CN102988956A - 预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂。首次证明含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(CRISPLD2)可结合细菌的LPS和单链DNA，其血清浓度与细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克密切相关。以CRISPLD2蛋白为靶分子，检测个体血清CRISPLD2浓度，预测个体对细菌感染的敏感性，并通过跟踪CRISPLD2血清水平预后细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克。且，通过提高血清中CRISPLD2蛋白的浓度，可预防和治疗细菌感染引起的严重脓毒血症及浓毒性休克。

Description

预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂
技术领域
本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及预防、诊断、治疗、预后细菌感染相关疾病的方法和试剂，特别是提供了一种混合细菌感染引起的严重脓毒血症及感染性休克预后，预防和治疗的新方法。
背景技术
细菌感染引起的脓毒血症至今仍然是危害人类健康的急性综合症，脓毒血症目前是美国排位第10的主要死亡原因，在中国脓毒血症的发病率和死亡率也不容乐观。全球每年至少有1800万例脓毒症发生，占世界总人口的0.3％，我国估计为300万例/年计算。保守预测我国严重脓毒症和脓毒性休克病人为174万病人。革兰氏阴性以及阳性细菌引起的脓毒血症主要原因是由于细菌或细菌毒素侵入血流引起。健康者在病原菌入侵后，一般仅表现为短暂的菌血症，细菌可被人体的免疫防御系统迅速消灭，并不引起明显症状；但各种免疫防御功能缺陷者(包括局部和全身屏障功能的丧失)，都易诱发脓毒血症。放射治疗、广谱抗菌素、细胞毒类药物的应用，以及各种大手术致严重的开放性创伤等都是脓毒血症的重要诱因。
单一微生物感染是指微生物培养中可以检出一个孤立的微生物体；多种微生物感染是指微生物培养中可以检出超过一个的微生物体，即多个微生物体。与单一微生物感染相比较，多种微生物感染引起的脓毒血症伴有较高并发症风险，较长的病程以及较高死亡率。
细菌感染引起的脓毒血症以及浓毒性休克的诊断、预防治疗工作仍然面临许多挑战，监测血流中的微量细菌和细菌毒素都是可行的诊断方法但存在严重缺点，而且缺乏统一的标准。
近20多年，发现一些可以应用于诊断的分子靶点的人血清分子可以应用于细菌感染的诊断，例如B型尿肽(B-type natriuretic peptide)、降血钙素原(Procalcitonin)、细菌聚脂多糖结合蛋白(LBP)、细菌渗透性增强蛋白(BPI)、可溶性CD14(sCD14)、Endocan等。其中降血钙素原(Procalcitonin)已被广泛应用于脓毒血症、严重脓毒血症、浓毒性休克的分类以及诊断，但它们都不能准确、有效预测浓毒性休克的发生。
目前感染免疫学研究认为，引起脓毒血症以及浓毒性休克的病源分子主要是革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)、细菌核酸(DNA)、糖肽(PGN)以及磷脂壁酸(LTA)；又发现细菌的单链DNA(ssDNA)可以保护个体，降低混合细菌感染的死亡率。革兰氏阴性菌感染往往伴随其它细菌的感染。多种抗原的病理协同作用还有待进一步研究，其原理有待揭示。因此，本领域迫切需要发现新的病理机制、开发的新的、有效地对严重脓毒血症以及浓毒性休克进行预后、预防和治疗的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供预防、诊断、治疗、预后混合细菌感染以及多种微生物感染相关疾病的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(CRISPLD2)及其编码基因的用途，用于制备预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的药物。
在一个优选例中，所述的药物用于：
阻断脂多糖(LPS)与靶细胞受体结合；或
抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症因子(如肿瘤坏死因子)释放。
在另一优选例中，所述的药物用于从源头上控制脂多糖(LPS)诱导的一系列病理反应，以及修饰单链DNA的免疫调控功能。
在另一优选例中，所述的含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2通过结合细菌单链DNA(ssDNA)和/或脂多糖(LPS)预防、缓解或治疗脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。
在本发明的另一方面，提供含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的脓毒血症、严重脓毒症以及感染性休克是格兰氏阴性细菌及多种微生物感染引起的脓毒血症、严重脓毒症以及感染性休克。
在另一优选例中，所述的细菌感染是格兰氏阴性细菌及多种微生物感染，可以包含格兰氏阳性细菌。
在另一优选例中，所述的细菌感染是混合细菌感染。
在另一优选例中，所述的混合细菌感染以及多种微生物感染包括内源性格兰氏阴性和阳性细菌混合感染或外源性格兰氏阴性感染。
在另一优选例中，所述的细菌选自(但不限于)：大肠杆菌，葡萄球菌，沙门氏菌，克雷伯氏菌，不动杆菌。
在本发明的另一方面，提供特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂的用途，用于制备诊断或预后细菌感染脓毒血症、严重脓毒血症以及感染性休克的试剂盒。
在另一优选例中，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂选自(但不限于)：
特异性扩增含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的引物；
特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的探针；或
特异性结合含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体或配体。
在另一优选例中，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体，如多克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症以及感染性休克的试剂盒，它包括：
容器，以及位于容器中的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂；较佳地，为用于检测CRISPLD2血清浓度的试剂，如多克隆抗体。
在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，包括步骤：提高需要的哺乳动物对象的血清中含LCCD结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的浓度。
在本发明的另一方面，提供一种预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，该方法包括：给予细菌感染者含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、显示了ELISA检测的标准曲线。
图2、显示了重组CRISPLD2的鉴定结果。其中，
A、10％SDS-PAGE胶分离纯化重组CRISPLD2分子，考马斯蓝鉴定；
B、抗CRISPLD2抗体免疫印迹；
C、抗c-myc-标记抗体免疫印迹。各泳道如下：1，4和6为培养基中的CRISPLD2；2为分子量标准；3和5为对照培养基。
图3、应用BIAcore技术测定的分子相互作用；CRISPLD2与LPS和单链DNA(OND)结合。其中，
A、E.col i LPS(E.coli-LPS)与CRISPLD2结合解离的传感图。
B、金黄色葡萄球菌(S.aureus)LTA(Aureus-LTA)与CRISPLD2结合解离的传感图。
C、E-coli糖脂(PGN)与CRISPLD2结合解离的传感图。
D、人工合成细菌单链GPC-DNA(ODN2006)与CRISPLD2结合解离的传感图。
E、人工合成细菌单链CPG-DNA(ODN2006(Ctr))与CRISPLD2结合解离的传感图。
F、人工合成双链RNA(PolyI:C)与CRISPLD2结合解离的传感图。
图4、盲肠结扎手术和穿刺诱导混合细菌感染脓毒血症以及低剂量LPS腹腔注射后血清CRISPLD2浓度的时间动力学曲线。A为大鼠盲肠结扎手术和穿刺诱导低度及中度混合细菌感染后血清CRISPLD2浓度变化。B为低剂量LPS腹腔注射后小鼠血清CRISPLD2浓度变化。
图5、重组CRISPLD2阻断LPS与靶细胞受体结合，抑制靶细胞炎症因子释放。其中，
A-B：重组CERISPLD2蛋白阻断大肠杆菌LPS及沙门氏菌(S.minnesota；S.m)LPS与靶细胞受体结合。其中，MFI是荧光强度的中值。
C-D：重组CERISPLD2蛋白阻断大肠杆菌LPS诱导的炎症因子释放。
图6、重组人CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死，血清CRISPLD2浓度与E.coli-LPS致死剂量相关性分析。
A、重组人类CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死。
B、小鼠血清CRISPLD2浓度与E.coli-LPS致死剂量正相关。
图7、抗菌素长时间治疗引起小鼠血清CRISPLD2浓度下降，小鼠对内毒素休克的敏感性增加。其中，
A、长时间服用万古霉素加新霉素导致小鼠血清CRISPLD2浓度下降。
B、长时间服用万古霉素加新霉素增加了小鼠对内毒素休克的敏感性。
图8、CRISPLD2血清浓度关与LPS诱导的内毒素休克的易感性呈正相关。
合并三例类似图7抗菌素长时间治疗的实验数据绘图并统计分析：
A、CRISPLD2血清浓度关与LPS诱导的内毒素休克的存活率呈正相关(小鼠腹腔(i.p.)注射亚致死剂量的大肠杆菌LPS 0.2mg)。
B、显示血清CRISPLD2水平正态分布曲线，提示了相应的内毒素休克的易感性变化与CRISPLD2水平的关系。纵坐标是血清CRISPLD2水平；横纵坐标是存活率或小鼠计数。
C、显示抗内毒素血清IgG抗体水平与存活率没有相关性。
图9、重组CRISPLD2蛋白静脉注射或内源性激活上调血清CRISPLD2水平保护混合细菌感染小鼠免于浓毒性休克。
图10、脓毒血症病人CRISPLD2-低/降钙素原(Procalcitonie)-高的血清样本频率更敏感地反映脓毒血症的严重程度及死亡率。APACHE II指数4-14为轻度脓毒血症病人；15-23为严重脓毒血症病人；23-39为严重脓毒血症乃至浓毒性休克高发病人。病例30，标本数180。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，首次证明了一种天然免疫调节蛋白——含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(cyste ine-rich secretoryprote in LCCL domain containing 2，CRISPLD2)可结合细菌的单链DNA和LPS，其血清浓度与细菌感染或细菌感染相关疾病(如严重脓毒血症以及浓毒性休克)的发生密切相关。一方面，以CRISPLD2蛋白作为靶分子，可检测个体血清CRISPLD2浓度，预测个体对细菌感染(如浓毒性休克)的敏感性，并通过跟踪血清水平CRISPLD2预后细菌感染引起的严重脓毒血症以及浓毒性休克。另一方面，通过提高血清中CRISPLD2蛋白的浓度，可以预防和治疗细菌感染引起严重脓毒血症以及浓毒性休克。在此基础上完成了本发明。
一种CRISPLD2的cDNA序列可参见登录号NM_031476(长度4607bp)或SEQ ID NO：1，其基因组序列可参见登录号NC_000016.9，其氨基酸序列可参见序列号NP_113664或SEQ ID NO：2。
在本发明中，术语“CRISPLD2蛋白”、“CRISPLD2多肽”、“含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2”或“人严重脓毒血症以及浓毒性休克相关蛋白CRISPLD2”可互换使用，都指具有人严重脓毒血症以及浓毒性休克相关蛋白CRISPLD2氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的CRISPLD2蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其它物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的CRISPLD2蛋白或多肽”是指CRISPLD2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CRISPLD2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明还包括CRISPLD2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然CRISPLD2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“CRISPLD2蛋白”指具有CRISPLD2蛋白活性的SEQID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与CRISPLD2蛋白相同功能的、SEQID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括CRISPLD2蛋白的活性片段和活性衍生物。通常，这些变异形式包括CRISPLD2蛋白的LCCD和R3H结构域。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与CRISPLD2DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗CRISPLD2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽，如包含CRISPLD2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了CRISPLD2多肽的可溶性片段。通常，这些变异形式包括CRISPLD2蛋白的LCCD和R3H结构域。
发明还提供CRISPLD2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然CRISPLD2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。通常，这些类似物包括CRISPLD2蛋白的LCCD和R3H结构域。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“CRISPLD2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
  最初的残基  代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)  Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)  Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)  Glu   Glu
  Cys(C)  Ser   Ser
  Gln(Q)  Asn   Asn
  Glu(E)  Asp   Asp
  Gly(G)  Pro；Ala   Ala
  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)  Arg；Gln；Asn  Arg
  Met(M)  Leu；Phe；Ile  Leu
  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr  Leu
  Pro(P)  Ala  Ala
  Ser(S)  Thr  Thr
  Thr(T)  Ser  Ser
  Trp(W)  Tyr；Phe  Tyr
  Tyr(Y)  Trp；Phe；Thr；Ser  Phe
  Val(V)  Ile；Leu；Met；Phe；Ala  Leu
编码CRISPLD2蛋白的基因(多核苷酸)可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的CRISPLD2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对CRISPLD2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CRISPLD2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达CRISPLD2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
抗CRISPLD2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本(尤其是血清样本)中的CRISPLD2蛋白。此外，与CRISPLD2蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。
多克隆抗体的生产可用CRISPLD2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CRISPLD2蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
如本文所用，所述的CRISPLD2的激动剂包括了稳定剂、促进剂、上调剂等。任何可提高CRISPLD2蛋白的活性、维持CRISPLD2蛋白的稳定性、促进CRISPLD2蛋白的表达、延长AC CRISPLD2hE蛋白有效作用时间、促进CRISPLD2的基因转录和翻译以及的物质均可用于本发明，作为对于预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的物质。
CRISPLD2蛋白及其激动剂(也称为促效剂)等，当在治疗上进行施用(给药)时，可预防或治疗败血症以及败血症休克。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的多肽可直接用于细菌感染或细菌感染相关疾病的治疗和预防，尤其是防治严重脓毒血症以及浓毒性休克。在使用本发明CRISPLD2蛋白时，还可同时使用其它用于同一病症的治疗剂。
本发明还提供了一种组合物(包括药物组合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％)的本发明CRISPLD2多肽或其激动剂以及(药学上)可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其它治疗剂一起使用。
本发明还涉及定量检测CRISPLD2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括ELISA、FISH测定和放射免疫测定。因此，在了解了CRISPLD2蛋白水平与疾病的关系后，本领域人员易于进行细菌感染或细菌感染相关疾病的诊断或预后。试验中所检测的CRISPLD2蛋白水平，可以用作解释CRISPLD2蛋白在调控细菌抗原反应中的重要性和用于诊断疾病的易感性。
一种检测样品中是否存在CRISPLD2蛋白的方法是利用特异性抗体识别CRISPLD2蛋白。本发明的主要应用包括：
1.将CRISPLD2蛋白作为靶分子，检测个体血清CRISPLD2浓度，预测诊断个体内对脓毒血症以及浓毒性休克的敏感性，为临床医生提供依据，对可能突发脓毒血症并引起休克的病人采取必要的预防治疗措。可根据临床的经验确定一个阈值，当CRISPLD2蛋白低于该阈值时，作出疾病的警示。
2.将重组CRISPLD2蛋白或包含RAAIH序列的肽段用于病人严重脓毒血症时干预治疗。
3.连续跟踪血清样品中先天免疫调节分子CRISPLD2浓度，以评估患者的天然免疫调节和病原体反应之间的动态平衡。作为预防和治疗感染性休克的措施，医源性调节血清CRISPLD2水平，修正天然免疫调控和病原体反应之间的不平衡。
本发明还提供了血清CRISPLD2浓度监测的试剂盒，其中包含容器，以及位于容器中的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2(CRISPLD2)或其编码基因的试剂(较佳地，为用于检测CRISPLD2血清浓度的试剂，如多克隆抗体)。试剂盒中的试剂可用于跟踪血清样品中先天免疫调节分子CRISPLD2浓度，以评估患者的天然免疫调控动态平衡状况，这一动态平衡的失衡直接反映疾病严重程度和可能的休克死亡率。
临床上，严重脓毒血症患者血清CRISPLD2浓度连续监测中，血清样本中出现CRISPLD2浓度低于正常平均值，而常规临床血清感染指标高于严重脓毒血症警戒线的血清标本直接指示浓毒性休克的可能。该指标与疾病严重性、死亡率相关性：严重脓毒血症患者血清样本中，CRISPLD2低于正常人平均值的样本出现频率直接反映病人的死亡几率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、质粒构建、细胞转染和蛋白表达纯化
1.质粒构建
CRISPLD2的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)下，其中结合LPS的二个LCCL结构域位于第286-370位和第387-460位；第333-337位为RAAIH(R3H)序列，结合ssDNA(SEQ ID NO：2序列，序列号NP_113664，氨基酸残基数497aa)：
  1 MSCVLGGVIP LGLLFLVCGS QGYLLPNVTL LEELLSKYQH NESHSRVRRA IPREDKEEIL
 61 MLHNKLRGQV QPQASNMEYM TWDDELEKSA AAWASQCIWE HGPTSLLVSI GQNLGAHWGR
121 YRSPGFHVQS WYDEVKDYTY PYPSECNPWC PERCSGPMCT HYTQIVWATT NKIGCAVNTC
181 RKMTVWGEVW ENAVYFVCNY SPKGNWIGEA PYKNGRPCSE CPPSYGGSCR NNLCYREETY
241 TPKPETDEMN EVETAPIPEE NHVWLQPRVM RPTKPKKTSA VNYMTQVVRC DTKMKDRCKG
301 STCNRYQCPA GCLNHKAKIF GTLFYESSSS IC
Figure BDA0000092444470000131
YGI LDDKGGLVDI TRNGKVPFFV
361 KSERHGVQSL SKYKPSSSFM VSKVKVQDLD CYTTVAQLCP FEKPATHCPR IHCPAHCKDE
421 PSYWAPVFGT NIYADTSSIC KTAVHAGVIS NESGGDVDVM PVDKKKTYVG SLRNGVQSES
481 LGTPRDGKAF RIFAVRQ
应用PCR从人类混合组织mRNA中获得部分或全长CRISPLD2阅读框架(ORF)cDNA。
引物1(扩增CRISPLD2蛋白第1-497aa对应的cDNA)：
Fl：5’-GCTGTCGCCGCTGCTACCGC(SEQ ID NO：3)；
Rl：5’-GACGCCCCTTCTCCCCTGGT(SEQ ID NO：4)。
PCR产物插入质粒pGEM-T(Promega)作为表达载体构建的模板。
将编码全长CRISPLD2的cDNA插入pcDNA3.1A(InviyroGen)质粒的多克隆位点，然后，转入CHO细胞(ATCC)，重组表达产生蛋白带有c-myc标记和6个His的重组CRISPLD2蛋白。
引物2(扩增CRISPLD2蛋白第257-497aa对应的cDNA)：
F2：5’-TGGAATTCCGAGAAGAAACCTACACTC(SEQ ID NO：5)
R2：5’-TGCTCGAGATTCACTGCCTGACAGCA(SEQ ID NO：6)
PCR产物插入质粒pGEM-T(Promega)作为表达载体构建的模板。
将编码CRISPLD2蛋白片段(SEQ ID NO：2中第257-497aa)的cDNA插入质粒pGEX-4T-l(GE Healthcare)的多克隆位点，转入CHO细胞(ATCC)，获得重组表达的GST-CRISPLD2融合蛋白。这一融合蛋白用来免疫兔子，获得抗血清。应用Protein G Agarose从抗血清中纯化获得抗CRISPLD2多克隆抗体(抗CRISPLD2IgG)。
2.细胞转染和蛋白表达纯化
应用Lipofectamine(Invitrogen)，将质粒转染CHO细胞，然后应用抗菌素G418选择转染阳性细胞。稳定表达人类CRISPLD2的CHO细胞培养时保持G418，应用有限稀释法进一步分离、选择高表达的CHO细胞克隆。
无血清培养液培养表达重组CRISPLD2蛋白的CHO细胞。收集上清液内含高浓度重组CRISPLD2蛋白。应用亲和层析，纯化培养液中的重组蛋白。
收集部分磷酸缓冲液透析(含有重组蛋白)，用SDS-PAGE电泳分离，考马斯蓝(coomass ie blue)染色SDS-PAGE胶，鉴定纯度，并用BCA测定试剂盒蛋白定量(Pierce)。
3.免疫酶联反应法(ELISA)测定CRISPLD2浓度
用碳酸钠缓冲液(pH 9.5)适当稀释培养液或血清，包被96孔板(NuncMaxiSorp，Denmark)，4℃过夜。磷酸缓冲液洗96孔板两遍，用含0.4％酪蛋白的磷酸缓冲液孵育1小时，然后用含8％(v/v)胎牛血清和抗CRISPLD2多克隆抗体(10ug/ml)的磷酸缓冲液孵育2小时，磷酸缓冲液洗4遍，加入辣根过氧化酶偶联的第二抗体，再用磷酸缓冲液洗4遍，商业TMB检测反应试剂96孔板显色反应，检测波长为450nm-570nm。以重组CRISPLD2(0.03-4.00微克/ml)为标准，可以定量样本中CRISPLD2的含量。获得的ELISA标准曲线如图1所示。
实施例2、蛋白纯度的鉴定
蛋白标本稀释在上样缓冲液中，由10％SDS-PAGE电泳胶分离，直接考马斯蓝染色鉴定蛋白纯度。免疫印迹法：SDS-PAGE电泳胶上的蛋白质转移到硝酸纤维膜(GE Healthcare)，硝酸纤维膜与含有第一抗体的缓冲液一起培养2小时37℃，清洗，荧光素标记的第二抗体(ROCKLAND)培养1小时37℃。ODYSSEY红外线图像系统(Infrared Imaging System)扫描硝酸纤维膜获得图像。结果如图2所示，可见获得了纯化的蛋白。
实施例3、CRISLD2的细菌结合能力
应用BIAcoreT100生物传感检测仪，通过Surface plasmon resonance(SPR)方法定量测定细菌抗原与CRISPLD2的结合。
细菌抗原分别如下：
E.coli LPS：购自Sigma；
金黄色葡萄球菌LTA：购自InvivoGen；
E-coli糖脂(PGN)：购自InvivoGen；
人工合成单链GPC-DNA(ODN2006)：购自InvivoGen，其序列为：5’-tcg tcgttt tgt cgt ttt gtc gtt-3’(24mer)；
人工合成单链CPG-DNA(ODN2006(Ctr))：购自InvivoGen，或其序列为：5’-tgc tgc ttt tgt gct ttt gtg ctt-3’(24mer)；
人工合成双链RNA(PolyI:C)：购自InvivoGen。
用仪器公司提供的试剂分别将重组CRISPLD2蛋白和IgG(0.18mg/ml溶解于醋酸缓冲液，pH 4.5)偶联到传感芯片(GE Healthcare)的两个通道。不同浓度(浓度分别为：0，0.3，1.0，3.0，10和30μM)细菌抗原溶于磷酸缓冲液，并衡量注入，同时流过传感芯片(20μl/min)的两个通道。从重组CRISPLD2蛋白通道获得的细菌抗原的结合反应单位(RU)减去IgG通道的信号(RU)；磷酸缓冲液(PBS)洗去未结合的细菌抗原；然后50mM NaOH洗去结合的细菌抗原，对芯片进行再生。
KD可以通过计算koff/kon两个常数的比率得到。解离比率常数(dissociationrate constant，koff)可以用公式：Rt＝Rt0e-koff(t-t0)。结合比率常数(associationrate constant，on))kon，从koff值推导，公式为：Rt＝Rmax[1-e-(konC+koff)(t-t0)]这里C为细菌抗原浓度，是细菌抗原与CRISPLD2结合最大结合反应单位(RU)，Rt是时间t.时细菌抗原与CTRISPLD2结合的量。
结果如图3所示。因此，CRISLD2能与ssDNA和LPS结合，但不结合金黄色葡萄球菌LTA、人工合成大肠杆菌PGN或人工合成双链RNA(dsRNA)。
实施例4、血液样品中CRISPLD2的浓度
血清、血桨CRISPLD2的浓度(64例正常成人，5例新生儿)测定如下：对于64例正常成人的血清和血桨，5例新生儿的脐带血，用免疫印迹法分析其CRISPLD2浓度。参照重组CRISPLD2标准浓度，血清、血浆CRISPLD2浓度由ODYSSEY红外线图像扫描分析系统计算定量。成人血清与新生儿脐带血CRISPLD2比较，并用T-test进行显著性分析。P＝0.025。将半定量免疫印迹法与竞争性-ELISA(表2)进行比较，结果相符合。
表2、竞争性-ELISA检测64例健康正常人血清以及5例新生儿的脐带血
  分子   标本  例数(n)   平均浓度(μg/ml)   范围(μg/ml)
  CRISPLD2   正常成人血清  64   220   50-500
  CRISPLD2   脐带血桨  5   55   20-100
实施例5、盲肠结扎穿孔混合细菌感染模型以及不同剂量LPS腹腔注射后血清CRISPLD2浓度
低度、中度盲肠结扎穿孔(CLP)混合细菌感染脓毒血症模型的制备：动物盲肠不同部位的结扎，盲肠穿刺针头的大小和盲肠穿孔次数的多少决定了动物混合细菌感染脓毒血症的严重程度。盲肠结扎穿孔手术前12小时禁食。腹腔戊巴比妥4毫克/公斤麻醉，下腹部去毛消毒。下腹部中线手术切开1厘米切口，从肠系膜分离盲肠，进行盲肠结扎及穿孔；低度脓毒血症结扎10％盲肠；中度脓毒血症结扎50％盲肠；穿孔使用21号针头。假手术组开下腹以后无盲肠结扎和穿孔。关闭创口，补充体液(50毫升/公斤生理盐水)。动物可以进食和饮水。
低度、中度盲肠结扎穿孔(CLP)混合细菌感染大鼠模型，以假手术为阴性对照；小鼠腹腔注射不同非毒性剂量E.coli-LPS，细菌脂蛋白和磷脂壁酸LTA，不同时间点小鼠尾静脉抽血，血清CRISPLD2由ELISA检测。盲肠结扎手术和穿刺诱导混合细菌感染脓毒血症以及低剂量LPS腹腔注射后血清CRISPLD2浓度的时间动力学曲线如图4A为盲肠结扎手术和穿刺诱导低度、中度混合细菌感染后血清CRISPLD2浓度变化。图4B为低剂量LPS腹腔注射后血清CRISPLD2浓度变化。
实施例6、重组CRISPLD2阻断LPS与靶细胞受体结合，抑制靶细胞炎症因子释放
5×106个/毫升人类外周单个核细胞悬浮在RPMI 1640培养液中(0.1％FCS)，加入重组CERISPLD2蛋白和Cy2标记的LPS，4℃，20分钟。流式细胞仪分析，单核细胞与淋巴细胞由点阵图分离(Dot-plot，SSC versus FSC)，分别分析FITC-LPS在这两群细胞上的荧光强度。重组CRISP-3蛋白(购自R&D)作为对照。结果如图5A和5B所示，重组CERISPLD2蛋白可阻断大肠杆菌LPS(Ec LPS)及沙门氏菌LPS与靶细胞受体结合。
5×106个/毫升人类外周单个核细胞悬浮在RPMI 1640培养液中(0.1％FCS)，加入重组CERISPLD2蛋白和LPS，37℃、18小时。培养液中TNF-α、IL-6由ELISA测定。结果如图5C和5D所示，重组CERISPLD2蛋白可阻断大肠杆菌LPS诱导的炎症因子释放。
实施例7、重组人CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死，血清CRISPLD2浓度与内毒素休克存活率相关
三组balb/c小鼠都腹腔注射400微克E.coli-LPS(以PBS为溶剂)，同时，正常对照组腹腔注射PBS(21个小鼠)，实验组腹腔注射1毫克重组CRISPLD2(17个小鼠)，实验对照组腹腔注射1毫克重组CRISP3(7个小鼠)(该蛋白同属CRISP家族，但缺失LPS结合区域)。存活率计数并制图。
结果如图6A所示，重组人CRISPLD2保护小鼠免于内毒素休克致死。
小鼠(20个小鼠)腹腔注射非毒性剂量E.coli-LPS(30微克/小鼠)，第十天时与4只正常小鼠一起尾静脉抽血，CRISPLD2进行ELISA检测，6小时后对全部小鼠进行不同致死剂量E.coli-LPS随机腹腔注射。第三十二天时，存活的小鼠再次尾静脉抽血，血清1∶10000稀释，CRISPLD2进行ELISA检测，6小时后再次随机腹腔注射不同致死剂量E.coli-LPS。每一小鼠的致死剂量E.coli-LPS与当时的血清CRISPLD2浓度数据相对应，组成数据矩阵，并应用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析，P值＝0.0009。Excel的logarithmictrendline是数据矩阵的最佳匹配。
结果如图6B所示，小鼠血清CRISPLD2浓度与E.coli-LPS致死剂量正相关。
上述结果提示，CRISPLD2蛋白是一个预测革兰氏阴性细菌败血症以及个体对内毒素敏感性的靶分子。
实施例8、广谱抗菌素长时间治疗引起小鼠血清CRISPLD2浓度下降，小鼠对亚致死剂量LPS诱导的内毒素休克敏感性增加
万古霉素(Van)1毫克/毫升+新霉素(Neo)0.5毫克/毫升溶解于饮用水中喂食小鼠(27个小鼠)杀灭体内共生菌，不同时间点小鼠尾静脉抽血，血清1∶1000稀释，CRISPLD2进行ELISA定量检测。
结果如图7A所示，长时间服用万古霉素加新霉素导致小鼠血清CRISPLD2浓度下降。
正常饮水的正常对照组，饮水中含广谱抗菌素的4天组以及15天组，三组小鼠都腹腔注射200微克E.coli-LPS。正常小鼠腹腔注射400微克E.coli-LPS才会有70-80％死亡率，连续15天服用广谱抗菌素的小鼠与正常对照相比，腹腔注射200微克E.coli-LPS导致的死亡率显著增加，而连续4天服用广谱抗菌素的小鼠与正常对照相比无显著变化。统计方法和统计数据已标在图上。
结果如图7B所示，表明长时间服用万古霉素加新霉素增加了小鼠对内毒素休克的敏感性(32个小鼠)。
实施例9、预测浓毒性休克易感性的血清CRISPLD2浓度阈值
图8A所示合并三个类似图7的实验结果，42个小鼠的组合数据，分析血清CRISPLD2水平与内毒素休克存活率相关性，以确定具有应用价值的血清CRISPLD2浓度阈值。
图8B所示合并三个类似图7的实验结果，血清CRISPLD2浓度成正态分布。
血清CRISPLD2浓度在平均值以下的小鼠由E.coli-LPS亚致死剂量(200微克/小鼠)导致的存活率显著下降；反之，血清CRISPLD2浓度在平均值以上的小鼠耐受E.coli-LPS亚致死剂量(200微克/小鼠)，存活率显著增加。血清CRISPLD2浓度平均值可以作为浓毒性休克易感性的阈值。
图8C所示血清抗内毒素免疫球蛋白(IgG)浓度与浓毒性休克易感性无关。
实施例10、重组CRISPLD2静脉注射，或小剂量LPS预注射，提高血清CRISPLD2水平保护混合细菌感染的中度盲肠结扎穿孔(CLP MID)小鼠
将重组CRISPLD2静脉注射，提高血清CRISPLD2水平25％，部分保护混合细菌感染的中度盲肠结扎穿孔(CLP MID)小鼠，如图9A和B所示；小剂量LPS(50微克/小鼠)预注射8天以后，提高血清CRISPLD2水平70-90％，很好地保护混合细菌感染的中度盲肠结扎穿孔(CLP MID)小鼠，如图9C-D所示。图9所示这一保护能力与血清CRISPLD2相关。
动物模型模说明：CLP脓毒血症动物模型模拟急性混合细菌感染，病理学原理和临床症状接近人类急性混合细菌感染脓毒血症。1.轻度脓毒血症模型，死亡率10-20％；2.中度严重脓毒血症模型，死亡率40-60％；3.重度严重脓毒血症模型，死亡率80-100％。动物盲肠不同部位的结扎，盲肠穿刺针头的大小和盲肠穿孔次数的多少决定了动物混合细菌感染脓毒血症的严重程度。盲肠结扎穿孔手术前12小时禁食。腹腔戊巴比妥4毫克/公斤麻醉，下腹部去毛消毒。下腹部中线手术切开1厘米切口，从肠系膜分离盲肠，进行盲肠结扎及穿孔；低度脓毒血症结扎10％盲肠；中度脓毒血症结扎50％盲肠；高度脓毒血症结扎75％盲肠；穿孔使用21号针头。假手术组开下腹以后无盲肠结扎和穿孔。关闭创口，补充体液(50毫升/公斤生理盐水)。动物可以进食和饮水。
实施例11、临床相关性
在临床上，分析病人体内的CRISPLD2浓度情况。严重脓毒血症病人PCT高，但CRISPLD2浓度低下的血清样本频率更敏感地反映脓毒血症病人的严重程度及死亡率。CRISPLD2浓度高于阈值的血清样本频率提示天然免调控机制尚可维持平衡，提示医生防止出现天然免疫调控机制失衡。
病人：30例急症严重创伤及其他原因引起的格兰氏阴性和阳性混合细菌感染病人，重症病人进入ICU病房。
血清CRISPLD2以及脓毒血症标志分子检测：平均检测1次/4天，28天连续观察血清CRISPLD2以及血清降钙素原(PCT，Procalcitonie)的浓度。
阈值界定：血清CRISPLD2水平的均值220微克/毫升为阈值，低于这一水平被认定为是CRISPLD2低，反之被认定为CRISPLD2高；降钙素原(PCT)正常值为0.03纳克/毫升，脓毒血症血清PCT阈值为2.0纳克/毫升，最高可达数百纳克/毫升。在其他感染性疾病，血清PCT一般低于2.0纳克/毫升水平。
病人临床严重程度指标：临床综合指数APACHEII；Acute Physiology andChronic Health Evaluation II急性生理学及慢性健康状况评分。APACHE II指数4-14为轻度脓毒血症病人；15-23为重度脓毒血症病人；23-39为严重脓毒血症乃至浓毒性休克高发病人(病例30，标本数180)。
图10显示了脓毒血症病人严重程度与血清CRISPLD2以及PCT的相关性。CRISPLD2-低/PCT-高的血清样本频率更敏感地反映脓毒血症的严重程度及死亡率。
讨论
1.分泌蛋白CRISPLD2是一个预测严重脓毒血症及脓毒性休克敏感性的靶分子
本发明显示，非常保守的半胱氨酸富集的分泌蛋白CRISPLD2(Cysteine-rich secretory protein LCCL domain containing 2)是一个血清浓度较高的ssDNA和LPS结合蛋白，该蛋白拥有一个R3H(RAAIH)结构域与ssDNA结合；两个与LPS结合的LCCL结构域，并具有较高的亲和力与ssDNA和LPS结合。不同于已知应急蛋白，大鼠肠穿孔混合细菌感染以及小鼠腹腔注射非毒性剂量LPS的第二天(急性期)，血清CRISPLD2浓度缓慢上升，第五天峰值。相反，初步实验数据显示肠穿孔混合细菌感染大鼠的感染部位组织渗出液中CRISPLD2浓度感染后数小时内快速上升。统计学分析发现该蛋白血清浓度与内毒素致死剂量正相关。CRISPLD2保护混合细菌感染动物与其血清浓度相关，这提示CRISPLD2蛋白是一个预后脓毒性休克敏感性、治疗严重脓毒血症及脓毒性休克的靶分子。
2.CRISPLD2蛋白可以保护小鼠，增加脓毒性休克的存活率，可以预防脓毒性休克
人类、小鼠和大鼠的心脏、肺脏、小肠、胎盘以及粒细胞、单核细胞都高表达CRISPLD2。体外实验中本发明人还发现大部分白细胞(包括粒细胞、单核细胞)自然释放该ssDNA和LPS结合蛋白。该蛋白在正常生理浓度范围内可以阻断LPS与受体结合，并抑制LPS诱导的炎症因子释放，包括肿瘤坏死因子TNF-α释放；该重组蛋白腹腔注射可以保护小鼠，大幅降低内毒素休克的死亡率，静脉注射该重组蛋白降低混合细菌感染死亡率，内源性大幅上调该蛋白血清水平导致大幅降低混合细菌感染死亡率。
外源性和内源性上调血清CRISPLD2水平，保护混合细菌感染CLP小鼠的结果提示：1.混合细菌感染中，内毒素(LPS)是引起脓毒性休克的几种已知细菌抗原中的主要抗原之一；2.CRISPLD2是LPS病理学反应的关键血清调控蛋白。3.由细菌抗原引起的反应，可能包括凝血系统异常，过度的免疫反应，组织器官衰竭以及其它血崩式的病理学反应；CRISPLD2蛋白的调控机制发生在病原分子与其细胞受体结合之前。
3.临床应用
根据以上理论基础，临床研究发现：严重脓毒血症病人CRISPLD2浓度低下的血清样本频率敏感地反映脓毒血症病人的严重程度及死亡率，而CRISPLD2浓度高于阈值的血清样本频率提示天然免调控机制尚可维持平衡，提示医生防止出现天然免调控机制失衡，开拓了临床预后及治疗应用的领域。本发明人还根据实验结果和严重脓毒血症病人临床研究，提出了应用临床预后的血清CRISPLD2浓度阈值标准，以及预防、干预治疗的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)

1.含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的药物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物用于：
阻断脂多糖与靶细胞受体结合；或
抑制脂多糖诱导的炎症因子释放。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2通过结合细菌单链DNA和/或脂多糖预防、缓解或治疗脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克。
4.含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的用途，用于制备诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂或试剂盒。
5.特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂的用途，用于制备诊断或预后细菌感染脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂盒。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂选自：
特异性扩增含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的引物；
特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2基因的探针；或
特异性结合含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体或配体。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体。
8.一种用于诊断或预后脓毒血症、严重脓毒血症或感染性休克的试剂盒，其特征在于，它包括：
容器，以及位于容器中的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2或其编码基因的试剂。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的特异性识别含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的试剂是抗含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2的抗体。
10.一种预防、缓解或治疗细菌感染或细菌感染相关疾病的方法，其特征在于，该方法包括：给予细菌感染者含LCCD和R3H结构域的半胱氨酸富集的分泌蛋白2。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102028935A (zh) * 2009-09-29 2011-04-27 上海南方基因科技有限公司 败血症以及败血症休克的预测、预防和治疗方法及试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021097685A1 (zh) * 2019-11-19 2021-05-27 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 混合检测PCT和Presepsin的试剂盒、方法以及应用

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