CN114426571A - 一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白pfl-96及其编码基因和应用 - Google Patents
一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白pfl-96及其编码基因和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL‑96及其编码基因和应用，属于生物医药技术领域。该凝集素蛋白PFL‑96的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，在体外能够抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白丝念珠菌、溶藻弧菌的生长并具有杀菌活性，此外还能够显著抑制人鼻咽癌细胞C666‑1、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela增殖，因此本发明的凝集素蛋白PFL‑96可用于制备抗菌、抗癌药物。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体而言，涉及一种重组蛋白药物，尤其涉及一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96及其编码基因和应用。
背景技术
合浦珠母贝(Pinctada fucata martensii)，又称马氏珠母贝，主要分布在我国广西、广东、海南、福建、台湾等沿海省份，是我国重要的海水养殖贝类和生产海水珍珠的主要贝种之一，所产珍珠被称为“南海珍珠”，晶莹剔透，圆润光泽，素有“东珠不如西珠，西珠不如南珠”美誉。近年来随着沿海经济高速发展，生态环境遭到严峻破坏，沿海水质日趋恶化，导致合浦珠母贝病害严重，尤其是细菌病害中的弧菌感染，严重制约到合浦珠母贝养殖业的发展，对我国南珠产业及其多元化发展造成重要影响。另一方面，在水产养殖业中抗生素的滥用所带来的环境污染、耐药菌株出现及人类健康等问题是全球性的。当下“减抗、替抗、限抗、禁抗”绿色养殖理念已深入人心，因此开发具有抗合浦珠母贝病害，提升珍珠养殖质量的抗生素替代品已成为研究热点。
合浦珠母贝属于海洋无脊椎动物，具有其独特的复杂天然免疫系统，其中凝集素是其天然免疫系统中重要的模式识别分子之一。合浦珠母贝在低温、高盐、高压的复杂海洋环境中产生了多种糖特异性结合的凝集素，具有调节机体代谢及通过识别和结合入侵病原体表面的糖残基参与宿主防御等诸多生理功能。目前在合浦珠母贝中已鉴定出五种凝集素或凝集素样基因，包括C-型凝集素、F-型凝集素、半乳糖结合凝集素、α-N-乙酰半乳糖结合凝集素和血清凝集素亚型-2，在宿主防御中发挥作用。然而，关于凝集素在合浦珠母贝免疫系统中的作用还未见深入报道。研究合浦珠母贝的凝集素不仅对深入了解合浦珠母贝对病原微生物免疫防控的机制，及开发制备新型替代抗生素的天然活性肽类药物用于合浦珠母贝健康养殖，以及用于人类疾病治疗方面具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96蛋白及其编码基因和应用。
为了实现上述技术目的，本发明人通过深度测序筛选合浦珠母珍珠层和棱柱层形成的新基因，得到一种编码具有假定半乳糖结合凝集素结构域的蛋白质(命名为PFL-96)，该蛋白在珍珠层形成中发挥重要作用，并且其作为一种凝集素蛋白具有抵御病原体的生物活性。
基于上述研究成果，实现本发明技术目的的技术方案如下：一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96，所述PFL-96具有：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
(2)在所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有同样稳定性的氨基酸序列。
本发明的合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的制备方法包括：(1)克隆获得去掉假定信号肽的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素基因片段，将其连入原核表达载体pET-28a，获得原核表达重组质粒pET-28a-PFL-96；(2)氯化钙热激法导入大肠杆菌BL21，获得重组菌株；(3)培养上述重组菌株，诱导重组蛋白PFL-96表达；(4)包涵体变性、复性、纯化及透析获得合浦珠母贝定半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96。
进一步地，本发明还提供了上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的编码基因，该基因编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。具体地，上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的基因编码序列如SEQ ID NO:2所示；适用于原核表达经密码子优化后的基因编码序列如SEQ ID NO:3所示。
进一步地，本发明还提供一种重组载体、重组细胞。该重组载体携带上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的编码基因。所述重组载体为将上述编码基因插入出发载体pET-28a的多克隆位点得到的重组载体。也可用现有的其它表达载体构建含有所述基因的重组载体。该重组细胞所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，即将上述编码基因插入出发载体pET-28a的多克隆位点得到的重组表达载体后转化至大肠杆菌BL21(DE3)得到所述重组细胞。
另外，本发明还提供了一种上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96在制备抑制或/和杀灭细菌的药物、保健品或食品添加剂中的应用，所述的细菌选自如下的至少一种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、溶藻弧菌。
另外，本发明还提供了一种上述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96在制备抗癌药物中的应用。所述的癌症为鼻咽癌、肝癌或宫颈癌。
与现有技术相比，本发明提供的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96蛋白，能抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、溶藻弧菌，同时能显著抑制人鼻咽癌细胞C666-1、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela的增殖，可以开发成替代抗生素的天然活性肽类药物用于合浦珠母贝健康养殖，也可以制备成人用的抗菌抗癌药物，为人类疾病治疗提供新型的原料。
附图说明
图1A为从合浦珠母贝肉cDNA中克隆获得的去掉信号肽的半乳糖结合凝集素PFL-96基因片段；图1B为构建到原核表达载体pET-28a上的阳性克隆子菌落PCR验证结果。
图2A为原核生物表达目的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为pET-28a空载体诱导；2为pET-28a空载体未诱导；3为重组质粒诱导后；4为重组质粒诱导破碎后上清；5为重组质粒诱导破碎后沉淀。图2B为蛋白质纯化SDS-PAGE鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为破碎后处理样品；2为纯化过程流穿样品；3和4为纯化过程洗脱样品。图2C为纯化后蛋白SDS-PAGE鉴定结果；M为蛋白质分子质量标准；1为0.5mg/mL牛血清蛋白(BSA)；2为纯化后目的蛋白样品。
图3为采用牛津杯法测定凝集素PFL-96对各菌株的抑菌活性结果。
图4为采用96孔法测定凝集素PFL-96对各菌株的最小抑菌浓度结果。
图5为采用涂板法确定凝集素PFL-96对各菌株的最小杀菌浓度。
图6为凝集素蛋白PFL-96显著抑制人鼻咽癌细胞C666-1、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela增殖结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围并不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径获得。
实施例1：合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96基因克隆及原核表达质粒构建
使用液氮迅速研磨合浦珠母贝肉，采用RNAiso Plus法提取总RNA，使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit进行反转录获得第一链cDNA，以其为模板进行PCR扩增目的基因。
上游引物F:5’-CGGGATCCATGACTGCAACACGAAACGC-3’(含BamH I限制性内切酶位点)；
下游引物R:5’-CCGCTCGAGCCAATATCTTCTAGAGCACT-3’(含Xho I限制性内切酶位点)；
PCR扩增体系：
扩增程序如下：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，后延伸72℃5min。
使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(图1A)，并过柱纯化收集，BamH I和Xho I进行双酶切，过柱回收纯化，与同样双酶切纯化的pET-28a载体，在T4 DNA连接酶作用下酶连，转入DH5α感受态细胞，复苏涂布LB卡那霉素抗性平板，菌落PCR筛选阳性克隆子(图1B)，提取质粒，送往上海生工测序鉴定。
实施例2：密码子优化及原核表达
合浦珠母贝为真核生物，由于存在密码子偏好性问题，真核基因在原核基因表达时需要进行密码子优化，再构建到原核表达载体pET-28a上，转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达，具体过程如下：1)挑取单菌落接种到含终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，37℃200rpm过夜培养；2)按照1％的接种量转接到100mL含终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，振荡培养3-4h，待其OD600为0.6-0.8；3)取出1mL菌液，10000rpm室温离心1min，弃上清，菌体沉淀-20℃保存；4)剩余培养物加入终浓度为0.2mM的IPTG，15℃200rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；5)取出1mL菌液，10000rpm室温离心1min，弃上清，保存菌体，同时4℃4000rpm离心10min收集剩余菌液，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；6)重悬液进行超声波破碎(超声4sec，间歇8sec，全程时间20min，功率400W)后，4℃10000rpm离心10min，收集上清和沉淀；7)步骤3、5、6中的沉淀用100μL1×上样缓冲液重悬，步骤6中的上清用2×上样缓冲液重悬；8)12％SDS-PAGE凝胶电泳检测，考马斯亮蓝染色观察蛋白条带(图2A)。
实施例3：包涵体蛋白变性
1)将实施例2步骤6获得的菌体沉淀重悬于20mL裂解液(20mM Tris-HCl，pH 8.0)，超声破碎(超声4sec，间歇8sec，全程时间20min，功率400W)；2)4℃10000rpm离心10min，收集沉淀；3)使用包涵体洗涤液(20mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH 8.0)洗涤包涵体3次；4)用包涵体溶解液(20mM Tris-HCl，5mM DTT，0.15M NaCl，8M尿素，pH 8.0)4℃过夜溶解包涵体；5)室温10000rpm离心15min，收集上清；5)装入透析袋，于20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 8.0的透析溶液中搅拌过夜透析。
实施例4：包涵体蛋白复性
1)采用低压层析系统，实施例3中获得的上清溶液以0.5mL/min流速上样至Ni-IDA结合缓冲液预平衡的Ni-IDA-Sepharose Cl-6B亲和层析柱中；2)用Ni-IDA结合缓冲液以0.5mL/min流速冲洗，3)用Ni-IDA洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，20mM咪唑，0.15M NaCl，8M尿素，pH 8.0)以1mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；4)用Ni-IDA洗脱液(20mMTris-HCl，250mM咪唑，0.15M NaCl，8M尿素，pH 8.0)以1mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；5)加入到透析袋中，在复性缓冲液中搅拌透析过夜，然后透析到PBS中储存；6)12％SDS-PAGE凝胶电泳鉴定(图2B、C)。
实施例5：牛津杯法测PFL-96抑菌活性
1)菌悬液制备：刮取试管斜面的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，ATCC6633)、白色念珠菌(Candida albicans，ATCC10231)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC6538)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，ATCC9027)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，ATCC14028)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli，ATCC25922)菌苔，及挑取培养板中的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，ATCC33787)单菌落，接种到4mLLB培养基，37℃180rpm振荡培养过夜，然后将菌液稀释6倍，测OD600，使其范围在0.3～0.8之间，然后根据稀释倍数乘以该OD600值，就是原始菌液的OD600，然后用PBS缓冲液稀释到1OD600，采用十倍稀释法稀释到1×106CFU/mL的菌悬液待用。
2)采用双层平板透明圈法，即在无菌培养皿90mm中倒入10mL高压灭菌的琼脂(1.5％)(下层)，待凝固后，迅速在平板上放入3只灭过菌的牛津杯(内径(6±0.1)mm，外径(7.8±0.1)mm，高(10±0.1)mm)，在无菌条件下加入混有受试菌的培养基15mL。待培养基凝固后取出牛津杯，分别向每个孔中加入制备好的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96(0.5mg/mL)100μL，阴性对照为100μL相同浓度的pET-28a空载表达上清，空白对照为相同体积的PBS。将平板先置4℃预扩散2-4h，再于37℃恒温箱培养16-20h，观察并测量抑菌圈的直径，每个抑菌圈测量3次，并进行3次独立重复实验，取平均值。
图3为采用牛津杯法测定凝集素PFL-96对各菌株的抑菌活性结果；其中：A为枯草芽孢杆菌，抑菌圈直径为25.50±0.84mm；B为白色念珠菌，抑菌圈直径为17.02±0.33mm；C为金黄色葡萄球菌，抑菌圈直径为20.55±2.15mm；D为溶藻弧菌，抑菌圈直径为16.74±1.44mm；E为铜绿假单胞菌；F为鼠伤寒沙门氏菌；G为大肠杆菌；H为PFL-96对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌抑菌圈直径的数据分析图。
实施例6：96孔法测PFL-96最小抑菌浓度MIC和最小杀菌浓度MBC
1)同实施例5制备菌悬液；
2)取无菌96孔板，每排1号孔加入100μL无菌LB培养基+100μLPBS作为空白对照，2-12号孔每孔加入100μL新鲜配制的106CFU/mL受试菌菌悬液，2-11号孔各孔分别加入128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素PFL-96100μL，此时各孔中药物终浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。12号孔加入100μLPBS作为阴性对照。每组3个复孔。
3)将96孔板置于37℃培养箱中培养16-24h，通过酶标仪测OD600吸光度，以肉眼未见细菌生长的最小稀释度为最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)，并从肉眼未见细菌生长的孔内取20μL培养物涂布平板，适温培养24h，观察平板中菌落的生长情况，以不生长菌落或生长菌落数低于5个所对应的药物的最小浓度为最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC)，所有实验均独立重复3次。
图4为采用96孔法测定凝集素PFL-96对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌的最小抑菌浓度；其中：A为枯草芽孢杆菌，最小抑菌浓度为4μg/mL；B为白色念珠菌，最小抑菌浓度为16μg/mL；C为金黄色葡萄球菌，最小抑菌浓度为8μg/mL；D为溶藻弧菌，最小抑菌浓度为16μg/mL(图中***表示P<0.001)。
图5为采用涂板法确定凝集素PFL-96对枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌的最小杀菌浓度；其中：A为枯草芽孢杆菌，A1平板中凝集素PFL-96终浓度为8μg/mL，没有菌落出现，A2平板中凝集素PFL-96终浓度为4μg/mL，出现大量菌落，说明凝集素PFL-96对枯草芽孢杆菌最小杀菌浓度为8μg/mL；B为白色念珠菌，B1平板中凝集素PFL-96终浓度为32μg/mL，总计长出4个单菌落，小于5个，B2平板中凝集素PFL-96终浓度为16μg/mL，出现多个单菌落，说明凝集素PFL-96对白色念珠菌最小杀菌浓度为32μg/mL；C为金黄色葡萄球菌，C1平板中凝集素PFL-96终浓度为16μg/mL，没有菌落出现，C2平板中凝集素PFL-96终浓度为8μg/mL，出现多个单菌落，说明凝集素PFL-96对金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度为16μg/mL；图D为溶藻弧菌，D1平板中凝集素PFL-96终浓度为32μg/mL，没有菌落出现，D2平板中凝集素PFL-96终浓度为16μg/mL，出现多个单菌落，说明凝集素PFL-96对溶藻弧菌最小杀菌浓度为32μg/mL。
实施例7：CCK8法检测PFL-96对癌细胞增殖影响
1)实验分组：1.对照组(PBS)组；2.0.5-256μg/mL合浦珠母贝凝集素PFL-96组；
2)人鼻咽癌C666-1、人肝癌HepG2、人宫颈癌Hela细胞培养方法如下：待细胞汇合度至80％-90％时，对细胞进行传代，弃去细胞培养上清，用1×PBS洗两遍，加入0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，待细胞变圆加入培养基终止消化，收集细胞悬液至10mL离心管中，1000rpm离心3min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，分配至培养皿中继续培养。其中C666-1细胞和Hela细胞使用完全RPMI-1640培养基进行培养，HepG2细胞使用完全DMEM培养基；
3)CCK8检测细胞增殖：将不同细胞接种至96孔板(C666-1每孔接种7×103个细胞，HepG2、Hela每孔接种5×103个细胞)，待细胞完全贴壁后加入不同浓度的药物处理细胞，48h后进行CCK8检测，向待测96孔板中每孔加入10μL CCK8反应2h，酶标仪在450nm波长处检测每孔的吸光值，计算各组细胞存活率。细胞活力(％)＝[A(实验组)-A(空白培养基)]/[A(对照组)-A(空白培养基)]×100％。
4)统计学分析：应用SPSS 20.0软件进行统计分析。所有实验重复3次，定量结果采用均数±标准差(X±S)表示。两组之间定量数值比较采用独立样本T检验，多组之间定量数值比较采用单因素方差分析，两两比较采用S-N-K法，检验水准α＝0.05。
图6为凝集素蛋白PFL-96显著抑制人鼻咽癌细胞C666-1、人肝癌细胞HepG2、人宫颈癌细胞Hela增殖结果，具体表现为在不同细胞中，合浦珠母贝凝集素PFL-96对细胞增殖整体呈现为低浓度促进、高浓度抑制的趋势。在C666-1细胞中0.5μg/mL-2μg/mL的PFL-96处理可以显著提高细胞存活率，8μg/mL-256μg/mL的PFL-96处理可以显著降低细胞存活率(P＜0.05)；在HepG2细胞中16μg/mL-256μg/mL的PFL-96处理可以显著降低细胞存活率(P＜0.05)；在Hela细胞中8μg/mL-256μg/mL的PFL-96处理可以显著降低细胞存活率(P＜0.05)。总之，经不同浓度PFL-96处理三种不同类型的人肿瘤细胞，在适当的浓度下可以呈现出增殖抑制的效果，不同类型细胞对该药物的耐受性不同。
通过以上实施例的试验结果可以看出，本发明从合浦珠母贝肉的cDNA中克隆获得去掉假定信号肽的半乳糖结合凝集素PFL-96基因片段，通过基因工程技术构建到原核表达载体pET-28a，诱导表达，获得包涵体蛋白，经过变性和复性获得目的蛋白PFL-96。该蛋白PFL-96在体外能够抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白丝念珠菌、溶藻弧菌的生长并具有杀菌活性，对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌抑菌效果不显著，因此本发明PFL-96蛋白可用于制备抗菌药物，用于提高合浦珠母贝防御病原微生物，还可以制备成人用的抗菌抗癌药物，为人类疾病治疗提供新型的原料。
Claims (8)
1.一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96，其特征在于，所述PFL-96具有：
(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或
(2)在所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有同样稳定性的氨基酸序列。
2.一种合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的编码基因，其特征在于，该基因编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
4.一种携带权利要求2或3所述编码基因的载体、重组细胞。
5.根据权利要求4所述的载体、重组细胞，其特征在于，所述重组细胞所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.一种根据权利要求1所述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96在制备抑制或/和杀灭细菌的药物、保健品或食品添加剂中的应用，所述的细菌选自如下的至少一种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、溶藻弧菌。
7.一种根据权利要求1所述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96在制备抗癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述合浦珠母贝抗菌半乳糖结合凝集素蛋白PFL-96在制备防治癌症的药物中的应用，所述的癌症为鼻咽癌、肝癌或宫颈癌。
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Cited By (1)
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| CN116462746A (zh) * | 2023-05-15 | 2023-07-21 | 广西中医药大学 | 一种合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白pfl-96及其编码基因和应用 |
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-
2022
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