JP2014524235A - アグロシベ・アエゲリタのレクチンａａｌ−２、及びそのコード遺伝子、その調製方法、及び応用 - Google Patents
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Abstract
本発明には、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２、及びそのコード遺伝子、その調製方法及び応用が開示された。本発明は、親和性クロマトグラフィーィー法を採用して、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）の全タンパク質からレクチンタンパク質ＡＡＬ−２を分離して得た。そのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表され、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表される。細胞試験によると、本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が、優れた腫瘍細胞致死活性を有し、肝臓癌細胞を顕著的にアポトーシスを起こせることができる。動物実験表明によると、ＡＡＬ−２が、腫瘍に対する良い治療効果を有する。糖チップ技術検出結果によると、ＡＡＬ−２が優先にＮ−アセチルグルコサミンを末端とする糖又は糖タンパク質に結合する。それをＮ−アセチルグルコサミンに関連する病症試薬、又はＮ−アセチルグルコサミンに関連する糖構造を検出する試薬とすることができる。
Description
本発明は、真菌から分離されたレクチン、及びそのコード遺伝子に関わり、特に、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）から分離されたレクチンＡＡＬ−２、及びそのコード遺伝子に関わる。また、本発明はアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の分離方法、及びその抗腫瘍、又はＮ−アセチルグルコサミンと関連する病症、及びＮ−アセチルグルコサミンと関連する糖構造の検出における応用に関わる。アグロシベ・アエゲリタのレクチンの分離及び応用領域に属する。
東洋において、医薬用真菌は、その独特の医薬用価値(特に、その抗腫瘍活性)により、二千年の歴史を持っている。前世紀の５０年代までは、技術の熟成、及び多糖などの有効成分の分離鑑定に基いて、医薬用真菌の医薬用の価値は欧米の研究者に初めて重視されるようになってきた。より多くの医薬用真菌の活性成分は、動物及び臨床試験においてスクリーニングが行われかつ験証されて、抗腫瘍薬のスクリーニングの宝庫になってきた。
アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）は、別名として柱状田頭茸（Southern poplar Mushroom）、茶樹茸、柳松茸などで、真菌門（Eumycophyta）、担子菌綱、ハラタケ目、オキナタケ科、フミヅキタケ類に属する。アグロシベ・アエゲリタは、人体に必要な八種のアミノ酸を含み、その中で、リジンが１.７５％と多く、栄養価値がシイタケ、エノキタケなどの他の食用菌を超えると同時に、独特な医薬用の価値を有する。民間では、それが抗癌、降血圧や、胃寒、腎炎、水腫の治療などに用いられている。独特な治療効果を持つが、その薬理成分がまだ明らかになっていない。
原発性肝臓癌は、世界では一番よく見られる悪性腫瘍の一つで、その全世界での罹病率及び死亡率がそれぞれ第７位及び第３位に列する。中国では、肝臓癌の罹病率は２５.７/１０万で、僅かに肺癌及び胃癌に次ぐが、その病死率が２３.７/１０万と高く、中国での腫瘍病死率において第２位に列する。今まで公認された肝臓癌診断治療法には、超音波診断、エタノールの皮下注射、化学放射線治療及び手術切除など方法があるが、肝臓癌の再発率及び転移率が高い。そこで、より有効な肝臓癌の抑制、又は肝臓癌細胞を殺す医薬又は方法が熱望されている。
レクチン（lectin）は、自然界で広く存在する非免疫由来のタンパク質で、可逆的｛かぎゃく てき｝に複数種類の糖又は糖タンパク質と結合することができ、且つこのような結合が酵素と基質との結合方式と異なっている。今まで、既に数百種類のレクチンが分離されて、レクチンの１種類ごとにその独特の生化学的特性、糖結合特異性及び幅広い生物活性、例えば、抗腫瘍活性、抗真菌活性及び抗ウイルス活性などを有する。孫慧（人名）などは、アニオン交換クロマトグラフィーという方法によりアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質からレクチンＡＡＬを分離して、それが広域スペクトルの抗腫瘍効果を有し、直腸がん、子宮頸がん、胃がん、白血病細胞など癌細胞のいずれに対しても致死活性を有することを検証した。中でも、白血病細胞ＨＬ６０に対する致死活性は、陽性対照薬のアドリアマイシンよりも高い（非特許文献１）。
孫慧など著 「アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬが抗腫瘍活性を有する」Biochem. J. (２００３) ３７４, ３２１−３２７
本発明は、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）から分離された新たなレクチンを提供することを目的とする。
また、本発明は、アグロシベ・アエゲリタから上記のレクチンを分離、又は、調製する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記の分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンをコードするｃＤＮＡを提供することを目的とする。
また、本発明は、上記のアグロシベ・アエゲリタのレクチンの、及びそのコード遺伝子の、薬理学的応用を提供することを目的とする。
また、本発明は、アグロシベ・アエゲリタから上記のレクチンを分離、又は、調製する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、上記の分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンをコードするｃＤＮＡを提供することを目的とする。
また、本発明は、上記のアグロシベ・アエゲリタのレクチンの、及びそのコード遺伝子の、薬理学的応用を提供することを目的とする。
本発明の上記の目的は、以下の技術手段により実現される。
本発明においては、新たなレクチンが、親和性クロマトグラフィーィー法によりアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質から分離されて、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と呼ばれ、そのアミノ酸配列が以下（ａ）又は（ｂ）で表される。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失又は/及び付加されている、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬの機能を有するポリペプチド変異体である。
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列において１つ若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失又は/及び付加されている、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬの機能を有するポリペプチド変異体である。
好ましくは、本発明の前記アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列である。
本発明においては、前記の"複数"が、通常１〜５０であり、好ましくは１〜３０であり、より好ましくは１〜２０であり、最も好ましくは２〜４である。これは、レクチンＡＡＬ−２の三次元構造におけるアミノ酸残基の位置、又はアミノ酸の種類によるものである。前記の"置換"とは、異なるアミノ酸残基で１つ若しくは複数のアミノ酸残基を置換することである。例えば、当業において、性能の近い又は似ているアミノ酸配列で置換する場合には、通常、タンパク質の機能が変わることはない。前記の"欠失"とは、アミノ酸配列の変改であり、１つ若しくは複数のアミノ酸残基が欠けることである。前記の"付加"とは、アミノ酸配列の改変であり、天然の分子に対しては、前記の改変による１若しくは複数のアミノ酸残基の添加、又は、Ｃ末端及び/又はＮ末端における１つ若しくは複数の（通常、２０以下であり、好ましくは１０以下であり、より好ましくは５以下である。）アミノ酸の添加である。
本発明の前記のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のポリペプチド変異体は、相同配列変異体、保存型変異体、等位変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高ストリンジェント又は低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能なＤＮＡがコードするタンパク質、及び、抗アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のポリペプチドの抗血清により得られたポリペプチド又はタンパク質からなる。
前記"ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件"とは、当業者において周知の低イオン強度と高温の条件を示す。通常、厳しい条件において、プローブとその目標配列とのハイブリダイゼーションの検出可能程度は、その他の配列とのハイブリダイゼーションの検出可能程度よりも高い（例えば、バックグラウンドを少なくとも２倍超える）。厳しいハイブリダイゼーション条件は配列依存性であり、異なる環境条件においては異なっている。比較的長い配列が比較的高い温度で特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー又は洗浄の条件を制御することにより、プローブと１００％相補する目標配列を同定することができる。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細なプロトコルは、文献（Tijssen, Techniques in Biochemistry andＭolecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays.１９９３)を参照することができる。より具体的には、前記のストリンジェントな条件としては、通常、特異配列の規定イオン強度、ｐＨにおける熱溶融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低い条件が選ばれる。Ｔｍとは、平衡状態で目標配列と相補するプローブの５０％が目標配列にハイブリダイズする時点に到達する温度（所定のイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度で）（目標配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、平衡状態で５０％のプローブが占められる）である。ストリンジェントな条件は、以下の条件であることができる。中でも、７.０乃至８.３のｐＨで塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン濃度より低く、通常、約０.０１乃至１.０ Ｍナトリウムイオン濃度（又は、その他の塩）であり、且つ温度が、短いプローブ（ヌクレオチドが１０乃至５０含まれるが、それに限定するものではない）に対しては、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（ヌクレオチドが５０含まれるが、それに限定するものではない）に対しては、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件をホルムアミドのような不安定剤の添加により実現することもできる。選択的な、又は特異的なハイブリダイゼーションに対しては、正のシグナルがバックグラウンドの少なくとも２倍であるハイブリダイゼーションでもいいが、場合によってはバックグラウンドの１０倍であるハイブリダイゼーションでもいい。参照として、前記の"ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件"については、以下のようである。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート又は５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０.２×ＳＳＣでの洗浄、及び６５℃で０.１％ ＳＤＳでの洗浄という条件である。前記の洗浄が、５、１５、３０、６０、１２０分間、又はより長く行うことができる。
本発明の前記のポリペプチド変異体が、遺伝的多型又は人工操作により発生することができる。これらの操作方法が、通常当業者に知られている。例えば、ＤＮＡ的突然変異によりＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列的変異体又はフラグメントを調製することができる。中でも、ポリヌクレオチドを誘変又は改変する的方法が、当業者によく知られている。
本発明により、その他のポリペプチド、例えば、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を、また提供する。
本発明は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２タンパク質又はポリペプチドの類似体も含む。これらの類似体は、天然アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２ポリペプチドとの相違点が、アミノ酸配列上の相違点であってもいいが、アミノ酸配列に影響を与えない修飾形式上の相違点であってもいい。若しくは、この両者を兼ね備える。これらのポリペプチドが、天然又は誘導の遺伝変異体を含む。誘導変異体が、各種類の技術により得られる。例えば、放射すること、又は誘変剤に暴露することによりランダム誘変を発生させる。また、特定部位の誘変法又はその他の既知な分子生物学の技術により、発生させることができる。類似体が、天然L-アミノ酸と違った残基（例えば、D-アミノ酸）を有する類似体、及び、非天然生存の、又は合成のアミノ酸（例えば、β、γ-アミノ酸）を有する類似体も含む。前記の修飾（通常、一次構造を変えない）形式が、体内又は体外でのポリペプチドの化学誘導形式、例えばアセチル化又はカルボキシル化を含む。前記の修飾が、糖基化も含む。例えば、ポリペプチドの合成及び加工において、又は更なる加工工程において糖基化修飾して発生するポリペプチドである。このような修飾は、ポリペプチドを、糖基化する酵素（例えば、哺乳動物の糖基化酵素又は脱糖基化酵素）に暴露させることにより達成することができる。修飾形式が、りん酸化アミノ酸残基（例えば、りん酸チロシン、りん酸トレオニン、りん酸セリン）を有する配列も含む。修飾されることで、抗タンパク質加水分解の性能が向上し、又は溶解の性能が最適化されたポリペプチドも含む。
本発明のその他の目的は、アグロシベ・アエゲリタからアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２を分離する方法を提供することである。当該方法が、（１）アグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を抽出し、変性タンパク質を除去する工程；（２）変性タンパク質が除去されたアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を親和性クロマトグラフィー用カラムに通過させ、紫外線検出器により不純物タンパク質の流出の検出ができなくなるまで親和性コラムを緩衝液で洗浄する工程；(３) 親和性クロマトグラフィー用カラムをＮ−アセチルグルコサミンの緩衝液で溶出し、流し出されたタンパク質を収集する工程；からなる。
より良い分離効果に達するために、前記親和性クロマトグラフィー用カラムが、Ｎ−アセチルグルコサミンがカップリングされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ-６Ｂの親和性クロマトグラフィー用カラムであり、工程（２）に記載の緩衝液が、ＰＢＳ緩衝液であることが好ましく；工程（３）においては、０.２ ｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルグルコサミンのＰＢＳ緩衝液で溶出を行うことが好ましい。
本発明では、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２の分離、精製において、親和性クロマトグラフィーィー方法を採用する。Ｎ−アセチルグルコサミンがカップリングされたSepharose-６Ｂの親和性コラムにより、一段階でアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質からレクチンＡＡＬ−２を抽出して得ることができる。本発明のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の分離の方法は、プロセスが簡便で、サンプルの純度が高く、調製コストが低い。
本発明のその他の目的は、レクチンＡＡＬ−２をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
本発明のその他の目的は、レクチンＡＡＬ−２をコードするヌクレオチド配列を提供することである。
アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２をコードするｃＤＮＡ配列は、以下の（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列である。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列；又は
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は/及び付加されているヌクレオチド変異体。当該ヌクレオチド変異体がコードするタンパク質はアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２の活性又は機能を有する。
前記ヌクレオチド変異形式には、通常１〜９０で、好ましくは１〜６０で、より好ましくは１〜２０で、最も好ましくは１〜１０のヌクレオチドの欠失、付加及び/又は置換、及び、５'及び/又は３'末端には複数（通常６０以下で、好ましくは３０以下で、より好ましくは１０以下で、最も好ましくは５以下である）のヌクレオチドが添加された変異体が含まれるが、こちらに限られない。
前記「ヌクレオチド変異体」とは、基本的に似ている配列である。ポリヌクレオチドに対しては、変体は、天然ポリヌクレオチドにおいて１つ若しくは複数の部位で１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失、付加又は/及び置換を含むものである。ポリヌクレオチドに対しては、保守的変体が、遺伝コドンの縮退によりコードされたアミノ酸配列が変わらない変体を含む。このような天然に存在している変体が、従来の分子生物学技術により同定することができる。また、変体ポリヌクレオチドが、合成に由来のポリヌクレオチド、例えば、特定部位の誘変又は組み換えの方法（例えば、ＤＮＡ組み換え）を採用して得たＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で表されるアミノ酸をコードするポリヌクレオチド変体も含む。当業者では、糖結合活性、ＤＮＡ結合活性、タンパク質同士の相互作用、一過性｛いっか せい｝研究における遺伝子発現の活性化状況などという分子生物技術手段により、変体ポリヌクレオチドがコードするタンパク質の機能又は活性をスクリーニング又は評価することができる。
更に、本発明は、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２をコードするｃＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、及び前記発現ベクターを含有するホスト細胞に関わる。
前記アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２をコードするｃＤＮＡ配列を、発現ベクター（前記発現ベクターは、各種類の市販の発現ベクターであってもよい。プラスミド、コスミッドなどが含まれる。）の適切な制限酵素切断部位の間に挿入し、操作可能に発現制御配列に接続することにより、当該ｃＤＮＡ配列を発現する発現ベクターが得られる。構築された発現ベクターが、５'非コード領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるｃＤＮＡ配列、及び３'非コード領域からなることができる。中でも、前記５'非コード領域については、プロモーター配列、エンハンサー配列、又は/及び翻訳リーダー配列などを含むことができる。前記プロモーター配列については、構成型、誘導型、組織又は器官特異的なプロモーターであってもいい。
前記３'非コード領域については、ターミネータ配列、ｍＲＮＡ切断配列などを含むことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるｃＤＮＡ配列については、１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は/及び付加されているヌクレオチド変異体に置換されてもいい。当該ヌクレオチド変異体がコードするタンパク質が、アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２の機能を有する。
更に、本発明は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列のアンチセンス配列を含むものである。このようなアンチセンス配列は、細胞内におけるアグロシベ・アエゲリタのレクチンタンパク質ＡＡＬ−２の発現の制御に用いることができる。
更には、本発明は、プローブとして使用することができるヌクレオチド分子を含むものである。当該分子が、通常アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のポリペプチドをコードする配列の連続ヌクレオチドを８〜１００、好ましくは１５〜５０有する。当該プローブについては、サンプルにはアグロシベ・アエゲリタのレクチンタンパク質のＡＡＬ−２をコードする核酸分子が存在するか否かの検出に用いることができる。
更に、本発明は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のヌクレオチド配列を検出する方法を含むものである。サンプルと上記のプローブでハイブリダイズした後、プローブが結合したかを検出することを含むものである。好ましくは、当該サンプルは、ＰＣＲ増幅した後の産物である。中でも、ＰＣＲ増幅のプライマーが、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のポリペプチドをコードする配列に対応し、当該コード配列の両側又は間に位置することができる。一般的には、プライマーの長さは２０〜５０ヌクレオチドである。
更に、本発明は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンタンパク質ＡＡＬ−２又はそのフラグメントのポリペプチドに対して、特異的な起源を有するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供するものである。前記「特異的」とは、抗体がアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物又はフラグメントに結合可能なことである。好ましくは、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物又はフラグメントに結合可能であるが、他の非関連の抗原分子を認識、結合しない抗体である。本発明においては、抗体は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を結合し制御することができる分子を含むものである。また、本発明は、修飾又は無修飾形式のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物に結合可能な抗体を含むものである。
本発明は、完整なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体だけではなく、かつ、免疫活性を有する抗体フラグメント、例えばＦａｂ'又は（Ｆａｂ）２フラグメント、抗体重鎖、抗体軽鎖、遺伝過程中改造された単鎖Ｆｖ分子やキメラ抗体、例えばマウス抗体結合特異性を有しながら、ヒト由来の抗体部分を保存する抗体も含む。
本発明の抗体は、当業者によって当業で既知の各種類の技術を採用することにより調製することができる。例えば、精製したアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物又はその抗原性を有するポリペプチドフラグメントを、ポリクローナル抗体の生産を誘導するように動物に投与することが挙げられる。それと同様に、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２又はその抗原性を有するフラグメントを発現する細胞も動物を免疫して抗体を生産することに用いられる。本発明の抗体は、モノクローナル抗体であってもいい。このようなモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により調製することができる。本発明の抗体は、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の機能を遮断可能な抗体、及びアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の機能に影響を与えない抗体を含む。本発明の各種類の抗体が、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物のフラグメント又は機能領域を利用して、通常の免疫技術により得られる。これらのフラグメント又は機能領域は、組み換え方法により調製する、又はポリペプチドシンセサイザーにより合成することができる。アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２遺伝子産物の無修飾形式に結合する抗体は、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）中で生産された遺伝子産物により動物を免疫して生まれる。翻訳の後で修飾する形式に結合する抗体（例えば、糖基化又はりん酸化したタンパク質又はポリペプチド）は、真核細胞（例えば、酵母又は昆虫細胞）中で生産された遺伝子産物により動物を免疫して得られる。
体外細胞試験により、本発明で分離されたＡＡＬ−２が腫瘍細胞を殺す活性を有し、肝臓癌細胞に対して顕著的にアポトーシスを起こさせることができ、且つこのようなアポトーシスを誘導する活性がアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の濃度による依存性を有することが、明らかになった。同時に、本発明においては、マウス肝臓癌細胞Ｈ２２で担がんマウスモデルを構築した。腫瘍内ＡＡＬ−２注入により、担がんマウスの腫瘍成長が明らかに抑制され、且つ担がんマウスの生存期が明らかに長くなる。これは、ＡＡＬ−２が腫瘍に対しては良い治療効果を持っていることを示した。
アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を腫瘍の治療に用いる場合には、その投与剤量及び投与方式が、腫瘍種類、患者の状况などの要因により決められる。アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２又はその突然変異体を注射制剤に調製し、静脈注射、１回又は複数回の腫瘍内、皮下注射又は静脈注射をすることができる。又は、それを経口剤、例えば腸溶性カプセル、コロン位置決めカプセル、微小球、ナノ粒子などに調製することができる。
また、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２又はその突然変異体をコードするヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を人体内での発現に適する発現ベクターに構築して遺伝子治療薬に調製する。これらの方法は、いずれも熟練した当業者によって把握されるものである。
本発明では、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の糖結合スペクトルを同定した結果、ＡＡＬ−２は、Ｎ−アセチルグルコサミンに対して高い結合特異性を有するタンパク質であることが示された。糖チップ技術の検出結果により、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が優先にＮ−アセチルグルコサミンを末端とする糖又は糖タンパク質に結合することが分かる。これにより、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を、Ｎ−アセチルグルコサミンに関連する病症の検出に用いることができ、且つ、Ｎ−アセチルグルコサミンに関連する糖構造を検出する試薬とすることができ、疾病診断のプローブに製成する潜在力があることが、明らかになった。
以下、具体的な実施例に合わせて本発明をより具体的に説明する。本発明の利点及び特点は、説明に従ってはっきりになる。しかし、これらの実施例は、ただの例であり、本発明の範囲構成を制限することはない。当業者に対して、容易に理解できるのは、本発明の趣旨及び範囲から離れない限り、本発明の技術方案的詳細内容及び形式を補正又は置換を行うことができるが、これらの補正及び置換は、全て本発明の保護範囲内に入ることである。
＜実施例＞
実施例１ アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２タンパク質の調製
（１）アグロシベ・アエゲリタの全タンパク質の調製
干したアグロシベ・アエゲリタの子実体(福建三明真菌研究所から入手)を取り、粉砕機で粉末まで粉砕し、１：１０ （ｗ／ｖ）の割合で再蒸留水を入れ、浸した。計３回、１回毎に４時間又は一晩浸した。それぞれ、１回毎に浸した上澄みを取り、８０％まで過硫酸アンモニウムを入れ、一晩置いた。遠心（１０、０００ ｒｐｍ／ｍｉｎ、２０ ｍｉｎ）して、沈殿を集め、沈殿を適当量の再蒸留水に溶かし、透析して塩を除去し、凍結乾燥してアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を得た。
実施例１ アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２タンパク質の調製
（１）アグロシベ・アエゲリタの全タンパク質の調製
干したアグロシベ・アエゲリタの子実体(福建三明真菌研究所から入手)を取り、粉砕機で粉末まで粉砕し、１：１０ （ｗ／ｖ）の割合で再蒸留水を入れ、浸した。計３回、１回毎に４時間又は一晩浸した。それぞれ、１回毎に浸した上澄みを取り、８０％まで過硫酸アンモニウムを入れ、一晩置いた。遠心（１０、０００ ｒｐｍ／ｍｉｎ、２０ ｍｉｎ）して、沈殿を集め、沈殿を適当量の再蒸留水に溶かし、透析して塩を除去し、凍結乾燥してアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を得た。
（２）親和性コラムの分離精製
４００ ｍｇのアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を取り、９０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に溶かし、遠心して変性タンパク質を除去した。上澄みを取り、親和性クロマトグラフィー用カラムを通せた。Ｎ−アセチルグルコサミンがカップリングしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを親和性クロマトグラフィー用カラムとした。ＰＢＳ緩衝液でバランスした後、上記のアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質の上澄みの親和性クロマトグラフィーィーを行いた。ローディング完了した後、紫外線検出器により不純物タンパク質の流出の検出ができなくなるまで親和性コラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０.２ ｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルグルコサミンのＰＢＳ緩衝液で溶出し、流し出されたタンパク質を集めて、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を得た。
４００ ｍｇのアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質を取り、９０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に溶かし、遠心して変性タンパク質を除去した。上澄みを取り、親和性クロマトグラフィー用カラムを通せた。Ｎ−アセチルグルコサミンがカップリングしたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂを親和性クロマトグラフィー用カラムとした。ＰＢＳ緩衝液でバランスした後、上記のアグロシベ・アエゲリタの全タンパク質の上澄みの親和性クロマトグラフィーィーを行いた。ローディング完了した後、紫外線検出器により不純物タンパク質の流出の検出ができなくなるまで親和性コラムをＰＢＳ緩衝液で洗浄し、０.２ ｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルグルコサミンのＰＢＳ緩衝液で溶出し、流し出されたタンパク質を集めて、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を得た。
集まったＡＡＬ−２を透析して余分のＮ−アセチルグルコサミンを除去し、鶏の赤血球でＡＡＬ−２の凝血活性を測定した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによりアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を検出して、単一のタンパク質成分であることが分かった。結果を図１に示す。
実施例２ アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２タンパク質のヌクレオチドコード領域の同定、及びＡＡＬ−２タンパク質のアミノ酸コード
実施例１におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥにより得たＡＡＬ−２バンドを切り出し、質量分析により、ペプチド断片を６本得た。同時に、本発明では、アグロシベ・アエゲリタの菌糸及び子実体のトランスクリプトームライブラリー(ＮＣＢＩコードはＳＲＡ０２６７３１である)を構築し、地元のＢＬＡＳＴＸにより６本のペプチド断片のアミノ酸配列とトランスクリプトームライブラリーとを相同アライメントを行いた。アライメントの結果、ＡＡＬ−２タンパク質のヌクレオチドコード領域が、トランスクリプトームライブラリーにおける遺伝子Unigene４１９８の相補鎖に位置することを見出した。オープン・リーディング・フレームの同定により、タンパク質コード領域を得た。このタンパク質コード領域により翻訳されたアミノ酸配列が、質量分析により得られたＡＡＬ−２ の６本ペプチド断片に高度にマッチ可能で（図２）、且つＥｘＰＡＳｙソフトウェアにより予測されたタンパク質分子量は、４３,１７５ｋＤａで、実施例１におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥ結果と一致した。これにより、このコード領域はアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のヌクレオチド配列であることを確かめにした。そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で表されるもので、質量分析同定により、コードされたアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で表されるものである。
実施例１におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥにより得たＡＡＬ−２バンドを切り出し、質量分析により、ペプチド断片を６本得た。同時に、本発明では、アグロシベ・アエゲリタの菌糸及び子実体のトランスクリプトームライブラリー(ＮＣＢＩコードはＳＲＡ０２６７３１である)を構築し、地元のＢＬＡＳＴＸにより６本のペプチド断片のアミノ酸配列とトランスクリプトームライブラリーとを相同アライメントを行いた。アライメントの結果、ＡＡＬ−２タンパク質のヌクレオチドコード領域が、トランスクリプトームライブラリーにおける遺伝子Unigene４１９８の相補鎖に位置することを見出した。オープン・リーディング・フレームの同定により、タンパク質コード領域を得た。このタンパク質コード領域により翻訳されたアミノ酸配列が、質量分析により得られたＡＡＬ−２ の６本ペプチド断片に高度にマッチ可能で（図２）、且つＥｘＰＡＳｙソフトウェアにより予測されたタンパク質分子量は、４３,１７５ｋＤａで、実施例１におけるＳＤＳ-ＰＡＧＥ結果と一致した。これにより、このコード領域はアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２のヌクレオチド配列であることを確かめにした。そのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で表されるもので、質量分析同定により、コードされたアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２で表されるものである。
実験例１ 本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と従来のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬとの相同性分析
１、本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と既に開示されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬとのヌクレオチド相同性のアライメント分析結果を図３に示す。アライメント結果から、両者のヌクレオチド相同性は、４０.６３％(１９３/４７５)、Ｇａｐ＝６１.２２％(７５０/１２２５)であることを分かった。
２、本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と既に開示されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬとのアミノ酸相同性分析結果を図４に示す。アライメント結果から、両者のアミノ酸相同性は２２.７８％(３６/１５８) で、アミノ酸残基の相似度は４７.４７％(７５/１５８) 、 Ｇａｐ＝６１.１８％(２４９/４０７)であることを分かった。
３、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と既に開示されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬとのＳＤＳ-ＰＡＧＥ結果から、ＡＡＬの分子量は１５．８ ｋＤａで、ＡＡＬ−２の分子量は４３ ｋＤａであることを分かった(図５)。
４、本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２と既に開示されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬとの糖スペクトル分析結果をそれぞれ表２及び表３に示す。
上記の実験結果により、従来技術におけるアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬは、単量体の分子量が１５.８ ｋＤａで、２量体であり、本発明に分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２は、分子量が４３ ｋＤａで、単量体であることを分かった。ＡＡＬとＡＡＬ−２とのヌクレオチド配列のアライメント及びアミノ酸配列アライメントにより、両者のヌクレオチド相同性は、約４０％、アミノ酸相同性は約２０％であることを分かった。糖スペクトルにより、ＡＡＬ−２がＮ−アセチルグルコサミンを末端とする糖基に特異的に結合し、ＡＡＬの糖スペクトルと全く異なっていることを分かった。その故、本発明に分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２は、ＡＡＬと全く違っているもう一つのアグロシベ・アエゲリタのレクチンである。
実験例２ アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２タンパク質の抗腫瘍活性実験
１．アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の体外における肝臓癌細胞に対する致死効果
１．アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の体外における肝臓癌細胞に対する致死効果
本実験では、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２（実施例１により分離されたタンパク質）の二種の腫瘍細胞株（Ｈ２２、Ｈｕｈ７）に対する致死活性を検出した。
Ｈ２２細胞株及びＨｕｈ７細胞株（ＡＴＣＣから入手）が、それぞれＲＰＭＩ１６４０培地及びＤＭＥＭ培地（いずれも１０％のウシ胎仔血清、１００ｍｇ／ｍＬ のストレプト及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリンを含む。）で培養された。濃度の違った、実施例１により調製されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を腫瘍細胞中に入れ（最終濃度は、０．６μｍｏｌ／Ｌ，１．２μｍｏｌ／Ｌ，２．４μｍｏｌ／Ｌ）、それぞれ２４時間及び３６時間培養された。処理された細胞を単一細胞までピペットで懸濁、又は消化し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ染料で染色し、フローサイトメーターで検出を行った。
検出結果を図６に示す。アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が、二種の肝臓癌細胞株の細胞アポトーシスを顕著に起こして、肝臓癌細胞を殺すことができる。
２．担がんマウス腫瘍組織に対するアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の成長抑制の作用
本実験においては、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６-８周齢、２０克）を採用し、腋窩で、０.１ｍＬのマウス肝臓癌細胞Ｈ２２株（１×１０７ cells/ｍＬ ）を皮下接種し、接種した後の第７日に腫瘍内アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２（実施例１により分離されたタンパク質）注射をした（５ｍｇ/kg, ０.１ｍＬ/匹）。対照では、生理食塩水を注射した。その後、１日を置いて注射し、計７回注射し、マウス腫瘍組織の寸法を記録した。腫瘍の寸法＝腫瘍組織の長さＬ×幅Ｗ２／２である。
本実験においては、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６-８周齢、２０克）を採用し、腋窩で、０.１ｍＬのマウス肝臓癌細胞Ｈ２２株（１×１０７ cells/ｍＬ ）を皮下接種し、接種した後の第７日に腫瘍内アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２（実施例１により分離されたタンパク質）注射をした（５ｍｇ/kg, ０.１ｍＬ/匹）。対照では、生理食塩水を注射した。その後、１日を置いて注射し、計７回注射し、マウス腫瘍組織の寸法を記録した。腫瘍の寸法＝腫瘍組織の長さＬ×幅Ｗ２／２である。
結果を図７に示す。アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が、担がんマウス腫瘍の成長を抑制し、担がんマウスの生存時間を顕著に長くすることが分かった。
細胞実験結果から、本発明により分離されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が肝臓癌細胞を殺す活性を有することを分かった。動物実験から、ＡＡＬ−２がＨ２２担がんマウスの腫瘍組織の成長を抑制し、担がんマウスの生存時間を長くし、担がんマウスに対して確実な治療作用を有することを分かった。
実験例３ アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の糖結合特異性
アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の糖結合活性を同定するために、本実験においては、糖チップ技術を利用し、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を採用して、４６５種の糖に対して検出を行った。
アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の糖結合活性を同定するために、本実験においては、糖チップ技術を利用し、アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２を採用して、４６５種の糖に対して検出を行った。
まず、ビオチンで、精製されたアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２（実施例１により分離されたものである）を標識し、２００ μg/ｍＬ のＡＡＬ−２で糖チップをインキュベートした。そして、フルオレセインにより標識されたストレプトアビジンを、ビオチンにより標識されたＡＡＬ−２を結合させた。結果を表４に示す（高→低の順で、違った糖に対するＡＡＬ−２ の親和力が並べた（前２３位の糖））。アグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２が特異的に優先にＮ−アセチルグルコサミンを末端とする糖に結合可能であることにより、ＡＡＬ−２が、Ｎ−アセチルグルコサミンを認識するプローブに開発される可能性があることが分かった。
Claims (10)
- アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２において、
アミノ酸が以下の（ａ）又は（ｂ）は、：
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸残基が置換、欠失又は/及び付加されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるアミノ酸の機能を有する誘導配列、であることを特徴とするアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２。 - 請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２の調製方法において、
（１）アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）の全タンパク質を抽出し、変性タンパク質を除去する工程；
（２）変性タンパク質が除去されたアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）の全タンパク質が親和性クロマトグラフィー用カラムを通過させ、不純物タンパク質の流出がなくなるまで親和性コラムを緩衝液で洗浄する工程；
（３）親和性クロマトグラフィー用カラムを緩衝液で溶出し、流し出されたタンパク質を収集する工程；
を含むアグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２の調製方法。 - 前記親和性クロマトグラフィー用カラムは、Ｎ−アセチルグルコサミンがカップリングされたＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ親和性クロマトグラフィー用カラムであり、工程（２）に記載の緩衝液は、ＰＢＳ緩衝液であり；工程（３）に記載の緩衝液は、Ｎ−アセチルグルコサミンを０.２ｍｏｌ／Ｌ含有する緩衝溶液であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- アグロシベ・アエゲリタ（Agrocybe aegerita）のレクチンＡＡＬ−２をコードするｃＤＮＡにおいて、
以下の（ａ）又は（ｂ）で表されるヌクレオチドであり、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列；又は
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で表されるヌクレオチド配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失又は/及び付加されているヌクレオチド変異配列であり、当該ヌクレオチド変異配列がコードするタンパク質は請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２の機能を有することを特徴とするｃＤＮＡ。 - 請求項４に記載のｃＤＮＡを含有する発現ベクター。
- 請求項５に記載の発現ベクターを含有するホスト細胞。
- 腫瘍の治療のための医薬組成物において、治療的に有効量の請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２、及び、薬学的に許容されるベクターからなる、ことを特徴とする腫瘍の治療のための医薬組成物。
- 請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２、又は、請求項４に記載のｃＤＮＡの抗腫瘍薬の調製における応用。
- 請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２、又は、請求項４に記載のｃＤＮＡのＮ−アセチルグルコサミンに関連する病症の試薬の調製、検出における応用。
- 請求項１に記載のアグロシベ・アエゲリタのレクチンＡＡＬ−２、又は、請求項４に記載のｃＤＮＡのＮ−アセチルグルコサミンに関連する糖構造的試薬の調製、検出における応用。
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