JP5709527B2 - 微生物感染症の治療 - Google Patents
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Description
緒言
本発明は、改良された微生物抗原ワクチン、医薬組成物、免疫原性組成物および抗体ならびに微生物感染症、特に、細菌由来（ブドウ球菌由来など）のものの治療におけるそれらの使用に関する。
本発明は、改良された微生物抗原ワクチン、医薬組成物、免疫原性組成物および抗体ならびに微生物感染症、特に、細菌由来（ブドウ球菌由来など）のものの治療におけるそれらの使用に関する。
多剤耐性（ＭＤＲ）は、特に、病院内で、グラム陽性菌において深刻化している問題である。細菌感染症を治療するために抗生物質および他の薬剤が広く用いられていることがそれらの薬剤に耐性を有する細菌の急速な発生につながり、多くの細菌が多剤耐性を有する。そのため、現在、そのような薬剤耐性感染症に対処するための改善された治療法を提供する必要がある。
ブドウ球菌(Staphylococci)は球状のグラム陽性菌であり、通常、ブドウのような不規則なクラスターに配列されている。ヒトの皮膚および粘膜の正常細菌叢のメンバーであるものも存在するし、化膿、膿瘍形成、様々な化膿性感染症、さらには致命的敗血症も引き起こすものも存在する。病原性ブドウ球菌は、多くの場合、溶血させ、血漿を凝固させ、様々な細胞外酵素および毒素を産生する。
ブドウ球菌属（The genus Staphylococcus）には少なくとも３０種存在する。臨床上重要である３つの主な種は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、および腐性ブドウ球菌(Staphylococcus saprophyticus)である。黄色ブドウ球菌はコアグラーゼ陽性であり、これにより他の種と区別される。黄色ブドウ球菌は、ヒトに対する主要な病原体である。ほとんど全ての人は一生の間に食中毒や軽度の皮膚感染症から生命を脅かす重度感染症にわたる重篤度の何らかの黄色ブドウ球菌感染症にかかる。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌は正常ヒト細菌叢であるが、とりわけ、非常に幼い患者、高齢患者および免疫不全患者において、多くの場合、埋め込み装置に関連して、感染症を引き起こすことがある。コアグラーゼ陰性ブドウ球菌によって引き起こされる感染症のおよそ７５％は表皮ブドウ球菌が原因である。Staphylococcus warneri、Staphylococcus hominis、およびその他の種が原因の感染症はあまり見られない。腐性ブドウ球菌は若い女性において比較的よく見られる尿路感染症の原因である。ブドウ球菌はカタラーゼを産生し、これにより連鎖球菌と区別される。S. lugdunensisも臨床的に関連があり、感染性心内膜炎の症例のおよそ５〜１０％において見られる。
関節腔内での、コラーゲンを主成分とする関節軟骨への黄色ブドウ球菌の定着は、敗血症性関節炎の発症に関与する重要な因子であるように思われる。血行性感染による細菌性関節炎は依然として深刻な医療問題である。この急速に進行する極めて破壊性の高い関節疾患は根絶することが困難である。一般に、感染した患者の５０％未満は回復するが深刻な関節損傷を受ける。黄色ブドウ球菌は、血行性および続発性骨髄炎にかかっている成人患者から単離された主要な病原体である。
入院患者において、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌は感染症の主な原因である。傷または留置している医療装置の初期局所感染は、敗血症、骨髄炎、乳腺炎および心内膜炎などのより重篤な侵襲性感染症に至ることがある。医療装置に関連した感染症では、移植の直後にプラスチックおよび金属の表面がフィブリノーゲンおよびフィブロネクチンなどの宿主血漿および基質タンパク質で覆われるようになる。黄色ブドウ球菌および他のブドウ球菌がこれらのタンパク質に付着するこの能力は感染の開始に不可欠である。血管移植片、静脈カテーテル、人工心臓弁、および心臓補助装置は血栓を形成し、細菌が定着しやすい。ブドウ球菌のうち、黄色ブドウ球菌が、一般的に、そのような感染について最も有害な病原体である。
世界を通じて病院内で、感染症を治療するために現在利用可能な抗生物質の大部分に対して耐性を示す黄色ブドウ球菌分離株の著しい増加が観察されている。黄色ブドウ球菌と闘うペニシリンの開発は、感染対策および治療における大きな進歩であった。残念なことに、ペニシリン耐性生物が急速に発生し、新しい抗生物質の必要性が重視された。新しい抗生物質が導入されるたびに、黄色ブドウ球菌はβ−ラクタマーゼ、改変ペニシリン結合タンパク質、および突然変異細胞膜タンパク質で対抗し、細菌の存続を可能にしてきた。その結果として、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）および多剤耐性生物が発生し、世界中の病院や老人ホームに重大な足がかりを築いてきた(Chambers, H.F., Clin Microbiol Rev, 1:173, 1988; およびMulligan, M.E., et al., Am J Med, 94:313, 1993)。今日、院内感染を引き起こすブドウ球菌の菌株の半数近くは、バンコマイシンを除く全ての抗生物質に耐性があるが、バンコマイシンの効果がなくなるのも時間の問題であると思われる。
そのため、黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌に起因する感染症を治療するための、この細菌の抗生物質耐性菌株に対して効果がある治療用物質の必要性は依然として非常に強く急増している。
ブドウ球菌、連鎖球菌および腸球菌などのグラム陽性病原体では、アドヘシンと呼ばれるタンパク質が、例えば、血塊への付着および外傷組織への定着を促すことにより、そのような感染を媒介する。これらの特異的な微生物表面アドヘシンはＭＳＣＲＡＭＭ（接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分）と呼ばれる(Patti, J., et al., Ann Rev Microbiol, 48:585-617, 1994; Patti, J. and Hook, M., Cur Opin Cell Biol., 6:752-758, 1994)。ＭＳＣＲＡＭＭは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、およびエラスチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を特異的に認識し、結合する。これらのＭＳＣＲＡＭＭは多くのグラム陽性病原体において見られ、それらのアミノ酸配列は関連しており、それらは類似のモジュール設計および共通の結合ドメイン構成を有する。
細菌細胞表面のＭＳＣＲＡＭＭと宿主組織内のリガンドは、鍵と鍵穴方式で相互作用し、細菌の宿主への付着が起こる。付着は、細菌の生存に必要であることが多く、細菌が宿主防御機構や抗生物質攻撃の回避を助ける。一度細菌が宿主組織への付着および定着に成功したら、それらの生理学は劇的に変化し、毒素や酵素などの損傷性成分が分泌される。さらに、付着細菌は多くの場合バイオフィルムを形成し、ほとんどの抗生物質の致死効果に急速に耐性を示すようになる。
細菌は、様々な基質タンパク質を認識するＭＳＣＲＡＭＭを発現することができる。ＭＳＣＲＡＭＭのリガンド結合部位は、アミノ酸配列の比較的短い隣接ストレッチ（モチーフ）によって定義されるように思われる。いくつかの異なる細菌種において類似のモチーフを見つけることができることから、これらの機能的モチーフは種間転移を受けるようである(Patti and Hook, Cur Opin Cell Biol, 6:752-758, 1994)。加えて、１つのＭＳＣＲＡＭＭがいくつかのＥＣＭリガンドと結合することができることもある。
ＭＳＣＲＡＭＭは、フィブリノーゲン（Ｆｇ）および／またはフィブロネクチン（Ｆｎ）などを含むタンパク質との結合により感染を媒介することができる。フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンは血漿中に見られるタンパク質であり、止血および凝固において重要な役割を果たす。
フィブリノーゲンは、６つのポリペプチド鎖、すなわち、２つのＡα鎖、２つのＢβ鎖および２つのγ鎖からなる。γ鎖のＣ末端部は生物学的に重要であり、血小板の付着および凝集中に血小板のインテグリンと相互作用する。黄色ブドウ球菌が標的としフィブリノーゲン依存性の細胞凝集および組織付着を起こすのもこの領域である。
黄色ブドウ球菌は、血小板の活性化および凝集を刺激するタンパク質が発現されるいくつかの表面を有する。黄色ブドウ球菌のＭＳＣＲＡＭＭタンパク質としては、限定されるものではないが、以下：
−フィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）；
−フィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）；
−フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ａ（ＦｎＢＰＡ）；
−フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ｂ（ＦｎＢＰＢ）；および
−黄色ブドウ球菌表面タンパク質ＳａｓＡ、ＳａｓＧ、ＳａｓＫなど
が挙げられる。
−フィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）；
−フィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）；
−フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ａ（ＦｎＢＰＡ）；
−フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ｂ（ＦｎＢＰＢ）；および
−黄色ブドウ球菌表面タンパク質ＳａｓＡ、ＳａｓＧ、ＳａｓＫなど
が挙げられる。
下記の表１は、様々な黄色ブドウ球菌細胞壁アンカー型表面タンパク質の選択の概要を示している。
a aa、アミノ酸単位でのタンパク質の長さ。
b タンパク質により認識、結合される分子成分（群）。
c ソルターゼにより認識される、Ｃ末端細胞壁選別シグナル中に存在するコンセンサスモチーフ。
d 細胞壁表面タンパク質が基質であるソルターゼ。
e TNFR、腫瘍壊死因子受容体
f 剥離上皮細胞中のタンパク質とも結合する。殺菌性脂質およびラクトフェリンに対する耐性を高める。
g 剥離鼻腔上皮細胞とも結合する。バイオフィルム形成に関与。
b タンパク質により認識、結合される分子成分（群）。
c ソルターゼにより認識される、Ｃ末端細胞壁選別シグナル中に存在するコンセンサスモチーフ。
d 細胞壁表面タンパク質が基質であるソルターゼ。
e TNFR、腫瘍壊死因子受容体
f 剥離上皮細胞中のタンパク質とも結合する。殺菌性脂質およびラクトフェリンに対する耐性を高める。
g 剥離鼻腔上皮細胞とも結合する。バイオフィルム形成に関与。
他のブドウ球菌は、上記のクランピング因子または結合タンパク質と類似している表面発現タンパク質（ＭＳＣＲＡＭＭ）を発現する。これらとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：
−表皮ブドウ球菌由来のＳｄｒＦ、ＳｄｒＧおよびＳｄｒＨ（ここで、ＳｄｒＧ／Ｆはフィブリノーゲンを結合することが分かっている）ならびにコラーゲン。
−表皮ブドウ球菌由来のＳｄｒＦ、ＳｄｒＧおよびＳｄｒＨ（ここで、ＳｄｒＧ／Ｆはフィブリノーゲンを結合することが分かっている）ならびにコラーゲン。
−Staphylococcus lugdunensis由来のＦｂｌはフィブリノーゲン結合タンパク質である。Ｆｂｌは、特徴的なセリン−アスパラギン酸リピート領域を含むブドウ球菌細胞表面タンパク質群であるＳｄｒファミリーのメンバーである。ＦｂＩのフィブリノーゲン結合ドメインは、３１３アミノ酸にマッピングされており、黄色ブドウ球菌由来のクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）の対応する領域に対して６２％同一性を示す。
他のリガンド結合タンパク質／アドヘシンには、Ｉｓｄタンパク質（鉄調節表面決定因子）が含まれ、それらの全てが本質的にＭＳＣＲＡＭＭであるわけでないが（例えば、ＩｓｄＢおよびＩｓｄＨ）は細菌の細胞外マトリックス成分への付着を促進し、本明細書では「ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質」と呼んでいる。ＩｓｄＡは扁平上皮細胞への付着を促進し、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンに対する親和性が弱いため、厳密にはＭＳＣＲＡＭＭと定義され得ることは知られている。
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）は、同定された最初のフィブリノーゲンγ鎖結合黄色ブドウ球菌アドヘシンである。続いて、フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ａ（ＦｎＢＰＡ）およびフィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ｂ（ＦｎＢＰＢ）が、Ｆｇのγ鎖の同じＣ末端ペプチドセグメントを結合することが分かっている二官能性タンパク質として認められた。ＣｌｆＡおよびＦｎＢＰは、ＣｌｆＢを含む、グラム陽性菌において発現される全ての細胞壁アンカー型タンパク質に共通した構造特性を有している。
例えば、クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）は、黄色ブドウ球菌の表在タンパク質である。ＣｌｆＡは黄色ブドウ球菌の重要な毒性因子である。ＣｌｆＡは、敗血症性関節炎および心内膜炎の病因となる。ＣｌｆＡは、限定されるものではないが、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥなどを含む、類似の構造的／モジュール構成を有する表面結合タンパク質ファミリーの典型である。
ＣｌｆＡは、５２０アミノ酸のＮ末端Ａドメイン（フィブリノーゲン結合領域）を含み、そして、このＡドメインは３つの独立して折り畳まれたサブドメインＮ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなる。このＡドメインは、その後にセリン−アスパラギン酸ジペプチドリピート領域と細胞壁−および膜−貫通領域が続き、そして、ソルターゼ促進の細胞壁への固定のためのＬＰＤＴＧ−モチーフを含む。ＣｌｆＡは、事実上全ての黄色ブドウ球菌菌株に存在する(Peacock SJ, Moore CE, Justice A, Kantzanou M, Story L, Mackie K, O´Neill G, Day NPJ (2002) Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus. Infect Immun 70:4987-4996)。ＣｌｆＡは、フィブリノーゲンのγ鎖のＣ末端と結合し、それによって、フィブリノーゲン液中での細菌の凝集を誘導することができる(McDevitt D, Nanavaty T, House-Pompeo K, Bell E, Turner N, McEntire L, Foster T, Hoeoek M (1997) Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor (ClfA) and fibrinogen. Eur J Biochem 247:416-424およびMcDevitt D, Francois P, Vaudaux P, Foster TJ (1994) Molecular characterization of the clumping factor (fibrinogen receptor) of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol 11:237-248)。
ＣｌｆＡおよび関連フィブリノーゲン結合タンパク質ＳｄｒＧおよびＣｌｆＢの三次元構造解析によって、これら全ての関連タンパク質のリガンド結合Ａドメインが全て、３つのサブドメインＮ１、Ｎ２およびＮ３からなり、領域Ｎ２−Ｎ３に相当する残基２２１〜５５９が、フィブリノーゲンを結合する能力を保有する最も小さなトランケート(the smallest truncate)であるということが分かった。アミノ酸残基５３２〜５３８がＣｌｆＡのラッチングペプチド(the latching peptide)領域に相当することも見い出されている。各サブドメインは、新規ＩｇＧ型折り畳みを形成する９つのβ鎖を含んでなる。これらのタンパク質のフィブリノーゲンγ鎖ペプチド結合部位は、Ｎ２とＮ３との間の接合部の疎水性溝に存在する。これらのタンパク質の三次元構造間に有意な構造的類似性があることも見出されており、これは、１以上の関連アミノ酸配列、類似のモジュール設計および共通の結合ドメイン構成によるものである。
ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＦｎＢＰＡ−Ａ（７つのアイソフォーム全て）およびＦｎＢＰＢ−Ｂ（７つのアイソフォーム全て）は類似のモジュール構成を有するため、ＰＨＹＲＥ分子モデリングを用いて、これらのタンパク質は同じ三次元構造を有すると考えられた。
ＩｓｄＡおよびＩｓｄＢは、ＣｌｆまたはＳｄｒタンパク質と同じタイプの構造ではない。これらは、リガンド結合に関与するＮＥＡＴと呼ばれる新規モチーフを有する。しかしながら、ＮＥＡＴモチーフは、β鎖のサンドイッチ（２枚の五本鎖逆平行βシートからなるβサンドイッチ折り畳み）からなり、Ｉｇ−スーパーファミリーのメンバーであるという点においてＣｌｆまたはＳｄｒの三次元構造と類似している(Pilpa et al “Solution Structure of the NEAT (NEAr Transported) Domain from IsdH/HarA: the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus” J. Mol. Biol. (2006) 360:435-447)。ＩｓｄＨのＮＥＡＴモチーフの三次元構造は解明されており、ループ１ｂ−２の残基は予測されている。
黄色ブドウ球菌でのＣｌｆＡの発現は、マクロファージおよび好中球の両方により食作用を妨げる(Palmqvist N, Patti JM, Tarkowski A, Josefsson E (2004) Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis. Microb Infect 6:188-195およびHiggins J, Loughman A, van Kessel KPM, van Strijp JAG, Foster TJ (2006) Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes. FEMS Microbiol Lett 258:290-296)。好中球ではこれはフィブリノーゲン依存性機構およびフィブリノーゲン非依存性機構の両方によるものである。対照的に、血小板は、ＣｌｆＡを発現する細菌によってＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａとのその相互作用を通じて活性化され、凝集に至る。これは、フィブリノーゲンが存在するときに最も効率的に遂行されるが、血小板活性化に関するフィブリノーゲン非依存性経路も存在する(Loughman A, Fitzgerald JR, Brennan MP, Higgins J, Downer R, Cox D, Foster TJ (2005) Roles of fibrinogen, immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A. Mol Microbiol 57:804-818およびO´Brien L, Kerrigan SW, Kaw G., Hogan M., Penades J., Litt D., Fitzgerald D.J., Foster T.J. & Cox D. (2002) Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus: roles for the clumping factors ClfA and ClfB, the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A. Mol Microbiol 44, 1033-1044)。
ＣｌｆＡは、マウスにおいて敗血症性関節炎を誘発する毒性因子である(Josefsson E., Hartford O., O'Brien L, Patti JM, Foster T (2001) Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A, a novel virulence determinant. J Infect Dis 184:1572-1580)。加えて、ＣｌｆＡをもう１つのフィブリノーゲン結合タンパク質ＣｌｆＢとともに排除することにより感染初期において全身性炎症が抑えられた(Palmqvist N, Foster T, Fitzgerald R, Josefsson E, Tarkowski A (2005) Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation. J Inf Dis 191:791-798)。
黄色ブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質ＣｌｆＡは、単離され特徴付けられており、例えば、米国特許第６，００８，３４１号および第６，１７７，０８４号の対象である。
ＣｌｆＡとＣｌｆＢは同一の構造的（三次元）構成を有し、およそ２７％のアミノ酸同一性を有する。ＦｎＢＰＡはＣｌｆＡ対しておよそ２５％のアミノ酸同一性を有する。
現在、ＭＳＣＲＡＭＭに基づくワクチンは認可されておらず、市場に出ていない。第三相臨床試験ではあまり行われない、Veronate（登録商標）、ドナー選択されたブドウ球菌性の静注用ヒト免疫グロブリン(a donor-selected staphylococcal human immune globulin intravenous)（ＩＧＩＶ）によるＣｌｆＡおよびＳｄｒＧの標的化は試験から外されていた。現在、それは、ブドウ球菌感染症の実行可能な治療であるかどうかを判定するために再評価されている。
ＷＯ ２００５／１１６０６４は、黄色ブドウ球菌の多官能性結合タンパク質であるＦｎＢＰＡに向けられている。ＦｎＢＰＡのＮ末端ＡドメインはＣｌｆＡに似ており、フィブリノーゲンを結合することが分かっている。しかしながら、ＦｎＢＰＡのＣ末端ＢＣＤドメインはフィブロネクチンも結合するため、ＦｎＢＰＡは二官能性ＭＳＣＲＡＭＭである。
ＷＯ ２００５／１１６０６４は、トランスグルタミナーゼの存在下では、細菌アドヘシンＦｎＢＰＡとその宿主タンパク質フィブロネクチンとの間に共有結合が形成され、その関連性がずっと強くなり本質的に不可逆となるという発見に基づいている。フィブリノーゲンは血液の主成分（約３ｍｇ／ｍｌ）であり、血液中ではフィブリノーゲンは凝固カスケードの最終標的となっている。フィブロネクチンはあまり多く存在せず、各１０〜１５のフィブリノーゲンに対してＦｎは約０．３ｍｇ／ｍｌまたは１分子である。フィブリノーゲンとフィブロネクチンは、それらが独立に循環する血液中では関連があるとは考えられていない。
重要なことには、ＷＯ ２００５／１１６０６４は、具体的には、第ＸＩＩＩａ因子触媒による共有結合架橋に関する。ＷＯ ２００５／１１６０６４は、正電荷側鎖（すなわち、トランスグルタミナーゼ基質）を有する残基を改変した組換えＦｎＢＰＡにおいて複数の変異体を単離している。さらに、ＷＯ ２００５／１１６０６４は、フィブリノーゲンでなく改変された共有結合性フィブロネクチン結合特性だけを有する変異体に向けられる。加えて、この文献は、変異タンパク質とそのリガンドの結合が減少したかどうかを実験的にを証明しておらず、裏付ける免疫原性データも示していない。
よって、グラム陽性菌の多剤耐性率やこれらの多剤耐性菌に対して好結果を示す治療およびワクチンがないことを考えると、抗生物質を使用せずにそのような細菌感染症に対処することができる代替治療は非常に価値あるものとなるであろう。
さらに、公知の治療またはワクチンと比べての効力の改善は、とりわけ、臨床状況において、特に重要であろう。
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従って、本発明は、そのような細菌感染症の治療のための代替の改善された治療の提供に向けられる。
発明の説明
本発明の第１の一般的態様によれば、治療に用いるための、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントが提供される。
本発明の第１の一般的態様によれば、治療に用いるための、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントが提供される。
好ましい実施形態によれば、治療に用いるための、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質、またはそのフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメントが提供される。
本発明の第２の態様によれば、個体において免疫応答を誘導しおよび／または微生物感染症にかかっている患者を治療する方法であって、前記個体に、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメント、あるいは前記組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントを含んでなるワクチンを投与することを含む方法が提供される。
本発明の第３の態様によれば、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質、またはそのフラグメントを含んでなるワクチンが提供される。
本発明の第４の態様によれば、好ましくは、過免疫血清としての、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントに対して惹起された抗体が提供される。
本発明の第５の態様によれば、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメント、および製薬上許容されるアジュバントを含んでなる免疫原性医薬組成物が提供される。
詳細な説明
本明細書において、「アドヘシン」、「ＭＳＣＲＡＭＭ」および「細胞壁アンカー型タンパク質」という用語は、互いに代替可能であり、あらゆる微生物由来リガンド結合タンパク質を含むと理解されるであろう。理想的には、これらのタンパク質は、フィブリノーゲン、ヘムまたはヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロビン、へミン、コラーゲンなどのリガンドを結合する。「ＭＳＣＲＡＭＭ様」タンパク質という用語は、Ｉｓｄタンパク質などの、前述のＭＳＣＲＡＭＭタンパク質と、関連のアミノ酸配列、類似のモジュール設計および／または共通／類似の結合ドメイン構成を有するタンパク質またはアドヘシンを含むように意図されている。理想的には、ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質は、類似の結合ドメイン構成／モジュール設計を有する。加えて、ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質は、ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質と少なくとも５０％、好ましくは６０％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
本明細書において、「アドヘシン」、「ＭＳＣＲＡＭＭ」および「細胞壁アンカー型タンパク質」という用語は、互いに代替可能であり、あらゆる微生物由来リガンド結合タンパク質を含むと理解されるであろう。理想的には、これらのタンパク質は、フィブリノーゲン、ヘムまたはヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロビン、へミン、コラーゲンなどのリガンドを結合する。「ＭＳＣＲＡＭＭ様」タンパク質という用語は、Ｉｓｄタンパク質などの、前述のＭＳＣＲＡＭＭタンパク質と、関連のアミノ酸配列、類似のモジュール設計および／または共通／類似の結合ドメイン構成を有するタンパク質またはアドヘシンを含むように意図されている。理想的には、ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質は、類似の結合ドメイン構成／モジュール設計を有する。加えて、ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質は、ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質と少なくとも５０％、好ましくは６０％、好ましくは７５％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
また、本明細書において言及される同一または相同率はいずれも、配列の全長に対し、利用可能な従来の方法を用いて決定されることも理解されるであろう。
「微生物(micro-organism)」、「微生物(microbe)」、「微生物の(microbial)」などという用語は、限定されるものではないが、細菌、真菌、ウイルス、酵母および／または糸状菌を含む生物を含む。
「免疫学的に有効な量」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞応答を誘導することができる量を含む。
本発明の第１の一般的態様によれば、治療に用いるための、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのリガンド結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメントが提供される。そのような組換えタンパク質は、敗血症、敗血症性関節炎および／または心内膜炎またはその他の類似の状態もしくは病状の治療などの微生物感染症の治療に用いてよい。そのような微生物感染症は、理想的には、ブドウ球菌またはその他の類似の微生物(micro-organisms)によって引き起こされ得るものである。
本発明のこの態様の１つの特定実施形態によれば、前記組換えＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントは、その宿主リガンドを非共有結合する能力が低下しているまたはその能力に欠けている。
よって、前記組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントは、その宿主リガンドとの結合を減少させ得るまたはその宿主リガンドとの結合を抑制し得ることは理解されるであろう。
本発明によれば、ドック、ロックアンドラッチング(Dock, Lock and Latching)（ＤＬＬ）を介して結合中に起こる、前記ＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質のそのリガンドとの非共有結合は、減少し得るまたは抑制され得ると仮定される。ＭＳＣＲＡＭＭのそのリガンドとの結合における第１段階は、ＤＬＬモデルを介した非共有相互作用を必要とすることが確認されている。これらはそのリガンドとの一次非共有ＭＳＣＲＡＭＭ相互作用である。ＭＳＣＲＡＭＭ−リガンド結合における最終段階は共有相互作用を必要とする。この特定の実施形態において、前記組換えＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントは、改変されたドック、ロックアンドラッチングによりその宿主リガンドを非共有結合する能力が低下しているまたはその能力に欠けている。前記ドック、ロックオアラッチング段階の１以上が改変されていてよい。
ＤＬＬモデルは、そのリガンドとの複合体のＳｄｒＧの三次元構造から解明された。ＣｌｆＡは、ＤＬＬ機構の軽微な変化によって作用することが現在知られている(Ganech et al (2008) “A structural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics”. PloS Pathog 4(11); e1000226)。ＤＬＬモデルは、具体的には、リガンド結合に関与する非共有相互作用に関する。ＤＬＬモデルは、限定されるものではないが、ＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質を含む、（アミノ酸の類似性／相同性によっても構造的構成相同性によっても）類似の構造様式の他の全てのタンパク質について推論される。
ＭＳＣＲＡＭＭ、特に、ＣｌｆＡ／ＣｌｆＢに関して、最小リガンド結合ドメインが領域Ａ亜領域Ｎ１〜Ｎ３、具体的には、変異体Ｄｅｖ−ＩｇＧ Ｉｇ折り畳みを含んでなる亜領域Ｎ２およびＮ３を含んでなることも見出されている。変異体Ｄｅｖ−ＩｇＧ Ｉｇ折り畳みは、免疫グロブリンモチーフの新規変異体であり、ＤＥ−変異体とも呼ばれる。ＣｌｆＡ／Ｂの２つのＤＥｖ−ＩｇＧドメインの間に形成された疎水性ポケットはフィブリノーゲンγ鎖のリガンド結合部位であると仮定される。本質的には、リガンドはＮ２とＮ３を分ける疎水性溝と結合する。具体的には、リガンド結合中にリガンドの折り畳まれていないペプチド成分が、Ｎ２サブドメインとＮ３サブドメインとの間に存在するその溝に入る。サブドメインＮ３のＣ末端のラッチングペプチドがコンホメーション変化を受け、サブドメインＮ２の２つのβ鎖の間に入り、このようにして、リガンドが所定位置に固定される。実際、クランピング因子中の残基Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｔｙｒ３３８およびＬｙｓ３８９は、フィブリノーゲンγ鎖の末端残基４０８ＡＧＤＶ４１１を接触させるように提案されており、それらの突然変異性置換によって、フィブリノーゲンに対する親和性がないかまたは著しく低下したタンパク質がもたらされた。この特定実施形態のさらなる詳細は後に説明する。
これらの教示は、クランピング因子、特に、ＣｌｆＡに関するものであるが、類似のモジュール結合ドメイン構成を有し同じようにリガンドを結合する他のＭＳＣＲＡＭＭおよび／またはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質に同じように適用することができる。
よって、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントを提供するために、全長タンパク質、リガンド結合ドメイン、最小リガンド結合ドメインまたはそのフラグメントを、その宿主リガンドとの結合を減少させるまたは抑制するように改変してよい。理想的には、ＣｌｆＡ／ＣｌｆＢおよび他の類似のＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質の場合、理想的には変異体Ｄｅｖ−ＩｇＧ Ｉｇ折り畳みを含んでなる領域Ａ亜領域Ｎ２およびＮ３を、その宿主リガンドとの結合を抑制するまたは減少させるように改変してよい。そのような改変は、ＤＬＬに必要な最小リガンド結合ドメイン間を分ける疎水性溝とのリガンド結合を抑制するように設計される。
リガンド結合ドメインにおけるそのような改変は、全長タンパク質、リガンド結合ドメイン、最小リガンド結合ドメインまたはそのフラグメントのいずれかを用いて、アミノ酸の置換または欠失により、アミノ酸レベルにおいて起こり得る。また、リガンド結合タンパク質と十分に高い相同性を有するタンパク質またはそのフラグメントも用いてよいことは理解されるであろう。本明細書において定義される高い相同性は、少なくとも５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９５％〜９９％、さらに好ましくは９９％以上のヌクレオチドがＤＮＡ配列の全長にわたってマッチする場合、またはアミノ酸配列は同一ではないが、同じ機能および活性を有するタンパク質を産生するときにそのアミノ酸配列に関連して用いられる場合に存在する。高い相同性についてのこれらの説明がタンパク質の三次元構造、すなわち、モジュール結合ドメイン構成に関係することもあることは理解されるであろう。
完全なリガンド結合タンパク質、リガンド結合ドメイン、最小リガンド結合ドメインまたはそのフラグメントを用いてよいことは理解されるであろう。
リガンド結合ドメイン、最小リガンド結合ドメインなどのリガンド結合タンパク質の末端切断型タンパク質の使用、またはそのフラグメントの使用は、製造を容易にしタンパク質の望ましくない切断などの他の問題を克服するために有利である。例えば、最小リガンド結合ドメイン中に存在するラッチングペプチドを、欠失／除去または改変してよい。例えば、ラッチングペプチドは、ＣｌｆＡでは領域Ａのアミノ酸５３２〜５３８に相当し、ＣｌｆＢでは領域Ａのアミノ酸５３０〜５４０に相当する(Walsh et al (2004) JBC 279(49): 50691-50699)。ＤＬＬを介したＭＳＣＲＡＭＭとのリガンド結合を抑制するようにこれらの残基を改変、置換または除去／欠失してよい。このようにして、ＭＳＣＲＡＭＭのそのリガンドとのＤＬＬ「ラッチング」は抑制される。この「ラッチング」は非共有相互作用によって起こる。１つの実施形態において、ラッチングペプチドは残る領域ＡのＣ末端アミノ酸残基とともにそのまま除去される。もう１つの実施形態によれば、ラッチングペプチド領域だけが除去される。さらにもう１つの実施形態によれば、ラッチングペプチド領域は、リガンド結合／ラッチングの減少または抑制を生じさせるアミノ酸置換を受ける。これらの説明は、ＤＬＬによりリガンドを結合する全てのＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質あるいは類似のモデルにも適用することができる。
このようにしてＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質を改変することにより、そのリガンドを結合する能力のないリガンド結合タンパク質を提供することができ、このタンパク質は免疫化によりその野生型タンパク質よりも大きな免疫応答を刺激する。有利には、このタンパク質は全身性炎症を軽減し、それによって微生物毒性を減少させる。その結果として、そのリガンドを結合する能力に欠けているこの改変リガンド結合ＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＲＡＭＭ様タンパク質(MSRAMM-like protein)は、有利には、微生物感染症の治療に用いることができる。従って、これらの発見は、野生型タンパク質由来のワクチンまたは免疫化治療用物質と比べてより良い結果をもたらす、細菌感染症に対する新規の有益なワクチン／免疫化治療用物質を提供する。
本発明の１つの実施形態によれば、前記リガンドはヘム、ヘモグロビンまたはフィブリノーゲンである。ハプトグロビン-ヘモグロビン、ヘモグロビン、へミン、コラーゲンなどの他のリガンドも意図され得る。
本発明のもう１つの実施形態によれば、前記組換えＭＳＣＲＡＭＭタンパク質は、
フィブリノーゲン結合タンパク質；または
ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧおよび／もしくはＳｄｒＦ
から選択される。
フィブリノーゲン結合タンパク質；または
ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＳｄｒＧおよび／もしくはＳｄｒＦ
から選択される。
フィブリノーゲン結合タンパク質は上記に詳述しており、これらとしては、限定されるものではないが、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＦｂＩ、ＩｓｄＡなどが挙げられる。ＳｄｒＧ／Ｆがコラーゲンを結合することは知られている。他のＭＳＣＲＡＭＭとしては、ＳａｓＡ、ＳａｓＧ、ＳａｓＫおよびＳｄｒＨが挙げられる。
前記組換えＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質は、
ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、および／またはＩｓｄＨ
から選択され得る。
ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、および／またはＩｓｄＨ
から選択され得る。
フィブリノーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭ ＣｌｆＡからの発見に基づき、類似の非リガンド結合変異体を、例えば、Ｉｓｄタンパク質（ＩｓｄＨおよびＩｓｄＢを含む）のＮＥＡＴ（ＮＥＡｒトランスポーター）モチーフにおいて作製することができる。上記に詳述したように、ＩｓｄＡおよびＩｓｄＢは、ＣｌｆまたはＳｄｒタンパク質と同じタイプの構造ではない。しかしながら、ＩｓｄのＮＥＡＴモチーフはリガンド結合（ハプトグロビン−ヘモグロビン、ヘモグロビン、へミン）に直接関与するため、ＮＥＡＴモチーフの改変は、ＣｌｆまたはＳｄｒのＤＬＬまたはＤＬＬ様宿主−リガンド相互作用を改変するのと同じように、宿主−リガンド相互作用(the host-ligand interation)を抑制するであろう。黄色ブドウ球菌のＩｓｄＡをはじめとする多くのＮＥＡＴドメイン含有タンパク質は、ヘム結合に関係している。ＩｓｄＡのヘム結合特性はＮＥＡＴドメイン内に含まれると仮定される。ヘムとの複合体のアポＩｓｄＡ ＮＥＡＴドメイン結晶構造は、大きな疎水性ヘム結合ポケットを有するクラスリンアダプター様β−サンドイッチ折り畳みを示した。ＩｓｄＢは２つのＮＥＡＴモチーフを有し、ＩｓｄＡは１つのＮＥＡＴモチーフを有する。Ｉｓｄタンパク質の非リガンド結合変異体は、リガンド結合について予測される残基を改変することにより、例えば、β鎖間の残基および／または疎水性ポケットを改変することにより単離してよい。加えて、ＮＥＡＴモチーフも、非共有宿主−リガンド相互作用をもたらすように改変してよい。
本発明のこの態様のもう１つの実施形態によれば、個体において免疫応答を誘導しおよび／または微生物感染症にかかっている患者を治療する方法であって、前記個体に、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメント、あるいは前記組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントを含んでなるワクチンを投与することを含む方法が提供される。
本発明のこの態様のもう１つの実施形態によれば、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントを含んでなるワクチンが提供される。
本発明のこの態様のもう１つの実施形態によれば、好ましくは、過免疫血清としての、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントに対して惹起された抗体が提供される。
本発明のこの態様のもう１つの実施形態によれば、その宿主リガンドとの結合が減少した、組換えブドウ球菌ＭＳＣＲＡＭＭもしくはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、またはそのフラグメントを含んでなる免疫原性医薬組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態によれば、治療に用いるための、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、またはフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメントが提供される。
前記組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、またはそのフラグメントを、敗血症、敗血症性関節炎および／または心内膜炎またはその他の類似の状態もしくは病状の治療などの微生物感染症、好ましくは、ブドウ球菌感染症の治療に用いてよいことは理解されるであろう。
前記タンパク質のフィブリノーゲン結合領域は、それがフィブリノーゲンをもはや結合しないように改変される。上述のように、この改変は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルにおいて起こり得る。また、フィブリノーゲン結合タンパク質と十分に高い相同性を有するタンパク質またはそのフラグメントも用いてよいことは理解されるであろう。本明細書において定義される高い相同性は、少なくとも５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％、さらに好ましくは９５％〜９９％、さらに好ましくは９９％のヌクレオチドがＤＮＡ配列の全長にわたってマッチする場合またはアミノ酸配列は同一ではないが同じ機能および活性を有するタンパク質を産生するときにそのアミノ酸配列に関連して用いられる場合に存在する。高い相同性についてのこれらの説明がタンパク質の三次元構造に関係することもあることは理解されるであろう。
完全なフィブリノーゲン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合領域、最小フィブリノーゲン結合領域、またはそのフラグメントを用いてよいことは理解されるであろう。末端切断型タンパク質またはそのフラグメントの使用は、製造を容易にしタンパク質の望ましくない切断などの他の問題を克服するために有利である。これについては以下に詳説する。
そのようなフラグメントは、理想的には、ＭＳＣＲＡＭＭのフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるべきである。末端切断型タンパク質または例えば、リガンド−フィブリノーゲン結合領域の１以上のサブドメインだけを含んでなるそのフラグメントを使用することの利点は、分解なしに高収率でタンパク質を精製可能であることに関係している。ＣｌｆＡタンパク質フィブリノーゲン結合領域は、Ａ領域とも呼ばれ、３つの亜領域、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなる。そのため、免疫原性フラグメントは、ＣｌｆＡ Ａ領域の亜領域Ｎ１、Ｎ２および／またはＮ３もしくはそのフラグメントを含んでなり得る。従って、例えば、ＣｌｆＡに関して、前記フラグメントは領域Ａのサブドメイン、Ｎ１、Ｎ２またはＮ３の１以上を含んでなり得る。理想的には、Ｎ２およびＮ３をこのトランケートとして用いてよく、このトランケートはタンパク質分解を受ける可能性が低く（プロテアーゼ切断部位はＣｌｆＡおよびＣｌｆＢのＮ１とＮ２の間にあると報告されている）、大腸菌(E. coli)においてより高いレベルで発現させることができる。Ｎ２およびＮ３はＣｌｆタンパク質の最小フィブリノーゲン結合領域である。
次の考察はフィブリノーゲン結合タンパク質ＣｌｆＡに関するものであるが、これらの説明を、他のＭＳＣＲＡＭＭ、ＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質、特に、アミノ酸またはタンパク質構造レベルのいずれかにおいてＣｌｆＡと構造的に類似している、例えば、ＣｌｆＢ、ＦｂＩおよびＳｄｒＦ／Ｇ（これらはコラーゲンも結合する）のような他のフィブリノーゲン結合タンパク質に同じように適用することができることは理解されるであろう。さらに、これらの教示はＦｎＢＰＡおよびＦｎＢＰＢにも適用することができる。従って、次の説明はフィブリノーゲン結合タンパク質に関するものであるが、フィブリノーゲン以外のリガンドを結合する他のＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質に同じように適用することができる。
本発明者らは、フィブリノーゲンを結合する能力のない、この改変フィブリノーゲン結合タンパク質、トランケートまたはそのフラグメントは免疫化により、通常フィブリノーゲンと結合するその野生型タンパク質よりも大きな免疫応答を刺激するということを偶然発見した。有利には、この改変フィブリノーゲン結合タンパク質は、黄色ブドウ球菌が発現される際に全身性炎症を誘発せず、それによって微生物毒性を減少させる。その結果として、フィブリノーゲンを結合する能力に欠けているこの改変タンパク質は、有利には、微生物感染症の治療に用いることができる。予想に反して、本発明者らは、この改変フィブリノーゲン結合タンパク質の防御効果が野生型タンパク質よりも大きいことも発見した。本発明者らは、そのような改変組換えタンパク質を含んでなる医薬組成物またはワクチンが、非改変（野生型）形態の同じ組換えタンパク質、例えばＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＧなどを含んでなる医薬組成物またはワクチンよりも効果が高いことも発見した。
従って、これらの発見は、ワクチン／免疫化治療用物質としても用いる場合に野生型タンパク質と比べてより良い結果をもたらす、細菌感染症に対する新規の有益なワクチン／免疫化治療用物質を提供する。
改変タンパク質は、ＭＳＣＲＡＭＭまたはＭＳＣＲＡＭＭ様タンパク質のものでもフィブリノーゲンまたは他のリガンドの結合タンパク質のものでも、そのような微生物感染症の治療に用いるための、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化抗体またはそのフラグメントを含む抗体の作製に用いてよいことは理解されるであろう。それゆえ、そのような抗体、例えば、過免疫血清を含む組成物を提供してよく、これらの組成物をブドウ球菌感染症に感染した患者の治療に用いてもよい。
よって、ブドウ球菌の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との結合を阻害するため、および患者におけるブドウ球菌感染症を予防／治療するために、前記タンパク質またはその活性フラグメントを用いてよい。
さらに、前記タンパク質またはその活性フラグメント、および前記タンパク質に対する抗体は、ブドウ球菌感染による感染症の治療に、能動または受動ワクチン接種用のワクチンの開発に有用であり、医薬組成物として傷または医療装置に投与する場合には、前記タンパク質も抗体も微生物感染症を予防する阻止薬として有用である。例えば、これらのタンパク質またはそのフラグメントは能動ワクチンに用いてよく、これらのタンパク質に対する抗体は受動ワクチンに用いてよい。
本明細書に記載のこれらのワクチンおよび製品は先行技術に対して著しい改善をもたらし、先行技術では免疫を与えるためのＭＳＣＲＡＭＭの一般的使用が教示されているが、本明細書に記載の予想外の改善されたワクチンまたは製品は教示されていない。
タンパク質、ＤＮＡおよび抗体の調製は当技術分野で周知であり、本明細書では詳細に記載しない。理想的には、これらの分子の作製において従来の技術が用いられる。本発明は、対象となる核酸またはアミノ酸配列を含有する核酸構築物、対象となるタンパク質を発現させるための、そのような核酸構築物を含有する組換え宿主細胞、および免疫原性組成物を含むと理解されるであろう。
投与では、前記タンパク質組成物を滅菌等張生理食塩溶液または他の製薬上許容されるアジュバント中に分散させてよい。
前記ワクチンがＤＮＡまたはタンパク質ワクチンであってよいことは理解されるであろう。
免疫化は、ＤＮＡ、タンパク質または抗体の注射によって行ってよい。あるいは、ＤＮＡを含み発現する弱毒化生物を投与してもよい。
投与し得るＤＮＡ、タンパク質または抗体の量は、プロモーター強度への依存性、タンパク質発現および発現遺伝子の免疫原性などのいくつかの緩和要素によって決まる。新たな用途ごとに必要な所望の免疫学的有効量が得られるようにこれらを改変してよい。
本発明のもう１つの実施形態によれば、個体において免疫応答を誘導しおよび／または微生物感染症にかかっている患者を治療する方法であって、前記個体に、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、または少なくともそのフィブリノーゲン結合領域を含んでなるそのフラグメントを投与することを含む方法が提供される。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、またはそのフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメントを含んでなるワクチンが提供される。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、好ましくは、過免疫血清としての、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、またはそのフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメントに対して惹起された抗体が提供される。
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、フィブリノーゲンを結合する能力のない、組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質、またはそのフィブリノーゲン結合領域の少なくとも一部を含んでなるそのフラグメント、および製薬上許容されるアジュバントを含んでなる免疫原性医薬組成物が提供される。
理想的には、前記組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質またはそのフラグメントは黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌および／またはS. lugdunensis由来のものである。
これらの実施形態のフィブリノーゲン結合タンパク質は、次のＦｂＩ、ＳｄｒＦ、および／またはＳｄｒＧ（これらはコラーゲン結合もする）の１つから選択してよい。あるいは、フィブリノーゲン結合タンパク質を、次のフィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）、フィブリノーゲン結合タンパク質クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ａ（ＦｎＢＰＡ）、フィブロネクチン−フィブリノーゲン結合タンパク質Ｂ（ＦｎＢＰＢ）の１つから選択してもよい。ＩｓｄＡは、付着を促進し、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンに対する親和性が弱いため、厳密にはフィブリノーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭと定義され得る。
そのようなフィブリノーゲン結合タンパク質のフィブリノーゲン結合領域内でのヌクレオチドまたはアミノ酸の置換または欠失により、フィブリノーゲンを結合する能力のない組換えタンパク質がもたらされることは理解されるであろう。
ＣｌｆＡ−フィブリノーゲン結合が、ＳｄｒＧのものと類似のドック、ロックアンドラッチ（ＤＬＬ）機構により起こることは解明されている。ＤＬＬモデルは上記に詳述した。ＣｌｆＡの領域Ａは前記タンパク質−リガンド相互作用に関与する。図１１に示されるように、いくつかのフィブリノーゲン結合ＭＳＣＲＡＭＭのモジュール構造は類似しており、全てＣｌｆＡと類似している領域Ａを含んでいる。
フィブリノーゲンγ鎖ペプチド結合部位は、ＣｌｆＡのＮ２とＮ３との間の接合部の疎水性溝に存在する。そのため、上述の置換または欠失は、ＭＳＣＲＡＭＭタンパク質−リガンド相互作用を改変しＣｌｆＡのフィブリノーゲンとの非共有結合を抑制するように設計される。
本発明の１つの特定の実施形態によれば、前記組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質はＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合欠損変異体である。この実施形態において、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合領域Ａは、任意の手段（置換または欠失突然変異など）によってそれがフィブリノーゲンをもはや結合しないように改変される。
理想的には、前記フィブリノーゲン結合タンパク質はＣｌｆＡであるが、ＣｌｆＡは多くの他のフィブリノーゲン結合タンパク質と三次元構造的類似性を有している。よって、ＣｌｆＡに関するこれらの説明は、ＣｌｆＢ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢ、ＦｂＩ、ＳｄｒＧ／Ｆ、ＩｓｄＡなどを含む他のＭＳＣＲＡＭＭフィブリノーゲン結合タンパク質に同じように適用することができることは理解されるであろう。これらのタンパク質は全て類似の三次元構造を有しているため、フィブリノーゲン結合領域に対して類似の改変／突然変異を行い、同じ結果を得ることができる。
ＣｌｆＡは、５２０アミノ酸のフィブリノーゲン結合ドメイン（アミノ酸４０〜５５９）を含んでなる９９３アミノ酸のタンパク質である。このフィブリノーゲン結合ドメインは、亜領域Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなるＮ末端Ａドメインである。本発明において、アミノ酸４０〜アミノ酸５５９のＮ１〜Ｎ３にわたるフィブリノーゲン領域全体を用いてよい。あるいは、Ｎ１〜Ｎ３領域のトランケート、例えば２２１〜５５９（最小フィブリノーゲン結合領域）、２２１〜５３１（ラッチングペプチドとそれに続く残基を含まない最小フィブリノーゲン領域）などを用いてもよい。理想的には、亜領域Ｎ２およびＮ３、すなわち、最小フィブリノーゲン結合領域を用いてよく、これはアミノ酸残基２２１〜５５９に相当する。あるいは、これらの亜領域のフラグメントを用いてもよい。
ＣｌｆＡのＮ２およびＮ３領域を含むアミノ酸残基２２１〜５５９は、フィブリノーゲンとの結合において重要な役割を果たし、最小フィブリノーゲン結合領域であることは確認されている。本発明者らはまた、この領域のアミノ酸残基の突然変異によって、その宿主免疫防御によって認識され得る発現タンパク質がもたらされるがフィブリノーゲン結合はないため、関連毒性が減少するということも偶然発見した。ＣｌｆＡのこの領域（３３９アミノ酸のフィブリノーゲン結合ドメイン）は、特異的三次元構造、いわゆるＤＥ−変異体ＩｇＧ折り畳みを有し、（置換または欠失などにより）改変した場合に改善された治療を提供し得る最小Ｆｇ−結合トランケートである。
フィブリノーゲン結合活性を喪失させる改変は、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルのいずれかにおける置換、付加または挿入または欠失によって行ってよい。理想的には、前記置換は、前記タンパク質またはフラグメントの（例えば、いわゆるＤＥ−変異体ＩｇＧ折り畳みの）三次元構造に悪影響を与えるため、それはフィブリノーゲンをもはや結合し得ない。
理想的には、前記ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換は、フィブリノーゲンとの非共有相互作用を、好ましくは、フィブリノーゲン結合タンパク質の領域ＡのＮ２とＮ３とを分ける疎水性ポケットとのリガンド結合を抑制することにより、減少させる。あるいは、リガンド結合を抑制するために、アミノ酸５３２〜５３８に相当するラッチングペプチド領域を置換によって改変してもよくまたは欠失させてもよい。加えて、ラッチングペプチド領域と、場合によってはＣ末端タンパク質残基の残部とを欠いている、すなわち、アミノ酸残基５３２〜５５９を欠いているトランケート／フラグメントを用いてもよい。
本発明のこの態様の１つの特定の実施形態によれば、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合欠損変異体は、アミノ酸Ｐ３３６をセリンとおよび／またはＹ３３８をアスパラギン酸とそれぞれ交換することによって構築してよい。残基の選択は、ＣｌｆＡのＸ線結晶構造とプロリンまたはチロシンの個々の変化により結合親和性を低下させるという見解に基づいた。驚くべきことに、本発明者らは、この変異型ＣｌｆＡタンパク質（ｒＣｌｆＡＰ３３６ Ｓ Ｙ３３８Ａ）は免疫応答を刺激し、ずっと効果の高いワクチンまたは抗体治療の創出に用いることができるということ発見した。この置換は、全長フィブリノーゲン結合タンパク質、フィブリノーゲン結合領域、最小フィブリノーゲン結合領域、またはそのフラグメントにおいて行ってもよい。
本発明のこの態様のもう１つの特定の実施形態によれば、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合欠損変異体は、アミノ酸Ｐ３３６をアスパラギン酸とおよび／またはＹ３３８をセリンとそれぞれ交換することによって構築してよい。前の実施形態と同様に、この変異型ＣｌｆＡタンパク質（ｒＣｌｆＡＰ３３６ Ａ Ｙ３３８Ｓ）もずっと効果の高いワクチンまたは抗体治療の創出に用いることができる。
あるいは、フィブリノーゲンを非共有結合する能力のない組換えフィブリノーゲン結合タンパク質をもたらすために、前記改変はラッチングペプチド配列（アミノ酸５３２〜５３８）を含まないフィブリノーゲン結合領域を含んでなる欠失形態であってもよい。この実施形態においては、ラッチングペプチドとそれに続くＣ−末端残基とを欠いている、ＣｌｆＡ領域Ａのアミノ酸残基２２１〜５３１を用いる。また、フィブリノーゲンのＤＬＬを妨げるラッチングペプチドアミノ酸５３２〜５３８におけるアミノ酸置換も意図され得る。
Ｃｌｆ−Ｓｄｒファミリーの全てのタンパク質がＤＬＬモデルによってリガンドを結合することは理解される。その三次元構造のモデリングによって、全長（Ｎ１〜Ｎ３）または最小リガンド結合トランケートＮ２−Ｎ３、またはそのフラグメントのいずれかにおいて、ラッチングペプチドを予測しそれを欠いたトランケートを作製することができる。
本発明者らは、これらの置換ｒＣｌｆＡタンパク質が（欠失変異体でも置換体でもトランケートでも）毒性および疾患の転帰を軽減し、驚くべきことに、野生型タンパク質よりも全身性炎症の誘発を減少させるということ発見した。
よって、これらの変異タンパク質による免疫化は、検証したタンパク質に基づき、変異型および野生型タンパク質の両方を認識した抗体のレベルを高め、野生型タンパク質よりも大きな免疫応答をもたらすと思われる。
よって、フィブリノーゲンをもはや結合しないように改変されたＣｌｆＡは、能動または受動免疫に有用な治療用物質候補である。このように、改変ＣｌｆＡタンパク質自体をワクチンとして用いてよく、またはこの改変ＣｌｆＡタンパク質対して惹起された抗体を用いてもよい。上記のように、前記ワクチンはＤＮＡまたはタンパク質ワクチンであってよい。
下記表に概略を示す次の配列を本発明に従って用いてよい。
２ 付加Ｎ残基（６ｘＨｉｓタグおよび付加残基）は６つのＨｉｓ残基の後に続いてＧｌｙおよびＳｅｒを含んでなる。付加Ｃ末端残基は、Ａｒｇの後に続いてＳｅｒを含んでなる（使用するプライマーまたは必要なＮ／Ｃ末端タグに応じて他の付加ＮおよびＣ末端残基を用いてよい））
３ ａａ残基５３２〜５３８に相当するラッチングペプチドと残りのＡ領域Ｃ末端残基とを含まない、すなわち、アミノ酸残基５３２〜５５９を欠いている。
理想的には、前記組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質は、残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８がセリンおよび／またはアラニンのいずれかと置換されている配列番号１〜３のいずれかによるアミノ酸配列、またはそのフラグメントを含んでなる。
あるいは、前記組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質のフラグメントは、配列番号４〜配列番号１４のいずれかによるアミノ酸配列を含んでなる。配列番号４および５は、上記表に概略を示すように、それぞれ、ＣｌｆＡ ＡドメインＮ１、Ｎ２、Ｎ３単独、ｒＣｌｆＡ Ｐ３３６Ｓ Ｙ３３８ＡおよびｒＣｌｆＡ Ｐ３３６Ａ Ｙ３３８Ｓに相当する。
また、ＳｄｒＧにおいて行われるラッチにおける置換に基づき、コンホメーション変化またはβ鎖相補性に欠陥があるラッチにおける置換はリガンド結合にも障害となるとも仮定される。よって、理想的には、前記置換は、ラッチングペプチドに相当するアミノ酸残基５３２〜５３８で起こり、ラッチングペプチドがコンホメーション変化を受ける能力またはリガンドを結合する能力あるいは両方に作用する。また、前記改変は、同様の結果を与えるように、アミノ酸残基５３２〜５３８（デルタラッチペプチド）を完全に除去することを含み得る。加えて、アミノ酸残基５３２〜５５９（ラッチングペプチド残基を含む）を欠いているＣ末端切断変異体もリガンドとの結合を生じさせるものであろう。
しかしながら、上記に具体的に列挙したもの以外の他のアミノ酸残基を置換し得るということも意図されであろう。例えば、前記タンパク質またはそのフラグメントのフィブリノーゲン結合特性を変更するために、Ｇｌｕ ５２６、Ｖａｌ ５２７、Ｔｙｒ ２５６およびＬｙｓ ３８９を置換してよい。このように、結合能力を低下させるいかなる置換も意図され得る。理想的には、そのような置換または欠失は、相同体、ＣｌｆＡのＶａｌ５２７およびＣｌｆＢのＮ５２６などの疎水性溝においてリガンドを結合するために疎水性ポケットおよび関連機構を生じさせる。ＣｌｆＢでは、Ｑ２３５およびＮ５２６が研究され、結合を減少させることが示された。ＦｎＢＰＡでも同様の研究が行われ、Ｎ３０４およびＦ３０６がＦｇ結合に重要であることが示された。このように、これらのアミノ酸残基における突然変異はリガンド結合に作用するであろう。
これらの説明を、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＧ、ＦｎＢＰＡ、ＦｎＢＰＢなどの他のフィブリノーゲン結合タンパク質に同じように適用することができることは理解されるであろう。よって、前記治療（ワクチン、抗体または医薬組成物など）は、完全フィブリノーゲン結合領域またはそのフラグメントを含んでなり得る。
本明細書において、「含んでなる(comprise, comprises, comprised and comprising)」という用語またはそのあらゆる語尾変化および「含む(include, includes, included and including)」という用語またはそのあらゆる語尾変化は完全に互いに代替可能であると考えられ、それら全てには可能な限り広範な解釈が与えられるべきである。
本発明は以上に記載した実施形態に限定されず、請求項の範囲内において構成および細部の両方を変更してよい。
ここで、以下の限定されない図面および実施例を参照して本発明を説明する。
図１〜図１５は実施例１の結果を示している。
実施例１
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなるｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（アミノ酸４０−５５９）
材料と方法
実施例に示す括弧内の数字で表した参考文献の詳細はこのセクションの最後に記述する。
Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなるｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（アミノ酸４０−５５９）
材料と方法
実施例に示す括弧内の数字で表した参考文献の詳細はこのセクションの最後に記述する。
マウス
ＮＭＲＩマウスは、Scanbur BK(Sollentuna, Sweden)から入手し、動物施設(the Department of Rheumatology, University of Goeteborg, Sweden)において飼育した。試験についてGoeteborg動物実験倫理委員会の承認を受けた。マウスは、１２時間の明暗サイクルで１ケージに１０動物まで収容し、標準的な研究用食餌および水を自由に摂取させた。試験開始時においてこれらの動物は６〜１６週齢であった。
ＮＭＲＩマウスは、Scanbur BK(Sollentuna, Sweden)から入手し、動物施設(the Department of Rheumatology, University of Goeteborg, Sweden)において飼育した。試験についてGoeteborg動物実験倫理委員会の承認を受けた。マウスは、１２時間の明暗サイクルで１ケージに１０動物まで収容し、標準的な研究用食餌および水を自由に摂取させた。試験開始時においてこれらの動物は６〜１６週齢であった。
細菌株
動物を感染させるために、黄色ブドウ球菌野生型菌株Ｎｅｗｍａｎ（１４）およびＬＳ−１（１１）ならびにその構築誘導体を使用した。菌株ＮｅｗｍａｎにおいてｃｌｆＡ Ｐ３３６ＳＹ３３８Ａ（ｃｌｆＡＰＹＩ）およびｃｌｆＡ Ｐ３３６ＡＹ３３８Ｓ（ｃｌｆＡＰＹＩＩ）誘導体を構築し、菌株ＬＳ−１に形質導入した（下記参照）。欠失変異体Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡ２：：Ｔｎ９１７変異体ＤＵ５８７６（３）およびＬＳ−１ ｃｌｆＡ２：：Ｔｎ９１７変異体（J.R. Fitzgerald et al.、非公開）も使用した。細菌を血液寒天培地プレートで４８時間増殖させ、回収し、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ(Sigma Chemicals)および１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドを含有するＰＢＳ中で−２０℃で凍結保存した。動物への注射前に、細菌懸濁液を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、適当な細胞濃度に調整した。各抗原投与に関し、血液寒天培地プレートで培養しコロニーを計数することにより生存能力のある細菌の数を測定した。
動物を感染させるために、黄色ブドウ球菌野生型菌株Ｎｅｗｍａｎ（１４）およびＬＳ−１（１１）ならびにその構築誘導体を使用した。菌株ＮｅｗｍａｎにおいてｃｌｆＡ Ｐ３３６ＳＹ３３８Ａ（ｃｌｆＡＰＹＩ）およびｃｌｆＡ Ｐ３３６ＡＹ３３８Ｓ（ｃｌｆＡＰＹＩＩ）誘導体を構築し、菌株ＬＳ−１に形質導入した（下記参照）。欠失変異体Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡ２：：Ｔｎ９１７変異体ＤＵ５８７６（３）およびＬＳ−１ ｃｌｆＡ２：：Ｔｎ９１７変異体（J.R. Fitzgerald et al.、非公開）も使用した。細菌を血液寒天培地プレートで４８時間増殖させ、回収し、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＢＳＡ(Sigma Chemicals)および１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ジメチルスルホキシドを含有するＰＢＳ中で−２０℃で凍結保存した。動物への注射前に、細菌懸濁液を解凍し、ＰＢＳで洗浄し、適当な細胞濃度に調整した。各抗原投与に関し、血液寒天培地プレートで培養しコロニーを計数することにより生存能力のある細菌の数を測定した。
黄色ブドウ球菌ＮｅｗｍａｎおよびＬＳ−１におけるｃｌｆＡＰＹＩおよびｃｌｆＡＰＹＩＩ突然変異の構築
この試験では、アミノ酸４０〜５５９に相当する、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなる全長ＣｌｆＡ Ａ領域トランケートを使用した。以下の説明および図面において：
−ＣｌｆＡは、ｒＣｌｆＡ４０−５５９（配列番号３）とも呼ばれ得る；
−ＣｌｆＡ Ｐ３３６ＳＹ３３８Ａは、ｃｌｆＡＰＹＩ、ｒｃｌｆＡＰＹまたはｒｃｌｆＡＰＹＩ（すなわち、ｃｌｆＡＰＹＩ４０−５５９）（配列番号４）とも呼ばれ得る；および
−ＣｌｆＡ Ｐ３３６ＡＹ３３８Ｓは、ｃｌｆＡＰＹＩＩ、ｒｃｌｆＡＰＹＩＩ（すなわち、ｃｌｆＡＰＹＩＩ４０−５５９）（配列番号５）とも呼ばれ得る。
この試験では、アミノ酸４０〜５５９に相当する、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３を含んでなる全長ＣｌｆＡ Ａ領域トランケートを使用した。以下の説明および図面において：
−ＣｌｆＡは、ｒＣｌｆＡ４０−５５９（配列番号３）とも呼ばれ得る；
−ＣｌｆＡ Ｐ３３６ＳＹ３３８Ａは、ｃｌｆＡＰＹＩ、ｒｃｌｆＡＰＹまたはｒｃｌｆＡＰＹＩ（すなわち、ｃｌｆＡＰＹＩ４０−５５９）（配列番号４）とも呼ばれ得る；および
−ＣｌｆＡ Ｐ３３６ＡＹ３３８Ｓは、ｃｌｆＡＰＹＩＩ、ｒｃｌｆＡＰＹＩＩ（すなわち、ｃｌｆＡＰＹＩＩ４０−５５９）（配列番号５）とも呼ばれ得る。
ｃｌｆＡに突然変異Ｐ３３６ＳおよびＹ３３８Ａを含むｐＣＦ７７ ＰＹの１．０２ｋｂ ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメント(Loughman et al., 2005)をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ−(Stratagene)にクローニングした。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで線状化し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｃｕｔ ｐＴＳｅｒｍＣ（J. Higgins、非公開）に連結し、Ｐ３３６ＳおよびＹ３３８Ａ置換を含む温度感受性大腸菌−黄色ブドウ球菌シャトルベクターであるプラスミドｐＡＲＭを作製した。
Ｐ３３６およびＹ３３８を置換することによって機能的または免疫反応性エピトープが偶然にも生み出される危険性を低下させるために、本発明者らは第２の変異体を作製した。この第２の変異体では置換順序を逆にし、Ｐ３３６ＡおよびＹ３３８Ｓを得た。これを作製するために、ｐＡＲＭと類似しているがＰ３３６ＡおよびＹ３３８Ｓ置換(the P336A and Y338S subsitutions)を含むプラスミドｐＪＨ２を作製した。ｐＣＦ７７ ＰＹ（６）を作製するのに使用した同じフランキングプライマーと、異なるオーバーラッピング変異プライマー対：
（突然変異は太字にし下線を施している）を使用してオーバーラッププライマーＰＣＲを利用し、ｐＣＦ７７ ＰＹＩＩを作製した。このプラスミドの１．０２ｋｂ ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを上記のように使用し、Ｐ３３６ＡおよびＹ３３８Ｓ置換を含む温度感受性大腸菌−黄色ブドウ球菌シャトルベクターであるｐＪＨ２を作製した。
ｐＡＲＭとｐＪＨ２の両方をエレクトロポレーションによりＲＮ４２２０（１５）に導入し、続いてファージ８５（１６）を使用して黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎ（１４）およびＬＳ−１（１１）に形質導入した。これらの菌株において、これらのプラスミドは染色体に挿入された後切除されるように促され、形質転換体の一部の染色体内に突然変異が残り、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩＩ、ＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩおよびＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩＩが生み出された。形質転換体をプラスミドの喪失およびフィブリノーゲン結合活性の喪失についてスクリーニングした。ｃｌｆＡプローブを使用したサザンハイブリダイゼーションによりｃｌｆＡ遺伝子の完全性を確認した（データは示していない）。抗ＣｌｆＡ領域Ａポリクローナルウサギ抗血清を使用したウエスタン免疫ブロット法により免疫反応性タンパク質（ＣｌｆＡＰＹ）の発現を確認した（データは示していない）。突然変異を、ゲノムＤＮＡのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント全体のＰＣＲおよびそれらの産物の商業的配列決定により確認した。配列決定された菌株ＬＳ−１のｃｌｆＡ遺伝子の約７００塩基は、菌株ＮｅｗｍａｎのＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡ遺伝子の対応する塩基と同一であった。
組換えＣｌｆＡおよびＣｌｆＡＰＹの製造
これまでに報告されているように（１７）、Ｈｉｓ−タグ付き組換えＣｌｆＡ領域Ａ、ドメインＮ１２３（アミノ酸４０−５５９）をｐＣＦ４０から製造し、陰イオン交換カラムによる研磨段階を追加した。プラスミドｐＣＦ７７ ＰＹ（６）を鋳型として使用してｃｌｆＡＰＹＩドメインＮ１２３をｐＱＥ３０にクローニングし、ｐＣＦ４０ＰＹを作製した。ｒＣｌｆＡに関して記載したように、このプラスミドを使用して、組換えＣｌｆＡＰＹもニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー(anion exchange chromatograpy)により製造した。濃縮および凍結乾燥の前に溶出液をＰＢＳで透析し、ＰＢＳを２回交換した。
これまでに報告されているように（１７）、Ｈｉｓ−タグ付き組換えＣｌｆＡ領域Ａ、ドメインＮ１２３（アミノ酸４０−５５９）をｐＣＦ４０から製造し、陰イオン交換カラムによる研磨段階を追加した。プラスミドｐＣＦ７７ ＰＹ（６）を鋳型として使用してｃｌｆＡＰＹＩドメインＮ１２３をｐＱＥ３０にクローニングし、ｐＣＦ４０ＰＹを作製した。ｒＣｌｆＡに関して記載したように、このプラスミドを使用して、組換えＣｌｆＡＰＹもニッケルアフィニティークロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー(anion exchange chromatograpy)により製造した。濃縮および凍結乾燥の前に溶出液をＰＢＳで透析し、ＰＢＳを２回交換した。
敗血症性関節炎および敗血症試験
試験１〜３では全てのマウス（各群ｎ＝１０）を菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させ、関節炎を誘発させた。試験４および５では、マウスを菌株ＮｅｗｍａｎおよびＬＳ−１それぞれにより感染させ、敗血症を誘発させた（各群ｎ＝１０）。
試験１〜３では全てのマウス（各群ｎ＝１０）を菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させ、関節炎を誘発させた。試験４および５では、マウスを菌株ＮｅｗｍａｎおよびＬＳ−１それぞれにより感染させ、敗血症を誘発させた（各群ｎ＝１０）。
試験１ マウスを３．５ｘ１０６ｃｆｕ／マウスの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎまたは４．３ｘ１０６ｃｆｕ／マウスのＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体（両方とも２００μｌ ＰＢＳ中）の静脈内注射により感染させた。臨床的関節炎および体重変化を第７日目まで追跡調査した。第８日目にマウスを犠牲にし、細菌の腎臓増殖を評価し、血清ＩＬ−６および総ＩｇＧ値を測定した。前後肢の関節において滑膜炎および骨破壊を組織学的に調査した。
試験２ マウスを５．０ｘ１０６ｃｆｕ、６．０ｘ１０６ｃｆｕまたは４．３ｘ１０６ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎ、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体またはＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡ：：ＥｒｍＲ（ｃｌｆＡヌル変異体）それぞれにより感染させた。臨床的関節炎および体重変化を第７日目まで追跡調査した。第７日目にマウスを犠牲にし、細菌の腎臓増殖を評価し、血清ＩＬ−６および総ＩｇＧ値を測定した。前後肢の関節において滑膜炎および骨破壊を組織学的に調査した。
試験３ マウスを４．７ｘ１０６ｃｆｕ、３．２ｘ１０６ｃｆｕ、３．９ｘ１０６ｃｆｕまたは４．８ｘ１０６ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎ、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体またはＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体それぞれにより感染させた。臨床的関節炎および体重変化を第７日目まで追跡調査した。第８日目にマウスを犠牲にし、細菌の腎臓増殖を評価した。
試験１〜３の結果はよく似ていたため、データをプールし、合わせて示した。
試験４では、マウスに５．２ｘ１０７ｃｆｕ、５．１ｘ１０７ｃｆｕまたは３．３ｘ１０７ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎ、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体またはｃｌｆＡヌル変異体それぞれを静脈内注射した。死亡率、体重変化および臨床的関節炎を第１０日目まで追跡調査した。
試験５では、マウスを９．４ｘ１０６ｃｆｕ、７．９ｘ１０６ｃｆｕ、１０．７ｘ１０６ｃｆｕまたは９．８ｘ１０６ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株ＬＳ−１、ＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体、ＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体、またはＬＳ−１ ｃｌｆＡヌル変異体それぞれにより感染させた。死亡率、臨床的関節炎および体重変化を第１６日目まで追跡調査した。
細菌の関節内注射
各マウスの１つの膝関節に２．４ｘ１０４ｃｆｕ、２．４ｘ１０４ｃｆｕ、または３．４ｘ１０４ｃｆｕの菌株Ｎｅｗｍａｎ 野生型、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体またはｃｌｆＡノックアウト変異体それぞれ（２０μｌ ＰＢＳ中）を注射した。各群Ｎ＝１０。３日後にマウスを犠牲にし、組織病理学的検査のために膝関節を採取した。
各マウスの１つの膝関節に２．４ｘ１０４ｃｆｕ、２．４ｘ１０４ｃｆｕ、または３．４ｘ１０４ｃｆｕの菌株Ｎｅｗｍａｎ 野生型、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体またはｃｌｆＡノックアウト変異体それぞれ（２０μｌ ＰＢＳ中）を注射した。各群Ｎ＝１０。３日後にマウスを犠牲にし、組織病理学的検査のために膝関節を採取した。
野生型および変異型組換えＣｌｆＡによるワクチン接種
精製したｒＣｌｆＡ４０−５５９、ｒＣｌｆＡＰＹ４０−５５９（すなわち、ｒＣｌｆＡＰＹＩ）またはＢＳＡを生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバント(Difco Laboratories)と１：１で乳化させた。第０日目に３０μｇ（＝０．５３ｎｍｏｌ）のタンパク質を含有するエマルジョン２００μｌを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。第１１日目にフロインド不完全アジュバント中の生理食塩水中３０μｇタンパク質による第１回目の追加免疫を行った。第２１日目に第２回目の追加免疫を行った。第３０日目にマウスから採血し、後で抗体応答を解析するために血清を凍結した。
精製したｒＣｌｆＡ４０−５５９、ｒＣｌｆＡＰＹ４０−５５９（すなわち、ｒＣｌｆＡＰＹＩ）またはＢＳＡを生理食塩水に溶解し、フロインド完全アジュバント(Difco Laboratories)と１：１で乳化させた。第０日目に３０μｇ（＝０．５３ｎｍｏｌ）のタンパク質を含有するエマルジョン２００μｌを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。第１１日目にフロインド不完全アジュバント中の生理食塩水中３０μｇタンパク質による第１回目の追加免疫を行った。第２１日目に第２回目の追加免疫を行った。第３０日目にマウスから採血し、後で抗体応答を解析するために血清を凍結した。
第３１日目に、各群１４〜１５マウスを、敗血症性関節炎の誘発のために４．０ｘ１０６ｃｆｕ／マウスのｉ．ｖ．注射により、または敗血症の誘発のために２．３ｘ１０７ｃｆｕ／マウスにより感染させた。臨床的関節炎、体重変化および死亡率をそれぞれ１１日間および１５日間追跡調査した。腎臓における細菌増殖を敗血症性関節炎試験により評価した。
感染マウスの臨床評価
臨床評価を盲検により行った。各肢を目視検査した。この検査により０〜３（０、腫脹および紅斑なし；１、軽度の腫脹および／または紅斑；２、中度の腫脹および／または紅斑；３ 著明な腫脹および／または紅斑）のスコアを付けた。動物の四肢全てのスコアを合計することによって関節炎指数とした。各マウスの全身状態も、全身性炎症の徴候、すなわち、体重減少、覚醒状態の低下、および毛の逆立ちを評価することによって検査した。重症の全身感染症の場合、マウスは病気が重くてさらに２４時間も生存できないと判断したときにはマウスを頸椎脱臼により死亡させ、敗血症による死亡と判定した。
臨床評価を盲検により行った。各肢を目視検査した。この検査により０〜３（０、腫脹および紅斑なし；１、軽度の腫脹および／または紅斑；２、中度の腫脹および／または紅斑；３ 著明な腫脹および／または紅斑）のスコアを付けた。動物の四肢全てのスコアを合計することによって関節炎指数とした。各マウスの全身状態も、全身性炎症の徴候、すなわち、体重減少、覚醒状態の低下、および毛の逆立ちを評価することによって検査した。重症の全身感染症の場合、マウスは病気が重くてさらに２４時間も生存できないと判断したときにはマウスを頸椎脱臼により死亡させ、敗血症による死亡と判定した。
組織学的検査
これまでに報告されている方法（１８）の変形（８）を用いて関節の組織学的検査を行った。
これまでに報告されている方法（１８）の変形（８）を用いて関節の組織学的検査を行った。
感染腎臓の細菌学的検査
腎臓を無菌摘出し、氷上で維持し、ホモジナイズし、ＰＢＳで連続希釈し、血液寒天培地プレート上に塗布した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に腎臓対当たりのｃｆｕ数を決定した。
腎臓を無菌摘出し、氷上で維持し、ホモジナイズし、ＰＢＳで連続希釈し、血液寒天培地プレート上に塗布した。３７℃で２４時間のインキュベーション後に腎臓対当たりのｃｆｕ数を決定した。
血清ＩｇＧの測定
放射免疫拡散法（１９）により血清中の総ＩｇＧ値を測定した。ヤギ抗マウス−ＩｇＧおよびマウスＩｇＧ標準は、Southern Biotech, Birmingham, ALから購入した。
放射免疫拡散法（１９）により血清中の総ＩｇＧ値を測定した。ヤギ抗マウス−ＩｇＧおよびマウスＩｇＧ標準は、Southern Biotech, Birmingham, ALから購入した。
特異的抗体−ＥＬＩＳＡ
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡによりｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹに対する血清特異的抗体応答を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡによりｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹに対する血清特異的抗体応答を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
第２回目の実施において、異なる免疫化群における特異的抗体応答をより正確に測定するために、特異的抗体応答をいくつかの血清希釈において決定した。そのため、全ての血清サンプルを１：５０００、１：２００００、１：８００００および１：３２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
ＩＬ−６の解析
これまでに報告されている方法（２０）によって血清ＩＬ−６を検出した。
これまでに報告されている方法（２０）によって血清ＩＬ−６を検出した。
統計分析
マンホイットニーＵ検定を用いて統計学的評価を行った。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。特に断りのない限り、データは、中央値、四分位範囲、および８０％中央範囲として報告している。
マンホイットニーＵ検定を用いて統計学的評価を行った。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。特に断りのない限り、データは、中央値、四分位範囲、および８０％中央範囲として報告している。
結果
ＣｌｆＡがフィブリノーゲンと結合するのに必要な２つのアミノ酸の置換により敗血症性関節炎および敗血症の発症が妨げられる
ＣｌｆＡによるフィブリノーゲン結合に必要であることが分かっている２つのアミノ酸（Ｐ３３６およびＹ３３８）を、細胞表面で非フィブリノーゲン結合ＣｌｆＡタンパク質を発現する菌株ＮｅｗｍａｎおよびＬＳ１の変異体を創出するように、対立遺伝子置換により改変した。前記タンパク質の発現レベルおよび完全性をウエスタンブロット法により測定し、細菌表面での変異タンパク質の発現が良好であり、発現されたタンパク質は適正なサイズであることを確認した。
ＣｌｆＡがフィブリノーゲンと結合するのに必要な２つのアミノ酸の置換により敗血症性関節炎および敗血症の発症が妨げられる
ＣｌｆＡによるフィブリノーゲン結合に必要であることが分かっている２つのアミノ酸（Ｐ３３６およびＹ３３８）を、細胞表面で非フィブリノーゲン結合ＣｌｆＡタンパク質を発現する菌株ＮｅｗｍａｎおよびＬＳ１の変異体を創出するように、対立遺伝子置換により改変した。前記タンパク質の発現レベルおよび完全性をウエスタンブロット法により測定し、細菌表面での変異タンパク質の発現が良好であり、発現されたタンパク質は適正なサイズであることを確認した。
Ｎｅｗｍａｎ野生型およびＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡ Ｐ３３６Ｓ Ｙ３３８Ａ（ｃｌｆＡＰＹＩ）が敗血症性関節炎を誘発する能力を調査した。敗血症性関節炎は、３．５ｘ１０６〜５．０ｘ１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）および３．２ｘ１０６〜６．０ｘ１０６ｃｆｕのＮｅｗｍａｎ野生型およびそのｃｌｆＡＰＹＩ変異体それぞれの静脈内接種により誘発した。関節炎の発症を７日間臨床調査した。ｃｌｆＡＰＹＩ変異体は、全試験期間中野生型菌株よりもはるかに重症でない関節炎を誘発した（Ｐ＞０．００１、図１Ａ）。関節炎の頻度はほとんどの時点においてＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩの場合よりも低かった（図６）。
予想外にも、ＣｌｆＡＰＹＩ分子の新たなアミノ酸組成は宿主の抗細菌防御との相互作用に適しているように思われる。この可能性を確かめるために、Ｐ３３６およびＹ３３８の代わりに異なるアミノ酸を用いた新しい構築物を作製した（ｃｌｆＡ Ｐ３３６Ａ Ｙ３３８Ｓ：ｃｌｆＡＰＹＩＩ）。３．９ｘ１０６ｃｆｕのＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩＩを接種したマウスはｃｌｆＡＰＹＩ変異体と同じ低い程度で（図１Ａ）、同様の頻度で（図６）関節炎を発症した。この結果は、フィブリノーゲン結合の喪失が関節炎レベルの低下に関与することを強く示唆している。
ＣｌｆＡは、フィブリノーゲン結合を必要としない機構により関節炎の発症に関与している可能性がある。これを検証するために、ＣｌｆＡタンパク質を欠いているＣｌｆＡ欠失変異体を、修飾非フィブリノーゲン結合ＣｌｆＡタンパク質を発現する変異体と比較した。しかしながら、４．３ｘ１０６〜４．８ｘ１０６ｃｆｕのｃｌｆＡヌル変異体により感染させたマウスは、ｃｌｆＡＰＹＩおよびｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体感染マウスと変わらずに関節炎を発症した（図１Ａ）。関節炎の頻度も変わらなかった（図６）。
感染関節も組織学的に調査した。試験１および２の両方において、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ感染マウスの滑膜炎は野生型感染マウスよりも著しく軽度であった（それぞれＰ＝０．０２および０．００１）。ヒト敗血症性関節炎の続発症の主な原因である骨破壊は、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ感染サンプルではほとんど見られなかった（試験２、Ｐ＝０．００１）。また、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体によって誘発された滑膜炎および骨破壊もＮｅｗｍａｎ野生型により感染させたマウスと比べてあまり著明ではなく（それぞれＰ＝０．００３および０．００６）、それほど著しくはないがＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ群よりもやや重度であった。
次に、感染過程に対するｃｌｆＡ突然変異の代謝の影響を解析した。試験期間中に、Ｎｅｗｍａｎ野生型菌株により感染させたマウスは最大約３０％の体重が減少した。フィブリノーゲン結合欠損変異体Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩおよびＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩＩにより感染させたマウスは、ほとんど全く体重が減少しなかった（Ｐ＞０．０００１ 対野生型）。対照的に、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体は体重減少に対して中間的な影響を及ぼし、野生型菌株よりもはるかに低いがｃｌｆＡＰＹＩおよびｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体菌株よりもはるかに高いものであった（ほとんどの場合Ｐ≦０．０２、図１Ｂ）。
感染第７日〜第８日目に、全身性炎症応答の尺度であるＩＬ−６の血清濃度を解析した。ＩＬ−６発現パターンは体重変化と類似していた。Ｎｅｗｍａｎ野生型は高濃度の血清ＩＬ−６（４．８（２．８、５．７）ｎｇ／ｍｌ）をもたらし、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体はかなり低いＩＬ−６（０．２（０．０７、２．４）ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）をもたらし、一方、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体は中間的な応答（２．５（１．３、３．２）ｎｇ／ｍｌ）を起こし野生型群およびｃｌｆＡＰＹＩ変異体群の両方と著しく異なっていた（それぞれＰ＝０．００９およびＰ＝０．００８）（中央値、四分位範囲）。
腎臓における細菌増殖は、Ｎｅｗｍａｎ野生型感染マウスでは、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹ変異体およびＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体の両方と比べて著しく多かった（それぞれＰ＜０．０００１、Ｐ＝０．０１１、およびＰ＝０．００５；図２）。Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体感染マウスは、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ感染マウスよりも腎臓における細菌増殖が著しく多かった（Ｐ＝０．０００５、図２）。
感染第７日〜第８日目に、マウスにおいて血清中の総ＩｇＧを測定した。Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ−およびＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体に感染した群のいずれにおいても、ＩｇＧ値の上昇は、野生型菌株により感染させたマウスと比べて著しく低かった（それぞれ３．１（１．２、４．９）；２．３（１．０、２．６）；および６．４（５．０、１１．０）（中央値、四分位範囲）；Ｐ≦０．０００３）。２つの変異体群間に有意差はなかった。
Ｎｅｗｍａｎ野生型感染マウスの死亡率は１７％であり、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩおよびｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体群では０％、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体群では３０％であった。野生型群とｃｌｆＡＰＹＩ群との間、そしてｃｌｆＡＰＹＩ群とｃｌｆＡヌル変異体群との間には死亡率に有意差があった（それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１）。
全身性炎症の直接および間接徴候は、フィブリノーゲン結合欠損のＣｌｆＡを発現する黄色ブドウ球菌により感染させたマウスでは低くなっている。予想外にも、ＣｌｆＡ発現が全くない菌株は、ＣｌｆＡＰＹ変異体発現菌株よりも高い全身性炎症を誘発した。
黄色ブドウ球菌の接種量を増やすことによりマウスにおいて敗血症を誘発した。マウスを、５．２ｘ１０７ｃｆｕのＮｅｗｍａｎ野生型、５．１ｘ１０７ｃｆｕのＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体および３．３ｘ１０７ｃｆｕのＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌル変異体により感染させた。５日で野生型感染マウスは全て死亡したが、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体マウスは感染の１０日後に１０匹のうち１匹だけが死亡した（Ｐ＜０．０００１、図３）。ｃｌｆＡヌル変異体により感染させたマウスの生存期間も、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体感染マウスよりも著しく短かった（Ｐ＜０．０００１、図３）。この試験において、ｃｌｆＡヌル変異体により抗原投与したマウスは、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体群よりも著しく高い関節炎を発症し、同時に、それらは体重が著しく大きく減少した（図７および８）。よって、敗血症性関節炎試験における全身性炎症の尺度と同様に、ＣｌｆＡ分子が発現される場合には、それにフィブリノーゲン結合特性がない限り、マウスの生存は長期に及ぶ。
関節への細菌の注射
関節における炎症反応がフィブリノーゲン結合に依存しているかどうかを検証するために、Ｎｅｗｍａｎ野生型、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩまたはＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌルをマウスの膝関節に直接注射し、それによって全身コンパートメントを回避した。３日後、滑膜炎（関節腔の多形核白血球浸潤および骨破壊を含む）を組織学により調査した。マウスには１つの膝に、２．４ｘ１０４ｃｆｕの野生型、２．４ｘ１０４ｃｆｕのｃｌｆＡヌル変異体、または３．４ｘ１０４ｃｆｕのｃｌｆＡＰＹＩ変異体を施与した。関節腔における滑膜炎および多形核白血球浸潤の組織学的指数は、野生型により感染させた膝では０．２５（０、３．０）、ｃｌｆＡヌル変異体では２．３８（０．２５、３．０）、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体では０．２５（０、０．２５）であった（中央値、四分位範囲）。骨破壊の組織学的指数は、野生型では０（０、１．０）、ｃｌｆＡヌル変異体では１．０（０、１．０）、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体では０（０、０）であった（中央値、四分位範囲；Ｐ＝０．０１ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体間）。ｃｌｆＡＰＹＩ変異体は、他の菌株よりも４２％多い菌株をマウスに与えたという事実にもかかわらず、滑膜炎および破壊をほとんど引き起こさなかったため、関節内での最大炎症応答にはＣｌｆＡにより促進されるフィブリノーゲン結合が必要であるという結論に達する。また、ＣｌｆＡ発現の不在もフィブリノーゲン結合欠損ＣｌｆＡ変異体と比べて炎症を高めた。
関節における炎症反応がフィブリノーゲン結合に依存しているかどうかを検証するために、Ｎｅｗｍａｎ野生型、Ｎｅｗｍａｎ ｃｌｆＡＰＹＩまたはＮｅｗｍａｎ ｃｌｆＡヌルをマウスの膝関節に直接注射し、それによって全身コンパートメントを回避した。３日後、滑膜炎（関節腔の多形核白血球浸潤および骨破壊を含む）を組織学により調査した。マウスには１つの膝に、２．４ｘ１０４ｃｆｕの野生型、２．４ｘ１０４ｃｆｕのｃｌｆＡヌル変異体、または３．４ｘ１０４ｃｆｕのｃｌｆＡＰＹＩ変異体を施与した。関節腔における滑膜炎および多形核白血球浸潤の組織学的指数は、野生型により感染させた膝では０．２５（０、３．０）、ｃｌｆＡヌル変異体では２．３８（０．２５、３．０）、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体では０．２５（０、０．２５）であった（中央値、四分位範囲）。骨破壊の組織学的指数は、野生型では０（０、１．０）、ｃｌｆＡヌル変異体では１．０（０、１．０）、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体では０（０、０）であった（中央値、四分位範囲；Ｐ＝０．０１ ｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体間）。ｃｌｆＡＰＹＩ変異体は、他の菌株よりも４２％多い菌株をマウスに与えたという事実にもかかわらず、滑膜炎および破壊をほとんど引き起こさなかったため、関節内での最大炎症応答にはＣｌｆＡにより促進されるフィブリノーゲン結合が必要であるという結論に達する。また、ＣｌｆＡ発現の不在もフィブリノーゲン結合欠損ＣｌｆＡ変異体と比べて炎症を高めた。
菌株ＬＳ−１におけるＰＹ突然変異
ＣｌｆＡのフィブリノーゲンを結合する能力が他の黄色ブドウ球菌菌株の毒性に作用するかどうかを判定するために、ｃｌｆＡＰＹＩ、ｃｌｆＡＰＹＩＩおよびｃｌｆＡヌル突然変異をＴＳＳＴ−１発現黄色ブドウ球菌菌株ＬＳ−１に形質導入した。マウスに、９．４ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１野生型、７．９ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩ、１０．７ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩＩ、または９．４ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡヌル変異体により抗原投与した。生存率を追跡調査することにより敗血症を調査した。１６日後、野生型菌株により抗原投与したマウスで生存しているのはたった４０％であった一方で、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体群により抗原投与したマウスの９０％およびｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体により感染させたマウスの８０％が生存していた（図４）。ＬＳ−１のｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体は毒性が著しく低かった（それぞれＰ＝０．０１４、Ｐ＝０．０５およびＰ＝０．０３）。
ＣｌｆＡのフィブリノーゲンを結合する能力が他の黄色ブドウ球菌菌株の毒性に作用するかどうかを判定するために、ｃｌｆＡＰＹＩ、ｃｌｆＡＰＹＩＩおよびｃｌｆＡヌル突然変異をＴＳＳＴ−１発現黄色ブドウ球菌菌株ＬＳ−１に形質導入した。マウスに、９．４ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１野生型、７．９ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩ、１０．７ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡＰＹＩＩ、または９．４ｘ１０６ｃｆｕのＬＳ−１ ｃｌｆＡヌル変異体により抗原投与した。生存率を追跡調査することにより敗血症を調査した。１６日後、野生型菌株により抗原投与したマウスで生存しているのはたった４０％であった一方で、ｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体群により抗原投与したマウスの９０％およびｃｌｆＡＰＹＩＩ変異体により感染させたマウスの８０％が生存していた（図４）。ＬＳ−１のｃｌｆＡＰＹＩ変異体およびｃｌｆＡヌル変異体は毒性が著しく低かった（それぞれＰ＝０．０１４、Ｐ＝０．０５およびＰ＝０．０３）。
組換えＣｌｆＡタンパク質による免疫化
敗血症性関節炎モデルと敗血症モデルの両方において、組換え野生型ＣｌｆＡ Ａドメインタンパク質（ｒＣｌｆＡ）および変異型ＣｌｆＡＰＹＩタンパク質（ｒＣｌｆＡＰＹ）によるワクチン接種の効果を調査した。マウスを感作した後、対照タンパク質ＢＳＡ、ｒＣｌｆＡ、またはｒＣｌｆＡＰＹにより２回追加免疫し、続いて、４．０ｘ１０６ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させて敗血症性関節炎を誘発した、または２．３ｘ１０７ｃｆｕの菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させて敗血症を誘発した。ｒＣｌｆＡＰＹ（すなわち、ＣｌｆＡＰＹＩ組換えタンパク質Ａドメイン）による免疫化は、対照マウスと比べて敗血症死を著しく防いた（Ｐ＝０．０１、図５）が、一方、ｒＣｌｆＡによる免疫化では著しい保護は得られなかった。細菌感染の前日、ｒＣｌｆＡＰＹにより免疫したマウスでは、ｒＣｌｆＡにより免疫したマウス（Ａ４０５＝０．１３（０．０７、０．１７）および０．１５（０．１０、０．２４）、両方の比較ではＰ＜０．０００１（中央値、四分位範囲））と比べて、ｒＣｌｆＡＰＹおよびｒＣｌｆＡの両方に対する特異的血清抗体応答はずっと高かった（Ａ４０５＝０．３９（０．３３、０．５６）および０．７１（０．５２、０．８１））。対照免疫動物はバックグラウンドレベルしか示さなかった（Ａ４０５ｎｍ＝０および０．０１（０、０．０１）（中央値、四分位範囲））。低用量の関節炎細菌により感染させた免疫マウスは、敗血症を誘発したマウスと、ｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹに対して類似の抗体応答を示した（データは示していない）。ｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹの両方による免疫化は、その保護は著しいものではなかったが、関節炎の発症を防いだ（図９）。
敗血症性関節炎モデルと敗血症モデルの両方において、組換え野生型ＣｌｆＡ Ａドメインタンパク質（ｒＣｌｆＡ）および変異型ＣｌｆＡＰＹＩタンパク質（ｒＣｌｆＡＰＹ）によるワクチン接種の効果を調査した。マウスを感作した後、対照タンパク質ＢＳＡ、ｒＣｌｆＡ、またはｒＣｌｆＡＰＹにより２回追加免疫し、続いて、４．０ｘ１０６ｃｆｕの黄色ブドウ球菌菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させて敗血症性関節炎を誘発した、または２．３ｘ１０７ｃｆｕの菌株Ｎｅｗｍａｎにより感染させて敗血症を誘発した。ｒＣｌｆＡＰＹ（すなわち、ＣｌｆＡＰＹＩ組換えタンパク質Ａドメイン）による免疫化は、対照マウスと比べて敗血症死を著しく防いた（Ｐ＝０．０１、図５）が、一方、ｒＣｌｆＡによる免疫化では著しい保護は得られなかった。細菌感染の前日、ｒＣｌｆＡＰＹにより免疫したマウスでは、ｒＣｌｆＡにより免疫したマウス（Ａ４０５＝０．１３（０．０７、０．１７）および０．１５（０．１０、０．２４）、両方の比較ではＰ＜０．０００１（中央値、四分位範囲））と比べて、ｒＣｌｆＡＰＹおよびｒＣｌｆＡの両方に対する特異的血清抗体応答はずっと高かった（Ａ４０５＝０．３９（０．３３、０．５６）および０．７１（０．５２、０．８１））。対照免疫動物はバックグラウンドレベルしか示さなかった（Ａ４０５ｎｍ＝０および０．０１（０、０．０１）（中央値、四分位範囲））。低用量の関節炎細菌により感染させた免疫マウスは、敗血症を誘発したマウスと、ｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹに対して類似の抗体応答を示した（データは示していない）。ｒＣｌｆＡおよびｒＣｌｆＡＰＹの両方による免疫化は、その保護は著しいものではなかったが、関節炎の発症を防いだ（図９）。
ｒＣｌｆＡＰＹおよびｒＣｌｆＡ免疫マウスでは、感染後第５日〜第９日の間に対照マウスと比べて体重減少が著しく低減した（データは示していない）。
感染後第１１日目に、ｒＣｌｆＡＰＹまたはｒＣｌｆＡにより免疫したマウスの腎臓における細菌増殖の減少傾向（ＢＳＡ：３８（３、４３６）；ｒＣｌｆＡＰＹ：７（２、１７）；ｒＣｌｆＡ：１０（７、５４）ｘ１０７ｃｆｕ／腎臓対）が認められた。
異なる免疫化群における特異的抗体応答をより正確に測定するために、特異的抗体応答をいくつかの血清希釈において決定した（第２回目の実施）。ｒＣｌｆＡＰＹにより免疫したマウスでは、全ての比較において各血清希釈で吸光度として測定した抗体応答は著しく高かったため、敗血症および関節炎細菌用量それぞれにより感染させた両方のマウスでは、ｒＣｌｆＡＰＹおよびｒＣｌｆＡ野生型抗原の両方に対して、ｒＣｌｆＡＰＹ免疫マウスの血清にはｒＣｌｆＡ野生型免疫マウスの血清よりも高い力価の特異的抗体が存在した可能性が非常に高いことをデータは示している（Ｐ＜０．０００１〜Ｐ＝０．００８、図１２〜１５）。ＢＳＡによる免疫化ではバックグラウンド抗体応答しか起こらなかった。
結論
これらの結果は、ＣｌｆＡ−フィブリノーゲン相互作用が細菌の毒性および疾患の転帰に不可欠であるということを強く示唆している。ＣｌｆＡのフィブリノーゲンを結合する能力は、敗血症死をもたらす能力という観点から毒性の増強に関係している。試験した両方のブドウ球菌菌株では、ｃｌｆＡＰＹ変異体は野生型よりも敗血症死を誘発することは少なかった。また、関節炎の重篤度は非フィブリノーゲン結合ｃｌｆＡＰＹ変異体により感染させたマウスにおいて強く低下した。
これらの結果は、ＣｌｆＡ−フィブリノーゲン相互作用が細菌の毒性および疾患の転帰に不可欠であるということを強く示唆している。ＣｌｆＡのフィブリノーゲンを結合する能力は、敗血症死をもたらす能力という観点から毒性の増強に関係している。試験した両方のブドウ球菌菌株では、ｃｌｆＡＰＹ変異体は野生型よりも敗血症死を誘発することは少なかった。また、関節炎の重篤度は非フィブリノーゲン結合ｃｌｆＡＰＹ変異体により感染させたマウスにおいて強く低下した。
フィブリノーゲン−細菌細胞表面相互作用による毒性増進の有力な機構は、好中球食作用の阻害である（５）。好中球は黄色ブドウ球菌感染初期の宿主防御に不可欠である（１３）。好中球が存在しないと、血液および腎臓において細菌増殖が激しく増加し、関節炎や死亡の頻度が増加する。ｃｌｆＡＰＹ変異体と比べて、野生型黄色ブドウ球菌の毒性がより著明であることは、ＣｌｆＡによるフィブリノーゲン媒介好中球食作用阻害により少なくとも部分的に説明することができる。フィブリノーゲンとＣｌｆＡとの結合は、好中球受容体によるオプソニンの付着またはオプソニンへの働きかけを減少させることによって、好中球によるオプソニン食作用を減少させ得る。また、結合したフィブリノーゲンが未知の防御宿主因子と黄色ブドウ球菌との結合を妨げる可能性もある。もう１つの選択肢は、フィブリノーゲン−ＣｌｆＡ相互作用が血管から組織内への細菌の通過を促しまたは組織への定着を促すことである。
予想外にも、本発明者らのデータは、ＣｌｆＡヌル変異体がｃｌｆＡＰＹ変異体菌株よりも毒性が高かったことも示している。場合により、ＣｌｆＡタンパク質はフィブリノーゲンとの相互作用以外のin vivo機能も有する。この研究で示されるように、この相互作用は宿主とっって明らかに不利なものである。ＣｌｆＡの他の機能は現在明確にマッピングされていないが、ＣｌｆＡによってもたらされる非フィブリノーゲン依存性血小板凝集によって、循環において大量の黄色ブドウ球菌が捕捉され、その後、細菌血小板複合体が細網内皮系を通じて除去されるかもしれない。このような血小板凝集媒介のブドウ球菌除去は野生型およびｃｌｆＡＰＹ突然変異菌株では起こりやすいがｃｌｆＡノックアウトでは起こらないであろう。野生型菌株ではフィブリノーゲン相互作用が他の事象より重要であるのに対し、ｃｌｆＡＰＹ変異体では上記のような細菌除去が宿主にとって非常に有益であるかもしれない。
ｃｌｆＡノックアウト変異体は、黄色ブドウ球菌菌株ＬＳ−１におけるｃｌｆＡＰＹ突然変異と同程度に敗血症死を防いだが、菌株Ｎｅｗｍａｎではそうであったとしてもあまり防げなかった。細菌毒性に対するＣｌｆＡ発現の全体的影響は、発現レベルや他の毒性因子の存在によって、異なる黄色ブドウ球菌菌株間で差がある。
関節腔においてｃｌｆＡＰＹ変異体が以前の同等以下の毒性を示すかどうかの問題は、炎症を起こした滑液ではフィブリノーゲンおよびフィブリンが豊富であることを考慮すると確かに重要である。本発明者らのデータは、ｃｌｆＡＰＹ変異体が軟骨および骨に対してあまり破壊性がないことを示唆している。
組換えＣｌｆＡ Ａドメイン非フィブリノーゲン結合Ｐ３３６Ｙ３３８変異体の防御効果は、野生型ｒＣｌｆＡの場合よりも大きかった。免疫原および野生型ＣｌｆＡタンパク質の両方に対してより高い特異的抗体応答がもたらされたことから、ＣｌｆＡＰＹによる免疫化によってより良好な免疫応答が誘導された可能性が非常に高い。より重要なことには、それによって野生型ＣｌｆＡよりも大きな、敗血症死に対する防御免疫応答が誘導された。
結論として、本発明者らの結果からｒＣｌｆＡＰＹは野生型組換えＣｌｆＡよりも良好なワクチン候補であることが分かる。本発明者らは、免疫時の野生型ＣｌｆＡタンパク質によるフィブリノーゲン結合は、ＣｌｆＡ分子上の重要なエピトープを隠すことから抗原提示を減少させ、それゆえ特異的抗体産生を低下させると仮設する。
実施例２
Ｎ２およびＮ３を含んでなるｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（ｒＣｌｆＡ ２２１−５５９）
材料と方法：
この実施例では実施例１に概略を示したプロトコールに従い、
−ｒＣｌｆＡ２２１−５５９（すなわち、アミノ酸２２０−５５９に相当するＮ２およびＮ３を含んでなるＣｌｆＡ Ａ領域トランケート）
−ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９；および
−ＢＳＡ
を利用した。
Ｎ２およびＮ３を含んでなるｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（ｒＣｌｆＡ ２２１−５５９）
材料と方法：
この実施例では実施例１に概略を示したプロトコールに従い、
−ｒＣｌｆＡ２２１−５５９（すなわち、アミノ酸２２０−５５９に相当するＮ２およびＮ３を含んでなるＣｌｆＡ Ａ領域トランケート）
−ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９；および
−ＢＳＡ
を利用した。
各群１５匹の雌ＮＭＲＩマウスとし、それらは試験開始時において８週齢であった。この実施例では、免疫化に使用した構築物はＣｌｆＡ野生型／天然Ｎ２Ｎ３トランケート、実施例１に定義した突然変異ＰＹを有するＣｌｆＡ Ｎ２Ｎ３トランケートであった。ＢＳＡを対照として用いた。
野生型および変異型組換えＣｌｆＡによるワクチン接種
実施例１のプロトコールに従って、マウスをｒＣｌｆＡ２２１−５５９、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９またはＢＳＡにより免疫した。
実施例１のプロトコールに従って、マウスをｒＣｌｆＡ２２１−５５９、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９またはＢＳＡにより免疫した。
精製したｒＣｌｆＡ２２１−５５９、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９（すなわち、ＣｌｆＡＰＹＩ組換えタンパク質ＡサブドメインＮ２およびＮ３）またはＢＳＡをＰＢＳに溶解し、フロインド完全アジュバントと１：１で乳化させた。第０日目に３０μｇ（＝０．７９ｎｍｏｌ）のタンパク質を含有するエマルジョン２００μｌをｓ．ｃ．注射した。第１２日目にフロインド不完全アジュバント中の生理食塩水中３０μｇタンパク質による第１回目の追加免疫を行った。第２２日目に第２回目の追加免疫を行った。第３１日目にマウスから採血し、後で抗体応答(antibody responces)を解析するために血清を凍結した。
特異的抗体−ＥＬＩＳＡ
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡによりｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９に対する血清特異的抗体応答を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：５０００、１：２００００、１：８００００および１：３２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡによりｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９に対する血清特異的抗体応答を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの組換えタンパク質でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：５０００、１：２００００、１：８００００および１：３２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
結果：
特異的抗体応答：
実施例１のとおり、４つの異なる血清希釈を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイおいて抗体応答を吸光度により測定した。得られたデータは実施例１のデータと非常に類似していた。ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９により免疫したマウスでは、１つの比較以外の全ての比較において各血清希釈で吸光度として測定した抗体応答は著しく高かったため、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９による免疫化では、天然ｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９の両方に対して、天然ｒＣｌｆＡ２２１−５９９による免疫化と比べて高い力価の特異的抗体をもたらす可能性が非常に高いことが分かった（Ｐ＝０．００１〜０．０２５、図１６および図１７参照）。ＢＳＡによる免疫化ではバックグラウンドレベルの抗体応答しか起こらなかった。
特異的抗体応答：
実施例１のとおり、４つの異なる血清希釈を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイおいて抗体応答を吸光度により測定した。得られたデータは実施例１のデータと非常に類似していた。ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９により免疫したマウスでは、１つの比較以外の全ての比較において各血清希釈で吸光度として測定した抗体応答は著しく高かったため、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９による免疫化では、天然ｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９の両方に対して、天然ｒＣｌｆＡ２２１−５９９による免疫化と比べて高い力価の特異的抗体をもたらす可能性が非常に高いことが分かった（Ｐ＝０．００１〜０．０２５、図１６および図１７参照）。ＢＳＡによる免疫化ではバックグラウンドレベルの抗体応答しか起こらなかった。
結論
本発明者らは、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９タンパク質による免疫化は、免疫原および野生型ＣｌｆＡタンパク質の両方に対して、天然タンパク質による免疫化よりも著しく高い抗体応答をもたらすことを見い出した。
本発明者らは、ｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９タンパク質による免疫化は、免疫原および野生型ＣｌｆＡタンパク質の両方に対して、天然タンパク質による免疫化よりも著しく高い抗体応答をもたらすことを見い出した。
これらの発見に基づき、本発明者らは、とにかくＰＹタンパク質が実施例１のようにアミノ酸４０〜５５０または実施例２のようにアミノ酸２２１〜５５９を含んでなるならば、ＰＹ−免疫化によって、対応するサイズの天然ＣｌｆＡによる免疫化よりも良好な免疫応答が誘導されるという結論に達する。
実施例３
ＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（δ／デルタラッチトランケート）
材料と方法：
この実施例では実施例１に概略を示したプロトコールに従い、以下の構築物を利用した：
−ｒＣｌｆＡ２２１−５３１（すなわち、Ｎ２およびＮ３アミノ酸２２０−５５９を含んでなるがラッチングペプチドアミノ酸５３２−５３８とそれに続くプロリンリッチ残基を含まないｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート。
ＣｌｆＡ Ａ領域トランケート（δ／デルタラッチトランケート）
材料と方法：
この実施例では実施例１に概略を示したプロトコールに従い、以下の構築物を利用した：
−ｒＣｌｆＡ２２１−５３１（すなわち、Ｎ２およびＮ３アミノ酸２２０−５５９を含んでなるがラッチングペプチドアミノ酸５３２−５３８とそれに続くプロリンリッチ残基を含まないｒＣｌｆＡ Ａ領域トランケート。
群は１５匹の雌ＮＭＲＩマウスとし、それらは試験開始時において８週齢であった。この実施例では、上記構築物を免疫化に使用した。実施例１のプロトコールに従って、マウスを上記トランケートにより免疫した。
野生型および変異型組換えＣｌｆＡによるワクチン接種
精製したｒＣｌｆＡ２２１−５３１をＰＢＳに溶解し、フロインド完全アジュバントと１：１で乳化させた。第０日目に０．７９ｎｍｏｌのタンパク質を含有するエマルジョン２００μｌをｓ．ｃ．注射した。第１２日目にフロインド不完全アジュバント中の生理食塩水中０．７９ｎｍｏｌタンパク質による第１回目の追加免疫を行った。第２２日目に第２回目の追加免疫を行った。第３１日目にマウスから採血し、後で抗体応答を解析するために血清を凍結した。
精製したｒＣｌｆＡ２２１−５３１をＰＢＳに溶解し、フロインド完全アジュバントと１：１で乳化させた。第０日目に０．７９ｎｍｏｌのタンパク質を含有するエマルジョン２００μｌをｓ．ｃ．注射した。第１２日目にフロインド不完全アジュバント中の生理食塩水中０．７９ｎｍｏｌタンパク質による第１回目の追加免疫を行った。第２２日目に第２回目の追加免疫を行った。第３１日目にマウスから採血し、後で抗体応答を解析するために血清を凍結した。
特異的抗体−ＥＬＩＳＡ
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡにより特異的抗体の血清濃度を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）を４．６μｇ／ｍｌのｒＣｌｆＡ２２１−５３１タンパク質（これは実施例１および２の５μｇ／ｍｌのｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９と等モルである）でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：５０００、１：２００００、１：８００００および１：３２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
第２回目の追加免疫の９日後に免疫マウスの血清サンプルを得た。ＥＬＩＳＡにより特異的抗体の血清濃度を測定した。マイクロプレート（９６−ウェル；Nunc）を４．６μｇ／ｍｌのｒＣｌｆＡ２２１−５３１タンパク質（これは実施例１および２の５μｇ／ｍｌのｒＣｌｆＡ２２１−５５９およびｒＣｌｆＡＰＹ２２１−５５９と等モルである）でコーティングした。ブロッキング剤、血清サンプル、ビオチン化抗体、およびＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−ｐｒｏｘｉｄａｓｅは全てＰＢＳで希釈した。これまでの報告（８）に従ってこのアッセイを実施した。全ての血清サンプルを１：５０００、１：２００００、１：８００００および１：３２００００希釈し、抗体応答を４０５ｎｍにおける吸光度としてモニタリングした。
結果：
実施例１のとおり、ＥＬＩＳＡアッセイおいて抗体応答を吸光度により測定した。ｒＣｌｆＡ２２１−５３１による免疫化は、特異的抗体応答として測定される免疫応答をもたらすことが分かった（図１８）。
実施例１のとおり、ＥＬＩＳＡアッセイおいて抗体応答を吸光度により測定した。ｒＣｌｆＡ２２１−５３１による免疫化は、特異的抗体応答として測定される免疫応答をもたらすことが分かった（図１８）。
結論：
本発明者らは、ｒＣｌｆＡ２２１−５３１は特異的抗体応答を引き起こすことからこの抗原が免疫原として働くことを見い出した。
本発明者らは、ｒＣｌｆＡ２２１−５３１は特異的抗体応答を引き起こすことからこの抗原が免疫原として働くことを見い出した。
参考文献
Claims (16)
- 微生物感染症の治療または予防用の薬剤の製造における組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質、またはフィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基２２１〜５３１を含んでなるそのフラグメントの使用であって、該組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質又はそのフラグメントが、フィブリノーゲンに非共有結合する能力が低減又は欠失した組換えフィブリノーゲン結合タンパク質を生じるアミノ酸残基Pro336及び／またはTyr338において少なくとも一つのアミノ酸残基の欠失又は置換を有し、かつ野生型ＣｌｆＡタンパク質と比べて大きな免疫応答を誘導する、上記使用。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質が、残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８におけるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の使用。
- アミノ酸残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８がセリンまたはアラニンのいずれかと置換されている、請求項２に記載の使用。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質がｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ｓ Ｙ ３３８ ＡまたはｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ａ Ｙ ３３８ Ｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
- アミノ酸残基Ａｌａ２５４、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｔｙｒ３３８、Ｉｌｅ３８７、Ｌｙｓ３８９、Ｇｌｕ５２６および／またはＶａｌ５２７がＡｌａまたはＳｅｒのいずれかと置換されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
- 組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質が、残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８がセリンおよび／またはアラニンのいずれかと置換され、ｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ｓ Ｙ ３３８ ＡまたはｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ａ Ｙ ３３８ Ｓをもたらす配列番号１〜３，６，９，１０および１３のいずれかによるアミノ酸配列、またはそのフラグメントを有するか、あるいは配列番号４，５，７，８，１１，１２および１４のいずれかによるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質が
ａ．亜領域Ｎ１２３、前記フィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基４０〜５５９にわたる；または
ｂ．亜領域Ｎ２３、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基２２１〜５５９にわたる；
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。 - 微生物感染症がStaphylocciによって引き起こされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質、またはフィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基２２１〜５３１を含んでなるそのフラグメントを含んでなる、ワクチンであって、該組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質又はそのフラグメントが、フィブリノーゲンに非共有結合する能力が低減又は欠失した組換えフィブリノーゲン結合タンパク質を生じる該フィブリノーゲン結合領域のアミノ酸残基Pro336及び／またはTyr338において少なくとも一つのアミノ酸残基の欠失又は置換を有し、かつ野生型ＣｌｆＡタンパク質と比べて大きな免疫応答を誘導する、上記ワクチン。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質、またはフィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基２２１〜５３１を含んでなるそのフラグメント、および製薬上許容されるアジュバントを含んでなる、免疫原性医薬組成物であって、該組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質又はそのフラグメントが、フィブリノーゲンに非共有結合する能力が低減又は欠失した組換えフィブリノーゲン結合タンパク質を生じる該フィブリノーゲン結合領域のアミノ酸残基Pro336及び／またはTyr338において少なくとも一つのアミノ酸残基の欠失又は置換を有し、かつ野生型ＣｌｆＡタンパク質と比べて大きな免疫応答を誘導する、上記免疫原性医薬組成物。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質が、残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８におけるアミノ酸置換を含む、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
- アミノ酸残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８がセリンまたはアラニンのいずれかと置換されている、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質がｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ｓ Ｙ ３３８ ＡまたはｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ａ Ｙ ３３８ Ｓである、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
- アミノ酸残基Ａｌａ２５４、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｔｙｒ３３８、Ｉｌｅ３８７、Ｌｙｓ３８９、Ｇｌｕ５２６および／またはＶａｌ５２７がＡｌａまたはＳｅｒのいずれかと置換されている、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
- 組換えブドウ球菌フィブリノーゲン結合タンパク質が、残基Ｐ３３６および／またはＹ３３８がセリンおよび／またはアラニンのいずれかと置換され、ｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ｓ Ｙ ３３８ ＡまたはｒＣｌｆＡＰ ３３６ Ａ Ｙ ３３８ Ｓをもたらす配列番号１〜３，６，９，１０および１３のいずれかによるアミノ酸配列、またはそのフラグメントを有するか、あるいは配列番号４，５，７，８，１１，１２および１４のいずれかによるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
- 組換えクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質が
ａ．亜領域Ｎ１２３、前記フィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基４０〜５５９にわたる；または
ｂ．亜領域Ｎ２３、ＣｌｆＡのフィブリノーゲン結合領域（領域Ａ）のアミノ酸残基２２１〜５５９にわたる；
を含む、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載の免疫原性医薬組成物。
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