CN113960310A - 重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。具体地公开了氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。本发明利用含有编码人源糖基转移酶B3GNT6(43‑384)基因的重组杆状病毒侵染昆虫细胞，得到分泌形式的糖基转移酶B3GNT6(43‑384)，该酶能高效、特异性地识别Gd‑IgA1铰链区的Tn抗原。基于此，本发明开发了新型的用于血清学诊断IgA肾病的化学酶法技术，该技术可以有效区分IgA肾病患者、健康对照和其他肾病对照，稳定性高、重复性好，且具有无创、快速、特异、灵敏的特点，具有十分广泛的临床应用前景和重要的意义。

Description

重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的 应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用。
背景技术
IgA肾病(Immunoglobulin A nephropathy，IgAN)是世界上最常见的原发性肾小球疾病，是导致终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)的重要原因。IgA肾病患者常于青壮年时期起病，超过30％的患者在发病10年后进入终末期肾病(尿毒症)，最终导致肾衰竭。IgA肾病的临床表现是：患者循环系统中的IgA抗体含量增高，多尿，会伴有尿蛋白，血尿，同时会出现高血压，浮肿等症状。具体的分子诊断是肾小球系膜区以IgA沉积为主，并且伴或不伴有其他免疫球蛋白如IgG和IgM，补体蛋白C3(complement 3)等等在肾小球系膜区沉积，光镜检查常见肾小球系膜基质增生，系膜细胞增殖，并时常伴随肾小球局灶节段纤维素样坏死以及肾小球新月体形成。因此，IgA肾病的目前诊断的金标准仅限于是肾脏病理组织活检，免疫病理检查肾小球周围是否有IgA的沉积，并伴有不同程度的组织病理损伤。但组织活检的方法具有创伤性，会给患者带来巨大痛苦，又不宜反复进行，也不能通过最初的肾活检结果来评估疾病进展的程度。
目前关于IgA肾病的发病机制尚不清晰，但是普遍认为该机制与粘膜免疫相关的诱发因素有关。同时，该领域也有认可的四重打击学说，其主要为：首先是IgA肾病患者血液循环系统中IgA1分子存在其铰链区的O糖基化的半乳糖缺失(人半乳糖缺乏IgA1，galactosedeficient IgA1，Gd-IgA1)的现象，这种糖基化缺陷IgA1分子在血液中容易自发性聚集并产生多聚循环免疫复合物。其次，在血液循环中产生针对Gd-IgA1的抗糖抗体，比如IgG的产生，然后，抗糖抗体将Gd-IgA1作为自身抗原，共同参与IgG-IgA1等免疫复合物的在循环系统形成或者在肾小球系膜区形成。最终这种包含IgA的循环免疫复合物在肾小球系膜区局部沉积，进而激活补体系统和诱发炎症反应，导致肾组织损伤。Gd-IgA1作为“四重打击”学说最重要的始动环节，国内外许多研究对其临床应用价值做了深入探讨。诸多研究已证明Gd-IgA1的形成在IgAN的发病中起着关键作用。Novak J实验室证实了IgA肾病患者循环中Gd-IgA1水平显著高于健康人，其诊断IgA肾病的特异度和灵敏度分别高达94％和76.5％，并以此提出了Gd-IgA1的无创诊断价值。有研究表明，Gd-IgA1更容易和系膜细胞结合并且诱导系膜细胞增殖，而且IgA肾病患者的循环系统中Gd-IgA1含量越高，预后能力越差，肾脏存活时间越短。和其他疾病相比，如IgA血管炎，其血液中IgA1不存在半乳糖缺失，仅会造成皮肤损伤，产生紫癜反应，但是Gd-IgA1却还能引起严重的肾小球损伤。
虽然Gd-IgA1的临床价值得到了多个研究的证实，但Gd-IgA1的测定方案仍局限在实验室层面，尚未得到临床推广。Gd-IgA1临床推广的阻碍在于目前尚无稳定可靠且大批量测定的检测方法。既往研究对Gd-IgA1的测定主要采用了基于凝集素HAA(Helix aspersaagglutinin)、HPA(Helix pomatia agglutinin)和VVL(Vicia villosa lectin)的ELISA法。此方法的弊端在于凝集素对O-糖的结合能力较弱，有效富集浓度高达几百微克，且底物特异性差，难以构建稳定的Gd-IgA1的测定体系。且相关的报道指出VVL除了能识别Gd-IgA1的GalNAc修饰外，还能识别没有O糖基化修饰的IgA2上的N-糖基化。除了凝集素ELISA的方法，日本学者应用Gd-IgA1的铰链区免疫小鼠，得到识别Gd-IgA1的特异性抗体——KM55，并应用KM55建立了测定Gd-IgA1的新方法。但此种抗体价格昂贵，难以应用于临床进行大批量样本测量。且该抗体存在一些弊端，虽然制备过程中应用携带了5个Tn的半抗原，但是与糖肽结合的实验中显示，KM55只对第一个有Tn修饰的肽段有明显的结合，对其他铰链区修饰的Tn抗原并没有结合。
Gd-IgA1检测方法面临的困境限制了其临床应用，阻碍了IgA肾病无创诊断及靶向治疗的进展。因此，探究新的、无创、快速、特异、灵敏的血清学诊断IgA肾病的技术是十分必要的，具有广泛的临床应用前景和重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何基于化学酶法技术方便、快速、特异地实现对Gd-IgA1的标记和/或检测，和/或，如何提供一种可以在临床上应用的无创、快速、特异、灵敏的血清型疾病诊断IgA肾病的产品。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质的应用，所述应用可为下述任一种：
B1)蛋白质在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；
B2)蛋白质在制备用于IgA肾病的预后或疗效预测的产品中的应用；
B3)蛋白质在标记Gd-IgA1中的应用；
B4)蛋白质在制备用于标记Gd-IgA1的产品中的应用；
B5)蛋白质在制备用于检测Gd-IgA1的产品中的应用；
B6)蛋白质在制备用于鉴别诊断IgA肾病与其他肾病的产品中的应用；
所述蛋白质名称为B3GNT6(43-384)，可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
B1)中所述诊断或辅助诊断IgA肾病的产品包括早期诊断或早期辅助诊断IgA肾病的产品。
B3)所述应用可为基于化学酶法的应用。
上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒，所述试剂盒可为酶联免疫试剂盒。
所述蛋白质B3GNT6(43-384)为一种截短的B3GNT6蛋白，与B3GNT6蛋白相比，N末端截短了42个氨基酸；截短的B3GNT6蛋白可作为糖基转移酶，能够特异性识别Tn抗原。
所述蛋白质B3GNT6(43-384)可为人源的。
与所述蛋白质B3GNT6(43-384)同源不同家族蛋白及不同源的同功能蛋白均在本发明的保护范围内。
本文中，术语“蛋白质B3GNT6(43-384)”、“糖基转移酶B3GNT6(43-384)”、“B3GNT6(43-384)”、“B3GNT6(43-384)截短体”可以互换使用。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质B3GNT6(43-384)的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质B3GNT6(43-384)的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质B3GNT6(43-384)且具有蛋白质B3GNT6(43-384)功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料的应用，所述应用可为下述任一种：
C1)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；
C2)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备用于IgA肾病的预后或疗效预测的产品中的应用；
C3)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在标记Gd-IgA1中的应用；
C4)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备用于标记Gd-IgA1的产品中的应用；
C5)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备用于检测Gd-IgA1的产品中的应用；
C6)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备所述蛋白质B3GNT6(43-384)中的应用；
C7)与所述蛋白质B3GNT6(43-384)相关的生物材料在制备用于鉴别诊断IgA肾病与其他肾病的产品中的应用；
所述生物材料可为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码所述蛋白质B3GNT6(43-384)的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的细胞系、或含有D2)所述表达盒的细胞系、或含有D3)所述重组载体的细胞系。
C1)中所述诊断或辅助诊断IgA肾病的产品包括早期诊断或早期辅助诊断IgA肾病的产品。
C3)所述应用可为基于化学酶法的应用。
上述应用中，所述产品可为试剂或试剂盒，所述试剂盒可为酶联免疫试剂盒。
上述应用中，D1)所述核酸分子可为下述任一种：
E1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；
E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质B3GNT6(43-384)。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、P1人工染色体(PAC)或Ti质粒人工染色体(TAC)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，在本发明的一个实施例中，载体具体可为载体pI-secSUMOstar。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。在本发明的一个实施例中，微生物具体可为大肠杆菌DH10Bac。
本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)、植物细胞或原核细胞。在本发明的一个实施例中，细胞具体可为sf21细胞。
所述重组载体具体可为重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)，所述重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)是将pI-secSUMOstar载体的BamHI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的DNA片段，保持pI-secSUMOstar载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)表达N端带有His6-Sumo标签的融合蛋白质，His6-Sumo标签蛋白和蛋白B3GNT6(43-384)之间含有TEV酶切位点，方便后续切除N端的His6-Sumo标签。
本发明还提供了一种Gd-IgA1的标记方法，所述方法包括对待测样本中的Gd-IgA1进行唾液酸酶处理，得到去唾液酸化的Gd-IgA1的步骤。
所述Gd-IgA1的标记方法可通过对IgA1抗体铰链区Tn抗原进行标记来实现。
所述唾液酸酶(sialidase)，又称神经氨酸酶(neuraminidases，NA)，广泛分布于生物体内，参与唾液酸的代谢，可作用于末端唾液酸残基,切除并因而暴露出半乳糖残基。
待测样本中的Gd-IgA1进行唾液酸酶处理后，存在于Gd-IgA1铰链区的大量的Tn抗原暴露，即连接在Ser或Thr上的半乳糖残基GalNAc暴露。暴露的Tn抗原可以进一步地被糖基转移酶B3GNT6(43-384)特异性识别，并通过酶促反应将含生物正交基团的GlcNAl转移到Tn抗原上，再利用生物正交反应(如点击反应)，将带有互补正交反应基团的标记基团转移到Tn抗原上进行标记或检测。
上述方法中，所述方法还包括如下步骤：
(1)采用所述蛋白质B3GNT6(43-384)作为糖基转移酶，以含有炔烃的糖基转移酶供体底物为酶促反应底物，对所述待测样本进行酶促反应；
(2)步骤(1)处理后的样本与含叠氮基团的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含叠氮基团的检测试剂标记的Gd-IgA1。
上述方法中，所述含有炔烃的糖基转移酶供体底物可为UDP-GlcNAl。
上述方法中，所述酶促反应可以金属离子作为催化剂，所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子，具体可为锰离子。
所述酶促反应的最适pH值可为7-8，具体地，所述酶促反应的最适pH值可为7.5。
上述方法中，所述含叠氮基团的检测试剂可为下述任一种：
F1)叠氮基团修饰的小分子标记物；
F2)叠氮基团修饰的染料；
F3)叠氮基团修饰的半抗原；
F4)N3-Cy5。
上述方法中，所述样本可为血液样本。
进一步地，所述血液样本可为血清、血浆或全血。
进一步地，所述点击反应可为铜离子催化的点击反应(铜催化的叠氮-炔基环加成反应)但不限于此。
进一步地，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(Cu+)化合物，如溴化亚铜、碘化亚铜等。
在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(CuSO4)和抗坏血酸钠(VcNa)，抗坏血酸钠(VcNa)将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应(铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应)。
进一步地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子催化的点击反应是在铜离子配体存在下进行。
所述铜离子配体包括BTTAA、BTTES、TBTA、BTTP、THPTA但不限于此，铜离子配体的存在可以稳定一价铜盐，保护一价铜离子免受氧化或者歧化作用，增强对点击反应的催化效果，降低一价铜的毒性。
在本发明的一个实施方案中，铜离子配体为BTTAA。BTTAA是一种铜盐催化的“叠氮-炔基”生物正交反应的加速配体，同时也是一种超低毒性的配体，生物相容。
进一步地，在本发明的一个实施方案中，Gd-IgA1的标记方法为：
(1)采用唾液酸酶进行去唾液酸化处理，采用所述蛋白质B3GNT6(43-384)作为糖基转移酶，以含有炔烃的糖基转移酶供体底物(如UDP-GlcNAl)为酶促反应底物，对待测样本(血浆样本)进行酶促反应；
(2)酶促反应处理后的样本(Gd-IgA1炔烃衍生物)与含叠氮基团的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含叠氮基团的检测试剂标记的Gd-IgA1。
上述Gd-IgA1的标记方法中，所述待测样本可为血浆样本，或为对血浆样本进行Gd-IgA1抗体富集处理得到的样本。
上述Gd-IgA1的标记方法中，步骤(1)的酶促反应的反应体系和反应条件可为：100ug Gd-IgA1，pH＝8.0HEPES(50mM)，MnCl2(2mM),MgCl2(5mM)，UDP-GlcNAl(100μM)，唾液酸酶(0.5mg/mL)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/mL)，用去离子水补齐到50μL，37℃水浴条件下反应60分钟。
上述Gd-IgA1的标记方法中，步骤(2)的点击反应的反应体系和反应条件为：酶促反应处理后的样本(Gd-IgA1炔烃衍生物)，100μM叠氮修饰Cy5(N3-Cy5)，500μM硫酸铜(CuSO4)，1mM配体BTTAA，10mM VcNa，37℃条件下反应60分钟。
本发明还提供了用于诊断或辅助诊断IgA肾病的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括下述任一种：
G1)所述试剂或试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)；
G2)所述试剂或试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)和IgA抗体；
G3)所述试剂或试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)、IgA抗体、含有炔烃的糖基转移酶供体底物、含叠氮基团的检测试剂和点击反应催化剂。
G4)所述试剂或试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)、唾液酸酶、IgA抗体、含有炔烃的糖基转移酶供体底物、含叠氮基团的检测试剂和点击反应催化剂。
本发明还提供了一种Gd-IgA1检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括所述蛋白质B3GNT6(43-384)。
所述试剂盒可为酶联免疫试剂盒。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述用于诊断或辅助诊断IgA肾病的酶联免疫试剂盒含有包被有抗IgA抗体的酶标板。
进一步地，所述试剂盒还包括酶促反应催化剂，所述酶促反应催化剂可为含金属离子的化合物。所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述酶促反应催化剂为MnCl2。
进一步地，所述试剂盒还包括铜离子配体(催化剂稳定剂)。所述铜离子配体可为BTTAA、BTTES、TBTA、BTTP、THPTA、亚磷酰胺或羧酸。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子配体为BTTAA。
上述试剂盒中，所述含有炔烃的糖基转移酶供体底物可为UDP-GlcNAl。
上述试剂盒中，所述含叠氮基团的检测试剂(即含有叠氮基团的标记分子)可为叠氮基团修饰的小分子标记物，所述小分子标记物可为染料或半抗原。
具体地，在本发明的一个实施方案中，上述试剂盒中，所述含叠氮基团的检测试剂为叠氮修饰的生物素(Az-biotin)。
上述试剂盒中，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(Cu+)化合物，如溴化亚铜或碘化亚铜但不限于此。
具体地，在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(CuSO4)和抗坏血酸钠(VcNa)。
进一步地，所述试剂盒还包括溶剂，所述溶剂可为水、四氢呋喃、DMSO、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或DMSO与水的混合物、或上述化合物的混合物。
进一步地，本发明还提供了所述试剂盒在鉴别诊断IgA肾病与非IgA肾病中的应用。
本领域技术人员应当理解，本文所述点击反应(click reaction)是指通过小单元的拼接，完成各种分子的化学合成。点击反应的代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition)，其基本反应原理是Cu+催化叠氮化物基团和炔基发生点击反应，使叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)作用形共价键，从而形成环加成产物五元三唑环。因此，利用点击反应对Gd-IgA1进行标记时，叠氮化物和炔烃部分是可互换的，即本发明所述的含有叠氮基团的标记分子(N3-Cy5)和含有炔烃的糖基转移酶供体底物(UDP-GlcNAl)也可以替换为含有炔烃的标记分子(如炔烃修饰的荧光基团或半抗原)和含有叠氮基团的糖基转移酶供体底物(如UDP-GlcNAz)，同样能够实现本发明的目的，没有脱离本发明的保护宗旨。
本发明所述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明所述诊断或辅助诊断IgA肾病的方法如下：取待测IgA患者血清、其他肾病对照和健康对照血清，采用以上任一所述的试剂盒进行ELISA检测，根据检测结果判断待测患者是否患有IgA肾病或鉴别诊断IgA肾病与其他肾病。
本发明利用含有编码人源糖基转移酶B3GNT6(43-384)基因的重组杆状病毒侵染昆虫细胞sf21，得到分泌形式的糖基转移酶B3GNT6(43-384)，该糖基转移酶能高效、特异性地识别Gd-IgA1铰链区的Tn抗原。基于此，本发明利用该糖基转移酶工具与生物正交反应结合，开发了新型的用于血清学诊断IgA肾病的化学酶法技术。由于在IgA肾病患者的血液循环系统中的Gd-IgA1铰链区含有丰富的Tn抗原，因此利用本发明所述的化学酶法技术可以实现体外识别和标记人血液样品(如血浆样品)中的Gd-IgA1铰链区的糖基化，以达到定量检测半乳糖异常的IgA1(Gd-IgA1)的目的。进一步地，血液中半乳糖缺失的Gd-IgA1水平与IgA肾病有密切联系，本发明的化学酶法的检测方法可以有效区分IgA肾病患者、健康对照和其他肾病对照，且该方法的稳定性高、重复性好，是克服现有技术中凝集素和抗体亲和力能力弱、特异性差、用量大且操作时间长等等缺陷的选择。本发明所述的基于化学酶法的诊断IgA肾病的技术具有无创、快速、特异、灵敏的特点，整合了生物正交反应基团，展现了优越的生物相容性优势，可对IgA肾病的早期诊断以及治疗提供有效的帮助，具有十分广泛的临床应用前景和重要的意义。
附图说明
图1为重组蛋白B3GNT6(43-384)纯化结果图。
图2为化学酶法标记半乳糖缺陷IgA1(Gd-IgA1)示意图。
图3为化学酶法标记健康对照和IgA肾病对照样本中Gd-IgA1的荧光扫描结果。“+”表示添加该物质，“-”表示不添加该物质。
图4为IgA肾病患者、健康患者和非IgA肾病的其他肾病对照患者样本中Gd-IgA1的统计分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的载体pI-secSUMOstar为lifesensors公司产品；
下述实施例采用ANOVA统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Brown-Forsythe检验，P＜0.05(****)表示具有极显著性差异。
实施例1重组蛋白B3GNT6(43-384)的制备
重组蛋白B3GNT6(43-384)(即本发明所述蛋白质B3GNT6(43-384))为一种截短的B3GNT6蛋白，与B3GNT6蛋白相比，N末端截短了42个氨基酸；截短的B3GNT6蛋白可作为糖基转移酶，能够特异性识别Tn抗原。
重组蛋白B3GNT6(43-384)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(由342个氨基酸残基组成)；编码重组蛋白B3GNT6(43-384)的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示(由1026个核苷酸组成)；SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质B3GNT6(43-384)。
一、重组表达载体的构建和表达
1、将密码子优化的编码重组蛋白B3GNT6(43-384)的基因(SEQ ID No.2)构建于pI-secSUMOstar质粒中，构建成功的重组载体命名为pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)。重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)是将pI-secSUMOstar载体的BamHI和EcoRI识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的DNA片段，保持pI-secSUMOstar载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
所述重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)表达N端带有His6-Sumo标签的融合蛋白质，His6-Sumo标签蛋白和蛋白B3GNT6(43-384)之间含有TEV酶切位点，方便后续切除N端的His6-Sumo标签。重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)进行测序鉴定正确后表明成功构建重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)。
将构建成功的重组载体pI-secSUMOstar-B3GNT6(43-384)转化到MAX EfficiencyDH10Bac(10361-012,Invitrogen)感受态细胞中，用LB培养基，37℃下，220转速培养4小时，再利用蓝白斑筛选，选择白色菌落进行杆状质粒(重组杆状病毒穿梭质粒)的提取。
2、脂质体转染法转染sf21细胞：取对数生长期的sf21细胞铺6孔板(2×106个细胞/孔)，室温静置贴壁，取2ug杆状质粒对6孔板的sf21细胞进行质粒转染(转染试剂：罗氏X-tremeGENE 9DNA transfect ref 06365787001)，设定对照组和转染组，培养环境为27℃，无二氧化碳，培养时间为72小时。具体转染操作为：配制质粒和转染试剂的混合液：用无抗SIM SF培养基(义翘神州)稀释，100μL培养基稀释2μg杆状质粒，100μL培养基稀释6μL转染试剂，吹打均匀后，脂质体组分(转染试剂)滴到杆状质粒DNA组分中，轻轻混匀后，静置30分钟，得到转染混合液。将200μL混合液加入到细胞中，中间不换液，需要利用封口膜进行密封，防止溶液蒸干。
3、收取病毒：待sf21细胞侵染四天后，收获上清即得到第一代重组杆状病毒(P1病毒)。具体操作步骤如下：先低速800×g离心去细胞沉淀，取上清液到新的离心管中，然后进行高速2000×g离心5分钟去细胞碎片，取上清液，然后加血清到5％浓度，得到第一代重组杆状病毒(P1病毒)，4℃保存。
4、P1病毒感染sf21细胞：取30ml的sf21细胞，细胞浓度为2×106个/mL，按照1:100比例进行感染病毒，即取300μL的P1病毒加入到sf21细胞中，混匀；110rpm，27℃，无二氧化碳进行培养，4天后收取上清液，处理方法如步骤3。
5、扩大培养体系为1L，同比例扩大病毒的侵染数量，其他操作如步骤3。
二、重组蛋白B3GNT6(43-384)的表达和纯化
按照步骤一培养感染的sf21细胞后产生重组蛋白B3GNT6(43-384)，产生的重组蛋白B3GNT6(43-384)N端带有His6-Sumo标签，可进一步用于纯化。
1、收集步骤一培养感染的sf21细胞后的上清液，进行超滤或者透析浓缩；再利用镍柱富集蛋白处理，具体为：首先进行柱结合过程，再依次用10mmol/L，30mmol/L，50mmol/L咪唑溶液梯度洗脱镍柱约5个柱体积，去掉杂蛋白。最后用250mmol/L的咪唑溶液洗脱镍柱，约3个柱体积，并收集洗脱的溶液即目的蛋白溶液。
2、使用12％SDS-PAGE检测蛋白质，收集较浓的蛋白溶液混合后，使用30K的MiliQ超滤膜超滤后进行BCA定量，利用10％甘油的20mM HEPES(pH＝7.5)进行-80℃保存。蛋白纯化的具体结果见图1，含有His6-Sumo标签的重组蛋白B3GNT6(43-384)在对应的位置出现清晰的条带(分子量约70KDa)。
实施例2重组蛋白B3GNT6(43-384)的功能测定
该部分实验采用Tn修饰的糖肽作为重组蛋白B3GNT6(43-384)的受体底物，对其进行活性探究。具体实施如下：
1、B3GNT6(43-384)的供体底物探究
首先，实验方案中制定了Tn修饰的糖肽序列，PIMAAAT(α-GalNAc)PAPAAK，并通过上海吉尔生化科技公司合成。分别利用供体底物5’-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰半乳糖胺(UDP-GlcNAc)(CAS:91183-98-1，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)及其叠氮衍生物(UDP-GlcNAz)(CAS:1611490-64-2，青岛曙格生物技术有限公司)和炔基衍生物(UDP-GlcNAl)(青岛曙格生物技术有限公司)对实施例1制备的重组蛋白B3GNT6(43-384)进行酶活性差异的比较。然后，设计反应体系，酶促反应为体系30ul，包含pH＝8.0HEPES(100mM),MnCl2(2mM),糖肽(1mM),UDP-GlcNAc或者UDP-GlcNAz或UDP-GlcNAl(2mM)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应30分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，反应液进行HPLC检测分析。HPLC检测中，HPLC分析中采用Agilent ZORBAX C18分析柱，柱温40℃，进样量20μl,流动相为由含千分之一三氟乙酸的乙腈和水组成的液体，梯度乙腈为15％-45％(20分钟)，流速为1ml/min,利用UV检测器在波长220nm处检测并自动形成分离图谱。
检测分析结果见表1：
表1酶促反应的产率
供体底物 UDP-GlcNAc UDP-GlcNAz UDP-GlcNAl
产率 100％ 11.3％ 99.6％
结果表明，重组蛋白B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAc的GlcNAc基团转移到糖肽上，得到产物GlcNAc-GalNAc-peptide产率是100％；重组蛋白B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAz的GlcNAz基团转移到糖肽上，得到产物GlcNAz-GalNAc-peptide，产率是11.3％；重组蛋白B3GNT6(43-384)能将UDP-GlcNAl的GlcNAl基团转移到糖肽上，得到产物GlcNAl-GalNAc-peptide，产率是99.6％。说明重组蛋白B3GNT6(43-384)可以高效利用天然核酸糖及其类似物，具有高效的生物催化活性，且利用UDP-GlcNAl的活性高于UDP-GlcNAz。因此，后续标记过程中采用UDP-GlcNAl作为重组蛋白B3GNT6(43-384)的供体底物。
实施例3化学酶法标记Gd-IgA1的铰链区Tn抗原
一、化学酶法标记血浆来源的单体Gd-IgA1
该化学酶法标记技术包含三步操作，目的是为了将Gd-IgA1的两种缺糖形式转化为一种形式，即Tn修饰，进而被标记，如图2所示：首先将Gd-IgA1进行唾液酸酶处理，再利用B3GNT6(43-384)识别Tn抗原，并将GlcNAl转移到Tn抗原上，最后一步进行生物正交反应，引入标记基团(如荧光基团)进行观察。具体操作步骤如下：
1、IgA肾病患者和其他肾病患者对照血浆来源于北大第一医院肾内科已经签署知情同意的肾活检诊断为IgA肾病的患者或非IgA肾病的其他肾病患者，健康人对照血浆来源于签署知情同意的健康献血者。利用凝集素Jacalin琼脂糖柱子分别进行富集IgA肾病患者、其他肾病患者或健康人的血浆样本中的Gd-IgA1，利用蜜二糖进行洗脱之后，再利用分子筛对Gd-IgA1单体进行富集，得到IgA肾病患者的Gd-IgA1样本、其他肾病患者的Gd-IgA1样本或健康人的Gd-IgA1样本。
2、酶促标记：将步骤1获得的IgA肾病患者的Gd-IgA1样本、其他肾病患者的Gd-IgA1样本或健康人的Gd-IgA1样本利用nanodrop的A280进行浓度测定。然后，各取IgA肾病患者的Gd-IgA1样本、其他肾病患者的Gd-IgA1样本或健康人的Gd-IgA1样本(25μg)进行标记反应，分别记为三组实验组：IgA肾病患者组、其他肾病对照组(简称肾病对照组)、健康对照组。对上述3组Gd-IgA1样本分别进行下述4种处理，得到酶促反应处理后的样本：
1)B3GNT6(43-384)+UDP-GlcNAl+
采用所述蛋白质B3GNT6(43-384)作为糖基转移酶，以含有炔烃的糖基转移酶供体底物(如UDP-GlcNAlK(青岛曙格生物技术有限公司))为酶促反应底物，对待测样本进行酶促反应，反应体系和反应条件为：100ug Gd-IgA1，pH＝8.0HEPES(50mM)，MnCl2(2mM)，MgCl2(5mM)，UDP-GlcNAl(100μM)，唾液酸酶(0.5mg/mL)，B3GNT6(43-384)(0.2mg/mL)，用去离子水补齐到50μL，37℃水浴条件下反应60分钟。
2)B3GNT6(43-384)-UDP-GlcNAl-
与1)相比，区别仅在于将B3GNT6(43-384)和UDP-GlcNAl替换为等体积的pH＝8.0HEPES。
3)B3GNT6(43-384)+UDP-GlcNAl-
与1)相比，区别仅在于将UDP-GlcNAl替换为等体积的pH＝8.0HEPES。
4)B3GNT6(43-384)-UDP-GlcNAl+
与1)相比，区别仅在于将UDP-GlcNAl替换为等体积的pH＝8.0HEPES。
3、生物正交反应：酶促反应处理后的样本(Gd-IgA1炔烃衍生物)与含叠氮基团的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含叠氮基团的检测试剂标记的Gd-IgA1。反应体系和反应条件为：经过B3GNT6酶促反应处理后的样本(Gd-IgA1炔烃衍生物)，100μM叠氮修饰Cy5(N3-Cy5)，500μM硫酸铜(CuSO4)，1mM配体BTTAA，10mM VcNa，37℃条件下反应60分钟。
4、加入5×的还原型loading buffer，95℃加热，然后上样10μL，进行SDS-PAGE(12％)跑胶观察。
5、跑胶完成后，利用Tythoon胶内荧光扫描仪进行Cy5荧光信号的扫描，扫描电压为800V。
6、扫描完成后，对蛋白胶进行考马斯亮蓝R250的染色观察。
7、完成步骤5,6之后，利用ImageJ对其相对定量分析。
8、结果显示，该化学酶法策略，可以有效的标记Gd-IgA1上的Tn抗原，且IgA肾病患者的Gd-IgA1的标记信号要强于健康对照，具体结果见图3。
9、实验过程中采取43例IgA肾病患者血浆、26例健康患者和28例非IgA肾病的其他肾病对照患者的血浆。按照步骤1-7，测定Gd-IgA1的含量。
10、从统计结果来看，该方法可以较好地区分IgA肾病患者和其他两组对照，详细见图4。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 重组蛋白在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 342
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Gln Glu Glu Thr Pro Glu Gly Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Asp
1 5 10 15
Glu Pro Pro Ser Glu Leu Val Pro Gly Pro Pro Cys Val Ala Asn Ala
20 25 30
Ser Ala Asn Ala Thr Ala Asp Phe Glu Gln Leu Pro Ala Arg Ile Gln
35 40 45
Asp Phe Leu Arg Tyr Arg His Cys Arg His Phe Pro Leu Leu Trp Asp
50 55 60
Ala Pro Ala Lys Cys Ala Gly Gly Arg Gly Val Phe Leu Leu Leu Ala
65 70 75 80
Val Lys Ser Ala Pro Glu His Tyr Glu Arg Arg Glu Leu Ile Arg Arg
85 90 95
Thr Trp Gly Gln Glu Arg Ser Tyr Gly Gly Arg Pro Val Arg Arg Leu
100 105 110
Phe Leu Leu Gly Thr Pro Gly Pro Glu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Arg
115 120 125
Leu Ala Glu Leu Val Ala Leu Glu Ala Arg Glu His Gly Asp Val Leu
130 135 140
Gln Trp Ala Phe Ala Asp Thr Phe Leu Asn Leu Thr Leu Lys His Leu
145 150 155 160
His Leu Leu Asp Trp Leu Ala Ala Arg Cys Pro His Ala Arg Phe Leu
165 170 175
Leu Ser Gly Asp Asp Asp Val Phe Val His Thr Ala Asn Val Val Arg
180 185 190
Phe Leu Gln Ala Gln Pro Pro Gly Arg His Leu Phe Ser Gly Gln Leu
195 200 205
Met Glu Gly Ser Val Pro Ile Arg Asp Ser Trp Ser Lys Tyr Phe Val
210 215 220
Pro Pro Gln Leu Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Pro Val Tyr Cys Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Phe Leu Leu Ser Gly Pro Thr Ala Arg Ala Leu Arg Ala Ala
245 250 255
Ala Arg His Thr Pro Leu Phe Pro Ile Asp Asp Ala Tyr Met Gly Met
260 265 270
Cys Leu Glu Arg Ala Gly Leu Ala Pro Ser Gly His Glu Gly Ile Arg
275 280 285
Pro Phe Gly Val Gln Leu Pro Gly Ala Gln Gln Ser Ser Phe Asp Pro
290 295 300
Cys Met Tyr Arg Glu Leu Leu Leu Val His Arg Phe Ala Pro Tyr Glu
305 310 315 320
Met Leu Leu Met Trp Lys Ala Leu His Ser Pro Ala Leu Ser Cys Asp
325 330 335
Arg Gly His Arg Val Ser
340
<210> 2
<211> 1026
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atgcaagaag aaacccccga ggggcctact gacgcgcccg ctgctgacga acctccatca 60
gaactggttc ctgggccccc gtgcgttgcg aatgcctctg ctaacgcgac tgcggatttt 120
gagcaacttc cggcgcgaat ccaggatttt ctgcgataca gacattgcag acacttcccc 180
ctgctgtggg acgccccggc taaatgtgca gggggccgag gtgtcttcct gttgttggca 240
gtgaaatccg ccccagaaca ttacgaaagg cgcgaattga ttcgcaggac ttggggtcaa 300
gaacggtctt acggtggcag accagttagg cgactctttt tgcttggaac gccggggcct 360
gaggatgaag ctagagccga aaggcttgcc gaacttgtag cactggaagc ccgagagcat 420
ggagatgtat tgcaatgggc ctttgcagac acatttctta acttgactct taaacacctt 480
catcttttgg attggctggc agcgcggtgc ccccatgcaa gatttttgct tagtggtgat 540
gacgatgttt ttgttcatac ggcaaacgtc gttaggttcc tgcaagcaca gcctcccgga 600
cgccacctct tcagcgggca gttgatggag ggtagtgtac caatacgaga cagctggagt 660
aagtattttg taccgccgca gctcttccct ggatcagcgt atcccgtata ctgttctggc 720
ggaggcttcc tgttgtcagg accgacagcg cgggccctca gggccgcagc tcggcacaca 780
cccctttttc cgattgacga cgcttacatg ggtatgtgtc ttgagcgagc aggtctcgcc 840
ccttctggtc acgaaggaat ccgccctttt ggggttcagc tgccgggggc acagcagtct 900
tctttcgatc catgcatgta ccgcgaactc ctgttggtgc accgatttgc gccatacgag 960
atgctcctta tgtggaaggc tttgcatagt cctgctctca gttgtgaccg aggacatcga 1020
gtatct 1026

Claims (10)

1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
B1)蛋白质在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；
B2)蛋白质在制备用于IgA肾病的预后或疗效预测的产品中的应用；
B3)蛋白质在标记Gd-IgA1中的应用；
B4)蛋白质在制备用于标记Gd-IgA1的产品中的应用；
B5)蛋白质在制备用于检测Gd-IgA1的产品中的应用；
B6)蛋白质在制备用于鉴别诊断IgA肾病与其他肾病的产品中的应用；
所述蛋白质为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：
C1)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备用于诊断或辅助诊断IgA肾病的产品中的应用；
C2)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备用于IgA肾病的预后或疗效预测的产品中的应用；
C3)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在标记Gd-IgA1中的应用；
C4)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备用于标记Gd-IgA1的产品中的应用；
C5)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备用于检测Gd-IgA1的产品中的应用；
C6)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备权利要求1中所述蛋白质中的应用；
C7)与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料在制备用于鉴别诊断IgA肾病与其他肾病的产品中的应用；
所述生物材料为下述D1)至D5)中的任一种：
D1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物；
D5)含有D1)所述核酸分子的细胞系、或含有D2)所述表达盒的细胞系、或含有D3)所述重组载体的细胞系。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，D1)所述核酸分子为下述任一种：
E1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子；
E2)核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA分子。
4.一种Gd-IgA1的标记方法，其特征在于，所述方法包括对待测样本中的Gd-IgA1进行唾液酸酶处理，得到去唾液酸化的Gd-IgA1的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：
(1)采用权利要求1中所述的蛋白质作为糖基转移酶，以含有炔烃的糖基转移酶供体底物为酶促反应底物，对所述待测样本进行酶促反应；
(2)步骤(1)处理后的样本与含叠氮基团的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含叠氮基团的检测试剂标记的Gd-IgA1。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有炔烃的糖基转移酶供体底物为UDP-GlcNAl。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述含叠氮基团的检测试剂为下述任一种：
F1)叠氮基团修饰的小分子标记物；
F2)叠氮基团修饰的染料；
F3)叠氮基团修饰的半抗原；
F4)N3-Cy5。
8.根据权利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于，所述样本为血液样本。
9.用于诊断或辅助诊断IgA肾病的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括下述任一种：
G1)所述试剂或试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质；
G2)所述试剂或试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质和IgA抗体；
G3)所述试剂或试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质、IgA抗体、含有炔烃的糖基转移酶供体底物、含叠氮基团的检测试剂和点击反应催化剂；
G4)所述试剂或试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质、唾液酸酶、IgA抗体、含有炔烃的糖基转移酶供体底物、含叠氮基团的检测试剂和点击反应催化剂。
10.一种Gd-IgA1检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1中所述的蛋白质。
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