CN114703201B - 适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术与发酵工程领域，提供了适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用，本发明通过将透明颤菌血红蛋白基因vgbS与弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT、链霉菌组成型强启动子PkasO*和弗氏链霉菌终止子Taph相连，组成VHb蛋白表达框PkasO*‑SPCynT‑vgbS‑Taph，所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明的VHb蛋白表达框P kasO* ‑SPCynT‑vgbS‑T aph 具有更高效的表达VHb的能力，将其应用于弗氏链霉菌中，VHb的表达效果更好，弗氏链霉菌的发酵产物产量更高，新霉素的产量至少提高了14.9%。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与发酵工程领域，具体涉及适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用。
背景技术
链霉菌在分类学上属于原核生物界放线菌目链霉菌科，具有多样化的基因组和极高的GC（70～76%）含量。自然界约70％的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生。新霉素是由弗氏链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素，能够干扰蛋白质合成，是国内外最为常用的兽用抗生素之一。其主要成分为新霉素B和C，以及少量新霉素A。新霉素B相对其他组分而言活性强、毒性低，是发酵过程中需要监测的主要组分。
表达载体pSET152是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，其中具有接合转移的oriT功能区域、链霉菌筛选标记-安普霉素抗性基因acc3(IV)、整合酶基因int(φC31)、链霉菌温和噬菌体φC31的attP位点。因此，pSET152可利用简便高效的属间接合转移法导入链霉菌，并可通过特异性重组整合在链霉菌染色体的attB位点上，随着宿主染色体的复制而复制。
透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是目前为止研究最为透彻的原核生物血红蛋白，来源于一种革兰氏阴性菌—透明颤菌。自然状态下的VHb以同型二聚体形式存在，两个亚基由146个氨基酸残基形成6个α-螺旋（A，B，E，F，G，H），相对分子量为15.8kDa，且各含有一分子b型血红素。低氧条件下，VHb可以与氧结合，发生构象变化，又能够与氧解离，将氧传递给呼吸链，调节呼吸链末端氧化酶的活性。目前，VHb已在多种宿主细胞（大肠杆菌、假单胞菌、烟草、水稻、斑马鱼等）中成功表达，用于改善动植物细胞特性、改善细菌在高耗氧或氧气受限的高密度发酵中的生长情况。VHb的编码基因为：vgb基因。依据弗氏链霉菌密码子偏好性优化vgb基因得到：vgbS基因。
陈文青等基于质粒pWQ2005中的硫链丝菌素诱导启动子PtipA启动vgb的表达，利用接合转移法将vgb基因整合到泰乐菌素的生产菌株弗氏链霉菌中，但由于PtipA启动子受到硫链丝菌素诱导，而在发酵过程中添加硫链丝菌素对菌体生长不利。并且，现有技术中均是单独将血红蛋白基因—vgb基因在链霉菌中进行强化表达，其表达效果以及促菌体生长和发酵产物合成的效果有限。如何构建适用于弗氏链霉菌的高效表达的VHb表达框一直亟待研究。
信号肽（又称“穿膜肽”）是蛋白质N-末端一段编码长度为5-30的疏水性氨基酸序列，用于引导新合成蛋白质向通路转移的短肽链。信号肽存在于分泌蛋白、跨膜蛋白和真核生物细胞器内的蛋白中。信号肽酶有三种：SPaseI、SPaseII和SPaseIII。目前尚无法根据前人结果选择合适的信号肽来构建适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框进行弗式链霉菌中透明颤菌血红蛋白的高效表达及基于透明颤菌血红蛋白高效表达的代谢产物的高效合成。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种适用于弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）的透明颤菌血红蛋白表达框。
适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述表达框的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
所述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的构建方法为：将透明颤菌血红蛋白基因vgbS与弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT、链霉菌组成型强启动子P kasO* 和弗氏链霉菌终止子T aph 相连，组成透明颤菌血红蛋白表达框（简称“VHb蛋白表达框”）P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph ，即所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框。
本发明通过将透明颤菌血红蛋白基因vgbS与弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT、链霉菌组成型强启动子P kasO* 和弗氏链霉菌终止子T aph 相连，组成VHb蛋白表达框P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph ，其在VHb蛋白表达框中含有弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT（简称“信号肽SPCynT”）的核苷酸序列，意外发现：与将常规的仅含有VHb编码基因（即vgbS）的VHb蛋白表达框P kasO* -vgbS-T aph 相比，本发明的VHb蛋白表达框P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 具有更高效的表达VHb的能力，将其应用于弗氏链霉菌中，VHb的表达效果更好，弗氏链霉菌的发酵产物产量更高，例如：新霉素的产量至少提高了14.9%。
本发明人通过运用SingnalP对所述信号肽SPCynT的进行分析，分析结果显示：所述弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT的切割位点在：44-45，切割概率为：45.37%，因此，本发明的表达框中所采用的弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT其被信号肽酶切割的概率较低，用其作为信号肽构建得到的表达框转入微生物内时不易失活。并且，本发明人还运用TMHMM对本发明的所述信号肽SPCynT的进行分析，分析结果显示：所述信号肽SPCynT的1~19号位置的氨基酸片段位于细胞膜内侧，20~42号位置的氨基酸片段位于细胞膜上，43~190号位置的氨基酸片段位于细胞膜的外侧，由此推测：本发明的所述信号肽SPCynT能够使VHb蛋白锚定在细胞膜上。本发明的信号肽SPCynT能够将透明颤菌血红蛋白锚定在细胞膜上，且不易失活，透明颤菌血红蛋白能够快速摄取胞外的氧并将其运送至胞内，其摄氧能力更好、氧传递效率更高。
本发明的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框不仅含有透明颤菌血红蛋白基因vgbS，具有强化表达透明颤菌血红蛋白的功能，还增加了弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT，构建了一种新型的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框，所述信号肽SPCynT其具有将表达的透明颤菌血红蛋白锚定在微生物的细胞膜上的功能，对提高微生物细胞摄氧和氧传递能力，改善细胞生长状态，真正实现高效表达血红蛋白以及促进微生物代谢产物合成更有利；为透明颤菌血红蛋白VHb在链霉菌中高效表达和广泛应用提供了理论指导；构建的VHb表达框P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 应用于弗氏链霉菌能够提高弗氏链霉菌中透明颤菌血红蛋白表达效率，对更广泛的链霉菌的工业生产有借鉴意义。
本发明的目的之二在于提供上述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，包括将上述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框转入表达载体中，得到含有所述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的表达载体，并将所述含有所述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的表达载体，导入链霉菌中构建转基因菌株。本发明构建得到的转基因菌株，不仅能够强化表达透明颤菌血红蛋白，还通过信号肽SPCynT能够将表达的透明颤菌血红蛋白锚定在链霉菌的细胞膜上，大大提高链霉菌的细胞摄氧和氧传递能力，改善细胞生长状态，真正实现高效表达血红蛋白以及促进链霉菌代谢产物的合成。
以上所述的应用中，进一步将所述转基因菌株按照现有的链霉菌发酵生产工艺进行发酵。更进一步的，将所述转基因菌株应用于发酵生产新霉素。所述转基因菌株发酵生产新霉素的发酵培养基配方为：10-30 g/L葡萄糖，50-90g/L玉米淀粉，10-30 g/L蛋白胨，3-9g/L酵母粉，20-40 g/L花生粕，3-9 g/L硫酸铵，2-10g/L 氯化钠，0.1-0.5g/L 磷酸氢二钠，1-8g/L 轻质碳酸钙，0.1-0.5g/L淀粉酶，灭菌前调pH至7.2-7.7。
以上所述的应用中，所述的表达载体为适用于链霉菌的表达载体。进一步的，所述的表达载体为pSET152载体。
以上所述的应用中，所述的链霉菌为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）。进一步的，所述的弗氏链霉菌为弗氏链霉菌Sf01（即Streptomyces fradiae Sf01），所述弗氏链霉菌Sf01于2022年01月21日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022111。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作详细的说明：
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
含有不同链霉菌信号肽的透明颤菌血红蛋白表达框的构建：
1、vgbS依据弗氏链霉菌密码子偏好性优化，由生工生物合成，PCR扩增得到vgbS片段；并将P kasO* 启动子、SPCynT信号肽、vgbS基因以及T aph 终止子四段连接起来，构建出P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 表达框，其序列为SEQ ID NO.1所示。
2、以pSET152质粒为模版，PCR扩增获得pSET152载体，引物为G-T5-F和G-T5-R，
G-T5-F：atcgaattcgtaatcatgtcatagctgtttcctg、
G-T5-R：gcttggcactggccgtcgttttac；
所述pSET152质粒自行构建或购买均可。
3、测定pSET152载体与目的基因片段的浓度，计算出载体与片段的使用量，于冰上配制反应体系（使用ClonExpress II重组克隆试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司），37℃重组反应30 min后立即置于冰上冷却；Ca2+转化法将重组产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，将菌体涂布在安普霉素抗性平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为M13-47与M13-48，若出现目的条带为890 bp，则可进行下一步测序，载体的核苷酸序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即表达载体构建成功，转化子命名为游离表达载体pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 。菌落PCR所用引物的序列如下：
M13-47：agggttttcccagtcacg、
M13-48：gagcggataacaatttcacac；
4、采用上述同样的方法，发明人选取了弗氏链霉菌中多种信号肽，包括EreA信号肽（其序列为SEQ ID NO.2所示）、KdpC信号肽（其序列为SEQ ID NO.3所示）、EfeB信号肽（其序列为SEQ ID NO. 4所示）对pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 载体中的SPCynT进行替换，其余表达框元件完全相同，将这些表达框插入pSET152质粒，构建得到了不同信号肽介导的透明颤菌血红蛋白表达载体，依次分别为：pSET-P kasO* -SPEreA-vgbS-T aph 、pSET-PkasO*-SPKdpC-vgbS-T aph 、pSET-P kasO* -SPEfeB-vgbS-T aph 。此外，作为对照组，构建了不含信号肽的血红蛋白表达载体pSET-PkasO*-vgbS-T aph ；
5、将上述血红蛋白表达载体通过接合转移转化至弗氏链霉菌Sf01中，构建了相应信号肽介导的弗氏链霉菌血红蛋白表达菌株Sf01/pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 、Sf01/pSET-P kasO* -SPEreA-vgbS-T aph 、Sf01/pSET-P kasO* -SPKdpC-vgbS-T aph 、Sf01/pSET-P kasO* -SPEfeB-vgbS-T aph 。此外，将不含信号肽的血红蛋白表达载体pSET-P kasO* -vgbS-T aph 也转入弗氏链霉菌Sf01中，得到Sf01/pSET-P kasO* -vgbS-T aph 。其中，所述弗氏链霉菌Sf01于2022年01月21日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022111。
6、适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的筛选：
将上述得到的弗氏链霉菌血红蛋白表达菌株进行新霉素发酵实验。种子培养的具体步骤：将实施例1获得的重组弗氏链霉菌菌株用无菌水洗涤斜面孢子，制成孢子悬液（约1×109个/mL），按10％的接种量分别接种到25 mL添加25 mg/L安普霉素的TSBY液体培养基中，230 r/min 35℃摇床培养48 h，获得发酵所需的种子培养液。
新霉素发酵培养基配方为：20 g/L葡萄糖，80 g/L玉米淀粉，14 g/L蛋白胨，6 g/L酵母粉，30 g/L花生粕，6 g/L硫酸铵，4.5 g/L 氯化钠，0.2 g/L 磷酸氢二钠，4 g/L 轻质碳酸钙，0.3 g/L淀粉酶，灭菌前调pH至7.5。
新霉素发酵的具体步骤：将新霉素发酵培养基装入250 mL锥形瓶中（每瓶的装液量为25 mL），随后以4%（v/v）的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于230 r/min 35℃摇床培养7 d。
新霉素产量检测的方法：采用HPLC-ELSD法测定，先称取一定重量的发酵液样品，用pH=2硫酸水溶液稀释若干倍，12000 r/min离心10 min，上清经过滤膜过滤后，置入进样瓶。检测条件为：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.2 mol/L三氟乙酸-乙腈（95:5），流速：1.0 mL/min；进样量20 μL，雾化温度：40℃，漂移管温度：40℃，氮气载气流速为1.8 L/min，柱温为30℃。根据标准曲线计算发酵后的各个重组菌株的新霉素的产量（具体数据表1）。
表1 含有不同透明颤菌血红蛋白表达框的弗氏链霉菌Sf01的新霉素产量
结果表明，当采用SPCynT信号肽构建VHb表达框（即SEQ ID NO.1所示的透明颤菌血红蛋白表达框）时，透明颤菌血红蛋白的表达效果最好，新霉素效价的提升效果最为明显，同时发现并不是所有的信号肽都适用于弗式链霉菌中透明颤菌血红蛋白的表达，至于哪种信号肽适用于血红蛋白表达并无原理可推导。
7、P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 表达框在新霉素合成中的应用：
本发明人针对不同的新霉素发酵培养基配方，考察了解弗氏链霉菌Sf01/pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 的发酵生产新霉素的能力（同时也在这20种培养基中接种Sf01/pSET-P kasO* -vgbS-T aph 作为对照），20组培养基配方具体如表2所示：
表2 不同的新霉素发酵培养基配方
种子培养的具体步骤：将上述获得的重组弗氏链霉菌Sf01/pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 和对照菌株Sf01/pSET-P kasO* -vgbS-T aph 用无菌水洗涤斜面孢子，制成孢子悬液（约1×109个/mL），按10％的接种量分别接种到25 mL添加25 mg/L安普霉素的TSBY液体培养基中，230 r/min 35℃摇床培养48 h，获得发酵所需的种子培养液。
新霉素发酵的具体步骤：将表2中不同的新霉素发酵培养基装入250 mL锥形瓶中（每瓶的装液量为25 mL），随后以4%（v/v）的接种量将种子培养液接种至对应的发酵培养基中，接种完毕后于230 r/min 35℃摇床培养7 d。
新霉素产量检测的方法：采用HPLC-ELSD法测定，先称取一定重量的发酵液样品，用pH=2硫酸水溶液稀释若干倍，12000 r/min离心10 min，上清经过滤膜过滤后，置入进样瓶。检测条件为：C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.2 mol/L三氟乙酸-乙腈（95:5），流速：1.0 mL/min；进样量20 μL，雾化温度：40℃，漂移管温度：40℃，氮气载气流速为1.8 L/min，柱温为30℃。根据标准曲线计算发酵后的各个重组菌株的新霉素的产量（具体数据见表3）。
表3不同培养基配方发酵后的新霉素效价
由表3可看出，在相同种子发酵的条件下，相对于现有技术的弗氏链霉菌Sf01/pSET-P kasO* -vgbS-T aph 来说，采用本发明的重组弗氏链霉菌Sf01/pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 的生产发酵的新霉素效价有大幅提升，并且，在不同生产发酵的条件下，相对于现有技术的弗氏链霉菌Sf01/pSET-PkasO*-vgbS-T aph 来说，采用本发明的重组弗氏链霉菌Sf01/pSET-P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 的生产发酵的新霉素效价至少也有提高14.9%，说明：本发明P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph 表达框在提高弗氏链霉菌的新霉素效价方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 789
<212> DNA
<213> 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)
<400> 1
tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60
ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagttgtg acctccacac ccgactccac 120
ggcgcccgcc cgcgagcgcc gcccccagcg ccgggcactg ctgcgcgccg cgctcgcggg 180
cggggccgta ctcggcgcgg gagccgccgt accggcttcc gccccggcca tgctggacca 240
gcagaccatc aacatcatca aggccaccgt cccggtcctg aaggagcacg gcgtcaccat 300
caccaccacc ttctacaaga acctgttcgc caagcacccc gaggtccggc cgctgttcga 360
catgggccgc caggagtccc tggagcagcc gaaggccctg gccatgaccg tcctggccgc 420
cgcccagaac atcgagaacc tgccggccat cctgccggcc gtcaagaaga tcgccgtcaa 480
gcactgccag gccggcgtcg ccgccgccca ctacccgatc gtcggccagg agctgctggg 540
cgccatcaaa gaggtcctgg gcgacgccgc caccgacgac atcctggacg cctggggcaa 600
ggcctacggc gtcatcgcgg acgtgttcat ccaggtcgag gccgacctgt acgcccaggc 660
cgtcgagtga gcggctcccg gccaggccgc ggaaagcggg ggccgggcgc cggtctccag 720
ggcggccggg tccggcgctc cgcaggccgc ttccggacca ctccggaagc ggcctccgtg 780
cggtcggag 789
<210> 2
<211> 117
<212> DNA
<213> 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)
<400> 2
atgcccccgc cgcgtccgct gctcctcgcc gccctggccc tggccgccct cgcgcccgcc 60
gccgtcgccc tggcccccgc cgtcgccccg gcccccgccg tcgccccggc ccccgcc 117
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)
<400> 3
atgaacaact ccgtagcgaa cacgggacgc ctggtctggg ccgcgctgcg catgctgctc 60
gtcctcacgg tcgtgaccgg gatcgtctat ccgctcgtcg tcacc 105
<210> 4
<211> 117
<212> DNA
<213> 弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)
<400> 4
atgagcgaca acctggagat ttcgcggcgt cgcctgctcg gcaccatggg cgccgccgga 60
gcggcgggac tcgcgctcgg cggcgcgggc ggcgccgcgg ggtacgcggc cctcgcc 117
Claims (10)
1.适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框，其特征在于：所述表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框，其特征在于，其构建方法为：将透明颤菌血红蛋白基因vgbS与弗氏链霉菌中碳酸酐酶CynT的信号肽SPCynT、链霉菌组成型强启动子P kasO* 和弗氏链霉菌终止子T aph 相连，组成透明颤菌血红蛋白表达框P kasO* -SPCynT-vgbS-T aph ，即所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框。
3.适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于，包括将权利要求1所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框转入表达载体中，得到含有所述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的表达载体，并将所述含有所述适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框的表达载体，导入链霉菌中构建转基因菌株。
4.根据权利要求3所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：将所述转基因菌株按照现有的链霉菌发酵生产工艺进行发酵。
5.根据权利要求4所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：将所述转基因菌株应用于发酵生产新霉素。
6.根据权利要求5所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于，所述转基因菌株发酵生产新霉素的发酵培养基配方为：10-30 g/L葡萄糖，50-90g/L玉米淀粉，10-30 g/L蛋白胨，3-9g/L酵母粉，20-40 g/L花生粕，3-9 g/L硫酸铵，2-10g/L 氯化钠，0.1-0.5g/L 磷酸氢二钠，1-8g/L 轻质碳酸钙，0.1-0.5g/L淀粉酶，灭菌前调pH至7.2-7.7。
7.根据权利要求3所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：所述的表达载体为适用于链霉菌的表达载体。
8.根据权利要求7所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：所述的表达载体为pSET152载体。
9.根据权利要求3所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：所述的链霉菌为弗氏链霉菌。
10.根据权利要求9所述的适用于弗氏链霉菌的透明颤菌血红蛋白表达框在链霉菌中的应用，其特征在于：所述的弗氏链霉菌为弗氏链霉菌Sf01，所述弗氏链霉菌Sf01于2022年01月21日保藏在位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022111。
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| CN101805742A (zh) * | 2010-04-17 | 2010-08-18 | 上海交通大学 | 透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法 |
| CN110106191A (zh) * | 2019-05-31 | 2019-08-09 | 枣庄市杰诺生物酶有限公司 | 人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用 |
| CN110563783A (zh) * | 2019-08-16 | 2019-12-13 | 上海交通大学 | 一种高效低毒四霉素b衍生物及其定向高产代谢工程方法 |
-
2022
- 2022-01-24 CN CN202210080475.0A patent/CN114703201B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101805742A (zh) * | 2010-04-17 | 2010-08-18 | 上海交通大学 | 透明颤菌血红蛋白vgbS核苷酸序列及其质粒和制备方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Anion Inhibition Studies of the Beta-Carbonic Anhydrase from Escherichia coli;Sonia Del Prete等;Molecules;第25卷(第11期);2564 * |
| 透明颤菌血红蛋白结构与过氧化物酶活性关系的研究;李伟;中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑(第4期);A006-31 * |
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| Publication number | Publication date |
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