CN111606988A - 翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽的信号肽、抗菌肽的编码基因及应用 - Google Patents

翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽的信号肽、抗菌肽的编码基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽Pernalins的信号肽、抗菌肽Pernalins的编码基因及应用，所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins选自Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D中的一种或几种；所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。翡翠贻贝在感染副溶血弧菌后，血淋巴细胞中的抗菌肽Pernalins能够响应免疫防御，长时间、持续的起到免疫防御作用，维持机体免疫反应。

Description

翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽的信号肽、抗菌肽的编码 基因及应用
技术领域
本发明涉及无脊椎动物基因工程技术领域，尤其涉及翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽的信号肽、抗菌肽的编码基因及应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是天然免疫系统的重要组成部分，普遍存在所有多细胞生物中，在免疫防御中起着极其重要的作用，可直接杀死病原体，亦可以作为免疫效应分子来调节宿主免疫防御系统。其还具有抗菌广谱性、高效性、快速杀菌能力、不易产生耐药性菌株等特性，因此成为国内外的研究热点。
1972年，瑞典科学家Boman首次在果蝇中发现抗菌肽，其后Steiner等真正第一次分离得到一种命名为天蚕素(Cecropins)的抗菌肽。在海洋动物是在1988年首次发现抗菌肽的，Takao等首次在鲎(Tachypleus tridentatus)中发现鲎素(tachyplesin)；相建海等也从对虾中克隆得到抗菌肽基因序列，分析对虾的抗菌肽富含脯氨酸和甘氨酸；鱼类中最早获得的抗菌肽是一种具有两亲性阳离子α螺旋结构的穿膜多肽—Pardaxin，由豹鳎(Pardachiruspavoninus)体表黏液中首先分离得到。目前对于翡翠贻贝中抗菌肽研究内容甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，所述Pernalins在面对微生物感染，长时间、持续起着免疫防御作用，能够维持机体免疫反应。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins选自Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D中的一种或几种；所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。
优选的，所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：13～SEQ ID NO：16所示。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的信号肽，所述PernalinA、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5～SEQID NO：8所示。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的编码基因，所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的编码基因的核苷酸序列分别如SEQID NO：9～SEQ ID NO：12所示。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者所述信号肽或者所述编码基因在制备激活免疫防御反应的制剂中的应用。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者所述信号肽或者所述编码基因在翡翠贻贝养殖中的应用。
优选的，所述应用包括防御和/或消除翡翠贻贝养殖中的微生物感染。
优选的，所述微生物包括副溶血弧菌。
本发明的有益效果：本发明提供了翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，所述Pernalins选自Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D中的一种或几种；所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。翡翠贻贝在感染副溶血弧菌后，血淋巴细胞中的抗菌肽Pernalins能够响应免疫防御，长时间、持续的起到免疫防御作用，维持机体免疫反应。在翡翠贻贝感染副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)后，Pernalins基因在短时间内(3h内)就有显著的变化，说明Pernalins对副溶血弧菌的感染具有灵敏性高、反应时间快的特点，使其在后续对降低水产养殖中微生物数量，优化水产生长环境具有广阔的应用范围和前景。
附图说明
图1-A为Pernalin A基因组图谱；
图1-B为Pernalin B基因组图谱；
图1-C为Pernalin B基因组图谱；
图1-D为Pernalin D基因组图谱；
图2-A为Pernalin A蛋白质三级结构图；
图2-B为Pernalin B蛋白质三级结构图；
图2-C为Pernalin C蛋白质三级结构图；
图2-D为Pernalin D蛋白质三级结构图；
图3-A为Pernalin A表达水平变化；
图3-B为Pernalin B表达水平变化；
图3-C为Pernalin C表达水平变化；
图3-D为Pernalin D表达水平变化；
图4-A为血淋巴细胞中各个Pernalins的表达情况；
图4-B为足部中各个Pernalins的表达情况；
图4-C为肝胰腺中中各个Pernalins的表达情况；
图4-D为厚壁壳肌中各个Pernalins的表达情况；
图4-E为腮部中各个Pernalins的表达情况；
图4-F为外套膜中各个Pernalins的表达情况；
图5中的A为副溶血弧菌胁迫后，Pernalin A在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；
图5中的B为副溶血弧菌胁迫后，Pernalin B在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；
图5中的C为副溶血弧菌胁迫后，Pernalin C在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；
图5中的D为副溶血弧菌胁迫后，Pernalin D在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化。
具体实施方式
本发明提供了翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins选自Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D中的一种或几种；所述Pernalin A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：MKTAVLLLLVMVPCFSVRGADASCARCKDHCRNKGCGFYMCVLRYGTYYCCCFKCSRDSFFNIGQVDQSLIEDVLEMPKDDDDLRMNK；所述Pernalin B的氨基酸序列如SEQID NO：2所示，具体为：MKTSVLLLAVLVAFFAVSDAQTACDRCKAYCTIKGCGYYLCVHRFPSYYCCCFKCAAD；所述Pernalin C的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：MKAVFSLVVVVVVILGVAEVNASCATSCSTRCYNKGCKYYAAAIRSGTCYCCCFKCGSDSFFNIGHVNEMTPREDFNEDTLMEIQNHKN；所述Pernalin D的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：MKTASLSVILVVVIFAVAEIYADCDSNCNHRCYYRGCKAYASALNNGTCYCCCVDCGSDSFFKIGHVNENTHRQQFTDELLMEIKNYRR。
本发明中，Pernalin A是由88个氨基酸组成，N-末端由22个氨基酸构成信号肽，分子量为7.10kDa；Pernalin B是由58个氨基酸组成，N-末端由20个氨基酸构成信号肽，分子量为6.44kDa；Pernalin C是由89个氨基酸组成，N-末端由22个氨基酸构成信号肽，分子量为9.81kDa；Pernalin D是由89个氨基酸组成，N-末端由22个氨基酸构成信号肽，分子量为10.11kDa。
Pernalins基因组图谱及蛋白质三级结构图参见图1-A～图1-D，其中图1-A为Pernalin A基因组图谱；图1-B为Pernalin B基因组图谱；图1-C为Pernalin B基因组图谱；图1-D为Pernalin D基因组图谱；图2-A为Pernalin A蛋白质三级结构图；图2-B为PernalinB蛋白质三级结构图；图2-C为Pernalin C蛋白质三级结构图；图2-D为Pernalin D蛋白质三级结构图。
本发明中，所述Pernalin A的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，具体为：SCARCKDHCRNKGCGFYMCVLRYGTYYCCCFKC；所述Pernalin B的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体为：ACDRCKAYCTIKGCGYYLCVHRFPSYYCCCFKC；所述Pernalin C的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，具体为：SCATSCSTRCYNKGCKYYAAAIRSGTCYCCCFKC；所述Pernalin D的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列如SEQ IDNO：16所示，具体为：DCDSNCNHRCYYRGCKAYASALNNGTCYCCCVDC。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的信号肽，所述PernalinA的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：MKTAVLLLLVMVPCFSVRGADA；所述Pernalin B的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：MKTSVLLLAVLVAFFAVSDA；所述Pernalin C的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：MKAVFSLVVVVVVILGVAEVNA；所述Pernalin D的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，具体为：MKTASLSVILVVVIFAVAEIYA。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的编码基因(抗菌肽Pernalins基因的ORF序列)，所述Pernalin A的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：ATGAAGACTGCAGTTCTTCTTCTTCTTGTCATGGTACCATGTTTTTCGGTGAGGGGTGCTGACGCCAGCTGTGCCCGATGTAAAGATCACTGTAGAAACAAGGGGTGTGGTTTTTATATGTGCGTCCTTAGATACGGTACATATTACTGTTGTTGTTTTAAGTGTTCTAGAGATTCCTTCTTTAACATTGGACAAGTTGACCAATCACTGATCGAGGACGTGCTTGAAATGCCGAAAGATGACGACGATTTGAGAATGAACAAGTAA；所述Pernalin B的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：ATGAAGACTTCAGTCCTCTTACTCGCTGTTTTGGTTGCTTTTTTCGCAGTGAGCGATGCTCAGACCGCCTGTGATCGGTGTAAAGCCTACTGTACTATTAAAGGATGTGGCTACTACTTGTGTGTCCACCGTTTCCCTTCCTATTACTGTTGCTGCTTCAAGTGTGCCGCAGAC；所述Pernalin C的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，具体为：ATGAAAGCTGTTTTTTCTCTTGTCGTCGTCGTCGTCGTTATTCTTGGAGTGGCTGAGGTCAATGCTAGCTGTGCAACCTCGTGCTCCACTAGATGTTATAACAAAGGCTGCAAATACTATGCAGCTGCCATTAGAAGTGGAACCTGCTATTGCTGTTGTTTCAAGTGCGGATCTGACAGCTTCTTCAACATCGGTCATGTCAATGAGATGACCCCAAGGGAGGATTTCAATGAAGATACGTTGATGGAAATCCAAAATCACAAAAACTAA；所述Pernalin D的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，具体为：ATGAAGACTGCTTCCCTTTCAGTAATTCTCGTTGTAGTAATTTTTGCAGTTGCAGAAATTTACGCTGACTGCGATAGCAACTGCAACCACAGGTGTTACTATAGAGGATGTAAAGCTTATGCCTCTGCACTCAACAATGGAACTTGCTATTGTTGTTGTGTCGATTGTGGTTCTGACAGCTTCTTCAAAATTGGTCACGTAAATGAGAATACTCACAGACAGCAATTTACTGATGAATTGTTGATGGAAATAAAGAATTACAGACGCTAG。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者所述信号肽或者所述编码基因在制备激活免疫防御反应的制剂中的应用。
翡翠贻贝在感染副溶血弧菌后，血淋巴细胞中的抗菌肽Pernalins能够响应免疫防御，长时间、持续的起到免疫防御作用，维持机体免疫反应。
本发明提供了上述方案所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者所述信号肽或者所述编码基因在翡翠贻贝养殖中的应用；所述应用优选的包括防御和/或消除翡翠贻贝养殖中的微生物感染；所述微生物优选的包括革兰氏阴性菌；所述革兰氏阴性菌优选的包括副溶血弧菌。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所涉及的翡翠贻贝Perna virids(由深圳大鹏海域中采集)。
本发明所涉及的菌种：副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)CGMCC NO1.1997(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)(http://www.cgmcc.net/index.html)。
实施例1检验抗菌肽Pernalins在不同组织中的表达水平差异
1)采集翡翠贻贝与养殖：采集位于深圳大鹏海域(22°34′11″N 114°31′50″E)养殖箱的翡翠贻贝至实验室中养殖，在培养温度为23℃的海水中养殖，使用氧气泵进行加氧。
2)翡翠贻贝组织取样：翡翠贻贝每5只为一组，分成4组进行取样。采集6个部位组织：足部、血淋巴细胞、肝胰腺、厚壁壳肌、鳃、外套膜，收集后马上置于液氮中冷冻，保存在-80℃进行后续实验。
3)总RNA提取：采取TRIzol试剂提取翡翠贻贝的总RNA，吸取不超过5×106个细胞，8000×g，4℃离心2min，去上清；加入适量的TRIzol，充分重悬后，室温静置5min后，12000×g，4℃离心5min，收集上清转移至新的离心管中；加入适量氯仿，振荡充分混匀，室温静置5min后，12000×g，4℃离心15min，收集水相转移至新的离心管中；加入适量异丙醇，充分混匀，室温静置10min后，12000×g，4℃离心10min；弃尽上清，加入与TRIzol等量的75％乙醇清洗沉淀，7500×g，4℃离心5min；弃尽上清，室温干燥后，用适量的RNase-free water溶解RNA，即为翡翠贻贝的总RNA，存储于-80℃冰箱。
4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证表达水平变化：
根据翡翠贻贝Pernalins抗菌肽序列设计特异性引物，从翡翠贻贝血淋巴细胞cDNA中克隆获得抗菌肽序列，引物序列如表1，总RNA采用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Takara,Japan)试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：37℃进行15min；85℃进行5sec，获得翡翠贻贝的cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：98℃，2min；98℃，10sec，60℃，10sec，68℃，30sec，共40个循环；溶解曲线程序：95℃，15sec，60℃，1min，升温速度按0.3℃至99℃，15sec；4℃终止反应。
表1 Pernalins克隆引物序列
Figure BDA0002527155470000061
Figure BDA0002527155470000071
结果参见图3-A～图3-D，其中图3-A为Pernalins A表达水平变化；图3-B为Pernalins B表达水平变化；图3-C为Pernalins C表达水平变化；图3-D为Pernalins D表达水平变化；结果表明，翡翠贻贝中抗菌肽Pernalins在血淋巴细胞中的表达量最高，说明免疫因子主要存在于血淋巴细胞中，符合体液免疫作为贻贝的免疫系统中主要组成，依靠血淋巴细胞进行免疫防御。表达量次之为外套膜和肝胰腺。由于贻贝的生活习性，外套膜是与外界有直接接触的主要组织，是免疫防御的第一道防线。。
检验抗菌肽Pernalins在不同组织中的表达水平差异
抗菌肽Pernalins在不同组织中的表达水平结果参见图4-A～图4-F，其中图4-A为血淋巴细胞中各个Pernalins的表达情况；图4-B为足部中各个Pernalins的表达情况；图4-C为肝胰腺中各个Pernalins的表达情况；图4-D为厚壁壳肌中各个Pernalins的表达情况；图4-E为腮部中各个Pernalins的表达情况；图4-F为外套膜中各个Pernalins的表达情况；比较不同组织中Pernalins表达量差异，发现组织中Pernalin C的表达水平最高，PernalinB、D表达量较少，其中Pernalin A的表达量最低，说明在本发明中发现的翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，Pernalin C在翡翠贻贝防御外界病原体起主要作用，Pernalin A的表达需要外界病原体感染后表达量才会有变化。
实施例2翡翠贻贝感染副溶血弧菌后，抗菌肽Pernalins的表达水平变化
1)采集翡翠贻贝与养殖：采集位于深圳大鹏海域(22°34′11″N 114°31′50″E)养殖箱的翡翠贻贝至实验室中养殖，在培养温度为23℃的海水中养殖，使用氧气泵进行加氧。
2)培养副溶血弧菌：首先在3％LB中培养副溶血弧菌至对数生长期，进行二次活化，生长至对数生长期阶段时，用磷酸缓冲液(PBS，124mM Na2HPO4，76mM NaH2PO4；pH 7.0)洗三次，调整微生物浓度为1×107cfu/mL，进行后续实验。
3)设置对照组及实验组：翡翠贻贝每5只为一组，设置4组，1组对照组和3组实验组。对照组：注射100μl PBS至翡翠贻贝；实验组：注射100μl(细菌数为106cfu)未灭活副溶血弧菌至翡翠贻贝。注射后翡翠贻贝放回海水(23℃)中养殖，分别抽取3h，6h，12h，24h和48h时间点的血淋巴细胞，离心收集后马上置于液氮中冷冻，在-80℃保存。
4)总RNA提取：采取TRIzol试剂提取翡翠贻贝的总RNA，吸取不超过5×106cells，8000×g，4℃离心2min，去上清；加入适量的TRIzol，充分重悬后，室温静置5min后，12000×g，4℃离心5min，收集上清转移至新的离心管中；加入适量氯仿，振荡充分混匀，室温静置5min后，12000×g，4℃离心15min，收集水相转移至新的离心管中；加入适量异丙醇，充分混匀，室温静置10min后，12000×g，4℃离心10min；弃尽上清，加入与TRIzol等量的75％乙醇清洗沉淀，7500×g，4℃离心5min；弃尽上清，室温干燥后，用适量的RNase-free water溶解RNA，即为翡翠贻贝的总RNA，存储于-80℃冰箱。
5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证表达水平变化：
根据翡翠贻贝Pernalins抗菌肽序列设计特异性引物，引物序列如表1，总RNA采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser(Takara,Japan)试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：37℃进行15min；85℃进行5sec，获得翡翠贻贝cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：98℃，2min；98℃，10sec，60℃，10sec，68℃，30sec，共40个循环；溶解曲线程序：95℃，15sec，60℃，1min，升温速度按0.3℃至99℃，15sec；4℃终止反应。
副溶血弧菌胁迫翡翠贻贝实验结果参见图5-A～图5-D，其中图5中的A为PernalinA在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；图5中的B为Pernalin B在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；图5中的C为Pernalin C在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；图5中的D为Pernalin D在血淋巴细胞中不同时间点的表达变化；结果表明，翡翠贻贝在感染副溶血弧菌后，血淋巴细胞中的抗菌肽Pernalins响应了免疫防御，Pernalins表达量发生显著变化，表达水平显著下降，在3h内均已发生显著的变化，说明翡翠贻贝在防御外界病原体侵染时，Pernalins发挥着主要的作用，血淋巴细胞快速转移至感染严重部位。短时间内(3h时)，Pernalin B变化幅度是最快，表达水平下降了76％，说明血淋巴细胞已快速转移至感染部位。而Pernalin D表达量变化幅度最大，在6h时，表达水平大幅度降至7.8％以下，24h时已无法检测。随着感染时间推移，血淋巴细胞中的Pernalins表达量逐步下降，在24h后，Pernalins的表达水平均已降至15.4％以下，Pernalin D甚至已接近不表达，直至48h时，Pernalins的表达水平均近为零。说明Pernalins在面对微生物感染，长时间、持续起着免疫防御作用，维持机体免疫反应。
实施例3翡翠贻贝cDNA的获得方法包括如下步骤：
①抽取翡翠贻贝血淋巴细胞后，采用TRIzol试剂提取血淋巴细胞的总RNA，通过反转录获得cDNA；
②根据Pernalins的ORF序列设计特异性引物，以翡翠贻贝血淋巴细胞的cDNA为模板，PCR克隆获得抗菌肽ORF序列，引物序列如表1，获得Pernalins相一致大小的特异性DNA片段，经测序得到267bp的抗菌肽Pernalin A基因、174bp的抗菌肽Pernalin B基因、270bp的抗菌肽Pernalin C基因、270bp的抗菌肽Pernalin D基因。在NCBI网站上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因。翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的氨基酸序列为：
Pernalin A的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：MKTAVLLLLVMVPCFSVRGADASCARCKDHCRNKGCGFYMCVLRYGTYYCCCFKCSRDSFFNIGQVDQSLIEDVLEMPKDDDDLRMNK，共88个氨基酸，分子量为7.10kDa；
Pernalin B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：MKTSVLLLAVLVAFFAVSDAQTACDRCKAYCTIKGCGYYLCVHRFPSYYCCCFKCAAD，共58个氨基酸，分子量为6.44kDa；
Pernalin C的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：MKAVFSLVVVVVVILGVAEVNASCATSCSTRCYNKGCKYYAAAIRSGTCYCCCFKCGSDSFFNIGHVNEMTPREDFNEDTLMEIQNHKN，共89个氨基酸，分子量为9.81kDa；
Pernalin D的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：MKTASLSVILVVVIFAVAEIYADCDSNCNHRCYYRGCKAYASALNNGTCYCCCVDCGSDSFFKIGHVNENTHRQQFTDELLMEIKNYRR，共89个氨基酸，分子量为10.11kDa；
通过与Mytilin B进行氨基酸同源性及空间结构分析，发现翡翠贻贝抗菌肽Pernalins中有一段肽段与Mytilin B抑菌活性中心同源性及空间构象相似性高；PernalinA的抑菌活性中心肽段氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，具体为：SCARCKDHCRNKGCGFYMCVLRYGTYYCCCFKC；Pernalin B的抑菌活性中心肽段氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体为：ACDRCKAYCTIKGCGYYLCVHRFPSYYCCCFKC；Pernalin C的抑菌活性中心肽段氨基酸序列如SEQID NO：15所示，具体为：SCATSCSTRCYNKGCKYYAAAIRSGTCYCCCFKC；Pernalin D的抑菌活性中心肽段氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，具体为：DCDSNCNHRCYYRGCKAYASALNNGTCYCCCVDC。
实施例4本发明的翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的制备方法
1)翡翠贻贝血淋巴细胞的收集和总RNA提取：
血淋巴细胞的收集：使用注射器从翡翠贻贝的厚壁壳肌肉中抽取1000μL血淋巴液，8000×g，4℃离心2min，即可用于后续的总RNA提取；
总RNA的提取：采取TRIzol试剂提取翡翠贻贝的总RNA，吸取不超过5×106cells，8000×g，4℃离心2min，去上清；加入适量的TRIzol，充分重悬后，室温静置5min后，12000×g，4℃离心5min，收集上清转移至新的离心管中；加入适量氯仿，振荡充分混匀，室温静置5min后，12000×g，4℃离心15min，收集水相转移至新的离心管中；加入适量异丙醇，充分混匀，室温静置10min后，12000×g，4℃离心10min；弃尽上清，加入与TRIzol等量的75％乙醇清洗沉淀，7500×g，4℃离心5min；弃尽上清，室温干燥后，用适量的RNase-free water溶解RNA，即为翡翠贻贝的总RNA，存储于-80℃冰箱。
2)抗菌肽ORF序列的克隆：
根据翡翠贻贝Pernalins抗菌肽序列设计特异性引物，从翡翠贻贝血淋巴细胞cDNA中克隆获得抗菌肽序列，引物序列如表1，采用TRIzol提取翡翠贻贝的血淋巴细胞总RNA，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,Japan)试剂盒进行反转录获得cDNA，反转录程序为：37℃进行15min；85℃进行5sec，获得翡翠贻贝cDNA。以该cDNA为模板，采用上下游引物进行扩增，PCR程序为：95℃，5min；95℃，30sec，50℃，30sec，72℃，10sec，共40个循环；72℃，10min；4℃终止反应，然后进行2％琼脂糖凝胶电泳，获得与Pernalins基因大小相符的特异性DNA片段，用干净刀片切取对应大小的目的片段，采用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段，克隆到pMD18-T vector上，送艾基生物公司进行测序，经测序得到267bp的抗菌肽Pernalin A基因、174bp的抗菌肽Pernalin B基因、270bp的抗菌肽Pernalin C基因、270bp的抗菌肽Pernalin D基因，在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上通过blast比对证实得到的基因片段为新的基因。
为了验证翡翠贻贝感染副溶血弧菌(革兰氏阴性菌)后，抗菌肽Pernalins基因对其产生的免疫反应，注射未灭活副溶血弧菌至翡翠贻贝中，利用qRT-PCR技术检测Pernalins基因在不同时间点表达水平变化。
3)序列的分析与抗菌肽序列的确定：
同源性比对和相似性搜索用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)BLAST在线软件进行，多序列比较用MultAlin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)在线软件进行比对，结果显示翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的ORF序列长度分别为：
Pernalin A共有267nt，翡翠贻贝抗菌肽Pernalin A的ORF序列(下划线部分为信号肽，灰色部分为活性序列)：
ATGAAGACTGCAGTTCTTCTTCTTCTTGTCATGGTACCATGTTTTTCGGTGAGGGGTGCT
M K T A V L L L L V M V P C F S V R G A
GACGCCAGCTGTGCCCGATGTAAAGATCACTGTAGAAACAAGGGGTGTGGTTTTTATATG
Figure BDA0002527155470000111
TGCGTCCTTAGATACGGTACATATTACTGTTGTTGTTTTAAGTGTTCTAGAGATTCCTTC
Figure BDA0002527155470000112
TTTAACATTGGACAAGTTGACCAATCACTGATCGAGGACGTGCTTGAAATGCCGAAAGAT
F N I G Q V D Q S L I E D V L E M P K D
GACGACGATTTGAGAATGAACAAGTAA
D D D L R M N K-
Pernalin B共有174nt，翡翠贻贝抗菌肽Pernalin B的ORF序列(下划线部分为信号肽，灰色部分为活性序列)：
ATGAAGACTTCAGTCCTCTTACTCGCTGTTTTGGTTGCTTTTTTCGCAGTGAGCGATGCT
M K T S V L L L A V L V A F F A V S D A
CAGACCGCCTGTGATCGGTGTAAAGCCTACTGTACTATTAAAGGATGTGGCTACTACTTG
Figure BDA0002527155470000113
TGTGTCCACCGTTTCCCTTCCTATTACTGTTGCTGCTTCAAGTGTGCCGCAGAC
Figure BDA0002527155470000114
Pernalin C共有270nt，翡翠贻贝抗菌肽Pernalin C的ORF序列(下划线部分为信号肽，灰色部分为活性序列)：
ATGAAAGCTGTTTTTTCTCTTGTCGTCGTCGTCGTCGTTATTCTTGGAGTGGCTGAGGTC
M K A V F S L V V V V V V I L G V AE V
AATGCTAGCTGTGCAACCTCGTGCTCCACTAGATGTTATAACAAAGGCTGCAAATACTAT
Figure BDA0002527155470000115
GCAGCTGCCATTAGAAGTGGAACCTGCTATTGCTGTTGTTTCAAGTGCGGATCTGACAGC
Figure BDA0002527155470000121
TTCTTCAACATCGGTCATGTCAATGAGATGACCCCAAGGGAGGATTTCAATGAAGATACG
F F N I G H V N E M T P R E D F N E D T
TTGATGGAAATCCAAAATCACAAAAACTAA
L M E I Q N H K N-
Pernalin D共有270nt，翡翠贻贝抗菌肽Pernalin D的ORF序列(下划线部分为信号肽，灰色部分为活性序列)：
ATGAAGACTGCTTCCCTTTCAGTAATTCTCGTTGTAGTAATTTTTGCAGTTGCAGAAATT
M K T A S L S V I L V V V I F A V A E I
TACGCTGACTGCGATAGCAACTGCAACCACAGGTGTTACTATAGAGGATGTAAAGCTTAT
Figure BDA0002527155470000122
GCCTCTGCACTCAACAATGGAACTTGCTATTGTTGTTGTGTCGATTGTGGTTCTGACAGC
Figure BDA0002527155470000123
TTCTTCAAAATTGGTCACGTAAATGAGAATACTCACAGACAGCAATTTACTGATGAATTG
F F K I G H V N E N T H R Q Q F T D E L
TTGATGGAAATAAAGAATTACAGACGCTAG
L M E I K N Y R R-
信号肽预测用SignalP 4.1:http://www.cbs.dtu.dk/aervices/SignalP/在线查找，分析结果如下：
翡翠贻贝抗菌肽PernalinA的氨基酸序列为：MKTAVLLLLVMVPCFSVRGADASCARCKDHCRNKGCGFYMCVLRYGTYYCCCFKCSRDSFFNIGQVDQSLIEDVLEMPKDDDDLRMNK，共88个氨基酸，分子量为7.10kDa，其中它的信号肽为MKTAVLLLLVMVPCFSVRGADA，共22个氨基酸；
Pernalin B的氨基酸序列为：MKTSVLLLAVLVAFFAVSDAQTACDRCKAYCTIKGCGYYLCVHRFPSYYCCCFKCAAD，共58个氨基酸，分子量为6.44kDa，其中它的信号肽为MKTSVLLLAVLVAFFAVSDA，共20个氨基酸；
Pernalin C的氨基酸序列为：MKAVFSLVVVVVVILGVAEVNASCATSCSTRCYNKGCKYYAAAIRSGTCYCCCFKCGSDSFFNIGHVNEMTPREDFNEDTLMEIQNHKN，共89个氨基酸，分子量为9.81kDa，其中它的信号肽为MKAVFSLVVVVVVILGVAEVNA，共22个氨基酸；
Pernalin D的氨基酸序列为：MKTASLSVILVVVIFAVAEIYADCDSNCNHRCYYRGCKAYASALNNGTCYCCCVDCGSDSFFKIGHVNENTHRQQFTDELLMEIKNYRR，共89个氨基酸，分子量为10.11kDa，其中它的信号肽为MKTASLSVILVVVIFAVAEIYA，共22个氨基酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 翡翠贻贝抗菌肽Pernalins、抗菌肽的信号肽、抗菌肽的编码基因及应用
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Lys Thr Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Met Val Pro Cys Phe Ser
1 5 10 15
Val Arg Gly Ala Asp Ala Ser Cys Ala Arg Cys Lys Asp His Cys Arg
20 25 30
Asn Lys Gly Cys Gly Phe Tyr Met Cys Val Leu Arg Tyr Gly Thr Tyr
35 40 45
Tyr Cys Cys Cys Phe Lys Cys Ser Arg Asp Ser Phe Phe Asn Ile Gly
50 55 60
Gln Val Asp Gln Ser Leu Ile Glu Asp Val Leu Glu Met Pro Lys Asp
65 70 75 80
Asp Asp Asp Leu Arg Met Asn Lys
85
<210> 2
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Thr Ser Val Leu Leu Leu Ala Val Leu Val Ala Phe Phe Ala
1 5 10 15
Val Ser Asp Ala Gln Thr Ala Cys Asp Arg Cys Lys Ala Tyr Cys Thr
20 25 30
Ile Lys Gly Cys Gly Tyr Tyr Leu Cys Val His Arg Phe Pro Ser Tyr
35 40 45
Tyr Cys Cys Cys Phe Lys Cys Ala Ala Asp
50 55
<210> 3
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Ala Val Phe Ser Leu Val Val Val Val Val Val Ile Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Glu Val Asn Ala Ser Cys Ala Thr Ser Cys Ser Thr Arg Cys
20 25 30
Tyr Asn Lys Gly Cys Lys Tyr Tyr Ala Ala Ala Ile Arg Ser Gly Thr
35 40 45
Cys Tyr Cys Cys Cys Phe Lys Cys Gly Ser Asp Ser Phe Phe Asn Ile
50 55 60
Gly His Val Asn Glu Met Thr Pro Arg Glu Asp Phe Asn Glu Asp Thr
65 70 75 80
Leu Met Glu Ile Gln Asn His Lys Asn
85
<210> 4
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Thr Ala Ser Leu Ser Val Ile Leu Val Val Val Ile Phe Ala
1 5 10 15
Val Ala Glu Ile Tyr Ala Asp Cys Asp Ser Asn Cys Asn His Arg Cys
20 25 30
Tyr Tyr Arg Gly Cys Lys Ala Tyr Ala Ser Ala Leu Asn Asn Gly Thr
35 40 45
Cys Tyr Cys Cys Cys Val Asp Cys Gly Ser Asp Ser Phe Phe Lys Ile
50 55 60
Gly His Val Asn Glu Asn Thr His Arg Gln Gln Phe Thr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Met Glu Ile Lys Asn Tyr Arg Arg
85
<210> 5
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Thr Ala Val Leu Leu Leu Leu Val Met Val Pro Cys Phe Ser
1 5 10 15
Val Arg Gly Ala Asp Ala
20
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Lys Thr Ser Val Leu Leu Leu Ala Val Leu Val Ala Phe Phe Ala
1 5 10 15
Val Ser Asp Ala
20
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Lys Ala Val Phe Ser Leu Val Val Val Val Val Val Ile Leu Gly
1 5 10 15
Val Ala Glu Val Asn Ala
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Lys Thr Ala Ser Leu Ser Val Ile Leu Val Val Val Ile Phe Ala
1 5 10 15
Val Ala Glu Ile Tyr Ala
20
<210> 9
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaagactg cagttcttct tcttcttgtc atggtaccat gtttttcggt gaggggtgct 60
gacgccagct gtgcccgatg taaagatcac tgtagaaaca aggggtgtgg tttttatatg 120
tgcgtcctta gatacggtac atattactgt tgttgtttta agtgttctag agattccttc 180
tttaacattg gacaagttga ccaatcactg atcgaggacg tgcttgaaat gccgaaagat 240
gacgacgatt tgagaatgaa caagtaa 267
<210> 10
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgaagactt cagtcctctt actcgctgtt ttggttgctt ttttcgcagt gagcgatgct 60
cagaccgcct gtgatcggtg taaagcctac tgtactatta aaggatgtgg ctactacttg 120
tgtgtccacc gtttcccttc ctattactgt tgctgcttca agtgtgccgc agac 174
<210> 11
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaaagctg ttttttctct tgtcgtcgtc gtcgtcgtta ttcttggagt ggctgaggtc 60
aatgctagct gtgcaacctc gtgctccact agatgttata acaaaggctg caaatactat 120
gcagctgcca ttagaagtgg aacctgctat tgctgttgtt tcaagtgcgg atctgacagc 180
ttcttcaaca tcggtcatgt caatgagatg accccaaggg aggatttcaa tgaagatacg 240
ttgatggaaa tccaaaatca caaaaactaa 270
<210> 12
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgaagactg cttccctttc agtaattctc gttgtagtaa tttttgcagt tgcagaaatt 60
tacgctgact gcgatagcaa ctgcaaccac aggtgttact atagaggatg taaagcttat 120
gcctctgcac tcaacaatgg aacttgctat tgttgttgtg tcgattgtgg ttctgacagc 180
ttcttcaaaa ttggtcacgt aaatgagaat actcacagac agcaatttac tgatgaattg 240
ttgatggaaa taaagaatta cagacgctag 270
<210> 13
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ser Cys Ala Arg Cys Lys Asp His Cys Arg Asn Lys Gly Cys Gly Phe
1 5 10 15
Tyr Met Cys Val Leu Arg Tyr Gly Thr Tyr Tyr Cys Cys Cys Phe Lys
20 25 30
Cys
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Cys Asp Arg Cys Lys Ala Tyr Cys Thr Ile Lys Gly Cys Gly Tyr
1 5 10 15
Tyr Leu Cys Val His Arg Phe Pro Ser Tyr Tyr Cys Cys Cys Phe Lys
20 25 30
Cys
<210> 15
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Ser Cys Ala Thr Ser Cys Ser Thr Arg Cys Tyr Asn Lys Gly Cys Lys
1 5 10 15
Tyr Tyr Ala Ala Ala Ile Arg Ser Gly Thr Cys Tyr Cys Cys Cys Phe
20 25 30
Lys Cys
<210> 16
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Asp Cys Asp Ser Asn Cys Asn His Arg Cys Tyr Tyr Arg Gly Cys Lys
1 5 10 15
Ala Tyr Ala Ser Ala Leu Asn Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Cys Cys Val
20 25 30
Asp Cys
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgaagactg cagttcttct tc 22
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttacttgttc attctcaaat cgtc 24
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agatttatga aaccgttgct ggctt 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
attgtacaaa gcaaaatgaa gactg 25
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atgaaagctg ttttttctct tg 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttagtttttg tgattttgga tttc 24
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atgaagactt cagtcctctt act 23
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctagttgttt tcaatgcttg gaatt 25
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acggtacata ttactgttgt tg 22
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aatcgtcgtc atctttcg 18
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaccacaatc gacacaacaa ca 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gatagcaact gcaaccacag g 21
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ctgtcagaac cacaatcgac ac 22
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgatagcaac tgcaaccaca g 21
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctgtgatcgg tgtaaagcct ac 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaacccgtc ctatgttgaa at 22
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
actccgtctg gattggtg 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ctcgtcgtat tcttgtttgc 20

Claims (8)

1.翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins选自PernalinA、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D中的一种或几种；所述PernalinA、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的翡翠贻贝抗菌肽Pernalins，其特征在于，所述PernalinA、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的抑菌活性中心肽段的氨基酸序列分别如SEQ IDNO：13～SEQ ID NO：16所示。
3.权利要求1所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的信号肽，其特征在于，所述Pernalin A、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5～SEQID NO：8所示。
4.权利要求1所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins的编码基因，其特征在于，所述PernalinA、Pernalin B、Pernalin C和Pernalin D的编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：9～SEQ ID NO：12所示。
5.权利要求1或2所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者权利要求3所述信号肽或者权利要求4所述编码基因在制备激活机体免疫防御反应的制剂中的应用。
6.权利要求1或2所述翡翠贻贝抗菌肽Pernalins或者权利要求3所述信号肽或者权利要求4所述编码基因在翡翠贻贝养殖中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括防御和/或消除翡翠贻贝养殖中的微生物感染。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物包括副溶血弧菌。
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