CN102020709A - 一种厚壳贻贝抗菌肽及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

一种厚壳贻贝抗菌肽，该抗菌肽的名称为myticin，其编码的cDNA基因的开放阅读框具有特殊的核苷酸序列，本发明还公开了厚壳贻贝抗菌肽的制备方法和真核表达载体及在制备抗生素中的应用。本发明的抗菌肽可以作为饲料添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，可用于水产养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量，也可以作为新型生物抗生素，用于细菌性疾病的治疗或预防。

Description

一种厚壳贻贝抗菌肽及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种厚壳贻贝抗菌肽，本发明还涉及该厚壳贻贝抗菌肽制备方法，本发明还涉及该厚壳贻贝抗菌肽的用途。

背景技术

中国是全球最大的水产养殖大国，水产品总产量(捕捞+养殖)占全球35％，其中水产品养殖产量约占全球的70％，2005年水产品产量达5181万吨。其中海水产品2854万吨，占总产量的55％，捕捞约1022万吨，人工养殖产品约1888万吨。随着全球对水产品的消费逐年增加，国内消费增长势头迅猛，另一方面全球海洋捕捞资源衰退，供给逐步转向以养殖水产品为主，中国水产养殖业在全球消费中越来越重要。人工养殖比例逐年提高，1978年人工养殖比例占26％，2005年人工养殖比例达61％。随着水产养殖业的蓬勃发展，由于高密度养殖、养殖水域富营养化、生态环境恶化等原因使得水产养殖品种频频发生各种疾病，经济损失严重，已成为21世纪水产养殖业发展的重要制约因素。据初步统计，目前危害水产养殖生物的病害已达400～500种，大多数病害是由病毒、细菌、真菌等微生物所引起的。而传统的抗微生物药物及饲料添加剂——抗生素，由于耐药性病原菌的形成，以及食品安全性等公共卫生上问题的提出，目前在世界各国养殖业中的使用都受到严格限制，如欧盟自2006年1月1日起，全面禁止食品动物使用抗生素促生长饲料添加剂，因此寻找安全的抗生素替代物、开发安全高效的新型抗微生物免疫增强剂或能增强养殖品种机体免疫力的饲料添加剂成为研究的热点，也是我国养殖业、饲料行业健康、持续发展首要解决的课题之一。

抗菌肽(antimicrobial peptides)作为先天免疫系统的重要部分对于保护生物机体具有不可或缺的作用。至今，已经有超过800个抗菌肽被分离和鉴定。根据它们的氨基酸组成和空间结构可分为α-螺旋阳离子线性抗菌肽、含二硫键的抗菌肽、富含某种氨基酸残基的抗菌肽和阴离子抗菌肽。抗菌肽的抗菌活性具有选择性高、杀菌快速、作用广谱和难以形成抗性的特点，使其成为研究和开发新型生物抗生素的理想候选。

贻贝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一个重要内容，其特殊的结构与广谱的抗菌功能使其具有重要的理论研究价值，同时也具有开发成为新型生物抗生素的潜力。近年来在海洋软体动物贻贝中发现了新的抗菌肽家族，该家族是由特定基因编码的一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，根据贻贝抗菌肽家族一级结构的不同可以将其分为4组：Defensins，Mytilins，Myticin和Mytimycin。由于抗菌肽天然产量低，合成抗菌肽的价格又太昂贵，因此应用基因工程技术对其进行克隆与表达，将是研究和开发利用抗菌肽的一条有效途径。Myticin是贻贝抗菌肽家族中的一类重要成员，目前已从不同种的贻贝中分离纯化到数种Myticin分子，被认为是贻贝防御机制中最重要的一类抗菌肽分子。

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国具有重要经济价值的养殖贻贝之一，对其抗菌肽的研究目前尚不多见。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种厚壳贻贝抗菌肽，该抗菌肽对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌具有显著抑制作用，具有广谱抗菌活性和医药价值。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种厚壳贻贝抗菌肽的制备方法。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种厚壳贻贝抗菌肽的表达载体。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种前述表达载体的重组工程菌。

本发明提供一种从厚壳贻贝血细胞克隆到的抗菌肽myticin的cDNA基因，该基因所编码的抗菌肽成熟肽分子由40个氨基酸组成，分子量为3893.7Da。我们利用厚壳贻贝myticin的cDNA基因，设计特异性引物扩增其成熟肽区域的核苷酸序列并利用基因工程的方法将其重组到表达载体并转化酿酒酵母，获得充足的基因工程菌。对重组抗菌肽myticin的体外抗菌实验表明，myticin对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均具有显著的抑制作用。鉴于贻贝抗菌肽具有广谱的抗菌活性以及稳定的结构，因而在生物抗生素开发中具有重要意义。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种厚壳贻贝抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的myticin cDNA基因的开放阅读框核苷酸序列如下：

atgaaggcaa caatcttgtt agcggttgta gtggcagtct ttgtcgcagg tacggaagct     60

cattcgcatg cttgcgcatc gtactactgt agcaagttct gtgggactgc tagttgcaca    120

cattacttat gccgagtact tcatcccggg aaactttgcg tctgtgttaa ttgcagcagg    180

gtaaaaaatc ctttcagagc tactcaagat gctaaaagta ttaacgaatt ggattacact    240

ccactaatga agtcgatgga aaatttggac aacggaatgg atatgttata a             291。

该抗菌肽的myticin cDNA基因的开放阅读框的编码蛋白质前体包括

信号肽：MKATILLAVV VAVFVAGTEA；

成熟肽：HSHACASYYC SKFCGTASCT HYLCRVLHPG KLCVCVNCSR；以及

成熟肽后区域：VKNPFRATQD AKSINELDYT PLMKSMENLD NGMDML。

3、一种权利要求1所述的厚壳贻贝抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

cDNA基因的克隆：用TRIzol试剂盒从厚壳贻贝血细胞中提取总RNA，用MMLV反转录为cDNA的第一链；根据厚壳贻贝的myticin的氨基酸序列保守区域设计简并引物，经扩增后得到厚壳贻贝抗菌肽myticin的cDNA编码框；

序列分析和比对：获得的序列数据经lasergen软件中的Editseq模块进行分析，进行载体序列去除，序列拼接以及ORF分析后进行在线BLAST搜索。

本发明的技术内容如下：

一、厚壳贻贝抗菌肽myticin的cDNA基因克隆及序列分析

采用TRIZOLReagent提取厚壳贻贝血细胞总RNA，并以1.2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，同时测定OD260和OD280值，分析所提RNA的浓度和纯度。根据Invitrogen公司FastTrack

2.0 Kit试剂盒操作手册，通过poly(T)纤维素柱进行亲和层析，从厚壳贻贝血细胞总RNA中得poly A+mRNA。用MMLV反转录为cDNA的第一链；根据不同种类贻贝的myticin的氨基酸序列保守区域设计简并引物，经PCR扩增后得到厚壳贻贝抗菌肽myticin的cDNA成熟肽编码框；

获得的序列数据经lasergen7.0软件中的Editseq模块进行分析，进行载体序列去除，序列拼接以及ORF分析后进行在线BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)搜索。

二、重组厚壳贻贝抗菌肽myticin基因的酿酒酵母表达载体的构建及在酿酒酵母中的表达

1、表达载体的构建与鉴定

根据myticin的cDNA基因成熟肽序列(120bp)两端序列设计正反向引物。正向引物在5’端分别加入两个保护碱基CG和酶切位点TCTAGA(XbaⅠ)；其后加一个T防止ORF移位；接着加密码子AAGAGA，其编码的KR两个氨基酸，以便酵母本身分泌的前体加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，并将表达产物分泌至培养基中；反向引物在5’端分别加入三个保护碱基CCG和酶切位点AAGCTT(HindⅢ)；pVT-1和pVT-2为测序引物。经PCR扩增后，PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，之后，取2μL PCR纯化产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将PCR纯化产物和表达载体pVT102U/α用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物分别用PCR产物纯化试剂盒和小量质粒提取试剂盒纯化。之后，将两者混合并加入T4DNA连接酶进行连接反应，16℃过夜。次日取10μL连接液转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于AMP+的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆送上海美季生物公司测序鉴定，测序引物为正向引物pVT-1和反向引物pVT-2。经测序表明克隆序列正确，表达载体质粒于-70℃保存于含30％甘油的LB液体培养基中。

2、表达载体的转化以及重组酿酒酵母的发酵

利用LiAC转化法将表达质粒DNA转化到酵母感受态细胞S78中，细胞悬浮液涂YSD板，30℃培养4-6天；挑取YSD板上菌斑于YSD溶液(50mL)中扩大培养24h；最后以1∶25的比例转入1LYPD(Peptone 20g/L，Yeast extract 10g/L，Glucose 20g/L，121℃灭菌15min)溶液中，30℃，250转/min扩大培养3-4天。

3、表达产物的分离纯化

发酵液经离心及过滤后上样阳离子交换高效液相色谱(HPLC)进行第一步分离。采用半制备型Waters 600型HPLC、美国GE公司的HiprepTM16/10 CM FF预装柱进行分离。Waters 2487检测器检测，检测波长为280nm。流动相为四相洗脱系统，流速为2mL/min。洗脱液分别为A相为0.1M醋酸，B相为0.1M醋酸钠溶液，C相1M氯化钠溶液，D相为去离子水。以50分钟内D液比例从0％到50％的线性梯度洗脱。

第二步为反相HPLC分离，采用半制备型Waters 600型HPLC、分析型Vydac C18RP-HPLC反相柱(218TP54，4.6×250mm)，Waters 2487检测器检测，检测波长为280nm。流动相为含0.1％TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃。40分钟内B液比例从5％到60％线性梯度洗脱。

通过Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳检测表达产物的分子量范围。

4、重组厚壳贻贝myticin的抗菌活性检测

采用培养基倍比稀释法测定厚壳贻贝抗菌肽myticin抗菌活性。细菌用LB液体培养基培养至对数生长期(A630nm为0.001)，在96孔板每个孔加入90μL菌液。多肽预先用PBS溶解，最高浓度为1mM，然后倍比稀释，最低浓度为25μM。并将各浓度多肽溶液加入96孔板中，10μL/孔，PBS作为阴性对照。

将96孔板在振荡器上轻柔的振荡使样品和菌液充分混合，然后放入37℃培养16-24h。采用酶标仪测定每个孔的OD值以衡量多肽对于细菌生长的抑制作用。多肽的最低抑制浓度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]-[b]表示，其中[a]代表细菌继续生长的最大浓度，而[b]代表细菌完全被杀灭的最低浓度。抗真菌试验与上述基本相同，只是真菌在Sabourand液体培养基中30℃培养48h后检测。

与现有技术相比，本发明的抗菌肽及其多核苷酸序列具有下列用途：

1).作为饲料添加剂可替代传统饲料中的某些抗生素，用于海水养殖业，实现绿色养殖，减少乃至消除抗生素在水产品中的蓄积，提高水产品质量。

2).可作为新型生物抗生素，用于细菌性疾病的治疗或预防。

3).将序列<400>1或其互补的多核苷酸(包括DNA和RNA)，或其片段，进行标记后，可以通过southern印迹，northern印迹，基因芯片，微阵列技术等，用于检测动物中该抗菌肽基因或片段的存在，或检测抗菌肽基因的转录情况。

4).根据序列<400>1或其互补的多核苷酸(包括DNA和RNA)设计引物，可通过荧光定量PCR检测在动物体内各组织以及动物发育过程中，该抗菌肽基因的转录分布特异性。

附图说明

图1为厚壳贻贝myticin的cDNA基因PCR扩增图(M为DNA Marker)。

图2为重组表达质粒菌落PCR鉴定(M为DNA Marker)。

图3为重组厚壳贻贝myticin经阳离子交换层析分离后的图谱(*号标注为目的峰)。

图4为重组厚壳贻贝myticin经阳离子交换层析分离后，目的峰进一步经C18反相高效液相层析分离的图谱(*号标注为重组myticin的洗脱峰)。

图5为重组厚壳贻贝myticin经分离纯化后，tricin-SDS-PAGE电泳检测图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例一：厚壳贻贝抗菌肽myticin的cDNA基因克隆

采用TRIZOLReagent提取厚壳贻贝血细胞总RNA，并以1.2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，同时测定OD₂₆₀和OD₂₈₀值，分析所提RNA的浓度和纯度。根据Invitrogen公司FastTrack2.0Kit试剂盒操作手册，通过poly(T)纤维素柱进行亲和层析，从厚壳贻贝血细胞总RNA中得poly A⁺mRNA。用MMLV反转录为cDNA的第一链；

根据从NCBI中搜索到的地中海贻贝(M.galloprovincialis)myticin的基因序列(GenBank登录号：AF162335和AF162334)中的保守区域设计上游引物(myticin2F：5’-CAAACGTACAACATGAAGG-3’)，下游引物为载体特异性引物(T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)，以厚壳贻贝血细胞cDNA的第一链为模板进行PCR扩增，体系如下：10×Easy Taq Buffer 5μl；10mM dNTP 1μl；10μM SP6 1μl；10μMmytilinR 1μl；5U/μl DNA Polymerase 0.5μl；模板：3μl；用水补足50μl。反应条件如下：94℃预变性3min；PCR设35个循环：94℃，30s；54℃，30s；72℃，1min。最后72℃延伸7min。

PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段用胶回收试剂盒纯化后，与pMD19-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，利用引物对SP6/mytilinR进行菌落PCR鉴定后，送上海英骏生物公司测序。

测序结果经去除载体序列和引物序列后，利用Lasergene v7.1软件中的EditSeq模块进行开放阅读框(open reading frame，ORF)分析；信号肽用SignalP 3.0在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行预测；成熟肽分子量及等电点利用在线软件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)进行计算；序列在线BLAST同源检索在NCBI中进行(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；序列比对分析采用MEGA4.0软件中Clustal W模块进行。

实施例二：厚壳贻贝抗菌肽myticin的真核表达载体的构建

根据mytilin-1，2，3和myticin-3，5的cDNA基因成熟肽序列(mytilin为102bp，myticin为120bp)两端序列设计正反向引物。正向引物在5’端分别加入两个保护碱基CG和酶切位点TCTAGA(XbaⅠ)；其后加一个T防止ORF移位；接着加密码子AAGAGA，其编码的KR两个氨基酸，以便酵母本身分泌的前体加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，并将表达产物分泌至培养基中；反向引物在5’端分别加入三个保护碱基CCG和酶切位点AAGCTT(HindⅢ)；pVT-1和pVT-2为测序引物。所有引物由上海美季生物公司合成，相关引物如下：

Myticin-F    CGTCTAGATAAGAGACATTCGCATGCTTGCACA

Myticin-R    CCGAAGCTTCTTGCTGCAATTAACACA

pVT-1        GCAAGGTAGACAAGC

pVT-2          CTGCACAATATTTCAAGC

PCR扩增：50μL反应体系。94℃预变性3min；94℃变性30s；54℃退火30s；72℃延伸2min(35个循环)；72℃延伸10min。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，之后，取2μL PCR纯化产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定图谱见图1，由图1可见，目的条带的分子量约为150bp左右，与预期分子量相符。

将PCR纯化产物和表达载体pVT102U/α用XbaⅠ和HindⅢ双酶切，酶切体系如下：10×酶切缓冲液2μL，XbaⅠ1μL，HindⅢ2μL，PCR产物7.5μL，ddH₂O7.5μL，37℃过夜。酶切产物分别用PCR产物纯化试剂盒和小量质粒提取试剂盒纯化。之后，将两者混合并加入T₄DNA连接酶进行连接反应，16℃过夜。次日取10μL连接液转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于AMP+的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，图2显示了重组表达质粒菌落PCR后的电泳检测图谱，目的条带分子量约为150bp，与预期分子量相符，说明目的基因已成功的插入表达载体。阳性克隆送上海美季生物公司测序鉴定，测序引物为正向引物pVT-1和反向引物pVT-2。经测序表明克隆序列正确，表达载体质粒于-70℃保存于含30％甘油的LB液体培养基中。

实施例三：表达载体的转化以及重组酿酒酵母的发酵

利用LiAC转化法将表达质粒DNA转化到酵母感受态细胞S78中，细胞悬浮液涂YSD(YNB 6.7g/L、Glucose 20g/L、Leucine 200mg/L、Adenine 50mg/L、Inositol 200mg/L和Agar 20g/L，121℃灭菌15min)板，30℃培养4-6天；挑取YSD板上菌斑于YSD溶液(50mL)中扩大培养24h；最后以1∶25的比例转入1LYPD(Peptone 20g/L，Yeast extract 10g/L，Glucose 20g/L，121℃灭菌15min)溶液中，30℃，250转/min扩大培养3-4天。

实施例4：表达产物的分离纯化

发酵液经离心及过滤后上样阳离子交换高效液相色谱(HPLC)进行第一步分离。采用半制备型Waters 600型HPLC、美国GE公司的HiprepTM16/10 CM FF预装柱进行分离。Waters 2487检测器检测，检测波长为280nm。流动相为四相洗脱系统，流速为2mL/min。洗脱液分别为A相为0.1M醋酸，B相为0.1M醋酸钠溶液，C相1M氯化钠溶液，D相为去离子水。以50分钟内D液比例从0％到50％的线性梯度洗脱。图3展示了发酵液经阳离子交换素朴分离后的洗脱图谱，各洗脱峰经电泳检测后初步确定三号峰(*号标注)含有重组蛋白，收集该目的峰上样反相高效液相色谱法进行进一步分离纯化。

第二步为反相HPLC分离，采用半制备型Waters 600型HPLC、分析型Vydac C18RP-HPLC反相柱(218TP54，4.6×250mm)，Waters 2487检测器检测，检测波长为280nm。流动相为含0.1％TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃。40分钟内B液比例从5％到60％线性梯度洗脱。图4展示了发酵液经阳离子交换层析后的目的峰经反相高效液相色谱分离后的洗脱曲线，其中重组蛋白所在目的峰以*号标注，收集该目的峰进行Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳检测以确定其分子量范围。

通过Tris-Tricine-SDS-PAGE电泳检测表达产物的分子量范围。由图5可见，经两部层析分离后，目的峰在电泳检测中为单一条带(箭头所指条带)，其分子量约为4kDa左右，与预期分子量相符，且抑菌活性测试表明，该产物具有与天然myticin类似的抑菌活性，由此可以确认厚壳贻贝抗菌肽myticin的重组表达获得成功，表达出来的重组myticin与天然myticin相比具有一致的一级结构和抑菌功能。

实施例五：重组厚壳贻贝myticin的抗菌活性检测

采用培养基倍比稀释法测定厚壳贻贝抗菌肽myticin抗菌活性。细菌用LB液体培养基培养至对数生长期(A_630nm为0.001)，在96孔板每个孔加入90μL菌液。多肽预先用PBS溶解，最高浓度为500μM，然后倍比稀释，最低浓度为1.25μM。并将各浓度多肽溶液加入96孔板中，10μL/孔，PBS作为阴性对照。

将96孔板在振荡器上轻柔的振荡使样品和菌液充分混合，然后放入37℃培养16-24h。采用酶标仪测定每个孔的OD值以衡量多肽对于细菌生长的抑制作用。多肽的最低抑制浓度(Minimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]-[b]表示，其中[a]代表细菌继续生长的最大浓度，而[b]代表细菌完全被杀灭的最低浓度。抗真菌试验与上述基本相同，只是真菌在Sabourand液体培养基中30℃培养48h后检测。

重组myticin的抗菌活性如下表所示：

菌种名称                             myticin(μM)

革兰氏阴性菌

大肠杆菌Escherichia coli             12-25

副溶血弧菌Vibrio Parahaemolyticus    12-25

绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa       12-25

普通变形杆菌Proteus vulgaris         25-50

哈维氏弧菌Vibrio.harveyi             25-50

溶藻弧菌Vibrio alginolyticus         25-50

革兰氏阳性菌

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis        2.5-5.0

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus  2.5-5.0

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis 6.5-12.5

藤黄叠球菌Sarcina luteus             12-25

巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium      6.5-12.5

真菌

白假丝酵母Candida albicans           25-50

白色念珠菌Monilia albican            25-50

Claims (7)

1.一种厚壳贻贝抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的myticin cDNA基因的开放阅读框核苷酸序列如下：

atgaaggcaa caatcttgtt agcggttgta gtggcagtct ttgtcgcagg tacggaagct     60

cattcgcatg cttgcgcatc gtactactgt agcaagttct gtgggactgc tagttgcaca    120

cattacttat gccgagtact tcatcccggg aaactttgcg tctgtgttaa ttgcagcagg    180

gtaaaaaatc ctttcagagc tactcaagat gctaaaagta ttaacgaatt ggattacact    240

ccactaatga agtcgatgga aaatttggac aacggaatgg atatgttata a             291。

2.根据权利要求1所述的厚壳贻贝抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的myticin cDNA基因的开放阅读框的编码蛋白质前体包括

信号肽：MKATILLAVV VAVFVAGTEA；

成熟肽：HSHACASYYC SKFCGTASCT HYLCRVLHPG KLCVCVNCSR；以及

成熟肽后区域：VKNPFRATQD AKSINELDYT PLMKSMENLD NGMDML。

3.一种权利要求1所述的厚壳贻贝抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

cDNA基因的克隆：用TRIzol试剂盒从厚壳贻贝血细胞中提取总RNA，用MMLV反转录为cDNA的第一链；根据厚壳贻贝的myticin的氨基酸序列保守区域设计简并引物，经扩增后得到厚壳贻贝抗菌肽myticin的cDNA编码框；

序列分析和比对：获得的序列数据经lasergen软件中的Editseq模块进行分析，进行载体序列去除，序列拼接以及ORF分析后进行在线BLAST搜索。

4.一种表达载体，其特征在于它含有权利要求1所述的核苷酸。

5.一种重组工程菌，其特征在于它含有权利要求3所述的表达载体。

6.根据权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于它的表达载体转化酿酒酵母得到的。

7.权利要求1所述的厚壳贻贝抗菌肽在制备抗生素中的应用。

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