CN117965667A - 一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法，通过在融合蛋白中设计多个目的多肽序列，并在目的多肽序列前后分别添加酶切位点和镍辅助化学切割位点以便将目的多肽切割出来。本发明中包涵体先进行镍辅助化学切割后其切割效率不低于90％，其切割后形成的前体多肽由于结构简单、溶解性好等优点，可进行进一步酶切加工，且前体多肽酶切效率不低于90％；本发明方法经两步切割后可直接将包涵体切割成目的多肽，避免了包涵体复性效率低和因目的蛋白串联次数过多导致结构复杂而酶直接切效率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法。
背景技术
生物活性肽具有信号分子的功能，大多数生物活性肽激素是由较大的无活性前体肽合成的。在它们的生物合成期间，这些肽经历了信号肽的切割、特定内肽酶对前体肽原的切割以及翻译后修饰。这些修饰中包括C末端甘氨酸酰胺化，C末端酰胺化修饰可提高其稳定性和活性。许多市售药用多肽及美容用肽都具有C末端酰胺化结构修饰。C末端甘氨酸酰胺化可见如肾上腺髓质素、P物质、加压素、胰高血糖素样肽以及一些天然毒素多肽和两栖类分泌的抗菌肽。
C末端酰胺化修饰可提高多肽生物学活性和稳定性。而这些C末端酰胺化修饰都是先经激素原转化酶等特定内肽酶切割后在肽C末端残留一个甘氨酸残基，随后C末端甘氨酸残基被肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)催化形成C末端酰胺。PAM特异性识别底物中的C末端甘氨酸残基，导致形成C末端α-酰胺化肽激素。如催化胰高血糖素样肽GLP～1(7～37)到GLP～1(7～36)酰胺的形成。所以，制备出C末端为甘氨酸残基的多肽可进一步经PAM酶催化用于C末端酰胺化修饰肽的制备。
目前胰高血糖素样肽及类似物多采用人工化学合成或基因工程方式制备。目前多肽类药物以人工化学合成为主，但是固相合成的成本较高，大量使用有机溶剂可能对多肽的活性有影响，且固相合成多肽的有关物质分析难度较高，需要对断裂肽、差象异构体、手性异构体等有关物质进行严格控制。如专利CN201210369966中采用全人工化学合成的方法制备利拉鲁肽。
随着分子生物学技术的发展，越来越多的上市多肽类药物采用基因工程的方法制备，如索马鲁肽采用酵母系统重组表达。利用酵母系统表达外源蛋白时，酵母内含有的多个蛋白酶家族可能会降解外源蛋白，特别是一些结构简单的小肽更容易被降解，降解产物随发酵时间的延长而增加，且难以通过纯化手段将其有效分离。通过分子生物学手段敲除或失活酵母宿主菌中的特定蛋白酶基因，可部分实现防止多肽的降解，但技术难度较大，且无法完全克服多肽被降解的缺点。
大肠杆菌表达体系也是常用的重组外源蛋白的表达手段。大肠杆菌中含有较少的蛋白酶，且不含糖基化位点。利用大肠杆菌系统重组表达制备可获得有活性的完整多肽。而大肠杆菌表达的可溶性融合蛋白需要经酶切去除促融合标签，在纯化工艺需严格控制酶切引入的伴侣蛋白的残留量，防止其带来的安全性风险。常规的大肠杆菌融合表达体系，可通过酶切去融合标签获得目标多肽，但是酶切后多肽的得率和回收率显著减少，严重制约多肽类药物的产业化。在已公开的GLP～1类多肽的制备发明专利中，CN201610753093.4采用伴侣蛋白～肠激酶融合表达Arg34～GLP～1(7～37)，CN201610857663.4采用SUMO～GLP～1(7～37)融合蛋白的方式重组表达GLP～1(7～37)。这些融合表达方法虽然融合蛋白的表达量和酶切效率较高，但是酶切得到的Arg 34～GLP～1(7～37)相对于融合蛋白分子量占比较低，其所获目的多肽的收率较低。且在纯化工艺上需严格控制酶切引入的伴侣蛋白的残留量，防止其带来的安全性风险。
通过串联重组表达融合蛋白方式较容易形成包涵体，且复性效率一般较低，即使串联重组表达融合蛋白为可溶性表达，其中酶切位点也可能受到融合蛋白空间结构掩埋影响导致切割效率低。复性得率低和酶切效率低等因素严重制约酶解法生产多肽。中国专利CN 111072783 A采用串联表达形式生产目的多肽，其包涵体溶解后酶切效率在40％～60％之间。可见，串联形式表达目的蛋白内的酶切位点很难被酶完全识别并切割。
化学切割通常可以不受蛋白构象影响而能充分切割融合蛋白，如溴化氰切割蛋白中甲硫氨酸及镍辅助化学切割“GSHHW”序列。镍辅助化学切割方法可在“GSHHW”序列中的G与S之间切割。其中镍辅助化学切割方法无毒无害，适合工业生产。中国专利CN116254283 A中报道了一种单次跨膜蛋白的跨膜结构域制备方法，其通过镍辅助化学切割“GSHHW”标签，可在变性剂存在条件下有效生产跨膜蛋白的跨膜结构域。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法，经两步切割后可将融合蛋白切割成目的多肽，避免了包涵体复性效率低和因目的蛋白串联次数过多导致结构复杂而酶直接切效率低的问题。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法，融合蛋白的通式为A-(B-X)n或A-(B-X)n-B，其中，A为前导肽，其序列包含有纯化标签和酶切位点；B为目的多肽；X为连接肽，其序列N末端为镍辅助化学切割序列GSHHW；若B的C末端氨基酸残基为G，则连接肽X的N端镍辅助化学切割序列为SHHW；所述n为2～10的整数；
融合蛋白通过表达载体被宿主细胞表达、纯化后，先在镍辅助化学切割液中被化学切割，生成包含目的多肽序列的前体多肽；然后前体多肽在酶切位点对应的酶切缓冲液中进行酶切，将前体多肽通过酶切生成目的多肽；
所述镍辅助化学切割缓冲液中包括：2～6M的盐酸胍、20～100mM的2～环已胺基乙磺酸、50～100mM的丙酮肟、0.5～1.5mM的氯化镍和10～100mM的氯化钠；pH为8.0～9.0；切割温度为25～40℃、切割时间为24～72h。
所述融合蛋白中连接肽X的通式为X＝E-F-G，其中E的序列为GSHHW或SHHW；F为0～15个氨基酸残基的连接序列，G为肠激酶切割位点或Kex2蛋白酶切割位点。
所述连接序列F的序列为GG、GES、GEPG、HHSGG GSEPS、ARARAKRRAPS或ARARAKRRAPY；
所述肠激酶切割位点为DDDDK；
所述Kex2蛋白酶切割位点为KR、RR、KK或RK。
所述融合蛋白中前导肽A包括6～50个氨基酸残基；
所述纯化标签为N端多聚His标签；
所述酶切位点为肠激酶特异识别序列DDDDK，对应的酶切缓冲液为肠激酶酶切缓冲液；
或者，酶切位点为Kex2酶切识别序列KR、RR、KK或RK，对应的酶切缓冲液为Kex2酶酶切缓冲液；
融合蛋白以包涵体形式表达，收集包涵体之后加入到2～6M盐酸胍溶液中进行变性溶解；然后基于纯化标签进行镍柱纯化，收集包涵体之后进行透析或超滤；再将包涵体加入到镍辅助化学切割缓冲液中进行化学切割；
化学切割完成后将反应体系进行透析或超滤除去盐酸胍，将缓冲液体系切换为25～50mM Tris-HCl缓冲液；调pH至8.0后，加入肠激酶或Kex2酶进行酶切。
编码融合蛋白的基因序列基于pET系列表达载体构建；所述宿主细胞为大肠杆菌。
所述宿主细胞为BL21(DE3)、pLysS或pLysE菌株。
所述表达载体转化入大肠杆菌的方法，包括电穿孔法、CaCl2转化法；
所述诱导宿主表达蛋白是通过0.2～0.8mM的IPTG、在25～37℃温度下进行诱导，使融合蛋白以包涵体的方式表达。
所述融合蛋白通过表达载体被宿主细胞表达后，收集宿主细胞，通过超声波破碎菌体释放融合蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明提供的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，通过在融合蛋白中设计多个目的多肽序列，并在目的多肽序列前后分别添加酶切位点和镍辅助化学切割位点以便将目的多肽切割出来；在切割时，先通过镍辅助化学方法将包涵体切割成前体多肽，由于所生成前体多肽空间结构简单、易于切割，所以可以使得之后酶切生产目的多肽的效率大为提升。
本发明提供的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，之所以先采用镍辅助化学切割是在于通过纯化标签纯化之后操作简单，切割效率高，也便于之后的酶切；对比实验表明，当融合蛋白被诱导为可溶性表达时，本发明发现即便融合蛋白是可溶性的，先使用酶切方法并不能有效切割(融合蛋白经肠激酶酶切后出现三条带，10kDa以上条带表明目的蛋白未能有效被切割，如图7所示)，推测其酶切位点可能空间结构被掩盖。
而当先用镍辅助化学切割时候，融合蛋白可被有效切割成前体多肽；当目标蛋白被诱导为表达量更高的包涵体形式，发现其纯化后可在盐酸胍溶液变性后直接进行镍辅助化学切割，随着镍辅助切割进行，原先不溶解的包涵体几乎全部溶解；推测随着化学切割进行，一开始未溶解的包涵体可进一步溶解被切割；镍辅助化学切割可在2M盐酸胍中有效切割包涵体，切割效率不低于90％(如图8所示，泳道4为融合蛋白电泳图，泳道1为包涵体经镍辅助化学切割后电泳图，从SDS～PAGE电泳结果目标斑点的浓淡对比推断切割效率，由于目标斑点浓淡的强烈对比，可推断镍辅助化学切割的切割效率不低于90％)。
由于镍离子的变性效果，镍辅助化学切割体系中一定的盐酸胍溶度是保证融合蛋白溶解并被有效切割必不可少的；其他成分则有助于进一步提高切割效率，实验结果表明本发明的镍辅助化学切割体系切割效率具有显著的优势。而且本发明的化学切割缓冲液体系切换成酶切缓冲液体系可通过超滤或透析直接实现，经化学切割后的生成的前体多肽可被酶进一步切割生成目的多肽序列，酶切割效率不低于90％(如图8所示，泳道1为化学切割后生成的前体多肽，泳道2为前体多肽经酶切后结果，两者对比非常显著，从SDS～PAGE电泳结果可见酶切效率不低于90％)。
本发明提供的切割融合蛋白制备多肽的方法，可同时解决包涵体复性率低和融合蛋白直接酶切效率低的问题，因此可利用包涵体表达量高等优点的同时提高酶的切割效率；采用本方法可大规模制备C末端为甘氨基酸残基的多肽，其可进一步用于C末端酰胺化肽的制备。
附图说明
图1为本发明切割融合蛋白获得目的多肽示意图；
图2-1为本发明实施例的编码融合蛋白的核苷酸序列；
图2-2为本发明实施例的质粒载体示意图；
图3为融合蛋白诱导表达电泳图，其中，1为诱导前，2为诱导后，3为marker；
图4为25℃条件下诱导后菌体超声破碎后上清和沉淀电泳图，其中，1为marker，2为破碎后上清，3为破碎后沉淀；
图5为37℃条件下诱导后菌体超声破碎后上清和沉淀电泳图，其中，1为marker，2为破碎后上清，3为破碎后沉淀；
图6为25℃条件下诱导后融合蛋白经镍柱纯化电泳图，其中，1为Marker，2为25℃条件下诱导破碎后上清，3为镍柱纯化上样后流穿，4为含50mM咪唑缓冲液洗杂，5为含300mM咪唑缓冲液洗脱，7为含1000mM咪唑缓冲液洗脱；
图7为25℃条件下诱导后融合蛋白经镍柱纯化并透析后的酶切前后电泳图，其中，1为Marker，2为酶切前融合蛋白，3为肠激酶酶切后；
图8为37℃条件下诱导后包涵体经镍柱纯化并透析后的酶切前后电泳图，其中，1融合蛋白化学切割后，2为化学切割后再酶切，3为Marker，4为融合蛋白；
图9为包涵体经镍辅助化学切割后质谱鉴定图，分子量约4785，与理论一致；
图10为包涵体经镍辅助化学切割后再经肠激酶酶切后质谱鉴定图，分子量约3175，与理论一致；
图11为延长肠激酶酶切时间后的质谱鉴定图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。其中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
菌株、质粒、辅料及其他材料均为市售产品。
本发明所用“融合蛋白”、“目的蛋白”可互换使用，是指包含串联目的多肽的蛋白。由于本发明主要关注于融合蛋白中目的多肽前后两端的切割，使得便于目的多肽的纯化；而目的多肽可以是多样的、广泛的，可以根据需求来灵活选择。
本发明在目的多肽的C端设置化学切割位点，其镍辅助化学切割序列为GSHHW，所用GSHHW序列为镍辅助化学切割识别标签，切割位点在G与S之间。
本发明在目的多肽的N端设置酶切位点，在经化学切割之后，多肽将会暴露出酶切位点，酶切更为容易、酶切效率会更高；所以酶切识别位点可以是多样的、广泛的，可以根据需求来灵活选择。
本发明提供一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法，融合蛋白的通式为A-(B-X)n或A-(B-X)n-B，其中，A为前导肽，其序列包含有纯化标签和酶切位点；B为目的多肽；X为连接肽，其序列N末端为镍辅助化学切割序列GSHHW；若B的C末端氨基酸残基为G，则连接肽X的N端镍辅助化学切割序列为SHHW；所述n为2～10的整数；
融合蛋白通过表达载体被宿主细胞表达、纯化后，先在镍辅助化学切割液中被化学切割，生成包含目的多肽序列的前体多肽；然后前体多肽在酶切位点对应的酶切缓冲液中进行酶切，将前体多肽通过酶切生成目的多肽；
所述镍辅助化学切割缓冲液中包括：2～6M的盐酸胍、20～100mM的2～环已胺基乙磺酸、50～100mM的丙酮肟、0.5～1.5mM的氯化镍和10～100mM的氯化钠；pH为8.0～9.0；切割温度为25～40℃、切割时间为24～72h。
进一步的，所述融合蛋白中前导肽A包括6～50个氨基酸残基；
所述纯化标签为N端多聚His标签，基于多聚His标签的纯化是当前比较流行、成熟的方案；选择该纯化标签可能会节省一定的成本。
所述融合蛋白中连接肽X的通式为X＝E-F-G，其中E的序列为GSHHW或SHHW；F为0～15个氨基酸残基的连接序列，G为肠激酶切割位点或Kex2蛋白酶切割位点。肠激酶或Kex2蛋白酶的应用也是当前比较流行、成熟的方案。
进一步的，所述连接序列F的序列为GG、GES、GEPG、HHSGG GSEPS、ARARAKRRAPS或ARARAKRRAPY；
所述肠激酶切割位点为DDDDK；
所述Kex2蛋白酶切割位点为KR、RR、KK或RK。
其中，融合蛋白N端为具有多聚组氨酸标签和酶切位点的前导肽，之后为目的多肽与连接肽间隔串联序列。
下面对融合蛋白的表达、切割进行详细的说明，而目的多肽具体以生产索马鲁肽前体序列(9～37)序列为例进行说明。当然其他序列的目的多肽也适用于本发明的切割方法。
具体的，设计3个串联索马鲁肽前体序列(9～37)的融合蛋白序列。索马鲁肽前体序列(9～37)的N端为肠激酶酶切位点DDDDK，C末端为GSHHW标签。由于索马鲁肽前体序列的C末端氨基酸残基为G，所以则连接肽X的N端镍辅助化学切割序列为SHHW。
如图1所示，所构建的融合蛋白(给出了其氨基酸残基序列)以包涵体形式表达，将包涵体加入到镍辅助化学切割缓冲液中进行化学切割，生成前体多肽(分子量4785)；前体多肽经酶切生成目的多肽索马鲁肽前体序列(分子量3175)。
编码融合蛋白的核苷酸序列如图2-1所示，委托基因合成公司合成并优化编码融合蛋白核酸的核苷酸序列，将其通过酶切位点NcoI和XhoI插入到图2-2所示的pET28a质粒中(pET28a质粒含有卡那霉素抗性基因)，构建重组质粒、表达载体。
将重组质粒通过CaC12转化法导入到宿主细胞BL21(DE3)中，再经过卡那霉素抗性涂板筛选单克隆得到索马鲁肽前体(9～37)菌株。经测序菌中的序列与设计一致。
进一步的，宿主细胞也可以为pLysS或pLysE菌株；表达载体转化入大肠杆菌的方法，包括电穿孔法、CaCl2转化法。
配制20L的LB液体培养基，封口，分装后灭菌(121℃，25min)，待用。
取出索马鲁肽前体(9～37)菌株，分别按照1％接种量接入三个50ml灭菌后培养基，在摇床37℃，220rpm的条件下过夜培养。
取出复苏菌液，分别按照1％接种量接入3个1L灭菌后培养基，在摇床37℃、220rpm的条件下培养至OD 600值约0.8，加入0.5mM的IPTG，在25℃温度下诱导2～8h。再分别按照1％接种量接入6个1L灭菌后培养基，在摇床37℃、220rpm的条件下培养至OD 600值约0.8，加入0.5mM的IPTG，在37℃温度下诱导6h。
收集在25℃条件下诱导2h后菌液，菌液在5000rpm，4℃离心30min，弃去上清收获菌体。通过SDS～PAGE观察菌体中目的蛋白的表达(图3)。
收集菌液在10000rpm，4℃离心30min，分别收集25℃和37℃条件诱导的菌体，之后经超声破碎仪超声波破碎，分别离心收集沉淀和上清并进行SDS～PAGE。通过SDS～PAGE观察菌体中目的蛋白的表达结果。
结果发现，25℃诱导条件下目的蛋白主要出现在上清中，可知目的蛋白为可溶性形式表达(如图4所示)。而37℃诱导条件下目的蛋白主要出现在沉淀，可知目的蛋白为包涵体形式表达(如图5所示)。
收集25℃诱导条件下的蛋白上清，并通过镍柱纯化(如图6所示)。
收集上述纯化后融合蛋白在酶切缓冲液中透析除去咪唑，之后加入肠激酶进行酶切；其中，融合蛋白2mg，肠激酶1U，在25℃条件下酶切24h，酶切后进行SDS～PAGE观察酶切效果。结果发现，目的蛋白经酶切后主要出现三条带，酶切后10kDa以上条带大量存在表明目的蛋白酶切不彻底。(如图7所示)。
收集37℃诱导条件下的包涵体，加入盐酸胍变性溶解后通过镍柱纯化，之后收集纯化后包涵体再经透析或超滤除去镍柱纯化中使用的咪唑。将除去咪唑的包涵体加入到镍辅助化学切割体系中进行化学切割。
所述镍辅助化学切割缓冲液中包括：2～6M的盐酸胍、20～100mM的2～环已胺基乙磺酸、50～100mM的丙酮肟、0.5～1.5mM的氯化镍和10～100mM的氯化钠；
一定的盐酸胍溶度是保证融合蛋白溶解并被有效切割必不可少的；其他成分则有助于进一步提高切割效率；具体的，化学切割体系为盐酸胍：2～6M；2～环已胺基乙磺酸：100mM；丙酮肟：100mM；氯化镍：1mM；氯化钠：20mM；pH 8.5；温度37℃，反应48h。
化学切割之后进行SDS～PAGE和质谱检测，结果发现，目的蛋白先经镍辅助化学切割后生成主要序列分子量约为4785的前体多肽(如图8所示，泳道1)，其质谱检测结果如图9所示，分子量与理论一致。
将上述经镍辅助切割后液体进行透析或超滤除去盐酸胍、氯化镍等小分子，之后加入Tris，致其缓冲液条件变为25～50mM Tris～HCl。调pH 8.0后，加入肠激酶进行酶切。
酶切后进行SDS～PAGE和质谱检测。结果发现，前体多肽再经肠激酶酶切后生成分子量约3174的目的条带(如图8所示，泳道2)，其对应序列为EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG(如图10所示，分子量与理论一致)，表明包涵体经两步切割处理后生成索马鲁肽前体(9～37)。
酶切后生成的目的多肽可经离子柱或反相高效液相色谱等进一步分离纯化。延长肠激酶酶切时间后的质谱鉴定如图11所示，延长肠激酶酶切时间可见分子量为4785的前肽信号几乎消失，提示前肽可完全切割；分子量2904信号峰为目的多肽(3175)被肠激酶非特异性切割生成多肽片段。
以上结果表示，以包涵体形式表达的融合蛋白产量较可溶性形式表达高。由于融合蛋白直接酶切效率不高，且包涵体形式不能用于直接酶切。而化学切割试剂分子量较小，可有效接触到蛋白中切割位点。为此，可先通过化学切割将包涵体切割转化成分子量较小的前体多肽。
包涵体先进行镍辅助化学切割后经SDS～PAGE电泳检测可见，其切割效率不低于90％(电源结果如图8所示，通过泳道中目标斑点浓淡定性判断其含量，进而推断其切割效率)。其切割后所形成的前体多肽由于结构简单、空间位阻小，其上酶切位点更容易接触到蛋白酶催化中心而被切割。故可将化学切割后生成的前体多肽进一步进行酶切加工除去N端多余氨基酸序列。
由SDS～PAGE电泳检测结果可见，前体多肽的酶切效率不低于90％(如图8所示)。
本发明方法经两步切割后可直接将包涵体切割成目的多肽：
融合蛋白以包涵体形式表达，收集包涵体之后加入到2～6M盐酸胍溶液中进行变性溶解；然后基于纯化标签进行镍柱纯化，收集包涵体之后进行透析或超滤；再将包涵体加入到镍辅助化学切割缓冲液中进行化学切割；
化学切割完成后将反应体系进行透析或超滤除去盐酸胍，将缓冲液体系切换为25～50mM Tris-HCl缓冲液；调pH至8.0后，加入肠激酶或Kex2酶进行酶切。
本发明避免了包涵体复性效率低和因目的蛋白串联次数过多导致结构复杂而酶直接切效率低的问题。融合蛋白纯化后可在盐酸胍溶液变性后直接进行镍辅助化学切割，随着镍辅助切割进行，原先不溶解的包涵体几乎全部溶解；推测随着化学切割进行，一开始未溶解的包涵体可进一步溶解被切割。
本发明可利用包涵体表达量高等优点的同时提高酶的切割效率；采用本方法可大规模制备C末端为甘氨基酸残基的多肽，其可进一步用于C末端酰胺化肽的制备。
以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，融合蛋白的通式为A-(B-X)n或A-(B-X)n-B，其中，A为前导肽，其序列包含有纯化标签和酶切位点；B为目的多肽；X为连接肽，其序列N末端为镍辅助化学切割序列GSHHW；若B的C末端氨基酸残基为G，则连接肽X的N端镍辅助化学切割序列为SHHW；所述n为2～10的整数；
融合蛋白通过表达载体被宿主细胞表达、纯化后，先在镍辅助化学切割液中被化学切割，生成包含目的多肽序列的前体多肽；然后前体多肽在酶切位点对应的酶切缓冲液中进行酶切，将前体多肽通过酶切生成目的多肽；
所述镍辅助化学切割缓冲液中包括：2～6M的盐酸胍、20～100mM的2～环已胺基乙磺酸、50～100mM的丙酮肟、0.5～1.5mM的氯化镍和10～100mM的氯化钠；pH为8.0～9.0；切割温度为25～40℃、切割时间为24～72h。
2.如权利要求1所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，所述融合蛋白中连接肽X的通式为X＝E-F-G，其中E的序列为GSHHW或SHHW；F为0～15个氨基酸残基的连接序列，G为肠激酶切割位点或Kex2蛋白酶切割位点。
3.如权利要求2所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，所述连接序列F的序列为GG、GES、GEPG、HHSGG GSEPS、ARARAKRRAPS或ARARAKRRAPY；
所述肠激酶切割位点为DDDDK；
所述Kex2蛋白酶切割位点为KR、RR、KK或RK。
4.如权利要求1或2所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，所述融合蛋白中前导肽A包括6～50个氨基酸残基；
所述纯化标签为N端多聚His标签；
所述酶切位点为肠激酶特异识别序列DDDDK，对应的酶切缓冲液为肠激酶酶切缓冲液；
或者，酶切位点为Kex2酶切识别序列KR、RR、KK或RK，对应的酶切缓冲液为Kex2酶酶切缓冲液。
5.如权利要求4所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，融合蛋白以包涵体形式表达，收集包涵体之后加入到2～6M盐酸胍溶液中进行变性溶解；然后基于纯化标签进行镍柱纯化，收集包涵体之后进行透析或超滤；再将包涵体加入到镍辅助化学切割缓冲液中进行化学切割；
化学切割完成后将反应体系进行透析或超滤除去盐酸胍，将缓冲液体系切换为25～50mM Tris-HCl缓冲液；调pH至8.0后，加入肠激酶或Kex2酶进行酶切。
6.如权利要求1所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，编码融合蛋白的基因序列基于pET系列表达载体构建；所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，所述宿主细胞为BL21(DE3)、pLysS或pLysE菌株。
8.如权利要求1或6所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，所述表达载体转化入大肠杆菌的方法，包括电穿孔法、CaCl2转化法；
所述诱导宿主表达蛋白是通过0.2～0.8mM的IPTG、在25～37℃温度下进行诱导，使融合蛋白以包涵体的方式表达。
9.如权利要求1或6所述的通过切割融合蛋白制备多肽的方法，其特征在于，融合蛋白通过表达载体被宿主细胞表达后，收集宿主细胞，通过超声波破碎菌体释放融合蛋白。
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