CN104109195B - 一种泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO：1；本发明表达的泥蚶半乳糖凝集素(Tg-GAL)融合蛋白具有广谱的杀菌活力，特别是对水产动物致病菌弧菌类有较强的杀菌效果，这为研制新型的具有抗微生物活性的药物和在水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。与传统从天然资源提取半乳糖凝集素的方法相比。本发明的制备方法使半乳糖凝集素大批量、无毒性，使低成本的规模化生产成为可能，为海洋养殖贝类饲料添加剂和细菌性疾病疫苗的研制提供了一种新的途径。

Description

一种泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用
技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用。
背景技术
半乳糖凝集素(galectin)是凝集素超级家族中的一个家族，广泛分布于各种动物体内。目前以从哺乳动物中克隆并命名的成员有14个，他们共同具有高度保守的由大约135个氨基酸组成的糖识别结构域(CRD)，对β半乳糖苷有特殊的亲和力，在细胞黏附、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤转移等许多生理和病理过程中发挥重要的作用。在无脊椎动物中半乳糖凝集素相关研究还比较少，初步发现其在无脊椎动物血液中具有多种生物活性，可以选择凝集各种细胞，是一种重要的模式识别受体，是免疫防御的重要体液因子之一。
起初，对凝集素的研究工作主要集中在凝集素的外源作用，如促进细胞有丝分裂和凝集恶性细胞的能力等。之后逐渐开展凝集素在机体内的生理功能研究，如细胞与细胞间的黏附，受体介导的胞饮，细菌感染宿主以及宿主巨噬细胞清除入侵的细菌，寄生虫感染宿主时的诱导宿主外周淋巴细胞凋亡及免疫保护现象等。鉴于凝集素具有的多种生理生化作用，日益受到广大科研工作者的关注。但研究表明，凝集素在不同种之间存在明显的功能上的差异，且贝类凝集素的研究刚刚起步。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半乳糖凝集素Tg-GAL及其应用，即一种来自于泥蚶的半乳糖凝集素(Tg-GAL)，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL，其氨基酸序列为SEQIDNO：1；
本发明还提供用于编码上述的半乳糖凝集素的基因，其核苷酸的序列为SEQIDNO：2。
本发明还提供用于表达上述的半乳糖凝集素的重组质粒。
本发明的泥蚶半乳糖凝集素用于制备饲料添加剂和细菌性疾病疫苗。
本发明表达的泥蚶半乳糖凝集素(Tg-GAL)融合蛋白具有广谱的杀菌活力，特别是对水产动物致病菌弧菌类有较强的杀菌效果，这为研制新型的具有抗微生物活性的药物和在水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。与传统从天然资源提取半乳糖凝集素的方法相比。本发明的制备方法使半乳糖凝集素大批量、无毒性，使低成本的规模化生产成为可能，为海洋养殖贝类饲料添加剂和细菌性疾病疫苗的研制提供了一种新的途径。
附图说明
图1：本发明的凝集素基因与与泥蚶galectin1(tandem-repeat)序列相似性比对图。
具体实施方式
1.泥蚶血细胞RNA的提取和反转
取鲜活的泥蚶，用针管抽取泥蚶血窦中的血液，取1ml血液放入离心管中，3500转/秒离心一分钟，去上清，保留血细胞，用Trizol试剂抽提RNA。用紫外分光光度计检测A280、A260的相对吸收值，同时采用电泳检查RNA完整性。用M-MLV反转录酶试剂盒反转RNA，得到cDNA第一条链。
2.泥蚶半乳糖凝集素(Tg-GAL)含ORF的cDNA的亚克隆和验证
依据Tg-GAL基因成熟肽cDNA序列设计引物
Tg-GAL-ORF-F5'TTGTTAAAATAGAGACAAGATG3'
Tg-GAL-ORF-R5'TAAAACAAAAGATTTTCAGAAG3'
以获得编码该基因成熟肽的基因片段。PCR反应程序：94℃变性4min，1个循环；94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃保温。，把扩增出的片度连入pGEM-Tvector(Promega,USA)，并测序获得本发明筛选到的泥蚶半乳糖凝集素Tg-GAL基因的核苷酸序列为SEQIDNO：2，其mRNA序列为SEQIDNO：3；翻译出的氨基酸序列为SEQIDNO：1。与泥蚶galectin1(tandem-repeat)序列相似性只有27.1％(图1)，因此本发明克隆得到的半乳糖凝集素是一种新型的凝集素基因。
3.泥蚶半乳糖凝集素(Tg-GAL)重组质粒构建
本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET原核表达系统载体pET-30b，也可以选用其它的原核表达载体，该载体能够使目标序列与硫氧还蛋白(Trx-Tag)融合，通常能够增加重组蛋白中可溶性蛋白比例。
重组子构建步骤如下：
1)使用5’末端和3’末端分别添加了XhoI和HindIII特定酶切位点的基因特异性引物Tg-GAL-EF(5'CTAAGCTTATGGCTTCTGTTGTT3')和Tg-GAL-ER(5'ATCTCGAGAAAAGATTTTCAGAAG3')扩增目的基因。
2)将扩增片段纯化回收，与pGEM-T载体连接，构建亚克隆。
3)转化Top10感受态细胞后筛选阳性克隆，提取质粒。
4)使用限制性内切酶酶切亚克隆质粒，对酶切产生的目的片段纯化回收。
5)回收目的片段与同样双酶切的表达载体连接，完成载体的构建。
6)选取3个重组子送出测序，确认阅读框正确和碱基序列正确。
4.载体转化和表达
1)将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养过夜。
2)利用EZSpinColumnPlasmidMini-Preps44Kit提取质粒，在紫外分光光度计上测定其浓度，并将质粒稀释至10ng/μl。
3)取1μl稀释后的质粒转化200μl表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞。
4)将转化产物接入10mlLB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素，34μg/ml氯霉素)，200r/min，37℃培养过夜。
5)第二天将培养物转接入300ml同样的培养基中，200r/min，37℃培养1-3h，中间每隔20分钟检测浓度一次，当OD600达到0.5-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG继续培养4h。
6)4℃，5000rpm，离心10min离心收集菌体沉淀。提取的适当菌体加入100μlPBS缓冲液后100℃沸水中煮10min后离心，取上清，进行15％的SDS-PAGE分离胶电泳分析，CoomassiebrilliantblueR-250染色后用凝胶成像系统拍摄并记录结果。剩余菌体于-20℃冻存备用。
5.重组蛋白的纯化
本发明采用的蛋白纯化Kit为TOYOBO公司MagExtractorHis-TagNPK-700。该纯化Kit利用了组氨酸侧链上的咪唑基与金属离子(Ni2+)等的螯合的特性，可以使基因重组技术制备的His-Tag融合重组蛋白的纯化效率大大提高。其中添加的磁珠是与镍螯合的琼脂磁珠，与His-Tag的选择性结合能力非常出色，能够从菌体破碎液中直接纯化His-Tag融合蛋白。变性状态下重组蛋白的纯化步骤如下：
1)在洗净吸附液中加入尿素，使尿素浓度达到8M，并用1MHCl调解pH为8.0。
2)菌体加入变性吸附洗净液后，加入5MNaCl，使终浓度达到3M。
3)于冰浴中超声波破碎。
4)12000rpm离心1min，回收上清。
5)上清中加入磁珠，室温震荡10～30min(强度大)。
6)稍离心分离磁珠，弃去上清。
7)加入变性吸附洗净液。
8)使用震荡器搅拌10s。
9)稍离心分离磁珠。
10)加入变性溶出液，室温下使用微型试管混匀器搅拌1～10min(强度大)。
11)瞬间高速分离。
12)回收上清液。
6.重组蛋白的复性
分离纯化后的重组蛋白，依次在含有8M、6M、4M、3M、2M、1M和0M尿素的50mMTris缓冲液(pH8.0)中透析各4h(4℃)，将裂解液中的盐酸胍替换出来。利用SDS-PAGE法鉴定透析后所获得的纯化样品的纯度。
7.SDS电泳和WesternBlotting鉴定
进行4％～20％SDS-PAGE梯度分离胶电泳分析，上样6μgTg-GAL纯化蛋白，CoomassiebrilliantblueR-250染色后用凝胶成像系统拍摄并记录结果重组蛋白的浓度测定。在蛋白相对分子质量约45.9KDa处有明显特异性蛋白条带，与预期大小一致，而空载体菌和未诱导菌均无此特异性表达条带。用His抗体进行重组蛋白的WesternBlotting鉴定，将SDS-PAGE分离后电转移至硝酸纤维素膜上，将膜置于30g/L的脱脂奶粉溶液中与4℃封闭过夜。然后滴加Tg-GAL抗His抗体于37℃反应2h，最后用DAB显色试剂盒显色。表达的目的蛋白经Westernblotting验证能被His抗体识别，检测的His标签融合蛋白Tg-GAL纯度>78％，浓度为3.26mg/ml。
8重组半乳糖凝集素抗菌活性检测
采用Bradford法对重组蛋白的含量进行测定。分别以副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌种，进行琼脂孔扩散抑菌试验。抑菌试验结果表明，重组Tg-GAL具有显著的抗阴性性菌活性，其对供试的海洋生物致病菌副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌表现出明显的抑制作用，最低抑制浓度(MIC)结果为2.45-6.25×10-3mg/mL之间，抑菌效果好于贝类体外重组抗菌肽。
9以2龄泥蚶为实验对象，分四组，每组放置50个健康泥蚶，在饵料中分别添加100mg/kg,200mg/kg,500mg/kg的重组半乳糖凝集素及不添加的对照组，投喂24小时后，用半致死浓度副溶血弧菌浸泡感染实验，研究表明：未投喂含半乳糖凝集素的泥蚶60小时后只有20％的存活率，而投喂含半乳糖凝集素的各组显示推迟死亡的现象，且半乳糖凝集素浓度越高，存活率越高，投喂免疫500mg/kg的感染79.0小时后，仍然有58％的存活率。同时做了对照试验，发现添加非泥蚶来源的C型凝集素(GenebankNo:DQ209290；AB308130)的泥蚶存活率只有34％，因此本发明的乳糖凝集素对提高泥蚶抗菌免疫的效果更好，这可能与该凝集素是从泥蚶中分离出的，更适应于泥蚶免疫系统的缘故。

Claims (4)

1.一种泥蚶半乳糖凝集素，其特征在于，所述的半乳糖凝集素的氨基酸序列为SEQIDNO：1。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的泥蚶半乳糖凝集素。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO：2。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒用于表达权利要求1所述的泥蚶半乳糖凝集素。
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