JP3924330B2 - 新規タンパク質、その遺伝子、アポトーシス誘導用試薬及び抗ガン剤 - Google Patents
新規タンパク質、その遺伝子、アポトーシス誘導用試薬及び抗ガン剤 Download PDFInfo
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Description
技術分野
本発明は、細胞に対してアポトーシス（apoptosis）を誘導させ、ガン細胞等の細胞死を誘発させるか、ガン細胞増殖抑制活性を示す新規なタンパク質、その遺伝子、そのモノクローナル抗体、ガン細胞アポトーシス認定用試薬及び抗ガン剤に関する。
従来技術
腫瘍性疾患は、化学療法の著しい進歩で生存率及び治療率が向上している。しかし、一方で抗ガン剤の強力な副作用により正常細胞に大きなダメージを与えることが社会問題化している。抗ガン剤の副作用を防止するには、優れたガン細胞選択性を有する薬剤又は腫瘍細胞の増殖をコントロールできる薬剤が要求される。
従来よりガンの化学療法では、治療投与量でも有害作用が発生しうるので、できるだけ投薬量を抑える方法が採られている。そのため複数の機序の異なる抗ガン剤の併用による相乗作用を期待したり、抗ガン剤と他の物質との併用によって抗ガン剤の作用を増強させる試みが行われている。後者では、抗ガン剤と免疫賦活剤との組合わせが一般化しており、腫瘍細胞への直接的な効果と、生体の免疫能を活性化することによる抗腫瘍効果の併用によって、抗腫瘍効果を増強させる。また、対象とする症例によっては、治療効果を上げるため、これらの方法と、放射線療法や外科的療法の組合わせによって効果を上げる努力が行われている。
近年、細胞死には２つの種類の死、即ち、アポトーシス（apoptosis，遺伝子に支配された細胞死）及びネクローシス（necrosis，遺伝子に支配を受けない細胞死）があることが知られるようになっている。アポトーシスとネクローシスとは、生化学的測定法としてＤＮＡが断片となる様子を観察することにより見分ける方法が良く用いられている。この測定法によると、従来の抗ガン剤は、腫瘍細胞に対してネクローシスを引き起こして抗ガン作用を発揮するものがほとんどであり、遺伝子的に腫瘍細胞の死をコントロールすることはできない。一方、腫瘍細胞にアポトーシスを起こす物質は、腫瘍細胞の死をコントロールできる可能性があることから盛んに研究が行われている。また、アポトーシスを誘導する抗ガン剤は、作用機序の異なる従来の抗ガン剤との併用によって抗腫瘍効果をより増強させることが期待できる。
発明の開示
本発明の目的は、細胞、特に、ヒトガン細胞に対してアポトーシスを誘導させ、細胞に細胞死を誘発させる活性若しくはガン細胞増殖抑制活性を示す新規なタンパク質、その断片、その遺伝子及びそのモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、in vitroにおいて、細胞、特にガン細胞に対してアポトーシスを誘導させ、細胞の細胞死を誘発するメカニズムを研究するためのアポトーシス誘導用試薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、特に、ヒトガン細胞に対して細胞増殖抑制作用又はガン細胞死を誘発する作用を示す抗ガン剤を提供することにある。
本発明者は、従来から知られるアポトーシスによる細胞死をガン治療に役立てるため、ガン細胞に対してアポトーシスを誘発するペプチド又はタンパク質を鋭意研究した結果、サバ内臓より精製したタンパク質に、血液ガン細胞のみならず、腫瘍ガン細胞の種々の細胞に対してもアポトーシス誘発活性を示すものがあることを見い出し、このｍＲＮＡを単離し、これを出発材料としてｃＤＮＡを得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すタンパク質が提供される。
また本発明によれば、前記タンパク質をコードする配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子が提供される。
更に本発明によれば、前記タンパク質のモノクローナル抗体が提供される。
更にまた本発明によれば、前記タンパク質を含むアポトーシス誘導用試薬が提供される。
更に本発明によれば、前記タンパク質を有効成分として含む抗ガン剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で調製した白血病細胞殺傷活性画分（レーン１はサバ内臓抽出物、レーン２は硫安沈澱画分、レーン３はゲル濾過活性画分、レーン４はＣｏｎ Ａカラム吸着画分、レーン５はＭｏｎｏ Ｑ吸着画分、レーン６は最終精製ＡＩＰ（アポトーシス誘導タンパク質）をそれぞれ示す）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。
図２は、実施例１で調製した白血病細胞殺傷活性画分（レーン１はサバ内臓抽出物、レーン２は硫安沈澱画分、レーン３はゲル濾過活性画分、レーン４はＣｏｎ Ａカラム吸着画分、レーン５はＭｏｎｏ Ｑ吸着画分、レーン６は最終精製ＡＩＰをそれぞれ示す）を、ＰＶＤＦ膜に転写後に白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体で免疫染色した結果を示す写真である。
図３は、実施例２で調製した各モノクローナル抗体（Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈ）の実施例１で調製したサバ内臓抽出液に対するウエスタンブロット解析の結果を示す写真であり、レーン１はモノクローナル抗体Ｉ３８Ａによる免疫染色、レーン２はモノクローナル抗体Ｉ３２Ｄによる免疫染色、レーン３はモノクローナル抗体Ｉ３１０Ｈによる免疫染色をそれぞれ示す。
図４は、実施例３で行った精製白血病細胞殺傷物質のヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対する殺傷活性を、ＭＴＳアッセイで測定した際の濃度と処理１６時間後の生細胞の割合との相関関係を示すグラフである。
図５は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質で処理した際の生細胞の割合を経時的に解析した結果を示すグラフである。
図６は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質で処理した際のＤＮＡ断片化を経時的に解析した結果を示す写真であり、各レーンの上に示された数字は経過時間を、Ｍは１２３ｂｐ分子量マーカーをそれぞれ示す。
図７は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質の処理０時間後（図７（Ａ））、２時間後（図７（Ｂ））、４時間後（図７（Ｃ））、１２時間後（図７（Ｄ））のそれぞれの細胞中のＤＮＡの含有量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。それぞれのグラフにおいて、縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。
図８は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質処理細胞の変化を顕微鏡で観察した結果を示す写真であって、（Ａ）は処理０時間後の結果、（Ｂ）は処理２時間後の結果、（Ｃ）は処理４時間後の結果、（Ｄ）は処理１２時間後の結果をそれぞれ示す。
図９は、図８に示す各処理時間経過後の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核をヘキスト３３２５８で蛍光染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す写真であって、（Ａ）は処理０時間後の結果、（Ｂ）は処理２時間後の結果、（Ｃ）は処理４時間後の結果、（Ｄ）は処理１２時間後の結果をそれぞれ示す。
図１０は、ＡＩＰ遺伝子及びその変異遺伝子をサル腎由来細胞株ｃｏｓ−７に導入し、各種の変異ＡＩＰを得、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析と同様な測定を行った、実施例５の結果を示す写真である。レーン１は配列番号１におけるアミノ酸配列１−５２４番からなる全長ＡＩＰ、レーン２はアミノ酸配列１−４９６番からなる変異ＡＩＰ、レーン３はアミノ酸配列１−５１４番からなる変異ＡＩＰの結果をそれぞれ示す。
図１１は、寄生虫に感染したサバの内臓抽出物（レーン１−５）と非感染サバの内臓抽出物（レーン６−１０）に対する、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を行った実施例６の結果を示す写真である。
発明の説明
本発明のタンパク質及びその断片は、▲１▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は、▲２▼該配列と少なくとも部分的に相同若しくは類似したアミノ酸配列を含み、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すか、▲３▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と配列相同性を有し、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すか、▲４▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうちの６１−８９番目のアミノ酸配列と、４９７−５１４番目のアミノ酸配列とを有し、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものである。
本発明において、前記▲２▼の配列番号１のアミノ酸配列に相同したとは、好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を示すものである。アミノ酸配列に類似の配列とは、該アミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列であって、そのタンパク質が配列番号１のタンパク質と同様なガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものを意味する。このようなアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸が置換している場合、少なくとも１つの新たなアミノ酸が挿入されている場合、少なくとも１つのアミノ酸が欠損している場合がある。
前記▲３▼の配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性を有するとは、配列番号１のアミノ酸配列と由来動物の種が異なることによるアミノ酸配列の相違が認められのみで、ガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものを意味する。
本発明のタンパク質及びその断片は、タンパク質又はアミノ酸のε−アミノ基、若しくはアミン化合物又はアミノ酸のアミノ基を基質として、以下に示す酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒し、過酸化水素を生成させることができるものと考えられる。
Ｒ−ＣＨ2ＮＨ2＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2＝Ｒ−ＣＨＯ＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
また、本発明のタンパク質及びその断片は、ガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示す一因として、補酵素としてのフラビンを必要とするものと考えられる。このため、配列番号１のアミノ酸配列において、可視吸収スペクトルに対するフラボタンパク質がもつ典型的な変化と同様な変化を示す配列番号１のアミノ酸配列のうちの６１−８９番目のアミノ酸配列を有することが好ましく、また、細胞死誘発活性を示すために必須であると考えられる配列番号１のアミノ酸配列のうちの４９７−５１４番目のアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明のタンパク質及びその断片において、細胞死誘発活性を示すとは、アポトーシスを示すことであり、これは、生化学的測定法としてＤＮＡの断片化、即ち、クロマチンＤＮＡのヌクレオソーム単位での切断を観察する方法、アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化をフローサイトメトリーで測定する方法、顕微鏡観察により、その形態的特徴からアポトーシスを検出する直接的方法等により確認することができる。この細胞としては、ガン細胞、例えば、肺ガン、胃ガン、大腸ガン、卵巣ガン、脳腫瘍、乳ガン、腎ガン、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）感染細胞等を挙げることができる。
このような相同又は類似のアミノ酸配列を含むタンパク質及びその断片は、通常の組換え技術等の公知の方法により容易に製造することができる。
本発明のタンパク質及びその断片は、タンパク質の他の構造的特徴は特に限定されない。例えば糖鎖等により修飾されていても良い。
本発明のタンパク質及びその断片の起源は特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で示すタンパク質は、寄生虫に感染したサバの内臓抽出物から単離したものである。即ち、サバ（学名：Scomber japonicus, 一般名：Chub mackerel）由来のものが挙げられる。しかし、後述の実施例で示すようにこのタンパク質は、寄生虫非感染サバの内臓抽出物からは得られなかった。従って、寄生虫感染のようにヘルパＴ2細胞（Ｔｈ2細胞）の活性化を伴う刺激によりサバから誘導されると同様に、同じ機構により哺乳動物からでも本発明のタンパク質及びその断片と同様なタンパク質又は配列相同性のあるタンパク質及びその断片を得ることができる。故に、本発明のタンパク質及びその断片の起源はサバに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来であっても良い。このような哺乳動物由来のタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、種の相違に基づく配列相同性を示すアミノ酸配列のタンパク質である。
配列番号１で示すタンパク質に対して配列相同性を有するタンパク質を調製するには、例えば、哺乳動物の遺伝子ライブラリーから配列番号２で示すＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション法により得られた遺伝子より、通常の組換え技術等に基づいて容易に得ることができる。
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、前記タンパク質又はその断片をコードする遺伝子及び該遺伝子のうち、配列表の配列番号２に示される塩基配列及び該配列と少なくとも部分的に相同若しくは類似した塩基配列を含む遺伝子である。ここで、類似した塩基配列とは、この塩基配列のうち、少なくとも１つのコドンが置換している場合、少なくとも１つの新規なコドンが挿入されている場合、少なくとも１つのコドンが欠損している場合であって、前記タンパク質のアミノ酸をコードするものである。
このような遺伝子は、公知の方法、例えばｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製して単離したり、ゲノムＤＮＡから単離することもできる他、化学的に合成することもできる。
本発明のモノクローナル抗体は、通常の方法、例えば前記タンパク質又はその断片を抗原として、ハイブリドーマの技術を利用して製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5872、寄託日1997,3,13）、モノクローナル抗体Ｉ３２Ｄ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5873、寄託日1997,3,13）又はモノクローナル抗体Ｉ３１０Ｈ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5874、寄託日1997,3,13）等が挙げられる。
本発明のタンパク質及びその断片は、前記遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞を増殖させ、細胞内又は細胞外に分泌させることにより得ることができる。この際、使用できる発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス等の他に本発明の遺伝子を組み込むことが可能であり、発現しようとする宿主細胞で該遺伝子を安定に存在させることができるＤＮＡ断片等を挙げることができる。発現ベクターは、転写プロモーター、転写を制御するエンハンサー、オペレーター配列、適切なリボソーム結合配列、転写および翻訳を制御する配列、ベクターＤＮＡの複製を行うための配列等が必要である。また、細胞外へ分泌させる場合には分泌シグナル配列が必要となる。
前記宿主細胞は、細菌である大腸菌、酵母等が有用であり、またアフリカミドリザルの線維芽細胞由来のＣＯＳ７細胞等が挙げられる。これらは市販品を用いることができる。
本発明のアポトーシス誘導用試薬は、前述の本発明のタンパク質、その断片及び前記本発明のモノクローナル抗体からなる群より選択される少なくとも１種を含んでおれば良い。この試薬を使用して、腫瘍細胞等の細胞にアポトーシスを誘導させることができ、アポトーシスを起こした細胞の細胞形態、細胞遺伝子及び細胞内シグナル伝達機構の解明を研究するキットとして使用できる。
本発明の抗ガン剤は、前述の本発明のタンパク質及び／又はその断片を有効成分として含み、必要により更に前述の本発明のモノクローナル抗体を含む。投与方法としては、経口、注射等により行うことができる。製剤は、散在、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、乳化剤、懸濁剤等の種々の形態とすることができる。また、本発明の抗ガン剤には、通常薬学的、製剤学的に許容できる添加剤を含んでいても良い。適当な投与量は、ガンの種類等によっても異なるが、患者の体重１ｋｇあたり、有効成分を約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与するのが好ましい。
本発明のタンパク質及びその断片は、細胞、特にヒトガン細胞に対してアポトーシス等を誘導させ、ガン細胞に細胞死を誘発させる活性若しくはガン細胞増殖抑制活性等を示す新規なものであり、且つサバ等の食用魚類にも含有されるので、ガン抑制等の機能性食品、抗ガン剤、アポトーシス誘導用試薬等に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、抗ガン剤、アポトーシス誘導用試薬等に有用である。
本発明の遺伝子は、前記本発明のタンパク質及びその断片をコードするものであるので、これらの大量製造に利用できる。
本発明のアポトーシス誘導用試薬は、細胞に対してアポトーシスを誘導させるので、そのアポトーシスを起こした細胞の細胞形態、細胞遺伝子及び細胞内シグナル伝達機構の解明を行うことができる。
本発明の抗ガン剤は、ガン細胞に対してアポトーシスを起こさせるので、ガン細胞の死をコントロールして抗ガン作用を得ることができると共に、他の細胞に対する副作用を極めて抑制することができる。
実施例
以下、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
マサバから内臓を摘出し、冷水を重量比で等量加えてホモジナイズした。次いで、冷却遠心分離機で、３０分間、15000ｇで遠心して油分と沈澱物を除去した。得られた精澄液を凍結乾燥してサバ内臓乾燥粉末とした。調製したサバ内臓乾燥粉末を10mg／mlの濃度となるように蒸留水に溶解し、氷上で十分冷却した後、硫酸アンモニウム５５重量％飽和状態とした。次いで、15000rpmで３０分間遠心分離を行って沈澱物を除去し、上清を硫酸アンモニウム９５重量％飽和状態とし、更に、前記条件で遠心分離を行って沈澱物を分離した。得られた沈澱物に少量のトリス緩衝液（２０mM Tri-HCl,pH７．５，０．３M NaCl）を加えて沈澱物を溶解させ飽和画分を得た。
得られた飽和画分の試料５mlを、予めトリス緩衝液で平衡化したカラム（商品名「HiLoad 16/60 Superdex 200」,Pharmacia社製）にかけ、６０ml／時間の流速でゲル濾過を行い、２．５mlずつ分取し、活性画分を収集した。得られた活性画分を、予めトリス緩衝液により平衡化したカラム（Con A-Sepharoseカラム,Pharmacia社製）にかけ、トリス緩衝液で２８０nmの吸収がなくなるまで洗浄した。
０．５M濃度メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含むトリス緩衝液で溶出される活性画分を集め、ビス−トリス緩衝液（２０mM bis-Tri-HCl,pH６．４，１００mM NaCl）で透析し、Ultrafree-15（商品名「Biomax-50」,MILLIPORE社製）で濃縮した。得られた濃縮液を、予めビス−トリス緩衝液で平衡化したカラム（商品名「Mono Q 5/5カラム」,Pharmacia社製）に供し、ビス−トリス緩衝液で２８０nmの吸収がなくなるまで洗浄後、結合画分をＮａＣｌの濃度勾配により以下の条件で溶出させた。目的のペプチド（タンパク質）を含む画分の溶出は３００mM前後に溶出した。
条件
緩衝液Ａ：20mMビス−トリス緩衝液,100mM NaCl,pH6.4
緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中に1M NaCl
グラジエント：０％Ｂ５分間，０〜５０％Ｂ２０分間，５０％Ｂ２分間，５０〜１００％５分間
流速：１．０ml／分
検出：２８０nm，０．２ＡＵＦＳ
得られた活性画分を、Ultrafree-15（商品名「Biomax-50」,MILLIPORE社製）で濃縮し、試料１mlを、予めリン酸緩衝液（商品名「ダルベッコＰＢＳ」、日水製薬社製）で平衡化したカラム（商品名「HiLoad 16/60 Superdex 200」,Pharmacia社製）にかけ、６０ml／時間の流速でゲル濾過を行い、１mlずつ分取し、活性画分を集め目的のタンパク質を精製した。尚、各精製段階での試料は15000rpmで１０分間遠心した後、０．４５μｍ孔の膜フィルターを通した。
ヒト白血病細胞（ＨＬ−６０）殺傷物質の精製：
各精製段階の白血病細胞殺傷活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、銀染色、及びＰＶＤＦ膜に転写後に白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体で免疫染色した。銀染色の結果を図１に、免疫染色の結果を図２にそれぞれ示す。図１のレーン６に示されるとおり、この方法で精製された白血病細胞殺傷物質は、約６２と６３キロダルトンの位置のみにバンドが見られた。６２と６３キロダルトンの位置のタンパク質は、免疫沈降で白血病細胞殺傷活性を完全に吸収できる３つの独立した単クローン抗体によって同じく認識された（図３）。更に、この白血病細胞殺傷活性を有する６２と６３キロダルトンの位置のバンドを別々に切り出し、各タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。その結果、６２キロダルトンのバンドは、
Glu His Leu Ala Asp Xaa Leu Glu Asp Lys Asp Tyr Asp Thr Leu Leu Gln Thr Leu Asp Asn Gly Leu Pro His Ileであり、
６３キロダルトンのバンドは、
Glu His Leu Ala Asp Xaa Leu Glu Asp Lys Asp Tyr Asp Thr Leu Leu Gln Thr Leu Aspであった。従って、６２と６３キロダルトンのタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は全く同じであり、この結果から、２つのタンパク質は同一遺伝子産物の可能性が考えられる。そこで、この白血病細胞殺傷物質は後述するようなアポトーシス活性を有することからアポトーシス誘導タンパク質（Apoptosis Inducing Protein, AIP）と命名した。
実施例２
ＡＩＰの単クローン抗体の調製
1）免疫：
実施例１で調製した精製ＡＩＰ１０μｇを当量の完全フロイントアジュバントと混合し、５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に注射した。２週間後、当量の抗原を当量の不完全フロイントアジュバントと混合し、腹腔内投与した。３週間後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した３０μｇの抗原を静脈内投与した。
2）融合：
最終免疫の３日後、マウスの脾細胞とミエローマＦＯＸ−ＮＹとをＰＥＧを用いて融合した。脾細胞とミエローマ細胞の比は５：１とした。選択培地にはＡＡＴ（７．５×１０-5Ｍ アデニン、８×１０-7Ｍ アミノプテリン、１．６×１０-5Ｍ チミジン）、インスリン（１０ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｌ）含有５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０を用いた。
3）ハイブリドーマのクローニング：
抗体産生ハイブリドーマの選択及びクローニングに免疫沈降法を用いた。この免疫沈降法は、ＡＩＰ（４０μｇ／ml）１μｌにハイブリドーマ培養上清２０μｌを加え、４℃、２．０時間インキュベーションした後、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭラビットＩｇｓを３μｇ加え、更に１．０時間インキュベーションした。次いで、反応溶液に１０％スタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aureus）菌体懸濁液（PANSORBIN Cells）５０μｌを加え、４℃、１．０時間インキュベーションした後、10000rpm、２分間遠心し、上清５μｌ、１０μｌ、２０μｌを取り、ＨＬ−６０ヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を調べた。
4）白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体の作製：
細胞融合８日目にて総数７６８ウェル中の精製ＡＩＰに対する抗体について酵素免疫測定法（ELISA）によりスクリーニングを行い、ELISA陽性の５６ウェルを選別した。細胞融合１０日目にELISA陽性の５６ウェルに対して、免疫沈降法とウエスタンブロット法により更に選別し、ELISA、免疫沈降法、ウエスタンブロット法の全ての方法で陽性である９ウェルを選択した。その中から抗体の産生の最も多い３ウェルに対し、３回の限定希釈法によるクローニングで独立した３つのクローンを得、各々Ｉ３８Ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5872）、Ｉ３２Ｄ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5873）及びＩ３１０Ｈ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5874）と命名した。サバ内臓抽出液に対するＩ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈのウエスタンブロットの結果を図３に示す。モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈの特定のクラスを、クラス特異的抗マウス抗体を使用して免疫染色法で決定した。その結果を表１に示す。モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０ＨはELISA、免疫沈降法、ウエスタンブロット法の全ての方法で使用可能な抗体であった。
実施例３
ＡＩＰのアポトーシス活性の測定
細胞は、急性前骨髄性白血病患者の抹消血から樹立された骨髄単球系細胞株ＨＬ−６０を用いた。培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（免疫生物研究所製 ＩＢＬ）に、１０％となるように牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを使用した。ＦＢＳは、予め５６℃、４５分間加熱し補体系を不活性化させたものを用いた。
まず、前記細胞溶液を管に移し、1000rpm、５分間遠心を行い、上清を除去し、１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を適当量加えて懸濁し、細胞数が５．０×１０5cells/mlになるように調節し、種々の濃度に調製した実施例１の精製ＡＩＰで処理した。
細胞死の測定は、Cell Titer 96商品名「Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit」（Promega社製）を用いて行った。
ＤＮＡ断片化の測定は次のように行った。まず、細胞懸濁液２５０μｌ（１．２５×１０5cells）に６２．５μｌの溶解緩衝液（２．０MNaCl、１０mM EDTA、５０mM Tris-HCl、pH８．０、１％SDS）と４μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、５６℃、９０分間溶解した。氷上で５分間静置後、８０μｌの５M ＮａＣｌを加え、更に氷上で５分間静置し、12000rpm、５分間遠心後、上清４００μｌを回収した。４μｌのＲＮａｓｅＡ（２０mg／ml）を加え、３７℃、６０分間処理し、ＲＮＡを分解した後、９００μｌの冷エタノールを加え、−２０℃で一晩静置した。その後、15000rpm、２０分間遠心後、沈澱物を１０μｌ ＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、pH７．５、１mM EDTA）に溶解し、２％アガロースゲル電気泳動で分析した。マーカーは、１２３ｂｐ ＤＮＡ ladder marker（LIFE TECHNOLOGIES）を用いた。
ＤＮＡ含量測定によるＤＮＡ分解検出は次のように行った。一定時間２０ng／mlのＡＩＰで処理することによりアポトーシスを誘発したＨＬ−６０細胞１×１０6個をＰＢＳ（−）で洗浄し、冷７０％エタノールを２００μｌ加え、４℃で一晩固定した。1500ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去後、エタノールを除くためＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞ペレットをＰＢＳ（−）０．１mlに浮遊させ、２．５μｌのＲＮａｓｅＡ（２０mg／ml）を加え、３７℃で２０分間処理しＲＮＡを分解した。その後、遠心で細胞を回収し、０．５mlの５０μｇ／mlヨウ化プロピジウム溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％ＮＰ−４０）を加え、４℃暗所で１０分間染色した。５０μｍのナイロンメッシュを通し、フローサイトメーターにより測定した。
蛍光染色によるクロマチン凝集の観察は、一定時間２０ng／mlのＡＩＰで処理することによりアポトーシスを誘発したＨＬ−６０細胞１×１０6個をＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞固定液（１％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ（−））を１００μｌ加え室温で３０分間静置して固定した。1500rpm、５分間遠心し、上清を除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞ペレットをＰＢＳ（−）２０μｌに浮遊させ、ＰＢＳ（−）含有４μｌの１mMヘキスト３３２５８を加えて混合した。スライドガラス上に細胞液を一滴落とし、カバーガラスを載せ蛍光顕微鏡下で観察した。
ヒト培養ガン細胞パネルによる制ガン効果の検定は次のように行った。ヒト培養ガン細胞３８系（肺ガン７系、胃ガン６系、大腸ガン６系、卵巣ガン５系、脳腫瘍６系、乳ガン５系、腎ガン２系、メラノーマ１系）及びマウスＰ３８８白血病細胞の合計３９系培養ガン細胞を、９６ウェルプレートにまき、翌日各濃度のＡＩＰを添加し、４８時間後に細胞増殖をスルホローダミンＢによる比色定量で測定した。
成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞及びヒトＴ細胞白血病ウイルス-１（HTLV-１）感染細胞の増殖に対するＡＩＰの影響は次のように検討した。
ＡＴＬ細胞３系（Maeda-V,Fukuda-V,Hara-V）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（HTLV-1）感染細胞２系（OYAJ-V, YAM-V）各１×１０5細胞に終濃度０、２、２２ng／mgになるようにＡＩＰを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で７時間培養後、０．５μＣｉの６−3Ｈチミジンを加え、更に５時間培養した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ＤＮＡに取り込まれた６−3Ｈチミジンの量を液体シンチレーションカウンターで測定した。
1）白血病細胞殺傷物質のもつアポトーシス活性：
精製白血病細胞殺傷物質のヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対する殺傷活性を、ＭＴＳアッセイで測定した。濃度と処理１６時間後の生細胞の割合との相関関係を図４に示す。約５ng／mlの濃度で５×１０5cells／mlの約５０％にあたる細胞を殺したことから、非常に強い白血病細胞殺傷活性を有していることが判った。２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質で処理した際の生細胞の割合を経時的に解析した結果を図５に示す。この結果、約４時間で約５０％にあたる細胞死を引き起こしていることが判った。この２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質で処理した際のＤＮＡ断片化を経時的に解析した結果を図６に示す。処理約２時間後からアポトーシスに特異的にヌクレオソーム単位のＤＮＡの断片化が見られた。通常、アポトーシスによる細胞死ではアポトーシス特異的ＤＮＡ断片化、即ち、クロマチンＤＮＡのヌクレオソーム単位での切断が見られることが知られている。
このアポトーシスに伴うＤＮＡ断片化はフローサイトメトリーでも測定することができ、アポトーシス細胞では、Ｇ１期細胞よりＤＮＡ含量の低い細胞として検出される。２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質の処理０、２時間後、４時間後及び１２時間後の細胞中のＤＮＡの含有量をフローサイトメトリーで解析した結果をそれぞれ図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。この結果、時間の経過と共にＤＮＡの含有量の低下したアポトーシス細胞の増加が認められた。
また、顕微鏡観察により、その形態的特徴からアポトーシスを検出する直接的方法もある。そこで、顕微鏡観察により、０、２時間後、４時間後及び１２時間後の２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核の変化を観察した。その顕微鏡写真をそれぞれ図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。アポトーシスを起こした細胞の核ではクロマチンの凝縮、核濃縮等が見られる。更に、図８で示す０、２時間後、４時間後及び１２時間後の２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核をそれぞれヘキスト３３２５８で蛍光染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果をそれぞれ図９（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。この結果、白血病細胞殺傷物質で処理したアポトーシスに特異的なクロマチン凝縮や核の断片化像が検出された。
以上の結果から、白血病細胞殺傷処理物質により処理して起こる細胞死はアポトーシスであると断定された。
2）ヒトガン細胞に対するＡＩＰの増殖阻害活性：
４３種類のヒトガン細胞の増殖に対するＡＩＰの影響をスルホローダミンＢによる比色定量又は６−3Ｈチミジンの取り込みで測定した。その結果を表２に示す。ＡＩＰは、検討した細胞の増殖を抑制した。
実施例４
1)サバ内臓からの全ＲＮＡ調製
全ＲＮＡ調製はＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法（Anal.Biochem.162,p156-159）に従って行った。
サバ内臓を、フェノールとチオシアン酸グアニジンとからなる溶液ISOGEN（株式会社ニッポンジーン製）５ml中でポリトロンホモゲナイザーにて均質化して溶解させた。得られた均質物に１mlのクロロホルムを加え、内容物を完全に混合し、氷上で１５分間放置した。４℃、5000ｇで３０分間遠心し、上層（水層）を回収した。この溶液に等容量のフェノール及びクロロホルムを加えて水層を抽出した後、回収水層と同量のイソプロピルアルコールを加え、室温で１０分間放置した。４℃、5000ｇで３０分間遠心し、ＲＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄後、ＲＮＡのペレットを溶出用緩衝液（１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA）１mlに溶解し、１mgの全ＲＮＡを得た。
2)ｍＲＮＡの精製
得られた全ＲＮＡを６５℃、５分間処理し、急冷した。不溶物は遠心分離して除去し、３M NaCl溶液を０．２ml加え、塩濃度が０．５Mとなるように調整した。ＲＮＡ溶液をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Pharmacia社製）に載せ、素通り分画をもう１度カラムに載せた。１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA，０．５M NaCl溶液（数カラム量）と１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA，０．１M NaCl溶液（数カラム量）とで洗浄し、吸着したポリ（Ａ）を有するＲＮＡを溶出用緩衝液で溶出した。得られたＲＮＡを再度上記の操作を繰り返し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．１）、２容量のエタノールを加え、−２０℃で沈澱させ、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約３５μｇを得た。
3)ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製
得られたポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ３μｇを蒸留水で７μｌとし、Not １ primer-adapter（０．５μｇ／ml，LIFE TECHNOLOGIES）２μｌを加え、７０℃、１０分間処理した後、急冷した。得られた溶液にＲＮＡｓｅ阻害剤（40unit/μl,Stratagene社製）１μｌ、２５０mM Tri-HCl,pH８．３，３７５mM KCl及び１５mM MgCl2からなる緩衝液４μｌ、ＤＴＴ １μｌ、１０mM ｄＮＴＰ混合液１μｌ、リバーストランスクリプターゼ（200units／μｌ、LIFE TECHNOLOGIES）を加え、良く混合し、３７℃で１時間反応させた。反応後、蒸留水９１μｌ、１００mM Tris-HCl，pH６．９，４５０mM KCl，２３mM MgCl2，０．７５mM β-NAD＋、５０mM（NH4）2SO4からなる緩衝液３０μｌ、１０mM ｄＮＴＰ混合液３μｌ、E.coli ＤＮＡリガーゼ（１０units／μｌ）１μｌ、E.coli ＤＮＡポリメラーゼ（１０units／μｌ）４μｌ、E.coli ＲＮａｓｅＨ（２units／μｌ）１μｌを加え、良く混合して１６℃で２時間反応させた。その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（５units／μｌ）２μｌを加え更に５分間反応させた。０．５M EDTA １０μｌを加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出を行い、７．５M酢酸アンモニウム０．５容量を加え、更に全容量の２倍量のエタノールを加えて14000gで２０分間遠心し、分離されたペレットを７０％エタノールで軽くすすいだ。乾燥後、２５μｌの蒸留水に溶解し、２５０mM Tri-HCl,pH７．６，５０mM MgCl2，５mM ATP，５mM DTT，２５％（w／v）ＰＥＧ8000からなる緩衝液１０μｌ、Sal １ adapter（１μｇ／μｌ）１０μｌ、T4DNAリガーゼ（１units／μｌ）５μｌを加え、１６℃で２４時間反応させた。フェノール−クロロホルム（１：１）抽出を行い、エタノール沈澱させた。４１μｌの蒸留水に溶解し、１０mM Tri-HCl,pH７．５，７mM MgCl2，１５０mM NaCl，７mM ２−メルカプトエタノール，０，０１％TritonX-100からなる緩衝液５μｌ、NotI（１５units／μｌ）４μｌを加え、３７℃で２時間反応させた。フェノール−クロロホルム（１：１）抽出を行い、エタノール沈澱させた。ＤＮＡペレットを１０mM Tri-HCl,pH７．５，０．１mM EDTA，２５mM NaClからなる緩衝液１００μｌに溶解し、同じ緩衝液で平衡化したSephacryl S-500カラム（１ml,LIFE TECHNOLOGIES）でゲル濾過を行い、必要な大きさのｃＤＮＡを含む分画を選択した。
作製したｃＤＮＡ１５ngとNot I-Sal Iとで処理したpSPORT １プラスミドベクター（LIFE TECHNOLOGIES）５０ngの混合液を蒸留水で１５μｌとし、２５０mM Tri-HCl,pH７．６，５０mM MgCl2，５mM ATP，５mM DTT，２５％（w／v）ＰＥＧ8000からなる緩衝液４μｌ、T4DNAリガーゼ（１units／μｌ）１μｌを加え、２２℃で４時間反応させ、ベクターにｃＤＮＡを組み込み、yeast ｔＲＮＡ（１μｇ／μｌ）５μｌ、７．５M NH4OAc１２．５μｌ、冷エタノール７０μｌを加え、エタノール沈澱させ、５μｌの蒸留水に溶解した。得られたベクターｃＤＮＡをエレクトロポレーション用大腸菌（Electro MAX DH10B Cell）にバイオラット社製のエレクトロポレーションシステムを用いて導入（１．８kV，２５mF，２００Ω）し、２３０万トランスフォマントからなるｃＤＮＡライブラリーを得た。
4)RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）によるＡＩＰ遺伝子の増幅
ＡＩＰのＮ−末端アミノ酸配列（ＥＨＬＡＤＸＬＥＤＫＤＹＤＴＬＬＱＴＬＤＮＧＬＰＨＩ）のＥＤＫＤＹＤＴに対応するセンス・プライマーNo.１と内部アミノ酸配列（ＭＩＹＤＱＡＤＶ）のＭＩＹＤＱＡＤに対応するアンチセンス・プライマーNo.２をそれぞれ化学合成し、ＡＩＰ遺伝子の増幅用プライマーとして用いた。前記得られた全ＲＮＡ ５μｇに、oligo（dT）12-18（０．５ng／μｌ）１μｌを加えて７５℃、１０分間保温した後、氷中で急冷した。次に２０mM Tris-HCl（pH８．４）、５０mM KCl、２．５mM MgCl2、０．５mMの各dNTP、１０mM DTT、２０units ＲＮＡｓｅ阻害剤、２００unitsリバーストランスクリプターゼを含有する溶液中で４２℃、１時間のｃＤＮＡ合成反応を行い、７０℃、１０分間加熱して反応を停止させ、２units E.colo ＲＮａｓｅ Ｈを加えて３７℃、２０分間処理し、残ったＲＮＡを分解させた。得られたｃＤＮＡの１／１０量、２種類のプライマーNo.１及びNo.２を各１００pmole、２０mM Tris-HCl（pH８．４）、５０mM KCl、１．５mM MgCl2、０．２mM各ｄＮＴＰ、１０mM ＤＴＴ、２．５units Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液中で９４℃、１分間、５６℃、１分間、７２℃、１分間の反応を３５回繰り返してＰＣＲを行った。このサイクル終了後に７２℃で８分間反応させ、ＰＣＲ産物３’末端にポリ（Ａ）を取り込ませるようにした。
5)ＰＣＲ産物のクローニングとその塩基配列の決定：
得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動により約６５０ｂｐの大きさであることが判った。上記ＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡリガーゼとＡＴＰによりプラスミドベクターｐＣＲIIに挿入し、その塩基配列をPERKIN ELMER社製のキット（ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit）の指示書に従ってジオキシヌクレオチドを蛍光標識したダイターミネーター法によって決定した。その結果、塩基配列から予測されるアミノ酸配列はＡＩＰの部分アミノ酸配列の決定から得られた配列を含んでいることが判り、pCRaip001と命名した。
6)プローブの標識：
得られたpCRaip001を制限酵素Eco RIで切断し、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離した後、約６５０ｂｐのインサートＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。回収ＤＮＡ断片６０ｎｇをテンプレートにし、ランダムプライム法を用いてPharmacia社製のキット（Ready To Go DNA Labelling Kit）の指示書に従って、［α-32Ｐ］dCTPで標識した。
7)pSPORT １ cDNAライブラリーから全長AIP遺伝子のスクリーニング
作製したpSPORT １ ｃＤＮＡライブラリーより、得られたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961,1975）でスクリーニングした。まず、アンピシリンを含む１５cm ＬＢ／agerプレートに約20000個のコロニーができるように前記で得たトランスフォマント約100万個をまき、約１２時間、３７℃で培養した。コロニーができたプレート上にナイロンフィルター（Amersham社製）を空気が入らないように静置し、約１分間後フィルターを剥がし、乾燥させた。フィルターを、コロニーが付いた面を上にして、１０％SDSを染み込ませた濾紙と、０．５M NaOH及び１．５M NaClを染み込ませた濾紙と、０．５M Tris-HCl，pH７．５，１．５M NaClの溶液を染み込ませた濾紙との上に各３分間順次静置させた後、２×ＳＳＣで良く洗浄し、乾燥させ、ＵＶトランスイルミネーターを用いてフィルター上にＤＮＡを固定させた。フィルターを５×ＳＳＣに浸した後、６×ＳＳＣ、５×Denhardt液、０．５％ＳＤＳ溶液（ハイブリダイゼーション溶液）中で６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダイゼーション液を捨て、予め６５℃に加温しておいたハイブリダイゼーション溶液に1000000cpm／mlになるように上記で得られた標識ＤＮＡ（１００℃で５分間加熱し、急冷したもの）を添加したものを注ぎ込み、６５℃で２０時間ゆっくり振盪させながらハイブリダイゼーションを行った。１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で１０分間、３回洗浄し、更に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で２０分間、３回の洗浄を６５℃で行った。自然乾燥後、−８０℃で一晩オートラジオグラフィーを行い、標識したプローブに強く会合した２７のコロニーを選択した。これらのプラスミドＤＮＡについて、上記で得たＰＣＲにより約６５０ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。これらのプラスミドは、pSAIP １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６及び２７と命名したが、いずれもＡＩＰのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することからＡＩＰ ｃＤＮＡを含んでいると考えられる。これらのうち、略完全長を有すると思われるpSAIP ２２について、その翻訳領域の全塩基配列をジデオキシヌクレオチドを蛍光標識したダイターミネーター法によって決定した。その塩基配列を配列表の配列番号２に、その塩基配列より予測されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
このｃＤＮＡ配列と予想されるアミノ酸配列は、ＡＩＰの部分アミノ配列の決定から得られた配列及びpCRaip001のインサートを全て含んでいることが判り、このｃＤＮＡはＡＩＰをコードしていることを確認した。成熟ＡＩＰのＮ−末端アミノ酸との比較から、塩基数１−９０がシグナルペプチドを、９１−１５７５がＡＩＰの成熟ペプチドをコードすると考えられる。このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの予想分子量は58668ダルトン（シグナルペプチドと予測される部分を除くと55243ダルトンとなる）であり、サバ内臓より精製されたＡＩＰの分子量より約7500ダルトン低かった。ＡＩＰはCon Aカラムに強く吸着される糖タンパク質であり、糖鎖部分が約7500ダルトン占めていると考えられる。
実施例５
実施例１において調製した精製ＡＩＰを、Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｄ−リジンと混合反応させることによって、過酸化水素が発生するか否かを発色試薬（ペルオキシダーゼ及びｏ−フェニレンジアミン）で測定した。その結果、精製ＡＩＰは、Ｌ−リジンを酸化して約２８００μＭの過酸化水素を生成した。一方、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｄ−リジンを混合した場合には、過酸化水素の発生は１０数μＭ程度であった。また、精製ＡＩＰは、リジンの他に、ロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン等を基質とし、過酸化水素を生成する。従って、精製ＡＩＰは、酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成するものと考えられる。
次に、前記酸化反応による過酸化水素の生成反応と、精製ＡＩＰの癌細胞アポトーシス活性との関係を調べるために、過酸化水素の分解反応を触媒するカタラーゼを添加したものとしないものとで精製ＡＩＰの癌細胞アポトーシス活性がどのようになるかを測定した。測定は、カタラーゼを添加する以外は、実施例３で行った精製白血病細胞（ヒト白血病細胞ＨＬ−６０）殺傷物質のもつアポトーシス活性を測定する方法と同様に行い、１６時間後の死細胞の割合を測定した。その結果、精製ＡＩＰに加えてカタラーゼを添加した場合の細胞死の割合は、精製ＡＩＰ単独添加の場合の死細胞の割合を１００％とした場合、１８％であった。
従って、精製ＡＩＰが癌細胞アポトーシス活性を示す一因として、前記酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成する反応が関与していると考えられる。
そこで、精製ＡＩＰをモチーフ解析して、フラボタンパク質が可視光吸収スペクトルに対して示す典型的な変化と同様な変化を示すドメインを探索したところ、配列表の配列番号１のアミノ酸配列において、６１−８９番目のアミノ酸配列がフラビン結合ドメインであることが判った。従って、酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成する反応に必要なアミノ酸配列の１つは、前記６１−８９番目のアミノ酸配列であることが判った。
次に、配列表の配列番号２に示される塩基配列のＡＩＰ遺伝子を、ＰＣＲ法により変異させ、その変異遺伝子を動物細胞発現用ベクター（ｐＭＥ１８Ｓ）に組み込んで得られたプラスミドをサル腎由来細胞株ｃｏｓ−７に導入し、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列１−５１４番及び１−４９６番の変異ＡＩＰを作製した。これらの変異ＡＩＰ及び実施例１で得られた精製ＡＩＰについて、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を測定した。その結果を図１０に示す。また、これらのＡＩＰ及び変異ＡＩＰのヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を実施例３と同様に測定したところ、アミノ酸配列１−５２４番から成る全長ＡＩＰ及びアミノ酸配列１−５１４番から成る変異ＡＩＰは癌細胞に対するアポトーシス活性を示したが、アミノ酸配列１−４９６番から成る変性ＡＩＰは癌細胞に対するアポトーシス活性を示さなかった。
従って、アミノ酸配列４９７−５１４番までの部位も、本発明のＡＩＰの機能維持に必要であることが判る。
実施例６
実施例１で調製した精製ＡＩＰの起源を探索するために、用いたマサバの内臓を分析したところ、寄生虫に感染していることが判った。そこで、寄生虫に感染しているマサバ５体と寄生虫に感染していないマサバ５体とから、それぞれ実施例１と同様に内臓抽出物を精製した。得られた各内臓抽出物に対して、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を行った。結果を図１１に示す。図１１において、レーン１−５は寄生虫に感染した５体のマサバ内臓抽出物の結果であり、レーン６−１０は寄生虫に感染していない５体のマサバ内臓抽出物の結果である。また、これらの内臓抽出物についてヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を実施例３と同様に測定した。その結果を表３に示す。表３において、試料番号１−５は寄生虫に感染した５体のマサバ内臓抽出物の結果であり、試料番号６−１０は寄生虫に感染していない５体のマサバ内臓抽出物の結果である。また、比活性は、試料番号５の内臓抽出物のヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性の強さを１にした時の相対活性の値を示す。
図１１及び表３の結果から、寄生虫に感染したマサバの内臓抽出物には本発明のＡＩＰが認められ、且つそれらには癌細胞アポトーシス活性が見られた。一方、寄生虫に感染していないマサバ内臓抽出物には以上の活性は見られなかった。従って、ＡＩＰの発現はヤサバから寄生虫感染により誘導されることが判った。
以上の点より、寄生虫感染のようにヘルパＴ２細胞（Ｔｈ２細胞）の活性化を伴う刺激によりマサバからＡＩＰが誘導され、同じような機構により哺乳類からでもＡＩＰに対して配列相同性若しくは細胞死誘発活性を有するタンパク質が誘導されうると判断できる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：５２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列番号：２
配列の長さ：１５７５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
配列
本発明は、細胞に対してアポトーシス（apoptosis）を誘導させ、ガン細胞等の細胞死を誘発させるか、ガン細胞増殖抑制活性を示す新規なタンパク質、その遺伝子、そのモノクローナル抗体、ガン細胞アポトーシス認定用試薬及び抗ガン剤に関する。
従来技術
腫瘍性疾患は、化学療法の著しい進歩で生存率及び治療率が向上している。しかし、一方で抗ガン剤の強力な副作用により正常細胞に大きなダメージを与えることが社会問題化している。抗ガン剤の副作用を防止するには、優れたガン細胞選択性を有する薬剤又は腫瘍細胞の増殖をコントロールできる薬剤が要求される。
従来よりガンの化学療法では、治療投与量でも有害作用が発生しうるので、できるだけ投薬量を抑える方法が採られている。そのため複数の機序の異なる抗ガン剤の併用による相乗作用を期待したり、抗ガン剤と他の物質との併用によって抗ガン剤の作用を増強させる試みが行われている。後者では、抗ガン剤と免疫賦活剤との組合わせが一般化しており、腫瘍細胞への直接的な効果と、生体の免疫能を活性化することによる抗腫瘍効果の併用によって、抗腫瘍効果を増強させる。また、対象とする症例によっては、治療効果を上げるため、これらの方法と、放射線療法や外科的療法の組合わせによって効果を上げる努力が行われている。
近年、細胞死には２つの種類の死、即ち、アポトーシス（apoptosis，遺伝子に支配された細胞死）及びネクローシス（necrosis，遺伝子に支配を受けない細胞死）があることが知られるようになっている。アポトーシスとネクローシスとは、生化学的測定法としてＤＮＡが断片となる様子を観察することにより見分ける方法が良く用いられている。この測定法によると、従来の抗ガン剤は、腫瘍細胞に対してネクローシスを引き起こして抗ガン作用を発揮するものがほとんどであり、遺伝子的に腫瘍細胞の死をコントロールすることはできない。一方、腫瘍細胞にアポトーシスを起こす物質は、腫瘍細胞の死をコントロールできる可能性があることから盛んに研究が行われている。また、アポトーシスを誘導する抗ガン剤は、作用機序の異なる従来の抗ガン剤との併用によって抗腫瘍効果をより増強させることが期待できる。
発明の開示
本発明の目的は、細胞、特に、ヒトガン細胞に対してアポトーシスを誘導させ、細胞に細胞死を誘発させる活性若しくはガン細胞増殖抑制活性を示す新規なタンパク質、その断片、その遺伝子及びそのモノクローナル抗体を提供することにある。
本発明の別の目的は、in vitroにおいて、細胞、特にガン細胞に対してアポトーシスを誘導させ、細胞の細胞死を誘発するメカニズムを研究するためのアポトーシス誘導用試薬を提供することにある。
本発明の他の目的は、特に、ヒトガン細胞に対して細胞増殖抑制作用又はガン細胞死を誘発する作用を示す抗ガン剤を提供することにある。
本発明者は、従来から知られるアポトーシスによる細胞死をガン治療に役立てるため、ガン細胞に対してアポトーシスを誘発するペプチド又はタンパク質を鋭意研究した結果、サバ内臓より精製したタンパク質に、血液ガン細胞のみならず、腫瘍ガン細胞の種々の細胞に対してもアポトーシス誘発活性を示すものがあることを見い出し、このｍＲＮＡを単離し、これを出発材料としてｃＤＮＡを得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明によれば、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すタンパク質が提供される。
また本発明によれば、前記タンパク質をコードする配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子が提供される。
更に本発明によれば、前記タンパク質のモノクローナル抗体が提供される。
更にまた本発明によれば、前記タンパク質を含むアポトーシス誘導用試薬が提供される。
更に本発明によれば、前記タンパク質を有効成分として含む抗ガン剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１で調製した白血病細胞殺傷活性画分（レーン１はサバ内臓抽出物、レーン２は硫安沈澱画分、レーン３はゲル濾過活性画分、レーン４はＣｏｎ Ａカラム吸着画分、レーン５はＭｏｎｏ Ｑ吸着画分、レーン６は最終精製ＡＩＰ（アポトーシス誘導タンパク質）をそれぞれ示す）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、銀染色した結果を示す写真である。
図２は、実施例１で調製した白血病細胞殺傷活性画分（レーン１はサバ内臓抽出物、レーン２は硫安沈澱画分、レーン３はゲル濾過活性画分、レーン４はＣｏｎ Ａカラム吸着画分、レーン５はＭｏｎｏ Ｑ吸着画分、レーン６は最終精製ＡＩＰをそれぞれ示す）を、ＰＶＤＦ膜に転写後に白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体で免疫染色した結果を示す写真である。
図３は、実施例２で調製した各モノクローナル抗体（Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈ）の実施例１で調製したサバ内臓抽出液に対するウエスタンブロット解析の結果を示す写真であり、レーン１はモノクローナル抗体Ｉ３８Ａによる免疫染色、レーン２はモノクローナル抗体Ｉ３２Ｄによる免疫染色、レーン３はモノクローナル抗体Ｉ３１０Ｈによる免疫染色をそれぞれ示す。
図４は、実施例３で行った精製白血病細胞殺傷物質のヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対する殺傷活性を、ＭＴＳアッセイで測定した際の濃度と処理１６時間後の生細胞の割合との相関関係を示すグラフである。
図５は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質で処理した際の生細胞の割合を経時的に解析した結果を示すグラフである。
図６は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質で処理した際のＤＮＡ断片化を経時的に解析した結果を示す写真であり、各レーンの上に示された数字は経過時間を、Ｍは１２３ｂｐ分子量マーカーをそれぞれ示す。
図７は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質の処理０時間後（図７（Ａ））、２時間後（図７（Ｂ））、４時間後（図７（Ｃ））、１２時間後（図７（Ｄ））のそれぞれの細胞中のＤＮＡの含有量をフローサイトメトリーで解析した結果を示すグラフである。それぞれのグラフにおいて、縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。
図８は、実施例３で行った白血病細胞殺傷物質処理細胞の変化を顕微鏡で観察した結果を示す写真であって、（Ａ）は処理０時間後の結果、（Ｂ）は処理２時間後の結果、（Ｃ）は処理４時間後の結果、（Ｄ）は処理１２時間後の結果をそれぞれ示す。
図９は、図８に示す各処理時間経過後の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核をヘキスト３３２５８で蛍光染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す写真であって、（Ａ）は処理０時間後の結果、（Ｂ）は処理２時間後の結果、（Ｃ）は処理４時間後の結果、（Ｄ）は処理１２時間後の結果をそれぞれ示す。
図１０は、ＡＩＰ遺伝子及びその変異遺伝子をサル腎由来細胞株ｃｏｓ−７に導入し、各種の変異ＡＩＰを得、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析と同様な測定を行った、実施例５の結果を示す写真である。レーン１は配列番号１におけるアミノ酸配列１−５２４番からなる全長ＡＩＰ、レーン２はアミノ酸配列１−４９６番からなる変異ＡＩＰ、レーン３はアミノ酸配列１−５１４番からなる変異ＡＩＰの結果をそれぞれ示す。
図１１は、寄生虫に感染したサバの内臓抽出物（レーン１−５）と非感染サバの内臓抽出物（レーン６−１０）に対する、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を行った実施例６の結果を示す写真である。
発明の説明
本発明のタンパク質及びその断片は、▲１▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列又は、▲２▼該配列と少なくとも部分的に相同若しくは類似したアミノ酸配列を含み、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すか、▲３▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と配列相同性を有し、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すか、▲４▼配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列のうちの６１−８９番目のアミノ酸配列と、４９７−５１４番目のアミノ酸配列とを有し、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものである。
本発明において、前記▲２▼の配列番号１のアミノ酸配列に相同したとは、好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を示すものである。アミノ酸配列に類似の配列とは、該アミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列であって、そのタンパク質が配列番号１のタンパク質と同様なガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものを意味する。このようなアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸が置換している場合、少なくとも１つの新たなアミノ酸が挿入されている場合、少なくとも１つのアミノ酸が欠損している場合がある。
前記▲３▼の配列番号１のアミノ酸配列と配列相同性を有するとは、配列番号１のアミノ酸配列と由来動物の種が異なることによるアミノ酸配列の相違が認められのみで、ガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すものを意味する。
本発明のタンパク質及びその断片は、タンパク質又はアミノ酸のε−アミノ基、若しくはアミン化合物又はアミノ酸のアミノ基を基質として、以下に示す酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒し、過酸化水素を生成させることができるものと考えられる。
Ｒ−ＣＨ2ＮＨ2＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2＝Ｒ−ＣＨＯ＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2
また、本発明のタンパク質及びその断片は、ガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示す一因として、補酵素としてのフラビンを必要とするものと考えられる。このため、配列番号１のアミノ酸配列において、可視吸収スペクトルに対するフラボタンパク質がもつ典型的な変化と同様な変化を示す配列番号１のアミノ酸配列のうちの６１−８９番目のアミノ酸配列を有することが好ましく、また、細胞死誘発活性を示すために必須であると考えられる配列番号１のアミノ酸配列のうちの４９７−５１４番目のアミノ酸配列を有することが好ましい。
本発明のタンパク質及びその断片において、細胞死誘発活性を示すとは、アポトーシスを示すことであり、これは、生化学的測定法としてＤＮＡの断片化、即ち、クロマチンＤＮＡのヌクレオソーム単位での切断を観察する方法、アポトーシスに伴うＤＮＡ断片化をフローサイトメトリーで測定する方法、顕微鏡観察により、その形態的特徴からアポトーシスを検出する直接的方法等により確認することができる。この細胞としては、ガン細胞、例えば、肺ガン、胃ガン、大腸ガン、卵巣ガン、脳腫瘍、乳ガン、腎ガン、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）感染細胞等を挙げることができる。
このような相同又は類似のアミノ酸配列を含むタンパク質及びその断片は、通常の組換え技術等の公知の方法により容易に製造することができる。
本発明のタンパク質及びその断片は、タンパク質の他の構造的特徴は特に限定されない。例えば糖鎖等により修飾されていても良い。
本発明のタンパク質及びその断片の起源は特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で示すタンパク質は、寄生虫に感染したサバの内臓抽出物から単離したものである。即ち、サバ（学名：Scomber japonicus, 一般名：Chub mackerel）由来のものが挙げられる。しかし、後述の実施例で示すようにこのタンパク質は、寄生虫非感染サバの内臓抽出物からは得られなかった。従って、寄生虫感染のようにヘルパＴ2細胞（Ｔｈ2細胞）の活性化を伴う刺激によりサバから誘導されると同様に、同じ機構により哺乳動物からでも本発明のタンパク質及びその断片と同様なタンパク質又は配列相同性のあるタンパク質及びその断片を得ることができる。故に、本発明のタンパク質及びその断片の起源はサバに限定されるものではなく、ヒト、マウス、ラット等の哺乳動物由来であっても良い。このような哺乳動物由来のタンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、種の相違に基づく配列相同性を示すアミノ酸配列のタンパク質である。
配列番号１で示すタンパク質に対して配列相同性を有するタンパク質を調製するには、例えば、哺乳動物の遺伝子ライブラリーから配列番号２で示すＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション法により得られた遺伝子より、通常の組換え技術等に基づいて容易に得ることができる。
本発明の遺伝子（ＤＮＡ）は、前記タンパク質又はその断片をコードする遺伝子及び該遺伝子のうち、配列表の配列番号２に示される塩基配列及び該配列と少なくとも部分的に相同若しくは類似した塩基配列を含む遺伝子である。ここで、類似した塩基配列とは、この塩基配列のうち、少なくとも１つのコドンが置換している場合、少なくとも１つの新規なコドンが挿入されている場合、少なくとも１つのコドンが欠損している場合であって、前記タンパク質のアミノ酸をコードするものである。
このような遺伝子は、公知の方法、例えばｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを作製して単離したり、ゲノムＤＮＡから単離することもできる他、化学的に合成することもできる。
本発明のモノクローナル抗体は、通常の方法、例えば前記タンパク質又はその断片を抗原として、ハイブリドーマの技術を利用して製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5872、寄託日1997,3,13）、モノクローナル抗体Ｉ３２Ｄ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5873、寄託日1997,3,13）又はモノクローナル抗体Ｉ３１０Ｈ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5874、寄託日1997,3,13）等が挙げられる。
本発明のタンパク質及びその断片は、前記遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、該発現ベクターで形質転換又は形質導入した宿主細胞を増殖させ、細胞内又は細胞外に分泌させることにより得ることができる。この際、使用できる発現ベクターとしては、プラスミド、ウイルス等の他に本発明の遺伝子を組み込むことが可能であり、発現しようとする宿主細胞で該遺伝子を安定に存在させることができるＤＮＡ断片等を挙げることができる。発現ベクターは、転写プロモーター、転写を制御するエンハンサー、オペレーター配列、適切なリボソーム結合配列、転写および翻訳を制御する配列、ベクターＤＮＡの複製を行うための配列等が必要である。また、細胞外へ分泌させる場合には分泌シグナル配列が必要となる。
前記宿主細胞は、細菌である大腸菌、酵母等が有用であり、またアフリカミドリザルの線維芽細胞由来のＣＯＳ７細胞等が挙げられる。これらは市販品を用いることができる。
本発明のアポトーシス誘導用試薬は、前述の本発明のタンパク質、その断片及び前記本発明のモノクローナル抗体からなる群より選択される少なくとも１種を含んでおれば良い。この試薬を使用して、腫瘍細胞等の細胞にアポトーシスを誘導させることができ、アポトーシスを起こした細胞の細胞形態、細胞遺伝子及び細胞内シグナル伝達機構の解明を研究するキットとして使用できる。
本発明の抗ガン剤は、前述の本発明のタンパク質及び／又はその断片を有効成分として含み、必要により更に前述の本発明のモノクローナル抗体を含む。投与方法としては、経口、注射等により行うことができる。製剤は、散在、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、乳化剤、懸濁剤等の種々の形態とすることができる。また、本発明の抗ガン剤には、通常薬学的、製剤学的に許容できる添加剤を含んでいても良い。適当な投与量は、ガンの種類等によっても異なるが、患者の体重１ｋｇあたり、有効成分を約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で投与するのが好ましい。
本発明のタンパク質及びその断片は、細胞、特にヒトガン細胞に対してアポトーシス等を誘導させ、ガン細胞に細胞死を誘発させる活性若しくはガン細胞増殖抑制活性等を示す新規なものであり、且つサバ等の食用魚類にも含有されるので、ガン抑制等の機能性食品、抗ガン剤、アポトーシス誘導用試薬等に有用である。また、本発明のモノクローナル抗体は、抗ガン剤、アポトーシス誘導用試薬等に有用である。
本発明の遺伝子は、前記本発明のタンパク質及びその断片をコードするものであるので、これらの大量製造に利用できる。
本発明のアポトーシス誘導用試薬は、細胞に対してアポトーシスを誘導させるので、そのアポトーシスを起こした細胞の細胞形態、細胞遺伝子及び細胞内シグナル伝達機構の解明を行うことができる。
本発明の抗ガン剤は、ガン細胞に対してアポトーシスを起こさせるので、ガン細胞の死をコントロールして抗ガン作用を得ることができると共に、他の細胞に対する副作用を極めて抑制することができる。
実施例
以下、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
マサバから内臓を摘出し、冷水を重量比で等量加えてホモジナイズした。次いで、冷却遠心分離機で、３０分間、15000ｇで遠心して油分と沈澱物を除去した。得られた精澄液を凍結乾燥してサバ内臓乾燥粉末とした。調製したサバ内臓乾燥粉末を10mg／mlの濃度となるように蒸留水に溶解し、氷上で十分冷却した後、硫酸アンモニウム５５重量％飽和状態とした。次いで、15000rpmで３０分間遠心分離を行って沈澱物を除去し、上清を硫酸アンモニウム９５重量％飽和状態とし、更に、前記条件で遠心分離を行って沈澱物を分離した。得られた沈澱物に少量のトリス緩衝液（２０mM Tri-HCl,pH７．５，０．３M NaCl）を加えて沈澱物を溶解させ飽和画分を得た。
得られた飽和画分の試料５mlを、予めトリス緩衝液で平衡化したカラム（商品名「HiLoad 16/60 Superdex 200」,Pharmacia社製）にかけ、６０ml／時間の流速でゲル濾過を行い、２．５mlずつ分取し、活性画分を収集した。得られた活性画分を、予めトリス緩衝液により平衡化したカラム（Con A-Sepharoseカラム,Pharmacia社製）にかけ、トリス緩衝液で２８０nmの吸収がなくなるまで洗浄した。
０．５M濃度メチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含むトリス緩衝液で溶出される活性画分を集め、ビス−トリス緩衝液（２０mM bis-Tri-HCl,pH６．４，１００mM NaCl）で透析し、Ultrafree-15（商品名「Biomax-50」,MILLIPORE社製）で濃縮した。得られた濃縮液を、予めビス−トリス緩衝液で平衡化したカラム（商品名「Mono Q 5/5カラム」,Pharmacia社製）に供し、ビス−トリス緩衝液で２８０nmの吸収がなくなるまで洗浄後、結合画分をＮａＣｌの濃度勾配により以下の条件で溶出させた。目的のペプチド（タンパク質）を含む画分の溶出は３００mM前後に溶出した。
条件
緩衝液Ａ：20mMビス−トリス緩衝液,100mM NaCl,pH6.4
緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ中に1M NaCl
グラジエント：０％Ｂ５分間，０〜５０％Ｂ２０分間，５０％Ｂ２分間，５０〜１００％５分間
流速：１．０ml／分
検出：２８０nm，０．２ＡＵＦＳ
得られた活性画分を、Ultrafree-15（商品名「Biomax-50」,MILLIPORE社製）で濃縮し、試料１mlを、予めリン酸緩衝液（商品名「ダルベッコＰＢＳ」、日水製薬社製）で平衡化したカラム（商品名「HiLoad 16/60 Superdex 200」,Pharmacia社製）にかけ、６０ml／時間の流速でゲル濾過を行い、１mlずつ分取し、活性画分を集め目的のタンパク質を精製した。尚、各精製段階での試料は15000rpmで１０分間遠心した後、０．４５μｍ孔の膜フィルターを通した。
ヒト白血病細胞（ＨＬ−６０）殺傷物質の精製：
各精製段階の白血病細胞殺傷活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、銀染色、及びＰＶＤＦ膜に転写後に白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体で免疫染色した。銀染色の結果を図１に、免疫染色の結果を図２にそれぞれ示す。図１のレーン６に示されるとおり、この方法で精製された白血病細胞殺傷物質は、約６２と６３キロダルトンの位置のみにバンドが見られた。６２と６３キロダルトンの位置のタンパク質は、免疫沈降で白血病細胞殺傷活性を完全に吸収できる３つの独立した単クローン抗体によって同じく認識された（図３）。更に、この白血病細胞殺傷活性を有する６２と６３キロダルトンの位置のバンドを別々に切り出し、各タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。その結果、６２キロダルトンのバンドは、
Glu His Leu Ala Asp Xaa Leu Glu Asp Lys Asp Tyr Asp Thr Leu Leu Gln Thr Leu Asp Asn Gly Leu Pro His Ileであり、
６３キロダルトンのバンドは、
Glu His Leu Ala Asp Xaa Leu Glu Asp Lys Asp Tyr Asp Thr Leu Leu Gln Thr Leu Aspであった。従って、６２と６３キロダルトンのタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は全く同じであり、この結果から、２つのタンパク質は同一遺伝子産物の可能性が考えられる。そこで、この白血病細胞殺傷物質は後述するようなアポトーシス活性を有することからアポトーシス誘導タンパク質（Apoptosis Inducing Protein, AIP）と命名した。
実施例２
ＡＩＰの単クローン抗体の調製
1）免疫：
実施例１で調製した精製ＡＩＰ１０μｇを当量の完全フロイントアジュバントと混合し、５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に注射した。２週間後、当量の抗原を当量の不完全フロイントアジュバントと混合し、腹腔内投与した。３週間後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解した３０μｇの抗原を静脈内投与した。
2）融合：
最終免疫の３日後、マウスの脾細胞とミエローマＦＯＸ−ＮＹとをＰＥＧを用いて融合した。脾細胞とミエローマ細胞の比は５：１とした。選択培地にはＡＡＴ（７．５×１０-5Ｍ アデニン、８×１０-7Ｍ アミノプテリン、１．６×１０-5Ｍ チミジン）、インスリン（１０ｍｇ／ｌ）、トランスフェリン（１０ｍｇ／ｌ）含有５％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ１６４０を用いた。
3）ハイブリドーマのクローニング：
抗体産生ハイブリドーマの選択及びクローニングに免疫沈降法を用いた。この免疫沈降法は、ＡＩＰ（４０μｇ／ml）１μｌにハイブリドーマ培養上清２０μｌを加え、４℃、２．０時間インキュベーションした後、抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭラビットＩｇｓを３μｇ加え、更に１．０時間インキュベーションした。次いで、反応溶液に１０％スタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aureus）菌体懸濁液（PANSORBIN Cells）５０μｌを加え、４℃、１．０時間インキュベーションした後、10000rpm、２分間遠心し、上清５μｌ、１０μｌ、２０μｌを取り、ＨＬ−６０ヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を調べた。
4）白血病細胞殺傷物質に対する単クローン抗体の作製：
細胞融合８日目にて総数７６８ウェル中の精製ＡＩＰに対する抗体について酵素免疫測定法（ELISA）によりスクリーニングを行い、ELISA陽性の５６ウェルを選別した。細胞融合１０日目にELISA陽性の５６ウェルに対して、免疫沈降法とウエスタンブロット法により更に選別し、ELISA、免疫沈降法、ウエスタンブロット法の全ての方法で陽性である９ウェルを選択した。その中から抗体の産生の最も多い３ウェルに対し、３回の限定希釈法によるクローニングで独立した３つのクローンを得、各々Ｉ３８Ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5872）、Ｉ３２Ｄ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5873）及びＩ３１０Ｈ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5874）と命名した。サバ内臓抽出液に対するＩ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈのウエスタンブロットの結果を図３に示す。モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０Ｈの特定のクラスを、クラス特異的抗マウス抗体を使用して免疫染色法で決定した。その結果を表１に示す。モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ、Ｉ３２Ｄ及びＩ３１０ＨはELISA、免疫沈降法、ウエスタンブロット法の全ての方法で使用可能な抗体であった。
ＡＩＰのアポトーシス活性の測定
細胞は、急性前骨髄性白血病患者の抹消血から樹立された骨髄単球系細胞株ＨＬ−６０を用いた。培地は、ＲＰＭＩ１６４０培地（免疫生物研究所製 ＩＢＬ）に、１０％となるように牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを使用した。ＦＢＳは、予め５６℃、４５分間加熱し補体系を不活性化させたものを用いた。
まず、前記細胞溶液を管に移し、1000rpm、５分間遠心を行い、上清を除去し、１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ１６４０培地を適当量加えて懸濁し、細胞数が５．０×１０5cells/mlになるように調節し、種々の濃度に調製した実施例１の精製ＡＩＰで処理した。
細胞死の測定は、Cell Titer 96商品名「Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit」（Promega社製）を用いて行った。
ＤＮＡ断片化の測定は次のように行った。まず、細胞懸濁液２５０μｌ（１．２５×１０5cells）に６２．５μｌの溶解緩衝液（２．０MNaCl、１０mM EDTA、５０mM Tris-HCl、pH８．０、１％SDS）と４μｌのプロテアーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、５６℃、９０分間溶解した。氷上で５分間静置後、８０μｌの５M ＮａＣｌを加え、更に氷上で５分間静置し、12000rpm、５分間遠心後、上清４００μｌを回収した。４μｌのＲＮａｓｅＡ（２０mg／ml）を加え、３７℃、６０分間処理し、ＲＮＡを分解した後、９００μｌの冷エタノールを加え、−２０℃で一晩静置した。その後、15000rpm、２０分間遠心後、沈澱物を１０μｌ ＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、pH７．５、１mM EDTA）に溶解し、２％アガロースゲル電気泳動で分析した。マーカーは、１２３ｂｐ ＤＮＡ ladder marker（LIFE TECHNOLOGIES）を用いた。
ＤＮＡ含量測定によるＤＮＡ分解検出は次のように行った。一定時間２０ng／mlのＡＩＰで処理することによりアポトーシスを誘発したＨＬ−６０細胞１×１０6個をＰＢＳ（−）で洗浄し、冷７０％エタノールを２００μｌ加え、４℃で一晩固定した。1500ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を除去後、エタノールを除くためＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞ペレットをＰＢＳ（−）０．１mlに浮遊させ、２．５μｌのＲＮａｓｅＡ（２０mg／ml）を加え、３７℃で２０分間処理しＲＮＡを分解した。その後、遠心で細胞を回収し、０．５mlの５０μｇ／mlヨウ化プロピジウム溶液（０．１％クエン酸ナトリウム、０．１％ＮＰ−４０）を加え、４℃暗所で１０分間染色した。５０μｍのナイロンメッシュを通し、フローサイトメーターにより測定した。
蛍光染色によるクロマチン凝集の観察は、一定時間２０ng／mlのＡＩＰで処理することによりアポトーシスを誘発したＨＬ−６０細胞１×１０6個をＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞固定液（１％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ（−））を１００μｌ加え室温で３０分間静置して固定した。1500rpm、５分間遠心し、上清を除去後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、細胞ペレットをＰＢＳ（−）２０μｌに浮遊させ、ＰＢＳ（−）含有４μｌの１mMヘキスト３３２５８を加えて混合した。スライドガラス上に細胞液を一滴落とし、カバーガラスを載せ蛍光顕微鏡下で観察した。
ヒト培養ガン細胞パネルによる制ガン効果の検定は次のように行った。ヒト培養ガン細胞３８系（肺ガン７系、胃ガン６系、大腸ガン６系、卵巣ガン５系、脳腫瘍６系、乳ガン５系、腎ガン２系、メラノーマ１系）及びマウスＰ３８８白血病細胞の合計３９系培養ガン細胞を、９６ウェルプレートにまき、翌日各濃度のＡＩＰを添加し、４８時間後に細胞増殖をスルホローダミンＢによる比色定量で測定した。
成人Ｔ細胞白血病（ATL）細胞及びヒトＴ細胞白血病ウイルス-１（HTLV-１）感染細胞の増殖に対するＡＩＰの影響は次のように検討した。
ＡＴＬ細胞３系（Maeda-V,Fukuda-V,Hara-V）及びヒトＴ細胞白血病ウイルス−１（HTLV-1）感染細胞２系（OYAJ-V, YAM-V）各１×１０5細胞に終濃度０、２、２２ng／mgになるようにＡＩＰを添加し、３７℃、５％ＣＯ2で７時間培養後、０．５μＣｉの６−3Ｈチミジンを加え、更に５時間培養した。ＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ＤＮＡに取り込まれた６−3Ｈチミジンの量を液体シンチレーションカウンターで測定した。
1）白血病細胞殺傷物質のもつアポトーシス活性：
精製白血病細胞殺傷物質のヒト白血病細胞ＨＬ−６０に対する殺傷活性を、ＭＴＳアッセイで測定した。濃度と処理１６時間後の生細胞の割合との相関関係を図４に示す。約５ng／mlの濃度で５×１０5cells／mlの約５０％にあたる細胞を殺したことから、非常に強い白血病細胞殺傷活性を有していることが判った。２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質で処理した際の生細胞の割合を経時的に解析した結果を図５に示す。この結果、約４時間で約５０％にあたる細胞死を引き起こしていることが判った。この２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質で処理した際のＤＮＡ断片化を経時的に解析した結果を図６に示す。処理約２時間後からアポトーシスに特異的にヌクレオソーム単位のＤＮＡの断片化が見られた。通常、アポトーシスによる細胞死ではアポトーシス特異的ＤＮＡ断片化、即ち、クロマチンＤＮＡのヌクレオソーム単位での切断が見られることが知られている。
このアポトーシスに伴うＤＮＡ断片化はフローサイトメトリーでも測定することができ、アポトーシス細胞では、Ｇ１期細胞よりＤＮＡ含量の低い細胞として検出される。２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質の処理０、２時間後、４時間後及び１２時間後の細胞中のＤＮＡの含有量をフローサイトメトリーで解析した結果をそれぞれ図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。この結果、時間の経過と共にＤＮＡの含有量の低下したアポトーシス細胞の増加が認められた。
また、顕微鏡観察により、その形態的特徴からアポトーシスを検出する直接的方法もある。そこで、顕微鏡観察により、０、２時間後、４時間後及び１２時間後の２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核の変化を観察した。その顕微鏡写真をそれぞれ図８（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。アポトーシスを起こした細胞の核ではクロマチンの凝縮、核濃縮等が見られる。更に、図８で示す０、２時間後、４時間後及び１２時間後の２０ng／ml濃度の白血病細胞殺傷物質処理細胞の核をそれぞれヘキスト３３２５８で蛍光染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。その結果をそれぞれ図９（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）に示す。この結果、白血病細胞殺傷物質で処理したアポトーシスに特異的なクロマチン凝縮や核の断片化像が検出された。
以上の結果から、白血病細胞殺傷処理物質により処理して起こる細胞死はアポトーシスであると断定された。
2）ヒトガン細胞に対するＡＩＰの増殖阻害活性：
４３種類のヒトガン細胞の増殖に対するＡＩＰの影響をスルホローダミンＢによる比色定量又は６−3Ｈチミジンの取り込みで測定した。その結果を表２に示す。ＡＩＰは、検討した細胞の増殖を抑制した。
1)サバ内臓からの全ＲＮＡ調製
全ＲＮＡ調製はＡＧＰＣ（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）法（Anal.Biochem.162,p156-159）に従って行った。
サバ内臓を、フェノールとチオシアン酸グアニジンとからなる溶液ISOGEN（株式会社ニッポンジーン製）５ml中でポリトロンホモゲナイザーにて均質化して溶解させた。得られた均質物に１mlのクロロホルムを加え、内容物を完全に混合し、氷上で１５分間放置した。４℃、5000ｇで３０分間遠心し、上層（水層）を回収した。この溶液に等容量のフェノール及びクロロホルムを加えて水層を抽出した後、回収水層と同量のイソプロピルアルコールを加え、室温で１０分間放置した。４℃、5000ｇで３０分間遠心し、ＲＮＡを沈澱させ、７０％エタノールで洗浄後、ＲＮＡのペレットを溶出用緩衝液（１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA）１mlに溶解し、１mgの全ＲＮＡを得た。
2)ｍＲＮＡの精製
得られた全ＲＮＡを６５℃、５分間処理し、急冷した。不溶物は遠心分離して除去し、３M NaCl溶液を０．２ml加え、塩濃度が０．５Mとなるように調整した。ＲＮＡ溶液をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラム（Pharmacia社製）に載せ、素通り分画をもう１度カラムに載せた。１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA，０．５M NaCl溶液（数カラム量）と１０mM Tri-HCl,pH７．４，１mM EDTA，０．１M NaCl溶液（数カラム量）とで洗浄し、吸着したポリ（Ａ）を有するＲＮＡを溶出用緩衝液で溶出した。得られたＲＮＡを再度上記の操作を繰り返し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH５．１）、２容量のエタノールを加え、−２０℃で沈澱させ、ポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ約３５μｇを得た。
3)ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製
得られたポリ（Ａ）を有するｍＲＮＡ３μｇを蒸留水で７μｌとし、Not １ primer-adapter（０．５μｇ／ml，LIFE TECHNOLOGIES）２μｌを加え、７０℃、１０分間処理した後、急冷した。得られた溶液にＲＮＡｓｅ阻害剤（40unit/μl,Stratagene社製）１μｌ、２５０mM Tri-HCl,pH８．３，３７５mM KCl及び１５mM MgCl2からなる緩衝液４μｌ、ＤＴＴ １μｌ、１０mM ｄＮＴＰ混合液１μｌ、リバーストランスクリプターゼ（200units／μｌ、LIFE TECHNOLOGIES）を加え、良く混合し、３７℃で１時間反応させた。反応後、蒸留水９１μｌ、１００mM Tris-HCl，pH６．９，４５０mM KCl，２３mM MgCl2，０．７５mM β-NAD＋、５０mM（NH4）2SO4からなる緩衝液３０μｌ、１０mM ｄＮＴＰ混合液３μｌ、E.coli ＤＮＡリガーゼ（１０units／μｌ）１μｌ、E.coli ＤＮＡポリメラーゼ（１０units／μｌ）４μｌ、E.coli ＲＮａｓｅＨ（２units／μｌ）１μｌを加え、良く混合して１６℃で２時間反応させた。その後Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（５units／μｌ）２μｌを加え更に５分間反応させた。０．５M EDTA １０μｌを加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム（１：１）で抽出を行い、７．５M酢酸アンモニウム０．５容量を加え、更に全容量の２倍量のエタノールを加えて14000gで２０分間遠心し、分離されたペレットを７０％エタノールで軽くすすいだ。乾燥後、２５μｌの蒸留水に溶解し、２５０mM Tri-HCl,pH７．６，５０mM MgCl2，５mM ATP，５mM DTT，２５％（w／v）ＰＥＧ8000からなる緩衝液１０μｌ、Sal １ adapter（１μｇ／μｌ）１０μｌ、T4DNAリガーゼ（１units／μｌ）５μｌを加え、１６℃で２４時間反応させた。フェノール−クロロホルム（１：１）抽出を行い、エタノール沈澱させた。４１μｌの蒸留水に溶解し、１０mM Tri-HCl,pH７．５，７mM MgCl2，１５０mM NaCl，７mM ２−メルカプトエタノール，０，０１％TritonX-100からなる緩衝液５μｌ、NotI（１５units／μｌ）４μｌを加え、３７℃で２時間反応させた。フェノール−クロロホルム（１：１）抽出を行い、エタノール沈澱させた。ＤＮＡペレットを１０mM Tri-HCl,pH７．５，０．１mM EDTA，２５mM NaClからなる緩衝液１００μｌに溶解し、同じ緩衝液で平衡化したSephacryl S-500カラム（１ml,LIFE TECHNOLOGIES）でゲル濾過を行い、必要な大きさのｃＤＮＡを含む分画を選択した。
作製したｃＤＮＡ１５ngとNot I-Sal Iとで処理したpSPORT １プラスミドベクター（LIFE TECHNOLOGIES）５０ngの混合液を蒸留水で１５μｌとし、２５０mM Tri-HCl,pH７．６，５０mM MgCl2，５mM ATP，５mM DTT，２５％（w／v）ＰＥＧ8000からなる緩衝液４μｌ、T4DNAリガーゼ（１units／μｌ）１μｌを加え、２２℃で４時間反応させ、ベクターにｃＤＮＡを組み込み、yeast ｔＲＮＡ（１μｇ／μｌ）５μｌ、７．５M NH4OAc１２．５μｌ、冷エタノール７０μｌを加え、エタノール沈澱させ、５μｌの蒸留水に溶解した。得られたベクターｃＤＮＡをエレクトロポレーション用大腸菌（Electro MAX DH10B Cell）にバイオラット社製のエレクトロポレーションシステムを用いて導入（１．８kV，２５mF，２００Ω）し、２３０万トランスフォマントからなるｃＤＮＡライブラリーを得た。
4)RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）によるＡＩＰ遺伝子の増幅
ＡＩＰのＮ−末端アミノ酸配列（ＥＨＬＡＤＸＬＥＤＫＤＹＤＴＬＬＱＴＬＤＮＧＬＰＨＩ）のＥＤＫＤＹＤＴに対応するセンス・プライマーNo.１と内部アミノ酸配列（ＭＩＹＤＱＡＤＶ）のＭＩＹＤＱＡＤに対応するアンチセンス・プライマーNo.２をそれぞれ化学合成し、ＡＩＰ遺伝子の増幅用プライマーとして用いた。前記得られた全ＲＮＡ ５μｇに、oligo（dT）12-18（０．５ng／μｌ）１μｌを加えて７５℃、１０分間保温した後、氷中で急冷した。次に２０mM Tris-HCl（pH８．４）、５０mM KCl、２．５mM MgCl2、０．５mMの各dNTP、１０mM DTT、２０units ＲＮＡｓｅ阻害剤、２００unitsリバーストランスクリプターゼを含有する溶液中で４２℃、１時間のｃＤＮＡ合成反応を行い、７０℃、１０分間加熱して反応を停止させ、２units E.colo ＲＮａｓｅ Ｈを加えて３７℃、２０分間処理し、残ったＲＮＡを分解させた。得られたｃＤＮＡの１／１０量、２種類のプライマーNo.１及びNo.２を各１００pmole、２０mM Tris-HCl（pH８．４）、５０mM KCl、１．５mM MgCl2、０．２mM各ｄＮＴＰ、１０mM ＤＴＴ、２．５units Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液中で９４℃、１分間、５６℃、１分間、７２℃、１分間の反応を３５回繰り返してＰＣＲを行った。このサイクル終了後に７２℃で８分間反応させ、ＰＣＲ産物３’末端にポリ（Ａ）を取り込ませるようにした。
5)ＰＣＲ産物のクローニングとその塩基配列の決定：
得られたＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動により約６５０ｂｐの大きさであることが判った。上記ＰＣＲ産物をＴ４ＤＮＡリガーゼとＡＴＰによりプラスミドベクターｐＣＲIIに挿入し、その塩基配列をPERKIN ELMER社製のキット（ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit）の指示書に従ってジオキシヌクレオチドを蛍光標識したダイターミネーター法によって決定した。その結果、塩基配列から予測されるアミノ酸配列はＡＩＰの部分アミノ酸配列の決定から得られた配列を含んでいることが判り、pCRaip001と命名した。
6)プローブの標識：
得られたpCRaip001を制限酵素Eco RIで切断し、１．５％アガロースゲル電気泳動で分離した後、約６５０ｂｐのインサートＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収した。回収ＤＮＡ断片６０ｎｇをテンプレートにし、ランダムプライム法を用いてPharmacia社製のキット（Ready To Go DNA Labelling Kit）の指示書に従って、［α-32Ｐ］dCTPで標識した。
7)pSPORT １ cDNAライブラリーから全長AIP遺伝子のスクリーニング
作製したpSPORT １ ｃＤＮＡライブラリーより、得られたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72:3961,1975）でスクリーニングした。まず、アンピシリンを含む１５cm ＬＢ／agerプレートに約20000個のコロニーができるように前記で得たトランスフォマント約100万個をまき、約１２時間、３７℃で培養した。コロニーができたプレート上にナイロンフィルター（Amersham社製）を空気が入らないように静置し、約１分間後フィルターを剥がし、乾燥させた。フィルターを、コロニーが付いた面を上にして、１０％SDSを染み込ませた濾紙と、０．５M NaOH及び１．５M NaClを染み込ませた濾紙と、０．５M Tris-HCl，pH７．５，１．５M NaClの溶液を染み込ませた濾紙との上に各３分間順次静置させた後、２×ＳＳＣで良く洗浄し、乾燥させ、ＵＶトランスイルミネーターを用いてフィルター上にＤＮＡを固定させた。フィルターを５×ＳＳＣに浸した後、６×ＳＳＣ、５×Denhardt液、０．５％ＳＤＳ溶液（ハイブリダイゼーション溶液）中で６５℃で２時間プレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダイゼーション液を捨て、予め６５℃に加温しておいたハイブリダイゼーション溶液に1000000cpm／mlになるように上記で得られた標識ＤＮＡ（１００℃で５分間加熱し、急冷したもの）を添加したものを注ぎ込み、６５℃で２０時間ゆっくり振盪させながらハイブリダイゼーションを行った。１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で１０分間、３回洗浄し、更に０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で２０分間、３回の洗浄を６５℃で行った。自然乾燥後、−８０℃で一晩オートラジオグラフィーを行い、標識したプローブに強く会合した２７のコロニーを選択した。これらのプラスミドＤＮＡについて、上記で得たＰＣＲにより約６５０ｂｐのＰＣＲ産物が確認された。これらのプラスミドは、pSAIP １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６及び２７と命名したが、いずれもＡＩＰのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を有することからＡＩＰ ｃＤＮＡを含んでいると考えられる。これらのうち、略完全長を有すると思われるpSAIP ２２について、その翻訳領域の全塩基配列をジデオキシヌクレオチドを蛍光標識したダイターミネーター法によって決定した。その塩基配列を配列表の配列番号２に、その塩基配列より予測されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
このｃＤＮＡ配列と予想されるアミノ酸配列は、ＡＩＰの部分アミノ配列の決定から得られた配列及びpCRaip001のインサートを全て含んでいることが判り、このｃＤＮＡはＡＩＰをコードしていることを確認した。成熟ＡＩＰのＮ−末端アミノ酸との比較から、塩基数１−９０がシグナルペプチドを、９１−１５７５がＡＩＰの成熟ペプチドをコードすると考えられる。このｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの予想分子量は58668ダルトン（シグナルペプチドと予測される部分を除くと55243ダルトンとなる）であり、サバ内臓より精製されたＡＩＰの分子量より約7500ダルトン低かった。ＡＩＰはCon Aカラムに強く吸着される糖タンパク質であり、糖鎖部分が約7500ダルトン占めていると考えられる。
実施例５
実施例１において調製した精製ＡＩＰを、Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｄ−リジンと混合反応させることによって、過酸化水素が発生するか否かを発色試薬（ペルオキシダーゼ及びｏ−フェニレンジアミン）で測定した。その結果、精製ＡＩＰは、Ｌ−リジンを酸化して約２８００μＭの過酸化水素を生成した。一方、ポリ−Ｌ−リジン又はポリ−Ｄ−リジンを混合した場合には、過酸化水素の発生は１０数μＭ程度であった。また、精製ＡＩＰは、リジンの他に、ロイシン、フェニルアラニン、アルギニン、メチオニン、ヒスチジン等を基質とし、過酸化水素を生成する。従って、精製ＡＩＰは、酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成するものと考えられる。
次に、前記酸化反応による過酸化水素の生成反応と、精製ＡＩＰの癌細胞アポトーシス活性との関係を調べるために、過酸化水素の分解反応を触媒するカタラーゼを添加したものとしないものとで精製ＡＩＰの癌細胞アポトーシス活性がどのようになるかを測定した。測定は、カタラーゼを添加する以外は、実施例３で行った精製白血病細胞（ヒト白血病細胞ＨＬ−６０）殺傷物質のもつアポトーシス活性を測定する方法と同様に行い、１６時間後の死細胞の割合を測定した。その結果、精製ＡＩＰに加えてカタラーゼを添加した場合の細胞死の割合は、精製ＡＩＰ単独添加の場合の死細胞の割合を１００％とした場合、１８％であった。
従って、精製ＡＩＰが癌細胞アポトーシス活性を示す一因として、前記酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成する反応が関与していると考えられる。
そこで、精製ＡＩＰをモチーフ解析して、フラボタンパク質が可視光吸収スペクトルに対して示す典型的な変化と同様な変化を示すドメインを探索したところ、配列表の配列番号１のアミノ酸配列において、６１−８９番目のアミノ酸配列がフラビン結合ドメインであることが判った。従って、酸化的脱アミノによるアルデヒド生成反応を触媒して過酸化水素を生成する反応に必要なアミノ酸配列の１つは、前記６１−８９番目のアミノ酸配列であることが判った。
次に、配列表の配列番号２に示される塩基配列のＡＩＰ遺伝子を、ＰＣＲ法により変異させ、その変異遺伝子を動物細胞発現用ベクター（ｐＭＥ１８Ｓ）に組み込んで得られたプラスミドをサル腎由来細胞株ｃｏｓ−７に導入し、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列１−５１４番及び１−４９６番の変異ＡＩＰを作製した。これらの変異ＡＩＰ及び実施例１で得られた精製ＡＩＰについて、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を測定した。その結果を図１０に示す。また、これらのＡＩＰ及び変異ＡＩＰのヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を実施例３と同様に測定したところ、アミノ酸配列１−５２４番から成る全長ＡＩＰ及びアミノ酸配列１−５１４番から成る変異ＡＩＰは癌細胞に対するアポトーシス活性を示したが、アミノ酸配列１−４９６番から成る変性ＡＩＰは癌細胞に対するアポトーシス活性を示さなかった。
従って、アミノ酸配列４９７−５１４番までの部位も、本発明のＡＩＰの機能維持に必要であることが判る。
実施例６
実施例１で調製した精製ＡＩＰの起源を探索するために、用いたマサバの内臓を分析したところ、寄生虫に感染していることが判った。そこで、寄生虫に感染しているマサバ５体と寄生虫に感染していないマサバ５体とから、それぞれ実施例１と同様に内臓抽出物を精製した。得られた各内臓抽出物に対して、実施例２で調製したモノクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を行った。結果を図１１に示す。図１１において、レーン１−５は寄生虫に感染した５体のマサバ内臓抽出物の結果であり、レーン６−１０は寄生虫に感染していない５体のマサバ内臓抽出物の結果である。また、これらの内臓抽出物についてヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性を実施例３と同様に測定した。その結果を表３に示す。表３において、試料番号１−５は寄生虫に感染した５体のマサバ内臓抽出物の結果であり、試料番号６−１０は寄生虫に感染していない５体のマサバ内臓抽出物の結果である。また、比活性は、試料番号５の内臓抽出物のヒト白血病細胞に対するアポトーシス活性の強さを１にした時の相対活性の値を示す。
図１１及び表３の結果から、寄生虫に感染したマサバの内臓抽出物には本発明のＡＩＰが認められ、且つそれらには癌細胞アポトーシス活性が見られた。一方、寄生虫に感染していないマサバ内臓抽出物には以上の活性は見られなかった。従って、ＡＩＰの発現はヤサバから寄生虫感染により誘導されることが判った。
以上の点より、寄生虫感染のようにヘルパＴ２細胞（Ｔｈ２細胞）の活性化を伴う刺激によりマサバからＡＩＰが誘導され、同じような機構により哺乳類からでもＡＩＰに対して配列相同性若しくは細胞死誘発活性を有するタンパク質が誘導されうると判断できる。
配列番号：１
配列の長さ：５２４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
配列の長さ：１５７５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ
配列
Claims (6)
- 配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、且つガン細胞増殖抑制活性又は細胞死誘発活性を示すタンパク質。
- 配列表の配列番号２に示される塩基配列からなる請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項１記載のタンパク質のモノクローナル抗体。
- モノクローナル抗体Ｉ３８Ａ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号 FERM BP-5872）、モノクローナル抗体Ｉ３２Ｄ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5873）及びモノクローナル抗体Ｉ３１０Ｈ（工業技術院生命工学工業技術研究所 国際受託番号FERM BP-5874）からなる群より、選択される請求項３記載のモノクローナル抗体。
- 請求項１タンパク質を含むアポトーシス誘導用試薬。
- 請求項１記載のタンパク質を有効成分として含む抗ガン剤。
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