CN115725000A

CN115725000A - 用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115725000A
Application number: CN202211564784.1A
Authority: CN
Inventors: 王朝; 高甜甜
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2022-12-07
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2023-03-03

Abstract

本发明公开了一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白及其制备方法和应用，属于重组蛋白技术领域，这种双标签重组蛋白包括纯化标签、目的蛋白、于目的蛋白的一端依次连接的第一蛋白酶切位点和第一促溶标签、以及于目的蛋白的另一端依次连接的第二蛋白酶切位点、第二促溶标签；通过构建双标签重组蛋白表达载体，制备双标签重组蛋白，应用于小肽的表达、纯化，以解决蛋白质体外可溶性表达时，结构简单的小肽序列在体外易降解，不易被纯化的问题。本发明适用于易降解小肽的体外表达纯化。

Description

用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于重组蛋白技术领域，涉及一种双标签重组蛋白，具体地说是用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是有机体的重要组成部分，在体外表达纯化出用于结构和功能分析的蛋白质是蛋白组学的研究基础。在蛋白质的体外表达系统中，大肠杆菌作为原核表达系统的代表性宿主菌，具有遗传背景清晰、表达周期短、操作简单及成本低等优点，是蛋白质体外表达的优先选择。但是，外源蛋白在大肠杆菌中表达量较大时，由于中间体不能完成折叠等原因，易进行不溶性表达，产生包涵体，包涵体的不正确空间结构导致其没有生物学活性，无法直接纯化与应用。

目前，为避免外源蛋白在大肠杆菌中表达形成包涵体，常用的手段是将Trx、MBP、GST或SUMO等大分子促溶标签基因构建至目的蛋白基因的一端，用于表达重组蛋白，以增强目的蛋白可溶性。但这种单标签重组蛋白表达载体，对于目的蛋白和亲和标签的大小有严格要求，仅在目的蛋白片段较长且结构稳定的情况下，能取得较好的表达及体外纯化效果；而当目的蛋白为神经肽等结构简单的小肽序列时，由于小肽序列仅由几个至十几个氨基酸构成，结构稳定性较差，在体外易降解，不易被纯化。

例如，中国专利文献CN103819563A和CN108508210A分别提供了一种MBP-tag和目的蛋白融合表达然后纯化的方法，虽然MBP-tag单标签重组蛋白表达载体显著降低了融合蛋白表达形成包涵体，提高可溶性表达，但MBP-tag分子过于庞大，用于小肽序列表达与纯化时，存在影响目的蛋白结构稳定性的问题，小肽序列在体外易降解，给蛋白纯化增大难度。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是要提供一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白及其制备方法和应用，这种双标签重组蛋白中，含有纯化标签、且目的蛋白两端分别构建有一个促溶标签；通过构建双标签重组蛋白表达载体，应用于小肽的表达、纯化，以解决蛋白质体外可溶性表达时，结构简单的小肽序列在体外易降解，不易被纯化的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，所述双标签重组蛋白包括纯化标签、目的蛋白、于目的蛋白的一端依次连接的第一蛋白酶切位点和第一促溶标签、以及于目的蛋白的另一端依次连接的第二蛋白酶切位点、第二促溶标签；

其中，所述纯化标签连接于蛋白酶切位点远离目的蛋白的一端；

优选地，构成目的蛋白的氨基酸数目为28-43个；

所述目的蛋白中不含有所述第一蛋白酶切位点或第二蛋白酶切位点。

正如本领域技术人员所知晓的，蛋白质具有氨基端(N端)和羧基端(C端)。当所述目的蛋白的一端为N端时，所述目的蛋白的另一端为C端；当所述目的蛋白的一端为C端时，所述目的蛋白的另一端为N端。

其中，纯化标签还可以是His,Strep,HA,Flag,Myc等，而促溶标签还可以是Trx，MBP,GST,SUMO,GB1,NusA等大分子标签，蛋白酶切位点还可以是TEV,Thrombin,Factor Xa,PreScission等。

作为本发明的一种限定，所述目的蛋白为神经肽(Neuropeptide)。

作为本发明的另一种限定，所述目的蛋白为甘丙肽、内咖肽、降钙素基因相关肽、肽YY、血管活性肠肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽或促肾上腺皮质激素释放激素。

其中，上述目的蛋白的氨基酸序列如下：

甘丙肽(GAL)：GWTLNSAGYLLGPHAVGNHRSFSDKNGLTS，记为SEQ ID

NO.1；

内咖肽(β-END)：YGGFMTSEKSQTPLVTLFKNAIIKNAYKKGE，记为SEQ ID NO.2；

降钙素基因相关肽(α-CGRP)：

ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF，记为SEQ ID NO.3；

肽YY(PYY)：YPIKPEAPREDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY，记为SEQ ID NO.4；

血管活性肠肽(VIP)：HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN，记为SEQ ID NO.5；

胰高血糖素(Glucagon)：HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT，记为SEQ ID NO.6；

生长抑素(Somatostatin)：SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC，记为SEQ ID NO.7；

胰多肽(PP)：APLEPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRYINMLTRPRY，记为SEQ ID NO.8；

组甲肽(PHM)：GPGSHADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLMEFLVPR，记为SEQ ID NO.9；

垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)：

HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK，记为SEQ IDNO.10；

促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)：

SEEPPISLDLTFHLLREVLEMARAEQLAQQAHSNRKLMEIIGK，记为SEQ ID NO.11。

作为本发明的第三种限定，所述促溶标签为Trx-tag或GB1-tag；所述蛋白酶切位点为PreScission蛋白酶切位点或Thrombin蛋白酶切位点。

其中，PreScission蛋白酶切位点的氨基酸序列为：LEVLFQGP；Thrombin蛋白酶切位点的氨基酸序列为：LVPRGS。

作为本发明的第三种限定，所述纯化标签为His-tag。

其中，His-tag为6个组氨酸组成的短肽，优选地，采用6个His-tag(6*His)，以提高纯化效果。

作为本发明的进一步限定，所述蛋白酶切位点和促溶标签之间连接有蛋白质linker序列；优选地，采用氨基酸序列GGGGG或SSG为蛋白质Linker序列，柔性的氨基酸链有利于蛋白构象的形成，避免蛋白折叠遮挡酶切位点，使蛋白酶能更高效地识别酶切位点，行使功能。

本发明还提供了一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的制备方法，包括依次进行的以下步骤：

S1、构建上述的双标签重组蛋白的表达载体；

S2、将S1所得双标签重组蛋白的表达载体转化至表达菌株，经培养，表达双标签重组蛋白；

S3、收集表达菌株菌体，破碎，利用纯化标签进行纯化，得双标签重组蛋白。

其中，表达菌株包括大肠杆菌BL21。

作为本发明的进一步限定，所述纯化的方法包括亲和层析和分子筛层析。

本发明也提供上述用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的应用，它是取上述的双标签重组蛋白，用于分离目的蛋白。

作为本发明的进一步限定，取所述双标签重组蛋白，采用第一蛋白酶切位点和第一蛋白酶切位点对应的蛋白酶，进行酶切，对酶切产物利用纯化标签进行分离，得目的蛋白。

由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

本发明的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白中含有纯化标签，且目的蛋白两端分别构建有一个蛋白酶切位点和促溶标签，蛋白两端的两个促溶标签增强外源目的蛋白可溶性表达的同时，避免了蛋白两端的暴露，尤其，显著增强了神经肽等易降解的小肽目的蛋白的稳定性；其中的蛋白酶切位点便于后续通过蛋白酶切分离目的蛋白，而纯化标签则有助于目的蛋白的纯化。

本发明通过构建双标签重组蛋白表达载体，应用于小肽的表达、纯化，解决了神经肽等结构简单的小肽序列，在体外可溶性表达时，易降解，不易被纯化的问题。

下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。

附图说明

图1为本发明实施例1中pET.32M.3C载体的质粒图谱；

图2为本发明实施例1中pET.32M.3C-GB1载体的质粒图谱；

图3为本发明实施例1中双标签重组蛋白的结构示意图；

图4为本发明实施例1中甘丙肽单标签重组蛋白的分子筛层析所得紫外吸收峰图；

图5为本发明实施例1中甘丙肽双标签重组蛋白的分子筛层析所得紫外吸收峰图；

图6为本发明实施例1中甘丙肽单标签重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；

图7为本发明实施例1中甘丙肽双标签重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图；

图8为本发明实施例1中目的蛋白为其它神经肽时，单标签重组蛋白和双标签重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图；

图9为本发明实施例2中分离目的蛋白所得紫外吸收峰图，左边为采用Superdex75纯化柱分离所得紫外吸收峰图，右边为采用Histrap层析柱分离所得紫外吸收峰图；

图10为本发明实施例2中16.5％Tricine-SDS-PAGE电泳结果图；图10A目的蛋白为甘丙肽，图10B目的蛋白为内咖肽，图10C目的蛋白为肽YY，图10D目的蛋白为血管活性肠肽，图10E目的蛋白为胰高血糖素，图10F目的蛋白为生长抑素，图10G目的蛋白为胰多肽，图10H目的蛋白为促肾上腺皮质激素释放激素，图10I目的蛋白为降钙素基因相关肽。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

本发明实施例中所使用的质粒载体、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。

所用的培养基和部分试剂包括：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，ddH₂O定容至1L，121℃高压灭菌20分钟。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂糖15g，ddH₂O定容至1L，121℃高压灭菌20分钟，降至55℃左右在超净台中倒平板。

Ni-NTA亲和层析缓冲液：

8×Binding buffer：Tris 19.35g，咪唑2.73g，氯化钠234g，ddH₂O定容至1L。

4×Elution buffer：Tris 9.68g，咪唑272g，氯化钠116.88g，ddH₂O定容至1L。

4×Strip buffer：Tris 9.68g，Na₂EDTA 148.8g，氯化钠117g，ddH₂O定容至1L。

分子筛缓冲液General buffer：4M氯化钠50mL，4MTris50ml，1MNaEEDTA2mL，2MDTT1mL，ddH₂O定容至2L，抽滤后，40％功率超声10分钟。

实施例中的分子生物学实验操作包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如转化采用的感受态细胞法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

实施例1用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的制备方法

本实施例包括依次进行的以下步骤：

S1、构建双标签重组蛋白的表达载体

采用同源重组的方法，将GB1-tag基因序列插入至pET.32M.3C载体EcoRΙ和XhoΙ两个酶切位点之间，其中，pET.32M.3C载体(pET载体系列，上游带有Trx tag和3C蛋白酶切位点)质粒图谱如图1，设计上下游引物，如表1，使上游引物包含Thrombin蛋白酶切位点基因序列和由5个甘氨酸组成的蛋白Linker序列所对应的基因序列。具体构建步骤如下：

表1引物序列

引物名称	序列编号	5’-3’序列
			上游引物	SEQ ID NO.12	cccggatccgaattcctggttccgcgtggctctggtggtggtggtggtatgcagtacaaactgat
下游引物	SEQ ID NO.13	gtggtggtggtgctcgagttcggtaacggtgaa

(1)PCR扩增

反应体系：模板DNA(100ng/μL含GB1基因序列)0.6μL，上下游引物各1.2μL，2×Phanta Master Mix 15μL，ddH₂O 12μL混匀离心后放入PCR仪进行扩增。

反应条件：95℃预变性3min后开始循环，95℃变性15s，58℃退火30秒，72℃延伸20s(本领域技术人员可根据目的基因长度设定1kb/min)，共35个循环，72℃终延伸5min，25℃降温1min。

(2)载体双酶切

反应体系及反应条件：载体DNA(100ng/μLpET.32M.3C载体)15μL，1μL限制性内切酶1，1μL限制性核酸内切酶2，CutSmart缓冲液3μL，ddH₂O12μL；金属浴37℃反应4h。

(3)胶回收

在PCR扩增产物和酶切后的载体中各加入3μL10×DNA Loading buffer混匀后加进凝固好的1％琼脂糖凝胶的孔槽中，130V电泳25min；通过凝胶成像仪确定目的条带，切下后使用胶回试剂盒提取目的DNA。

(4)同源重组

反应体系：酶切载体6μL，目的基因1μL，5×CEⅡbuffer 2μL,ExnaseⅡ1μL。混匀离心后放入金属浴37℃反应30分钟。

(5)转化

将重组产物全部加入DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，42℃热激1min15s后放入冰上冷却2分钟。加入100μL的LB液体培养基，37℃孵育45分钟，涂布于氨苄青霉素抗性的平板上，放入37℃恒温培养箱培养12h。

(6)质粒提取与检测

挑选单个菌落进行PCR扩增，挑选菌落PCR筛选出的阳性克隆，加入10mL氨苄抗性的LB液体培养基中，放入37℃摇床中培养12h，3900rpm离心10min收集菌体，使用质粒小提试剂盒提取质粒，进行测序，测序正确即为载体pET.32M.3C-GB1，质粒图谱如图2。

(7)目的蛋白连接入载体pET.32M.3C-GB1

确定甘丙肽、内咖肽、降钙素基因相关肽、肽YY、血管活性肠肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽和促肾上腺皮质激素释放激素的基因序列，共11个；

参照(1)-(6)中的方法，通过同源重组，分别将上述11个基因序列插入pET.32M.3C-GB1载体BamH1和EcoR1两个酶切位点之间，构建得11种双标签重组蛋白的表达载体。

S2、双标签重组蛋白的表达载体的表达

将11种双标签重组蛋白的表达载体分别转化至大肠杆菌BL21中，涂布于氨苄抗性的平板上，放入37℃恒温培养箱培养12h，挑菌至10mL含有氨苄抗性的LB液体培养基中，放入37℃摇床培养6h后，转入1L氨苄抗性的LB液体培养基继续扩大培养至OD₆₀₀为0.6，转至16℃摇床降温20min，加入终浓度为0.25mM的IPTG诱导双标签重组蛋白表达，16℃继续培养18h，使双标签重组蛋白充分表达。

S3、双标签重组蛋白的纯化

(I)裂解提纯：取S2中培养18h后的11株菌株，3900rpm离心15min，分别收集菌体。将菌体用50mL的1×Binding buffer重悬，加入1mL50mM的PMSF，在600Bar的压力下循环破菌5min，降至压力为0后收集菌体，4℃13000rpm离心30min收取上清。

(II)Ni-NTA亲和层析粗提纯

用1×Binding buffer冲洗硫酸镍处理过的层析柱3个柱体积，将离心后的上清加入层析柱中4℃孵育25min，使重组蛋白与镍柱结合，流出上清；再使用1×Binding buffer冲洗层析柱2个柱体积，加入15mL的Elution buffer4℃孵育30min洗脱重组蛋白，镍柱使用结束后倒入1个柱体积的1×Strip buffer。

(III)分子筛纯化

使用AKTA Pure仪器过分子筛，纯化柱采用Superdex200，缓冲液为Generalbuffer，使用前用General buffer平衡1个柱体积。将收集的15mL的Elution buffer通过0.22μm的滤膜过滤后通过AKTA Pure系统上样至Superdex200层析柱，设定程序以0.5的压力，3mL/min的流速收集样品；紫外吸收峰图中，出峰的位置，即对应纯化出的双标签重组蛋白。

本实施例共纯化出双标签重组蛋白11个，双标签重组蛋白的结构示意图如图3，包括纯化标签His-tag、目的蛋白、于目的蛋白的一端依次连接的PreScission蛋白酶切位点和Trx-tag、以及于目的蛋白的另一端依次连接的Thrombin蛋白酶切位点、GB1-tag；

其中，His-tag连接于蛋白酶切位点远离目的蛋白的一端；

目的蛋白中不含有PreScission蛋白酶切位点或Thrombin蛋白酶切位点。

11个双标签重组蛋白中，目的蛋白分别为甘丙肽、内咖肽、降钙素基因相关肽、肽YY、血管活性肠肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽和促肾上腺皮质激素释放激素。

对比例：单标签重组蛋白和双标签重组蛋白体外表达和蛋白降解情况对比(一)制备单标签重组蛋白：

按照实施例1中步骤(7)的方法，通过同源重组，分别将实施例1中的目的蛋白基因序列插入至pET.32M.3C载体中BamH1和Xho1两个酶切位点之间，构建得单标签重组蛋白表达载体。

按照实施例1中S2和S3的方法，使单标签重组蛋白表达载体在体外表达，经分子筛层析，纯化得单标签重组蛋白。

(二)体外表达和蛋白降解情况对比：

对单标签重组蛋白和双标签重组蛋白纯化过程所得样品进行SDS-PAGE电泳，以对比体外表达和蛋白降解情况。所得样品包括破菌后的取样，记为W；离心后上清取样，记为S；镍柱纯化后取样，记为E；分子筛纯化后蛋白峰不同收集管数内的样品取样，依次记为44-47。其中，M代表蛋白Marker。

目的蛋白为甘丙肽时，甘丙肽单标签重组蛋白和甘丙肽双标签重组蛋白的分子筛层析所得紫外吸收峰图，峰尖两端对应的样品即为纯化出的重组蛋白。如图4和图5，表明本发明能够成功体外表达单标签重组蛋白和双标签重组蛋白；甘丙肽单标签重组蛋白和甘丙肽双标签重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果如图6-7，对比可以明显看出，使用双重标签后，重组蛋白的降解情况得到明显改善。

目的蛋白为其它神经肽时，SDS-PAGE电泳结果如图8，其中，泳道1、3、5、7、9、11和13依次是目的蛋白为生长抑素、胰高血糖素、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽、降钙素基因相关肽、内咖肽和血管活性肠肽对应的单标签重组蛋白；泳道2、4、6、8、10、12和14则依次为上述7个目的蛋白对应的双标签重组蛋白。图8表明，单标签重组蛋白都发生了不同程度的降解，而双重标签重组蛋白较稳定，两者对比可以看出使用双重标签后蛋白降解情况得到改善。

目的蛋白为其它神经肽时，采用上述实验方法也得到了类似结果，即双重标签不影响重组蛋白体外表达，且所得重组蛋白稳定性好，不易降解。

实施例2用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的应用

本实施例应用实施例1制得的双标签重组蛋白进行目的蛋白分离，具体过程如下：

蛋白酶酶切：取实施例1制得的11个双标签重组蛋白，分别使用浓缩管3700rpm离心至10mL，加入Thrombin和PreScission蛋白酶4℃过夜切除标签(Tag)。

分离目的蛋白：利用His-tag通过Histrap层析柱分离，使用Histrap层析柱时，先用ddH₂O以1mL/min的流速冲洗柱子5个柱体积，洗去柱内乙醇，再使用Equilibrium buffer以3mL/min的流速平衡5个柱体积；上样后设定程序以0.5的压力，2mL/min的流速收集目的蛋白，其中，目的蛋白先流出，紫外吸收峰图中第一个峰代表目的蛋白，第二个峰代表Tag。

在另外的实施方式中，本领域技术人员采用Superdex75纯化柱参照(III)中方法，分离目的蛋白，也成功分离得到目的蛋白：甘丙肽、内咖肽、降钙素基因相关肽、肽YY、血管活性肠肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽和促肾上腺皮质激素释放激素。其中，目的蛋白分子量小，在紫外吸收峰图中位于第二个峰。

目的蛋白为甘丙肽时，如图9，左边为采用Superdex75纯化柱分离所得紫外吸收峰图，右边为采用Histrap层析柱分离所得紫外吸收峰图，其它神经肽纯化过程中也得到相似峰图。结果表明，两种方式均能分离目的蛋白，表明本发明的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白经表达、纯化，能成功分离得到易降解的神经肽。

分离目的蛋白结果验证：

目的蛋白为：甘丙肽(图10A)，内咖肽(图10B)，肽YY(图10C)，血管活性肠肽(图10D)，胰高血糖素(图10E)，生长抑素(图10F)，胰多肽(图10G)，促肾上腺皮质激素释放激素(图10H)，降钙素基因相关肽(图10I)时，对双标签重组蛋白纯化和目的蛋白分离过程所得样品进行16.5％Tricine-SDS-PAGE电泳，以验证目的蛋白分离情况。所得样品包括破菌后的取样，上样于至泳道1；离心后上清取样，上样于泳道2；镍柱纯化后取样，上样于泳道3；分子筛纯化后取样，上样于泳道4；蛋白酶酶切后取样，上样于泳道5；分离出的Tag取样，上样于泳道6；分离出的目的蛋白取样，上样于泳道7。其中，M代表蛋白Marker(kDa)。

结果如图10，图中泳道4与前三个泳道对比可以看出经过双标签重组蛋白的纯化能得到纯净稳定的重组蛋白样品；泳道5中，经过PreScission和Thrombin两种蛋白酶切后，蛋白标签与目的蛋白分离，从上到下三个蛋白条带依次是Trx标签、GB1标签与目的蛋白；泳道6为Histrap分离后Tag峰取样，两条蛋白条带分别代表Trx-tag和GB1-tag；泳道7为使用本发明的方法分离所得目的蛋白。结果表明，本发明的双标签重组蛋白进行表达纯化后能成功分离目的蛋白，目的蛋白稳定性好，不易降解。

需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。

Claims

1.一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述双标签重组蛋白包括纯化标签、目的蛋白、于目的蛋白的一端依次连接的第一蛋白酶切位点和第一促溶标签、以及于目的蛋白的另一端依次连接的第二蛋白酶切位点、第二促溶标签；

2.根据权利要求1所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述目的蛋白为神经肽。

3.根据权利要求1所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述目的蛋白为甘丙肽、内咖肽、降钙素基因相关肽、肽YY、血管活性肠肽、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、组甲肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽或促肾上腺皮质激素释放激素。

4.根据权利要求1所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述促溶标签为Trx-tag或GB1-tag；

所述蛋白酶切位点为PreScission蛋白酶切位点或Thrombin蛋白酶切位点。

5.根据权利要求1所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述纯化标签为His-tag。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白，其特征在于，所述蛋白酶切位点和促溶标签之间连接有蛋白质Linker序列。

7.一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括依次进行的以下步骤：

S1、构建权利要求1-6中任一项所述的双标签重组蛋白的表达载体；

8.根据权利要求7所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述纯化提纯的方法包括亲和层析和分子筛层析。

9.一种用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的应用，其特征在于，取权利要求7所述的双标签重组蛋白，用于分离目的蛋白。

10.根据权利要求9所述的用于表达、纯化小肽的双标签重组蛋白的应用，其特征在于，取所述双标签重组蛋白，采用第一蛋白酶切位点和第一蛋白酶切位点对应的蛋白酶，进行酶切，对酶切产物利用纯化标签进行分离，得目的蛋白。