CN109777792B - 一种rna解旋酶3及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有RNA解旋酶3生物学功能或活性的肽或蛋白，所述肽或蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性为95％以上。本发明还涉及编码所述肽或蛋白的核苷酸序列。本发明还涉及含有所述核苷酸序列的重组载体，宿主细胞。本发明还提供了一种改善植物抗病毒性能的方法和制备转基因植物的方法。本发明提供了一种新型的具有RNA解旋酶3活性或功能的肽或蛋白及其编码序列，对RNA解旋酶3过表达的转基因植株进行病毒侵染，结果表明：RNA解旋酶转基因植株中病毒RNA基因组积累量显著降低，植物感病率显著降低。

Description

一种RNA解旋酶3及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物RNA解旋酶及其编码基因和应用，特别是涉及一个来源于拟南芥的RNA解旋酶3及其编码基因，以及其在培育抗病毒性能增强的转基因植物中的应用。

背景技术

植物病毒等病害的发生严重地威胁着我国粮食作物生产。每年因病害造成的粮食减产超过15％。RNA沉默是真核生物内的重要抗性调控机制，其作用机制是利用小分子RNA对靶基因的表达进行抑制(Younis et al.2014)，是植物抗病毒的关键手段。

Argonaute(AGO)蛋白是RNA沉默系统中非常重要的组成部分。拟南芥中已报道有10种Argonaute蛋白，其中AGO1、AGO2参与抗性反应。RNA沉默信号通路中最终完成调控作用的是以AGO为主体的RISC复合体。RISC复合体结合小分子RNA，通过mRNA切割、翻译抑制以及靶位点的DNA甲基化、染色质修饰等调控植物对病毒的抗性。拟南芥(Arabidopsisthaliana)AGO1蛋白(AtAGO1)是最早发现的AGO蛋白，参与了植物对病毒的抗性反应，病毒小RNA(virus siRNAs,vsiRNAs)能够进入AGO1形成的RISC复合物中，靶向病毒基因组，抑制病毒基因的表达(Qu et al.2008；Wang et al.2011b)。AGO2/3/7与21nt小RNA(small RNA,sRNA)结合主要调控植物抵御病毒和细菌侵染(Pumplin and Voinnet 2013)。拟南芥AGO2蛋白(AtAGO2)在抵御病毒侵染中也发挥至关重要的作用。AGO2突变品系对多种病毒的抵御能力显著降低(Mi et al.2008；Wang et al.2011b)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNA沉默的病害防治策略。基于RNA沉默技术的病害防治具有如下优势：1)选择对病毒基因进行专一性沉默，对高等动物和人类是安全的；2)对非靶标生物无杀伤作用；3)对环境无毒无害。

研究表明，以AGO为主体的RISC复合体进行RNA沉默能够有效控制植物病害，在病害防治领域具有重要的发展前景。当前，基于RNA沉默进行病害有效控制的关键是筛选并鉴定以AGO为主体的RISC复合体的其他关键核心蛋白，并对该核心蛋白进行转基因植物构建。但是，当前对这些关键核心蛋白的研究比较薄弱。

发明内容

因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种与RNA沉默复合体的核心蛋白AGO2相互作用的关键蛋白-RNA解旋酶3，本发明还提供了该RNA解旋酶3的基因序列及其应用。本发明人利用带有标签的AGO基因过表达拟南芥植株，利用AGO蛋白抗体进行免疫共沉淀实验，对于共沉淀下来的蛋白组分通过质谱分析，获得与AGO蛋白互作的RNA解旋酶，将所述RNA解旋酶3基因突变后，植物的抗病性减弱，将RNA解旋酶3基因导入突变体植物后，该转基因植物的抗病性能显著增强，而且这些性状可稳定遗传。

一方面，本发明提供了一种具有RNA解旋酶3生物学功能或活性的肽或蛋白，所述肽或蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性为95％以上。

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的肽或蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽或蛋白的片段、或肽或蛋白的变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明的保护范围之列。具体的变体可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述的肽或蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持与本发明所述的RNA解旋酶3相同的生物学功能或活性的肽或蛋白，可以是下列情形：(I)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟肽或蛋白与另一种化合物(比如延长肽或蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合到成熟的肽或蛋白而形成的肽或蛋白序列(如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方法所用的宿主，本发明的肽或蛋白可以是糖基化的。本发明的肽或蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

优选的，所述肽或蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还涉及编码所述肽或蛋白的核苷酸序列。

所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的同源性为70％以上。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的变体，只要其与该核苷酸序列具有70％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述核苷酸序列的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的核苷酸序列。此核苷酸序列的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是核苷酸序列的替换形式，它可能是核苷酸序列的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽或蛋白的功能。

另外，可与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的肽或蛋白与SEQ ID NO:1所示的肽或蛋白有相同的生物学功能和活性。

优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还涉及一种含有所述核苷酸序列的重组载体，以及利用所述重组载体转化、转导或转染得到的遗传工程化宿主细胞。

本发明中，编码所述肽或蛋白的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述核苷酸序列的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3.1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内稳定复制，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选pET载体系列以及其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法可用于构建含编码具有RNA解旋酶3活性或功能的肽或蛋白的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA序列、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素等。

本发明中，编码所述肽或蛋白的核苷酸序列或含有该核苷酸序列的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸序列或重组载体的基因工程化宿主细胞。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明还涉及所述核苷酸序列在制备重组RNA解旋酶3中的应用。

通过常规的重组DNA技术，利用本发明的核苷酸序列可用来表达或生产重组的RNA解旋酶3；一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码具有RNA解旋酶3活性或功能的核苷酸序列(或变异体)，或用含有该核苷酸序列的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞的条件下进行培养。当宿主细胞生长至适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

通过常规的转基因技术，利用本发明的核苷酸序列可获得RNA解旋酶3稳定表达的转基因株系。一般来说有以下步骤：

1)制备含有编码具有RNA解旋酶3活性或功能的核苷酸序列的质粒，从而获得RNA解旋酶3转基因品系的阳性克隆质粒；

2)使用所述阳性克隆质粒转化农杆菌；

3)将待转化植物的花苞浸在菌液中转染农杆菌；

4)收集种子并种植，鉴定阳性转基因植株；

5)将鉴定为阳性的植株单株收种子，保存为T0代；

6)种植T0代，获得RNA解旋酶3稳定表达的转基因株系。

本发明的要点在于提供了SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

本发明还提供了一种改善植物抗病毒性能的方法，所述方法包括以下步骤：

将本发明的编码具有RNA解旋酶3活性或功能的核苷酸序列(或变异体)或者包含所述序列的重组表达载体导入植物或植物组织并使其表达；

优选地，所述植物是拟南芥。

本发明还提供了一种制备转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：

在有效产生植物的条件下培养含有本发明的编码具有RNA解旋酶3活性或功能的核苷酸序列或者重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明还提供了本发明的编码具有RNA解旋酶3活性或功能的核苷酸序列、其重组表达载体或者重组细胞用于改善植物抗病毒性的用途；优选地，所述植物是拟南芥。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了RNA解旋酶3及其抗病毒的重要功能，对RNA解旋酶3突变和过表达的转基因植株进行病毒侵染，结果表明：RNA解旋酶突变体植株中病毒RNA基因组积累量显著增加，而RNA解旋酶3转基因植株中病毒RNA基因组积累量显著降低，植物感病性显著降低。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为质谱分析结合鉴定AGO2的关键互作蛋白的肽段图；

图2为质谱分析结合鉴定AGO2的关键互作蛋白的肽段图；

图3为质谱分析结合鉴定AGO2的关键互作蛋白的肽段图；

图4显示在RNA解旋酶3突变品系中，病毒积累量增加，RNA解旋酶3转基因品系病毒积累量降低，说明RNA解旋酶增强了植物的抗病毒功能。

图5为RNA解旋酶3转基因品系抗病毒性能增强。病毒侵染野生型对照组、突变品系组和突变品系背景下的转基因品系组，突变品系组植物病毒积累量显著增加，在RNA解旋酶3突变品系基础上进行RNA解旋酶3转基因品系组植物的病毒积累量显著降低，恢复至野生型水平。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1获得拟南芥AGO2RISC复合体中核心蛋白RNA解旋酶3

带有HA标签的AGO2过表达植物以及104EV植物材料；

其中，在pEarlryGate104质粒上插入GUS基因CDS序列，阳性克隆转化拟南芥Col-0WT，筛选basta抗性的转基因植株，并用HA抗体检测目的基因的表达，最终确定的阳性株系为104EV。

1g材料加入5ml提取缓冲液(所述缓冲液包含100mM NaCl、5mM MgCl₂、5mM DTT、20mM Tris-HCL(PH7.5)、0.2％Tween-20、1片蛋白酶抑制剂(Roche))。

分别取3g HA-AGO2植物材料，104EV植物材料，于液氮中研磨，充分研磨得到的粉末取出放到新的50ml离心管中，加入15ml提取缓冲液。低转速摇匀，大概15min溶解充分后，离心，5000g/15min/4℃，上清过miracloth(Merk)，滤掉植物残渣，再次把过滤得到的溶液离心，5000g/5min/4℃，上清转移到新管。取出300μL作为蛋白上样的Input，其余样品分别加入等量40μL HA磁珠(购自Roche)。4℃孵育4个小时后，1000g/3min/4℃离心，磁珠沉在管底，吸掉上清。加入洗涤缓冲液(购自Roche，所述洗涤缓冲液包含150mM NaCl、5mM MgCl₂、5mM DTT、20mM Tris-HCL(PH7.5)、0.3％Triton-X 100，1片蛋白酶抑制剂)洗涤磁珠，去掉非特异结合的蛋白。1000g/3min/4℃离心后，去掉上清，约留100μL上清，作为pulldown后的蛋白样品。100μL IP样品加入25μL 5XSDS loading dye(蛋白上样缓冲液)，(125mM Tris-HCL(PH6.8)、25％甘油、5％SDS、5mM DTT、0.5％BPB)，沸水煮样10min。SDS-PAGE胶电泳，将蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，蛋白胶送至质谱平台进行切胶质谱分析AGO2的关键互作蛋白。其中，所述质谱肽段峰图如图1-3所示。

根据质谱分析获得的肽段与拟南芥基因组进行比对，发现获得与RNA沉默复合体的核心蛋白AGO2互作的关键蛋白-RNA解旋酶3。

其中，所述RNA解旋酶3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1

MASTVGVPSLYQVPHLEISKPNSKKRSNCLSLSLDKPFFTPLSLVRRTRRIHSSSLLVPSAVATPNSVLSEEAFKSLGLSDHDEYDLDGDNNNVEADDGEELAISKLSLPQRLEESLEKRGITHLFPIQRAVLVPALQGRDIIARAKTGTGKTLAFGIPIIKRLTEEAGDYTAFRRSGRLPKFLVLAPTRELAKQVEKEIKESAPYLSTVCVYGGVSYTIQQSALTRGVDVVVGTPGRIIDLIEGRSLKLGEVEYLVLDEADQMLAVGFEEAVESILENLPTKRQSMLFSATMPTWVKKLARKYLDNPLNIDLVGDQDEKLAEGIKLYAIATTSTSKRTILSDLITVYAKGGKTIVFTQTKRDADEVSLALSNSIATEALHGDISQHQRERTLNAFRQGKFTVLVATDVASRGLDIPNVDLVIHYELPNDPETFVHRSGRTGRAGKEGSAILMHTSSQKRTVRSLERDVGCHFEFISPPTVGDLLESSADQVVATLNGVHPDSIKFFSATAQKLYEEKGTDALAAALAHLSGFSQPPSSRSLLSHEKGWVTLQLIRDPTNARGFLSARSVTGFLSDLYRTAADEVGKIFLIADDRIQGAVFDLPEEIAKELLEKDVPEGNSLSMITKLPPLQDDGPSSDNYGRFSSRDRMPRGGGGSRGSRGGRGGSSRGRDSWGGDDDRGSRRSSGGGSSWSRGGSSSRGSSDDWLIGGRSSSSSRAPSRERSFGGSCFICGKSGHRATDCPDKRGF。

所述RNA解旋酶3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示：

SEQ ID NO:2

ATGGCGTCGACGGTAGGAGTTCCATCACTATACCAAGTTCCTCACCTTGAAATCTCCAAACCCAATTCCAAAAAGAGGTCTAATTGTTTATCTTTATCTCTCGATAAGCCTTTCTTCACTCCCTTATCTCTTGTTCGTAGAACTCGTCGTATCCATTCCTCTTCTCTTCTTGTTCCTTCTGCTGTTGCTACTCCTAATTCTGTTCTCAGTGAAGAAGCTTTCAAAAGTCTTGGTCTTTCTGACCATGACGAATATGACCTTGACGGCGACAACAACAACGTTGAAGCTGATGATGGTGAAGAACTCGCTATCTCTAAACTTAGTTTGCCTCAACGTCTTGAAGAGTCTCTTGAGAAACGTGGTATCACTCATCTCTTCCCCATTCAGAGAGCTGTGTTGGTACCTGCACTGCAAGGAAGAGATATTATAGCTCGTGCAAAGACAGGAACTGGAAAGACTTTGGCTTTTGGTATTCCTATCATTAAACGTCTCACTGAAGAAGCTGGAGACTACACTGCTTTCAGGAGGTCTGGTCGTCTTCCTAAGTTCCTTGTCCTTGCGCCGACCCGAGAGCTGGCTAAGCAAGTGGAGAAGGAGATTAAGGAGTCTGCACCTTATTTGAGCACTGTTTGTGTGTATGGGGGAGTTTCTTATACCATTCAGCAGAGTGCTTTAACTCGTGGTGTTGATGTTGTTGTTGGAACTCCTGGAAGAATCATTGATTTGATTGAAGGAAGGAGTCTTAAATTGGGAGAAGTTGAGTATTTGGTACTTGATGAAGCTGATCAGATGCTTGCTGTTGGGTTTGAGGAGGCCGTGGAATCGATTCTTGAGAATCTTCCAACTAAGCGACAAAGTATGCTTTTCTCAGCAACTATGCCTACTTGGGTTAAGAAGTTGGCGAGGAAGTACCTTGACAATCCCTTGAATATTGATCTGGTTGGAGACCAAGATGAGAAGCTCGCAGAGGGTATCAAACTTTATGCAATCGCAACCACATCGACATCAAAACGCACTATTCTAAGCGACCTTATTACAGTGTATGCGAAGGGTGGCAAGACCATTGTTTTTACCCAAACTAAAAGAGATGCAGACGAAGTTTCTCTTGCATTGTCAAACAGTATAGCTACCGAAGCACTTCATGGAGATATATCTCAGCATCAAAGAGAGAGAACACTCAATGCTTTCCGTCAAGGGAAATTCACCGTATTAGTTGCCACTGATGTTGCATCTCGTGGACTTGACATCCCGAACGTAGATCTAGTTATCCACTATGAACTTCCTAATGACCCAGAAACTTTTGTGCACCGTTCTGGTCGTACTGGGCGTGCAGGGAAAGAAGGCTCTGCCATTCTCATGCACACCAGCAGCCAAAAGAGAACAGTGAGGTCTCTGGAGCGTGACGTAGGCTGCCATTTTGAATTCATTAGCCCACCAACTGTTGGAGACTTGTTGGAATCGTCAGCAGACCAAGTGGTGGCCACTCTAAATGGTGTTCACCCTGACTCCATAAAGTTTTTCTCAGCAACTGCTCAAAAACTATATGAGGAGAAAGGAACAGATGCTTTAGCTGCAGCTCTAGCTCACCTGAGTGGTTTCTCTCAGCCGCCTTCATCAAGATCTCTCCTCAGCCATGAGAAGGGATGGGTGACTTTGCAATTGATCCGAGATCCAACGAACGCTAGAGGCTTTCTGTCTGCGAGGTCTGTTACTGGTTTTCTTTCCGATCTTTACCGTACAGCTGCAGATGAAGTTGGAAAAATCTTCTTGATCGCCGATGACAGGATCCAAGGAGCTGTATTTGATCTACCAGAGGAGATCGCGAAAGAGCTCCTAGAGAAAGATGTCCCCGAAGGCAACAGTTTATCCATGATAACAAAGTTACCTCCACTTCAAGATGACGGACCATCTAGTGATAACTACGGACGGTTCTCTAGCAGAGACAGGATGCCTAGAGGAGGAGGAGGTTCTAGAGGGTCAAGAGGCGGTAGAGGAGGATCATCACGAGGCCGTGATAGTTGGGGAGGTGATGATGACAGAGGTAGTAGAAGGAGCAGTGGTGGAGGAAGCAGCTGGTCCCGAGGTGGTAGTAGTTCCAGAGGAAGTTCTGATGATTGGTTGATCGGTGGCAGAAGTTCATCAAGCAGCAGAGCTCCTTCGCGGGAGAGAAGTTTTGGAGGTTCATGCTTCATTTGTGGGAAATCTGGACACAGGGCAACAGATTGTCCTGATAAGAGAGGATTTTAG

实施例2：拟南芥RNA解旋酶3转基因品系的获得

Trizol法提取野生型拟南芥的RNA，利用反转录试剂盒(天根)逆转录得到cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增出RNA解旋酶基因3，回收纯化PCR产物，PCR产物连接pENTR载体，25℃反应4h，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂于卡那抗性平板，37℃过夜培养，挑单菌落做菌检，挑出阳性克隆送公司测序，取测序成功的菌斑加入于3ml卡那抗性液体培养基过夜培养培养。离心收集菌体，利用小提试剂盒(天根)提取质粒，进行37℃酶切3h，跑琼脂糖胶，将线性化的质粒条带切胶回收，胶回收产物进行LR反应，25℃反应4h。连接产物转化DH5a。筛选阳性克隆，提质粒，至此就得到了拟南芥RNA解旋酶3转基因品系的阳性克隆质粒。利用农杆菌浸花法，将转基因阳性质粒转化农杆菌GV3101，将待转化植物倒置，使得花苞浸在菌液中。每颗植物浸泡1min，然后将植物直立放置在光照培养架上，待转化的植株长出成熟果荚后，收取种子后，干燥并春花种下去，等待苗子长到4周左右，提蛋白鉴定阳性转基因植株。将鉴定为阳性的植株单株收种子，保存为F0代。干燥春化后，种下去，为F1代。

实施例3：拟南芥RNA解旋酶突变品系以及在突变品系基础上进行RNA解旋酶3转基 因，其抗病毒性能出现差异

种植哥伦比亚野生型拟南芥Col-0(Col-0-wt)、RNA解旋酶突变品系拟南芥(rh3-4，其中rh3基因第九个内含子区引入T-DNA插入的突变体)以及在该突变品系基础上进行RNA解旋酶3转基因的拟南芥(302RH3)，等到4周苗龄时，进行芜菁花叶病毒(TurnipMosaicVirus，TuMV)的侵染。将TuMV野生型病毒的质粒转化GV3101感受态，阳性菌落摇菌，到菌体OD600≈0.8时，收集菌体，用注射液(500μL 1M MgCl₂，500μL 1M MES，50μL 0.15MAS，至50ml)将菌体重悬，测定菌体吸光度，至OD600＝0.5。在拟南芥叶片上注射菌液，通常注射第三轮叶片，注射完将叶片上多余的菌液吸走，将植物放在光照生长架上培养。大约2周左右，能够观察到新生的叶片出现斑驳褶皱的表型。

统计野生型植物(Col-0-wt)、突变品系(rh3-4)以及RH3转基因植物(302RH3)的病毒积累的程度。具体地，所述实验步骤如下：

1)使用TuMV GFP病毒侵染Col-0，rh3-4，302RH3植物，2周后获得发病植物；

2)只取发病部位的叶片，称重后进行液氮研磨。研磨后的粉末，1/3用于提取蛋白，1/3用于提取mRNA(热酚法)，1/3用于提取sRNA(Trizol法)；

3)TuMV CP蛋白检测

Western blot检测TuMV CP蛋白的积累。一抗为anti-TuMV CP，二抗为anti-Rabbit；

4)TuMV gRNA检测

提取的发病材料的mRNA，取5μg RNA，跑甲醛变性胶。跑完胶转膜，将mRNA转到Hybond N+膜。UV交联。用亚甲基蓝染色，作为rRNA内参。85℃热交联。

Northern blot检测TuMV gRNA，步骤如下：

①PCR扩增TuMV UK1的序列；使用random a Gene labeling system(Promega，U1100)，以PCR片段为模板，获得随机标记的探针；

其中，所述PCR扩增使用如下的引物：

TuMV CP正向引物：SEQ ID NO 3：CGAACTGACGGAGGACAAA；

TuMV CP反向引物：SEQ ID NO 4：TTCCATCCAAGCCGAACA)

②60℃预杂30min，加入上一步加入的探针，60℃过夜杂交，洗膜，压P屏，检测信号。

5)TuMV sRNA检测

做脲素胶，发病材料提取的sRNA，取10μg上样。跑完胶转膜，化学交联，85℃热交联。

Northern blot检测TuMV sRNA，步骤如下：

①PCR扩增TuMV UK1的序列；使用random a Gene labeling system(Promega，U1100)，以PCR片段为模板，获得随机标记的探针；

其中，所述PCR扩增使用如下的引物：

TuMV CI正向引物：SEQ ID NO 5：ACTCTCAATGATATAGAGGATG

TuMV CI反向引物：SEQ ID NO 6：TTGATGGTGAACTGCCTCAAG②37℃预杂30min，加入上一步加入的探针，37℃过夜杂交，洗膜，压P屏，检测信号。

U6做为内参。α-Tubulin为内参基因Tubulin的单克隆抗体(购买自BioEasy公司)，α-TuMV为TuMV CP的单克隆抗体；结果如图4所示，显示在RNA解旋酶3突变品系中，病毒RNA基因组积累量增加，RNA解旋酶3转基因品系病毒RNA基因组积累量降低，说明RNA解旋酶增强了植物的抗病毒功能。左侧为没有进行病毒侵染的对照组(Mock)，右侧为进行病毒侵染的实验组。病毒侵染的实验组中与野生型(Col-0WT)相比，RNA解旋酶3突变/转基因品系病毒RNA的积累量显著发生变化。可以看到野生型对照组相比，突变品系组植物病毒积累量显著增加，在RNA解旋酶3突变品系基础上进行RNA解旋酶3转基因品系组植物的病毒积累量显著降低，恢复至野生型水平，表型见图5，说明RH解旋酶3具有较高的抗病性能。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 一种RNA解旋酶3及其编码基因和应用

<130> DIC18110034

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 748

<212> PRT

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

Met Ala Ser Thr Val Gly Val Pro Ser Leu Tyr Gln Val Pro His Leu

1 5 10 15

Glu Ile Ser Lys Pro Asn Ser Lys Lys Arg Ser Asn Cys Leu Ser Leu

20 25 30

Ser Leu Asp Lys Pro Phe Phe Thr Pro Leu Ser Leu Val Arg Arg Thr

35 40 45

Arg Arg Ile His Ser Ser Ser Leu Leu Val Pro Ser Ala Val Ala Thr

50 55 60

Pro Asn Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Phe Lys Ser Leu Gly Leu Ser

65 70 75 80

Asp His Asp Glu Tyr Asp Leu Asp Gly Asp Asn Asn Asn Val Glu Ala

85 90 95

Asp Asp Gly Glu Glu Leu Ala Ile Ser Lys Leu Ser Leu Pro Gln Arg

100 105 110

Leu Glu Glu Ser Leu Glu Lys Arg Gly Ile Thr His Leu Phe Pro Ile

115 120 125

Gln Arg Ala Val Leu Val Pro Ala Leu Gln Gly Arg Asp Ile Ile Ala

130 135 140

Arg Ala Lys Thr Gly Thr Gly Lys Thr Leu Ala Phe Gly Ile Pro Ile

145 150 155 160

Ile Lys Arg Leu Thr Glu Glu Ala Gly Asp Tyr Thr Ala Phe Arg Arg

165 170 175

Ser Gly Arg Leu Pro Lys Phe Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu

180 185 190

Ala Lys Gln Val Glu Lys Glu Ile Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Leu Ser

195 200 205

Thr Val Cys Val Tyr Gly Gly Val Ser Tyr Thr Ile Gln Gln Ser Ala

210 215 220

Leu Thr Arg Gly Val Asp Val Val Val Gly Thr Pro Gly Arg Ile Ile

225 230 235 240

Asp Leu Ile Glu Gly Arg Ser Leu Lys Leu Gly Glu Val Glu Tyr Leu

245 250 255

Val Leu Asp Glu Ala Asp Gln Met Leu Ala Val Gly Phe Glu Glu Ala

260 265 270

Val Glu Ser Ile Leu Glu Asn Leu Pro Thr Lys Arg Gln Ser Met Leu

275 280 285

Phe Ser Ala Thr Met Pro Thr Trp Val Lys Lys Leu Ala Arg Lys Tyr

290 295 300

Leu Asp Asn Pro Leu Asn Ile Asp Leu Val Gly Asp Gln Asp Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Glu Gly Ile Lys Leu Tyr Ala Ile Ala Thr Thr Ser Thr Ser

325 330 335

Lys Arg Thr Ile Leu Ser Asp Leu Ile Thr Val Tyr Ala Lys Gly Gly

340 345 350

Lys Thr Ile Val Phe Thr Gln Thr Lys Arg Asp Ala Asp Glu Val Ser

355 360 365

Leu Ala Leu Ser Asn Ser Ile Ala Thr Glu Ala Leu His Gly Asp Ile

370 375 380

Ser Gln His Gln Arg Glu Arg Thr Leu Asn Ala Phe Arg Gln Gly Lys

385 390 395 400

Phe Thr Val Leu Val Ala Thr Asp Val Ala Ser Arg Gly Leu Asp Ile

405 410 415

Pro Asn Val Asp Leu Val Ile His Tyr Glu Leu Pro Asn Asp Pro Glu

420 425 430

Thr Phe Val His Arg Ser Gly Arg Thr Gly Arg Ala Gly Lys Glu Gly

435 440 445

Ser Ala Ile Leu Met His Thr Ser Ser Gln Lys Arg Thr Val Arg Ser

450 455 460

Leu Glu Arg Asp Val Gly Cys His Phe Glu Phe Ile Ser Pro Pro Thr

465 470 475 480

Val Gly Asp Leu Leu Glu Ser Ser Ala Asp Gln Val Val Ala Thr Leu

485 490 495

Asn Gly Val His Pro Asp Ser Ile Lys Phe Phe Ser Ala Thr Ala Gln

500 505 510

Lys Leu Tyr Glu Glu Lys Gly Thr Asp Ala Leu Ala Ala Ala Leu Ala

515 520 525

His Leu Ser Gly Phe Ser Gln Pro Pro Ser Ser Arg Ser Leu Leu Ser

530 535 540

His Glu Lys Gly Trp Val Thr Leu Gln Leu Ile Arg Asp Pro Thr Asn

545 550 555 560

Ala Arg Gly Phe Leu Ser Ala Arg Ser Val Thr Gly Phe Leu Ser Asp

565 570 575

Leu Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Glu Val Gly Lys Ile Phe Leu Ile Ala

580 585 590

Asp Asp Arg Ile Gln Gly Ala Val Phe Asp Leu Pro Glu Glu Ile Ala

595 600 605

Lys Glu Leu Leu Glu Lys Asp Val Pro Glu Gly Asn Ser Leu Ser Met

610 615 620

Ile Thr Lys Leu Pro Pro Leu Gln Asp Asp Gly Pro Ser Ser Asp Asn

625 630 635 640

Tyr Gly Arg Phe Ser Ser Arg Asp Arg Met Pro Arg Gly Gly Gly Gly

645 650 655

Ser Arg Gly Ser Arg Gly Gly Arg Gly Gly Ser Ser Arg Gly Arg Asp

660 665 670

Ser Trp Gly Gly Asp Asp Asp Arg Gly Ser Arg Arg Ser Ser Gly Gly

675 680 685

Gly Ser Ser Trp Ser Arg Gly Gly Ser Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp

690 695 700

Asp Trp Leu Ile Gly Gly Arg Ser Ser Ser Ser Ser Arg Ala Pro Ser

705 710 715 720

Arg Glu Arg Ser Phe Gly Gly Ser Cys Phe Ile Cys Gly Lys Ser Gly

725 730 735

His Arg Ala Thr Asp Cys Pro Asp Lys Arg Gly Phe

740 745

<210> 2

<211> 2247

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 2

atggcgtcga cggtaggagt tccatcacta taccaagttc ctcaccttga aatctccaaa 60

cccaattcca aaaagaggtc taattgttta tctttatctc tcgataagcc tttcttcact 120

cccttatctc ttgttcgtag aactcgtcgt atccattcct cttctcttct tgttccttct 180

gctgttgcta ctcctaattc tgttctcagt gaagaagctt tcaaaagtct tggtctttct 240

gaccatgacg aatatgacct tgacggcgac aacaacaacg ttgaagctga tgatggtgaa 300

gaactcgcta tctctaaact tagtttgcct caacgtcttg aagagtctct tgagaaacgt 360

ggtatcactc atctcttccc cattcagaga gctgtgttgg tacctgcact gcaaggaaga 420

gatattatag ctcgtgcaaa gacaggaact ggaaagactt tggcttttgg tattcctatc 480

attaaacgtc tcactgaaga agctggagac tacactgctt tcaggaggtc tggtcgtctt 540

cctaagttcc ttgtccttgc gccgacccga gagctggcta agcaagtgga gaaggagatt 600

aaggagtctg caccttattt gagcactgtt tgtgtgtatg ggggagtttc ttataccatt 660

cagcagagtg ctttaactcg tggtgttgat gttgttgttg gaactcctgg aagaatcatt 720

gatttgattg aaggaaggag tcttaaattg ggagaagttg agtatttggt acttgatgaa 780

gctgatcaga tgcttgctgt tgggtttgag gaggccgtgg aatcgattct tgagaatctt 840

ccaactaagc gacaaagtat gcttttctca gcaactatgc ctacttgggt taagaagttg 900

gcgaggaagt accttgacaa tcccttgaat attgatctgg ttggagacca agatgagaag 960

ctcgcagagg gtatcaaact ttatgcaatc gcaaccacat cgacatcaaa acgcactatt 1020

ctaagcgacc ttattacagt gtatgcgaag ggtggcaaga ccattgtttt tacccaaact 1080

aaaagagatg cagacgaagt ttctcttgca ttgtcaaaca gtatagctac cgaagcactt 1140

catggagata tatctcagca tcaaagagag agaacactca atgctttccg tcaagggaaa 1200

ttcaccgtat tagttgccac tgatgttgca tctcgtggac ttgacatccc gaacgtagat 1260

ctagttatcc actatgaact tcctaatgac ccagaaactt ttgtgcaccg ttctggtcgt 1320

actgggcgtg cagggaaaga aggctctgcc attctcatgc acaccagcag ccaaaagaga 1380

acagtgaggt ctctggagcg tgacgtaggc tgccattttg aattcattag cccaccaact 1440

gttggagact tgttggaatc gtcagcagac caagtggtgg ccactctaaa tggtgttcac 1500

cctgactcca taaagttttt ctcagcaact gctcaaaaac tatatgagga gaaaggaaca 1560

gatgctttag ctgcagctct agctcacctg agtggtttct ctcagccgcc ttcatcaaga 1620

tctctcctca gccatgagaa gggatgggtg actttgcaat tgatccgaga tccaacgaac 1680

gctagaggct ttctgtctgc gaggtctgtt actggttttc tttccgatct ttaccgtaca 1740

gctgcagatg aagttggaaa aatcttcttg atcgccgatg acaggatcca aggagctgta 1800

tttgatctac cagaggagat cgcgaaagag ctcctagaga aagatgtccc cgaaggcaac 1860

agtttatcca tgataacaaa gttacctcca cttcaagatg acggaccatc tagtgataac 1920

tacggacggt tctctagcag agacaggatg cctagaggag gaggaggttc tagagggtca 1980

agaggcggta gaggaggatc atcacgaggc cgtgatagtt ggggaggtga tgatgacaga 2040

ggtagtagaa ggagcagtgg tggaggaagc agctggtccc gaggtggtag tagttccaga 2100

ggaagttctg atgattggtt gatcggtggc agaagttcat caagcagcag agctccttcg 2160

cgggagagaa gttttggagg ttcatgcttc atttgtggga aatctggaca cagggcaaca 2220

gattgtcctg ataagagagg attttag 2247

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgaactgacg gaggacaaa 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccatccaa gccgaaca 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actctcaatg atatagagga tg 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgatggtga actgcctcaa g 21

Claims (6)

1.一种具有RNA解旋酶3生物学功能或活性的蛋白在制备具备改善的抗病毒性的转基因拟南芥中的应用；

其中，所述肽或蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2.一种编码具有RNA解旋酶3生物学功能或活性的蛋白的核苷酸序列在制备具备改善的抗病毒性的转基因拟南芥中的应用；

其中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

3.一种含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的重组载体在制备具备改善的抗病毒性的转基因拟南芥中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述载体为质粒载体。

5.一种遗传工程化宿主细胞在制备具备改善的抗病毒性的转基因拟南芥中的应用；

其中，所述宿主细胞使用含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的重组载体转化、转导或转染得到。

6.一种改善拟南芥抗病毒性能的方法，所述方法包括以下步骤：

将如SEQ ID NO: 1所示的蛋白、如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列、含有如SEQ IDNO: 2所示的核苷酸序列的重组载体或使用含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的重组载体转化、转导或转染得到的宿主细胞导入拟南芥或拟南芥组织并使其表达。

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