EA019516B1 - Лечение микробных инфекций - Google Patents
Лечение микробных инфекций Download PDFInfo
- Publication number
- EA019516B1 EA019516B1 EA201001212A EA201001212A EA019516B1 EA 019516 B1 EA019516 B1 EA 019516B1 EA 201001212 A EA201001212 A EA 201001212A EA 201001212 A EA201001212 A EA 201001212A EA 019516 B1 EA019516 B1 EA 019516B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- fibrinogen
- c1ga
- fragment
- amino acid
- region
- Prior art date
Links
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 142
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 138
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 132
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 74
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 74
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 136
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 130
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 130
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 130
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 41
- 102000025748 fibrinogen binding proteins Human genes 0.000 claims description 41
- 101710128530 Fibrinogen-binding protein Proteins 0.000 claims description 33
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 30
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 21
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 claims description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 claims description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 18
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 87
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 42
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 42
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 41
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 35
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 31
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 28
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 27
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 27
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 26
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 21
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 20
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 16
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 15
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 15
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 15
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 14
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 14
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 12
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 12
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 10
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 10
- 102100030647 Transcription factor-like 5 protein Human genes 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 9
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 8
- 230000034994 death Effects 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 108091009104 fibrinogen binding proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 7
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 7
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 7
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 6
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 6
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 6
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100028029 SCL-interrupting locus protein Human genes 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 description 4
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 4
- 108091006419 SLC25A12 Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 3
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 3
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 3
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 3
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 3
- 102100024783 Fibrinogen gamma chain Human genes 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 3
- 108010048325 fibrinopeptides gamma Proteins 0.000 description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 3
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 0 *C1C*#CC1 Chemical compound *C1C*#CC1 0.000 description 2
- 102000052567 Anaphase-Promoting Complex-Cyclosome Apc1 Subunit Human genes 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700022034 Opsonin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108091006463 SLC25A24 Proteins 0.000 description 2
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 2
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 108010056458 bacterial fibronectin-binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 2
- 244000000059 gram-positive pathogen Species 0.000 description 2
- 208000013210 hematogenous Diseases 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108010037833 Bacterial Adhesins Proteins 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000736839 Chara Species 0.000 description 1
- 102000005853 Clathrin Human genes 0.000 description 1
- 108010019874 Clathrin Proteins 0.000 description 1
- 108010065152 Coagulase Proteins 0.000 description 1
- 108090000044 Complement Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100035431 Complement factor I Human genes 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023970 Keratin, type I cytoskeletal 10 Human genes 0.000 description 1
- 101710183404 Keratin, type I cytoskeletal 10 Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010024774 Localised infection Diseases 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 101100189356 Mus musculus Papolb gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108700020474 Penicillin-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100323872 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) aru1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000941 anti-staphylcoccal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000025255 bacterial arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229930193282 clathrin Natural products 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000012969 defense response to bacterium Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009522 phase III clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 206010040872 skin infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008718 systemic inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000002885 thrombogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000541 tocopherol-rich extract Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/085—Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к улучшенным вакцинам против микробных антигенов, фармацевтическим композициям, иммуногенным композициям и антителам и их применению для лечения микробных инфекций, в частности инфекций бактериального происхождения, включая стафилококковое происхождение. В идеале изобретение относится к рекомбинантным стафилококковым MSCRAMM или MSCRAMM-подобным белкам либо их фрагментам с уменьшенным связыванием с их лигандом хозяина для применения в терапии.
Description
Настоящее изобретение относится к улучшенным вакцинам против микробных антигенов, фармацевтическим композициям, иммуногенным композициям и антителам и их применению в лечении микробных инфекций, в частности инфекций бактериального происхождения, включая стафилококковое происхождение.
Множественная лекарственная устойчивость (МОК) представляет собой растущую проблему среди грамположительных бактерий, в частности, в больницах. Широкое применение антибиотиков и других агентов для лечения бактериальных инфекций привело к быстрому развитию бактерий, устойчивых к данным агентам, и многие бактерии имеют множественную лекарственную устойчивость. Таким образом, в настоящее время существует необходимость в обеспечении улучшенных способов лечения для решения проблем, связанных с такими устойчивыми к лекарствам инфекциями.
Стафилококки представляют собой грамположительные бактерии сферической формы, обычно организованные в виде виноградоподобных нерегулярных кластеров. Некоторые из них являются членами нормальной флоры кожи и слизистых мембран человека, другие вызывают нагноение, формирование абсцесса, различные пиогенные инфекции и даже фатальный сепсис. Патогенные стафилококки часто вызывают гемолиз крови, коагуляцию плазмы и производят различные внеклеточные ферменты и токсины.
Род 81арйу1ососси5 имеет по меньшей мере 30 видов. К трем основным видам, имеющим клиническое значение, относятся 81арйу1ососси5 аигеик, 81арйу1ососси5 ерИегшМЦ и 81арйу1ососси5 каргорйуНсик. 81арйу1ососси5 аигеик является положительным в отношении коагулазы, что отличает его от других видов. 8. аигеик является основным патогеном для людей. Почти каждый человек в течение жизни имеет какой-либо тип инфекции, вызываемой 8. аигеик, варьирующий по тяжести от пищевого отравления или незначительных кожных инфекций до тяжелых, угрожающих жизни инфекций. Отрицательные в отношении коагулазы стафилококки представляют собой нормальную человеческую флору, которая иногда вызывает инфекцию, часто ассоциированную с имплантированными устройствами, особенно у очень молодых, пожилых пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. Приблизительно 75% инфекций, вызванных отрицательными в отношении коагулазы стафилококками, ассоциированы 8. ерИегшйщ. Инфекции, вызванные 81арйу1ососси5 \\'агпеп. 81арйу1ососси5 1юпшп5 и другими видами, менее распространены. 8. каргорйуйсик является относительно частой причиной инфекций мочевых путей у молодых женщин. Стафилококки продуцируют каталазу, которая отличает их от стрептококков. 8. 1пдбппеп515 также имеет клиническое значение и присутствует приблизительно в 5-10% случаев инфекционного эндокардита.
Колонизация 8. аигеик суставного хряща, в котором коллаген является основным компонентом, внутри суставной щели, по-видимому, является важным фактором, способствующим развитию септического артрита. Гематогенно-приобретенный бактериальный артрит остается серьезной медицинской проблемой. Это быстро прогрессирующее и чрезвычайно разрушительное для суставов заболевание трудно лечить. Как правило, менее 50% инфицированных пациентов не могут восстановиться без серьезных повреждений суставов. 8. аигеик является преобладающим патогеном, выделенным из взрослых пациентов с гематогенным и вторичным остеомиелитом.
У госпитализированных пациентов бактерии 81арйу1ососси5, такие как 8. аигеик, являются основной причиной инфекции. Первично локализованные инфекции ран или постоянных медицинских устройств могут привести к более серьезным инвазивным инфекциям, таким как сепсис, остеомиелит, мастит и эндокардит. В случае инфекций, ассоциированных с медицинскими устройствами, пластмассовые и металлические поверхности покрываются плазмой хозяина и матриксными белками, такими как фибриноген и фибронектин, вскоре после имплантации. Эта способность 8. аигеик и других стафилококковых бактерий прикрепляться к этим белкам является существенной для начала инфекции. Сосудистые трансплантаты, внутривенные катетеры, искусственные клапаны сердца и устройства сердечной помощи являются тромбогенными и склонны к бактериальной колонизации. Из стафилококковых бактерий 8. аигеик является обычно самым разрушительным возбудителем таких инфекций.
Значительный рост изолятов 8. аигеик, которые демонстрируют устойчивость к большинству доступных в настоящее время антибиотиков для лечения инфекций, наблюдался в больницах по всему миру. Разработка пенициллина для борьбы с 8. аигеик явилась значительным прогрессом в контроле и лечении инфекций. К сожалению, быстро появились пенициллин-устойчивые микроорганизмы и потребность в новых антибиотиках стала первостепенной. С появлением каждого нового антибиотика 8. аигеик был способен противодействовать ему с помощью β-лактамаз, измененных пенициллинсвязывающих белков и мутантных белков клеточных мембран, позволяющих бактерии выживать. Таким образом, метициллин-устойчивый 8. аигеик (МК8А) и организмы с множественной лекарственной устойчивостью появились и создали основной плацдарм в больницах и домах престарелых по всему миру (СйатЬеш, Н.Р., Сйи. МюгоЬю1. Кеу., 1:173, 1988 и МиШдаи, М.Е., е! а1., Ат 1. Меб., 94:313, 1993). Сегодня почти половина стафилококковых штаммов, вызывающих внутрибольничные инфекции, устойчивы ко всем антибиотикам, за исключением ванкомицина, и это, по-видимому, лишь вопрос времени, когда ванкомицин также станет неэффективным.
- 1 019516
Таким образом, сохраняется очень сильная и быстро растущая потребность в терапевтических средствах для лечения инфекций, вызванных стафилококками, такими как 8. аигеик, которые эффективны в отношении штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам.
В случае грамположительных патогенов, таких как стафилококки, стрептококки и энтерококки, белки, названные адгезинами, опосредуют такие инфекции, например, путем стимулирования колонизации, прикрепления к сгусткам крови и травмированным тканям. Эти специфические микробные поверхностные адгезины называются М8СЕЛММ8 (микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные матриксные молекулы) (РаШ, 1. е1 а1., Апп Вес. МкгоЬюк, 48:585-617, 1994; РаШ, 1. апб Ноок, М., Сиг. Θρίη Се11 Бю1., 6:752-758, 1994). М8СЕАММ§ специфически распознают и связываются с компонентами внеклеточного матрикса (ЕСМ), такими как фибронектин, фибриноген, коллаген и эластин. Эти М8СЕАММ5 находятся во многих грамположительных патогенах, и их аминокислотные последовательности являются родственными, они имеют сходную модульную конструкцию и общую организацию связывающих доменов.
М8СКАММ5 на поверхности бактериальной клетки и лиганды в ткани хозяина взаимодействуют по типу замка и ключа, что приводит к прикреплению бактерий к хозяину. Адгезия часто требуется для выживания бактерий и помогает бактериям обойти защитные механизмы хозяина и испытания на антибиотики. После того как бактерии успешно прикрепились и заселили ткани хозяина, их физиология резко меняется и они секретируют повреждающие компоненты, такие как токсины и ферменты. Более того, прикрепленные бактерии часто продуцируют биопленку и быстро становятся устойчивыми к убивающему эффекту большинства антибиотиков.
Бактерия может экспрессировать М8СЕАММ5, которые распознают различные матриксные белки. Лигандсвязывающие сайты в М8СЕАММ5, по-видимому, определяются относительно короткими непрерывными участками аминокислотных последовательностей (мотивами). Поскольку похожий мотив можно найти в нескольких различных видах бактерий, возможно, что посредством этих функциональных мотивов осуществляется межвидовой перенос (РаШ апб Ноок, Сиг. Θρίη Се11 Бю1., 6:752-758, 1994). Кроме того, единичный М8СЕАММ может иногда связываться с несколькими ЕСМ лигандами.
М8СЕАММ5 могут опосредовать инфекцию путем связывания с белками, включающими фибриноген (Ед) и/или фибронектин (Еп) и т.д. Фибриноген и фибронектин представляют собой белки, обнаруженные в плазме крови, и играют ключевые роли в гемостазе и коагуляции.
Фибриноген состоит из шести полипептидных цепей: двух Аа, двух Ββ и двух γ-цепей. С-концевая часть γ-цепи является биологически важной и взаимодействует с тромбоцитарным интегрином во время прикрепления тромбоцитов и агрегации. Именно эта область, которая также является мишенью для 81ар11у1ососси5 аигеик, приводит к фибриноген-зависимой аггрегации клеток и прикреплению к тканям.
81ар11у1ососси5 аигеик имеет несколько поверхностных экспрессирующихся белков, которые стимулируют активацию и агрегацию тромбоцитов. Белки М8СЕАММ из 81ар11у1ососси5 аигеик включают, но не ограничиваются этим, следующие:
фибриногенсвязывающий белок фактора агглютинации А (С1ГА); фибриногенсвязывающий белок фактора агглютинации В (С1ГВ); фибронектин-фибриногенсвязывающий белок А (ЕпВРА); фибронектин-фибриногенсвязывающий белок В (ЕпВРВ) и 8. аигеик поверхностные белки 8а§А, 8а§С, 8а§К и т.д.
В таблице ниже приведен перечень различных поверхностных белков, заякоренных в клеточной мембране 81арйу1ососси5 аигеик.
- 2 019516
| Поверхностный белок | ТЕ* | Лиганд(ы)0 | Мотив0 | Сортаза0 |
| Белок А (Бра) | 508 | Иммуноглобулин, фактор Виллебранда, ΤΝΕΚ® | ЬРЕТС | А |
| Фибронектин-связывающий белок А (ЕпЬрА) | 1018 | Фибронектин, фибриноген, эластин | ЬРЕТС | А |
| Фибронектин-связывающий белок В (ЕпЬрВ) | 914 | Фибронектин, фибриноген, эластин | ЬРЕТС | А |
| Фактор агглютинации А (СКА) | 933 | Фибриноген, фактор комплемента I | ЬРОТС | А |
| Фактор агглютинации В (СИВ) | 913 | Фибриноген, цитокератин 10 | ЬРЕТС | А |
| Адгезия к коллагену (Спа) | 1183 | Коллаген | ЬРКТС | А |
| БбгС | 947 | Не известны | ЬРЕТС | А |
| 5с1г0 | 1315 | Не известны | ЬРЕТС | А |
| 6с1гЕ | 1166 | Не известны | ЬРЕТС | А |
| ΡΙβ | 1637 | Не известны | ί.ΡϋΤΟ | А |
| БазА | 1261 | Не известны | ЬРОТС | А |
| БазВ | 937 | Не известны | ι_Ρϋτα | А |
| ЗэзС | 2186 | Не известны | ίΡΝΤΟ | А |
| ЗазО | 241 | Не известны | ЬРААС | А |
| ЗазЕ/1зс1А | 354 | Гем' | ЬРКТС | А |
| БазЕ | 637 | Не известны | ЬРКАО | А |
| БазС/Аар | 1117 | Не известны9 | ЬРКТО | А |
| БазН | 308 | Неизвестны | ЬРКТС | А |
| 8аз1/НагА/1збН | 895 | Гаптоглобин | ЬРКТС | А |
| ЗазД/1зс1В | 645 | Гемоглобин, гем | ЬРОТС | А |
| БазК | 211 | Не известны | ЬРКТС | А |
| 1зРС | 227 | Гем | ΝΡΟΤΝ | В |
| а а.к., длина белка в аминокислотах; ь молекулярный(е) компонент(ы), распознаваемый(е) и связываемый(е) белком; с консенсусный мотив, распознаваемый сортазой и находящийся в Сконцевом сигнале сортировки на клеточной стенке; ά сортаза, для которой поверхностный белок клеточной стенки является субстратом; е ΊΝΕΚ, рецептор фактора некроза опухоли; Н также связывается с белками слущенных эпителиальных клеток. Стимулирует устойчивость к бактерицидным липидам и лактоферрину; д также связывается со слущенными эпителиальными клетками носовой полости. Участвуют в образовании биопленок. | |
| Другие | стафилококковые бактерии продуцируют поверхностные экспрессируемые белки |
(М8СВАММз), которые похожи на факторы агглютинации или связывающие белки, перечисленные выше. Они включают, но не ограничиваются этим:
8йгР, 8бгО и 8йгН из 8. ер1бегш1б18, где 8йгО/Р, как было показано, связывается с фибриногеном и коллагеном;
РЬ1 из 81арйу1ососси8 1идйипепы8 представляет собой фибриногенсвязывающий белок. РЬ1 является членом 8йг-семейства: группы стафилококковых поверхностных белков, содержащих характерную область серин-аспартатных повторов. Фибриногенсвязывающий домен РЫ был картирован до 313 аминокислот и показал 62%-ную идентичность с соответствующей областью фактора агглютинации А (С1НА) из 81арйу1ососеи8 аигеиз.
Другие лигандсвязывающие белки/адгезины включают белки Ιδά (железорегулируемые поверхностные детерминанты), которые, хотя все они сами по себе не являются М8СКАММз (например, ΙδάΒ и ΙδάΗ), способствуют адгезии бактерий к компонентам внеклеточного матрикса и названы в данном изобретении М8СВАММ-подобными белками. Известно, что ΙδάΑ стимулирует адгезию к клеткам плоского эпителия и обладает слабым сродством к фибриногену и фибронектину, так что формально может быть определен как М8СВАММ.
Фактор агглютинации А (С1НА) был идентифицирован как первый адгезии 8. аигеиз, связывающий γ-цепь фибриногена. Затем были идентифицированы фибронектин-фибриногенсвязывающий белок А (РпВРА) и фибронектин-фибриногенсвязывающий белок В (РпВРВ) в качестве бифункциональных белков, которые, как обнаружили, связываются с тем же С-концевым пептидным сегментом в γ-цепи Рд. СНА и РпВР имеют структурные признаки, которые являются общими для всех белков, заякоренных в клеточной стенке, экспрессирующихся в грамположительных бактериях, включая СНВ.
Фактор агглютинации А (С1НА), например, представляет собой белок, расположенный на поверхности 81арйу1ососси8 аигеиз. С1НА является важным фактором вирулентности 8. аигеиз. Он вносит вклад в патогенез септического артрита и эндокардита. С1НА представляет собой образец семейства поверхностно-ассоциированных белков со сходной структурной/модульной организацией, включая, но не ограничиваясь этим, СНВ, 8йгЭ, 8йгЕ и т.д.
СНА содержит Ν-концевой домен А (фибриногенсвязывающую область) длиной 520 аминокислот, который включает три отдельно свернутых субдомена N1, N2 и N3. За доменом А следует серинаспартатная дипептидная повторяющаяся область и область, соединяющая клеточную стенку и мембра
- 3 019516 ну, которая содержит ЬРПТО-мотив для стимулируемого сортазой заякоривания в клеточной стенке. СИЛ присутствует практически во всех штаммах 8. аигеик (Реасоск 8.1., Мооге С.Е., 1икйсе А., ΚαηΙζαηοιι М., 8!огу Ь., Маск1е К., СЫеШ 6., Эау Ν.Ρ.Ι. (2002) У1ги1еи1 сошЫпайопз о! аййекш апй (охт депек ίη па!ига1 рори1айопз о! 81арНу1ососсик аигеик. 1п!ес( 1ттип., 70:4987-4996). Он связывается с С-концом γ-цепи фибриногена и таким образом способен индуцировать агглютинацию бактерий в растворе фибриногена (МсЭеуШ Ό., №1пауа(у Т., Ноике-Ротрео К., Ве11 Е., Тигпег Ν., МсЕпйте Ь., Еок!ет Т., Ноок М. (1997) Сйа^асΐе^^ζайοη о! (Не шЮгасйоп Ье!теееп (Не 81арНу1ососсик аигеик с1ишртд ГасЮг (С1ГА) апй ПЬпподеп. Еиг 1. ВюсНет. 247:416-424 и МсЭеу|(( Ό., Егапсо1к Р., Уаийаих Р., Еок(ег Т.1. (1994) Мо1еси1аг с11агас(епζа(^οη о! (Не с1ишртд ГасЮг (йЬпподеп тесерЮт) о! 81арНу1ососсик аигеик, Мо1. МютоЬюк, 11:237-248).
Трехмерный структурный анализ С1!А и родственных фибриногенсвязывающих белков 8йтО и С1!В показал, что лигандсвязывающий домен А во всех этих родственных белках состоит из трех субдоменов N1, N2 и N3, с остатками 221-559, соответствующими участкам Ν2-Ν3, представляющим собой наименьшее укорочение, которое сохраняет способность связываться с фибриногеном. Обнаружили, что аминокислотные остатки 532-538 соответствуют области фиксирующего пептида из С1!А. Каждый субдомен содержит девять β-цепей, которые образуют новую 1дС-подобную укладку. Пептидсвязывающий сайт γ-цепь фибриногена в этих белках находится в гидрофобной бороздке на границе между N2 и N3. Обнаружили, что существует значительное структурное сходство между трехмерной структурой этих белков, которое обусловлено одной или более чем одной родственной аминокислотной последовательностью, сходной модульной конструкцией и общей организацией связывающего домена.
8йгС, 8йгЭ, 8йгЕ, ТпВРА-А (все семь изоформ) и ТпВРВ-В (все семь изоформ) имеют сходную модульную организацию и, используя, таким образом, РНУКЕ молекулярное моделирование можно ожидать, что эти белки будут иметь одинаковую трехмерную структуру.
1кйА и 1кйВ не имеют такого же типа структуры, как белки С1! или 8йг. Они имеют новый мотив, названный ^ЖАТ, который вовлечен в связывание лиганда. Однако НЕАТ-мотив сходен с трехмерной структурой С1! или 8йг в том, что он состоит из сэндвича бета-цепей (бета-сэндвич-укладка, которая состоит из двух пятицепочечных антипараллельных бета-слоев) и является членом 1д-суперсемейства (Рйра е( а1. 8о1ийоп 81гис1иге о! (Не ЖАТ (ЖЛг Ттапкройей) Эошат !гот 1кйН/НагА: (Не Нитап Нетод1оЬш КесерЮг ш 8(ар1ососсик аигеик, 1. Мо1. Вю1. (2006) 10 360:435-447). Была установлена трехмерная структура NЕЛТ-мотива 1кйН и предсказаны остатки в петле 1Ь-2.
Экспрессия С1!А на 8. аигеик препятствует фагоцитозу как макрофагами, так и нейтрофилами (Ра1тсрзк( К, Ра1й 1.М., ТаткотекИ А., 1оке!ккоп Е. (2004) Ехртеккюп о! к(ар11у1ососса1 с1итршд !ас(ог А йпрейек тасгорНаде рйадосуЮык, МюгоЬ 1п!ес1., 6:188-195 и Шддшк 1., ЬоидНтап А., уап Кекке1 К.Р.М., уап 8(п)р 1.А.6., Еок(ег Т.1. (2006) С1итртд !ас!ог А о! 81арНу1ососсик аигеик шЫЬНк рНадосуЮык Ьу Нитап ро1утогрйопис1еаг 1еикосу!ек, ЕЕМ8 МютоЬюк Ьей, 258:290-296). В нейтрофилах это связано как с фибриноген-зависимым механизмом, так и с фибриноген-независимым механизмом. Напротив, тромбоциты активируются бактериями, экспрессирующими С1!А, посредством его взаимодействия с ОРПЬ/Ша, приводящего к агрегации. Это наиболее эффективно осуществляется, когда фибриноген присутствует, но существует также фибриноген-независимый путь активации тромбоцитов (ЬоидНтап А., Е|Юдега1й 1.К., Вгеппап М.Р., Шддтк 1., Эотепег К., Сох Ό., Еок(ег Т.1. (2005) Ко1ек о! йЬпподеп, 1ттипод1оЬийп апй сотр1етеп( т р1а(е1е( асйуайоп ргото(ей Ьу 8(арНу1ососсик аигеик с1итртд !ас!ог А, Мо1. МютоЬюк, 57:804-818 и О'Впеп Ь., Кетйдап 8.Ч., Кате 6., Нодап М., Репайек 1., Ь1й Ό., Е|рдега1й Ό.Ι., Еок(ег Т.1. & Сох Ό. (2002) Мц1йр1е шесйашкшк !ог (Не асйуайоп о! Нитап р1а(е1е( аддтедайоп Ьу 81арНу1ососсик аигеик: го1ек !ог (Не с1ишртд !ас!огк С1!А апй С1!В, (Не кеппе-акраПа1е гереа( рто1еш 8йгЕ апй рто1еш А, Мо1. М1сгоЬю1. 44, 1033-1044).
С1!А является фактором вирулентности для индукции септического артрита у мышей (1оке!ккоп Е., Натйогй О., О'Впеп Ь., Ра1й 1.М., Еок1ет Т. (2001) Рто1есйоп адатк! ехрептеп(а1 81арНу1ососсик аигеик аг(11пйк Ьу гасстаЕоп тейй с1итртд !ас!ог А, а поге1 У1ги1епсе йеЮгттапЬ 1. Шес!. Э1к, 184:1572-1580). Кроме того, элиминация С1!А вместе с другим фибриногенсвязывающим белком С1!В защищала против системного воспаления на ранних стадиях инфекции (Ра1тс.|У1к( К, Еок(ег Т., ЕЙ2дета1й К., 1оке!ккоп Е., ТаткотекИ А. (2005) ИЬтопесйп-Ьшйтд рто!етк апй йЬпподеп-Ьтйтд с1итршд !ас!огк р1ау Фкйпс! го1ек ш к!арйу1ососса1 аййпйк апй кук(етю 1пПаттайоп, 1. 1пТ. Э1к, 191:791-798).
8(ар11у1ососсик аигеик фибриногенсвязывающий белок С1!А был выделен и охарактеризован и является предметом, например, патентов США №№ 6008341 и 6177084.
С1!А и С1!В имеют идентичную структурную (трехмерную) организацию и приблизительно 27%ную аминокислотную идентичность. ЕпВРА имеет приблизительно 25%-ную аминокислотную идентичность с С1!А.
В настоящее время нет одобренных и коммерчески доступных вакцин на основе М8СК.ЛММ. Уетопа!е®, донор-селективный противостафилококковый человеческий иммуноглобулиновый внутривенный (Ю1У) препарат, направленный на С1!А и 8йтО, плохо проявил себя в III фазе клинических испытаний и был снят с испытаний. В настоящее время его переоценивают для того, чтобы определить, является ли он эффективным для лечения стафилококковых инфекций.
- 4 019516 \νϋ 2005/116064 относится к ЕпВРА, который является многофункциональным связывающим белком 8. аигеик. Ν-концевой домен А ЕпВРА напоминает С1ГА и, как было показано, связывается с фибриногеном. Однако С-концевые ВСЭ домены ЕпВРА связываются с фибронектином, следовательно, ЕпВРА является бифункциональным М8СКЛММ.
νθ 2005/116064 основана на открытии, что в присутствии трансглутаминазы ковалентные связи образуются между бактериальным адгезином ЕпВРА и белком фибронектином хозяина, делая ассоциацию значительно более сильной и, по существу, необратимой. Фибриноген является основным компонентом (примерно 3 мг/мл) в крови, где он выступает в качестве конечной мишени каскада коагуляции. Фибронектин присутствует в меньшем количестве, примерно 0,3 мг/мл или одна молекула Еп на каждые 10-15 молекул фибриногена. Считают, что фибриноген и фибронектин не связываются в крови, где они циркулируют независимо.
Важно отметить, что νθ 2005/116064 конкретно относится к ковалентному сшиванию, катализируемому фактором Х111а. В νθ 2005/116064 выделено множество мутантных рекомбинантных ЕпВРА, в которых были изменены остатки с положительно заряженными боковыми цепями (т.е. субстраты для трансглутаминазы). Более того, νθ 2005/116064 относится к мутантам, в которых изменены только связывающие свойства ковалентного фибронектина, а не фибриногена. Кроме того, в данном изобретении экспериментально не показано, уменьшается ли связывание мутантного белка с лигандом, и не представлено никаких данных, подтверждающих иммуногенность.
Таким образом, в связи с распространенностью множественной лекарственной устойчивости у грамположительных бактерий и отсутствием успешных способов лечения и вакцин против таких бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, любая альтернативная терапия, которая может справляться с подобными бактериальными инфекциями без применения антибиотиков, будет иметь важное значение.
Более того, любые улучшения эффективности известных способов лечения или вакцин будут иметь особое значение, особенно в клинических условиях.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на обеспечение альтернативной и улучшенной терапии для такого лечения таких бактериальных инфекций.
Краткое изложение сущности изобретения
В соответствии с первым основным аспектом изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или МБСКАММ-подобный белок или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина для применения в терапии.
В соответствии с предпочтительным воплощением предложен рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок М8СКАММ или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области без способности связывать фибриноген, для применения в терапии.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию, включающий введение указанному индивидууму рекомбинантного стафилококкового М8СКАММ или М8СК.АММподобного белка или его фрагмента, или вакцины, содержащей рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или МБСКАММ-подобный белок или его фрагмент, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый белок М8СКАММ или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина.
В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения предложены антитела, полученные против рекомбинантного стафилококкового М8СКАММ или М8СКАММ-подобного белка или его фрагмента, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина предпочтительно в виде гипериммунной сыворотки.
В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или М8СКАММподобный белок или его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина и фармацевтически приемлемым адъювантом.
Подробное описание
Следует понимать, что в данном описании термины адгезии, М8СКАММ и белки, заякоренные в клеточной стенке являются взаимозаменяемыми и охватывают все происходящие из микробов лигандсвязывающие белки. В идеале эти белки связывают фибриноген, гем или гемоглобин, гаптоглобингемоглобин, гемин, коллаген и другие подобные лиганды. Предполагается, что термин М8СК.АММподобные белки охватывает белки или адгезины, которые имеют родственные аминокислотные последовательности, сходную модульную конструкцию и/или общую/сходную организацию связывающего домена с такими белками М8СКАММ, как белки Ικά. В идеале МБСКАММ-подобные белки имеют сходную организацию/модульную конструкцию связывающего домена. Кроме того, М8СК.АММподобные белки могут иметь по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 75%, более предпочтительно 85%, еще более предпочтительно 95%, а еще лучше 99% или более идентичности с
- 5 019516 белками М8СКАММ.
Следует также понимать, что любой процент идентичности или гомологии, упомянутый в описании, определяют с использованием имеющихся традиционных способов относительно целой/всей длины последовательности.
Термин микроорганизм, микроб, микробный или тому подобный включает, но не ограничивается организмами, включающими бактерии, грибы, вирусы, дрожжи и/или плесень.
Термин иммунологически эффективное количество относится к таким количествам, которые способны вызывать В-клеточный и/или Т-клеточный ответ.
В соответствии с первым основным аспектом изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый М8СВАММ или М8СКАММ-подобный белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть лигандсвязывающей области с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина, для применения в терапии. Такой рекомбинантный белок может быть использован в лечении микробных инфекций, таких как лечение сепсиса, септического артрита и/или эндокардита или других сходных заболеваний либо болезненных состояний. Такие микробные инфекции, в идеале, могут быть вызваны стафилококками или другими сходными микроорганизмами.
В соответствии с одним конкретным воплощением этого аспекта изобретения рекомбинантный М8СКАММ или М8СКАММ-подобный белок или его фрагмент имеет уменьшенную способность или отсутствие способности нековалентно связываться с его лигандом хозяина.
Таким образом, следует понимать, что рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или М8СКАММ-подобный белок или его фрагмент может иметь уменьшенное связывание с его лигандом хозяина или связывание с лигандом хозяина может быть предотвращено.
В соответствии с изобретением предполагают, что нековалентное связывание, которое происходит во время связывания, посредством стыковки, захвата и фиксации (Эоск, Ьоск апб Ьа1сЫид (ПЬЬ)), М8СКАММ или М8СКАММ-подобного белка с его лигандом, может быть уменьшено или предотвращено. Установлено, что первая стадия в связывании М8СКАММ с его лигандом включает нековалентное взаимодействие через ПЬЬ-модель. Это первичные нековалентные взаимодействия М8СКАММ с лигандом. Конечные стадии связывания М8СКАММ с лигандом включают ковалентные взаимодействия. В этом конкретном воплощении рекомбинантный М8СКАММ или М8СКАММ-подобный белок либо его фрагмент имеют уменьшенную способность или отсутствие способности нековалентно связываться с его лигандом хозяина вследствие изменения стыковки, захвата и фиксации. Могут быть изменены одна или более стадий стыковки, захвата или фиксации.
Модель ПЬЬ была выявлена из трехмерной структуры 8бгС в комплексе с его лигандом. В настоящее время было показано, что СНА действует с незначительным изменением ПЬЬ-механизма (Саиесй с1 а1.(2008) А 51гис1ига1 тобе1 οί 1Пе 81арйу1ососси5 аигеик С1Га-йЬгтодеи т!егас1юи ореик пе\у ауеииек Ног 111е беыди оГ аиб-81арйу1ососса1 Шегареибск, Р1о8 РаШод, 4(11); е1000226). ПЬЬ-модель относится именно к нековалентным взаимодействиям, вовлеченным в связывание лиганда. ПЬЬ-модель предложена для всех других белков сходного структурного типа (будь то аминокислотное сходство/гомология или гомология структурной организации), включая, но не ограничиваясь этим, М8СЯАММ или М8СЯАММподобные белки.
В отношении М8СКАММ5 С1ГА/С1ГВ, в частности, было обнаружено, что минимальный лигандсвязывающий домен содержит субобласти Ν1-Ν3 области А, а именно субобласти N2 и N3, которые содержат вариант Оех-1дС 1д укладки. Вариант Оех-1дС 1д укладки представляет собой новый вариант иммуноглобулинового мотива, также названный ΌΕ-вариантом. Предполагают, что гидрофобный карман, образованный между двумя Оех-1дС доменами С1ГА/В, представляет собой лигандсвязывающий сайт для γ-цепи фибриногена. По сути, лиганд связывается с гидрофобной бороздкой, разделяющей N2 и N3. А именно, во время связывания лиганда развернутый пептидный компонент лиганда встраивается в бороздку, расположенную между субдоменами N2 и N3. Фиксирующий пептид на С-конце субдомена N3 претерпевает конформационное изменение и встраивается между двумя β-цепями в субдомене N2, таким образом фиксируя лиганд на месте. Действительно, мутагенная замена остатков Туг256, Рго336, Туг338 и Бу5389 в факторе агглютинации, которые, как предполагают, контактируют с концевыми остатками 408АСОУ411 γ-цепи фибриногена, приводит к образованию белков с отсутствующим или заметно уменьшенным сродством к фибриногену. Более подробная информация о данном конкретном воплощении предложена ниже.
Хотя эти идеи относятся к факторам агглютинации, в частности к С1ГА, они в равной степени применимы к другим М8СКАММ и/или М8СКАММ-подобным белкам, которые имеют сходную модульную организацию связывающего домена и связывают лиганды аналогичным образом.
Таким образом, для получения рекомбинантных стафилококковых М8СВАММ или М8СВАММподобных белков или их фрагментов с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина, полноразмерный белок, лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен или его фрагмент могут быть изменены для уменьшения или предотвращения связывания с его лигандом хозяина. В идеале, для С1ГА/С1ГВ и других сходных М8СВАММ или М8СВАММ-подобных белков субобласти N2 и N3
- 6 019516 области А, которые в идеале содержат вариант Осу-1дС 1д укладки, могут быть изменены для предотвращения или уменьшения связывания с его лигандом хозяина. Такое изменение предназначено для предотвращения связывания лиганда с гидрофобной бороздкой, разделяющей минимальные лигандсвязывающие домены, необходимые для ОЬЬ.
Такие изменения в лигандсвязывающем домене могут происходить на аминокислотном уровне путем замены или делеции аминокислоты с использованием либо полноразмерного белка, лигандсвязывающего домена, минимального лигандсвязывающего домена, либо его фрагмента. Следует понимать, что белки или их фрагменты с достаточно высокой гомологией с лигандсвязывающим белком также могут быть использованы. Высокая гомология, как определено в данном изобретении, имеет место, когда по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95-99%, наиболее предпочтительно 99% или более нуклеотидов совпадают по всей длине последовательности ДНК, или при использовании в отношении аминокислотных последовательностей, когда указанные аминокислотные последовательности не идентичны, но производят белок, имеющий ту же функцию и активность. Следует понимать, что эти комментарии по поводу высокой гомологии также могут относиться к трехмерной структуре белка, то есть к модульной организации связывающего домена.
Следует понимать, что может быть использован полный лигандсвязывающий белок, лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен или его фрагмент.
Применение укороченных белков лигандсвязывающего белка, таких как лигандсвязывающий домен, минимальный лигандсвязывающий домен, или применение их фрагментов является предпочтительным для облегчения изготовления и преодоления других проблем, таких как нежелательное расщепление белка. Например, фиксирующий пептид, присутствующий в минимальном лигандсвязывающем домене, может быть делетирован/удален или изменен. Например, фиксирующий пептид в СИЛ соответствует аминокислотам 532-538 области А и в СИВ - аминокислотам 530-540 области А (\Уа1511 с1 а1.(2004) ДВС 279(49): 50691-50699). Эти остатки могут быть изменены, заменены или удалены/делетированы для предотвращения связывания лиганда с М8СКАММ через ЭШ Таким образом, ИЕЬ фиксирование М8СКАММ с его лигандом предотвращается. Это фиксирование осуществляется посредством нековалентного взаимодействия. В одном воплощении фиксирующий пептид полностью удален вместе с остальными С-концевыми аминокислотными остатками области А. Согласно другому воплощению удалена только фиксирующая пептидная область. В соответствии с еще одним воплощением фиксирующая пептидная область подвергается аминокислотной замене, приводящей к уменьшению или предотвращению связывания/фиксирования. Эти комментарии применимы ко всем М8СКАММ или М8СКАММподобным белкам, которые связывают лиганды посредством ИЕЕ или похожих моделей.
Изменяя М8СКАММ или М8СК.ЛММ-подобный белок таким путем, можно создать лигандсвязывающий белок, неспособный связываться со своим лигандом, который стимулирует больший иммунный ответ при иммунизации, чем белок дикого типа. Предпочтительно это уменьшает системное воспаление, снижая тем самым микробную вирулентность. Следовательно, этот измененный лигандсвязывающий М8СКАММ или М8КАММ-подобный белок, который лишен способности связываться со своим лигандом, может быть предпочтительно использован для лечения микробных инфекций. Таким образом, эти данные представляют новое и ценное терапевтическое средство для вакцинации/иммунизации против бактериальных инфекций, которое обеспечивает лучшие результаты по сравнению с терапевтическим средством для вакцинации/иммунизации, происходящим из белка дикого типа.
В соответствии с одним воплощением изобретения лиганд представляет собой гем, гемоглобин или фибриноген. Могут рассматриваться и другие лиганды, такие как гаптоглобин-гемоглобин, гемоглобин, гемин, коллаген и т.д.
В соответствии с другим воплощением изобретения рекомбинантный белок М8СК.ЛММ выбран из фибриногенсвязывающего белка или 8бтИ, 8бтЕ, 8бтС и/или 8бтЕ.
Фибриногенсвязывающие белки были описаны выше и включают, но не ограничиваются этим, С1ГЛ. СИВ, ЕиВРА, ЕиВРВ, ЕЫ, ПбА и т.д. Было показано, что 8бтС/Е связывает коллаген. Другие М8СКАММ8 включают 8а§А, 8а§С, 8а§К и 8бтН.
Рекомбинантный М8СКАММ-подобный белок может быть выбран из ПбА, ПбВ и/или ПбН.
На основании данных о фибриногенсвязывающем М8СКАММ С1ГА могут быть получены аналогичные не-лигандсвязывающие мутанты, например, в ИЕАТ (ИЕАт ТтаикроИет) мотиве белков Пб, включая ПбН и ПбВ. Как описано выше, 1§бА и ПбВ не имеют такого же типа структуры, как белки СИ или 8бт. Однако ИЕАТ-мотив в Пб непосредственно вовлечен в связывание лиганда (гаптоглобингемоглобин, гемоглобин, гемин), таким образом изменения в ИЕАТ-мотиве будут препятствовать взаимодействию хозяин-лиганд таким же образом, как изменение ИЕЕ- или ИЕЬ-подобного взаимодействия хозяин-лиганд для СИ или 8бт. Многие ИЕАТ доменсодержащие белки, включая ПбА в 81арйу1ососси5 аитеик, вовлечены в связывание с гемом. Предполагают, что гемсвязывающее свойство ПбА содержится в ИЕАТ-домене. Кристаллические структуры ано-ПбА ИЕАТ-домена и в комплексе с гемом продемонстрировали подобную клатриновому адаптеру бета-сэндвич-укладку с большим гидрофобным гемсвязывающим карманом. ПбВ имеет два ИЕАТ-мотива, и ПбА имеет один ИЕАТ-мотив. Не
- 7 019516 лигандсвязывающие мутанты белков Ιδά могут быть выделены путем изменения остатков, предназначенных для связывания с лигандом, например, путем изменения остатков между бета-цепями и/или гидрофобным карманом. Кроме того, ΝΕΑΤ-мотив может быть изменен для воздействия на нековалентные взаимодействия хозяин-лиганд.
В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию, включающий введение указанному индивидууму рекомбинантного стафилококкового М8СКАММ или МБСКАММ-подобного белка или его фрагмента либо вакцины, содержащей рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или МБСКАММ-подобный белок либо его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина.
В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или М8СКАММ-подобный белок либо его фрагмент с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина.
В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложены антитела против рекомбинантного стафилококкового М8СКАММ или М8СКАММ-подобного белка или его фрагмента с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина предпочтительно в форме гипериммунной сыворотки.
В соответствии с другим воплощением этого аспекта настоящего изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый М8СКАММ или МБСКАММ-подобный белок или его фрагмент, с уменьшенным связыванием с его лигандом хозяина.
В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения предложен рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области и лишенный способности связывать фибриноген, для применения в терапии.
Следует понимать, что рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент может быть использован для лечения микробных инфекций, предпочтительно стафилококковых инфекций, например, для лечения сепсиса, септического артрита и/или эндокардита или других похожих заболеваний или болезненных состояний.
Фибриногенсвязывающая область белка изменена таким образом, что больше не связывается с фибриногеном. Как отмечалось выше, изменение может произойти на нуклеотидном или аминокислотном уровне. Следует понимать, что могут быть использованы также белки или их фрагменты с достаточно высокой гомологией с фибриногенсвязывающим белком. Высокая гомология, как определено в данном изобретении, имеет место, когда по меньшей мере 50%, предпочтительно 60%, предпочтительно 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95%, наиболее предпочтительно 95-99%, особенно предпочтительно 99% нуклеотидов совпадают по всей длине последовательности ДНК, или при использовании в отношении аминокислотных последовательностей, когда указанные аминокислотные последовательности не идентичны, но производят белок, имеющий ту же функцию и активность. Следует понимать, что эти комментарии о высокой гомологии также могут относиться к трехмерной структуре белка.
Следует понимать, что может быть использован полный фибриногенсвязывающий белок, фибриногенсвязывающая область, минимальная фибриногенсвязывающая область или ее фрагмент. Применение укороченных белков или их фрагментов является предпочтительным для облегчения изготовления и преодоления других проблем, таких как нежелательное расщепление белка. Это описано ниже.
Такие фрагменты, в идеале, должны содержать по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области М8СКАММ. Преимущества применения укороченного белка или его фрагмента, содержащего, например, только один или более субдоменов лиганд-фибриногенсвязывающей области, относится к способности очищать белок с высокими выходами без деградации. Фибриногенсвязывающая область белка С1ГА, иначе называемая областью А, содержит 3 субобласти, N1, N2 и N3. Таким образом, иммуногенный фрагмент может содержать субобласти N1, N2 и/или N3 области А С1ГА или ее фрагмент. Таким образом, например, в отношении С1ГА фрагмент может содержать один или более субдоменов области А, N1, N2 или N3. В идеале, могут быть использованы N2 и N3, поскольку такое укорочение, вероятно, меньше подвергается протеолизу (сообщалось, что сайт для расщепления протеазами находится между N1 и N2 в С1ГА и СНВ) и может экспрессироваться на более высоких уровнях в Е. сой. N2 и N3 представляют собой минимальную фибриногенсвязывающую область белков С1Г.
Следует понимать, что хотя последующее обсуждение относится к фибриногенсвязывающему белку С1ГА, эти комментарии в равной степени применимы к другим М8СКАММ, М8СКАММ-подобным белкам и, в частности, другим фибриногенсвязывающим белкам, которые структурно сходны на уровне либо аминокислотной, либо белковой структуры с С1ГА, например, таким как С1ГВ, ЕЫ и 8йтР/С (которые также связывают коллаген). Кроме того, эти идеи применимы к РиВРА и РиВРВ. Таким образом, хотя следующие комментарии относятся к фибриногенсвязывающим белкам, они в равной степени применимы к другим М8СКАММ или МБСКАММ-подобным белкам, которые связываются с лигандами, отличными от фибриногена.
- 8 019516
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что измененный фибриногенсвязывающий белок, укорочение или его фрагмент, лишенный способности связываться с фибриногеном, стимулирует больший иммунный ответ при иммунизации, чем белок дикого типа, который связывается с фибриногеном обычным способом. Предпочтительно этот измененный фибриногенсвязывающий белок не вызывает системного воспаления при экспрессии в 8. аигеик и, таким образом, микробная вирулентность уменьшается. Следовательно, этот измененный белок, который лишен способности связываться с фибриногеном, может быть предпочтительно использован для лечения микробных инфекций. Авторы изобретения также обнаружили, вопреки ожиданиям, что защитный эффект измененного фибриногенсвязывающего белка выше, чем у белка дикого типа. Авторы изобретения обнаружили, что фармацевтическая композиция или вакцина, содержащая такой измененный рекомбинантный белок, является более эффективной, чем фармацевтическая композиция или вакцина, содержащая тот же рекомбинантный белок в неизмененной (дикого типа) форме, такой как С1ГА, С1ГВ, 8бгС и т.д.
Таким образом, эти данные представляют новое и полезное терапевтическое средство для вакцинации/иммунизации против бактериальных инфекций, которое обеспечивает лучшие результаты по сравнению с белком дикого типа, также используемым в качестве терапевтического средства для вакцинации/иммунизации.
Следует понимать, что измененный белок, будь то М8СЕАММ или М8СЕАММ-подобный белок, фибриноген или другой лигандсвязывающий белок, может быть использован для получения антител, включая моноклональные, поликлональные, химерные, гуманизированные антитела или их фрагменты, для применения в лечении таких микробных инфекций. Затем могут быть предложены композиции, которые включают такие антитела, например, как гипериммунная сыворотка, и эти композиции могут быть использованы в лечении пациентов, инфицированных стафилококковыми инфекциями.
Таким образом, белки или их активные фрагменты могут быть использованы для ингибирования связывания стафилококков с внеклеточным матриксом (ЕСМ) и для предупреждения/лечения стафилококковых инфекций у пациента.
Кроме того, белки или их активные фрагменты и антитела к белкам полезны в лечении инфекций, вызванных стафилококками, для разработки вакцин для активной и пассивной вакцинации и при введении в виде фармацевтической композиции для раны или медицинского устройства, как белки, так и антитела полезны в качестве блокирующих агентов для предупреждения микробных инфекций. Например, эти белки или их фрагменты могут быть использованы в активных вакцинах, а антитела к этим белкам в пассивных вакцинах.
Эти вакцины и продукты, описанные в данном изобретении, представляют значительное улучшение по сравнению с предшествующим уровнем техники, в котором сообщается об обычном применении М8СЕАММ5 для обеспечения иммунизации, но не сообщается о неожиданных и улучшенных вакцинах или продуктах, описанных в данном изобретении.
Получение белков, ДНК и антител хорошо известно в данной области техники и не будет подробно описываться в данном изобретении. Обычные способы идеально подходят для получения этих молекул. Изобретение также будет понятно для охвата конструкций нуклеиновых кислот, содержащих нуклеиновокислотную и аминокислотную последовательность, представляющую интерес, рекомбинантных клеток-хозяев, содержащих такие конструкции нуклеиновых кислот для экспрессии интересующего белка, и иммуногенных композиций.
Для введения белковая композиция может быть диспергирована в стерильном изотоническом солевом растворе или другом фармацевтически приемлемом адъюванте.
Следует понимать, что вакцина может быть ДНК- или белковой вакциной.
Иммунизация может иметь место при введении ДНК, белка или антител. Кроме того, может быть введен ослабленный живой организм, который включает и экспрессирует ДНК.
Количество ДНК, белка или антител, которые могут быть введены, будет зависеть от некоторых смягчающих факторов, включая зависимость от силы промотора, экспрессии белка и иммуногенности экспрессируемого гена. Они могут быть изменены для каждого нового применения для получения желаемого иммунологически эффективного количества.
В соответствии с другим воплощением данного изобретения предложен способ индукции иммунного ответа у индивидуума и/или лечения пациента, имеющего микробную инфекцию, включающий введение индивидууму рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, фибриногенсвязывающую область, без способности связываться с фибриногеном.
В соответствии с другим предпочтительным воплощением данного изобретения предложена вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с фибриногеном.
В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения предложено антитело против рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка или его фрагмента, содержащего по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с
- 9 019516 фибриногеном, предпочтительно в форме гипериммунной сыворотки.
В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением данного изобретения предложена иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент, содержащий по меньшей мере часть фибриногенсвязывающей области, без способности связываться с фибриногеном, и фармацевтически приемлемый адъювант.
В идеале рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок или его фрагмент происходит из 8. аигеи5, 8. ер1йегт1й15 и/или 8. 1идйипеп515.
В этих воплощениях фибриногенсвязывающий белок может быть выбран из ГЫ, 8йгГ и/или 8йгС (которые также являются коллагенсвязывающими). Альтернативно, фибриногенсвязывающий белок может быть выбран из фибриногенсвязывающего белка фактора агглютинации А (С1ИА), фибриногенсвязывающего белка фактора агглютинации В (СИВ), фибронектин-фибриногенсвязывающего белка А (ГиВРА), фибронектин-фибриногенсвязывающего белка В (ГиВРВ). ИйА стимулирует адгезию, имеет слабую аффинность к фибриногену и фибронектину, поэтому может быть в принципе определен как фибриногенсвязывающий М8СКАММ.
Следует понимать, что нуклеотидные и аминокислотные замены или делеции в фибриногенсвязывающей области таких фибриногенсвязывающих белков дают в результате рекомбинантный белок без способности связываться с фибриногеном.
Было выявлено, что связывание С1ИА с фибриногеном осуществляется посредством механизма стыковки, захвата и фиксации (йоск, 1оск апй 1а!сИ1пд (ИЕЬ)), аналогичного механизму для 8йгС. Модель ИЕЬ была описана выше. Область А С1ИА отвечает за белок-лигандное взаимодействие. Как показано на фиг. 11, модульная структура нескольких фибриногенсвязывающих М8СКАММ сходна и все они содержат область А, похожую на С1ИА.
Пептидсвязывающий сайт γ-цепи фибриногена расположен в гидрофобной бороздке на границе между N2 и N3 С1ИА. Таким образом, замены или делеции, упомянутые выше, направлены на изменение взаимодействия между белком М8СКАММ и лигандом и предотвращение нековалентного связывания С1ИА с фибриногеном.
В соответствии с одним конкретным воплощением настоящего изобретения рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок представляет собой мутант С1ИА, дефектный в отношении связывания с фибриногеном. В этом воплощении фибриногенсвязывающая область А СИА изменена любыми способами (такими как мутации с заменой или делецией) с тем, чтобы она больше не связывалась с фибриногеном.
В идеале, фибриногенсвязывающий белок представляет С1ИА, однако С1ИА имеет трехмерное структурное сходство со многими другими фибриногенсвязывающими белками. Таким образом, следует понимать, что эти комментарии, относящиеся к С1ИА, в равной степени применимы к другим М8СКАММ фибриногенсвязывающим белкам, включая СИВ, ГиВРА, ГиВРВ, ГЫ, 8йгС/Г, 1§йА и т.д. Все эти белки имеют похожие трехмерные структуры, поэтому сходные изменения/мутации в фибриногенсвязывающей области могут быть сделаны с получением тех же результатов.
С1ИА представляет собой белок из 993 аминокислот, содержащий фибриногенсвязывающий домен из 520 аминокислот (из аминокислот с 40 по 559). Этот фибриногенсвязывающий домен представляет собой Ν-концевой А домен, содержащий субобласти N1, N2 и N3. В изобретении может быть использована полная фибриногеновая область, охватывающая №-N3, от аминокислоты 40 до аминокислоты 559. Альтернативно, может быть использовано укорочение №-143-области, например 221-559 (минимальная фибриногенсвязывающая область), 221-531 (минимальная фибриногеновая область без фиксирующего пептида и последующих остатков) и т.д. В идеале, могут быть использованы субобласти N2 и N3, минимальная фибриногенсвязывающая область, которые соответствуют аминокислотным остаткам 221-559. Альтернативно, может быть использован фрагмент этих субобластей.
Было установлено, что аминокислотные остатки от 221 до 559, охватывающие области N2 и N3 С1ИА, играют важную роль в связывании с фибриногеном и представляют собой минимальную фибриногенсвязывающую область. Авторы изобретения также неожиданно обнаружили, что мутация аминокислотных остатков в этой области дает в результате экспрессируемый белок, который может распознаваться иммунной защитной системой хозяина, но лишен связывания с фибриногеном и поэтому уменьшает ассоциированную вирулентность. Эта область (фибриногенсвязывающий домен из 339 аминокислот) С1ИА имеет определенную трехмерную структуру, так называемый ΌΕ-вариант 1дС укладки, и представляет собой минимальное Гд-связывающее укорочение, которое в случае изменения (посредством замены или делеции и т.д.) может обеспечить улучшенную терапию.
Изменение, приводящее к потере фибриногенсвязывающей активности, может происходить путем замены, добавления либо вставки или делеции либо на нуклеотидном, либо на аминокислотном уровне. В идеале, замена отрицательно влияет на трехмерную структуру (например, так называемого ΌΕварианта 1дС укладки) белка или фрагмента, поэтому он больше не может связываться с фибриногеном.
В идеале, нуклеотидная или аминокислотная замена уменьшает нековалентное взаимодействие с фибриногеном предпочтительно посредством предотвращения связывания лиганда с гидрофобным карманом, разделяющим N2 и N3 области А фибриногенсвязывающего белка. Альтернативно, область фик- 10 019516 сирующего пептида, соответствующая аминокислотам 532-538, может быть изменена посредством замены или делеции для предотвращения связывания лиганда. Дополнительно могут быть использованы укорочение/фрагмент, лишенные области фиксирующего пептида и возможно оставшейся части С-концевых белковых остатков, то есть лишенные аминокислотных остатков 532-559.
В соответствии с одним конкретным воплощением этого аспекта изобретения мутант СИЛ, дефектный в отношении связывания с фибриногеном, может быть сконструирован посредством замены аминокислот Р336 на серин и/или Υ338 на аспартат соответственно. Выбор остатков был основан на рентгеноструктурном анализе СИЛ и наблюдении, что индивидуальные изменения в пролине или тирозине уменьшали связывающую способность. Неожиданно авторы изобретения обнаружили, что этот мутантный белок СИЛ (гСПАР3368 Υ338Α) стимулирует иммунный ответ и может быть использован для создания значительно более эффективной вакцинной или антительной терапии. Эта замена может иметь место в полноразмерном фибриногенсвязывающем белке, фибриногенсвязывающей области, минимальной фибриногенсвязывающей области или его фрагменте.
В соответствии с другим конкретным воплощением этого аспекта изобретения мутант СПА, дефектный в отношении связывания с фибриногеном, может быть сконструирован посредством замены аминокислот Р336 на аспартат и/или Υ338 на серин соответственно. Как и в предыдущем воплощении, этот мутантный белок СПА (гСПАР 336А Υ3388) также может быть использован для создания значительно более эффективной вакцинной или антительной терапии.
Альтернативно, изменение может быть в форме делеции, включая фибриногенсвязывающую область без последовательности фиксирующего пептида (аминокислоты 532-538), с получением рекомбинантного фибриногенсвязывающего белка без способности нековалентно связываться с фибриногеном. В этом воплощении используют аминокислотные остатки 221-531 области А СПА, которая лишена фиксирующего пептида и последующих С-концевых остатков. Альтернативно, может быть рассмотрена аминокислотная замена в аминокислотах 532-538 фиксирующего пептида, которая препятствует ΌΕΕ фибриногена.
Следует понимать, что все белки семейства СИ'-Ббг связывают лиганды согласно ΌΕΕ-модели. Посредством моделирования трехмерной структуры можно предсказать фиксирующий пептид и сделать укорочение с его отсутствием либо в полноразмерном (Ν1-Ν3), либо в минимальном лигандсвязывающем укорочении Ν2-Ν3 или его фрагменте.
Авторы изобретения обнаружили, что эти белки гСПА с заменами (либо мутанты с делециями, либо замены или укорочения) снижали вирулентность и облегчали исход заболевания и неожиданно индуцировали менее системное воспаление, чем белок дикого типа.
Таким образом, иммунизация этих мутантных белков, как ожидается, основана на тестировании белков, увеличении уровня антител, которые распознают как мутантный белок, так и белок дикого типа, и обеспечивают больший иммунный ответ, чем в случае белка дикого типа.
Таким образом, СПА, который был изменен так, что он больше не может связываться с фибриногеном, является полезным терапевтическим кандидатом для активной или пассивной иммунизации. Следовательно, сам измененный белок СПА может быть использован в качестве вакцины, или могут быть использованы антитела, полученные к этому измененному белку СПА. Как указано выше, вакцина может быть ДНК- или белковой вакциной.
Следующие последовательности, представленные в таблице ниже, могут быть использованы в соответствии с изобретением._____________________________________________________
5ЕО Ю N0:
Описание
Длина
Область А \лй гСИА - полноразмерная а.к. последовательность (Пример 1)______________ м/1 гСИА область А - полноразмерная последовательность ДНК (Пример 1)__________ \лЛ гСИА область А - полноразмерная а.к.
последовательность (Пример 1)_______________ гСИАРУ! область А (пример 1)_________________ гСИАРУП область А (пример 1)________________ м/ί гСИА область А - полноразмерная а.к. последовательность с дополнительными Ν- и Сконцевыми остатками1 (пример 2)_____________ гСИАРУ! область А с дополнительными Ν- и Сконцевыми остатками (пример 1)_____________ гСИАРУП область А с дополнительными Ν- и С1560 нуклеотидов
530 а.к.
530 а. к.
N1 -Ν3
N1 -Ν3
N1 -Ν3
N1 -Ν3
N1 -Ν3
N1 -Ν3
N1 - N3
- 11 019516
| концевыми остатками | |||
| 9 | гСУКА 221-559 (пример 2) | 339 а.к. | N2 и N3 |
| 10 | гСИА 221-559 с дополнительными Ν- и Суконцевыми остатками1 (пример 2) | 349 а.к. | N2 и N3 |
| 11 | гСНА ΡΥ 221-559 (пример 2) | 339 а.к. | N2 и N3 |
| 12 | гСНА ΡΥ 221-559 с дополнительными Ν- и Суконцевыми остатками1 (пример 2) | 349 а.к. | N2 и N3 |
| 13 | гСНА 221-531 (дельта укорочение без фиксирующего пептида) с дополнительными Νи С-концевыми остатками2 (пример 2) | 321 а.к. | N2 и Ν3ύ |
| 14 | гСИАРУ 221-531 (дельта укорочение без фиксирующего пептида) | 311 а.к. | N2 и N3* |
| Дополнительные N остатки (\-концевой участок (6хН1з метка и дополни- |
тельные остатки) содержат 6 остатков Н1з с последующими О1у и 8ег. Дополнительные С-концевые остатки включают Ьуз с последующим Ьеи (другие дополнительные Ν- и С-концевые остатки могут быть использованы в зависимости от используемого праймера или необходимых Ν/С-концевых маркеров).
2 Дополнительные N остатки (6хН18 метка и дополнительные остатки) включают 6 остатков Н18 с последующими О1у и 8ег. Дополнительные С-концевые остатки включают Агд с последующим 8ег (другие дополнительные Ν-и Сконцевые остатки могут быть использованы в зависимости от используемого праймера или необходимых Ν/С-концевых маркеров).
3 Без фиксирующего пептида, соответствующего а.к. остаткам 532-538 и оставшихся С-концевых остатков области А, то есть лишенные аминокислотных остатков 532-559.
В идеале рекомбинантный стафилококковый фибриногенсвязывающий белок содержит аминокислотную последовательность согласно любой из 8Ер ΙΌ N0: 1-3, где Р336 и/или Υ338 заменены серином и/или аланином, или его фрагмент.
Альтерантивно, фрагмент рекомбинантного стафилококкового фибриногенсвязывающего белка содержит аминокислотную последовательность согласно любой из 8Ер ΙΌ N0: 4-8ЕР ΙΌ N0: 14. 8Ер ΙΌ N0: 4 и 5 соответствуют только N1, N2, N3 домена А С1ГА, гСИ'А Р3368 Υ338Α и гСИ'А Р336А Υ338 8 соответственно, как указано в таблице выше.
Предполагают также, основываясь на заменах в фиксирующем пептиде, которые были сделаны в 8бгО, что замены в фиксирующем пептиде, которые являются дефектными в отношении конформационного изменения или комплементации бета-цепи, также будут дефектными в отношении связывания с лигандом. Таким образом, в идеале, замены приходятся на аминокислотные остатки 532-538, которые соответствуют фиксирующему пептиду и влияют на способность пептида подвергаться конформационному изменению или связываться с лигандом, или на то и другое. Альтернативно, изменение может включать удаление аминокислотных остатков 532-538 (дельта фиксирующий пептид) вообще с получением аналогичных результатов. Кроме того, С-концевой укороченный мутант, лишенный аминокислотных остатков 532-559 (включая остатки фиксирующего пептида), также будет влиять на связывание с лигандом.
Однако также предполагается, что другие аминокислотные остатки могут быть заменены иначе, чем конкретно указано выше. Например, О1и 526, Уа1 527, Туг 256 и Ьуз 389 могут быть заменены для изменения фибриногенсвязывающих свойств белка или его фрагмента. Таким образом, может рассматриваться любая замена, которая уменьшает связывающую способность. В идеале, такие замены или делеции влияют на гидрофобный карман и ассоциированный механизм связывания лиганда в гидрофобной бороздке, такие как гомологи Уа1527 в СНА и N526 в С1£В. В С1£В Р235 и N526 были изучены для того, чтобы показать, как уменьшается связывание. Похожее исследование было сделано с ЕпВРА, где N304 и Е306, как было показано, являются важными для связывания Ед. Таким образом, мутации в этих аминокислотных остатках будут влиять на связывание лиганда.
Следует понимать, что эти комментарии в равной степени применимы к другим фибриногенсвязывающим белкам, таким как С11В, 8бгО, ЕпВРА, ЕпВРВ. Таким образом, лечение (вакцина, антитело или фармацевтическая композиция и т.д.) может включать полную фибриногенсвязывающую область или ее фрагмент.
В описании термины содержат, содержит, содержать в себе и включающие или любой его вариант и термины включать, включает, включенный и включительно или любой его вариант считаются полностью взаимозаменяемыми и они все должны иметь как можно более широкую интерпретацию.
Изобретение не ограничивается воплощением, описанным выше в данном изобретении, но может варьировать как в конструкции, так и в деталях в пределах формулы изобретения.
Настоящее изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие неограничивающие графические материалы и примеры.
На фиг. 1-15 показаны результаты примера 1.
На фиг. 1 показана тяжесть артрита (А), измеряемая в виде артритного индекса, и потеря массы (Б) мышей, инокулированных штаммом 8. аигеиз Жлутап и нулевыми мутантами с1£ΑРΥI, с1£ΑРΥII и с1£А. Инокулировали 3,2х106-6,0х106 КОЕ штаммов 8. аигеиз. Данные представлены в виде медиан (прямоугольники или средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Объединены данные из трех экспериментов. ^етотап = 27-30, ^1£АР^ = 30, ^1£АРта = 10 и ^1£А = 16- 12 019516
20.
На фиг. 2 показан бактериальный рост в почках у мышей на 7-8 сутки после инокуляции 3,2х1066,0х106 КОЕ штамма 8. аитеик Ые^таи и нулевыми мутантами οΙίΆΡΥΙ, οΙίΑΡΥΙΙ и с1ГЛ. Данные представлены как КОЕ на пару почек. Если рост не был обнаружен, то количество определяли по наибольшему возможному количеству в соответствии с используемым разведением. Объединены данные из трех экспериментов. = 26, Ν,,ιγαρυι = 30, Ν,,ιγαρυπ = 10 и Ν γ = 15.
На фиг. 3 показано выживание мышей после инокуляции 5,2, 5,1 или 3,3х107 КОЕ штамма 8. аитеик №\νιη;·ιη. мутанта ΟΓΛΡΥΙ или нулевого мутанта с1ГА соответственно. N = 10 в группе в начале эксперимента.
На фиг. 4 показано выживание мышей после инокуляции 9,4, 7,9, 10,7 или 9,8х106 КОЕ штамма 8. аитеик Ь8-1 и нулевых мутантов ο1ΓΑΡΥΙ, ΗΓΑΡΥΙΙ или с1ГА соответственно. N = 15 в группе в начале эксперимента.
На фиг. 5 показано выживание мышей, иммунизированных БСА, рекомбинантным С1ГА или рекомбинантным Ο1ΓΑΡΥ (то есть доменом А рекомбинантного белка ΟΓΑΡΥΙ) и инокулированных 2,3х107 КОЕ 8. аитеик №\νιηηη. N = 15 в группе в начале эксперимента.
На фиг. 6 показана частота артритных мышей, инокулированных 3,2х106-6,0х106 КОЕ штамма 8. аитеик №'еттап дикого типа и нулевых мутантов ο1ΓΑΡΥΙ, с1ГЛРУ11 и с1ГА. Объединены данные из трех экспериментов. Ν·'..Υ.ν,·ΙΙΙΝΙ1 = 27-30, 01ΓΑΡΥΙ = 30, Ν,ΙΓΑΡΥΠ = 10 и Νγ = 16-20.
На фиг. 7 показана тяжесть артрита, измеренная в виде артритного индекса у мышей, инокулированных 5,2, 5,1 или 3,3х107 КОЕ штамма 8. аитеик №\νιηηη дикого типа, мутанта с1ГЛРУ1 или нулевого мутанта с1ГА соответственно. Данные представлены в виде медиан (прямоугольники), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Ν\..ξ,ΤΜΙΙ = 0-10, Νο1ΓΛΡΥΙ = 9-10 И Хс1ГА = 0-10.
На фиг. 8 показана потеря массы у мышей, инокулированных 5,2, 5,1 или 3,3х107 КОЕ штамма 8. аитеик №\νιηηη дикого типа, мутанта ΟΓΑΡΥΙ или нулевого мутанта с1ГА соответственно. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапозонов (усы). Ν'Ν·.ν..:η = 0-10, Ν^γαρυι = 9-10 И Νγ - 0-10.
На фиг. 9 показана тяжесть артрита, измеренная в виде артритного индекса у мышей, иммунизированных БСА, рекомбинантным С1ГА или рекомбинантным ί,ΊΓΑΡΥ (то есть доменом А рекомбинантного белка ΟΓΑΡΥΙ) и инокулированного 4,0х106 КОЕ 8. аитеик №\νιηηη. Данные представлены в виде медиан (прямоугольники), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Ν^^ = 14, Νο1ΓΑΡΥ = 14 и Νο1Γα = 15 в группе в начале эксперимента.
На фиг. 10 представлена нуклеотидная и аминокислотная последовательность домена А белка С1ГА дикого типа (гС1ГА), только доменов Ν123, с выделенными остатками, которые изменены в следующих примерах (Р336 и Υ338) с получением γΟΓΛΡΥΙ/ΙΙ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3). Это тот домен А рекомбинантного белка, который использовали при вакцинации в следующих примерах.
На фиг. 11 показано иллюстративное представление структуры белков ЕпВРА, С1ГВ, С1ГА и 8бтС. Область А представляет собой фибриногенсвязывающую область, 8 представляет собой сигнальную последовательность, представляет собой домен, расположенный в клеточной стенке, М представляет собой мембранный якорь, включающий ЬРХТС мотив, + представляет положительно заряженные остатки и В представляет собой повторяющуюся область. В С1ГА область А содержит Ν123 (не показано). ВСЭ-область ЕпВРА (и более короткая СЭ-область ЕпВРВ - не показано) связывает фибронектин.
На фиг. 12 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С.'1ГЛРУ40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА40-559 (гС1ГА) или рекомбинантным С.’1ГЛРУ40-559 (τΟΓΑΡΥ), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 2,3х107 КОЕ/мышь штамма 8. аитеик №\νιηηη дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Ν^^ = 13-15, ΝΓαΓΛ = 15 и ΗαΓΑΡΥ = 15.
На фиг. 13 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГА40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА40-559 (гС1ГА) или рекомбинантным С.’1ГЛРУ40-559 (ΎΟΓΛΡΥ), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 2,3 х107 КОЕ/мышь штамма 8. аигеик №\νιηηη дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Ν = 13-15, ΝΓαΓΛ = 15 и ΝΓαΓΛΡΥ = 15.
На фиг. 14 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГАРУ40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА40-559 (гС1ГА) или рекомбинантным С1ГАРУ40-559 (тС1ГАРУ), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 4,0х106 КОЕ/мышь штамма 8. аитеик №\νιηηη дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). Ν^^ = 14-15, ΝΓαΓΛ = 15 и Νι-αΓΛΡΥ = 15.
- 13 019516
На фиг. 15 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГА40-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА40-559 (гС1ГА) или рекомбинантным С1ГАРУ40-559 (гСИАРУ), через 9 суток после второй бустерной иммунизации, которая была за сутки до инфицирования 4,0х106 КОЕ/мышь штамма 8. аигеик Ые^тап дикого типа для индукции сепсиса. Данные представлены в виде медиан (средних линий), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). ЫБСА = 14-15, ЫгС1ГА = 15 и ЫгС1ГАру = 15.
На фиг. 16 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГАРУ221-559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА221-559 (гС1ГА221-559) или рекомбинантным С1ГАРУ221-559 (гС1ГАРУ221-559), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). ЫБСА =15, ЫгС1ГА221-559 = 14-15 и ЫгС1ГАРУ221-559 = 14-15.
На фиг. 17 примера 2 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГА221559 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных бычьим сывороточным альбумином (БСА), рекомбинантным С1ГА221-559 (гС1£А221-559) или рекомбинантным С1ГАРУ221-559 (гС1£АРУ221-559), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапозонов (усы). ЫБСА =15, ЫгС1ГА221-559 = 14-15 и ЫгС1ГАРУ221-559 = 14-15.
На фиг. 18 примера 3 показаны специфические антительные ответы на рекомбинантный С1ГА221531 в образцах сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным С1ГАРУ221-531 (гС1£АРУ221531), через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Данные представлены в виде медиан (средние линии), интерквартильных размахов (рамки) и 80% центральных диапазонов (усы). ЫгС1ГА221-531 = 14-15.
Примеры
Пример 1. Укорочения области А гС1ГА, содержащие N1, N2 и N3 (аминокислоты 40-559).
Материалы и методы.
Полная информация о числовых ссылках в скобках, указанных в примерах, приведена в конце данного раздела.
Мыши.
Мышей ΝΜΚ.Ι получали из 8сапЬиг ВК (8о11еп1ииа, Швеция) и содержали в виварии Отделения Ревматологии Университета г. Гётеборга, Швеции. Этическая комиссия Гётеборга по вопросам экспериментов над животными одобрила данные эксперименты. Их размещали по 10 животных в каждой клетке с 12-часовым циклом света-темноты и кормили стандартной лабораторной пищей и водой без ограничения. В начале экспериментов возраст животных составлял от 6 до 16 недель.
Бактериальные штаммы.
Для инфицирования животных использовали штаммы 8. аигеик дикого типа №\утап (14) и Ь8-1 (11) и их сконструированные производные. Производные с1ГА Р3з68Узз8 (с1ГАРУ1) и с1ГА Р336АУзз88 (сГГАРУП) конструировали на основе штамма Ыезгтап и трансдуцировали в штамм Ь8-1 (см. ниже). Также использовали делеционные мутанты Ыезгтап с1£А2::Тп917 мутант ЭШ876 (3) и Ь8-1 с1ГА2::Тп917 мутант (1.К.. ЕЦхдега1б е1 а1., не опубликовано). Бактерии выращивали на чашках с кровяным агаром в течение 48 ч, собирали и хранили замороженными при температуре -20°С в РВ8, содержащем 5% (мас./об.) БСА (81дта Сйетюа1к) и 10% (об./об.) диметилсульфоксида. Перед инъекцией животным бактериальные суспензии оттаивали, промывали в РВ8 и доводили до соответствующих концентраций клеток. Количество жизнеспособных бактерий измеряли в связи с каждым контрольным заражением посредством культивирования на чашках с кровяным агаром и подсчета колоний.
Конструирование мутаций с1£АРУ1 и сИАРУП в 8. аигеик Ыезгшап и Ь8-1.
В этом эксперименте использовали укорочение области А полноразмерного С1ГА, содержащее N1, N2 и N3 и соответствующее аминокислотам 40-559. В следующем описании и фигурах:
С1ГА также может называться как гС1ГА 40-559 (8ЕЭ ΙΌ N0: 3);
С1ГА Р3368У338А также может называться как с1ГАРУЕ гсИАРУ или гс1ГАРУ1 (т.е. с1ГАРУ1 40-559) (8Е(Э ΙΌ N0: 4) и
С1ГА Р336АУ3388 также может называться как с1£АРУЛ, гсГГАРУЛ (т.е. сИАРУП 40-559) (8ЕЭ ΙΌ N0: 5);
1,02 т.п.н. РкП-ВатШ фрагмент рСЕ77 РУ (Ьоидйтап е1 а1., 2005), содержащий мутации Р3368 и У336А в с1ГА, клонировали в рВ1иекспрШ 8К-(8йа1адепе). Эту плазмиду линеаризовали с помощью Нш6ΙΙΙ и лигировали в НтбШ-разрезанную рТ8егтС (1. Шддтк, не опубликовано) с получением плазмиды рАКМ, которая является температурочувствительным шаттл-вектором Е.со11-8. аигеик, содержащим замены Р3368 и У338А.
Для того чтобы уменьшить риск непреднамеренного создания функционального или иммунореактивного эпитопа путем замены Р336 и Υ338, авторы изобретения создали второй мутант, в котором порядок замен был обратным, получив Р336А и Υ3388. Чтобы получить это, создали плазмиду р1Н2. аналогичную рАКМ, но содержащую замены Р336А и Υ3388. ПЦР с перекрывающимися праймерами использовали с теми же фланкирующими праймерами, используемыми для получения рСЕ77 РΥ (6), и другой парой пе
- 14 019516 рекрывающихся мутагенных праймеров
ЕЗ: ССААСТТТеАССАТССССССТТСТАТТСАСССТСААААТС и КЗ: САТТТТСАССОТСААТАСААбССОССАТССТСАААСТТСС (мутации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты), с получением рСЕ77 ΡΥΙΙ. 1,02 т.п.н. ΡδΐΙΗΐηάΙΙΙ фрагмент этой плазмиды использовали, как описано выше, с получением рШ2, температурочувствительного шаттл-вектора Е.со11-8. аигеиз, содержащего замены Р336А и Υ3388.
Обе плазмиды рАРМ и рШ2 переносили в КИ4220 (15) посредством электропорации и затем трансдуцировали с использованием фага 85 (16) в 8. аигеиз Иемтап (14) и Б8-1 (11). В этих штаммах плазмиды индуцировали для встраивания в хромосому и затем вырезали, оставляя мутации в хромосоме части трансформантов, создавая Иемтап ^ίΑΡΥΙ, Иемтап сИАРУН, Б8-1 с1£АРУ! и Б8-1 ^ΓΑΡΥΙΙ. Трансформанты скринировали в отношении потери плазмиды и потери фибриногенсвязывающей активности. Целостность гена с1ПА проверяли с помощью саузерн-гибридизации с использованием пробы с1ПА (данные не показаны). Экспрессия иммунореактивного белка (ΠίΑΡΥ) проверяли с помощью вестерниммуноблоттинга с использованием поликлональной кроличьей антисыворотки против области А СПА (данные не показаны). Мутации проверяли с помощью ПЦР между КрнЕВашН! фрагментами из геномной ДНК и коммерческим секвенированием продуктов. Около 700 оснований гена с1ПА штамма Б8-1, которые были секвенированы, были идентичны соответствующим основаниям в гене Иемтап с1ПА штамма Иемтап.
Получение рекомбинантных С1ПА и С1ПΑΡΥ.
Ηΐδ-меченая область А рекомбинантного С1ПА, домены N123 (аминокислоты 40-559), получали из рСЕ40, как описано ранее (17), с дополнительной стадией очистки через анионообменную колонку. Плазмиду рСЕ77 ΡΥ (6) использовали в качестве матрицы для клонирования доменов N123 с1ПΑΡΥI в р^Ε30 с получением рСЕ40ΡΥ. Используя эту плазмиду, также получали рекомбинантный С1ПΑΡΥ с помощью аффинной хроматографии на никеле и анионобменной хроматографии, как было описано для гС1ПА. Элюаты диализовали против двух смен ΡΒ8 до концентрирования и лиофилизации.
Эксперименты в отношении септического артрита и сепсиса.
В экспериментах 1-3 всех мышей (п=10 в группе) инфицировали штаммом Иемтап для индукции артрита. В экспериментах 4 и 5 мышей инфицировали штаммом Иемтап и Б8-1 соответственно для индукции сепсиса (п=10 в группе).
Эксперимент 1. Мыши инфицировали внутривенной инъекцией 3,5 х106 КОЕ/мышь штамма 8. аигеи§ Иемтап или 4,3 х106 КОЕ/мышь мутанта Иемтап с1ПΑΡΥI, оба в 200 мкл ΡΒ8. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 8-е сутки, оценивали рост бактерий в почках и измеряли уровни ΙΕ-6 и общего Ι§Ο в сыворотке. Синовит и деструкцию костей исследовали гистологически на суставах передних и задних лап.
Эксперимент 2. Мышей инфицировали 5,0х106 КОЕ, 6,0х106 КОЕ или 4,3 х106 КОЕ штамма 8. аигеи§ Иемтап, мутанта с1ПΑΡΥI или Иемтап с1ПА::Бгтк (нулевого мутанта с1ПА) соответственно. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 7-е сутки, оценивали рост бактерий в почках и измеряли уровни ΙΕ-6 и общего Ι§Ο в сыворотке. Синовит и деструкцию костей исследовали гистологически на суставах передних и задних лап.
Эксперимент 3. Мышей инфицировали 4,7х106 КОЕ, 3,2х106 КОЕ, 3,9х106 КОЕ или 4,8х106 КОЕ штамма 8. аигеиз Иемтап, мутанта с1ПΑΡΥI, мутанта Иемтап с1ПΑΡΥII или нулевого мутанта Иемтап с1ПА соответственно. За клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 7 суток. Мышей умерщвляли на 7-е сутки и оценивали рост бактерий в почках.
Результаты экспериментов 1-3 были сходными, поэтому данные объединяли и представляли вместе.
В эксперименте 4 мышам инъецировали внутривенно 5,2х107 КОЕ, 5,1х 107 КОЕ или 3,3х107 КОЕ штамма 8. аигеиз Иемтап, мутанта с1ПΑΡΥI или нулевого мутанта с1ПА соответственно. За гибелью, изменением массы и клиническим артритом следили вплоть до 10 суток.
В эксперименте 5 мышей инфицировали 9,4х106 КОЕ, 7,9х106 КОЕ, 10,7х 106 КОЕ или 9,8х106 КОЕ штамма 8. аигеиз Б8-1, мутанта Б8-1 с1ПΑΡΥI, мутанта Б8-1 с1ПΑΡΥII или нулевого мутанта Б8-1 с1ПА соответственно. За гибелью, клиническим артритом и изменением массы следили вплоть до 16 суток.
Внутрисуставная инъекция бактерий.
В один коленный сустав на мышь инъецировали 2,4х104 КОЕ, 2,4х104 КОЕ или 3,4х104 КОЕ штамма Иемтап дикого типа, мутанта с1ПΑΡΥI или нокаутного мутанта с1ПА соответственно в 20 мкл ΡΒ8. И = 10 в группе. Мышей умерщвляли через 3 суток и коленные суставы собирали для гистопатологического исследования.
Вакцинация С1ПА дикого типа и мутантным рекомбинантным С1ПА.
Очищенный гС1ПА40-559, ^С1ПΑΡΥ40-559 (т.е. γΕΊΙΆΡΥΙ) или БСА растворяли в физиологическом растворе и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда (ЭП'со ЕаЬога1опе§). 200 мкл эмульсии, содержащей 30 мкг (= 0,53 нмоль) белка, вводили подкожно (п/к) в 0-е сутки. Первую бустерную иммунизацию 30 мкг белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 11-е сутки. Вторую бустерую иммунизацию осуществляли на 21-е сутки. На 30-е сутки у мышей собирали
- 15 019516 кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов.
На 31-е сутки 14-15 мышей в группе инфицировали посредством внутривенной инъекции 4,0х106 КОЕ/мышь для индукции септического артрита или 2,3 х107 КОЕ/мышь для индукции сепсиса. За клиническим артритом, изменением массы и гибелью следили в течение 11 и 15 суток соответственно. Рост бактерий в почках оценивали в эксперименте в отношении септического артрита.
Клиническая оценка инфицированных мышей.
Клиническую оценку осуществляли слепым методом. Каждую конечность тщательно осматривали. Осмотр давал оценку в баллах от 0 до 3 (0 - отсутствие набухания и покраснения; 1 - незначительное набухание и/или покраснение; 2 - умеренное набухание и/или покраснение; 3 - значительное набухание и/или покраснение). Артритный индекс определяли путем сложения баллов по всем четырем конечностям животного. Общее состояние каждой мыши также оценивали путем определения признаков системного воспаления, т.е. уменьшения массы, пониженной активности и взъерошенной шерсти. В случаях тяжелой системной инфекции, когда мышь оценивали как слишком больную, чтобы она смогла пережить еще 24 ч, ее умерщвляли посредством цервикальной дислокации и считали умершей из-за сепсиса.
Г истологический анализ.
Гистологический анализ суставов осуществляли, используя модификацию (8) ранее описанного метода (18).
Бактериологический анализ инфицированных почек.
Почки иссекали в асептических условиях, помещали на лед, гомогенизировали, серийно разбавляли в РВ8 и помещали на чашки с кровяным агаром. Через 24 ч инкубации при 37°С определяли число КОЕ на пару почек.
Измерение сывороточного 1с.|С.
Уровни общего 1§С в сыворотке определяли методом радиальной иммунодиффузии (19). Антимышиный 1§С козы и мышиный 1§С стандарт были приобретены в ЗоиШсгп Вю1сс11. Впташдйат, АЬ.
Специфические антитела - ЕЫ8А.
Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Специфический антительный ответ из сыворотки против гС1ГА и гСИАРУ измеряли с помощью ЕЫ8А. Микропланшеты (96-луночные; Иипс) покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного белка в РВ8.
Блокирующий агент, образцы сыворотки, биотинилированные антитела и ЕхйАуИш-пероксидазу разбавляли в РВ8. Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:20000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм.
Во втором эксперименте, чтобы получить более точный уровень специфических антительных ответов в различных группах иммунизации, ответы определяли при нескольких разведениях сыворотки. Таким образом, все образцы сыворотки разбавляли 1:5000, 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм.
Анализ 1Ь-6.
1Ь-6 в сыворотке определяли ранее описанным методом (20).
Статистический анализ.
Статистический анализ осуществляли с использованием критерия Манна-Уитни и. Р < 0,05 считали значимым. Данные представлены в виде медиан, интерквартильных размахов и 80% центральных диапазонов, если не указано иное.
Результаты.
Замена двух аминокислот, необходимых для связывания С1ГА с фибриногеном, снижает развитие септического артрита и сепсиса.
Две аминокислоты (Р336 и Υ338), которые, как известно, необходимы для связывания С1ГА с фибриногеном, изменяли посредством аллельного обмена для создания мутантов штаммов Ие^таи и Ь81, которые экспрессировали не-фибриногенсвязывающий белок С1ГА на клеточной поверхности. Уровень экспрессии и целостность белка измеряли с помощью вестерн-блоттинга, который выявил, что наблюдалась хорошая экспрессия мутантных белков на бактериальной поверхности и что экспрессируемый белок имел правильный размер.
Исследовали способность Ие^таи дикого типа и Ие^таи с1ГА Р3368 Υ^^ (с1ГАРΥI) вызывать септический артрит. Септический артрит индуцировали внутривенной инокуляцией 3,5х106-5,0х106 колониеобразующих единиц (КОЕ) и 3,2х 106-6,0х 106 КОЕ Ие\утап дикого типа и мутанта с1ГАРΥ1 соответственно. Развитие артрита исследовали в клинических условиях в течение 7 суток. Мутант с1ГАРΥI индуцировал значительно менее тяжелый артрит, чем штамм дикого типа в течение всего экспериментального периода (Р > 0,001, фиг. 1А). Частота артрита была ниже для Ие\утап с1ГАРΥI для большинства временных точек (фиг. 6).
Неожиданно оказалось, что новая аминокислотная композиция в молекуле С1ГАРΥI подходит для взаимодействия с антибактериальной защитой хозяина. Для проверки этой возможности сделали новую конструкцию, где различные аминокислоты были заменены на Р336 и Υ338 (с1ГА Р336А Υ338δ: с1ГАРΥII). У мышей, которым инокулировали 3,9х106 КОЕ Ие\\тпап с1ГАРУП, развился артрит в такой же низкой
- 16 019516 степени, что и после мутанта сНАРУ! (фиг. 1А) и с одинаковой частотой (фиг. 6). Этот результат убедительно указывает на то, что потеря связывания с фибриногеном отвечает за уменьшенный уровень артрита.
Возможно, что СНА вовлечен в развитие артрита с помощью механизмов, которые не включают связывание фибриногена. Для того чтобы проверить это, делеционный мутант СНА, лишенный белка СНА, сравнили с мутантами, экспрессирующими модифицированный белок СНА, не связывающий фибриноген. Однако у мышей, которых инфицировали 4,3х106-4,8х106 КОЕ нулевого мутанта сНА, развивался артрит, сходный с артритом, индуцированным у мышей, инфицированных мутантами сНАРУ! и сНАРУП (фиг. 1А). Частота артрита также не различалась (фиг. 6).
Инфицированные суставы исследовали также гистологически. Синовит у мышей, инфицированных №\хтап сНАРУ1, был значительно мягче, чем у мышей, инфицированных штаммом дикого типа, как в 1, так и во 2 эксперименте (Р = 0,02 и 0,001 соответственно). Разрушение кости - основная причина последствий у человека с септическим артритом - почти отсутствовала в №\хтап сНАРУ!-инфицированных образцах (эксперимент 2, Р = 0,001). Синовит и деструкция кости, индуцированные нулевым мутантом №\хтап сНА, также были менее выраженными по сравнению с мышами, инфицированными №\хтап дикого типа (Р = 0,003 и 0,006 соответственно), но несколько более тяжелыми, чем в группе №\хтап сНАРУР хотя и не очень значительно.
Затем анализировали метаболические последствия сНА мутаций для инфекционного процесса. Мыши, инфицированные штаммом №\хтап дикого типа, теряли вплоть до примерно 30% массы своего тела в течение экспериментального периода. Мыши, которых инфицировали мутантами №\хтап сНАРУ! и №\хтап сНАРУП, дефектными в отношении связывания с фибриногеном, почти не теряли массу (Р > 0,0001 по сравнению с диким типом). Напротив, нулевой мутант №\хтап с1НА оказывал промежуточный эффект на потерю массы, воздействуя значительно меньше, чем штамм дикого типа, но значительно больше, чем мутантные штаммы сНАРУ! и сНАРУП (Р < 0,02 в большинстве случаев, фиг. 1Б).
Уровни 1Ь-6 в сыворотке, являющиеся показателем системного воспалительного ответа, анализировали на 7-8-е сутки инфекции. Характер экспрессии 1Ь-6 был сходен с изменениями массы. №\хтап дикого типа индуцировал высокие уровни сывороточного 1Ь-6 (4,8 (2,8, 5,7) нг/мл), мутант №\хтап сНАРУ! индуцировал значительно более низкий уровень 1Ь-6 (0,2 (0,07, 2,4) нг/мл, Р < 0,0001), тогда как нулевой мутант №\хтап с1НА давал в результате промежуточный ответ (2,5 (1,3, 3,2) нг/мл) со значительным отличием как для группы дикого типа, так и для группы мутанта с1НАРУ1 (Р = 0,009 и Р= 0,008 соответственно) (медиана, интерквартильный размах).
Рост бактерий в почках был значительно выше у мышей, инфицированных штаммом №\хтап дикого типа по сравнению и с мутантами №\хтап сНАРУ, и с нулевым мутантом №\хтап сНА (Р < 0,0001, Р = 0,011 и Р = 0,005 соответственно, фиг. 2). Мыши, инфицированные нулевым мутантом №\хтап с1Н А, имели значительно больший бактериальный рост в почках, чем мыши, инфицированные №\хтап сНАРУ! (Р = 0,0005, фиг. 2).
Общий 1дС в сыворотке измеряли у мышей на 7-8-е сутки инфекции. Наблюдали значительно меньшее увеличение уровней 1дС как в группе, инфицированной №\хтап сНАРУ!, так и в группе, инфицированной нулевым мутантом №\хтап сНА, по сравнению с мышами, инфицированными штаммом дикого типа (3,1 (1,2, 4,9); 2,3 (1,0, 2,6) и 6,4 (5,0, 11,0) соответственно (медиана, интерквартильный размах); Р < 0,0003). Между двумя мутантными группами не было значительных различий.
Смертность составила 17% у мышей, инфицированных №\хтап дикого типа, 0% в группах мутантов №\хтап сНАРУ1 и сНАРП и 30% в группе нулевого мутанта №\хтап сНА. Существовали значительные различия в смертности между группами дикого типа и сНАРУ! и между группами сНАРУ! и нулевого мутанта с1НА (Р< 0,05 и Р < 0,01 соответственно).
Оказалось, что прямые и косвенные признаки системного воспаления ниже у мышей, инфицированных 8. аигеик, экспрессирующим СНА, который является дефектным в отношении связывания фибриногена. Неожиданно, штамм, который полностью лишен экспрессии С1НА, больше индуцировал системное воспаление, чем штамм, экспрессирующий мутант СНАРУ.
Сепсис индуцировали у мышей путем увеличения дозы инокуляции 8. аигеик. Мышей инфицировали 5,2х107 КОЕ №\хтап дикого типа, 5,1х107 КОЕ мутанта №\хтап сНАРУ1 и 3,3х107 КОЕ нулевого мутанта №\хтап сНА. В течение 5 суток все мыши, инфицированные диким типом, погибли, и только одна мышь из десяти с мутантом сНАРУ! погибла через 10 суток после инфицирования (Р < 0,0001, фиг. 3). Мыши, инфицированные нулевым мутантом с1НА, также прожили значительно меньше времени, чем мыши, инфицированные мутантом сНАРУ! (Р < 0,0001, фиг. 3). В этом эксперименте у мышей, зараженных нулевым мутантом с1НА, артрит развивался в значительно большей степени, чем в группе мутанта СНАРУ!, хотя в то же время они потеряли значительно большую массу (фиг. 7 и 8). Таким образом, по аналогии с показателями системного воспаления в экспериментах в отношении септического артрита выживание мышей продлевается, если молекула С1НА экспрессируется, до тех пор, пока она лишена фибриногенсвязывающих свойств.
- 17 019516
Инъекция бактерий в суставы.
Для того чтобы проверить, зависит ли воспалительная реакция в суставах от связывания с фибриногеном, №\ушап дикого типа, №\ушап С1ГАРУ1 или нулевой мутант №\ушап с1ГА инъецировали непосредственно в коленный сустав мышей, минуя, таким образом, системные отсеки. Синовит, включая полиморфноядерную инфильтрацию суставной полости, и разрушение кости исследовали с помощью гистологии через 3 суток. Мыши получали 2,4х104 КОЕ дикого типа, 2,4х104 КОЕ нулевого мутанта с1ГА или 3,4 х104 КОЕ мутанта С1ГАРУ1 в одно колено. Гистологический индекс при синовите и полиморфноядерной инфильтрации в суставной полости составлял 0,25 (0, 3,0) для коленей, инфицированных диким типом, 2,38 (0,25, 3,0) для нулевого мутанта с1ГА и 0,25 (0, 0,25) для мутанта С1ГАРУ1 (медиана, интерквартильный размах). Гистологический индекс для разрушения кости составлял 0 (0, 1,0) для дикого типа, 1,0 (0, 1,0) для нулевого мутанта с1ГА и 0 (0, 0) для мутанта с1£АРУ1 (медиана, интерквартильный размах; Р = 0,01 между мутантом с1£АРУ1 и нулевым мутантом с1ГА). Поскольку мутант с1£АРУ1 индуцировал очень незначительный синовит и разрушение кости, несмотря на то что мышам давали на 42% больше этого штамма, чем других штаммов, пришли к выводу, что С1ГА-стимулированное связывание с фибриногеном необходимо для максимального воспалительного ответа внутри сустава. Кроме того, отсутствие экспрессии С1ГА увеличивало воспаление по сравнению с мутантом С1ГА, дефектным в отношении связывания с фибриногеном.
Мутация РУ в штамме Ь8-1.
Для того чтобы определить, влияет ли способность С1ГА связываться с фибриногеном на вирулентность других штаммов 8. аигеик, с1£АРУ1, сИАРУН и нулевые мутации с1ГА подвергали трансдукции в штамм 8. аигеик Ь8-1, экспрессирующий Т88Т-1. Мышей заражали 9,4х106 КОЕ Ь8-1 дикого типа, 7,9х106 КОЕ Ь8-1 с1£АРУ1, 10,7х106 КОЕ Ь8-1 с1£АРУП или 9,4х106 КОЕ нулевого мутанта Ь8-1 с1ГА. Сепсис исследовали по частоте выживания. Через 16 суток только 40% мышей, зараженных штаммом дикого типа, были живы, тогда как 90% мышей, зараженных мутантом с1ГАРУ1 и нулевым мутантом с1ГА, и 80% мышей, инфицированных мутантом сМАРУП, были живы (фиг. 4). Мутанты с1£ΛРΥI и нулевой мутант с1ГА Ь8-1 были значительно менее вирулентными (Р = 0,014, Р = 0,05 и Р= 0,03 соответственно).
Иммунизация рекомбинантными белками С1ГА.
Эффект вакцинации рекомбинантным белком дикого типа С1ГА доменом А (гС1£А) и мутантным белком С1ГАРУ1 (гОГАРУ) исследовали, как на модели септического артрита, так и на модели сепсиса. Мышей сенсибилизировали и затем дважды иммунизировали контрольным белком БСА, гС1£А или гОГАРУ и затем инфицировали 4,0х106 КОЕ штамма 8. аигеик №\ушап для индукции септического артрита или 2,3х107 КОЕ штамма №\ушап для индукции сепсиса. Иммунизация с помощью гС1ГАРУ (т.е. домен А рекомбинантного белка С1£АРУ1) значительно защищала против смерти из-за сепсиса по сравнению с контрольными мышами (Р = 0,01, фиг. 5), тогда как иммунизация гС1£А не давала значительной защиты. За сутки до бактериальной инфекции наблюдали значительно более высокий специфический антительный ответ в сыворотке как против гС1ГАРУ. так и против гС1£А у мышей, иммунизировнных гОГАРУ (А405 = 0,39 (0,33, 0,56) и 0,71 (0,52, 0,81)), по сравнению с мышами, иммунизированными гС1£А (А405 = 0,13 (0,07, 0,17) и 0,15 (0,10, 0,24), Р< 0,0001 в обоих сравнениях (медиана, интерквартильный размах)). Контрольные иммунизированные животные имели только фоновые уровни (А405 нм = 0 и 0,01 (0, 0,01) (медиана, интерквартильный размах)). Иммунизированные мыши, которые подлежали инфицированию более низкой дозой бактерий для индукции артрита, имели сходные антительные ответы на гС1£А и гС1ГАРУ, как и мыши, у которых индуцировали сепсис (данные не показаны). Иммунизация как гС1£А, так и гС1ГАРУ защищала против развития артрита, хотя защита не была значительной (фиг. 9).
В течение 5-9 суток после ифицирования потеря массы значительно снижалась у гС1ГАРУ- и гС1£Аиммунизированных мышей по сравнению с контрольными мышами (данные не показаны).
Наблюдали тенденцию к уменьшенному росту бактерий в почках мышей, иммунизированных гОГАРУ или гС1£А, на 11-е сутки после инфицирования (БСА: 38 (3, 436); гС1ГАРУ: 7 (2, 17); гС1£А: 10 (7, 54)х 107 КОЕ/пара почек).
Чтобы получить более точную оценку специфических антительных ответов в различных группах иммунизации, ответы определяли при нескольких разведениях сыворотки (второй эксперимент). Данные показывают, что, весьма вероятно, существуют более высокие титры специфических антител в сыворотках гСЙАРУ-иммунизированных мышей к антигенам как гСГАРУ, так и гС1£А дикого типа у мышей, которые подлежали инфицированию как септической, так и артритной бактериальной дозой соответственно, чем в сыворотках мышей, иммунизированных гС1£А дикого типа, поскольку антительные ответы, измеренные по поглощению, были значительно выше у мышей, иммунизированных гС1ГАРУ, в каждом разведении сыворотки во всех сравнениях (от Р < 0,0001 до Р = 0,008, фиг. 12-15). Иммунизация БСА вызывала только фоновый антительный ответ.
Заключение.
Результаты убедительно указывают на то, что взаимодействие С1ГА - фибриноген является критичным для бактериальной вирулентности и исхода заболевания. Способность С1ГА связываться с фибрино
- 18 019516 геном ассоциирована с увеличенной вирулентностью с точки зрения способности вызывать смерть от сепсиса. В обоих протестированных стафилококковых штаммах мутант с1ГАРУ индуцировал реже смерть от сепсиса, чем дикий тип. Тяжесть артрита также значительно уменьшалась у мышей, инфицированных мутантом с1ГАРУ, не связывающим фибриноген.
Вероятным механизмом для стимуляции вирулентности за счет взаимодействия фибриногена и бактериальной клеточной поверхности является ингибирование нейтрофильного фагоцитоза (5). Нейтрофилы являются ключевыми для иммунной защиты хозяина на ранней стадии инфекции 8. аигеик (13). Без нейтрофилов бактериальный рост сильно увеличивается в крови и почках и частота артрита и смертности возрастает. Фибриноген-опосредованное ингибирование нейтрофильного фагоцитоза С1ГА можно объяснить, по меньшей мере, частично более выраженной вирулентностью 8. аигеик дикого типа по сравнению с мутантами с1ГАРУ. Связывание фибриногена с С1ГА может уменьшить опсонофагоцитоз нейтрофилами за счет уменьшения отложения опсонинов или доступа к опсонинам нейтрофильных рецепторов. Альтернативно, связанный фибриноген может блокировать взаимодействие неизвестного защитного фактора хозяина с 8. аигеик. Другое мнение заключается в том, что взаимодействие фибриноген -С1ГА стимулирует переход бактерий из кровеносного сосуда в ткань или стимулирует колонизацию тканей.
Неожиданно, данные авторов изобретения также демонстрируют, что нулевой мутант С1ГА был более вирулентным, чем мутантные штаммы с1ГАРУ. Возможно, белок С1ГА имеет другие функции ш у1уо, чем взаимодействие с фибриногеном. Это взаимодействие явно не выгодно для хозяина, как показано в данном исследовании. Другие функции С1ГА в настоящее время не отображены так хорошо, но не зависимая от фибриногена агрегация тромбоцитов, вызванная С1ГА, может привести к захвату большого количества 8. аигеик в кровотоке с последующей элиминацией комплексов бактерий с тромбоцитами через ретикулоэндотелиальную систему. Такая опосредованная агрегацией тромбоцитов элиминация стафилококков часто встречаются в случае штаммов дикого типа и мутанта с1ГАРУ, но не в случае нокаутного штамма с1ГА. Если в штамме дикого типа взаимодействие с фибриногеном будет превалировать над другими событиями, то такая элиминация бактерий в случае мутантов с1ГАРУ может быть очень полезна для хозяина.
Нокаутный мутант с1ГА защищал против септической смерти в такой же степени, что и с1ГАРУ мутация в штамме 8. аигеик Ь8-1, но защищала меньше, если вообще защищала, в случае штамма Ые^тап. Общее влияние экспрессии С1ГА на бактериальную вирулентность может различаться между разными штаммами 8. аигеик в зависимости от уровня экспрессии и присутствия других вирулентных факторов.
Вопрос о том, демонстрирует ли мутант с1ГАРУ равную или меньшую вирулентность, находясь в суставной полости, имеет определенное значение, подразумевающее, что при воспалении в синовиальной жидкости фибриноген и фибрин находятся в избыточном количестве. Данные авторов изобретения позволяют предположить, что мутант с1ГАРУ является менее разрушительным для хряща и кости.
Защитный эффект мутанта с рекомбинантным доменом А Р336У338 С1ГА, не связывающим фибриноген больше, чем для гС1ГА дикого типа. Иммунизация с помощью С1ГАРУ, весьма вероятно, индуцировала лучший иммунный ответ, поскольку более высокие специфические антительные ответы индуцировались против как иммуногена, так и белка С1ГА дикого типа. Более важно, что она индуцировала больший защитный иммунный ответ против септической смерти, чем С1ГА дикого типа.
В заключение, результаты авторов изобретения показывают, что гС1ГАРУ является лучшим кандидатом на роль вакцины, чем рекомбинантный С1ГА дикого типа. Авторы изобретения предполагают, что связывание фибриногена с белком С1ГА дикого типа во время фазы иммунизации уменьшает презентацию антигена из-за сокрытия важных эпитопов на молекуле С1ГА и поэтому ухудшает продукцию специфических антител.
Пример 2. Укорочение области А гС1ГА, содержащее N2 и N3 (гС1Г А 221-559).
Материалы и методы.
В этом примере использовали протоколы, изложенные в примере 1:
гС1ГА 221-559 (т.е. укорочение области А С1ГА, содержащее N2 и N3, соответствующие аминокислотам 220-559);
ГС1ГАРУ221-559 и
БСА.
В начале экспериментов было 15 мышей-самок ИМК! в группе в возрасте 8 недель. В этом примере конструкции, используемые для иммунизации, представляли собой С1ГА дикого типа/нативное укорочение №N3, С1ГА №N3 укорочение с мутацией РУ, как описано в примере 1. БСА использовали в качестве контроля.
Вакцинация С1ГА дикого типа и мутантным рекомбинатным С1ГА.
Мышей иммунизировали с помощью гС1ГА 221-559, гС1ГАРУ 221-559 или БСА в соответствии с протоколом в примере 1.
Очищенные гС1ГА221-559, гС1ГАРУ221-559 (т.е. субдомены N2 и N3 рекомбинантного белка А С1ГАРУ1) или БСА растворяли в РВ8 и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда. 200 мкл эмульсии, содержащей 30 мкг (= 0,79 нмоль) белка, инъецировали п/к в 0-е сутки. Первую бустерную иммунизацию 30 мкг белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 12-е
- 19 019516 сутки. Вторую бустерную иммунизацию осуществляли на 22-е сутки. На 31-е сутки у мышей брали кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов.
Специфические антитела - ЕЬ18А.
Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Специфический антительный ответ в сыворотке против гС1ГА221-559 и гС1ГАРУ221-559 измеряли с помощью ЕЬ18А. Микропланшеты (96-луночные; Кшс) покрывали 5 мкг/мл рекомбинантного белка в РВ8. Блокирующий агент, образцы сыворотки, биотинилированные антитела и Ех1тАу1бтпероксидазу разбавляли в РВУ Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:5000, 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм.
Результаты.
Специфический антительный ответ.
Антительный ответ измеряли по поглощению в ЕЬ18А-анализе, как в примере 1, с четырьмя разными разведениями сыворотки. Полученные данные были очень похожи на данные в примере 1.
Обнаружили, что иммунизация с помощью гС1ГАРУ221-559, весьма вероятно, приводит к более высоким титрам специфических антител к обоим нативным гС1ГА221-559 и гС1ГАРУ221-559 по сравнению с иммунизацией нативным гС1ГА221-599, поскольку наблюдались значительно более высокие антительные ответы, измеренные по поглощению, у мышей, иммунизированных гС1ГАРУ221-559, при каждом разведении сыворотки, во всех сравнениях, кроме одного (Р = 0,001 - 0,025, см. фиг. 16 и 17). Иммунизация БСА индуцирует только фоновые уровни антительного ответа.
Заключение.
Авторы изобретения обнаружили, что иммунизация белком гС1ГАРУ221-559 приводит к значительно более высоким антительным ответам как к иммуногену, так и к белку С1ГА дикого типа, чем иммунизация природным белком.
На основании этих данных авторы изобретения заключили, что РУ-иммунизация, независимо от того, содержит ли РУ белок аминокислоты 40-550, как в примере 1, или аминокислоты 221-559, как в примере 2, индуцирует лучший иммунный ответ, чем иммунизация нативным С1ГА соответствующего размера.
Пример 3.
Укорочение области А С1ГА (δ/дельта укорочение без фиксирующего пептида).
Материалы и методы.
В данном примере использовали протоколы, изложенные в примере 1, в которых используют следующую конструкцию: гС1ГА 221-531 (т.е. укорочение области А гС1ГА, содержащее аминокислоты 220559 N2 и N3, но без аминокислот 532-538 фиксирующего пептида и последующих пролин-богатых остатков).
В начале эксперимента было 15 самок мышей NΜΚI в группе в возрасте 8 недель. В этом примере для иммунизации использовали указанную выше конструкцию. Мышей иммунизировали указанным выше укорочением в соответствии с протоколом из примера 1.
Вакцинация С1ГА дикого типа и мутантным рекомбинантным С1ГА.
Очищенный гС1ГА221-531 растворяли в РВУ и эмульгировали 1:1 в полном адъюванте Фрейнда. 200 мкл эмульсии, содержащей 0,79 нмоль белка, было инъецировано п/к на сутки 0. Первую бустерную иммунизацию с помощью 0,79 нмоль белка в физиологическом растворе в неполном адъюванте Фрейнда осуществляли на 12-е сутки. Вторую бустерную иммунизацию осуществляли на 22-е сутки. На 31-е сутки у мышей брали кровь и сыворотку замораживали для последующего анализа антительных ответов.
Специфические антитела - ЕЬ18А.
Образцы сыворотки от иммунизированных мышей получали через 9 суток после второй бустерной иммунизации. Уровни специфических антител в сыворотке измеряли с помощью ЕЬ18А. Микропланшеты (96-луночные; Nиис) покрывали белком гС1ГА221-531 в концентрации 4,6 мкг/мл, эквимолярной 5 мкл/мл гС1ГА221-559 и гС1ГАРУ221-559, из примеров 1 и 2. Блокирующий агент, образцы сыворотки, биотинилированные антитела и Ех1гАу1бш-пероксидазу разбавляли в РВУ Анализ проводили в соответствии с предыдущим описанием (8). Все образцы сыворотки разбавляли 1:5000. 1:20000, 1:80000 и 1:320000 и антительный ответ определяли как поглощение при 405 нм.
Результаты.
Антительный ответ измеряли по поглощению в ЕЬ18А-анализе, как в примере 1. Обнаружили, что иммунизация с помощью гС1ГА221-531 дает иммунный ответ, измеренный как специфический антительный ответ (фиг. 18).
Заключение.
Авторы изобретения обнаружили, что гС1ГА221-531 работает как иммуноген, поскольку данный антиген индуцирует специфический антительный ответ.
- 20 019516
Список литературы.
1. Реасоск 8.Ι., Мооге С.Е., ИкОсе А., Кайхапои М., 8(огу Ь., Маск1е К., ΘΝβίΠ С., Эау Ν.Ρ.Ι (2002) У1ги1еп( сотЬшайопк оГ абкект апб (охт депек ίη па(ига1 рори1а(юпк оГ 8(арку1ососсик аигеик, 1пГес( 1ттип, 70:4987-4996.
2. МсЭеуШ Ό., №1пауа1у Т., Ноике-Ротрео К., Ве11 Е., Тигпег Ν., МсЕпйге Ь., Рок(ег Т., Ноок М. (1997) Скагас(епха(юп оГ (ке ш(егасйоп Ье(теееп (ке 8(арку1ососсик аигеик скииртд Гас(ог (С1ГА) апб ПЬпподеп Еиг I. Вюскет., 247:416-424.
3. МсЭеуШ Ό., Ргапсо18 Р., Уаибаих Р., Рок(ег Т.1. (1994) Мо1еси1аг скагас(епха(юп оГ (Не скииртд ГасЮг (ГЬпподеп гесер(ог) оГ 8(арку1ососсик аигеик, Мо1. МюгоЬюк, 11:237-248.
4. Ра1тс.|У181 Ν., Ра(к РМ., ТагкотекИ А., 1океГккоп Е. (2004) Ехргеккюп оГ к(арку1ососса1 скииртд ГасЮг А тчребек тасгоркаде ркадосу(окй, МюгоЬ. 1пГес1. 6:188-195.
5. Н1ддтк I., Ьоидктап А., уап Кекке1 К.Р.М., уап 8(г()р РА.С., Рок(ег Т.1. (2006) С1итртд Гас(ог А оГ 8(арку1ососсик аигеик тЫЬбк ркадосу(ок1к Ьу китап ро1утогркопис1еаг 1еикосу(ек, РЕМ8 МюгоЬюк Ье((, 258:290-296.
6. Ьоидктап А., Рйгдега1б РВ., Вгеппап М.Р., Шддтк I., Оотепег В., Сох Ό., Рок(ег Т.1. (2005) Во1ек оГ ГЬпподеп 1ттипод1оЬи1т апб сотр1етей т р1а(е1е! аскуакоп ргото(еб Ьу 8(арку1ососсик аигеик с1итртд ГасЮг А, Мо1. МюгоЬюк, 57:804-818.
7. ОВпеп Ь., Кетдап 8.У., Кате С., Нодап М., Репабек I., ЬГ( Ό., Рйгдега1б Ό.Ρ, Рок(ег Т.1. & Сох Ό. (2002) Ми1йр1е тескайктк Гог (ке асйуайоп оГ китап р1а(е1е( аддгедайоп Ьу 8(арку1ососсик аигеик: го1ек Гог 1ке с1итртд Гас(огк С1ГА апб С1ГВ, (ке кегте-акраг(а(е гереа( рго(ет 8бгЕ апб рго(ет А, Мо1. МюгоЬюк, 44, 1033-1044.
8. .ТокеГккоп Е., НаПГогб О., О'Впеп Ь., Ра((1 РМ., Рок(ег Т. (2001) Рго(ес(юп адатк( ехрептеп(а1 81арку1ососсик аигеик аг(кг1(1к Ьу уасстакоп тейк с1итртд Гас(ог А, а поуе1 У1ги1епсе бе(егттап(, Р 1пГес(. ϋί5, 184:1572-1580.
9. Ра1тс.|У1к( Ν., Рок(ег Т., Рйгдега1б В., 1океГккоп Е., ТагкотекИ А. (2005) Р1Ьгопесйп-Ьтбтд рго(етк апб ГЬпподеп-Ьтбтд с1итртд Гас(огк р1ау б1к(1пс( го1ек ш к1арку1ососса1 аг(кг1(1к апб кук(еиис 1пйаттайоп ί. 1пГ. ϋΐδ, 191:791-798.
10. Оетеапауадат С.С.8., Уапп Е.В., Скеп У., Сагкоп М., Ва.)аккапкаг К.В., Ноок М., №пауапа 8.У.Й. (2002) А поуе1 уапап( оГ (ке 1ттипод1оЬикп Го1б т кигГасе абкектк оГ 8(арку1ососсик аигеик: сгук1а1 к(гис1иге оГ (ке Г1Ьг1подеп-Ь1пб1пд М8СВАММ, с1итртд Гас(ог А, Тке ЕМВО 1оигпа1, 21:6660-6672.
11. Вгете11 Т., Ьапде 8., ΥасоиЬ А., Вубеп С., Тагкотекк1 А. (1991) Ехрептеп(а1 8(арку1ососсик аигеик айкпйк т тюе, 1пГес(. 1ттип., 59:2615-2623.
12. 8ак1шепе Е., Вгете11 Т., ТагкотекИ А. (1996) Аббйюп оГ согйсок(его1бк (о апйЬюйс (геа(теп( ате1юга(ек (ке соигке оГ ехрептеп(а1 8(арку1ососсик аигеик айкпйк, Айкпйк Вкеитайкт, 39:1596-1605.
13. Уегбгепдк М., Тагкотекк1 А. (1997) Во1е оГ пейгоркйк ш ехрептеп(а1 керйсет1а апб керйс айкпйк тбисеб Ьу 8(арку1ососсик аигеик, 1пГес(. 1ттип., 65:2517-2521.
14. Ьййе Е.8., Ьогепх Ь.Ь. (1952) 8(арку1ососса1 соади1аке: тобе оГ асйоп апб апйдейсйу, Р Сеп М1сгоЬю1., 6:95-107.
15. Кге1ктей(к В.№ ЬоГбак1 8., Ве(1еу М.Р, О'Веб1у М., 8скйеуег( Р.М., Вегдбо11 М.8., №уюк В.Р. (1983) Тке (охю ккоск купбготе ехо(охт к(гис(ига1 депе 1к по( бе(ес(аЬ1у (гапктй(еб Ьу а ргоркаде, ^(иге, 305:709-712.
16. Рок(ег Т.Р (1998) т Ме(кобк т МюгоЬю1оду, уо1. 27: Вас(епа1 Ра(кодепекй, ебк ХУПНатк Р., Ке(1еу Р, 8а1топб С. (Асабетй Ргекк, Ьопбоп), р. 433-454.
17. О' Соппе11 О.Р., №пауа(у Т., МсЬеук( Ό., СигиДббарра 8., Ноок М., Рок(ег Т.Р (1998) Тке ГЬпподеп-Ьтбтд М8СВАММ (с1итртд Гас(ог) оГ 8(арку1ососсик аигеик как а Са2++-берепбеп( 1пк1Ьйогу кйе, Р Вю1. Скет., 273:6821-6829.
18. 8ак1шепе Е., Вгете11 Т., ТагкотекИ А. (1999) Сотр1етеп( бер1ейоп аддгауа(ек 8(арку1ососсик аигеик керйсает1а апб керйс айкпйк, С1т Ехр. 1ттипо1., 115:95-102.
19. Мапай С., СагЬопага А.О., Негетапк РР. (1965) 1ттипоскет1са1 с.|иайка(юп оГапйдепк Ьу ктд1е габ1а1 1ттипоб1ГГик1оп, 1ттипоскет1к(гу, 2:235-254.
20. Вгете11 Т., АЬбе1поиг А., Тагкотекк1 А. (1992) Н1к(ора(ко1одюа1 апб кего1одюа1 ргодгеккюп оГ ехрептеп(а1 8(арку1ососсик аигеик айкпйк, 1пГес( 1ттип., 60:2976-2985.
Claims (17)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА), содержащий аминокислотную последовательность согласно ЗЕО ΙΌ N0: 1 или последовательность с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 1, или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А) по меньшей мере с одной заменой, вставкой, делецией или добавлением аминокислотного остатка в аминокислотных остатках А1а254, Туг256, Рго336, Туг338, 11е387, Ьу8389, 61и526 и/или Уа1527 с получением рекомбинантного фибриногенсвязывающего белка с уменьшенной способностью или отсутствием способности нековалентно связываться с фибриногеном, который стимулирует больший иммунный ответ, чем белок С1ГА дикого типа, для использования в лечении или профилактике микробных инфекций, предпочтительно вызванных стафилококками.
- 2. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по п.1, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из ЗЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 10 и 13 или последовательности с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности ЗЕО ΙΌ N0: 3, 6, 9, 10 или 13.
- 3. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по п. 1 или 2, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную замену в аминокислотных остатках А1а254, Туг256, Рго336, Туг338, Пе387, Ьу§389, 61и526 и/или Уа1527.
- 4. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-3, где нековалентное связывание, которое имеет место при стыковке, захвате и фиксации (йоск, 1оск апй 1а1с1ип§) фактора агглютинации А (С1ГА) с фибриногеном, уменьшено или предотвращено.
- 5. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-4, где замена аминокислотного остатка уменьшает нековалентное взаимодействие с фибриногеном посредством предотвращения или уменьшения связывания лиганда с гидрофобным карманом, разделяющим субобласти N2 и N3 области А фибриногенсвязывающего белка.
- 6. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-5, содержащий фибриногенсвязывающую область без аминокислотных остатков фиксирующего пептида.
- 7. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-6, где аминокислотные остатки А1а254, Туг256, Рго336, Туг338, Пе387, Бу5389. 61и526 и/или Уа1527 заменены либо на А1а, либо на 8ег.
- 8. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-7, содержащий аминокислотную последовательность согласно любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 3-14 или последовательности с 85%, предпочтительно 95% идентичностью последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 314, где остаток Р336 и/или Υ338 в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 3, 6, 9, 10 и 13 заменен(ы) на серин и/или аланин.
- 9. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по п.7 или 8, имеющий аминокислотную последовательность согласно любой из 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 3, где остаток Р336 и/или Υ338 заменен(ы) на серин и/или аланин с получением гС1ГАР3368 Υ33^ или гС1ГАР336 А Υ338δ, или ее фрагмент.
- 10. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-9, содержащий фибриногенсвязывающий белок, фибриногенсвязывающую область, минимальную фибриногенсвязывающую область и/или ее фрагмент.
- 11. Рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент по любому из пп.1-10, содержащий субобласти N123, охватывающие аминокислотные остатки 40-559 фибриногенсвязывающей области (область А); и/или субобласти N23, охватывающие аминокислотные остатки 221-559 фибриногенсвязывающей области С1ГА (область А).
- 12. Применение рекомбинантного стафилококкового фактора агглютинации А (С1ГА) или его фрагмента, содержащего, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11 в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики микробной инфекции, предпочтительно вызванной стафилококками.
- 13. Конструкция нуклеиновой кислоты, экспрессирующая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11.
- 14. Экспрессирующий вектор, экспрессирующий рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11.
- 15. Клетка-хозяин, экспрессирующая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ГА) или его фрагмент, содержащий по меньшей мере аминокислотные остатки 221-531 фибриноген- 22 019516 связывающей области (область А), по любому из пп.1-11.
- 16. Вакцина, содержащая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (СНА) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11.
- 17. Иммуногенная фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный стафилококковый фактор агглютинации А (С1ИА) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере, аминокислотные остатки 221-531 фибриногенсвязывающей области (область А), по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый адъювант.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE20080070 | 2008-01-31 | ||
| GBGB0801768.3A GB0801768D0 (en) | 2008-01-31 | 2008-01-31 | Treatment of microbial infections |
| PCT/EP2009/051033 WO2009095453A1 (en) | 2008-01-31 | 2009-01-29 | Treatment of microbial infections |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201001212A1 EA201001212A1 (ru) | 2011-02-28 |
| EA201001212A8 EA201001212A8 (ru) | 2014-03-31 |
| EA019516B1 true EA019516B1 (ru) | 2014-04-30 |
Family
ID=40512496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201001212A EA019516B1 (ru) | 2008-01-31 | 2009-01-29 | Лечение микробных инфекций |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20110150918A1 (ru) |
| EP (2) | EP3117832B1 (ru) |
| JP (1) | JP5709527B2 (ru) |
| KR (1) | KR101739048B1 (ru) |
| CN (1) | CN101983067B (ru) |
| AU (1) | AU2009209598B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0906997A2 (ru) |
| CA (1) | CA2713241C (ru) |
| CY (1) | CY1118153T1 (ru) |
| DK (1) | DK2244722T3 (ru) |
| EA (1) | EA019516B1 (ru) |
| ES (2) | ES2960604T3 (ru) |
| HR (1) | HRP20161305T1 (ru) |
| HU (1) | HUE031614T2 (ru) |
| LT (1) | LT2244722T (ru) |
| MX (1) | MX2010008423A (ru) |
| PL (1) | PL2244722T3 (ru) |
| PT (1) | PT2244722T (ru) |
| SG (1) | SG188102A1 (ru) |
| SI (1) | SI2244722T1 (ru) |
| WO (1) | WO2009095453A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201005798B (ru) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2642984A1 (en) * | 2006-02-22 | 2007-09-07 | The Texas A & M University System | Antibodies recognizing a highly expressed putative antigen of ca-mrsa and methods of use |
| US20110150918A1 (en) | 2008-01-31 | 2011-06-23 | Timothy Foster | Treatment of microbial infections |
| CA2766629C (en) | 2009-06-22 | 2020-03-24 | Wyeth Llc | Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens |
| SG177653A1 (en) | 2009-07-15 | 2012-02-28 | Aimm Therapeutics Bv | Gram-positive bacteria specific binding compounds |
| WO2011007004A1 (en) | 2009-07-16 | 2011-01-20 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | Treatment of infections |
| GB0913680D0 (en) * | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| EP2488547B1 (en) | 2009-10-15 | 2017-12-06 | University Court of the University of Edinburgh | Staphylococcal antigens |
| CN101843899B (zh) * | 2010-05-24 | 2012-11-07 | 中国人民解放军第三军医大学 | 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（mrsa）重组多亚单位基因工程疫苗及其制备方法 |
| US9095540B2 (en) | 2010-09-09 | 2015-08-04 | The University Of Chicago | Methods and compositions involving protective staphylococcal antigens |
| WO2013159021A1 (en) * | 2012-04-20 | 2013-10-24 | The Texas A&M University System | Engineered collagen binding mscramm with enhanced affinity for collagen |
| SG11201503232TA (en) * | 2012-11-06 | 2015-05-28 | Medimmune Llc | Antibodies to s. aureus surface determinants |
| GB201310008D0 (en) | 2013-06-05 | 2013-07-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition for use in therapy |
| EP3229833A1 (en) | 2014-12-10 | 2017-10-18 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Method of treatment |
| US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
| US10738338B2 (en) | 2016-10-18 | 2020-08-11 | The Research Foundation for the State University | Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate |
| GB201802339D0 (en) * | 2018-02-13 | 2018-03-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic composition |
| AU2019258504B2 (en) * | 2018-04-24 | 2020-03-12 | Fibriant B.V. | Therapeutic uses of fibrinogen gamma prime variants |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6008341A (en) * | 1994-08-22 | 1999-12-28 | The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | S. aureus fibrinogen binding protein gene |
| WO2000064925A1 (en) * | 1999-04-28 | 2000-11-02 | The Provost Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Near Dublin | Method of inhibiting leukocyte adhesion to fibrinogen |
| CA2351018A1 (en) * | 2001-07-09 | 2003-01-09 | Universite De Sherbrooke | Dna vaccine against staphylococcus aureus |
| JP2008502363A (ja) | 2004-05-21 | 2008-01-31 | ワイス | Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓの改変型フィブロネクチン結合タンパク質 |
| US20110150918A1 (en) | 2008-01-31 | 2011-06-23 | Timothy Foster | Treatment of microbial infections |
-
2009
- 2009-01-29 US US12/865,336 patent/US20110150918A1/en not_active Abandoned
- 2009-01-29 CA CA2713241A patent/CA2713241C/en active Active
- 2009-01-29 SI SI200931536A patent/SI2244722T1/sl unknown
- 2009-01-29 KR KR1020107019237A patent/KR101739048B1/ko active IP Right Grant
- 2009-01-29 PT PT97053276T patent/PT2244722T/pt unknown
- 2009-01-29 ES ES16173940T patent/ES2960604T3/es active Active
- 2009-01-29 PL PL09705327T patent/PL2244722T3/pl unknown
- 2009-01-29 BR BRPI0906997-6A patent/BRPI0906997A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-01-29 EA EA201001212A patent/EA019516B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-01-29 ES ES09705327.6T patent/ES2599953T3/es active Active
- 2009-01-29 CN CN200980112527.0A patent/CN101983067B/zh active Active
- 2009-01-29 EP EP16173940.4A patent/EP3117832B1/en active Active
- 2009-01-29 WO PCT/EP2009/051033 patent/WO2009095453A1/en active Application Filing
- 2009-01-29 HU HUE09705327A patent/HUE031614T2/en unknown
- 2009-01-29 LT LTEP09705327.6T patent/LT2244722T/lt unknown
- 2009-01-29 MX MX2010008423A patent/MX2010008423A/es active IP Right Grant
- 2009-01-29 AU AU2009209598A patent/AU2009209598B2/en active Active
- 2009-01-29 DK DK09705327.6T patent/DK2244722T3/en active
- 2009-01-29 EP EP09705327.6A patent/EP2244722B1/en not_active Revoked
- 2009-01-29 SG SG2013007786A patent/SG188102A1/en unknown
- 2009-01-29 JP JP2010544703A patent/JP5709527B2/ja active Active
-
2010
- 2010-08-13 ZA ZA2010/05798A patent/ZA201005798B/en unknown
-
2015
- 2015-05-01 US US14/701,789 patent/US9637525B2/en active Active
-
2016
- 2016-10-10 HR HRP20161305TT patent/HRP20161305T1/hr unknown
- 2016-10-26 CY CY20161101085T patent/CY1118153T1/el unknown
-
2017
- 2017-03-20 US US15/463,665 patent/US11512118B2/en active Active
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| DEIVANAYAGAM С.С.S. ET AL: "A novel variant of the immunoglobulin fold in surface adhesins of Staphylococcus aureus: Crystal structure of the fibrinogen-binding MSCRAMM, clumping factor A", EMBO JOURNAL 20021216 GB, vol. 21, no. 24, 16 December 2002 (2002-12-16), pages 6660-6672, XP002523689, ISSN: 0261-4189, abstract, page 6668, right-hand column, paragraph 2 - page 6669, right-hand column, paragraph 1, figure 7 * |
| JOSEFSSON E. ET AL: "PROTECTION AGAINST EXPERIMENTAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS ARTHRITIS BY VACCINATION WITH CLUMPING FACTOR A, A NOVEL VIRULENCE DETERMINANT", JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES, UNIVERSITY OF CHICAGO PRESS, CHICAGO, IL, vol. 184, no. 12, 15 December 2001 (2001-12-15), pages 1572-1580, XP009028976, ISSN: 0022-1899, abstract, page 1573, right-hand column, paragraph 3 - page 1574, right-hand column, paragraph 1 page 1578, right-hand column, last paragraph - page 1579, left-hand column, paragraph 1 page 1578, right-hand column, last paragraph - page 1579, left-hand column, paragraph 2 * |
| JOSEFSSON ELISABET ET AL: "Fibrinogen binding sites P336 and Y338 of clumping factor A are crucial for Staphylococcus aureus virulence", PLOS ONE 2008, vol. 3, no. 5, 2008, page e2206, XP002523693, ISSN: 1932-6203, the whole document * |
| KEANE FIONA M. ET AL: "Fibrinogen and elastin bind to the same region within the A domain of flbronectin binding protein A, an MSCRAMM of Staphylococcus aureus", MOLECULAR MICROBIOLOGY FEB 2007, vol. 63, no. 3, February 2007 (2007-02), pages 711-723, XP002523691, ISSN: 0950-382X, page 715, right-hand column, lines 18-26; figure 1; tab. 1, page 719, left-hand column, line 17 - page 719, right-hand column, paragraph 1 * |
| KEANE FIONA M. ET AL: "The N-terminal a domain of Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein a binds to tropoelastin", BIOCHEMISTRY, vol. 46, no. 24, June 2007 (2007-06), pages 7226-7232, XP002523692, ISSN: 0006-2960, page 7227, right-hand column, paragraph 4; figure 1, page 7228, left-hand column, paragraph 2-4, page 7230, left-hand column, paragraph 2 - page 7230, right-hand column, paragraph 2, page 7231, right-hand column, lines 11-41 * |
| LIU ET AL: "A segment of Staphylococcus aureus clumping factor A with fibrinogen-binding activity (ClfA221-550) inhibits platelet-plug formation in mice", THROMBOSIS RESEARCH, TARRYTOWN, NY, US, vol. 121, no. 2, 1 January 2007 (2007-01-01), pages 183-191, XP022360853, ISSN: 0049-3848, abstract, page 185, left-hand column, paragraph 2, page 185, right-hand column, last paragraph - page 186, right-hand column, paragraph 2, page 187, right-hand column, paragraph 2 - page 188, right-hand column, paragraph 1, tab. 1 * |
| LOUGHMAN ANTHONY ET AL: "Roles for fibrinogen, immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A", MOLECULAR MICROBIOLOGY AUG 2005, vol. 57, no. 3, August 2005 (2005-08), pages 804-818, XP002523690, ISSN: 0950-382X, page 805, left-hand column, paragraph 16-22; figure 1 page 806, left-hand column, paragraph 3 - page 806, right-hand column, paragraph 1 page 808, right-hand column, paragraph 1 page 810, right-hand column, last paragraph - page L, line 1; figure 7 page 814, left-hand column, last paragraph - page 814, right-hand column, paragraph 1 * |
| MIAJLOVIC HELEN ET AL: "Both complement- and fibrinogen-dependent mechanisms contribute to platelet aggregation mediated by Staphylococcus aureus clumping factor B", INFECTION AND IMMUNITY JUL 2007, vol. 75, no. 7, July 2007 (2007-07), pages 3335-3343, XP002523688, ISSN: 0019-9567, abstract, page 3339, right-hand column, last paragraph - page 3340, right-hand column, paragraph 2, figure 10 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA019516B1 (ru) | Лечение микробных инфекций | |
| AU2010272505B2 (en) | Treatment of infections | |
| WO2017192594A1 (en) | Binding moieties for biofilm remediation | |
| WO2016154491A1 (en) | Binding moieties for biofilm remediation | |
| CN106795506B (zh) | 去免疫化溶葡萄球菌酶和使用方法 | |
| JP6934904B2 (ja) | バイオフィルム除去のための結合モイエティ | |
| AU2012216332B2 (en) | Treatment of microbial infections |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM |