CN108774634A - 重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法 - Google Patents

重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET‑21b‑SUMO蛋白酶表达质粒的构建；S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析、Superdex 200凝胶过滤层析等方法对目标蛋白酶进行提纯，大幅缩短了目标蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。

Description

重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法
技术领域
本发明涉及聚合物反应领域，具体为重组SUMO蛋白酶在大肠 杆菌中的生产方法。
技术背景
目前，蛋白产量及活性不高是异源蛋白表达尤其是毒性蛋白表达 的技术瓶颈。随着生物技术的发展，研究者应用融合表达策略克服毒 性及难溶性蛋白的表达难关。
自2004年以来，SUMO作为融合标签越来越多地用于表达系统 中。SUMO比传统的融合标签如硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽 糖结合蛋白等具有更大的优势，除了具有传统融合标签的促进可溶性 的特性外，还具有分子伴侣功能，能促进目的蛋白的正确折叠等特点， 同时对热和蛋白酶有很强的抗性，有利于保持目的蛋白的稳定性。
SUMO融合标签的更大的优势在于其具有与其配套的SUMO 蛋白酶。SUMO蛋白酶具有较强的专一性，它所识别的区域并非其 他丝氨酸蛋白酶或化学试剂的一级序列，而是蛋白质的三维结构，因 此导致其切割效率高而且不具有非特异性。SUMO蛋白酶识别 SUMO三级结构后，能从SUMO末端的双甘氨酸处将目的蛋白从融 合蛋白上切割下来，不存在任何氨基酸残留，因而较适用于表达天然 序列的重组蛋白。
SUMO蛋白酶能特应性地切割含SUMO位点的融合蛋白，SUMO 蛋白酶切位点常被用于客户融合蛋白标签的切除，高纯度和高活性的 SUMO蛋白酶的研制成功将产生一定的商业价值。
目前，市场上SUMO蛋白酶，生物活性普遍较低，而且常见的 SUMO蛋白酶生产方法，步骤繁琐，成本较高。因此，研发一种重组 SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，实现高纯度重组SUMO蛋 白酶的制备，从而节省实验步骤并减少成本，是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的在于：提供重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生 产方法，以解决上述技术问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建；
S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；
S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。
优选地，所述的步骤S1，具体分如下步骤：
a、根据密码子优化后的基因序列，SUMO蛋白酶直接进行基因 合成；
b、将PET-21b载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基 因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；
c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置 30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液 体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL 氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；
d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含 氨苄青霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过 夜，抽提质粒并Sanger法测序。
优选地，所述的步骤S2，具体分如下步骤：
a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的 PET-21b-SUMO蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含 氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；
b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含氨苄青霉素抗性 的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100 的比例接菌液于4ml含氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养2.5h， OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱 导蛋白表达；
c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收 集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后 12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％ 聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观 察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示在诱导表达后的菌体中出现与 SUMO蛋白酶理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该 条带存在，证明了SUMO蛋白酶表达正常。
优选地，所述步骤S3，具体分如下步骤：
a、将S2-a步骤中过夜培养已转入PET-21b-SUMO蛋白酶质粒的 BL21(DE3)菌液以体积比1:100的比例接于800ml含氨苄青霉素 LB中，37℃、220rpm条件下培养2h左右，OD600nm达到0.6-0.8 时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000 rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；
b、将-20℃冻存菌体加入细胞裂解液(比例为：1g菌体对应5mL 细胞裂解液)，使用超声波破碎仪，低温条件下超声3秒，停10秒， 共运行10分钟进行破菌，4℃、16000rpm条件下离心15min，分 离上清液与沉淀；
c、分别取上清液、沉淀，并采用SDS-PAGE法进行检测，检测 结果为破碎后上清和沉淀中均有与SUMO蛋白酶理论分子量一致的 条带，上清中含有80％以上蛋白酶，说明破碎结果良好；
d、将S3-b步骤中分离的上清液，置于干净的50ml的离心管中 加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，先用细胞裂解液100ml清洗，再用 含有20mM/L咪唑的洗脱液30ml进行洗脱，然后含有500mM/L咪 唑的洗脱液5ml进行洗脱，最后将洗脱液以SUMO蛋白酶储存液作 为流动相过分子筛Superdex 200，根据280nm紫外吸收值收集目的 蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测，从而 制得纯化的SUMO蛋白酶。
优选地，在步骤S3-b、S3-d中，所述细胞裂解液中含有20mM/L 的三羟甲基氨基甲烷、300mM/L的氯化钠、重量百分比为10％的甘 油，所述细胞裂解液PH为8.0。
本发明的有益效果在于：
本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组 SUMO蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析和Superdex 200 凝胶过滤层析对SUMO蛋白酶进行提纯，整个纯化过程仅需5～6h， 简单的两步纯化方式整体大幅缩短了SUMO蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了SUMO蛋白酶的纯度、得率和酶活，并且融合 有His标签的SUMO蛋白酶可对带有His标签的靶蛋白进行酶切后 纯化，收集酶切后Ni柱流出液即可得到浓度及纯度较高的天然蛋白， 与其他的酶切纯化方式相比节省实验步骤并减少成本。该SUMO蛋 白酶纯化工艺的新方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基 础。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作 进一步的说明。
实施例1：
重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：
S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建，具体分如下步骤：
a、根据密码子优化后的基因序列，SUMO蛋白酶直接进行基因 合成；
b、将PET-21b载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基 因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；
c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液 体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL 氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；
d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含 氨苄青霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过 夜，抽提质粒并Sanger法测序。
S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定，具体分如下步骤：
a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的 PET-21b-SUMO蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含 氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；
b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含氨苄青霉素抗性 的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100 的比例接菌液于4ml含氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养2.5h， OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱 导蛋白表达；
c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收 集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后 12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％ 聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观 察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示在诱导表达后的菌体中出现与 SUMO蛋白酶理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该 条带存在，证明了SUMO蛋白酶表达正常。
S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定，具体分如下步骤：
a、将S2-a步骤中过夜培养已转入PET-21b-SUMO蛋白酶质粒的 BL21(DE3)菌液以体积比1:100的比例接于800ml含氨苄青霉素 LB中，37℃、220rpm条件下培养2h左右，OD600nm达到0.6-0.8 时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000 rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；
b、将-20℃冻存菌体加入细胞裂解液(比例为：1g菌体对应5mL 细胞裂解液)，使用超声波破碎仪，低温条件下超声3秒，停10秒， 共运行10分钟进行破菌，4℃、16000rpm条件下离心15min，分 离上清液与沉淀；
c、分别取上清液、沉淀，并采用SDS-PAGE法进行检测，检测 结果为破碎后上清和沉淀中均有与SUMO蛋白酶理论分子量一致的 条带，上清中含有80％以上蛋白酶，说明破碎结果良好；
d、将S3-b步骤中分离的上清液，置于干净的50ml的离心管中 加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，先用细胞裂解液100ml清洗，再用 含有20mM/L咪唑的洗脱液30ml进行洗脱，然后含有500mM/L咪 唑的洗脱液5ml进行洗脱，最后将洗脱液以SUMO蛋白酶储存液作 为流动相过分子筛Superdex 200，根据280nm紫外吸收值收集目的 蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测，从而 制得纯化的SUMO蛋白酶。
其中，在步骤S3-b、S3-d中，所述细胞裂解液中含有20mM/L 的三羟甲基氨基甲烷、300mM/L的氯化钠、重量百分比为10％的甘 油，所述细胞裂解液PH为8.0。
上述对发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述 方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的这种非 实质改进，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合 的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、PET-21b-SUMO蛋白酶表达质粒的构建；
S2、SUMO蛋白酶的诱导表达与鉴定；
S3、SUMO蛋白酶的纯化与鉴定。
2.根据权利要求1所述的重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S1，具体分如下步骤：
a、根据密码子优化后的基因序列，SUMO蛋白酶直接进行基因合成；
b、将PET-21b载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；
c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；
d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含氨苄青霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。
3.根据权利要求2所述的重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S2，具体分如下步骤：
a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的PET-21b-SUMO蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；
b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于4ml含氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养2.5h，OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达；
c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示在诱导表达后的菌体中出现与SUMO蛋白酶理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该条带存在，证明了SUMO蛋白酶表达正常。
4.根据权利要求3所述的重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述步骤S3，具体分如下步骤：
a、将S2-a步骤中过夜培养已转入PET-21b-SUMO蛋白酶质粒的BL21(DE3)菌液以体积比1:100的比例接于800ml含氨苄青霉素LB中，37℃、220rpm条件下培养2h左右，OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；
b、将-20℃冻存菌体加入细胞裂解液(比例为：1g菌体对应5mL细胞裂解液)，使用超声波破碎仪，低温条件下超声3秒，停10秒，共运行10分钟进行破菌，4℃、16000rpm条件下离心15min，分离上清液与沉淀；
c、分别取上清液、沉淀，并采用SDS-PAGE法进行检测，检测结果为破碎后上清和沉淀中均有与SUMO蛋白酶理论分子量一致的条带，上清中含有80％以上蛋白酶，说明破碎结果良好；
d、将S3-b步骤中分离的上清液，置于干净的50ml的离心管中加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，先用细胞裂解液100ml清洗，再用含有20mM/L咪唑的洗脱液30ml进行洗脱，然后含有500mM/L咪唑的洗脱液5ml进行洗脱，最后将洗脱液以SUMO蛋白酶储存液作为流动相过分子筛Superdex 200，根据280nm紫外吸收值收集目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测，从而制得纯化的SUMO蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的重组SUMO蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，在步骤S3-b、S3-d中，所述细胞裂解液中含有20mM/L的三羟甲基氨基甲烷、300mM/L的氯化钠、重量百分比为10％的甘油，所述细胞裂解液PH为8.0。
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