CN113372428B

CN113372428B - 文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用

Info

Publication number: CN113372428B
Application number: CN202110559923.0A
Authority: CN
Inventors: 黄慧清; 黄盛丰; 徐安龙; 严信宇; 李军; 徐立群; 杨满意; 徐单单; 陈素红; 王霞
Original assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Current assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority date: 2021-05-21
Filing date: 2021-05-21
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2041-05-21
Also published as: CN113372428A

Abstract

本申请属于生物领域，提供了文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用。本申请首次发现的C型凝集素BjCTL4基因编码的蛋白，其CTL样结构域具有传统CTL的基本特征，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL的类似基序，以及与Ca²⁺相关的糖结合基序QPD/EPN和WND的类似基序，经过初步验证能较为广泛结合细菌表面的多糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可发展为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。

Description

文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用

技术领域

本申请属于生物领域，具体涉及文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用。

背景技术

文昌鱼(代表性的例子如：青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum))，属于脊索动物门(Chordate)，头索动物亚门(cephalochordate)，是现存和脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。文昌鱼缺乏类似脊椎动物的适应性免疫系统，但仍然能在充满病原微生物的海洋环境中健康生存，主要依赖于其有效而特异的免疫系统。先天免疫系统的诱导性防御机制是由一系列的模式识别分子(PRR)识别病原相关分子模式(PAMP)，并起始各种信号途径控制一系列免疫相关基因的表达从而达到清除病原体的效果。

C型凝集素(C type lectin,CTL)超家族是一类包含C-type lectin likedomains(CTLDs)且功能广泛的蛋白。利用凝集素分子通过模式识别效应来区分“自己”和“非己”也已经成为无脊椎动物和脊椎动物参与先天免疫的重要手段。

关于人类和其它哺乳动物CTL家族的免疫功能研究已经积累了大量资料，并且随着对高等动物CTL家族在天然免疫中重要性的认识，人们意识到低等动物，如鱼类、昆虫、甲壳动物、软体动物和线虫等，其CTL分子在先天免疫中也是占据非常重要的地位。

文昌鱼和脊椎动物CTL分子的同源性相差较大，但令人惊讶的是脊椎动物几类CTL蛋白都能在文昌鱼中找到同源物，如SEEC、DGCR2、polycystin和collectin等，并且dualCTLD类CTL蛋白也存在于文昌鱼中。对文昌鱼CTL家族的初步功能分析显示，它们功能广泛，但多数是作为一种急性免疫反应蛋白参与对机体的防御。其中由N端信号肽和单个CTLD组成的CTL分子AmphiCTL1具有细菌识别和凝集的活性，可以作为PRR参与文昌鱼先天免疫反应，并且与其它CTL分子功能不同的是，它还具有直接杀伤特异微生物的活性，其活性的发挥主要通过结合微生物细胞壁上的肽聚糖和葡聚糖完成的(Yu et al.,2007)。

文昌鱼是现存的最原始的脊索动物代表，其基因组水平、形体结构和免疫机制都代表了最简单的脊椎动物模式，是研究脊椎动物免疫系统的起源和进化的理想实验动物模型。结合低等动物CTL家族的多样性和复杂性，对文昌鱼的CTL进行深入的研究，从而研究文昌鱼的免疫防御机制和对病原感染应答的规律，能够为阐明海水养殖动物免疫防御机制提供资料，为开发海水养殖控制病害提供新方法、新思路，也为养殖水产动物病害的免疫防治技术提供理论依据。

发明内容

一方面，本申请提供了一种多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。

一方面，本申请提供了一种包含SEQ ID NO：4所述序列的多肽；在一些实施方案中，所述多肽的序列如SEQ ID NO.：3所示。

一方面，本申请提供了一种核酸，其编码所述的多肽；在一些实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：2所示；在一些实施方案中，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO：1所示。

一方面，本申请提供了所述多肽的表达方法，包括以下步骤：

S1.构建载有所述的核酸的重组表达载体；

S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；

S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；

S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行多肽的提取和纯化

在一些实施方案中，所述步骤S1包括以下步骤：

S1.1根据所述的核酸的序列设计引物；

S1.2以含有所述的核酸序列的pGEX-T easy vector质粒为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；

S1.3将步骤S1.2的PCR扩增产物克隆到表达载体上，得到重组表达载体。

在一些实施方案中，所述引物的选自SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6所示的引物，或SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8所示的引物；

在一些实施方案中，所述引物含有Kpn I和/或Xho I切割位点。

在一些实施方案中，所述步骤S4中蛋白的纯化选自亲和层析法；在一些实施方案中，所述亲和层析法选自Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow。

一方面，本申请提供了一种载体，其包含所述的核酸分子。

在一些实施方案中，所述载体选自质粒、噬菌体、人工染色体、病毒中的至少一种；在一些实施方案中，所述载体选自质粒；优选地，所述载体选自pET23a-ELP-GFP或pET-SUMO。

一方面，本申请提供了一种细胞，其包含所述的核酸或所述的载体。

在一些实施方案中，所述细胞选自原核细胞；在一些实施方案中，所述细胞选自大肠杆菌；在一些实施方案中，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)菌株。

一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含任一所述的多肽，或所述的核酸，或所述的载体，所述的细胞；以及任选地，药学上可接受的载体和/或赋形剂。

一方面，本申请提供了任一所述的多肽，或所述多肽任一的融合蛋白，或所述的核酸，或所述的载体，或所述的细胞，或所述的药物组合物在制备抗感染性疾病药物中的应用。

在一些实施方案中，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白或ELP融合蛋白中的一种或两种；在一些实施方案中，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白。

在一些实施方案中，所述感染性疾病选自细菌引起的感染；在一些实施方案中，所述细菌选自肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、巴氏葡萄球菌、大肠杆菌和贝内克氏菌中的至少一种。

本申请首次发现的C型凝集素BjCTL4基因编码的蛋白，其CTL样结构域具有传统CTL的基本特征，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL的类似基序，以及与Ca²⁺相关的糖结合基序QPD/EPN和WND的类似基序，经过验证能较为广泛结合细菌表面的多糖，并且有明显的细菌结合、细菌凝集作用，可发展为天然的抑菌活性物质以及制备治疗感染性疾病的药物。

附图说明

图1为实施例2中文昌鱼BjCTL4与人的代表性CTLs的Alignment比对结果。

图2为实施例3中文昌鱼BjCTL4蛋白结构预测分析结果。

图3为实施例4中SUMO基因的PCR扩增结果。其中，M为DL2000 marker，1为SUMO。

图4为实施例4中pET-SUMO融合表达载体的构建流程图。SUMO基因通过PCR扩增并被连接至pET21b的BamHI/NdeI位点。

图5为实施例4中的重组质粒pET-SUMO的双酶切鉴定结果。其中，M为DL2000marker，1为pET-SUMO。

图6为实施例5中BjCTL4的CTLD扩增结果(pET23a-ELP-GFP)。其中，M为DL2000marker，1为BjCTL4-CTLD。

图7为实施例5中BjCTL4的全长序列和CTLD的扩增结果(pET-SUMO)。其中，M为DL2000 marker；1为BjCTL4fl；3,4为BjCTL4-CTLD；5为阴性对照。

图8为实施例6中Western blot分析ELP-CTL4s重组蛋白的表达情况。其中，1：pELP-CTL4s的未诱导裂解细菌的总蛋白；2：pELP-CTL4s裂解细菌的总蛋白；3：超声处理后，来自pELP-CTL4s的裂解细菌的沉淀；4：超声处理后来自pELP-CTL4s裂解细菌的上清液。

图9为实施例6中SDS-PAGE检测重组蛋白ELP-CTL4s的纯化结果。其中，1：用20mM咪唑-TBS洗脱；2-3：用100mM咪唑-TBS洗脱；4-5：用250mM咪唑-TBS洗脱。

图10为Western blot分析SUMO-CTL4s和SUMO-CTL4fl的表达情况。其中，1：pSUMO-CTL4fl的裂解细菌的总蛋白；2：超声处理后来自pSUMO-CTL4fl的裂解细菌的上清液；3：超声处理后来自pSUMO-CTL4fl的裂解细菌的沉淀；4：pSUMO-CTL4s的裂解细菌的总蛋白；5：超声处理后来自pSUMO-CTL4s的裂解细菌的沉淀；6：超声处理后来自pSUMO-CTL4s的裂解细菌的上清液。

图11为SDS-PAGE检测重组蛋白SUMO-CTL4s的纯化结果。其中，1：用20mM咪唑-TBS洗脱；2-4：用100mM咪唑-TBS洗脱；5：用250mM咪唑-TBS洗脱。

图12为SDS-PAGE检测重组蛋白SUMO-CTL4fl的纯化结果。其中，1：pSUMO-CTL4f1的裂解细菌的总蛋白；2：超声处理后来自pSUMO-CTL4f1裂解细菌的上清液；3：超声处理后来自pSUMO-CTL4f1的裂解细菌的沉淀；4：flow-through fraction；5：用20mM咪唑-TBS洗脱；6-8：用100mM咪唑-TBS洗脱；9：用250mM咪唑-TBS洗脱。

图13为重组蛋白SUMO-CTL4(SUMO-CTL4s和SUMO-CTL4fl)的红细胞凝集现象。

图14为重组蛋白SUMO-CTL4fl的细菌凝集活性分析。SUMO-CTL4f1在钙离子条件下强烈聚集粪肠球菌和肺炎克雷伯菌。显微照片上的粗条表示100μm。SUMO蛋白作为平行的阴性对照。

图15为重组蛋白SUMO-CTL4s的细菌凝集活性分析。显微照片上的粗条表示100μm。SUMO蛋白作为平行的阴性对照。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本申请的技术方案，具体实施例不代表对本申请保护范围的限制。其他人根据本申请理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本申请的保护范围。

实施例1通用的方法与步骤

cDNA分析方法

Alignment分析采用ClustalX(1.83)软件和Gene Doc软件完成，系统发生学分析(phylogenetics)基本上利用MEGA 4.1(Beta)软件完成。

基因克隆

取青岛文昌鱼全鱼，总RNA的提取参照Invitrogen公司TRIzol Reagent Kit说明书操作。取1μg总RNA，按照TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTraAce-α-TM说明书操作进行逆转录合成第一链。按照Invitrogen的GeneRacerTM Kit进行RNA的去磷酸化RACE、脱帽反应、RNA oligo的连接及mRNA的逆转录从而合成cDNA一链，采用Takara的LA Taq聚合酶按照GeneRacerTM Kit的反应体系进行PCR扩增。采用Takara的LATaq聚合酶扩增ORF框基因。

基因片段扩增引物和ORF扩增引物如下。

CTL4-f-F：5’-caagttaaggagcctcaacccag-3’

CTL4-f-R：5’-cgttccgccttgtgagtggac-3’

CTL4-ORF-F：5’-caggagaggttccacacaagt-3’

CTL4-ORF-R：5’-gtccgtcttgttccaggttag-3’

pET-SUMO载体的构建

对pET21b载体进行改造，构建pET-SUMO载体。以含有SUMO全长基因的pGEX-Teasyvector质粒(由蓝东明提供)为模板，采用引物S-F(含NdeI酶切位点)和S-R(含BamHI酶切位点)进行PCR扩增，用NdeI和BamHI限制性内切酶对扩增片段和预先纯化的pET21b质粒进行酶消化，通过琼脂糖凝胶纯化回收酶切产物，并用T4 DNA ligase进行连接。将连接产物转化至E.coli DH5α，筛选阳性克隆进行测序鉴定。

S-F：5’-GGGAATTC CATATG atgtcggactcagaagtcaa-3’

保护碱基NdeI

S-R：5’-CGC GGATCC GGTACCcaccaccaatctgtt ctctg-3’

保护碱基BamHI KpnI

重组蛋白的原核表达

用pET23a-ELP-GFP融合表达载体(由蓝东明提供)和pET-SUMO融合表达载体表达BjCTL4的全长序列和CTLD序列。基因扩增，酶切，产物回收，筛选亚克隆以及蛋白表达。大体过程为，以含有目的基因全长序列的pGEX-T easy vector质粒为模板，用相应的引物扩增片段，用合适的酶对扩增产物和预先纯化的载体质粒进行酶消化，琼脂糖凝胶纯化回收酶切产物，并用T4 DNAligase进行连接。将连接产物转化至E.coli DH5α，筛选克隆进行测序鉴定。将测序正确的重组表达质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，培养表达菌，用适量的IPTG诱导蛋白的表达后采用离心的方法收集细菌，超声波破碎细菌细胞后，分别取总菌、上清和沉淀通过SDS-PAGE(12％或15％)和Western blot方法检测外源蛋白的表达量及可溶性。

CTL4s-ELP-F：5’-CGG GGTACC gtctgtcctaaaggtgttgt-3’

保护碱基KpnⅠ

CTL4s-ELP-R：5’-CCG CTCGAG ttaatcagacttgcagacgtagtt-3’

保护碱基XhoⅠ

CTL4s-SUMO-F：5’-CGG GGTACC tagtctgtcctaaaggtgttgt-3’

保护碱基KpnⅠ

CTL4s-SUMO-R：5’-CCG CTCGAG atcagacttgcagacgtagtt-3’

保护碱基XhoⅠ

CTL4fl-SUMO-F：5’-CGG GGTACC tacaaggcggaacgtttctggctacg-3’

保护碱基KpnⅠ

CTL4fl-SUMO-R：5’-CCG CTCGAG cccggctctgcacgagaaa-3’

保护碱基XhoⅠ

其中，CTL4s-ELP-F和CTL4s-ELP-R为表达BjCTL4的CTLD序列的pET23a-ELP-GFP表达载体的上游、下游引物；CTL4s-SUMO-F(SEQ ID NO.5)和CTL4s-SUMO-R(SEQ ID NO.6)为为表达BjCTL4的CTLD序列的pET-SUMO表达载体的上游、下游引物；CTL4fl-SUMO-F(SEQ IDNO.7)和CTL4fl-SUMO-R(SEQ ID NO.8)为表达BjCTL4全长序列的pET-SUMO表达载体的上游、下游引物。

包涵体变复性

将经实施例3收集的沉淀蛋白用TBS缓冲液充分洗涤，采用离心方法(6,000rpm×10min)收集沉淀，重复洗涤两次，然后用不同浓度的尿素-TBS溶液洗涤沉淀，收集洗涤液制备电泳样品，通过SDS-PAGE分析方法检测洗涤效果，找出最佳洗涤和变性包涵体的条件。

包涵体变性的方法如下：将经过超声波破碎处理的细菌在4℃12,000rpm离心20min，收集菌体沉淀，按照1g沉淀：10ml溶液的比例用2M尿素-TBS缓冲液与包涵体孵育2h，室温12,000rpm×10min离心收集沉淀，重复孵育一次；将得到沉淀按照1g：50ml溶液的比例用4M尿素-TBS缓冲液溶解沉淀，加入磁力搅拌器促溶，室温12,000rpm×10min离心收集上清溶液备用。

包涵体的透析复性的方法如下：将透析袋剪成合适长度的小段，用10mM NaHCO₃溶液浸泡并煮沸5min，然后转移至10mM EDTA溶液煮沸5min，更换新鲜10mM EDTA溶液再次煮沸5min，用ddH₂O漂洗数次，置于20％乙醇短期保存。透析袋使用前用ddH₂O漂洗数次以除去乙醇，将变性蛋白上清液装入其中，以细绳封口，把透析袋转移至透析液buffer A，4℃透析24h，然后将透析袋转移至buffer B，4℃透析24h，最后将透析袋转移至buffer C，4℃透析12h，更换新鲜buffer C，4℃再次透析12h。最后4℃12,000rpm×15min离心收集复性蛋白，取上清液进行蛋白纯化。

蛋白的纯化和浓缩

采用Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析方法对重组可溶蛋白进行纯化，采用Millipore超滤离心管浓缩蛋白。

Ni²⁺-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析纯化：

Ni²⁺-Chelating Sepharose亲和层析柱大小约为(1.6cm×10cm)，操作过程维持4ml/min恒定流速。用5倍于柱床体积(VC)的ddH₂O清洗乙醇封存的Ni²⁺柱料以去除多余的乙醇；用2倍VC的0.2M NiSO4溶液与柱料孵育，使柱料结合Ni²⁺；用10倍VC的ddH₂O清洗柱料，以除去游离的Ni²⁺；用5倍VC的TBS缓冲液平衡柱料；将蛋白上清液与柱料孵育，使柱料结合目的蛋白；用TBS缓冲液洗涤柱料至紫外吸收峰达到基线水平，收集蛋白穿流峰溶液，并取少量制备电泳样品；分别用不同浓度咪唑-TBS缓冲液(20mM、100mM、250mM)洗脱蛋白，每个浓度咪唑溶液都洗至蛋白紫外吸收峰的平台期为止，收集洗脱峰溶液并制备电泳样品，通过SDS-PAGE方法检测。

Ni²⁺-Chelating Sepharose亲和层析柱的处理方法为：用至少2-5倍VC的ddH₂O清洗柱料；用10倍VC的含1M NaCl，50mM EDTA，pH8.0的溶液洗脱柱料上的Ni²⁺；用10倍VC的ddH₂O清洗柱料；用10倍VC的1.0M NaOH溶液去除残留蛋白(限性流速1.0ml/min)；最后用至少10倍VC的ddH₂O清洗柱料，直至洗脱液pH≈7.0停止，用20％乙醇封存层析柱。

蛋白的浓缩：

用蒸馏水清洗新购置的Millipore超滤离心管数遍，然后用TBS缓冲液平衡数遍；把纯化过的蛋白溶液与预冷的TBS缓冲液按照1：10比例(V：V)稀释混匀，加至超滤离心管，4℃<4,000g离心15min后，收集上层液(约1ml)；按之前步骤重复稀释和离心3-5遍，以稀释蛋白溶液中的咪唑；最后一次离心至蛋白溶液原体积的1/4-1/2以达到浓缩蛋白的效果；用大量蒸馏水清洗超滤离心管，用蒸馏水短期封存于4℃冰箱，用20％乙醇长期封存于-20℃冰箱。

红细胞凝集实验

实验采用α-乳糖(α-lactose)，D-甘露糖(D-Mannose)，D-果糖(D-Fructose)，D-半乳糖(D-Galactose)，葡萄糖(Glucose)，麦芽糖(Maltose)，蔗糖(Sucrose)，N-乙酰半乳糖胺(N-GlcNAc)，大肠杆菌E.coli 0111:B4脂多糖(LPS)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的脂磷酸壁(LTA)9种糖类，每个浓度重复三次。以TRX和SUMO融合蛋白作为阴性对照。

红细胞凝集活力鉴定

1)红细胞的制备：分别取兔和小鼠的全血，用适量3.8％(V：V)枸橼酸钠溶液抗凝；抗凝血经1,000rpm离心5min除去血浆；加10倍体积TBS缓冲液充分洗涤红细胞沉淀，1,000rpm离心3min，弃上清液，重复三次，最后一次用1,500rpm离心3min弃去上清后，加入适量TBS缓冲液至红细胞沉淀中配成5％(V：V)红细胞悬浮液。

2)红细胞凝集活力测定在96孔V型微量血凝板中进行，分别在各V型孔加入15μl红细胞悬液，1μl 1M CaCl₂，不同浓度蛋白溶液，用TBS补平至总体积100μl，温和混匀，室温放置1-2h，肉眼观察。如红细胞不发生凝集，则在V型血凝板小孔内自然沉降形成一界线清晰的红色小点；如发生凝集，则形成网络扩散状的红斑块。使红细胞发生凝集的最低浓度蛋白溶液则为该蛋白的红细胞凝集活力。测定蛋白活力是否钙依赖型的方法类似，分别在各V型孔加入15μl红细胞悬液，凝集活力浓度的蛋白溶液，不同浓度的CaCl₂/EDTA，用TBS补平至总体积100μl，温和混匀，室温放置1-2h，肉眼观察红细胞凝集的情况。

微生物凝集实验

本实验针对的微生物包括：腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus.aureus)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，鳗弧菌(Vibrioanguillarum)，枯草杆菌(Bacillus subtilis)，醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，贝内氏菌(Beneckea)和巴氏葡萄球菌(Staphylococcus pasteuri)。

实验方法：通过离心的方法(室温6,000rpm×5min)收集各菌，然后用TBS缓冲液洗涤，室温6,000rpm×5min离心收集各菌，重复洗涤两次后稀释至OD₆₀₀约为1。取稀释好的菌液950μl，加入50μl FITC溶液(溶于DMSO，终浓度为10mg/ml)与之孵育，避光摇晃1h。接着，用大量TBS缓冲液洗去未结合的FITC，最后把细菌悬浮在含有10mM的CaCl₂的TBS缓冲液中备用。在96孔平底板的每孔上加入10μl的菌悬浮液(大约包含1×10⁷CFU/ml细菌)，适量包含终浓度10mM CaCl₂的蛋白溶液，用TBS缓冲液补平体系至100μl，充分混匀后避光静置1-2h，最后在荧光显微镜下检测其凝集活性。为了检测钙离子对微生物凝集活性的影响，加入终浓度10mM的EDTA溶液开展相应实验。以TRX蛋白作为阴性对照开展平行对照实验。

实施例2 cDNA全长扩增和序列分析

在青岛文昌鱼消化道cDNA文库中发现了包含CTLD的分子，序列分析表明基因片段的5’和3’末端均不完全，通过RACE扩增，得到基因的全长序列，命名为BjCTL4。

BjCTL4的序列如SEQ ID NO.：1所示。

信号序列显示为阴影区域。CTLD用下划线标出。“WIGL”和甘露糖/葡萄糖识别位点(QPD/EPN)用方框标出。

将BjCTL4蛋白分子以及人的代表性CTLs的CTLD进行Alignment比对分析发现，文昌鱼的这个CTL样分子具有传统CTL的基本特征，包括两对或者三对保守的二硫键，特征性基序WIGL的类似基序，以及与Ca²⁺相关的糖结合基序QPD/EPN和WND的类似基序(图1)，预测这它们可能具有凝集素分子的基本活性。

实施例3 BjCTL4的CTLDs序列分析

BjCTL4基因全长2,059bp，编码475个aa。SMART预测结果显示，这个基因编码的蛋白质是由N端信号肽、数个表皮生长因子EGF结构域以及一个CTLD所组成的，属于分泌型的凝集素分子(图2)。

对BjCTL4编码蛋白进行序列分析发现，该分子包含三对半胱氨酸，属于分泌型的长环CTLs，它们原始简单的结构已经具有大部分传统CTL分子的特性，包括保守的半胱氨酸和WIGL基序，以及特征基序EPN/QPD和WND基序(BjCTL4是EPT)。EPN和WND的基序与钙离子依赖型的糖结合作用相关，某些CTL分子的EPN基序可能被QPD这种保守基序取代。EPN/QPD两个基序中间的脯氨酸高度保守，将邻近两个能够提供钙离子结合位点的羰基支链以顺式或反式的方式分开，并调整它们至钙离子结合所需要的合适位置，从而在钙离子的协助下与特异单糖形成氢键。具有EPN基序的分子多数具备与甘露糖或葡萄糖结合的活性，而具有QPD基序的分子则具备与半乳糖结合的活性。BjCTL4分子虽然保留了特征基序EPN/QPD，但是在序列上稍有差别，暗示该分子的CTLDs的钙离子和糖结合活性可能会区别于传统的CTLDcps。

实施例4 pET-SUMO表达载体构建

改造pET21b载体为pET-SUMO载体。

以包含SUMO基因的pGEX-T easy质粒为模板，设计合适的引物进行PCR扩增，获得与预期PCR产物相符的特异条带(图3)。将纯化回收的基因片段用NdeI和BamHI酶切后，与经NdeI和BamHI酶切过的线性载体pET21b进行连接，构建融合表达质粒pET-SUMO，整体构建步骤如图4所示。用T7和T7T引物对阳性克隆的重组质粒进行双向序列测定，测序结果与预期一致，目的片段正确插入质粒中。另外，双酶切鉴定实验也显示重组质粒构建成功(图5)。

实施例5 BjCTL4原核表达载体的构建

如实施例3的结果可知，BjCTL4蛋白结构较为复杂，包含数个表皮生长因子EGF结构域和单个CTLD，故针对BjCTL4的全长序列以及CTLD进行体外重组表达。

采用包含ELP标签的pET23a-ELP-GFP融合表达载体对BjCTL4的CTLD进行表达，将酶切过的BjCTL4-CTLD基因片段(图6)与酶切过的线性载体连接，构建融合表达质粒pELP-GFP-CTL4-CTLD(简称pELP-CTL4s)。采用包含SUMO标签的pET-SUMO表达载体对BjCTL4的全长序列以及CTLD进行体外重组表达，将酶切过的BjCTL4的CTLD基因片段以及全长片段(切除信号肽区域)(图7)与酶切过的线性载体pET-SUMO连接，构建融合表达质粒pSUMO-CTL4-CTLD(简称pSUMO-CTL4s和pSUMO-CTL4fl)，用T7和T7T引物对阳性克隆的重组质粒进行双向序列测定，测序结果与预期结果一致，目的片段均正确插入重组质粒中。

实施例6 ELP-CTL4s重组蛋白的表达和纯化

将实施例5制备的融合表达质粒pELP-CTL4s转化到E.coli菌株BL21(DE3)中构建工程菌株，培养表达菌以获得蛋白，并检测目的蛋白在工程菌株中的表达情况。

软件预测融合伴侣ELP的分子量大约为40.9kDa，BjCTL4s蛋白为14.1kDa，故ELP-CTL4s重组蛋白分子量为55.0kDa。Western blot检测结果表明，这个重组融合蛋白分子量与预测值一致，且主要以可溶的形式大量表达在宿主菌中(图8)。

以盐溶解的方法对可溶蛋白进行粗纯化(具体方法见蓝东明的毕业论文)，然后通过Ni²⁺-Chelating Sepharose层析法进行第二次纯化，用不同浓度咪唑洗脱蛋白并进行SDS-PAGE分析。结果表明，ELP-CTL4s重组蛋白可以被20mM，100mM和250mM咪唑-TBS溶液洗脱下来，纯度和浓度均比较高(图9)。

实施例7 SUMO-CTL4s和SUMO-CTL4fl蛋白的表达和纯化

将融合表达质粒pSUMO-CTL4s和pSUMO-CTL4fl转化到E.coli菌株BL21(DE3)中构建工程菌株，按照之前叙述的方法进行蛋白表达，然后收集总菌、沉淀和上清制备样品，并通过12％的SDS-PAGE电泳和Western blot分析各个蛋白的表达情况。软件预测融合伴侣SUMO的分子量理论值为12.8kDa，BjCTL4s蛋白为14.1kDa，BjCTL4fl蛋白为48.4kDa，故SUMO-CTL4s重组蛋白理论分子量为26.9kDa，SUMO-CTL4fl蛋白为61.2kDa，。Western blot检测结果表明，这两个重组融合蛋白的分子量与预测值一致，SUMO-CTL4s蛋白以可溶的形式大量表达在细菌中，而SUMO-CTL4fl蛋白主要以沉淀形式存在，但也有一定量可溶蛋白(图10)。

通过Ni²⁺-Chelating Sepharose层析方法对可溶蛋白进行纯化，用不同浓度咪唑洗脱蛋白并进行SDS-PAGE分析，结果表明，四个目的蛋白均得到一定程度的纯化(图11和12)

实施例8红细胞凝集活性鉴定

红细胞凝集活性鉴定结果表明，SUMO-CTL4s和SUMO-CTL4fl两个蛋白在10mM钙离子的参与下诱导小鼠红细胞发生凝集，同等浓度的ELP-CTL4s不能诱导红细胞的凝集；在凝集体系中加入10mM EDTA后，蛋白的凝集活性被完全抑制(图13)，可见这两个蛋白的红细胞凝集活性都是钙离子依赖性的。通过倍比稀释，获得各个蛋白的红细胞凝集活力：SUMO-CTL4s约为30g，SUMO-CTL4fl约为100g。ELP-CTL4s没有显示红细胞凝集活性可能因为融合伴体ELP太大，影响了其蛋白活性的发挥。

实施例9细菌凝集实验

为了研究SUMO-CTL4s和SUMO-CTL4fl蛋白是否会引起微生物的凝集，将FITC标记的大肠杆菌、贝内氏菌、巴氏葡萄球菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯氏菌与重组蛋白共孵育，通过荧光显微镜观测各微生物的凝集情况。

结果发现，在10mM钙离子的参与下，SUMO-CTL4fl能较强烈地凝集革兰氏阴性菌(G-)肺炎克雷伯氏菌，稍微弱地凝集革兰氏阳性菌(G+)粪肠球菌(图14)；SUMO-CTL4s除了能对以上两种细菌产生凝集作用以外，还能较为强烈地凝集巴氏葡萄球菌(G+)，稍微弱地凝集大肠杆菌(G-)和贝内克氏菌(G-)(图15)。

可见，BjCTL4初步具备PRRs的细菌识别和结合活性，尽管活性不是非常强烈，并且其细菌凝集功能的发挥主要依赖于CTLD对PAMPs的识别特异性。

序列表

<110> 广东食品药品职业学院

<120> 文昌鱼C型凝集素BjCTL4基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2059

<212> DNA

<213> 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)

<220>

<223> BjCTL4 基因

<220>

<221> misc_feature

<222> (1475)..(1475)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1530)..(1530)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1541)..(1541)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1555)..(1555)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1557)..(1557)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1559)..(1559)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1823)..(1823)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1880)..(1880)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1953)..(1953)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1955)..(1955)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1958)..(1958)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (1967)..(1967)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2003)..(2003)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2056)..(2056)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

atgtggacgc tcctgttctt gaccttggct gcggccgcct gtccggtcca ctcacaaggc 60

ggaacgtttc tggctacgta tttgggctac gactacttca aagtaccagc ctcaggccag 120

atgagcagcg cgaacgtcaa ggctacttgc gacggagcgg gttacgtcac accgtgtccc 180

ggggacggaa cctgccagtt ttcgtcagcc gactgtgtcc tgactgggct tactaactgc 240

aacaatccaa tgtacgaagt atccgacgtt ctttgcggtg acaatccccg gtattgtccg 300

gcgtttgacg gagtgtacag cttcctgggc aaccatgcga acggtgcctg cggtgtggag 360

ggtggcagca tgtgcacgac cgggaatagc tactataacc gctacgcctt ctgcgcccgt 420

gtggaggtga acgagtgcag cagcgacccc tgtcagaatg gtgcatcatg tcaggacggg 480

ggaaacagtt ttacctgtca gtgtgcacct gggtacactg gaactctctg tgaaacggac 540

atcgacgagt gtgcgggcat tgagtgcctg tccggtggaa cctgcgtgga tcacgtgaac 600

ggctacagct gtgtctgtcc taaaggtgtt gtcggagaca agtgtgaaac ggtccaatac 660

gctgacggct gcctgctgtt ctccttcgat gccgtctcct actccgaagc gagccaggag 720

tgccagacca ggggagggca cctggtggat gtgaaggagg ccgagctgca gcgtctcatc 780

gctgatacca ttcctaccgg aagtgacgtg tccccgtgga tcggactcaa gctgtcgccc 840

ggggtcatga cctatgctga cgggaccggt gtctcgggcc agctgcagtg gtcggccagt 900

gagcccacca cttcctgtga cctgtgcgct tacctggaca gctcggacga ccatcgtgcc 960

aaaaccgcct cctgtactga gagacacaac tacgtctgca agtctgatcc caagccctgc 1020

caacggaaca tctgctacaa caacggcgtc tgctcgacct gctttaacga ctcctacagc 1080

gtctgttcct gcctgcctgg atatgagggg gacatttgca atatggatat tgacgagtgc 1140

tcctcgaatc cttgtcaaaa cggcggaagc tgcaataacg cccagaactc gtacttttgc 1200

cactgcagta ttgggtatgg aggcaacaac tgccaaacag atctggacct gtgcgcccag 1260

gttgtctgcc cgttcaactg gcagtgtcag gacgagggga accacttcat ctgtctcgcc 1320

ggaatgacca ggcttgttga gccttatgtg tgcagcagcg cctcctgtcc ggacggcatg 1380

tactgcaagg aggaggggcc ggcatctttc tcgtgcagag ccgggtgacg tcatcacgag 1440

tctaacctgg aacaagacgg accggaatcg gaacncgaac caaaacacgc tgacaaaaaa 1500

cacagattaa gctaaattaa cccttagttn ttcttactca nccttttgct ttacncncnt 1560

tagtgccgtt atagatcaga cagcatctat tcctaaccct tgtgcctacg tgtgtgtgtg 1620

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtatg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgcact 1680

atctttcaac agttaatgct ccttaagtga aatgacaaca tgattcatag atgttttatt 1740

gtaacaaata tgcgtgatat aacaaaatgg tctatccaac ttctgttaaa atagtactgt 1800

tctacgaatg tgtacaacga ttnttttgtg tgatgcttca tagtatgata taggtaatta 1860

tcttgttttg tgaaataatn tgaagatgat acaatatact ttaatgattc cacaacaacg 1920

tatcgttata acgctagtta ggaaaatagc atntnttntt ggcagtntga ctttttcaac 1980

actttcctcg caaatgtaga ctntaataaa tgactaatca agcaaaaaaa aaaaaaaaaa 2040

aaaaaaaaaa aaacangtc 2059

<210> 2

<211> 387

<212> DNA

<213> 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)

<220>

<223> BjCTL4基因编码CTLD的片段

<400> 2

tgtcctaaag gtgttgtcgg agacaagtgt gaaacggtcc aatacgctga cggctgcctg 60

ctgttctcct tcgatgccgt ctcctactcc gaagcgagcc aggagtgcca gaccagggga 120

gggcacctgg tggatgtgaa ggaggccgag ctgcagcgtc tcatcgctga taccattcct 180

accggaagtg acgtgtcccc gtggatcgga ctcaagctgt cgcccggggt catgacctat 240

gctgacggga ccggtgtctc gggccagctg cagtggtcgg ccagtgagcc caccacttcc 300

tgtgacctgt gcgcttacct ggacagctcg gacgaccatc gtgccaaaac cgcctcctgt 360

actgagagac acaactacgt ctgcaag 387

<210> 3

<211> 475

<212> PRT

<213> 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)

<220>

<223> BjCTL4全长蛋白

<400> 3

Met Trp Thr Leu Leu Phe Leu Thr Leu Ala Ala Ala Ala Cys Pro Val

1 5 10 15

His Ser Gln Gly Gly Thr Phe Leu Ala Thr Tyr Leu Gly Tyr Asp Tyr

20 25 30

Phe Lys Val Pro Ala Ser Gly Gln Met Ser Ser Ala Asn Val Lys Ala

35 40 45

Thr Cys Asp Gly Ala Gly Tyr Val Thr Pro Cys Pro Gly Asp Gly Thr

50 55 60

Cys Gln Phe Ser Ser Ala Asp Cys Val Leu Thr Gly Leu Thr Asn Cys

65 70 75 80

Asn Asn Pro Met Tyr Glu Val Ser Asp Val Leu Cys Gly Asp Asn Pro

85 90 95

Arg Tyr Cys Pro Ala Phe Asp Gly Val Tyr Ser Phe Leu Gly Asn His

100 105 110

Ala Asn Gly Ala Cys Gly Val Glu Gly Gly Ser Met Cys Thr Thr Gly

115 120 125

Asn Ser Tyr Tyr Asn Arg Tyr Ala Phe Cys Ala Arg Val Glu Val Asn

130 135 140

Glu Cys Ser Ser Asp Pro Cys Gln Asn Gly Ala Ser Cys Gln Asp Gly

145 150 155 160

Gly Asn Ser Phe Thr Cys Gln Cys Ala Pro Gly Tyr Thr Gly Thr Leu

165 170 175

Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ala Gly Ile Glu Cys Leu Ser Gly

180 185 190

Gly Thr Cys Val Asp His Val Asn Gly Tyr Ser Cys Val Cys Pro Lys

195 200 205

Gly Val Val Gly Asp Lys Cys Glu Thr Val Gln Tyr Ala Asp Gly Cys

210 215 220

Leu Leu Phe Ser Phe Asp Ala Val Ser Tyr Ser Glu Ala Ser Gln Glu

225 230 235 240

Cys Gln Thr Arg Gly Gly His Leu Val Asp Val Lys Glu Ala Glu Leu

245 250 255

Gln Arg Leu Ile Ala Asp Thr Ile Pro Thr Gly Ser Asp Val Ser Pro

260 265 270

Trp Ile Gly Leu Lys Leu Ser Pro Gly Val Met Thr Tyr Ala Asp Gly

275 280 285

Thr Gly Val Ser Gly Gln Leu Gln Trp Ser Ala Ser Glu Pro Thr Thr

290 295 300

Ser Cys Asp Leu Cys Ala Tyr Leu Asp Ser Ser Asp Asp His Arg Ala

305 310 315 320

Lys Thr Ala Ser Cys Thr Glu Arg His Asn Tyr Val Cys Lys Ser Asp

325 330 335

Pro Lys Pro Cys Gln Arg Asn Ile Cys Tyr Asn Asn Gly Val Cys Ser

340 345 350

Thr Cys Phe Asn Asp Ser Tyr Ser Val Cys Ser Cys Leu Pro Gly Tyr

355 360 365

Glu Gly Asp Ile Cys Asn Met Asp Ile Asp Glu Cys Ser Ser Asn Pro

370 375 380

Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Asn Asn Ala Gln Asn Ser Tyr Phe Cys

385 390 395 400

His Cys Ser Ile Gly Tyr Gly Gly Asn Asn Cys Gln Thr Asp Leu Asp

405 410 415

Leu Cys Ala Gln Val Val Cys Pro Phe Asn Trp Gln Cys Gln Asp Glu

420 425 430

Gly Asn His Phe Ile Cys Leu Ala Gly Met Thr Arg Leu Val Glu Pro

435 440 445

Tyr Val Cys Ser Ser Ala Ser Cys Pro Asp Gly Met Tyr Cys Lys Glu

450 455 460

Glu Gly Pro Ala Ser Phe Ser Cys Arg Ala Gly

465 470 475

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)

<220>

<223> BjCTL4蛋白的CTLD

<400> 4

Cys Pro Lys Gly Val Val Gly Asp Lys Cys Glu Thr Val Gln Tyr Ala

1 5 10 15

Asp Gly Cys Leu Leu Phe Ser Phe Asp Ala Val Ser Tyr Ser Glu Ala

20 25 30

Ser Gln Glu Cys Gln Thr Arg Gly Gly His Leu Val Asp Val Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Leu Gln Arg Leu Ile Ala Asp Thr Ile Pro Thr Gly Ser Asp

50 55 60

Val Ser Pro Trp Ile Gly Leu Lys Leu Ser Pro Gly Val Met Thr Tyr

65 70 75 80

Ala Asp Gly Thr Gly Val Ser Gly Gln Leu Gln Trp Ser Ala Ser Glu

85 90 95

Pro Thr Thr Ser Cys Asp Leu Cys Ala Tyr Leu Asp Ser Ser Asp Asp

100 105 110

His Arg Ala Lys Thr Ala Ser Cys Thr Glu Arg His Asn Tyr Val Cys

115 120 125

Lys

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTL4s-SUMO-F

<400> 5

cggggtacct agtctgtcct aaaggtgttg t 31

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTL4s-SUMO-R

<400> 6

ccgctcgaga tcagacttgc agacgtagtt 30

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTL4fl-SUMO-F

<400> 7

cggggtacct acaaggcgga acgtttctgg ctacg 35

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTL4fl-SUMO-R

<400> 8

ccgctcgagc ccggctctgc acgagaaa 28

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种多肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO.：3所示。

3.一种核酸，其编码如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQID NO：2所示。

4.一种核酸，其编码如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述核酸分子的序列如SEQID NO：1所示。

5.权利要求1所述的多肽的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建载有如权利要求3所述的核酸的重组表达载体；

S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；

S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；

S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行多肽的提取和纯化。

6.如权利要求5所述的表达方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

S1.1根据如权利要求3所述的核酸的序列设计引物；

S1.2以含有如权利要求3所述的核酸序列的pGEX-T easy vector质粒为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；

7.如权利要求6所述的表达方法，其特征在于，所述引物的选自SEQ ID NO.：5和SEQ IDNO.：6所示的引物。

8.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建载有如权利要求4所述的核酸的重组表达载体；

S2.将步骤S1制备的重组表达载体转化宿主细胞；

S3.对步骤S2制备的转化后的宿主细胞进行培养；

S4.对步骤S3培养后的宿主细胞进行多肽的提取和纯化。

9.如权利要求8所述的表达方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

S1.1根据如权利要求4所述的核酸的序列设计引物；

S1.2以含有如权利要求4所述的核酸序列的pGEX-T easy vector质粒为模板，以S1.1的引物进行PCR扩增；

10.如权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述引物的选自SEQ ID NO.：7和SEQID NO.：8所示的引物。

11.如权利要求6或9所述的表达方法，其特征在于，所述引物含有Kpn I和/或Xho I切割位点。

12.如权利要求5或8所述的表达方法，其特征在于，所述步骤S4中蛋白的纯化选自亲和层析法。

13.如权利要求12所述的表达方法，其特征在于，所述亲和层析法选自Ni²⁺-ChelatingSepharose Fast Flow。

14.一种载体，其包含如权利要求3所述的核酸分子。

15.一种载体，其包含如权利要求4所述的核酸分子。

16.如权利要求14或15所述的载体，其特征在于，所述载体选自质粒、噬菌体、人工染色体、病毒中的至少一种。

17.如权利要求14或15所述的载体，其特征在于，所述载体选自质粒。

18.如权利要求14或15所述的载体，其特征在于，所述载体选自pET23a-ELP-GFP或pET-SUMO。

19.一种细胞，其包含如权利要求3或4所述的核酸或如权利要求14或15所述的载体。

20.如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自原核细胞。

21.如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自大肠杆菌。

22.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)菌株。

23.一种药物组合物，其包含权利要求1或2任一所述的多肽，或权利要求3或4所述的核酸，或权利要求14或15所述的载体，或权利要求19所述的细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

24.权利要求1或2任一所述的多肽及其融合蛋白、或权利要求3或4所述的核酸、或权利要求14或15所述的载体、或权利要求19所述的细胞、或权利要求23所述的药物组合物在制备抗感染性疾病药物中的应用；所述感染性疾病选自细菌引起的感染，所述细菌选自肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、巴氏葡萄球菌、大肠杆菌和贝内克氏菌中的至少一种。

25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白或ELP融合蛋白中的一种或两种。

26.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述融合蛋白选自SUMO融合蛋白。