CN107090030A - 含有fgfr，磷脂双分子层和膜骨架蛋白msp的类膜体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白的类膜体系及其制备方法，具体涉及利用FGFR组装纳米盘(nanodisc)的方法和利用含有FGFR的纳米盘在抗体筛选和药物筛选方面的应用。

Description

含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系及其制 备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系及其组装方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子受体属于酪氨酸(Fibroblast Growth Factor Receptor，FGFRs)激酶超家族中的成员。人类FGFR家族具有四个成员，FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。FGFR家族在生物体的生理和代谢活动中具有十分重要的功能，包括胚胎发育、受伤组织修复、血管的生成、细胞增殖、细胞迁移和细胞分化等，异常的信号通路可能会导致癌症的发生。因此，FGFRs成为了肿瘤学中潜在的药物靶标，研究FGFRs的信号通路、作用机制和原理对相关的疾病研究和药物开发具有十分重要的意义。

FGFR在结构上一般分为三个部分，膜外配体结合区、跨膜区、膜内激酶区。在蛋白质水平上FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4大约有55％～72％的同源序列，因此具有很高的同源性。膜外区主要包括一个疏水的信号肽段，2～3个类免疫球蛋白结构域(D1～D3)，在D1区和D2区之间有一个～30个苏氨酸的酸盒，D2和D3结构区是结合配体(FGF)和硫酸肝素(HPSG)的区域；跨膜区的功能是把物质和信号从膜外区传送到膜内区；在膜内区的部分，靠近细胞膜的区段被称为近膜区，近膜区连接着膜内的酪氨酸激酶区域；在膜内区最末端是C端。体外对FGFR的研究还只限制在FGFR的单结构域的研究，没有在整体的结构水平下对FGFR的功能进行研究，因此，如果能够在体外构建一种含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系(包括FGFR的包含跨膜区，膜外配体结合区，膜内激酶区)，模拟天然的FGFR的生理条件，对于真实和准确的研究FGFR的功能具有深远的意义，同时利用所述类膜体系为FGFR的功能研究，FGFR抗体的制备及FGFR抑制剂的筛选及改造，提供了有利的工具。

发明内容

为了解决上述问题，本发明人经过深入研究，开发出人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系及其制备方法，并在多个方面利用所述人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系。

具体而言，本发明提供一种人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系，所述类膜体系包含：

1)成纤维细胞生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptor，FGFR)，

2)磷脂双分子层，

3)膜骨架蛋白(Membrane Scaffoldprotein，MSP)，

其中，MSP包裹磷脂形成磷脂双分子层，FGFR的胞外区在磷脂双分子层的一侧，FGFR的胞内区在磷脂双分子层的另一侧，FGFR的跨膜区由磷酸双分子层包裹，并贯穿整个磷脂双分子层。

在优选的实施方案中，所述磷脂双分子层是碟状的。

在优选的实施方案中，所述FGFR包括FGFRlc(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)、FGFR1b(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)、FGFR2c(其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)、FGFR2b(其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)、FGFR3c(其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示)、FGFR3b(其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)、FGFR4(其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示)，或在包含跨膜区的前提下与上述任意一种具有60％以上，优选80以上，还优选95％以上，更优选99％以上的同源性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，用于形成类膜体系的所述磷脂包括所有的磷脂，优选选自POPG(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油))或POPC(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)或POPE(1-十六酰基-2-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)或POPS(1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸)或DOPG(1，2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-rac-甘油))或DOPC(1，2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱)或DOPE(1，2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)或DOPS(1，2-二-(9Z-十八碳烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-L-丝氨酸)或PI(3，4)P21-十七酰-2-(5Z，8Z，11Z，14Z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-3′，4′-二磷酸)或PI(4，5)P2(1-十七酰-2-(5Z，8Z，11Z，14Z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-4′，5′-二磷酸))或PI(3，4，5)P3(1-十七酰-2-(5Z，8Z，11Z，14Z-花生四烯酰)-sn-甘油基-3-磷酸-(1′-肌肉-肌醇-3′，4′，5′-三磷酸))。所述磷脂最优选选自POPG和POPC，其中磷脂的组成由它们中的一种及多种按照不同比例混合。

在优选的实施方案中，所述比例是其中一种磷脂可以是1％-100％。

在优选的实施方案中，膜骨架蛋白MSP包括MSP1D1(其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示)，MSP1D1DH7-10(其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示)，MSP1D1DH5(其氨基酸序列如SEQID NO：10所示)，或与MSP序列具有70％以上，优选80％以上，还优选90％上，更优选95％以上，最优选98％以上的同源性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，所述人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系通过以下步骤构建：

1)将FGFR编码基因插入到真核表达载体中，并用真核细胞表达FGFR蛋白；

2)将纯化的所述FGFR蛋白与MSP，磷脂和去污剂混合；

3)去除步骤2)中多余的去污剂；

4)分离含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系。

在优选的实施方案中，所述真核表达载体可以是哺乳动物表达载体和或昆虫细胞表达载体。

在优选的实施方案中，FGFR蛋白与MSP，磷脂和去污剂的比例为1∶1-2：50-100∶100-200，优选比例为为1∶1∶50∶100。

在优选的实施方案中，其中FGFR蛋白，MSP，磷脂和去污剂中任意两种成分的可选比例是原比例的0.01-100倍，优选比例为0.1-10倍更优选比例为0.5-5倍，最优选比例为0.8-2.5倍。

在优选的实施方案中，所述去污剂选自聚乙二醇辛基苯基醚(triton)或胆酸钠，更优选胆酸钠。

在优选的实施方案中，所述磷脂选自POPG、POPC、POPE、POPS、DOPG、DOPC、DOPE、DOPS、DMPC、PI(3，4)P2、PI(4，5)P2、PI(3，4，5)P3或其组合，优选为POPG。

本发明还提供一种制备所述人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将FGFR编码基因插入到真核中，并用真核细胞表达FGFR蛋白；

2)将纯化的所述FGFR蛋白与MSP，磷脂和去污剂按照一定比例混合；

3)去除来自步骤2)中的去污剂；和

4)分离含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系。

在优选的实施方案中，所述真核表达载体可以是哺乳动物表达载体和或昆虫细胞表达载体。

在优选的实施方案中，FGFR蛋白与MSP，磷脂和去污剂的比例中可选比例为1∶1-2∶30-100∶100-200，优选为1∶1∶40∶80。

在优选的实施方案中，其中任意两种成分的可选比例是原比例的0.01-100倍，优选比例为0.1-10倍更优选比例为0.5-5倍，最优选比例为0.8-2.5倍。

在优选的实施方案中，所述去污剂选自壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)，聚乙二醇辛基苯基醚(triton)，或胆酸钠，更优选胆酸钠。

在本发明中，MSP是由Apolipoprotein A-I(ApoA-I)蛋白改造得到的两亲性蛋白，其包裹磷脂形成的纳米级碟状磷脂双分子层，进一步的，将FGFR迁入到纳米盘中，其中FGFR的胞外区在纳米盘的磷脂双分子层的一侧，FGFR的胞内区在纳米盘的磷脂双分子成的另一侧，FGFR的跨膜区由磷酸双分子层包裹，并贯穿整个磷脂双分子层。

需要注意的是，本领域技术人员知晓成纤维细胞生长因子受体酪氨酸(FGFR)家族包括FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4等7个成员，它们具有很高的同源性，都为单跨膜的膜蛋白，所以在纳米盘的组装方法上具有共性。

因此，本发明中所述的“FGFR蛋白”是指天然存在于人中的成熟FGFR蛋白，在典型的情况下，FGFR蛋白包括七种，分别是FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-7所示，或在包含所述FGFR的跨膜区的前提下与SEQ ID NO：1-7具有60％以上，优选80％以上，还优选95％以上，更优选99％以上的同源性的氨基酸序列。

在优选的实施方案中，所述真核表达载体是pFastBac^TM1，pFastBac^TM-Gus，pFastBac^TMHT，pFastBac^TMHT-CAT，pFastBac^TMDual或pFastBac^TMDual-Gus/CAT，用蓝白斑筛选法筛选出插入有目的片段，即FGFR编码基因的表达载体。

在优选的实施方案中，所述真核细胞是昆虫细胞，优选Sf9或Sf21细胞。

在优选的实施方案中，通过用含有tritonX-100的裂解缓冲液裂解细胞，通过肝素层析柱进行纯化，获得FGFR蛋白。所述去污剂是本领域技术人员公知和常用的。

在优选的实施方案中，步骤3)中所述的多余的去污剂用biobeads去除。

在优选的实施方案中，步骤4)中所述分离利用分子筛进行。用于本发明的分子筛是本领域技术人员已知的，例如FPLC分子筛(Superdex 200 10/300GL，GE)。、

在优选的实施方案中，磷脂(lipid)是POPG或POPC或POPE或POPS或DOPG或DOPC或DOPE或DOPS，或PIP2或PIP3或CLP的一种，或是其中两种及两以上的混合物，其中混合比例可以是任意的。

在优选的实施方案中，所加入的去污剂是胆酸钠。

在优选的实施方案中，所述MSP：磷脂：胆酸钠：FGFR1c的比例是1∶50∶100∶1。

本发明还提供所述的人造的含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系用于制备抗体、药物筛选或开发FGFR活性检测试剂盒的用途，所述药物优选为FGFR抑制剂。

本发明制备的含有FGFR的纳米盘(Nanodisc)的主要优点是能够使不易溶解的蛋白如FGFR等跨膜蛋白在没有去污剂的条件下溶解，并且使FGFR存在于一种接近天然磷脂双分子层环境中，形成的纳米盘大小均一，且尺寸可控。

附图说明

图1FGFR1c核酸电泳图

图2.FGFR1c蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

图3.MSP蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图

图4.FGFR1c的纳米盘分子排阻层析图

图5.FGFR1c的纳米盘的SDS-PAGE凝胶电泳图

图6.FGFR1c的纳米盘的透射电镜图

图7.FGFR1c的纳米盘的磷酸化及抑制剂药效的western blot图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施中实验主要试剂耗材及仪器：克隆所用引物均为上海生工合成。聚合酶链式反应(PCR)中DNA聚合酶(primer star)、限制性内切酶、连接酶、Dpn l均购于Takara公司；DNA marker购于Thermo公司；普通DNA产物回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购于TIANGEN公司。E.coliDH5α菌株，E.coliDH10菌株，E.coliBL21菌株，pET22b-SUMO-FGF21质粒，SUMO蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司。

S.O.C培养基、Tris、咪唑、抗生素购置于上海生工，其他盐类购于国药，浓缩管购于Millipore。FPLC仪器使用的是GE公司的系统，使用的肝素亲和层析柱，Ni-sepharose层析柱和分子排阻层析柱Hiload 16/60Superdex75pg均购于GE公司。昆虫细胞培养基(Sf-900TM II SFM)，购自gibco。BCA试剂盒购于Thermo，FGFR酪氨酸磷酸化抗体购自R&D。实施例1.FGFR1c的克隆与阳性筛选

以合成的FGFR1c为模板，进行PCR扩增，所述FGFR1c的序列如SEQ ID NO：1所示。所使用的两条引物的序列分别为：

P1：5’-CCCGGATCCATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTC-3’(SEQ ID NO：12)，

P2：5’-CGCAAGCTTCAAGCGGCGTTTGAGTCCGCCATTG-3’(SEQ ID NO：13)。

在它们的两端分别含有限制性内切酶BamHI和HindIII的酶切位点。PCR反应条件为：94℃，5min；60℃，30s；72℃，3min，循环次数为30次，72℃，5min。琼脂糖电泳检测，如图1所示。PCR产物纯化试剂盒进行回收并将产物送交生工公司测序。pFastBac^TM1载体(购置invitrogen)与PCR扩增的FGFR1c的DNA片段用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，以获得两端分别为BamHI和HindIII酶切产生的粘性末端的pFastBac^TM1载体和FGFR1c(22-765)的DNA片段。将它们分别用琼脂糖电泳分离纯化，紫外灯下切割含有pFastBac^TM1载体及FGFR1c目标片段的区域，DNA小量回收试剂盒回收目标片段。琼脂糖电泳结果估测载体和目的基因含量，将目的基因片段与载体按照摩尔比约3∶1的比例进行混合，TaKaRa连接试剂盒于16℃恒温连接2h。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑选转化菌株进行菌落PCR检测并送交生工公司测序。

取测序正确的1ng pFastBac^TM1-FGFRlc重组质粒加入至100μL DH10Bac的感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热激45s，冰上孵育2min，加入900μL S.O.C培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，0.05％NaCl2，2.5mMKCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖)，37℃震荡4h。用S.O.C培养基将细胞稀释为原浓度的10^-1，10^-2，10^-3，取稀释后的溶液100μL分别涂于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100ug/mL Bluo-gal以及40μg/mL IPTG的LB平板中，37℃培养48h。取平板上的10个白色单克隆，接种于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素、100μg/mL Bluo-gal以及40μg/mL IPTG的LB培养基中，37℃过夜培养。异丙醇沉淀法提取病毒杆粒，提取方法步骤如下：

1.用离心方法收集3mL过夜培养的细菌，用300ul溶液1(50mM葡萄糖，25mM tris-cl，10mM EDTA，100ug/mLRNA酶)将菌体重悬，轻轻震荡并混合均匀。

2.将300uL溶液2(0.2M NaOH，1％SDS)加入到混合均匀的菌液中，轻轻混匀，孵育3-5分钟，溶液变的澄清，到半透明状态。

3.缓慢加入300uL溶液3(3M醋酸钾，pH 5.5)，轻轻混匀，形成白色沉淀。

4.在4℃下14000rpm离心20mins

5.轻轻将上清液转移到含有0.9的异丙醇溶液中，混合均匀，冰上孵育20mins

6.在4℃下14000rpm离心10mins

7.去掉上清，用0.5mL的70％的乙醇溶液清洗三次。

8.室温放置20-30分钟完全去掉乙醇，加入40uL去离子水溶解提取的杆粒。

用PCR法检测病毒杆粒。该PCR法中所使用的两条引物序列分别为：

P1：5’-gCGGATCCATGGCTGTGCTGGTCACAGCCACACTCTGCACC-3’(SEQ ID NO：14)，

P2：5’-CcCAAGCTTttaCTCCTGGTTGGAGGTCAAGGCCACGATGCG-3’(SEQ ID NO：15)。

PCR反应条件为：94℃，3min；94℃，45s；55℃，45s；72℃，3min，从第二到第4步循环次数为30次，72℃，5min。琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物。结果如图1所示，PCR鉴定目的条带在2200bp处，与理论值一致。

实施例2.FGFR1c病毒包装

首先将2×10⁶个sf9细胞放入T25培养瓶中并加入无抗体的昆虫细胞培养基5ml，静置30分钟以上。另一方面利用脂质体转染试剂进行转染，将12uL的转染试剂和2ug的杆粒(实施例1中分离的)分别放入100uL无血清无抗性的培养基中，孵育30分钟后再将两种含有2ug的杆粒的培养基放入含有12ul转染试剂的培养基中，孵育30分钟后将混合物滴入预先准备好的T25培养瓶中。培养4天，收集上清病毒即是第一代病毒P1，将1mL P1加入到含有1×10⁷个细胞的T75培养瓶中(15-20ml昆虫细胞培养基)，培养4天，收集上清病毒即是第二代病毒P2，将1mL P2加入到含有1×10⁷个细胞的T75培养瓶中(15-20ml培养基)，培养4天。收集上清，即为P3代病毒，可用于表达蛋白使用。

实施例3.FGFR1c蛋白的表达

用无菌的容量2L的三角烧瓶中加入500ml的S.O.C培养基，并加入sf9细胞使其细胞浓度达到0.5×10⁶个/mL，培养约20h，待细胞浓度达到1.0×10⁶个/mL时，每瓶加入5mlFGFR1c的P3代病毒，继续培养36-48h，收集细胞，将收集的细胞进行SDS-PAGE凝胶电泳分析其表达。

实施例4.FGFR蛋白的纯化

将收集的sF9细胞按照一定比例加入裂解液，以1g细胞(湿重)加入10ml细胞裂解液(20mM Tris，100mMNaCl，1mM DTT，0.2％Triton，0.2mM NaVO₃，pH7.2)裂解1h后，利用超速离心机进行离心，5万rpm离心1h，收集上清，用肝素亲和层析纯化蛋白。用平衡缓冲液(20mM Tris，100mMNaCl，1mM DTT，0.2％Triton，0.2mMNaVO₃)平衡肝素亲和层析柱，将上清液与肝素孵育1h，进行纯化，利用洗脱缓冲液(20mM tris，300mM NaCl，1mM DTT，0.2％triton，0.2mMNaVO₃)洗脱杂蛋白，最后用缓冲液(20mM tris，1M NaCl，1mM DTT，0.2％triton，0.2mMNaVO₃)缓冲洗脱FGFR1c蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定。如图2所示。凝胶电泳中纯化后FGFR条带的分子量在9万左右，与理论分子分子量一致。

实施例5.MSP1D1 DH5载体构建

在金斯瑞公司根据MSP1D1 DH5氨基酸序列进行大肠杆菌表达密码子优化，并合成cDNA，(序列如SEQ ID NO：11所示)，推导的氨基酸序列如(SEQ ID NO：10)。

使用的引物包括：

正向引物：

5’-CGCCATATGGGTCATCATCATCATCATCATCACGATTATGATATTC-3’(SEQ ID NO：16)，

反向引物：

5’-CCGGAATCCTTACTGGGTATTCAGCTTTTTAGT-3’(SEQ ID NO：17)。利用引物进行MSP1D1 DH5基因的扩增。

将MSP1D1 DH5的PCR产物用和PET28a质粒分别用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切。将它们分别用琼脂糖电泳分离纯化，紫外灯下切割含有pET28a载体及MSP1D1 DH5目标片段的区域，DNA小量回收试剂盒(购置于TIANGEN公司)回收目标片段，按照试剂盒提供的方法进行提取。琼脂糖电泳结果检测载体和目的基因含量，将目的基因片段与载体按照摩尔比约3∶1的比例进行混合，TaKaRa连接试剂盒于16℃恒温连接2h。连接产物转化DH5a感受态细胞，挑选转化菌株进行菌落PCR检测并送交生工公司测序。对正确的克隆进行质粒提取，将提取的pET28a-MSP1D1 DH5质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌种(Novagen)中，得到具有卡那霉素抗性的阳性单克隆，将其作为表达菌种存于-80℃超低温冰箱。

实施例6.MSP1D1 DH5蛋白表达

实验的具体步骤如下：

(1)从-80℃中取出保存的MSP1D1 DH5菌种置于冰上，取出200uL接种到含有5mlLB培养基试管中，加入终浓度为50mg的卡那霉素，37℃过夜培养；

(2)按1∶100(5ml)转接至500ml LB培养基，加入终浓度为50mg的卡那霉素，；

(3)37℃培养至OD₆₀₀达0.8-1.0之间时，加IPTG 250ul(终浓度为0.5M)，25℃诱导表达3.5-4h，离心收集菌体。

(4)将离心沉淀存入-80℃中，诱导前后样品需进行SDS-PAGE检测。

实施例7.MSP1 D1 DH5蛋白纯化

pET28a-MSP1D1 DH5载体来源于本实验室，其中，MSP的编码序列为SEQ ID NO：11，在MSP的N端插入有6*His tag以方便对目的蛋白的纯化，这里MSP系列蛋白我们采用的是两步层析法，分别是Ni-NTA亲和柱层析法和FPLC分子筛层析法。实验的具体步骤如下：

(1)超声破碎：从-80℃中取出保存的菌液，常温水浴融化菌液，其间要不时摇匀几次；待完全解冻后，倒出至玻璃小烧杯中，冰浴，超声破碎仪参数设定为工作3s，间歇4s，时长5min，反复三次；然后将细胞破碎后溶液14000rpm 30min(46#转子)离心；取出上清存4℃；超声破碎后离心前取20ul样品，13000rpm 1min离心，其中上清加4ul 6*SDS loadingbuffer制成破碎上清电泳样品，而沉淀部分加20ul 2*SDS loading buffer重悬制成破碎后沉淀电泳样品，均存放于-20℃。

(2)Ni-NTA亲和柱纯化：使用前需先对Ni-NTA亲和柱进行再生处理和缓冲液平衡处理，处理方法是：分别用0.5M NaOH，100mM EDTA，100mM Ni2SO4，20％乙醇各洗2个柱体积，各个环节前后均需穿插水洗5个柱体积，以去除之前挂在柱上的杂蛋白，最后用悬菌缓冲液平衡5个柱体积；将超声破碎离心后的上清与适量镍填料混匀在4℃中结合大于2h；结合完成后缓慢上样，并收集穿出液；上样结束后用平衡缓冲液洗2个柱体积，收集没挂到柱上的杂蛋白峰；接着分别用不断升高咪唑浓度的梯度缓冲液进行洗脱，收集各段蛋白峰；从各洗脱峰接收管中取出20ul用于SDS-PAGE检测，其余分别保存至4℃。

(3)浓缩：根据SDS-PAGE检测结果对洗脱峰接收管用超滤浓缩管(10kD cutoff)进行浓缩，3000rpm 4℃离心，直至浓缩至约5ml。

(4)FPLC分子筛进一步纯化：组建好分子筛(HiLoad 16/60Superdex75，GE)，并用已抽滤的FPLC平衡缓冲液平衡1个柱体积以上；将上步得到的浓缩液在4℃13000rpm离心10min，将上清液转移至另一新的EP管中；从此管中取5ul作为SDS-PAGE电泳样品；将剩余处理好的浓缩液进行分子筛上样(千万不要吸进气泡及沉淀)；进样速度要控制好，关注柱压；收集各峰蛋白液，并在各管中取出10ul用于SDS-PAGE电泳检测，其余保存至4℃。

(5)二次浓缩：根据SDS-PAGE电泳检测结果对分子筛各峰接收管用超滤浓缩管(10kD cutoff)进行浓缩，3000rpm 4℃离心，直至浓缩至约1.5ml，保存至4℃。

(6)浓度测定：从最终获得的蛋白样品中取出5ul用分子筛缓冲液稀释至200ul，通过紫外分光光度计测定A280吸光值；经过计算可获得蛋白的浓度。

实施例8.磷脂母液的制备

(1)本实验中所购买的磷脂均为粉末，而组装中常用磷脂母液，这样所用磷脂均需先溶解在胆酸钠溶液中，其母液制备过程如下：

(2)称量所需的磷脂粉末，将其溶于氯仿溶液中，用缓慢的氮气吹干使其平铺于容器底部形成透明或是白色的薄膜，本实施例中称取30mgPOPC；

(3)将此容器用封口膜密封并留有少许气孔，接着放入冻干瓶中使用真空冷冻冻干机进行冻干3-4h，以去除残留的氯仿。

(4)往冻干过后的磷脂薄膜中加入适量的预先配置好的胆酸钠溶液(通常胆酸钠的浓度是磷脂浓度的两倍)，然后在旋转摇床上低速混匀过夜即可得到磷脂母液，本实施例中加入1mL80mM的胆酸钠溶液(20mM tris，100mM NaCl，pH 7.2)

(5)混匀后的磷脂母液可长时间储存在-80℃中。

实施例9.FGFR的纳米盘组装

(1)将纯化好的MSP蛋白和实施例8中制备的磷脂母液按照一定的比例混合，这里MSP DH5∶磷脂∶胆酸钠∶FGFR1c的物质的量比＝1∶50∶100∶0.2；4℃孵育2h。

(2)孵育结束后，加入适量的疏水吸附剂Bio-Beads SM-2(Bio-Rad，Hercules，CA)去除胆酸钠分子；这里疏水吸附剂Bio-Beads的量与组装溶液的胆酸钠的含量成正比，通常是0.5-0.8g的bio-Beads可以吸附去除过程在室温条件下旋转摇床中混合4-8h。

(3)混合结束后吸取上清，4℃13000rpm离心10min，通过FPLC分子筛进一步纯化(Superdex 20010/300GL，GE)；如图3所示。取峰1进行SDS-PAG凝胶电泳检测后用超滤浓缩管(30kD cutoff)进行浓缩，3000rpm 4℃离心。进行SDS-PAGE凝胶电泳进行分析，如图4所示。FGFR1c，MSP，同时在峰1中出现。

实施例10.FGFR的纳米盘的电镜表征

将纯化的样品加入磷钨酸进行染色，并吸取10ul滴定到400目的铜网上进行表征，电镜图片清晰可见nanodiscs，如图5所示。成功的组装了纳米盘。

实施例11.FGFR的nanodisc的磷酸化验证

活性验证试验，将实施例9中的含有FGFR1c的纳米盘(溶于20mM tris，100mMNaCl，pH 7.2)分别分装于4个EP管中，并分别加入多韦替尼，使多韦替尼终浓度为1000nM，500nM，250nM和0nM。随后在4个EP管中分别加入终浓度为10mM MgCl₂和20μM ATP在37℃反应15min，加入2倍的上样缓冲液(20mMTris-HCl pH8.0，100mM DTT，2％SDS，20％甘油和0.016％考马斯亮蓝)，95℃加热10min。反应之后进行western blot，使用FGFR酪氨酸磷酸化抗体(R&D)进行验证，如图7所示。组装进入纳米盘中的FGFR能够在体外自磷酸化，说明组装之后的FGFR具有生物活性。图7的结果还说明了组装之后的FGFR能够被FGFR抑制剂多韦替尼所抑制。综上所述，含有FGFR的纳米盘可以被用来做为药物筛选，进一步地，其也可以被用来作为FGFR抗体的制备，还可以被用来作为FGFR活性检测试剂盒的开发。

含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系及其制备方法

IB177795

王俊峰

0

CN

142733196909200318

赵宏鑫

0

刘娟娟

0

中国科学院合肥物质科学研究院

2

121000007178068020

CN

CN

安徽省合肥市蜀山区蜀山湖路350号

230031

Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences

No. 350, Shushanhu Road, Shushan District, Hefei, Anhui 230031 P. R.China

1

0

0

中科专利商标代理有限责任公司

11021

穆彬

1102114882.8

010-68619696

1

0

0

1

0

0

0

0

0

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发明专利请求书

110101

4

权利要求书

100001

0

说明书

100002

0

说明书附图

100003

0

说明书摘要

100004

0

10

专利代理委托书

100007

2

中科专利商标代理有限责任公司

2017

05

31

Claims (10)

1.一种人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系，所述类膜体系包含：

1)成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，

2)磷脂双分子层，

3)膜骨架蛋白(MSP)，

其中，所述MSP包裹磷脂形成磷脂双分子层，所述FGFR的胞外区在磷脂双分子层的一侧，所述FGFR的胞内区在磷脂双分子层的另一侧，所述FGFR的跨膜区由磷酸双分子层包裹，并贯穿整个磷脂双分子层。

2.根据权利要求1所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系，其制备过程包括以下步骤：

1)将FGFR目的基因插入到表达载体中，并在细胞中表达FGFR蛋白；

2)将纯化的所述FGFR蛋白与MSP、磷脂和去污剂混合；

3)去除来自步骤2)中的多余的去污剂；和

4)分离含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系。

3.一种制备人造的含有FGFR，磷脂双分子层和和膜骨架蛋白MSP的类膜体系的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将FGFR目的基因插入到表达载体中，并在细胞中表达FGFR蛋白；

2)将纯化的所述FGFR蛋白与MSP蛋白、磷脂和去污剂混合；

3)去除来自步骤2)中多余的去污剂；和

4)分离含有磷脂双分子层的FGFR的类膜体系。

4.根据权利要求1或2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系或权利要求3所述的方法，所述磷脂选自POPG、POPC、POPE、POPS、DOPG、DOPC、DOPE、DOPS、DMPC、PI(3，4)P2、PI(4，5)P2、PI(3，4，5)P3或其任意组合，优选为POPG。

5.根据权利要求1所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系，所述FGFR包括FGFR1c、FGFR1b、FGFR2c、FGFR2b、FGFR3c、FGFR3b、FGFR4或它们的突变体，所述突变体保持FGFR的特有生物活性和功能。

6.根据权利要求2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系或权利要求3所述的方法，所述表达载体是真核表达载体，优选选自pFastBac^TM1，pFastBac^TM-Gus，pFastBac^TMHT，pFastBac^TMHT-CAT，pFastBac^TMDual或pFastBac^TMDual-Gus/CAT，所述细胞是真核细胞，优选为昆虫细胞，更优选Sf9或Sf21细胞。

7.根据权利要求2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系或权利要求3所述的方法，所述FGFR蛋白与MSP蛋白，磷脂和去污剂的比例为1∶1-2∶50-100∶100-200，优选为1∶1∶50∶100。

8.根据权利要求2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系或权利要求3所述的方法，步骤4)中所述分离利用分子筛进行。

9.根据权利要求2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系或权利要求3所述的方法，所述去污剂选自壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)、聚乙二醇辛基苯基醚或胆酸钠，优选是胆酸钠。

10.权利要求1或2所述的人造的含有FGFR，磷脂双分子层和膜骨架蛋白MSP的类膜体系用于制备抗体、药物筛选或开发FGFR活性检测试剂盒的用途，所述药物优选为FGFR抑制剂。