CN103319587A

CN103319587A - 一种鱼类促摄食成熟肽及其应用

Info

Publication number: CN103319587A
Application number: CN 201310255800
Authority: CN
Inventors: 陈华谱; 李水生; 黄洪新; 杨振国; 俸敏; 张悠然; 张晶晶; 张勇; 赵斌
Original assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical College
Current assignee: Affiliated Hospital of Guangdong Medical College
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-09-25

Abstract

本发明公开了一种鱼类促摄食成熟肽及应用。本发明鱼类NMS神经肽基因及其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明鱼类NMS神经肽基因在鱼类的神经系统高表达，并通过分子调控机制研究及生理实验证实该基因产生的成熟肽NMSRP具有调节鱼类摄食的功能，能够用于调节鱼类摄食以及用于制备促进鱼类摄食的饲料。

Description

一种鱼类促摄食成熟肽及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鱼类促摄食成熟肽及其应用。

背景技术

神经肽是一类主要由脑分泌产生的具有内分泌功能或神经递质作用的蛋白质多肽。它们通过与受体结合启动细胞信号传递，在调控脊椎动物生理活动的各方面中发挥着关键作用。目前，通过各种基因工程的手段，获取高活性的促摄食剂促进养殖动物的生长，以提高生产效益和为人民日益增长的物质需求提供更多的动物蛋白成为了养殖业迫切的任务。

2005年，NMS(Neuromedin S)被利用反向药理学的方法从大鼠脑中分离出鉴定出来。大鼠的NMS前肽含有152个氨基酸残基，NMS成熟肽具有36个氨基酸残基，N端含有信号肽，具有4个潜在的内切酶酶切位点。NMS成熟肽由前体蛋白在第3和第4个加工位点之间裂解产生。NMS的第1和第2个加工位点之间的氨基酸序列彼此是高度同源的，预示着一个全新的活性成熟肽(NMS Relatied peptide，NMSRP)的存在。中枢神经系统进行NMS成熟肽处理，能显著降低小鼠的食欲与体重，并且此效应能持续很长时间，表明了NMS具有较强的抑制摄食的调控效应。功能缺失性研究表明，通过敲除小鼠的NMS受体NMUR2，NMS抑制摄食的行为消失，提示NMS在调节摄食活动与能量代谢平衡中具有重要的作用，但来自同一个蛋白前体的NMSRP成熟肽的功能研究尚未展开。

摄食行为的调控是由神经肽NPY(Neuropetide Y)和Orexin等神经内分泌因子构成的一个综合、复杂而又精确的神经内分泌调控网络，并时刻维持着能量的摄入与支出处于动态平衡之中。在众多的神经调节因子中找出主导的调控因子是开发高活性促摄食促生长剂的基础。通过搜索EST数据库与鱼类的基因组数据库，并进行基因共线性分析，首次证实了鱼类NMS基因的存在，并证实了鱼类NMS基因的成熟肽NMSRP均能刺激NPY和Orexin的显著性表达及增加金鱼的饵料摄入量，显示出了较强的促摄食功能，从而奠定了开发为一种新型诱食剂的基础。神经肽类活性物质具有活性高、用量少、来源方便、成本低、无毒副作用及序列短、易合成等优点，因此将有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于根据现有NMS基因的生物学特点，提供鱼类第一例NMS成熟肽。

本发明另一目的在于提供上述鱼类NMS神经肽的编码基因及其编码氨基酸序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供上述鱼类NMS神经肽的成熟肽(NMSRP成熟肽)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述成熟多肽的编码基因，其核酸序列如SEQ IDNO：3所示。

本发明另一目的在于提供上述鱼类NMSRP成熟肽的应用。所述应用包括在鱼类摄食调节中的应用以及用于制备鱼类促摄食饲料。

本发明提供一种鱼类促摄食饲料，其中该饲料包含上述鱼类NMS神经肽的成熟肽NMSRP(SEQ ID NO：2)。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

通过分析人、鸡及鱼类基因组和EST数据库，在多种鱼类中发现NMS基因的存在(图1)。根据这些序列设计引物，结合分子克隆技术，在斑马鱼中克隆得到NMS cDNA序列480bp，其中开放阅读框(ORF)序列333bp，编码的NMS蛋白前体为110个氨基酸。蛋白前体等电点为7.67，分子量为12.72千道尔顿，其中N-端信号肽由22个氨基酸组成(图2)。

序列多重比对分析表明，鱼类的NMS蛋白前体与哺乳类的序列存在较大差异。鱼类NMS蛋白前体保留了第1和第2个断裂识别位点，但缺失了第3和第4个断裂位点。这导致鱼类NMS蛋白前体缺失了传统的NMS成熟肽，只保留了NMSRP成熟肽，表明了鱼类NMS基因完全由NMSRP成熟肽来介导并执行其生理功能(图3)。

采用实时荧光定量PCR检测斑马鱼NMS基因在各种组织中的表达，结果显示NMS mRNA在脑、肝脏、脾脏、卵巢、垂体和肌肉中都有较高的表达；另外在心脏和肠的表达量较弱；在肾脏和鳃中检测不到表达信号。从中显示出NMS具有明显的组织表达特异性(图4)。NMS基因在脑和垂体中的高表达预示着NMS在上游神经中枢系统中的调控作用。

本发明鱼类NMS神经肽基因可以用于鱼类摄食调控。

用实时荧光定量PCR检测斑马鱼基因在饥饿状态下的变化，结果表明：在饥饿3天后，下丘脑中NMS基因的表达量显著高于对照组(P＜0.05)，表明NMS与摄食调控相关(图5)。采用腹腔注射方式研究化学合成的NMSRP成熟肽对斑马鱼摄食调控的影响，结果表明：10ng/gBW和100ng/gBW NMSRP成熟肽腹腔注射能够均能刺激摄食调控关键调控因子NPY和Orexin的显著性表达(图6)。另外，100ng/gBW NMSRP成熟肽腹腔注射能够显著性增加金鱼的摄食量(图7)。从分子研究和实际应用表明，NMSRP成熟肽具有促进摄食的生理功能。因此，本发明鱼类NMS神经肽基因编码的成熟肽NMSRP可以用于诱导鱼类摄食。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明本发明基于斑马鱼的理论研究，鉴定了鱼类NMS神经肽基因编码的成熟肽NMSRP具有调节鱼类摄食的功能，并且处于摄食调控关键因子NPY和Orexin的更上一层水平。这为开发出高活性、无毒和成本低廉的诱食剂，作为饲料添加剂，促进养殖鱼类等的发展具有广泛的应用价值

附图说明

图1：本发明NMS基因共线性分析；包括人类、鸡、红鳍东方鲀NMS基因的共线性分析；物种间的同源基因用线联系。

图2：本发明斑马鱼NMS cDNA序列及推导的氨基酸序列。信号肽用下划线表示；NMSRP成熟肽用阴影表示。

图3：物种间NMS的氨基酸多重比对，成熟肽用阴影表示，潜在的断裂位点用方框表示。

图4：本发明斑马鱼NMS基因在成鱼各个组织的表达分析。18s作为内参基因。B.全脑；P.垂体；H.心脏；K.肾脏；L.肝脏；Sp.脾脏；O.卵巢；M.肌肉；I.肠；Gi.鳃；NC.以水为模版的空白对照。

图5：本发明斑马鱼NMS基因在饥饿过程的表达变化；斑马鱼饥饿3天后下丘脑中NMS基因的表达变化。采用实时荧光定量PCR检测获得NMS相对表达水平。结果表述为平均值±标准方差(n＝10)。*表示有显著性差异(P＜0.05)。

图6：NMSRP成熟肽腹腔注射对斑马鱼下丘脑中NPY和Orexin的表达影响。采用实时荧光定量PCR检测NPY(A)和Orexin(B)的相对表达水平。结果表述为平均值±标准方差(n＝10)。上标不同字母(a、b和c)表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)。

图7：本发明斑马鱼NMSRP成熟肽腹腔注射对金鱼摄食的影响。结果表述为平均值±标准方差(n＝8)。星号表示与对照组有显著性差异(P＜0.05)。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

1.斑马鱼脑总RNA的提取

取健康斑马鱼，解剖后立即分离出脑组织。采用Trizol试剂法提取获得斑马鱼总RNA，其OD_260/280＝1.85，电泳结果显示，28S rRNA，18S rRNA条带清晰，28S条带亮度为18S的两倍，表明所得总RNA未被蛋白质、酚和基因组DNA污染，纯度高。

2.cDNA第一链的合成

取1μg斑马鱼脑总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT(序列如SEQ ID NO：4所示)混合，进行反转录，所得产物置于-20℃保存备用。

SEQ ID NO：4：GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT

3.引物设计

通过分析基因组和EST数据库，采用基因共线性的方法在人(hunman，Homosapiens)、鸡(chicken，Gallus gallus)、斑马鱼(zebrafish，Danio rerio)和红鳍东方鲀(fugu，Takifugu rubripes)中发现编码NMS蛋白前体的基因序列。根据这些序列设计简并引物，利用Clustal X软件进行多序列比对，确定保守区，根据所确定保守区设计引物如SEQ ID NO：5和6所示。

F：AACTAGTCATTCTGCCCAGCAG(SEQ ID NO：5)

R：GGTGCTGTTCATGATGTTTGTAG(SEQ ID NO：6)

4.斑马鱼NMS基因cDNA序列的克隆

以合成的第一链cDNA作为模板，进行PCR扩增，所得PCR产物上样至1.8wt％琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至

Easy载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源分析表明，目的产物为NMS基因的cDNA序列，长度为480bp。

实施例2NMS神经肽的序列比对分析

通过序列比对分析，NMS蛋白前体在不同脊椎动物中序列变异较大。NMS蛋白前体中第1和第2个断裂识别位点十分保守，而在所分析的鱼类NMS蛋白前体序列中，第3和第4个断裂识别位点缺失，导致鱼类NMS的蛋白前体丢失了传统的NMS成熟肽，保留了NMSRP成熟肽(图3)。

实施例3斑马鱼NMS基因的组织表达

采用实时荧光定量PCR检测斑马鱼NMS基因在各种组织中的表达，结果显示NMS mRNA在脑、肝脏、脾脏、卵巢、垂体和肌肉中具有较高的表达；在心脏和肠的表达量较弱；在肾脏和鳃中检测不到表达信号(图4)。

实施例4斑马鱼NMS基因在饥饿过程的表达变化

将成年斑马鱼随机分配到3个独立的玻璃缸中，分别标为对照组、饥饿组和复投组共3组。每天早上9:00准时投喂，驯养两周，让各组实验鱼的生活习态正常后，开始饥饿状态下的实验。对照组每天正常投喂，饥饿组和复投组在实验开始后停止投喂。在饥饿组停止投喂3天后，用MS-222麻醉，经处死、收集下丘脑样品、液氮速冻处理，并存放于-80℃超低温冰箱保存。复投组复投食物1小时后，取下丘脑，-80℃超低温冰箱备用。将收集到的下丘脑样本进行总RNA的提取，反转录，并进行荧光定量检测NMS基因的表达变化。结果表明：经过3天饥饿之后，NMS基因在饥饿之后的表达量显著性上升，而在复投食物后，表达量恢复到正常水平(图5)。

实施例5斑马鱼NMSRP成熟肽在体注射对摄食调控的作用

采用腹腔注射方式研究化学合成的斑马鱼NMSRP成熟肽(SEQ ID NO：2)对摄食调控的影响。结果表明：10ng/gBW和100ng/gBW NMSRP成熟肽注射组均能够刺激摄食调控关键因子NPY的显著性表达。100ng/gBW NMSRP成熟肽注射组同样能刺激摄食调控因子Orexin的显著性表达(图6)。

实施例6斑马鱼NMSRP成熟肽腹腔注射对金鱼摄食的影响

金鱼和斑马鱼均属于鲤科鱼类，亲缘关系较近。体型较大的金鱼比斑马鱼更便于进行摄食实验的研究。将体重4±0.5g的金鱼随机分配到玻璃缸中，每个缸1条金鱼。金鱼每天定时(上午9:00)投喂一次，食物投喂量约为体重的3％。驯养两周后开始正式实验。金鱼用MS-222麻醉后，称量每组中个体体重(body weight，BW)，根据体重分别由腹腔注射0.7％鱼类生理盐水(对照组)、100ng/gBW斑马鱼NMSRP成熟肽(注射组)。注射1小时后，分别向每组金鱼投喂固定重量的食物，让每组金鱼自由摄食1小时。同时将等量的食物放入水中，以计算食物在水中1小时中的重量变化。将各组剩余的食物分别收集并烘干，根据剩余的食物的重量计算各组中单位体重金鱼的摄食量。

采用腹腔注射方式研究斑马鱼NMSRP成熟肽对金鱼摄食的影响，结果表明：对照组每条鱼的平均摄食量为0.0215g；注射组每条鱼平均摄食量为0.0278g。注射组的摄食量高出对照组29.30％，显示出NMSRP成熟肽具有较强的促摄食作用。

Claims

1.一种鱼类促摄食多肽，其具有序列表的序列2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述多肽的DNA序列。

3.如权利要求2所述的DNA序列，其特征在于：所述编码序列是序列表中序列3所示的DNA序列。

4.权利要求1所述的多肽在鱼类摄食调节中的应用。

5.权利要求2或3所述的DNA序列在鱼类摄食调节中的应用。

6.权利要求1所述的多肽在制备鱼类人工饲料中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，所述的饲料用于促进鱼类摄食。

8.权利要求2或3所述的DNA序列在制备鱼类人工饲料中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述的饲料用于促进鱼类摄食。

10.一种鱼类促摄食饲料，其包含权利要求1所述的多肽或权利要求2或3所述的DNA序列。