CN108707195B - 翘嘴鳜IFN-α3基因、重组蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

翘嘴鳜IFN-α3基因、重组蛋白、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种翘嘴鳜IFN‑α3基因、重组蛋白、制备方法及应用。本发明通过采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN‑α3全长cDNA序列，如SEQ ID NO：1所示；利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；将ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoR I和Xho I进行双酶切得到目的片段；用EcoR I和Xho I对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)‑IFN‑α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；将质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN‑α3重组蛋白，如SEQ ID NO：2所示。该IFN‑α3重组蛋白可用于浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面，能够有效激活翘嘴翘嘴鳜进入抗病毒状态，降低死亡率。

Description

翘嘴鳜IFN-α3基因、重组蛋白、制备方法及应用
技术领域
本发明属于水产养殖、生物技术和医药生物工程领域，尤其涉及一种翘嘴鳜IFN-α3基因、IFN-α3重组蛋白、IFN-α3重组蛋白的制备方法以及IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。
背景技术
在鱼类养殖中，病毒性疾病往往是造成损失大面积减产的重要因素，其发病迅速且无有效的治疗药物和手段，盲目用药还会造成药物残留和环境污染，采用疫苗手段可取得安全高效的防治效果，是今后鱼类病毒性疾病防治的发展方向。
干扰素(Interferons，IFNs)是一种具有多功能活性的，分泌型的蛋白质，当机体和细胞受到病毒或其它诱导剂刺激后，能够诱导脊椎动物淋巴细胞和单核细胞产生的一系列体液免疫和细胞免疫因子，诱导产生多种抗病毒蛋白，包括：Mx、PKR、Viperin、IRF-1与IRF-2a、IRF-2b、IRF-7等抗病毒蛋白，进入抗病毒状态，从而很好地抵御病毒病的发生，并且IFN-α抗病毒作用要高于IFN-γ和IFN-β。但目前鱼类的疫苗均通过灭活染病病原来制备，由于病毒来源有限，无法制备大批量疫苗，而且鱼类是非特异性免疫，其免疫效果受到一定影响；另一方面，常用的注射免疫方式操作麻烦，使得鱼类疫苗的应用和推广受到了很大的限制。因此，开发成本低廉、免疫方式简便的疫苗对鱼类养殖业的健康发展尤为重要。翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是中国重要的名优淡水养殖品种，随着养殖密度的提高，养殖病害愈发严重，导致翘嘴鳜暴发性死亡最严重的是由传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)也称虹彩病毒(MRV)引起的传染性病毒感染疾病，不仅带来巨大经济损失，还制约翘嘴鳜养殖业的发展。由于翘嘴鳜是终身以活鱼为食，口服或注射的免疫方式很难在翘嘴鳜养殖中使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新克隆到的翘嘴鳜IFN-α3基因。
本发明的再一目的在于提供上述翘嘴鳜IFN-α3基因表达到的IFN-α3重组蛋白。
本发明的再一目的在于提供上述IFN-α3重组蛋白的的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用，旨在解决口服或注射的免疫方式很难在翘嘴鳜养殖中得到应用的问题。
本发明是这样实现的，一种翘嘴鳜IFN-α3基因，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的进一步公开了一种翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明进一步公开了翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列；
(2)利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；
(3)将所述ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoR I和Xho I进行双酶切得到目的片段；
(4)用EcoR I和Xho I对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)-IFN-α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；
(5)将所述质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN-α3蛋白。
优选地，在步骤(1)中，所述翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列的克隆包括翘嘴鳜IFN-α35’端序列的扩增以及3’端序列的扩增；其中，在5’端序列的扩增中：
IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：
GSP1：5’-ATGAGCTGGACGAGAG-3’；
PCR第一轮扩增引物为：
GSP2：5’-AGCTGTTGCTCACATGACCG-3’；
PCR第二轮扩增引物为：
GSP3：5’-GCCAATCACAGCAGAGCG-3’；
AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’；
在3’端序列的扩增中：
IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：
3’CDS PrimerA：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC-3’；
PCR第一轮扩增引物为：
GSP4：5’-TGGAGAAAAGCACTCTGTACCGCAC-3’；
UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；
PCR第二轮扩增引物为：
GSP5：5’-TGATCAGGAAGGAAACTGAAGTGCA-3’；
UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
优选地，在步骤(2)中，所述带有酶切位点的引物为：
IFN-α3-EcoRI-F：5’-TCCGAATTCTGTGATTGGCTCA-3’；
IFN-α3-XhoI-R：5’-GCTCGAGTCAGTGTTGGTGA-3’。
本发明进一步公开了上述翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。
更具体的，该应用的方法包括以下步骤：取1～4厘米长的翘嘴鳜浸泡在免疫浸泡液中进行IFN-α3蛋白疫苗浸泡免疫，所述免疫浸泡液为含有所述IFN-α3蛋白的水体；将浸泡免疫后的翘嘴鳜置于25℃环境下，投喂赤眼鳟鱼进行恒温养殖。
优选地，水体中IFN-α3蛋白浓度大于100mg/L；翘嘴鳜在水体中的浸泡时间大于60min。
本发明克服现有技术的不足，提供一种翘嘴鳜IFN-α3基因、IFN-α3重组蛋白、IFN-α3重组蛋白的制备方法以及IFN-α3重组蛋白在浸泡免疫预防翘嘴鳜病毒病方面的应用。本发明通过从翘嘴鳜中克隆IFN-α3全长cDNA，采用pET32a(+)原核表达系统表达IFN-α3重组蛋白，以割胶纯化的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白为免疫原，制成免疫浸泡液，将翘嘴鳜浸泡在其中，进行浸泡免疫；免疫后的翘嘴鳜置于25℃环境下、投喂赤眼鳟鱼进行恒温养殖。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明通过克隆IFN-α3基因，表达和纯化IFN-α3重组蛋白，并采用浸泡免疫的方式对翘嘴鳜苗进行免疫，经试验证明，采用本发明所述方法免疫后，能够有效激活翘嘴翘嘴鳜进入抗病毒状态，有效提高翘嘴翘嘴鳜胸腺、头肾、脾脏、肝脏、体肾、血中IFN-α3转录水平的显著上调，抗病毒相关基因(Mx、PKR、Viperin、IRF-1与IRF-2a、IRF-2b、IRF-7等)的表达量也相应提高，从而提高抗病毒能力，能够显著降低ISKNV病毒感染翘嘴翘嘴鳜的死亡率。
附图说明
图1是IFN-α3原核表达载体构建时所得产物的电泳结果图；其中，图A为IFN-α3ORF段PCR产物；图B为pMD19T-IFN-α3和pET32a(+)双酶切产物；图C为将pET32a(+)-IFN-α3转入DH5α后的阳性克隆；各图中，泳道1、3、6均为Marker DL5000；泳道2为IFN-α3ORF段PCR产物；泳道4为pMD19T-IFN-α3双酶切产物；泳道5为pET32a(+)双酶切产物；泳道7为将pET32a(+)-IFN-α3转入DH5α后的阳性克隆；
图2是E.coli BL21(DE3)表达的rgcIFN-α3和Trx蛋白SDS-PAGE电泳结果图；其中，泳道M为marker(kDa)；泳道1为pET-32a(+)-IFN-α3/BL21诱导后总细菌裂解物；泳道2为pET-32a(+)-IFN-α3/BL21未诱导总细菌裂解物；泳道3为pET32a(+)/BL21诱导后总细菌裂解物；泳道4为pET32a(+)/BL21未诱导总细菌裂解物；泳道5为BL21总细菌裂解物；
图3是IFN-α3蛋白浸泡免疫后翘嘴鳜不同组织IFN-α3mRNA相对于对照组表达量的变化结果；其中，*表示与对照组差异显著(p<0.05)；
图4是IFN-α3蛋白浸泡免疫后翘嘴鳜肝(A)、脾(B)、肾(C)和肠(D)中7种相关免疫基因mRNA相对于对照组表达量的变化结果；其中，*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)，**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)；
图5是不同免疫组攻毒实验后的翘嘴鳜的累计死亡率结果；其中，空白(正常水体)和PBS浸泡为对照组，IFN-α3蛋白浸泡为免疫组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列的克隆：
1、引物的合成
从翘嘴鳜转录组测序结果中搜索得到翘嘴鳜IFN-α3基因的部分cDNA序列，该cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，所表达的IFN-α3重组蛋白如SEQ ID NO：2所示。
2、样本RNA的提取
采用Trizol法提取所采集的翘嘴鳜脾脏中的RNA。使用NANODROP 2000(Thermoscientific，美国)超微量紫外分光光度计检测RNA的质量及浓度，并进行琼脂糖电泳查看所抽提RNA的完整性。若所抽提的RNA质量不达标则重复此步骤再次抽提直到得到质量合格的RNA样本。
3、翘嘴鳜IFN-α35’端序列的扩增
(1)用SUPERSCRIPT II RT酶(5′RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends,Version 2.0，Invitrogen)、引物GSP-1对已提取的总RNA进行IFN-α3第一链cDNA的合成。
引物GSP-1的序列为5’-ATGAGCTGGACGAGAG-3’；
(2)使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理，使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C。
(3)第一轮PCR扩增
第一轮PCR扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃终延伸7min。
第一轮PCR扩增引物为GSP2：5’-AGCTGTTGCTCACATGACCG-3’；
(4)第二轮PCR扩增
PCR第二轮扩增反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃终延伸7min。
第二轮PCR扩增引物为GSP3：5’-GCCAATCACAGCAGAGCG-3’；
(5)将第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，并使用胶回收试剂盒(上海生工生物有限公司)对纯化后目的条带进行切胶回收。将回收的PCR产物克隆到pMD18-T载体上(Takara，日本)，挑取阳性克隆，送上海生工生物有限公司测序，得到有效的目的片段。
4、翘嘴鳜IFN-α33’端序列的扩增
与上述5’端扩增时的第(1)～第(5)步相同，不同之处在于，在进行第二轮PCR扩增时，将第一轮扩增的PCR产物稀释50倍；并且，
IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：
3’CDS Primer A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC-3’；
第一轮扩增引物替换为：
GSP4：5’-TGGAGAAAAGCACTCTGTACCGCAC-3’；
第二轮扩增引物替换为：
GSP5：5’-TGATCAGGAAGGAAACTGAAGTGCA-3’。
实施例2原核表达载体的构建
1、翘嘴鳜IFN-α3的分子克隆
(1)根据去除信号肽后IFN-α3的cDNA序列设计带酶切位点的引物IFN-α3-EcoRI-F和IFN-α3-XhoI-R：
IFN-α3-EcoRI-F：5’-TCCGAATTCTGTGATTGGCTCA-3’
IFN-α3-XhoI-R：5’-GCTCGAGTCAGTGTTGGTGA-3’。
(2)PCR反应体系如下：
(3)PCR反应程序如下：
2、目的片段与T载体连接：将PCR获得的产物凝胶电泳观察目的条带，然后用凝胶试剂盒回收，与T载体连接。
以上实验过程中，图1A的泳道2所示为PCR获得翘嘴鳜IFN-α3ORF序列，496bp；与pMD19T连接并测序正确后，将其用EcoR I和Xho I进行双酶切后，切出目的片段如图1B的泳道4所示，同时将pET32a(+)进行双酶切片段如图1B泳道5所示。
3、连接产物转化与筛选：取一管DH5α感受态细胞，加入10μL目的片段与pMD19-T的连接产物，加入800μL LB培养基，混匀，37℃活化40min。4℃，3500r/min离心5min，弃800μL上清，混匀剩余培养基与菌体。将混合物涂布在含Amp的LB平板上，室温下正置30min，再倒置于恒温培养箱中37℃培养过夜。挑取白色阳性单菌落，接种于LB液体培养基37℃，250r/min培养过夜。
经过菌液PCR鉴定，选取阳性克隆抽提重组质粒保存。如图1C泳道7所示，为pET32a(+)-IFN-α3的重组表达载体转入DH5α菌株后的阳性结果。
实施例3翘嘴鳜重组IFN-α3的原核表达
1、重组表达质粒的构建：将pMD19-T-IFN-α3质粒和表达载体pET32a(+)质粒进行双酶切，酶切体系如下：
2、琼脂糖凝胶电泳，并将割胶回收酶切后的目的片段，如图1B所示，IFN-α3片段与载体pET32a(+)按摩尔比为5:1的比例进行连接，4℃过夜获得表达载体。
3、将上述连接产物转入DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，通过菌液PCR鉴定，选择阳性克隆抽提质粒。
4、将正确的重组质粒转入表达菌E.coliBL21(DE3)中。
5、诱导融合蛋白表达
分别吸取pET-32a(+)-IFN-α3/BL21菌液5μL、pET-32a(+)/BL21菌液5μL，于5mL含Amp(浓度为100μg/mL)的LB培养基中，37℃，250r/min培养过夜。
6、将菌液离心收集纯化，获得翘嘴鳜重组IFN-α3蛋白，如图2的泳道1所示，pET-32a(+)-IFN-α3/BL21产生的蛋白在36kDa处显示出条带，与预测大小36kDa对应。
实施例4重组IFN-α3蛋白浸泡免疫效果的检测
1、正常翘嘴鳜体内IFN-α3基因的表达量的检测
利用qPCR技术检测了翘嘴鳜的8个组织的IFN-α3的组成型表达情况经qPCR检测发现，健康翘嘴鳜IFN-α3基因在血液中的表达量最高，其次是头肾和脾脏，其它组织中也能检测到，但表达量较低，最低的是肠组织，如图3所示。
2、IFN-α3蛋白浸泡免疫后的翘嘴鳜体内IFN-α3基因的表达情况
翘嘴鳜经重组IFN-α3蛋白浸泡后，IFN-α3转录水平在胸腺、头肾、脾脏、肝脏、体肾、血中显著上调；其中，浸泡3h后肝脏IFN-α3上调达最高峰，头肾、脾脏分别在12h、48h时达最高峰，胸腺在6h时表达量最高，表达量的最高值出现在重组IFN-α3蛋白12h后的头肾中，是对照组的5.6倍(P<0.01)，如图3所示。
3、IFN-α3蛋白浸泡免疫后的翘嘴鳜体内相关免疫基因的表达情况
翘嘴鳜经重组IFN-α3蛋白浸泡后，肝、脾、肾、肠4个组织中的PKR、Mx、Viperin、IRF-1、IRF-2a、IRF-2b、IRF-7基因表达量与对照组进行比较，如图4所示，图4为IFN-α3蛋白浸泡免疫后翘嘴鳜肝(A)、脾(B)、肾(C)和肠(D)中7种相关免疫基因mRNA相对于对照组表达量的变化结果。从图4中可以看出：
(1)在肝脏中，如图4A，全部7种基因的表达均有不同程度的上调。其中，Viperin的上调幅度最高，在浸泡4h后就达到了对照组的13.926倍，8h后依然保持有13.795倍的相对表达量；PKR和Mx在浸泡后的表达趋势相类似，都是在浸泡8h后就达到了4倍以上的相对表达量；IRF-1在浸泡4h后的相对表达量就达到了2倍以上；浸泡后IRF-2a和IRF-2b有相似的表达趋势，均在浸泡24h后达到峰值，分别为6.881倍和6.529倍；IRF-7在所检测的整个时间段均维持在较高的表达水平，浸泡4h后其表达量就已显著高于对照组达到了3倍以上，之后一直维持在1.8～2.6倍之间。
(2)在脾脏中，如图4B，PKR在浸泡4h后就已极显著上调(P<0.01)，8h后相对表达量达到1.816倍，72h后达到4倍以上；Mx的表达量在浸泡8h后极显著上升至1.785倍(P<0.01)；Viperin在浸泡4h后就已极显著高于对照组达到了3倍以上(P<0.01)；IRF-1与IRF-2a、IRF-2b、IRF-7几个基因在浸泡后的表达趋势相类似，都是在浸泡4h后就显著上调(P＜0.05)。
(3)在肾脏中，如图4C，PKR、Mx和Viperin极显著上调(P<0.01)的峰值出现在浸泡后8h，而IRF-1、IRF-2a、IRF-2b、IRF-7几个基因却在浸泡4h后就已达到了极显著上调(P<0.01)的峰值。
(4)肠组织中，如图4D，Mx和IRF-7的相对表达量均在浸泡4h后就已经极显著高于正常水平(P<0.01)，PKR直到浸泡后12h才极显著升高(P<0.01)；Viperin在浸泡4h后其相对表达量就达到了3.986倍；IRF-1和IRF-2b都表现为先升高后降低再升高的趋势。IRF-2a在浸泡8h后就一直保持在2～3倍的相对表达量。
实施例5翘嘴鳜经重组IFN-α3蛋白浸泡免疫的保护效果
免疫后第28天，进行攻毒试验，各组每尾鱼通过腹腔注射10×TCID50ISKNV，连续观察12天，记录感染发病和死亡情况，计算相对免疫保护(relative percent survival，RPS)，RPS＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％。
用10×TCID50ISKNV攻毒后，免疫组(重组IFN-α3蛋白浸泡)与对照组[空白(正常水体)组和PBS浸泡组]在11天内均出现了不同程度的死亡，死亡时间集中在攻毒的第6天后，如图5所示。经重组IFN-α3蛋白浸泡翘嘴鳜后产生了较高的免疫力，PCR检测死亡翘嘴鳜为ISKNV阳性，同时观察其发病症状，与自然环境下感染ISKNV发病症状相同，表明其死亡原因是由于人工感染ISKNV所致。免疫后第11天，免疫组累计死亡率28.7％，空白和PBS对照组累计死亡率为100％，如图5所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 翘嘴鳜IFN-α3基因、重组蛋白、制备方法及应用
<130> PA181807F
<141> 2018-05-30
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 863
<212> DNA
<213> Siniperca chuatsi
<400> 1
agagctcagt ctgcagccac catcaccacc accaccacca tcatcaccgc caccatcttc 60
atcatgttca gctggaccgg cctgctcttc gtcctctgca ccctgactcc tgcgctctgc 120
tgtgattggc tcagacacta cggtcatgtg agcaacagct ctctgactct cgtccagatc 180
atgggcggtc agatgactga agaggagagt ccattttcct ttccaaacaa actctacaaa 240
cacatacaaa aggcagaggt ggagtcccag ctggttttca tcagagacag tctggagcta 300
attcttggtc tctatcgcca tgacaacctc tcctctgcta cctgggatac cgacaagacg 360
gagcacttcc tgttgtgcat ccacagacag atagatggac tcaatagctg tgtgtcgact 420
aacaagcaag caaactacaa actgaaaaaa tactacaaga gactggagaa aagcactctg 480
taccgcactg gtggtagtgc tgcgtcctgg gagctgatca ggaaggaaac tgaagtgcac 540
ctggaacggt cggccctgct ggtggccccc atagctacaa cacttcatca ccaacactga 600
cacgtctcat cagtctgtct cactgtctcc agcgtttatt ctgtctctct gtgagagttt 660
ctattgtcag tctatttatt tatttatcat ttatcgtttc tatttatgaa caaagtgctc 720
atcttgtatt tatttattta ttgaactctg acagttttgt atttacagac tctgagtctg 780
attttacttg aaaaattttg ataacggacc acaataaaga catttcatac aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 863
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> Siniperca chuatsi
<400> 2
Met Phe Ser Trp Thr Gly Leu Leu Phe Val Leu Cys Thr Leu Thr Pro
1 5 10 15
Ala Leu Cys Cys Asp Trp Leu Arg His Tyr Gly His Val Ser Asn Ser
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Val Gln Ile Met Gly Gly Gln Met Thr Glu Glu Glu
35 40 45
Ser Pro Phe Ser Phe Pro Asn Lys Leu Tyr Lys His Ile Gln Lys Ala
50 55 60
Glu Val Glu Ser Gln Leu Val Phe Ile Arg Asp Ser Leu Glu Leu Ile
65 70 75 80
Leu Gly Leu Tyr Arg His Asp Asn Leu Ser Ser Ala Thr Trp Asp Thr
85 90 95
Asp Lys Thr Glu His Phe Leu Leu Cys Ile His Arg Gln Ile Asp Gly
100 105 110
Leu Asn Ser Cys Val Ser Thr Asn Lys Gln Ala Asn Tyr Lys Leu Lys
115 120 125
Lys Tyr Tyr Lys Arg Leu Glu Lys Ser Thr Leu Tyr Arg Thr Gly Gly
130 135 140
Ser Ala Ala Ser Trp Glu Leu Ile Arg Lys Glu Thr Glu Val His Leu
145 150 155 160
Glu Arg Ser Ala Leu Leu Val Ala Pro Ile Ala Thr Thr Leu His His
165 170 175
Gln His
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgagctgga cgagag 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agctgttgct cacatgaccg 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gccaatcaca gcagagcg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggccacgcgt cgactagtac 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
aagcagtggt atcaacgcag actac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tggagaaaag cactctgtac cgcac 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
tgatcaggaa ggaaactgaa gtgca 25

Claims (5)

1.一种翘嘴鳜IFN-α3基因，其特征在于，该基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白，其特征在于，该蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求2所述的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)采用cDNA末端快速扩增RACE技术克隆翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列；
(2)利用带有酶切位点的引物克隆出该cDNA序列的ORF序列；
(3)将所述ORF序列克隆入pMD19T载体后，再用EcoR I和Xho I进行双酶切得到目的片段；
(4)用EcoR I和Xho I对pET32a(+)载体进行双酶切，将该双酶切载体与所述目的片段连接，得到pET32a(+)-IFN-α3重组表达载体，转入DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆并提取保存质粒；
(5)将所述质粒转入表达菌BL21，经IPTG诱导表达获得IFN-α3蛋白。
4.如权利要求3所述的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述翘嘴鳜IFN-α3全长cDNA序列的克隆包括翘嘴鳜IFN-α35’端序列的扩增以及3’端序列的扩增；其中，在5’端序列的扩增中：
IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：
GSP1：5’-ATGAGCTGGACGAGAG-3’；
PCR第一轮扩增引物为：
GSP2：5’-AGCTGTTGCTCACATGACCG-3’；
PCR第二轮扩增引物为：
GSP3：5’-GCCAATCACAGCAGAGCG-3’；
AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’；
在3’端序列的扩增中：
IFN-α3第一链cDNA的克隆引物为：
3’CDS Primer A：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC-3’；
PCR第一轮扩增引物为：
GSP4：5’-TGGAGAAAAGCACTCTGTACCGCAC-3’；
UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；
PCR第二轮扩增引物为：
GSP5：5’-TGATCAGGAAGGAAACTGAAGTGCA-3’；
UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’。
5.如权利要求3所述的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述带有酶切位点的引物为：
IFN-α3-EcoRI-F：5’-TCCGAATTCTGTGATTGGCTCA-3’；
IFN-α3-XhoI-R：5’-GCTCGAGTCAGTGTTGGTGA-3’。
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