CN103525837A - Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。其所编码的Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2可用于制备Bt杀虫剂，可将Cry72Aa1操纵子基因转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

Description

Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白（Insectididal crystalproteins，简称ICPs），ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，已陆续分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N,等Microbiol Mol Biol Rev,1998,62:807-813;http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。目前已经分离克隆了72个类群的杀虫蛋白。一般而言，Cry蛋白都是由单个操纵元编码的，如Cry1、Cry2、Cry3、Cry4和Cry9等毒蛋白，这些基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD;cry54和cry56等基因编码的杀虫晶体蛋白分子量为70-80kDa。随着对Bt杀虫基因研究的深入，一些具有两个操纵元编码的杀虫基因蛋白陆续被发现，这些具有两个编码框的基因在第一个基因后面由一个具有相同编码方向的orf2共同组成这个基因的操纵子。这类操纵子基因由三个部分组成，包括cry基因编码60-80kDa Cry蛋白，由orf2编码的50-60kDa的蛋白，以及位于这两个蛋白之间的30-140bp的非编码序列。目前具有两个操纵元的杀虫基因蛋白有Cry5Ad1、Cry10Aa1、Cry19Aa1、Cry24Ba1、Cry39Aa1、Cry44Aa1、Cry44Aa1、Cry30Db1和Cry30Ba1。在之前的研究中，这类毒性蛋白只对蚊虫具有很好的杀虫活性。一些研究者认为orf2具有稳定cry mRNA的作用，或者其编码的ORF2蛋白可能作为一个分子伴侣，有助于cry蛋白晶体的形成（Rosso ML,1997.ApplEnviron Microbiol63:4449-4455）；而另一些研究者则认为ORF2蛋白对于稳定晶体构型具有重要的作用（J.Eleazar Barboza-Corona,2012.Appl Environ Microbiol78(6):2005-2012），这类蛋白的形成可能是在进化过程中由于插入序列或者是点突变造成的。ORF2蛋白与Cry1、Cry4、Cry7、Cry8、Cry9等大分子量Cry蛋白的C端相类似，因此一些大分子的cry基因在进化过程中由于基因突变等因素造成完整的基因序列被分为两部分，形成由两个基因组成的cry操纵子基因（Thorne L,1986.J Bacteriology.166:801–811）。

分子伴侣是细胞中一大类蛋白质，是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确组装，但不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。

研究表明，Cry1、Cry2和Cry9蛋白对鳞翅目害虫有很好的杀虫毒性，cry1类基因已被广泛用于转基因作物。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性。然而，从上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实（McGaughey,W.H.1985.Science.229:193-195），原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟（Plodiainterpunctella）在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性（Tabashnik,B.E,等1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:4120-4124），上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成（冯夏.1996.昆虫学报,39(3):238-244;Hofte,H.,1988.Appl.Environ.Microbiol.54:2010-2017）。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性（Schnepf,E.,等1998.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806）。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题,但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现（Georghiou G P,1997.Applied and Environmental Microbiology,63:1095-1101）。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力、宽杀虫谱的Bt基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因及其应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种新的Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因，所述Cry72Aa1操纵子基因包括一个Cry72Aa1基因、orf2基因以及它们之间的非编码间隔区，其核苷酸序列为：

i）Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或

ii）Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii）在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明还提供用于检测上述操纵子基因的PCR引物对，包括：

72AF：5’-ATGTCTAATCGTTATCCACG-3’

72AOR：5’-TTAACGGCTGTATCCTTGATT-3’

本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）新菌株HS18-1。该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，保藏号为CGMCC No.2718。该菌株已在ZL200910081594.2中公开。

通过对菌株HS18-1基因组和质粒进行测序分析，发现该菌株存在一个新的cry操纵子基因，设计其全长基因引物，克隆得到Cry72Aa1操纵子基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，全长为3754bp，包括一个Cry72Aa1基因（SEQ ID No.3，2064bp）和一个orf2基因（SEQ ID No.4，1623bp）以及它们之间67bp非编码间隔区。

所述Cry72Aa1操纵子基因包括编码蛋白Cry72Aa1和ORF2的核苷酸序列。其中，Cry72Aa1基因编码687个氨基酸组成的Cry72Aa1蛋白（SEQ ID No.5）；orf2基因编码536个氨基酸组成的orf2蛋白（SEQ ID No.2）。蛋白ORF2为蛋白Cry72Aa1的分子伴侣。

在softberry网站采用bacterial sigma7.0promoter程序对该操纵子中的cry基因进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为Cry72Aa1。

其中，Cry72Aa1和ORF2蛋白的氨基酸组成如表1和表2所示。

表1 Cry72Aa1蛋白的氨基酸组成

氨基酸	数目	百分比%	氨基酸	数目	百分比%
						Ala(A)	39	3.88	Met(M)	7	1.17
Cys(C)	10	1.35	Asn(N)	53	7.82
						Asp(D)	37	5.50	Pro(P)	28	3.60
Glu(E)	34	5.58	Gln(Q)	24	3.91
						Phe(F)	30	5.53	Arg(R)	39	7.58
Gly(G)	49	4.11	Ser(S)	66	7.74
						His(H)	13	2.25	Thr(T)	43	5.72
Ile(I)	47	6.88	Val(V)	35	4.57
						Lys(K)	25	4.08	Trp(W)	10	2.28
Leu(L)	61	8.78	Tyr(Y)	38	7.68

表2 cry72Aa1操纵子ORF2蛋白的氨基酸组成

氨基酸	数目	百分比%	氨基酸	数目	百分比%
						Ala(A)	27	3.39	Met(M)	15	3.15
Cys(C)	11	1.88	Asn(N)	40	7.45
						Asp(D)	38	7.13	Pro(P)	19	3.08
Glu(E)	32	6.64	Gln(Q)	31	6.38
						Phe(F)	15	3.49	Arg(R)	18	4.42
Gly(G)	41	4.34	Ser(S)	33	4.89
						His(H)	20	3.70	Thr(T)	35	5.88
Ile(I)	31	5.73	Val(V)	27	4.46
						Lys(K)	32	6.59	Trp(W)	6	1.73
Leu(L)	37	6.84	Tyr(Y)	32	8.17

应理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白Cry72Aa1（SEQ ID No.5）和ORF2的氨基酸序列（SEQ ID No.2），在不影响其活性的前提下，取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，在Cry72Aa1操纵子基因的间隔序列非活性区段，将第Cry72Aa1蛋白的第684位Leu替换为Gly，将第676位的Leu缺失，在第688位增加一个Ala或增加Lys，不影响蛋白的活性。orf2编码的蛋白质在基因表达中所起的作用类似于130-135kDa的杀虫晶体蛋白质的C末端（J.Eleazar Barboza-corona,Hyun-Woopark.2012.Appl.Environ.Microbio.78(6):2005.)。根据杀虫晶体蛋白的作用机理，其在昆虫的碱性肠液中将被水解为具有毒性的区段，而C-末端将被水解（Schnepf,E.,1998.Mol.Biol.Rev.65(3):775-806）。间隔序列在表达过程中不参与蛋白质的表达，因此对间隔序列中氨基酸的缺失，替换等将不影响其杀虫活性。因此，本发明的Bt蛋白Cry72Aa1（SEQID No.5）和ORF2蛋白（SEQ ID No.2）还包括所示氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的氨基酸序列，从而得到具有与Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2同等活性或功能的由Cry72Aa1-ORF2衍生的蛋白质。

本发明还提供含有编码上述Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因的载体以及含有该载体的宿主细胞及工程菌（如大肠杆菌或真菌）。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的基因和蛋白可以从菌株HS18-1中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。

以菌株HS18-1的基因组DNA为模板，以pS72-F和pS72-R为引物进行PCR扩增，得到cry72Aa1基因。引物pS72-F和pS72-R的序列如下：

pS72-F：5’-GGG GTC GAC AATGTCTAATCGTTATCCACG-3’

pS72-R：5’-CCC CTC GAG TTATTTGACAAATAAACTATT-3’。

以菌株HS18-1的基因组DNA为模板，以pS72O-F和pS72O-R为引物进行PCR扩增，得到orf2基因。引物pS72O-F和pS72O-R的序列如下：

pS72O-F：5’-GGG GTC GAC AATGTTTACAAGTGGCACGAAA-3’

pS72O-R:5’-CCC CTC GAG TTAACGGCTGTATCCTTGATTA-3’。

以菌株HS18-1的基因组DNA为模板，以上述pS72-F和p72SO-R为引物进行PCR扩增，得到Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因。

将cry72Aa1基因、orf2基因和Cry72Aa1操纵子基因分别插入到芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pSTK上，构建得到重组表达载体pSTK-cry72Aa1、pSTK-orf2和pSTK-cry72Aa1-orf2。

本发明还提供Cry72Aa1操纵子基因或Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2在制备杀虫剂中的应用。

本发明还提供了含有Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2的杀虫剂。通过发酵含有Cry72Aa1操纵子基因的宿主细胞，得到含有Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2的发酵液，制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2。

本发明还提供了Cry72Aa1操纵子基因或Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2在培育转基因植物中的应用。

本发明还提供了Cry72Aa1操纵子基因或Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2在提高转基因植物抗虫性中的应用。

所述应用为将Cry72Aa1操纵子基因与表达载体连接，得到能够表达Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2的重组表达载体，再通过转基因方法将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry72Aa1操纵子基因的转化体，表达Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2，提高植物抗虫性。

将Cry72Aa1操纵子基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2的重组表达载体，进而通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述重组表达载体导入植物，得到含有Cry72Aa1操纵子基因的转化体，例如农作物或果树等转基因植物，表达Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2，使其具备抗虫性。

本领域技术人员还可以根据本发明的Cry72Aa1操纵子基因转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。例如，利用密码子的简并性，将Cry72Aa1操纵子基因设计为水稻偏爱的密码子基因序列，再将合成的Cry72Aa1操纵子基因序列与载体pCAMBIA1300连接，通过农杆菌介导转入到水稻基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因水稻品种。

本发明提供的Cry72Aa1-ORF2是一种新的Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道，因此，本发明的Bt蛋白Cry72Aa1-ORF2具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫活性中。

附图说明

图1为含cry72Aa1基因的重组质粒的酶切鉴定图谱；其中，M为DNA分子量标准；1为cry72Aa1基因插入片段；2为重组质粒pSTK-cry72Aa1经SalI和XhoI双酶切产物；3为pSTK空载体质粒。

图2为含orf2基因的重组质粒的酶切鉴定图谱；其中，M为DNA分子量标准；1为orf2基因插入片段；2为重组质粒pSTK-orf2经SalI和XhoI双酶切产物，3为pSTK空载体质粒。

图3为含cry72orf2-orf2基因的重组质粒的酶切鉴定图谱；其中，M为DNA分子量标准；1为cry72Aa1-orf2基因插入片段；2为重组质粒pSTK-cry72Aa1-orf2经SalI和XhoI双酶切产物；3为pSTK空载体质粒。

图4为重组基因在无晶体突变株HD73-中表达的SDS-PAGE检测结果；其中，M为蛋白Marker;1为含有电转重组质粒pSTK-cry72Aa1-orf2的无晶体突变株HD73-的表达蛋白；2为含有电转重组质粒pSTK72-orf2的无晶体突变株HD73-的表达蛋白；3为含有电转重组质粒pSTK-cry72Aa1的无晶体突变株HD73^-的表达蛋白；4为含有电转空载体pSTK的无晶体突变株HD73^-的表达蛋白（阴性对照）；5为菌株HS18-1表达的粗蛋白。

图5为重组基因在无晶体突变株HD73^-中表达的扫描电镜图；其中，A为含有质粒pSTK的无晶体突变株的扫描电镜图；B为含有重组载体pSTK-cry72Aa1的无晶体突变株的扫描电镜图；C为含有重组载体pSTK-orf2的无晶体突变株的扫描电镜图；D为重组载体pSTK-cry72Aa1-orf2的无晶体突变株的扫描电镜图，显示能产生球形晶体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因的克隆

本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）新菌株HS18-1，该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101）保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis），保藏号为CGMCC No.2718。

本实施例通过如下方法克隆得到Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因的全长序列。

采用细菌基因组DNA纯化试剂盒（购自康为世纪公司）提取菌株HS18-1的总DNA作为模板，用于扩增Cry72Aa1操纵子基因，TaqMix（购自博迈德公司）。引物序列如下：

72AF：5’-ATGTCTAATCGTTATCCACG-3’

72AOR：5’-TTAACGGCTGTATCCTTGATT-3’

PCR反应体系：

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃50s，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。扩增反应产物在0.7%琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图3所示，通过扩增得到了约为3754bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。

实施例2 Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因的表达及Cry72Aa1-ORF2蛋白的获得

根据Cry72Aa1操纵子基因开放阅读框两端序列，设计并合成4条特异引物用于扩增cry72Aa1、orf2以及完整的Cry72Aa1操纵子基因（表1），pS72-F和pS72R用于扩增cry72Aa1基因；pS72-F和p72SO-R用于扩增完整的Cry72Aa1-orf2操纵子基因；p72SO-F和p72SO-R用于扩增orf2基因，引物下划线部分为SalI和XhoI酶切位点。以HS18-1总DNA为模板进行PCR扩增，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pSTK连接，转化Trans1-T1（购自全式金公司）感受态细胞，提取质粒，进行酶切，电泳验证插入片断大小符合预期目的片段后（图1-图3），转入去甲基化感受态细胞trans110（购自全式金公司），然后提取重组质粒并采用电击转化方法（2.2kV、1000Ω、25μF）将重组质粒转入无晶体突变株HD73^-制备的感受态细胞。将重组质粒分别命名为pSTK-cry72Aa1、pSTK-orf2和pSTK-cry72Aa1-orf2，含重组质粒的转化子分别命名为HD72、HD72orf和HD72O。将阳性转化子接种于1/2LB培养基中，在200r/min、30℃下培养72h，离心培养液收集菌体，弃上清，用无菌水水洗菌体3次，加入10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)30mL超声波破碎，提取目的蛋白，进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE分析结果表明，转化子HD72O表达分子量约为150kDa的蛋白条带。转化子HD72只表达约77kDa的cry72Aa1蛋白，而转化子HD72orf仅表达60kDa的ORF2蛋白（图4）。

表1cry72Aa1-orf2操纵子序列不同部分扩增引物

注：下划线部分GTCGAC为Sal I酶切位点，CTC GAG为XhoI酶切位点。

实施例3 显微观察cry72Aa1、orf2及完整Cry72Aa1操纵子基因在HD73-中的表达

待实施例2中90%以上的芽孢形成后收集菌体，制片，并于光学显微镜下观察转化子是否产生晶体蛋白，若产生晶体蛋白，则采用扫描电镜观察晶体形态。

通过光学显微镜和扫描电镜观察，完整的Cry72Aa1-orf2操纵子基因在HD73^-中表达并形成球形伴孢晶体，而cry72Aa1基因单独在HD73^-中表达时表达量小，orf2基因单独表达则不能形成伴孢晶体（图5）。

实施例4Cry72Aa1、ORF2及Cry72Aa1-ORF2蛋白杀虫活性测定

将实施例2中获得的转化子HD72、HD72orf和HD72O的表达产物对甜菜夜蛾进行杀虫活性测定。首先将各转化子表达的目的蛋白稀释成不同浓度：HD72（1.5、2.7、4.8、8.7和15.8μg/mL）；HD72orf(0.1、0.8、1.6、3.2、6.4和12μg/mL)；HD72O（1.2、22.7、7.4、13.2、40.6μg/mL）等6个不同的浓度梯度，然后每个浓度梯度处理分别投入45头甜菜夜蛾幼虫，每个浓度梯度的处理重复3次，转化pSTK质粒的无晶体突变株的表达产物作为阴性对照，清水为空白对照；72h后统计结果，用SPSS13.0软件分析LC₅₀（半数致死浓度，即杀死50%防治对象的药剂浓度）。

由表2可以看出，转化子HD72O表达产物对甜菜夜蛾具有很好的杀虫活性，LC₅₀为20.8μg/mL；转化子HD72表达产物对甜菜夜蛾具有一定的杀虫活性LC₅₀为55.7μg/mL；转化子HD72orf及阴性对照对甜菜夜蛾均不具杀虫活性。

表2三种不同转化子表达蛋白对甜菜夜蛾的杀虫活性

注：N表示无杀虫活性。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因，将其转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性。例如：利用密码子的简并性，将cry72Aa1-orf2基因设计成水稻偏好密码子的基因序列，再将合成的cry72Aa1-orf基因与载体pCAMBIA1300连接，通过农杆菌介导转入到水稻基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因水稻品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.Bt蛋白Cry72Aa1操纵子基因，其核苷酸序列为：

i）Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或

ii）Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii）在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1%SDS的0.1×SSPE或含0.1%SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

2.含有权利要求1所述基因的载体。

3.含有权利要求1所述基因的工程菌。

4.由权利要求1所述基因编码的蛋白制备的杀虫剂。

5.权利要求1所述基因或权利要求2所述载体在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述基因、权利要求2所述载体或权利要求3所述工程菌在提高植物抗虫性中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为棉花、玉米、水稻。

8.用于检测权利要求1所述基因的PCR引物对，其特征在于，包括：

72AF：5’-ATGTCTAATCGTTATCCACG-3’和

72AOR：5’-TTAACGGCTGTATCCTTGATT-3’。

9.一种分子伴侣，其氨基酸序列为：

1）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或

2）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

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