CN108314714A

CN108314714A - 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用

Info

Publication number: CN108314714A
Application number: CN201810346084.2A
Authority: CN
Inventors: 邱德文; 杨远坤; 杨秀芬; 曾洪梅; 郭立华; 袁京京
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: CN108314714B

Abstract

本发明公开了一种大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用，该蛋白能提高植物抗病性，可以作为一种诱导植物免疫的诱导子应用到植物病害的防治领域。该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。利用工程菌株表达可以获得高小变大的蛋白，可以用于提高烟草和棉花的抗病性，所涉及的植物病害为烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病。该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗病性，且效果快，作用时间长。VdPEL1为提高植物的抗病性提供了新的途径。

Description

大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌型蛋白激发子。

背景技术

目前，对植物病害的防治主要采取化学防治和选育抗病品种。但是随着病原菌致病小种的不断进化，对农药产生了抗药性而降低了防治效果，进而导致用药量的不断增加。同时大量使用化学农药导致的农产品安全、生态安全也越备受重视。随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到极大关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，愈发受到关注，并成为生物农药的重要发展方向。因此，从病原菌中分离鉴定出具有新功能的激发子已成为国内外科学家关注的焦点。

大丽轮枝菌是植物病原真菌，可侵染38科660种植物，包括农作物184种，主要有棉花、茄子、番茄、烟草、马铃薯、西瓜、黄瓜、花生、大豆等，破坏寄主植物维管束而导致植株萎蔫死亡，造成巨大的经济损失。大丽轮枝菌在侵染植物过程中分泌产生的激发子能激活植物的免疫系统，诱导植物的防御反应，最终使植物产生系统抗性。

目前，国内外从大丽轮枝菌中分离鉴定到能够引起植物抗病性的活性成分并不多。2004年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离到一个蛋白激发子VdNEP，该激发子能诱导植物防御反应(J.Y.,Wang.等，应用环境微生物,大丽轮枝菌激发子VdNEP诱导棉花萎蔫.2004,70：4989-95)；2012年，Wang.等人从大丽轮枝菌中分离得到了一种激发子PevD1，该激发子是一种小分子蛋白，分子量为17kDa，研究证明能诱导植物过敏反应，氧爆发和抗病相关蛋白的积累，促进苯丙素合成途径，提升植物基础抗性(B.N.,Wang.等，应用环境微生物，大丽轮枝菌激发子的纯化和鉴定以及诱导烟草抗性反应,2012，93：191-201)。后期实验进一步证明，2012年Wang等人分离得到的蛋白激发子PevD1有效地诱导棉花系统抗病性，减轻棉花黄萎病的发病率(B.Bu,等，植物细胞报告，大丽轮枝菌激发子PevD1诱导棉花黄萎病抗性,2014，33,461-470)。2017年Yi Zhang等人发现大丽轮枝菌产生的VdCP1也具有蛋白激发子的功能，诱导烟草和棉花的抗病性。

所有已公开发表的文献表明，大丽轮枝菌可以产生引起植物的防御反应，提高植物抗性的激发子，其性质和种类各不相同，寻找新的蛋白激发子，不仅对揭示大丽轮枝菌与植物互作机理提供理论依据，更重要的是能为开发提高植物免疫抗性的蛋白质生物农药提供有效的蛋白资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种大丽轮枝菌Verticillium dahlia分泌型蛋白激发子VdPEL1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

本发明所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，所述植物为烟草和棉花。

本发明所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其中，当用于诱导减少烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病时，所述VdPEL1的诱导浓度为1μM；当用于诱导烟草对烟草花叶病的抗性时，所述VdPEL1的诱导浓度为500nM。

一种VdPEL1基因，其中，其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

(2)与上述多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明所述的VdPEL1基因，其中，其多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。也可以是编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的氨基酸的密码子的其他组合形式。

VdPEL1基因可用于基因工程菌株的表达，表达载体优选pPICZαA，重组载体可用毕赤酵母(Pichia pastoris KM71H)表达。得到分子量约29kD的融合表达蛋白(VdPEL1)，可以诱导烟草对灰霉病，烟草花叶病和棉花黄萎病的抗性反应，提高植物抗性。

本发明所述的蛋白激发子可以通过基因工程手段表达获得重组蛋白。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

该蛋白激发子可以明显的提高植物的抗病性，浓度低，起效快，作用时间长。VdPEL1为提高植物抗病性、减轻病害发生提供了新的途径，因而在现在农业绿色发展上具有广阔的应用前景。

微生物保藏信息

编号CGMCC No.7611，命名Verticillium dahliae，菌株XH-8，2013年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，电话010-64807355。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用作进一步说明。

附图说明

图1为蛋白激发子VdPEL1的SDS-GAGE检测图和Western Blotting检测图；

图2为不同浓度下蛋白激发子VdPEL1在烟草叶片的过敏性反应检测；

图3为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草叶片ROS反应；

图4为蛋白激发子诱导抗病相关基因的表达；

图5为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草抗灰霉病的效果图；

图6为蛋白激发子VdPEL1诱导烟草抗花叶病的效果图；

图7为蛋白激发子VdPEL1诱导棉花抗黄萎病的效果图。

具体实施方式

实施例1VdPEL1蛋白的真核表达和纯化

(1)VdPEL1蛋白激发子的分离鉴定

果胶裂解酶广泛的存在于植物病原菌的分泌物中，且已被验证可以作为蛋白激发子激活植物免疫反应(Poinssot.等,分子植物与微生物互作杂志，一个灰霉菌果胶酶激活葡萄树的免疫响应，2003,553–564.)。基于大丽轮枝菌基因组测序的完成，以及大丽轮枝菌蛋白分泌组学数据，并且结合本实验室前期对蛋白激发子的筛选体系，通过NCBI数据库中的CDD功能对大丽轮枝菌分泌组中的果胶裂解酶与已上报的激发子进行保守序列比对，同时进行系统发育进化树分析，确定了10个候选蛋白。将10个候选蛋白的编码序列分别构建到瞬时表达载体PYBA1132中，转化农杆菌并注射烟草叶片，三天后观察是否有过敏性反应出现，并用Western blot检测候选蛋白是否在烟草中表达。根据植物免疫反应一过敏性反应有无及强弱，最终确定VdPEL1作为潜在的大丽轮枝菌蛋白激发子。

(2)表达载体的构建

设计蛋白激发子基因VdPEL1的特异性引物，引入带有保护碱基的酶切位点，正向引物：5’-cggaattcgtcaacaacgtcacccccaa-3’，如SEQ ID NO:3所示，(下划线为Eco RI的酶切序列)，反向引物：5’-gctctagaccgcaagccttgacggtggtgt-3’，如SEQ ID NO:4所示，(下划线为Xba I的酶切序列)，扩增全长VdPEL1基因(94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35cycles；72℃5min)。先将VdPEL1基因目的片段克隆到pMD18-T simple载体，测序验证获得正确的质粒，然后利用Eco RI和Xba I酶切后，将VdPEL1片段克隆到pPICZαA载体(Invitrogen)的EcoRI/XbaI位点。将重组载体pPICZαA-VdPEL1转化到大肠杆菌TransT1菌株中，进行大量培养，提取质粒获得高浓度重组载体。

(3)诱导表达

利用内切酶Pme I线性化构建好的重组载体pPICZαA-VdPEL1，电激转化到毕赤酵母(Pichia pastoris KM71H)，然后利用博来霉素抗生素压力进行转化子的筛选，挑取阳性克隆进行诱导表达。接种阳性克隆子到10mL YPD(1％Yeast Extract(酵母提取物)，2％Peptone(蛋白胨)，2％Dextrose(葡萄糖)培养基中，30℃，200rpm培养过夜，将10mL种子培养液接种于1L BMG(100mM，pH6.0磷酸缓冲液，1.34％YNB，1％甘油)培养基中，30℃，250rpm培养24h至OD600＝6.0，离心发酵液，收集菌体，换用100mL BHH(100mM，pH6.0磷酸缓冲液，1.34％YNB，0.5％甲醇)培养基重悬菌体，30℃，250rpm继续培养，每24h添加终浓度为0.5％的甲醇。3天后，12000rpm离心收集上清液，取20μL上清液，加入4μL6×SDS上样缓冲液(变性)，沸水浴中加热10min，后进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约29kD的融合表达蛋白(RVdPEL1)，与预测分子量大小一致；进一步利用Western Blotting检测重组蛋白的表达，证实重组表达的蛋白为单一的条带(如图1)。

(4)重组蛋白的纯化

结果：获得纯化的融合表达蛋白(VdPEL1)

实施例2 VdPEL1诱导植物防御反应

(1)VdPEL1诱导烟草过敏性反应(HR)

经测定浓度后的VdPEL1蛋白,将其浓度调整到1μM，500nM，300nM，200nM和100nM。选取生长旺盛的5～6叶期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将约20uL指定浓度的重组蛋白VdPEL1，从叶片背面注入不同的烟草叶片中。同时1μM的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)为对照，注射48h后，观察过敏性反应。同时，处理后的叶片拍照后，进行台盼蓝染色，观察染色情况。

结果：在重组蛋白VdPEL1处理的叶片部位有明显的过敏性反应出现，台盼蓝染色后，过敏反应部位被染成蓝色。(如图2)

(2)VdPEL1诱导烟草叶片ROS反应

经测定浓度后的VdPEL1蛋白，将其浓度调整到500nM。选取生长旺盛的5～6叶期的烟草中部叶片，用1mL不带针头的注射器，将约20uL重组蛋白VdPEL1，从叶片背面注入不同的烟草叶片中。同时以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)为对照，注射24h后，取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于500mL烧杯中，加入适量DAB(3，3’-Diaminbenzidine)(Sigma)染液(1mg/mL，pH 3.8)，真空将染色液抽入叶片，室温避光处理2小时后去除染色液，加入无水乙醇进行脱色，待叶片的绿色完全脱去后，将叶片取出，放置平整观察并拍照。

结果：在重组蛋白VdPEL1处理的叶片部位有明显的褐色沉积物质出现(如图3)。

(3)VdPEL1诱导抗性相关基因转录水平显著升高

为了进一步明确VdPEL1激发植物免疫的作用，采用实时荧光定量PCR方法对烟草抗性相关基因的表达量进行分析。选取重组蛋白VdPEL1处理样品和对照蛋白BSA处理的样品液氮研磨成粉，利用TransGen公司的植物RNA提取试剂盒提取RNA，去除基因组DNA，获得高纯度的RNA。第一链cDNA的合成，采用TransGen公司的TransScript Two-Step RT-PCRKit。取500ng总RNA，按照试剂盒说明书，用TransScript RT/RI Enzyme Mix，以AnchoredOligo(dT)18为引物，42℃孵育30min，85℃加热5min使酶失活。取2uL反转录产物作为模板，β-actin为内参基因，检测抗性相关基因的表达量。相应的引物如下：

PR1-a：

F:5′-cgttgagatgtgggtcgatg-3′，如SEQ ID NO:5所示；R:5′-cctagcacatccaacacgaa-3′，如SEQ ID NO:6所示；

PR5：

F:5′-ctcatgctgccacttttgac-3′，如SEQ ID NO:7所示；R:5′-ctccaagattggcctgagtc-3′，如SEQ ID NO:8所示；

NPR1:

F:5′-gatacacggtgctgcatgtt-3′，如SEQ ID NO:9所示；R:5′-aagcctagtgagcctcttgg-3′，如SEQ ID NO:10所示；

PAL:

F:5′-attgctggtttgctcactgg-3′，如SEQ ID NO:11所示；R:5′-tccttaggctgcaactcgaa-3′，如SEQ ID NO:12所示；

COI1：

F:5′-aactggtcgggatctcttgg-3′，如SEQ ID NO:13所示；R:5′-taggcaagtatatgggcggg-3′，如SEQ ID NO:14所示。

结果：荧光定量PCR结果表明VdPEL1在处理烟草叶片后24小时导致抗病相关基因的表达量显著升高(如图4)。

实施例3 VdPEL1诱导烟草和棉花抗病性

(1)诱导烟草对灰葡萄孢菌的抗性

50uL纯化后的VdPEL1(1μM)从叶子背面注入不同的烟草叶片中。以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理20株，重复3次。诱导72h后点接种灰葡萄孢菌孢子悬浮液(10⁵个/ml)，保湿24h，第3d进行病斑大小测量。

对照叶片病斑面积＝31.15mm²

处理叶片病斑面积＝20.94mm²

结果：激发子蛋白VdPEL1可诱导烟草对灰霉菌的抗性(如图5)，且病斑面积减少约32.78％。

(2)诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)的抗性

50uL纯化后的VdPEL1溶液(500nM)从叶子背面注入不同的烟草叶片中，以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理20株，重复3次。诱导72h后，在接种叶片的上三片叶片摩擦接种等量的TMV-GFP(添加了GFP标签的TMV，在紫外灯下可发出绿色荧光)。接种3d后统计侵染点数。

表1：VdPEL1诱导烟草抑制TMV侵染实验

表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性

结果：激发子蛋白VdPEL1可诱导烟草花叶病的抗性(如图6)，且减少病害38.18％。

(3)诱导棉花黄萎病的抗性

选取生长4周的棉花幼苗，50uL纯化后的VdPEL1溶液(1μM)注射棉花叶片背面，以相同浓度的BSA(缓冲液为20mM Tris-HCl，pH 8.0)作为对照，每处理20株，重复3次。处理72h后，将大丽轮枝菌孢子悬浮液(10⁶/ml)灌根于幼苗根部，处理后的幼苗放置于25℃继续培养14天后统计并计算病情指数。

病情指数(％)＝[Σ(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×4)]×100

病害减少(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100

表中不同字母表示在ρ＜0.01水平时的差异显著性。

结果：激发子蛋白VdPEL1可诱导棉花对黄萎病的抗性(图7)，且病情指数减少约28.85％。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学研究院植物保护研究所

<120> 大丽轮枝菌分泌型蛋白激发子VdPEL1及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 大丽轮枝菌蛋白激发子核苷酸序列(Verticillium dahliae)

<400> 1

atgaagttct ccgctgtcct cgctgccctc ggcgccgccg tcgccatcgc gtcccccgcc 60

gtcaacaacg tcacccccaa caccgtcggt gctctcgagc gccgcgccgc cttccccatc 120

cccgcctcca agggctccgt cacctacaag aaggtccaga ccatcaaggg tgtcttcgac 180

ggtggcctca agacctacgg ccgtggcgtc aagtgcaccg gccagaagga gggcggtgac 240

gccgatgccg tcttcatcct cgagaacggc gccaccctga agaacgccat catcggcgcc 300

gaccagatcg agggtgtcca ctgcaagggc gcctgcacca tcgagaacgt ttggtggaag 360

gatgtctgcg aggacgcgct gagtattaag ggggatggta acgctattgt gcgcggtgga 420

ggagcccagt ctgcttctga caaggttatc cagcacaacg gtctcggaac cgtgaccatt 480

gacggcttca ccgtcgtcga cttcggcaag ctgtaccgcg cgtgcggtaa ctgcaagaag 540

atgggccgcc gcaacgtcgt catcaagaac gtcaaggcct acaacggcaa gctcctcgcc 600

ggcatcaaca gcaacaaggg tgacgtcgcc accatcacca acacgtgctc caccagcgtc 660

aagaaggtct gcaccgagtt caacggcacc acccccggca aggagcccaa ggagatccgc 720

tccggccctt ctgcctcttg caagtacacc accgtcaagg cttgc 765

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 大丽轮枝菌蛋白激发子氨基酸序列(Verticillium dahliae)

<400> 2

Met Lys Phe Ser Ala Val Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Val Ala Ile

1 5 10 15

Ala Ser Pro Ala Val Asn Asn Val Thr Pro Asn Thr Val Gly Ala Leu

20 25 30

Glu Arg Arg Ala Ala Phe Pro Ile Pro Ala Ser Lys Gly Ser Val Thr

35 40 45

Tyr Lys Lys Val Gln Thr Ile Lys Gly Val Phe Asp Gly Gly Leu Lys

50 55 60

Thr Tyr Gly Arg Gly Val Lys Cys Thr Gly Gln Lys Glu Gly Gly Asp

65 70 75 80

Ala Asp Ala Val Phe Ile Leu Glu Asn Gly Ala Thr Leu Lys Asn Ala

85 90 95

Ile Ile Gly Ala Asp Gln Ile Glu Gly Val His Cys Lys Gly Ala Cys

100 105 110

Thr Ile Glu Asn Val Trp Trp Lys Asp Val Cys Glu Asp Ala Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Gly Asp Gly Asn Ala Ile Val Arg Gly Gly Gly Ala Gln Ser

130 135 140

Ala Ser Asp Lys Val Ile Gln His Asn Gly Leu Gly Thr Val Thr Ile

145 150 155 160

Asp Gly Phe Thr Val Val Asp Phe Gly Lys Leu Tyr Arg Ala Cys Gly

165 170 175

Asn Cys Lys Lys Met Gly Arg Arg Asn Val Val Ile Lys Asn Val Lys

180 185 190

Ala Tyr Asn Gly Lys Leu Leu Ala Gly Ile Asn Ser Asn Lys Gly Asp

195 200 205

Val Ala Thr Ile Thr Asn Thr Cys Ser Thr Ser Val Lys Lys Val Cys

210 215 220

Thr Glu Phe Asn Gly Thr Thr Pro Gly Lys Glu Pro Lys Glu Ile Arg

225 230 235 240

Ser Gly Pro Ser Ala Ser Cys Lys Tyr Thr Thr Val Lys Ala Cys

245 250 255

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattcgt caacaacgtc acccccaa 28

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagacc gcaagccttg acggtggtgt 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgttgagatg tgggtcgatg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctagcacat ccaacacgaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcatgctgc cacttttgac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctccaagatt ggcctgagtc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gatacacggt gctgcatgtt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcctagtg agcctcttgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

attgctggtt tgctcactgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccttaggct gcaactcgaa 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aactggtcgg gatctcttgg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taggcaagta tatgggcggg 20

Claims

1.一种大丽轮枝菌Verticillium dahlia分泌型蛋白激发子VdPEL1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用。

3.根据权利要求2所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其特征在于：所述植物为烟草和棉花。

4.根据权利要求3所述的蛋白激发子VdPEL1在诱导植物防御反应及提高植物抗病性中的应用，其特征在于：当用于诱导减少烟草花叶病、灰霉病和棉花黄萎病时，所述VdPEL1的诱导浓度为1μM；当用于诱导烟草对烟草花叶病的抗性时，所述VdPEL1的诱导浓度为500nM。

5.一种VdPEL1基因，其特征在于：其核苷酸序列为下列所述之一：

(1)编码如SEQ ID NO:2所示蛋白质的多核苷酸序列；

6.根据权利要求5所述的VdPEL1基因，其特征在于：其多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求5或6所述的VdPEL1基因。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：在真核表达载体pPICZαA中插入VdPEL1基因。

9.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于：含有权利要求7或8所述的重组载体。

10.根据权利要求9所述遗传工程的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为含有权利要求7所述重组载体的毕赤酵母Pichia pastoris KM71H。