CN104755502A

CN104755502A - 多肽的产生和纯化方法

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Publication number: CN104755502A
Application number: CN201280076298.3A
Authority: CN
Inventors: 林章凛; 徐望晖; 邢磊; 曾伶俐; 周碧红; 赵青; 吴伟
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2032-10-12
Also published as: US20140106399A1; WO2014056199A1; US9200306B2; CN104755502B

Abstract

本发明涉及多肽的产生和纯化方法。更具体地，本发明公开了包含促溶肽标签部分、自聚集肽部分和目的多肽部分的融合蛋白和通过表达所述融合蛋白来产生和纯化目的多肽的方法。

Description

多) ¾的产生和纯化方法技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及包含促溶肽标签部分、自聚集肽部分和目的多肽部分的融合蛋白和通过表达所述融合蛋白来产生和纯化目的多肽的方法。说背景技术月目前，关于多牍在医药中应用的研发已广泛涉及抗肿瘤药物、心脑血管药物、疫苗和抗病毒药物，以及诊断试剂盒等多个方面 (Leader等， 2008)。同迅速增长的市场需求相比，多肽的生产方法在一定程度上限制了其发展。常规的化学固相合成法在生产超过 30个氨基酸的中长多肽时，随着肽段长度增大，合成的成本和难度将大幅增加 (Bray等， 2003)。

另一种有效的手段是采用重组方法在宿主细胞内产生多駄。利用大肠杆菌生长速率快、表达量高、生产成本低等特点，通过引入外源基因，或者操作基因改变氨基酸序列，能够很容易生产得到所需的多駄产品，而且该方法操作步骤简便、易于放大生产。目前市场上超过 30%的重组多肽类药物是使用大肠杆菌细胞生产的 (Kamionka等， 2011 ; Demain等， 2009; Walsh, 2003和 2006)。然而，长度小于 100个氨基酸的短肽很容易被蛋白醸降解，大大影响产率 (Murby等， 1996; Kuliopulos等， 1994; Hamiig等， 1998)。

在重组产生多牍的方法中，纯化步骤非常关键。据报道，重组多) ¾的分离与纯化成本约占其全部生产成本的 60%- 80% (陈浩等人， 2002)。重组多肽的纯化方法包括传统的离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等。离子交换层析和疏水性相互作用层析由于对样品起始条件育一定的要求，通用性和效率不及亲和层析。亲和纯化通常可以获得超过 90%的高收率，使其成为目前最常用的重组蛋白纯化方法。常用的亲和纯化技术包括组氨酸标签 (his- tag)或谷胱甘肽转移酶标签 (GSTTtag)与目的多肽的融合表达，为不同目的多駄的生产提供了通用的纯化手段。然而昂贵纯化柱使亲和纯化成本较高，不利于工业领域的应用。

本领域仍需要低成本、简便、高效的多牍产生和纯化方法。发明概述

本发明提供了基于自聚集肽和促溶牍标签的低成本、简便、高效的多

)¾产生和纯化方法。

在第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含促溶) ¾标签部分、自聚集肽部分以及目的多肽部分，其中所述目的多肽部分位于所述促溶肽标签部分和所述自聚集肽部分之间，并且所述目的多肽部分通过第一接头连接于所述自聚集肽部分，其中所述第一接头包含第一切割位点，所述融合蛋白在宿主细胞内表达后通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。在一些实施方案中，所述自聚集肽部分位于所述融合蛋白的 C端。

在一些实施方案中，所述自聚集肽部分包含两亲性自组装短肽。在一些实施方案中，所述两亲性自组装短肽选自两亲性 β折叠短肽、两亲性 α 螺旋短肽、类表面活性剂短肽。

在一些实施方案中，所述两亲性 β折叠短肽的长度为 4-30个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述两亲性 β折叠短肽的疏水性氨基酸残基含量为 40%-80%。在一具体实施方案中，所述两亲性 β折叠短肽的氨基酸序列示于 SEQ ID NO 在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的自聚集肽部分包括 1个所述两亲性 β折叠短肽。在另一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的自聚集肽部分包括串联重复的两个或更多个所述两亲性 β折叠短肽。

在一些实施方案中，所述两亲性 α螺旋短肽的长度为 4-30个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述两亲性 α螺旋短肽的疏水性氨基酸残基含量为 40%-80%。在一具体实施方案中，所述两亲性 α螺旋短肽的氨基酸序列示于 SEQ ID NO 在一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的自聚集肽部分包括 1个所述两亲性 α螺旋短肽。在另一些实施方案中，本发明的融合蛋白中的自聚集肽部分包括串联重复的两个或更多个所述两亲性 α螺旋短肽。

在一些实施方案中，所述类表面活性剂短肽具有 7-30个氨基酸残基，其从 Ν端到 C端具有以下通式表示的氨基酸序列： A-B或 B-A

其其中中 AA是是亲亲水水性性氨氨基基酸酸残残基基组组成成的的肽肽，，所所述述亲亲水水性性氨氨基基酸酸残残基基可可以以是是相相同同的的或或不不同同的的，，且且选选自自 LLyyss、、 AAsspp.. AArrgg、、 GGlluu、、 HHiiss.. SSeerr、、 TThhrr、、 AAssnn和和 GGiinn;;

BB 是是由由疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基组组成成的的肽肽，，所所述述疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基可可以以是是相相同同的的 55 或或不不同同的的，，且且选选自自 LLeeuu、、 GGllyy、、 AAllaa.. VVaall、、 IIllee、、 PPhhee和和 TTiipp;; 且且 AA与与 BB通通过过肽肽键键连连接接；；并并且且其其中中在在所所述述类类表表面面活活性性剂剂短短肽肽中中疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基的的比比例例是是 5555%%--9955%%。。在在一一些些实实施施方方案案中中，，所所述述类类表表面面活活性性剂剂短短肽肽具具有有 88个个氨氨基基酸酸残残基基，，其其中中疏疏水水性性氨氨基基酸酸残残基基的的比比例例是是 7755%%。。在在一一些些具具体体的的实实施施方方案案中中，，所所述述类类表表面面活活性性剂剂短短肽肽的的氨氨基基酸酸序序列列示示于于 SSEEQQ IIDD NNOO::33、、 SSEEQQ IIDD NNOO::44或或 1100 SSEEQQ IIDD NNOO::55。。

在在一一些些实实施施方方案案中中，，本本发发的的融融合合蛋蛋白白中中的的促促溶溶肽肽标标签签选选自自 NNuussAA、、 GGSSTT、、 TTrrxx、、 SSUUMMOO,, DDssbbCC、、 ZZ、、 GGBB11、、 MMBBPP禾禾 ΠΠ TT77PPKK。。

在在一一些些实实施施方方案案中中，，本本发发明明的的融融合合蛋蛋白白中中的的所所述述第第一一切切割割位位点点选选自自化化学学切切割割位位点点、、酶酶法法切切割割位位点点和和自自切切割割位位点点。。在在一一些些实实施施方方案案中中，，所所述述自自切切 1155 割割位位点点为为内内含含駄駄iinnteteiinn))。。在在一一些些具具体体的的实实施施方方案案中中，，所所述述内内含含肽肽为为序序列列示示于于 SSEEQQ IIDD NNOO::66的的 MMxxee GGyyrrAA。。在在一一些些具具钵钵的的实实施施方方案案中中，， MMxxee GGyyrrAA直直接接连连接接于于所所述述目目的的多多肽肽的的 CC端端。。

在在一一些些可可选选的的实实施施方方案案中中，，本本发发明明的的融融合合蛋蛋白白中中的的所所述述第第一一接接头头还还包包含含间间隔隔物物。。

2200 在在一一些些实实施施方方案案中中，，本本发发明明的的融融合合蛋蛋白白中中的的所所述述目目的的多多駄駄通通过过第第二二接接头头连连接接于于所所述述促促溶溶肽肽标标签签。。在在一一些些可可选选的的实实施施方方案案中中，，所所述述第第二二接接头头包包含含间间隔隔物物。。在在另另一一些些可可选选的的实实施施方方案案中中，，所所述述第第二二接接头头包包含含第第二二切切割割位位点点，，其其中中第第二二切切割割位位点点的的切切割割条条件件不不^^于于所所述述第第一一切切割割位位点点的的切切割割条条件件。。在在一一些些实实施施方方案案中中，，所所述述第第二二切切割割位位点点选选自自第第二二化化学学切切割割位位点点、、第第二二酶酶法法切切割割

2255 位位点点和和第第二二自自切切割割位位点点。。在在一一些些具具体体的的实实施施方方案案中中，，所所述述第第二二酶酶法法切切割割位位点点包包含含 SSEEQQ IIDD NNOO::77所所示示的的肠肠激激酶酶识识别别序序列列。。在在另另一一些些具具体体的的实实施施方方案案中中，，所所述述肠肠激激酶酶识识别别序序列列直直接接连连接接于于所所述述目目的的多多肽肽的的 NN端端。。在在一一些些可可选选的的实实施施方方案案中中，，所所述述第第二二接接头头除除了了第第二二切切割割位位点点外外还还包包括括间间隔隔物物。。

在在一一些些实实施施方方案案中中，，本本发发明明的的融融合合蛋蛋白白中中的的所所述述目目的的多多肽肽为为长长度度为为

在在另另一一方方面面，，本本发发明明提提供供了了一一种种多多核核苷苷酸酸，，其其包包含含编编码码本本发发明明上上述述的的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。

在另一方面，本发明提供了一种表达构建体，其包含本发明上述的多核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明上述的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明上述的融合蛋白。

在另一方面，本发明提供了一种产生和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 培养本发上述的宿主细胞，从而表达本发明的融合蛋白；

(b)裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分；

(c) 通过切割第一切割位点从所述不溶部分释放可溶的带有促溶駄标签的目的多駄；和

(d) 去除步骤 W中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。在一些实施方案中，本发明的产生和纯化目的多肽的方法还包括：

(e) 如果所表达的融合蛋白存在第二切割位点，则通过切割第二切割位点使所述目的多肽和所述促溶肽标签分离；

(f) 去除所述促溶肽标签，获得纯化的目的多肽。附图说明

图 1. 基于自聚集肽 (ELK16)和促溶肽标签 (Τπ 的多駄产生和纯化策略以及表达载体图谱。 Α : 带促溶肽标签； Β : 不带促溶肽标签； pET-Lip A-Intein-ELK 16载体； D: pET Trx-EK- lutein- ELK16载体。

图 2. 目的多肽的表达与纯化结果。 A: 不带 Trx标签；带 Trx标签。图 3. 目标蛋白 GLP- 1与 Trx分离的 HPLC吸收峰图谱。

图 4. 融合蛋白 Trx-目的多肽- lutein- ELK16 经肠激酶切割的结果的 SDS- PAGE分析。

图 5. 促溶) ¾标签 SUMO与自聚集) ¾ ELK 16组合用于产生和纯化目的多肽的结果。

图 6. 促溶肽标签 GST与自聚集肽 ELK16组合用于产生和纯化目的多牍的结果。图 7. 促溶 J¾标签 DsbC与自聚集肽 ELK16组合用于产生和纯化目的多馱的结果。

图 8. 促溶牍标签 GB1与自聚集肽 ELK16组合用于产生和纯化目的多肽的结果。

图 9. 促溶) ¾标签 Z与自聚集肽 ELK16组合用于产生和纯化目的多) ¾ 的结果。

图 10. 自聚集肽 18A和 L6KD与促溶牍标签 Tnc组合用于产生和纯化 GLP1多肽的结果。发明详述

在第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含促溶駄标签部分、自聚集肽部分以及目的多肽部分，其中所述目的多肽部分位于所述促溶肽标签部分和所述自聚集肽部分之间，并且所述目的多肽部分通过第一接头连接于所述自聚集肽部分，其中所述第一接头包含第一切割位点，所述融合蛋白在宿主细胞内表达后可通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。

在第二方面，本发明提供一种多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。

在第三方面，本发明提供一种表达构建体，其包含本发明的多核苷酸。在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合蛋白。

在第五方面，本发明提供一种产生和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 培养本发明的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白； (b)裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分；（c)通过切割第一切割位点从所述不溶部分释放可溶的带有促溶肽标签的目的多肽；和 (d) 去除步骤 (C)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。

如本文所用，术语 "多) ¾ "和 "蛋白"可互换使用，并且定义为由通过肽键连接的氨基酸残基组成的生物分子。如本文所用， " 的多駄 "或"目的蛋白" 是指可通过本发明的方法产生并纯化的任何多肽或蛋白质，其非限制性例子包括酶、激素、免疫球蛋白链、诸如抗癌多肽的治疗性多) ¾、诊断性多) ¾或者可以用于免疫 §的的多) ¾或其生物学活性片段等等。目的多肽可以来自任何来源，包括微生物来源多肽、喃乳动物来源多肽和人工蛋白质 (例如融合蛋白或突变的蛋白质)等等。

目的多肽可以是任何长度的多肽和蛋白。可通过本发明的方法产生并纯化的目的多肽的长度可以是 20-200， 25-150， 30-120， 30- 100个氨基酸残基，例如，大约 30，大约 40，大约 50，大约 60，大约 70，大约 80，大约 90个氨基酸残基。

可通过本发明的方法来产生并纯化的 "目的多駄" 的实例包括但不限于胰高血糖素样肽 GLP- i、 B型脑利钠肽 BNP、促姨岛素分泌肽 Ex- 4、趋化因子 CCL5、基质细胞衍生因子 SDF- 1α、促生长因子 IGF- ia、肥胖荷尔蒙 Lep、 P条丐素 (Calcitonin)、 ' 莫 -瑞'林 (Sermordin)、 '胸,腺 H太 (Thymosin)、 ;X 蛭素 (Lepimdin)、天査素 (Cecropin)、人富组蛋白 (Histatin)、防御素 (defensin)、和人纤溶酶原 (Kringle i- 5)或它们的生物学活性片段等。

如本文所用， "促溶肽标签"是指与目的多肽融合后能够帮助目的多駄正确折叠并提高融合蛋白可溶性的融合标签。本领域技术人员已知多这样的 "促溶肽标签"。可用于本发明的合适的促溶肽标签包括但不限于

NusA、 GST、 Trx、 SUMO , DsbC、 Z、 GB1 , MBP禾口 T7PK(Leder et al, 2007; Esposito和 Chatteijee, 2006; Waugh, 2005)。在一个优选实施方案中，所述促溶肽标签为 Trx。

如本文所用， "自聚集肽"是指与目标多肽部分融合并在宿主细胞表达后能够介导融合蛋白在胞内形成不可溶的活性聚集体的多肽。如本文所用，

"活性聚集体"指的是目标多肽部分仍然能够正确折叠并保持活性或者是指聚集体中的目的多肽部分在与自聚集駄分离后能够处于可溶状态。

无意于受到任何理论的限制，本领域中已知一些两亲性 (amphipathic) 多肽由于具有彼此分隔的亲水性区域和疏水性区域，在疏水相互作用以及其它推动力作用下能自发地形成特定的自组装结构 (Zhao 等， 2008)。本发明人令人惊奇地发现一些具有自组装能力的两亲性短肽能够诱导细胞内活性聚集体的形成。用作本发明的自聚集肽的两亲性自组装短肽可以选自两亲性 β折叠短肽、两亲性 α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。

如本文所用， "两亲性 β折叠短肽"是指具有 4-30个氨基酸残基，由疏水性氨基酸、带电荷的亲水性氨基酸交替排列构成的短肽，其形成 β折叠时，一侧为疏水氨基酸残基，另一侧是交替排列带正电荷和带负电荷的亲水性氨基酸残基。这些短肽可以在疏水相互作用、静电相互作用以及氢键作用下形成自组装结构。一般而言，两亲性 β折叠结构的长度越长或疏水性越强，自组装越容易发生，形成的自聚集体的机械强度越强。为了保证足够的自组装能力，本发明的两亲性 β折叠短肽应当包含一定量的疏水性氨基酸。本发明的两亲性 β折叠短肽包括 40-80%、 45-70%、 50-60%, 例如大约 50%的疏水性氨基酸残基。可用作本发明的自聚集肽的两亲性 β折叠短肽的具体实例是氨基酸序列示于 SEQ ID ΝΟ: 1的 ELK16 (氨基酸序列： LELELKLKLELELKLK)。

本领域已有通过多个重复单元串联重复形成具有自聚集特性的多肽的报道，如类弹性蛋白 ELP, 其由 110个 VPGXG重复单元组成，其聚集特性与重复单元数目相关 (Banki, et al., 2005; MacEwan和 Chilkoti, 2010)。也有报道显示由多个重复单元组成的两亲性 β折叠的自聚集倾向随着重复单元数目增加而增强 (Zhang et al, 1992)。可以预期，由多个上述 "两亲性 β折叠短肽" 串联组成的多肽能够保留甚至获得增强的自组装能力。

因此，本发明的自聚集肽部分可以包括一或多个串联连接的所述两亲性 β折叠短肽。本发明的自聚集肽部分可以包含 1-150、 1-130、 1-110、 1-90、 1-70、 1-50、 1-30、 1-10个、 1-5个，例如 1、 2、 3、 4、 5个所述两亲性 β 折叠短肽。所述自聚集肽部分中的两或多个两亲性 β折叠短肽可以形成串联重复。为了便于重组操作以及考虑到生产成本问题，期望使用较少的重复。因此，在一些实施方案中，所述 "自聚集肽部分"仅包含一个所述两亲性 β折叠短肽。

α螺旋是肽链骨架围绕一个轴以螺旋的方式伸展的一种蛋白二级结构。如本文所用， "两亲性 α螺旋短肽"是指具有 4-30个氨基酸残基，与普通 α 螺旋相比具有独特的亲水、疏水氨基酸排列，使得在形成的 α螺旋结构的一侧主要为亲水性氨基酸，而在另一侧主要为疏水性氨基酸的短肽。据推测两亲性 α螺旋在水溶液中通过形成卷曲螺旋 (coiled-coil)而实现自组装，其中两个 α螺旋通过疏水相互作用结合，并进一步通过带电氨基酸的静电相互作用力稳定这种结合。本发明的两亲性 α 螺旋短肽包括 40-80%、 45-70%、 50-60%, 例如大约 50%的疏水性氨基酸残基。可用作本发明的自聚集肽的两亲性 α螺旋短肽的具体实例为氨基酸序列示于 SEQ ID NO:2的 18 A (EWLKAFYEKVLEKLKELF)。与两亲性 β折叠类似，由两亲性 α螺旋短肽串联组成的多肽保持甚至增强自组装能力。本发明的 "自聚集肽部分"可以包括一或多个串联连接的所述两亲性 α螺旋短肽。例如，本发明的"自聚集肽部分 "可以包含 1-150、 1-130、 1-110、 1-90、 1-70、 1-50、 1-30、 1-10个、 1-5个，例如 1、 2、 3、 4、 5个所述两亲性 α螺旋短肽。所述自聚集肽部分中的两或多个两亲性 α螺旋短肽可以形成串联重复。不过，为了便于重组操作以及考虑到生产成本问题，期望使用较少的重复。因此，在一些实施方案中，本发明的 "自聚集肽部分"仅包含一个所述两亲性 α螺旋短肽。

"类表面活性剂肽"是可用作本发明的自聚集肽的另一类两亲性多肽，其通常由 7-30个氨基酸残基组成，延伸长度约 2-5nm，结构类似于脂质，由一段疏水性氨基酸尾部和亲水性氨基酸头部构成。类表面活性剂结构的性质类似于表面活性剂，在水溶液中可以形成胶束、纳米管等组装结构。适于用作本发明的自聚集肽的类表面活性剂短肽的长度可以是 7-30个氨基酸残基，其包括从 N端到 C端的以下通式表示的氨基酸序列：

A-B或 B-A,

其中 A与 B之间通过肽键连接。 A是由亲水性氨基酸组成的亲水性头部，所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自 Lys、 Asp, Arg、 Glu、 His. Ser、 Thr、 Asn和 Gln。 A的实例包括 KD、 KK等。 B是由疏水性氨基酸残基组成的疏水性尾部，所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自 Leu、Gly、Ala、 Val、Ile、Phe和 Trp。B的实例包括 LLLLLL(L6) 或 GAVIL等。本发明的类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸比例高于亲水性氨基酸的比例，在所述类表面活性剂短肽中的疏水性氨基酸比例可以是 55-95%, 60-95%, 65-95%, 70-95%, 75-95%, 80-95%, 85-95%, 90-95%。在一些实施方案中，所述类表面活性剂短肽具有 8个氨基酸残基，其中疏水性氨基酸的比例是 75%。适用于本发明的自聚集肽的类表面活性剂短肽的具体实例包括氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO: 5的 L6KD、 L6K2或 DKL6。

此外，巳有报道，一些蛋白结构域，例如 β淀粉样肽、 VP1、 MalE31、 CBD_d。_s等，也能够诱导融合蛋白形成聚集体，本发明预期这样的结构域也可用作本发明 "自聚集肽"。然而这些结构域的结构相对复杂并且其诱导聚集的机理伋不清楚 (Mitraki, 2010)。在本发明中优选使用结构相对简单以及长度较短的两亲性自组装短肽。

本发明人之前的研究已经发现，具有诱导活性聚集体形成的能力的自聚集肽 (如两亲性自组装肽与目的多肽作为融合蛋白在宿主细胞内表达后，表达的融合蛋白可形成不可溶的聚集体。聚集体的形成可以避免胞内蛋白酶对融合蛋白的降解，因此提高目的多牍的产量。细胞裂解后，可以简单地通过离心沉淀或过滤等方法从细胞裂解物中收集不溶的聚集体，除去可溶的杂质，实现对融合蛋白的初步纯化。之后，通过切割位于自聚集牍部分以及目的多肽之间的接头中的切割位点，使得可溶的包含目的多肽的部分从不可溶部分 (沉淀)释放出来，分布于上清液中，再次简单地通过离心沉淀或过滤等方法即可去除不溶的杂质，收获可溶的目的多肽。通过这样的基于自聚集駄的方法生产多肽 (示意图见于图 1A)可以筒化分离纯化步骤，避免使用昂贵的纯化柱，显著地降低生产成本。

本领域中已知促溶肽标签可以提高融合蛋白的可溶性，这与自聚集駄倾向于使融合蛋白不可溶的作用相反。然而，本发明人令人惊奇地发现，当包含促溶肽标签部分、目的多肽部分和自聚集牍部分的融合蛋白在宿主细胞内表达后仍能形成不溶聚集体，仍然可以通过上述步骤容易地进行分离纯化 (示意图见于图 1B)，而促溶肽标签可以进一步促进目的多牍的正确折叠，还可以在去除自聚集肽部分后保持或提高目的多肽的可溶性。无意于受到任何理论的限制，这种结果据推测是由于促溶肽标签和自聚集駄能够形成某种功能上的平衡。此外，本发明人还发现促溶肽标签的使用还可以改善融合蛋白的表达，可用于生产某些原来难以重组生产的多肽。

根据本发明，目的多肽通过第一接头连接于所述自聚集駄部分，其中所述第一接头包含第一切割位点。如本文所用， "切割位点"包括实现切割所需的序列，如用于酶法切割的蛋白醇识别序列、用于自切割的内含馱序列等。

本发明的用于将可溶的包含目的多肽的部分从不可溶部分 (沉淀)释放出来的第一切割位点包括可以化学切割、酶法切割或自切割的切割位点，或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。本发明中优选的第一切割位点可以进行自切割，例如，其包含可自切割的内含肽的氨基酸序列。这是因为基于内含肽的切割方法不需要外加酶或使用如化学法中所用的溴化氢等有害物质，而仅仅需要改变聚集体所处的缓冲环境就能筒单地诱导切割 (Wu et al.， 1998; TELENTI et al, 1997)。本领域已知多种自切割内含駄，例如 NEB公司的一系列具有不同自切割特性的内含肽。在一个具体的实施方案中，所述内含肽为序列示于 SEQ ID NO:6 的 Mxe GyrA，通过在缓冲体系中加入合适量的二硫苏糖醇就可诱导该内含肽在其羧基端的自切本发明的融合蛋白中目的蛋白可以与促溶肽标签直接连接，或者可以通过第二接头与促溶牍标签连接。如果需要获得不带标签的目的多肽，可以在第二接头中再引入第二切割位点。在进行第一次切割步骤使得目的多駄与自聚集肽部分分离后，通过切割第二切割位点，进一步将目的多駄和促溶肽标签分离，再通过进一步的分离纯化 (如通过 HPLC)，获得不带标签的目的多肽。因此，本发明的产生和纯化目的多駄的方法还可以包括： (d) 如果存在第二切割位点，则通过切割第二切割位点使目的多肽和促溶肽标签分离；（e) 去除所述促溶駄标签，获得纯化的目的多駄。

本发明的于将目的多駄和促溶肽标签分离的第二可切割位点包括可以化学切割、酶法切割或自切割的切割位点，或本领域技术人员已知的其它任何切割位点。在一些实施方案中，所述第二切割位点为酶法切割位点。在一些具体的实施方式中，所述酶法切割位点包含肠激酶识别位点 (氨基酸序列： DDDDK， SEQ ID NO:7) o

应当理解，所述第二切割位点应具有与第一切割位点不同的切割条件, 使得在切割第一切割位点时第二切割位点不被切割，目的蛋白仍保持与促溶肽标签相连接。这可以通过多种方式来实现，非限制性实例包括，例如，第一切割位点为自切割而第二切割位点通过酶法切割，或者第一和第二切割位点均为酶法切割但是分别通过不同的酶来切割等等。

本领域技术人员能够理解，为了减少本发明的融合蛋白中不同部分之间的相互干扰，可以通过间隔物连接融合蛋白的不同部分。如本文所用， "间隔物"是指具有一定长度的由低疏水性和低电荷效应的氨基酸组成的多肽，其用于融合蛋白可以使所连接的各部分充分展开，互不干扰地充分折叠成各自的天然构象。因此，所述第一接头和 /或第二接头除切割位点外还可以额外包含间隔物。在一些实施方案中，如无需除去促溶肽标签，本发明的融合蛋白中的第二接头可以仅包含间隔物而不含切割位点。

本领域常用的此类间隔物包括例如，富含甘氨酸 (G)和丝氨酸 (S)的柔性的 GS型间隔物；富含脯氨酸 (P)和苏氨酸 0 的刚性的 PT型间隔物。由于 PT型间隔物通常相对于 GS型间隔物具有更好的蛋白醸耐受性，因而在本发明中优选使用 PT型间隔物。在一些具体实施方案中，本发明所使用的间隔物是序歹为 PTPPTTPTPPTTPTPT(SEQ ID NO:8)的 PT型间隔物。

在多駄类药物的生产中，常常需要重组产生的多肽与目的多肽具有一致的序列，即两端不具有额外的氨基酸残基。在本发明中，这可以通过选择合适的第一和第二切割位点及它们与的多肽的连接方式来实现。本领域技术人员清楚如何根据切割位点的特性来进行这样的选择。例如，在一个具体实施方案中，可以使第一切割位点的 Mxe GyrA与所述目的多駄的 C 端直接连接，使得其与所述目的多駄之间没有额外的氨基酸残基。由于 Mxe GyrA直接在其 N端进行切割，这样经切割产生的目的多肽 C端没有多余的氨基酸残基。在另一个具体实施方案中，可以使第二切割位点的肠激酶识别位点与所述目的多駄的 N端直接连接，使得其与所述目的多肽之间没有额外的氨基酸残基。由于肠激酶直接在其识别位点 C端进行切割，这样最后获得的目的多肽 N端没有多余的氨基酸残基。如果要获得两端均不含任何多余氨基酸残基的目的多牍，则可通过例如，使第一切割位点的 Mxe GyrA与所述目的多駄的 C端直接连接并且使第二切割位点的肠激酶识另 ί]位点与所述目的多肽的 Ν端直接连接来实现。

如上所述，本发明也涉及多核苷酸，其包含编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。如本文所用， "多核苷酸"是指多个核苷酸通过 3'-5'-憐酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞 (如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善融合蛋白的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。

如上所述，本发明也涉及包含本发明上述的多核昔酸的表达构建俥。在本发明的表达构建体中，编码所述融合蛋白的多核苷酸的序列与表达控制序列可操纵地连接以进行希望的转录及最终在宿主细胞中产生所述融合蛋白。合适的表达控制序列包括但不限于启动子、增强子、核糖体作用位点如核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录剪接序列、转录终止序列和稳定 mRNA的序列等等。

用于本发明的表达构建体的载体包括那些在宿主细胞中自主复制的载体，如质粒载体；还包括能够整合到宿主细胞 DNA中并和宿主细胞 DNA 一起复制的载体。可商购获得许多适于本发明的载体。在一个具体实施方案中，本发明的表达构建体衍生自 Novagen公司的 pET30a(+)。

本发明还涉及一种宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸或以本发明的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达本发明的融合蛋白。用于表达本发明融合蛋白的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。示例性的原核宿主包括埃希氏菌属 ( c/ien'di i 、芽孢杆菌属 ( β«7ΖΜ 、沙门氏菌属 (5^wi。《e〃a)以及假单胞菌属 ( ^£?Μί/。《ί。《ίΜ)禾口链霉菌属 (Sireptomyci^)的细菌。在优选的实施方案中，宿主细胞是埃希氏菌属细胞，优选是大肠杆菌。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的宿主细胞为大肠杆菌 BL21 (DE3)菌株细胞 (Novagen)。

可以通过许多已熟知的技术之一将本发明的重组表达构建体导入宿主细胞，这样的技术包括但不限于：热激转化，电穿孔， DEAE-葡聚糖转染，显微注射，脂质体接介导的转染，憐酸钙沉淀，原生质融合，微粒轰击，病毒转化及类似技术。

本发明上面描述的用于生产和纯化目的多肽的方法中，通过形成不溶聚集钵保护目的多肽，解决了重组表达中长多肽在胞内易被降解的问题；通过促溶肽标签的使 ffi增强了目的多肽的可溶性，改善了目的多肽的表达；融合蛋白的自聚集和自切割使得可以实现简单的分离纯化操作，避免了昂贵的柱分离。因此，本发明的方法是一种低成本、简便、高效的适于工业应用的多肽产生和纯化方法。实施例

下面将通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所描述的实施例范围中。实施例 1：构建 ELK16融合表达载体

本申请实施例中所使用的表达载体 pET~LipA- Inteiri- ELK16 和 pET-Trx-EK-Intein-ELKl 6的构建过程如下：

首先构建 ρΕΤ ϋρΑ- lutein- ELK16载体，该载体结构如图 1C所示，其中 "Target peptide"序列为枯草芽孢杆菌脂肪酶 A (LipA)的序列。选择商用质粒 Novogen公司的 pET^OaC^载体，用在线工具 DNAworks 设什 PT型连接肽和 ELK16的核苷酸序列，利用重叠 PCR的方法将来自枯草芽抱杆菌脂肪酶 A的 LipA多核苷酸和带 PT型间隔物的 ELK16多核苷酸按 LipA基因在 N端的顺序合成出来，再将此段多核苷酸插入 pET^30a(+) 质粒的 Ndel和 Xhol位点间，形成 pET^30a(卜)- LipA- ELK16。

使用 Tiangen 公司的高纯度质粒小提试剂盒提取 pET~30a(H LipA-ELKl 6质粒和 New England Biolab (NEB)公司的 pTWINl 质粒，分别利用如下两套正向引物和反向引物，按照常规方法进行 PCR扩增获得 LipA多核苷酸片段和 Mxe GyrA内含駄多核酸片段：

第一套引物：上游引物 5'- GCGATACATATGCACCATCACCATCA- 3'

(SEQ ID NO:9, 带下划线誠基为限制性内切酶 Nde I识别位点)和下游引物

ID NO: 10;

第二套引物：上游引物

ID NO: 11 ，和下游弓 i 物

5'-ATTTi: AAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3^! (SEQ ID NO: 12，带下划线碱基为限制性内切酶 Hind III识别位点)。

PCR反应使用 Tiangen公司的 pfo聚合酶， PCR反应条件为：先 94°C 2min; 然后 94°C Imin, 57°C lmin， 72 °C 40sec，共 30个循环；最后 72 °C lOmiiio 反应结束后，对 PCR扩增产物进行 1%琼)！糖凝胶电泳检测，结果 PCR扩增出正确大小的条带，与预期结果相符。之后将两个片段进行凝胶分离回收，再以两个片段作为模板，进行重叠 PCR反应：先在不加入引物的情况下 94 °C 2min; 然后 94 °C Imin, 70 °C Imiii, 72 °C 80sec，共 10 个循环；最后 72 °C 10min。再进行 94 °C 2min ; 然后加入引物 5'-GCGATACATATGCACCATCACCATCA~3'(SEQ ID NO: 13) 和 5LATTTTAAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3'(SEQ ID NO: 14)， PCR程序 94 °C Imin, 57 °C Imin, 72 °C 40sec，共 17个循环；最后 72°C 10min。反应结束后，对 PCR扩增产物进行 1 琼脂糖凝胶电泳检测，结果 PCR扩增出与预期相符的正确条带。将重叠 PCR产物用限制性内切醸 Nde I 和 Hind III 进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒 pET-30a(+)-LipA-EI,K16 进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌 BL21(DE3XNovageii)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有 50 g/mL卡那霉素的 LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的 pE iipA- intein- ELK16序列正确。

再构建 pET rx-EK- Intein- ELK16载体，该载体结构如图 ID所示。先用表 1 中引物 Trx- For和 ΊΥχ- Rev，以大肠 F菌菌株 BL21(DE3)的基因组 UNA为模板，扩增编码 Trx蛋白的基因 trxA，用 Nde I和 Spe I限制性内切酶双酶切后插入同样处理后的 pET ipA- Intein- ELK16 载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌 BL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有 50 g/mL卡那霉素的 LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明获得正确的 pE Trx- Intein- ELK16。

之后用表 1 中弓 i 物 Trx- EK- For 和 Trx- EK-Rev ，以 pE LipA- Intein- ELK16为模板，扩增带 EK位点的 intein基因，并用 Bgl II 和 Hind III限制性内切酶双酶切后插入同样处理后的 pET-Trx- intein- ELK16 质粒载体进行连接，将连接产物转化到大肠杼菌 BL2i(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有 50 μ₈/πι£卡那霉素的 LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的 pET-Trx-EK- intein- ELK16 序列正确。表 1

引物碱基序列 SEQ ID NO 说明

Trx- For 5'-AGTTACATATGAGCGATAAAATTATTC-3' 15 Nde I

5'-TCACGACTAGTGCATCTCCCGTGATGCACATTCGC 16 Spe I,

Trx-Rev ATGATATCAGAACCTGAACCTGAACCAGATCTCGCC EcoR V,

AGGTTAGCGTCGAGGAAC-3' Bgl 11

5'-AGTCAAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGG 17

Trx-EK-For Bgl 11

ATATCATGCGAATGTGCATCACGGGAGATGC-3'

Trx-EK-Rev 5 '-GTCGGAAGCTTAGCGTGGCTGACGAACCCGTTC-3 ' 18 Hind III 实施例 2: 构建七种医药用多 jft的 ELK16融合表达构建体

选定了姨高血糖素样肽 GLP- 1、 B型脑利钠駄 BNP、促姨岛素分泌 jft Ex- 4、趋化因子 CCL5、基质细胞衍生因子 SDF- ia、促生长因子 IGF- 1α和肥牌荷尔蒙 Lep作为目的多駄通过本发明的方法进行重组产生和纯化。所述多肽信息见下表 2: 表 2

目标在大肠杆菌中的表达氨基酸序列优化的核苷酸序列长度

多肽 (SEQ ID NO) (SEQ ID NO)

19 20

GLP- 1 31 aa 作为融合蛋白可溶，否则将降解（Wu等，

201 Ϊ )

作为融合蛋白可溶，否则将降解 (Sim等， 2ί 22

BNP 32 aa

2005)

作为融合蛋白可溶，否 ^将降解 23 24

Ex-4 39 aa

(Bosse-Doenecke等， 2008:)

CCL-5 66 aa 包涵体 (Proudfoot等， 1995) 25 26

SDF- ! a 67 aa 包涵体 (Cho等， 2008) 28

IGF- l a 70 aa 包涵体 (Zhang等， 2010) 29 30

Lep 346 aa 包涵体 (Gertler等， 1998) 31 32

对编码以上目的多肽的核苷酸序列进行密码子优化 (见表 2)，以便其能更好地在大肠杆菌中表达，并采用化学合成法获得相应编码序列。

下面以 GLP- 1为例说明七种医药用多肽的 ELK16融合表达构建体的构建方法。

扩增 GLP 1所用的引物序列如下表 3所示。利用表 3中的引物 GLP1 F 和 GLP1 R, 通过 PCR扩增编码 GLP- 1的编码多核苷酸，并在用 Nde I和 Spe I双酶切后将其插入如图 1 C所示的表达载体 pET- LipA Intdn- ELK16同样双醸切后的 Nde I与内含肽 (Intein)编码序列内部靠近 5'端的 Spe I位点之间 (距离 5'端 17个碱基的位置)，同保持内含肽 (Intein)编码序列 5'端的序列不变；另一方面，利用表 3中的引物 Trx- GLP1- F和 GLP1- R扩增目的多台，并将其插入双酶切后 pET-Trx- EK- Intein- ELK16的 Bgl II与 Spe I位点之间，同时在 Bgl II 位点与目的多肽之间引入肠激酶 (EK)切割位点 DDDDK(Asp- Asp- Asp- Asp- Lys)。

引物碱基序列 SEQ ID NO 说明

GLP 1 -F S'-AGCATCATATGCATGCAGAAGGCACCTTT-B' 33 Nde I

S'-AGTCAAGATCTGGGTACCGACGACGACGACA 34 Trx- GLPl -F Bgl II

AG CATGCAGAAGGCACCTTT-3'

S'-AGCATACTAGTGCATCTCCCGTGATGCAGATAT 35

GLP1 - Sep I

CACCACGACCTTTAACCAG-3' 实施例 3 : 七种医药用多駄的表达和初步纯化

通过氯化钙法化将实施例 2 中获得的融合表达构建体分别转化入大肠杆菌 BL21 (DE3)感受态细胞，通过菌落 PCR和质粒测序鉴定得到阳性克隆。

将阳性克隆接入 LB培养基中，用 0.2 mM IPTG分别在 23 °C、 30°C、 37°C诱导表达 6 ho收获菌体，并测量菌浓度 OD₆。₍₎ (以下将 1 mL的 OD₆«。为 1的细胞量称为 1 OD)。

将菌体用裂解缓冲液 (2.4 g 的 Tris、 29.22 g 的 NaCl、 0,37 g 的 Na₂ EDTA-2H₂0溶解于 800 mL水中，调 pH至 8.2，加水定容至 1 L)重悬至 20 OD/mL, 超声破碎。在 4°C， 10000 rpm的条件 T离心 i0 min，分别收集上清和沉淀部分。将沉淀部分用添加了 0.5 %的表面活性剂 Triton X- 100的裂解缓冲液洗涤 i次 (去除细胞膜碎片等杂质)，再用裂解缓冲液洗涤 2次，使得 Triton X- 100基本去除。

将洗涤后的沉淀部分用含有 40 mM DTT的内含駄切割缓冲液 (0.62 g二硫苏糖醇溶解于 100 mL裂解缓冲液中，置于- 20°C待用)充分重悬，每 20 OD 细胞破碎后的裂解沉淀部分 ffi 1 mL内含肽切割缓冲液重悬 (20 OD/mL) ,在 4 Ό下放置 24 h，使得内含牍充分进行自切割。

最后，通过离心分离上清和沉淀部分，沉淀部分用与上一重悬步骤相同的体积的裂解缓冲液重悬。

将通过以上操作所获得的聚集钵、内含肽介导的自切割后的沉淀以及内含駄介导的自切割后释放的上清用 4- 12% Bis Tris SDS-PAGE 或 12% Tris-Glysine SDS- PAGE分析其蛋白成分，结果如图 2所示。其中图 2A为不带 T«标签的目的多肽的表达与纯化结果；图 2B为带 T c标签的目的多駄的表达与纯化结果。泳道 a: 菌体破碎后沉淀部分；泳道 b : 融合蛋白经过内含駄介导的自切割并离心后沉淀部分；泳道 c : 融合蛋白经过内含肽介导的自切割后的离心后上清部分；泳道 p : 经 HPLC精制纯化后的样品；泳道 1-3 :蛋白定量标准品 (Std)，其中较大的条带为牛血清白蛋白 BSA(67 kD) , 上样量依次为 3 μ₈、 1.5 μ , 0,75 _tag;其中较小的条带为抑菌肽 Aprotinin(6,5 kD) , 上样量依次为〗,5 g、 0.75 μ₈, 0,3 μ_{8 ;} 泳道 4- 7 : 只含有牛血清蛋白 BSA的蛋白定量标准品，上样量依次为 6 μ₈、 3 μ₈、 1 .5 和 0.75 g。融合蛋白、切割后的 Intein- ELK16 以及目的多) ¾的位置由图例标出。蛋白分子量标准 Ml (14〜94 kD)和 M2(3.3〜20.1 kD)各个条带对应的分子量列于蛋白胶图片左侧和右侧。

依照蛋白定量标准品，应用 Bio- Rad公司的 Quantity ONE凝胶定量分析软件对标条带进行光密度分析，可什算得出融合蛋白形成的聚集体产量、在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的目的多肽产量、以及的多駄在上清中的纯度，结果如表 4所示。

a蛋白聚集体产量和 ^b内含肽介导的自切割后的目的多 ift产量 (以在菌浓度 00_6∞为 2时，每升 LB培养基中的大肠杆菌细胞产生 2.66 mg细胞湿重 ΐί·算)； ^c 内含肽介导的自切割效率 = 00%><(切割前聚集体表达量—切割后聚集体剰余量 )/切割前聚集体产量； ^d回收率 =100%χ目的多肽实际产量 /蛋白聚集体在完全切割的情况下 ¾生产目的多肽的理论产量； ^e 目的多駄在内含駄介导的自切割后位于不可溶组分中。结果

对于未添加 Trx标签的多肽：

(1) 七类中长多肽有五种目的多肽，分别为 GLP1、 CCL5、 SDF- 1α、 IGF- 1 与 Lep，可在与 Intein ELK16融合表达后形成大量聚集体，表达量为 28.4-44.6 g/mg细胞湿重。此外，目的多肽 BNP和 Ex 4在图 2中未给出结果，原因是在菌体破碎后的上清和沉淀中均未见外源蛋白表达。 (2) 目的多肽 GLP- 1可在内含肽介导的切割后直接释放到上清中，回收率约为 46.8 %，产量为 1 .8 g/mg 细胞湿重。因此，上清中的目的多駄 GLP- 1 直接使用反相 HPLC精制纯化，如图 2所示，终产物纯度达 95%以上，终产量约为 0.8 g/mg细胞湿重。

(3) 虽然 IGFl o SDF- 1 α、 CCL- 5和 Leptin与 lutein- ELK16融合表达大部分分布在聚集体中，但经内含駄介导的自切割后在不可溶沉淀中。对于与 Trx融合表达的目的多肽：

(1)六种目标駄段： GLP-1 , Ex- 4、 BNP、 CCL5、 SDF- 1α与 IGF- 1α与 Trx 标签及 lutein- ELKi 6 融合表达后均可大量形成聚集体，表达量为 11.4-57,8 g/mg细胞湿重；且在内含肽介导的自切割之后可释放到上清之中，产量为 3.4~13.4 g/mg细胞湿重，纯度为 63.0%~79 7%。目的多肽 Lep 在图中未给出结果，原因是与 Trx标签融合后的 Lep在内含駄介导的自切割后仍停留在不溶沉淀中，可考虑更换促溶肽标签进行 Lep的表达纯化。

(2) 在对可溶性的改进方面，其中 GLP- i、 BNP、 Ex4和 IGF- l ot在内含肽介导的自切割之后释放到上清中的比例较高，回收率为 46 2~73.1%。然而， CCL5和 SDF- l ot经内含肽介导的自切割之后释放到上清中的比例较低，使得肽段的回收率分别降至 26.5%和 19.3%。也可考虑更换促溶肽标签提高这两种多肽经内含牍介导的自切割之后在上清中的比例。实施例 4: 通过肠激酶切割进一步分离纯化目的多肽

对实施例 3中获得的与 Trx融合表达的目的多肽 GLP-1、 BNP、 Ex- 4、 CCL5、 SDF- 1 a与 IGF- 1 α进行进一步的分离纯化。

首先，使用肠激酶 (Enterokinase, New England BioLabs, 货号 P8070S) 对上述几种经内含肽介导的自切割之后能释放到上清中的融合蛋白 Trx-駄进行切割，具体的操作步骤为：

使用截留分子量为 3K 的超滤器通过超滤将内含肽介导的自切割后的上清中的内含駄切割缓冲液置换为肠激酶切割缓冲液 (20 mM Tris-IICl, 50 mM aCl, 2 mM CaC12 , ρΐϊ 8.0)；在含有目标融合蛋白的溶液中加入酶量为 0.001 % (w/w)的肠激酶（例如，对于 1 mL目标融合蛋白含量为 1 mg/mL 的溶液，加入 1 0 ng肠激酶)，在 23 °C恒温反应 1 6 h; 将经肠激酶切割所得样品保存在- 70Ό条件下等待后续纯化操作。

接下来，对于肠激酶切割后生成的 Trx标签与目的多肽，可进一步通过反相 HPLC对其进行纯化，详细过程如下：

配置流动相 100% ¾0(含 0.1% TFA)，与流动相 B: 80% 乙腈 (含 0.12% TFA);在流速为 1 mL/min的条件下，使用含 5% B的流动相平衡 HPLC 色谱柱，所使用的为反相 C18色谱柱 Diamonsif，货号 99603); 采用梯度洗脱，使在 0~60 min内流动相组成由 5%上升至 80% B, 同时检测波长为 215 nm ¾键特征吸收波长>与 280 nm(氨基酸 1>τ、 Ti 与 Phe的共轭双键吸收波长)的吸光度曲线；使用高效液相色谱系统自动收集器采集洗脱过程中出现的吸收峰对应级分；将吸收峰对应级分分装、冻干并保存于 - 20°C条件下，水将冻干样品重悬后 j¾ SDS-PAGE检测吸收峰对应的级分，并进一步进行质谱检测。以对 Trx- GLPi进行肠激酶切割后的的样品为例，其通过反相 HPLC分离的吸收峰图谱如图 3所示。

将通过以上操作所获得的经肠激酶切割前后的样品以及经反相 HPLC 纯化后的产物用 4-12% Bis- Tris SDS- PAGE分析其蛋白成分，结果如图 4所示。其中泳道 c: 肠激酶切割前样品；泳道 d: 肠激酶切割后的样品；泳道 Trx-CCL5经肠激酶切割后的沉淀；泳道 p_; 经反相 HPLC精制纯化后样品；泳道 1- 3 :蛋白定量标准品 (Std)，其中较大的条带为牛血清蛋白 BSA(67 kD) , 上样量依次为 3 tig, 1。5 μ₈、 0.75 _§; 其中较小的条带为抑菌牍 Aprotinm(6.5 kD), 上样量依次为 1.5 μ§、 0.75 0.3 go 黑色箭头指示肠激酶切割后产生的 ΤΓ 标签，蓝色箭头指示肠激酶切割后产生的目的多肽。蛋白分子量标准 Ml(14〜66 kD)和 M2(3，3〜20.1 kD)各个条带对应的分子量分别列于蛋白胶图片左侧和右侧。

依照蛋白定量标准品，应用 Bio Rad Quantity ONE对目标条带进行光密度分析，进一步计算得出样品中的目的多肽产量以及纯度。结果

(1) 在以上切割条件下，肠激酶对于 Trx- GLP1、 Trx- BNP、 Trx- Ex4、 Trx- SDF- la以及 Trx- CCL5的切割效率接近 100%, i均产生了条带位置正确的 TlX 标签与的多駄，证明对于以上目的多肽，使用肠激酶可以高效地特异性切割。 (2) 对于结果中未显示的 TYx- IGF 1οι，经检测发现切割后的条带位置不正确，且推测为在 IGF- 1α序列中发生了 ^特异性切割，因此 IGF- 1 α不适合通过肠激酶切割进行分离纯化。

(3) 经肠激醸切割去除 Trx标签后， CCL5样品中出现大量不可溶沉淀，将离心后的上清与沉淀经 SDS- PAGE检测，发现 CCL5完全分布于不可溶组分中，而 Ι χ标签完全分布于可溶组分中。说明 CCL5在与 Trx融合表达后虽然可溶性得到了提高，但是并未完全正确折叠，故在去除促溶肽标签 Trx后形成沉淀。可考虑更换促溶駄标签进行 CCL5的表达纯化。

(4) 去除 Trx标签的 GLP1、 BNP、 Ex4与 SDF- lot可经反相 HPLC进行有效的回收和纯化，终产物纯度达 95%以上，终产量约为 0.3- L8 g/mg细胞湿重，具体结果参见下表 5 :

³经过 HPLC精制纯化后的目的多駄的产量 (每升 LB培养基中的大涵杆菌细胞产生 2.66士 0.99 mg细胞湿重 i†'算，采用 Pierce® bicinchoninic acid (BCA) 试剂盒进行定量)。 ^b 括号中列出了经 HPLC纯化之后的最终回收率，由目的多肽的终产量与表 3中聚集体表达量之比计算得到上述实施例的结果表明，促溶肽标签可与自聚集肽组合进行多肽产生和纯化，即使给目的多肽加入促溶肽标签，自聚集肽仍能介导融合蛋白形成不溶聚集体，适于通过离心沉淀或过滤等方法进行快速分离纯化。并且加入促溶肽标签以改善目的多肽的表达以及提高目的多肽的溶解性。实施例 5: 利用不同促溶駄标签和自聚集駄的组合来产生和纯化多肽促溶肽标签

除了 Trx外，还选择了包括下表中的另外 5种常用促溶牍标签用于与自聚集) ¾组合进行多肽产生和纯化。

根据上面实施例中描述的方法，分别构建了融合蛋白 SUMO-胸腺素 (Thymosm)/BNP-intein-ELKl 6 、 GST-GLP 1 -intein-ELKl 6 、 DsbC- GLPi- intein- ELKi6、 GBi- GLPi- intein- ELK16、 Z-GLP1 -intein-ELKl 6 的表达载体，并根据上面描述的方法进行了重组表达和基于自聚集肽的分离纯化。 SDS- PAGE检测结果示于图 5- 9，其中泳道 S: 细胞裂解物的可溶部分；泳道 ir 细胞裂解物的不可溶部分；泳道 c₅s_; 经切割的融合蛋白的可溶部分；泳道 c n: 经切割的融合蛋白的不可溶部分。表达和纯化结果总结于下表 7。

结果表明，多种促溶牍标签均与自聚集肽组合进行多肽产生和纯化。自聚集) ¾ 18A和 L6KD

还对另外两种与 ELK16具育类似功能的自聚集肽〗 8A和 L6KD进行了测试。根据上面实施例中描述的方法，分别构建了融合蛋白 Trx- GLPl- intein- 18A、 Trx- GLPl- intein- L6KD的表达载体，并根据上面描述的方法进行了重组表达和基于自聚集肽的分离纯化。 SDS- PAGE 检测结果示于图〗0，其中泳道 s: 细胞裂解物的可溶部分；泳道 in: 细胞裂解物的不可溶部分；泳道 c,s: 经切割的融合蛋白的可溶部分；泳道 Cjf 经切割的融合蛋白的不可溶部分。结果表明自聚集駄 18A和 L6KD同样适用于本发明的方法。参考文献

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Claims

1. 融合蛋白，其包含促溶) ¾标签部分、自聚集) ¾部分以及目的多肽部分，其中所述目的多駄部分位于所述促溶肽标签部分和所述自聚集肽部分之间，并且所述目的多肽部分通过第一接头连接于所述自聚集肽部分，其中所述第一接头包含第一切割位点，所述融合蛋白在宿主细胞内表达后可又

通过所述自聚集肽部分形成活性聚集体。

2. 权利要求 1的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分包含两亲性自组装短肽。

3. 权利要求 2的融合蛋白，其中所述两亲性自组装短牍选自两亲性 β 折叠短肽、两亲性 α螺旋短肽和类表面活性剂短肽。

4. 权利要求 3的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分包括 1个所述两亲性 β折叠短肽。书

5. 权利要求 3的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分包括串联重复的两个或更多个所述两亲性 β折叠短肽。

6. 权利要求 4或 5的融合蛋白，其中所述两亲性 β折叠短肽的长度为 4- 30个氨基酸残基。

7. 权利要求 4-6任一项的融合蛋白，其中所述两亲性 β折叠短肽的疏水性氨基酸残基含量为 40% 80%。

8. 权利要求 7的融合蛋白，其中所述两亲性 β折叠短肽的氨基酸序列示于 SEQ ID ΝΟ: 1。

9. 权利要求 3的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分包括 1个所述两亲性 α螺旋短肽。

10. 权利要求 3的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分包括串联重复的两个或更多个所述两亲性 α螺旋短肽。

11. 权利要求 9或 10的融合蛋白，其中所述两亲性 α螺旋短肽的长度为 4-30个氨基酸残基。

12. 权利要求 941任一项的融合蛋白，其中所述两亲性 α螺旋短肽的疏水性氨基酸残基含量为 40%- 80%。

13. 权利要求 12的融合蛋白，其中所述两亲性 α螺旋短肽的氨基酸序列示于 SEQ ID NO:2 o

14. 权利要求 3的融合蛋白，其中所述类表面活性剂短肽具有 7-30个氨基酸残基，其从 N端到 C端具有以下通式表示的氨基酸序列：

A-B或 B-A

其中 A是由亲水性氨基酸残基组成的肽，所述亲水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自 Lys、 Asp. Arg、 Glu、 His. Ser、 Thr、 Asn和 Gin;

B 是由疏水性氨基酸残基组成的肽，所述疏水性氨基酸残基可以是相同的或不同的，且选自 Leu、 Gly、 Ala. Val、 Ile、 Phe和 Tip;

A与 B通过肽键连接；并且

其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是 55%-95%。

15. 权利要求 14的融合蛋白，其中所述类表面活性剂短肽具有 8个氨基酸残基，其中在所述类表面活性剂短肽中疏水性氨基酸残基的比例是 75%。

16. 权利要求 15的融合蛋白，其中所述类表面活性剂短肽的氨基酸序列示于 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:5。

17. 权利要求 146中任一项的融合蛋白，其中所述自聚集肽部分位于所述融合蛋白的 C端。

18. 权利要求 1-17 中任一项的融合蛋白，其中所述促溶肽标签选自 NusA、 GST, Trx、 SUMO, DsbC、 Z八 GB1 、 MBP禾 Π T7PK：。

19. 权利要求 148 中任一项的融合蛋白，其中所述第一切割位点选自化学切割位点、醇法切割位点和自切割位点。

20. 权利要求 19的融合蛋白，其中所述自切割位点为内含肽。

21. 权利要求 20的融合蛋白，其中所述内含肽为序列示于 SEQ ID NO:6 的 Mxe GyrA

22. 权利要求 21的融合蛋白，其中所述 Mxe GyrA直接连接于所述目的多肽的 C端。

23. 权利要求 1-22 中任一项的融合蛋白，其中所述第一接头还包含间

24. 权利要求 1-23 中任一项的融合蛋白，其中所述的多肽通过第

25. 权利要求 24的融合蛋白，其中所述第二接头包含间隔物。

26. 权利要求 24的融合蛋白，其中所述第二接头包含第二切割位点，其中第二切割位点的切割条件不同于所述第一切割位点的切割条件。

27. 权利要求 26的融合蛋白，所述第二切割位点选自第二化学切割位点、第二酶法切割位点和第二自切割位点。

28. 权利要求 27的融合蛋白，其中所述第二酶法切割位点包含 SEQ ID NO:7所示的肠激酶识别序列。

29. 权利要求 28的融合蛋白，其中所述肠激酶识别序列直接连接于所述目的多肽的 N端。

30. 权利要求 26- 29中任一项的融合蛋白，其中所述第二接头还包括间

31. 权利要求 1-30中任一项的融合蛋白，其中所述目的多肽为长度为 30-100个氨基酸残基的多肽。

32. 多核苷酸，其包含编码权利要求 1-31 中任一项的融合蛋白的核苷酸序列或其互补序列。

33. 表达构建体，其包含权利要求 32的多核苷酸。

34. 宿主细胞，其包含权利要求 32的多核苷酸或以权利要求 33的表达构建体转化，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。

35. 产生和纯化目的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 培养权利要求 34的宿主细胞，从而表达所述融合蛋白；

(b) 裂解所述宿主细胞，然后去除细胞裂解物的可溶部分，回收不溶部分；

(c) 通过切割第一切割位点所述不溶部分释放可溶的带有促溶馱标签的目的多肽；和

(d) 去除步骤 (c)中的不溶部分，回收含有所述目的多肽的可溶部分。

36. 权利要求 35的方法，还包括：

(e) 如果存在第二切割位点，则通过切割第二切割位点使所述目的多牍和所述促溶肽标签分离；

(f 去除所述促溶肽标签，获得纯化的目的多駄。