CN114317577A

CN114317577A - 一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用

Info

Publication number: CN114317577A
Application number: CN202011047143.XA
Authority: CN
Inventors: 文良柱; 方宏清; 韦炎龙; 窦俊
Original assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Wanxin Pharmaceutical Technology Suzhou Co ltd; Jiangsu Wanbang Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Wanbang Biopharmaceutical Group Co ltd; Wanxin Pharmaceutical Technology Suzhou Co ltd; Jiangsu Wanbang Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用。本发明人筛选不同来源的蛋白质二硫键异构酶，并将其与巯基氧化酶构建到同一个启动子控制下。通过添加氮末端标签策略优化这两种蛋白的表达，构建可溶性表达系统。在大肠杆菌中，该系统与目的蛋白重组猪羧肽酶原B共表达后，可实现猪羧肽酶原B的可溶性表达，大大减少了包涵体的形成。该可溶性表达系统也可用于其它目的蛋白，例如胰蛋白酶原的可溶性表达，具有促进目的蛋白可溶性表达的通用性。本发明内容在重组蛋白生产和新酶原件筛选等领域具有应用前景。

Description

一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用

技术领域

本发明属于重组蛋白表达领域，更具体地，本发明涉及一种可溶性表达系统，及其构建和在包括重组猪羧肽酶原B在内的蛋白可溶性表达上的应用。

背景技术

蛋白酶在药物生产、科学研究领域具有重要作用，羧肽酶B(CarboxypeptidasesB，CPB)是一种含金属锌的蛋白酶，可水解蛋白质或多肽类底物C端的精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)，在药物生产、科学研究以及急性胰腺炎的诊断等方面具有重要作用(Francesc XAvilés,Josep Vendrell,Alicia Guasch,Miquel Coll,Robert Huber,Advances inmetallo-procarboxypeptidases.European Journal of Biochemistry,1993,211(3):381–389；Lihui Deng,Lei Wang,Fengjiao Yong,Junjie Xiong,Tao Jin,Daniel De LaIglesia-Garcia,Shameena Bharucha,Kiran Altaf,Wei Huang,Qing Xia,Prediction ofthe severity of acute pancreatitis on admission by carboxypeptidase-Bactivation peptide:A systematic review and meta-analysis.ClinicalBiochemistry,2015,48(10-11):740–746)。特别是在胰岛素原转化为胰岛素的过程中，CPB是不可缺少的工具酶之一(Manuel Mansur,Liliam Martínez,Mariela Pérez,MadayAlonso-del-Rivero,Isvaloy Márquez,Yanay Proenza,Laura Varas,Francesc X.Avilés,Expression,purification and characterization of porcine pancreaticCarboxypeptidase B from Pichia pastoris for the conversion of recombinanthuman insulin.Enzyme and Microbial Technology,2007,40(3):476–480)。

目前，活性CPB的制备方法主要分为两种，一种是直接从猪胰腺中提取并纯化，但是这种方法价格昂贵，且制品中残留其它酶类或病毒等，使得应用受到限制；另一种方法是利用微生物(原核表达系统或真核表达系统)发酵的方法表达CPB的酶原(proCPB)，纯化后去除N末端前肽获得具有催化活性的酶体(安宇，李节，李素霞，赵健，范立强，袁勤生.重组羧肽酶B及其包涵体溶解性的研究.食品与药品A，2007，9(10)：1–5；王德解，苗林，陈宏，李彦英，陈惠鹏，方宏清.鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达、纯化与鉴定.生物工程学报，2007,23(1)：61–66)。相比于真核表达系统，原核表达系统尤其是大肠杆菌(Escherichiacoli)具有遗传背景清晰、基因工程操作手段成熟、细胞生长能力强等优点，是理想的外源蛋白表达宿主之一。但是，大肠杆菌所表达包括猪羧肽酶原B(proCPB)在内的很多外源蛋白均是以包涵体的形式存在于细胞中，后续还需对产物进行复性，操作复杂且复性率低(张笑岩，张会勇，范豪，李泰明，刘景晶，曹荣月.重组猪羧肽酶原B在大肠杆菌中的表达与复性研究.药物生物技术，2010,17(1)：39–44)。

CPB含有7个半胱氨酸，其中一个半胱氨酸呈游离态，另外6个形成3对二硫键。大肠杆菌缺乏真核细胞中翻译后修饰的酶类，并且细胞质在谷氧还蛋白(Glutaredoxin)和硫氧还蛋白(Thioredoxin)途径作用下呈现还原型环境，不利于二硫键形成，导致外源蛋白尤其是含有多个二硫键的蛋白极易形成包涵体。在宿主细胞中，将外源蛋白从包涵体转为天然构象并以可溶性蛋白的形式存在，可降低蛋白质的工业生产成本。辅助蛋白是指能够协助受体蛋白(或叫目的蛋白)组装或介导蛋白质正确折叠的蛋白质，将其与目的蛋白共表达是避免包涵体形成的有效手段之一。常用的辅助蛋白，包括热休克蛋白分子伴侣以及一些参与蛋白质异构化反应的酶类，如蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase，PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl prolyl cis-trans isomerase，PPI)。中科院生物物理所的王志珍院士团队率先提出“PDI既是酶又是分子伴侣”的假说，在对PDI进行大量结构和功能分析工作后证实这一观点，得到广泛认同(Shengjian Li,Xinguo Hong,Yuanyuan Shi,Hui Li,Chih-chen Wang.Annular arrangement and collaborativeactions of four domains of protein-disulfide isomerase-A small angle X-rayscattering study in solution.Journal of Biological Chemistry,2006,281(10):6581–6588)。热休克蛋白分子伴侣包括小分子量热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp104等(Neil Andrew D.Bascos and Samuel J.Landry.Ahistory of molecular chaperone structures in the protein databank.International Journal of Molecular Sciences,2019,20(24):6195)。这其中包括了一些已经商品化的分子伴侣蛋白，例如：GroEL、GroES、DnaK、DnaJ和GrpE(Takara)。大肠杆菌GroEL/GroES系统是最经典的分子伴侣组合之一，早在1973年就被研究报导，GroEL和GroES分别属于Hsp60和Hsp10(Nat Sternberg.Properties of a mutant Escherichiacoli defective in bacteriophageλhead formation(groE):II.The propagation ofphageλ.Journal of Molecular Biology,1973,76(1):25–44)。该系统在ATP的驱动下形成分子腔结构提供蛋白折叠的微环境。Hsp70家族通常不形成空腔结构包裹目的蛋白，而是固定目的受体蛋白多肽片段调节蛋白质折叠。DnaK属于Hsp70家族，可与DnaJ(属于Hsp40家族)和GrpE共同使用(Kazuyo Nishihara,Masaaki Kanemori,Masanari Kitagawa,HidekiYanagi,Takashi Yura.Chaperone coexpression plasmids:differential andsynergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroES in assisting folding ofan allergen of Japanese Cedar Pollen,Cryj2,in Escherichia coli.Applied andEnvironmental Microbiology,1998,64(5):1694–1699)。此外，一些核糖体、RNA、磷脂也被鉴定出具有分子伴侣活性(王志珍.蛋白质折叠和分子伴侣.生物学通报，2004,39(5)：1–6)。

本发明人以E.coli W3110基因组(NCBI VERSION：AC_000091.1)为模板，扩增基因groS(NCBI GI：89110863)、groL(NCBI GI：89110864)、dnaK(NCBI GI：89106898)、dnaJ(NCBI GI：89106899)和grpE(NCBI GI：89109414)，参照文献(Kazuyo Nishihara,MasaakiKanemori,Masanari Kitagawa,Hideki Yanagi,Takashi Yura.Chaperone coexpressionplasmids:differential and synergistic roles of DnaK-DnaJ-GrpE and GroEL-GroESin assisting folding of an allergen of Japanese Cedar Pollen,Cryj2,inEscherichia coli.Applied and Environmental Microbiology,1998,64(5):1694–1699)报导的方法获得GroES(NCBI protein_id＝"AP_004643.1")-GroEL(NCBI protein_id＝"AP_004644.1")、DnaK(NCBI protein_id＝"AP_000678.1")-DnaJ(NCBI protein_id＝"AP_000679.1")-GrpE(NCBI protein_id＝"AP_003194.1")和GroES-GroEL-DnaK-DnaJ-GrpE三种分子伴侣系统，分别与proCPB共表达后，仍产生大量proCPB包涵体。因此，需尝试改造现有的分子伴侣系统或开发新的原核生物辅助蛋白体系。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种原核生物的可溶性表达系统(分子伴侣)及装载可溶性表达系统的质粒载体。

本发明的另一目的在于利用上述可溶性表达系统实现包括重组猪羧肽酶原B(proCPB)在内的目标蛋白的可溶性表达。

本发明的目的还在于对可溶性表达系统的传代稳定性和通用性作出评价。

本发明的第一方面，提供一种原核生物可溶性表达系统，所述可溶性表达系统具有巯基氧化酶基因和蛋白质二硫键异构酶基因；所述蛋白质二硫键异构酶基因前具有突变型trx标签。

本发明所述的巯基氧化酶基因可以为优化或未优化的巯基氧化酶基因，只要能够发挥其作用就可以用于本发明，例如所述的巯基氧化酶的蛋白质序列参照来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的ERV1(NCBI VERSION：P27882.2)设计改造，其基因序列(ERV1)如序列SEQ ID NO.1所示。

本发明所述的蛋白质二硫键异构酶基因可以为优化或未优化的巯基氧化酶基因，只要能够发挥其作用就可以用于本发明，例如所述的蛋白质二硫键异构酶可以为来源于人(Homo sapiens)(简写为hPDI)，或来源于酿酒酵母(简写为sPDI)，或来源于大肠杆菌(简写为DsbC)；其中，hPDI的氨基酸序列参照NCBI(VERSION：NP_000909.2)提供的序列设计改造，对应的核酸序列(hPDI)如SEQ ID NO.2所示；sPDI的氨基酸序列参照NCBI(VERSION：AAA34848.1)提供的序列设计改造，对应的核酸序列(sPDI)如SEQ ID NO.3所示；DsbC的核酸序列(dsbC)来源于E.coli BL21(DE3)基因组(NCBI VERSION：CP001509.3)，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所述的系统中蛋白质二硫键异构酶基因必须具有突变型trx标签，否则无法实现可溶性表达，本发明所述的突变型trx标签序列如SEQ ID NO.8突变型trx标签所示。

本发明所述的系统中，巯基氧化酶基因前可以不具标签，也可以同样的具有突变型trx标签，均可实现很好的可溶性表达。

本发明所述的可溶性表达系统，还可以进一步的包括控制两个基因的启动子序列，启动子的种类没有特别要求，不会对本发明的效果产生影响，可以为本领域常用的启动子，例如为阿拉伯糖启动子或T7启动子。

本发明的另一方面还提供包含本发明所述的表达系统的载体。

本发明所述的包含本发明所述的表达系统的载体中，所用的基础载体并没有特别限制，可以为本领域常用的载体，例如pET22b、PUC57等。

在本发明的另一方面，提供一种用于重组蛋白可溶性表达的试剂盒，所述试剂盒中包括所述的重组质粒，或E.coli BL21(DE3)装载所述的重组质粒。

本发明的第三方面还提供一种原核生物可溶性表达目标蛋白的方法，用带有本发明所述的表达系统的载体转化原核宿主细胞，所述原核宿主细胞中还同时具有目标蛋白表达载体。

本发明的目标蛋白主要为需要形成至少两个链内或链间二硫键以获得生物学活性，例如羧肽酶B或胰蛋白酶原，本发明所述的系统和方法可以直接实现可溶性表达，无需对产物进行复性等复杂的操作。

本发明所述的原核宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)，相对于其他菌株，可以大大降低成本。

本发明通过将蛋白质二硫键异构酶，并将其与巯基氧化酶构建到同一个启动子控制下。通过添加氮末端标签策略优化这两种蛋白的表达，构建可溶性表达系统(ERV1-TrxsPDI或TrxERV1-TrxsPDI)。在大肠杆菌中，该系统与目的蛋白重组猪羧肽酶原B共表达后，可实现猪羧肽酶原B的可溶性表达，大大减少了包涵体的形成。本发明首次利用大肠杆菌实现猪羧肽酶原B的可溶性表达，并获得有活性的蛋白。该可溶性表达系统也可用于其它目的蛋白，例如胰蛋白酶原的可溶性表达，具有促进目的蛋白可溶性表达的通用性。本发明内容在重组蛋白生产和新酶原件筛选等领域具有应用前景。

附图说明

图1为质粒p15ARA示意图。

图2为质粒p15ARA1示意图。

图3为质粒p15ARA2示意图。

图4为质粒p15ARA3示意图。

图5为质粒p15T1示意图。

图6为质粒p15T2示意图。

图7为质粒p15T3示意图。

图8为质粒pET22b-ERV1示意图。

图9为质粒pET22b-hPDI示意图。

图10为质粒pET22b-sPDI示意图。

图11为质粒pET22b-dsbC示意图。

图12为质粒pET22b-TE示意图。

图13为质粒pET22b-TH示意图。

图14为质粒pET22b-TS示意图。

图15为质粒pET22b-TD示意图。

图16为质粒pET22b-GE示意图。

图17为质粒pET22b-GH示意图。

图18为质粒pET22b-GS示意图。

图19为质粒pET22b-GD示意图。

图20为质粒pET22b-7E示意图。

图21为质粒pET22b-7H示意图。

图22为质粒pET22b-7S示意图。

图23为质粒pET22b-7D示意图。

图24为质粒p15SARA示意图。

图25为质粒p0E-TS示意图。

图26为质粒p0E-GS示意图。

图27为质粒p0E-TH示意图。

图28为质粒p0E-7H示意图。

图29为质粒p0E-GH示意图。

图30为质粒p0E-0D示意图。

图31为质粒pTE-TS示意图。

图32为质粒pTE-GS示意图。

图33为质粒pTE-TH示意图。

图34为质粒pTE-7H示意图。

图35为质粒pTE-GH示意图。

图36为质粒pTE-0D示意图。

图37为质粒pET-0E-TS示意图。

图38为质粒pT7-0E-TS示意图。

图39为质粒p0E示意图。

图40为质粒pTS示意图。

图41为质粒pET-P示意图。

图42为质粒pET-TP示意图。

图43为菌株WF1、WF2和WF3表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果。图43中，M：标准分子量。

图44为菌株WF4、WF5和WF6表达蛋白的SDS-PAGE电泳结果。图44中，M：标准分子量。

图45为ERV1、TrxERV1、T7ERV1和GSTERV1表达的SDS-PAGE电泳结果。图45中，M：标准分子量；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxERV1的分子量为24.12kDa；T7ERV1的分子量为23.08kDa；GSTERV1的分子量为23.29kDa。

图46为hPDI、TrxhPDI、T7hPDI和GSThPDI表达的SDS-PAGE电泳结果。图46中，M：标准分子量；hPDI的分子量为52.05kDa；TrxhPDI的分子量为54.47kDa；T7hPDI的分子量为53.43kDa；GSThPDI的分子量为53.64kDa。

图47为sPDI、TrxsPDI、T7sPDI和GSTsPDI表达的SDS-PAGE电泳结果。图47中，M：标准分子量；sPDI的分子量为55.70kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kDa；T7sPDI的分子量为57.09kDa；GSTsPDI的分子量为57.29kDa。

图48为DsbC、TrxDsbC、T7DsbC和GSTDsbC表达的SDS-PAGE电泳结果。图48中，M：标准分子量。DsbC的分子量为23.51kDa；TrxDsbC的分子量为25.93kDa；T7DsbC的分子量为24.89kDa；GSTDsbC的分子量为25.10kDa。

图49为CPB0表达proCPB的SDS-PAGE电泳结果。图49中，M：标准分子量；T：总蛋白；C：可溶性蛋白；I：包涵体蛋白；proCPB的分子量为45.97kDa。

图50为菌株CPB0在不同IPTG诱导浓度下表达proCPB。图52中，M：标准分子量；proCPB的分子量为45.97kDa。

图51为proCPB与不带N末端标签的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶共表达的SDS-PAGE电泳结果。图51中，M：标准分子量；proCPB的分子量为45.97kDa；ERV1的分子量为21.70kDa；hPDI的分子量为52.05kDa；sPDI的分子量为55.70kDa；DsbC的分子量为23.51kDa。

图52为proCPB与带N末端标签的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶共表达的SDS-PAGE电泳结果，IPTG诱导浓度为0.03mM。图52中，M：标准分子量；proCPB的分子量为45.97kDa；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxERV1的分子量为24.12kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kD；GSTsPDI的分子量为57.29kDa；TrxhPDI的分子量为54.47kDa；T7hPDI的分子量为53.43kDa；GSThPDI的分子量为53.64kDa；DsbC的分子量为23.51kDa。

图53为T7启动子控制ERV1-TrxsPDI对proCPB表达可溶性的影响。图53中，标准分子量；T：总蛋白；C：可溶性蛋白；I：包涵体蛋白；proCPB的分子量为45.97kDa；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kDa。

图54为ERV1或TrxsPDI对proCPB表达可溶性的影响。图54中，M：标准分子量；T：总蛋白；C：可溶性蛋白；I：包涵体蛋白；proCPB的分子量为45.97kDa；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kDa。

图55为加入L-阿拉伯糖和IPTG可稳定地实现猪羧肽酶原B的可溶性表达。

图56为PTm0的表达。图56中，M：标准分子量；T：总蛋白；C：可溶性蛋白；I：包涵体蛋白；PTm0的分子量为24.38kD；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kDa。

图57为TrxA-PTm0的表达。图57中，M：标准分子量；T：总蛋白；C：可溶性蛋白；I：包涵体蛋白；TrxA-PTm0的分子量为42.23kD；ERV1的分子量为21.70kDa；TrxsPDI的分子量为58.12kDa。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明专利的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均是本领域技术人员所熟知的，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的方法，或按照制造厂商所建议的方法。

质粒小提试剂盒(AXYGEN)和快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(AXYGEN)购自康宁生命科学(吴江)有限公司；重组克隆试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa)、限制性内切酶(TaKaRa)、DNA连接试剂盒(TaKaRa)以及高保真PCR反应试剂盒(

GXL DNA聚合酶，TaKaRa)购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

PCR扩增反应条件：94℃预变性5min；98℃变性10s，60℃复性10s，72℃延伸(1kb/min)，10个循环；98℃变性10s，55℃复性10s，72℃延伸(1kb/min)，10个循环；72℃延伸7min。

包括质粒pET3b、pET21b、pET22b、pET32a和pACYCDuet-1和pACYC184等本发明所用到的所有质粒或载体均购自Novagen公司。

E.coli DH5α用于质粒扩增，E.coli DMT购自北京全式金生物技术有限公司，用于扩增利用体外重组技术获得的质粒，E.coli BL21(DE3)购自天根生化科技(北京)有限公司，用于蛋白表达。

菌株培养条件：挑取单菌落至含有5mL液体Luria-Bertani(LB)培养基的试管中，在37℃、220rpm条件下培养10–12h。氨苄青霉素(Amp，50μg/mL)、氯霉素(Cm，25μg/mL)和卡那霉素(Kan，25μg/mL)根据质粒所携带抗生素基因按照要求使用。

蛋白表达条件如下：

1)挑取单菌落至含有5mL液体Luria-Bertani(LB)培养基的试管中，在30℃、200rpm条件下培养10–12h。2)将菌液转接至含有50mL的LB培养基的摇瓶中培养，使初始OD_600nm为0.1，随后在30℃、200rpm的条件下继续培养。3)在以菌株E.coli BL21(DE3)为宿主时，如有外源蛋白在阿拉伯糖的启动子控制下，则在OD_600nm为0.3–0.4时加入诱导物L-阿拉伯糖，工作浓度为2mg/mL；如有外源蛋白在T7启动子控制下，则在OD_600nm为0.6–0.8时加入诱导物IPTG，如无特殊说明，工作浓度为0.3mM IPTG。4)在20℃、200rpm的条件下继续培养15h。5)收集菌体并稀释到合适的浓度，利用超声破碎法分离可溶性蛋白和包涵体蛋白，总蛋白样品不进行超声破碎。超声破碎条件：置于冰水浴中超生5s，暂停5s，连续60个循环。离心后的上清液含有可溶性蛋白，沉淀含有包涵体蛋白。重悬包涵体蛋白制备样品，确保总蛋白、可溶性蛋白及包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳样品对应的菌体量是一致的。6)利用SDS-PAGE电泳对蛋白表达进行鉴定。

目的蛋白的纯化与活化方法操作如下：

1)在4℃条件下离心收集表达蛋白后的细胞，用20mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体2次，随后用Tris-HCl缓冲液重悬细胞。利用DEAE-FF柱离子交换层析纯化蛋白，平衡液为pH值8.0的20mmol/L Tris-HCl缓冲液；洗脱液为80mM的NaCl溶液。取254nm处吸收最强的样品进行下一步活化操作。2)利用双缩脲法测定纯化后proCPB的浓度，进而计算proCPB的质量。活化时以1：150～2500(胰蛋白酶：proCPB)的质量比，优选1:200(胰蛋白酶：proCPB)的质量比加入胰蛋白酶，在37℃反应2～3h后，加入终浓度为0.1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)终止反应。3)对活化后的样品进行phenyl sephamse FF疏水层析，样品加入(NH₄)₂SO₄使终浓度为0.8M，平衡液为含1M(NH₄)₂SO₄，pH 7.0的20mM Tris-HCl溶液，洗脱液为pH 7.0，20mMTris-HCl溶液。

蛋白含量的测定参照文献(M.M.Bradford.A rapid and sensitive method forthe quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding.Analytical Biochemistry,1976,72,248–254)采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

CPB的活性测定方法参照文献(J.E.Folk,Jules A.Gladner,W.R.Carroll,J.A.Gladner.Carboxypeptidase B.The Journal of Biological Chemistry,1960,235,2272–2277)进行：

1mM N-马脲酰精氨酸(BGA)底物溶解到含0.1M NaCl，pH值为7.65的25mM Tris溶液中，25℃下在波长254nm处检测产物吸收值的变化。25℃时，每分钟水解1μmol BGA底物引起反应物在254nm处吸收值增加0.12的酶量。实施例中所用到的引物全部由苏州金唯智生物科技有限公司，序列如表1所示。

表1引物列表

实施例中所用到的质粒如表2所示。

表2质粒列表

若无特别说明，实施例采用的实验总方案如下：

一种原核生物的可溶性表达系统的构建方法，所述方法包括：

(1)一种可溶性表达系统，使之存在巯基氧化酶以及蛋白质二硫键异构酶或全部经过密码子优化的相关基因：所述的巯基氧化酶的蛋白质序列参照来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)的ERV1(NCBI VERSION：P27882.2)设计改造，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57载体上(pUC57-ERV1)，其基因序列(ERV1)如SEQ ID NO.1所示；所述的蛋白质二硫键异构酶为来源于人(Homo sapiens)(简写为hPDI)，或来源于酿酒酵母(简写为sPDI)，或来源于大肠杆菌(简写为DsbC)。其中，hPDI的氨基酸序列参照NCBI(VERSION：NP_000909.2)提供的序列设计改造，对应的核酸序列(hPDI)如SEQID NO.2所示；sPDI的氨基酸序列参照NCBI(VERSION：AAA34848.1)提供的序列设计改造，对应的核酸序列(sPDI)如SEQ ID NO.3所示；DsbC的核酸序列(dsbC)来源于E.coli BL21(DE3)基因组(NCBI VERSION：CP001509.3)，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。这三条序列连同RBS序列及终止子序列由京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57载体上，获得质粒pUC57-hPDI、pUC57-sPDI和pUC57-dsbC。

(2)所述的ERV1、hPDI、sPDI和dsbC添加或不添加标签，所述标签选自：突变型trx标签(在蛋白或基因名称前添加Trx，其DNA序列如SEQ ID NO.8：ATGAGCGACAAGATTCACCTGACCGACGATAGCTTCGACACCGATGTTCTGAAGGCGGATGGT)、GST标签(在蛋白或基因名称前添加GST，其DNA序列如SEQ ID NO.9：ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTG)或T7标签(在蛋白或基因名称前添加GST，其DNA序列如SEQ ID NO.10：ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGTTCC)。

(3)利用来源于大肠杆菌的阿拉伯糖启动子控制(1)所述基因，并克隆到p15Aori-CmR骨架上：构建质粒p15ARA1装载ERV1和hPDI；构建质粒p15ARA2装载ERV1和sPDI；构建质粒p15ARA3装载ERV1和dsbC。

(4)大肠杆菌中转化(3)所述的质粒，诱导表达相关蛋白。

(5)利用T7启动子控制(1)所述基因，并克隆到p15A ori-CmR骨架上：构建质粒p15T1装载ERV1和hPDI；构建质粒p15T2装载ERV1和sPDI；构建质粒p15T3装载ERV1和dsbC。

(6)大肠杆菌中转化(5)所述的质粒，诱导表达相关蛋白。

(7)克隆(2)所述的基因到载体pET22b上：质粒pET22b-ERV1装载ERV1基因；质粒pET22b-hPDI装载hPDI基因；质粒pET22b-sPDI装载sPDI基因；质粒pET22b-dsbC装载dsbC基因；质粒pET22b-TE装载TrxERV1基因；质粒pET22b-TH装载TrxhPDI基因；质粒pET22b-TS装载TrxsPDI基因；质粒pET22b-TD装载TrxdsbC基因；质粒pET22b-GE装载GSTERV1基因；质粒pET22b-GH装载GSThPDI基因；质粒pET22b-GS装载GSTsPDI基因；质粒pET22b-GD装载GSTdsbC基因；质粒pET22b-7E装载T7ERV1基因；质粒pET22b-7H装载T7hPDI基因；质粒pET22b-7S装载T7sPDI基因；质粒pET22b-7D装载T7dsbC基因。

(8)大肠杆菌中转化(7)所述的质粒，诱导表达相关蛋白。

(9)优选(7)、(8)所述的基因ERV1、TrxERV1、TrxsPDI、GSTsPDI、TrxhPDI、T7hPDI、GSThPDI和dsbC，利用来源于沙门氏菌(Salmonella enterica)的阿拉伯糖启动子控制巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶，并利用p15A ori-Cm^R骨架装载：质粒p0E-TS装载ERV1和TrxsPDI基因；质粒p0E-GS装载ERV1和GSTsPDI基因；质粒p0E-TH装载ERV1和TrxhPDI基因；质粒p0E-7H装载ERV1和T7hPDI基因；质粒p0E-GH装载ERV1和GSThPDI基因；质粒p0E-0D装载ERV1和dsbC基因；质粒pTE-TS装载TrxERV1和TrxsPDI基因；质粒pTE-GS装载TrxERV1和GSTsPDI基因；质粒pTE-TH装载TrxERV1和TrxhPDI基因；质粒pTE-7H装载TrxERV1和T7hPDI基因；质粒pTE-GH装载TrxERV1和GSThPDI基因；质粒pTE-0D装载TrxERV1和dsbC基因。

在本发明的另一方面，在于利用可溶性表达系统进行重组猪羧肽酶原B的可溶性表达：

(10)所述的proCPB的蛋白序列来源于欧亚野猪(Sus scrofa)，其蛋白序列来源于NCBI(VERSION：CAB46991.1)，但去掉2–15位信号肽氨基酸序列，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示。克隆proCPB到质粒pET21b骨架NdeI、XhoI位点上，获得质粒pETCPB。

(11)作为对照，大肠杆菌中仅引入重组猪羧肽酶原B基因，使之存在质粒pETCPB。诱导proCPB表达。

(12)大肠杆菌中引入重组猪羧肽酶原B、巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶的相关基因，使之存在质粒pETCPB，同时存在质粒p15ARA1、p15ARA2、p15ARA3、p15T1、p15T2、p15T3。诱导表达相关蛋白。

(13)大肠杆菌中引入重组猪羧肽酶原B、巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶的相关基因，使之存在质粒pETCPB，同时存在质粒pTE-TS、pTE-GS、pTE-TH、pTE-7H、pTE-GH、pTE-0D、p0E-TS、p0E-GS、p0E-TH、p0E-7H、p0E-GH或p0E-0D。诱导表达相关蛋白。

(14)ERV1-TrxsPDI或TrxERV1-TrxsPDI是优选的组合，可实现重组猪羧肽酶原B的可溶性表达。优选ERV1-TrxsPDI组合并置于Pzt-1启动子(tet operator)的控制下，并装载到p15A ori-CmR骨架上，构建质粒pTET-0E-TS。

(15)大肠杆菌中引入重组猪羧肽酶原B、巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶的相关基因，使之存在质粒pETCPB，同时存在质粒pTET-0E-TS。诱导表达相关蛋白。

(16)优选ERV1-TrxsPDI组合，置于T7启动子的控制下，并装载到p15A ori-CmR骨架上，构建质粒pT7-0E-TS。

(17)大肠杆菌中引入重组猪羧肽酶原B、巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶的相关基因，使之存在质粒pETCPB，同时存在质粒pT7-0E-TS。诱导表达相关蛋白。

(18)利用阿拉伯糖启动子分别控制ERV1或TrxsPDI，并装载到p15A ori-CmR骨架上，构建质粒p0E或pTS。

(19)大肠杆菌中引入重组猪羧肽酶原B基因，还引入巯基氧化酶或蛋白质二硫键异构酶的相关基因，使之存在质粒pETCPB，同时存在质粒p0E或pTS。诱导表达相关蛋白，评价巯基氧化酶或蛋白质二硫键异构酶单独存在时对重组猪羧肽酶原B可溶性表达的影响。

在本发明的另一方面，还在于利用可溶性表达系统进行重组胰蛋白酶原的可溶性表达：

(20)所述的PTm0的蛋白序列来源于Sus scrofa，参照NCBI(VERSION：NP_001156363.1)提供的序列信息设计改造，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57载体的EcoRI、NotI位点上(pUC57-PTm0)。克隆PTm0基因到质粒pET22b的骨架上，获得质粒pET-P，用于表达PTm0蛋白；克隆PTm0基因到质粒pET32a的骨架上，获得质粒pET-TP，用于表达TrxA-PTm0蛋白。

(21)作为对照，大肠杆菌中仅引入重组胰蛋白酶原基因，使之存在质粒pET-P或pET-TP。诱导表达相关蛋白。

(22)大肠杆菌中引入巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶基因，同时引入重组胰蛋白酶原基因，使之存在质粒p0E-TS，同时存在质粒pET-P或pET-TP。诱导表达相关蛋白。

实施例1、质粒构建

一、质粒p15ARA的构建

araC-P_BAD序列来源于E.coli BL21(DE3)基因组序列(NCBI VERSION：CP001509.3)。

1、以BL21(DE3)基因组为模板，PARA-5、PARA-3为引物，PCR扩增约1.7kb含有araC基因、P_BAD启动子以及部分araB基因序列的DNA片段ARA。

2、以质粒pACYCDuet-1为模板，ACYC-5、ACYC-3为引物，PCR扩增含有Cm^R和p15Aori的DNA骨架ACYC(约2.2kb)。

3、骨架ACYC和片段ARA体外重组，构建质粒p15ARA(结构示意图如图1所示)。所有的体外重组操作利用南京诺唯赞生物科技有限公司的重组克隆试剂盒完成。

4、挑取单菌落，以P15AC、ACYC-33为引物进行PCR鉴定，约1.4kb为阳性，阴性无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

二、质粒p15ARA1的构建

1、以质粒p15ARA为模板，以ACYC-5、ACYC-33为引物PCR扩增约3,507bp含有Cm^R-p15A ori-araC的DNA骨架ACYC3。

2、以质粒pUC57-ERV1为模板，ERV-5、ERV-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有ERV1基因的DNA片段ERV11。

3、以质粒pUC57-hPDI为模板，以HPDI-5、KANT-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有hPDI基因的DNA片段HPDI1。

4、骨架ACYC3与片段ERV11和HPDI1体外重组，构建质粒p15ARA1(结构示意图如图2所示，该质粒用于表达ERV1和hPDI)。

5、挑取单菌落，以ARAO-0、TACI-2为引物，PCR能扩增出约0.8kb条带，同时以TACI-3、LAC-3为引物，PCR能扩增出约1.7kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三、质粒p15ARA2的构建

1、以质粒pUC57-sPDI为模板，以SPDI-5、KANT-3为引物，PCR扩增约1.7kb含有sPDI基因的DNA片段SPDI1。

2、骨架ACYC3与片段ERV11和SPDI1体外重组，构建质粒p15ARA2(结构示意图如图3所示，该质粒用于表达ERV1和sPDI)。

3、挑取单菌落，以ARAO-0、TACI-5为引物，PCR能扩增出约0.8kb条带，同时以TACI-3、LAC-3为引物，PCR能扩增约1.8kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

四、质粒p15ARA3的构建

1、以质粒pUC57-dsbC为模板，以HPDI-5、KANT-3为引物，PCR扩增约0.8kb含有dsbC基因的DNA片段DSBC1。

2、骨架ACYC3与片段ERV11和DSBC1体外重组，构建质粒p15ARA3(结构示意图如图4所示，该质粒用于表达ERV1和DsbC)。

3、挑取单菌落，以ARAO-0、TACI-6为引物，PCR能扩增出约0.8kb条带，同时以TACI-3、LAC-3为引物，PCR扩增约1kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

五、质粒p15T1的构建

1、以质粒pACYCDuet-1为模板，以CYCD-5、CYCD-3为引物，PCR扩增约3.7kb含有Cm^R、p15A ori和T7启动子的DNA片段ACYC8。

2、以质粒p15ARA1为模板，以FZ-51、FZ-31为引物，PCR扩增约2.0kb的DNA片段FZDB1。

3、骨架ACYC8和片段FZDB1体外重组，构建质粒p15TL1(结构示意图如图5所示，该质粒用于表达ERV1和hPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为2.1kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

六、质粒p15T2的构建

1、以质粒p15ARA2为模板，以FZ-51、FZ-32为引物，PCR扩增约2.1kb的DNA片段FZDB2。

2、骨架ACYC8和片段FZDB2体外重组，构建质粒p15TL2(结构示意图如图6所示，该质粒用于表达ERV1和sPDI)。

3、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为2.2kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

七、质粒p15T3的构建

1、以质粒p15ARA3为模板，以FZ-51、FZ-33为引物，PCR扩增约1.3kb的DNA片段FZDB3。

2、骨架ACYC8和片段FZDB3体外重组，构建质粒p15TL3(结构示意图如图7所示，该质粒用于表达ERV1和DsbC)。

3、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.4kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

八、质粒pET22b-ERV1的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以2ERV1-5、2ERV1-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有ERV1基因的DNA片段22ERV1。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段22ERV1，获得片段22ERV1-NB。

3、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切质粒pET22b，回收约5.4kb的骨架pET22b-NB。

4、片段22ERV1-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-ERV1(结构示意图如图8所示，该质粒用于表达ERV1)。

5、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.8kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

九、质粒pET22b-hPDI的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以2hPDI-5、2hPDI-3为引物，PCR扩增约1.4kb含有hPDI基因的DNA片段22HPDI。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段22HPDI，获得片段22HPDI-NB。

3、片段22HPDI-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-hPDI(结构示意图如图9所示，该质粒用于表达hPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.6kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十、质粒pET22b-sPDI的构建

1、以质粒pUC57-sPDI为模板，以2sPDI-5、2sPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有sPDI的DNA片段22SPDI。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段22SPDI，获得片段22SPDI-NB。

3、片段22SPDI-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-sPDI(结构示意图如图10所示，该质粒用于表达sPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.7kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十一、质粒pET22b-dsbC的构建

1、以pUC57-dsbC为模板，以2DSBC-5、2DSBC-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有dsbC基因的DNA片段22DSBC。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段22DSBC，获得片段22DSBC-NB。

3、片段22DSBC-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-dsbC(结构示意图如图11所示，该质粒用于表达DsbC)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.9kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十二、质粒pET22b-TE的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以TRX-11、ERV1P-33为引物，PCR扩增约0.6kb含有突变型trx标签和ERV1基因的DNA片段TRX11。

2、再以片段TRX11为模板，以TRX-1、ERV1P-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有TrxERV1基因的DNA片段TRX1。

3、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段TRX1，获得DNA片段TRX1-NB。

4、将片段TRX1-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-TE(结构示意图如图12所示，该质粒用于表达TrxERV1)。

5、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.9kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十三、质粒pET22b-TH的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以TRX-22、HPDI-33为引物，PCR扩增约1.4kb含有突变型trx标签和hPDI基因的DNA片段TRX22。

2、再以片段TRX22为模板，以TRX-1、HPDI-3为引物，PCR扩增约1.4kb含有TrxhPDI基因的DNA片段TRX2。

3、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段TRX2，获得DNA片段TRX2-NB。

4、将片段TRX2-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-TH(结构示意图如图13所示，该质粒用于表达TrxhPDI)。

5、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.7kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十四、质粒pET22b-TS的构建

1、以质粒p15ARA2为模板，以TRX-33、SPDI-33为引物，PCR扩增约1.5kb含有突变型trx标签和sPDI基因的DNA片段TRX33。

2、再以片段TRX33为模板，以TRX-1、SPDI-3为引物，PCR扩增约1.6kb含有TrxsPDI基因的DNA片段TRX3。

3、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段TRX3，获得DNA片段TRX3-NB。

4、将片段TRX3-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-TS(结构示意图如图14所示，该质粒用于表达TrxsPDI)。

5、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.8kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十五、质粒pET22b-TD的构建

1、以质粒p15ARA3为模板，以TRX-44、DSBC-33为引物，PCR扩增约0.7kb含有突变型trx标签和dsbC基因的DNA片段TRX44。

2、再以TRX44为模板，以TRX-1、DSBC-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有TrxdsbC基因的DNA片段TRX4。

3、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段TRX4，获得DNA片段TRX4-NB。

4、将片段TRX4-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-TD(结构示意图如图15所示，该质粒用于表达TrxDsbC)。

十六、质粒pET22b-GE的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以GST-1、ERV1P-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有GSTERV1基因的DNA片段GST1。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段GST1，获得DNA片段GST1-NB。

3、将片段GST1-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-GE(结构示意图如图16所示，该质粒用于表达GSTERV1)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.8kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十七、质粒pET22b-GH的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以GST-2、HPDI-3为引物，PCR扩增约1.4kb含有GSThPDI基因的DNA片段GST2。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段GST2，获得DNA片段GST2-NB。

3、将片段GST2-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-GH(结构示意图如图17所示，该质粒用于表达GSThPDI)。

十八、质粒pET22b-GS的构建

1、以质粒p15ARA2为模板，以GST-3、SPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有GSTsPDI基因的DNA片段GST3。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段GST3，获得DNA片段GST3-NB。

3、将片段GST3-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-GS(结构示意图如图18所示，该质粒用于表达GSTsPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.8kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

十九、质粒pET22b-GD的构建

1、以质粒p15ARA3为模板，以GST-4、DSBC-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有GSTdsbC基因的DNA片段GST4。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段GST4，获得DNA片段GST4-NB。

3、将片段GST4-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-GD(结构示意图如图19所示，该质粒用于表达GSTDsbC)。

二十、质粒pET22b-7E的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以T7T-1、ERV1P-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有T7ERV1基因的DNA片段T7T1。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段T7T1，获得DNA片段T7T1-NB。

3、将片段T7T1-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-7E(结构示意图如图20所示，该质粒用于表达T7ERV1)。

二十一、质粒pET22b-7H的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以T7T-2、HPDI-3为引物，PCR扩增约1.4kb含有T7hPDI基因的DNA片段T7T2。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段T7T2，获得DNA片段T7T2-NB。

3、将片段T7T2-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-7H(结构示意图如图21所示，该质粒用于表达T7hPDI)。

二十二、质粒pET22b-7S的构建

1、以质粒p15ARA2为模板，以T7T-3、SPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有T7sPDI基因的DNA片段T7T3。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段T7T3，获得DNA片段T7T3-NB。

3、将片段T7T3-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-7S(结构示意图如图22所示，该质粒用于表达T7sPDI)。

二十三、质粒pET22b-7D的构建

1、以质粒p15ARA3为模板，以T7T-4、DSBC-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有T7dsbC基因的DNA片段T7T4。

2、利用限制性内切酶Nde I、BamH I酶切片段T7T4，获得DNA片段T7T4-NB。

3、将片段T7T4-NB与骨架pET22b-NB相连，构建质粒pET22b-7D(结构示意图如图23所示，该质粒用于表达T7DsbC)。

二十四、质粒p15SARA的构建

1、质粒p15SARA参照质粒pAR3(Julián Pérez-Pérez and Julio Gutiérrez,Anarabinose-inducible expression vector,pAR3,compatible with ColE1-derivedplasmids.Gene,1995,158(1),141-142；ATCC87026)设计。

2、沙门氏菌的阿拉伯糖启动子、RBS序列、E.coli araB基因部分序列和终止子由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(如SEQ ID NO.7所示)并克隆到pUC57载体上，获得质粒pUC57-SARA。

3、以质粒pACYC184为模板，以C184-5、C184-3为引物，PCR扩增约2.0kb含有p15Aori和Cm^R的DNA骨架ACYC184。

4、以质粒pUC57-SARA为模板，以SARA-5、SARA-3为引物，PCR扩增约1.5kb含沙门氏菌的阿拉伯糖启动子、RBS序列、E.coli araB基因部分序列和终止子的DNA片段SARA1。

5、将骨架ACYC184和片段SARA1体外重组，构建质粒p15SARA(结构示意图如图24所示)。

6、挑取单菌落，利用引物SARA-0、SARA-1进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.6kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

二十五、质粒p0E-TS的构建

1、以质粒p15SARA为模板，以GEw-5、DKt-3为引物，PCR扩增约3.5kb的DNA骨架SARAB。

2、以质粒p15ARA1为模板，以0ERV-5、0ERV-3为引物，PCR扩增约0.6kb含有ERV1基因的DNA片段0ERV1。

3、以质粒pET22b-TS为模板，以22b-5、0sPDI-3为引物，PCR扩增约1.6kb含有TrxsPDI基因的DNA片段TsPDI。

4、骨架SARAB与片段0ERV1和TsPDI体外重组，构建质粒p0E-TS(结构示意图如图25所示，该质粒用于表达ERV1和TrxsPDI)。

5、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-5为引物，PCR能扩增出约0.9kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.7kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

二十六、质粒p0E-GS的构建

1、以质粒pET22b-GS为模板，以22b-5、0sPDI-3为引物，PCR扩增约1.6kb含有GSTsPDI基因的DNA片段GsPDI。

2、骨架SARAB与片段0ERV1和GsPDI体外重组，构建质粒p0E-GS(结构示意图如图26所示，该质粒用于表达ERV1和GSTsPDI)。

3、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-5为引物，PCR能扩增出约0.9kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.7kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

二十七、质粒p0E-TH的构建

1、以质粒pET22b-TH为模板，以22b-5、0hPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有TrxhPDI基因的DNA片段ThPDI。

2、骨架SARAB与片段0ERV1和ThPDI体外重组，构建质粒p0E-TH(结构示意图如图27所示，该质粒用于表达ERV1和TrxhPDI)。

3、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-2为引物，PCR能扩增出约0.9kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.6kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

二十八、质粒p0E-7H的构建

1、以质粒pET22b-7H为模板，以22b-5、0hPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有T7hPDI基因的DNA片段7hPDI。

2、骨架SARAB与片段0ERV1和7hPDI体外重组，构建质粒p0E-7H(结构示意图如图28所示，该质粒用于表达ERV1和T7hPDI)。

二十九、质粒p0E-GH的构建

1、以质粒pET22b-GH为模板，以22b-5、0hPDI-3为引物，PCR扩增约1.5kb含有GSThPDI基因的DNA片段GhPDI。

2、骨架SARAB与片段0ERV1和GhPDI体外重组，构建质粒p0E-GH(结构示意图如图29所示，该质粒用于表达ERV1和GSThPDI)。

三十、质粒p0E-0D的构建

1、以质粒pET22b-dsbC为模板，以22b-5、0dsbC-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有dsbC基因的DNA片段0dsbC。

2、骨架SARAB与片段0ERV1和0dsbC体外重组，构建质粒p0E-0D(结构示意图如图30所示，该质粒用于表达ERV1和DsbC)。

3、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-6为引物，PCR能扩增出约0.9kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约0.9kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十一、质粒pTE-TS的构建

1、以质粒pET22b-TE为模板，以TrxARA-5、0ERV-3为引物，PCR扩增约0.7kb含有TrxERV1基因的DNA片段TERV1。

2、骨架SARAB与片段TERV1和TsPDI体外重组，构建质粒pTE-TS(结构示意图如图31所示，该质粒用于表达TrxERV1和TrxsPDI)。

3、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-5为引物，PCR能扩增出约1.0kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.7kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十二、质粒pTE-GS的构建

1、骨架SARAB与片段TERV1和GsPDI体外重组，构建质粒pTE-GS(结构示意图如图32所示，该质粒用于表达TrxERV1和GSTsPDI)。

2、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-5为引物，PCR能扩增出约1.0kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.7kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十三、质粒pTE-TH的构建

1、骨架SARAB与片段TERV1和ThPDI体外重组，构建质粒pTE-TH(结构示意图如图33所示，该质粒用于表达TrxERV1和TrxhPDI)。

2、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-2为引物，PCR能扩增出约1.0kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约1.6kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十四、质粒pTE-7H的构建

1、骨架SARAB与片段TERV1和7hPDI体外重组，构建质粒pTE-7H(结构示意图如图34所示)。

三十五、质粒pTE-GH的构建

1、骨架SARAB与片段TERV1和GhPDI体外重组，构建质粒pTE-GH(结构示意图如图35所示，该质粒用于表达TrxERV1和GSThPDI)。

三十六、质粒pTE-0D的构建

1、骨架SARAB与片段TERV1和0dsbC体外重组，构建质粒pTE-0D(结构示意图如图36所示，该质粒用于表达TrxERV1和DsbC)。

2、挑取单菌落，以ARAC-0、TACI-6为引物，PCR能扩增出约1.0kb的条带，同时以TACI-3、TACI-7为引物，PCR能扩增出约0.9kb条带的克隆为阳性。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十七、质粒pET-0E-TS的构建

1、以质粒pET3b为模板，以3bES-5、3bES-3为引物，PCR扩增约4.6kb的含有T7启动子、pBR322 ori和Amp^R的DNA骨架ET3B。

2、以质粒p0E-TS为模板，以ES3b-5、ES3b-3为引物，PCR扩增约2.2kb含有ERV1和TrxsPDI基因的DNA片段3bES。

3、将骨架ET3B与片段3bES体外重组，构建质粒pET-0E-TS(结构示意图如图37所示，该质粒用于表达ERV1和TrxsPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为2.3kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十八、质粒pT7-0E-TS的构建

1、以质粒pACYCDuet-1为模板，以CYCT7-5、CYCT7-3为引物，PCR扩增约2.1kb含有p15A ori和Cm^R的DNA骨架P15AT。

2、以质粒pET-0E-TS为模板，以T715-5、T715-3为引物，PCR扩增约3kb含有T7启动子、ERV1和TrxsPDI基因的DNA片段ETT7。

3、将骨架P15AT和片段ETT7体外重组，构建质粒pT7-0E-TS(结构示意图如图38所示，该质粒用于表达ERV1和TrxsPDI)。

4、挑取单菌落，利用引物T715-0、T715-1进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为3.0kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

三十九、质粒p0E的构建

1、以质粒p15ARA1为模板，以0ERV-5、0ERV-31为引物，PCR扩增约0.6kb含有ERV1基因的DNA片段0EERV1。

2、将骨架SARAB与片段0EERV1体外重组，构建质粒p0E(结构示意图如图39所示，该质粒用于表达ERV1)。

3、挑取单菌落，利用引物ARAC-0、TACI-7进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为0.8kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

四十、质粒pTS的构建

1、以质粒pET22b-TS为模板，以0sPDI-5、0sPDI-3为引物，PCR扩增约1.6kb含有TrxsPDI基因的DNA片段TsPDI1。

2、将骨架SARAB与片段TsPDI1体外重组，构建质粒pTS(结构示意图如图40所示，该质粒用于表达TrxsPDI)。

3、挑取单菌落，利用引物ARAC-0、TACI-7进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.8kb。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

四十一、质粒pET-P的构建

1、以质粒pUC57-PTm0为模板，以PTm0-5N、PTm0-3H为引物，PCR扩增约0.7kb含有PTm0基因的DNA片段22PTM。

2、利用限制性内切酶NdeI、HindIII酶切片段22PTm0，获得片段22PTM-NH。

3、利用限制性内切酶NdeI、HindIII酶切质粒pET22b，回收约5.4kb的骨架pET22b-NH。

4、片段22PTM-NH与骨架pET22b-NH相连，构建质粒pET-P(结构示意图如图41所示，该质粒用于表达PTm0)。

四十二、质粒pET-TP的构建

1、以质粒pUC57-PTm0为模板，以M13F、M13R为引物，PCR扩增约0.9kb含有PTm0基因的DNA片段32PTM。

2、利用限制性内切酶EcoRI、NotI酶切片段32PTm0，获得片段32PTM-EN。

3、利用限制性内切酶EcoRI、NotI酶切质粒pET32a，回收约5.9kb的骨架pET32a-EN。

4、片段32PTM-EN与骨架pET32a-EN相连，构建质粒pET-TP(结构示意图如图42所示，该质粒用于表达TrxA-PTm0)。

5、挑取单菌落，利用引物T7、T7t进行PCR鉴定，阳性克隆条带约为1.4kb，阴性克隆无条带。将阳性克隆测序验证并提取质粒。

实施例2、菌株的构建

一、巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶表达菌株的构建

1、将质粒p15ARA1转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15ARA1，命名为WF1。该菌株表达ERV1和hPDI。

2、将质粒p15ARA2转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15ARA2，命名为WF2。该菌株表达ERV1和sPDI。

3、将质粒p15ARA3转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15ARA3，命名为WF3。该菌株表达ERV1和DsbC。

4、将质粒p15T1转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T1，命名为WF4。该菌株表达ERV1和hPDI。

5、将质粒p15T2转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T2，命名为WF5。该菌株表达ERV1和sPDI。

6、将质粒p15T3转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T3，命名为WF6。该菌株表达ERV1和DsbC。

7、将质粒pET22b-ERV1转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-ERV1，命名为WF11。该菌株表达ERV1。

8、将质粒pET22b-TE转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-TE，命名为WF12。该菌株表达TrxERV1。

9、将质粒pET22b-7E转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-7E，命名为WF13。该菌株表达T7ERV1。

10、将质粒pET22b-GE转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-GE，命名为WF14。该菌株表达GSTERV1。

11、将质粒pET22b-hPDI转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-hPDI，命名为WF15。该菌株表达hPDI。

12、将质粒pET22b-TH转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-TH，命名为WF16。该菌株表达TrxhPDI。

13、将质粒pET22b-7H转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-7H，命名为WF17。该菌株表达T7hPDI。

14、将质粒pET22b-GH转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-GH，命名为WF18。该菌株表达GSThPDI。

15、将质粒pET22b-sPDI转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-sPDI，命名为WF19。该菌株表达sPDI。

16、将质粒pET22b-TS转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-TS，命名为WF20。该菌株表达TrxsPDI。

17、将质粒pET22b-7S转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-7S，命名为WF21。该菌株表达T7sPDI。

18、将质粒pET22b-GS转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-GS，命名为WF22。该菌株表达GSTsPDI。

19、将质粒pET22b-dsbC转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-dsbC，命名为WF23。该菌株表达dsbC。

20、将质粒pET22b-TD转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-TD，命名为WF24。该菌株表达TrxDsbC。

21、将质粒pET22b-7D转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-7D，命名为WF25。该菌株表达T7DsbC。

22、将质粒pET22b-GD转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET22b-GD，命名为WF26。该菌株表达GSTDsbC。

二、猪羧肽酶原B表达菌株的构建

1、将质粒pETCPB转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pETCPB，命名为CPB0。该菌株表达proCPB。

2、将质粒p15T1和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T1/pETCPB，命名为CPB1。该菌株表达ERV1、hPDI和proCPB。

3、将质粒p15T2和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T2/pETCPB，命名为CPB2。该菌株表达ERV1、sPDI和proCPB。

4、将质粒p15T3和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p15T3/pETCPB，命名为CPB3。该菌株表达ERV1、DsbC和proCPB。

5、将质粒p0E-TS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-TS/pETCPB，命名为CPB11。该菌株表达ERV1、TrxsPDI和proCPB。

6、将质粒p0E-GS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-GS/pETCPB，命名为CPB12。该菌株表达ERV1、GSTsPDI和proCPB。

7、将质粒p0E-TH和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-TH/pETCPB，命名为CPB13。该菌株表达ERV1、TrxhPDI和proCPB。

8、将质粒p0E-7H和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-7H/pETCPB，命名为CPB14。该菌株表达ERV1、T7hPDI和proCPB。

9、将质粒p0E-GH和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-GH/pETCPB，命名为CPB15。该菌株表达ERV1、GSThPDI和proCPB。

10、将质粒p0E-0D和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-0D/pETCPB，命名为CPB16。该菌株表达ERV1、DsbC和proCPB。

11、将质粒pTE-TS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-TS/pETCPB，命名为CPB17。该菌株表达TrxERV1、TrxsPDI和proCPB。

12、将质粒pTE-GS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-GS/pETCPB，命名为CPB18。该菌株表达TrxERV1、GSTsPDI和proCPB。

13、将质粒pTE-TH和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-TH/pETCPB，命名为CPB19。该菌株表达TrxERV1、TrxhPDI和proCPB。

14、将质粒pTE-7H和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-7H/pETCPB，命名为CPB20。该菌株表达TrxERV1、T7hPDI和proCPB。

15、将质粒pTE-GH和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-GH/pETCPB，命名为CPB21。该菌株表达TrxERV1、GSThPDI和proCPB。

16、将质粒pTE-0D和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTE-0D/pETCPB，命名为CPB22。该菌株表达TrxERV1、DsbC和proCPB。

18、将质粒pT7-0E-TS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pT7-0E-TS/pETCPB，命名为CPB31。该菌株表达ERV1、TrxsPDI和proCPB。

19、将质粒p0E和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E/pETCPB，命名为CPB41。该菌株表达ERV1和proCPB。

20、将质粒pTS和pETCPB同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pTS/pETCPB，命名为CPB42。该菌株表达TrxsPDI和proCPB。

三、胰蛋白酶原表达菌株的构建

1、将质粒pET-P转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET-P，命名为PTM1。该菌株表达PTm0。

2、将质粒p0E-TS和pET-P同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-TS/pET-P，命名为PTM2。该菌株表达ERV1、TrxsPDI和PTm0。

3、将质粒pET-TP转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/pET-TP，命名为PTM3。该菌株表达TrxA-PTm0。

4、将质粒p0E-TS和pET-TP同时转化到菌株BL21(DE3)中，获得菌株BL21(DE3)/p0E-TS/pET-TP，命名为PTM4。该菌株表达ERV1、TrxsPDI和TrxA-PTm0。

实施例3、N末端标签优化策略实现巯基氧化酶以及蛋白质二硫键异构酶的可溶性表达

培养菌株BL21(DE3)、WF1、WF2及WF3，当OD_600nm为0.3–0.4时加入L-阿拉伯糖诱导表达对应的巯基氧化酶(ERV1)和蛋白质二硫键异构酶(hPDI、sPDI或DsbC)，可溶性蛋白和包含体蛋白SDS-PAGE电泳结果如图43所示。ERV1、hPDI、sPDI和DsbC的蛋白分子量分别约为21.70kDa、52.05kDa、55.70kDa和23.51kDa。与对照BL21(DE3)相比，目的蛋白未出现条带。

将巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶基因的启动子更换为强度更强的T7启动子。培养菌株BL21(DE3)、WF4、WF5或WF6，加入诱导剂IPTG，表达对应的巯基氧化酶(ERV1)和蛋白质二硫键异构酶(hPDI、sPDI或DsbC)，可溶性蛋白和包含体蛋白SDS-PAGE电泳结果如图44所示。与对照BL21(DE3)相比，目的蛋白未出现条带。

巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶以可溶性的形式存在于细胞中表达一定水平时才能够发挥功能。对此，优化ERV1、hPDI、sPDI或DsbC的N末端标签(添加突变型trx标签、T7标签或GST标签)增强蛋白的可溶性表达能力。培养菌株BL21(DE3)、WF11、WF12、WF13和WF14，加入诱导剂IPTG，总蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图45所示。ERV1、TrxERV1、T7ERV1以及GSTERV1均能够产生可溶性蛋白。根据蛋白电泳条带大小，TrxERV1可溶性表达效果最优、ERV1次优。培养菌株BL21(DE3)、WF15、WF16、WF17和WF18，加入诱导剂IPTG，总蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图46所示。其中，TrxhPDI、T7hPDI以及GSThPDI可溶性表达效果较好，而hPDI表达效果不理想，总蛋白样品也未见明显条带。培养菌株BL21(DE3)、WF19、WF20、WF21和WF22，加入诱导剂IPTG，总蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图47所示。TrxsPDI具有很高的蛋白表达量以及很好的可溶性表达效果，T7sPDI和GSTsPDI有一定的可溶性表达，sPDI表达效果不理想。培养菌株BL21(DE3)、WF23、WF24、WF25和WF26，加入诱导剂IPTG，总蛋白和可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图48所示。DsbC、TrxDsbC、T7DsbC以及GSTDsbC均能够产生可溶性蛋白。

结论：

通过添加N末端标签策略极大程度提高了hPDI和sPDI的表达水平，并实现它们的可溶性表达。

实施例4、可溶性表达系统的构建

可溶性表达系统由能够可溶性表达的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶组成。根据实施例3的结果，优选ERV1或TrxERV1分别与TrxsPDI、GSTsPDI、TrxhPDI、T7hPDI、GSThPDI或DsbC组合，构建如下质粒：p0E-TS表达ERV1和TrxsPDI；p0E-GS表达ERV1和GSTsPDI；p0E-TH表达ERV1和TrxhPDI；p0E-7H表达ERV1和T7hPDI；p0E-GH表达ERV1和GSThPDI；p0E-0D表达ERV1和DsbC；pTE-TS表达TrxERV1和TrxsPDI；pTE-GS表达TrxERV1和GSTsPDI；pTE-TH表达TrxERV1和TrxhPDI；pTE-7H表达TrxERV1和T7hPDI；pTE-GH表达TrxERV1和GSThPDI；pTE-0D表达TrxERV1和DsbC。这些质粒装载的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶基因在来源于Salmonella enterica的阿拉伯糖启动子控制下，利用p15A ori-Cm^R骨架，可与装载目的基因的pET系列载体配合使用。

实施例5、proCPB的可溶性表达

培养菌株CPB0并诱导表达proCPB，如图49和52所示，猪羧肽酶原B以包涵体的形式存在于细胞中。

培养菌株WF11、WF12、WF13和WF14，加入诱导剂IPTG，可溶性蛋白和包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图51所示，猪羧肽酶原B主要以包涵体的形式存在于细胞中。proCPB与不带N末端标签的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶共表达未能实现可溶性表达。

随后，proCPB与添加了N末端标签的巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶共表达。根据图50的结果，将IPTG诱导浓度暂将至0.03mM。以E.coli BL21(DE3)为宿主，装载质粒pETCPB与实施例4中的质粒(p0E-TS、p0E-GS、p0E-TH、p0E-7H、p0E-GH、p0E-0D、pTE-TS、pTE-GS、pTE-TH、pTE-7H、pTE-GH或pTE-0D)。培养菌株CPB11、CPB12、CPB13、CPB14、CPB15、CPB16、CPB17、CPB18、CPB19、CPB20、CPB21和CPB22，加入诱导剂L-阿拉伯糖和IPTG，总蛋白、可溶性蛋白和包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图52所示。ERV1-TrxsPDI和TrxERV1-TrxsPDI可实现proCPB可溶性表达，而其他10种组合未能实现proCPB可溶性表达。

结论：

ERV1-TrxsPDI或TrxERV1-TrxsPDI组合可实现proCPB可溶性表达，证明巯基氧化酶联合蛋白质二硫键异构酶能够作为可溶性表达系统用于目的蛋白的可溶性表达。而且发明人发现如果不采用突变型trx标签，则无法实现可溶性表达。

实施例6、更换可溶性表达系统ERV1-TrxsPDI的启动子对proCPB表达可溶性的影响

以控制可溶性表达系统ERV1-TrxsPDI的启动子为单变量，将阿拉伯糖启动子变更为T7启动子，研究启动子对目的蛋白可溶性表达的影响。培养菌株CPB31，IPTG诱导ERV1、TrxsPDI和proCPB同时表达。总蛋白、可溶性蛋白和包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图53所示。

结论：

可溶性表达系统ERV1-TrxsPDI可促进目的蛋白proCPB可溶性表达，不受启动子种类限制。

实施例7、单独表达ERV1或TrxsPDI对猪羧肽酶原B表达可溶性的影响

可溶性表达系统包括ERV1和TrxsPDI两种蛋白。为研究单独表达ERV1或TrxsPDI对目的蛋白proCPB表达可溶性的影响，构建质粒p0E和pTS分别装载ERV1基因和TrxsPDI基因。培养菌株CPB41和CPB42，加入诱导剂L-阿拉伯糖和IPTG，总蛋白、可溶性蛋白和包涵体蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图54所示。ERV1与proCPB共表达时，proCPB主要以包涵体的形式存在，而且部分ERV1也以包涵体的形式存在。TrxsPDI与proCPB共表达时，TrxsPDI对proCPB的可溶性表达能够起到一定促进作用，但是大量的蛋白还是以包涵体的形式存在。

结论：

proCPB的可溶性表达是由巯基氧化酶和蛋白质二硫键异构酶共同作用下实现的。

实施例8、可溶性表达系统稳定性的研究

将保藏的菌株CPB11甘油菌涂布于含有Amp和Cm的LB平板，倒置于30℃的恒温培养箱中孵育约20h。挑取单菌落至含有Amp和Cm液体LB培养基(5mL)的试管中，在30℃、200rpm培养条件下孵育约12h，记为第0代。(转接第0代菌液后，加入L-阿拉伯糖和IPTG可实现猪羧肽酶原B的可溶性表达，如图55所示，诱导剂IPTG工作浓度调回0.3mM)。吸取50μL第0代菌液至含有Amp和Cm的液体LB培养基(5mL)中，在在30℃、200rpm培养条件下孵育约12h，记为第1代(有抗)。如此操作直至获得第21代(有抗)。转接第21代(有抗)至含有Amp和Cm的液体LB培养基(50mL)的摇瓶中培养，使初始OD_600nm为0.1，随后在30℃、200rpm的条件下继续培养。在OD_600nm为0.3–0.4时加入诱导物L-阿拉伯糖(工作浓度为2mg/mL)诱导ERV1和TrxsPDI表达。培养至OD_600nm为0.6–0.8时加入诱导物IPTG(工作浓度为0.3mM IPTG)诱导proCPB表达。随后，在20℃、200rpm的条件下继续培养15h，收集菌体，制备样品并进行SDS-PAGE蛋白电泳。

在第0代菌液基础上，按照上述的传代培养方法，但全过程不添加抗生素，获得第第21代(无抗)。同样按照上述蛋白表达方法，但全过程不添加抗生素，研究不添加抗生素时可溶性表达系统稳定性。

结论：本专利开发的可溶性表达系统在传代10天后，仍具有稳定性，且无需添加抗生素。

实施例9、重组CPB的活性鉴定

参照实施例5的方法表达蛋白，对菌株CPB11表达的目的蛋白进行纯化、活化以及活性测定。500ml的培养液离心后收集菌体沉淀。超声破菌后，离心，上清经DEAE-FF柱离子交换层析、胰蛋白酶活化proCPB生成CPB、Phenyl Sepharose FF疏水层析后，获得重组CPB纯品。利用Bradford法测定蛋白质含量，以马尿酰-L-精氨酸为底物测定CPB活性。1个酶活性单位(U)定义为，25℃，pH7.65，每min水解1μmol底物所需的酶量。经测定，重组CPB的比活性达到179.1u/mg。

实施例10、胰蛋白酶原的可溶性表达

为研究可溶性表达系统对胰蛋白酶原表达可溶性的影响，培养菌株PTM1和PTM2并诱导表达相关蛋白。菌株PTM1只过表达PTm0(24.38kDa)，菌株PTM2过表达ERV1、TrxsPDI和PTm0。如图56所示，菌株PTM1表达的部分PTm0蛋白以包涵体的形式存在，菌体生长受到严重抑制。而PTm0与可溶性表达系统共表达后，基本上以可溶性蛋白的形式的存在，并且相比于单独表达PTm0，菌体生长能力提高了77.3％。

如图57所示，TrxA标签来源于质粒pET32a，当添加在PTm0的N末端后，TrxA-PTm0蛋白主要以包涵体的形式存在于细胞中。而TrxA-PTm0在可溶性表达系统的作用下，可形成可溶性蛋白。

结论：

可溶性表达系统不受目的蛋白种类限制，可实现多种外源蛋白的可溶性表达。

序列表

<110> 江苏万邦医药科技有限公司

万新医药科技（苏州）有限公司

江苏万邦生化医药集团有限责任公司

<120> 一种可溶性表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcaaag caatcgacaa aatgaccgac aatcctccac aagaaggtct gagcggtcgc 60

aaaatcatct acgatgagga tggcaaaccg tgccgcagtt gcaatacgct gctggacttc 120

cagtacgtga ccggcaaaat cagcaacggt ctgaagaatc tgagcagcaa tggcaaactg 180

gcgggtaccg gtgcgctgac cggcgaagcc agtgaactga tgccgggcag ccgtacctat 240

cgcaaagttg atccgccgga cgtggaacag ctgggtcgca gcagctggac gctgctgcac 300

agtgttgccg ccagctaccc agcccagcca accgatcagc agaagggcga aatgaagcag 360

tttctgaaca tcttcagcca catctacccg tgcaactggt gcgcgaaaga tttcgagaaa 420

tatatccgcg aaaatgcgcc gcaagttgaa agtcgcgaag aactgggccg ctggatgtgc 480

gaggcccaca acaaggtgaa caagaagctg cgcaaaccga agttcgactg caacttctgg 540

gagaaacgat ggaaagatgg ctgggatgaa taa 573

<210> 2

<211> 1522

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggctgggat gaataactcg agtaaggagg atatttagat ggatgcgcca gaagaagaag 60

atcacgttct ggtgctgcgc aaaagtaatt tcgccgaagc gctggccgcc cacaagtatc 120

tgctggtgga attttatgcc ccgtggtgcg gccattgcaa agcgctggcc ccagaatacg 180

cgaaagccgc gggtaaactc aaagccgaag gcagcgagat ccgtctggcc aaagttgacg 240

ccaccgaaga aagcgatctg gcgcagcagt acggtgtgcg tggctacccg accatcaaat 300

tcttccgcaa tggcgatacc gccagtccga aagaatacac ggccggtcgc gaagcggatg 360

acatcgtgaa ctggctgaaa aagcgcaccg gcccagcggc gaccacgctg ccagatggtg 420

ccgcggccga aagcctcgtt gaaagcagcg aagtggccgt gattggcttc ttcaaggatg 480

tggaaagcga tagcgccaag cagtttctgc aagcggcgga agcgatcgac gatatcccgt 540

tcggcatcac cagcaatagc gacgtgttca gcaagtacca gctggataag gacggcgttg 600

tgctgtttaa aaaatttgac gaaggccgca ataacttcga aggcgaagtg accaaagaaa 660

atctgctgga cttcatcaaa cacaaccagc taccactggt gatcgagttc acggagcaga 720

ccgccccgaa aattttcggc ggcgagatca agacccatat tctgctgttt ctgccgaaaa 780

gcgttagtga ctacgacggc aaactcagca attttaagac cgccgcggag agcttcaaag 840

gcaaaattct gttcattttt attgacagcg atcacacgga taaccagcgc attctggagt 900

tcttcggtct caaaaaagag gaatgcccag ccgttcgtct gatcacgctg gaagaagaga 960

tgaccaagta taagccggag agcgaagaac tgacggcgga gcgtatcacg gaattttgcc 1020

accgctttct ggaaggcaag atcaaaccac atctgatgag ccaagaactg ccggaagact 1080

gggataaaca gccagtgaaa gtgctggtgg gcaaaaactt cgaggatgtt gccttcgatg 1140

agaagaaaaa tgtttttgtt gagttctacg ccccgtggtg tggccactgc aaacaactcg 1200

ccccgatctg ggacaaactg ggcgaaacct acaaagatca tgaaaatatc gtgatcgcca 1260

aaatggatag caccgccaat gaggttgaag ccgtgaaggt tcacagcttc ccaacgctga 1320

aatttttccc ggccagcgcg gaccgcaccg ttattgatta caacggcgaa cgcacgctgg 1380

atggcttcaa gaaatttctg gaaagcggtg gccaagatgg cgccggctaa gaattaattc 1440

atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 1500

tttccccgaa aagtgccacc tg 1522

<210> 3

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggctgggat gaataaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac atatgccaga 60

agatagtctt agcctcagtt ggccgccgac gctgagcatg aataccttca gccgcaccac 120

gtggtggctg gccgaatttt tcgccccgtg gtgcggccac tgtaaaaaca tggcgccgga 180

gtacgttaaa gcggccgaaa cgctggtgga aaagaatatc acgctggccc agatcgactg 240

caccgaaaac caagatttgt gcatggagca caacatcccg ggctttccga gtctgaaaat 300

ctttaaaaat agtgatgtga acaacagcat cgattacgaa ggcccgcgta ccgccgaagc 360

gatcgttcag ttcatgatca aacagagcca gccagccgtt gcggttgttg ccgatctgcc 420

ggcctatctg gcgaatgaaa cctttgtgac cccagtgatc gttcagagcg gtaaaatcga 480

cgcggacttc aatgccacgt tctatagcat ggccaataaa cattttaacg actacgattt 540

cgtgagcgcc gaaaacgccg aggacgactt caagctgagc atctatctgc caagcgcgat 600

ggatgagccg gtggtgtaca atggcaaaaa agccgacatc gcggatgccg acgtgttcga 660

aaaatggctg caagttgagg cgctgccata tttcggcgaa atcgatggca gcgtgttcgc 720

ccagtacgtt gaaagtggtc tgccgctggg ttatctgttc tataacgatg aagaagaact 780

ggaggagtac aagccgctct tcacggaact cgcgaaaaag aaccgcggtc tgatgaactt 840

cgtgagcatc gacgcccgta aattcggtcg ccacgccggt aatctgaaca tgaaggaaca 900

gttcccgctg ttcgcgatcc acgacatgac cgaggatctg aaatacggtc tgccgcagct 960

gagcgaagaa gccttcgacg agctgagcga caaaatcgtt ctggagagca aagcgattga 1020

accgctggtg aaggacttcc tcaaaggtga tgcgagccca atcgttaaaa gtcaagaaat 1080

cttcgagaat caagatagca gcgtgttcca gctggtgggc aagaaccacg atgagatcgt 1140

gaacgacccg aaaaaggatg tgctcgttct gtactatgcg ccgtggtgcg gtcattgcaa 1200

acgtctggcg ccaacctacc aagaactggc ggatacctac gccaacgcca cgagcgatgt 1260

gctgatcgcc aaactggacc acaccgaaaa tgacgttcgc ggcgttgtga tcgaaggcta 1320

cccgaccatc gttttctacc cgggtggcaa aaagagcgag agcgtggtgt atcaaggcag 1380

ccgcagtctg gacagtctgt ttgattttat caaggaaaat ggccacttcg atgtggatgg 1440

caaggcgctg tacgaggaag cccaagaaaa agcggcggaa gaagcggatg cggatgccga 1500

actggccgac gaagaggatg cgatccatga tgaactgtaa gaattaattc atgagcggat 1560

acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 1620

aagtgccacc tg 1632

<210> 4

<211> 781

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggctgggat gaataactcg agtaaggagg atatttagat ggacgcggca attcaacaaa 60

cgttagccaa aatgggcatc aaaagcagcg atattcagcc cgcgcccgta gctggcatga 120

agacagttct gactaacagc ggcgtgttgt acatcaccga tgatggtaaa catatcattc 180

aggggccaat gtatgacgtt agcggcacgg ctccggtcaa tgtcaccaat aagatgctgt 240

taaagcagtt gaatgcgctt gaaaaagaga tgatcgttta taaagcgccg caggaaaaac 300

acgtcatcac cgtgtttact gatattacct gtggttactg ccacaaactg catgagcaaa 360

tggcagacta taacgcgctg gggatcaccg tgcgttatct tgctttcccg cgccaggggc 420

tggacagcga tgcagagaaa gaaatgaaag ctatctggtg tgcgaaagat aaaaacaaag 480

cgtttgatga tgtgatggca ggtaaaagcg tcgcaccagc cagctgcgac gtggatattg 540

ccgaccatta cgtacttggc gtccagcttg gcgttagcgg tactccggca gttgtgctga 600

gcaatggcac acttgttccg ggttaccagc cgccgaaaga gatgaaagaa ttcctcgacg 660

aacaccaaaa aatgaccagc ggtaaataag aattaattca tgagcggata catatttgaa 720

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 780

g 781

<210> 5

<211> 1206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcaccaca gcggtgaaca cttcgagggc gaaaaggtgt ttcgtgtgaa cgttgaggac 60

gaaaacgata tcagcctgct gcatgagctg gcgagcaccc gtcagatcga cttctggaag 120

ccggatagcg tgacccaaat taaaccgcac agcaccgtgg acttccgtgt taaagcggaa 180

gacatcctgg cggttgagga ttttctggaa cagaacgagc tgcaatacga agtgctgatt 240

aacaacctgc gtagcgttct ggaggcgcag ttcgacagcc gtgtgcgtac caccggtcac 300

agctacgaaa agtataacaa ctgggaaacc atcgaggcgt ggaccaaaca agttaccagc 360

gagaacccgg atctgatcag ccgtaccgcg attggtacca cctttctggg caacaacatt 420

tacctgctga aggttggtaa accgggtccg aacaagccgg cgatcttcat ggattgcggt 480

tttcacgcgc gtgaatggat tagccatgcg ttctgccagt ggtttgtgcg tgaggcggtt 540

ctgacctacg gctatgaaag ccacatgacc gagttcctga acaaactgga cttttatgtg 600

ctgccggttc tgaacatcga tggttacatt tatacctgga ccaagaaccg tatgtggcgt 660

aaaacccgta gcaccaacgc gggtaccacc tgcattggta ccgacccgaa ccgtaacttt 720

gatgcgggtt ggtgcaccac cggtgcgagc accgacccgt gcgatgaaac ctactgcggc 780

agcgcggcgg agagcgaaaa ggagaccaaa gcgctggcgg actttatccg taacaacctg 840

agcagcatca aggcgtacct gaccattcac agctatagcc agatgattct gtacccgtat 900

agctacgatt ataaactgcc ggaaaacaac gcggagctga acaacctggc gaaggcggcg 960

gtgaaagagc tggcgaccct gtacggcacc aagtacacct atggtccggg tgcgaccacc 1020

atttatccgg cggcgggtgg cagcgatgat tgggcgtacg accaaggtat taagtatagc 1080

ttcacctttg aactgcgtga taaaggtcgt tacggcttta tcctgccgga gagccagatt 1140

caagcgacct gcgaggaaac catgctggcg attaaatacg tgaccaacta tgttctgggt 1200

cacctg 1206

<210> 6

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgccaactg atgatgatga taagattgtt ggtggttaca cttgtgctgc taattctatc 60

ccttaccaag tttctttgaa ctctggttct catttttgtg gtggttcttt gattaattct 120

caatgggttg tttctgctgc tcattgttac aagtctagaa tccaagttag attgggtgaa 180

cacaacattg atgttttgga aggaaatgag caattcatta acgctgctaa gattattact 240

cacccaaact tcaacggtaa cactttggat aacgatatca tgttgattaa attgtcttct 300

ccagctactt tgaactctag agttgctact gtttctttgc ctagatcttg tgctgctgct 360

ggtactgaat gtttgatttc tggttggggt aatactaagt cttctggttc ttcttaccca 420

tctttgttgc aatgtttgaa ggctcctgtt ttgtctgatt cttcttgtaa gtcttcttat 480

cctggtcaaa ttactggtaa catgatttgt gttggtttct tggaaggtgg taaagatgct 540

tgtcaaggag attctggtgg tccagttgtt tgtaatggtc aattgcaagg tattgtttct 600

tggggttatg gttgtgctca aaagaacaaa cctggtgttt acactaaggt ttgtaactac 660

gttaactgga ttcaacaaac tattgctgct aattaa 696

<210> 7

<211> 1538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatggcagaa attcgaagaa tagttacggc ttatgacatc tttgtggaca catcattcac 60

tttttattca catccggccc tgaactcgct aggacttgcc ccggtgcatt ttttaaatac 120

ccgcgaaaaa tagagctgat cgtcaaatcc aacattgcgc ccaacggtcg ctatcggcat 180

tcgcgtagtg ctaagcagaa gtttcgcctg gctgatacgc tgatcttcgc gccagctcaa 240

tacgctaatg cctaactgct ggcggaacag atgtgataac cgggagggcg acaggcagac 300

atgctgggcg acgctggcga tatcaaaatg gctgtccgcc agatggtcgc tgatatactg 360

gcaggcatcg cgcacacggc tatccatcgg cgggtgcaac gactcattaa ttaccgccat 420

acgtctgagc aacaactgct ccagcagatt gatcgccagt agctcagaat agcgaccttc 480

cccttgcccg gcgctgatga tctgcccgaa cagttcgctg aaatgcggct ggcgcgcctc 540

gtccgggcgg aaaaatcctg tctgggcaaa gattgtcggc caggtcagcc actcctgcca 600

gtaggcgcga ggccggaaat aaacccactg gtgataccac tcgctggcgt ccggatgccg 660

tccatagtga tgaatctcgc ccggcggaaa caataatata tcgccaggcc gacagacaaa 720

ctgctcgcca ttattattaa tgacgccctc tccgcggatg gtcaggttaa gaatatatcc 780

cttcatgccc aacggacgat cgataaaaaa atccagatat ccattcgctt caattggcgt 840

cagcccggcg accagatggg cattaaatga atatcccggc aatagcggat cattttgcgt 900

ttcagccatg atttctctac cccccgatgt tcagagaaga accaaattgt ccatatcgac 960

caggacgaca gagcttccgt ctccgcaaga ctttgcgctt gatgaaagca cgtatcaacc 1020

ccgcttgtga aaagcgcttt gtaacaaaag cgtacagttc aggcgataaa attaagtaac 1080

agaagtgtct ataactatgg ctggaatgtc cacattgaat atttgcacag cgtcacactt 1140

tgcaaagcat tagcattttt gtccataaga ttagcggatc ctgcctgacg gtttttgccg 1200

cgactctcta taatttctcc atacctgttt ttctggatgg agtaagacca tggctatgga 1260

ttgtggagac gtttagatgg cgattgcaat tggcctcgat tttggcagtg attctgtgcg 1320

agctttggcg gtggactgcg ccagcggtga agagatcgcc accagcgtag agtggtatcc 1380

ccgttggtaa tttctgcttt cgtaataatt cacggccctg catgcaagct cagatctgag 1440

cttggctgtt ttggcggatg agagaagagg tcgactctag aggatctact agtcataggc 1500

gccgatatca gatccggtac caagcttatc gatgataa 1538

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagcgaca agattcacct gaccgacgat agcttcgaca ccgatgttct gaaggcggat 60

ggt 63

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tg 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggtt cc 42

Claims

1.一种原核生物可溶性表达系统，其特征在于，所述可溶性表达系统具有巯基氧化酶基因和蛋白质二硫键异构酶基因；所述蛋白质二硫键异构酶基因前具有突变型trx标签。

2.根据权利要求1所述的可溶性表达系统，其特征在于，巯基氧化酶基因为ERV1，序列如SEQ ID NO.1所示；蛋白质二硫键异构酶基因选自序列如SEQ ID NO.2所示的hPDI、序列如SEQ ID NO.3所示的sPDI或序列如SEQ ID NO.4所示的DsbC。

3.根据权利要求1所述的可溶性表达系统，其特征在于，巯基氧化酶基因前也具有突变型trx标签。

4.根据权利要求1所述的可溶性表达系统，其特征在于，突变型trx标签序列如SEQ IDNO.8所示。

5.根据权利要求1所述的可溶性表达系统，其特征在于，还包括启动子序列；优选的，启动子为阿拉伯糖启动子或T7启动子。

6.包含权利要求1～5任一项所述的表达系统的载体。

7.包含权利要求1～5任一项所述的表达系统或权利要求6所述的载体的试剂盒。

8.一种原核生物可溶性表达目标蛋白的方法，其特征在于，用带有权利要求1～5任一项所述的表达系统的载体转化原核宿主细胞，所述原核宿主细胞中还同时具有目标蛋白表达载体。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白要求形成至少两个链内或链间二硫键以获得生物学活性；优选的，所述目标蛋白为羧肽酶B或胰蛋白酶原。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述原核宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)。