CN102911261B - 杨树菇凝集素aal-2及其编码基因、其制备方法和应用 - Google Patents

杨树菇凝集素aal-2及其编码基因、其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了杨树菇凝集素AAL-2及其编码基因、其制备方法和应用。本发明采用亲和层析方法从杨树菇（Agrocybeaegerita）总蛋白中分离得到凝集素蛋白AAL-2，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。细胞试验表明，本发明所分离杨树菇凝集素AAL-2具有优异的杀伤肿瘤细胞活性，能够引起肝癌细胞发生显著性的凋亡。动物实验表明，AAL-2对肿瘤有较好的治疗效果。糖芯片技术检测结果显示，AAL-2优先结合以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖或糖蛋白，可将其作为检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的病症试剂或作为检测N-乙酰葡萄糖胺相关糖结构的试剂。

Description

杨树菇凝集素AAL-2及其编码基因、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种从真菌中分离到的凝集素及其编码基因，尤其涉及从杨树菇(Agrocybe aegerita)中分离到的凝集素AAL-2及其编码基因，本发明还涉及杨树菇凝集素AAL-2的分离方法及其在抗肿瘤或检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的病症及与N-乙酰葡萄糖胺相关糖结构中的应用，属于杨树菇凝集素的分离和应用领域。
背景技术
药用真菌在东方因其独特的药用价值(尤其是它的抗肿瘤活性)有着两千余年的历史。直到上世纪50年代，随着技术的成熟和多糖等有效成分的分离鉴定，药用真菌的药用价值才逐渐被欧美研究者所重视，越来越多的药用真菌活性成分在动物和临床试验中进行筛选并得到验证，成为抗肿瘤药物的筛选宝库。
杨树菇(Agrocybe aegerita)，又名柱状田头菇、杨树菇、柳松茸等，隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。杨树菇富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达1.75％，其营养价值超过香菇、金针菇等其它食用菌，同时又具有独特的药用价值，民间常将其用于抗癌、降血压，治疗胃冷、肾炎、水肿等，具有独特疗效，但其中的药理成分并不明确。
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其全球发病率和死亡率分别列第七位和第三位。中国肝癌的发病率为25.7/10万，仅次于肺癌和胃癌，而其病死率高达23.7/10万，在中国的肿瘤病死率中列第二位。目前公认的肝癌诊断疗法有超声波诊断，皮下乙醇注射，放化疗以及手术切除等方法，但是肝癌的复发率和转移率较高。因此，亟待寻找更加有效抑制肝癌或杀死肝癌细胞的药物或方法。
凝集素(lectin)是自然界中广泛存在的一种非免疫来源的蛋白，能够可逆的结合多种糖或糖蛋白，并且这种结合不同于酶和底物的结合方式。至今，人类已经分离出数百种凝集素，每种凝集素都有其独特的生化特性、糖结合特异性和广泛的生物活性，譬如：抗肿瘤活性，抗真菌活性和抗病毒活性等。孙慧等通过阴离子交换层析的方法从杨树菇总蛋白中分离得到凝集素AAL，并验证其具有广谱的抗肿瘤效果，对直肠癌、宫颈癌、胃癌、血癌细胞等癌细胞均有杀伤活性，其中，对血癌细胞HL60的杀伤活性高于阳性对照药阿霉素(孙慧等，杨树菇凝集素AAL具有抗肿瘤活性.Biochem.J.(2003)374，321-327)。
发明内容
本发明目的之一是提供一种从杨树菇(Agrocybe aegerita)中分离到的新的凝集素；
本发明目的之二是提供一种从杨树菇分离或制备上述凝集素的方法；
本发明目的之三是提供编码上述所分离的杨树菇凝集素的cDNA；
本发明目的之四是提供上述杨树菇凝集素及其编码基因的药理用途；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明通过亲和层析方法从杨树菇总蛋白中分离得到一种新的凝集素，命名为杨树菇凝集素AAL-2，其氨基酸序列为以下(a)或(b)所示：
(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或
(b)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而获得的仍具有杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL功能的多肽变异体。
优选的，本发明所述的杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2为SEQID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明中所述的“多个”通常意味着通常为1-50个，较佳的1-30个，更佳的1-20个，最佳的为2～4个，这些取决于凝集素AAL-2三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸序列进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。所述的“缺失”是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基或者在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳的为10个以内，更佳的为5个以内)氨基酸。
本发明所述的杨树菇凝集素AAL-2的多肽变异体包括：同源序列变异体、保守型变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨杂交条件下能与杨树菇凝集素AAL-2核苷酸序列杂交的DNA所编码的蛋白以及利用抗杨树菇凝集素AAL-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
所述“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。作为参考，所述的“严谨杂交条件”可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
本发明所述的多肽变异体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的变异体或片段，其中，由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域普通技术人员所习知。
本发明还提供了其它多肽，如包含杨树菇凝集素AAL-2或其片段的融合蛋白。
本发明还包括杨树菇凝集素AAL-2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇凝集素AAL-2多肽的差异可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响氨基酸序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物以及具有非天然存活的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。所述的修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。所述的修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸苏氨酸，磷酸丝氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明的第二个目的是提供一种从杨树菇中分离得到杨树菇(Agrocybeaegerita)凝集素AAL-2的方法，包括：(1)提取杨树菇总蛋白并除去变性蛋白；(2)将除去变性蛋白后的杨树菇总蛋白过亲和层析柱，用缓冲液清洗亲和柱至紫外检测器检测不到有杂蛋白流出；(3)以N-乙酰葡萄糖胺的缓冲液洗脱亲和层析柱，收集流出的蛋白，即得。
为了达到更好的分离效果，其中，所述的亲和层析柱优选为以N-乙酰葡萄糖胺偶联的Sepharose 6B为亲和层析柱；步骤(2)中所述的缓冲液为PBS缓冲液；步骤(3)中优选以0.2mol/L的N-乙酰葡萄糖胺的PBS缓冲液进行洗脱；
本发明在分离纯化杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2的过程中采用亲和层析的方法，利用N-乙酰葡萄糖胺偶联的Sepharose-6B亲和柱，一步从杨树菇总蛋白中提取得到凝集素AAL-2，本发明分离杨树菇凝集素AAL-2方法工艺流程简单、样品纯度高、制备成本低。
本发明的第三个目的是提供编码凝集素AAL-2的核苷酸序列。
编码杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2的cDNA序列，该cDNA序列为以下(a)或(b)的核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或
(b)将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的核苷酸变异体，该核苷酸变异体所编码的蛋白仍具有杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2的活性或功能。
所述的核苷酸变异形式包括但并不限于：通常为1-90个，较佳的1-60个，更佳的1-20个，最佳的为1-10个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加多个(通常为60个以内，较佳的为30个以内，更佳的为10个以内，最佳的为5个以内)核苷酸所得到的变异体。
所述“核苷酸变异体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变所得到的仍编码SEQID No.2所示的氨基酸的多核苷酸变体，或者是通过重组的方法(例如DNA改组)。本领域技术人员可通过以下分子生物技术手段来筛选或评价变体多核苷酸所编码蛋白的功能或活性：糖结合活性，DNA结合活性，蛋白之间的相互作用，瞬时研究中基因表达的激活情况等。
本发明还涉及含有编码杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2的cDNA序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞。
将所述编码杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素AAL-2的cDNA序列插入到表达载体(所述的表达载体可以是各种市售的表达载体，包括质粒，粘粒等)合适的限制性酶切位点之间可操作的与表达调控序列相连接，即可得到表达该cDNA序列的表达载体；所构建的表达载体可以由5’非编码区、SEQ ID NO：1所示的cDNA序列以及3’非编码区组成，其中，所述的5’非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子序列可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性诱导子。
所述的3’非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等，SEQ ID NO：1所示的cDNA序列可由将其一个或多个的碱基进行替换、缺失或/和插入而得到的核苷酸变异体所替换，该核苷酸变异体所编码的蛋白仍具有杨树菇(Agrocybeaegerita)凝集素AAL-2的功能。
本发明还包括杨树菇凝集素AAL-2多肽编码cDNA序列的反义序列。这种反义序列可以用于抑制细胞内杨树菇凝集素蛋白AAL-2的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核苷酸分子，该分子通常具有杨树菇凝集素AAL-2多肽编码序列的8-100个，较佳为15-50个的连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码杨树菇凝集素蛋白AAL-2的核酸分子。
本发明还包括检测杨树菇凝集素AAL-2核苷酸序列的方法，包括：用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳的，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于杨树菇凝集素AAL-2多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为20-50个核苷酸。
本发明还提供了对杨树菇凝集素蛋白AAL-2或是其片段编码的多肽具有特异性来源的多克隆抗体和单克隆抗体。所述“特异性”是指抗体能够结合于杨树菇凝集素AAL-2基因产物或片段。较佳的，指那些能够与杨树菇凝集素AAL-2基因产物或片段结合但不识别和结合与其他非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制杨树菇凝集素AAL-2的分子。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的杨树菇凝集素AAL-2基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段，抗体重链，抗体轻链，遗传过程改造的单链Fv分子或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域普通技术人员采用本领域已知的各种技术进行制备。例如，纯化的杨树菇凝集素AAL-2基因产物或者其具有抗原性的多肽片段，将其施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达杨树菇凝集素AAL-2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物产生抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断杨树菇凝集素AAL-2功能的抗体以及不影响杨树菇凝集素AAL-2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用杨树菇凝集素AAL-2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成，与杨树菇凝集素AAL-2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以利用原核细胞(如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
体外细胞试验表明，本发明所分离的AAL-2具有杀伤肿瘤细胞活性，能够引起肝癌细胞发生显著性的凋亡，并且这种诱导凋亡的活性具有杨树菇凝集素AAL-2浓度依赖性。同时本发明用小鼠肝癌细胞H22构建荷瘤小鼠模型，通过瘤内注射AAL-2，荷瘤小鼠的肿瘤生长受到明显的抑制，并且荷瘤小鼠的生存期得到明显延长，表明AAL-2对肿瘤有较好的治疗效果。
将杨树菇凝集素AAL-2用于治疗肿瘤时，其给药剂量和给药方式可根据肿瘤种类、病人的状况等因素确定。可将杨树菇凝集素AAL-2或其突变体制备成注射制剂，通过静脉注射，单次或多次瘤内、肌肉注射或静脉注射，或将其制备成口服制剂如肠溶胶囊、结肠定位胶囊、微球、纳米粒等。
此外，还可将编码或杨树菇凝集素AAL-2其突变体的核苷酸(例如：SEQID No.1)构建成适合在人体内表达的表达载体以制备成基因治疗药物，这些方法都是本领域技术人员所熟练掌握。
本发明还鉴定了杨树菇凝集素AAL-2的糖结合谱，结果显示AAL-2是一种对N-乙酰葡萄糖胺有较高结合特异性的蛋白，通过糖芯片技术检测结果显示，杨树菇凝集素AAL-2优先结合以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖或糖蛋白，表明杨树菇凝集AAL-2能够应用于检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的病症以及作为检测与N-乙酰葡萄糖胺相关的糖结构的试剂，有开发成疾病诊断探针的潜力。
附图说明
图1杨树菇凝集素AAL-2亲和层析图和SDS-PAGE电泳结果；(A)杨树菇凝集素AAL-2亲和层析图；(B)：杨树菇凝集素AAL-2的SDS-PAGE电泳结果；1泳道是杨树菇总蛋白，2泳道是杨树菇总蛋白穿过亲和柱的蛋白，3泳道是杨树菇凝集素AAL-2，M泳道是蛋白Marker。
图2杨树菇凝集素AAL-2氨基酸序列与质谱得到的肽段氨基酸序列同源度对比分析结果。
图3杨树菇凝集素AAL-2核苷酸序列与杨树菇凝集素AAL核苷酸序列的同源度对比分析结果。
图4杨树菇凝集素AAL-2氨基酸序列与杨树菇凝集素AAL氨基酸序列的同源度对比结果。
图5杨树菇凝集素AAL-2和杨树菇凝集素AAL的SDS-PAGE电泳结果。
图6杨树菇凝集素AAL-2诱导肿瘤细胞凋亡实验结果：(A).AAL-2诱导H22细胞凋亡；(B).AAL-2诱导Huh7细胞凋亡。
图7杨树菇凝集素AAL-2对荷瘤小鼠肿瘤组织的生长抑制作用实验结果；(A).AAL-2抑制肿瘤的生长；(B).AAL-2延长荷瘤小鼠生存周期。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1杨树菇凝集素AAL-2蛋白的制备
(1)、杨树菇总蛋白的制备
取晒干的杨树菇子实体(购自福建三明真菌研究所)，用粉碎机粉碎成粉末，按照1∶10(w/v)的比例加入双蒸水浸泡，共浸泡3次，每次4小时或过夜，取每次浸泡的上清，加入硫酸铵至80％，静置过夜。离心(10,000rpm/min，20min)收集沉淀，将沉淀溶于适量双蒸水，透析除盐，冷冻干燥后即为杨树菇总蛋白。
(2)、亲和柱分离纯化
取400mg杨树菇总蛋白溶于90mL PBS缓冲液中，离心除去变性蛋白，取上清过亲和层析柱，以N-乙酰葡萄糖胺偶联的Sepharose 6B为亲和层析柱，用PBS缓冲液平衡后，将上述杨树菇总蛋白上清液进行亲和层析，上样完成后，用PBS缓冲液清洗亲和柱至紫外检测器检测不到有杂蛋白流出，以0.2mol/L的N-乙酰葡萄糖胺的PBS缓冲液洗脱，收集流出的蛋白，即为杨树菇凝集素AAL-2。
收集到的AAL-2透析除去多余的N-乙酰葡萄糖胺，以鸡血红细胞检测AAL-2凝血活性，SDS-PAGE检测杨树菇凝集素AAL-2为单一蛋白组分，见图1。
实施例2杨树菇凝集素AAL-2蛋白核苷酸编码区的确定及AAL-2蛋白氨基酸编码
将实施例1中通过SDS-PAGE得到的AAL-2条带切下，通过质谱鉴定，得到6条肽段。同时，本发明构建了杨树菇菌丝和子实体的转录组文库(NCBI编码为SRA026731)，并通过本地BLASTX将6条肽段的氨基酸序列同转录组文库进行同源比对。比对发现AAL-2蛋白的核苷酸编码区位于转录组文库中基因Unigene4198的互补链上，通过确认开放阅读框，得到了一段蛋白质编码区，由此蛋白质编码区翻译成的氨基酸序列能够高度匹配用质谱得到的AAL-2的6条肽段(图2)，并且ExPASy软件预测的蛋白质分子量为43,175kDa，与实施例1中的SDS-PAGE结果一致。由此认定此编码区为杨树菇凝集素AAL-2的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，通过质谱鉴定确认，所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
表1质谱分析得到的6条AAL-2酶解肽段的氨基酸序列
  肽段的编号   氨基酸序列
  #1   GFANIVGFGLDGVVIGR
  #2   MVIANFGYDAGGWR
  #3   YLADIR
  #4   DFGYDAGGWR
  #5   HVFISR
  #6   FIADLTGNGR
实验例1本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2与现有的杨树菇凝集素AAL的同源性分析
1、本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2和已公布的杨树菇凝集素AAL核苷酸同源性对比分析结果见图3，从对比结果可见，二者的核苷酸同源性为40.63％(193/475)，Gap＝61.22％(750/1225)。
2、本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2和已公布的杨树菇凝集素AAL氨基酸同源性分析结果见图4，从对比结果可见，二者的氨基酸同源性为22.78％(36/158)，氨基酸残基的相似度为47.47％(75/158)，Gap＝61.18％(249/407)。
3、从杨树菇凝集素AAL-2和已公布杨树菇凝集素AAL的SDS-PAGE结果可见，AAL分子量为15.8kDa；AAL-2分子量为43kDa(图5)。
4、本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2和已公布的杨树菇凝集素AAL的糖谱分析结果分别见表2和表3。
表2AAL-2糖谱分析结果(亲和力前18位的糖基结构)
Figure BDA0000080265780000091
表3AAL糖谱分析结果
Figure BDA0000080265780000092
Figure BDA0000080265780000101
根据上述实验结果可见：现有技术中的杨树菇凝集素AAL单体分子量为15.8kDa，是二聚体；本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2分子量为43kDa，是单体。通过AAL和AAL-2核苷酸序列比对和氨基酸序列比对，显示二者核苷酸同源性约为40％，氨基酸同源性约为20％。糖谱显示AAL-2特异性的结合以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖基，完全不同于AAL的糖谱。所以，本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2是完全不同于AAL的另一种杨树菇凝集素。
实验例2杨树菇凝集素AAL-2蛋白抗肿瘤活性实验
一、杨树菇凝集素AAL-2在体外对肝癌细胞的杀伤作用
本实验检测了杨树菇凝集素AAL-2(实施例1所分离的蛋白)对两种肿瘤细胞株(H22，Huh7)的杀伤活性。
H22细胞株和Huh7细胞株(购自ATCC)分别在RPMI1640培养基和DMEM培养基(均包含10％胎牛血清，100mg/mL链霉素和100U/mL青霉素)中培养。将不同浓度的实施例1所制备的杨树菇凝集素AAL-2加入到肿瘤细胞中(终浓度为0.6μmol/L，1.2μmol/L，2.4μmol/L)，分别培养24小时和36小时。将处理的细胞吹打或消化成单个细胞，用Annexin V/PI染料进行染色，并用流式细胞仪检测。
检测结果如图6所示，杨树菇凝集素AAL-2可以显著引起两种肝癌细胞株发生细胞凋亡从而杀伤肝癌细胞。
二、杨树菇凝集素AAL-2对荷瘤小鼠肿瘤组织的生长抑制作用
在本实验中，采用BALB/c小鼠(6-8周龄，20克)，在腋窝皮下接种0.1mL小鼠肝癌细胞H22株(1×107cells/mL)，在接种后7天瘤内注射杨树菇凝集素AAL-2(实施例1所分离的蛋白)(5mg/kg，0.1mL/只)。对照注射生理盐水。此后隔天注射，共注射7次，并记录小鼠肿瘤组织大小。肿瘤大小＝肿瘤组织长L×宽W2/2。结果如图7所示。杨树菇凝集素AAL-2能抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长并显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
细胞实验结果可见，本发明所分离的杨树菇凝集素AAL-2具有杀伤肝癌细胞的活性；动物实验表明，AAL-2抑制H22荷瘤小鼠的肿瘤组织生长，有延长荷瘤小鼠的生存时间，对荷瘤小鼠有确切的治疗作用。
实验例3杨树菇凝集素AAL-2糖结合特异性
为了鉴定杨树菇凝集素AAL-2的糖结合活性，本实验运用糖芯片技术，采用杨树菇凝集素AAL-2对465种糖进行检测。
首先将纯化的杨树菇凝集素AAL-2(实施例1所分离)标记生物素，200μg/mL的AAL-2孵育糖芯片，后用荧光素标记的链亲和素结合生物素标记的AAL-2。结果如表4所示(AAL-2对不同糖的亲和力由高到低排列(前23位糖))。杨树菇凝集素AAL-2能够特异性的优先结合以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖，表明AAL-2有可能开发成识别N-乙酰葡萄糖胺的探针。
表4
Figure BDA0000080265780000111
<110>  武汉奥力生物技术有限公司
 
 
<120>  杨树菇凝集素AAL-2及其编码基因、其制备方法和应用
 
 
<130>  PTZL00257
 
 
<160>  2    
 
 
<170>  PatentIn version 3.1
 
 
<210>  1
<211>  1224
<212>  DNA
<213>  Agrocybe aegerita
 
 
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1224)
<223> 
 
 
 
<400>  1
atg acc agc aac gtc atc acc caa gat ttg ccc ata ccc gtc gcc agt       48
Met Thr Ser Asn Val Ile Thr Gln Asp Leu Pro Ile Pro Val Ala Ser        
1               5                   10                  15             
 
cgc ggc ttt gct gac att gtt ggc ttc ggt ctc gat gga gtc gtt atc       96
Arg Gly Phe Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Leu Asp Gly Val Val Ile        
            20                  25                  30                 
 
ggg cgc aac gcc gtc aac ctt cag ccc ttc ctt gcg gtc aag aac ttt      144
Gly Arg Asn Ala Val Asn Leu Gln Pro Phe Leu Ala Val Lys Asn Phe        
        35                  40                  45                     
 
gca cag aac gca gga ggg tgg ctc acc acg aaa cac gtt cgt ctc att      192
Ala Gln Asn Ala Gly Gly Trp Leu Thr Thr Lys His Val Arg Leu Ile        
    50                  55                  60                         
 
gcc gac acg acc ggc acc gga aaa ggc gac atc gtt ggg ttc ggc aac      240
Ala Asp Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Asp Ile Val Gly Phe Gly Asn        
65                  70                  75                  80         
 
gct ggc gtc tat gtc tct gtc aat aac ggc aaa aac acg ttt gct gac      288
Ala Gly Val Tyr Val Ser Val Asn Asn Gly Lys Asn Thr Phe Ala Asp        
                85                  90                  95             
 
ccg ccg aag atg gtc att gcc aac ttc ggt tac gat gca ggc ggc tgg      336
Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp        
            100                 105                 110                
 
cgc gtc gaa aag cac ctt cgc tac ttg gcc gac atc agg aag atc gga      384
Arg Val Glu Lys His Leu Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Arg Lys Ile Gly        
        115                 120                 125                    
 
cgg gct gat atc ata ggt ttt ggg gaa aaa gga gtc ctc gtc tcc cgc      432
Arg Ala Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Arg        
    130                 135                 140                        
 
aac aac ggc ggt ttg aac ttc ggc ccc gcc acc ctc gtt ttg aaa gac      480
Asn Asn Gly Gly Leu Asn Phe Gly Pro Ala Thr Leu Val Leu Lys Asp        
145                 150                 155                 160        
 
ttt ggc tac gat gcc ggt gga tgg cga ctc gac cgt cac ctt cgt ttt      528
Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe        
                165                 170                 175            
 
ctt gct gac gtt aca ggg aac gga cac ctc gac atc gtt ggt ttc ggt      576
Leu Ala Asp Val Thr Gly Asn Gly His Leu Asp Ile Val Gly Phe Gly        
            180                 185                 190                
 
gac aag cac gtc ttc atc agc cgt aac aac ggc gat ggg act ttc gcc      624
Asp Lys His Val Phe Ile Ser Arg Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Ala        
        195                 200                 205                    
 
ccc gca aaa tct gtc atc gac aac ttc tgc att gac gct ggt ggt tgg      672
Pro Ala Lys Ser Val Ile Asp Asn Phe Cys Ile Asp Ala Gly Gly Trp        
    210                 215                 220                        
 
aag atc ggc gac cac cct cgc ttc gta gct gac ttg aca ggt gac gga      720
Lys Ile Gly Asp His Pro Arg Phe Val Ala Asp Leu Thr Gly Asp Gly        
225                 230                 235                 240        
 
acg gcc gac atc att ggg tgt ggt aag gcc gga tgc tgg gtc gct ctg      768
Thr Ala Asp Ile Ile Gly Cys Gly Lys Ala Gly Cys Trp Val Ala Leu        
                245                 250                 255            
 
aat aat ggc ggc ggc gtt ttt ggg cag gtc aag ttg gtt atc aac gac      816
Asn Asn Gly Gly Gly Val Phe Gly Gln Val Lys Leu Val Ile Asn Asp        
            260                 265                 270                
 
ttt gga acc gat aag ggt tgg cag gcc gcc aag cat cct cga ttc att      864
Phe Gly Thr Asp Lys Gly Trp Gln Ala Ala Lys His Pro Arg Phe Ile        
        275                 280                 285                    
 
gct gac ctc acg ggc aat ggg cgc ggt gac gtt gtt gga ttc ggg aac      912
Ala Asp Leu Thr Gly Asn Gly Arg Gly Asp Val Val Gly Phe Gly Asn         
    290                 295                 300                        
 
gcc ggg gtc tat gtt gcg ctc aat aac ggc gat ggt act ttc cag tcg      960
Ala Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Gln Ser        
305                 310                 315                 320        
 
gcc aag ctc gtg ctc aag gac ttc ggc gtc caa cag gga tgg acg gtc     1008
Ala Lys Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Val Gln Gln Gly Trp Thr Val        
                325                 330                 335             
 
agc aag cac cga agg ttc gta gtc gac ttg acg ggg gac gga tgt gca     1056
Ser Lys His Arg Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala        
            340                 345                 350                
 
gac atc atc ggc ttt gga gag aag gag aca ctc gtc tcg tac aac gac     1104
Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Glu Thr Leu Val Ser Tyr Asn Asp        
        355                 360                 365                    
 
ggc aaa ggc aat ttc ggc cca gtc aag gcc ctt acc aac gac ttt tcg     1152
Gly Lys Gly Asn Phe Gly Pro Val Lys Ala Leu Thr Asn Asp Phe Ser        
    370                 375                 380                        
 
ttc agc ggt gga aaa tgg gcc ccg gag acg act gtc tgc tgg atg gcc     1200
Phe Ser Gly Gly Lys Trp Ala Pro Glu Thr Thr Val Cys Trp Met Ala        
385                 390                 395                 400        
 
aac ttg gac agc agc agg cat tag                                     1224
Asn Leu Asp Ser Ser Arg His                                             
                405                                                    
 
 
<210>  2
<211>  407
<212>  PRT
<213>  Agrocybe aegerita
 
 
<400>  2
 
Met Thr Ser Asn Val Ile Thr Gln Asp Leu Pro Ile Pro Val Ala Ser
1               5                   10                  15     
 
 
Arg Gly Phe Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Leu Asp Gly Val Val Ile
            20                  25                  30         
 
 
Gly Arg Asn Ala Val Asn Leu Gln Pro Phe Leu Ala Val Lys Asn Phe
        35                  40                  45             
 
 
Ala Gln Asn Ala Gly Gly Trp Leu Thr Thr Lys His Val Arg Leu Ile
    50                  55                  60                 
 
 
Ala Asp Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Asp Ile Val Gly Phe Gly Asn
65                  70                  75                  80 
 
 
Ala Gly Val Tyr Val Ser Val Asn Asn Gly Lys Asn Thr Phe Ala Asp
                85                  90                  95     
 
 
Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp
            100                 105                 110        
 
 
Arg Val Glu Lys His Leu Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Arg Lys Ile Gly
        115                 120                 125            
 
 
Arg Ala Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Arg
    130                 135                 140                
 
 
Asn Asn Gly Gly Leu Asn Phe Gly Pro Ala Thr Leu Val Leu Lys Asp
145                 150                 155                 160
 
 
Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe
                165                 170                 175    
 
 
Leu Ala Asp Val Thr Gly Asn Gly His Leu Asp Ile Val Gly Phe Gly
            180                 185                 190        
 
 
Asp Lys His Val Phe Ile Ser Arg Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Ala
        195                 200                 205            
 
 
Pro Ala Lys Ser Val Ile Asp Asn Phe Cys Ile Asp Ala Gly Gly Trp
    210                 215                 220                
 
 
Lys Ile Gly Asp His Pro Arg Phe Val Ala Asp Leu Thr Gly Asp Gly
225                 230                 235                 240
 
 
Thr Ala Asp Ile Ile Gly Cys Gly Lys Ala Gly Cys Trp Val Ala Leu
                245                 250                 255    
 
 
Asn Asn Gly Gly Gly Val Phe Gly Gln Val Lys Leu Val Ile Asn Asp
            260                 265                 270        
 
 
Phe Gly Thr Asp Lys Gly Trp Gln Ala Ala Lys His Pro Arg Phe Ile
        275                 280                 285            
 
 
Ala Asp Leu Thr Gly Asn Gly Arg Gly Asp Val Val Gly Phe Gly Asn
    290                 295                 300                
 
 
Ala Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Gln Ser
305                 310                 315                 320
 
 
Ala Lys Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Val Gln Gln Gly Trp Thr Val
                325                 330                 335    
 
 
Ser Lys His Arg Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala
            340                 345                 350        
 
 
Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Glu Thr Leu Val Ser Tyr Asn Asp
        355                 360                 365            
 
 
Gly Lys Gly Asn Phe Gly Pro Val Lys Ala Leu Thr Asn Asp Phe Ser
    370                 375                 380                
 
 
Phe Ser Gly Gly Lys Trp Ala Pro Glu Thr Thr Val Cys Trp Met Ala
385                 390                 395                 400
 
 
Asn Leu Asp Ser Ser Arg His
                405        

Claims (9)

1.杨树菇（Agrocybe aegerita）凝集素AAL-2，其特征在于：其氨基酸为SEQ ID NO.2所示。
2.一种制备权利要求1所述杨树菇凝集素AAL-2的方法，包括：（1）提取杨树菇总蛋白并去除变性蛋白；（2）除去变性蛋白后的杨树菇总蛋白过亲和层析柱,用缓冲液清洗亲和柱至无杂蛋白流出；（3）以缓冲液洗脱亲和层析柱，收集流出的蛋白，即得；所述的亲和层析柱是N-乙酰葡萄糖胺偶联的Sepharose 6B亲和层析柱。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的缓冲液为PBS缓冲液；步骤（3）中所述的缓冲液是含有0.2mol/LN-乙酰葡萄糖胺的缓冲溶液。
4.编码杨树菇凝集素AAL-2的cDNA，其特征在于：该cDNA为SEQ IDNO.1所示的核苷酸。
5.含有权利要求4所述cDNA的表达载体。
6.含有权利要求5所述表达载体的宿主细胞。
7.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于：由治疗上有效量的权利要求1所述的杨树菇凝集素AAL-2与药学上可接受的载体组成。
8.权利要求1所述的杨树菇凝集素AAL-2或权利要求4所述的cDNA在制备抗肝癌药物中的用途。
9.权利要求1所述的杨树菇凝集素AAL-2或权利要求4所述的cDNA在制备识别N-乙酰葡萄糖胺试剂中的用途。
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