CN102348719A - 多肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(‘CHIPS’)生物活性的多肽，该多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或变体，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或变体组成，其中所述片段或变体相对于SEQ ID NO：1的野生型CHIPS蛋白质保留氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和/或G112A。在一个实施方案中，多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。本发明的相关方面提供了包含本发明多肽的药物组合物，及其制备和使用方法。

Description

多肽及其用途
技术领域
本发明涉及新多肽以及它们在治疗与补体C5a受体和/或甲酰化肽受体的活化相关的症状与疾病中的用途。本发明特别提供金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococcus aureus)(‘CHIPS’)的变体形式以及它们在治疗急性和慢性炎性病症中的用途。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是导致多种疾病的常见人类病原体。金黄色葡萄球菌导致疾病的机理是多因素的。除了由特殊毒素(例如引起中毒性休克综合征的中毒性休克综合征毒素(TSST-1)或肠毒素)引起的一些葡萄球菌病之外，金黄色葡萄球菌感染的致病性是不依赖于单一因素的。金黄色葡萄球菌拥有大量不同的“工具”来引发疾病。这些不同因素整体组合的共同作用促进其在宿主内的定殖(colonization)、生长和扩散。吞噬细胞对于葡萄球菌的吞噬和杀伤是最重要的宿主防御机制。吞噬细胞通过入侵者(例如甲酰化肽)所释放的细胞因子和趋化因子并且在炎性级联反应(inflammatorycascades)如补体系统活化时被吸引至感染部位。释放这些化学引诱物所产生的梯度，将吞噬细胞吸引至炎症部位。
Veldkamp等研究了生长中的金黄色葡萄球菌上清液与吞噬细胞的相互作用。他们发现，尽管葡萄球菌上清液能够刺激吞噬细胞，但如通过单克隆抗体检测，还存在一种能够特异性下调补体C5a受体(C5aR)和甲酰化肽受体(FPR)表达的因子(见Veldkamp等，2000，Infect Immun 68(10)：5908-13；Veldkamp等，1997，Inflammation 21(5)：541-51)。他们从金黄色葡萄球菌的上清液中分离出了导致该作用的14.1kDa的蛋白；该蛋白被命名为CHIPS，即金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白。CHIPS能够抑制由C5a和fMLP引起的嗜中性粒细胞的趋化性以及活化。此外，还发现CHIPS非常具有选择性，因为它不影响广泛选择的其他受体(a broad selection of other receptors)，包括存在于嗜中性粒细胞上的其他化学引诱物受体，例如FPR-样1、C3aR、IL-8RA和IL-8RB、LTB4受体和PAF受体。这表明CHIPS特异性地抑制G-蛋白偶联受体家族中的两个成员，C5aR和FPR。CHIPS对细胞没有毒性，并且还抑制其他细胞例如单核细胞和肥大细胞上的C5aR。
Postma等显示，CHIPS以不依赖于能量的方式直接同C5aR和FPR结合。此外，CHIPS在同其受体结合时不发生内化。CHIPS分别以1.1和35.4nM的表观Kd值同C5aR和FPR两个受体结合(见Postma等，2004，J Immunol172(11)：6994-7001)。这些Kd值的范围与对它们的天然配体所记录的范围相同(见Van Epps等，1993，J Immunol 150(1)：246-252；Falk等，1982，InfectImmun 36(2)：450-454；Huey&Hugli，1985，Immunol.135(3)：2063-8；Pike等，1980，J Exp Med 152(1)：31-40)。CHIPS中用于结合甲酰化肽受体和C5a受体的活性部位位于CHIPS分子的不同区域。N-末端和C-末端并且特别是第一个和第三个氨基酸参与了CHIPS对甲酰化肽受体的活性(见Haas等，2004，JImmunol 173(9)：5704-11)。至少前30个N-末端氨基酸不参与CHIPS同C5aR的结合和对C5aR的阻断。因此，不含前30个氨基酸的CHIPS蛋白，CHIPS31-121，显示出对C5aR阻断活性的完整保留，但完全失去了对FPR的活性(见Haas等，2005，J Mol Biol 353(4)：859-872)。
近年来人们已经清楚，仅次于宿主防御，趋化因子受体，例如FPR和C5aR，也参与了多种其他炎性过程。近来鉴定的多种新型和源于宿主的FPR激动剂，扩展了FPR在疾病过程中的功能意义(见Le等，2002，Trends Immunol23(11)：541-8)。对C5aR在多种不同疾病过程中的显著作用，人们开展了许多研究，所述疾病过程包括：脓毒症、缺血-再灌注损伤、类风湿性关节炎、哮喘和免疫复合物疾病。多种使用动物模型的实验研究证明了在这些疾病过程中将C5aR作为目标带来的有益效果(见Guo等，2004，Shock 21(1)：1-7；Huber-Lang等，2001，J Immunol 166(2)：1193-1199；Heller等，1999，J Immunol163(2)：985-94)。CHIPS特异性抑制FPR和C5aR的独特性质，使该蛋白成为了一些疾病的抗炎药物中的有力候选者(promising candidate)，在所述疾病中FPR或C5aR的激活起重要作用。
使用分离的人类和小鼠嗜中性粒细胞的实验表明，CHIPS对于小鼠C5aR的活性不到其对于人类受体的活性的30分之一。这种在与小鼠细胞比较时针对人细胞的活性方面存在的30倍差距表明了CHIPS的人特异性，其阻碍了CHIPS在小鼠感染模型或其他动物模型中的测试。
金黄色葡萄球菌是人类皮肤的正常共生物，由金黄色葡萄球菌引起的轻微皮肤或伤口感染一般而言是自我限制性(self-limiting)的。金黄色葡萄球能够潜在地感染身体的任何组织，并偶尔由最初(primary)感染部位扩散而导致威胁生病的疾病，例如骨髓炎、心内膜炎、肺炎和败血症。CHIPS基因存在于大部分的临床金黄色葡萄球菌的菌株和来自健康携带者的菌株中，体内CHIPS的生成如由Haas等利用小鼠感染模型所描述(见Haas等，2004，J ExpMed 199(5)：687-95)。由于金黄色葡萄球菌是非常常见的细菌，大多数个体很有可能在生命的早期接触金黄色葡萄球菌和CHIPS蛋白，并导致了抗CHIPS抗体的产生。
野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列如下所示(其中氨基酸数31至113标以下划线)：
FTFEPFPTNEEIESNKKMLEKEKAYKESFKNSGLPTTLGKLDERLRNYLKK GTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYLNTPLAEDRKNVELLGKMYKTYFFK KGESKSSYVINGPGKTNEYAY
SEQ ID NO：1
野生型CHIPS蛋白的氨基酸序列还以数据库登记号AAQ14339、CAG41022和YP_041409进行了公开。
野生型CHIPS蛋白的多种片段、变体和衍生物及其用途公开于EP1095059A、EP1244790A、PCT/EP2005/004156和PCT/EP2007/001443，其公开通过提述并入本文。
本发明探索的是提供基于野生型CHIPS蛋白的新突变型式的治疗剂，其显示出有利的性质。
发明内容
本发明的第一个方面提供了具有金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(‘CHIPS’)生物活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或变体，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS生物活性的片段或变体组成，其中所述片段或变体相对于SEQ ID NO：1的野生型CHIPS蛋白质保留氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和/或G112A。
NSGLPTTLGL
Figure BDA0000089847850000042
ERLRNYLKKGTKNSAQFEKMVILTENKGYYTVYL
Figure BDA0000089847850000043
TPLAEDRKNVELLGKMYKTYFF
Figure BDA0000089847850000044
KGES
Figure BDA0000089847850000045
SSYVIP
SEQ ID NO：2
应理解的是SEQ ID NO：2对应于具有下述氨基酸取代的SEQ ID NO：1的氨基酸31-113：K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和G112A(参见SEQ ID NO：2中粗体下划线的氨基酸)。
应进一步理解的是，SEQ ID NO：2的多肽可含或不含N端甲硫氨酸(未示于SEQ ID NO：2)而表达。本文中所有对SEQ ID NO：2多肽的提及均应视为如此。
为了避免疑问，除非另行指明，在本说明书中，所有氨基酸相对于CHIPS蛋白片段、变体或衍生物等的编号为相对于野生型CHIPS蛋白(即SEQ IDNO：1)。举例而言，相对于SEQ ID NO：1的取代K40E对应于在SEQ ID NO：2中第十个氨基酸用谷氨酸取代赖氨酸(因为SEQ ID NO：2并不包含SEQ IDNO：1的前30个氨基酸)。
本发明的第一个方面涵盖了SEQ ID NO：2具有CHIPS生物活性的片段和变体，其中所述变体保留相对于SEQ ID NO：1的野生型CHIPS蛋白的氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和/或G112A。在此上下文中，“保留”意指当所述变体包含对应于SEQ ID NO：1的40、42、77、100、105、111和/或112位的氨基酸时，则该氨基酸分别为谷氨酸、缬氨酸、组氨酸、精氨酸、精氨酸、赖氨酸和/或丙氨酸。举例而言，当所述多肽是SEQID NO：2的52个C端氨基酸的变体时，其在对应于SEQ ID NO：1的77位的氨基酸处包含组氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的100位的氨基酸处包含精氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的105位的氨基酸处包含精氨酸，在对应于SEQID NO：1的111位的氨基酸处包含赖氨酸，并在对应于SEQ ID NO：1的77位的氨基酸处包含丙氨酸。然而，由于该示例性变体缺乏SEQ ID NO：2的氨基酸1至51，其并不包含对应于SEQ ID NO：1的40或42位的氨基酸。
由SEQ ID NO：2限定的多肽包含83个氨基酸。然而本领域技术人员应理解的是本发明多肽可为更长或更短的长度。举例而言，所述多肽可包含多于或少于83个氨基酸，或可由多于或少于83个氨基酸组成，或可包含恰好83个氨基酸，或恰好由83个氨基酸组成。优选地，所述多肽长度上少于500个氨基酸，例如长度上少于400、300、200、150、140、130、125、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、95、90、85、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、65、60、55、50、40、30个或更少的氨基酸。
举例而言，所述多肽的长度可为70至110个氨基酸，例如长度上为75至90个氨基酸，例如75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90个氨基酸。在一个实施方案中，所述多肽的长度为83个氨基酸。
因此，在本发明的第一个方面的一个实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的片段、或其变体，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段、或其变体组成。
关于“片段”，我们包括了SEQ ID NO：2氨基酸序列的至少10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81或82个连续氨基酸。
在进一步的实施方案中，所述多肽包含在N和/或C端或内部插入了一个或多个附加的氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或由在N和/或C端或内部插入了一个或多个附加的氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。举例而言，所述多肽可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个附加的氨基酸，或由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个附加的氨基酸组成。有利地，附加的氨基酸位于SEQ ID NO：2氨基酸序列的C端。
在本发明第一个方面的更进一步的实施方案中，所述多肽包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的变体、或其片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变体、或其片段组成。
“变体”意指所述多肽并不与SEQ ID NO：2享有100％氨基酸序列同一性，即SEQ ID NO：2的一个或多个氨基酸必须经修饰。举例而言，所述多肽可包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％同一性，更优选与所述序列具有至少70％或80％或85％或90％同一性，且最优选与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％同一性，更优选与所述序列具有至少70％或80％或85％或90％同一性，且最优选与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成。
同一性百分比能够通过本领域已知方法确定，例如使用在Expasy工具网站(http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html)上的LALIGN程序(Huang和Miller，Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357)，利用全局比对选项、评分矩阵BLOSUM62、开启缺口罚分(opening gap penalty)-14、延伸缺口罚分(extending gap penalty)-4作为参数。
或者，两个多肽之间的序列同一性百分比可以利用适当的电脑程序测定，例如威斯康辛大学遗传计算组(University of Wisconsin Genetic ComputingGroup)的GAP程序，并且应理解(it will be appreciated that)同一性百分比的计算是相对于其序列已进行了最优比对排列的多肽而进行的。
“修饰”意指在特定位置的氨基酸与SEQ ID NO：2的多肽中的该氨基酸相比发生改变。举例而言，在特定位置的氨基酸可为非天然的，缺失的或取代的，或可为一个或多个氨基酸的插入/添加位点。本领域技术人员应理解的是所述取代可为保守的或非保守的。
在一个实施方案中，所述变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸发生保守取代的片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其中一个或多个氨基酸发生保守取代的片段组成。“保守取代”意指一个氨基酸由另一个具有类似性质(大小，疏水性等)取代，从而使得所述多肽的功能并不受显著改变。因此“保守取代”旨在指如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr的组合。
在进一步的实施方案中，所述变体包含在暴露于多肽表面的一个或多个氨基酸处的修饰。暴露于表面的氨基酸可以使用本领域已知的技术测定(见实施例B)。然而，应理解的是，对非暴露的氨基酸的修饰也可以造成在变体多肽表面的结构变化(相对于野生型CHIPS蛋白或SEQ ID NO：2的多肽而言)。
技术人员应理解的是，氨基酸分子还可以以其他方式进行修饰，例如通过化学修饰。因此，本发明的多肽可以由通过肽键或经过修饰的肽键而彼此相连的氨基酸组成，例如肽酯，并包含除基因编码的20个氨基酸之外的氨基酸。例如，所述多肽可以包含L-氨基酸和/或D-氨基酸，以及经修饰的氨基酸比如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸和O-磷酸酪氨酸。所述多肽可以通过自然方法来修饰，例如翻译后修饰，或通过本领域已知的化学修饰技术来修饰。修饰能够在所述变体CHIPS多肽氨基酸序列内的任何位置，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端进行。
然而，在一个实施方案中，本发明的多肽包含天然L-氨基酸或由天然L-氨基酸组成。
已知多肽的修饰型(modified form)或变体型能够使用本领域已知技术生成(见Sambrook&Russell，2000，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ThirdEdition，Cold Spring Harbor，New York，(分子克隆，实验手册，第三版，冷泉港，纽约)其以引用的方式并入本文中)。例如，点突变可以通过定点诱变而引入到特定的氨基酸残基处(见Sambrook&Russell，同上，第13章)。生成亲本多核苷酸的变体的其他方法描述如下。
关于CHIPS的“生物活性”用于本文表示野生型CHIPS蛋白对于活体、组织或细胞的作用。这些作用在此处包含但不限于与其一个或多个天然配体的结合，以及由此产生的下游事件，引起对活体的直接或间接作用。因此，CHIPS蛋白的“生物活性”包括对由补体成分C5a和/或N-甲酰肽fMLP诱导的嗜中性粒细胞的趋化性和/或活化的抑制。例如，保持的活性可以包含对C5a受体(C5aR)的拮抗和/或对甲酰化肽受体(FPR)的拮抗。
然而，在一个实施方案中，本发明的变体CHIPS多肽缺乏FPR结合位点(例如，所述多肽缺乏SEQ ID NO：1的氨基酸1至30)。
在另一实施方案中，本发明的多肽显示出CHIPS蛋白在体内的一种或多种生物活性。
测定野生型CHIPS蛋白及其变体的生物活性和结合特性的测定法是本领域已知的(见实施例)。
当然，本领域技术人员应该了解，本发明第一方面的多肽相对于野生型CHIPS蛋白显示出的水平可以显示出更低、相等或更高水平的生物活性。优选地，本发明的多肽显示出野生型CHIPS蛋白显示出的水平的至少10％水平的生物活性，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。更优选地，本发明的多肽与野生型CHIPS蛋白显示出的生物活性相比显示出相等水平或更高的生物活性。最优选地，本发明的多肽显示出相对于野生型CHIPS蛋白更高水平的生物活性(即更有活性)。例如，本发明的多肽可以显示出野生型CHIPS蛋白显示出的水平的至少110％水平的生物活性，例如至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、500％或更高。
在另一实施方案中，本发明的多肽对于C5aR和/或FRP具有特异结合活性，该活性等于或大于野生型CHIPS蛋白显示的相应活性。
因此，本发明的多肽仅显示出CHIPS蛋白的生物活性，即该多肽的活性具有选择性。例如，本发明的多肽可以选择性地抑制由补体成分C5a和/或由N-甲酰肽fMLP诱导的嗜中性粒细胞的趋化性和/或活化。“选择性”表示与对细胞中其他蛋白活性的调控相比，该多肽在更大程度上抑制了所述生物活性。因此，该多肽优选地仅抑制野生型CHIPS蛋白的生物活性，然而应该了解，细胞中其他蛋白的表达和活性可以作为所述选择性抑制的下游后果而发生改变。因此，我们排除了对细胞过程具有非特异性作用的作用物(agents)。
在本发明第一个方面的更进一步实施方案中，所述多肽是SEQ ID NO：2的多肽的变体，其中一个或多个表面表位经修饰。此类修饰可为直接的(即表位自身内氨基酸的修饰)或间接的(即修饰的氨基酸不在表位中，但是当其被修饰时，导致表位内氨基酸或该表位结构的修饰)。
“表面表位”意指野生型CHIPS蛋白表面暴露的氨基酸残基的构象，所述构象由响应于CHIPS抗原攻击(challenge)而产生的抗CHIPS抗体和/或响应于金黄色葡萄球菌攻击而产生的抗体所识别。
在本发明第一个方面的一个具体实施方案中，所述多肽在人体中相对于SEQ ID NO：1的多肽具有更低的免疫原性。
“免疫原性”意指多肽在宿主生物中诱导免疫应答(即产生抗多肽的抗体)的能力。优选地，该多肽在人体内相对于SEQ ID NO：1的多肽具有更低的免疫原性。
免疫原性可以通过本领域熟知的方法确定。例如，家兔或其他动物物种(例如小鼠、大鼠、豚鼠、狗等)可用本发明的多肽进行免疫，并确定免疫复合物的形成。理想情况下，在几种不同物种中研究免疫应答，以排除物种特异性的影响。一种合适的评估人体内可能存在的免疫原性的方法包括纯化人抗CHIPS IgG并确定变体多肽对此类抗体的亲和力，例如使用ELISA(见以下实施例)。
在进一步的实施方案中，本发明的多肽能够抑制嗜中性粒细胞的C5a诱导的活化。该抑制可以为部分的或完全的。因此，与缺乏该多肽时的活化相比，响应于本发明的多肽可将嗜中性粒细胞的C5a诱导的活化抑制至少10％，例如至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％且优选100％。
在本发明第一个方面的一个优选实施方案中，所述多肽呈现一种或多种(例如，全部)下述性质：
(a)抑制嗜中性粒细胞迁移(趋化性)的IC50小于lnM，优选0.5nM或更小(参见实施例)；和/或
(b)血清IgG效价为野生型CHIPS的2％或更少(参见实施例)；和/或
(c)阻断C5aR的IC50小于野生型CHIPS的四倍(less than four times that ofwildtyp CHIPS)(参见实施例)；和/或
(d)解链温度Tm高于50℃，优选高于60℃(参见实施例)。
因此，在一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。举例而言，所述多肽可由SEQ ID NO：2的氨基酸序列与附加的N端甲硫氨酸组成。
在进一步的实施方案中，所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
本发明的多肽可以由本领域技术人员熟知的方法制备(例如，见Sambrook&Russell，2000，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Third Edition，ColdSpring Harbor，New York，其以引用的方式并入本文中)。
简言之，构建的表达载体可以包含核酸分子，所述核酸分子能够在合适的宿主中表达由该核酸分子编码的多肽。
已经发展出了许多将核酸分子特别是DNA可操作地连接到载体上的方法，例如通过互补粘性末端。例如，互补均聚物束(complementary homopolymertracts)可以加至将要插入载体DNA中的DNA区段。然后将该载体和DNA区段通过互补均聚物尾部(complementary homopolymer tails)之间的氢键键合而结合形成重组DNA分子。
具有一个或多个限制性位点的合成接头提供了另一种将DNA区段与载体连接的方法。将DNA区段，例如由内切核酸酶的限制性消化而产生的DNA区段，用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I处理，所述酶通过其3’-5’外切核酸酶活性除去了突出的、3’-单链末端，并以其聚合活性填充凹陷的3’-末端。
因此，这些活性结合起来产生了平末端的DNA区段。然后将该平末端区段与较大量摩尔过量(a larger molar excess)的接头分子在酶的存在下温育，所述酶能够催化平末端DNA分子的连接，例如噬菌体T4DNA连接酶。因此，反应的产物为末端具有聚合接头序列的DNA区段。然后将这些DNA区段用合适的限制性酶切割，并连接到表达载体中，所述表达载体已经经过酶切产生了能与上述DNA区段相容(compatible with)的末端。
含有各种限制性内切核酸酶位点的合成接头可从多种来源以商业方法得到，包括从International Biotechnologies Inc.，New Haven，CN，USA。
对编码本发明多肽的DNA的理想修饰方法是利用PCR。该方法可以用于将DNA引入合适的载体，例如通过工程构建到合适的限制性位点中，或可以以本领域已知的其它有效方式修饰DNA。
在本方法中，将要进行酶扩增的DNA两侧是两个特异性引物，该引物本身将被纳入扩增出的DNA中。所述特异性引物可以包含限制性内切核酸酶识别位点，该位点能够使用本领域已知方法用于向表达载体中的克隆。
然后，将该DNA(或者在逆转录病毒载体的情况下为RNA)在合适的宿主中表达，生成包含本发明化合物的多肽。因此，可以根据已知技术，再按照包含于本文的教导进行适当的修饰来使用编码所述多肽的DNA，以构建表达载体，然后将该表达载体用于转化合适的宿主细胞以表达和生成本发明的化合物。此类技术包括在以下文件中公开的那些：1984年4月3日颁发给Rutter等人的美国专利第4440859号，1985年7月23日颁发给Weissman的美国专利第4530901号，1986年4月15日颁发给Crowl的美国专利第4582800号，1987年6月30日颁发给Mark等人的美国专利第4677063号，1987年7月7日颁发给Goeddel的美国专利第4678751号，1987年11月3日颁发给Itakura等人的美国专利第4704362号，1987年12月1日颁发给Murray的美国专利第4710463号，1988年7月12日颁发给Toole，Jr.等人的美国专利第4757006号，1988年8月23日颁发给Goeddel等人的美国专利第4766075号，和1989年3月7日颁发给Stalker的美国专利第4810648号(将它们以引用的方式并入本文中)。
编码组成本发明化合物的多肽的DNA(或者在逆转录病毒载体的情况下为RNA)可以与多种其他DNA序列结合以引入合适的宿主。该伴随DNA(companion DNA)将依赖于宿主的性质、将DNA引入宿主的方式以及是否希望保留或整合附加体。
通常来讲，DNA以正确的方向和正确的阅读框插入至表达载体中例如质粒中以作表达。如必要的话，DNA可以连接于由预期的宿主识别的适当的转录和翻译调节性控制核苷酸序列，虽然这样的控制通常在表达载体中也可以实现。然后将该载体通过标准技术引入宿主。通常来讲，不是所有的宿主都会受到所述载体的转化。因此，有必要选择转化了的宿主细胞。一种选择技术包括将一个DNA序列连同任何必需的控制元件引入该表达载体，所述DNA序列编码在转化细胞中可选择的性状(trait)，例如抗生素抗性。或者，这种可选择的性状的基因可以在另一个用于共转化预期的宿主细胞的载体上。
然后将用本发明表达载体转化的宿主细胞在本领域技术人员熟知的合适的条件下参考包含于本文的教导培养足够时间，以使该多肽表达，其后可以回收所述多肽。
许多表达系统为已知的，包括细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
载体通常包括原核复制子，例如ColE1 ori，以用于在原核细胞中的增殖，即使该载体是用于其他非原核生物细胞类型中的表达。载体还可以包含合适的启动子，例如原核生物启动子，其能够指导基因在受其转化的细菌宿主细胞例如大肠杆菌中的表达(转录和翻译)。
启动子是一种表达控制元件，由DNA序列组成，其使RNA聚合酶能够结合并使转录发生。与示范性细菌宿主兼容的启动子序列通常由质粒载体提供，所述载体包含方便的限制性位点以插入本发明的DNA区段。
典型的原核载体质粒为可从Biorad Laboratories(Richmond，CA，USA)获得的pUC18、pUC19、pBR322和pBR329，以及可从Pharmacia，Piscataway，NJ，USA获得的pTrc99A和pKK223-3。特别优选的原核载体质粒包括pET系统(Novagene)，pRSET和pHIP(Invitrogen，California，USA)。
典型的哺乳动物细胞载体质粒是可从Pharmacia，Piscataway，NJ，USA获得的pSVL。该载体利用SV40晚期启动子以驱动克隆基因的表达，其中最高水平的表达发现于T抗原生成细胞，例如COS-1细胞。
可诱导性哺乳动物表达载体的例子是pMSG，同样可从Pharmacia获得。该载体利用源于小鼠乳瘤病毒长末端重复序列的糖皮质激素诱导型启动子，以驱动克隆基因的表达。
可利用的酵母质粒载体为pRS403-406和pRS413-416，其通常可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA获得。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406为酵母整合型质粒(Yeast Integrating plasmid；YIps)，并合并了酵母选择标记HIS3、TRP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416为酵母着丝粒质粒(Ycps)。
其他载体和表达系统均为本领域已知的，并用于多种宿主细胞。
宿主细胞可以为原核或真核的。细菌细胞为优选的原核宿主细胞，并通常是大肠杆菌的菌株，比方说，例如可从Bethesda Research Laboratories Inc.，Bethesda，MD，USA获得的大肠杆菌菌株DH5和可从Rockville，MD，USA的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))获得的RR1(编号ATCC31343)。优选的真核宿主细胞包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞，优选脊椎动物细胞，比如来自小鼠、大鼠、猴或人类成纤维细胞系和肾细胞系的那些。酵母宿主细胞包括YPH499、YPH500和YPH501，其通常可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA92037，USA获得。优选的哺乳动物宿主细胞包括可从ATCC作为CRL1658获得的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293细胞即人胚肾细胞和NS0细胞。优选的昆虫细胞为可用杆状病毒表达载体转染的Sf9细胞。
以本发明的DNA构建体转化合适的细胞宿主，是通过已知方法完成的，并通常依赖于所用载体的类型。关于原核宿主细胞的转化，参见例如Cohen等(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69，2110和Sambrook等(1989)MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY。酵母细胞的转化描述于Sherman等(1986)Methods In YeastGenetics，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY。Beggs(1978)Nature275，104-109中描述的方法也可适用。关于脊椎动物细胞，用于转染这些细胞的试剂例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖或脂质体制剂，可由Stratagene CloningSystems或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD 20877，USA提供。
电穿孔法也可以用于转化和/或转染细胞，并已知在本领域中能够用于转化酵母细胞、细菌细胞、昆虫细胞和脊椎动物细胞。
例如，许多细菌种类可以通过Luchansky等(1988)Mol.Microbiol.2，637-646中描述的方法进行转化，其以引用的方式并入本文中。最大数量的转化体在以25μFD使用6250V每em对悬浮于2.5PEB中的DNA-细胞混合物进行电穿孔之后持续(consistently)回收。
以电穿孔转化酵母的方法公开于Becker&Guarente(1990)MethodsEnzymol.194，182中。
成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过已知技术鉴定。例如，可以培养在引入本发明表达构建体后产生的细胞来产生本发明的多肽。可以收获并裂解细胞，并可以使用由Southem(1975)J.Mol.Biol.98，503或Berent等(1985)Biotech.3，208描述的方法检验它们的DNA内容物中所述DNA的存在。或者，上清液中所述蛋白的存在可以通过下面描述的抗体来检测。
除了直接检测存在的重组DNA之外，当重组DNA能够指导蛋白表达时，成功的转化还能够通过已知的免疫学方法而确认。例如，表达载体成功转化的细胞生成展现适当抗原性的蛋白。
收获疑似得到转化的细胞样品，并利用合适的抗体检测所述蛋白。
宿主细胞可以是非人动物体内的宿主细胞。因此，依靠转基因的存在而表达本发明第一方面的化合物(或其结合部分(binding moiety))的转基因非人动物也包含于此。优选地，该转基因非人动物为啮齿动物例如小鼠。转基因非人动物可以使用本领域已知方法产生。
培养宿主细胞和分离重组蛋白的方法为本领域熟知的。应理解，依赖于宿主细胞，生成的本发明化合物(或其结合部分(binding moiety))可以是不同的。例如，特定的宿主细胞，例如酵母或细菌细胞，可以不含，也可以包含不同的翻译后修饰系统，所述系统可以产生可能以不同方式进行翻译后修饰的多种形式的本发明化合物(或其结合部分(binding moiety))。
优选地，本发明的化合物(或其结合部分(binding moiety))在真核系统中产生，例如哺乳动物细胞。
根据次优选的实施方案，本发明的化合物(或其结合部分(binding moiety))可利用商业上可以获得的体外翻译系统而在体外生成，例如家兔网织红细胞裂解液或麦胚裂解液(可从Promega获得)。优选地，该翻译系统为兔网织红细胞裂解液。方便地，该翻译系统可以耦合至转录系统，例如TNT转录-翻译系统(Promega)。此系统具有以下优点，即在与翻译相同的反应中从编码DNA多核苷酸产生合适的mRNA转录物。
因此，本发明的第二方面提供编码本发明第一方面的多肽的核酸分子。在一个实施方案中，该核酸分子为DNA分子。有利的是，该核酸分子进一步包含宿主细胞可识别的信号肽，所述宿主细胞即为在其中表达本发明多肽的细胞。
本发明的第三方面提供包含本发明第二方面的核酸分子的载体。在一个实施方案中，该载体为表达载体(例如来自pET系统、pRSET或pHIP的任何载体)。
本发明的第四方面提供包含本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
本发明的第五方面提供生成本发明第一方面多肽的方法，其包括在表达该多肽的条件下，培养含有本发明第二方面的核酸分子或本发明第三方面的载体的宿主细胞群体，并从中分离所述多肽。表达多肽的“分离”包括从培养基中去除一部分或全部的杂质，例如细胞碎片。在一个实施方案中，所述多肽是基本上(substantially)纯的。
本领域技术人员应理解，本发明的多肽优选地以药物组合物的形式提供，该药物组合物包含所述化合物和药学上可接受的载体。因此，本发明的第六方面提供包含本发明第一方面的多肽的药理组合物。
“药学上可接受的”包括无菌且不含热原(pyrogen free)的制剂。合适的药物载体为制药领域熟知的。载体必须为“可接受的(acceptable)”，即在某种意义上与本发明的化合物相兼容，且对其受体无害。通常，载体会是无菌且不含热原的水或盐水；然而，也可以利用其他可接受的载体。因此，“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的赋形剂”包括用于形成该制剂一部分的任何化合物，其旨在仅产生载体的作用，即本身不具有生物活性。药学上可接受的载体或赋形剂通常为安全的、无毒的，且不会在生物学或其他方面产生不良影响(neither biologically nor otherwise undersirable)。用于本文的药学上可接受的载体或赋形剂同时包括一种和多于一种的此类载体或赋形剂的情况。
本发明的多肽可以制成不同浓度，其依赖于所用化合物的效力/毒性。优选地，该制剂包含浓度为0.1μM至1mM的本发明的作用物，更优选1μM至100μM，5μM至50μM，10μM至50μM，20μM至40μM且最优选约30μM。对于体外应用，该制剂可以包含更低浓度的本发明化合物，例如0.0025μM至1μM。
本领域技术人员应理解，所述药物和作用物(即多肽)通常将与根据计划的施用途径和标准药物实践而选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用(例如，见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，19th edition，1995，Ed.Alfonso Gennaro，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA，其以引用的方式并入本文中)。
例如，所述药物和作用物可以以片剂、胶囊、胚珠制剂(ovule)、酏剂、溶液或悬浮液的形式进行口服、口腔或舌下施用，其可以包含调味剂或着色剂，用于立即释放的、延迟释放的或控制释放的应用。该药物和作用物还可以通过海绵体内注射(intracavernosal injection)的方式施用。
此类片剂可以包含以微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙(dibasic calcium phosphate)和甘氨酸为例的赋形剂，以淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯(tapioca)淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和特定的复合硅酸盐为例的崩解剂，以及以聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶为例的造粒粘合剂(granulationbinder)。此外，以硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石为例的润滑剂也可以包含在内。
相似类型的固体组合物也可以用作明胶胶囊的填充剂。就这点而言优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮液和/或酏剂，本发明的化合物可以与以下物质组合：各种甜味剂或调味剂，色素(colouring matter)或染料，乳化剂和/或悬浮剂，以水、乙醇、丙二醇和甘油为例的稀释剂，以及它们的组合。
本发明的药物和作用物还可以以胃肠外施用，例如静脉内、关节内、动脉内施用、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下施用，或者可以通过灌注技术施用。它们的最佳应用形式是无菌水溶液，其可以包含其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使该溶液与血液等渗。如必要的话，水溶液应该进行适当地缓冲(优选缓冲至pH3-9)。无菌条件下合适的胃肠外制剂的制备，可以由本领域技术人员熟知的标准药物技术容易地完成。
适合胃肠外施用的制剂包括：水性和非水性的无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与目标受体血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶，并可以在冷冻干燥(冻干)的条件下贮存，其只需要在使用前即刻加入无菌液体载体，例如注射用水。临时调配的(extemporaneous)注射溶液和悬浮液可以用上文描述的类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
对于向人类患者的口服和胃肠外施用，所述药物和作用物的每日剂量水平通常会介于每位成人1至1000mg(即大约0.015至15mg/kg)之间，以单独或分开的剂量施用。
所述药物和作用物还可以通过鼻内或通过吸入施用，并方便地以干粉吸入剂或气溶胶喷雾剂的形式递送，所述干粉吸入剂或气溶胶喷雾剂由加压容器、泵、喷雾器或雾化器呈递，其中利用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、以1，1，1，2-四氟乙烷(HFA 134A3)或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227EA3)为例的氢氟烷烃、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，其剂量单位可以通过提供定量递送的阀门而确定。该加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以包含活性化合物的溶液或悬浮液，例如利用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以额外地包含润滑剂，例如三油酸山梨坦。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如以明胶制成)可以配制成包含本发明化合物和合适的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合。
优选安排气溶胶或干粉制剂，从而使每计量药剂或“喷气”包含至少lmg的本发明化合物以供递送给患者。应理解，气溶胶的每日总剂量因患者而异，且可以以单剂量施用，或者更通常在一天中以分开的多个剂量施用。
或者，所述药物和作用物可以以栓剂或阴道栓的形式施用，或者它们可以以洗剂(lotion)、溶液、乳霜(cream)、药膏或撒粉(dusting powder)的形式施用。本发明的化合物还可经皮施用，例如，通过利用皮肤贴片(skin patch)。它们还可以通过眼部途径施用。
对于向皮肤的局部用药，所述药物和作用物可以制成包含活性化合物的合适的药膏，所述活性化合物悬浮或溶解于例如一种或多种以下物质的混合物中：矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物(polyoxyethylene polyoxypropylene compound)、乳化蜡和水。或者，它们可以制成合适的洗剂或乳霜，其悬浮或溶解于例如一种或多种以下物质的混合物中：矿物油、单硬脂山梨坦、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
适合在口中的局部施用的制剂包括：锭剂(lozenges)，其包含的活性成分存在于加香基料(flavoured basis)中，所述基料通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍芪胶(tragacanth)；锭片(pastilles)，其包含的活性成分存在于惰性基料中，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；以及漱口剂，其包含的活性成分存在于合适的液体载体中。
当药物或作用物为多肽时，可优选利用缓释(sustained-release)药物递送系统，例如微球。它们是为了减少注射的频率而特别设计的。该系统的一个例子是Nutropin Depot(重组生长激素缓释剂)，其将重组人生长激素(rhGH)包裹于可生物降解的微球中，一旦注射，其将在一段持续的时间内缓慢释放rhGH。
缓释免疫球蛋白组合物还包括脂质体包裹的免疫球蛋白。含有免疫球蛋白的脂质体由本身已知的方法制备。参见，例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-92(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4(1980)；美国专利第4485045、4544545、6139869和6027726号。普通情况下，脂质体为小型(约200至约800埃)、单层型的，其中脂质含量大于约30摩尔百分数(mol.％)胆固醇；选择的比例是为了最佳的免疫球蛋白治疗而调整的。
或者，多肽药物和作用物可以通过外科手术植入的设备来施用，其将药物直接释放于所需部位。
电穿孔治疗(EPT)系统也可以用于该蛋白和多肽的施用。对细胞递送脉冲电场的设备增加细胞膜对药物的通透性，致使细胞内药物递送的显著增强。
蛋白和多肽还可以通过电掺入(electroincorporation；EI)递送。当皮肤表面上直径高达30微米的小颗粒经受与电穿孔中所用相同或类似的电脉冲时，EI就会发生。在EI中，这些颗粒受到驱动而穿透角质层并进入皮肤的更深层。该颗粒可以用药物或基因加载或包裹，或可以简单地像“子弹”一样在皮肤上产生小孔，药物能够通过这种小孔进入。
另外一种递送蛋白和多肽的方法是热敏感ReGel注射剂(thermo-sensitiveReGel injectable)。低于体温时，ReGel为可注射的液体，而它在体温时会迅速形成凝胶状贮存器，其缓慢消蚀并溶解成已知的、安全的、可生物降解的聚合物。活性药物经过一段时间随着该生物聚合物的溶解而进行递送。
蛋白和多肽药物还可以口服递送。一种这样的系统利用了口服摄入维生素B12至体内的天然过程来共同递送蛋白和多肽。通过搭载于该维生素B12的摄入系统，该蛋白或多肽能够移动穿透肠壁。维生素B12的类似物和药物形成复合物，所述复合物同时保留该复合物的维生素B12部分对于内因子(IF)的高亲和力以及该复合物的药物部分的高生物活性。
因此，本发明的一个方面提供本发明第一方面的多肽以用于医药用途。
本发明的另一个方面提供了根据本发明第一个方面的多肽用于抑制补体5a (C5a)和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性。
本发明一个相关的方面提供本发明第一方面的多肽在制备药物中的用途，所述药物用以抑制补体5a(C5a)和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性。
过敏毒素C5a介导多种炎性反应。通过作用于C5aR，其在活化和募集吞噬细胞中起重要作用，并对入侵微生物的有效清除是至关重要的。近年来，已经明了的是，C5a还在破坏性炎性过程例如组织损伤和导致器官衰竭的严重炎性症状中起重要作用。此外，C5a还与其他几种生物过程相关，所述过程影响正常的器官发育、多种细胞谱系的早期分化以及保护细胞免受程序性死亡(见表1)。
表1
C5a-相关的生物过程
Figure BDA0000089847850000181
人甲酰肽受体(FPR)及其变体FPRL-1(FPR-样1)和FPRL-2(FPR-样2)属于七跨膜域的Gi-蛋白偶联受体。两种受体均以高水平存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中。FPR定义为高亲和力甲酰肽受体，而FPRL-1基于其仅由高浓度fMLP活化而定义为低亲和力受体。由于自然中甲酰肽的唯一来源是细菌和线粒体蛋白合成，人们认为这些受体的功能是作为介导者(mediator)将吞噬细胞募集至细菌入侵或组织损伤部位。该观点由以下观察结果所支持，即FPR敲除小鼠更容易受到单核细胞增生利斯特杆菌(Listeria monocytogenes)的感染。同样，功能失常的FPR等位基因与局限型青少年牙周炎有关。
在过去的几年中，鉴定了这些受体的大量非甲酰化肽配体(见表2)。这些配体起源于不同来源，包括随机肽文库、内生性来源(endogenous source)和病原体。它们中的一些与包括阿尔茨海默病、淀粉样变性和朊病毒病在内的人类疾病相关。因此，将甲酰肽受体在不同炎性过程的治疗中作为目标。
表2
FPR和FPRL-1激动剂和拮抗剂
表2-续
因此，将该多肽用作C5aR的拮抗剂。方便地，该多肽能够与该受体直接结合。
在一个实施方案中，该多肽用于抑制C5a受体的整体或部分功能。
在一个进一步的实施方案中，C5a受体位于嗜中性粒细胞、单核细胞和/或内皮细胞上。
因此，该多肽可以用于抑制由补体5a(C5a)诱导的嗜中性粒细胞的活化。
在一个实施方案中，该多肽用于治疗炎症，例如急性或慢性炎性反应。
术语“治疗”以及类似用语，用于本文通常表示取得希望的药理学和生理学效果。此外，它表示任何过程、作用、应用、治疗或者诸如此类的意思，其中哺乳动物，包括人类，出于改善该哺乳动物状况的目的而受到直接或非直接地医治(medical aid)。因此，治疗包括治疗性和预防性两种用途。
在另一个实施方案中，该多肽用于治疗选自下组的疾病或症状的用途：急性反应性关节炎、急性移植排斥、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、酒精性肝炎、同种异体移植、阿尔茨海默病、动脉硬化、阿尔图斯反应、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、细菌性脑膜炎、支气管癌(bronchogeniccarcinoma)、大疱性类天疱疮(bullous pemphigoid)、烧伤(burn)、心肺分流术(cardiopulmonary bypass)、心血管疾病、慢性支气管炎、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性皮炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、皮肤T细胞淋巴瘤、囊性纤维化、皮肤病(dermatoses)、中枢神经系统疾病、子宫内膜异位症(endometriosis)、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、实验性变应性神经炎(EAN)、冻伤、胃癌、肠胃病、泌尿生殖疾病、痛风、幽门螺杆菌胃炎(Helicobacter pylori gastritis)、血液透析、遗传性血管性水肿、超敏性肺炎、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis)、免疫复合物(IC)诱发性血管炎、缺血性休克、缺血再灌注发作、缺血再灌注损伤、关节疾病、(大)血管外科手术((large)vessel surgery)、金属烟热(metal fumefever)、多发性硬化、多系统器官衰竭、重症肌无力、心肌梗死、胰腺炎、腹膜炎、胸膜气肿(pleural emphesema)、心肺分流术后(CPB)炎症、银屑病(psoriasis)、重复性劳损(repetitive strain injury)(RSI)、呼吸系统疾病(respiratory disease)、类风湿性关节炎、脓毒症(sepsis)、败血性休克、鼻窦炎、皮肤病(skin disease)、中风、系统性红斑狼疮(SLE)、移植、(创伤性)脑损伤((traumatic)brain injury)、溃疡性结肠炎、尿路感染、血管渗漏综合征、血管炎和异种移植。
在一个实施方案中，该多肽用于治疗再灌注损伤的用途。例如，再灌注损伤可以与急性心肌梗死(AMI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、中风和/或器官移植相关。
在另一个实施方案中，该多肽用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的用途。
因此，本发明进一步提供治疗受试者的方法，该受试者需要使用补体5a(C5a)和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性抑制剂的治疗，该方法包括向受试者施用本发明第一方面的多肽或本发明第六方面的药物组合物。
本领域技术人员应理解，所述受试者为人。
将本发明的多肽或药物组合物以有效量对患者施用。“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效的”，用于本文表示对补体5a(C5a)和/或N-甲酰肽fMLP的生物活性产生抑制的量。这是经计算能产生预期治疗效果的活性物质的预定量。此外，还旨在表示该量足够减少且最优选防止宿主的活性、功能和反应上的临床显著性缺陷。或者，治疗有效量是足够对宿主的临床显著症状产生改善作用的。本领域技术人员应理解，化合物的量可以根据其比活性而改变。联系到所需的稀释剂，合适的剂量可以包含经计算能产生预期治疗效果的预定量的活性组合物。在制备本发明组合物的方法和用途中，提供活性成分的治疗有效量。治疗有效量可以由医药或兽医领域的普通工作人员运用此领域的已知方法根据患者的特性，例如年龄、重量、性别、症状、并发症、其他疾病等确定。
因此，在一个实施方案中，该方法包括对个体施用足以发挥C5aR和/或FPR拮抗剂作用的量的所述化合物。
本领域技术人员应理解，所述有效量的化合物或其制剂可以以单一大丸剂(single bolus dose)递送(即急性施用)，或者，更优选地，在一段时间内以多剂量递送(即慢性施用)。
本发明的变体CHIPS蛋白可以通过定向进化技术制备，例如由AlligatorBioscience AB开发的Fragment-Induced Nucleotide Diversity(‘FIND’)(片段引发的核苷酸多样性)方法。该FIND方法在WO98/58080，WO02/48351和WO03/97834中有详细描述。
因此，本发明的另一方面提供用于生成本发明第一方面的多肽的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供一种或多种编码SEQ ID NO：2的多肽或其变体的亲本多核苷酸分子；
(b)以核酸酶(例如外切核酸酶)消化所述一种或多种亲本多核苷酸分子以产生多核苷酸片段；
(c)将步骤(b)产生的所述多核苷酸片段彼此接触；和
(d)扩增彼此退火的片段以产生至少一种编码变体CHIPS多肽的多核苷酸序列，所述变体CHIPS多肽与所述一种或多种亲本多核苷酸分子编码的那些多肽相比具有改变的氨基酸序列。
技术人员应理解，步骤(a)提供的亲本多核苷酸可以为双链或单链的。然而步骤(a)中的亲本多核苷酸分子优选为单链的。
在一个实施方案中，步骤(d)包括添加具有预定变异性的寡核苷酸，以控制引入亲本多核苷酸确定区域的变异性程度。
在另一个实施方案中，该方法另外包括步骤(e)，即表达步骤(d)中产生的至少一种多核苷酸序列并在所得多肽中筛选野生型CHIPS蛋白的生物活性，例如能够抑制嗜中性粒细胞的C5a诱导的活化和/或嗜中性粒细胞的fMLP诱导的活化。
步骤(e)还可以包括检测产生的多肽同C5aR和/或FPR结合的能力。该结合特性可以使用本领域的已知技术评估，例如亲和层析和噬菌体展示。
更优选地，所述方法进一步包括步骤(f)，即在所得多肽中筛选相对于SEQID NO：2的多肽降低的免疫原性。
例如，步骤(e)可以包含以下筛选过程中的一种或多种：
(i)测定变体CHIPS多肽结合C5aR的能力。
例如，噬菌体选择可以用于筛选变体多肽与对应于C5aR的N-末端部分的肽的结合。第一轮阳性筛选之后，可以将洗脱的噬菌体扩增，并进行下一轮阳性筛选。在第二轮阳性筛选中，可以加入人抗CHIPS抗体，以吸附多余的CHIPS分子，所述多余CHIPS分子保留有对抗CHIPS抗体的结合；该方法能够增加鉴定具有较低免疫原性的克隆的可能性。
第二轮阳性筛选之后，立即将洗脱的噬菌体与包裹于磁珠的人抗CHIPS抗体进行温育。然后收集洗脱液的汇集物(pool)，如下：(1)不结合抗体的噬菌体，(2)清洗步骤后洗脱的噬菌体，(3)以低浓度CHIPS洗脱的噬菌体或(4)以高浓度CHIPS洗脱的噬菌体。可以选择来自汇集物(1)和(2)的克隆优先用于进一步筛选。
来自所选突变体汇集物的基因可以克隆至pRSET载体，且蛋白以HT形式生成。
(ii)通过表达ELISA测定每种变体CHIPS多肽的浓度。
(iii)测定变体CHIPS多肽与抗CHIPS抗体的结合活性，例如通过抑制性ELISA(inhibition ELISA)和/或人抗CHIPS抗体ELISA。
(iv)选择的变体CHIPS多肽还可以重新表达，并以表达ELISA和肽ELISA进行分析。
示范性筛选过程的进一步细节在实施例中提供(见下文)。
应理解，能够高通量操作的筛选测定法是特别优选的。实例可以包括基于细胞的测定法和蛋白质-蛋白质结合测定法。可以运用基于SPA(闪烁亲近测定法；Amersham International)的系统。
其他检测多肽/多肽相互作用的方法包括超滤与离子喷射质谱/HPLC方法或者其他物理方法和分析方法。例如，可以运用本领域技术人员熟知的荧光共振能量转移(Fluorescence Energy Resonance Transfer)(FRET)方法，其中两个荧光标记实体的结合可以通过测量荧光标记彼此靠近时的相互作用而测量。
检测多肽与大分子例如DNA、RNA、蛋白和磷脂的结合的其他方法，包括表面等离振子共振测定法(surface plasmon resonance assay)，例如由Plant等(1995)Analyt Biochem 226(2)，342-348描述的(其以引用的方式并入本文中)。这些方法可以利用经过标记的多肽，例如用放射性或荧光标记标记的多肽。
能够结合目标大分子(例如C5aR或FPR)的多肽的其它鉴定方法为这样一种方法，其中当目标大分子暴露于多肽时，多肽与所述大分子的任何结合都会被检测和/或测量。多肽与大分子结合的结合常数可以确定。多肽和大分子结合的合适的检测和/或测量(量化)方法为本领域技术人员熟知的，且可以利用例如能够进行高通量操作的方法进行，例如基于芯片的方法。名为VLSIPSTM的新技术，能够产生包含数以十万计或更多的不同分子探针的极小型芯片。这些生物芯片或阵列具有成列的探针；每个探针都分配有特定的位点。产生的生物芯片其每个位点均有例如10微米的尺寸。所述芯片可以用于确定目标分子是否与芯片上的任何探针有相互作用。在选定的测试条件下，将阵列暴露于目标分子后，扫描设备可以检测阵列的每个位点并确定目标分子是否与该位点的探针相互作用。
生物芯片或阵列能够应用在多种筛选技术中以获得有关探针或目标分子的信息。例如，可以利用肽文库作为探针以筛选药物。所述肽可以暴露于受体，并且结合于受体的探针可以得到鉴定。参见1999年2月23号颁发给Rava等人的美国专利第5874219号。
应理解，鉴定可在体内阻断C5aR和/或FPR的多肽将是理想的。因此，应理解，可以选择所述方法中应用的试剂和条件从而使所述多肽和与其相互作用的多肽间的相互作用，与体内天然存在的所述多肽和天然存在的与其相互作用的多肽间的相互作用基本相同。
本发明的示范性实施方案由以下非限制性实施例所描述，并涉及以下图示：
图1-健康人类供体(n＝168)中IgG抗CHIPS效价的频率分布。效价定义为减去背景值后吸光值为0.300的稀释度的对数。平均效价为3.62，标准差(SD)为0.72。插入值表示研究开始前的6个受试者的抗CHIPS效价(每次ELISA中以汇集(pooled)人血清为参照进行了校正的3个值的平均值(mean of 3values corrected for human pooled serum as reference in every ELISA))。
图2-志愿者血清中检测出的CHIPS的药效学。CHIPS是通过静脉内注射(iv injection)CHIPS后在不同时间点以特异性捕获ELISA而测定的。空心的标志代表安慰剂，而实心标志代表CHIPS接受者(receiver)。
图3-人抗CHIPS IgG抑制了通过捕获ELISA完成的CHIPS的检测。将回收的2.5ng·mL-1CHIPS掺入(spike into)不同浓度的汇集的人血清中并由捕获ELISA进行测量(a)。经过蛋白-G-Sepharose(琼脂糖凝胶)消耗人血清中的IgG，消除对CHIPS捕获ELISA的抑制作用(b)。将不同浓度的CHIPS与缓冲液(●)、1％人血清(来自单一供体，▲)、或经过蛋白-G-Sepharose后的1％的血清
Figure BDA0000089847850000251
温育。数据显示的是一个代表性实验。
图4-CHIPS于外周血嗜中性粒细胞的表面回收。在静脉内注射CHIPS后的不同时间点，结合于嗜中性粒细胞表面的CHIPS的存在性用兔抗CHIPS抗体检测。显示各个受试者；白色柱代表安慰剂，而黑色柱代表CHIPS接受者。数值表示在不同时间点(T＝0、15、60、240分钟和24小时之后)EDTA全血样品中门控的嗜中性粒细胞(gated neutrophils)的平均荧光(MFL)。次级FITC标记的结合物(secondary FITC labelled conjugate)的背景MFL值为6。
图5-人外周血嗜中性粒细胞上FPR(a)和C5aR(b)的表达。在静脉内注射CHIPS后的不同时间点，嗜中性粒细胞表面上存在的FPR通过FITC标记的fMLP来检测，而存在的C5aR通过FITC标记的抗CD88mAb(单克隆抗体)来检测。白色柱代表安慰剂，而黑色柱代表CHIPS接受者。数值表示门控的嗜中性粒细胞的平均荧光(MFL)。
图6-离体(ex vivo)全血fMLP刺激后外周血嗜中性粒细胞的抑制指数。在静脉内注射CHIPS后的不同时间点，将EDTA抗凝血与缓冲液和fMLP于37℃温育30分钟，并分析CD11b和CD62L二者的表达。在每个时间点，将CD11b和CD62L的表达相对于经缓冲液处理的对照样品表示(CD11b相对增高而CD62L表达相对降低)。这些数值用于计算在每个时间点每个受试者的活化指数(CD62L的相对值/CD11b的相对值)。数值以平均值±SD(标准差)的形式表示了安慰剂(○)、血清和嗜中性粒细胞CHIPS阴性(-)受试者(●)和CHIPS阳性(+)受试者(■)。
图7-循环外周血白细胞(a)和血清炎症标记物CRP(b)的水平。在静脉内注射CHIPS后的不同时间点，进行WBC的计数和CRP的测量。(1.1和1.6分别表示1天零1个小时或一天零6个小时)。将WBC的数据相对于T＝0时的数值表示，并以mg· L-1表示CRP的数据。数值为安慰剂(●)和CHIPS接受者(▲)的平均值±SD(标准差)。
图8-以循环免疫复合物(CIC；(a))和肥大细胞标志类胰蛋白酶(b)的水平量度的CHIPS的不良反应。在静脉内注射CHIPS后的不同时间点，对两种标记物进行了特异性检测。将数据相对于T＝0时的数值表示，并显示为安慰剂(●)和CHIPS接受者(▲)的平均值±SD(标准差)。
图9-静脉内注射CHIPS后不同时间点的循环外周血嗜中性粒细胞上CD11b和CD62L的表达指数。对于每个受试者，将在每个时间点上CD11b和CD62L的表达都相对于T＝0时的起始表达水平进行标准化。这些数值用于计算每个受试者在每个时间点的活化指数(CD11b的相对值/CD62L的相对值)。
图10-健康人受试者中CHIPS的免疫原性。在试验开始前和试验结束后7天和42天时在全部受试者中测定针对CHIPS的特异性IgG效价。数值为安慰剂(●)和CHIPS接受者(■)的平均值±SD(标准差)。
图11-体外CHIPS-IgG复合物诱导的嗜中性粒细胞上CD11b的相对表达。从健康志愿者中分离的嗜中性粒细胞以浓度渐增的CHIPS连同(■)或不连同(●)20μg·mL-1亲和纯化的人抗CHIPS IgG进行攻击(challenge)。为了确定FcγR的功能，将细胞用封闭mAb抗FcRII(IV-3)和F(ab’)2抗FcRIII(3G8)预处理，清洗并用于用缓冲液中的CHIPS(□)刺激或用抗CHIPS IgG(○)刺激。攻击之后，将细胞与荧光标记的抗CD11b mAb进行冰浴，以测定细胞活化的水平。将数据相对于单独的缓冲液中(不含CHIPS也不含IgG)细胞的CD11b表达来表示，并显示为平均值±SEM(n≥3)。
图12-离体CHIPS和丙氨酸取代突变体诱导的全血嗜中性粒细胞上CD11b的相对表达。以浓度渐增的野生型CHIPS(CHIPSWT)、取代了46位精氨酸的丙氨酸取代突变体(CHIPSR46A)和取代了69位赖氨酸的丙氨酸取代突变体(CHIPSK69A)对来自健康志愿者中的EDTA血进行攻击。CD11b的表达通过特异性mAb于冰上确定，并将数据相对于单独缓冲液中的细胞表示，表示为平均值±SEM(n≥3)。
图13-特异性抗CHIPS IgG效价和离体(ex vivo)全血嗜中性粒细胞的最大刺激所需的CHIPS之间的关系。用浓度渐增的CHIPS攻击来自健康志愿者的EDTA血液，并将CD11b表达作为细胞活化的指标测量。IgG抗CHIPS效价是通过ELISA确定的，并定义为给出0.300吸光度的对数血清稀释。使用下式进行回归分析：y＝截距+斜率x ln(x)。
图14-减少CHIPS与人抗CHIPS IgG的相互作用，但仍保留C5aR阻断活性的实验策略。在起始轮次的随机诱变和噬菌体选择/ELISA筛选之后进行三轮的并对减少的IgG结合和保留的C5aR肽结合进行噬菌体选择/ELISA筛选。然后分析改善的克隆中突变的结构分布，并通过理性设计导入新的突变。对减少的IgG相互作用和保留的C5aR结合和抑制对这些克隆进行进一步分析。
图15-将来自轮次1(n＝360)、轮次3(n＝320)和轮次4(n＝96)的克隆(A)和最佳克隆(B)的平均值与wt CHIPS1-121进行比较，将所述平均值测量为对人抗CHIPS31-113IgG的％结合。来自轮次4的96个克隆的分布示于C。
图16-在对减少的抗CHIPS31-113IgG结合和保留的C5aR结合进行筛选的过程中第四个多样化轮次之后鉴定的42个最佳克隆的图。选择对人C5aR显示出最高结合的10个克隆(圆圈内)用于进一步的计算/理性设计。
图17-在随机诱变、
Figure BDA0000089847850000272
和理性设计之后最佳的七个克隆的序列比对。在几乎所有克隆中位置K40、D42、N77、N111和G112发生突变并与位置K50、K69、K92、K100和K105处的突变进行不同组合。突变的位置位于α-螺旋、β1和β2折叠之间的环、β2和β3折叠之间的环、β折叠3、β3和β4折叠之间的环和β折叠4。
图18-ADC-1004突变的结构分布。ADC-1004突变的表面呈递。将CHIPS31-121(PDB编号：1XEE)的已知NMR结构用于显示ADC-1004氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和G112A的结构分布。该图是由PyMol分子作图程序(DeLano，2002.The PyMol Molecular GraphicsSystem.Delano Scientific，San Carlos)生成的。
图19-ADC-1004显示与人血清中的抗体具有非常低的相互作用。将ADC-1004在人血清中的IgG结合与CHIPS1-121、CHIPS31-113、链激酶和阿那白滞素(Anakinra)的结合通过ELISA相比较。将人血清的系列稀释添加至包被CHIPS变体或PBS的板。人血清汇集物的IgG效价示于(A)，而28个不同个体的人血清的效价示于(B)。直线代表中位值。
图20-ADC-1004是补体活化的低水平诱导剂。通过ELISA来研究由来自人血清的抗CHIPS抗体和CHIPS变体之间相互作用介导的补体片段C3c沉积。将ADC-1004介导的C3c沉积与CHIPS1-121或CHIPS31-113的C3c沉积相比较。将人血清的系列稀释添加至包被CHIPS变体或PBS的板。量化补体片段C3c的沉积并将其针对血清浓度作图。使用人血清汇集物的C3c沉积示于(A)，而使用28个不同个体的人血清在10％血清的沉积示于(B)。直线代表中位值。
图21-ADC-1004抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞活化和迁移。(A)-将Fluo-3标记的嗜中性粒细胞用浓度渐增的CHIPS变体(CHIPS1-121、CHIPS31-113或ADC-1004)预温育，并用恒定浓度的C5a(3nM)刺激。结果表示为经缓冲液处理的细胞的百分比抑制，并来自代表性实验。(B)-将钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞和一定效价的CHIPS变体(CHIPS1-121、CHIPS31-113或ADC-1004)添加至Transwell系统的上室，而将1nM C5a添加至下室。在平板读数器中测量标记的嗜中性粒细胞的迁移。结果表示为与未添加CHIPS的细胞相比的趋化性的百分比抑制。
图22-根据MR/SPECT测量ADC-1004显著减少了相对于缺血区域(风险区域)的梗死大小(p＜0.007，Mann-Whitney U检验)。
图23-ADC-1004减少微血管梗阻。
图24-来自经安慰剂(A)和ADC-1004(B)处理的动物的来自梗死区域的心肌组织针对CD18表达进行染色。切片的图像分析显示ADC-1004处理的动物中的较低染色，表明炎性细胞活化的减少。
图25-主动脉血液中的PaO2/FiO2：基线处(移植之前)，移植两个经安慰剂处理的动物(对照1和2)和两个经ADC-1004处理的受试者(ADC-10041和2)之后1、3和6小时处。
实施例A-体内CHIPS活性
材料和方法
动物模型中CHIPS毒性的临床前评价
进行了不同的临床前毒理学研究以研究CHIPS的安全性。其包括：(i)在一组由3只组成的麻醉小猎犬(beagle dog)中CHIPS对于不同心血管和呼吸参数的作用。对这些狗以大约30分钟的间隔通过历时1分钟的静脉内灌注施用0.2、2.0、20mg·kg-1的递增剂量的CHIPS。(ii)小鼠的行为(“Irwin”(欧文行为计分法))测试：将CHIPS以7.5、25和75mg·kg-1的剂量作为单次静脉内注射施用给雄性ICR CD-1小鼠(每组3只)，以评估其对一般行为的影响。另一附加组接受了同样体积(10mL·kg-1)的运载体(vehicle)(0.9％w/v无菌盐水)。(iii)大鼠中的急性静脉内毒性研究：将96.1mg·kg-1CHIPS作为单剂量(基于体积考量的最大可实现量(the maximum practically achievable due to volumeconsiderations))对5只雄性和5只雌性大鼠静脉内施用。(iv)小鼠中的急性静脉内毒性：将96.1mg·kg-1CHIPS作为单剂量对5只雄性和5只雌性小鼠静脉内施用。(v)大鼠中7天静脉内推注的初步(preliminary)毒性研究(24只雄性和24只雌性，最大剂量10mg·kg-1)。(vi)大鼠中7天静脉内推注的毒性研究(76只雄性和76只雌性，最大剂量10mg·kg-1)。(vii)狗中7天静脉内推注的剂量范围的探测研究(2只雄性和2只雌性，最大剂量20mg·kg-1)。(viii)狗中7天静脉内推注的毒性研究(12只雄性和12只雌性，最大剂量20mg·kg-1)。
包括人类志愿者
健康志愿者的纳入标准如下：(i)受试者应为男性。(ii)受试者应满足以下体重指数(BMI)范围：18-30(kg·m2)和年龄范围：18-50周岁，包括两个端值(both inclusive)。(iii)医学筛选分为两部分。受试者以抗CHIPS抗体水平进行预筛选。只有具有低效价的受试者能在用药之前的3周内进行第二部分筛选，其包括：病史，体检，血压、心率、呼吸和体温的检测，呼气酒精测试(alcoholbreath test)，血液尿液检查，心电图(ECG)和药物筛选。
入院和随访(admission and follow-up)
将选择的6位受试者(4位接受CHIPS，2位为对照)在用药的前一天收至Clinical Pharmacology Unit(临床药学单位)(Kendle，Utrecht，The Netherlands)。进行了基线测定，包括为保证安全性的血样(blood samples for safety)、尿液分析、暂时性病史(interim medical history)、体检、生命体征和ECG(心电图)。给药当日，将野生型CHIPS(0.1mg·kg-1作为单剂量的无菌冷冻等渗盐水溶液施用，所述溶液含有浓度为5mg·mL-1的CHIPS)或安慰剂(0.9％NaCl)通过历时5分钟的静脉输注施用。将受试者与遥测系统相连，从给药前30分钟开始进行心脏监测，并持续至给药开始后4小时。用Finapres连续测量受试者的血压，从给药前5分钟直至给药后30分钟。进行生命体征的测量，并在入院期间特定的时间点进行ECG。为安全起见，对所有受试者进行临床状态和实验室数据(血液学、生物化学、凝血和尿液分析)的监控。对不良事件，根据其严重程度及与CHIPS或安慰剂的关系而进行记录和表征。受试者在给药后24小时出院。给药两周后，受试者重返该单位进行评估生命体征、ECG、血和尿以及抗CHIPS抗体水平的访问。随访安排在给药6周后。
CHIPS的克隆和表达
CHIPS的克隆和表达如Haas等(2004)J.Immunol.173：5704-11所述。简言之，将不含信号序列的基因通过重叠延伸PCR克隆至pRSET载体，其直接位于肠激酶切割位点的下游(directly downstream of the enterokinase cleavagesite)及EcoRI限制位点之前。以CelLytic B Bacterial Cell lysis/ExtractionReagent(CelLytic B细菌细胞裂解/提取试剂)(Sigma)和溶菌酶按厂商说明对细菌进行裂解。组氨酸标记的蛋白以镍柱(HiTrap Chelating HP，5mL，Amersham Biosciences)根据厂商说明进行纯化，其后以肠激酶(Invitrogen)进行切割。以15％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳，Mini Protean 3系统，Bio-Rad)和考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)(Merck)检测样品的纯度和蛋白的存在。
用于静脉内使用的CHIPS的纯化
在8L发酵培养基中在由大豆蛋白胨和酵母提取物组成生长培养基中使全长CHIPS在含有CHIPS编码序列的大肠杆菌菌株中表达，所述CHIPS编码序列直接位于PelB编码序列的下游。通过两阶段阳离子交换纯化过程继以脱盐步骤从生长培养基和细胞二者中分离CHIPS。将细菌细胞团(cell pellet)重悬于包含NaCl(10mM)和DTT(10mM)的磷酸盐缓冲液(30mM；pH7.0)并冷冻。其后于37℃解冻，冰浴并进行超声处理。于15,000rpm离心后，回收了琥珀色的“细胞”上清液。将该上清液以30mM磷酸盐缓冲液稀释4倍，并过Source S-30柱。以磷酸盐缓冲液盐梯度洗脱材料，并将包含CHIPS的级分合并，并进一步利用具有小落差盐梯度(shallow salt gradient)的精制柱(polishing column)进行纯化。将包含CHIPS且纯度高于97％(由HPLC测定)的级分合并，并过Sephadex G 25脱盐柱以除去磷酸盐和过量的氯化钠。通过在Affimix树脂(Biorad)上轻轻地摇动除去内毒素，并通过超滤对制备物进行灭菌。通过HPLC-MS在Microbondapac CN-RP柱上检查纯度，该柱具有由水-TFA至甲醇-TFA组成的梯度流动相。CHIPS一般于大约13分钟时洗脱。该产物以无菌盐水稀释至所需浓度，并贮存于-20℃。
抗CHIPS抗体
利用弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvants)以重组CHIPS免疫兔子，并以弗氏不完全佐剂加强免疫(boost)。用ELISA按前述方法(见Haas等，2004，J Immunol 173(9)：5704-11)检查出血对于CHIPS的反应性。从最后的出血(finalbleeding)中以标准Protein-G(Pharmacia)亲和层析法按照厂商说明纯化IgG。对于CHIPS的特异性小鼠单克隆(抗体)(monoclonal)按所述方法生成，以Protein-G Sepharose(琼脂糖凝胶)柱纯化IgG(见Haas等，2004，J Immunol173(9)：5704-11)。
亲和纯化的人抗CHIPS IgG的分离
利用CNBR-活化的Sepharose 4B(Pharmacia，GE)按照厂商的通用说明将CHIPS1-121偶联于(couple to)固体基质上。将大约8mg的纯化CHIPS偶联于1克Sepharose(琼脂糖凝胶)上。用该材料装填一个小型柱(±1mL)，以PBS平衡并缓慢灌入稀释于PBS的静脉用人IgG(IgG-IV；Sanquin，Amsterdam，TheNetherlands)。以PBS充分洗涤该柱，并随后以pH 3的0.1M Glycine HCl(盐酸甘氨酸)缓冲液洗脱。将0.5mL的级分收集至含有50μL 1M Tris/HCl pH8的试管，用于中和。汇集具有最高OD280值的级分，并相对于PBS透析。以ELISA分析最终制备物的IgG含量。因此用PBS中2μg·mL-1的绵羊抗人IgG(ICN)包被平板，以5％BSA封闭，并同标准IgG制备物(参考血清；Boehringer)和未知样品的连续稀释一起进行温育。捕获的IgG以过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Southern)检测，并以TMB作为底物。IgG的浓度由参考曲线计算而得。
抗CHIPSELISA
微量滴定板(Greiner)以每孔50μL包含1μg·mL-1CHIPS的PBS包被，并于4℃过夜。所有清洗步骤均以PBS-0.05％Tween-20进行3次，随后于37℃温育1小时。平板以PBS-0.05％Tween-204％BSA封闭，清洗并与稀释于PBS-0.05％Tween-20 1％BSA的血清或抗体一起温育。结合的抗体以结合了过氧化物酶的物种特异性山羊抗IgG(全部来自Southern，Birmingham，USA)检测，并以TMB作为底物。以H2SO4终止反应，并在BioRad ELISA-分析仪(ELISA-reader)中测量450nm的吸光度。
捕获ELISA (Capture ELISA)
微量滴定板以50μL的包含3μg·mL-1抗CHIPS mAb 2G8的PBS包被，并于4℃过夜。将板以包含4％BSA和0.05％Tween-20的PBS封闭，清洗，并与在含1％BSA的PBS/Tween中稀释的样品及作为标准品的2倍稀释范围的CHIPS一起进行温育。随后，将板与0.33μg·mL-1兔抗CHIPS IgG和1∶5000稀释的结合有过氧化物酶的山羊抗兔IgG(Southem)一起温育。结合的抗体以TMB作为底物进行定量，以1N H2SO4终止反应，并在BioRad ELISA-分析仪上在450nm测量。
人PMN的分离
将获得自健康志愿者的血液收集至含有肝素钠(Greiner Bio-One)作为抗凝血剂的试管中。以PBS按1/1(v/v)稀释肝素化血，并以10mL Ficoll(聚蔗糖)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)和12mL Histopaque(密度1.119g·mL-1；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)进行密度梯度分离(layer onto agradient of 10mL Ficoll and 12mL Histopaque)。离心(320×g 20分钟，于22℃)后，从Histopaque相收集嗜中性粒细胞，并以含有25mM HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺(Invitrogen Life Technologies)和0.05％HSA(Sanguin)的冷RPMI1640培养液清洗。剩余的红细胞以冰冷的水(ice-cold water)裂解30秒，之后加入浓缩PBS(10×PBS)以恢复等渗。清洗后，对细胞计数并按照每毫升107个嗜中性粒细胞重悬于RPMI-1640/0.05％HSA。
嗜中性粒细胞抗原表达
将全血收集至K3-EDTA试管并置于冰上。将荧光标记的mAb的最优稀释等量分装至Falcon试管，并与50μL血液在温和搅拌下于冰上混合30分钟。以FACS-Lysing solution(FACS-裂解溶液)(BD)裂解红细胞，随后以缓冲液清洗并将细胞团重悬于含0.5％多聚甲醛(paraformaldehyde)和0.1％叠氮化物的PBS。以基于正向和横向散射作为门控(based on forward and sideward scattersfor gating)的FACsCalibur分析嗜中性粒细胞表面抗原的表达。用校准珠(Calibration beads)(Calibrite；BD)和同型匹配对照(isotype matched controls)设置合适的背景值及电子补偿。应用以下mAb和探针：APC标记的抗CD11b(CR3)(克隆44；BD)；PE标记的抗CD62L(L-选择素)(克隆Dreg 56BD)；FITC标记的抗CD88(C5aR)(克隆W17/1；Serotec)；荧光素标记的甲酰基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(“FITC-fMLP”；Molecular Probes)；兔抗CHIPS IgG(EWI)和FITC标记的F(ab)’2羊抗兔IgG(Sigma)。
全血离体刺激
将部分K3-EDTA血保存于室温下，并用于离体嗜中性粒细胞的刺激。因此，将血液与10倍浓缩的刺激物(缓冲液对照，1×10-8M fMLP)混合，并于37℃伴有温和振荡温育30分钟。将试管置于冰上以终止反应，并与抗CD11b和抗CD62L mAb混合。于冰上30分钟后，按上述方法处理样品。
CHIPS/IgG刺激的嗜中性粒细胞上的CD11b表达
将不同浓度的CHIPS(最终浓度0-9μg·mL-1)与亲和纯化的人抗CHIPSIgG(0-40μg·mL-1)于37℃温育30分钟。之后，将50μL分离的人嗜中性粒细胞(107mL-1)加入至CHIPS/抗CHIPS混合物并于37℃伴有温和振荡温育30分钟。将细胞在冰上放置10分钟，之后加入3.5μL荧光小鼠抗人CD11b(BDbiosciences，San Diego，CA)并冰浴30分钟。以RPMI 1640/0.05％HSA清洗细胞，并以200μL 0.5％多聚甲醛进行固定。
全血中细胞上的CD11b表达利用从人类志愿者中收集的血液进行，选择不同的抗CHIPS效价。由于IgG已经存在于全血中，于是仅将样品(50μL)与CHIPS(0-9μg·mL-1)于37℃温育30分钟。将样品在冰上放置10分钟，之后加入3.5μL荧光标记的小鼠抗人CD11b并冰浴30分钟。裂解红细胞并加入1mL FACS裂解溶液(1∶10稀释于水)固定4分钟。将细胞于1200rpm旋转10分钟，并以冰冷的RPMI 1640/0.05％HSA清洗细胞团。最后，将细胞重悬于175μL RPMI 1640/0.05％HSA。以FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)测量代表细胞活化的受体表达。
循环免疫复合物(CIC)
以来自Quidel(San Diego，CA)的两种不同ELISA测定CIC：CIC-C1q酶免疫测定法是基于补体结合性IC会与固定的人C1q纯化蛋白结合的原理；CIC-Raji细胞取代酶免疫测定法通过利用mAb测量含有IC的C3活化片断，所述mAb特异性结合C3的iC3b、C3dg和C3d活化片断，其方式类似于典型的Raji细胞CR2结合反应。合并两种测定法的数据，并将结果相对于时间为0时的数值表示。
血清类胰蛋白酶的浓度
利用来自Pharmacia Diagnostics(Woerden，The Netherlands)的ImmunoCAPTM技术在UniCAP R-100上测量源于血清的类胰蛋白酶(α和β两种形式)。健康对照的正常几何平均值(normal geometric mean)为5.6μg·L-1(Pharmacia)。结果相对于时间为0时的数值表示。
研究方案及其任何修正均通过了独立的伦理委员会(independent ethicscommittee)的批准。本研究依照欧共体(European Community；EC)的良好药品临床试验管理规范(Good Clinical Practice)(GCP)和“赫尔辛基宣言”(‘Declaration of Helsinki’)(2000)的规则施行。
结果
CHIPS在临床前毒理学研究中未显示出明显的毒性
CHIPS的施用在所有的毒理学动物研究中，在以下方面均未引起与CHIPS相关的毒理学显著变化：临床观察、体重、摄食(food consumption)、血液学、凝血、血液化学参数、检眼镜检查、心电图、宏观或显微病理或行为。
在麻醉的小猎犬中检查了CHIPS对于各种心血管和呼吸参数的影响。在接受低剂量CHIPS(0.02和2mg·kg-1)的犬中，与输注运载体(等渗盐水)相比时没有对心血管和呼吸有影响的证据。以20mg·kg-1CHIPS静脉内施用后，在开始施用后大约1分钟时记录到了平均动脉血压的短暂降低(～40％)。开始给药后大约5分钟内，平均动脉血压恢复至给药前水平。对血压的影响与心率短暂的、不一致的(inconsistent)变化相符。在CHIPS首次施用之后的大约30分钟，对一只犬施用重复静脉内的CHIPS剂量(20mg·kg-1)。记录到的类似于第一剂后的对心肺参数的短暂影响在该CHIPS重复施用后不显著。然而，二次施用产生了延长的平均动脉血压降低，其在二次施用后约30分钟达到了最大18％的降低。仅在这只动物中，CHIPS重复施用后的12分钟，出现了与某些形式的轻微过敏反应一致的全身性皮肤反应(generalized skin reaction)。
该研究结果表明在人类受试者中，在所用剂量范围下(0.1mg·kg-1)不太可能观察到对心肺的影响。此外，可能发生的任何影响都预计为短暂和可逆的。
抗CHIPS抗体效价的分布
由于金黄色葡萄球菌是一种常见细菌且CHIPS基因存在于大多数金黄色葡萄球菌菌株中，因此我们假定所有个体均具有循环抗CHIPS抗体。因此，我们检测了健康志愿者血清中的抗CHIPS IgG的量。图1表示了一组168名健康人类志愿者中抗CHIPS IgG效价的分布。在测量的这组样品中，没有效价低于所用ELISA的检测限。认为研究的群体代表一般群体。从该数据得出的结论是，一般群体中超过99％的人具有可检测出的抗CHIPS IgG血清水平。图1还显示了试验中包括的受试者的效价。
静脉内施用的CHIPS的药物代谢动力学
在CHIPS施用后的四个不同时间点，以ELISA测定了CHIPS血清效价(图2)。仅在具有低效价抗CHIPS抗体的接受CHIPS的个体中(受试者104和105)观察到了CHIPS效价的增加。我们确定了人血清对CHIPS ELISA的影响。将CHIPS掺入不同浓度的汇集的人血清，并由捕获ELISA进行检测。图3a显示，血清抑制了捕获ELISA。利用蛋白G-琼脂糖凝胶(protein G-sepharose)柱消耗IgG消除了抑制作用(图3b)。
CHIPS体内结合FPR和C5aR
CHIPS以高亲和力结合嗜中性粒细胞上的FPR和C5aR，且可以由抗CHIPS抗体按照前文对小鼠mAb的描述检测。CHIPS施用后的不同时间点，存在于嗜中性粒细胞表面的CHIPS的量使用兔抗CHIPS抗体测定，如图4中所示。只有在具有低抗CHIPS抗体效价的受试者中(受试者#104和#105)检测到了嗜中性细胞表面的CHIPS。此外，在这两个受试者中，对CHIPS的检测与抗CHIPS抗体效价呈负相关。由于存在于血清中的抗CHIPS抗体干扰了(interfere with)CHIPS的直接检测，因此，该直接检测的阴性结果并不能排除CHIPS结合了受体。然而，结合于FPR和C5aR的CHIPS干扰了通过抗FPR和抗C5aR抗体对这些受体的检测，如前文所述(见Veldkamp等，2000，InfectImmun 68(10)：5908-13)。图5显示通过FITC-fMLP和抗C5aR抗体结合而测定的FPR和C5a受体的表达。具有低抗CHIPS抗体效价的受试者显示FPR和C5aR表达的降低，表明CHIPS已经占据了所述受体。在具有高抗CHIPS抗体效价的受试者中(103和106)，FPR和C5aR的表达没有变化，表明抗CHIPS抗体干扰了CHIPS结合受体。
依赖于抗CHIPS抗体效价的CHIPS对于fMLP诱导的嗜中性粒细胞活化 的离体抑制
细胞活化时，出现了CD62L表达的降低和CD11b表达的增高。为了检测静脉内CHIPS对于嗜中性粒细胞抑制的影响，我们离体测量了fMLP诱导的CD62L和CD11b的表达。在全血测定中，将嗜中性粒细胞用fMLP离体活化。如图6所示，静脉内施用的CHIPS能够离体抑制fMLP诱导的嗜中性粒细胞活化。这种抑制仅在具有可检测的CHIPS血清浓度的受试者中(受试者104和105)观察到。
CHIPS引发的不良反应
在CHIPS施用后直接观察到了严重的副作用。大部分不良事件于受试者106中观察到，其包括：肌肉疼痛、呼吸困难、腹痛、呕吐、肌肉痉挛、寒战、出汗、眼眶水肿(edema orbita)和眩晕。这些症状的最终诊断为类过敏性反应。对该受试者以氯马斯汀(clemastine)、IV液(IV fluids)、曲马多(tramadol)和泼尼松龙(prednisolone)治疗。
报道的其他不良事件包括：心悸、发热(feeling warm)、胸痛、面红(flushing)、发寒、腿部疲劳、体位性头晕(postural dizziness)、发烧、头痛、恶心、视力模糊。除了受试者106的严重背痛之外，受试者103与105报道有轻微背痛。受试者104报道有肌肉痉挛。受试者104和105在用药后大约4小时开始观察到高达38.6℃的发烧，并在第一天晚间消退。
血压没有变化，且ECG未见异常。除了受试者106(89％氧饱和)在上述不良事件期间的间歇性低读数，未观察到氧饱和的异常。接受安慰剂的受试者未报道有不良反应。
静脉内CHIPS引发了白细胞减少和CRP水平升高
如图7所示，我们测量了给药前和给药后的白细胞计数(WBC)和C反应性蛋白浓度(CRP)。在接受CHIPS的受试者中，CHIPS引发了短暂的白细胞减少，其在2天内消退。此外，用药后的第一天开始产生CRP浓度的升高，其在第15天随访过程中对受试者进行筛选时恢复到了正常水平(图7b)。
循环免疫复合物和升高的血清类胰蛋白酶表明类过敏性反应
我们测量了循环免疫复合物的量和血清类胰蛋白酶浓度。静脉内施用CHIPS诱导了接受CHIPS的受试者体内免疫复合物的形成(图8a)。我们还观察到了类胰蛋白酶血清浓度的升高，其于给药后大约10分钟时达到最高(图8b)。
CHIPS诱导了体内细胞活化
为了研究CHIPS对于细胞活化的直接作用，我们测定了嗜中性粒细胞上CD62L和CD11b受体的表达。受体表达的测量于收集血样后立刻进行，而无需任何进一步的细胞刺激。受试者104、105和106显示了嗜中性粒细胞上CD62L表达的减低和CD11b表达的升高，代表了体内细胞活化(图9)。
CHIPS施用后抗CHIPS抗体效价的升高
蛋白的免疫原性的特点是引发抗体的能力。我们测定了健康人类受试者中CHIPS的免疫原性。接受静脉内CHIPS的受试者表现出了抗CHIPS IgG的增加(图10)。
体外CHIPS对于嗜中性粒细胞的活化依赖于抗体浓度
我们研究了体外CHIPS-IgG复合物对于嗜中性粒细胞的活化。将不同浓度的CHIPS与20μg·mL-1人亲和纯化的抗CHIPS IgG一起预温育，并用于刺激分离的嗜中性粒细胞，如图11所示。亲和纯化的抗CHIPS IgG在缺乏CHIPS的情况下不能活化嗜中性粒细胞(未显示数据)。CHIPS-IgG复合物能够以依赖剂量的方式刺激嗜中性粒细胞。图11还显示，存在细胞最大活化所需要的最优CHIPS浓度。CHIPS-IgG诱导的细胞活化由FcR封闭抗体完全抑制。因此，结论是，这种测定法中CHIPS-IgG诱导的细胞活化是由Fc受体介导的。
CHIPSR46A(第46位精氨酸用丙氨酸取代)和CHIPSK69A(第96位赖氨酸用丙氨酸取代)为两种具有单氨基酸取代的CHIPS突变体，如先前所述(见Haas等，2005，J Mol Biol 353(4)：859-872)。如通过ELISA测量，这些CHIPS突变体显示出了对纯化的抗CHIPS IgG降低的亲和力(未显示数据)。当用于全血细胞活化测定法时，这些突变体与野生型CHIPS相比具有较低的细胞活化潜能(图12)。对于CHIPSR46A和CHIPSK69A，与野生型CHIPS相比，需要高10倍的浓度才能达到相同的细胞活化。这表明，仅次于抗体效价，与抗原的反应性水平决定了细胞活化的程度(amount)。
CHIPS对于嗜中性粒细胞的离体活化也依赖于抗CHIPS IgG浓度
我们在全血离体测定法中测量了CHIPS对于嗜中性粒细胞活化的作用。由于抗CHIPS抗体已经存在于全血中，因此并未将CHIPS与亲和纯化的抗CHIPS IgG一起预温育。将不同浓度的CHIPS加入来自人类志愿者的血液中，并测量代表细胞活化的CD11b表达。图13表明了通过在来自8名具有不同抗CHIPS IgG效价的健康志愿者的全血中的CD11b表达，测得了嗜中性粒细胞最大刺激所需的CHIPS浓度。如体外实验所示，嗜中性粒细胞的最大刺激依赖于CHIPS/抗CHIPS的比率。这也在离体测定法中观察到。当存在更高的抗CHIPS浓度时，嗜中性粒细胞的最大刺激需要更高的CHIPS浓度。
讨论
金黄色葡萄球菌的趋化抑制蛋白是人C5a受体和甲酰肽受体非常有力的抑制剂。两种受体，尤其是C5aR，均在多种不同炎性疾病的治疗中被描述为重要靶物。CHIPS有效抑制C5aR和FPR的能力，使该蛋白成为这些疾病治疗中的候选治疗剂。此外，针对C5aR和FPR的活性位于CHIPS分子不同区域的事实，使得靶向特定受体成为可能(见Haas等，2004，J Immunol173(9)：5704-11)。CHIPS蛋白的人类特异性，如从对人类细胞的活性与对小鼠细胞活性的30倍差异中所显而易见的，阻碍了在动物模型中对CHIPS活性的体内评估(见de Haas等，2004，J Exp Med 199(5)：687-95)。
我们研究了一组6位健康人类受试者中金黄色葡萄球菌的趋化抑制蛋白的活性、药物代谢动力学和毒性。在不同动物模型中施用高浓度CHIPS(小鼠中高至96.1mg·kg-1的单次静脉内剂量)的临床前毒理学研究未显示显著的毒性迹象。因此，以0.1mg·kg-1的起始剂量静脉内施用5分钟被认为是安全的。
由于金黄色葡萄球菌是一种常见细菌且CHIPS蛋白在大多数金黄色葡萄球菌菌株中均有表达，因此我们假定所有个体均具有抗CHIPS抗体。通过在对168份从人类志愿者随机采集的血清的汇集物中筛选抗CHIPS IgG效价证实了这点。使用小鼠单克隆抗体的实验表明，这些单克隆抗体可以在体外干扰CHIPS的活性(见Haas等，2004，J Immunol 173(9)：5704-11)。因此，有理由猜测，接受CHIPS蛋白的健康受试者中存在的抗CHIPS抗体同样干扰活性。
对人受试者施用CHIPS是研究体内活性和药物代谢动力学的独特机会。静脉内施用0.1mg·kg-1CHIPS后，我们测量了CHIPS血清浓度。图2表示了给药后不同时间点的CHIPS血清浓度。在接受了CHIPS蛋白的四名受试者中，仅有两名测量到了增加的CHIPS血清浓度(受试者104和105)。有趣的观察现象是，这两个个体同时显示最低的抗CHIPS IgG效价。这表明，抗CHIPS抗体干扰了对CHIPS的检测。因此，由于这种干扰的存在，在受试者104和105中测量的CHIPS血清浓度是被低估的。基于这些数据，我们计算出CHIPS在体内的预测半衰期至少为1.5小时。
当检测嗜中性粒细胞膜表面存在的CHIPS量时，我们观察到与抗CHIPSIgG效价之间的相同关系。仅在来自受试者104和105的嗜中性粒细胞表面能够检测到CHIPS。此外，还显示这些CHIPS分子占据FPR和C5aR，其原因是在这些个体中通过抗FPR和抗C5aR抗体对两种受体的检测中存在下调。同样，以fMLP刺激时，只有来自受试者104和105的嗜中性粒细胞表现出降低的活化。不幸的是，用C5a刺激的实验因技术原因失败。然而，这些实验清晰地表明，静脉内施用的CHIPS对于离体嗜中性粒细胞活化具有抑制作用，且该作用由抗CHIPS抗体所抑制。
在临床前动物毒性研究中未发现相关的不良反应。在人类受试者中施用的0.1mg·kg-1CHIPS为2名受试者(受试者103和104)所耐受，在受试者105中中度耐受，而受试者106在CHIPS输注后直接产生了严重的症状，其诊断为类过敏性反应。我们测量了所有受试者中的嗜中性粒细胞CD11b表面表达以研究CHIPS诱导的细胞活化。对受试者104、105和106观察到了细胞的活化。在接受CHIPS的一组受试者中，在给药后第2天时C反应性蛋白相对于对照有所增加。
肥大细胞，其为存在于外周组织的白细胞，在炎症和速发型变应反应中具有核心作用。从分泌性颗粒释放的类胰蛋白酶是肥大细胞脱粒的代表性特征。血清肥大细胞类胰蛋白酶浓度在过敏性反应和其他变应性症状中增加(见Payne&Kam，2004，Anaesthesia 59(7)：695-703)。CHIPS施用后观察到的类过敏性反应，通过代表肥大细胞活化的类胰蛋白酶水平的增加所确认。在类胰蛋白酶水平的升高之前是循环免疫复合物的增加。免疫复合物能够通过FcγR交联和通过补体活化以及C5a的生成而活化肥大细胞(见Jancar&Crespo，2005，Trends Immunol 26(1)：48-55)。
体外实验确认了在抗CHIPS抗体存在下CHIPS的细胞活化特性。CHIPS诱导的嗜中性粒细胞活化，通过阻断FcγRII和FcγRIII封闭抗体而受到抑制。这表明，CHIPS诱导的这些细胞的活化，最有可能是由CHIPS/抗CHIPS免疫复合物引起的。当我们在检验的受试者中寻找循环免疫复合物时，在接受静脉内CHIPS的受试者中还发现了免疫复合物的增加。抗CHIPS抗体效价和CHIPS诱导的细胞活化间的关系在体外和离体实验中均很清晰。这与受试者103中观察到的形成对比，所述受试者103具有最高的抗CHIPS抗体效价，但却只报告了轻微的不良反应。当然，研究的群体仅限于4个受试者，且有大量不同的因素影响个体内不良反应的发生和感知(perception)。此外，体外实验证实了存在诱导细胞活化的最优抗体浓度。非常高的抗CHIPS抗体效价有可能减少了类过敏性反应的发生。早期研究表明，CHIPS不结合除表达C5aR和FPR的细胞外的其他细胞，且没有证据显示CHIPS直接活化细胞。虽然抗体在细胞活化中明显发挥了作用，但少数观察结果和体内的复杂性均阻碍了对这些数据的解释。
我们证实了对于抗CHIPS IgG具有降低的亲和性的两个CHIPS突变体(CHIPSR46A和CHIPSK69A)在体外显示出了降低的细胞活化潜能。尽管抗CHIPS抗体具有中和作用，我们依然能够检测出CHIPS蛋白显著的血清浓度。此外，在循环嗜中性粒细胞上检测出了静脉内施用的CHIPS，其结合于FPR和C5aR，并能够在离体用fMLP刺激时抑制嗜中性粒细胞响应。这表明，CHIPS蛋白能够在体内找到它的目标，即FPR和C5aR。
我们发现，CHIPS蛋白在血清中的半衰期约为1.5小时。此外，还观察到在细胞表面结合于其受体的CHIPS具有相同的半衰期，表明其具有相同数量级的功能半衰期。这表明，CHIPS蛋白不是立即从血液中清除的。通过引入点突变有可能延长CHIPS蛋白半衰期，例如已经对链激酶所显示的，其为一种在急性心肌梗死中用于溶栓的蛋白药物(见Wu等，1998，Appl EnvironMicrobiol 64(3)：824-829)。然而，1.5小时的半衰期意味着在停止给药时任何(免疫抑制)效果都将迅速消失。这相对于以Infliximab为例的具有较长半衰期的抗体药物而言可以是一个优点，所述具有较长半衰期的抗体药物与升高的感染发生率相关(见Listing等，2005，Arthritis Rheum 52(11)：3403-3412；Crum等，2005，Medicine(Baltimore)84(5)：291-302)。
实施例B-定向进化CHIPS以生成具有降低的与人抗体的相互作用的功能性变体
摘要
金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(CHIPS)是结合并阻断C5a受体(C5aR)和甲酰化肽受体，从而抑制与炎症相关的免疫细胞募集的蛋白质。如果CHIPS与存在的人抗体具有较小的反应性，则其应可用作抗炎药。因此，我们对CHIPS基因应用了定向进化和计算/理性设计，从而生成展示与人IgG较低相互作用但仍保留生物活性的新CHIPS变体。该优化是以四个轮次进行的：一个轮次的随机诱变以增加CHIPS基因的多样性和三个轮次的通过FragmentINduced Diversity
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的DNA重组。每个轮次通过噬菌体选择和/或ELISA来筛选减少的与人IgG的相互作用和保留的C5aR结合。人抗CHIPSIgG的平均结合随着每轮进化而减少。对于进一步优化，通过理性设计，基于在定向进化过程中鉴定的突变，导入新的氨基酸取代。最终，可鉴定出七个具有与人IgG较低相互作用并保留C5aR阻断能力的CHIPS变体。
背景介绍
炎症是组织对损伤或病原体感染的反应。将免疫细胞和可溶性分子吸引至损害或感染位点起始愈合过程。尽管引起炎性应答的能力对生存至关重要，但为了健康亦需要控制炎症的能力。抗炎药旨在阻断炎症中的关键事件以供治疗具有过量或不受控的炎症的疾病。此类药物的实例为批准供治疗类风湿性关节炎的
许多细菌发展出回避人免疫系统的策略，例如通过避免识别，或通过分泌中和免疫系统介导的抗菌作用的蛋白质。金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(CHIPS)是14.1kDa的蛋白质，通过结合并阻断C5a受体(C5aR)和甲酰化肽受体，其为与炎症相关的免疫细胞募集和活化的强力抑制剂(De Haas等，2004；Postma等，2004)。如此，CHIPS是有望用于治疗几种炎性疾病例如脓毒症(Rittirsch等，2008)或缺血-再灌注损伤和免疫复合物病(Heller等，1999)的抗炎蛋白。然而，多数个体具有一定效价的预先形成的对CHIPS具特异性的抗体(Wright等，2007)。这些抗体可中和CHIPS的功能或诱导免疫反应，因此CHIPS分子可受益于进行使其作为药物在人循环中良好作用的优化。
定向进化是已确立的供改进蛋白质的方法。其已用于改进多种蛋白质功能如稳定性、活性或亲和力(Johannes等，2006)。重要的是，对于蛋白质疗法的开发，证明定向进化对于产生具有增强的治疗潜力的蛋白质变体是有用的工具(Yuan等，2005)。所述定向进化方法是特别有效的，因为其并不需要对蛋白质结构的先验知识。替代使用效率低下并耗费时间的基于定位诱变的方法，可进行数轮基因重组和高通量筛选以鉴定改进的变体。该过程可反复进行，且有益的突变会累积，同时对所需性质不需要的突变会被排除，如(Yuan等，2005)和(Zhao，2007)中所综述。
几种用于定向进化的不同方法已描述于文献中；其中包括DNA改组(Stemmer，1994a；Stemmer，1994b)和Staggered Extension过程(StEP)(Yuan等，2005；Zhao等，1998)。另一种称为Fragment INduced Diversity
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的DNA重组技术之前已证明可用于优化羧肽酶U的热稳定性(Knecht等，2006)和IL-1受体拮抗剂的活性(Dahlen等，2008)。
尽管已成功地利用定向进化鉴定新的和改善的蛋白质变体，该类型技术的限制是无法筛选蛋白质的整个序列空间。然而，如果将定向进化与计算工具和理性设计结合，可更有效地探索序列空间(Wong等，2007；Zhao，2007)。
在本实施例中，将
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与CHIPS基因的理性/计算设计组合，旨在构建与现存特异性人IgG具有较低相互作用的新的蛋白质变体。改进的CHIPS分子应表征为与现存抗体的减少的反应性，但仍保留对C5aR的活性。因此，与筛选减少的IgG相互作用的过程平行监视受体结合。如此，我们能够分离与人抗CHIPS IgG具有显著减少的相互作用但仍保留C5aR阻断活性的新CHIPS变体。
材料和方法
重组蛋白的克隆、表达和纯化
如前所述克隆、表达和纯化了野生型(Wt)CHIPS1-121(De Haas等，2004)。具有截短C端的CHIPS(CHIPSΔC)长为112个氨基酸，作为克隆的结果，具有两个额外的无关氨基酸包含于表达蛋白的C末端(CHIPS1-112)。通过截短和定位诱变从编码wt全长CHIPS1-121的基因构建编码CHIPS ΔC及其相应单突变体K61A、K69A和K100A以及CHIPS ΔN/C(CHIPS31-113)的基因。然后将这些CHIPS变体如上所述克隆和表达。将单突变体用于Haas等(Haas等，2005)的结构分析，但还对抗CHIPS IgG结合进行筛选，且突变体K61A、K69A和K100A显示了减少的结合(数据未显示)。
将选自该研究中的文库的CHIPS变体以相同方式表达，但从包涵体纯化(Gustafsson等，2009)或通过Expressway Cell-Free E.coli Expression System(Invitrogen，Carlsbad，CA)根据生产商的推荐进行表达。
文库构建
随机诱变
为了在轮次1(参见图14)中构建CHIPS变体的不同文库，使用两种不同的随机诱变方法以构建总共四个文库。如前所述进行易错PCR(Leung等，1989)。构建了一个具有高突变频率的文库(文库1.1)和一个具有低突变频率的文库(文库1.2)。使用引物(Fw：5’-TCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTTACTTTTGAACCG-3’[SEQ  IDNO：3]和Rev：5’-GCCTGCGGCCGCAGATCTACCATTAATTACATAAG-3’[SEQ ID NO：4])在7.5mM MgCl2和0.64mM MnCl2存在下进行了20个循环的PCR。添加2.5U AmpliTaq Thermostable DNA聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)，并使用如下程序进行反应：94℃进行5分钟/(94℃进行30秒/55℃进行30秒/72℃进行40秒)进行20次并最终在72℃进行10分钟延伸。如生产商推荐使用GeneMorph II(Stratagene，La Jolla，CA)。将10pg DNA(CHIPS ΔC和相应的K61A、K69A和K100A单突变体的混合物)用于设计低突变频率文库(文库1.4)而将1ng DNA用于更高突变频率的文库(文库1.3)。PCR反应包含如上所述的引物，而PCR程序为95℃进行2分钟/(95℃进行1分钟/60℃进行1分钟和72℃进行1分钟)进行40次并最终在72℃延伸10分钟。为了增加1ng文库中的突变频率，对其进行再一轮的Genemorph II诱变。此时，PCR反应中DNA的量为10ng。在纯化之后，将PCR产物根据生产商的推荐亚克隆入pGEM-T载体(Promega，Madison，WI)，并分析序列和评估碱基交换。
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在轮次2至4进行
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重组以构建重组克隆的不同文库，如例如专利EP1341909和EP1504098中所述。简言之，通过使用一个生物素化的和一个常规的引物生成PCR产物来制备单链DNA。将所述PCR产物固定化于含有链霉抗生物素结合的磁性珠的柱上(Miltenyi Biotec GmbH，BergischGladbach，Germany)，并置于μMACS分离器的磁场中。将PCR产物用0.1MNaOH变性，并收集洗脱的非生物素化DNA链，并通过琼脂糖凝胶电泳使用Recochips(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)依照生产商的推荐进行纯化。
Figure BDA0000089847850000443
实验是通过分别对200ng有义和反义ssDNA在不同试管中在缓冲液中如生产商所推荐用外切核酸酶I(Exo I)(New England Biolabs，Ipswich，MA)(100U/μg DNA)片段化10分钟，用外切核酸酶V(Exo V)(USB，Cleveland，OH)(25U/μg DNA)片段化45分钟和用外切核酸酶VII(Exo VII)(USB)(10U/μg DNA)片段化30分钟来起始。将从外切核酸酶消化所得的ssDNA片段在不添加引物的PCR样反应中重组，然后使用标准PCR实验方案进行扩增。在纯化之后，将PCR产物依照生产商的推荐亚克隆入pGEM-T载体(Promega)并分析序列。
平板形式的蛋白质表达
将通过随机诱变或
Figure BDA0000089847850000444
构建的CHIPS文库克隆入经修饰的pRSET B载体(Invitrogen)的BbsI和BglII位点中以供在大肠杆菌中表达。将文库转化入大肠杆菌BL21star DE3pLysS(Invitrogen)，铺板于具有补充50μg/ml氨苄西林和34μg/ml氯霉素的LB琼脂的20cm Qtray板，并在37℃温育过夜。翌日，使用菌落挑取机器人挑取大肠杆菌菌落并接种于含有150μl补充有50μg/ml氨苄西林和34μg/ml氯霉素的Luria Broth(LB)的96孔圆底板中。将培养物在37℃以78％湿度并在Multitron平板振荡器(Infors HT，Bottmingen，Switzerland)中以700rpm振荡温育过夜。从过夜培养物通过1/100稀释至具有50μg/ml氨苄西林的新鲜培养基来制备日间培养物(day culture)，并如上所述在37℃继续温育。为了诱导蛋白质表达，在三小时之后将0.5mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)添加至培养物，然后再将培养物培养三小时。通过离心沉淀大肠杆菌培养物，并将沉淀在-20℃冷冻。通过在含完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche，Basel，Switzerland)、25U/ml Benzonase(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)和1KU/ml rLysozyme(EMD Chemicals，Darmstadt，Germany)的PBS 0.05％Tween20中冻融所述大肠杆菌沉淀来制备裂解液，并在室温振荡温育10分钟。
定点诱变
定点诱变是使用QuikChange II诱变试剂盒(Stratagene)依照生产商的推荐用携带特定突变的引物进行的。验证新的CHIPS变体的序列，并将其转化入大肠杆菌BL21Star(DE3)pLysS(Invitrogen)以供蛋白质表达。
人抗CHIP31-113IgG的亲和纯化
将纯化的CHIPS31-113偶联于经CNBr活化的Sepharose 4B(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)，并依照生产商的指示装填Tricon 5/20柱(Amersham Biosciences)。亲和纯化是在
Figure BDA0000089847850000451
Prime系统(AmershamBiosciences)上依照生产商的实验方案进行的。将总人IgG(1g)(IV-IgG)(Sanquin，Amsterdam，The Netherlands)在柱上运行，然后用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱结合的人IgG，并用1M Tris，pH8.0中和pH。汇集含有蛋白质的洗脱级分，并在PD-10柱(Amersham Biosciences)上将缓冲液变为PBS。
噬菌体选择
将随机诱变文库和
Figure BDA0000089847850000452
文库克隆入噬菌粒pFAB75(Johansen等，1995)的SfiI和NotI位点，并转化入大肠杆菌TOP10F′(Invitrogen)以供在噬菌体颗粒上表达。依照标准实验方案使用VSCM13(Stratagene)作为辅助噬菌体(Cicortas Gunnarsson等，2004)制备噬菌体储备。正选择是对由氨基酸7-28组成的具有硫酸化的酪氨酸的生物素化的C5aR肽(生物素-C5aR肽)(AnaSpec，San José，CA)在终浓度10-7M和链霉抗生物素包被的磁性Dynabead(Invitrogen)上进行的。将所述混合物在室温旋转温育1小时，然后在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 0.05％Tween 20(选择缓冲液)中充分洗涤。肽结合剂的洗脱是用1M甘氨酸0.1％BSA，pH2.2进行的，然后添加1M Tris pH9.0以中和洗脱液。然后如上所述将该选择方案重复一次。就在第二轮正选择之后，对CHIPS噬菌体储备进行一轮对人抗CHIPS31-113IgG结合的负选择。将包被人抗CHIPS31-113IgG的Estapor 0.83μm磁珠(Bangs-Laboratories Inc.，Fishers，IN)在选择缓冲液中洗涤三次，然后在选择缓冲液中在室温旋转封闭1小时。将来自正选择的洗脱液添加至珠，并将其在室温温育另外15分钟。在磁体上分离之后，保存上清，并将其用于感染指数生长中的大肠杆菌TOP10F′，并从该大肠杆菌纯化噬菌粒。
ELISA
在整个研究中，将ELISA用于筛选并表征结合。将Maxisorb透明或白色96或384孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)在4℃用PBS中的特异性蛋白质或抗体包被过夜。如果没有不同的描述，温育是以100或25μl的体积在室温进行1小时，总是接着用PBS 0.05％Tween 20洗涤三次。使用Super Signal ELISAPico Chemiluminescent Substrate(Pierce，Rockford，IL)并测量发光。
蛋白表达分析
对于表达蛋白的量化，将板用3μg/ml识别CHIPS氨基酸24-30的肽的单克隆抗CHIPS抗体2H7包被(Haas等，2004)。将板在含3％奶粉的PBS0.05％Tween 20中封闭，洗涤，并用来自ΔC CHIPS变体的裂解液的稀释来温育。用3μg/ml多克隆兔抗CHIPS N-端IgG(通过用KLH偶联的对应于CHIPSN端氨基酸1-14的合成肽对兔免疫接种产生的IgG)和辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG(Southem Biotech，Birmingham，AL)检测结合。
抗CHIPS IgG结合分析
对于人抗CHIPS31-113IgG对CHIPS ΔC变体结合的检测，将板用大肠杆菌裂解液如针对蛋白表达分析所述进行包被、封闭和温育。添加亲和纯化的人抗CHIPS31-113IgG，并用山羊抗人IgG HRP(Jackson ImmunoResearch，WestGrove，PA)检测结合。在最初筛选过程中，对CHIPS裂解液进行单点测量，并将其与Wt CHIPS1-121的滴定曲线比较。将结果与来自表达ELISA的结果相关联。在之后的筛选/表征中对有限数量的变体绘制完整的滴定曲线。
肽结合分析
为了测量CHIPS变体对C5aR肽的结合，包被了5μg/ml链霉抗生物素(Sigma-Aldrich)。此外，在洗涤并封闭板(PBS 0.05％Tween 20中的2％BSA)之后将生物素-C5aR肽(Anaspec)添加至0.3μg/ml的终浓度。然后用CHIPS裂解液温育板，并用1μg/ml mAb 2H7和HRP-结合的兔抗小鼠IgG(Dako，Glostrup，Denmark)进行检测。
与CHIPS1-121竞争的抗CHIPS IgG结合分析
将CHIPS变体的五倍稀释系列在室温在聚丙烯板(Nunc)中用60ng/ml亲和纯化的人抗CHIPS31-113多克隆IgG预温育2小时。纯化的wt CHIPS1-121包被于ELISA板中。在用PBS-0.05％Tween-20中的4％BSA封闭之后，将IgG/CHPS变体混合物添加至板，并在室温进一步温育2小时。用山羊抗人IgGHRP和邻苯二胺二盐酸盐底物(OPD)进行检测。
血清IgG结合分析
在ELISA中对来自人汇集血清的IgG测试其与CHIPS变体的反应性。将板用等摩尔量的蛋白质或PBS包被。在含3％奶粉的PBS-0.05％Tween-20中封闭之后，添加系列稀释的人血清。用兔抗人IgG-HRP(Dako)检测结合于CHIPS变体的IgG。报道的IgG效价是通过将发光数据相对稀释因子作图接着在非线性曲线拟合模型中进行分析来计算的。效价报道为达到截取值的血清稀释因子。该截取值是通过包被野生型CHIPS1-121并分析IgG在不同稀释度的汇集人血清中的结合来设定的。由稀释1/40000的血清产生的信号设为截取值，这是因为在该稀释结合于CHIPS1-121的IgG显示为位于结合曲线的动态区间(dynamic interval)。
生物学测定
对人C5aR的结合
人嗜中性粒细胞是从获得自Lund University Hospital(Lund，Sweden)的血液棕黄层(buffy coat)制备的。将所述血液棕黄层用含2％新生小牛血清(NBS)(Lonza)的PBS进行1/1(v/v)稀释，并添加至Ficoll Paque plus(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)顶部。在以1000 x g离心30分钟之后将嗜中性粒细胞收集于PBS中。然后通过用冰冷H2O温育30秒来裂解红细胞，并添加4 x PBS，并将悬液在4℃以600 x g离心7分钟。在含有2％NBS的PBS中收集嗜中性粒细胞，并将剩余的红细胞通过用冰冷H2O温育30秒来裂解，并添加4 x PBS。嗜中性粒细胞通过在4℃以1000 x g离心5分钟来收集。
对人嗜中性粒细胞以及稳定转染的细胞系U937/C5aR(来自E.Prossnitz博士(University of New Mexico，Albuquerque，NM)慷慨的礼物)研究对人C5aR的结合。将细胞在75em2细胞培养瓶中在5％CO2培养箱中在37℃培养，并维持于含L-谷氨酰胺(Lonza)和10％胎牛血清(FBS)(Lonza，Basel，Switzerland)的RPMI 1640培养基中。对C5aR的结合以两种方式通过流式细胞计量术来分析。在第一种方法中，将ΔC CHIPS变体(通过来自Invitrogen的ExpresswayCell-Free E.coli Expression System表达)的稀释系列与细胞一同温育，并通过2H7单克隆抗CHIPS抗体继以R-藻红蛋白(RPE)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako)来检测CHIPS结合。在第二种方法中，将CHIPS ΔC变体与如上的细胞一同温育，然后通过将单克隆抗C5aR抗体和RPE标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白添加至细胞来量化对结合的抑制程度。
C5aR阻断
人嗜中性粒细胞中C5a诱导的钙动员是通过流式细胞计量术来研究的。将5×106/ml的嗜中性粒细胞用含有0.05％BSA的RPMI 1640培养基中的2μM Fluo-3AM(Sigma-Aldrich)在室温(RT)温育30分钟，然后在含有0.05％BSA的RPMI 1640中洗涤并重悬。然后将细胞用纯化的CHIPS变体(重克隆为ΔN/C形式)的3倍稀释系列在室温预温育30分钟，并添加C5a(Sigma-Aldrich)(终浓度0.3nM)以诱导钙释放。这可通过在FACScalibur流式细胞计数器(BD Biosciences，San José，CA)上以荧光方式来测量。
C5a诱导的人嗜中性粒细胞的迁移(趋化性)是在Transwell系统(NeuroProbe，Gaithersburg，MD)中测量的。因此将5×106/ml人嗜中性粒细胞用4μMCalcein-AM(Sigma-Aldrich)标记，在含1％人血清白蛋白(HSA)的Hank平衡盐溶液(HBSS)中洗涤，并重悬于含1％HSA的HBSS中。将细胞进一步在RT用一定效价的纯化CHIPS ΔN/C变体温育15分钟。将C5a添加至孔的下室至终浓度为1nM。将经标记的细胞添加至上室。将板在37℃，5％CO2温育30分钟。然后用PBS漂洗过滤器以去除未迁移的细胞，并以485nm的激发和530nm的发射在荧光平板读数器中测量荧光。将数据用非线性回归模型(S形剂量应答曲线0-100，具有可变的斜率)拟合。
通过圆二色性(CD)光谱学下的热变性
在CHIPS变体的热展开过程中从4至85℃以1℃/分钟的扫描率，16秒的应答和1nm的带宽监视212nm处的CD信号。蛋白质浓度为PBS pH7.2中的0.5mg/ml，并使用具有1mm光路长度的石英小杯。为了调查可逆性，在向上扫描之后监视从85至4℃的热扫描。结构变化是从每次热扫描之前和之后在4或85℃的远UV CD光谱确定的。记录250至190nm的光谱，扫描速率为20nm/分钟，应答为8秒而带宽为lnm。所有的CD光谱学是在具有JASCO PTC-343 Peltier型恒温试池架(cell holder)的Jasco(Jasco Inc.，Easton，MD)J-720分光旋光计上进行的。由于对于所有变体热展开是不可逆的，无法获得热力学稳定性。然而，由于对于所有变体是以相同的速度监视展开，Tm提供了变体之间的比较性热稳定性。Tm是通过将方程1拟合至CD数据获得的。
ϵ obs = ( k N · T + b N ) + ( k U · T + b U ) · e - ( A ( 1 - ( T / T m ) ) + 3000 ( T - T m - T · ln ( T / T m ) ) ) / RT ( 1 + e - ( A ( 1 - ( T / T m ) ) + 3000 ( T - T m - T · ln ( T / T m ) ) ) / RT )
(方程1)
在方程1中，εobs是在212nm处观察到的椭圆率，kN、bN、kU和bU分别限定天然和展开状态的基线。A是拟合过程中的参数，但对于不可逆展开无价值，T是以开尔文计的温度，而R为气体常数。在该方程中，假定蛋白质遵循两个状态的变性过程，并在该温度区具有恒定的ΔCo p，从而使得变性遵循Gibbs-Helmholtz方程。对于此种展开，参数A为ΔHo.，而3000是ΔCo p的估计的量度，然而这些参数对于不可逆展开不相关。
分子建模
建模是通过使用可获得的CHIPS31-121NMR结构(PDB编号：1XEE)(Haas等，2005)和PyMol分子图像程序(DeLano，2008)进行的。
结果
用低IgG结合构建CHIPS变体的策略
对于抗CHIPS IgG相互作用减少但仍保留C5aR阻断活性的进化是在一轮随机诱变和三轮
Figure BDA0000089847850000501
重组中，然后进行计算分析和理性设计来进行的(图14)。选择之前显示较不易结合人抗CHIPS IgG(数据未显示)的在N端和C端均截短(CHIPS ΔN/C)并包含单突变K61A、K69A和K100A的较短的CHIPS变体作为优化过程的起始材料。维持CHIPS中的头30个N端氨基酸作为识别序列(对其不进行诱变或重组)以供在ELISA中捕获抗体。然后将选定的克隆重新克隆入截短的(CHIPS ΔN/C)形式，然后对生物活性进行表征(C5aR抑制)。
为了增加找到具有减少的IgG结合的新CHIPS变体的可能性，应用几种不同的ELISA以研究CHIPS和亲和纯化的抗CHIPS31-113IgG之间的相互作用。在ELISA中对于轮次1、3和4中的每个文库进行几个筛选轮次。每轮的初始筛选是通过单点测量进行的，而在后续轮次的筛选中进行更加全面的测定，即对于每个选定的突变体绘制完整滴定曲线。
此外，为了在选择和筛选过程中保留新的CHIPS变体的生物功能性，持续监视对具有硫酸化酪氨酸的C5aRN端氨基酸7-28的肽的结合。C5aR的残基10-18之前显示为对CHIPS的结合域(Postma等，2005)。C5aR的酪氨酸11和14显示为经硫酸化，显示其对于C5aR的C5a依赖性活化至关重要(Farzan等，2001)。最近对于CHIPS结合于C5aR N端肽的研究着重于位置11和14的硫酸化酪氨酸对于CHIPS结合的作用，并显示CHIPS以高亲和力结合于C5aR N端的硫酸化肽(Ippel等，2009)。
随机诱变文库和筛选
通过随机诱变将多样性导入CHIPS ΔC序列。构建了四个具有不同突变频率的文库(文库的细节描述于表3)。对所有四个文库进行噬菌体选择：首先对于C5aR肽结合(正选择)，然后对减少的抗CHIPS IgG结合进行选择(负选择)。汇集来自负选择的上清液，允许其感染大肠杆菌，并纯化噬菌粒。将来自突变体汇集物的CHIPS编码序列重新克隆入表达载体pRSET B，并随后将360个CHIPS变体以板形式表达，并以ELISA筛选减少的抗-CHIPS31-113IgG结合(图15A)。克隆显示与wt CHIPS1-121相比平均70％的抗CHIPS31-113IgG结合。最为改善的克隆显示53％结合。
对具有最低抗CHIPS31-113IgG结合的64个克隆进一步以ELISA分析其保留的C5aR肽结合。C5aR肽结合的平均值为相对于wt CHIPS1-121 80％的结合。选择具有最高C5aR肽结合的30个克隆以供通过以ELISA绘制完整的滴定曲线来进一步分析减少的抗CHIPS31-113IgG结合。最终，选择具有显著减少的抗CHIPS31-113IgG结合但仍保留C5aR肽结合的9个克隆用于通过
Figure BDA0000089847850000511
的DNA重组。
Figure BDA0000089847850000512
文库和筛选
Figure BDA0000089847850000513
轮次1
两个具有不同重组频率(即不同交换数)的文库是从在随机诱变步骤中选出的9个克隆(包含总共18个氨基酸取代)构建的(表3)。文库2.1通过
Figure BDA0000089847850000514
设计，其中将短的随机化寡核苷酸添加至反应。该寡核苷酸对应于氨基酸100至112，且其添加是为了增加CHIPS的C末端的突变数。文库2.2通过
Figure BDA0000089847850000515
在易错条件下设计以增加整个CHIPS序列中新突变数。
对文库进行如上所述的噬菌体选择，并汇集来自负选择的上清液，并从大肠杆菌纯化噬菌粒。使用DNA的这种汇集物作为第二轮
Figure BDA0000089847850000516
的起始材料。
轮次2
在第二轮
Figure BDA0000089847850000518
中，构建了一个文库(文库3.1)(参见表3)。将6.3×103个克隆以板形式表达，并以ELISA筛选与抗CHIPS31-113IgG和C5aR肽的两种相互作用。对C5aR肽的平均结合是wt CHIPS1-121结合的92％。选择显示对抗CHIPS31-113IgG的结合具有wt CHIPS1-121最大70％和对C5aR肽的结合具有wt CHIPS1-121至少80％的320个克隆以供第二轮对更低的抗CHIPS31-113IgG结合的ELISA筛选。通过一个单独的ELISA中的分析来将应答与表达水平相关联。改善最多的克隆显示与wt CHIPS1-121相比13％的抗CHIPS31-113IgG结合，而这些克隆中的平均值为39％结合(图15A)。
其中，40个克隆与wt CHIPS1-121相比显示＜40％的结合，然后对其进一步以剂量依赖性设定以ELISA进行分析。确定每个变体的EC50值(即介导最大结合一半的每个CHIPS变体的浓度)和平台值，并将其与wt CHIPS1-121的值比较。选择相对于来自随机诱变轮次的最佳克隆有所改善的12个克隆以供最后轮次的重组。这些克隆在抗CHIPS31-113IgG结合中显示高至至少2.4倍的EC50和wt CHIPS1-121平台值的最多54％。
Figure BDA0000089847850000522
轮次3
在最终轮次的中构建了两个文库。第一个文库基于六个选定的呈现14个氨基酸改变的克隆(文库4.1)，而第二个文库是从在之前轮次的中选择的所有12个克隆(总计25个氨基酸改变)制备的(文库4.2)。两个文库均是通过使用两个重复轮次的
Figure BDA0000089847850000525
且其间并无任何选择或筛选而设计的，与之前的文库相比产生了更高频率的重组克隆(92％)(表3)。
将9.6×103个克隆以板形式表达，并以ELISA筛选减少的人抗CHIPS31-113IgG结合。1000个克隆显示wt CHIPS1-121结合于抗CHIPS31-113IgG的最大10％，并用ELISA进一步分析C5aR肽结合。C5aR肽结合的平均值为wt CHIPS1-121结合的45％。选择与wt CHIPS1-121相比显示至少95％对C5aR肽的结合的96个克隆(图15A)进一步以ELISA分析减少的抗CHIPS31-113IgG结合和以流式细胞计量术分析保留的C5aR结合。所述克隆与wt CHIPS1-121相比显示平均7.1％的抗-CHIPS31-113IgG结合。改善最多的克隆与wt CHIPS1-121相比显示2.5％的结合(图15B)。该96个克隆的分布显示于图15C。
在测序之后，鉴定了42个独特的克隆。所有42个克隆在最后一轮筛选之后与wt CHIPS1-121相比显示＜10％的对抗CHIPS31-113IgG的结合。通过不含细胞的蛋白质表达系统表达这些克隆以改善蛋白质的产率，并通过ELISA和流式细胞计量术进一步表征产物。在该彻底的表征过程中，少数克隆与在之前的筛选过程中所测量的相比显示更高的针对抗CHIPS31-113IgG的结合，因此截取值设为13％而非之前的10。选择对人C5aR显示最高结合以及对抗CHIPS31-113IgG显示低结合(＜wt CHIPS1-121的13％)的10个克隆以供进一步诱变。这些克隆示于表5。
分子建模和理性设计
为了更进一步减少与抗CHIPS31-113IgG的相互作用，通过定点诱变10个选定克隆中的四个，构建了27个新的CHIPS变体(表5和表6)。通过将新突变导入这些特定克隆，呈现了所有在定向进化中鉴定出的12个突变位置。该定点诱变是通过分析蛋白质结构而设计的，其中特别着眼于在定向进化过程中生成的突变氨基酸的结构作用。对这些突变位置中的一些提出了新的取代，并将其加入相对于在定向进化中生成的克隆的新组合中。
CHIPS变体的表征
首先通过ELISA分析突变体对C5aR肽的结合。选择与所述肽显示至少90％结合的克隆以供进一步分析。在后续的用人嗜中性粒细胞进行的结合实验中，发现在位置112为丙氨酸的克隆S3.09相对于在该位置为缬氨酸的相应克隆(F3.08；wt CHIPS1-121结合的84％)展示对C5aR的改善结合(wtCHIPS1-121结合的105)。就此原因，在多数选定的克隆中，在位置112将V112取代为丙氨酸。此外，将克隆重新克隆为ΔN/C形式，并随后从包涵体如前所述(Gustafsson等，2009)通过大量洗涤包涵体、溶解、重新折叠(将蛋白质溶液逐滴添加至PBS中)和凝胶过滤来加以纯化。选择在对U937/C5aR细胞的流式细胞计量术实验中显示最高的C5aR阻断活性(在C5a刺激之后阻断Ca2+释放)的16个克隆以供进一步表征。在对人嗜中性粒细胞通过ELISA分析CHIPS对血清IgG的结合和通过流式细胞计量术分析生物功能性(C5aR阻断活性)之后，可最终选定7个克隆作为最有前途的候选(参见补充表III)。该选择是基于下述标准：血清IgG效价最高为2.3％，而C5aR阻断活性(嗜中性粒细胞中)为对于wt CHIPS1-121所观察到的至少50％。将这些克隆通过研究对嗜中性粒细胞迁移(趋化性)的抑制和通过由CD光谱学确定Tm值来进一步表征(表4)。温度变性显示所有克隆与CHIPS ΔN/C相比具有高解链温度。一些变体在低温显示小转变而在高温显示大转变，表明在低温下的部分展开。CHIPSΔN/C显示可逆的展开，而所有七个克隆显示不可逆的热展开。这表明所述克隆在展开状态与wt CHIPS1-121和CHIPS ΔN/C相比具有更高的聚集倾向。所述七个克隆的理论pI值在表6给出。这些值略高于wt CHIPS1-121的pI(pI为9.36)，因此在低于9.36的pH，wt CHIPS1-121和所述七个变体携带净正电荷。
图17显示了七个最佳克隆的序列比对。所述克隆包含每序列五至八个突变。三个突变位置位于α-螺旋，一个位于β1链和β2链之间的环，两个位于β2链和β3链之间的环，一个位于β链3，一个位于β3和β4链之间的环，而两个位于β链4。更具体而言，位置K40、D42、N77、K100、N111和G112在四个或更多克隆中与位置K50、K69、K92和K105的突变以不同方式组合突变。取代N77Y、N111K和G112A在所述克隆中最常见，分别呈现于七个克隆中的六个。
在所述七个克隆中，将一个变体(376)鉴定为最吸引人，并选为在后续研究中进行进一步表征。图18显示了克隆376表面图，突变用绿色标记。尽管该候选在所述七个最佳克隆中并不具有最低的IgG效价，但是其效价与wtCHIPS1-121相比降低了几乎180倍。认为该突变体高度保留阻断C5aR信号传导和抑制C5a诱导的趋化性的能力更加重要。
讨论
尽管蛋白质的某些特征可为药物开发所瞩目，但是其他性质可能需要改善以设计有前景的药物候选。目前，有多种药物(经批准或在临床试验阶段)通过使用蛋白质工程改造而经优化。组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)经数次改进以最终在血清中具有更长半衰期以及对纤维蛋白的更高特异性(Keyt等，1994)。tPA的这种工程改造型式
Figure BDA0000089847850000541
现已批准用于治疗急性心肌梗死。ANYARA是具有肿瘤特异性的超抗原偶联抗体，目前处于临床试验中。降低了超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)的抗原性以使得ANYARA成为更具吸引力的抗肿瘤药物候选(Erlandsson等，2003)。
与设计完善的筛选方法组合，可利用定向进化来改进蛋白质的几乎所有特征，即改善的亲和力，较高的效力或降低的免疫原性。然而，当改善所需的特定性质时，重要的是持续监视该蛋白质在所述特定性质的优化过程中亦可能改变的其他重要特征。
在该研究中，我们得以将CHIPS变体和人IgG之间的相互作用减少至wt CHIPS1-121的仅0.5％，同时仍旧保持C5aR阻断活性。这是通过在定向进化和筛选的轮次中持续监视C5aR结合从而确保该性质在优化过程中不致丧失而达成的。而且，为了增加找到具有减少的IgG结合的新CHIPS变体的可能性，在筛选轮次中应用了几种验证该性质的方法。
将定向进化(随机诱变和
Figure BDA0000089847850000542
)与计算/理性设计组合使用以将CHIPS分子朝着与特定人IgG较低相互作用的方向改进。首先通过随机诱变将多样性导入序列，然后顺序进行三轮
Figure BDA0000089847850000543
每轮之后进行选择和/或筛选。无需对CHIPS中针对现存IgG的表位的先验知识，将在之前轮次中发现为有益的突变重组以形成新的CHIPS变体，并显示IgG结合随着每一轮次而减少。在最后一轮
Figure BDA0000089847850000551
之后，最佳的克隆展示对人抗CHIPS31-113IgG的结合减少至对wt CHIPS1-121结合的仅2.5％。这是通过应用定向进化而取得的显著的结合减少。然而，为了更进一步减少结合，通过分子建模设计了定点诱变，并导入了其他突变。改善最多的最终克隆显示了对于wt CHIPS1-121观察到的IgG结合的0.5％。这是通过分析在定向进化过程中发现其重要性的位置的结构分布而达成的。
在七个最佳克隆中突变的组合导致这些变体的独特性质。在调查不同突变残基的贡献的尝试中，应用了在最终七个克隆中最频繁的突变位置：D42、N77、N111和G112的结构分析。D42是α-螺旋中的氨基酸，其表现对分子内相互作用的重要性。取代为缬氨酸(V)潜在地破坏了D42和R46之间形成的H-H键。该变化可改变CHIPS分子的结构，并还有可能改变IgG表位。在位置42导入疏水的缬氨酸表现为增加分子的稳定性。更可能的是，该疏水性残基良好地融入结构内部，并使疏水性核稳定化，而这可能是为何其呈现于七个选定克隆的六个中的原因。然而，由于增加的疏水性，该突变可影响可逆性和展开状态中的聚集倾向。N77在所述克隆中的六个中突变为酪氨酸(Y)，在一个克隆中突变为组氨酸(H)。其在β2-β3环中暴露，并可直接参与IgG结合。当比较N77Y和N77H时，在该位置酪氨酸表现为与组氨酸相比增加稳定性。另一方面，在该位置具有组氨酸的克隆376，与除了位置77为酪氨酸之外完全相同的克隆335相比，更好地保留了生物学功能(趋化性的抑制)。N111是β4中暴露的残基。该位置当取代为赖氨酸(K)时变得荷更多正电，这是显著的表面变化，在所述七个克隆的六个中显示为有益的。β4中的G112并不特别暴露。发现在该位置小氨基酸是有利的。如果大氨基酸如缬氨酸插入该位置，其可能与M93冲突(collide)，结果可能影响结构。发现将在定向进化中选出的G112V突变改变为丙氨酸(A)在所有携带G112V突变的克隆中对于保留C5aR阻断活性是有益的。有趣的是，七个最佳克隆中的三个(变体335、338和377)与定向进化中发现的克隆是相同的，但在位置112用A取代了V。
在七个最终克隆中，12个赖氨酸中的四个突变为精氨酸。在位置92和105精氨酸取代赖氨酸见于所述克隆中的三个，而在位置100的取代见于所述克隆中的四个。对于为何所述四个赖氨酸取代为精氨酸可有几种解释。从赖氨酸至精氨酸的取代可来自仅仅一个碱基变化，且精氨酸与赖氨酸具有多种类似性质，而数种其他可通过一个碱基变化而获得的氨基酸与赖氨酸差异更大，因此更难融入所述蛋白质的表面。精氨酸可稳定该蛋白质，并通常常见于结合表面。在所述CHIPS变体中，精氨酸可贡献于保留C5aR结合。
其他研究者已成功地应用了将随机诱变或定向进化与计算/理性设计组合的方法(Buskirk等，2004)。举例而言，可首先利用诱变以提供关于对于突变重要的残基的信息。如此，可将诱变从随机化的视角取而代之地导向基于理性的选择(Lingen等，2002)。
我们的结果阐明了通过使用定向进化和计算/理性设计可有效地在细菌来源的蛋白质中减少针对人IgG的表位。
抗体表位的去除在免疫学之内的多个学科中具有相关性。在变态反应研究中，去除IgE表位以构建低变应原性变应原衍生物以用作候选疫苗(Linhart等，2008；Mothes-Luksch等，2008；Szalai等，2008；Vrtala等，2004)。该研究主要通过表位定位和后续的遗传工程或通过设计嵌合蛋白或杂交分子进行，但也有通过定向进化构建低变应原的研究。在最近的研究(Gafvelin等，2007)中，通过对三个组2个螨变应原基因进行多基因重组的定向进化生成了具有减少的IgE反应性并保留T细胞反应性的低变应原候选。
总而言之，通过使用定向进化、计算分析和理性设计，我们更高程度地生成了与现存的特异性人IgG具有减少的相互作用而不影响CHIPS和C5aR之间相互作用的新CHIPS分子。该研究导致与wt CHIPS1-121蛋白相比更适于治疗用途的CHIPS变体，因其与现存人IgG形成复合物的倾向显著降低，并由此更易耐受，并在功能上作为C5aR拮抗剂比wt CHIPS1-121蛋白更为有效。
在这些变体中，鉴定了一个具有令人意想不到的有利性质的变体(376)。将该克隆命名为ADC-1004。
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Figure BDA0000089847850000591
Figure BDA0000089847850000601
补充表III在
Figure BDA0000089847850000611
重组之后选定的定点突变体和克隆的表征。七个最终选定的克隆以粗体标记。
Figure BDA0000089847850000612
1未予确定
2不适用
表5在第四轮多样化和筛选之后选定的10个克隆中的突变
Figure BDA0000089847850000621
表6在
Figure BDA0000089847850000622
重组之后选定的克隆中的四个中进行的定位突变
Figure BDA0000089847850000623
Figure BDA0000089847850000631
实施例C-CHIPS变体ADC-1004为与来自人血清的IgG显示低相互作用的强力C5AR拮抗剂
大多数人群在生活史早期会遭遇CHIPS，因为金黄色葡萄球菌是常见细菌，而CHIPS基因呈现于超过60％的金黄色葡萄球菌菌株。其结果，在人血清中已检测出干扰CHIPS与C5aR结合的循环抗CHIPS抗体(Wright等，2007，Mol Immunol 44：2507)。循环抗体可中和蛋白质的生物学作用。此类中和抗体可影响药物的效力，如存在于MS患者的抗IFN-β抗体(Bertolotto等，2000，Immunopharmacology 48：95)。此外，循环的特异性抗体可与蛋白质形成免疫复合物(IC)。已知免疫复合物若沉积于血管或器官例如肾脏中会导致疾病。此外，IC介导的经典补体途径的活化导致白细胞活化以及后续的组织损伤。因此，CHIPS作为抗炎分子起作用的潜力受特异性抗体妨碍。
除了与现存抗体反应，施用于人的重组蛋白可潜在地诱导新的TH细胞依赖性免疫应答。预测施用于人的重组或外源蛋白质是否可能诱导TH细胞依赖性抗体应答是困难的；例如，动物模型并非总是适用于人的应答。然而，对于衡量候选生物医药TH细胞表位含量已开发了T细胞表位算法(De Groot等，2001，Vaccine 19：4385；Desmet，Spriet&Lasters，2002，Proteins 48：31；Desmet等，2005，Proteins 58：53)。最近的数据确证了这些模型可用于预测人抗体应答(Koren等，2007，Clin Immunol 124：26)。
之前显示CHIPS的N端氨基酸对于FPR结合是必需的(Haas等，2005，JMol Biol 353：859)。其结果，N端截短将使CHIPS活性特异性针对C5aR结合。为了设计具有特异性C5aR阻断活性并与人抗体相互作用低的分子，采用了定向进化方法。新的改进CHIPS变体可通过使用DNA重组、分子建模、定位诱变和多轮筛选减少的特异性抗体相互作用以及保留的C5aR结合(参见上述实施例B)来发现。在该研究中，我们在不同测定法中表征了称为ADC-1004的新CHIPS变体的性质，涉及与来自人血清的IgG的相互作用、补体活化、C5aR抑制、免疫复合物形成和T细胞表位含量，以衡量使用该蛋白质作为药物的可行性。我们的数据阐明了蛋白质的IgG结合可显著减少，同时仍旧保留其生物功能。ADC-1004确实是对C5aR具有强力拮抗活性的蛋白质。现存的人抗体与ADC-1004展示非常弱的相互作用，且我们推测中和ADC-1004的速发型应答很可能不会在人体内发生。同时，当在不同体外模型中相比较时，我们显示ADC-1004并不诱导任何抗体介导作用至与全长CHIPS1-121相同的程度。
材料和方法
重组蛋白的克隆、表达和纯化
如前所述(10)克隆、表达并纯化了野生型CHIPS1-121。通过截短和诱变构建了CHIPS31-113和ADC-1004(原稿准备中)。然后如上所述克隆并培养这些CHIPS变体，但其为从包涵体纯化。简言之，沉淀100ml大肠杆菌培养物，并将沉淀在-20℃冷冻过夜。通过在三种不同缓冲液中洗涤来纯化包涵体：缓冲液1：50mM Tris pH8.0、1mM EDTA、25％蔗糖；缓冲液2：20mM Tris pH8.0、0.2MNaCl、0.5％脱氧胆酸钠、2mM EDTA；和缓冲液3：10mM Tris pH8.0、0.25％脱氧胆酸钠、1mM EDTA。将沉淀溶解，在冰上声处理，并在室温在每种缓冲液中振荡温育30分钟。然后在每轮洗涤之后通过以12000rpm离心来沉淀包涵体。将纯化的包涵体溶解于50mM Tris-HCl、0.2M NaCl、2mM EDTA、7M GuHCl pH8.0，并通过迅速稀释于PBS来进行重新折叠(最终蛋白质浓度最大为100μg/ml)并在室温旋转温育过夜。然后，在AmiconUltra旋转过滤器(Millipore，Billerica，MA)上浓缩之后，通过在HiLoad 16/60Superdex 75制备级柱(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上凝胶过滤来进一步纯化蛋白质。蛋白质浓度是通过QuantiPro BCA测定试剂盒(Sigma Aldrich，StLouis，MO)来确定的。
人嗜中性粒细胞的分离
从获得自Lund University Hospital(Lund，Sweden)的血液棕黄层通过Percoll(Sigma-Aldrich)密度梯度离心来制备人嗜中性粒细胞。将剩余的红细胞用冰冷H2O裂解30秒。最后将细胞收集在RPMI-1640/0.05％BSA中。
细胞培养
用C5aR转染的U937细胞(人幼单核细胞细胞系)(U937/C5aR)是来自E.Prossnitz博士(University of New Mexico，Albuquerque，NM)的慷慨礼物。将细胞在37℃在5％CO2培养箱中在75cm2细胞培养瓶中培养，并维持于含L-谷氨酰胺(Cambrex，Verviers，Belgium)和10％FBS(Cambrex，Verviers，Belgium)的RPMI 1640培养基中。
与人血清的相互作用
对人汇集血清或来自128、28和127个健康个体(3H Biomedical，Uppsala，Sweden)的血清分别以ELISA测试与CHIPS1-121、CHIPS31-113、ADC-1004的反应性。还对人汇集血清测试其与链激酶(Aventis-Behring，King of Prussia，PA)和阿那白滞素(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)的结合。将板用等摩尔量的蛋白质或PBS包被。添加系列稀释的人血清并允许其结合。IgG对CHIPS变体的结合用HRP结合的兔抗人IgG(Dako A/S，Glostrup，Denmark)继以用SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce，Rockford，IL)显色来检测。使用1/40000稀释的血清对包被的CHIPS1-121的结合以更新(regnerate)截取值。测量发光，并将其针对稀释因子作图，并在非线性曲线拟合模型中分析以计算达到截取值的稀释，将其报道为效价。
补体沉积
以ELISA来研究由来自人血清的抗CHIPS抗体和CHIPS变体之间的相互作用介导的补体沉积。将板用等摩尔量的CHIPS1-121、CHIPS31-113、ADC-1004或PBS包被，并用人血清温育。用小鼠抗人C3c抗体(Quidel，San Diego，CA)和HRP结合的抗小鼠Ig(Dako A/S)继以添加Super Signal ELISA PicoChemiluminescent Substrate来量化补体沉积。测量发光并将其针对血清浓度作图。
生物活性测定
C5a诱导的嗜中性粒细胞趋化性是在具有8.0μm的过滤器大小的ChemoTx Transwell系统(Neuro Probe，Gaithersburg，MD)中测量的。将5×106/ml的人嗜中性粒细胞用4μM Calcein-AM(Sigma Aldrich)在室温轻微搅拌下标记20分钟，在含1％HSA的HBSS中洗涤一次，并将细胞重悬于含1％HSA的HBSS中至2.5×106/ml。将细胞在室温用一定效价的CHIPS变体进一步温育15分钟。将C5a(Sigma Aldrich)添加至孔的下室至1nM的终浓度。装配上室，并将标记的细胞添加至上室。将标记的细胞添加至对照孔的下室以代表总计数。将板在37℃和5％CO2温育30分钟。然后用PBS漂洗过滤器以去除未迁移细胞并以485nm的激发和540nm的发射来测量荧光。结果表示为与未添加CHIPS的细胞相比的趋化性的％抑制。
对纯化的CHIPS变体测试其在人嗜中性粒细胞中抑制C5a诱导的钙动员的能力。简言之，将5×106/ml嗜中性粒细胞用含0.05％BSA的RPMI1640培养基中的2μM Fluo-3AM(Sigma Aldrich)在室温温育30分钟，洗涤两次并在含0.05％BSA的RPMI1640培养基中重悬至106个细胞/ml的浓度。将细胞用CHIPS变体的3倍稀释系列在室温预温育30分钟。对每个样品测量基线荧光度水平～10秒，然后添加C5a(Sigma Aldrich)(终浓度3nM)并将样品迅速置回试样架以继续在FACScalibur流式细胞计数器(BD Biosciences，San José，CA)中进行测量。在正面和侧面散射方面对细胞群体选段(gating)之后分析样品。结果表示为未添加CHIPS的细胞的抑制百分比。
T细胞表位分析
使用
Figure BDA0000089847850000671
系统(Desmet，Spriet&Lasters，2002，Proteins 48：31；Desmet等，2005，Proteins 58：53)根据专利EP1226528对CHIPS变体分析其T细胞表位含量。
分子建模
建模是通过使用可获得的CHIPS31-121NMR结构(PDB编号：1XEE)(18)和PyMol分子图像程序(DeLano，2002，The PyMol Molecular Graphics System.Delano Scientific，San Carlos)来进行的。
结果
ADC-1004
ADC-1004是新的CHIPS变体，其基于CHIPS31-113序列，具有七个氨基酸取代，即K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和G112A。ADC-1004是通过诱变和对于减少的特异性抗体相互作用以及保留的C5aR结合筛选CHIPS文库而发现的。之前如通过多维NMR(18)所确定，CHIPS31-121折叠描述为由N端两亲性的α-螺旋和四链的反平行β-折叠组成。使用该模型来显示对我们在该研究中表征的ADC-1004特征有贡献的ADC-1004突变结构分布(图18)。
ADC-1004显示与人血清中的IgG的低水平相互作用
为了衡量ADC-1004的有用性，以ELISA研究了其与人血清中IgG的相互作用。使用来自健康志愿者的人血清将针对ADC-1004的IgG效价与针对CHIPS1-121、CHIPS31-113、链激酶和阿那白滞素(一种重组IL-1受体拮抗剂，经批准供治疗类风湿性关节炎)的效价相比较。对阿那白滞素的效价包含在内作为阴性对照，因为对该分子无法检测出效价。显示ADC-1004抗体效价显著低于CHIPS1-121(低172倍)、CHIPS31-113(低9倍)和链激酶(低15倍)的效价。(图19A)。此外，对于个体血清效价的分析显示与对ADC-1004的相比，显著更多数量的个体对CHIPS1-121和CHIPS31-113有应答(图19B)。给出对s CHIPS1-121最高IgG应答的个体亦为对CHIPS31-113和ADC-1004的最高应答者。
ADC-1004诱导低水平的抗体依赖性补体活化
循环中的抗体可以许多方式干扰重组蛋白的作用。除了抗CHIPS抗体的中和作用之外，CHIPS和抗体之间的相互作用可潜在地活化补体级联。此种活化可导致不受欢迎的结果如白血病活化及其所致的组织伤害。
为了研究补体活化，将CHIPS变体包被于ELISA板，并用人血清的系列稀释温育，并量化补体片段C3c的沉积。与来自上面表示的血清IgG相互作用实验的结果一致，ADC-1004介导最低的C3c沉积。在10％血清处，显示ADC-1004介导的C3c沉积比由CHIPS1-121诱导的低六倍，而比CHIPS31-113诱导的C3c沉积低三倍(图20A)。此外，在10％血清处，对来自28个个体的血清的分析亦显示与ADC-1004温育时，相对于CHIPS1-121和CHIPS31-113显示显著更低的C3c沉积。
ADC-1004抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞活化和迁移
CHIPS通过阻断C5aR抑制C5a依赖性嗜中性粒细胞活化和迁移。为了调查ADC-1004是否起抑制C5a诱导的趋化性和活化的作用，将该CHIPS变体与CHIPS1-121和CHIPS31-113在两个测定法中进行比较。
首先，通过由流式细胞计量术测量胞内钙的动员来调查C5aR信号途径的抑制。将CHIPS变体的系列稀释与经Fluo-3标记的嗜中性粒细胞预温育，并用C5a刺激所述细胞。流式细胞计量术数据显示ADC-1004抑制50％的钙释放所需的浓度(IC50)为0.4nM±0.12，其为从三个独立实验计算的平均值。该平均值与CHIPS31-113的IC50相同并且为CHIPS31-113的IC50的两倍。代表性实例示于图21A。其次，在Transwell系统中研究嗜中性粒细胞迁移，其中将CHIPS变体的系列稀释与经Calcein标记的嗜中性粒细胞在Transwell的上室中预温育。然后允许经标记的嗜中性粒细胞向C5a梯度穿过膜迁移至下室。结果显示ADC-1004的IC50与CHIPS31-113的IC50相同，并几乎高至CHIPS1-121的IC50的四倍(图21B)。
ADC-1004T细胞表位含量
T细胞表位为确保TH细胞活化所需的蛋白质的肽。将ADC-1004的T细胞表位含量与野生型全长CHIPS(CHIPS1-121)的T细胞表位含量在计算机(insilico)模型中加以比较(Desmet，Spriet&Lasters，2002，Proteins 48：31；Desmet等，2005，Proteins 58：53))以评估ADC-1004诱导新的TH-细胞依赖性抗体应答的可能性。表7显示在ADC-1004中预计的表位的总数与在CHIPS1-121中相比低。而且，ADC-1004中预计的表位与CHIPS1-121中所见的那些不同，并较不混杂(数据未显示)。
讨论
补体片段C5a是通过C5aR施加促炎性作用的强力的肽，该机理涉及许多炎性疾病。因此可将C5aR视为这些疾病中重要的药物靶标(Monk等，2007，Br J Pharmacol.152(4)：429-48；Ricklin&Lambris，2007，Nat Biotechnol25：1265)。C5aR拮抗剂CHIPS是一种由人类病原体金黄色葡萄球菌产生用于通过调节先天免疫系统而躲避宿主应答的蛋白质(De Haas等，2004，Agent.JExp Med 199：687；Lee等，2004，J Infect Dis 190：571；Rooijakkers等，2005，NatImmunol 6：920；Jongerius等，2007，J Exp Med 204：2461)。已在人血清中发现针对CHIPS的抗体(Wright等，2007，Mol Immunol 44：2507)；因此人不太可能耐受该蛋白质，且体内CHIPS活性可能会被中和。基本上，CHIPS是强力的C5aR拮抗剂，但由于现存的特异性抗体，其对人的使用受限。
为了增加在体内使用该蛋白质的可行性，我们构建了改进的功能统一体(functional unity)，称作ADC-1004。该CHIPS变体携带七个氨基酸取代(参见上述实施例B)，其一同贡献于所述ADC-1004蛋白质的新特征。有趣的是，尽管存在完全改变其与人抗体相互作用的多个突变，抑制C5aR的生物功能却得到了保留。推定所述氨基酸取代中的一些实际上起稳定CHIPS折叠的作用而不是直接涉及减少抗体对ADC-1004的结合(参见上述实施例B)。
我们确定了IgG针对ADC-1004的效价，将其与针对全长CHIPS1-121和截短的CHIPS31-113变体的效价以及针对两种已知的生物医药的效价相比较。为了比较，使用了链激酶，一种来源于细菌蛋白的已知药物。超过30年以来，链激酶一直用于治疗心肌梗死(ISIS-2.ISIS-2(Second International Study ofInfarct Survival)Collaborative Group.，1988，Randomised trial of intravenousstreptokinase，oral aspirin，both，or neither among 17，187cases of suspected acutemyocardial infarction，Lancet 2：349)。ADC-1004对来自人血清的人IgG，无论是汇集的血清或来自不同个体的血清均显示低相互作用。ADC-1004的效价比全长CHIPS1-121效价低172倍，且比链激酶低15倍。同时，没有一个个体对ADC-1004具有强应答，而数个个体对全长CHIPS1-121显示特别高的效价。
显示与人抗体的这种低相互作用是有利的，因为ADC-1004并不诱导抗体介导的作用至与全长CHIPS1-121或CHIPS31-113相同的程度。当通过在ELISA中固化CHIPS变体并添加血清来研究补体活化时，证明ADC-1004为补体活化的不良诱导剂，与全长CHIPS1-121相比生成低6倍的C3c沉积。这些数据表明与其他测试的CHIPS变体相比，当施用ADC-1004时较不可能诱导免疫介导的不良作用。
引人注目的是，导入的突变并未去除ADC-1004的生物功能。在抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞迁移方面，ADC1004显示与CHIPS31-113等同的IC50值，且比全长CHIPS1-121的IC50值高四倍。当通过用C5a刺激抑制人嗜中性粒细胞中的钙释放的方式研究生物活性时，CHIPS变体之间的差异甚至更小。ADC-1004 IC50的平均值与CHIPS31-113的IC50相同，并为全长CHIPS1-121的两倍。
之前已在人血清中检测出干扰CHIPS与C5aR结合的抗CHIPS抗体(Wright等，2007，Mol Immunol 44：2507)。对于体内功能性至关重要的是，ADC-1004并不受到与全长CHIPS1-121相同程度的人血清抑制，如当对经人C5aR稳定转染的U937测试时在钙释放测定中所示(数据未显示)。尽管ADC-1004与人血清中的IgG的相互作用当以ELISA研究时无法检出，一些低亲和力表位可能仍存在于蛋白质中，且可解释当以钙释放模型研究ADC-1004时所见的血清作用。同时，其他Ig类型也可参与人对CHIPS的应答。我们关注了IgM对不同CHIPS变体的应答，且其总是比IgG应答低3-20倍。
ADC-1004与现存的人IgG展示非常弱的相互作用。然而，存在值得考虑的其他方面的免疫原性。衡量其是否正如许多重组或非人蛋白质那样易于诱导TH细胞依赖性免疫应答亦为重要的。在蛋白质之内的外源表位或糖基化的缺乏所导致的隐藏表位的暴露以及由于非最优配方导致的聚集物的存在是在生物药物中见到的抗原性的一些成因(Schellekens，2003，Nephrol DialTransplant 18：1257)。然而，如果所述蛋白质将开发用于治疗慢性疾病，即如果其将向同一患者施用多于一次，那么更重要的是考虑在重组蛋白质之内的T细胞表位。ADC-1004是小蛋白，并对于治疗急性炎症可能会是最为有益的，因为其在循环中可能具有较短的半衰期，原因是其尺寸较小。为了验证ADC-1004的T细胞依赖性免疫原性与全长CHIPS1-121相比并未增加，我们在计算机模型中评估了CHIPS变体的T细胞表位含量。显示ADC-1004含有中等数量的潜在T细胞表位(总计11个强TH表位)，少于CHIPS1-121，并近似于(comparable to)之前在该模型中研究的其他蛋白质(Van Walle等，2007，Expertopinion on biological therapy 7：405)。举例而言，批准供治疗非霍杰金淋巴瘤和RA的嵌合抗体利妥昔单抗(Rituximab)显示为含有总计22个强TH表位，而目前进行临床试验的人抗体Ofatumumab显示为含有总计六个强TH表位。亦重要的是考虑几个在CHIPS1-121和ADC-1004之间有所不同的表位。因此，施用ADC-1004相比CHIPS1-121较不可能发生强T细胞记忆应答，因为现存的记忆T细胞是配置为针对CHIPS1-121中存在的表位的。因此，任何针对ADC-1004的T细胞应答会是经典的、非基于记忆的应答。将避免现存抗体(由此去除B细胞表位)与避免TH细胞记忆组合的手段与ADC-1004与野生型CHIPS相比具有显著较弱的免疫原性是一致的。
总而言之，我们用CHIPS进行的研究显示可显著减少蛋白质与人血清中抗体的相互作用，而仍旧保留该蛋白质的生物功能。
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表7
对于CHIPS1-121和ADC-1004的TH表位计数。结合于同组(DRB1、DRB3/4/5、DP、DQ)的多个HLA的肽仅计一次
Figure BDA0000089847850000751
实施例D-对CHIPS变体ADC-1004在治疗急性心肌梗死和再灌注损伤中的效力的体内研究
背景介绍
选择一种基于经皮导管的方法以诱导具有最小创伤、手术诱导的应激和循环生理学中次要变化的缺血。选择心肌梗死的大小作为主要作用参数，因为在临床环境下，长期结果主要取决于梗死的大小[1]。减少心肌梗死的大小亦为再灌注疗法的目标。在打开冠状动脉闭塞之后取得良好宏观结果的再灌注疗法可能仍导致归于微血管损伤的持续ST-段抬高[2]。微血管损伤的程度与心肌缺血的持续时间和心肌梗死的程度有关，但亦可能由再灌注损伤所引起。微血管梗阻的存在与较不良的临床结果相关[3]。因此将MO选为互补作用参数。离体MRI允许获得心肌梗死的高分辨率照片，并与用TTC染色的组织学联系紧密[4]，并因此被选为IS衡量方法。使用SPECT以确定缺血过程中的风险区域。微血管梗阻的存在可具有几种病理生理学机理[5]。其一为当再灌注时由嗜中性粒细胞诱导的炎症应答。在梗死区域中携带C5aR(CD88)的细胞可通过组织学确定。嗜中性粒细胞活化的状态可通过CD88和活化标志物CD18在组织学切片中监视。ADC-1004处理时活化嗜中性粒细胞的减少会表明嗜中性粒细胞炎症应答的减少。
材料和方法
实验准备
使8头40-50kg健康的雄性和雌性家猪绝食过夜(但可获得水)。在步骤之前用Kataminol(氯胺酮(ketamine)，Intervet AB Danderyd Sweden)和Rompun(赛拉嗪(xylazin)，Bayer AG，Leverhusen，Germany)进行术前用药30分钟。在用5-25mg/kg硫喷妥钠(thiopental)(Pentothal，Abbott，Stockholm，Sweden)诱导麻醉之后，对动物经口插入具套的(cuffed)气管导管。之后，以1.5ml/分钟的速率起始缓慢灌注缓冲的葡萄糖(25mg/ml)中的1.25μl/ml芬太尼(fentanyl)(Fentanyl，Pharmalink AB，Stockholm，Sweden)，并根据需要进行调整。在平衡麻醉过程中，针对动物的需求以小的推注剂量滴定硫喷妥钠(Pentothal，Abbott，Stockholm，Sweden)。用Siemens-Elema 900B通气机以体积控制模式建立机械通气，加以调整以获得正常二氧化碳血。起始设定为：15/分钟的呼吸速率，10ml/kg的潮气量和5cmH2O的正终末呼气压。对动物通以一氧化二氮(70％)和氧气(30％)的混合物。持续监视猪的心电图(ECG)和动脉内血压。在导管插入起始时静脉内给予肝素(200IU/kg)。将6F插管器鞘(Onset，Cordis Co.Miami，FL，USA)插入经手术暴露的左颈动脉，通过其将6F JL4WiseguideTM(Boston Scientific Scimed，Maple Grove，MN，USA)插入左主冠状动脉。使用所述导管将0.014英寸PT ChoiceTM导线(Boston Scientific Scimed，Maple Grove，MN，USA)置入LAD的远端部分。然后将3.5x15mm MaverichTM monovail血管成形术气球(Boston Scientific Scimed，Maple Grove，MN，USA)置于LAD的中间部分，紧接着第一斜行支远端。所有的放射学步骤是在实验性导管插入实验室中进行的(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)。
缺血实验方案
缺血是通过使血管成形术气球膨胀40分钟诱导的。在气球膨胀之后而在气球收缩之前进行血管造影，以验证冠状血管的完全阻塞并校正气球位置。在气球收缩之后，进行后续的血管造影以验证在之前阻塞的动脉中的血流恢复。
ADC-1004递送实验方案
在诱导缺血之后大约22分钟，将约4mg/kg的0.9％NaCl中的ADC-1104的单剂静脉内施用于八个动物。八个(8)动物仅接受盐水。在实验过程中监视ADC-1004的血浆浓度，并在实验持续的四小时40分钟中取得了目标血浆浓度(使用诱导缺血作为t＝0)。
通过SPECT离体评价风险区域
使用单光子发射计算机化断层显象(SPECT)将AAR评价为左心室心肌的百分比。将五百MBq的99mTc-替曲膦(tetrofosmin)在血管成形术气球收缩之前18分钟静脉内施用。用双头照相机(Skylight，Philips，Best，the Netherlands)以32个投影(每个投影40秒)用64X64矩阵获得5X5X5mm的数字分辨率来进行离体成像。使用最大似然-期望最大化(maximum likelihood-expectationmaximization，MLEM)的迭代重构是用具有设定为0.6的Nyquist和数量级5.0的截取频率的低分辨率Butterworth滤镜进行的。未使用减弱或散射校正。最后，重构了短轴和长轴图像。将在MR图像中手动绘制的左心室心内和心外边界复制至共同记录的SPECT图像。SPECT缺陷定义为MRI确定的心肌之内具有低于心肌中最大计数55％的计数的区[6]。
通过离体MRI评价的梗死大小和微血管梗阻
使用1.5T Philips Intera CV MR扫描仪(Philips，Best，the Netherlands)根据之前所述的实验方案[4，7]进行心脏的离体成像。简言之，在取出心脏之前30分钟静脉内施用基于钆的造影剂(Dotarem，gadoteric acid，Gothia Medical，Billdal，Sweden)(0.4mmol/kg)。心脏是在起始再灌注之后4小时取出的。在取出之后，立即将心脏在冷盐水中漂洗，并用含有重水的气球填充心室。T1加权像的三维获取(TR＝20ms，TE＝3.2ms，倾倒角(flip angle)＝70°和两次平均)产生一叠大约200个图像，其具有0.5mm的相等分辨率，覆盖整个心脏。然后使用头部线圈(head coil)获取图像，且获取的持续时间通常为45分钟。使用可免费获得的软件分析MR图像[8，9]。左心室心肌的心内和心外边界是在短轴离体图像中手动绘制的。这限定了左心室心肌的体积(cm3＝ml)。梗死大小(IS)首先是作为梗死的心肌体积(cm3)确定的。梗死体积计算为切片厚度(cm)与具有高于梗死阈值(定义为比未受影响的远端心肌的平均强度高＞8SD)的信号强度的超增强像素(cm2)的乘积。微血管梗阻定义为梗死核心中的低强度区，其具有少于梗死阈值的信号强度。手动将这些区包括在梗死体积中。微血管梗阻的体积(cm3)计算为手动包括微血管梗阻区之前和之后梗死体积之间的差异。此外，微血管梗阻的大小表示为风险区域的百分比的百分比。最终，梗死大小表示为左心室心肌的百分比。最后，梗死大小表示为风险区域的百分比(IS/AAR)以对于组之间风险区域的任何差异进行调整[10，11]。
组织学
将来自猪#7和#8的梗死区域的心肌组织用于本研究。将组织固定于4％甲醛或骤冻(snap frozen)于在干冰上冰冷的异戊烷中。将经甲醛固定的组织包埋于石蜡中，并以5μm切片，在37℃干燥过夜，并根据下述方法染色。将冷冻保藏的组织以8μm切片，在室温干燥过夜，并根据下述方法染色。
对5μm石蜡切片进行用CD88、Serotec、MCA 1283T的染色。将样品脱石蜡，并在硼酸(pH8.0)中以煮沸10分钟并在室温冷却20分钟进行抗原回收处理。然后将样品用自来水中的1％H2O2处理20分钟，在PBS中洗涤三次，并在PBS中的5％正常山羊血清中温育30分钟。之后将样品用一抗即用含5％正常山羊血清的PBS稀释至1μg/ml的小鼠抗人CD88温育30分钟。在用PBS洗涤三次之后，将样品用Envision Mouse(Dako，K4001)温育30分钟，再在PBS中洗涤两次，并在Tris-HCl中洗涤一次。最终用DAB处理样品5-10分钟，并用Mayers苏木精处理5秒，然后用盖玻片封固。
对8μm冷冻切片进行用CD18、abcam、ab34117的染色。将样品在丙酮中固定10分钟，然后用自来水中的1％H2O2处理20分钟，在PBS中洗涤三次，并在PBS中的5％正常山羊血清中温育30分钟。之后将样品用一抗即用含5％正常山羊血清的PBS稀释至1μg/ml的小鼠抗猪CD18温育60分钟。在用PBS洗涤三次之后，将样品用Envision Mouse(Dako，K4001)温育30分钟，再在PBS中洗涤两次，并在Tris-HCl中洗涤一次。最终用DAB处理样品5-10分钟，并用Mayers苏木精处理5秒，然后用盖玻片封固。将载玻片用显微镜分析并用基于PC的图像分析系统(Leica Q500，Cambridge，UK)计算正染色区的百分比。
结果
在用于急性心肌梗死的猪模型中测试了ADC-1004。在十六个动物中诱导了缺血，其中八头猪接受了大约4mg/kg盐水中的ADC-1004，而八头猪接受了盐水(对照组)。如材料和方法中所述处理并测试了动物。
示于图22和图23的结果显示ADC-1004显著减少了通过MR/SPECT(p＜0.007，Mann-Whitney U检验)测量的相对于缺血区域(风险区域)的梗死大小。这支持ADC-1004的临床治疗效果，因为长期结果主要取决于梗死大小[1]。在用ADC-1004处理的组中平均微血管梗阻减少。微血管梗阻是临床上证明为与心肌梗死严重性相关的因素[3]。微血管梗阻隐含的一种病理生理学机理可为再灌注时嗜中性粒细胞诱导的炎症应答[5]。来自组织学调查的结果显示许多明显的CD88阳性细胞同时见于安慰剂处理切片以及来自ADC-1004处理的切片的梗死区。在两者情况下，阳性细胞数均约为250/mm2。阳性细胞不仅见于血管，还掺杂在心肌纤维中。CD18显示更加多变的反应，包括弱阳性至强阳性细胞。安慰剂处理样品与接受ADC-1004的样品(图24B)相比显示显著更多的阳性细胞(图24A)。而且与经处理的样品相比，更强染色的细胞见于安慰剂处理中。用图像分析设备进行的测量得出安慰剂处理与经ADC-1004处理的相比表达多至2-3倍的CD18，表明ADC-1004施用时，嗜中性粒细胞活化的减少。
因此，显示的数据表明在急性心肌梗死中通过施用ADC-1004作用于C5aR(并由此抑制由嗜中性粒细胞所致的活化和炎症)减少了梗死的严重性。
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9.网站标题[http://segment.heiberg.se/]
10.
Figure BDA0000089847850000811
E：Acute Myocardial Infarction.The relationship betweenduration och ischaemia and infarct size in humans-Assessment by MRI andSPECT.In PhD thesis Lund：University of Lund；2005.
11.Hedstrom E，Frogner F，Astrom-Olsson K等Myocardial infarct size inrelation to myocardium at risk versus duration of ischemia in humans：Comparisonwith different species(Abstract).J Cardiovasc Magn Reson 2007，9：363
实施例E-对CHIPS变体ADC-1004在治疗中风和再灌注损伤中效力的体内研究
背景介绍
该研究的目的是为了调查在瞬时大脑中动脉阻塞(tMCAO)的大鼠模型中，在大脑中动脉阻塞之后1小时45分钟和在再灌注之前15分钟起始用ADC-1004的处理并以24小时输注进行输注，是否会不同地影响大脑梗死大小。
材料和方法
暂时性大脑中动脉阻塞(tMCAO)
所有的手术方法均经Lund University的Ethics Committee for AnimalResearch批准。任意给予雄性Wistar大鼠水和食物，并将其居处置于12小时光/12小时暗循环下。使大鼠绝食过夜，并对其使用管腔内丝线(intraluminalfilament)技术进行2小时瞬时大脑中动脉阻塞(MCAO)。在2小时阻塞之后，再灌注1.5小时之后进行对缺陷的神经学评价。纳入显示旋转不平衡和附肢配置障碍(dysfunctional limb placement)的大鼠。通过管腔内丝线技术阻塞右侧的大脑中动脉(MCA)。通过吸入O2∶N2O(30∶70)中的4％异氟烷(Forene)然后自发在鼻罩中通气递送O2∶N2O中的2％异氟烷来麻醉动物。为了连续监视血压，控制血液气体和为了注射60IU肝素，将导管插入尾动脉。
使用连接于直肠温度探针的加热垫来保证体温维持在37℃。将激光多普勒(Doppler)探针粘着于颅骨右侧，从而监视MCA区域中的血流。实验性中风是通过首先在颈中部切开皮肤以暴露右侧的颈总动脉及其内部和外部部分。结扎颈外动脉，并用缝线围绕颈内动脉。在颈总动脉中，在靠近分歧处作一个小切口，并将丝线导入颈内动脉，并延伸至其阻断大脑中动脉的起始。该阻断记录为激光多普勒信号的减少。在该手术步骤之后，在缺血过程中允许大鼠从麻醉恢复。再灌注是在2小时之后再一次麻醉动物时通过去除丝线来进行的。
在再灌注之前，将硅导管插入上腔静脉，并向心脏前进1-2cm。使该导管稳定化，并将其以隧道形式埋(tunnelate)在后颈皮肤下。将该导管连接至旋转系统，其允许动物在塑料碗中自由移动而仍旧接受ADC-1004或安慰剂(盲的)注射。在MCAO结束之前十五分钟，对动物以推注剂量将溶液注射入腔静脉，然后持续输注溶液24小时。将血液(0.25-0.5ml)离心，并将血浆冷冻以供进一步分析。在再输注之后3、19、24和48小时取血样。在接受假手术的动物中，进行相同的手术，但不插入丝线。包括在本研究中的动物的所有生理参数在正常范围内：PO2＞90mm Hg，pCO2 30-50mm Hg，而pH7.35-45，手术过程中的动脉血压和直肠温度亦然。
梗死评估
在再灌注2日之后，将动物在4％异氟烷中麻醉，并斩首。将脑迅速从颅骨移除，并置于冷盐水中10分钟。在组织切片器中，将脑切为十二个一毫米厚的冠状片，并将切片在37℃在含有1.0％氯化2，3，5-三苯基四氮唑(TTC)的盐水溶液中染色20分钟。对接受假手术的动物进行相同的过程。梗死大小是通过计算机协助的图像分析评价的。
结果
在用于中风的大鼠模型中测试了ADC-1004。用安慰剂(盐水)处理的大鼠具有24.5mm3的平均梗死体积，而用ADC-1004处理的动物具有15.8mm3的平均梗死大小。
这些结果清楚地显示了ADC-1004处理的动物中朝向较小的梗死大小的倾向。
实施例F-对CHIPS变体ADC-1004在肺移植中的治疗中的效力的体内研究
背景介绍
当前肺移植的障碍涉及(1)缺乏合适的供体器官，(2)缺血/再灌注(I/R)损伤，(3)排斥，和(4)梗阻性微支气管炎(bronchiolitis obliteran)的发生。在移植之后的肺I/R损伤是呼吸衰竭的常见原因，并通常在移植后最初72个小时中显现。[1]I/R损伤继续为早期手术后阶段中发病率和死亡率的广泛和实质原因，报道的比率高至41％。[1]具有I/R损伤的30日患者死亡率约为40％，相比较，在不具I/R损伤的患者中为7％。[2]显示I/R损伤的患者需要延长的机械通气及更长的住院期，并具有增加的多器官衰竭的风险。[3]
I/R损伤的机理是多样的，并包括活性氧类物质(reactive oxygen species；ROS)的生成、白细胞活化/募集、补体和血小板活化、肺血管紧张度的异常和增加的促凝集活性。促炎症细胞因子的产生在I/R之后在肺中可观地增加。几个研究表明肺I/R损伤的特征是嗜中性粒细胞依赖性损伤。[4，5]几个研究显示嗜中性粒细胞活化化合物造成肺损伤，嗜中性粒细胞耗尽减弱肺I/R损伤，而嗜中性粒细胞粘附的耗尽阻止肺I/R损伤。[6，7]
将ADC-1004用于根据文献8修饰的猪肺移植模型，在移植后最初6小时内和20小时之后调查移植的肺的状况。将动脉氧张力视为肺状况的标记。
材料和方法
使用具有约66kg重量的八头瑞典当地品种的猪(4个供体和4个受体)。所有的动物接受遵守由National Institute of Health公开的“Guide for the Careand Use of Laboratory Animals”(NIH公开文献85-23，1985年修订1985)的人道待遇。
一般性实验设定之前描述于参考文献8。其过程如下简述：
供体过程
将动物用Siemens Servoventilator 300通气，并使用10L/分钟的控制体积、调节压力的通气(20次呼吸/分钟；正终末呼气压；8cm H2O；吸气氧分数为0.5-1.0)。进行了胸骨切开术。在系统肝素化(4mg/kg)之后，将40cm长的32F插管插入肺动脉(PA)。进入了左和右胸部空间。仔细检查了肺的所有部分，并将正呼气末压力暂时增加至10cm H2O直至消除肺膨胀不全的部分。将腹腔内脏从横膈膜移开以避免压缩下部肺叶。结扎上腔静脉和下腔静脉静脉。钳住升主动脉。通过切口打开右心房和左心房。用1L的冷保存溶液灌注PA，所述溶液在经处理的动物中补充有ADC-1004。通过维持保存溶液水平在肺上20cm的高度将平均PA灌注压力维持在20mmHg之下。在该过程之后，移除肺部并在4℃冷藏60小时。
受体过程
使受体猪镇静并麻醉。所述动物接受1.2g的肌肉内苄青霉素普鲁卡因(benzylpenicillinprocain，Ilocillin；Ciba-Geigy，Basel，Switzerland)。进行气管造口术，插入7号气管导管，并将所述动物与以供体相同的方式通气。通过颈内静脉导入两个中央静脉导管，并将两个导管通过颈动脉置于主动脉中。通过耻骨上膀胱造口术将Foley导管插入膀胱。通过第六肋间空间进行左侧开胸术，并进行左侧的全肺切除术，注意保留肺静脉的长端。
将来自供体猪的储藏的左肺从右肺切下，并随后移植入受体猪。在对移植肺进行再灌注之前30分钟给予ADC-1004。所述剂量是作为0.4mg/kg的推注剂量和作为0.4(第一处理的猪)或0.2mg/kg/h(第二处理的猪)的灌注给予的。将猪置于俯伏的位置。在整个实验中持续ADC-1004的灌注。当通过移植的肺建立血流时，时间限定为零。之后进行六个小时的气体交换。在再灌注之后十九至二十小时，通过第七肋间空间进行了右侧的开胸术和右侧的全肺切除术，而猪完全依赖于左侧的移植肺供其存活。然后在全肺切除术之前和之后取血气。对于所有动物在实验过程中的液体供应保持恒定，并由720mL的10％葡萄糖(即30mL/h的麻醉灌注)组成。在实验过程中持续给予170mL/小时的Ringer乳酸。
结果
两个经ADC-1004处理的接受肺移植的动物在移植之后显示增加的氧张力。如图25中所示，所有猪在移植之前以大约相同的基线起始。早在移植后1小时，经ADC-1004处理的动物与经安慰剂处理的动物相比，显示氧气交换能力的增加，在3小时之后，经处理的ADC-1004动物达到高氧气交换能力，表明与安慰剂处理的动物相比更好的肺部状况。在6小时之后，对照动物之一显示气体交换能力的增加，尽管仍不能达到ADC-1004处理的猪中的水平。在使得所述猪100％依赖于移植的左肺的右侧全肺切除术之后主动脉血中的PaO2(FiO2＝1.0)示于表8。
这些数据表明经ADC-1004处理的组中的肺与安慰剂组相比在移植后20小时处于更好的状况。在肺移植之后即刻的气体交换能力越好，重症护理处置所需的时间越短，而大量临床材料显示了更好的30日存活率。肺移植之后最初24个小时中气体交换能力受损表明再灌注损伤。因此，表明ADC-1004对C5aR的抑制减少了肺移植中的再灌注损伤。
表8
在右侧全肺切除术之后主动脉血中的PaO2(FiO2＝1.0)
  对照1   对照2   ADC-1004_1   ADC-1004_2
  30.4   46.6   67.2   50.2
参考文献
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Claims (52)

1.一种具有金黄色葡萄球菌趋化抑制蛋白(‘CHIPS’)的生物活性的多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS的生物活性的片段或变体，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其具有CHIPS的生物活性的片段或变体组成，其中所述变体相对于SEQ ID NO：1的野生型CHIPS蛋白质保留氨基酸取代K40E、D42V、N77H、K100R、K105R、N111K和/或G112A。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽能够抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞的活化。
3.权利要求1或2的多肽，其中所述多肽能够抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞的活化至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％和优选100％。
4.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽的生物活性大于SEQ IDNO：1的多肽的生物活性。
5.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽的长度少于500个氨基酸，例如长度少于400、300、200、150、140、130、125、121、120、119、118、117、116、115、114、113、112、111、110、109、108、107、106、105、104、103、102、101、100、95、90、85、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、65、60、55、50、40、30个或更少的氨基酸。
6.权利要求5的多肽，其中所述多肽长度为70至110个氨基酸，例如长度为75至90个氨基酸。
7.权利要求6的多肽，其中所述多肽长度为83个氨基酸。
8.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段或其变体，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的片段或其变体组成。
9.权利要求8的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的至少10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81或82个连续氨基酸。
10.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽包含在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N和/或C端和/或内部插入的一个或多个附加的氨基酸，或由在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的N和/或C端和/或内部插入的一个或多个附加的氨基酸组成。
11.权利要求10的多肽，其中所述多肽包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个附加的氨基酸，或由至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个附加的氨基酸组成。
12.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：2的氨基酸序列的变体组成，或由其片段组成。
13.权利要求12的多肽，其中所述变体包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％同一性，更优选与所述序列具有至少70％或80％或85％或90％同一性，且最优选与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少60％同一性，更优选与所述序列具有至少70％或80％或85％或90％同一性，且最优选与所述氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列组成。
14.权利要求12或13的多肽，其中所述变体包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段，或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其片段组成，其中一个或多个氨基酸经保守取代。
15.权利要求12至14任一项的多肽，其中所述多肽为SEQ ID NO：2的多肽的变体，其中一个或多个表面表位经修饰。
16.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽比SEQ ID NO：1的多肽在人体中的免疫原性低。
17.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽呈现一种或多种下述性质：
(a)抑制嗜中性粒细胞迁移(趋化性)的IC50小于1nM，优选0.5nM或更小(参见实施例)；
(b)血清IgG效价为野生型CHIPS的2％或更少(参见实施例)；
(c)阻断C5aR的IC50小于野生型CHIPS的四倍(less than four times that ofwildtype CHIPS)(参见实施例)；
(d)解链温度Tm高于50℃，优选高于60℃(参见实施例)。
18.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成。
19.前述任一项权利要求的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO：2的多肽连同N端甲硫氨酸组成。
20.一种核酸分子，其编码权利要求1至19任一项的多肽。
21.权利要求20的核酸分子，其中所述核酸分子是DNA分子。
22.一种载体，其包含权利要求19或20的核酸分子。
23.权利要求22的载体，其中所述载体是表达载体。
24.权利要求22或23的载体，其中所述载体选自下组：pRSET和pET系统的载体。
25.一种宿主细胞，其包含权利要求20或21的核酸分子或权利要求22至24任一项的载体。
26.一种产生权利要求1至19任一项的多肽的方法，包括在表达该多肽的条件下培养包含权利要求20或21的核酸分子或权利要求22至24任一项的载体的宿主细胞群体，并从中分离所述多肽。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1至19任一项的多肽。
28.权利要求1至19任一项的多肽用于医药。
29.权利要求1至19任一项的多肽用于抑制补体5a(C5a)的生物活性。
30.权利要求29的多肽用于抑制C5a受体的功能。
31.权利要求30的多肽，其中所述C5a受体位于嗜中性粒细胞、单核细胞和/或内皮细胞上。
32.权利要求29至31任一项的多肽用于抑制由补体5a(C5a)诱导的嗜中性粒细胞的活化。
33.权利要求29至32任一项的多肽用于治疗炎症。
34.权利要求29至33任一项的多肽用于治疗选自下组的疾病或症状：急性反应性关节炎、急性移植排斥、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、酒精性肝炎、同种异体移植、阿尔茨海默病、动脉硬化、阿尔图斯反应、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、细菌性脑膜炎、支气管癌、大疱性类天疱疮、烧伤、心肺分流术、心血管疾病、慢性支气管炎、慢性淋巴白血病、慢性阻塞性肺病(COPD)、接触性皮炎、克罗恩病、皮肤T细胞淋巴瘤、囊性纤维化、皮肤病(dermatose)、中枢神经系统疾病、子宫内膜异位症、实验性变应性脑脊髓炎(EAE)、实验性变应性神经炎(EAN)、冻伤、胃癌、肠胃病、泌尿生殖疾病、痛风、幽门螺杆菌胃炎、血液透析、遗传性血管性水肿、超敏性肺炎、特发性肺纤维化、免疫复合物(IC)诱发性血管炎、缺血性休克、缺血再灌注发作、缺血再灌注损伤、关节疾病、(大)血管外科手术、金属烟热、多发性硬化、多系统器官衰竭、重症肌无力、心肌梗死、胰腺炎、腹膜炎、胸膜气肿、心肺分流术后(CPB)炎症、银屑病、重复性劳损(RSI)、呼吸系统疾病、类风湿性关节炎、脓毒症、败血性休克、鼻窦炎、皮肤病(skin disease)、中风、系统性红斑狼疮(SLE)、移植、(创伤性)脑损伤、溃疡性结肠炎、尿路感染、血管渗漏综合征、血管炎和异种移植。
35.权利要求34的多肽用于治疗再灌注损伤。
36.权利要求35的多肽，其中所述再灌注损伤与急性心肌梗死(AMI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)、中风和/或器官移植相关。
37.权利要求34的多肽用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
38.一种用于产生权利要求1至19任一项的多肽的方法，其包括下述步骤：
(a)提供编码SEQ ID NO：2的多肽的一种或多种亲本多核苷酸分子；
(b)以核酸酶消化所述一种或多种亲本多核苷酸分子以产生多核苷酸片段；
(c)将步骤(b)中产生的所述多核苷酸片段彼此接触；和
(d)扩增彼此退火的片段以产生至少一种编码变体CHIPS多肽的多核苷酸序列，所述变体CHIPS多肽与由所述一种或多种亲本多核苷酸分子编码的那些多肽相比具有改变的氨基酸序列。
39.权利要求38的方法，其进一步包括表达步骤(d)中产生的所述至少一种多核苷酸序列并在所得多肽中筛选野生型CHIPS蛋白的生物活性的步骤(e)。
40.权利要求39的方法，其中所述野生型CHIPS蛋白的生物活性是抑制C5a诱导的嗜中性粒细胞活化的能力。
41.权利要求38至40任一项的方法，其进一步包括在所得多肽中筛选相对于SEQ ID NO：1的多肽降低的免疫原性的步骤(f)。
42.权利要求38至41任一项的方法，其中步骤(a)中所述的一种或多种亲本多核苷酸分子为单链的。
43.权利要求41至42任一项的方法，其中步骤(b)中所述的核酸酶为外切核酸酶。
44.权利要求38至43任一项的方法，其中步骤(d)包括添加具有预定变异性的寡核苷酸。
45.权利要求39至44任一项的方法，其中步骤(e)包括检测所得多肽结合C5aR的能力。
46.一种基本如本文说明书所描述的多肽。
47.一种基本如本文说明书所描述的核酸分子。
48.一种基本如本文说明书所描述的载体。
49.一种基本如本文说明书所描述的宿主细胞。
50.一种基本如本文说明书所描述的产生多肽的方法。
51.一种基本如本文说明书所描述的药理组合物。
52.一种基本如本文说明书所描述的多肽的用途。
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