CN101113171A

CN101113171A - 一种用以增加动物摄食量的胜肽

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Publication number: CN101113171A
Application number: CNA2006101039076A
Authority: CN
Inventors: 吴金洌; 陆振冈; 宋嘉轩
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-07-26
Filing date: 2006-07-26
Publication date: 2008-01-30

Abstract

本发明关于一种用以增加动物摄食量的胜肽，该胜肽具有如SEQ ID NO：1所示的胜肽序列。本发明的胜肽可用以有效增加动物的食欲，以提升其摄食量，藉以促进该动物生长，使该动物的肉质更为肥美，并增加养殖的产量。

Description

一种用以增加动物摄食量的胜肽

技术领域

本发明是关于一种用以增加动物摄食量的诱食剂，特别是关于一种用以增加动物摄食量的胜肽。

背景技术

养殖业为一固有产业，在全世界均扮演重要的角色，这是因为它和人们的生活息息相关。养殖业主要的贡献是为提供人们丰富多样的食物选择，以及优良的蛋白质来源。近年来，为了顺应时代的潮流，养殖业逐渐朝高科技产业发展。

养殖业中，水产养殖业占了重要的部分。习知水产养殖业的水生动物中，除了少部分为观赏用途外，大多数为食用用途。养殖业者于养殖时，首要关心的是如何使所养殖的水生动物保持良好的健康状态，以及如何增加其肉质的肥美度。而想要达成此目的，首要的条件为水生动物需要具有良好的食欲。

然而，放养密度、环境变化及性别成熟等压力因子都可能影响水生动物的食欲。当所饲养的水生动物出现厌食的情况时，通常会造成水生动物生长的迟缓(sluggishness)与死亡率的上升等现象，进而造成养殖产量下降。

以石斑鱼为例，由于石斑鱼肉质细致且味道鲜美，已成为筵席上的最佳菜肴，因而受到水产养殖业者的喜爱。石斑鱼在台湾的养殖发展已有二十余年，其中以点带石斑(Epinephelus coioides)、马拉巴石斑(E.malabaricus)、鞍带石斑(E.lanceolatus)，及棕点石斑(E.fuscoguttatus)等鱼种为养殖的大宗。但是，石斑鱼的饲养相当困难，这系因为石斑鱼的摄食量不但会受到前述压力因子的影响，而且其嘴形也较一般鱼种小，并缺乏保存内生性营养(endogenous nutrition)的能力，加上开始摄食的速度较慢等因素所致。故提高石斑鱼的食欲为石斑鱼养殖重要的一环。

为增加水生动物的食欲，即有人提出通过改变喂食时间来增加摄食量的方法，但此种方法对水生动物的食欲并无太显著的影响。另外，亦有人提出通过控制环境因子，如光照期(photoperiod)(Bolliet et al.，2001)及温度(Talbot etal.，1999)等，来增进水生动物摄食量的方法。此种方法虽可提高部分水生动物的摄食量，但控制光照期及温度，需要特殊的设备，这会使得饲养的成本提高，此方式并不符合简便经济的原则。

习知水生动物食欲是藉由脑部与周边讯号的交互作用来进行调控。脑部(特别是海马回)会产生刺激食物摄取(即，促食(orexigenic))或抑制食物摄取(即，厌食(anorexigenic))的重要参与者(actors)。为此，找出水生动物脑中刺激食物摄取的因子，藉由该因子来增加水生动物的摄食量应为一可行的方法。

发明内容

为解决前述习知技术的问题，本发明的目的即在于提供一种用以增加动物摄食量的胜肽，藉以提高养殖的动物的摄食量，进而增加养殖产量。

根据本发明所指出的用以增加动物摄食量的胜肽，其包含一如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

本发明的另一目的是为提供一种用以增加动物摄食量的组合物，其包含一胜肽片段，以及一药理上可接受的载物，其中该胜肽片段具有如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。

本发明前述的动物，可为畜产动物或水生动物，当为畜产动物时，较佳者为牛、羊、鸡或猪，更佳者为鸡。当为水生动物时，较佳者为鱼类，更佳者为养殖鱼类。在此所称的养殖鱼类系指可藉由人工饲养的鱼类，较佳为水产养殖业者所养殖的鱼类。作为前述的养殖鱼类，在此可举出的例子，包含石斑鱼(grouper)、海鲡(cobia)、鲷鱼(seabream)、比目鱼(halibut)、鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、鲶鱼(catfish)、鲤鱼(carp)、金鱼(goldfish)、吴郭鱼(tilapia)与斑马鱼(zebrafish)等，但并不仅限于此。

由于本发明的胜肽为一种神经胜肽Y(neuropeptide Y，NPY)，这是一种广泛分布于中心及周边神经系统中的神经传递物质(neurotransmitter)。因此，本发明中的胜肽片段可取自天然的动物尤其是水生动物体中，或以习知的化学合成法合成，也可以用习知的分子生物学方法制备。可知，NPY系属于G蛋白0耦合接受器超级家族(G-protein-coupled receptor superfamily)的Y接收器(Y receptor)的调控，经由动物的肌肉、心脏、肾脏、眼睛及脑中的血管收缩(vasoconstriction)作用，参与该动物的生长、繁殖、性别转换(sex reversal)及血压调控等过程。此外，NPY能够影响动物体内的能量平衡以及生热作用(thermogenesis)。综上所述，习知的研究结果与公开的文献中仅指出NPY和动物体的生长、繁殖、能量平衡及生热作用的可能的关联性，但并未揭示NPY和动物的食欲调控的任何相关可能性。

本发明的又一目的是提供一种用以编码如前述的用以增加动物摄食量的胜肽的核苷酸片段，其具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明的又一目的是提供一种用以筛选能增加动物摄食量的诱食剂的方法，其步骤包含：(i)将该诱食剂与一饲料混合，藉以获得一混合物；(ii)对该动物投予该混合物；(iii)检测该动物体内如SEQ ID NO：1所示的胜肽片段的表现量；以及(iv)以该胜肽片段的表现量高低来判断该诱食剂对该动物摄食的影响。

可应用于本发明前述步骤(iii)中，该胜肽片段的检测方法的种类在此并没有特别的限制。习知技艺者可轻易的藉由任何习知的方法检测该胜肽片段的表现量，例如胶体电泳、西方墨点法、免疫反应法...等，但并不仅限于此；或是藉由检测能编码该胜肽片段的mRNA的表现量来判定，作为前述的mRNA的序列，例如由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列所转录而成的序列。前述的mRNA表现量的检测法，例如北方墨点法，但并不仅限于此。

本发明的又一目的为提供一种增加动物摄食量的方法，其步骤包含：(1)提供一诱食剂，该诱食剂包含如SEQ ID NO：1所示的胜肽；(2)提供一动物；以及(3)将该诱食剂投予至该动物的体内。该诱食剂可进一步包含一药理上可接受的载物。

前述的胜肽可取自天然的动物尤其是水生动物体中，或以众所周知的化学合成法合成，亦可以用习知的分子生物学方法制备，方法如下：(a)提供如SEQID NO：2所示的核苷酸片段；(b)提供一表现载体；(c)将该核苷酸片段与该表现载体重组为一重组表现载体；(d)将该重组表现载体送入宿主细胞中；以及(e)使该宿主细胞表现该胜肽，该宿主细胞可以系E.coli、酵母菌及动物细胞，但不仅限于此。

以E.coli为例，可选定E.coli系统的表现质体后，再选定该表现质体中适当的限制酶切位(restriction enzyme site)，以该限制酶剪切来表现质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将前述经限制酶剪切后的表现质体及核苷酸片段进行接合反应(ligation)。接着将含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的E.coli系统表现质体转形(transform)入E.coli菌体中，E.coli可为E.coli BL21^TM(DE3)pLysS，转形可用电转形(electro-transformation)或热休克(heat shock)等任何习知的转形技术来进行，转形后用诱导物(inducer)诱导E.coli表现本发明的胜肽，诱导物可为IPTG等习知诱导物。

以酵母菌为例，则可选定酵母菌系统的表现质体及该表现质体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表现质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表现质体及核苷酸片段进行接合反应。接着将含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的酵母菌系统的表现质体转形入酵母菌中，转形可用任何习知转形技术来进行，例如可先去除酵母菌的细胞壁，使酵母菌形成原生质球状体(spheroplast)再进行转形，或是用碱性阴离子(如LiCl或RbCl)加上热休克来处理酵母菌以进行转形，转形后用诱导物诱导酵母菌表现本发明的胜肽，诱导物可为IPTG等习知诱导物。

以动物细胞为例，可选定动物细胞系统的表现质体及该表现质体中适当的限制酶切位后，以该限制酶剪切该表现质体，亦以该限制酶剪切含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的核苷酸片段，将以限制酶剪切后的表现质体及核苷酸片段进行接合反应。接着将含有可编码本发明的胜肽的核苷酸序列的动物细胞系统的表现质体转染入动物细胞中，该动物细胞可为昆虫细胞或哺乳动物细胞，转染可用任何习知转染技术来进行，如用微脂粒感染法(lipofection)或磷酸钙(calcium phosphate)法来表现本发明中的胜肽。

此外，为使本发明增加动物摄食量的方法处理的动物的摄食量能有效提升，前述的诱食剂可经由口服、注射或经鼻滴入的方式投予至该动物的体内。口服可以通过直接口服或添加于饲料中。当以口服方式投予时，为避免该诱食剂于通过该动物的消化道时被消化道中的消化液所破坏，该诱食剂可进一步藉由习知技术将其进行微包埋处理，以增强其对抗消化液的能力。作为本发明前述注射方式的例子，包括静脉注射(IV)、肌肉注射(IM)及腹腔注射(IP)等，但并不仅限于此。当以静脉注射方式投予至动物体内时，为使其能发挥最大的效果，该诱食剂较佳系注入该动物的脑部，更佳系注入该动物的侧脑室。

本发明的组合物或胜肽，可促进动物食欲，因此可增加动物摄食量，提升动物的生长表现，并能减少饲料喂食后的残留量。另外，本发明的组合物或胜肽还可使动物初次开始摄食饲料的时间提早，以及缩短动物摄食的时间。

本发明将藉由下述的实施方式做进一步的说明，下列的实例乃用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围。熟习本发明的技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许的改良与修饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

关于本发明的优点与精神可以藉由以下的发明详述及附图得到进一步的了解。

附图说明

图1A为npy在石斑鱼不同组织的基因表现。

图1B为npy在石斑鱼不同组织的基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图2A为石斑鱼在安排喂食(scheduled feeding)下npy的基因表现。

图2B为石斑鱼在安排喂食下npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图3A为石斑鱼在限制饮食下npy的基因表现。

图3B为石斑鱼在限制饮食下npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图4为石斑鱼在食物剥夺下脑部npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图5A为石斑鱼鱼苗不同阶段的形态。

图5B为石斑鱼鱼苗不同阶段npy的基因表现。

图5C为石斑鱼鱼苗不同阶段npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图6为正常的石斑鱼和厌食(anorexia)的石斑鱼的npy基因相对于β-肌动蛋白的表现。

图7为投予鸡NPY胜肽后鸡的摄食量的变化。

具体实施方式

实施例1

本发明的胜肽片段的制备

首先按照Chomczynski和Sacchi的方法(1987)从石斑鱼(点带石斑(E.coioides))的组织分离总(total)RNA。接下来，从10μg总RNA合成cDNA，使用的系含有200U Molony鼠类血癌病毒反转录酶(Molony murine leukemiavirus reverse transcriptase)、1mM dNTP、160U RNase抑制剂(inhibitor)及1.6μg随机引子(random primer)的1X反转录缓冲液。在42℃进行转录30分钟。接着以PCR放大(amplify)npy基因，PCR系使用含有20μg反转录产物、0.5U TaqDNA聚合酶及1μg正反向npy引子的80μl 1X PCR缓冲液，正相npy引子具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，反相npy引子具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。PCR会在DNA温度循环反应器(thermal cycler)进行，PCR步骤为在55℃缓冷配对(annealing)1分钟30秒，在72℃延长(extension)1分钟30秒，在94℃变性(denaturation)1分钟。共35个循环(cycle)。PCR反应终止后，取15μl的PCR产物以2％洋菜胶体(agarose gel)作电泳分析，接着进行溴乙烯(ethidium bromide)染色。

纯化的PCR产物会被选殖进M13mp18或pBluescript的SmaI位置，并会以双脱氧核醣链停止法(dideoxynucleotide chain termination)定序。npy基因经定序后得到如SEQ ID NO：2所示的序列。

另一方面，将纯化的PCR产物与表现载体pET31b(+)分别以限制酶AlwNI剪切，再将剪切后的PCR产物及pET31b(+)进行接合反应，将接合反应后所得含有PCR产物的pET31b(+)转形至表现宿主E.coli BL21^TM(DE3)pLysS中，在37℃下以200rpm振荡培养，并以不同浓度的IPTG进行诱导(induce)，结果以1mM IPTG诱导的效果最好。以12％SDS-PAGE分析，发现E.coliBL21^TM(DE3)pLysS所表现的NPY胜肽位于不可溶蛋白部分，其分子量约为26.4kDa，西方墨渍法亦证明其确为NPY胜肽。将所得不可溶蛋白部分以组胺酸亲和层析法(His·Bindchromatography)进行纯化，接着以溴化氰(CNBr)进行剪切，藉此可得到纯化的NPY胜肽。

实施例2

npy mRNA在石斑鱼体内的分布

依Chomczynski及Sacchi的方法(1987)分离石斑鱼(点带石斑)的脑、鳃、心脏、肝脏、胃、肠、肾脏、脾脏、肌肉及血液的总RNA。再以寡(dT)(oligo(dT))纤维素分离聚(A)mRNA，方法为加1体积的结合2X缓冲液(binding 2X buffer)到100-300μl的总RNA中，在65℃加热RNA混合物10分钟，接着冷却到室温。将RNA混合物加到1ml在结合1X缓冲液中的寡(dT)纤维素，在室温温和摇动15分钟让RNA和寡(dT)纤维素结合。接着在1,500xg离心15分钟，离心后丢弃上清液。加500μl洗涤缓冲液(wash buffer)到寡(dT)纤维素，温和摇动几秒钟。接着在1,500xg离心2分钟，离心后丢弃上清液。加200μl洗提缓冲液(elution buffer)到寡(dT)纤维素并温和摇动数分钟。在1,500xg离心5分钟，将上清液移到新的试管中。加0.1ml 3M醋酸钠及2.5体积乙醇到上清液中，加以混合并置于-20℃整夜。在12,000xg离心15分钟，所得沉淀物即为聚(A)mRNA。以1ml 70％乙醇洗涤沉淀物，在真空下使沉淀物干燥，并将沉淀物再悬浮于适当体积的TE缓冲液，将悬浮液储存于-70℃。

将聚(A)mRNA绞碎(mince)在10μl的反转录预混合物(premixture)中。反转录混合物的最终组成为10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl、1mM MnCl₂、0.2mM dNTP、1mM寡(dT)、5mM随机六聚物引子(random hexamer primer)及1.25单位的rTh DNA聚合酶(DNA polymerase)(Perkin-Elmer，CA)。将反转录混合物样品在1000℃加热1分钟，在70℃培养15分钟，接着在42℃ 5分钟以进行反转录。在反转录反应后，加入40μl的螯合(chelating)混合物(5％甘油、10mM Tris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、0.75乙二醇二乙醚二胺四乙酸(ethylene glycol-bis(b-aminoethyl ether)-N-tetraacetic acid，EGTA)、0.05％Tween20、1.5mM MgCl₂及0.25mM npy的每一正向引子和反向引子)，接着进行六十回的PCR(94℃1分钟，62℃ 2分钟，72℃3分钟)。

PCR反应终止后，接着进行南方墨点法(Southern blot)。方法为先以1.2％洋菜胶体分析PCR产物，再转印到尼龙膜(nylon membrane)上，并以UV交连(cross-linked)。杂交(hybridization)系在55℃于杂交溶液及以DIG(digoxigenin，洋地黄毒)-11-dUTP标定(DIG-11-dUTP-labeled)的npy cDNA探针中进行。接下来在室温以5ml洗涤液I(wash solution I)洗涤膜一次，在65℃以洗涤液II洗涤膜二次，并于10ml阻断液(blocking solution)中进行阻断。以阻断液稀释抗DIG-AP(alkaline phosphatase，碱性磷酸酶)标定物(conjugate)至浓度74mU/ml，将阻断后的膜在10ml此抗DIG-AP溶液反应30分钟，并在10ml侦测缓冲液(detection buffer)平衡2-5分钟。最后进行呈色反应(coloringreaction)，将膜置于10ml新鲜制备的颜色-受质溶液(color-substrate solution)中，并在黑暗中封于一盒内进行反应，以加入50ml的水来终止呈色反应。

南方墨点法的结果(图1A)可见到npy mRNA在石斑鱼脑部有显著的表现。将该结果以STORMTM系统定量，且和用对β-肌动蛋白(β-actin)专一的探针获得的量做比较。每一组织的平均值被用来测定npy：β-肌动蛋白的讯号比值(p＞0.05)。统计值以ANOVA(变异数分析)系统计算。

相对npy mRNA的量以6次SE的平均来表现。数据经单因子变异数(one-way ANOVA)分析，接着进行Student-Newman-Keuls多重比较(multiple-comparisons)试验。P＝0.05被认为是显著的。

图1B为npy在石斑鱼不同组织的基因相对于β-肌动蛋白的表现，当中可见到npy mRNA在脑、鳃、肝脏及胃中都有表现，特别是脑中的表现量特别高，因此，可知NPY主要表现于脑部，必要时可从脑部进行分离。

实施例3

石斑鱼在安排喂食(scheduled feeding)下npy基因表现

本实施例共有七个实验群组，每一群组包含10-12只已适应65公升水族箱的石斑鱼(点带石斑)。所有的鱼每天在安排的时间(下午3点)被喂食体重2％的饲料。在实验日，石斑鱼群组在安排的喂食时间前2小时、1小时、0小时(即安排的喂食时间)被牺牲，或在安排的喂食时间后15分钟、0.5小时、1小时、2小时被牺牲。

以和实施例2相同的方法对npy mRNA的量进行侦测以及统计分析。

图2A为石斑鱼在安排喂食(scheduled feeding)下npy的基因表现，当中可见到石斑鱼脑中npy mRNA的量在安排的喂食时间(0h)最高。图2B为石斑鱼在安排喂食下npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现，可看到在石斑鱼脑中，安排的喂食时间前两小时(-2h)，npy mRNA的量显著较安排的喂食时间前1小时(1h)、安排的喂食时间(0h)及安排的喂食时间后15分钟(+0.25h)低，且可见到，在安排的喂食时间(0h)的前，随安排的喂食时间的接近，npy mRNA的量逐渐上升，在安排的喂食时间(0h)达到最高，安排的喂食时间(0h)后就开始下降。

从本实施例可看到，npy基因的表现和禁食(fasting)间具有交互作用，npy基因表现量在禁食时上升，而在喂食后下降。由此可知，npy基因的表现和食欲有关，食欲上升时npy的基因表现量上升；食欲下降时npy的基因表现量下降。

实施例4

限制饮食增加石斑鱼npy基因表现

本实施例共有三个实验群组，每一群组包含12只已适应65公升水族箱的石斑鱼(点带石斑)。一群组喂食正常体重2％的饲料，另外两个群组分别喂食体重1％和0.5％的饲料，共喂食7天。7天后鱼被牺牲且其脑组织被收集。

图3A为石斑鱼在限制饮食下npy的基因表现，当中可见到当饲料量从2％体重(控制组)降到1％体重及0.5％体重时，石斑鱼脑部npy mRNA的量显著上升。而经β-肌动蛋白校正后，在图3B可看到更显著的结果。

由此可知，石斑鱼营养的不足会活化npy在石斑鱼脑部的表现，再次推知npy基因的表现和石斑鱼的食欲具有相关性，石斑鱼食欲增加时npy基因的表现亦增加。

实施例5

食物剥夺增加石斑鱼npy基因表现

本实施例的每一实验群组包含12只已适应65公升水族箱的石斑鱼(点带石斑)。控制组的鱼喂食正常体重2％的饲料(0小时)，剩下的群组分别食物剥夺24、48、72、96、120及144小时。所有群组均在食物剥夺期间的最后被牺牲以取得脑组织。

图4为石斑鱼在食物剥夺下脑部npy的基因相对于β-肌动蛋白的表现，当中可见到和正常喂食的石斑鱼比较，食物剥夺24小时并未显著改变npymRNA的量，然而，食物剥夺48、72、96、120及144小时则造成npy mRNA的量显著改变，特别是在食物剥夺72小时的时候npy mRNA的量上升了将近两倍。

本实施例中，食物剥夺造成石斑鱼脑部和时间相关，且相当显著的npymRNA量的上升。可知食物剥夺活化了脑部npy基因的表现及可能的蛋白质合成。又一次证明了NPY的表现和石斑鱼的食欲间的相关性，石斑鱼食欲上升时npy基因表现亦上升。

实施例6

石斑鱼鱼苗摄食增加npy基因表现

以和实施例2相同的方法对npy mRNA的量进行侦测，并以和实施例2相同的方法对npy mRNA的量及食物摄取进行统计分析。

图5A为石斑鱼鱼苗不同阶段的形态，当中L1为孵化期(hatching stage)；L2为专性内生摄食(obligate endogenous feeding)时(即卵黄吸收(yolkabsorption))，其时嘴被口咽膜(oropharyngeal membrane)覆盖；L3为开口期(open mouth stage)，其时口咽膜被破坏。孵化后的石斑鱼(点带石斑)幼鱼(post-hatching larvae)以半定量RT-PCR分析其npy基因表现(图5B)，再以β-肌动蛋白校正(图5C)，指出在L1及L2npy基因表现较低。而npy基因表现量在L3时显著较高，且幼鱼的后很快就开始摄食。可见npy基因表现和石斑鱼摄食间具有正相关性。

实施例7

厌食(anorexia)的石斑鱼npy基因表现下降

本实施例中取得具有临床厌食症状的石斑鱼(点带石斑)，该些石斑鱼显示出生长缓慢、摄食不足、迟缓(sluggishness)、厌食(anorexia)、高死亡率(highmortality)及身体形状改变等现象。这些具有临床厌食症状的石斑鱼，其npymRNA的量下降了两倍(请参阅图6)。

由本实施例可知石斑鱼食欲下降时，其npy mRNA表现量亦下降，因此可推知npy mRNA表现量上升时，石斑鱼的食欲亦上升。

实施例8

在石斑鱼侧脑室注射NPY胜肽增加石斑鱼的摄食量

以化学合成法合成NPY胜肽。依照Narnaware等人(1999)的描述，石斑鱼(点带石斑)在侧脑室注射(intracerebroventricular injection)后随即回到试验水族箱中，在2-5分钟内会从麻醉恢复。为了正确测量每只鱼所消耗的食物量，摄食基值在侧脑室注射前30分钟被记录。给予体重2％的饲料的石斑鱼正常会在30分钟内消耗饲料的50-75％。在实验日，控制组的鱼或不处理，或侧脑室注射盐水溶液(saline solution)。进行侧脑室注射15分钟后，体重2％的饲料被加入槽中。在预备(preliminary)试验中，注射NPY的鱼在30分钟的观察期被观察到消耗了体重的2％饲料，因此，在整个摄食实验中均维持消耗体重的2％饲料。

在饲料进入槽后立刻开始观察摄食行为。依照Volkoff等人所描述的(1999)，摄食行为被定义为“完全(complete)”和“不完全(incomplete)摄食行为”。完全的摄食行为定义为鱼接近饲料并消耗它。不完全的摄食行为定义为鱼接近饲料并以闭着的嘴碰或撞它，或将饲料摄入口中接着吐出。完全及不完全的摄食行为均在给予饲料30分钟内被记录。每一条鱼消耗的食物被转换为30分钟内湿体重(wet body weight)所消耗的食物毫克数，用饲料的平均重量来计算。

每日在注射前3小时给予饲料，以确保石斑鱼在摄食试验时是饱足的。注射前，石斑鱼在含有鱼保安(tricaine methanesulphonate)(MS222，1∶10,000)的水中被麻醉，在失去平衡后，石斑鱼随即在下午3点到3点半的间被注射。注射合成的石斑鱼NPY(5-10ng/体重)后，食物摄取在下午3点到3点半的间，侧脑室注射20分钟后被测量。

以和实施例2相同的方法对完全摄食及不完全摄食进行统计分析。

在下午3点到3点半，比较单一侧脑室注射石斑鱼NPY(5-10ng/体重)和注射盐水的石斑鱼，可见到两者在食物摄取上显著的差异。脑部侧脑室注射石斑鱼NPY显示以和剂量相关的方式刺激石斑鱼摄食。和注射盐水的群组比较，注射5ng/体重的NPY会增加近两倍的食物摄取。本发明中，注射盐水和未注射的控制组在食物摄取上没有差异。

本实施例直接证明了脑中NPY的增加，的确会增加石斑鱼食物摄取的增加。

实施例9

对NPY胜肽进行微包埋处理

本发明中微包埋处理包括了溶媒挥发法(solvent evaporation)以及褐藻酸钠乳化法(sodium alginate)，溶媒挥发法系以一修饰过的溶煤挥发技术，将聚合微粒球(polymeric microsphere)和NPY胜肽以三种不同比例一同胶囊化(co-encapsulate)。将卵白蛋白(ovalbumin)做为致孔剂(pore-forming agent)使NPY胜肽在体内得以释放出来，卵白蛋白并可用来稳定NPY胜肽使其活性延长。

前述的褐藻酸钠乳化法，系将4重量％的NPY胜肽和20重量％的油混合，超音波振荡10秒以使NPY胜肽均匀的分散在油里，再加入20重量％的褐藻酸钠水溶液及2.5重量％的乳化剂(胆盐)，超音波振荡以形成水包油乳化液(oil-in-water emulsion)，该水包油乳化液中含有直径1～5μm的散布NPY胜肽的油滴。再加入2.5％硫酸铝(Al₂(SO₄)₃)水溶液至100重量％以硬化褐藻酸钠，最后进行冷冻干燥即完成微包埋处理。

实施例10

投予鸡NPY胜肽增加鸡的摄食量

将一日年龄大的雄肉鸡饲养于无窗的房间，温度固定在28℃并持续给予光照，鸡可自由摄取市售初级饲料(starter diet)及水。将鸡分为四组，其中一组为注射组、二组为喂食组及一组为经鼻滴入组。注射组中，鸡在第一天以微注射器(microsyringe)对鸡静脉注射10μg/10μl的NPY胜肽；喂食组中系将实施例9的经微包埋处理的NPY胜肽以370或740ppm的比例混合于鸡饲料中，并让鸡在两星期内自由摄食该饲料；经鼻滴入组中则系在第一天从鸡的鼻子滴入10μg/10μl的NPY胜肽。

两个星期中每天测量食物摄取的情形，其系藉由测量预称重的鸡，其饲料消失的情形。鸡的体重系由一准确度±1mg的电子数字秤来测量。由测量结果可知，以喂食的方式给予NPY胜肽，增加了鸡20％的食物摄取量，结果请参阅图7。

由此可见，NPY胜肽不仅在水生动物可增加其食物摄取，对于畜产动物，也确实有增加其食物摄取的功能。

实施例11

NPY存不同动物的序列比对

将具有如SEQ ID NO：1所示序列的NPY胜肽和海鲡(cobia)做比对，发现两者序列完全相同。亦将具有如SEQ ID NO：1所示序列的NPY胜肽和其它动物，包括比目鱼(halibut)、鳟鱼(trout)、鲶鱼(catfish)、鲤鱼(carp)、金鱼(goldfish)及斑马鱼(zebrafish)、鸡(chicken)、牛(cow)、羊(sheep)等的NPY，进行序列比对。

从表一中可以看到，SEQ ID NO：1所示序列的NPY胜肽，其序列和所有进行比对的动物的NPY都具有很高的相似性(similarity)。凭此推论可知，本发明的胜肽亦应能促进其它物种的动物的摄食量。

由上述说明及实施例可知，在安排喂食、限制饮食及食物剥夺下石斑鱼NPY的基因表现，及石斑鱼鱼苗不同阶段的NPY基因表现，还有厌食(anorexia)的石斑鱼的NPY基因表现，均证实NPY的基因表现和石斑鱼的食欲成正相关，npy mRNA表现量上升时，石斑鱼的食欲亦上升。在石斑鱼侧脑室注射NPY对摄食的影响更直接证明当NPY胜肽的量增加时，确实会增加石斑鱼的摄食量，增加的摄食量可达原本的两倍的多。投予鸡NPY胜肽时，也可增加鸡的摄食量。此外，NPY在不同动物的序列比对证实了本发明的胜肽和所试验的动物均具有高度相似性，因此，本发明所提供的胜肽，确实具有促进动物摄食的功能。

藉由以上较佳具体实施例的详述，希望能更加清楚描述本发明的特征与精神，而并非以上述所揭露的较佳具体实施例来对本发明的范畴加以限制。相反地，其目的是希望能涵盖各种改变及具相等性的安排于本发明所欲申请的专利范围的范畴内。

表一石斑鱼NPY的成熟胜肽序列和其它动物间的相似性

	石斑鱼	比目鱼	鳟鱼	鲶鱼	鲤鱼	金鱼	斑马鱼	鸡	牛	羊
	石斑鱼	比目鱼	鳟鱼	鲶鱼	鲤鱼	金鱼	斑马鱼	鸡	牛	羊	石斑鱼比目鱼鳟鱼鲶鱼鲤鱼金鱼斑马鱼鸡牛羊	-978888888688868891	97-9191918891838688	8891-91888688808380	889191-949194838683	88918894-97100889188	8688869197-97868886	8891889410097-889188	86838083888688979491	8886838691889197-97	918880838886889497-

序列表

<110>吴金洌陆振冈

<120>一种用以增加动物摄食量的胜肽

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>36

<212>PRT

<213>点带石斑(Epinephelus coioides)

<400>1

Tyr Pro Val Lys Pro Glu Asn Pro Gly Asp Asp Ala Pro Ala Glu Asp

1 5 10 15

Leu Ala Lys Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr

20 25 30

Arg Gln Arg Tyr

35

<210>2

<211>108

<212>DNA

<213>点带石斑(Epinephelus coioides)

<400>2

tacccggtga aaccggagaa ccctggggat gacgccccgg cggaggacct ggccaagtac 60

tactcagccc tgagacacta cattaacctc atcacaagac agaggtat 108

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>点带石斑(Epinephelus coioides)

<400>3

gcgcaaatct ccctctcatc c 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>点带石斑(Epinephelus coioides)

<400>4

tgccctcctc cactttactg t 21

Claims

1.一种用以增加动物摄食量的胜肽，该胜肽具有如SEQ ID NO：1所示的胜肽序列。

2.根据权利要求1所述的胜肽，其中该动物为畜产动物。

3.根据权利要求2所述的胜肽，其中该畜产动物选自牛、羊、鸡以及猪所组成的群组。

4.根据权利要求3所述的胜肽，其中该畜产动物为鸡。

5.根据权利要求1所述的胜肽，其中该动物为水生动物。

6.根据权利要求5所述的胜肽，其中该水生动物为鱼类。

7.根据权利要求6所述的胜肽，其中该鱼类为养殖鱼类。

8.根据权利要求7所述的胜肽，其中该养殖鱼类选自石斑鱼、海鲡、鲷鱼、比目鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲶鱼、鲤鱼、金鱼、吴郭鱼以及斑马鱼所组成的群组。

9.一种用以增加动物摄食量的组合物，其包含根据权利要求1所示的胜肽序列，以及一药理上可接受的载物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中该动物为畜产动物。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中该畜产动物系选自牛、羊、鸡以及猪所组成的群组。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中该畜产动物为鸡。

13.根据权利要求9所述的组合物，其中该动物为水生动物。

14.根据权利要求13所的的组合物，其中该水生动物为鱼类。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中该鱼类为养殖鱼类。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中该养殖鱼类选自石斑鱼、海鲡、鲷鱼、比目鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲶鱼、鲤鱼、金鱼、吴郭鱼以及斑马鱼所组成的群组。

17.一种用以筛选能增加动物摄食量的诱食剂的方法，步骤包含：

(i)将该诱食剂与一饲料混合，藉以获得一混合物；

(ii)对该动物投予该混合物；

(iii)检测该动物体内根据权利要求1所示的胜肽片段的表现量；以及

(iv)以该胜肽片段的表现量高低来判断该诱食剂对该动物摄食的影响。

18.一种编码根据权利要求1所述的胜肽的核苷酸片段，其包含如SEQID NO：2所示的核苷酸序列。

19.一种增加动物摄食量的方法，其步骤包含：

(1)提供一诱食剂，该诱食剂包含根据权利要求1项所示的胜肽；

(2)提供一动物；以及

(3)将该诱食剂投予至该动物的体内。

20.根据权利要求19所述的方法，该诱食剂进一步包含一药理上可接受的载物。

21.根据权利要求19所述的方法，其中该诱食剂是以口服的方法投予至该动物的体内。

22.根据权利要求21所述的方法，其中该诱食剂经过微包埋处理。

23.根据权利要求19所述的方法，其中该诱食剂是以注射的方法投予至该动物的体内。

24.根据权利要求23所述的方法，其中该诱食剂是以静脉注射的方法投予至该动物的体内。

25.根据权利要求24所述的方法，其中该诱食剂是以静脉注射的方法投予至该动物的脑部。

26.根据权利要求25所述的方法，其中该脑部系为侧脑室。

27.根据权利要求23所述的方法，其中该诱食剂是以肌肉注射的方法投予至该动物的体内。

28.根据权利要求23所述的方法，其中该诱食剂是以腹腔注射的方法投予至该动物的体内。

29.根据权利要求19所述的方法，其中该诱食剂是以经鼻滴入的方法投予至该动物的体内。