupu konstrukce expresního vektorového plasmidu, nesoucího DNA, která kóduje HEU3 typ polidštěného těžkého polypeptidu, získaného ve výše uvedeném bodě 2), je ukázán na obr. 63.

Deset pg plasmidu pHSGHEU222-l-2 bylo naštěpeno restrikčními enzymy Hind III a Apal. Jeden pg plasmidu pSRgPDH, připraveného v odkazovém příkladě 23, byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Apal a defosforylován pomocí CIP. 100 ng defosforylovaného pSRgPDH bylo pomocí soupravy DNA Ligation Kit ligováno s HEU3-DNA, který byl rovněž naštěpen Hind III a Apal a poté byla směs použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a kultivovány při 37 °C.

Jakékoliv transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze. Aby byla potvrzena přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu, byla extrahovaná plasmidová DNA naštěpena s Hind III a Apal a podrobena elektroforéze v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu. To umožnilo izolaci plasmidu pHEUX 322-22-5, který obsahuje DNA, kódující HEU3 typ polidštěného těžkého řetězce, umístěného v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

(5) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, že DNA inzerty plasmidů, získané ve výše zmíněných bodech (2) až (4), měly žádoucí nukleotidové sekvence, byly DNA inzerty analyzovány a byly stanoveny nukleotidové sekvence. Jako sekvenační primery byly použity primery 7AH1P a HEU28R:

Výsledkem bylo zjištění, že DNA inzerty plasmidů pHEUX580-3-23, pHEUX222-l-4 a pHEUX322-22-5 měly nukleotidové sekvence: SEQ ID č. 142, SEQ ID ě. 144; a SEQ ID č. 146 na seznamu sekvencí.

• ·

176

Příklad 4

Exprese polidštěné protilátky typu Eu v COS-7 buňkách

Aby došlo k expresi polidštěného těžkého řetězce typu Eu a polidštěných lehkých řetězců typu Eu, konstruovaných v příkladech 2 a 3, byla provedena transfekce COS-7 buněk s každým výše připraveným plasmidem, a to metodou transfekce s použitím transfekčního činidla FuGENEó (transfekční činidlo, Boehringer Mannheim).

x 10⁵ COS-7 buněk bylo pěstováno do semikonfluentní fáze na petriho miskách pro buněčné kultury (průměr: 90 mm; kultivační plocha: 57 cm , Sumitomo Bakelite, K.K.), které obsahovaly DMEM médium (Nissui pharmaceuticals K.K.), doplněné 10 obj. % FCS (Moregate).

Do 200 μΐ DMEM, které neobsahovalo FCS, bylo přidáno šest μΐ transfekčního činidla a roztok byl ponechán stát 5 min. při teplotě místnosti (dále označováno jako „transfekční činidlo/DMEM“).

Byly smíchány 2 pg DNA expresního plasmidu polidštěného těžkého řetězce typu Eu (pHEUX580-3-23, pHEUX222-l-4 nebo pHEUX322-22-5) a 2 pg expresního plasmidu polidštěného lehkého řetězce typu LEU (pLEUXl5-29-5, pLEUX22-7-l nebo pLEUX31-6-2), připravených pomocí soupravy pro přípravu plasmidu v širokém měřítku (Withered MaxiPrep DNA Purification System; Promega). Dále bylo ve stejné zkumavce provedeno etanolové srážení a sraženiny byly suspendovány v 5 μΐ destilované vody. Do suspenze bylo přidáno 206 μΐ směsi transkekění činidlo/DMEM. Po 15 min. byly COS-7 buňky na misce převrstveny směsí transfekční činidlo/DMEM, obsahující DNA. Buňky byly kultivovány 72 hodin při 37 °C v prostředí 5 obj. % plynného CO2. Po této době byl získán supematant.

Použitím výše uvedené metody byly různě transfektované COS-7 buňky kultivovány s každým z následujících plasmidů nebo plasmidových kombinací a poté byl získán supematant.:

(A) : bez plasmidové DNA (B) : kotransfekce s pHEUX580-3-23 a pLEUXl 5-29-5 (C) : kotransfekce s pHEUX222-l-4 apLEUX15-29-5

4 (D) : kotransfekce s pHEUX322-22-5 a pLEUXl 5-29-5 (E) : kotransfekce s pHEUX580-3-23 a pLEUX22-7-l (F) : kotransfekce s pHEUX222-l-4 apLEUX22-7-l (G) : kotransfekce s pHEUX322-22-5 apLEUX22-7-l (H) : kotransfekce s pHEUX580-3-23 apLEUX31-6-2 (I) : kotransfekce s pHEUX222-l-4 a pLEUX31-6-2 (J) : kotransfekce s pHEUX322-22-5 apLEUX31-6-2

Příklad 5

Kvantifikace produktů exprese metodou ELISA

Byla ověřena exprese polidštěné protilátky v supematantu kultury, který byl připraven v příkladu 4 a byla provedena kvantifikace produktů exprese v souladu s podobnou metodou, jako je popsaná v odkazovém příkladě 17, ale s tím rozdílem, že jako ředidlo bylo použito DMEM. Dále bylo ověřeno, že každý expresní produkt supematantů kultury [B], [C], [D], [E], [F], [G], [Η], [I] a [J], které byly připraveny v příkladě 4, byl specificky detekován pomocí protilátky proti lidskému IgG.

Příklad 6

Stanovení vazebné aktivity lidského Fas

Stanovení vazebné aktivity Fas v supernatantech buněčné kultury, které byly připraveny v příkladě 4, bylo provedeno podobným způsobem jako v odkazovém příkladě 18, ale s tím, že jako ředidlo bylo použito DMEM. Vazebná aktivita pro lidský Fas fůzní protein byla ukázána pro exprimované produkty supematantů kultur kategorií [B], [C], [D], [E], [F], [G], [Η], [I] a [J], připravených v příkladě 4 (obr. 64).

Příklad 7

Kompetitivní inhibice vazby HFE7A na Fas ·· · ·

Produkty exprese z příkladu 4 byly vzhledem ke své schopnosti kompetitivně inhibovat vazbu HFE7A na lidský Fas luzní protein zjištěny způsobem, podobným tomu, který je popsán v odkazovém příkladě 19, ale s tím, že jako ředidlo bylo použito DMEM.

Bylo ověřeno, že každý produkt exprese supematantů [B], [C], [D], [E], [F], [G], [Η], [I] a [J] z příkladě 4, specificky inhiboval vazbu protilátky HFE7A, která byla připravena z myššího hybridomu, na lidský Fas fuzní protein (obr. 65).

Příklad 8

Aktivita, indukující apoptózu

Aktivita, indukující apoptózu, každého produktu exprese v supematantech kultury, které byly získány v příkladě 4, byla zjištěna metodou popsanou v odkazovém příkladě 20.

Každý produkt exprese supematantů kultury [B], [C], [D], [E], [F], [G], [Η], [I] a [J], které byly získány v příkladě 4, indukuje apoptózu v T buňkách linie buněk lymfomu, exprimujících lidský Fas antigen (obr. 66).

Příklad 9

Konstrukce expresního vektoru těžkého řetězce polidštěné HFE7A

Byla připravena DNA, kódující polidštěný těžký řetězec, ve které byly pouze CDR a nikoliv FR oblasti těžkého řetězce protilátky HFE7A včleněny do těžkého řetězce lidské protilátky 8E10 (dále označována jako „HHH typ polidštěného těžkého řetězce“). DNA a expresní vektorový plasmid, mající tuto DNA, byl připraven následovně.

1) Syntéza primem

Syntéza DNA (SEQ ID č. 156 na seznamu sekvencí), kódující HHH typ polidštěného těžkého řetězce (SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí), byla provedena pomocí PCR. Protein, kódovaný DNA, obsahuje variabilní oblast (kde je do lidské monoklonální protilátky 8E10 včleněna každá z CDR těžkého řetězce protilátky HFE7A v odpovídající pozici) a konstantní oblast těžkého řetězce lidského Ig (γ-řetězec). Kromě výše zmíněného 7AH1P (SEQ ID č. 76 na seznamu sekvencí) a H5- (SEQ ID č. 103 na seznamu sekvencí) byly pro PCR syntetizovány následující 4 oligonukleotidové primery:

5-GATGCAGTGG GTACGACAGG CCCCTGGAC-3' (HFR1F: SEQ ID č. 158 na seznamu sekvencí);

'-GTCCAGGGGC CTGTCGTACC CACTGCATC-3 ’ (HFR1B: SEQ ID č. 159 na seznamu sekvencí);

5-CAAGGGCCGG GTCACAATCA CTCGAGACAC ATC-3' (HFR2F: SEQ ID č. 160 na seznamu sekvencí); a

5-GATGTGTCTC GAGTGATTGT GACCCGGCCC TTG-3' (HFR2B: SEQ ID č. 161 na seznamu sekvencí).

2) Příprava DNA, kódující HHH typ polidštěného těžkého řetězce

HHH-DNA fragment (SEQ ID č. 156 na seznamu sekvencí), kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí, byl připraven PCR. Produkt byl poté začleněn do plasmidu a klonován v E. coli. Jako templát pro PCR byl použit plasmid pgHPDHV3, připravený v odkazovém příkladě 23.

Těžký řetězec, kódovaný plasmidem pgHPDHV3, má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako FR oblast těžkého řetězce protilátky 8E10, až na to, že místo 38 aminokyseliny (Arg) je Lys, místo 66 aminokyseliny (Arg) je Lys, místo 67 aminokyseliny (Val) je Ala, místo 69 aminokyseliny (Ile) je Leu a místo 71 aminokyseliny (Arg) je Val (aminokyselinové číslování je definováno v souladu s odkazem na Kabat a koE). Ostatní aminokyseliny v FR oblasti a aminokyselina v konstantní oblasti nejsou nahrazeny.

CDR v aminokyselinové sekvenci těžkého řetězce, kódovaného pgHPDHV3, jsou stejné jako CDR v myšší HFE7A. V následujících krocích byl dále modifikován pgHPDHV3 (kódující aminokyselinovou sekvenci těžkého řetězce) tak, že aminokyseliny ve výše uvedených pozicích byly stejné jako aminokyseliny v FR těžkého řetězce protilátky 8E10.

a) První fáze PCR

Nástin první fáze PCR pro přípravu HHHV-DNA je ukázán na obr. 67.

HHHV1-DNA fragment, kódující sekreční signální sekvenci, FRHi oblast, CDRHi oblast a část FRL2 oblasti, pozměněné tak, že obsahuje místo pro štěpení restrikčním enzymem Hind III na 5'-konci, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHPDHV3, 200 ng;

primer 7AH1P, 80 pmol;

primer HFR1B, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

HHHV2-DNA fragment, kódující část FRH2 oblasti, CDRH2 oblast a část FRH3 oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidů pgHPDHV3, 200 ng;

primer HFR1F, 80 pmol;

primer HFR2B, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

·· ·· ·· « · · · · • · ♦ · · • 9 «·· ··· • · · 9 · · · · · ·

181

HHHV3-DNA fragment, kódující část CDRH₂ oblasti a část FRH₃ oblasti, byl připraven následovně.

Složení roztoku pro PCR reakci:

DNA plasmidu pgHPDHV3,200 ng;

primer HFR2F, 80 pmol;

primer H5-, 80 pmol;

směs dNTP, 20 μΐ;

x Pfu pufr, 20 μΐ;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 μΐ.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po extrakci fenolem a srážení etanolem byla vznikající sraženina DNA podrobena elektroforéze v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužky, odpovídající HHHV1-DNA, HHHV2-DNA a HHHV3DNA, byly žiletkou vyříznuty a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, poté byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

b) Druhá fáze PCR

Nástin druhé fáze PCR pro přípravu HHHV-DNA je ukázán na obr. 68.

HHHV-DNA, ve kterém byly fúzovány výše popsané HHHV1-DNA, HHHV2-DNA a HHHV3-DNA fragmenty, byla připravena následujícím způsobem.

Složení PCR reakce:

roztok HHHV1-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 μΐ;

• ·

• · · ¥ · 9 ·« * ··· <* · • . · · roztok HHHV2-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 pl;

roztok HHHV3-DNA, připravený v první fázi PCR, 10 pl;

primer 7AH1P, 80 pmol;

primer H5-, 80 pmol;

směs dNTP, 20 pl;

x Pfu pufr, 20 pl;

Pfu DNA polymeráza, 10 jednotek; a redestilovaná voda do konečného objemu 200 pl.

PCR reakce byla prováděna následujícím způsobem. Roztok byl nejdříve zahříván 2 min. při 94 °C, poté byl cyklus zahřívání 1 min. na 94 °C, 1 min. na 55 °C a 2 min. na 72 °C opakován 30 krát. Po ukončení procesu byl reakční roztok zahříván 10 min. při 72 °C.

Po extrakci fenolem a srážení etanolem byla vznikající sraženina DNA podrobena elektroforéze v 5 hmotn./obj. %ním polyakrylamidovém gelu. Aby bylo možno detekovat DNA pod UV světlem, byl akrylamidový gel po elektroforéze fixován s roztokem ethidium bromidu o koncentraci 1 pg/ml. DNA proužek, odpovídající HHHV-DNA, byl žiletkou vyříznut a DNA byla z gelu eluována použitím zařízení Centricon a Centriruter. Eluovaná DNA byla koncentrována nejdříve odstředěním při 7 500 x g, poté byla srážena etanolem a nakonec byla rozpuštěna v 50 μΐ destilované vody.

c) Konstrukce plasmidu pgHSHHHl

Nástin postupu konstrukce plasmidu pgHSHHHl, nesoucího HHHV-DNA fragment, je ukázán na obr. 69.

HHHV-DNA fragment, získaný výše, byl dále purifikován extrakcí fenolem a srážením etanolem a poté byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Sací. Jeden pg plasmidu pgHPDHV3 byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Sací a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pgHPDHV3 a naštěpený HHHV-DNA fragment byly pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligovány. Ligovaná DNA byla použita pro transformaci E. coli JMI09. Buňky byly rozetřeny na agarové LB médium, obsahující v konečné koncentraci 50 pg/ml chloramfenikolu a misky byly inkubovány při 37 °C.

» · · · · * ·

Takto získané transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml chloramfenikolu a plasmidová DNA byla ze vznikající kultury extrahována metodou alkalické lýze (Sambrook a kol.). Vzniklá extrahovaná plasmidová DNA byla naštěpena restrikčními enzymy Hind III a Sací a klon, nesoucí HHHV-DNA fragment, byl selektován elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu.

Byl získán plasmid pgHSHHHl, nesoucí DNA, která kóduje fuzní polypeptid variabilní oblasti polidštěného těžkého řetězce typu HHH a konstantní oblasti γ řetězce lidského IgGl.

3) Ověření nukleotidových sekvencí

Pro ověření, mají-li DNA inzerty plasmidů pgHSHHHl, získané ve výše uvedeném bodě 2), žádoucí nukleotidovou sekvenci, byla stanovena jejich sekvence. Jako sekvenační primery při stanovení sekvence byly použity následující oligonukleotidy: komerčně dostupný oligonukleotidový primer RV (Takara Shuzo. Co., Ltd.); výše zmíněné primery 7AH1P (SEQ ID č. 76 na seznamu sekvencí), HFR14 (SEQ ID č. 158 na seznamu sekvencí), HFR1B (SEQ ID č. 159 na seznamu sekvencí), HFR2F ) SEQ ID č. 160 na seznamu sekvencí), HFR2B (SEQ ID č. 161 na seznamu sekvencí), H5- (SEQ ID č. 103 na seznamu sekvencí) a nově syntetizované primery:

5'-CTACAATCAA AAGTTCAAGG-3' (SACF: SEQ ID č. 162);

5'-GACTATAGTA AC AACTGGTA-3' (APAF: SEQ ID č. 163);

5'-GTACCAGTTG TTACTATAGT-3' (SACB: SEQ ID č. 164); a '-GCAGCCCAGG GCCGCTGTGC-3' (APAB: SEQ ID č. 165);

Pozice, do kterých se každý primer váže, jsou ukázány na obr. 70.

Závěren bylo stanoveno, že plasmid pgHSHHHl měl nukleotidové sekvence: SEQ ID č.

156 na seznamu sekvencí, kódující polypeptid o SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí.

Transformant E. coli pgHSHHHl SANK 72198, obsahující plasmid pgHSHHHl, byl 18. září 1998 uložen v Kogyo Gijutsuin Seimei-Kogaku Kogyo Gijutsu Kenkyujo v souladu s Budapešťskou Dohodou a bylo mu přiděleno přístupové číslo FERM BP-6510.

4) Konstrukce expresního vektoru

Expresní plasmidový vektor pSRHHH, nesoucí DNA, která kóduje HHH typ polypeptidu polidštěného těžkého řetězce (SEQ ID č. 156 na seznamu sekvencí), byl konstruován s použitím plasmidu pgHSHHHl, získaného v bodě 3). Postup konstrukce plasmidu pSRHHH je nastíněn na obr. 71.

Jeden pg DNA plasmidu pSRgPDH (viz odkazový příklad 23) byl naštěpen restrikčními enzymy Hind III a Sací a defosforylován pomocí CIP. Vznikající defosforylovaná DNA plasmidu pSRgPDH (100 ng) byla pomocí soupravy DNA Ligation Kit (Version 2.0, Takara Shuzo Co., Ltd.) ligována s 10 pg pgHSHHHl DNA fragmentu, který byl rovněž naštěpen Hind III a Sací. Ligační směs byla poté použita pro transformaci E. coli JMI09. Tyto buňky byly rozetřeny na misky s LB agarem, obsahující 50 pg/ml ampicilinu a kultivovány při 37 °C.

Všechny vznikající transformanty byly kultivovány v kapalném LB médiu, obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plasmidová DNA byla z kultury extrahována metodou alkalické lýze [Sambrook a kol.}. Po naštěpení plasmidové DNA s Hind III a Sací byla přítomnost nebo nepřítomnost žádoucího insertu potvrzena elektroforézou v 1 hmotn./obj. %ním agarózovém gelu, fixovaném v roztoku ethidium bromidu. Získaný plasmid pSRHHH, který obsahuje DNA, kódující HHH typ polidštěného těžkého řetězce, byl inzertován v downstream oblasti SRa promotoru ve správné orientaci.

Příklad 10

Konstrukce expresního vektoru lehkého řetězce polidštěné HFE7A

Jako expresní plasmidový vektor, nesoucí DNA (SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí), která kóduje polidštěný lehký řetězec (SEQ ID č. 106 na seznamu sekvencí) byl použit pLPDHH75, připravený v odkazovém příkladě 21. Při tomto konstruování byly do lehkého ·♦· ·

řetězce lidské protilátky 8EHTCL včleněny pouze CDR a nikoliv FR oblasti lehkého řetězce protilátky HFE7A.

Příklad 11

Exprese v COS-1 buňkách

COS-1 buňky byly pěstovány do semikonfluentní fáze v a(+)MEM, které obsahovalo 10 obj. % FCS (Moregate), v kultivační baňce (plocha kultivace: 225 cm²). Médium nebylo dále používáno a do baňky byly přidány 3 ml roztoku trypsin-EDTA (Sigma) a ta byla dále inkubována při 37 °C po dobu 3 min., aby byly odděleny buňky. Oddělené buňky byly poté sklizeny odstředěním 2 min. při 800 rpm a byly dvakrát promyty PBS(-) pufrem. COS-1 buňky o

byly suspendovány v PBS (-) pufru tak, že hustota buněk byla 1x10 buněk/ml.

Současně bylo smícháno 10 pg expresní plasmidové DNA pro těžký řetězec polidštěné HFE7A a 10 pg expresní plasmidové DNA pro lehký řetězec polidštěné HFE7A, připravených metodou alkalické lýze a odstředěním v hustotním gradientu chloridu česného (Sambrook a kol.). Do směsi byl přidán etanol, aby byla vysrážená DNA a sraženina byla suspendována ve 20 pl PBS (-) pufru. Vzniklá plasmidová suspenze (20pl) byla smíchána s 20 pl předem připravené suspenze buněk COS-1 (2 x 10⁶ buněk) a směs byla převedena do FCT-13 nádobky (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.) s elektrodami ve vzdálenosti 2 mm. Nádobka byla vložena do přístroje pro transfekci genů GTE-1 (Shimadzu Seisakusyo, Κ. K.). Žádoucí plasmidová DNA byla transformována v COS-1 buňkách tím, že byly dvakrát v intervalu 1 s aplikovány 2 pulsy, každý 600 V, 50 pF.

Po této době byl roztok směsi buňka-DNA suspendován v 5 ml a(+)MEM s 10 obj. % FCS a byl převeden do kultivační baňky (plocha kultivace 25 cm²). Po inkubaci pod 5 obj. % CO2 při 37 °C, 72 h, byl získán supernatant.

Použitím výše uvedené metody byly COS-1 buňky různě transfektovány s každou z následujících plasmidových kombinací a byl získán příslušný supernatant:

(A) : bez plasmidové DNA (B) : kotransfekce s pSRgPDH a pSRPDHH (C) : kotransfekce s pSRHHH a pSRPDHH

00 *·

0 · · · *

0*00 · ·· 0 000

0 0 0 9000 0· ··

00 0

186

0 ·>

Příklad 12

Kvantifikace produktů exprese metodou ELISA

Exprese polidštěné protilátky v supernatantu kultury, která byla připravena v příkladě 11, byla ověřena v souladu s metodou, popsanou v odkazovém příkladě 17 a byla provedena kvantifikace produktů exprese. Závěrem bylo ověřeno, že každý expresní produkt supematantů, které byly připraveny pomocí (B) a (C) v příkladě 11, byl specificky detekován pomocí protilátky proti lidskému IgG.

Příklad 13

Stanovení vazebné aktivity na Fas

Supematanty kultur, získané v příkladě 11, byly upraveny na konečnou koncentraci žádoucí polidštěné protilátky v a (+) MEM, obsahujícím 10 obj. % FCS, 100 ng/ml. Koncentrace byly spočítány postupem, popsaným v odkazovém příkladě 17. V případě, že byly koncentrace žádoucího produktu menší než 100 ng/ml, byl supernatant nejdříve koncentrován na Centriprep-10 (Amicon, Co. Ltd). Tzn., že 5 ml supernatantu bylo převedeno do Centriprep-10, následovalo zahuštění odstředěním při 3 000 x g. Koncentrace produktu byla znovu spočítána způsobem, popsaným v odkazovém příkladě 17.

Každý vznikající roztok, upravený na 100 ng/ml, byl poté zřeďován postupným 2 násobným ředěním oc(+) MEM médiem, obsahujícím 10 obj. % FCS. Vazebná aktivita na lidský Fas fuzní protein byla stanovena metodou ELISA, která je popsána v odkazovém příkladě 18.

Vazebná aktivita na lidský Fas fúzní protein byla ověřena pro supernatanty, připravené v příkladu 11 použitím (B) a (C) a je ukázána na obr. 72.

Příklad 14

Kompetitivní inhibice vazby HFE7A na Fas • fc · ·

fc · · · · • · ··· fcfcfc • · •fc fcfc ··

Kompetitivní inhibiční aktivita každého exprimo váného produktu proti lidskému Fas fuznímu proteinu, který byl připraven v příkladě 11, spolu s aktivitou HFE7A, byla stanovena podobnou metodou jako je popsána v odkazovém příkladě 26.

Bylo ověřeno, že každý produkt exprese, připravený v příkladě 11, specificky inhiboval vazbu HFE7A, připravené z myššího hybridomu, na lidský Fas fuzní protein (obr. 73).

Příklad 15

Aktivita, indukující apoptózu

Supematanty kultur, které byly získány v příkladě 11, byly upraveny tak, že konečná koncentrace protilátky byla 100 ng/ml. Byl použit způsob podobný tomu, který je popsán v odkazovém příkladě 22 (jako ředidlo bylo v případě nutnosti použito RPMI 1640 médium, obsahující 10 obj. % FCS). Každý z roztoků produktů exprese byl poté naředěn sérií 2násobného ředění RPMI 1640 médiem, které obsahuje 10 obj. % FCS. Cytotoxická aktivita každého vzorku pro buňky WR19L12a byla stanovena způsobem, popsaným v odkazovém příkladě 20.

Každý z produktů exprese supematantu kultury, které byly získány v odkazovém příkladě 22 použitím [B] a [C], podle očekávání indukoval podobně jako HFE7A, připravená z hybridomových kultur, apoptózu v T buňkách linie buněk lymfomu, exprimujících lidský Fas antigen.

0 0 0 0 ♦

0 0 0 0

0 000000

0 0

188

<400> 5 Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1	5	10	15
<210>	6
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	6
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1	5
<210>	7
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Mus musculus
<400>	7
Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Arg Thr
1	5

<210>	8
<211>	1392
<212>	DNA
<213>	Mus	musculus
<220>
<221>	CDS
<222>	(1) -	.(1392)

<220>

<221> mat peptid <222> (58) .. (1392) <220>

<221> sig peptid <222> (1)..(57) <400> 8 atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt 48

Met Gly Trp Ser Cys lle lle Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

-15 -10 -5 gtc cat tet cag gtc caa ctg cag cag cct ggg gct gag ctt gtg aag 96

Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys

-11 5 10 cct ggg gct tea gtg aag ctg tcc tgc aag gct tet ggc tac acc ttc

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

20 25

144 • 9

189 • 9 99 _ _ - .999

9 9 99999

9 9 · 9 9 999 999

9 9 9 9 ·9

999 99 999 9999 99 99

acc agc Thr Ser 30

tac Tyr

tgg atg Trp Met

cag tgg gta

aaa cag agg cct gga

cag Gin

ggc Gly

ctt Leu 45

192

Gin 35

Trp Val

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

gag

tgg

atc

gga

gag

att

gat

cct

tet

gat

agc

tat

act

aac

tac

aat

240

Glu

Trp

lle

Gly

Glu

lle

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

50

55

60

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

act

gta

gac

aca

tcc

tcc

agc

288

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

65

70

75

aca

gcc

tac

atg

cag

ctc

agc

agc

ctg

aca

tet

gag

gac

tet

gcg

gtc

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

80

85

90

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

agt

aac

aac

tgg

tac

ttc

gat

384

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

95

100

105

gtc

tgg

ggc

aca

ggg

acc

acg

gtc

acc

gtc

tcc

tea

gcc

aaa

acg

aca

432

Val

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr

110

115

120

125

ccc

cca

tet

gtc

tat

cca

ctg

gcc

cct

gga

tet

get

gcc

caa

act

aac

480

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr

Asn

130

135

140

tcc

atg

gtg

acc

ctg

gga

tgc

ctg

gtc

aag

ggc

tat

ttc

cct

gag

cca

528

Ser

Met

val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

145

150

155

gtg

aca

gtg

acc

tgg

aac

tet

gga

tcc

ctg

tcc

agc

ggt

gtg

cac

acc

576

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly

Val

His

Thr

160

165

170

ttc

cca

get

gtc

ctg

cag

tet

gac

ctc

tac

act

ctg

agc

agc

tea

gtg

624

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Val

175

180

185

act

gtc

ccc

tcc

agc

acc

tgg

ccc

agc

cag

acc

gtc

acc

tgc

aac

gtt

672

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Thr

Trp

Pro

Ser

Gin

Thr

Val

Thr

Cys

Asn

Val

190

195

200

205

gcc

cac

ccg

gcc

agc

agc

acc

aag

gtg

gac

aag

aaa

att

gtg

ccc

agg

720

Ala

His

Pro

Ala

Ser

Ser

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Lys

lle

Val

Pro

Arg

210

215

220

gat

tgt

ggt

tgt

aag

cct

tgc

ata

tgt

aca

gtc

cca

gaa

gta

tea

tet

768

Asp

Cys

Gly

Cys

Lys

Pro

Cys

lle

Cys

Thr

Val

Pro

Glu

Val

Ser

Ser

225

-

230

235

gtc

ttc

atc

ttc

ccc

cca

aag

ccc

aag

gat

gtg

ctc

acc

att

act

ctg

816

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Val

Leu

Thr

lle

Thr

Leu

240

245

250

• ·

190

act Thr

cct aag Pro Lys 255

gtc acg tgt

gtt gtg gta gac

atc Ile

age aag gat gat Ser Lys Asp Asp 265

ccc Pro

864

Val

Thr

Cys

Val 260

Val Val Asp

gag

gtc

cag

ttc

age

tgg

ttt

gta

gat

gat

gtg

gag

gtg

cac

aca

get

912

Glu

Val

Gin

Phe

Ser

Trp

Phe

Val

Asp

Asp

Val

Glu

Val

His

Thr

Ala

270

275

280

285

cag

acg

caa

ccc

cgg

gag

gag

cag

ttc

aac

age

act

ttc

ege

tea

gtc

960

Gin

Thr

Gin

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Phe

Asn

Ser

Thr

Phe

Arg

Ser

Val

290

295

300

agt

gaa

ctt

ccc

atc

atg

cac

cag

aac

tgg

ctc

aat

ggc

aag

gag

ttc

1008

Ser

Glu

Leu

Pro

Ile

Met

His

Gin

Asn

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Phe

305

310

315

aaa

tgc

agg

gtc

aac

agt

gca

get

ttc

cct

gcc

ccc

atc

gag

aaa

acc

1056

Lys

Cys

Arg

Val

Asn

Ser

Ala

Ala

Phe

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

320

325

330

atc

tcc

aaa

acc

aaa

ggc

aga

ccg

aag

get

cca

cag

gtg

tac

acc

att

1104

Ile

Ser

Lys

Thr

Lys

Gly

Arg

Pro

Lys

Ala

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Ile

335

340

345

cca

cct

ccc

aag

gag

cag

atg

gcc

aag

gat

aaa

gtc

agt

ctg

acc

tgc

1152

Pro

Pro

Pro

Lys

Glu

Gin

Met

Ala

Lys

Asp

Lys

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

350

355

360

365

atg

ata

aca

gac

ttc

ttc

cct

gaa

gac

att

act

gtg

gag

tgg

cag

tgg

1200

Met

Ile

Thr

Asp

Phe

Phe

Pro

Glu

Asp

Ile

Thr

Val

Glu

Trp

Gin

Trp

370

375

380

aat

ggg

cag

cca

gcg

gag

aac

tac

aag

aac

act

cag

ccc

atc

atg

aac

1248

Asn

Gly

Gin

Pro

Ala

Glu

Asn

Tyr

Lys

Asn

Thr

Gin

Pro

Ile

Met

Asn

385

390

395

acg

aat

ggc

tet

tac

ttc

gtc

tac

age

aag

ctc

aat

gtg

cag

aag

age

1296

Thr

Asn

Gly

Ser

Tyr

Phe

Val

Tyr

Ser

Lys

Leu

Asn

Val

Gin

Lys

Ser

400

405

410

aac

tgg

gag

gca

gga

aat

act

ttc

acc

tgc

tet

gtg

tta

cat

gag

ggc

1344

Asn

Trp

Glu

Ala

Gly

Asn

Thr

Phe

Thr

Cys

Ser

Val

Leu

His

Glu

Gly

415

420

425

ctg

cac

aac

cac

cat

act

gag

aag

age

ctc

tcc

cac

tet

cct

ggt

aaa

1392

Leu

His

Asn

His

His

Thr

Glu

Lys

Ser

Leu

Ser

His

Ser

Pro

Gly

Lys

430

435

440

445

<210> 9 <211> 464 <212> PRT <213 > Mus musculus <400> 9

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly -15 -10 -5

3333

191

3 33 · 3 3···

3 3 33333 • 33 · 33··· ···

3 · · · · ·

333 33 333 ·333 ·· ··

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Gin 5

Gin

Pro

Gly

Ala

Glu 10

Leu

Val

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Leu 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Lys

Gin

Arg 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Ile

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Ser

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Gin

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp 90

Ser

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg 100

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Thr

Gly

Thr 115

Thr

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Lys

Thr

Thr 125

Pro

Pro

Ser

Val

Tyr 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly 135

Ser

Ala

Ala

Gin

Thr 140

Asn

Ser

Met

Val

Thr 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Gly

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ser

Leu

Ser

Ser

Gly 170

Val

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser 180

Asp

Leu

Tyr

Thr

Leu 185

Ser

Ser

Ser

Val

Thr 190

Val

Pro

Ser

Ser

Thr 195

Trp

Pro

Ser

Gin

Thr 200

Val

Thr

Cys

Asn

Val 205

Ala

His

Pro

Ala

Ser 210

Ser

Thr

Lys

Val

Asp 215

Lys

Lys

Ile

Val

Pro 220

Arg

Asp

Cys

Gly

Cys 225

Lys

Pro

Cys

Ile

Cys 230

Thr

Val

Pro

Glu

Val 235

Ser

Ser

Val

Phe

Ile 240

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro 245

Lys

Asp

Val

Leu

Thr 250

Ile

Thr

Leu

Thr

Pro 255

Lys

Val

Thr

Cys

Val 260

Val

Val

Asp

Ile

Ser 265

Lys

Asp

Asp

Pro

Glu 270

Val

Gin

Phe

Ser

Ttp 275

Phe

Val

Asp

Asp

Val 280

Glu

Val

His

Thr

Ala 285

Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val 290 295 300 »· · · ·· ·· » · · · » · · · ··· ··· • · ·· ·«

192

Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gin Asn Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 305 310 315

Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 320 325 330

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gin Val Tyr Thr Ile 335 340 345

Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys

350 355 360 365

Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gin Trp

370 375 380

Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn 385 390 395

Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gin Lys Ser 400 405 410

Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly 415 420 425

Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 430 435 440 445

<210> <211> <212> <213>	10 714 DNA MUS	musculus
<220>
<221>	CDS
<222>	(1)	..(714)

<220>

<221> mat peptid

<222>

(61) .

-(714)

<220>

<221>

sig peptid

<222>

(l) . ·

(60)

<400>

10

atg gag aca

gac aca

atc

ctg

cta

tgg

gtg

atg

atg

ctc

tgg

att

cca

Met Glu Thr

Asp Thr

Ile

Leu

Leu

Trp

Val

Met

Met

Leu

Trp

Ile

Pro

-20

-15

-10

-5

ggc tcc act

ggt gac

att

gtg

ctg

acc

caa

tet

cca

get

tet

ttg

get

Gly Ser Thr

Gly Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

-1 1

5

10

·«»· ř« ·· »· «· · ···· ···· • « · ··*·· , * « · · · ······ • · · · · · · «·· ·· »·«··«· ·· *«

193

gtg Val

tet Ser

cta ggg cag Leu Gly Gin 15

agg gcc acc atc tcc

tgc aag gcc

age Ser

caa Gin

agt Ser

144

Arg Ala

Thr 20

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala 25

gtt

gat

tat

gat

ggt

gat

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

192

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

gga

cag

cca

ccc

aaa

ctc

ctc

atc

tat

get

gca

tcc

aat

cta

gaa

tet

240

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

ggg

atc

cca

gcc

agg

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

acc

288

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

ctc

aac

atc

cat

cct

gtg

gag

gag

gag

gat

get

gca

acc

tat

tac

tgt

336

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

cag

caa

agt

aat

gag

gat

cct

cgg

acg

ttc

ggt

gga

ggc

acc

aag

ctg

384

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

gaa

atc

aaa

cgg

get

gat

get

gca

cca

act

gta

tcc

atc

ttc

cca

cca

432

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

tcc

agt

gag

cag

tta

aca

tet

gga

ggt

gcc

tca

gtc

gtg

tgc

ttc

ttg

480

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

125

130

135

140

aac

aac

ttc

tac

ccc

aaa

gac

atc

aat

gtc

aag

tgg

aag

att

gat

ggc

528

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

145

150

155

agt

gaa

ega

caa

aat

ggc

gtc

ctg

aac

agt

tgg

act

gat

cag

gac

age

576

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

aaa

gac

age

acc

tac

age

atg

age

age

acc

ctc

acg

ttg

acc

aag

gac

624

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

gag

tat

gaa

ega

cat

aac

age

tat

acc

tgt

gag

gcc

act

cac

aag

aca

672

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

tca

act

tca

ccc

att

gtc

aag

age

ttc

aac

agg

aat

gag

tgt

714

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

205

210

•

215

<2l0> 11 <211> 238 <212> PRT <213> Mus musculus ··· ·

194

<400> 11

Ile -15

Leu Leu Trp Val Met -10

Met

Leu

Trp

Ile

Pro -5

Met -20

Glu Thr Asp Thr

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

-1

1

5

10

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Ala

Asp

Ala

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Ser

Glu

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Phe

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Lys

Asp

Ile

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

Ile

Asp

Gly

145

150

155

Ser

Glu

Arg

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

175

180

185

Glu

Tyr

Glu

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

190

195

200

Ser

Thr

Ser

Pro

Ile

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

205

210

215

<210> 12 <211> 34 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s U}měle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikací DNA, kódující extracelulární oblast lidského Fas antigenů

• · φ

• ΦΦΦ ·· • φ φφ ·· φ φ · · • φ φ · • φ φφ φφ

195 <400> 12 ggggaattcc agtacggagt tggggaagct cttt <210> 13 <211> 35 <212> DNA <2i3> Uměle připravená sekvence <220>

<223> .

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující extracelulární oblast lidského Fas antigenu <400> 13 gtttcttctg cctctgtcac caagttagat ctgga 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popig uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA kódující extracelulární oblast myššího IL-3 receptorů <400> 14 tccagatcta acttggtgac agaggcagaa gaaac <210> 15 <211> 28 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{<2 2 3 >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA kódující extracelulární oblast myššího IL-3 receptorů <400> 15 ccctctagac gcgtcacgtg ggcatcac 28 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16

Gin Xaa Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu 15 10

196 » ·0 · » 0 0 ·

000 00· <210> 17 <211> 22 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17

Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr Ile Ser 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<22 3 > p_Opi_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující gama 1 těžký řetězec podtyp 2b myššího imunoglobulinu <400> 18 gacctcacca tgggatgga 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223^> p_Opj_{s um}g|_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující gama 1 těžký řetězec podtyp 2b myššího imunoglobulinu <400> 19 tttaccagga gagtgggaga 2.0 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující kapa lehký řetězec podtyp 3 myššího imunoglobulinu <400> 20 aagaagcatc ctctcatcta 20 <210> 21 <211> 20

197 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_opi_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující kapa lehký řetězec podtyp 3 myššího imunoglobulinu <400> 21 acactcattc ctgttgaagc 20 <210> 22 <211> 28 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Adaptorový primer pro subklonování cDNA, kódující těžký řetězec protilátky HFE7A proti lidskému Fas <400> 22 ggggaattcg acctcaccat gggatgga 28 <210> 23 <211> 32 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

< 2 2 3 > popis uměle připravené sekvence: Adaptorový primer pro subklonování cDNA, kódující těžký řetězec protilátky HFE7A proti lidskému Fas <400> 23 gggtctagac tatttaccag gagagtggga ga 32 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: Adaptorový primer pro subklonování cDNA kódující lehký řetězec protilátky HFE7A proti lidskému Fas <400> 24 ggggaattca agaagcatcc tctcatcta <210> 25 <211> 37 <212> DNA

198 • · · · » · · · » · · · ·· · ··· • · • · · · < 213 > Uměle připravená sekvence <220> .

< 2 2 3 > p_Opi_s uměle připravené sekvence: Adaptorový primer pro subklonování cDNA, kódující lehký řetězec protilátky HFE7A proti lidskému Fas <400> 25 ggggcggccg cttactaaca ctcattcctg ttgaagc <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 26

Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gin Val Thr Asp lle Asn Ser 15 10 15

Lys Gly Leu <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27

Val Thr Asp lle Asn Ser Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr 15 10 15

Thr Val Glu

<210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 28 Glu Leu Arg Lys Thr Val	Thr Thr Val Glu Thr Gin Asn	Leu Glu Gly
1 5	10	15
Leu His His Asp

<210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens • ·

199 <400> 29

Thr Gin Asn Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gin Phe Cys His Lys 15 10 15

Pro Cys Pro Pro 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 30

Gly Gin Phe Cys His Lys Pro Cys Pro Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg 15 10 15

Asp Cys Thr Val 20

<210> 31 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 31 Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp	Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu	Pro Asp
1	5	10	15
Cys Val Pro Cys Gin

<210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32

Asn Gly Asp Glu Pro Asp Cys Val Pro Cys Gin Glu Gly Lys Glu Tyr 15 10 15

Thr Asp Lys Ala 20 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33

Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His Phe Ser Ser Lys Cys Arg 15 10 15

Arg Cys Arg » · · • ·

200 · · · · • · · · · · ··· ··· <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34

His Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His 15 10 15

Gly Leu Glu Val 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35

Leu Cys Asp Glu Gly His Gly Leu Glu Val Glu lle Asn Cys Thr Arg 15 10 15

Thr Gin Asn Thr 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36

Glu lle Asn Cys Thr Arg Thr Gin Asn Thr Lys Cys Arg Cys Lys Pro 15 10 15

Asn Phe Phe Cys 20 <210> 37 <211> 20 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 37

Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu 15 10 15

His Cys Asp Pro 20 <210> 38 <211> 20

201 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 38

Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp Pro Cys Thr Lys Cys Glu His 15 10 15

Gly Ile Ile Lys 20

<210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 39 Cys Thr Lys Cys Glu His	Gly Ile Ile Lys Glu	Cys Thr Leu Thr Ser
1	5	10	15
Asn Thr Lys Cys

<210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40

Glu Cys Thr Leu Thr Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg 15 10 15

Ser Asn <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41

Ser Ser Gly Lys Tyr Glu Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala 15 10 15

Phe Asn Val Glu 20 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens • · 9 · 9 ·

202 <400> 42

His Gly Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr 15 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43

Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gin Asn Thr 15 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44

Lys Cys Arg Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys 15 10 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 45

Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp 15 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46

Gly Lys Ile Ala Ser Cys Leu Asn Asp Asn 15 10 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gcgaattctg ccttgactga.-tcagagtttc ctca <210> 48 <211> 32 <212> DNA ·· ·· • · · · • · · · ·· · ···

203

<213 > Homo sapiens <400> 48 gctctagatg aggtgaaaga tgagctggag ga 32 <210> 49 <211> 768 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<221> CDS <222> (40)..(753) <220>

<221> mat peptid <222> (100)..(753) <220>

<221> sig peptid <222> (40)..(99) <220>

<2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti lidskémů Fas <400> 49 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttctcagag atg gag aca gac aca 54 Met Glu Thr Asp Thr -20

atc ctg cta

tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca ggc tcc act ggt gac

102

Ile -15

Leu

Leu

Trp

Val Leu Leu -10

Leu Trp Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr Gly Asp

-1

1

att

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

ggt

act

ttg

tet

ctg

tet

cca

ggg

gag

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

agg

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

aag

gcc

age

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

gat

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

cag

gca

ccc

aga

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

ctc

ctc

atc

tat

gct

gca

tcc

aat

ctc

gaa

tet

ggg

atc

cca

gac

agg

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

acc

ctc

acc

atc

tet

cgt

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

70

75

80

204 • ·· · ► 9 9 · » · · · 99 9 · ·9

ctg gag ccg gcg gat

ttt gca gtc Phe Ala Val

tat Tyr 90

tac tgt

cag caa agt

aat gag Asn Glu

390

Leu

Glu

Pro Ala 85

Asp

Tyr

Cys

Gin

Gin Ser 95

gat

cct

cgg

acg

ttc

ggt

caa

ggc

acc

agg

ctg

gaa

atc

aaa

cgg

act

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

gtg

gct

gca

cca

tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag

cag

ttg

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

aaa

tet

gga

act

gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

aga

gag

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aaa

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

aac

tcc

cag

gag

agt

gtc

aca

gag

cag

gac

agc

aag

gac

agc

acc

tac

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

agc

ctc

agc

agc

acc

ctg

acg

ctg

agc

aaa

gca

gac

tac

gag

aaa

cac

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

aaa

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

agc

tcg

ccc

gtc

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

aca

aag

agc

ttc

aac

agg

gga

gag

tgt

tagtaagaat tcggg

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 215 <210> 50 <211> 238 <212> PRT < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< 2 2 3 >} Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

<400> 50

Thr

Ile -15

Leu

Leu Trp

Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val

Pro -5

Met -20

Glu Thr Asp

Gly

Ser

Thr

Gly -1

Asp 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

205 • a ·· ·· • a a a a • · · · · a a aaa ··· • · · aaa aa »·

Val Asp Tyr Asp 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gin

Gin

Lys

Pro

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Ala

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 210 215 <210> 51 <211> 768 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<221> CDS <222> (40)..(753) <220>

<221> mat peptid <222> (100)..(753) <220>

<221> sig peptid <222> (40)..(99) <220>

11 11 ··

111 1 · 9 1 1

9 9 9 9 9 • 11 991 111

1 11

1191999 9 1 91

206 <223 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti lidskému Fas <400> 51 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttctcagag atg gag aca gac aca 54 Met Glu Thr Asp Thr -20

atc lle -15

ctg Leu

cta Leu

tgg gtg ctg

ctg Leu

ctc Leu

tgg Trp

gtt Val

cca Pro -5

ggc Gly

tcc Ser

act ggt gac

102

Trp Val

Leu -10

Thr

Gly -1

Asp 1

att

gtg

ctc

acc caa

tet

cca

ggt

act

ttg

tet

ctg

tet

cca

ggg

gag

150

lle

Val

Leu

Thr Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

agg

gcc

acc

ctc tcc

tgc

aag

gcc

agc

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

198

Arg

Ala

Thr

Leu Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

gat

agt

tat

atg aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

cag

gca

ccc

aga

246

Asp

Ser

Tyr

Met Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

ctc

ctc

atc

tat gct

gca

tcc

aat

ctc

gaa

tet

ggg

atc

cca

gac

agg

294

Leu

Leu

lle

Tyr Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

lle

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

ttt

agt

ggc

agt ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

acc

ctc

acc

atc

cat

cct

342

Phe

Ser

Gly

Ser Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

His

Pro

70

75

80

gtg

gag

gag

gag gat

gct

gca

acc

tat

tac

tgt

cag

caa

agt

aat

gag

390

Val

Glu

Glu

Glu Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

gat

cct

cgg

acg ttc

ggt

caa

ggc

acc

agg

ctg

gaa

atc

aaa

cgg

act

438

Asp

Pro

Arg

Thr Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

100

105

110

gtg

gct

gca

cca tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag

cag

ttg

486

Val

Ala

Ala

Pro Ser

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

aaa

tet

gga

act gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

534

Lys

Ser

Gly

Thr Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

aga

gag

gcc

aaa gta

cag

tgg

aaa

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

582

Arg

Glu

Ala

Lys Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

aac

tcc

cag

gag agt

gtc

aca

gag

cag

gac

agc

aag

gac

agc

acc

tac

630

Asn

Ser

Gin

Glu Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

9· *9 • 9 9 9 · 9 99 • 9 9 9 9

9 9 99 999 99

9 9 9 9 9

999 99 999 9*99 99 99

207

678 »·· ·

age ctc age Ser Leu Ser 180

age acc Ser Thr

ctg acg ctg age aaa gca

gac tac gag aaa cac

Leu

Thr

Leu 185

Ser Lys Ala

Asp

Tyr Glu 190

Lys His

aaa

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

age

tcg

ccc

gtc

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

aca

aag

age

ttc

aac

agg

gga

gag

tgt

tagtaagaat 1

tcggg

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

<210> 52 <211> 238 <212> PRT <213 > Uměle připravená sekvence

726

768 <220>

<223 > p_Opj_{s um}gie připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

<400> 52

Met -20

Glu

Thr

Asp

Thr

Ile -15

Leu

Leu

Trp

Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly Asp -1 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu

Thr

Ile

His 80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu 85

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr 90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser 95

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile 110

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 115

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 125

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys 130

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 135

Val

Val

Cys

Leu

Leu 140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro 145

Arg

Glu

Ala

Lys

Val 150

Gin

Trp

Lys

Val

Asp 155

Asn

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser « » » · • · -» · · · »·« «« ·»· ···· ·· ··

208

160

165

170

Lys

Asp

Ser 175

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 185

Ser

Lys Ala

Asp

Tyr 190

Glu

Lys

His

Lys

Val 195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 200

Thr

His

Gin Gly

Leu 205

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg 215

Gly

Glu

Cys

<210> 53 <211> 768 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<221> CDS <222> (40)..(753) <220>

<221> mat peptid <222> (100)..(753) <220>

<221> sig peptid <222> (40) . . (99) <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 53 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttctcagag atg gag aca gac aca 54 Met Glu Thr Asp Thr -20

atc lle -15

ctg cta tgg

gtg Val

ctg ctg ctc tgg gtt

cca ggc

tcc act ggt gac

102

Leu

Leu

Trp

Leu Leu -10

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly Asp

-1

1

att

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

ggt

act

ttg

tet

ctg

tet

cca

ggg

gag

150

lle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

agg

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

aag

gcc

age

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

gat

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

cag

cca

ccc

aaa

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

35

40

45

209

ctc Leu 50

ctc atc tat get gca tcc aat

ctc gaa tet ggg atc cca gac agg

294

Leu

Ile

Tyr Ala

Ala Ser Asn 55

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro Asp Arg 65

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

acc

ctc

acc

atc

cat

cct

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

His

Pro

70

75

80

gtg

gag

gag

gag

gat

get

gca

acc

tat

tac

tgt

cag

caa

agt

aat

gag

390

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

gat

cct

cgg

acg

ttc

ggt

caa

ggc

acc

agg

ctg

gaa

atc

aaa

cgg

act

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin'

Gly

Thr

Arg

Leu

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

100

105

110

gtg

get

gca

cca

tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag

cag

ttg

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

aaa

tet

gga

act

gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

aga

gag

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aaa

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

aac

tcc

cag

gag

agt

gtc

aca

gag

cag

gac

age

aag

gac

age

acc

tac

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

age

ctc

age

age

acc

ctg

acg

ctg

age

aaa

gca

gac

tac

gag

aaa

cac

678

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

180

185

190

aaa

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

age

tcg

ccc

gtc

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

aca

aag

age

ttc

aac

agg

gga

gag

tgt

tagtaagaat 1

tcggg

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210 215 <210> 54 <211> 238 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s um}ěle připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 54

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5 • ·

0 · · 0 · 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 · 0 · • 00 0 00000000 0 0 0 0 0 0 0

000 00 000 0000 00 00

210

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser

-1

1

5

10

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

SO

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

<210> 55 <211> 34 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{c >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 55 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttct • · · · • · · flflflfl flflflfl • · · · · · · · • · · fl ········ • · · flfl flfl ··· ·· ··· flflflfl ·· flfl

211 <210> 56 <211> 44 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 56 gagagggtgg ccctctcccc tggagacaga gacaaagtac ctgg 44 <210> 57 <211> 44 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}gle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 57 ccaggtactt tgtctctgtc tccaggggag agggccaccc tctc 44 <210> 58 <211> 44 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opjg _Uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 58 gattcgagat tggatgcagc atagatgagg agtctgggtg cctg 44 <210> 59 <211> 45 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

< 2 2 3 > p_Opi_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 59 gctgcatcca atctcgaatc tgggatccca gacaggttta gtggc 45 • · · ·

212 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 60 aaaatccgcc ggctccagac gagagatggt gagggtgaag tctgtcccag ac <210> 61 <211> 58 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 61 ctcgtctgga gccggcggat tttgcagtct attactgtca gcaaagtaat gaggatcc )> 62

L> 55

2> DNA

3> Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 62 tgaagacaga tggtgcagcc acagtccgtt tgatttccag cctggtgcct tgacc <220>

<223>

DNA

Uměle připravená sekvence

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 63 ggtcaaggca ccaggctgga aatcaaacgg actgtggctg caccatctgt cttca <210> 64

213 <211> 45 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 64 cccgaattct tactaacact ctcccctgtt gaagctcttt gtgac 45 <210> 65 <211> 55 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s um}ěl_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 65 tctgtcccag acccactgcc actaaacctg tctgggatcc cagattcgag attgg 55 <210> 66 <211> 55 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 66 gtttagtggc agtgggtctg ggacagactt cacctctacc atccatcctg tggag 55 <210> 67 <211> 55 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^<223> p_Opi_{s um}ěle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 67 atggtgcagc cacagtccgt ttgatttcca gcctggtgcc ttgaccgaac gtccg 55 <210> 68 <211> 20 • · · ·

214 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 68 cccaagctta agaagcatcc 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 69 atctatgctg catccaatct 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opi_s uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 70 gttgtgtgcc tgctgaataa 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 71 cccgaattct tactaacact 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA

215

<213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěi_e připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 72 ttattcagca ggcacacaac 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA kódující lehké řetězce polidštěných protilátek proti Fas <400> 73 agattggatg cagcatagat 2 0 <21O> 74 <211> 457 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis umele připravené sekvence: DNA kódující dílčí peptid těžkého řetězce polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> CDS <222> (21)..(455) <220>

<221> mat peptid <222> (78)..(455) <220>

<221> sig peptid <222> (21)..(77) <400> 74 aagcttggct tgacctcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta 53 Met Gly Trp Ser Cys Xle lle Leu Phe Leu Val

-15 -10 gca aca gct aca ggt gtc cac tet cag gtc caa ctg gtg cag tet ggg 101

Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly

-5 -11 5

216 ·· I » · 9 » 9 9

9 «

9 «

gct gag gtc aag

aag cct ggg

gct tea gtg aag gtg tcc tgc aag gct

149

Ala Glu Val

Lys

Lys

Pro Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

10

tet

ggc

tac

acc

ttc

acc

agc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gta

aaa

cag

gcc

197

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

25

30

35

40

cct

gga

cag

agg

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

gat

agc

245

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

45

50

55

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

act

gta

293

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

60

65

70

gac

aca

tcc

gct

agc

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

agc

agc

ctg

aga

tet

341

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

75

80

85

gag

gac

acg

gcg

gtc

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

agt

aac

389

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

90

95

100

aac

tgg

tac

ttc

gat

gtc

tgg

ggc

gaa

ggg

acc

ctg

gtc

acc

gtc

tcc

437

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

105

110

115

120

tea

gcc

tcc

acc

aag

ggc

cc

457

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

125 <210> 75 <211> 145 <212> PRT <213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný dílčí peptid těžkého řetězce polidštěné protilátky proti lidskému Fas <400> 75

Met

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr -5

Gly

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

35 40 45

217 • fcfc fcfcfc

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg Asp 100

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly <210> 76 <211> 40 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s um}ěi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 76 gggaagcttg gcttgacctc accatgggat ggagctgtat 40 <210> 77 <211> 48 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

O

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 77 tgaagcccca ggcttcttga cctcagcccc agactgcacc agttggac 48 <210> 78 <211> 36 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

9 · 9 9 9 9 9>9· • · · · · 9 9 9 • 99 · 9 9 999999

9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99

218 <223> Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 78 tccactcaag cctctgtcca ggggcctgtt ttaccc 36 <210> 79 <211> 52 <212> DNA <213> JUměle připravená sekvence <220>

^{< >} (Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 79 gtctggggct gaggtcaaga agcctggggc ttcagtgaag gtgtcctgca ag 52 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 80 caggcccctg gacagaggct tgagtggatg ggagagatt 39 <210> 81 <211> 50 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opi_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 81 tcagatctca ggctgctgag ctccatgtag gctgtgctag cggatgtgtc <210> 82 <211> 44 <212> DNA • flfl β flfl · • fl flfl • fl · · · · · ··· • · · flflflfl fl flfl fl ····· • flfl flfl flfl •flfl ·· ··· flflflfl flfl flfl

219 <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 82 tggagctcag cagcctgaga tctgaggaca cggcggtcta ttac 44 <210> 83 <211> 55 <2l2> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího variabilní oblast v těžkém řetězci polidštěné protilátky proti Fas <400> 83 gatgggccct tggtggaggc tgaggagacg gtgaccaggg tcccttcgcc ccagt 55 <210> 84 <2X1> 39 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu Gl <400> 84 gggaagcttc cgcggtcaca tggcaccacc tctcttgca 39 <210> 85 <211> 35 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> popj_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu Gl <400> 85 gctctgcaga gagaagattg ggagttactg gaatc •4 44 4·

4 4 0 4 4

4 4 4 4

4 444 444

4 4

4 4 4 4 44 44

220 <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

^> Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu Gl <400> 86 tctctgcaga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcac 35 <210> 87 <211> 39 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu Gl <400> 87 ggggaattcg ggagcggggc ttgccggccg tcgcactca 39 <210> 88 <211> 2077 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^c > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> sig peptide <222> (27)..(83) <220>

<221> intron <222> (741)..(1131) <220>

<221> intron <222> (1177) . . (1294) <220>

<221> intron <222> (1625)..(1721) <220>

Φ ·*· ·

ΦΦ « • · • · ·

9 9 • ΦΦ ··

ΦΦ ·· « « · · • Φ Φ Φ ·· Φ ΦΦΦ Φ ·

ΦΦ 99

221 <221> exon <222> (27)..(740) <220>

<221> exon <222> (1132)..(1176) <220>

<221> exon <222> (1295)..(1624) <220>

<221> exon <222> (1722) .. (2042) <220>

<221> mat peptid <222> (84)..(740) <220>

<221> mat peptid <222> (1132)..(1176) <220>

<221> mat peptid <222> (1295)..(1624) <220>

<221> mat peptid <222> (1722)..(2042) <220>

<221> CDS <222> (27)..(740) <220>

<221> CDS <222> (1132)..(1176) <220>

<221> CDS <222> (1295)..(1624) <220>

<221> CDS <222> (1722)..(2042) <400> 88 gggcgaaagc ttggcttgac ctcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc 53 Met Gly Trp Ser Cys Xle lle Leu Phe ttg gta gca aca gct aca ggt gtc cac tet cag gtc caa ctg gtg cag 101

Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin

-10 -5 -11 5 • · · · • · • · • · · » · · · • · · · · · • · • · · ·

222

tet ggg get gag Ser Gly Ala Glu

gtc Val

aag aag cct ggg get

tea gtg aag gtg tec tgc

149

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

10

aag

get

tet

ggc

tac

acc

ttc

acc

age

tac

tgg

atg

cag

tgg

gta

aaa

197

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

25

30

35

cag

gcc

cct

gga

cag

agg

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

245

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

40

45

50

gat

age

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

293

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

55

60

65

70

act

gta

gac

aca

tec

get

age

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

age

age

ctg

341

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

75

80

85

aga

tet

gag

gac

acg

gcg

gtc

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

389

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

90

95

100

agt

aac

aac

tgg

tac

ttc

gat

gtc

tgg

ggc

gaa

ggg

acc

ctg

gtc

acc

437

Ser

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

val

Thr

105

110

115

gtc

tec

tea

gcc

tec

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

485

Val

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

120

125

130

tec

tec

aag

age

acc

tet

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

ggc

tgc

ctg

gtc

533

Ser

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

135

140

145

150

aag

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tea

ggc

gcc

581

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

155

160

165

ctg

acc

age

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

get

gtc

cta

cag

tec

tea

gga

629

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

170

175

180

ctc

tac

tec

ctc

age

age

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tec

age

age

ttg

ggc

677

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

185

190

195

acc

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

ccc

age

aac

acc

aag

725

Thr

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

200

205

210

gtg gac aag aga gtt ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa 780

Val Asp Lys Arg Val

215 gccaggctca gcgctcctgc ctggacgcat cccggctatg cagtcccagt ccagggcagc 840 • a a a a a a aaaa a · · · · · · « a a a a a a aaa aaa aaa a a a a aaa aa aaa aaaa aa a«

223

aaggcaggcc	ccgtctgcct	cttcacccgg	aggcctctgc	ccgccccact	catgctcagg	900
gagagggtct	tctggctttt	tccccaggct	ctgggcaggc	acaggctagg	tgcccctaac	960
ccaggccctg	cacacaaagg	ggcaggtgct	gggctcagac	ctgccaagag	ccatatccgg	1020
gaggaccctg	cccctgacct	aagcccaccc	caaaggccaa	actctccact	ccctcagctc	1080
ggacaccttc	tctcctccca	gattccagta	actcccaatc	ttctctctgc	a gag ccc Glu Pro	1137

220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1186 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1246 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1303 Ala Pro Glu 235

ctc ctg ggg	gga ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac	1351
Leu Leu	Gly 240	Gly	Pro Ser Val	Phe Leu 245	Phe	Pro	Pro Lys 250	Pro Lys Asp
acc ctc	atg	ate	tec cgg acc	cct gag	gtc	aca	tgc gtg	gtg gtg gac	1399
Thr Leu	Met	Ile	Ser Arg Thr	Pro Glu	Val	Thr	Cys Val	Val Val Asp
255			260				265
gtg age	cac	gaa	gac cct gag	gtc aag	ttc	aac	tgg tac	gtg gac ggc	1447
Val Ser	His	Glu	Asp Pro Glu	Val Lys	Phe	Asn	Trp Tyr	Val Asp Gly
270			275			280		285
gtg gag	gtg	cat	aat gcc aag	aca aag	ccg	cgg	gag gag	cag tac aac	1495
Val Glu	Val	His	Asn Ala Lys	Thr Lys	Pro	Arg	Glu Glu	Gin Tyr Asn
			290		295			300
age acg	tac	cgt	gtg gtc age	gtc ctc	acc	gtc	ctg cac	cag gac tgg	1543
Ser Thr	Tyr	Arg	Val Val Ser	Val Leu	Thr	Val	Leu His	Gin Asp Trp
		305		310				315
ctg aat	ggc	aag	gag tac aag	tgc aag	gtc	tec	aac aaa	gcc ctc cca	1591
Leu Asn	Gly	Lys	Glu Tyr Lys	Cys Lys	Val	Ser	Asn Lys	Ala Leu Pro
	320			325			330
gcc ccc	ate	gag	aaa acc ate	tec aaa	gcc	aaa	ggtgggaccc gtggggtgcg	1644
Ala Pro	Ile	Glu	Lys Thr Ile	Ser Lys	Ala	Lys
335			340

agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac 1704 caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg 1754

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 . 350 355

224 • · · · · · φ ·· *· • · φ φ φ φ··· φ φ · · · · ♦ ·· · φ e φφφφφφ • · φ φ · ·

ccc cca tcc cgg gag Pro Pro Ser Arg Glu 360

gag atg acc aag aac cag

gtc Val

agc Ser

ctg acc tgc Leu Thr Cys 370

1802

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

ctg

gtc

aaa

99C

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

1850

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

375

380

385

aat

939

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

1898

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

390

395

400

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

1946

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

val

Asp

Lys

Ser

405

410

415

agg

tgg

cag

cag

999

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

9tg

atg

cat

gag

gct

1994

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

420

425

430

435

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

2042

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

440

445

450

tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt 2077 <210> 89 <211> 470 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

< 2 2 3 > pqjj_{s um}ěi_e připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 89

Met

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr -5

Gly

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Lys

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Arg

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

Asp

Thr

Ser

Ala

Ser

70 75

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90

225

Tyr	Tyr Cys Ala Arg Asn Arg	Asp	Tyr Ser Asn Asn 105	Trp	Tyr	Phe	Asp
95	100
Val	Trp	Gly Glu Gly Thr Leu	Val	Thr Val Ser Ser	Ala	Ser	Thr	Lys
110		115		120				125
Gly	Pro	Ser Val Phe Pro Leu	Ala	Pro Ser Ser Lys	Ser	Thr	Ser	Gly
		130		135			140
Gly	Thr	Ala Ala Leu Gly Cys	Leu	Val Lys Asp Tyr	Phe	Pro	Glu	Pro
		145		150		155
Val	Thr	Val Ser Trp Asn Ser	Gly	Ala Leu Thr Ser	Gly	val	His	Thr
		160	165		170
Phe	Pro	Ala Val Leu Gin Ser	Ser	Gly Leu Tyr Ser	Leu	Ser	Ser	Val
	175	180		185
Val	Thr	Val Pro Ser Ser Ser	Leu	Gly Thr Gin Thr	Tyr	Ile	Cys	Asn
190		195		200				205
Val	Asn	His Lys Pro Ser Asn	Thr	Lys Val Asp Lys	Arg	Val	Glu	Pro
		210		215			220
Lys	Ser	Cys Asp Lys Thr His	Thr	Cys Pro Pro Cys	Pro	Ala	Pro	Glu
		225		230		235
Leu	Leu	Gly Gly Pro Ser Val	Phe	Leu Phe Pro Pro	Lys	Pro	Lys	Asp
		240	245		250
Thr	Leu	Met Ile Ser Arg Thr	Pro	Glu Val Thr Cys	Val	Val	Val	Asp
	255	260		265
Val	Ser	His Glu Asp Pro Glu	Val	Lys Phe Asn Trp	Tyr	Val	Asp	Gly
270		275		280				285
Val	Glu	Val His Asn Ala Lys	Thr	Lys Pro Arg Glu	Glu	Gin	Tyr	Asn
		290		295			300
Ser	Thr	Tyr Arg Val Val Ser	Val	Leu Thr Val Leu	His	Gin	Asp	Trp
		305		310		315
Leu	Asn	Gly Lys Glu Tyr Lys	Cys	Lys Val Ser Asn	Lys	Ala	Leu	Pro
		320	325		330
Ala	Pro	Ile Glu Lys Thr Ile	Ser	Lys Ala Lys Gly	Gin	Pro	Arg	Glu
	335	340		345
Pro	Gin	Val Tyr Thr Leu Pro	Pro	Ser Arg Glu Glu	Met	Thr	Lys	Asn
350		355		360				365
Gin	Val	Ser Leu Thr Cys Leu	Val	Lys Gly Phe Tyr	Pro	Ser	Asp	Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 .· · · · · • · · «··· »··· « · · · · · · • ·· · ········ • · · · · · ' ··· *· ····»·· ·» ·«

226

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 <210> 90 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s um}ěle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 90 acagccggga aggtgtgcac 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s U}měle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 91 agacaccctc cctccctgtg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 92 gtgcagggcc tgggttaggg <21O> 93

227 <211> 20 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^<223> Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 93 gcacggtggg catgtgtgag 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA kódující těžký řetězec polidštěhé protilátky proti Fas <400> 94 gttttggggg gaagaggaag 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 95 ccagtcctgg tgcaggacgg 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opjg _umgi_e připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 96 cctgtggttc tcggggctgc 20 <210> 97 <211> 20

228 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Op_{ls um}ěle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 97 cgtggtcttg tagttgttct <210> 98 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opi_s uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 98 cttcctcttc cccccaaaac <210> 99 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 99 ccgtcctgca ccaggactgg <21O> 100 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opig _Uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 100 gcagccccga gaaccacagg <210> 101 <211> 20 <212> DNA • ·

9t · · fc ·

229 • · ·· · <213 > Uměle připravená sekvence <220>

< 2 2 3 > p_Op j_{s um}ěi_e připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 101 agaacaacta caagaccacg 20 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<2 2 3 > pppi_s uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 102 gcctgacatc tgaggactc 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 103 gagtcctcag atgtcaggc 19 <210> 104 <211> 34 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> ' '

Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 104 gagcagtact cgttgctgcc gcgcgcgcca ccag 34 <210> 105 <211> 24 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence • · ·

230 <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 105 ggtatggctg attaatgatc aatg 24 <210> 106 <211> 768 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> CDS <222> (40)..(753) <220>

<221> mat peptid <222> (100)..(753) <220>

<221> sig peptid <222> (40)..(99) <400> 106 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttctcagag atg gag aca gac aca 54 Met Glu Thr Asp Thr -20

atc Ile -15

ctg cta tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt

cca ggc tcc act ggt gag

102

Leu

Leu

Trp

Val

Leu -10

Leu Leu

Trp Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr Gly Glu

-1

1

att

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

ggt

act

ttg

tet

ctg

tet

cca

ggg

gag

150

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

agg

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

aag

gcc

age

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

20

25

30

gat

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

cag

gca

ccc

aga

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

ctc

ctc

atc

tat

gct

gca

tcc

aat

ctc

gaa

tet

ggg

atc

cca

gac

agg

294

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

····

9· 4 4 4· • · · 44 4 · 4 · 4 4

4 4 · · 4 4 4

4 4 4 4 4 444444

4 4 4 4 4 4

231

ttt agt ggc agt	ggg tet ggg aca gac ttc acc ctc acc atc tet cgt	342
Phe	Ser	Gly Ser	Gly 70	Ser	Gly	Thr	Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
75	80
ctg	gag	ccg gag	gat	ttt	gca	gtc	tat tac	tgt cag caa agt aat gag	390
Leu	Glu	Pro Glu	Asp	Phe	Ala	Val	Tyr Tyr	Cys Gin Gin Ser Asn Glu
		85					90	95
gat	cct	cgg acg	ttc	ggt	caa	ggc	acc aag	ctg gaa atc aaa cgg act	438
Asp	Pro	Arg Thr	Phe	Gly	Gin	Gly	Thr Lys	Leu Glu Ile Lys Arg Thr
		100				105		110
gtg	gct	gca cca	tet	gtc	ttc	atc	ttc ccg	cca tet gat gag cag ttg	486
Val	Ala	Ala Pro	Ser	Val	Phe	Ile	Phe Pro	Pro Ser Asp Glu Gin Leu
	115				120			125
aaa	tet	gga act	gcc	tet	gtt	gtg	tgc ctg	ctg aat aac ttc tat ccc	534
Lys	Ser	Gly Thr	Ala	Ser	Val	Val	Cys Leu	Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130				135				140 145
aga	gag	gcc aaa	gta	cag	tgg	aaa	gtg gat	aac gcc ctc caa tcg ggt	582
Arg	Glu	Ala Lys	Val	Gin	Trp	Lys	Val Asp	Asn Ala Leu Gin Ser Gly
			150				155	160
aac	tcc	cag gag	agt	gtc	aca	gag	cag gac	age aag gac age acc tac	630
Asn	Ser	Gin Glu	Ser	Val	Thr	Glu	Gin Asp	Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
		165					170	175
ago	ctc	ago age	acc	ctg	acg	ctg	age aaa	gca gac tac gag aaa cac	678
Ser	Leu	Ser Ser	Thr	Leu	Thr	Leu	Ser Lys	Ala Asp Tyr Glu Lys His
		180				185		190
aaa	gtc	tac gcc	tgc	gaa	gtc	acc	cat cag	ggc ctg age tcg ccc gtc	726
Lys	Val	Tyr Ala	Cys	Glu	val	Thr	His Gin	Gly Leu Ser Ser Pro Val
	195				200			205
aca	aag	age ttc	aac	agg	gga	gag	tgt tagtaagaat tcggg	768
Thr	Lys	Ser Phe	Asn	Arg	Gly	Glu	Cys
210				215

<210> 107 <211> 238 <212> PRT < 213 > Umele připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 107

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

-20 -15 -10 -5

Gly Ser Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser

-11 5 10

232 ·fl·· fl · · flfl flfl • fl · flflflfl flflflfl fl fl fl ·«··· • · » · · « flflfl··· • · » · fl · · • flfl flfl flflfl ···· flfl ··

Leu

Ser

Pro 15

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala

Ser Gin

Ser

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

lle

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

lle

Ser

Arg

Leu

Glu

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

95

100

105

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205 2X0 2X5 <2X0> X08 <2XX> 768 <2X2> DNA < 2 x 3 > Uměle připravená sekvence <220>

<22X> CDS <222> (40)..(753) <220>

<221> mat peptid <222> (100)..(753) <220>

<221> sig peptid <222> (40). . (99)

233 <220>

< 2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 108 cccaagctta agaagcatcc tctcatctag ttctcagag atg gag aca gac aca 54 Met Glu Thr Asp Thr -20

atc lle -15

ctg Leu

cta Leu

tgg gtg ctg ctg ctc tgg gtt cca ggc

tcc act ggt gag

102

Trp

Val

Leu -10

Leu Leu

Trp Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr Gly Glu

-1

1

att

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

ggt

act

ttg

tet

ctg

tet

cca

ggg

gag

150

lle

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

5

10

15

agg

gcc

acc

ctc

tcc

tgc

aag

gcc

agc

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

198

Arg

Ala

Thr

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr Asp

Gly

20

25

30

gat

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

cag

gca

ccc

aga

246

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Ala

Pro

Arg

35

40

45

ctc

ctc

atc

tat

gct

gca

tcc

aat

ctc

gaa

tet

ggg

atc

cca

gac

agg

294

Leu

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

lle

Pro

Asp

Arg

50

55

60

65

ttt

agt

ggc

agt

ggg

tet

ggg

aca

gac

ttc

acc

ctc

acc

atc

cat

cct

342

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

His

Pro

70

75

80

gtg

gag

gag

gag

gat

gct

gca

acc

tat

tac

tgt

cag

caa

agt

aat

gag

390

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

85

90

95

gat

cct

cgg

acg

ttc

ggt

caa

ggc

acc

aag

ctg

gaa

atc

aaa

cgg

act

438

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

100

105

110

gtg

gct

gca

cca

tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag

cag

ttg

486

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

115

120

125

aaa

tet

gga

act

gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

534

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

130

135

140

145

aga

gag

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aaa

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

582

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

150

155

160

aac

tcc

cag

gag

agt

gtc

aca

gag

cag

gac

agc

aag

gac

agc

acc

tac

630

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

165

170

175

234 ·« · · ·· • · 9 9 9 9 » 9999

9 · * 9 « · 9

99 9 99999999

9 9 9 9 9 9

agc ctc agc Ser Leu Ser 180

agc acc ctg acg

ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac

678

Ser Thr

Leu

Thr

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

Glu Lys His

185

190

aaa

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

agc

tcg

ccc

gtc

726

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

195

200

205

aca

aag

agc

ttc

aac

agg

gga

gag

tgt

tagtaagaat tcggg

768

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

210

215

<210> 109 <211> 238 <212> PRT <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opj_{s um}gi_e připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 109

Met -20

Glu

Thr

Asp

Thr

Ile -15

Leu

Leu

Trp

Val

Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr

Gly -1

Glu 1

Ile

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Gly

Thr 10

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro 15

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr 20

Leu

Ser

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Gin

Ala

Pro

Arg

Leu 50

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro

Asp

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu

Thr

Ile

His 80

Pro

Val

Glu

Glu

Glu 85

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr 90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser 95

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile 110

Lys

Arg

Thr

Val

Ala 115

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125 130 135 140

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155

9 9 • 9

9

9 9 · · 9 9

9 9 9 9 • 9 999 999 *

•9 9· 99

235 • 99 9

Ala

Leu

Gin

Ser 160

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu 165

Ser

Val

Thr

Glu

Gin 170

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser 175

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser 180

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu 185

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr 190

Glu

Lys

His

Lys

Val 195

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val 200

Thr

His

Gin

Gly

Leu 205

Ser

Ser

Pro

Val

Thr 210

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg 215

Gly Glu

Cys

<210> 110 <211> 29 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > pqjj_{s um}gi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 110 ggtgagattg tgctcaccca atctccagg 29 <210> 111 <211> 29 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> p_Opi_s uměle připravené sekvence: PCRprimerpro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 111 cctggagatt gggtgagcac aatctcacc 29 <210> 112 <211> 31 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

- 5 2 3

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 112 ccatctctcg tctggagccg gaggattttg c 31 <210> 113 <211> 31 ·· · φφφ • Φ·Φ· • φ »· ··

236 <212 > DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 113 gcaaaatcct ccggctccag acgagagatg g 31 <210> 114 <211> 31 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> _v

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 114 caaggcacca agctggaaat caaacggact g 31 <210> 115 <211> 31 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^<223> Popis uměle připravené sekvence: PCRprimerpro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 115 cagtccgttt gatttccagc ttggtgcctt g 31 <210> 116 <211> 2071 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> popjg _uměi_e připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> sig peptid <222> (21)..(77) <220>

<221> intron <222> (735)..(1125) φφφ φφ

237 φφφφ φφφ φ φ φ • φ φ φ φφφ φφφφ » Φ Φ Φ » φ φ φ φφφ φφφ <220>

<221> intron <222> (1171)..(1288) <220>

<221> intron <222> (1619)..(1715) <220>

<221> exon <222> (21)..(734) <220>

<221> exon <222> (1126)..(1170) <220>

<221> exon <222> (1289)..(1618) <220>

<221> exon <222> (1716)..(2036) <220>

<221> mat peptid <222> (78) . . (734) <220>

<221> mat peptid <222> (1126)..(1170) <220>

<221> mat peptid <222> (1289)..(1618) <220>

<221> mat peptid <222> (1716)..(2036) <220>

<221> CDS <222> (21)..(734) <220>

<221> CDS <222> (1126)..(1170) <220>

<221> CDS <222> (1289) . . (1618) <220>

<221> CDS <222> (1716)..(2036)

238 atc atc ctc

Ile Ile Leu • •Μ • 00 0

0 ·

0

909 0099

09 • 0 9

0 9

909 999

0 • 9 ·0 <400> 116 aagcttggct tgacctcacc atg gga tgg agc tgt Met Gly Trp Ser Cys ttc ttg gta 53 Phe Leu Val

gca aca

gct aca ggt gtc cac tet Ala Thr Gly Val His Ser

cag gtc caa ctg gtg cag

tet Ser

ggg Gly

101

Ala

Thr

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

-5

-1

gct

gag

gtc

aag

aag

cct

ggg

gct

tea

gtg

aag

gtg

tcc

tgc

aag

gct

149

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

10

15

20

tet

ggc

tac

acc

ttc

acc

agc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gta

aaa

cag

gcc

197

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

Ala

25

30

35

40

cct

gga

cag

ggc

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

gat

agc

245

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Xle

Asp

Pro

Ser

Asp

Ser

45

50

55

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

act

gta

293

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Val

60

65

70

gac

aca

tcc

act

agc

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

agc

agc

ctg

aga

tet

341

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

75

80

85

gag

gac

acg

gcg

gtc

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

agt

aac

389

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp.

Tyr

Ser

Asn

90

95

100

aac

tgg

tac

ttc

gat

gtc

tgg

ggc

gaa

ggg

acc

ctg

gtc

acc

gtc

tcc

437

Asn

Txp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

105

110

115

120

tea

gcc

tcc

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

tcc

485

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

Ser

125

130

135

aag

agc

acc

tet

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

gac

533

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

140

145

150

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tea

ggc

gcc

ctg

acc

581

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

155

160

165

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

gtc

cta

cag

tcc

tea

gga

ctc

tac

629

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

Tyr

170

175

180

tcc

ctc

agc

agc

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tcc

agc

agc

ttg

ggc

acc

cag

677

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

185

190

195

200

239 aag gtg gac 725

Lys Val Asp

215 • ·· · ♦ · · • · · • · · · · · • · acc tac atc tgc Thr Tyr Ile Cys aac gtg aat cac aag Asn Val Asn His Lys 205 ccc agc aac acc Pro Ser Asn Thr 210 ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa aag aga gtt Lys Arg Val

774

gccaggctca	gcgctcctgc	ctggacgcat	cccggctatg	cagtcccagt	ccagggcagc	834
aaggcaggcc	ccgtctgcct	cttcacccgg	aggcctctgc	ccgccccact	catgctcagg	894
gagagggtct	tctggctttt	tccccaggct	ctgggcaggc	acaggctagg	tgcccctaac	954
ccaggccctg	cacacaaagg	ggcaggtgct	gggctcagac	ctgccaagag	ccatatccgg	1014
gaggaccctg	cccctgacct	aagcccaccc	caaaggccaa	actctccact	ccctcagctc	1074
ggacaccttc	tctcctccca	gattccagta	actcccaatc	ttctctctgc	a gag ccc	1131

Glu Pro 220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1180 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1240 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1297 Ala Pro Glu 235

ctc ctg ggg

gga ccg Gly Pro

tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc

aag Lys

gac Asp

1345

Leu

Leu

Gly 240

Ser Val

Phe 245

Leu

Phe Pro Pro Lys 250

Pro

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

1393

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

1441

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

gag

cag

tac

aac

1489

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

1537

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

1585

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320 325 330 • · * · ·· φφ φ φφφφ φφφφ • φ φ ΦΦΦΦ· φ φφ φ φφ ΦΦΦΦΦΦ φφφ φ φ φ φ • ΦΦ φφ φφφ φφφφ φφ φφ

240 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg 1638 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

335 340 agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac 1698 caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg 1748

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350 355

ccc cca tcc cgg gag Pro Pro Ser Arg Glu

gag atg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc

1796

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser Leu

Thr 370

Cys

360

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

1844

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

375

380

385

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

1892

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

390

395

400

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

age

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

age

1940

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

405

410

415

agg

tgg

cag

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

1988

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

420

425

430

435

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

age

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

2036

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

440 445 450 tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt 2071 <210> 117 <211> 470 <212> PRT < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 117

Met

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr -5

Gly

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 «9··

9« 99

9 9999 999*

9 9 99999

9 9 9 99999999

9 9 9 9 9 9

999 9* 999 9999 99 99

241

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Lys

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

lle

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg 100

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Glu

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Val

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser 180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser 185

Leu

Ser

Ser

Val

Val 190

Thr

Val

Pro

Ser

Ser 195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

lle

Cys

Asn 205

Val

Asn

His

Lys

Pro 210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val 215

Asp

Lys

Arg

Val

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala 235

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly 240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

lle

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

Val

Val

Val

Asp

Val 270

Ser

His

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr 300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305 310 315

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 320 325 330

99 99 99

9 9 9 9 9 9 fc · 9 9 9 9

9 9 999999

9 9 9

9999999 99 99

242

9 ··«·

Ala

Pro 335

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 340

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 118 caggcccctg gacagggcct tgagtggatg 30 <210> 119 <211> 30 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 119 catccactca aggccctgtc caggggcctg 30 <210> 120 <211> 39 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence

243 φ

φφφφ φφ «φ » φ φ φ

I · ♦ Φ φφφ φφφ φ φ φφ φφ <220>

<22 3 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 120 gctgagctcc atgtaggctg tgctagtgga tgtgtctac 39 <210> 121 <211> 33 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA včetně SR alfa promotoru <400> 121 tgcacgcgtg gctgtggaat gtgtgtcagt tag 33 <210> 122 <211> 31 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

* Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA včetně SR alfa promotoru <400> 122 tccgaagctt ttagagcaga agtaacactt c 31 <210> 123 <211> 36 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Qp|_{s um}ěi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA včetně SR alfa promotoru <400> 123 aaagcggccg ctgctagctt ggctgtggaa tgtgtg 36 <210> 124 <211> 34 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

·· ·· ·· • · · ·« · • · · · · • · ··· ··· • · · ···· ·· ··

244 • ···· t ·· · ·· • · · • · · · • · · · ··· ·· ··* <223 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci DNA, kódující kapa lehký řetězec lidského imunoglobulinu <400> 124 aagcttatgg acatgagggt ccccgctctg ctcc 34 <210> 125 <211> 729 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125

aagcttatgg	acatgagggt	ccccgctctg	ctcctggggc	tcctgctact	ctggctccga	60
ggtgccagat	gtgacatcca	gatgacccag	tctccatcct	ccctgtctgc	atctgtagga	120
gacagagtca	ccatcacttg	ccgggcaagt	cagagcatta	gcagctattt	aaattggtat	180
cagcagaaac	cagggaaagc	ccctaagctc	ctgatctatg	ctgcatccag	tttgcaaagt	240
ggggtcccat	caaggttcag	tggcagtgga	tctgggacag	atttcactct	caccatcagc	300
agtctgcaac	ctgaagattt	tgcaacttac	tactgtcaac	agagttacag	tacccctcga	360
acgttcggcc	aagggaccaa	ggtggaaatc	aaacgaactg	tggctgcacc	atctgtcttc	420
atcttcccgc	catctgatga	gcagttgaaa	tctggaactg	cctctgttgt	gtgcctgctg	480
aataacttct	atcccagaga	ggccaaagta	cagtggaagg	tggataacgc	cctccaatcg	540
ggtaactccc	aggagagtgt	tacagagcag	gacagcaagg	acagcaccta	cagcctcagc	600
agcaccctga	cgctgagcaa	agcagactac	gagaaacaca	aagtctacgc	ctgcgaagtc	660
acccatcagg	gcctgagctc	gcccgtcaca	aagagcttca	acaggggaga	gtgttagtaa	720

gaattcggg 729 <210> 126 <211> 767 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> CDS <222> (39)..(752) <220>

<221> mat peptida

245 <222> (99)..(752) <220>

<221> sig peptid <222> (39) . . (98) <400> 126 ccaagcttaa gaagcatcct ctcatctagt tctcagag atg gag aca gac aca atc 56 Met Glu Thr Asp Thr lle -20 -15

ctg Leu

cta tgg gtg ctg

ctg Leu

ctc tgg gtt Leu Trp Val

cca ggc tcc act ggt gac att

104

Leu Trp Val

Leu -10

Pro -5

Gly

Ser

Thr Gly Asp lle

-1

1

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

tcc

tcc

ctg

tet

gca

tet

gta

gga

gac

aga

152

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly Asp

Arg

5

10

15

gtc

acc

atc

act

tgc

aag

gcc

agc

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

gat

200

Val

Thr

lle

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

20

25

30

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

aag

gca

ccc

aag

ctc

248

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

35

40

45

50

ctc

atc

tat

gct

gca

tcc

aat

ttg

gaa

agt

ggg

gtc

cca

tea

agg

ttc

296

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

55

60

65

agt

gga

agt

gga

tet

ggg

aca

gat

ttt

act

ctc

acc

atc

agc

agc

ctg

344

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

lle

Ser

Ser

Leu

70

75

80

cag

cct

gaa

gat

ttt

gca

acc

tac

tac

tgt

cag

caa

agt

aac

gag

gat

392

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

85

90

95

cct

cgg

acg

ttc

ggc

caa

ggc

acc

aag

gtg

gaa

atc

aaa

cgg

act

gtg

440

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

val

Glu

lle

Lys

Arg

Thr

Val

100

105

110

gct

gca

cca

tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag

cag

ttg

aaa

488

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

lle

Phe

Pro

Pro

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

115

120

125

130

tet

gga

act

gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc

tat

ccc

aga

536

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

135

140

145

gag

gcc

aaa

gta

cag

tgg

aaa

gtg

gat

aac

gcc

ctc

caa

tcg

ggt

aac

584

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

150

155

160

• · · · · ·

246

tcc Ser

cag gag agt gtc aca

gag cag gac age aag gac age acc tac age

Gin Glu 165

Ser Val Thr

Glu Gin 170

Asp

Ser

Lys Asp Ser 175

Thr Tyr

Ser

ctc

age

age

acc

ctg

acg

ctg

age

aaa

gca

gac

tac

gag

aaa

cac

aaa

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

180

185

190

gtc

tac

gcc

tgc

gaa

gtc

acc

cat

cag

ggc

ctg

age

tcg

ccc

gtc

aca

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

195

200

205

210

aag

age

ttc

aac

agg

gga

gag

tgt

tagtaagaat 1

tcggg

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

215

632

680

728

767 <210> 127 <211> 238 <212> PRT < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

<400> 127

Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

Met Glu -20

Thr Asp

Thr

-15

-10

-5

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

-1

1

5

10

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

15

20

25

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

30

35

40

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

45

50

55

60

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

65

70

75

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

80

85

90

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

95

100

105

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

• · φ φ φ φ • Φ φ φφφφ φφφφ φ φ φ φφφφφ

247

Asn Asn Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala Leu Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys Asp Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp Tyr Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu Ser Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

<210> 128

<211> 767

<212> DNA

<213> Uměle

připravená

sekvence

<220>

<223 > p_Opi_{s um}ěie připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> CDS <222> (39)..(752) <220>

<221> mat peptid <222> (99) .. (752) <220>

<221> sig peptid <222> (39)..(98) <400> 128 ccaagcttaa gaagcatcct ctcatctagt tctcagag atg gag aca gac aca atc 56 Met Glu Thr Asp Thr Ile -20 -15

ctg cta tgg gtg ctg

ctg ctc tgg gtt cca ggc tcc act ggt gac

att Ile

104

Leu

Leu Trp

Val Leu -10

Leu

Leu

Trp

Val Pro Gly Ser Thr Gly

Asp 1

-5

-1

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

tcc

tcc

ctg

tet

gca

tet

gta

gga

gac

aga

152

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

5

10

15

gtc

acc

atc

act

tgc

aag

gcc

age

caa

agt

gtt

gat

tat

gat

ggt

gat

200

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

20

25

30

• · · · · • · ··· ···

248

agt Ser 35	tat Tyr	atg Met	aac Asn	tgg Trp	tac caa cag aaa cca gga cag gca ccc aag ctc	248
Tyr Gin 40	Gin	Lys Pro	Gly 45	Gin Ala Pro	Lys Leu 50
ctc	atc	tat	gct	gca	tcc aat	ttg	gaa agt	ggg	gtc cca tea	agg ttc	296
Leu	Ile	Tyr	Ala	Ala	Ser Asn	Leu	Glu Ser	Gly	Val Pro Ser	Arg Phe
				55			60			65
agt	gga	agt	gga	tet	ggg aca	gat	ttt act	ctc	acc atc agc	agc ctg	344
Ser	Gly	Ser	Gly	Ser	Gly Thr	Asp	Phe Thr	Leu	Thr Ile Ser	Ser Leu
			70				75		80
cag	cct	gaa	gat	ttt	gca acc	tac	tac tgt	caa	cag agt aac	gag gat	392
Gin	Pro	Glu	Asp	Phe	Ala Thr	Tyr	Tyr Cys	Gin	Gin Ser Asn	Glu Asp
		85				90			95
cct	ega	acg	ttc	ggc	caa ggc	acc	aag gtg	gaa	atc aaa cgg	act gtg	440
Pro	Arg	Thr	Phe	Gly	Gin Gly	Thr	Lys Val	Glu	Ile Lys Arg	Thr Val
	100				105				110
gct	gca	cca	tet	gtc	ttc atc	ttc	ccg cca	tet	gat gag cag	ttg aaa	488
Ala	Ala	Pro	Ser	Val	Phe Ile	Phe	Pro Pro	Ser	Asp Glu Gin	Leu Lys
115					120			125		130
tet	gga	act	gcc	tet	gtt gtg	tgc	ctg ctg	aat	aac ttc tat	ccc aga	536
Ser	Gly	Thr	Ala	Ser	Val Val	Cys	Leu Leu	Asn	Asn Phe Tyr	Pro Arg
				135			140			145
gag	gcc	aaa	gta	cag	tgg aaa	gtg	gat aac	gcc	ctc caa tcg	ggt aac	584
Glu	Ala	Lys	Val	Gin	Trp Lys	Val	Asp Asn	Ala	Leu Gin Ser	Gly Asn
			150				155		160
tcc	cag	gag	agt	gtc	aca gag	cag	gac agc	aag	gac agc acc	tac agc	632
Ser	Gin	Glu	Ser	Val	Thr Glu	Gin	Asp Ser	Lys	Asp Ser Thr	Tyr Ser
		165				170			175
ctc	agc	agc	acc	ctg	acg ctg	agc	aaa gca	gac	tac gag aaa	cac aaa	680
Leu	Ser	Ser	Thr	Leu	Thr Leu	Ser	Lys Ala	Asp	Tyr Glu Lys	His Lys
	180				185				190
gtc	tac	gcc	tgc	gaa	gtc acc	cat	cag ggc	ctg	agc tcg ccc	gtc aca	728
Val	Tyr	Ala	Cys	Glu	Val Thr	His	Gin Gly	Leu	Ser Ser Pro	Val Thr
195					200			205		210
aag	agc	ttc	aac	agg	gga gag	tgt	tagtaagaat i	tcggg		767
Lys	Ser	Phe	Asn	Arg	Gly Glu	Cys

215 <210> 129 <211> 238 <212 > PRT <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis umele připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas • · · · • · φ φ φ φ φ φ φ • · φ φ φ φφφφφφ

249

<400> 129	Leu	Leu	Trp	Val	Pro -5
Met -20	Glu Thr Asp Thr Ile -15	Leu Leu	Trp	Val	Leu -10
Gly	Ser Thr Gly Asp Ile	Val Leu	Thr	Gin	Ser	Pro	Ser	Ser	Leu	Ser
	-1 1		5					10
Ala	Ser Val Gly Asp Arg	Val Thr	Ile	Thr	Cys	Lys	Ala	Ser	Gin	Ser
	15	20					25
Val	Asp Tyr Asp Gly Asp	Ser Tyr	Met	Asn	Trp	Tyr	Gin	Gin	Lys	Pro
	30	35				40
Gly	Gin Ala Pro Lys Leu	Leu Ile	Tyr	Ala	Ala	Ser	Asn	Leu	Glu	Ser
45	50				55					60
Gly	Val Pro Ser Arg Phe	Ser Gly	Ser	Gly	Ser	Gly	Thr	Asp	Phe	Thr
	65			70					75
Leu	Thr Ile Ser Ser Leu	Gin Pro	Glu	Asp	Phe	Ala	Thr	Tyr	Tyr	Cys
	80		85					90
Gin	Gin Ser Asn Glu Asp	Pro Arg	Thr	Phe	Gly	Gin	Gly	Thr	Lys	Val
	95	100					105
Glu	Ile Lys Arg Thr Val	Ala Ala	Pro	Ser	Val	Phe	Ile	Phe	Pro	Pro
	110	115				120
Ser	Asp Glu Gin Leu Lys	Ser Gly	Thr	Ala	Ser	Val	Val	Cys	Leu	Leu
125	130				135					140
Asn	Asn Phe Tyr Pro Arg	Glu Ala	Lys	Val	Gin	Trp	Lys	Val	Asp	Asn
	145			150					155
Ala	Leu Gin Ser Gly Asn	Ser Gin	Glu	Ser	Val	Thr	Glu	Gin	Asp	Ser
	160		165					170
Lys	Asp Ser Thr Tyr Ser	Leu Ser	Ser	Thr	Leu	Thr	Leu	Ser	Lys	Ala
	175	180					185
Asp	Tyr Glu Lys His Lys	Val Tyr	Ala	Cys	Glu	Val	Thr	His	Gin	Gly
	190	195				200
Leu	Ser Ser Pro Val Thr	Lys Ser	Phe	Asn	Arg	Gly	Glu	Cys
205	210				215

<210> 130 <211> 778 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas • · · ·

250 <220>

<221> CDS <222> (39)..(752) <220>

<221> mat peptid <222> (99)..(752) <220>

<221> sig peptid <222> (39)..(98) <400> 130 ccaagcttaa gaagcatcct ctcatctagt tctcagag atg gag aca gac aca atc 56 Met Glu Thr Asp Thr Ile -20 -15

ctg Leu

cta tgg

gtg Val

ctg Leu -10

ctg ctc tgg gtt

cca ggc

tcc act ggt gac

att Ile

104

Leu

Trp

Leu

Leu

Trp

Val

Pro -5

Gly

Ser

Thr Gly Asp

-1

1

gtg

ctc

acc

caa

tet

cca

tcc

tcc

ctg

tet

gca

tet

gta gga

gac

aga

152

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val Gly Asp 15

Arg

gtc

acc

atc

act

tgc

aag

gcc

age

caa

agt

gtt

gat

tat gat

ggt

gat

200

Val

Thr 20

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr Asp

Gly

Asp

agt

tat

atg

aac

tgg

tac

caa

cag

aaa

cca

gga

aag

gca ccc

aaa

ctc

248

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Lys

Ala Pro

Lys

Leu 50

ctc

atc

tac

gct

gca

tcc

aat

ttg

gaa

tea

ggg

atc

cca tea

agg

ttc

296

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

Ile

Pro Ser

Arg 65

Phe

agt

gga

agt

gga

tet

ggg

aca

gat

ttt

act

ctc

acc

atc age

age

ctg

344

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu

Thr

Ile Ser 80

Ser

Leu

cag

cct

gag

gat

ttt

gca

acc

tat

tac

tgt

cag

caa

agt aat

gag

gat

392

Gin

Pro

Glu 85

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr 90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser Asn 95

Glu

Asp

cct

cgg

a cg

ttc

ggt

caa

ggc

acc

aag

gtg

gaa

atc

aaa cgg

act

gtg

440

Pro

Arg 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

Thr

Lys

Val

Glu

Ile 110

Lys -Arg

Thr

Val

gct

gca

cca

tet

gtc

ttc

atc

ttc

ccg

cca

tet

gat

gag cag

ttg

aaa

488

Ala 115

Ala

Pro

Ser

Val

Phe 120

Ile

Phe

Pro

Pro

Ser 125

Asp

Glu Gin

Leu

Lys 130

tet

gga

act

gcc

tet

gtt

gtg

tgc

ctg

ctg

aat

aac

ttc tat

ccc

aga

536

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser 135

Val

Val

Cys

Leu

Leu 140

Asn

Asn

Phe Tyr

Pro 145

Arg

• · · · φ φ · « · · «

251

gag Glu	gcc aaa gta Ala Lys Val 150	cag Gin	tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac	584
Trp	Lys	Val	Asp 155	Asn Ala	Leu Gin Ser 160	Gly Asn
tcc	cag gag agt	gtc	aca	gag	cag	gac	agc aag	gac agc acc	tac agc	632
Ser	Gin Glu Ser	Val	Thr	Glu	Gin	Asp	Ser Lys	Asp Ser Thr	Tyr Ser
	165				170			175
ctc	agc agc acc	ctg	acg	ctg	agc	aaa	gca gac	tac gag aaa	cac aaa	680
Leu	Ser Ser Thr	Leu	Thr	Leu	Ser	Lys	Ala Asp	Tyr Glu Lys	His Lys
	180			185				190
gtc	tac gcc tgc	gaa	gtc	acc	cat	cag	ggc ctg	agc tcg ccc	gtc aca	728
Val	Tyr Ala Cys	Glu	Val	Thr	His	Gin	Gly Leu	Ser Ser Pro	Val Thr
195			200				205		210
aag	agc ttc aac	agg	gga	gag	tgt	tagtaagaat tcgggaagcc gaattc	778
Lys	Ser Phe Asn	Arg	Gly	Glu	Cys

215 <210> 131 <211> 238 <212> PRT <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěie připravené sekvence: Navrhovaný lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

<400> 131

Met -20

Glu Thr Asp Thr lle Leu -15

Leu

Trp

Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

-10

-5

Gly

Ser

Thr

Gly -1

Asp 1

lle

Val

Leu

Thr 5

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly Asp

Arg

Val

Thr 20

lle

Thr

Cys

Lys

Ala 25

Ser

Gin

Ser

Val

Asp 30

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser 35

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr 40

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly 45

Lys

Ala

Pro

Lys

Leu 50

Leu

lle

Tyr

Ala

Ala 55

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser 60

Gly

lle

Pro

Ser

Arg 65

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly 70

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe 75

Thr

Leu

Thr

lle

Ser 80

Ser

Leu

Gin

Pro

Glu 85

Asp

Phe

Ala

Thr

Tyr 90

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser 95

Asn

Glu

Asp

Pro

Arg 100

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly 105

Thr

Lys

Val

• · · · · · · ' • · • · ··· ·· ·· • ·

252

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Val

Ala

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Ile

Phe

Pro

Pro

110

115

120

Ser

Asp

Glu

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Val

Cys

Leu

Leu

125

130

135

140

Asn

Asn

Phe

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

Val

Asp

Asn

145

150

155

Ala

Leu

Gin

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

160

165

170

Lys

Asp

Ser

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

175

180

185

Asp

Tyr

Glu

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

190

195

200

Leu

Ser

Ser

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

205

210

215

<210> 132 <211> 41 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 132 agggaggatg gagattgggt gagcacaatg tcaccagtgg a <210> 133 <211> 39 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 133 attgtgctca cccaatctcc atcctccctg tctgcatct <210> 134 <211> 42 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

253 ·· · · ·· ·· ·· • fl··· flflflfl • · 9 9 9 9 9 •fl 9 9 9 999999

9 9 9 9 9 • ·· ··· ···· ·· flfl <2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 134 atcaacactt tggctggcct tgcaagtgat ggtgactctg tc 42 <210> 135 <211> 40 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > ρ_Ορ|_{5 um}ěi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 135 ccatcacttg caaggccagc caaagtgttg attatgatgg 40 <210> 136 <211> 48 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}gi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 136 agtttcgaga ttggatgcag catagatgag gagtttgggt gcctttcc 48 <210> 137 <211> 45 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 137 cccaagctcc tcatctatgc tgcatccaat ttggaaagtg gggtc 45 <210> 138 <211> 44 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

»·»· • · · · · · • · · · · • · · · * · 9 · • 9 9

9999 99 99

254 <223 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifíkaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 138 ttggccgaac gttcgaggat cctcgttact ctgttgacag tagt 44 <210> 139 <211> 44 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifíkaci fragmentu

DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 139 actactgtca acagagtaac gaggatcctc gaacgttcgg ccaa 44 <210> 140 <211> 45 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}gi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifíkaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 140 ctcatctatg ctgcatccaa tttggaaagt gggatcccat caagg 45 <210> 141 <211> 45 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<2 23 > p_Qp _{1S um}g[_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifíkaci fragmentu DNA, kódujícího lehký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 141 attggatgca gcatagatga ggagcttggg tgcctgtcct ggttt 45 <210> 142 <211> 2073 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

255 < 2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> sig peptid

<222>	(23) . .	(79)
<220> <221> <222>	intron (737) .	.(1127)
<220> <221> <222>	intron (1173)	..(1290)
<220> <221> <222>	intron (1621)	..(1717)
<220> <221> <222>	exon (23) . .	(736)
<220> <221> <222>	exon (1128)	.. (1172)
<220> <221> <222>	exon (1291)	.. (1620)
<220> <221> <222>	exon (1718)	.. (2038)
<220> <221> <222>	mat peptid (80)..(736)
<220> <221> <222>	mat peptid (1128) . . (1172)
<220> <221> <222>	mat peptid (1291)..(1620)
<220> <221> <222>	mat peptid (1718)..(2038)

<220>

<221> CDS <222> (23)..(736)

• · · · ·

256

<220> <221> CDS <222> (1128)	..(1172)
<220>
<221> CDS
<222> (1291)	..(1620)
<220>
<221> CDS
<222> (1718)	..(2038)
<400> 142
ccaagcttgg cttgacctca cc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg 52
	Met Gly Trp Ser Cys lle lle Leu Phe Leu
	-15 -10
gta gca aca	get aca ggt gtc cat tet cag gtc caa ctg gtg cag tet 100
Val Ala Thr	Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser
	-5 -11 5
ggg get gag	gtc aag aag cct ggg get tea gtg aag gtg tcc tgc aag 148
Gly Ala Glu	Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys
10	15 20
get tet ggc	tac acc ttc acc agc tac tgg atg cag tgg gta aaa cag 196
Ala Ser Gly	Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin
25	30 35
gcc cct gga	cag gga ctt gag tgg atg gga gag att gat cct tet gat 244
Ala Pro Gly	Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Glu Xle Asp Pro Ser Asp
40	45 50 55
agc tat act	aac tac aat caa aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act 292
Ser Tyr Thr	Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr
	60 65 70
gta gac aca	tcc act agc aca gcc tac atg gag ctc agc agc ctg aga 340
Val Asp Thr	Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg
	75 80 85
tet gag gac	acg gcg gtc tat tac tgt gca aga aat agg gac tat agt 388
Ser Glu Asp	Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser
90	95 100
aac aač tgg	tac ttc gat gtc tgg ggc caa ggt aca ctg gtc acc gtc 436
Asn Asn Trp	Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
105	110 115
tcc tea gcc	tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc 484
Ser Ser Ala	Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
120	125 130 135
tcc aag agc	acc tet ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag 532
Ser Lys Ser	Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
	140 145 150

257 ·· 99 • 9 9 4 • 9 9 4

999 994

4

99

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tea

ggc

gcc

ctg

580

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

155

160

165

acc

age

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

get

gtc

eta

cag

tec

tea

gga

ctc

628

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

170

175

180

tac

tec

ctc

age

age

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tec

age

age

ttg

ggc

acc

676

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

185

190

195

cag

acc

tac

ate

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

ccc

age

aac

acc

aag

gtg

724

Gin

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

200

205

210

215

776 gac aag aga gtt ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa Asp Lys Arg Val

gccaggctca	gcgctcctgc	ctggacgcat	cccggctatg	cagtcccagt	ccagggcagc	836
aaggcaggcc	ccgtctgcct	cttcacccgg	aggcctctgc	ccgccccact	catgctcagg	896
gagagggtct	tctggctttt	tccccaggct	ctgggcaggc	acaggctagg	tgcccctaac	956
ccaggccctg	cacacaaagg	ggcaggtgct	gggctcagac	ctgccaagag	ccatatccgg	1016
gaggaccctg	cccctgacct	aagcccaccc	caaaggccaa	actctccact	ccctcagctc	1076
ggacaccttc	tctcctccca	gattccagta	actcccaatc	ttctctctgc	a gag ccc	1133

Glu Pro 220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1182 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1242 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1299 Ala Pro Glu 235

ctc ctg

ggg Gly 240

gga Gly

ccg tea

gtc ttc

ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac

1347

Leu

Leu

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro Lys Pro 250

Lys Asp

acc

ctc

atg

ate

tec

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

1395

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

1443

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

val

Asp

Gly

270

275

280

285

• · ·· · ·· · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • ·« « · · 999999

9 9 9 9 9 9

999 99 999 9999 99 99

258

gtg Val	gag Glu	gtg cat	aat Asn 290	gcc Ala	aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac
Val	His	Lys Thr	Lys	Pro Arg 295	Glu Glu Gin Tyr 300	Asn
agc	acg	tac	cgt	gtg	gtc	agc gtc	ctc	acc gtc	ctg cac cag gac	tgg
Ser	Thr	Tyr	Arg	Val	Val	Ser Val	Leu	Thr Val	Leu His Gin Asp	Trp
			305				310		315
ctg	aat	ggc	aag	gag	tac	aag tgc	aag	gtc tcc	aac aaa gcc ctc	cca
Leu	Asn	Gly	Lys	Glu	Tyr	Lys Cys	Lys	Val Ser	Asn Lys Ala Leu	Pro
		320				325			330
gcc	ccc	atc	gag	aaa	acc	atc tcc	aaa	gcc aaa	ggtgggaccc gtggggtgcg
Ala	Pro	Ile	Glu	Lys	Thr	Ile Ser	Lys	Ala Lys

335 340 agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350 355

ccc

cca

tcc

cgg

gag

gag

atg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

agg

tgg

cag

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 450

Lys

tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt

1491

1539

1587

1640

1700

1750

1798

1846

1894

1942

1990

2038

2073 <210> 143 <211> 470 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěle připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas «··· ·· ·· ·· • · * · · · · ···· • · · ··«·· • · · · · » ·····« • · · · · · · ··& ·· ·♦· ···· ·· »· 259

<400> 143

Met

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr -5

Gly

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Lys

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg 100

Asp

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Val

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser 180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser 185

Leu

Ser

Ser

Val

Val 190

Thr

Val

Pro

Ser

Ser 195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn 205

Val

Asn

His

Lys

Pro 210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val 215

Asp

Lys

Arg

Val

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala 235

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly 240

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

Val

Val

Val

Asp

·· *· • · v · « · · · ··* »» « • » ·♦

260 ···· * «· ·· · » • · • · • · r·*·«··

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320

325

330

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

335

340

345

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

350

355

360

365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

370

375

380

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

385

390

395

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

400

405

410

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

415

420

425

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

430

435

440

445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 <210> 144 <211> 2073 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}ěi_e připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> sig peptid <222> (23)..(79) <220>

<221> intron <222> (737)..(1127) <220>

<221> intron • · • · · · ·

261 ·· · ··· <222> (1173)..(1290) <220>

<221> intron <222> (1621)..(1717) <220>

<221> exon <222> (23)..(736) <220>

<221> exon <222> (1128)..(1172) <220>

<221> exon <222> (1291)..(1620) <220>

<221> exon <222> (1718)..(2038) <220>

<221> mat peptid <222> (80)..(736) <220>

<221> mat peptid <222> (1128)..(1172) <220>

<221> mat peptid <222> (1291)..(1620) <220>

<221> mat peptid <222> (1718)..(2038) <220>

<221> CDS <222> (23)..(736) <220>

<221> CDS <222> (1128)..(1172) <220>

<221> CDS <222> (1291)..(1620) <220>

<221> CDS <222> (1718)..(2038)

262 ttc ttg 52

Phe Leu <400> 144 ccaagcttgg cttgacctca cc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu

gta gca aca gct

aca ggt Thr Gly -5

gtc cat tet cag gtc caa ctg gtg

cag Gin

tet Ser

100

Val

Ala Thr

Ala

Val His Ser Gin

Val

Gin

Leu

Val 5

-1

1

ggg

gct

gag

gtc

aag

aag

cct

ggg

gct

tca

gtg

aag

gtg

tcc

tgc

aag

148

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

10

15

20

gct

tet

ggc

tac

acc

ttc

acc

agc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gta

aaa

cag

196

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Lys

Gin

25

30

35

gcc

cct

gga

cag

gga

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

gat

244

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

40

45

50

55

agc

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ata

act

292

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Ile

Thr

60

65

70

gta

gac

aca

tcc

act

agc

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

agc

agc

ctg

aga

340

Val

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

75

80

85

tet

gag

gac

acg

gcg

gtc

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

agt

388

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

90

95

100

aac

aac

tgg

tac

ttc

gat

gtc

tgg

ggc

caa

ggt

aca

ctg

gtc

acc

gtc

436

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

105

110

115

tcc

tca

gcc

tcc

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

tcc

484

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

120

125

130

135

tcc

aag

agc

acc

tet

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

532

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

140

145

150

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tca

ggc

gcc

ctg

580

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

155

160

165

acc

agc

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

gtc

cta

cag

tcc

tca

gga

ctc

628

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

170

175

180

tac

tcc

ctc

agc

agc

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tcc

agc

agc

ttg

ggc

acc

676

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

185

190

195

• · · · • ·

263 cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg 724

Gin Thr Tyr lle Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

200 205 210 215 gac aag aga gtt ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa 776

Asp Lys Arg Val

gccaggctca	gcgctcctgc	ctggacgcat	cccggctatg	cagtcccagt	ccagggcagc	836
aaggcaggcc	ccgtctgcct	cttcacccgg	aggcctctgc	ccgccccact	catgctcagg	896
gagagggtct	tctggctttt	tccccaggct	ctgggcaggc	acaggctagg	tgcccctaac	956
ccaggccctg	cacacaaagg	ggcaggtgct	gggctcagac	ctgccaagag	ccatatccgg	1016
gaggaccctg	cccctgacct	aagcccaccc	caaaggccaa	actctccact	ccctcagctc	1076
ggacaccttc	tctcctccca	gattccagta	actcccaatc	ttctctctgc	a gag ccc	1133

Glu Pro 220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1182 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1242 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1299 Ala Pro Glu 235

ctc ctg ggg gga

ccg tea

gtc Val

ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

1347

Leu

Leu

Gly 240

Gly

Pro

Ser

245

250

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

gtc

aca

tgc

gtg

gtg

gtg

gac

1395

Thr

Leu

Met

lle

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

gtg

agc

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

1443

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

ccg

cgg

gag

gag

cag

tac

aac

1491

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

agc

acg

tac

cgt

gtg

gtc

agc

gtc

ctc

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

1539

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

1587

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320 325 330 • ·

264 gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggtgggaccc gtggggtgcg

Ala Pro lle Glu Lys Thr lle Ser Lys Ala Lys

335 340 agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350 355

1640

1700

1750

1798

1846

1894

1942

1990

2038

2073

ccc

cca

tcc

cgg

gag

gag

atg

acc

aag

aac

cag

gtc

agc

ctg

acc

tgc

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

lle

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

agg

tgg

cag

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

gct

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 450

Lys

tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt <210> 145 <211> 470 <212> PRT < 213 ^> u_mgj_e přip_ravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 145

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

lle

lle

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

Val

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

-1

1

5

10

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 • · · · • · • · · • · · ·

265

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Lys

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

lle

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

lle 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr 80

Met

Glu

Leu

Ser

Ser 85

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg Asp 100

Tyr

Ser

Asn

Asn 105

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Val

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser 180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser 185

Leu

Ser

Ser

Val

Val 190

Thr

Val

Pro

Ser

Ser 195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

lle

Cys

Asn 205

Val

Asn

His

Lys

Pro 210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val 215

Asp

Lys

Arg

Val

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala 235

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly Gly 240

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

Xle

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

Val

Val

Val

Asp

Val 270

Ser

His

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr 300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 305

Val

Val

Ser

Val

Leu 310

Thr

Val

Leu

His

Gin 315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 325

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 330

Ala

Leu

Pro

• · • · · ····· • φ φ · · · φφ φ ··<

• φ · φ φ φ · φφφ φφ φφφ ·Φ·Φ ·· ··

266

Ala

Pro 335

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 340

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

Leu

His

Asn

His

Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

450 <210> 146 <211> 2073 <212> DNA < 213 > (Uměle připravená sekvence <220>

<223 ^> p_Qpj_{s um}ěj_e připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <220>

<221> sig peptid <222> (23)..(79) <220>

<221> intron <222> (737)..(1127) <220>

<221> intron <222> (1173)..(1290) <220>

<221> intron <222> (1621)..(1717) <220>

<221> exon <222> (23) . . (736) • · · · · · · ·· · · · · · * • · · · · · • · · ······ • · · · ······· ·· ··

267

<220>

<221> exon <222> (1128)..(1172) <220>

<221> exon <222> (1291)..(1620) <220>

<221> exon <222> (1718)..(2038) <220>

<221> mat peptid <222> (80)..(736) <220>

<221> mat peptid <222> (1128)..(1172) <220>

<221> mat peptid <222> (1291)..(1620) <220>

<221> mat peptid <222> (1718)..(2038) <220>

<221> CDS <222> (23)..(736) <220>

<221> CDS <222> (1128)..(1172) <220>

<221> CDS <222> (1291)..(1620) <220>

<221> CDS <222> (1718)..(2038) <400> 146 ccaagcttgg cttgacctca cc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg 52 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu

-15 -10

gta Val

gca aca gct aca ggt gtc

cat tet cag gtc caa ctg gtg cag tet

100

Ala Thr Ala

Thr Gly Val -5

His Ser Gin

Val Gin Leu

Val 5

Gin

Ser

-1

1

999

gct

gag

gtc

aag

aag

cct

ggg

gct

tca

gtg

aag

gtg

tcc

tgc

aag

148

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

10

15

20

99 9

268

gct tet ggc tac

acc ttc acc age tac tgg atg cag tgg gta ega cag

196

Ala Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser Tyr Trp

Met Gin 35

Trp

Val Arg

Gin

gcc

cct

gga

caa

gga

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

gat

244

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp

40

45

50

55

age

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

aag

gcc

aca

ttg

act

292

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

60

65

70

gta

gac

aca

tec

act

age

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

age

age

ctg

aga

340

Val

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

75

80

85

tet

gag

gac

acg

gcg

gtc

tat

tac

tgt

gca

aga

aat

agg

gac

tat

agt

388

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Asn

Arg

Asp

Tyr

Ser

90

95

100

aac

aac

tgg

tac

ttc

gat

gtc

tgg

ggc

caa

ggt

aca

ctg

gtc

acc

gtc

436

Asn

Asn

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

105

110

115

tec

tea

gcc

tec

acc

aag

ggc

cca

tcg

gtc

ttc

ccc

ctg

gca

ccc

tec

484

Ser

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser

120

125

130

135

tec

aag

age

acc

tet

ggg

ggc

aca

gcg

gcc

ctg

ggc

tgc

ctg

gtc

aag

532

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser

Gly Gly

Thr

Ala

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

140

145

150

gac

tac

ttc

ccc

gaa

ccg

gtg

acg

gtg

tcg

tgg

aac

tea

ggc

gcc

ctg

580

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

155

160

165

acc

age

ggc

gtg

cac

acc

ttc

ccg

gct

gtc

cta

cag

tec

tea

gga

ctc

628

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Leu

170

175

180

tac

tec

ctc

age

age

gtg

gtg

acc

gtg

ccc

tec

age

age

ttg

ggc

acc

676

Tyr

Ser

Leu

Ser

Ser

Val

val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

185

190

195

cag

acc

tac

atc

tgc

aac

gtg

aat

cac

aag

CCC

age

aac

acc

aag

gtg

724

Gin

Thr

Tyr

Xle

Cys

Asn

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

200

205

210

215

gac aag aga gtt ggtgagaggc cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa 776 Asp Lys Arg Val gccaggctca gcgctcctgc ctggacgcat cccggctatg cagtcccagt ccagggcagc 836 aaggcaggcc ccgtctgcct cttcacccgg aggcctctgc ccgccccact catgctcagg 896 gagagggtct tctggctttt tccccaggct ctgggcaggc acaggctagg tgcccctaac 956

• ·· ·· ·· • 9 · · · · · ·

269 ccaggccctg cacacaaagg ggcaggtgct gggctcagac ctgccaagag ccatatccgg 1016 gaggaccctg cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc 1076 ggacaccttc tctcctccca gattccagta actcccaatc ttctctctgc a gag ccc 1133 Glu Pro 220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1182 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1242 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1299 Ala Pro Glu 235

ctc ctg	ggg gga Gly Gly 240	ccg tea gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac	1347
Leu	Leu	Pro Ser	Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245	250
acc	ctc	atg atc	tcc cgg	acc cct gag gtc	aca tgc gtg gtg gtg gac	1395
Thr	Leu 255	Met lle	Ser Arg	Thr Pro Glu Val 260	Thr Cys Val Val Val Asp 265
gtg	agc	cac gaa	gac cct	gag gtc aag ttc	aac tgg tac gtg gac ggc	1443
Val 270	Ser	His Glu	Asp Pro 275	Glu Val Lys Phe	Asn Trp Tyr Val Asp Gly 280 285
gtg	gag	gtg cat	aat gcc	aag aca aag ccg	cgg gag gag cag tac aac	1491
Val	Glu	Val His	Asn Ala 290	Lys Thr Lys Pro 295	Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 300
agc	acg	tac cgt	gtg gtc	agc gtc ctc acc	gtc ctg cac cag gac tgg	1539
Ser	Thr	Tyr Arg 305	Val Val	Ser Val Leu Thr 310	Val Leu His Gin Asp Trp 315
ctg	aat	ggc aag	gag tac	aag tgc aag gtc	tcc aac aaa gcc ctc cca	1587
Leu	Asn	Gly Lys 320	Glu Tyr	Lys Cys Lys Val 325	Ser Asn Lys Ala Leu Pro 330
gcc Ala	ccc Pro 335	atc gag lle Glu	aaa acc Lys Thr	atc tcc aaa gcc lle Ser Lys Ala 340	aaa ggtgggaccc gtggggtgcg Lys	1640

agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac 1700 caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg 1750

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350 355 ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc 1798

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys

360 365 370 • · · ·

270

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

age

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

age

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

age

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

age

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr 415

val

Asp

Lys

Ser

agg

tgg

cag

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tea

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

Arg 420

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala 435

ctg

cac

aac

cac

tac

acg

cag

aag

age

ctc

tcc

ctg

tcc

ccg

ggt

aaa

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

440 445 450

1846

1894

1942

1990

2038 tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt

2073 <210> 147 <211> 470 <212> PRT < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 147

Met

Gly

Trp

Ser

Cys -15

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu -10

Val

Ala

Thr

Ala

Thr -5

Gly

Val

His

Ser -1

Gin 1

Val

Gin

Leu

Val 5

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu 10

Val

Lys

Lys

Pro

Gly 15

Ala

Ser

Val

Lys

Val 20

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser 25

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr 30

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Met

Gly

Glu 50

Ile

Asp

Pro

Ser

Asp 55

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr 60

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu 70

Thr

Val

Asp

Thr

Ser 75

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

85 90

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Arg Asp Tyr Ser Asn Asn Trp Tyr Phe Asp 95 100 105 ·· ·· ·· ·· · ·· · · ··«· • · · · · · · · • · · * ········ • · · · · · · ··· ·· ··· ···· ·· ··

271 ·»··

Val 110

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr 115

Leu

Val

Thr

Val

Ser 120

Ser

Ala

Ser

Thr

Lys 125

Gly

Pro

Ser

Val

Phe 130

Pro

Leu

Ala

Pro

Ser 135

Ser

Lys

Ser

Thr

Ser 140

Gly

Gly

Thr

Ala

Ala 145

Leu

Gly

Cys

Leu

Val 150

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro 155

Glu

Pro

Val

Thr

Val 160

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly 165

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly 170

Val

His

Thr

Phe

Pro 175

Ala

Val

Leu

Gin

Ser 180

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser 185

Leu

Ser

Ser

Val

Val 190

Thr

Val

Pro

Ser

Ser 195

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin 200

Thr

Tyr

Ile

Cys

Asn 205

Val

Asn

His

Lys

Pro 210

Ser

Asn

Thr

Lys

Val 215

Asp

Lys

Arg

Val

Glu 220

Pro

Lys

Ser

Cys

Asp 225

Lys

Thr

His

Thr

Cys 230

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala 235

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly Gly 240

Pro

Ser

Val

Phe 245

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys 250

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu 255

Met

Ile

Ser

Arg

Thr 260

Pro

Glu

Val

Thr

Cys 265

Val

Val

Val

Asp

Val 270

Ser

His

Glu

Asp

Pro 275

Glu

Val

Lys

Phe

Asn 280

Trp

Tyr

Val.

Asp

Gly 285

Val

Glu

Val

His

Asn 290

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro 295

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr 300

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg 305

Val

Val

Ser

Val

Leu 310

Thr

Val

Leu

His

Gin 315

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly 320

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys 325

Lys

Val

Ser

Asn

Lys 330

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro 335

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile 340

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly 345

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro 350

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu 355

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr 370

Cys

Leu

Val

Lys

Gly 375

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp 380

Ile

Ala

Val

Glu

Trp 385

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin 390

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr 395

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro 400

Val

Leu

Asp

Ser

Asp 405

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu 410

Tyr

Ser

Lys

44

4 4 4

4 4 4

444 444 • 4

44

272

Leu

Thr 415

Val

Asp

Lys

Ser Arg 420

Trp Gin

Gin Gly

Asn 425

Val

Phe

Ser

Cys

Ser 430

Val

Met

His

Glu

Ala Leu 435

His Asn

His Tyr 440

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu 445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly 450

Lys

<210> 148 <211> 38 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_s uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 148 ccaagcttgg cttgacctca ccatgggatg gagctgta 38 <210> 149 <211> 40 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{c >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 149 agtgggtaaa acaggcccct ggacagggac ttgagtggat 40 <210> 150 <211> 40 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 150 atccactcaa gtccctgtcc aggggcctgt tttacccact 40 <210> 151 <211> 64 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence »·»· ·» • · · ···« ·»«« • « « ·«»»· • · · · · » ·»· ··· • » · · « « · »»· «· ··· ···» ·· »0

273 <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 151 aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccagtgtacc ttggccccag 60 acat <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

152

DNA

Uměle připravená sekvence

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

152 <400>

gttcaagggc aaggccacaa taactgtaga cacatccgc 39 <210> 153 <211> 39 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

^{< >} Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 153 gcggatgtgt ctacagttat tgtggccttg cccttgaac 39 <210> 154 <211> 40 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 ·>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 154 agtgggtacg acaggcccct ggacaaggac ttgagtggat 40 <210> 155 <211> 40 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence

I · » ^w » · · 9

999 999

9

9 9 9

274 <220>

<2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fiagmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 155 atccactcaa gtccttgtcc aggggcctgt cgtacccact 40 <210> 156 <211> 2077 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<221> sig peptid <222> (27) . . (83) <220>

<221> intron <222> (741) .. (1131) <220>

<221> intron <222> (1177)..(1294) <220>

<221> intron <222> (1625)..(1725) <220>

<221> exon <222> (27)..(740) <220>

<221> exon <222> (1132)..(1176) <220>

<221> exon <222> (1295)..(1624) <220>

<221> exon <222> (1722)..(2042) <220>

<221> mat peptid <222> (84)..(740) <220>

<221> mat peptid <222> (1132)..(1176)

·· · ··<

• <

• · ··

275 <220>

<221> mat peptid <222> (1295)..(1624) <220>

<221> mat peptid <222> (1722)..(2042) <220>

<221> CDS <222> (27)..(740) <220>

<221> CDS <222> (1132)..(1176) <220>

<221> CDS <222> (1295)..(1624) <220>

<221> CDS <222> (1722)..(2042) <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaná DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 156 gggcgaaagc ttggcttgac ctcacc atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc 53 Met Gly Trp Ser Cys Xle Ile Leu Phe

ttg gta Leu Val -10

gca Ala

aca Thr

gct aca Ala Thr -5

ggt gtc cac tet cag gtc caa ctg gtg cag

101

Gly

Val

His

Ser Gin

Val Gin Leu

Val 5

Gin

-1

1

tet

ggg

gct

gag

gtc

aag

aag

cct

ggg

gct

tea

gtg

aag

gtg

tcc

tgc

149

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

Lys

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

10

15

20

aag

gct

tet

ggc

tac

acc

ttc

acc

agc

tac

tgg

atg

cag

tgg

gta

ega

197

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

25

30

35

cag

gcc

cct

gga

cag

ggc

ctt

gag

tgg

atg

gga

gag

att

gat

cct

tet

245

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Met

Gly

Glu

Ile

Asp

Pro

Ser

40

45

50

gat

agc

tat

act

aac

tac

aat

caa

aag

ttc

aag

ggc

cgg

gtc

aca

atc

293

Asp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Tyr

Asn

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Xle

55

60

65

70

act

ega

gac

aca

tcc

act

agc

aca

gcc

tac

atg

gag

ctc

agc

agc

ctg

341

Thr

Arg

Asp

Thr

Ser

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

80 85 ····

276

aga tet	gag gac	acg gcg gtc tat	tac tgt	gca aga aat agg gac tat	389
Arg	Ser	Glu	Asp 90	Thr Ala Val	Tyr	Tyr 95	Cys	Ala Arg Asn Arg 100	Asp Tyr
agt	aac	aac	tgg	tac ttc gat	gtc	tgg	ggc	gaa ggg acc ctg	gtc acc	437
Ser	Asn	Asn 105	Trp	Tyr Phe Asp	Val 110	Trp	Gly	Glu Gly Thr Leu 115	Val Thr
gtc	tcc	tea	gcc	tcc acc aag	ggc	cca	tcg	gtc ttc ccc ctg	gca ccc	485
Val	Ser 120	Ser	Ala	Ser Thr Lys 125	Gly	Pro	Ser	Val Phe Pro Leu 130	Ala Pro
tcc	tcc	aag	agc	acc tet ggg	ggc	aca	gcg	gcc ctg ggc tgc	ctg gtc	533
Ser 135	Ser	Lys	Ser	Thr Ser Gly 140	Gly	Thr	Ala	Ala Leu Gly Cys 145	Leu Val 150
aag	gac	tac	ttc	ccc gaa ccg	gtg	acg	gtg	tcg tgg aac tea	ggc gcc	581
Lys	Asp	Tyr	Phe	Pro Glu Pro 155	Val	Thr	Val 160	Ser Trp Asn Ser	Gly Ala 165
ctg	acc	agc	ggc	gtg cac acc	ttc	ccg	gct	gtc cta cag tcc	tea gga	629
Leu	Thr	Ser	Gly 170	Val His Thr	Phe	Pro 175	Ala	Val Leu Gin Ser 180	Ser Gly
ctc	tac	tcc	ctc	agc agc gtg	gtg	acc	gtg	ccc tcc agc agc	ttg ggc	677
Leu	Tyr	Ser 185	Leu	Ser Ser Val	Val 190	Thr	Val	Pro Ser Ser Ser 195	Leu Gly
acc	cag	acc	tac	atc tgc aac	gtg	aat	cac	aag ccc agc aac	acc aag	725
Thr	Gin 200	Thr	Tyr	lle Cys Asn 205	Val	Asn	His	Lys Pro Ser Asn 210	Thr Lys
gtg Val	gac Asp	aag Lys	aga Arg	gtt ggtgagaggc i Val	cagcacaggg agggagggtg tctgctggaa	780

215 gccaggctca gcgctcctgc ctggacgcat cccggctatg cagtcccagt ccagggcagc 840 aaggcaggcc ccgtctgcct cttcacccgg aggcctctgc ccgccccact catgctcagg 900 gagagggtct tctggctttt tccccaggct ctgggcaggc acaggctagg tgcccctaac 960 ccaggccctg cacacaaagg ggcaggtgct gggctcagac ctgccaagag ccatatccgg 1020 gaggaccctg cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc 1080 ggacaccttc tctcctccca gattccagta actcccaatc ttctctctgc a gag ccc 1137 Glu Pro 220 aaa tet tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca ggtaagccag 1186 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg 1246 φφφ · φ φ

277 gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct cttcctca gca cct gaa 1303 Ala Pro Glu 235

ctc ctg	ggg gga Gly Gly 240	ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac	1351
Leu	Leu	Pro Ser	Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245	250
acc	ctc	atg atc	tcc cgg	acc cct gag gtc	aca tgc gtg gtg gtg gac	1399
Thr	Leu 255	Met Ile	Ser Arg	Thr Pro Glu Val 260	Thr Cys Val Val Val Asp 265
gtg	agc	cac gaa	gac cct	gag gtc aag ttc	aac tgg tac gtg gac ggc	1447
Val 270	Ser	His Glu	Asp Pro 275	Glu Val Lys Phe	Asn Trp Tyr Val Asp Gly 280 285
gtg	gag	gtg cat	aat gcc	aag aca aag ccg	cgg gag gag cag tac aac	1495
Val	Glu	Val His	Asn Ala 290	Lys Thr Lys Pro 295	Arg Glu Glu Gin Tyr Asn 300
agc	acg	tac cgt	gtg gtc	agc gtc ctc acc	gtc ctg cac cag gac tgg	1543
Ser	Thr	Tyr Arg 305	Val Val	Ser Val Leu Thr 310	Val Leu His Gin Asp Trp 315
ctg	aat	ggc aag	gag tac	aag tgc aag gtc	tcc aac aaa gcc ctc cca	1591
Leu	Asn	Gly Lys 320	Glu Tyr	Lys Cys Lys Val 325	Ser Asn Lys Ala Leu Pro 330
gcc Ala	ccc Pro 335	atc gag Ile Glu	aaa acc Lys Thr	atc tcc aaa gcc Ile Ser Lys Ala 340	aaa ggtgggaccc gtggggtgcg Lys	1644

agggccacat ggacagaggc cggctcggcc caccctctgc cctgagagtg accgctgtac 1704 caacctctgt ccctaca ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc ctg 1754

Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu 345 350 355

ccc Pro

cca tcc cgg gag gag

atg acc

aag aac cag gtc agc

ctg acc Leu Thr 370

tgc Cys

1802

Pro

Ser

Arg

Glu 360

Glu

Met

Thr

Lys

Asn 365

Gin

Val

Ser

ctg

gtc

aaa

ggc

ttc

tat

ccc

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg gag

agc

1850

Leu

val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp Glu

Ser

375

380

385

aat

ggg

cag

ccg

gag

aac

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg ctg

gac

1898

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val Leu

Asp

390

395

400

tcc

gac

ggc

tcc

ttc

ttc

ctc

tat

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac aag

agc

1946

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp Lys

Ser

405

410

415

agg

tgg

cag

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat gag

gct

1994

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His Glu

Ala

420

425

430

435

• · • · · · ·

278 age ctc tec ctg

Ser Leu Ser Leu

445 tcc ccg ggt aaa

Ser Pro Gly Lys

450 ctg cac aac cac Leu His Asn His tac acg cag aag Tyr Thr Gin Lys 440

2042 tgagtgcgac ggccggcaag ccccgctccc gaatt

2077 <210> 157 <211> 470 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

* ^> Popis uměle připravené sekvence: Navrhovaný těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 157

Met	Gly	Trp	Ser	Cys -15	Ile	Ile	Leu
Val	His	Ser -1	Gin 1	Val	Gin	Leu	Val 5
Pro	Gly 15	Ala	Ser	Val	Lys	Val 20	Ser
Thr 30	Ser	Tyr	Trp	Met	Gin 35	Trp	Val
Glu	Trp	Met	Gly	Glu 50	Ile	Asp	Pro
Gin	Lys	Phe	Lys 65	Gly	Arg	Val	Thr
Thr	Ala	Tyr 80	Met	Glu	Leu	Ser	Ser 85
Tyr	Tyr 95	Cys	Ala	Arg	Asn	Arg Asp 100
Val 110	Trp	Gly	Glu	Gly	Thr 115	Leu	Val
Gly	Pro	Ser	Val	Phe 130	Pro	Leu	Ala
Gly	Thr	Ala	Ala 145	Leu	Gly	Cys	Leu
Val	Thr	Val 160	Ser	Trp	Asn	Ser	Gly 165
Phe	Pro 175	Ala	Val	Leu	Gin	Ser 180	Ser

Phe	Leu -10	Val	Ala	Thr	Ala	Thr -5	Gly
Gin	Ser	Gly	Ala	Glu 10	Val	Lys	Lys
Cys	Lys	Ala	Ser 25	Gly Tyr	Thr	Phe
Arg	Gin	Ala 40	Pro	Gly	Gin	Gly	Leu 45
Ser	Asp 55	Ser	Tyr	Thr	Asn	Tyr 60	Asn
Ile 70	Thr	Arg Asp	Thr	Ser 75	Thr	Ser
Leu	Arg	Ser	Glu	Asp 90	Thr	Ala	Val
Tyr	Ser	Asn	Asn 105	Trp	Tyr	Phe	Asp
Thr	Val	Ser 120	Ser	Ala	Ser	Thr	Lys 125
Pro	Ser 135	Ser	Lys	Ser	Thr	Ser 140	Gly
Val 150	Lys	Asp	Tyr	Phe	Pro 155	Glu	Pro
Ala	Leu	Thr	Ser	Gly 170	Val	His	Thr
Gly	Leu	Tyr	Ser	Leu	Ser	Ser	Val

185 • ····

279

Val

Thr

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

lle

Cys

Asn

190

195

200

205

Val

Asn

His

Lys

Pro

Ser

Asn

Thr

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Val

Glu

Pro

210

215

220

Lys

Ser

Cys

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

225

230

235

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

240

245

250

Thr

Leu

Met

Xie

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

255

260

265

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

270

275

280

285

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

290

295

300

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

305

310

315

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

320

325

330

Ala

Pro

lle

Glu

Lys

Thr

lle

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

335

340

345

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

Lys

Asn

350

355

360

365

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

lle

370

375

380

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

385

390

395

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

400

405

410

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

415

420

425

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

430

435

440

445

Ser

Leu

Ser

Pro

Gly

Lys

<210> 158 <211> 29 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence

450 • ·· ·

280 <220>

< 2 2 3 > Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 158 gatgcagtgg gtacgacagg cccctggac 29 <210> 159 <211> 29 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

* ^> Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu

DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 159 gtccaggggc ctgtcgtacc cactgcatc 29 <210> 160 <211> 33 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223>

Popis uměle připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 160 caagggccgg gtcacaatca ctcgagacac atc 33 <210> 161 <211> 33 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223 > p_Opj_{s um}gi_e připravené sekvence: PCR primer pro amplifikaci fragmentu DNA, kódujícího těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 161 gatgtgtctc gagtgattgt gacccggccc ttg 33 <210> 162 <211> 20 <212> DNA < 213 > Uměle připravená sekvence • ·· · • · · · · • * ·»· ··· • ·

281 <220>

<223> Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 162 ctacaatcaa aagttcaagg 20 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<223 > Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 163 gactatagta acaactggta c 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213 > Uměle připravená sekvence <220>

<223> * w v

Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas <400> 164 gtaccagttg ttactatagt c 21 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

^{<223 >} Popis uměle připravené sekvence: Sekvenační primer pro DNA, kódující těžký řetězec polidštěné protilátky proti Fas

Claims (42)

1. PATENTOVÉ NÁROKY ·Μ·

   1. Polidštěná molekula typu protilátky proti Fas, vyznačující se tím, že je schopna v buňkách s abnormalitami v systému Fas/Fas ligand

   a) indukovat apoptózu vazbou Fas na povrch buňky a v buňkách bez takovéto abnormality

   b) zabránit apoptóze, která by jinak byla indukována vazbou Fas ligandů na Fas antigen.
2. 2. Molekula typu protilátky, vyznačující se tím, že zahrnuje jednu nebo více podjednotek těžkého řetězce, mající v podstatě aminokyselinovou sekvenci vybranou z. aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 143;

   aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 145; aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 147; a aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí.
3. 3. Protilátka podle nároku 2, vyznačující se tím, že má jednu nebo více podjednotek lehkého řetězce, mající v podstatě aminokyselinovou sekvenci vybranou z:

   aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 107; aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 127; aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 129; a aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí.
4. 4. Protilátka podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že těžký řetězec se skládá v podstatě z aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí.
5. 5. Protilátka podle nároku 4, vyznačující se tím, že lehký řetězec se skládá v podstatě z aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí.
6. 6. Protilátka podle nároku 2, vyznačující se tím, že se skládá ze dvou těžkých řetězců a dvou lehkých řetězců a že každý z těžkých řetězců se skládá v podstatě z aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 157 na seznamu sekvencí a každý z lehkých řetězců se

   283 skládá v podstatě z aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 107 na seznamu sekvencí.
7. 7. Molekula typu protilátky, vyznačující se tím, že jedna nebo více podjednotek lehkého řetězce má v podstatě aminokyselinovou sekvenci vybranou z:

   aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 127; aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 129; a aminokyselinové sekvence 1 až 218 ze SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce má v podstatě aminokyselinovou sekvenci vybranou z:

   aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 143;

   aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID č. 145; a aminokyselinové sekvence 1 až 451 ze SEQ ID ě. 147;

   na seznamu sekvencí.
8. 8. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 127 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ED č. 143.
9. 9. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 127 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID ě. 145.
10. 10. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 127 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID č. 147.
11. 11. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID ě. 129 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ED č. 143.
12. 12. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID c. 129 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ED ě. 145.

    ····

    99 ·· ·· • · · · · • · · · · « * ··· · · ·
13. 13. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 129 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID č. 147.
14. 14. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 131 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID č. 143.
15. 15. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ Π) č. 131 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID č. 145.
16. 16. Protilátka podle nároku 7, vyznačující se tím, že podjednotky lehkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 218 ze SEQ ID č. 131 a jedna nebo více podjednotek těžkého řetězce v podstatě mají aminokyselinovou sekvenci 1 až 451 ze SEQ ID č. 147.
17. 17. Protilátka podle kteréhokoli z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že váže peptid, zahrnující aminokyselinovou sekvenci se SEQ ID č. 1 na seznamu sekvencí.
18. 18. Protilátka podle kteréhokoli z předchozích nároků, vyznačující se tím, že se skládá ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců.
19. 19. Přípravek pro profylaxi a/nebo léčbu stavů zahrnujících abnormaltu v systému Fas/Fas ligand, vyznačující se tím, že zahrnuje protilátku podle kteréhokoli z předchozích nároků.
20. 20. Přípravek podle nároku 19, vyznačující se tím, že onemocnění je vybráno z: autoimunitních onemocnění vybraných ze systémového lupusu erythematodes, Hashimotovy choroby, revmatoidní artritidy, Sjógrenova syndromu, zhoubné anémie, Addisonovy choroby, sklerodermie, Goodpastureova syndromu, Crohnovy choroby, autoimunitní hemolytické anémie, sterility, myasthenie gravis, roztroušené sklerózy, Basedowovy nemoci, purpurózní trombopenie a inzulín-dependentního diabetů mellitus; alergie; revmatoidní artritidy; arteriosklerózy; myokarditidy; kardiomyopathie; glomerulární nefritidy; hypoplastické anémie; hepatitidy vybrané z fulminantní hepatitidy, chronické hepatitidy, virové hepatitidy

    99 9· *·

    9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 ·

    9 9 999 999

    9 99 9 dále vybrané z hepatitidy C, hepatitidy B, hepatitidy D a alkoholické hepatitidy; a vypuzení po orgánové transplantaci.
21. 21. Použití protilátky podle kteréhokoli z nároků 1 až 18 při výrobě léku pro léčbu stavu zahrnujícího abnormalitu v systému Fas/Fas ligand.
22. 22. Použití podle nároku 21, vyznačující se tím, že lék je pro lidské použití.
23. 23. DNA, vyznačující se tím, že kóduje protilátku podle kteréhokoli z nároků 1 až 18.
24. 24. Rekombinantní DNA vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA podle nároku 23.
25. 25. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformována vektorem podle nároku 24.
26. 26. Způsob produkce protilátky proti Fas, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 25, a získání protilátky z výsledné kultury.
27. 27. Transformantní kmen E. coli vybraný z FERM BP-6512, FERM BP-6511, FERM BP-6513, FERMBP-6515, FERMBP-6514, FERMBP-6516 aFERMBP-6510.
28. 28. Polypeptid, vyznačující se tím, že má aminokyselinovou sekvenci vybranou z aminokyselinové sekvence 1 až 218 se SEQ ID č. 127, z aminokyselinové sekvence 1 až 218 se SEQ ID č. 129 a z aminokyselinové sekvence 1 až 218 se SEQ ID č. 131 na seznamu sekvencí, spolu s polypeptidem, který má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, skládající se z aminokyselinové sekvence 1 až 451 se SEQ ID č. 143, z aminokyselinové sekvence 1 až 451 se SEQ ID č. 145 a z aminokyselinové sekvence 1 až 451 se SEQ ID č. 147 na seznamu sekvencí, tyto dva polypeptidy tvoří Fas-specifickou protilátku.
29. 29. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28.
30. 30. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 99 až 752 se SEQ ED č. 126 na seznamu sekvencí.

    286

    Φ

    Φ φφφφ • «φφ φφ φφ • φ φ φ • φ · · φ Φφφ φφφ φ · φφ φφ
31. 31. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 99 až 752 se SEQ ID č. 128 na seznamu sekvencí.
32. 32. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 99 až 752 se SEQ ID č. 130 na seznamu sekvencí.
33. 33. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 80 až 2038 se SEQ ID č. 142 na seznamu sekvencí.
34. 34. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 80 až 2038 se SEQ ID č. 144 na seznamu sekvencí.
35. 35. DNA, vyznačující se tím, že kóduje polypeptid podle nároku 28 a zahrnuje nukleotidovou sekvenci 80 až 2038 se SEQ ED č. 146 na seznamu sekvencí.
36. 36. Rekombinantní DNA vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA podle kteréhokoli z nároků 29 až 35.
37. 37. Rekombinantní DNA vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA podle kteréhokoli z nároků 30 až 32.
38. 38. Rekombinantní DNA vektor, vyznačující se tím, že zahrnuje DNA podle kteréhokoli z nároků 33 až 35.
39. 39. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformována rekombinantním DNA vektorem podle nároku 36.
40. 40. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, zeje transformována rekombinantním DNA vektorem, vybraným z vektorů podle nároků 37 a 38 ajejich kombinací.
41. 41. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že je transformována vektorem podle nároku 37 a vektorem podle nároku 38.
42. 42. Hostitelská buňka podle kteréhokoli z nároků 39 až 41, vyznačující se tím, že je savčí.