CN104212807A - 斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用 - Google Patents

斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现orexin-A基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能。在发现糖代谢功能的基础上，本实验室利用大肠杆菌原核表达系统获得了大量粗提级别的重组石斑鱼orexin-A，并将其添加到石斑鱼饲料中进行生理实验研究其对石斑鱼生长的影响；利用本发明可以获得来源稳定、成本低廉的石斑鱼orexin-A重组蛋白，并进一步制备适合海水鱼类使用的鱼类促生长剂或添加剂。

Description

斜带石斑鱼 orexin-A 在调控石斑鱼糖代谢中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用。具体应用为将石斑鱼orexin-A用于制备鱼苗苗种促生长剂或饲料添加剂。
背景技术
斜带石斑鱼orexin-A （又称为食欲肽）是由43个氨基酸组成的蛋白质。Orexin是1998年在哺乳动物中发现的新型下丘脑神经肽，分为orexin-A和orexin-B两种，是来源于同一个orexin前体信使RNA经过不同剪接、翻译后的产物。斜带石斑鱼Orexin-A含有一对二硫键，由第7位与第14位的半胱氨酸构成，蛋白大小约为4.7Kda，其序列与结构与哺乳动物orexin-A类似，哺乳动物orexin-A由33个氨基酸及两对链内二硫键构成，蛋白大小约为3.6kda。近年来，鱼类的orexin-A相继被克隆出来，其中包括斜带石斑鱼、鳟鱼、鳕鱼、罗非鱼、青鳉及斑马鱼等，在基因序列与氨基酸序列的同源性上，斜带石斑鱼orexin-A与其他的鱼类的同源性高于哺乳动物，表现出在鱼类中较高的保守性。
目前，对于鱼类orexin-A功能及应用的研究很少，对于哺乳动物及鱼类中的orexin-A研究主要集中在orexin-A对摄食、体重的调控及睡眠觉醒的调控方面，哺乳动物中近年来已经陆续有研究表明orexin-A可以调控机体代谢，而在鱼类研究中针对orexin-A对于糖代谢调控方面的研究则未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效促进石斑鱼苗种生长的饵料添加剂的缺陷，提供斜带石斑鱼orexin-A基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。
本发明的另一个目的是提供斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促生长剂或饲料添加剂中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
斜带石斑鱼orexin-A基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。本发明通过研究发现，用人工合成超纯级别重组斜带石斑鱼orexin-A进行腹腔注射斜带石斑鱼，结果展示，重组斜带石斑鱼orexin-A以葡萄糖依赖性刺激石斑鱼的糖代谢。
本发明用于表达斜带石斑鱼orexin-A的基因片段是以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于斜带石斑鱼下丘脑cDNA上的前体orexin-A片段。按照上述的斜带石斑鱼orexin-A重组蛋白基因序列，它正好是斜带石斑鱼orexin-A前体基因139bp至267bp（相当于1位至43位氨基酸）的片段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1~2所示。
本发明通过研究发现：斜带石斑鱼orexin-A基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1或glut-4的表达量。所以，本发明还保护斜带石斑鱼orexin-A基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1或glut-4表达量中的应用。
本发明提供斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼鱼苗苗种促生长剂或饲料添加剂中的应用。本发明将高效表达并进行粗提纯的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗，实验结果展示：饲料中添加重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白能够显著性的促进石斑鱼鱼苗的生长。
石斑鱼是海洋珊瑚礁鱼类,属鮨科(Serranidae)，石斑鱼属(Epinephelus)，有30多种。石斑鱼是一种名贵的海水鱼类，具有极高的经济价值和营养价值。石斑鱼的苗种培育是养殖生产持续发展的关键，但目前在石斑鱼人工养殖中还没有一种能有效促进其苗种生长的饵料添加剂。
一种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂，所述促生长剂或饲料添加剂中含有有效剂量的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白。
本发明的有益效果是：
本发明通过研究发现orexin-A基因对石斑鱼糖代谢具有调控功能，具体为斜带石斑鱼orexin-A基因可以以葡萄糖依赖的特性刺激上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1或glut-4的表达量。所以，将orexin-A蛋白作为良好的添加剂加入饲料中，显著性的促进石斑鱼鱼苗的生长。
附图说明
图1.以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板的orexin-A基因中间片段PCR扩增产物的凝胶电泳分析图，其中：M. 分子量标准；1. PCR扩增产物。
图2.重组质粒PCR和酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中：M1、M2. 分子量标准；1. PCR鉴定；2. BamH I与Hind III双酶切鉴定。
图3.重组斜带石斑鱼orexin-A基因表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳图谱，其中M是蛋白分子量，泳道1~4是不同批次的诱导后表达产物，泳道5~6是未诱表达产物。
图4.重组斜带石斑鱼orexin-A基因表达产物的Western Blot图谱，其中泳道1~6是不同批次诱导后表达产物。
图5.重组斜带石斑鱼orexin-A飞行时间质谱MS/MS检测一级质谱结果。
图6.重组斜带石斑鱼orexin-A飞行时间质谱MS/MS检测二级质谱结果。
图7.对斜带石斑鱼腹腔注射orexin-A对肝脏组织glut-1表达量的影响。
图8.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肝脏组织glut-1表达量的影响。
图9.对斜带石斑鱼腹腔注射orexin-A对肝脏组织glut-4表达量的影响。
图10.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肝脏组织glut-4表达量的影响。
图11.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A对肌肉组织glut-1表达量的影响。
图12.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肌肉组织glut-1表达量的影响。
图13.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A对肌肉组织glut-4表达量的影响。
图14.对斜带石斑鱼腹腔共注射orexin-A与葡萄糖对肌肉组织glut-4表达量的影响。
图15.orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼体重的影响。
图16.orexin-A蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼肝、肌糖原的影响。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
实施例 1 ：斜带石斑鱼 orexin-A 基因的合成与表达载体的构建
根据已发表的石斑鱼前体orexin的cDNA序列，以与斜带石斑鱼下丘脑的cDNA全序列为引物设计模板，设计合成一对特异性引物并且加入了保护碱基，上游引物F的序列为：5’- CGGGATCCGCACAGCGTGTCTGAGTGC-3’，下游引物R的序列为：5’- CCCAAGCTTCAGGGTGAGAATGCCAGC-3’。PCR反应是以斜带石斑鱼下丘脑总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增orexin-A序列，反应条件为：95℃预变性5分钟；下边为38个循环，分为95℃变性30秒，58℃退火30秒， 72℃延伸15秒，共40个循环； PCR扩增产物的电泳鉴定图见图1。从图1可见第一次PCR扩增了一段长约150bp的序列。将目的条带用E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit回收。
质粒pET22b+与orexin-A PCR胶回收产物经限制酶BamH I与Hind III双酶切后，酶切产物用E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit回收。胶回收后的orexin-A基因片段与载体片段按3:1混合，用MBI T4连接酶22℃连接16小时后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌DH5α中，筛选具氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约5.4kb的重组质粒，用限制酶BamH I与Hind III双酶切重组质粒，得到150bp和5.4kb的两个片段，大小分别与斜带石斑鱼orexin-A基因和表达载体pET22b+大小相同，证明斜带石斑鱼orexin-A基因已克隆入大肠杆菌表达载体pET22b+中，将重组质粒pET22b-orexin-A用pET22b的一对通用引物进行序列测定，测序结果与Genebank的序列进行比较，结果表明克隆的PCR产物是斜带石斑鱼orexin-A基因，重组质粒命名为pET22b-orexin-A。质粒构建与酶切分析图见图2。
实施例 2
高效表达斜带石斑鱼 orexin-A 的大肠杆菌重组株 pET22b-orexin-A-Origami 的构建
CaCl2法将pET22b-orexin-A转化Origami 2(DE3)，在含氨苄青霉素、链霉素及四环素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含pET22b-orexin-A的重组转化子pET22b-orexin-A-Origami。
实施例 3 ：
利用大肠杆菌基因工程菌 pET22b-orexin-A-Origami 生产重组斜带石斑鱼 orexin-A ：挑取大肠杆菌基因工程菌pET22b-orexin-A-Origami单菌落接种在含有100ug/ml氨苄青霉素、50ug/ml链霉素、25ug/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，200转/分培养过夜，次日按1:50接种量接种于适当体积的相同培养基中，37℃培养至A600为0.5～0.6，加入IPTG（终浓度为0.8mmol/l）和20％葡萄糖（终浓度为0.2％），于37℃诱导培养6小时后收菌。合成的斜带石斑鱼胚胎期orexin-A在大肠杆菌基因工程菌pET22b-orexin-A-Origami中已获得高效表达。
取少量细胞加2×电泳上样缓冲液，煮沸5分钟后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳。结果见图9，显示经诱导的pET22b-orexin-A-Origami在约7kD的位置上出现一条新的蛋白带，未诱导的pET22b-orexin-A-Origami不出现此带，证明斜带石斑鱼胚胎期orexin-A已在pET22b-orexin-A-Origami中诱导表达，见图3。
将重组斜带石斑鱼胚胎期orexin-A采用免疫印迹（Western blot）方法进行免疫活性鉴定。一抗为兔抗His标签单克隆抗体，二抗为羊抗兔IgG-AP。结果见图4，显示兔抗His标签单克隆抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合orexin-A蛋白。
将SDS-PAGE上的蛋白进行点靶后进行时间飞行质谱MS/MS检测，检测结果表明目标蛋白与预期蛋白完全匹配，见图5、6。结合pET22b-orexin-A重组子的DNA测序结果，证明得到的蛋白是重组斜带石斑鱼orexin-A。
实施例 4
用人工合成超纯级别重组斜带石斑鱼 orexin-A 进行腹腔注射斜带石斑鱼并测定 orexin-A 对石斑鱼糖代谢调控功能的检测。
实验用石斑鱼驯养于循环海水养殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分别进行饱食投喂，驯养两周，在注射实验进行前，对实验用鱼进行饥饿3天处理。对于orexin-A注射组，实验鱼随机分成4组，每组44条，分别注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、1000ng/g B.W.的OXA，OXA用PBS稀释，对照组0ng/g B.W.注射PBS。每组注射后0h、2h、4h、6h取肝脏、肌肉（白肌），液氮速冻，保存于-80℃备用。对于orexin-A+葡萄糖注射组，实验鱼随机分成4组，每组44条，分别注射0ng/g B.W.、10ng/g B.W.、100ng/g B.W.、 1000ng/g B.W.的OXA，OXA用0.002 g/g的葡萄糖（PBS溶解）溶液稀释，对照组0ng/g B.W.注射0.002 g/g B.W. 的葡萄糖。每组注射后0h、2h、4h、6h取肝脏、肌肉（白肌），液氮速冻，保存于-80℃备用。
所取样本参照Trizol Reagent(Invitrogen, Inc.)说明书进行RNA提取，参照Toyobo FSK-100试剂盒说明书进行反转录，参照Toyobo SYBR-Green说明书进行实时荧光定量PCR检测相关基因的表达量变化。试验结果如图7、8、9、10、11、12、13、14。Orexin-A在肝脏、肌肉中均以葡萄糖依赖的特性刺激葡萄糖转运蛋白glut-1，glut-4的表达量上调。
实施例 5
orexin-A 蛋白作为饲料添加剂投喂斜带石斑鱼鱼苗对石斑鱼生长特性的影响
实验用斜带石斑鱼购自广东省大亚湾养殖示范基地，共480尾，体重平均为50g，体长平均15cm。驯养于循环海水养殖池中，自然光照，每天早7:00和晚6:00分别进行饱食投喂，驯养两周。驯化完成后，条件与驯化时期相同，在投喂前进行蛋白喷洒，使蛋白均匀喷洒到饲料表面，投喂前后进行饲料称重记录。长期投喂添加重组Orexin-A的饲料对斜带石斑鱼体重的影响见图15，对照组投喂喷洒灭菌超纯水的常规含糖饲料，实验组在常规含糖饲料的基础上添加不同剂量的重组Orexin-A，实验连续投喂6周，所得数据用标准差±标准误来表示（n=40），标记星号表示实验组与对照组相比产生的显著性差异水平，显著性结果通过单因素方差分析得到，采用Duncan分析方法（＊P<0.05）。统计结果通过SPSS19.0软件分析得到。
长期投喂添加重组Orexin-A的饲料对斜带石斑鱼血糖和肝肌糖原的影响见图16，对照组投喂喷洒灭菌超纯水的常规含糖饲料，实验组在常规含糖饲料的基础上添加不同剂量的重组Orexin-A，实验连续投喂6周后取血清、肝脏、肌肉样本分析血糖和肝肌糖原含量。所得数据用标准差±标准误来表示（n=40），标记星号表示实验组与对照组相比产生的显著性差异水平，显著性结果通过单因素方差分析得到，采用Duncan分析方法（＊P<0.05）。统计结果通过SPSS19.0软件分析得到。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 斜带石斑鱼orexin-A在调控石斑鱼糖代谢中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> Orexin-A基因片段序列
<400> 1
cacagcgtgt ctgagtgctg cagacaacca cctcgcaatt gtcgcctcca tgtgttgctt 60
tgtcgctctg gcagcaaaaa tctgggggga acgctcacag gagacgctgc tgctggcatt 120
ctcaccctg 129
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> Orexin-A基因片段编码氨基酸序列
<400> 2
His Ser Val Ser Glu Cys Cys Arg Gln Pro Pro Arg Asn Cys Arg Leu
1 5 10 15
His Val Leu Leu Cys Arg Ser Gly Ser Lys Asn Leu Gly Gly Thr Leu
20 25 30
Thr Gly Asp Ala Ala Ala Gly Ile Leu Thr Leu
35 40
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 上游引物F
<400> 3
cgggatccgc acagcgtgtc tgagtgc 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 下游引物R
<400> 4
cccaagcttc agggtgagaa tgccagc 27

Claims (5)

1.斜带石斑鱼orexin-A基因在调控石斑鱼糖代谢中的应用。
2. 斜带石斑鱼orexin-A蛋白在制备石斑鱼苗种促生长剂或饲料添加剂中的应用。
3.一种石斑鱼种苗促生长剂或饲料添加剂，其特征在于，所述促生长剂或饲料添加剂中含有有效剂量的重组斜带石斑鱼orexin-A蛋白。
4.斜带石斑鱼orexin-A基因在上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1或glut-4表达量中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，orexin-A基因是以葡萄糖依赖的特性刺激上调肝脏或肌肉中葡萄糖转运蛋白glut-1或glut-4的表达量。
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