CN108715851B

CN108715851B - 一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用

Info

Publication number: CN108715851B
Application number: CN201810397344.9A
Authority: CN
Inventors: 刘晓春; 贺蒙; 唐海培; 李水生; 蒙子宁; 蔡春有; 李波; 林浩然
Original assignee: Hainan Chenhai Aquatic Co ltd; Yangjiang Polytechnic; Sun Yat Sen University
Current assignee: Hainan Chenhai Aquatic Co ltd; Yangjiang Polytechnic; Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108715851A

Abstract

本发明公开了一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了该斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。并进一步公开了包含该斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的表达载体，一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法及该方法获得的重组蛋白，以及该重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。

Description

一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用。

背景技术

刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein，AGRP)是由AgRP基因所编码，由下丘脑AgRP/NPY神经元产生的一种旁信号分子，又称之为刺鼠相关肽。AGRP与NPY在同一类神经元中共表达，起到了增加食欲、减少新陈代谢和能量消耗的作用。同时，AGRP是一种强效和长效的食欲刺激物质，在小鼠中单次注射后促进摄食的效应时间能达到7天以上。人和大鼠的AGRP均由132个氨基酸构成，而且具有非常高的保守型(81％)。研究结果显示AGRP的二级结构主要由自由螺旋和β-片层构成，其对于受热变性和酸降解具有很高的稳定性。核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)研究结果显示，AGRP末端结构由多个保守的半胱氨酸残基组成的5对二硫键维系，多个研究显示该结构是其发挥生理功能的重要区域。

AgRP基因主要在下丘脑和肾上腺高表达，在性腺、肾脏和肺低表达，储存在细胞内的分泌颗粒通过调节通路进行分泌。在小鼠中通过转基因过表达AGRP会造成食欲过盛，从而出现肥胖和高血糖的症状，揭示了AGRP在摄食和能量消耗调控方面的重要作用。在中枢神经系统，AGRP主要通过对黑皮质素受体(特别是MC3R和MC4R)的抑制作用而刺激食欲上升。虽然AGRP抑制黑皮质素受体信号的确切机制尚不清楚，但根据目前的研究结果，AGRP主要具有两种功能：抑制α-MSH与黑皮质素受体的结合的竞争性拮抗剂(competitiveantagonist)功能和直接抑制黑皮质素受体活性的反向激动剂(inverse agonist)功能。在外周组织中，AGRP主要在肾上腺表达。大鼠在饥饿状态下，肾上腺皮质AGRP短型异构体上调，同时下丘脑AGRP短型异构体也上调。肥胖人群和禁食大鼠体内血浆中AGRP水平也会上调。正因为如此，AGRP在摄食和能量代谢中的作用目前已被大多数的学者所肯定。

AGRP还能够通过调节下丘脑-垂体轴从而影响神经内分泌的功能。在大鼠中，脑腔注射AGRP会导致促甲状腺激素(TSH)以及血液循环中的T3、T4两种甲状腺激素水平的下降，从而使甲状腺功能受到抑制。尽管NPY对生殖的调控已被证实，但是有关其同源性物质AGRP及其递质，比如由AgRP神经元产生的GABA，对生殖方面的影响的信息很少，目前国外很多学者研究认为，AGRP通过下丘脑黑皮质素系统在生殖系统的调控过程中发挥了一定的作用。

斜带石斑鱼俗称青斑，是一种鲈形目鮨科鱼类，由于其具有肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快速等特点，近年来已经成为福建、广东、海南、台湾四省重要的海水养殖鱼类。在水产养殖领域，利用AGRP强效和长效的食欲刺激效果，能够从内分泌水平提高养殖鱼类摄食量，促进其生长，从而达到缩短养殖周期和降低养殖成本的目的。

发明内容

本发明的目的之一是提供斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其编码蛋白、含有所述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的表达载体。

本发明的目的还在于提供一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法以及由该方法制备获得的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白。

本发明的第三个目的在于提供上述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。

本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，它的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

所述斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的cDNA，其全长为432bp，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1。

本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白。

优选的，所述的寄主细胞是原核细胞或真核细胞。

进一步优选的，所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21。

本发明还提供了一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的步骤的方法制备。

本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：上述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂和鱼类饲料添加剂中的应用。

本发明的斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白可以用于制备鱼类新型促食剂和饲料添加剂，具有促进鱼类摄食和减少能量消耗的作用。

本发明具有以下优点：

(1)本发明利用生物信息学结合PCR技术，在斜带石斑鱼中克隆得到了摄食调控基因AgRP1，并构建了原核表达载体，其能够在大肠杆菌中大量表达斜带石斑鱼AgRP1基因所编码的蛋白；

(2)在本发明中斜带石斑鱼AGRP1在下丘脑表达丰富，并参与了下丘脑中包括摄食和能量消耗在内的多种生理功能的调控，丰富了鱼类摄食系统信号通路的理论，在促进鱼类摄食和新型饲料添加剂的开发等方面具有十分重要的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中斜带石斑鱼AgRP1基因的PCR扩增图；

图2是实施例1中将重组质粒转化入BL21感受态细胞后菌液PCR鉴定结果；

图3是实施例1中斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白表达和纯化的SDS-PAGE(a图)及Western Blot(b图)分析图，其中，M，蛋白分子量标准，A，菌体破碎后总蛋白，B，沉淀部分蛋白，C，上清部分蛋白，Western Blot所使用的抗体为His标签抗体；

图4是实施例1中不同浓度洗脱液洗脱条件优化，C，D，E，F泳道分别为PH8.0条件下洗脱液咪唑浓度为20mM、50mM、200mM、500mM的洗脱结果，A，B泳道为对照；

图5是AGRP1重组蛋白纯化后的SDS-PAGE检测结果，箭头所指为重组蛋白目的条带；

图6是实施例2中在人胚肾HKE-293T细胞系中进行的，斜带石斑鱼AGRP1对MC4R受体活性抑制作用的双荧光验证实验结果，A图为AGRP1重组蛋白对MC4R受体活性的直接抑制和对α-MSH与MC4R受体结合的竞争性拮抗效果的验证结果，各组之间显著性用不同字母标示；B图为不同浓度AGRP1重组蛋白对MC4R活性的影响；

图7是实施例3中AGRP1重组蛋白在体注射斜带石斑鱼实验结果，A图为注射不同浓度AGRP1重组蛋白后3h和6h，其同源基因AgRP2的表达变化情况；B图为注射不同浓度AGRP1重组蛋白后3h和6h，抑制摄食基因POMC的表达变化。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白的制备

1、斜带石斑鱼总RNA的提取

选取健康斜带石斑鱼4条，体长20-30cm，体重0.7-1kg，以冰浴麻醉约2min后，杀鱼取样，取其全部脑组织，采用Trizol试剂法抽提获得斜带石斑鱼脑组织总RNA，-80℃保存备用。

2、斜带石斑鱼AgRP1基因的克隆

(1)第一链cDNA的合成：

1)取出保存的斜带石斑鱼脑组织RNA 1μL，加入1μL的Oligo(dT)16(10mM)，混匀后置于70℃水浴5min；

2)冰上放置5min后，向EP管中先后加入dNTP Mixture(10mM)2μL、5×RT Buffer 4μL、Rnase抑制剂1μL(10U/μL)、Rnase-free ddH₂O 8μL、ReverTra Ace 1μL；

3)将EP管置于PCR仪中，按30℃10min，42℃60min，99℃5min，4℃5min程序后瞬时离心，反转录得到第一链的单链cDNA，于-20℃冰箱保存备用。

(2)以cDNA为模板的AgRP1基因克隆：

根据生物信息学中相关的序列比对和结构分析结果，在AgRP1基因的cDNA序列(如SEQ ID NO：3所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)中去除编码20个氨基酸的信号肽的序列，以剩下的序列在两端设计特异性引物，如下：

AgRP1-RT-F:5'-CGCGAATTCCTGGTTCATGGAAA-3'(SEQ ID NO:5)(下划线标记部分为内切酶EcoR1的识别序列)；

AgRP1-RT-R:5'-CCGCTCGAGTCAGGTGCGTCTGGGCGGG-3'(SEQ ID NO:6)(下划线标记部分为内切酶Xho1的识别序列)。

以第一链cDNA为模板，采用上游引物AgRP1-RT-F和AgRP1-RT-R进行PCR扩增，获得不含信息肽的AgRP1基因，扩增片段大小为369bp(如图1所示)，扩增序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，切胶回收目的片段。将纯化后的目的片段连接至PGEMT-easy载体，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，测序结果经BLAST比对分析，比对结果表明目的产物确为AgRP1基因。

3、AgRP1基因原核表达载体的构建

提取含有AgRP1基因的PGEMT-easy质粒，分别经过内切酶EcoR1和Xho1的双酶切过夜，获得目的片段，将目的片段连接到经EcoR1和Xho1双酶切线性化过的PET32a载体，PET32a为带有His标签蛋白的原核表达载体。连接过程中采用连接酶T4DNA Ligase，温度4℃，连接过夜。

将上述连接产物转化进入扩增宿主-大肠杆菌DH5α的感受态细胞，筛选培养，将获得的阳性单克隆菌落进行菌液PCR验证，PCR扩增的片段大小与目的片段大小相似，约369bp，并将该阳性单菌落进行测序验证，测序结果与目的片段的序列一致，说明成功构建了斜带石斑鱼AgRP1的原核重组表达载体：PET32a-AgRP1。

4、AgRP1基因的原核表达及纯化

(1)转化表达宿主：

提取构建好的重组表达载体质粒(PET32a-AgRP1)，将质粒转化进入表达宿主-大肠杆菌BL21的感受态细胞，用含氨苄青霉素(Amp)的培养基，进行筛选培养，挑取阳性单克隆菌落，进行菌液PCR验证(如图2所示)，PCR扩增的片段大小与目的片段大小相似，约369bp。验证正确后，以含Amp的培养基过夜扩大培养该阳性菌落，取菌液加入甘油，按25％甘油终浓度保存在-80℃冰箱中，进行菌种保存。

(2)重组蛋白的诱导表达：

将含有重组表达载体(PET32a-AgRP1)的大肠杆菌BL21按1：50接种至含抗性的LB培养基培养3h，当菌液OD₆₀₀值介于0.4～0.6之间时，取少量诱导前的菌液，作为后续实验的对照。剩下的菌液加入终浓度为1M的IPTG进行诱导培养，诱导培养后收集菌液，离心获得菌体，加入1×Ni-NTA结合缓冲液重悬菌体，此时取20μL菌体重悬液，作为后续实验对照。将剩下的菌体重悬液超声波破碎，离心，将上清和沉淀分开。

分别将诱导前和诱导后的总菌体、上清和沉淀加入蛋白Loading buffer，混匀，沸水浴中煮5min，分别取10μL进行SDS-PAGE和western blot检测，检测结果如图3所示。

图3(a图)可以看出，经IPTG诱导后，AGRP1重组蛋白在上清和沉淀中都有表达，而且可溶性表达量更高；而从图3的western blotting检测结果(b图)中可看出，相比对照组，使用1M IPTG诱导后明显能看到AGRP1重组蛋白大量表达。

(3)重组蛋白的纯化、脱盐及冻干：

将诱导表达后的菌体超声破碎，离心，弃沉淀，将上清经孔径0.45微米的滤膜过滤备用。

镍柱准备，往柱子内加入2mL的Ni-NTA His-Bind，再加10mL水过柱；再加入10mL的1×Ni-NTA结合缓冲液平衡柱子。

挂柱，往50mL离心管中加入结合缓冲液，再加入菌体上清液，盖上盖子，封口膜封口，置于冰上，缓慢摇匀、亲和吸附1小时。将摇匀的融合液过镍柱，收集穿过液，再重复过镍柱两次。

漂洗和洗脱，重组蛋白挂柱后，先用1×Ni-NTA漂洗液漂洗，再分别以20mM、50mM、200mM、500mM浓度的咪唑洗脱液洗脱，对不同浓度咪唑洗脱液洗脱下来的物质进行SDS-PAGE检测，检测结果显示重组蛋白能被四种不同浓度咪唑洗脱下来，其中咪唑浓度为200mM时，回收率最高(如图4红色箭头所示)，故选用200mM的咪唑洗脱液用于洗脱获得纯化重组蛋白。

基于上述探索出的最优的诱导培养条件、最适浓度的咪唑洗脱液等，再进行大量表达、纯后获得大量重组蛋白，并结合SDS-PAGE进行检测，检测结果如图5所示。AGRP1重组蛋白的分子量约为33kDa，如图5中所示。

将纯化后的重组蛋白进行脱盐，先用0.02M的PB缓冲液进行清洗和平衡柱子。加入样品，收集穿过液。待样品完全进入下端柱子后，再加入PB缓冲液洗脱，收集洗脱液，即为脱盐后的重组蛋白。

将脱盐的重组蛋白进行冻存：将含有目的蛋白的收集液置于合适大小的EP管中，用封口膜封口，并在封口膜上扎孔，以便冻存时水分能从孔中散失。管子竖直放于干冰迅速冻成冰状，放于-80℃冰箱。隔天，将-80℃保存的管子置于调试完好的冻存机挂瓶内，开始冻存。冻存时间视水分散失快慢而定，一般8h以上或者过夜。将冻存好的、含有目的蛋白的管子取下迅速放于-80℃冰箱保存备用

实施例2 AGRP1重组蛋白药理学性质检测

在人胚肾细胞系HKE-293T中，通过转染真核表达载体的方法，在细胞系中表达斜带石斑鱼MC4R受体。再使用AGRP1重组蛋白和α-MSH(Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH₂)作为刺激剂，加入细胞培养基中孵育细胞，其中1组为不表达MC4R受体的空白对照，2组为表达MC4R受体但不加刺激剂，3组为表达MC4R受体并用α-MSH刺激，4组为表达MC4R受体并同时用α-MSH和AgRP1重组蛋白刺激，5组为表达MC4R受体并仅用AGRP1重组蛋白刺激。孵育24h后，收集并裂解细胞，利用Dual-Luciferase双荧光素酶报告系统(Promega，E1910)检测MC4R受体的活性。

检测结果如图6所示。从图6(A图)的检测结果可获知，AgRP1重组蛋白能直接显著抑制MC4R活性，并能竞争性拮抗α-MSH对MC4R的激动效果；图6(B图)结果说明AGRP1重组蛋白对MC4R的直接抑制效果具有剂量依赖性，其有效工作浓度为10^-7mol/L以上。

实施例3 AGRP1重组蛋白对摄食相关因子的调控

利用两种浓度(1000ng/g体重和100ng/g体重)AGRP1重组蛋白对斜带石斑鱼进行腹腔注射，结果发现AGRP1重组蛋白可以显著提升其同源基因AgRP2的表达量(图7中A图)，并引起能抑制摄食的POMC基因表达下调(图7中B图)，从基因表达水平说明斜带石斑鱼AGRP1重组蛋白具有促进摄食的功能。

本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。

序列表

<110> 中山大学

海南晨海水产有限公司

阳江职业技术学院

<120> 一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> DNA

<213> 刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein)

<400> 1

ctggttcatg gaaacatcca gctggatgat ggtccggccg ccgcccgccg caccgacacc 60

tcctacctgt cagacattgc agagagaagc cacgcccccg accccatgca ggagcccgcc 120

ctcctgcctg ttgattcagt ggaggatcac tacctgatgg acacagcgtc ctacgatgag 180

gactcgtcag cagccctgca gcttcagggt cgagccatgc gttcatcgcg acgctgcatc 240

ccccaccagc agtcctgtct gggttaccca ctgccctgct gtgaccgctg tgacacctgc 300

tactgccgct tcttcaatgc catctgctac tgccgccgcg ttggccacga ttgcccgccc 360

agacgcacc 369

<210> 2

<211> 123

<212> PRT

<213> 刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein)

<400> 2

Leu Val His Gly Asn Ile Gln Leu Asp Asp Gly Pro Ala Ala Ala Arg

1 5 10 15

Arg Thr Asp Thr Ser Tyr Leu Ser Asp Ile Ala Glu Arg Ser His Ala

20 25 30

Pro Asp Pro Met Gln Glu Pro Ala Leu Leu Pro Val Asp Ser Val Glu

35 40 45

Asp His Tyr Leu Met Asp Thr Ala Ser Tyr Asp Glu Asp Ser Ser Ala

50 55 60

Ala Leu Gln Leu Gln Gly Arg Ala Met Arg Ser Ser Arg Arg Cys Ile

65 70 75 80

Pro His Gln Gln Ser Cys Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Cys Cys Asp Arg

85 90 95

Cys Asp Thr Cys Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Ile Cys Tyr Cys Arg

100 105 110

Arg Val Gly His Asp Cys Pro Pro Arg Arg Thr

115 120

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein)

<400> 3

atgttcggct ctgtgctgct ctgctgcatc tcctttagtc tgctgcgtct ctcttcttct 60

ctggttcatg gaaacatcca gctggatgat ggtccggccg ccgcccgccg caccgacacc 120

tcctacctgt cagacattgc agagagaagc cacgcccccg accccatgca ggagcccgcc 180

ctcctgcctg ttgattcagt ggaggatcac tacctgatgg acacagcgtc ctacgatgag 240

gactcgtcag cagccctgca gcttcagggt cgagccatgc gttcatcgcg acgctgcatc 300

ccccaccagc agtcctgtct gggttaccca ctgccctgct gtgaccgctg tgacacctgc 360

tactgccgct tcttcaatgc catctgctac tgccgccgcg ttggccacga ttgcccgccc 420

agacgcacct ga 432

<210> 4

<211> 143

<212> PRT

<213> 刺鼠相关蛋白(Agouti-related protein)

<400> 4

Met Phe Gly Ser Val Leu Leu Cys Cys Ile Ser Phe Ser Leu Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Ser Ser Leu Val His Gly Asn Ile Gln Leu Asp Asp Gly Pro

20 25 30

Ala Ala Ala Arg Arg Thr Asp Thr Ser Tyr Leu Ser Asp Ile Ala Glu

35 40 45

Arg Ser His Ala Pro Asp Pro Met Gln Glu Pro Ala Leu Leu Pro Val

50 55 60

Asp Ser Val Glu Asp His Tyr Leu Met Asp Thr Ala Ser Tyr Asp Glu

65 70 75 80

Asp Ser Ser Ala Ala Leu Gln Leu Gln Gly Arg Ala Met Arg Ser Ser

85 90 95

Arg Arg Cys Ile Pro His Gln Gln Ser Cys Leu Gly Tyr Pro Leu Pro

100 105 110

Cys Cys Asp Arg Cys Asp Thr Cys Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Ile

115 120 125

Cys Tyr Cys Arg Arg Val Gly His Asp Cys Pro Pro Arg Arg Thr

130 135 140

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcgaattcc tggttcatgg aaa 23

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcgagt caggtgcgtc tgggcggg 28

Claims

1.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1的编码蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种表达载体，其特征是：所述表达载体含有权利要求1所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1。

4.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的制备方法，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的寄主细胞是原核细胞或真核细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21。

7.一种斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白，包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白的步骤的方法制备。

8.权利要求7所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备具有促进摄食功效的鱼类促食剂中的应用。

9.权利要求7所述的斜带石斑鱼摄食调控相关基因AgRP1重组蛋白在制备鱼类饲料添加剂中的应用。