CN100595278C - 一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 - Google Patents
一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100595278C CN100595278C CN200610019363A CN200610019363A CN100595278C CN 100595278 C CN100595278 C CN 100595278C CN 200610019363 A CN200610019363 A CN 200610019363A CN 200610019363 A CN200610019363 A CN 200610019363A CN 100595278 C CN100595278 C CN 100595278C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- pen24
- prawn
- reorganization
- pet
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种表达重组对虾肽Pen24基因工程菌株及应用，编码该Pen24的核苷酸和氨基酸序列，表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，CCTCC No：M206003，利用工程菌株表达重组对虾肽Pen24。Pen24对革兰氏阳性细菌、阴性细菌；抗氨苄青霉素的大肠杆菌和强致病性细菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和绿脓杆菌等均有很好的抗菌活性。Pen24对病毒感染具有明显的抗病毒活性。Pen24在治疗或预防动物和植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，作为防腐剂在化妆品、食品和动物饲料中应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更属于一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株，更具体涉及含有对虾肽基因的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，对虾肽相关的重组对虾肽Pen24，重组对虾肽Pen24对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒均具有明显的抗生物活性。还涉及基因工程菌株的制备方法，同时，还涉及重组基因工程蛋白质Pen24在预防和治疗动物和植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，以及作为防腐剂在化妆品、食品和饲料等领域中的用途。
背景技术
抗菌肽是宿主免疫防御系统的重要组成部分，也是机体理想的第一道防线。Boman G等最先通过注射阴沟杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生具有抗菌活性的多肽，即cecropins[Boman H G et al.，1987]。此后科学家们在哺乳动物、被囊动物(tunicate)、两栖动物、昆虫、鱼类、鸟类和植物等多种生物体中发现并分离获得了约300种内源性抗菌肽。
抗菌肽是生物体抵御外源性病原微生物的入侵而产生的一类小分子多肽，能对抗外界病原体的感染。抗菌肽是由细菌特定基因编码产生的一类小分子多肽，具有广谱抗菌性，尤其对耐药菌株有明显的杀灭作用，且不破坏生物体细胞，无免疫原性[Michael C et al.，2003]。如果蝇中的andropin、drosocin，蜜蜂中的apidaecin、abaecin，狼蛛的acanthoscurrin等。两栖动物它们的皮肤能够分泌大量的抗菌肽类物质，其含量非常高。如研究最广泛的magaininsm、源于南美蛙的dermasep tin、来自树蛙的bombininh以及日本蛙的melittin相关肽等。在海洋生物中发现与抗菌肽相关的肽类物质，海兔的dolabellanin。哺乳动物中，抗菌肽在吞噬细胞和粘膜上皮细胞表达，目前已发现防御素和cathelicidins家族为代表的大量的抗菌活性肽。
抗菌肽除了抗菌活性外，同时还具有多种其他的调控功能。哺乳动物防御素主要有α-防御素和β-防御素两种，具有广泛的抗革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、真菌和一些具包膜病毒的活性。从大鼠附睾头部上皮细胞中成功地克隆到一个特异表达的新基因，并观察到这个基因所编码的多肽具有抗菌功能，并可能与生育有关[张永莲等，2002]。
抗菌肽抗菌广谱，对病毒、寄生虫、癌细胞均有抑制作用。哺乳动物抗菌肽具有保守的多个半胱氨酸，能形成几个稳定的二硫键，具有十分广泛的抗菌谱，除抗细菌、真菌、病毒外，还对支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞(如肿瘤细胞)有杀灭作用。cecropin P1是一种哺乳动物抗菌肽，对G-菌及一些G+菌有抑制杀灭作用。抗菌肽高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的，另外一些天然抗菌肽的C端往往是酰胺化的，这与抗菌肽的广谱抗菌活性有关。
一般地，大多数抗菌肽由30多个氨基酸残基组成，C端富含丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸等非极性氨基酸，N端富含精氨酸和赖氨酸等阳离子型氨基酸，中间部分富含脯氨酸[Daniel M L et al.，2003；Harder J et al.，2001]。在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基。大多数抗菌肽具有α-螺旋或者β-折叠结构，有些同时包含这两种结构。ceceopin P1是由31个氨基酸组成的多肽，分子量约为3ku，不含半胱氨酸，不能形成分子内二硫键，其分子内含有两亲性α-螺旋，中间是形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列，与昆虫cecropin IA有64％相似性，与cecropin B有75％的相似性。
抗菌肽被认为是鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一。Chisholm等研究证明甲壳动物的血细胞溶胞上清液含有能杀灭细菌的因子[Chisholm J R S etal.，1995]；Pierce等从鲎血细胞中分离到的抗菌肽[Pierce J C et al.，1997]；Schnapp等从青蟹的血细胞中分离到3种具有杀菌作用的肽[Schnapp D et al.，1996]。至今，已在南美白对虾、南美蓝对虾、印度对虾、中国对虾和斑节对虾等体内发现多种抗菌肽。
Penaeidin家族是阳离子抗菌肽，COOH-端含有6个半胱氨酸，形成3个二硫键，NH2-端富含脯氨酸。Penaeidin前体N端具有保守性很强的信号肽，经加工获得成熟肽。Penaeidin成熟肽有翻译后修饰的特性，或者C端酰氨化，或者N端通过焦谷氨酸环化。
抗菌肽的天然产量有限，国内外学者通过化学合成获得抗菌肽。但是，化学合成法步骤复杂、产量低、成本较高。目前国内外学者在研究抗菌肽一级结构的基础上，采用分子生物学和基因工程技术方法在原核细胞、真核细胞或某些藻类中表达抗菌肽，并且获得了抗菌肽转基因的动植物。大肠杆菌为革兰氏阴性细菌，遗传背景清楚，有大量可用于克隆和表达外源性基因的菌株，并且易被大规模培养。但是，由于抗菌肽对大肠杆菌的毒性或杀菌作用，所以大肠杆菌不适宜用于表达抗菌肽，但也有少数成功的例子。邱定红选择自然界活性最强的天蚕素类抗菌肽B(CB)cDNA与人干扰素A1(h IFN A1)cDNA融合，构建原核表达载体pBV-20的融合表达质粒pBV-20-hIFN A1-CB(pHC)，转导入大肠杆菌E.coli JMB菌株，温控诱导后表达纯化了的融合蛋白hIFN A1-CB[邱定红等，2002]。通过基因工程技术生产抗菌肽，实现抗菌肽批量生产具有重要的意义，将有希望使抗菌肽成为抑制和杀灭主要病原体、特别是耐药菌的新型药物。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株。重组对虾肽Pen24对虾肽具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抑菌活性；对氨苄青霉素不敏感的强致病性细菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和绿脓杆菌等有很好的抗菌活性。同时，重组对虾肽Pen24对抗氨苄青霉素的大肠杆菌具有抑菌活性。重组对虾肽Pen24对昆虫核型多角体病毒(包括家蚕核型多角体病毒、苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒、甜菜夜蛾核型多角体病毒等)、对虾白斑综合症病毒(简称WSSV)的感染均具有明显的抗病毒活性。基因工程重组对虾肽Pen24可广泛应用于动物和植物的细菌、真菌和病毒病的预防和治疗，以及作为防腐剂应用于化妆品、食品和饲料等领域。
由于传统抗生素的应用带来的耐药性、药物残留等问题，对抗生素肽的研究开发已成为世界上研究抗生素新产品的前沿性课题。抗菌肽与传统的抗生素相比具有分子量小、抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机理独特等优点，具有抗细菌、霉菌、病毒、原虫、癌细胞、螺旋体等多种活性，且不易产生耐药性。利用抗菌肽替代传统抗生素，作为新一代的抗菌药来源，对提高畜产品品质，推动绿色生物科技的发展具有非常重要的意义和广阔的应用前景。
本发明的目的是在于提供一种含有南美白对虾Penaeidin-2基因的重组基因工程大肠杆菌菌株，其特征在于：该菌株是一种高效表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，该菌株株于2006年1月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M206003，含有插入了南美白对虾Penaeidin-2表达盒的重组表达质粒，或者包含编码本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的DNA片断。利用该基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，可表达基因工程重组对虾肽Pen24。
本发明的目的是在于提供一种大肠杆菌宿主细胞的构建方法，方法简便，操作方便，该宿主细胞包含重组对虾肽Pen24的核苷酸序列。表达量高，基因工程蛋白的表达量最高可以达到菌体蛋白总量的20％，融合表达，安全性高，利于产业化生产。
本发明的目的之一是在于提供一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株在预防或治疗动物和植物的细菌、真菌和病毒病中的应用，还可作为防腐剂在化妆品、食品和动物饲料中应用。
本发明提供一种基因工程重组对虾肽Pen24，其分子量为约24kDa。所述的基因工程重组对虾肽Pen24具有抗细菌、真菌和病毒感染的生物活性。
本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表2的氨基酸序列至少有70％的同源性。
本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表2的氨基酸序列至少有80％的同源性。
本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的氨基酸序列，其氨基酸序列与序列表2的氨基酸序列至少有90％的同源性。
本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24对应的核苷酸序列，其核苷酸序列与序列表1的核苷酸序列至少有50％的同源性。
本发明的目的之一是提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24对应的核苷酸序列，，其核苷酸序列与序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
本发明的目的之一是提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含编码本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的DNA片断。
本发明的目的之一是提供一种大肠杆菌宿主细胞的构建方法，该宿主细胞包含本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸片断。
本发明还涉及重组对虾肽Pen24在抗细菌感染中的应用。
本发明还涉及重组对虾肽Pen24在抗真菌感染中的应用。
本发明还涉及重组对虾肽Pen24在抗病毒感染中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明提供一种DNA片断的制备方法，该片段包含所述的编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，本发明所提供的一种基因工程重组对虾肽Pen24，其具有与序列表2所示氨基酸至少70％同源性的序列，其分子量为约24kDa，该基因工程重组对虾肽Pen24具有抗细菌、真菌和病毒感染的生物活性。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾肽Pen24，一种分离的蛋白质，其具有与序列表2所示氨基酸至少80％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾肽Pen24，一种分离的蛋白质，其具有与序列表2所示氨基酸至少90％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24具有的氨基酸序列为序列表2。
本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的氨基酸序列可以在一定范围内进行修饰、改变，所获得的修饰后的蛋白质或蛋白质的片段与基因工程重组对虾肽Pen24有相同的生物学功能。重组对虾肽Pen24具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抑菌活性；对氨苄青霉素不敏感的强致病性细菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和绿脓杆菌等有很好的抗菌活性。同时，重组对虾肽Pen24对抗氨苄青霉素的大肠杆菌具有抑菌活性。重组对虾肽Pen24对昆虫核型多角体病毒(包括家蚕核型多角体病毒、苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒、棉铃虫核型多角体病毒、甜菜夜蛾核型多角体病毒等)、对虾白斑综合症病毒(简称WSSV)的感染均具有明显的抗病毒活性。
对蛋白质进行修饰和改变的方法为常规的方法[Joe Sambrook，DavidRussell et al.，Molecular Cloning：A Laboratry Manual，Cold Spring Harbor Lab(CSHL)Press，2001]，为本专业技术人员所熟悉。按照现代生命科学的理论，氨基酸序列同源性70％以上的蛋白质在生物学中常被诠释为是具有相同生物学功能的蛋白质。在此范围内对蛋白质氨基酸序列进行的修饰和突变均被认为并未改变蛋白质的生物学特性，这些改变和修饰包括：
(1)对个别氨基酸进行突变，特别是非功能决定位点的氨基酸。
(2)缺失或插入个别氨基酸，特别是非功能决定位点的氨基酸。这样的改变如果没有改变蛋白的空间构象，就不会影响蛋白质的生物学功能，也不会改变蛋白质的免疫原性。
(3)插入特殊的氨基酸残基。为了增加或改变蛋白质的可溶性，增加稳定性，在基因工程生产过程中，往往会在蛋白质的N、C端加入一些氨基酸残基，以避免形成包涵体，减少宿主细胞蛋白质内切酶的降解；或者在N、C端加入一些特殊的氨基酸功能位点以利于蛋白质的表达和纯化。
以上对蛋白质进行修饰和改变的方法为常规的方法(常规方法同上)，为本专业技术人员所熟悉。通过上述方法获得的与本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24有70％同源性的蛋白质或片段都具有与本发明所述基因工程重组对虾肽Pen24相同的生物学功能，即它们具有抗细菌、真菌和病毒感染的生物活性，能够用于实现本发明的一个或多个目的。
根据蛋白质的氨基酸组成，结合SDS-PAGE的分析结果，本发明所涉及的基因工程重组对虾肽Pen24的分子量为约24kDa。如果蛋白质的氨基酸序列发生部分或局部的改变，蛋白质的分子量会发生变化。选用不同的宿主菌株和表达载体，由于翻译后修饰的原因，蛋白质的分子量也会发生变化。选用不同的检测方法，蛋白质的分子量也会有一些差异，但这些变化和差异在原则上不会超过蛋白质分子量的10％。
本发明以南美白对虾为材料，提取总RNA，设计Penaeidin-2特异引物，通过RT-PCR、PCR扩增，得到其成熟肽编码区序列，核苷酸序列为：
tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa
在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列为序列表1。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种基因工程重组对虾肽Pen24，该蛋白为基因工程融合蛋白，其N的氨基酸是载体所编码的，N端氨基酸是：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSEF
本发明提供一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列，其具有与序列表1所示核苷酸至少有50％同源性的序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列，其核苷酸序列与序列表1的核苷酸序列至少有80％的同源性。
基因工程蛋白质氨基酸序列的任何改变可能改变其编码的氨基酸，进而改变其编码蛋白质的结构和功能，但生物的氨基酸密码子存在兼并性。本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列可以进行突变，但其编码的蛋白质有相同的生物学功能。这些突变包括错义突变、同义突变和移码突变。这些方法为常规的方法，可以通过点突变等方法实现。这些方法为本专业技术人员所熟悉，不需进行创造性劳动即可获得。通过该方法获得的与本发明所述的核苷酸序列有50％同源性的核苷酸序列都具有与本发明所述核苷酸序列相同的生物学功能，能够用于实现本发明的一个或多个目的。按照现代生物学的概念，尤其是生物信息学的理论，同源性在70％以上的核苷酸序列可以判定为具有显著的相似性，同源性在80％以上的核苷酸序列可以判定为具有相同的生物学功能。
本发明所述的编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列可以在一定范围内进行改变，所获得的核苷酸序列与编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列具有相同的生物学功能。
在本发明的一个实施方案中，所用pET-32a(+)质粒为Novagen公司产品，在pET-32a(+)质粒多克隆位点上游还带有His.Tag、S.Tag及肠激酶和凝血酶酶切位点，表达的重组对虾肽Pen24为融合蛋白，其分子质量约24kDa。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种Penaeidin-2DNA片断及其制备方法。该片段包含本发明所述的编码基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列。
发明所涉及的DNA片断可以通过以下方式获得：
(1)人工合成，可直接用DNA合成仪人工合成本发明所述的DNA片断，或者分段合成本发明所述的DNA片断，这些合成产物具有与本发明所述的DNA片断相同的生物学功能，可以实现本发明所述的一个或多个目的。
(2)PCR扩增，以本发明所述的DNA片断为模板，或者以含有本发明所述的DNA片断的质粒、载体、宿主细胞为模板，通过PCR扩增得到DNA片断，这些PCR产物具有与本发明所述的DNA片断相同的生物学功能，可以实现本发明所述的一个或多个目的。
以上方法为分子生物学中常用的方法，为本领域技术人员所熟悉，不需通过创造性劳动即可获得，所获得的DNA片断被视为与本发明所涉及的核苷酸序列有相同的生物学功能，能够进一步通过基因工程的方法实现本发明的一个或多个发明目的。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞——大肠杆菌E.coli，该宿主细胞包含编码本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的DNA片断。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株，该菌株分类命名为E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2006年1月10日，保藏编号：CCTCC No：M206003，该宿主细胞包含本发明所述的基因工程重组对虾肽Pen24的核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种大肠杆菌重组基因工程菌株E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的构建方法。
(1)南美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成
采集健康南美白对虾血淋巴，获得血细胞，按Qiagen公司RNeasy Mini Kit说明书提取总RNA，并按Promega公司Universal Riboclone cDNA SynthesisSystem试剂盒操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链。
(2)PCR扩增Penaeidin-2基因
以反转录合成的cDNA第一条链为模板，上游引物P1：5′GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3′(下划线处为EcoR I位点)，下游引物P2：3′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5′(下划线处为Hind III位点)。利用PCR仪扩增，获得168bp目的基因。
′(3)重组质粒pGEM-T/Pen的构建和鉴定
回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化E.coli JM109(购于美国Promega公司)感受态细胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T/Pen。
′(4)重组表达质粒pET-pen的构建和鉴定
用EcoR I、Hind III分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组子pGEM-T/Pen质粒DNA，将Penaeidin-2基因定向插入表达载体pET-32a(+)，获得重组质粒pET-pen。转化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受态细胞。用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序分析鉴定重组质粒pET-pen。该菌株命名为大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种利用大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)表达基因工程重组对虾肽Pen24的方法。
(1)挑取单菌落接种于含200μg/mL氨苄青霉素(Amp)，34μg/mL氯霉素和15μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。4℃放置过夜。
(2)次日按4％接种量接入新鲜2YT液体培养基中，在37℃下继续振荡培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG至终浓度为0.4mmoI/L，在37℃下诱导表达3-5h，4℃离心收集菌体。
(3)15％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种纯化基因工程重组对虾肽Pen24的方法。
(1)超声波破碎离心收集上清；
(2)采用His·Bind resin柱，按照操作手册纯化基因工程重组对虾肽Pen24；
(3)PBS缓冲液(pH7.3)透析处理纯化的基因工程重组对虾肽Pen24；
(4)15％SDS-PAGE电泳，激光扫描检测重组对虾肽蛋白Pen24纯度。
(5)采用Bradford assay法，测定纯化的重组对虾肽蛋白Pen24浓度。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗细菌的生物活性。
(1)采用纸片扩散法，检测重组对虾肽Pen24对大肠杆菌的活力单位和抑菌效价。
(2)采用纸片扩散法，检测重组对虾肽Pen24对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素的大肠杆菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。
(3)采用液体生长抑制法，测定重组对虾肽Pen24对MIC。
将过夜培养的不同菌种进行倍比稀释，取10-3稀释度进行MIC测定，最后通过计算菌落形成单位(CFU)判断最小抑菌浓度。
重组对虾肽Pen24对虾肽具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抑菌活性；对氨苄青霉素不敏感的强致病性细菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和绿脓杆菌等有很好的抗菌活性。同时，重组对虾肽Pen24对抗氨苄青霉素的大肠杆菌具有抑菌活性。
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的生物活性。
采用舔食法，检测该重组对虾肽Pen24对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染家蚕幼虫的影响。重组对虾肽Pen24具有明显的抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的生物活性。
采用舔食法，检测该重组对虾肽Pen24对苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)感染银纹夜蛾幼虫的影响。重组对虾肽Pen24具有明显的抗苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)感染的活性。
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)的生物活性。
采用舔食法，检测该重组对虾肽Pen24对棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)感染棉铃虫幼虫的影响。重组对虾肽Pen24具有明显的抗棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)感染的活性。
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)的生物活性。
采用舔食法，检测该重组对虾肽Pen24对甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)感染甜菜夜蛾幼虫的影响。重组对虾肽Pen24具有明显的抗甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)感染的活性。
在本发明的一个实施方案中，检测了基因工程重组对虾肽Pen24抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)的生物活性。
采用注射法，检测该重组对虾肽Pen24对对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染克氏原螯虾的影响。重组对虾肽Pen24具有明显的抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染的活性。
附图说明
本发明的上述和其它目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。图1基因penaedin-2RT-PCR鉴定图。
Lane 1.DL2000 Markers；Lane 2.PCR product
图2重组质粒pGEM-T/Pen-2的PCR和酶切鉴定图
Lane 1 DL2000；Lane 2PCR product；Lane 3 pGEM-T/Pen/EcoRI+HindIII；Lane 4pGEM-T/Pen/EcoRI；Lane 5 pGEM-T/Pen plasmid；lane6 marker III
图3重组表达质粒pET-pen的PCR和酶切鉴定图
Lane 1 DL2000 Markers；Lane 2.PCR product；Lane 3.pET-pen/EcoR I+HindIII；
Lane 4.pET-pen/EcoRI；Lane 5.pET-32a(+)/EcoRI；Lane 6.MarkerIII.
图4重组表达质粒pET-pen的构建过程图
图515％SDS-PAGE检测Pen24的表达
Lane 1.纯化的Pen24融合蛋白；Lane 2.分子量标准；Lane 3.E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)未诱导；Lane 4.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)诱导前；Lane 5.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)诱导4h；Lane 6.E.coliOrigami B(DE3)pLysS(pET-pen)诱导3h；Lane 7.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)诱导4h；Lane 8.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)诱导前；Lane 9.E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32)未诱导
图6重组对虾肽Pen24抑菌效价测定
图7重组对虾肽Pen24抑制BmNPV感染家蚕的活性测定
注：TN+BmNPV：BmNPV阳性对照组；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPV：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+BmNPV组；A组，B组：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV组；TN：TN Buffer对照组
图8重组对虾肽Pen24抑制AcNPV感染银纹夜蛾的活性测定
注：AcNPV：AcNPV阳性对照组；AcNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+AcNPV组；AcNPV+Pen-24：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV组；PBS：PBS Buffer对照组
图9重组对虾肽Pen24抑制HaNPV感染银纹夜蛾的活性测定
注：HaNPV：HaNPV阳性对照组；HaNPV+Pen-24：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV组；HaNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+HaNPV组；PBS：PBS Buffer对照组
图10重组对虾肽Pen24抑制SeMNPV感染银纹夜蛾的活性测定
注：SeMNPV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+SeMNPV组；SeMNPV+Pen-24：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV组；SeMNPV：SeMNPV阳性对照组；PBS：PBS Buffer对照组
图11重组对虾肽Pen-24抑制WSSV感染克氏原螯虾的活性测定
注：WSSV+E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)：E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET)破碎上清液+WSSV组；WSSV+PBS：WSSV阳性对照组；WSSV+Pen-24：重组对虾肽Pen24+WSSV组；PBS：PBS Buffer对照组
具体实施方式
实施例1南美白对虾总RNA的提取
将南美白对虾饲养于通氧22℃的水箱中待用。选取蜕皮间期健康虾，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，用2.5mL一次性注射器从虾的腹窦处收集血淋巴750μL，加入等体积的抗凝剂(PH7.0)，镜检记数，取细胞含量为1×107的血淋巴于4℃、、800g离心15min，移去上清，收集血细胞。按照Qiagen公司RNeasyMini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃，以备用。
对提取的南美白对虾总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示28S和18S两条带清晰可见，并且两条带的显色强度近似为2∶1，说明所提取的总RNA基本上没有降解，完整性较好。
实施例2南美白对虾反转录cDNA第一条链的合成
以Oligo(dT)15为引物，按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction试剂盒说明书合成cDNA第一链。具体操作步骤如下：将以下试剂加入到经DEPC浸泡并灭菌处理过的PCR反应管中：25mM MgCl2，4μL；10×反转录缓冲液，2μL；10mM dNTP混合物，2μL；重组的
核糖核酸酶抑制剂，0.5μL；24U/μLAMV反转录酶，0.8μL；0.5μg/μL Oligo(dT)15引物1μL；总RNA，3μL；无核酸酶的水，2.7μL。反应条件为：42℃，1小时；95℃，5分钟；3℃，5分钟。将合成的cDNA第一链存放于-80℃备用。
实施例3南美白对虾Penaeidin-2基因的扩增
1.扩增引物的合成
设计引物，上游引物P1：5′GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3′(下划线处为EcoR I位点)，下游引物P2：3′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA5′(下划线处为Hind III位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。
2.目的基因的PCR扩增
按照Reverse Transcription Reaction试剂盒操作手册，以反转录合成的cDNA第一条链为模板，PCR扩增目的基因Penaeidin-2。PCR反应体系：10×reactionbuffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U/μL Taq DNA聚合酶1μL；模板6μL；加无菌水至终体积为50μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，30s；53℃，45s；72℃30s(35个循环)；72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳结果如附图1所示。PCR扩增目的基因Penaeidin-2产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，有一约为168bp DNA带，与预测目的基因Penaeidin-2结果相符。
实施例4南美白对虾Penaeidin-2基因的克隆
1.目的基因penaedin-2片段的回收
采用DNA胶回收试剂盒(Omega公司产品)，按照Omega公司DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。具体操作步骤如下：
(1)PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。
(2)在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。
(3)将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。
(4)加300μL Binding Buffer，离心弃去液体。
(5)加750μL Washing Buffer，离心弃去液体。
(6)重复步骤(5)。
(7)空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。
(8)将柱子放于1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，收集离心液，贮存于-20℃。
2.目的基因penaedin-2片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T/Pen
将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为：2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T载体，0.5μL；PCR产物，4.0μL；T4DNA ligase，0.5μL；无加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液体，16℃连接15h。
3.质粒的转化
(1)感受态细胞的制备：采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。挑取单个E.coli JM 109菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mL LB培养液中，37℃，220rpm振荡，待菌液OD值为0.6时，取1.5mL菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，弃上清。加入800μL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。4,000rpm离心10min，弃上清。加入100μL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，4℃保存，7～10天内使用。
(2)质粒转化E.coli JM109感受态细胞：取上述连接产物10μL加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入390μL新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。取100μL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和Amp抗性的LB平板上，37℃培养过夜，观察结果，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落快速提取质粒进行PCR和酶切鉴定。
4.重组质粒pGEM-T/Pen的鉴定
随机挑取10个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒(Qiagen公司产品)抽提质粒。以质粒pGEM-T/Pen为模板，用引物P 1、P2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因已克隆入pGEM-T载体中。PCR与酶切鉴定结果见附图2。重组质粒pGEM-T/Pen经EcoRI+HindIII双酶切，得到约3000bp和168bp的预期DNA片断，pGEM-T/Pen经EcoRI单酶切，得到单一约3168bp的预期DNA片断。
5.Penaeidin-2核苷酸序列测定
质粒pGEM-T/Pen DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pGEM-T/Pen质粒经全自动测序分析，Penaeidin-2基因核苷酸序列为：
tacaggggcggttacacaggcccgatacccaggccaccacccattggaagaccaccgttcagacctgtttgcaatgcatgctacagactttccgtctcagatgctcgcaattgctgcatcaagttcggaagctgttgtcacttagtaaaaggataa
实施例5基因工程菌株
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)的构建和鉴定
1.重组表达质粒pET-pen的构建
用EcoR I、Hind III分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组子pGEM-T/Pen质粒DNA，分别用胶回收试剂盒回收、纯化目的DNA片断，再将Penaeidin-2DNA片断与pET-32a(+)DNA片断连接，16℃连接15h后，产物转化E.coli OrigamiB(DE3)pLysS感受态细胞，涂布于含12.5μg/ml Tetracycline、15μg/mlKanamycin、34μg/ml Chloramphenicol的LB平板上，37℃培养过夜。
2.重组表达质粒pET-pen的鉴定
随机挑取10个阳性克隆，经扩大培养后，用质粒提取试剂盒抽提质粒，PCR和EcoR I、Hind III酶切鉴定pET-pen重组表达质粒。以质粒pET-pen为模板，用引物P1、P2扩增出与预测结果相符的片断，表明目的基因已克隆入pET-32a(+)载体中。PCR与酶切鉴定结果如附图3。重组质粒pET-pen DNA经EcoRI+HindIII双酶切，得到约5875bp和168bp的二个DNA片断，pET-pen DNA经EcoRI单酶切，得到单一约6043bp的DNA片断。
重组表达质粒pET-pen的构建过程如附图4。
3.核苷酸序列测定
质粒pET-pen DNA经PCR和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA测序分析。pET-pen质粒经全自动测序分析，结果表明6个Hi s序列成功的融合到Penaeidin-2基因成熟肽起始密码子tac前，序列阅读框没有移码。
上述所构建的菌株为E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)。
实施例6基因工程重组对虾肽Pen24的表达
挑取用甘油保存的菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接种于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4％接种量接入新鲜含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37℃培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37℃下诱导表达，诱导后2h，3h，4h分别取样，离心沉淀，去上清，加入300μLPBS(PH6.9)缓冲液，超声波破碎，12,000g离心10min，上清加入5×SDS-PAGE样品缓冲液，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图5所示。15％SDS-PAGE电泳结果表明在IPTG诱导后基因工程菌株能够表达重组对虾肽Pen24，表达产物分子量与预期相符，为24kDa。
实施例7基因工程重组对虾肽Pen24的纯化
(1)挑取用甘油保存的菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，接种于含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的LB液体培养基中，37℃，250r/min下振荡培养8-12h。次日按4％接种量接入新鲜含100μg/mL Ampicillin，34μg/mL chloramphenicol和15μg/mL kanamycin(sulfate)的2YT液体培养基中，37℃培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入诱导物IPTG(终浓度为0.4mM)，37℃下诱导表达，诱导表达4h后，5000g离心收集菌体。
(2)重悬于Binding Buffer pH7.920mmol/L Tris-HCl，5mmol/L NaCl中，4℃，进行超声波破碎菌处理(处理30min，每次10s，间隔30s)。12,000g离心20min两次，收集上清，上清即为基因工程重组对虾肽Pen24的提取液。
(3)Ni++柱层析样品处理：基因工程重组对虾肽Pen24的提取液经0.45μm的滤膜过滤，用1×Binding Buffer定容至100ml Ni++柱层析样品。用10床1×Binding Buffer，20床无菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer(5mM NiSO4)，结合Ni++；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床后，备用(1床即是柱内介质的体积)。样品经蠕动泵以循环方式通过Ni++柱，使带有6×His的蛋白样品流动相充分与Ni++柱中的Ni++相结合，过夜后从Ni++柱出口收集未与Ni++结合的样品(穿漏液)。分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni++柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer(1M咪唑+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗脱与Ni++柱结合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。Ni++柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗样柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer(100mM EDTA+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl pH7.9)洗柱子。通过SDS-PAGE检验目的蛋白在洗脱液中的分布，参照《分子克隆》进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R250染色检测分析表达结果。结果如附图5所示。纯化样品经15％SDS-PAGE检测，有大小为24.1kDa的单一条带。
实施例8基因工程重组对虾肽Pen24纯化样品中蛋白质含量的确定
将15mL经Ni++柱洗脱、收集的基因工程重组对虾肽Pen24纯化样品装入经处理的透析袋中，放入盛有1000mL PBS缓冲液(PH6.9)烧杯中透析、过夜。以上操作均在4℃进行。用Bradford法确定重组对虾肽Pen24含量，用mg/mL标定。
Bradford法具体操作如下：
(1)将0、1、2、3、4、5、6μL 1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)标准溶液依次加入酶标微孔板中，用PBS补足50μL。
(2)向每孔中加入200μL Bradford试剂工作液(0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振荡、混匀后，室温放置2分钟。
(3)用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD570值(λ＝570nm)。以BSA蛋白质浓度为横坐标，以BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线。
(4)用同样方法测定样品的OD570值，用标准曲线中确定样品的浓度。
实施例9基因工程重组对虾肽Pen24
抗细菌的生物活性
(1)重组对虾肽Pen24抑菌效价和活力单位测定
采用纸片扩散法，检测重组对虾肽Pen24对大肠杆菌的活力单位和抑菌效价。滤纸片直径为0.6cm。实验菌种大肠杆菌(Escherichia coli)，将培养至对数生长期的大肠杆菌(CFU＝1.5×106个/mL)以1∶200比例均匀涂布于LB琼脂平板上，待干燥后贴上无菌纸片，将待测重组抗菌肽Pen24溶液20μL加到纸片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作阴性对照，同时以含氨苄青霉素的药敏纸片作阳性对照，37℃孵育12h后，测量抑菌圈直径大小。
结果如附图6所示。当对虾肽Pen24为2.80μg时，抑菌圈直径为17.44mm，2.80μg Pen24和10μg(含15IU)的氨苄青霉素药敏纸片产生的抑菌圈大小相等，表明重组对虾肽Pen24的杀菌活力为：1μg抗菌肽与5IU的氨苄青霉素杀菌活力相当。试验中，每片药敏纸片中重组对虾肽Pen24含量增加，抑菌圈直径逐渐增大。
(2)采用纸片扩散法，检测重组对虾肽Pen24对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素的大肠杆菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性。实验菌种包括：抗氨苄青霉素大肠杆菌Escherichia coliBL21(pET-32a)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(中国典型培养物保藏中心提供)。将培养至对数生长期的不同细菌(CFU＝1.5×106个/mL)以1∶200比例均匀涂布于LB琼脂平板上，待干燥后贴上无菌纸片，将待测重组抗菌肽Pen24溶液20μL加到纸片上，以E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-32a)20μL作阴性对照，同时以含氨苄青霉素的药敏纸片作阳性对照，37℃孵育12h后，测量抑菌圈直径大小。
重组对虾肽Pen24对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素的大肠杆菌菌株E.coli BL21(pET-32a)的活性结果见表1。抑菌圈大小又表明重组对虾肽Pen24对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有不同程度的抗菌活性，并且对包括氨苄青霉素抗性菌在内的多种细菌都有抑制作用，且随着抗菌肽含量的提高，抑菌圈逐渐加大，效果不断加强。
表1重组对虾肽Pen24活力测定
(3)重组对虾肽Penaeidin-2最小抑菌浓度(MIC)值测定
最小抑菌浓度(MIC)值的测定参照液体生长抑制法，将过夜培养的不同菌种进行10倍稀释，取10-3稀释度进行MIC测定，分别各取5μL(CFU＝1.5×107个/mL)加入1.5mL EP管中，向各管中依次加入0μL、10μL、20μL、30μL、35μL、36μL、38μL、40μL等经过透析处理的并已经定量的纯化重组对虾肽，37℃静止培养24小时，均匀涂布于琼脂平板，37℃过夜培养后计算菌落形成单位(CFU)。结果见表2。表明重组对虾肽Pen-24对多种强致病性细菌均有很好的抑菌作用，Pen-24对革兰氏阳性细菌抑菌效果较革兰氏阴性细菌显著。
表2重组对虾肽Pen24最小抑菌浓度(MIC)的测定
实施例10基因工程重组对虾肽Pen24
抗家蚕核形多角体病毒感染的生物活性
1.样品的制备
(1)家蚕核形多角体病毒(BmNPV)样品的制备：
家蚕核形多角体病毒(BmNPV)粗提液经蔗糖梯度纯化，于显微镜下计数，BmNPV含量为1.6×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL NT Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL NT Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
2.Pen24抗家蚕核形多角体病毒(BmNPV)感染生物活性测定
家蚕购于武汉从蚕业研究所，于室温饲养。将五龄家蚕幼虫分成5组，选择8×108PIB/mL BmNPV作为病毒感染剂量。分别用下述4种样品添食感染：
①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+BmNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品与BmNPV悬液混合，26℃下作用1h后，涂于4片中等大小、新鲜干净桑叶上，每片300μL，等其干燥后喂养家蚕。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品与BmNPV悬液混合，26℃下作用1h后，涂于4片中等大小、新鲜干净桑叶上，每片300μL，等其干燥后喂养家蚕。
③BmNPV阳性对照组：
BmNPV悬液涂于4片中等大小、新鲜干净桑叶上，每片300μL，等其干燥后喂养家蚕。
④TN Buffer对照组：
TN Buffer涂于4片中等大小、新鲜干净桑叶上，每片300μL，等其干燥后喂养家蚕。
家蚕幼虫于20-25℃条件下饲养，感染BmNPV病毒3天后，每天喂食新鲜干净桑叶两次，一天两次记录家蚕幼虫死亡的情况。
结果见附图7。结果表明，第6天，E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV组死亡率分别为10％，20％；BmNPV阳性对照组死亡率为40％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV对照组死亡率为40％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液)+BmNPV组死亡率分别为60％，70％；BmNPV阳性对照组死亡率100％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+BmNPV对照组死亡率为100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制BmNPV对五龄家蚕幼虫感染，具有抗BmNPV病毒感染的生物活性。
实施例11基因工程重组对虾肽Pen24
抗苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)感染的生物活性
采用舔食法，检测基因工程重组对虾肽Pen24抗苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)感染银纹夜蛾幼虫的影响。
1.样品的制备
(1)苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)样品的制备：
苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)粗提液经蔗糖梯度纯化，于显微镜下计数，AcNPV含量为1.1×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
2.Pen24抗苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)感染生物活性测定
选择1.1×104PIB/mL AcNPV作为病毒感染剂量。将银纹夜蛾饲养于26℃，用人工饲料饲养。将三龄银纹夜蛾幼虫分成4组，分别用下述4种样品添食感染：
①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品与AcNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养银纹夜蛾幼虫。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品与AcNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养银纹夜蛾幼虫。
③AcNPV阳性对照组：
AcNPV悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养银纹夜蛾幼虫。
④PBS Buffer对照组：
PBS Buffer悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养银纹夜蛾幼虫。
银纹夜蛾幼虫于20-25℃条件下饲养，感染AcNPV病毒三天后，每天喂食新鲜人工饲料，一天两次记录银纹夜蛾幼虫死亡情况。
结果见附图8。结果表明，第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV组死亡率为58％；AcNPV阳性对照组死亡率为84％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV对照组死亡率为92％。第7天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+AcNPV组死亡率为75％；AcNPV阳性对照组死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+AcNPV对照组死亡率为100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制AcNPV对三龄银纹夜蛾幼虫的感染，具有抗AcNPV病毒感染的生物活性。
实施例12基因工程重组对虾肽Pen24
抗棉铃虫核形多角体病毒(HaNPV)感染的生物活性
采用舔食法，检测基因工程重组对虾肽Pen24抗棉铃虫核形多角体病毒(HaNPV)感染棉铃虫幼虫的影响。
1.样品的制备
(1)棉铃虫核形多角体病毒(HaNPV)样品的制备：
棉铃虫核形多角体病毒(HaNPV)粗提液经蔗糖梯度纯化，于显微镜下计数，HaNPV含量为1.5×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
2.Pen24抗棉铃虫核形多角体病毒(HaNPV)感染生物活性测定
选择1.5×104PIB/mL HaNPV作为病毒感染剂量。将棉铃虫饲养于26℃，用人工饲料饲养。将三龄棉铃虫幼虫分成4组，分别用下述4种样品添食感染：
①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品与HaNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养棉铃虫幼虫。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品与HaNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养棉铃虫幼虫。
③HaNPV阳性对照组：
HaNPV悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养棉铃虫幼虫。
④PBS Buffer对照组：
PBS Buffer悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养棉铃虫幼虫。
棉铃虫幼虫于20-25℃条件下饲养，感染HaNPV病毒三天后，每天喂食新鲜人工饲料，一天两次记录棉铃虫幼虫死亡情况。
结果见附图9。结果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV组死亡率为33％；HaNPV阳性对照组死亡率为75％；E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV对照组死亡率为75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV组死亡率为67％；HaNPV阳性对照组死亡率为92％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV对照组死亡率为92％。第6天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+HaNPV组死亡率为83％；HaNPV阳性对照组死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+HaNPV对照组死亡率为100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制HaNPV对三龄棉铃虫幼虫的感染，具有抗HaNPV病毒感染的生物活性。
实施例13基因工程重组对虾肽Pen24
抗甜菜夜蛾核形多角体病毒(SeMNPV)感染的生物活性
采用舔食法，检测基因工程重组对虾肽Pen24抗甜菜夜蛾核形多角体病毒(SeMNPV)感染甜菜夜蛾幼虫的影响。
1.样品的制备
(1)甜菜夜蛾核形多角体病毒(SeMNPV)样品的制备：
甜菜夜蛾核形多角体病毒(SeMNPV)粗提液经蔗糖梯度纯化，于显微镜下计数，SeMNPV含量为7.8×109PIB/mL。
(2)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
(3)E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品制备：
菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。
2.Pen24抗甜菜夜蛾核形多角体病毒(SeMNPV)感染生物活性测定
选择7.8×104PIB/mL SeMNPV作为病毒感染剂量。将甜菜夜蛾饲养于26℃，用人工饲料饲养。将三龄甜菜夜蛾幼虫分成4组，分别用下述4种样品添食感染：
①E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液样品与SeMNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养甜菜夜蛾幼虫。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV组：
E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品与SeMNPV悬液混合，26℃下作用1h后，按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养甜菜夜蛾幼虫。
③SeMNPV阳性对照组：
SeMNPV悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养甜菜夜蛾幼虫。
④PBS Buffer对照组：
PBS Buffer悬液按300μL涂于1cm3人工饲料表面，喂养甜菜夜蛾幼虫。
甜菜夜蛾幼虫于20-25℃条件下饲养，感染SeMNPV病毒三天后，每天喂食新鲜人工饲料，一天两次记录甜菜夜蛾幼虫死亡情况。
结果见附图10。结果表明，第4天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV组死亡率为58％；SeMNPV阳性对照组死亡率为75％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV对照组死亡率为75％。第5天，E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV组死亡率为58％；SeMNPV阳性对照组死亡率为100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV对照组死亡率为100％。第7天，E.coliOrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)破碎上清液+SeMNPV组死亡率为75％；SeMNPV阳性对照组死亡率100％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液+SeMNPV对照组死亡率为100％。抗菌肽Pen24能有效地抑制SeMNPV对三龄甜菜夜蛾幼虫的感染，具有抗SeMNPV病毒感染的生物活性。
实施例14基因工程重组对虾肽Pen24
抗对虾白斑综合症病毒感染的生物活性
1.样品的制备和处理
(1)对虾白斑综合症病毒(WSSV)样品的制备
将-20℃冻存的经对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染的克氏原螯虾置冰上，取头胸部(腮、肝、心脏等器官)，用手术剪刀剪成小块，放入玻璃匀浆器内，冰浴匀浆。匀浆液12000r/min 4℃离心20min，上清液用0.45μm滤膜过滤除菌，分装1.5ml EP管-20℃冻存备用。
用上述WSSV病毒悬液，用150μl/头WSSV悬液注射克氏原螯虾，22-24℃感染，结果6.5天内全部死亡。用100μl/头WSSV悬液注射克氏原螯虾，22-24℃感染，结果9天内全部死亡。我们选择0.1mL WSSV病毒悬液为基因工程重组对虾肽Pen24抗对虾白斑综合症病毒感染体实验的WSSV病毒感染剂量。
(2)四种试验样品的处理
①基因工程重组对虾肽Pen24纯化样品试验组样品：将定量的1mg/mL重组对虾肽Pen24纯化样品与WSSV病毒悬液等体积混匀，26℃下作用1h。
②E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液样品制备和处理：菌种E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))经发酵，收集菌体。100克湿菌体用500mL PBS Buffer重悬，超声波破碎，离心，取上清。将破碎上清液与WSSV病毒悬液等体积混匀，26℃下作用1h。
③WSSV阳性对照组样品：WSSV病毒悬液用PBS稀释1倍，26℃下作用1h。
④健康对照组样品：PBS Buffer。
2.Pen24抗对虾白斑综合症病毒(WSSV)感染生物活性测定
克氏原螯虾于22-24℃于室温饲养，对虾饵料(0号)购于湛江粤华水产饲料有限公司。将克氏原螯虾分成4组，分别用上述4种试验样品注射克氏原螯虾。剂量0.15mL/尾，每组25尾，两个重复。在自然气温(15～22℃)的条件下养殖，每天换水并投喂人工虾饲料一次，一天两次记录螯虾死亡的情况。
结果见表3和附图11。室温(20-25℃)饲养的结果显示，克氏原螯虾于22-24℃养殖，在第4天，基因工程重组对虾肽Pen24样品试验组无死亡；WSSV阳性对照组组死亡率为15％；E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液组死亡率为20％。第9天，WSSV阳性对照组和E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-32a(+))破碎上清液组死亡率均为100％，基因工程重组对虾肽Pen24纯化样品试验组死亡率为85％，有15％的存活率。表明基因工程重组对虾肽Pen24在克氏原螯虾体内能较有效地抵抗WSSV的感染，具有抗WSSV病毒感染的生物活性。
表3重组对虾肽Pen24抗WSSV感染的测定
序列表1
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用
<130>一种重组对虾肽Pen24核苷酸序列
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>657
<212>DNA
<213>重组DNA
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(657)
<223>
<400>1
atg agc gat aaa att att cac ctg act gac gac agt ttt gac acg gat 48
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
gta ctc aaa gcg gac ggg gcg atc ctc gtc gat ttc tgg gca gag tgg 96
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
tgc ggt ccg tgc aaa atg atc gcc ccg att ctg gat gaa atc gct gac 144
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
gaa tat cag ggc aaa ctg acc gtt gca aaa ctg aac atc gat caa aac 192
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
cct ggc act gcg ccg aaa tat ggc atc cgt ggt atc ccg act ctg ctg 240
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
ctg ttc aaa aac ggt gaa gtg gcg gca acc aaa gtg ggt gca ctg tct 288
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
aaa ggt cag ttg aaa gag ttc ctc gac gct aac ctg gcc ggt tct ggt 336
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
tct ggc cat atg cac cat cat cat cat cat tct tct ggt ctg gtg cca 384
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
cgc ggt tct ggt atg aaa gaa acc gct gct gct aaa ttc gaa cgc cag 432
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
cac atg gac agc cca gat ctg ggt acc gac gac gac gac aag gcc atg 480
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
gct gat atc gga tcc gaa ttc tac agg ggc ggt tac aca ggc ccg ata 528
Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile
165 170 175
ccc agg cca cca ccc att gga aga cca ccg ttc aga cct gtt tgc aat 576
Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn
180 185 190
gca tgc tac aga ctt tcc gtc tca gat gct cgc aat tgc tgc atc aag 624
Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys
195 200 205
ttc gga agc tgt tgt cac tta gta aaa gga taa 657
Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly
210 215
<210>2
<211>218
<212>PRT
<213>重组DNA
<400>2
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile
165 170 175
Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn
180 185 190
Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys
195 200 205
Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly
210 215
序列表2
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用
<130>一种重组对虾肽Pen24氨基酸序列
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>218
<212>PRT
<213>重组蛋白质
<400>1
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile
165 170 175
Pro Arg Pro Pro Pro Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn
180 185 190
Ala Cys Tyr Arg Leu Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys
195 200 205
Phe Gly Ser Cys Cys His Leu Val Lys Gly
210 215
Claims (11)
1、一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾肽Pen24，其序列为序列表2所示氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述的蛋白质的分子量为24干道尔顿。
3、一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾肽Pen24对应的核酸，其序列为序列表1所示核苷酸序列。
4、一种基因工程菌株，其特征在于包含如权利要求3所述的核苷酸序列。
5、一种表达重组对虾肽Pen24基因工程菌株，其特征在于：所述的菌株是基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，CCTCC No：M206003。
6、一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株的构建方法，它包括下列步骤：
A、美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成：采集南美白对虾血淋巴，获得血细胞，提取总RNA，并按Promega公司UniversalRiboclone cDNA Synthesis System试剂盒操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链；
B、PCR扩增Penaeidin-2基因：以反转录合成的cDNA第一条链为模板，上游引物P1：5′GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3′；下游引物P2：3′GTGAATCATTTTCCTATTTTCGAA 5′，利用PCR仪扩增，获得168bp目的基因；
C、重组质粒pGEM-T/Pen的构建和鉴定：回收PCR产物，将PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含X-gal、IPTG和Amp抗性的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序分析鉴定重组质粒pGEM-T/Pen；
D、重组表达质粒pET-pen的构建和鉴定：用EcoR I、Hind III分别双酶切表达载体pET-32a(+)和重组子pGEM-T/Pen质粒DNA，将Penaeidin-2基因定向插入表达载体pET-32a(+)，获得重组表达质粒pET-pen，转化E.coli Origami B(DE3)pLysS感受态细胞获得大肠杆菌重组基因工程菌株E.coli OrigamiB(DE3)pLysS(pET-pen)，用PCR和限制性内切酶酶切鉴定、DNA测序分析鉴定重组表达质粒pET-pen。
7、权利要求1所述的重组对虾肽Pen24在制备抗细菌感染药物中的应用。
8、权利要求1所述的重组对虾肽Pen24在制备抗病毒感染药物中的应用。
9、重组对虾肽Pen24作为防腐剂在化妆品中的应用。
10、重组对虾肽Pen24作为防腐剂在食品中的应用。
11、重组对虾肽Pen24作为防腐剂在动物饲料中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610019363A CN100595278C (zh) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | 一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN200610019363A CN100595278C (zh) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | 一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1896238A CN1896238A (zh) | 2007-01-17 |
| CN100595278C true CN100595278C (zh) | 2010-03-24 |
Family
ID=37608886
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200610019363A Expired - Fee Related CN100595278C (zh) | 2006-06-15 | 2006-06-15 | 一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100595278C (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101503697B (zh) * | 2009-03-09 | 2013-08-07 | 中山大学 | 一种人血管内皮细胞生长抑制因子rhVEGI-192A的重组蛋白的制备方法 |
| CN103013896A (zh) * | 2012-10-15 | 2013-04-03 | 周建业 | Hplc12型冰结构蛋白在枯草芽孢杆菌中重组表达与制备方法 |
| CN102993309B (zh) * | 2012-10-18 | 2014-12-03 | 武汉大学 | 一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用 |
| CN105411873A (zh) * | 2015-12-14 | 2016-03-23 | 北京肽康生物科技有限公司 | 抗菌肽作为消炎祛痘剂在化妆品制备中的应用 |
| CN108101964B (zh) * | 2017-11-30 | 2020-06-26 | 天津科技大学 | 酸乳中新型ace抑制肽及其基因工程生产方法 |
| CN112458079A (zh) * | 2020-11-28 | 2021-03-09 | 华中农业大学 | 一种提取克氏原螯虾血淋巴总rna的方法 |
-
2006
- 2006-06-15 CN CN200610019363A patent/CN100595278C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| 中国对虾PC-Ⅲ系列抗菌肽的分离纯化及活性. 安贤惠等.动物学研究，第26卷第4期. 2005 |
| 中国对虾PC-Ⅲ系列抗菌肽的分离纯化及活性. 安贤惠等.动物学研究，第26卷第4期. 2005 * |
| 中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆. 康翠洁等.山东大学学报(理学版)，第37卷第6期. 2002 |
| 中国对虾抗菌肽成熟肽的cDNA克隆. 康翠洁等.山东大学学报(理学版)，第37卷第6期. 2002 * |
| 中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）抗菌因子及模式识别蛋白的研究. 柳峰松.中国科学院研究生院博士学位论文. 2005 |
| 中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗菌因子及模式识别蛋白的研究. 柳峰松.中国科学院研究生院博士学位论文. 2005 * |
| 中国明对虾一种抗菌蛋白(Crustin)基因的克隆与表达特征研究. 柳峰松等.第四届世界华人虾类养殖研讨会论文摘要汇编. 2004 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1896238A (zh) | 2007-01-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100595278C (zh) | 一种表达重组对虾肽Pen24的基因工程菌株及应用 | |
| CN101191129A (zh) | 基因工程家蚕抗菌肽及制备方法和应用 | |
| CN111349177B (zh) | 一种融合抗菌肽cat的制备方法和应用 | |
| CN102190718B (zh) | 重组对虾蛋白sf-p9及制备方法和应用 | |
| CN106414484A (zh) | 杀虫融合蛋白改进 | |
| CN108314714A (zh) | 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用 | |
| CN105219779B (zh) | 红螯螯虾抗脂多糖因子及其制备方法与应用 | |
| CN102304516A (zh) | 拟穴青蟹阴离子抗菌肽的毕赤酵母表达产物及其制备方法 | |
| CN110982822B (zh) | 一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用 | |
| CN112851792A (zh) | 一种草鱼TNF-α重组蛋白的制备方法及其应用 | |
| CN103214583A (zh) | 细菌素lacticin Q的分泌表达方法 | |
| CN101280021B (zh) | 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白vp28-cd及制备和用途 | |
| CN108586587B (zh) | 一种假结核耶尔森氏菌杀虫蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN102517308A (zh) | 一种含金纹细蛾几丁质酶基因重组质粒的构建和应用 | |
| CN109721646B (zh) | 一种诱导增强水稻稻瘟菌抗性的稻瘟菌分泌蛋白及其应用 | |
| CN101886081A (zh) | 克氏原螯虾甲壳肽基因及其编码的甲壳肽与应用 | |
| CN104988170B (zh) | 一种融合抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN1459506A (zh) | 中国对虾抗菌肽基因的重组表达与应用 | |
| CN110452290A (zh) | 来源于帚枝霉属真菌的激发子蛋白及其编码基因在蔬菜生防上的应用 | |
| CN110054684A (zh) | 东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin-5及其编码基因和应用 | |
| CN102094024A (zh) | 一种小菜蛾天蚕素基因、编码的蛋白、相应的表达系统和应用 | |
| CN104911201B (zh) | 一种提高杆状病毒杀虫效率的遗传改造方法 | |
| CN112321697B (zh) | 一种黑水虻抗菌肽Cecropin-α及其应用 | |
| CN101434958A (zh) | 一种制备猪α-干扰素的方法 | |
| CN101570755B (zh) | 一种细菌源蛋白酶抑制剂新基因及其表达与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100324 Termination date: 20170615 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |