CN110724697A

CN110724697A - 靶向gpc3和cd19双靶点的嵌合抗原受体方法和用途

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Publication number: CN110724697A
Application number: CN201810775724.1A
Authority: CN
Inventors: 刘雅容; 金涛
Original assignee: Shanghai Hrain Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Hrain Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2020-01-24
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN110724697B

Abstract

本发明涉及靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种多核苷酸序列，选自：(1)含有依次连接的抗GPC3单链抗体的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、人IgG4铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。本发明制备的CART细胞带有tEGFR组件其具有体内示踪和安全开关的作用。

Description

靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体方法和用途

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，具体涉及靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

肝癌在世界上最流行的肿瘤中位居第五并且在癌症相关死亡的最常见原因中位居第三(Bosch等，Gastroenterologyl 27:S5-Sl6，2004；El–Serag等，Gastroenterologyl32:2557 76，2007)。根据美国癌症学会，肝细胞癌(HCC)占肝癌病例的约75％，往往直到晚期肝癌才会有症状。外科手术是肝癌的标准治疗，因为这种类型的癌症对大多数的化疗药物反应不好。因此，迫切需要开发具有不同作用机制的新药物。

磷脂酰肌醇蛋白多糖3(Glypican 3，GPC3)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的竣基端(C末端)肽(Capurro等，Dev Ce 1114:700 711，2008；Capurro等，Cancer Res 65:6245-6254，2005)。GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。考虑到GPC3在肝细胞肝癌，黑色素瘤等肿瘤中特异性的高表达，其被认为是肿瘤免疫治疗的一个候选靶标。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)T细胞是指经基因修饰后，能以MHC非限制性方式识别特定目的抗原，并且持续活化扩增的T细胞。2012年国际细胞治疗协会年会中指出生物免疫细胞治疗已经成为手术、放疗、化疗外的第四种治疗肿瘤的手段，并将成为未来肿瘤治疗必选手段。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

目前在ClinicalTrials.gov注册的抗Mesothelin CAR-T细胞治疗临床试验有10项，主要针对胰腺癌、卵巢癌、胸膜瘤、肺癌以及乳腺癌等恶性肿瘤。在宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究中，病人都是在接受过一线治疗后病情进一步发展，并且肿瘤组织表达Mesothelin，他们接受了瞬转CAR mRNA的T细胞治疗。这种Mesothelin特异性的二代CAR具有CD3ξ和4-1BB共刺激因子结构域。这些Mesothelin特异性的CAR T存活期短，在两位病人中表现出了抗肿瘤作用，可见Mesothelin能够作为CAR T细胞识别的抗原，并且瞬转mRNA的方式也是可行的。另一项宾夕法尼亚大学开展的I期临床研究使用的是慢病毒转染的Mesothelin特异性CAR。这项开始于2014年7月的研究是针对耐化疗的恶性胰腺癌、上皮性卵巢癌和恶性上皮胸膜间皮瘤。在6位病人的早期研究结果中，4位病人在CAR T细胞输注28天后病情稳定。CAR T细胞输注没有引起急性副反应，并且相比mRNA瞬转，慢病毒转染构建的CAR T细胞的持续性得到提升。

通过临床试验的开展以及对试验结果的分析，研究者们对抗Mesothelin CAR-T细胞治疗方法在应用中的缺陷有了更深刻的认识，从而能进一步开展针对性的研究克服存在的问题。鉴于在实体瘤治疗中，促使CAR-T细胞最大效率地进入肿瘤组织是取得治疗功效的重要保证。根据胸膜间皮瘤细胞能大量分泌趋化因子CCL2，宾夕法尼亚大学Carl June研究小组设计了同时表达CCL2受体CCR2的抗Mesothelin CAR-T细胞，从而通过CCL2/CCR2的作用趋化CAR-T细胞至肿瘤组织高效发挥杀伤作用。斯隆-凯特琳癌症中心则恶性胸膜瘤中比较了胸腔内输注和系统输注CAR T细胞的效果，发现胸腔内输注方式能使细胞持续性强，肿瘤内部积聚多，发挥更好的抗肿瘤作用。斯隆-凯特琳癌症中心即将就该种输注方式的安全性进一步开展临床研究。

CAR-T细胞的一大优点是它们是活性药物，一旦输入，生理机制会调控T细胞的平衡、记忆形成和抗原驱动的扩增。然而，这种治疗尚未完善，T细胞会脱靶而攻击其他的组织，或扩增量过高，超出治疗所需。鉴于CAR-T细胞已被纳入标准治疗范围，设计病人或药物可控的启动或关闭机制来调控CAR-T细胞的存在是非常有用的。由于技术原因，关闭机制更易应用于T细胞。作为其中之一，iCas9系统正在临床研究当中。细胞在表达iCas9时，使用小分子化合物可诱导iCas9前体分子形成二聚体，激活凋亡途径，从而实现清除细胞的目的。在移植物抗宿主病中，小分子AP1903已被用于诱导iCas9二聚体和清除T细胞，表明了这种方法的可行性(Clin Cancer Res.2016Apr 15；22(8):1875-84.)。

另外，还可利用临床上已经使用的清除性抗体，使CAR-T细胞同时表达这些抗体针对的蛋白，如tEGFR，在治疗相关的毒性反应产生或是治疗已经完成后，通过给予抗体药物清除相应的CAR-T细胞(Sci Transl Med 2015；7：275ra22.)。

特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体己被公开在如，中国专利文献CN101186650A。此外据文献Advances in Liver Cancer Antibody Therapies:A Focus onGlypican 3and Mesothelin，BioDrugs，2011年10月1日，25(5)：275-284)，其他己知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC333，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基。15例患者的GPC3-GC333抗体在治疗HCC的I期临床试验中观察到明显的治疗效果，推测裸的抗体在对抗人的肝癌不能起到很好的疗效。一个关于GPC3衍生肽疫苗的I期临床试验所获得的结果显示，肝癌患者的中位总生存期与GPC3特异性CTL的频率呈正相关，这项研究表明GPC3针对性的T细胞可能是肝癌治疗潜在靶标。

本发明构建靶向GPC3和CD19双靶点CAR，本发明引入CD19靶点能增加CART细胞的存续性，即此双靶点CART输注血液之后与CD19靶抗原接触后将会大量扩增，CART细胞会不断得到血液中CD19抗原刺激，使其有更多的CART细胞进入实体瘤内部，间接增加了GPC3CART细胞的功能。本发明对CART细胞进行了修饰，即引入了安全开关即tEGFR结构，它既可以使CAR-T细胞体内进行很好的被示踪，更重要的是此结构可以作为CAR-T细胞的安全开关：即不想其发挥作用时可加入妥西单抗，安全有效的控制输注的针对GPC3靶点的CAR-T细胞在体内发挥作用。本发明为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。

随着CAR-T细胞治疗经验的积累和不断完善，其在实体肿瘤中的应用越来越受到各界关注。在此环境下，我们要加快步伐，利用自身已有的工作基础、研发团队、医疗团队申请开展临床试验，推动CAR-T细胞治疗在实体瘤的道路上快速前进。

发明内容

本发明第一方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的抗GPC3单链抗体的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、人IgG4铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，在所述抗GPC3单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1-63位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第64-792位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第853-1587位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人IgG4铰链区的编码序列如SEQ ID NO:1第1588-1623位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD28跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1第1627-1707位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的编码序列如SEQID NO:1第1708-1833位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1第1834-2169位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段的编码序列如SEQ ID NO:1第2314-3318位核苷酸序列所示。

本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的抗GPC3单链抗体、抗CD19单链抗体、人IgG4铰链区、人CD28跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白和任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和

(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的由(1)衍生的融合蛋白；

优选地，所述抗GPC3单克隆抗体GC33。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列在所述抗GPC3单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID NO:2第1-21位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GPC3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-264位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第285-529位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第530-541位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第543-569位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第570-611位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第612-723位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成。在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成。在一个或多个实施方案中，所述EGFR的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第772-1106位氨基酸所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

本发明第四方面提供一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有本文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的核酸构建物，或感染了本文所述的逆转录病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的EGFR的含胞外结构域III、胞外结构域IV和任选的跨膜区的片段。

本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。

本发明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物或逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

本发明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GPC3介导的疾病的药物中的用途。

在一个或多个实施方案中，所述GPC3介导的疾病为肝癌。

附图说明

图1：RV-GPC3–CD19-tEGFR逆转录病毒表达载体(RV-GPC3–CD19-tEGFR)示意图。SP：信号肽；VL：轻链可变区；Lk：接头(G₄S)₃；VH：重链可变区；H：IgG4铰链区；TM：CD28跨膜区；WPRE：土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件。

具体实施方式

本发明提供一种靶向GPC3和CD19嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有依次连接的抗GPC3单链抗体、抗CD19单链抗体、人IgG4铰链区、人CD28跨膜区、人41BB胞内区、人CD3ζ胞内区、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段。

适用于本发明的抗GPC3单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗GPC3单克隆抗体。

因此，在某些实施方案中，适用于本发明的抗GPC3单链抗体含有特异性识别人GPC3。任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。可举例的这类单链抗体包括但不限于NH3、GC33。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是GC33。

形成本发明的融合蛋白，如抗GPC3单链抗体的轻链可变区和重链可变区、抗CD19单链抗体的轻链可变区和重链可变区、人IgG4铰链区、人CD28跨膜区、41BB和人CD3ζ胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

本发明也包括SEQ ID NO:2第22-1106位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-1106位氨基酸序列所示的CAR或SEQ ID NO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在SEQ ID NO:2第22-1106位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-1106位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第64－3318位核苷酸所示，或如SEQ ID NO:1第1-3318位核苷酸所示。

在某些实施方案中，本发明的多核苷酸序列还包含编码EGFR的片段的核苷酸序列。

适用于本发明的EGFR可以是本领域周知的EGFR，例如来自人的EGFR。EGFR含有N末端胞外结构域I和II，胞外结构域III，胞外结构域IV，跨膜区，近膜区结构域以及酪氨酸激酶结构域。本发明优选使用截短的EGFR(“tEGFR”，即本文所述的EGFR的片段)，尤其是不包括其胞内区域(近膜区结构域及酪氨酸激酶结构域)的截短的EGFR。在某些实施方案中，还可以进一步将不包括胞内区域的EGFR进一步截短成不包括胞外结构域I和II。因此，在某些实施方案中，本发明使用的tEGFR含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区组成。在某些实施方案中，所述tEGFR含有人EGFR的第310-646位氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成，其中第310-480位氨基酸序列为人EGFR的胞外结构域III，第481-620为人EGFR的胞外结构域IV，第621-646位氨基酸为人EGFR的跨膜区。

为促进tEGFR的表达，还可在其N端设置前导序列。在某些实施方案中，本发明使用来自GM-CSF受体(“GMCSFR”)α链的信号肽。在某些实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第750-771位氨基酸所示。

除此之外，可通过P2A多肽的编码序列将所述信号肽及tEGFR的编码序列与本发明CAR中人CD3ζ胞内区的编码序列相连。在一个或多个实施方案中，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第724-749位氨基酸所示。

本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白(CAR和/或tEGFR)的表达。在将核酸构建物插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至启动子，并将构建体并入表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

本发明的多核苷酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，本文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。所述土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件可增强病毒转录物的稳定性。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的逆转录病毒，该病毒含有本文所述的逆转录病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。

因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆转录病毒载体，或感染了本文所述的逆转录病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白和任选的tEGFR。

本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。

本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR和任选的tEGFR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。

因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸构建物、表达载体、病毒以及CAR-T细胞治疗的疾病优选为GPC3介导的疾病。

在某些实施方案中，所述GPC3介导的疾病为肝癌。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。

在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗GPC3介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：GPC3–CD19-CAR-tEGFR基因序列的确定

从NCBI网站数据库搜索到抗GPC3抗体重链和轻链可变区基因序列信息(GC33)，抗CD19抗体重链和轻链可变区基因序列信息(FMC63)序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行密码子优化，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

各基因核苷酸和氨基酸序列信息见(SEQUNCE ID NO.1-2)

将上述序列依次进行连接，在各序列连接处引入不同酶切位点，形成完整GPC3–CD19-IgG4-CD28-41BB-tEGFR基因序列信息。

实施例2：包含CAR分子的核酸序列的病毒载体的构建

将实施例1中制备的CAR分子的核苷酸序列经NotI(NEB)和EcoRI(NEB)双酶切、经T4连接酶(NEB)连接插入逆转录病毒RV载体的NotI-EcoRI位点，转化到感受态E.coli(DH5α)，将重组质粒送上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的GPC3–

CD19-IgG4-CD28-41BB-tEGFR序列比对来验证序列是否正确。测序引物为：

正义序列:AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQUNCE ID NO.3)

反义序列:TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQUNCE ID NO.4)

经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，纯化质粒的质粒磷酸钙法转染293T细胞进行逆转录病毒包装实验。

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。

实施例3：逆转录病毒包装

1.第1天293T细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6*10^6cells/ml铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37度培养过夜。

2.第2天293T细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；准备质粒复合物，各种质粒的量为Retro backbone(MSCV)为12.5ug，Gag-pol为10ug，VSVg为6.25ug，CaCl₂ 250ul，H₂O为1ml总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到293T皿中，37度培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。

3.第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后分装保存于-80度，继续添加预热的新鲜DMEM培养基。

序列表

<110> 上海恒润达生生物科技有限公司

<120> 靶向GPC3和CD19双靶点的嵌合抗原受体方法和用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3318

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacgtcg tcatgacgca gtcaccgctt tcacttcctg tcacacctgg ggagcccgca 120

agcattagct gccgctcaag tcagtcactg gttcactcta atgcaaacac atacctgcac 180

tggtaccttc aaaagcccgg tcaaagccca caacttctga tatataaggt aagcaataga 240

ttctccggtg tacctgatag gttttcagga agtgggtccg gtacagactt tacattgaaa 300

ataagtagag tggaggcaga ggatgtagga gtgtactact gttctcaaaa cacccacgta 360

ccaccgacat ttgggcaggg gacaaagttg gaaattaaga gaggcggcgg gggttctggt 420

ggcggcggca gcggcggtgg aggatcacag gtacaactcg tgcagtcagg tgctgaggta 480

aaaaagccgg gtgccagcgt gaaagtgagc tgtaaggcat ctggttacac cttcacggat 540

tacgagatgc actgggttcg acaagcgccc ggtcaaggac tcgaatggat gggagcgctt 600

gacccgaaga ctggagatac agcgtactcc cagaaattca agggaagggt gactcttact 660

gccgacgagt caacaagcac ggcttatatg gaactttcca gcttgcggag cgaagacacc 720

gccgtgtatt attgtaccag gttctattca tatacttact gggggcaagg tactctcgtc 780

acggtatctt ccggtggagg cggcagtggc ggaggtggga gcggaggggg cggttccggt 840

ggcgggggat ctgaggtgaa gctgcaggaa agcggccctg gcctggtggc ccccagccag 900

agcctgagcg tgacctgcac cgtgagcggc gtgagcctgc ccgactacgg cgtgagctgg 960

atccggcagc cccccaggaa gggcctggaa tggctgggcg tgatctgggg cagcgagacc 1020

acctactaca acagcgccct gaagagccgg ctgaccatca tcaaggacaa cagcaagagc 1080

caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta ctactgcgcc 1140

aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 1200

accgtgagca gcggcagcac ctccggcagc ggcaagcctg gcagcggcga gggcagcacc 1260

aagggcgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 1320

gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 1380

aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 1440

cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 1500

gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 1560

ggcggcggaa caaagctgga aatcaccgag agcaagtacg gaccgccctg ccccccttgc 1620

cctatgttct gggtgctggt ggtggtcgga ggcgtgctgg cctgctacag cctgctggtc 1680

accgtggcct tcatcatctt ttgggtgaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1740

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1800

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgcgggtga agttcagcag aagcgccgac 1860

gcccctgcct accagcaggg ccagaatcag ctgtacaacg agctgaacct gggcagaagg 1920

gaagagtacg acgtcctgga taagcggaga ggccgggacc ctgagatggg cggcaagcct 1980

cggcggaaga acccccagga aggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 2040

gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cggaggcggg gcaagggcca cgacggcctg 2100

tatcagggcc tgtccaccgc caccaaggat acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 2160

cccccaaggc gagctaaacg aggctcaggc gcgacgaact ttagtttgct gaagcaagct 2220

ggggatgtag aggaaaatcc gggtcccatg ttgctccttg tgacgagcct cctgctctgc 2280

gagctgcccc atccagcctt cctcctcatc ccgcggaagg tgtgcaatgg cataggcatt 2340

ggcgagttta aagattctct gagcataaat gctacgaata ttaagcattt caagaattgt 2400

acttctatta gtggcgacct ccatattctt ccggttgcct tcaggggtga ctctttcacc 2460

cacacacctc cattggatcc acaagaactt gacatcctga agacggttaa agagattaca 2520

ggcttcctcc ttatccaagc gtggcccgag aacagaacgg acttgcacgc ctttgagaac 2580

ctcgaaataa tacggggtcg gacgaagcaa cacggccaat ttagccttgc ggttgttagt 2640

ctgaacatta cttctctcgg ccttcgctct ttgaaagaaa tcagcgacgg agatgtcatc 2700

attagtggaa acaagaacct gtgctacgcg aacacaatca actggaagaa gctcttcggt 2760

acttcaggcc aaaagacaaa gattattagt aacagaggag agaatagctg taaggctacc 2820

ggacaagttt gtcacgcctt gtgtagtcca gagggttgct ggggaccgga accaagggat 2880

tgcgtcagtt gccggaacgt gagtcgcgga cgcgagtgtg tggataagtg caatcttctg 2940

gaaggggaac cgcgagagtt tgtagaaaat tccgaatgta tacagtgtca tcccgagtgt 3000

cttccacaag caatgaatat cacatgtaca gggaggggtc ctgataactg tatccaatgt 3060

gcacactaca tagatggtcc tcactgtgta aagacgtgcc ccgccggagt aatgggtgaa 3120

aacaacaccc tcgtgtggaa gtacgccgat gccgggcatg tctgtcattt gtgtcatccc 3180

aactgcacat atggctgtac cggtcctgga ttggagggct gtccaacaaa cgggccgaaa 3240

ataccgagta tcgcaacagg catggtggga gcacttttgc ttctcctcgt tgtcgccctg 3300

ggcatcggct tgttcatg 3318

<210> 2

<211> 1106

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Ala Pro Ala Val Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Pro Val Thr Pro Gly Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly

35 40 45

Ser Leu Val His Ser Ala Ala Ala Thr Thr Leu His Thr Thr Leu Gly

50 55 60

Leu Pro Gly Gly Ser Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Val Ser Ala Ala

65 70 75 80

Pro Ser Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala

85 90 95

Pro Thr Leu Leu Ile Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Val Thr

100 105 110

Thr Cys Ser Gly Ala Thr His Val Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Leu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Ala Gly Val

145 150 155 160

Leu Leu Pro Gly Ala Ser Val Leu Val Ser Cys Leu Ala Ser Gly Thr

165 170 175

Thr Pro Thr Ala Thr Gly Met His Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly

180 185 190

Gly Leu Gly Thr Met Gly Ala Leu Ala Pro Leu Thr Gly Ala Thr Ala

195 200 205

Thr Ser Gly Leu Pro Leu Gly Ala Val Thr Leu Thr Ala Ala Gly Ser

210 215 220

Thr Ser Thr Ala Thr Met Gly Leu Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Thr

225 230 235 240

Ala Val Thr Thr Cys Thr Ala Pro Thr Ser Thr Thr Thr Thr Gly Gly

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val Leu Leu

275 280 285

Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gly Ser Leu Ser Val

290 295 300

Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Ala Thr Gly Val Ser Thr

305 310 315 320

Ile Ala Gly Pro Pro Ala Leu Gly Leu Gly Thr Leu Gly Val Ile Thr

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ser Ala Leu Leu Ser Ala Leu Thr

340 345 350

Ile Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ser Gly Val Pro Leu Leu Met Ala Ser

355 360 365

Leu Gly Thr Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Cys Ala Leu His Thr Thr

370 375 380

Thr Gly Gly Ser Thr Ala Met Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Ser Val

385 390 395 400

Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Leu Pro Gly Ser Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Thr Leu Gly Ala Ile Gly Met Thr Gly Thr Thr Ser Ser

420 425 430

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser

435 440 445

Gly Ala Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Ala Gly

450 455 460

Thr Val Leu Leu Leu Ile Thr His Thr Ser Ala Leu His Ser Gly Val

465 470 475 480

Pro Ser Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Thr Ser Leu Thr

485 490 495

Ile Ser Ala Leu Gly Gly Gly Ala Ile Ala Thr Thr Pro Cys Gly Gly

500 505 510

Gly Ala Thr Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile

515 520 525

Thr Gly Ser Leu Thr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Pro Thr

530 535 540

Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Thr Ser Leu Leu Val

545 550 555 560

Thr Val Ala Pro Ile Ile Pro Thr Val Leu Ala Gly Ala Leu Leu Leu

565 570 575

Leu Thr Ile Pro Leu Gly Pro Pro Met Ala Pro Val Gly Thr Thr Gly

580 585 590

Gly Gly Ala Gly Cys Ser Cys Ala Pro Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly

595 600 605

Cys Gly Leu Ala Val Leu Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Thr

610 615 620

Gly Gly Gly Gly Ala Gly Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Gly Ala Ala

625 630 635 640

Gly Gly Thr Ala Val Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ala Ala Pro Gly Met

645 650 655

Gly Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Pro Gly Gly Gly Leu Thr Ala Gly

660 665 670

Leu Gly Leu Ala Leu Met Ala Gly Ala Thr Ser Gly Ile Gly Met Leu

675 680 685

Gly Gly Ala Ala Ala Gly Leu Gly His Ala Gly Leu Thr Gly Gly Leu

690 695 700

Ser Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ala Leu His Met Gly Ala Leu

705 710 715 720

Pro Pro Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ser Gly Ala Thr Ala Pro Ser Leu

725 730 735

Leu Leu Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Ala Pro Gly Pro Met Leu Leu

740 745 750

Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Gly Leu Pro His Pro Ala Pro Leu

755 760 765

Leu Ile Pro Ala Leu Val Cys Ala Gly Ile Gly Ile Gly Gly Pro Leu

770 775 780

Ala Ser Leu Ser Ile Ala Ala Thr Ala Ile Leu His Pro Leu Ala Cys

785 790 795 800

Thr Ser Ile Ser Gly Ala Leu His Ile Leu Pro Val Ala Pro Ala Gly

805 810 815

Ala Ser Pro Thr His Thr Pro Pro Leu Ala Pro Gly Gly Leu Ala Ile

820 825 830

Leu Leu Thr Val Leu Gly Ile Thr Gly Pro Leu Leu Ile Gly Ala Thr

835 840 845

Pro Gly Ala Ala Thr Ala Leu His Ala Pro Gly Ala Leu Gly Ile Ile

850 855 860

Ala Gly Ala Thr Leu Gly His Gly Gly Pro Ser Leu Ala Val Val Ser

865 870 875 880

Leu Ala Ile Thr Ser Leu Gly Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ile Ser Ala

885 890 895

Gly Ala Val Ile Ile Ser Gly Ala Leu Ala Leu Cys Thr Ala Ala Thr

900 905 910

Ile Ala Thr Leu Leu Leu Pro Gly Thr Ser Gly Gly Leu Thr Leu Ile

915 920 925

Ile Ser Ala Ala Gly Gly Ala Ser Cys Leu Ala Thr Gly Gly Val Cys

930 935 940

His Ala Leu Cys Ser Pro Gly Gly Cys Thr Gly Pro Gly Pro Ala Ala

945 950 955 960

Cys Val Ser Cys Ala Ala Val Ser Ala Gly Ala Gly Cys Val Ala Leu

965 970 975

Cys Ala Leu Leu Gly Gly Gly Pro Ala Gly Pro Val Gly Ala Ser Gly

980 985 990

Cys Ile Gly Cys His Pro Gly Cys Leu Pro Gly Ala Met Ala Ile Thr

995 1000 1005

Cys Thr Gly Ala Gly Pro Ala Ala Cys Ile Gly Cys Ala His Thr Ile

1010 1015 1020

Ala Gly Pro His Cys Val Leu Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Gly

1025 1030 1035 1040

Ala Ala Thr Leu Val Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gly His Val Cys His

1045 1050 1055

Leu Cys His Pro Ala Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Gly

1060 1065 1070

Gly Cys Pro Thr Ala Gly Pro Leu Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met

1075 1080 1085

Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu

1090 1095 1100

Pro Met

1105

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 3

agcatcgttc tgtgttgtct c 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 4

tgtttgtctt gtggcaatac ac 22

Claims

1.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)含有依次连接的抗GPC3单链抗体的编码序列、抗CD19单链抗体的编码序列、人IgG4铰链区的编码序列、人CD28跨膜区的编码序列、人41BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

2.如权利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于，

所述多核苷酸序列在所述抗GPC3单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-63位多核苷酸所示；和/或

所述抗GPC3单链抗体的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第64-792位多核苷酸所示；和/或

所述抗CD19单链抗体的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第853-1587位多核苷酸所示；和/或

所述人IgG4铰链区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1588-1623位多核苷酸所示；和/或

所述人CD28跨膜区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1627-1707位多核苷酸所示；和/或

所述人41BB胞内区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1708-1833位多核苷酸所示；和/或

所述人CD3ζ胞内区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1834-2169位多核苷酸所示；和/或

所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞外结构域I II、胞外结构域IV以及跨膜区组成；优选地，所述片段含有人EGFR的第310-646位多核苷酸序列，或由人EGFR的第310-646位多核苷酸序列组成；更优选地，所述片段的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第2314-3318位多核苷酸所示。

3.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

(1)含有依次连接的抗GPC3单链抗体、抗CD19单链抗体、人IgG4铰链区、人CD28跨膜区、人41BB胞内区和人CD3ζ胞内区的融合蛋白、任选的EGFR的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的编码序列；和

优选地，所述抗GPC3单克隆抗体为GC33。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：

所述融合蛋白在所述抗GPC3单链抗体的N端还含有信号肽，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示；

所述抗GPC3单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-264位氨基酸所示；

所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第285-529位氨基酸所示；

所述人IgG4铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第530-541位氨基酸所示；

所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第543-569位氨基酸所示；

所述人41BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第570-611位氨基酸所示；

所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第612-723位氨基酸所示；

和

所述EGFR的片段含有EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV以及跨膜区，或由EGFR的胞外结构域I II、胞外结构域IV以及跨膜区组成；优选地，所述片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列组成；更优选地，所述片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第772-1106位氨基酸所示。

5.一种核酸构建物，所述核酸构建物含有权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸序列；

优选地，所述核酸构建物为载体；

更优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，pis包装信号，酶切位点，土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，以及权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸序列。

6.一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有权利要求5所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

7.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸序列，或含有权利要求5所述的核酸构建物，或感染了权利要求6所述的逆转录病毒，或稳定表达权利要求4中任一项所述的融合蛋白和任选的EGFR的含胞外结构域III、胞外结构域IV片段部分。

8.权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸构建物或权利要求7所述的逆转录病毒在制备活化的T细胞中的应用。

9.权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的逆转录病毒、或权利要求7所述的基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GPC3介导的疾病的药物中的用途；

优选地，所述GPC3介导的疾病为肝癌。