CN101983067A - 微生物感染的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、药物组合物、免疫原性组合物和抗体及其在治疗微生物感染特别是细菌来源包括葡萄球菌来源的微生物感染中的用途。理想地，本发明涉及用于治疗的对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段。
Description
前言
本发明涉及改进的微生物抗原疫苗、药物组合物、免疫原性组合物和抗体及其在治疗微生物感染，特别是细菌来源的，包括葡萄球菌(Staphylococcal)来源的微生物感染中的用途。
多重耐药性(MDR)是革兰氏阳性细菌尤其是医院中的日益严重的问题。抗生素和其它治疗细菌感染的试剂的广泛使用已经引起细菌迅速产生针对所述试剂的抗性，很多细菌具有多重耐药性。因此，目前需要提供改进的处理这样的耐药性感染的治疗。
葡萄球菌是球形的革兰氏阳性细菌，其通常按照葡萄样不规则成簇排列。有一些是人类皮肤和粘膜的正常菌丛(flora)的成员，其它的则引起化脓、脓肿形成、多种化脓性感染，甚至是致命的败血病。致病性葡萄球菌通常引发溶血、使血浆凝固并产生多种细胞外酶类和毒素。
葡萄球菌属中有至少30个种。具有临床重要性的三个主要种是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)。金黄色葡萄球菌是凝固酶阳性的，这将其与其它的种区分开。金黄色葡萄球菌是对于人类的主要病原体。几乎每个人在其一生中都具有一些类型的金黄色葡萄球菌感染，从食物中毒的严重性或轻微皮肤感染到严重的威胁生命的感染。凝固酶阴性的葡萄球菌是正常的人类菌丛，其有时引起感染，通常与移植装置相关，特别是在非常年幼的、年老的和免疫缺陷的患者中。大约75％的由凝固酶阴性的葡萄球菌引起的感染都是由表皮葡萄球菌引起的。由沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和其它种引起的感染较不常见。腐生葡萄球菌是年轻妇女中尿道感染的相对常见的诱因。葡萄球菌产生过氧化氢酶，这将其与链球菌(streptococci)区别开来。路邓葡萄球菌(S.lugdunensis)也是临床相关的，其存在于大约5-10％的感染性心内膜炎的病例中。
在关节空间内，金黄色葡萄球菌在主要成分为胶原的关节软骨内的定殖似乎是促成脓毒性关节炎产生的重要因素。造血性获得的细菌性关节炎仍然是严重的医学问题。这种迅速进展和高度破坏性的关节病难以根除。通常而言，不产生严重的关节损伤的话，有50％以下的感染患者难以恢复。金黄色葡萄球菌是从具有造血性和继发性骨髓炎的成年患者中分离而来的主要病原体。
在住院患者中，葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌是主要的感染诱因。伤口或留置的医疗器械的最初局部感染能够导致更严重的侵入性感染例如败血病、骨髓炎、乳腺炎和心内膜炎。在与医疗器械有关的感染中，在移植之后较短时间内塑料和金属表面被宿主血浆和基质蛋白例如纤维蛋白原和纤连蛋白包被。金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌粘附到这些蛋白上的这种能力对于感染的起始是必不可少的。血管移植物、静脉内导管、动脉心瓣膜和心脏辅助装置是血栓形成性的，易于细菌的群集。一般而言，在葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌是这些感染中最具破坏性的病原体。
在世界范围内的医院中已经观察到了对目前可用的治疗感染的多数抗生素呈现抗性的金黄色葡萄球菌分离体的显著增加。抵抗金黄色葡萄球菌的青霉素的开发是感染控制和治疗中的一大进步。不幸的是，青霉素抗性的生物迅速出现，迫切需要新的抗生素。随着每种新的抗生素的引进，金黄色葡萄球菌能够对抗β-内酰胺酶——改变的青霉素结合蛋白，以及允许细菌存在的突变的细胞膜蛋白。因此，出现了甲氧苯青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)和多重耐药的生物并且在全世界的医院和疗养院留下了主要足迹(Chambers，H.F.，Clin Microbiol Rev，1：173，1988；和Mulligan，M.E.等人，AmJ Med，94：313，1993)。目前，引起医院中的感染的葡萄球菌菌株中几乎有一半对于除了万古霉素以外的所有抗生素都是抗性的，似乎万古霉素变得无效也只是时间的问题。
因此，迫切且日益需要用于治疗葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌感染的治疗剂，所述治疗剂有效抵抗那些抗生素抗性的细菌菌株。
在革兰氏阳性病原体例如葡萄球菌、链球菌和肠球菌中，被称为粘附素(adhesin)的蛋白通过例如促进群集、附着至血液凝块和使组织受损而介导这样的感染。这些特异性微生物表面粘附素被称为MSCRAMM(微生物表面成分识别性粘附基质分子)(Patti，J.等人，Ann Rev Microbiol，48：585-617，1994；Patti，J.and Hook，M.，Cur Opin Cell Biol.，6：752-758，1994)。MSCRAMM特异性识别并结合至细胞外基质(ECM)成分，例如纤连蛋白、纤维蛋白原、胶原和弹性蛋白。在很多革兰氏阳性病原体中发现了这些MSCRAMM，其氨基酸序列是相关的，它们具有相似的模块(modular)设计和共同的结合结构域组构。
细菌细胞表面上的MSCRAMM和宿主组织内的配体以锁钥模式相互作用，从而导致细菌粘附至宿主。细菌生存通常需要粘附，其帮助细菌规避宿主的防御机制和抗生素的挑战。一旦细菌成功粘附并群集在宿主组织中，其生理即被显著改变，并且分泌破坏性成分例如毒素和酶。此外，粘附细菌通常产生生物膜并迅速对多数抗生素的杀灭效应产生抗性。
细菌能够表达识别多种基质蛋白的MSCRAMM。MSCRAMM中的配体结合位点似乎是由氨基酸序列的相对较短的连续区段(基序)决定的。因为在几种不同的细菌物种中可以发现相似的基序，所以这些功能性基序似乎会进行种间转移(Patti and Hook，Cur Opin Cell Biol，6：752-758，1994)。另外，有时单一的MSCRAMM能够结合数个ECM配体。
MSCRAMM能够通过与包括纤维蛋白原(Fg)和/或纤连蛋白(Fn)等的蛋白结合而介导感染。纤维蛋白原和纤连蛋白是在血浆中发现的蛋白，其在止血和凝固中发挥重要作用。
纤维蛋白原由6条多肽链组成：2条Aα、2条Bβ和2条γ-链。γ-链的C末端部分在生物学上是重要的，并且在血小板吸附和聚集中与血小板整联蛋白相互作用。该区域也是金黄色葡萄球菌靶定的，导致纤维蛋白原依赖性的细胞聚集和组织吸附。
金黄色葡萄球菌具有数个表面表达的蛋白，其刺激血小板激活和聚集。金黄色葡萄球菌的MSCRAMM蛋白包括但不限于下列蛋白：
-纤维蛋白原结合蛋白聚集因子A(ClfA)；
-纤维蛋白原结合蛋白聚集因子B(ClfB)；
-纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白A(FnBPA)；
-纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白B(FnBPB)；和
-金黄色葡萄球菌表面蛋白SasA、SasG、SasK等。
下表1列举了各种金黄色葡萄球菌细胞壁锚定表面蛋白的选集
表1
aaa，以氨基酸表示的蛋白长度。
b蛋白识别和结合的分子成分。
c分选酶识别的且存在于C末端细胞壁分选信号中的共有基序。
d以细胞壁表面蛋白为底物的分选酶。
e TNFR：肿瘤坏死因子受体。
f也与脱落的上皮细胞中的蛋白结合。促进对杀菌脂质和乳铁蛋白的抗性。
g也与脱落的鼻上皮细胞结合。参与生物膜的形成。
其它的葡萄球菌表达类似于以上所列出的聚集因子或结合蛋白的表面表达的蛋白(MSCRAMM)。这些包括但不限于：
-来自表皮葡萄球菌的SdrF、SdrG和SdrH，其中已经表明SdrG/F与纤维蛋白原和胶原结合。
-来自路邓葡萄球菌的Fbl是与纤维蛋白原结合的蛋白。Fbl是Sdr家族的成员，Sdr家族是一组含有特征性丝氨酸-天冬氨酸重复区的葡萄球菌细胞表面蛋白。已经测绘出Fbl的纤维蛋白原结合结构域为313个氨基酸，并且与来自金黄色葡萄球菌的聚集因子A(ClfA)的相应区域具有62％的同一性。
其它的与配体结合的蛋白/粘附素包括Isd蛋白(离子调控的表面决定子)，虽然它们全部都不是MSCRAMM本身(例如IsdB和IsdH)，但是它们促进细菌粘附至细胞外基质成分，在本文中将它们称为“MSCRAMM样蛋白”。已经知道IsdA促进向鳞状细胞的粘附，并且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性弱，所以在技术上将其定义为MSCRAMM。
聚集因子A(ClfA)是第一个被鉴定出来的与纤维蛋白原的γ-链结合的金黄色葡萄球菌粘附素。随后认识到纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白A(FnBPA)和纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白B(FnBPB)是与Fg的γ-链中相同的C末端肽区段结合的双功能蛋白。ClfA和FnBP具有在革兰氏阳性菌中表达的所有细胞壁锚定蛋白包括ClfB共有的结构特征。
例如，聚集因子A(ClfA)是金黄色葡萄球菌的位于表面上的蛋白。ClfA是金黄色葡萄球菌的重要毒力因子。其促成脓毒性关节炎和心内膜炎的病理发生。ClfA是具有相似的结构/模块组构的表面结合蛋白家族(包括但不限于ClfB、SdrD、SdrE等)的原始型。
ClfA含有520个氨基酸的N末端A结构域(纤维蛋白原结合区域)，其包括三个单独折叠的亚结构域N1、N2和N3。A结构域后面是丝氨酸-天冬氨酸二肽重复区域以及细胞壁和膜跨越区域，其含有用于分选酶促进的向细胞壁锚定的LPDTG基序。ClfA实际上存在于所有的金黄色葡萄球菌菌株中(Peacock SJ，Moore CE，Justice A，Kantzanou M，Story L，Mackie K，O′NeillG，Day NPJ(2002)Virulent combinations of adhesin and toxin genes in natural populations of Staphylococcus aureus.Infect Immun 70：4987-4996)。其与纤维蛋白原的γ-链的C末端结合，因此能够诱导纤维蛋白原溶液中的细菌聚集(McDevitt D，Nanavaty T，House-Pompeo K，Bell E，Turner N，McEntire L，Foster T，
M(1997)Characterization of the interaction between the Staphylococcus aureus clumping factor(ClfA)and fibrinogen.Eur J Biochem247：416-424；和McDevitt D，Francois P，Vaudaux P，Foster TJ(1994)Molecular characterization of the clumping factor(fibrinogen receptor)ofStaphylococcus aureus.Mol Microbiol 11：237-248)。
对ClfA和相关的纤维蛋白原结合蛋白SdrG和ClfB进行的三维结构分析已经揭示：在所有这些相关蛋白中，配体结合A结构域均由三个亚结构域N1、N2和N3组成，其中对应于区域N2-N3的残基221-559是最小的保留与纤维蛋白原结合能力的截短物(truncate)。已经发现氨基酸残基532至538对应于ClfA的锁闭肽(latching peptide)区域。每个亚结构域包含9个β链，其构成新的IgG型折叠。这些蛋白中的纤维蛋白原γ链肽结合位点位于N2和N3之间的节点的疏水槽。已经发现这些蛋白的三维结构存在显著的结构相似性，这是由于存在一个或多个相关的氨基酸序列、相似的模块设计和共同的结合结构域组构。
SdrC、SdrD、SdrE、FnBPA-A(所有7个同型)和FnBPB-B(所有7个同型)具有相似的模块组构，因此使用PHYRE分子模型，预期这些蛋白将具有相同的三维结构。
IsdA和IsdB不具有与Clf或Sdr蛋白相同类型的结构。它们具有新的被称为NEAT的基序，该基序参与配体结合。但是，NEAT基序由β链夹心结构组成(由2个5条链的反平行β片层组成的β夹心折叠)并且是Ig超家族成员(Pilpa等人“Solution Structure of the NEAT(NEAr Transported)Domain from IsdH/HarA：the Human Hemoglobin Receptor in Staplococcus aureus”J.Mol.Biol.(2006)360：435-447)，从这个意义上来讲，NEAT基序与Clf或Sdr的三维结构是相似的。已经解决了IsdH的NEAT基序的三维结构并预测了环1b-2中的残基。
金黄色葡萄球菌上ClfA的表达阻碍巨噬细胞和嗜中性粒细胞的吞噬作用(Palmqvist N，Patti JM，Tarkowski A，Josefsson E(2004)Expression of staphylococcal clumping factor A impedes macrophage phagocytosis.Microb Infect 6：188-195；和Higgins J，Loughman A，van Kessel KPM，van Strijp JAG，Foster TJ(2006)Clumping factor A of Staphylococcus aureus inhibits phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes.FEMS Microbiol Lett258：290-296)。在嗜中性粒细胞中，这是由纤维蛋白原依赖性机制和纤维蛋白原非依赖性机制共同造成的。相反，细菌表达的ClfA通过与GPIIb/IIIa发生相互作用而激活血小板，从而导致聚集。当纤维蛋白原存在时，这个作用进行得最为有效；但是还存在血小板激活的纤维蛋白原非依赖性途径(Loughman A，Fitzgerald JR，Brennan MP，Higgins J，Downer R，Cox D，FosterTJ(2005)Roles of fibrinogen，immunoglobulin and complement in platelet activation promoted by Staphylococcus aureus clumping factor A.Mol Microbiol 57：804-818；和O′Brien L，Kerrigan SW，Kaw G.，Hogan M.，PenadésJ.，Litt D.，Fitzgerald D.J.，Foster T.J.&Cox D.(2002)Multiple mechanisms for the activation of human platelet aggregation by Staphylococcus aureus：roles for the clumping factors ClfA and ClfB，the serine-aspartate repeat protein SdrE and protein A.Mol Microbiol 44，1033-1044)。
ClfA是诱导小鼠中的脓毒性关节炎的毒力因子(Josefsson E.，Hartford O.，O′Brien L，Patti JM，Foster T(2001)Protection against experimental Staphylococcus aureus arthritis by vaccination with clumping factor A，a novel virulence determinant.J Infect Dis 184：1572-1580)。此外，ClfA连同另一种纤维蛋白原结合蛋白ClfB的消除引起在感染早期抵抗全身性炎症的保护(Palmqvist N，Foster T，Fitzgerald R，Josefsson E，Tarkowski A(2005)Fibronectin-binding proteins and fibrinogen-binding clumping factors play distinct roles in staphylococcal arthritis and systemic inflammation.J Inf Dis191：791-798)。
已经分离并且表征了金黄色葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白ClfA，其为例如美国专利号6,008,341和6,177,084的主题。
ClfA和ClfB具有相同的结构(三维)组构和大约27％的氨基酸同一性。FnBPA与ClfA具有大约25％的氨基酸同一性。
目前尚无基于MSCRAMM的疫苗被批准并上市。
是一种供体选择的葡萄球菌静脉内人类免疫球蛋白(IGIV)，其靶向ClfA和SdrG，由于在III期临床试验表现较差，所以从临床试验被撤销。目前正在重新评估以确定它是不是葡萄球菌感染的可行性治疗。
WO 2005/116064涉及FnBPA，其为金黄色葡萄球菌的多功能结合蛋白。FnBPA的N末端A结构域类似于ClFA，已经发现其与纤维蛋白原结合。但是，FnBPA的C末端BCD结构域与纤连蛋白结合，因此，FnBPA是双功能的MSCRAMM。
WO 2005/116064基于以下发现：在存在转谷氨酰胺酶的情况下，在细菌粘附素FnBPA和宿主蛋白纤连蛋白之间形成共价连接，从而使得结合更加强烈并基本上是不可逆的。纤维蛋白原是血液中的主要成分(～3mg/ml)，在血液中其作为凝固级联的最终靶标。纤连蛋白含量较低，～0.3mg/ml或者对于每10-15个纤维蛋白原有一个Fn分子。纤维蛋白原和纤连蛋白被认为与血液无关，在血液中它们独立地循环。
重要的是，WO 2005/116064特别涉及因子XIIIa催化的共价交联。WO2005/116064分离了重组FnBPA中的多个突变体，其中具有带正电荷侧链的残基(即转谷氨酰胺酶底物)被改变。此外，WO 2005/116064涉及具有改变的共价纤连蛋白结合特性而非只有纤维蛋白原结合特性的突变体。此外，该文献没有通过实验证明突变蛋白与配体的结合是否减少，并且没有提供任何支持性的免疫原性数据。
因此，鉴于多重耐药性在革兰氏阳性菌中的流行以及对这些多重耐药性细菌的成功治疗和疫苗的缺乏，任何能够不使用抗生素来处理这样的细菌感染的替代性治疗将具有重要意义。
此外，对于任何已知的治疗或疫苗的效力的任何改进将具有重要意义，特别是在临床环境中。
因此，本发明旨在提供治疗这样的细菌感染的替代性和改进的治疗法。
发明内容
根据本发明的第一个一般性方面，提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，用于治疗。
根据优选的实施方式，提供了不具有结合纤维蛋白原的能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合性MSCRAMM蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段，用于治疗。
根据本发明的第二方面，提供了在个体中诱导免疫反应的方法和/或治疗患有微生物感染的患者的方法，其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，或包含所述重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段的疫苗。
根据本发明的第三方面，提供了包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM蛋白或其片段的疫苗。
根据本发明的第四方面，提供了针对对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段而产生的抗体，优选为超免疫血清的形式。
根据本发明的第五方面，提供了免疫原性药物组合物，其包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂。
详细描述
在本说明书中，术语“粘附素”、“MSCRAMM”和“细胞壁锚定蛋白”将被理解为可以相互替换并且涵盖所有的源自微生物的配体结合蛋白。理想地，这些蛋白与纤维蛋白原、血红素或血红蛋白、触珠蛋白-血红蛋白、氯化血红素、胶原和其它这样的配体结合。术语“MSCRAMM样”蛋白旨在涵盖与这样的MSCRAMM蛋白具有相关的氨基酸序列、相似的模块设计和/或共同/相似的结合结构域组构(organization)的蛋白或粘附素，例如Isd蛋白。理想地，MSCRAMM样蛋白具有相似的结合结构域组构/模块设计。另外，MSCRAMM样蛋白与MSCRAMM蛋白可以具有至少50％、优选60％、优选75％、更优选85％、还更优选95％，又更优选99％或更高的氨基酸序列同一性。
还应该理解，本说明书所称的任何百分比同一性或同源性是使用可获得的常规方法在序列的整个/完整长度上确定的。
术语“微生物(micro-organism)”、“微生物(microbe)”、“微生物的(microbial)”或类似的术语包括但不限于下列生物体，包括：细菌、真菌、病毒、酵母和/或霉菌。
术语“免疫有效数量”包括能够刺激B细胞和/或T细胞反应的那些量。
根据本发明的第一个一般性方面，提供了对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白，或其片段，其包含至少一部分配体结合区域，用于治疗。这样的重组蛋白可用于治疗微生物感染，例如治疗脓毒症、脓毒性关节炎和/或心内膜炎或其它类似的病状或疾病状态。这样的微生物感染理想地是由葡萄球菌或其它类似的微生物引起的。
根据本发明的这个方面的一个特定实施方式，所述重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。
因此，应该理解，重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段可能具有减少的与其宿主配体的结合或者与其宿主配体的结合被阻止。
根据本发明推论：MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白通过坞、锁和锁闭(Dock，Lock and Latching(DLL))与其配体结合过程中发生的非共价结合可能被减少或阻止。已经证明MSCRAMM与其配体结合的第一个步骤涉及通过DLL模型进行的非共价相互作用。这些是MSCRAMM与配体的首要的非共价相互作用。MSCRAMM-配体结合的最后阶段涉及共价相互作用。在这个特定实施方式中，由于改变的坞、锁和锁闭，重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段具有减少的或不具备与其宿主配体非共价结合的能力。一个或多个坞、锁或锁闭步骤可以被改变。
DLL模型是从SdrG与其配体的复合物的三维结构中阐明的。现在已经表明ClfA通过DLL机制的微小变化发挥作用(Ganech等人(2008)“Astructural model of the Staphylococcus aureus Clfa-fibrinogen interaction opens new avenues for the design of anti-staphylococcal therapeutics”.PloS Pathog4(11)；e1000226)。DLL模型特别涉及参与配体结合的非共价相互作用。对于所有其它的相似结构类型(无论是按照氨基酸相似性/同源性还是按照结构组构同源性)的蛋白均推断具有DLL模型，包括但不限于MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白。
特别在涉及MSCRAMM ClfA/ClfB时，发现最小配体结合结构域包含区域A的亚区域N1至N3，特别是包含变体Dev-IgG Ig折叠的亚区域N2和N3。变体Dev-IgG Ig折叠是免疫球蛋白基序的新变体，其也被称为DE变体。据推论，在ClfA/B的两个DEv-IgG结构域之间形成的疏水袋是纤维蛋白原γ-链的配体结合位点。实质上，配体与分隔N2和N3的疏水槽结合。特别地，在配体结合过程中，配体的未折叠肽成分插入位于N2和N3亚结构域之间的槽。亚结构域N3的C末端的锁闭肽发生构象变化并插入亚结构域N2的两条B链之间，因此，将配体锁定在适当位置。确实，聚集因子中的残基Tyr256、Pro336、Tyr338和Lys389(它们被认为是与纤维蛋白原的γ链末端残基408AGDV411接触)的突变取代使得该蛋白丧失或显著降低其对纤维蛋白原的亲和力。下文将详述该具体实施方式的更多细节。
虽然这些教导涉及聚集因子，尤其是ClfA，但是它们同样适用于其它具有类似模块结合结构域组构和以相似方式与配体结合的MSCRAMM和/或MSCRAMM样蛋白。
因此，为了提供对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，可以改变全长蛋白、配体结合结构域、最小配体结合结构域或其片段以减少或阻止与其宿主配体的结合。理想地，对于ClfA/ClfB或其它类似MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白，可以改变区域A的亚区域N2和N3(其理想地包含变体Dev-IgG Ig折叠)以阻止或减少与其宿主配体的结合。这样的改变被设计为阻止配体与疏水槽的结合，所述疏水槽分隔DLL所需的最小配体结合结构域。
可以使用全长蛋白、配体结合结构域、最小配体结合结构域或其片段，通过氨基酸取代或删除，使配体结合结构域在氨基酸水平发生这样的改变。应该理解，还可以使用与配体结合蛋白具有足够高的同源性的蛋白或其片段。本文定义的高同源性是指，在全长DNA序列上至少50％、优选60％、优选70％、优选80％、更优选90％、还更优选95％、又更优选95％至99％、又更优选99％或更多的核苷酸的匹配，或者，当用于氨基酸序列时是指，氨基酸序列虽不相同但产生具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解，这些关于高同源性的论述也适用于蛋白质的三维结构，即模块结合结构域组构。
应该理解，可以使用完整的配体结合蛋白、配体结合结构域、最小配体结合结构域或其片段。
使用配体结合蛋白的截短的蛋白例如配体结合结构域、最小配体结合结构域或使用其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要的蛋白切割等其它问题是有利的。例如，存在于最小配体结合结构域中的锁闭肽可以被删除/除去或改变。例如，锁闭肽在ClfA中对应于区域A的氨基酸532至538；在ClfB中对应于区域A的氨基酸530至540(Walsh等人(2004)JBC 279(49)：50691-50699)。可以将这些残基改变、取代或除去/删除以阻止配体通过DLL与MSCRAMM结合。按照这种方式，MSCRAMM与其配体的DLL“锁闭”被阻止。这种“锁闭”通过非共价相互作用的方式发生。在一个实施方式中，沿着剩余区域A的C末端氨基酸残基将全部锁闭肽除掉。根据另一个实施方式，仅有锁闭肽区域被除掉。根据另外一个实施方式，锁闭肽区域发生氨基酸取代以减少或阻止配体结合/锁闭。这些论述适用于所有的通过DLL或类似模型与配体结合的MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白。
通过以这种方式改变MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白，可以提供不具有与其配体结合能力的配体结合蛋白，在免疫之后其会刺激产生比野生型蛋白更大的免疫反应。有利地，这减少了全身性炎症，从而降低了微生物毒力。因此，这种缺少与其配体结合能力的改变的配体结合性MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白可有利地用于微生物感染的治疗。因此，这些发现呈现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗/免疫治疗剂，与源自野生型蛋白的疫苗或免疫治疗剂相比，其提供了更好的效果。
根据本发明的一个实施方式，所述配体是血红素、血红蛋白或纤维蛋白原。可以考虑其它配体，例如触珠蛋白-血红蛋白、血红蛋白、氯化血红素、胶原等。
根据本发明的另一个实施方式，重组MSCRAMM蛋白选自：纤维蛋白原结合蛋白；或
SdrD、SdrE、SdrG和/或SdrF。
上文已经详述了纤维蛋白原结合蛋白，包括但不限于ClfA、ClfB、FnBPA、FnBPB、FbI、IsdA等。已经表明SdrG/F与胶原结合。其它的MSCRAMM包括SasA、SasG、SasK和SdrH。
重组MSCRAMM样蛋白可以选自：IsdA、IsdB和/或IsdH。
基于来自纤维蛋白原结合性MSCRAMM ClfA的发现，可以在例如包括IsdH和IsdB的Isd蛋白的NEAT(NEAr转运子)基序中产生相似的非配体结合性突变体。如上文所详述，IsdA和IsdB不具有与Clf或Sdr蛋白相同类型的结构。但是，Isd中的NEAT基序直接参与配体结合(触珠蛋白-血红蛋白、血红蛋白、氯化血红素)，因此，NEAT基序中的改变将以改变Clf或Sdr的DLL或DLL样宿主配体相互作用的相同方式阻止宿主配体相互作用。很多含有NEAT结构域的蛋白参与血红素(haem)的结合，包括金黄色葡萄球菌中的IsdA。据推论：IsdA与血红素结合的性质包含于NEAT结构域中。apo-IsdA NEAT结构域和与血红素的复合物中的晶体结构已经揭示出具有大的疏水性血红素结合袋的网格蛋白适配子样β夹心折叠。IsdB具有两个NEAT基序；IsdA具有一个NEAT基序。可以通过改变预测为配体结合的残基来分离Isd蛋白的非配体结合性突变体，例如通过改变β链和/或疏水袋之间的残基来进行。另外，可以改变NEAT基序来影响非共价的宿主-配体相互作用。
根据本发明的该方面的另一个实施方式，提供了在个体中诱导免疫反应和/或治疗患有微生物感染的患者的方法，其包括给予所述个体对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，或包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段的疫苗。
根据本发明的该方面的另一个实施方式，提供了包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段的疫苗。
根据本发明的该方面的另一个实施方式，提供了针对对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段而产生的抗体，优选为超免疫血清的形式。
根据本发明的该方面的另一个实施方式，提供了免疫原性药物组合物，其包含对其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段。
根据本发明的优选实施方式，提供了不具有与纤维蛋白原结合的能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白，或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段，用于治疗。
应该理解，重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段可用于治疗微生物感染，优选为葡萄球菌感染，例如治疗脓毒症、脓毒性关节炎和/或心内膜炎或其它类似的病状或疾病状态。
蛋白的纤维蛋白原结合区域被改变从而不再与纤维蛋白原结合。如上所述，该改变可以发生在核苷酸或氨基酸水平。应该理解，还可以使用与纤维蛋白原结合蛋白具有足够高的同源性的蛋白或其片段。本文定义的高同源性是指，在全长DNA序列上至少50％、优选60％、优选70％、优选80％、更优选90％、还更优选95％、又更优选95％至99％、又更优选99％的核苷酸的匹配，或者，当关于氨基酸序列使用时是指，氨基酸序列虽不相同但产生具有相同功能性和活性的蛋白。应该理解，这些关于高同源性的论述也可以涉及蛋白质的三维结构。
应该理解，可以使用完整的纤维蛋白原结合蛋白、纤维蛋白原结合区域、最小纤维蛋白原结合区域或其片段。使用截短的蛋白或其片段对于操作简易性以及克服诸如不想要的蛋白切割等其它问题是有利的。这将在下文详述。
理想地，这样的片段应该包含MSCRAMM的至少一部分纤维蛋白原结合区域。使用截短的蛋白或其片段(包含例如仅有配体-纤维蛋白原结合区域的一个或多个亚结构域)的好处在于，能够在不发生降解的情况下以高产率纯化蛋白。ClfA蛋白的纤维蛋白原结合区域，或者称为A区域，包含3个亚区域：N1、N2和N3。因此，免疫原性片段可以包含ClfA A区域的亚区域N1、N2和/或N3或其片段。因此，例如，涉及到ClfA时，片段可以包含区域A中的一个或多个亚结构域，N1、N2或N3。理想地，可以使用N2和N3，因为该截短物较不容易发生蛋白酶解(已经报道在ClfA和ClfB中的N1和N2之间存在蛋白酶切割位点)并且可以在大肠杆菌中以较高水平表达。N2和N3是Clf蛋白的最小纤维蛋白原结合区域。
应该理解，虽然以下讨论涉及纤维蛋白原结合蛋白ClfA，但是这些论述同样适用于其它的MSCRAMM、MSCRAMM样蛋白，特别是其它的在氨基酸或蛋白质结构水平上与ClfA在结构上相似的纤维蛋白原结合蛋白，例如ClfB、FbI和SdrF/G(其也与胶原结合)。此外，这些教导适用于FnBPA和FnBPB。因此，虽然以下论述涉及纤维蛋白原结合蛋白，但是它们也同样适用于其它的与纤维蛋白原之外的配体结合的MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白。
我们出乎意料地发现：在免疫之后，这种不具有与纤维蛋白原结合能力的改变的纤维蛋白原结合蛋白、截短物或其片段刺激产生比那些以正常方式结合至纤维蛋白原的野生型蛋白更大的免疫反应。有利地，当由金黄色葡萄球菌表达时，这种改变的纤维蛋白原结合蛋白不引起全身性炎症。因此，微生物毒力降低。因此，这种缺乏与纤维蛋白原结合能力的改变的蛋白能够有利地用于治疗微生物感染。与预期相反，我们还发现，改变的纤维蛋白原结合蛋白的保护效应比野生型蛋白大。我们发现包含这样的改变的重组蛋白的药物组合物或疫苗比包含未经改变(野生型)的形式的相同重组蛋白(例如ClfA、ClfB、SdrG等)的药物组合物或疫苗更加有效。
因此，这些发现呈现了抵抗细菌感染的新的且有价值的疫苗/免疫治疗剂，与同样用作疫苗/免疫治疗剂的野生型蛋白相比，其提供了更好的效果。
应该理解，改变的蛋白，无论是MSCRAMM或MSCRAMM样或纤维蛋白原或其它配体结合，可用于产生抗体，包括单克隆、多克隆、嵌合、人源化抗体或其片段，以用于治疗这样的微生物感染。然后可以提供包括这样的抗体例如超免疫血清的组合物，这些组合物可用于治疗感染了葡萄球菌感染的患者。
因此，蛋白或其活性片段可用于抑制葡萄球菌与细胞外基质(ECM)的结合并用于预防/治疗患者中的葡萄球菌感染。
此外，蛋白或其活性片段以及针对所述蛋白的抗体可用于治疗来自葡萄球菌感染的感染，用于开发进行主动或被动疫苗接种的疫苗，当作为药物组合物向伤口或医疗器械施用时，蛋白和抗体均可用作预防微生物感染的阻断剂。例如，这些蛋白或其片段可用于主动疫苗，针对这些蛋白的抗体可用于被动疫苗。
本文描述的这些疫苗和产品呈现出对于现有技术的显著改进，现有技术教导了MSCRAMM进行免疫的一般性用途，但是没有教导本文描述的出人意料的和改进的疫苗或产品。
蛋白质、DNA和抗体的制备在本领域是熟知的，本文中将不再详细描述。在产生这些分子的过程中理想地使用常规技术。还应该理解本发明涵盖包含目标核酸或氨基酸序列的核酸构建体、包含这样的核酸构建体以表达目标蛋白的重组宿主细胞以及免疫原性组合物。
为了给药，可以将蛋白组合物分散于无菌的等渗盐溶液或其它药学上可接受的佐剂中。
应该理解，疫苗可以是DNA或蛋白质疫苗。
可以通过注射DNA、蛋白质或抗体进行免疫接种。备选地，可以给予包括并表达DNA的减毒的活的生物体。
可以给予的DNA、蛋白质或抗体的量将取决于数个减轻要素，包括，对于启动子强度、蛋白表达和表达的基因的免疫原性的依赖性。对于每个新的应用可以改变这些因素以获得想要的需要的免疫有效数量。
根据本发明的另一个实施方式，提供了在个体中诱导免疫反应和/或治疗患有微生物感染的患者的方法，其包括给予所述个体不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其至少包含纤维蛋白原结合区域的片段。
根据本发明的另一个优选实施方式，提供了一种疫苗，其包含不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段。
根据本发明的另外一个优选实施方式，提供了针对重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段产生的抗体，优选为超免疫血清的形式，所述重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段不具备与纤维蛋白原结合的能力。
根据本发明的另外一个优选实施方式，提供了一种免疫原性药物组合物，其包含不具备与纤维蛋白原结合能力的重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其含有至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段以及药学上可接受的佐剂。
理想地，重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白或其片段源自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和/或路邓葡萄球菌。
这些实施方式的纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列FbI、SdrF和/或SdrG(其也与胶原结合)的一种。备选地，纤维蛋白原结合蛋白可以选自下列一种：纤维蛋白原结合蛋白聚集因子A(ClfA)、纤维蛋白原结合蛋白聚集因子B(ClfB)、纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白A(FnBPA)、纤连蛋白-纤维蛋白原结合蛋白B(FnBPB)。IsdA促进粘附，并且对于纤维蛋白原和纤连蛋白的亲和性较弱，所以在技术上可以将其定义为纤维蛋白原结合性MSCRAMM。
应该理解，这样的纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白原结合区域内的核苷酸或氨基酸取代或删除将产生不具备与纤维蛋白原结合能力的重组蛋白。
已经推论出ClfA-纤维蛋白原的结合是通过类似于SdrG的坞、锁和锁闭(DLL)机制发生的。上文详述了DLL模型。ClfA的区域A负责蛋白-配体相互作用。如图11中所示，几个纤维蛋白原结合性MSCRAMM的模块结构是相似的，都含有类似于ClfA的区域A。
纤维蛋白原γ-链肽结合位点位于ClfA的N2和N3之间的节点的疏水槽中。因此，以上提及的取代或删除被设计为改变MSCRAMM蛋白-配体相互作用并阻止ClfA与纤维蛋白原的非共价结合。
根据本发明的一个具体实施方式，重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白是ClfA的纤维蛋白原结合缺陷型突变体。在该实施方式中，ClfA的纤维蛋白原结合区域A被任何方式改变(例如取代或删除突变)从而其不再与纤维蛋白原结合。
理想地，纤维蛋白原结合蛋白是ClfA，但是，ClfA具有与很多其它纤维蛋白原结合蛋白相似的三维结构。因此，应该理解，这些关于ClfA的论述同样适用于其它MSCRAMM纤维蛋白原结合蛋白，包括ClfB、FnBPA、FnBPB、FbI、SdrG/F、IsdA等。所有这些蛋白都具有相似的三维结构，因此，可以对纤维蛋白原结合区域进行相似的改变/突变以达到相同的结果。
ClfA是993个氨基酸的蛋白，其包含520个氨基酸的纤维蛋白原结合结构域(从氨基酸40至559)。该纤维蛋白原结合结构域是包含亚区域N1、N2和N3的N末端A结构域。跨越N1至N3的从氨基酸40至氨基酸559的整个纤维蛋白原区域可用于本发明。备选地，可以使用N1至N3区域的截短物，例如221至559(最小纤维蛋白原结合区域)、221至531(不含锁闭肽和其后的残基的最小纤维蛋白原区域)等。理想地，可以使用亚区域N2和N3，最小纤维蛋白原结合区域，其对应于氨基酸残基221至559。备选地，可以使用这些亚区域的片段。
已经研究表明，ClfA的涵盖了N2和N3区域的氨基酸残基221至559在与纤维蛋白原结合的过程中发挥重要作用，其为最小纤维蛋白原结合区域。我们还出乎意料地发现该区域中的氨基酸残基突变产生可以被宿主免疫防御识别但是没有纤维蛋白原结合的表达蛋白，因此，降低了相关的毒力。ClfA的这个区域(339个氨基酸的纤维蛋白原结合结构域)具有特异性的三维结构，即所谓的DE变体IgG折叠，其为最小Fg结合截短物，如果被改变的话(通过取代或删除等)，能够提供改进的治疗。
可以通过在核苷酸或氨基酸水平上进行取代、添加或插入或删除来进行改变以导致纤维蛋白原结合活性的丧失。理想地，取代对蛋白或片段的三维结构(例如，所谓的DE变体IgG折叠)造成负面影响，所以它将不能再与纤维蛋白原结合。
理想地，核苷酸或氨基酸取代减少与纤维蛋白原的非共价相互作用，优选通过阻止配体与分隔纤维蛋白原结合蛋白的区域A的N2和N3的疏水袋结合。备选地，对应于氨基酸532至538的锁闭肽区域可以通过取代或删除被改变，以阻止配体结合。另外，可以使用没有锁闭肽区域和任选地没有C末端蛋白残基的剩余部分即没有氨基酸残基532至559的截短物/片段。
根据本发明的这个方面的一个具体实施方式，可以通过分别将氨基酸P336替换为丝氨酸和/或将氨基酸Y338替换为天冬氨酸来构建ClfA的纤维蛋白原结合缺陷的突变体。残基的选择是基于ClfA的X射线晶体结构以及“对脯氨酸或酪氨酸的单个改变降低结合活性”的观察。令人惊奇的是，我们发现该突变体ClfA蛋白(rClfAP336S Y338A)刺激免疫反应并且可用于产生更加有效的疫苗或抗体治疗。所述取代可以发生在全长纤维蛋白原结合蛋白、纤维蛋白原结合区域、最小纤维蛋白原结合区域或其片段中。
根据本发明的这个方面的另一个具体实施方式，可以通过分别将氨基酸P336替换为天冬氨酸和/或将氨基酸Y338替换为丝氨酸来构建ClfA的纤维蛋白原结合缺陷的突变体。如同上一个实施方式一样，该突变体ClfA蛋白(rClfAP336A Y338S)也可用于产生更加有效的疫苗或抗体治疗。
或者，所述改变可以是删除的形式，包括不含锁闭肽序列(氨基酸532至538)的纤维蛋白原结合区域，以产生不具备与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合蛋白。在该实施方式中，使用了ClfA的区域A的氨基酸残基221至531，其没有锁闭肽和其后的C末端残基。备选地，可以考虑锁闭肽氨基酸532至538中的氨基酸取代，其阻止纤维蛋白原的DLL。
应该理解，Clf-Sdr家族中的所有蛋白都通过DLL模型与配体结合。通过模拟三维结构可以预测锁闭肽并制备没有锁闭肽的截短物，不论是全长(N1至N3)还是最小配体结合截短物N2-N3或其片段。
我们发现这些取代的rClfA蛋白(不论是删除突变体，取代或截短物)降低了毒力和疾病后果，并且令人惊奇地诱导比野生型蛋白少的全身性炎症。
因此，基于所测的蛋白，预期以这些突变体蛋白进行的免疫将增强同时识别突变体和野生型蛋白的抗体水平并且将提供比野生型蛋白更大的免疫反应。
因此，经过改变从而其不再与纤维蛋白原结合的ClfA是用于主动或被动免疫的有用的候选治疗剂。按照这种方式，经改变的ClfA蛋白本身可用作疫苗，或者可以使用针对这种改变的ClfA蛋白产生的抗体。如上所述，疫苗可以是DNA或蛋白疫苗。
下表中列出的以下序列可以根据本发明使用。
1另外的N残基(N-末端延伸(6×His标签和另外的残基)包含6个His残基，接着是Gly和Ser。另外的C末端残基包含Lys，接着是Leu(可以使用其它的另外的N和C末端残基-取决于所用的引物或需要的N/C末端标签)
2另外的N残基(6×His标签和另外的残基)包含6个His残基，接着是Gly和Ser。另外的C末端残基包含Arg，接着是Ser(可以使用其它的另外的N和C末端残基-取决于所用的引物或需要的N/C末端标签)
3不含对应于氨基酸残基532至538的锁闭肽和剩余的A区域C末端残基，即没有氨基酸残基532至559。
理想地，重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白包含根据任意SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列或其片段，其中残基P336和/或Y338被丝氨酸和/或丙氨酸取代。
备选地，重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白的片段包含根据任意SEQID NO：4至SEQ ID NO：14的氨基酸序列。SEQ ID NO：4和5仅对应于ClfA结构域N1、N2、N3，其分别为rClfA P336S Y338A和rClfA P336A Y338S，如上表中所示。
基于在SdrG中进行的锁闭中的取代推测：在构象变化或β链互补方面存在缺陷的锁闭中的取代在配体结合上也将是有缺陷的。因此，理想地，取代发生于对应于锁闭肽的氨基酸残基532至538并影响肽发生构象变化的能力或与配体的结合或二者皆有。备选地，改变可以包含一起除掉氨基酸残基532至538(Δ锁闭肽)，以产生相似的结果。另外，没有氨基酸残基532至559(包括锁闭肽残基)的C末端截短突变体也将影响与配体的结合。
但是，应该考虑到，除了以上特别指明的那些之外，也可以对其它的氨基酸残基进行取代。例如，可以对Glu 526、Val 527、Tyr 256和Lys 389进行取代以改变蛋白或其片段的纤维蛋白原结合性质。因此，任何减少结合能力的取代均可以被考虑到。理想地，这样的取代或删除影响疏水袋和与之相关的与疏水沟中的配体结合的机制，例如ClfA中的同源物Val527和ClfB中的N526。在ClfB中，已经研究表明Q235和N526减少结合。以FnBPA进行了相似研究，其中表明N304和F306对于Fg结合是重要的。因此，这些氨基酸残基中的突变将影响配体结合。
应该理解，这些论述对于其它纤维蛋白原结合蛋白例如ClfB、SdrG、FnBPA、FnBPB同样适用。因此，治疗(疫苗、抗体或药物组合物等)可以包含完整的纤维蛋白原结合区域或其片段。
在本说明书中，术语“包括(comprise)、包括(comprises)、包括(comprised)和包括(comprising)”或其任何变体以及术语“包括(include)、包括(includes)、包括(included)和包括(including)”或其任何变体被认为是完全可以相互替换使用，它们应该被赋予最可能宽的解释。
本发明不限于以上描述的实施方式，可以在权利要求的范围内在解释和细节方面变化。
现在将通过参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明。
图1至15显示了实施例1的结果。
图1显示了在接种了金黄色葡萄球菌菌株Newman，和clfAPYI、clfAPYII和clfA无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性(A)和体重丧失(B)。接种3.2×106-6.0×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株。数据表示为中位数(正方形或中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。汇集来自三次实验的数据。NNewman＝27-30，NclfAPYI＝30，NclfAPYII＝10，NclfA＝16-20。
图2显示了以3.2×106-6.0×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman，和clfAPYI、clfAPYII和clfA无效突变体接种之后7-8天的小鼠肾脏中的细菌生长。数据表示为每对肾脏中的cfu。当检测不到生长时，将计数设置为根据所用的稀释度的最高可能计数。汇集来自三次实验的数据。NNewman＝26，NclfAPYI＝30，NclfAPYII＝10，NclfA＝15。
图3显示了分别接种5.2、5.1或3.3×107cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman、clfAPYI突变体或clfA无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组N＝10。
图4显示了分别接种9.4、7.9、10.7或9.8×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株LS-1，和clfAPYI、clfAPYII或clfA无效突变体之后的小鼠生存情况。从开始起每组N＝15。
图5显示了以BSA、重组ClfA或重组ClfAPY(即ClfAPYI重组蛋白A结构域)免疫并接种了2.3×107cfu的金黄色葡萄球菌Newman的小鼠的生存情况。从开始起每组N＝15。
图6显示了接种了3.2×106-6.0×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型，和clfAPYI、clfAPYII和clfA无效突变体的关节炎小鼠的频率。汇集来自三次实验的数据。NNewman＝27-30，NclfAPYI＝30，NclfAPYII＝10，NclfA＝16-20。
图7显示了分别接种了5.2、5.1或3.3×107cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型、clfAPYI突变体或clfA无效突变体的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性。数据表示为中位数(正方形)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NNewman＝0-10，NclfAPYI＝9-10，NclfA＝0-10。
图8显示了分别接种了5.2、5.1或3.3×107cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型、clfAPYI突变体或clfA无效突变体的小鼠中的体重丧失。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NNewman＝0-10，NclfAPYI＝9-10，NclfA＝0-10。
图9显示了以BSA、重组ClfA或重组ClfAPY(即ClfAPYI重组蛋白A结构域)免疫并接种了4.0×106cfu的金黄色葡萄球菌Newman的小鼠中以关节炎指数测定的关节炎的严重性。数据表示为中位数(正方形)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。从开始起，每组NBSA＝14，NclfAPY＝14，NclfA＝15。
图10给出了野生型ClfA A结构域蛋白(rClfA)、仅结构域N123的核苷酸和氨基酸序列，其中以高亮标出了在以下实施例中被改变以产生rClfAPYI/II(SEQ ID No.3)的残基(P336和Y338)。在以下实施例中用于疫苗接种的正是这个重组蛋白A结构域。
图11显示了FnBPA、ClfB、ClfA和SdrG蛋白结构的示例性图。区域A是纤维蛋白原结合区域，S是信号序列，W是细胞壁跨越结构域，M是膜锚定，其包括LPXTG基序，+表示带正电的残基，R是重复区域。在ClfA中，区域A包含N123(未显示)。FnBPA的BCD区域(以及FnBPB的较短的CD区域-未显示)与纤连蛋白结合。
图12显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA40-559(rClfA)或重组ClfAPY40-559(rClfAPY)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfAPY40-559的特异性抗体反应，1天之后以2.3×107cfu/小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝13-15，NrClfA＝15，NrClfAPY＝15。
图13显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA40-559(rClfA)或重组ClfAPY40-559(rClfAPY)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfA40-559的特异性抗体反应，1天之后以2.3×107cfu/小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型的感染以诱导脓毒症。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝13-15，NrClfA＝15，NrClfAPY＝15。
图14显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA40-559(rClfA)或重组ClfAPY40-559(rClfAPY)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfAPY40-559的特异性抗体反应，1天之后以4.0×106cfu/小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝14-15，NrClfA＝15，NrClfAPY＝15。
图15显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA40-559(rClfA)或重组ClfAPY40-559(rClfAPY)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfA40-559的特异性抗体反应，1天之后以4.0×106cfu/小鼠进行金黄色葡萄球菌菌株Newman野生型的感染以诱导脓毒性关节炎。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝14-15，NrClfA＝15，NrClfAPY＝15。
实施例2的图16显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA221-559(rClfA221-559)或重组ClfAPY221-559(rClfAPY221-559)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfAPY221-559的特异性抗体反应。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝15，NrClfA221-559＝14-15，NrClfAPY221-559＝14-15。
实施例2的图17显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用牛血清白蛋白(BSA)、重组ClfA221-559(rClfA221-559)或重组ClfAPY221-559(rClfAPY221-559)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfA221-559的特异性抗体反应。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NBSA＝15，NrClfA221-559＝14-15，NrClfAPY221-559＝14-15。
实施例3的图18显示了在第二次加强免疫9天之后，对于用重组ClfAPY221-531(rClfA221-531)免疫的小鼠血清样品中的重组ClfA221-53l的特异性抗体反应。数据表示为中位数(中线)、四分位数间距(框)和80％中间间距(须)。NrClfA221-531＝14-15。
实施例
实施例1
包含N1、N2和N3(氨基酸40-559)的rClfA A区域截短物
材料和方法
在本部分末尾处提供了实施例中给出的括号中的数字参考文献的全部细节。
小鼠
NMRI小鼠获自Scanbur BK(Sollentuna，瑞典)，维持在瑞典哥德堡大学风湿病学系的动物厂房中。哥德堡动物实验伦理委员会批准了该实验。每个笼子中饲养10只动物，以12小时的光照-黑暗进行循环，以标准实验室食品和水随意饲养。在实验开始时，动物为6至16周龄。
细菌菌株
为了感染动物，使用了金黄色葡萄球菌野生型菌株Newman(14)和LS-1(11)及其构建衍生物。在菌株Newman中构建clfA P336SY338A(clfAPYI)和clfAP336AY338S(clfAPYII)衍生物并将其转导至菌株LS-1(见下文)。还使用了删除突变体Newman clfA2::Tn917突变体DU5876(3)和LS-1 clfA2::Tn917突变体(J.R.Fitzgerald等人，未发表)。细菌在血液琼脂板上生长48小时，收获并于-20℃冷冻于含有5％(重量/体积)BSA(Sigma Chemicals)和10％(体积/体积)二甲基亚砜的PBS中。在注射到动物中之前，将细菌悬浮液解冻，在PBS中洗涤，并调整至合适的细胞浓度。在每次刺激时根据血液琼脂板上的培养和计数菌落测定活细菌的数目。
在金黄色葡萄球菌Newman和LS-1中构建clfAPYI和clfAPYII突变
在本实验中，使用了包含对应于氨基酸40-559的N1、N2和N3的全长ClfAA区域截短物。在以下描述和附图中：
-ClfA也可被称作rClfA 40-559(SEQ ID NO 3)；
-ClfA P336SY338A也可被称作clfAPYI、rclfAPY或rclfAPYI(即clfAPYI40-559)(SEQ ID NO 4)；和
-ClfA P336AY338S也可被称作clfAPYII、rclfAPYII(即clfAPYII 40-559)(SEQ ID NO 5)。
将在clfA中含有P336S和Y338A突变的1.02kb的pCF77PY的PstI-BamHI片段(Loughman等人，2005)克隆进入pBluescriptII SK-(Stratagene)。使用HindIII将该质粒线性化并连接进入HindIII-切割的pTSermC(J.Higgins，未发表)以产生质粒pARM，其为温度敏感性的大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒，其含有P336S和Y338A取代。
为了降低由于取代P336和Y338而产生功能性或免疫反应性表位的未知风险，我们产生了第二个突变体，其中取代的顺序是反的，即产生P336A和Y338S。为了产生这个，产生了类似于pARM但是包含P336A和Y338S取代的质粒pJH2。使用与用以制备pCF77PY(6)相同的侧翼引物和一对不同的重叠突变引物(突变以黑体和下划线表示)进行重叠引物PCR以产生pCF77PYII：
F3：GCAACTTTGACCATGGCCGCTTCTATTGACCCTGAAAATG和
R3：CATTTTCAGGGTCAATAGAAGCGGCCATGGTCAAAGTTGC
如上所述，使用该质粒的1.02kb PstI-HindIII片段用于产生pJH2——一种温度敏感性大肠杆菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒，其含有P336A和Y338S取代。
通过电穿孔将pARM和pJH2都转移到RN4220(15)中，然后使用噬菌体85(16)将其转导到金黄色葡萄球菌Newman(14)和LS-1(11)中。在这些菌株中，诱导该质粒使其插入到染色体中，然后进行切割，将突变留在一定比例的转化子的染色体中，产生Newman clfAPYI、Newman clfAPYII、LS-1clfAPYI和LS-1clfAPYII。就质粒的损失和纤维蛋白原结合活性的丧失筛选转化子。使用clfA探针通过Southern杂交验证clfA基因的完整性(数据未显示)。使用抗-ClfA区域A的多克隆兔子抗血清通过Westem免疫印迹验证免疫反应性蛋白(ClfAPY)的表达(数据未显示)。通过在来自基因组DNA的KpnI-BamHI片段上进行PCR和产物的商业测序对突变进行验证。所测序的菌株LS-1的clfA基因的大约700个碱基与菌株Newman的Newman clfA基因中的对应碱基是相同的。
重组ClfA和ClfAPY的产生
按照以前的描述(17)，从pCF40产生His标记的重组ClfA区域A、结构域N123(氨基酸40-559)，其中增加了另外的通过阴离子交换柱的抛光步骤。使用质粒pCF77PY(6)作为模板，将clfAPYI结构域N123克隆进入pQE30中以产生pCF40PY。使用该质粒，还通过镍亲和层析和阴离子交换层析产生了重组ClfAPY，如同对于rClfA的描述一样。在浓缩和冷冻干燥之前，以PBS将洗脱物透析两次。
脓毒性关节炎和脓毒症实验
在实验1-3中，以菌株Newman感染所有的小鼠(每组n＝10)以引发关节炎，在实验4和5中，分别以菌株Newman和LS-1感染小鼠(每组n＝10)以引发脓毒症。
实验1通过静脉内注射3.5×106cfu/小鼠的金黄色葡萄球菌菌株Newman或4.3×106cfu/小鼠的Newman clfAPYI突变体感染小鼠，二者均处于200μl PBS中。监测临床关节炎和重量变化直至第7天。在第8天将小鼠杀死，测定肾脏中细菌的生长并且测定血清IL-6和总IgG水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
实验2分别以5.0×106cfu、6.0×106cfu或4.3×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman、clfAPYI突变体或Newman clfA::ErmR(clfA无效突变体)感染小鼠。监测临床关节炎和重量变化直至第7天。在第7天将小鼠杀死，测定肾脏中细菌的生长；测定血清IL-6和总IgG水平。在前和后足的关节处进行滑膜炎和骨破坏的组织学研究。
实验3分别以4.7×106cfu、3.2×106cfu、3.9×106cfu或4.8×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman、clfAPYI突变体、Newman clfAPYII突变体或NewmanclfA无效突变体感染小鼠。监测临床关节炎和重量变化直至第7天。在第8天将小鼠杀死，测定肾脏中细菌的生长.
实验1-3的结果是非常相似的，所以将数据汇集并一起呈现。
在实验4中，将小鼠分别用5.2×107cfu、5.1×107cfu或3.3×107cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman、clfAPYI突变体或clfA无效突变体静脉内注射。监测死亡率、重量变化和临床关节炎直至第10天。
在实验5中，将小鼠分别用9.4×106cfu、7.9×106cfu、10.7×106cfu或9.8×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株LS-1、LS-1clfAPYI突变体、LS-1 clfAPYII突变体或LS-1 clfA无效突变体感染。监测死亡率、临床关节炎和重量变化直至第16天。
关节内注射细菌
分别以2.4×104cfu、2.4×104cfu或3.4×104cfu的菌株Newman野生型、clfAPYI突变体或clfA敲除突变体(处于20μl PBS中)注射每只小鼠的一个膝关节。每组N＝10。在3天后杀死小鼠，收集膝关节用于组织病理学检查。
以野生型和突变体重组ClfA进行疫苗接种
将纯化的rClfA40-559、rClfAPY40-559(即rClfAPYI)或BSA溶解于生理盐水中并与弗氏完全佐剂(Difco Laboratories)以1∶1进行乳化。在第0天将200μl含有30μg(＝0.53nmol)蛋白的乳液皮下(s.c.)注射。在第11天以不完全的弗氏佐剂中的生理盐水中的30μg蛋白进行第一次加强免疫。在第21天进行第二次加强免疫。在第30天将小鼠放血，将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
在第31天，以4.0×106cfu/小鼠通过静脉内注射感染每组14-15只小鼠以诱导脓毒性关节炎，或者以2.3×107cfu/小鼠诱导脓毒症。监测临床关节炎、重量变化和死亡率分别达11和15天。在脓毒性关节炎实验中测定肾脏中的细菌生长。
感染小鼠的临床评价
以不知情方式进行临床评价。目测检查每个肢体。检查产生0至3的评分(0是没有肿胀和红斑；1是轻微肿胀和/或红斑；2是中度肿胀和/或红斑；3是显著肿胀和/或红斑)。通过将动物的所有四肢的评分相加而获得关节炎指数。还通过测定全身性炎症的迹象即重量减轻、警戒性降低和皮毛发皱来检查每只小鼠的总体状况。在严重全身性感染的情况下，当判定某小鼠病得太严重以致于活不过24小时的时候，通过断颈法将其杀死并且认为是由于脓毒症而死亡的。
组织学检查
使用以前描述的方法(18)的修改(8)来进行关节的组织学检查。
感染的肾脏的细菌学检查
无菌分离肾脏、置于冰上、匀浆、在PBS中连续稀释并涂布于血液琼脂板上。在37℃温育24小时之后，测定每对肾脏的cfu数目。
血清IgG的测定
通过放射状免疫扩散技术(19)测定血清中的总IgG水平。山羊抗小鼠IgG和小鼠IgG标准物购自Southern Biotech，Birmingham，AL。
特异性抗体-ELISA
在第二次加强免疫之后9天从经免疫的小鼠获取血清样品。通过ELISA测定针对rClfA和rClfAPY的血清特异性抗体反应。以PBS中的5μg/ml的重组蛋白包被微板(96-孔；Nunc)。封闭试剂、血清样品、生物素化的抗体和ExtrAvidin-过氧化物酶均在PBS中稀释。根据以前的描述(8)进行该检验。所有的血清样品以1∶20000稀释，以405nm处的吸光度监测抗体反应。
在第二轮中，为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定，在数个血清稀释度中测定反应。因此，所有的血清样品以1∶5000、1∶20000、1∶80000和1∶320000稀释，以405nm处的吸光度监测抗体反应。
IL-6分析
根据以前描述的方法(20)检测血清IL-6。
统计学分析
使用Mann-Whitney U检验进行统计学评价。P＜0.05被认为是显著性的。除非另有指明，否则数据报告为中位数、四分位数间距和80％中间间距。
结果
ClfA与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸的替换阻碍了脓毒性关节炎
和脓毒症的发生
通过等位基因交换将已知为ClfA与纤维蛋白原结合必需的两个氨基酸(P336和Y338)改变以产生菌株Newman和LS1的突变体，其在细胞表面表达非纤维蛋白原结合性ClfA蛋白。通过Western印迹检测该蛋白的表达水平和完整性，证明了该突变蛋白在细菌表面表达良好并且表达的蛋白是正确的大小。
研究了Newman野生型和Newman clfA P336S Y338A(clfAPYI)引发脓毒性关节炎的能力。通过静脉内分别接种3.5×106至5.0×106的菌落形成单位(cfu)和3.2×106至6.0×106cfu的Newman野生型和clfAPYI突变体诱导脓毒性关节炎。对关节炎的发展临床研究7天。在整个实验期间，相比野生型菌株，clfAPYI突变体引发的关节炎严重性显著较低(P＞0.001，图1A)。在多数时间点，对于Newman clfAPYI，关节炎的频率较低(图6)。
出乎意料的是，ClfAPYI分子中的新的氨基酸组成似乎适合与宿主的抗细菌防御相互作用。为了检验这个可能性，制备了一种新的构建体，其中以不同的氨基酸来取代P336和Y338(clfA P336A Y338S：clfAPYII)。以3.9×106cfu的NewmanclfAPYII接种的小鼠产生的关节炎程度与clfAPYI突变体一样低(图1A)，并且具有相似的频率(图6)。这个结果强烈表明，纤维蛋白原结合的丧失促成关节炎水平的降低。
ClfA可能通过不涉及纤维蛋白原结合的机制参与关节炎的发生。为测试这个可能性，将缺少ClfA蛋白的ClfA删除突变体与表达修饰的非纤维蛋白原结合性ClfA蛋白的突变体进行比较。但是，以4.3×106至4.8×106cfu的clfA无效突变体感染的小鼠产生的关节炎与clfAPYI和clfAPYII突变体感染的小鼠在方式上没有差异(图1A)。关节炎的频率也是不可区分的(图6)。
还对感染的关节进行了组织学研究。在实验1和2中，相比野生型感染的小鼠，Newman clfAPYI感染的小鼠中的滑膜炎均显著较轻(分别为P＝0.02和0.001)。在Newman clfAPYI感染的样品中，几乎不存在骨破坏(骨破坏是人类脓毒性关节炎后遗症的主要诱因)(实验2，P＝0.001)。与Newman野生型感染的小鼠相比，Newman clfA无效突变体诱导的滑膜炎和骨破坏均较轻(分别为P＝0.003和0.006)，但是在某种程度上比Newman clfAPYI组严重，虽然不是很显著。
接下来分析了clfA突变对于感染过程造成的代谢后果。以Newman野生型菌株感染的小鼠在实验过程中体重下降了高达大约30％。以纤维蛋白原结合缺陷的突变体Newman clfAPYI和Newman clfAPYII感染的小鼠重量几乎没有任何减少(P＞0.0001相对于野生型)。相反，Newman clfA无效突变体对于重量损失具有中等效应，导致显著小于野生型菌株，但是显著高于clfAPYI和clfAPYII突变体菌株(在多数情况下P≤0.02，图1B)。
在感染的第7-8天分析了作为全身性炎症反应的度量的血清IL-6水平。IL-6的表达模式类似于重量变化。Newman野生型引发高水平的血清IL-6(4.8(2.8，5.7)ng/ml)，Newman clfAPYI突变体引发显著较低的IL-6(0.2(0.07，2.4)ng/ml，P＜0.0001)而Newman clfA无效突变体产生中等的反应(2.5(1.3，3.2)ng/ml)，其与野生型和clfAPYI突变体组均有显著差异(分别为P＝0.009和P＝0.008)(中位数，四分位数间距)。
与Newman clfAPY突变体和Newman clfA无效突变体这两者相比，在Newman野生型感染的小鼠中，肾脏中的细菌生长显著较高(分别为P＜0.0001，P＝0.011，和P＝0.005；图2)。相比于Newman clfAPYI-感染的小鼠，Newman clfA无效突变体-感染的小鼠的肾脏中的细菌生长显著较高(P＝0.0005，图2)。
在感染的第7-8天测定了小鼠血清中的总IgG。Newman clfAPYI-和NewmanclfA无效突变体-感染的两个组中的IgG水平的增加都显著低于以野生型菌株感染的小鼠(分别为3.1(1.2，4.9)；2.3(1.0，2.6)；和6.4(5.0，11.0)(中位数，四分位数间距)；P≤0.0003)。在两个突变体组之间没有显著性差异。
在Newman野生型感染的小鼠中死亡率是17％，在Newman clfAPYI和clfAPYII突变体组中是0％，在Newman clfA无效突变体组中是30％。在野生型和clfAPYI组之间以及在clfAPYI和clfA无效突变体组之间的死亡率存在显著性差异(分别为P＜0.05和P＜0.01)。
在感染了表达纤维蛋白原结合缺陷的ClfA的金黄色葡萄球菌的小鼠中，全身性炎症的直接和间接迹象似乎较低。出人意料的是，不表达ClfA的菌株都诱导了比表达ClfAPY突变体的菌株更强烈的全身性炎症。
通过增加金黄色葡萄球菌的接种剂量诱导了脓毒症。以5.2×107cfu的Newman野生型、5.1×107cfu的Newman clfAPYI突变体和3.3×107cfu的Newman clfA无效突变体注射小鼠。在5天内，所有的感染了野生型的小鼠都死亡，但是在注射10天后，10只注射了clfAPYI突变体的小鼠中仅有1只死亡(P＜0.0001，图3)。注射了clfA无效突变体的小鼠的生存时间也显著短于clfAPYI突变体感染的小鼠(P＜0.0001，图3)。在该实验中，以clfA无效突变体刺激的小鼠产生显著多于clfAPYI突变体组的关节炎，同时它们损失显著更多的重量(图7和8)。因此，通过与脓毒性关节炎实验中的全身性炎症的度量相类比发现，如果ClfA分子被表达，则小鼠的生存被延长，只要该ClfA分子没有纤维蛋白原结合性质。
将细菌注射进入关节
为了测定关节中的炎性反应是否依赖于纤维蛋白原结合，将Newman野生型、Newman clfAPYI或Newman clfA空白直接注射进入小鼠的膝关节，从而绕过全身性区室。3天之后通过组织学方法研究滑膜炎，包括关节腔的多形核渗透，以及骨破坏。小鼠在一个膝处接受2.4×104cfu的野生型、2.4×104cfu的clfA无效突变体或3.4×104cfu的clfAPYI突变体。对于感染了野生型的膝，关节腔内的滑膜炎和多形核渗透的组织学指数为0.25(0，3.0)，对于clfA无效突变体为2.38(0.25，3.0)，对于clfAPYI突变体为0.25(0，0.25)(中位数，四分位数间距)。对于野生型，骨破坏的组织学指数是0(0，1.0)，对于clfA无效突变体为1.0(0，1.0)，对于clfAPYI突变体为0(0，0)(中位数，四分位数间距；在clfAPYI突变体和clfA无效突变体之间P＝0.01)。由于clfAPYI突变体引发极少的滑膜炎和破坏，所以，虽然存在“给予小鼠的该菌株的量比其它菌株多40％”这一事实，但是仍然得出结论：ClfA促使的纤维蛋白原结合对于关节内的最大炎性反应是必需的。再次，相对于纤维蛋白原结合缺陷的ClfA突变体，ClfA表达的缺失增强了炎症。
菌株LS-1中的PY突变
为了确定ClfA与纤维蛋白原结合的能力是否影响其它金黄色葡萄球菌菌株的毒力，将clfAPYI、clfAPYII和clfA无效突变转导到表达TSST-1的金黄色葡萄球菌菌株LS-1。以9.4×106cfu的LS-1野生型、7.9×106cfu的LS-1 clfAPYI、10.7×106cfu的LS-1 clfAPYII或9.4×106cfu的LS-1 clfA无效突变体刺激小鼠。通过监测存活率来研究脓毒症。在16天之后，以野生型菌株刺激的小鼠只有40％是存活的，而以clfAPYI突变体和clfA无效突变体组刺激的小鼠有90％是存活的，以clfAPYII突变体感染的小鼠有80％是存活的(图4)。LS-1的clfAPYI突变体和clfA无效突变体的毒力显著较低(分别为P＝0.014、P＝0.05和P＝0.03)。
以重组ClfA蛋白进行免疫
在脓毒性关节炎模型和脓毒症模型中都研究了重组野生型ClfA A结构域蛋白(rClfA)和突变体ClfAPYI蛋白(rClfAPY)进行疫苗接种的效应。将小鼠致敏，然后以对照蛋白BSA、rClfA或rClfAPY进行两次加强免疫，然后以4.0×106cfu的金黄色葡萄球菌菌株Newman感染以诱导脓毒性关节炎，或者以2.3×107cfu的菌株Newman感染以诱导脓毒症。与对照小鼠相比，以rClfAPY(即ClfAPYI重组蛋白A结构域)进行的免疫对脓毒性死亡产生了显著性保护(P＝0.01，图5)，而rClfA免疫没有产生显著性保护。在细菌感染之前的1天，在rClfAPY免疫的小鼠中，对于rClfAPY和rClfA的特异性血清抗体反应(A405＝0.39(0.33，0.56)和0.71(0.52，0.81))比rClfA免疫的小鼠高得多(A405＝0.13(0.07，0.17)和0.15(0.10，0.24)，在两个对比中P＜0.0001(中位数，四分位数间距))。对照免疫的动物仅具有背景水平(A405nm＝0和0.01(0，0.01)(中位数，四分位数间距))。以较低的关节炎细菌剂量感染的免疫小鼠与其中诱导了脓毒症的小鼠产生了相似的针对rClfA和rClfAPY的抗体反应(数据未显示)。以rClfA和rClfAPY免疫均具有对于发生关节炎的保护，虽然这种保护不是显著性的(图9)。
在感染后第5至9天内，与对照小鼠相比，在rClfAPY和rClfA免疫的小鼠中重量损失显著减少(数据未显示)。
观察到在感染后第11天，以rClfAPY和rClfA免疫的小鼠的肾脏中细菌生长的减少趋势(BSA：38(3，436)；rClfAPY：7(2，17)；rClfA：10(7，54)×107cfu/对肾脏)。
为了获得不同免疫组中特异性抗体反应的更精确的测定，在数个血清稀释度(第二轮)中确定了反应。数据显示：在以脓毒性和关节炎细菌剂量感染的小鼠中，与来自rClfA野生型免疫的小鼠的血清相比，来自rClfAPY免疫小鼠的血清的特异性抗体对于rClfAPY和rClfA野生型抗原的效价都较高，这是因为，在所有的比较中，以rClfAPY免疫的小鼠的每个血清稀释度中按照吸光度测定的抗体反应都显著较高(P＜0.0001至P＝0.008，图12-15)。BSA免疫仅引发了背景抗体反应。
结论
结果强烈表明：ClfA-纤维蛋白原相互作用对于细菌毒力和疾病后果至关重要。在引起脓毒性死亡的能力方面，ClfA与纤维蛋白原结合的能力与增强的毒力相关。在所测的两个葡萄球菌菌株中，clfAPY突变体诱导的脓毒性死亡都低于野生型。同样，在感染了非纤维蛋白原结合性clfAPY突变体的小鼠中，关节炎的严重性显著降低。
纤维蛋白原-细菌细胞表面相互作用对于毒力的促进的一个可能机理是对于嗜中性粒细胞的吞噬作用的抑制(5)。嗜中性粒细胞对于金黄色葡萄球菌感染早期的宿主防御是至关重要的(13)。如果没有嗜中性粒细胞，血液和肾脏中的细菌生长将强烈扩大，关节炎的频率和死亡率增加。通过ClfA进行的纤维蛋白原介导的对于嗜中性粒细胞的吞噬作用的抑制可以至少部分解释野生型金黄色葡萄球菌相对于clfAPY突变体的更强烈的毒力。纤维蛋白原与ClfA的结合能够通过减少调理素沉积或通过减少嗜中性粒细胞受体与调理素的接触而降低嗜中性粒细胞的调理吞噬。备选地，结合的纤维蛋白原可能阻断未知的保护性宿主因子与金黄色葡萄球菌的结合。另一个可能是纤维蛋白原-ClfA相互作用促进细菌通过血管进入组织或促进在组织中的群集。
出人意料的是，我们的数据还表明，ClfA无效突变体比clfAPY突变体菌株的毒力更强。ClfA蛋白有可能在体内具有除了与纤维蛋白原相互作用之外的功能。如本研究所示，这种相互作用对于宿主而言显然是不利的。ClfA的其它功能至今不明，但是ClfA表现出来的非纤维蛋白原依赖性血小板的聚集可能导致循环中的大量金黄色葡萄球菌的捕获，进而通过网状内皮组织系统将细菌-血小板复合物清除。在野生型和clfAPY突变菌株中将容易地发生这种血小板聚集介导的葡萄球菌的清除，但是在clfA敲除体中则不会发生。虽然在野生型菌株中纤维蛋白原相互作用将掩盖其它事件，但是在clfAPY突变体中这样的细菌清除可能对于宿主是非常有益的。
clfA敲除突变体对于脓毒性死亡的保护程度与金黄色葡萄球菌菌株LS-1中的clfAPY突变体是相同的，但是在菌株Newman中保护较少，如果有所保护的话。ClfA表达对于细菌毒力的总体影响在不同的金黄色葡萄球菌菌株之间可以是不同的，这取决于其它毒力因子的表达水平和存在。
考虑到在发炎的滑液中纤维蛋白原和纤维蛋白含量丰富，关于“clfAPY突变体在关节腔中是否显示出同样的或较低的毒力”的问题是有一定的重要意义的。我们的数据表明，clfAPY突变体对于软骨和骨的破坏性较低。
重组ClfA A结构域非纤维蛋白原结合性P336Y338突变体的保护效应比野生型rClfA更高。以ClfAPY进行免疫非常可能诱导更好的免疫反应，因为针对免疫原和野生型ClfA蛋白均引发了更高的特异性抗体反应。更重要的是，其比野生型ClfA诱导产生更大的抵抗脓毒性死亡的保护性免疫反应。
总之，我们的结果表明rClfAPY是比野生型重组ClfA更好的候选疫苗。我们假设：由于ClfA分子中的重要表位的掩藏，所以在免疫期间野生型ClfA蛋白与纤维蛋白原的结合降低了抗原呈递，因此破坏了特异性抗体的产生。
实施例2
包含N2和N3的rClfA A区域截短物(rClfA 221-559)
材料和方法
在本实施例中沿用实施例1中所示的程序，其中使用了
-rClfA 221-559(即包含对应于氨基酸220-559的N2和N3的ClfA A区域截短物)
-rClfAPY221-559；和
-BSA。
每组有15只雌性NMRI小鼠，在实验开始时其为8周龄。在本实施例中，用于免疫的构建体为ClfA野生型/原态N2N3截短物、具有如实施例1中定义的突变PY的ClfA N2N3截短物。BSA用作对照。
以野生型和突变体重组ClfA进行疫苗接种
根据实施例1的程序以rClfA 221-559、rClfAPY 221-559或BSA对小鼠进行免疫。
将纯化的rClfA221-559、rClfAPY221-559(即ClfAPYI重组蛋白A亚结构域N2和N3)或BSA溶解于PBS中并与弗氏完全佐剂以1∶1进行乳化。在第0天将200μl含有30μg(＝0.79nmol)蛋白的乳液通过皮下注射。在第12天以不完全的弗氏佐剂中的生理盐水中的30μg蛋白进行第一次加强免疫。在第22天进行第二次加强免疫。在第31天将小鼠放血，将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
特异性抗体-ELISA
在第二次加强免疫之后9天从免疫小鼠获取血清样品。通过ELISA测定针对rClfA221-559和rClfAPY221-559的血清特异性抗体反应。以PBS中的5μg/ml的重组蛋白包被微板(96-孔；Nunc)。封闭试剂、血清样品、生物素化的抗体和ExtrAvidin-过氧化物酶均在PBS中稀释。根据以前的描述(8)进行该检验。所有的血清样品以1∶5000、1∶20000、1∶80000和1∶320000进行稀释，以405nm处的吸光度监测抗体反应。
结果
特异性抗体反应
按照实施例1，以4个不同的血清稀释度在ELISA检验中通过吸光度测定抗体反应。获得的数据与实施例1中的数据非常相似。
发现相对于以原态rClfA221-599进行的免疫，以rClfAPY221-559进行的免疫非常可能产生较高效价的针对原态rClfA221-559和rClfAPY221-559的特异性抗体，因为除了一个以外，在所有的对比中，在每个血清稀释度，以rClfAPY221-559进行免疫的小鼠都具有显著较高的以吸光度测定的抗体反应(P＝0.001至0.025，见图16和17)。BSA免疫仅引发背景水平的抗体反应。
结论
我们发现，以rClfAPY221-559蛋白进行的免疫产生的针对免疫原和野生型ClfA蛋白的抗体反应都显著高于以原态蛋白进行的免疫。
基于这些发现，我们得出结论：无论是实施例1中的包含氨基酸40-550的还是实施例2中包含氨基酸221至559的PY蛋白，以PY-免疫都引发比相应大小的原态ClfA进行的免疫更好的免疫反应。
实施例3
ClfA A区域截短物(δ/Δ锁闭截短物)
材料和方法
在本实施例中沿用实施例1中所示的程序，其中使用了以下构建体
-rClfA 221-531(即包含N2和N3氨基酸220-559但不含锁闭肽氨基酸532-538和随后的富含脯氨酸残基的rClfA A区域截短物)。
每组有15只雌性NMRI小鼠，在实验开始时其为8周龄。在本实施例中，使用上述构建体用于免疫。根据实施例1中的程序以上述截短物免疫小鼠。
以野生型和突变体重组ClfA进行疫苗接种
将纯化的rClfA221-531溶解于PBS中并与弗氏完全佐剂以1∶1进行乳化。在第0天将200μl含有0.79nmol蛋白的乳液通过皮下注射。在第12天以不完全弗氏佐剂中的生理盐水中的0.79nmol蛋白进行第一次加强免疫。在第22天进行第二次加强免疫。在第31天将小鼠放血，将血清冷冻用于后续的抗体反应分析。
特异性抗体-ELISA
在第二次加强免疫之后9天从免疫小鼠获取血清样品。通过ELISA测定特异性抗体的血清水平。以4.6μg/ml的rClfA221-531蛋白包被微板(96-孔；Nunc)，所述蛋白量与实施例1和2中的5μg/ml的rClfA221-559和rClfAPY221-559是等摩尔量的。封闭试剂、血清样品、生物素化的抗体和ExtrAvidin-过氧化物酶均在PBS中稀释。根据以前的描述(8)进行该检验。所有的血清样品以1∶5000、1∶20000、1∶80000和1∶320000进行稀释，以405nm处的吸光度监测抗体反应。
结果
按照实施例1，以ELISA-检验中的吸光度测定抗体反应。发现以rClfA221-531进行的免疫产生免疫反应，如特异性抗体反应所测(图18)。
结论
我们发现，rClfA221-531作为免疫原发生作用，因为该抗原引发特异性抗体反应。
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Claims (30)
1.与其宿主配体的结合减少的重组葡萄球菌MSCRAMM蛋白或MSCRAMM样蛋白或其片段，其包含至少一部分配体结合区域，用于治疗。
2.权利要求1的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其具有减少的或不具有与其宿主配体非共价结合的能力，用于治疗。
3.权利要求2的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其中MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白与其配体通过坞、锁和锁闭发生的非共价结合被减少或阻止。
4.权利要求1-3任一项的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，其中所述配体是血红素、血红蛋白、胶原或纤维蛋白原。
5.权利要求1-4任一项的重组MSCRAMM蛋白或MSCRAMM样蛋白或其片段，其为：
a.纤维蛋白原结合蛋白；
b.SdrD、SdrE、SdrG、SdrF；或
c.IsdB和/或IsdH。
6.权利要求5的重组纤维蛋白原结合蛋白或其包含至少一部分纤维蛋白原结合区域的片段，具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合的能力。
7.权利要求6的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含两个形成疏水袋的DeV-IgG结构域，其中：
两个Dev-IgG结构域之间形成的疏水袋被改变以减少或阻止纤维蛋白原结合；或
纤维蛋白原结合蛋白包含覆盖疏水沟中的纤维蛋白原的锁闭肽并且所述锁闭肽被改变或删除以减少或阻止纤维蛋白原结合。
8.权利要求5至7任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述纤维蛋白原结合蛋白仅包含纤维蛋白原结合区域或其片段。
9.权利要求5至8任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其源自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和/或路邓葡萄球菌。
10.权利要求5至9任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述纤维蛋白原结合蛋白选自下列中的一项：
a.FbI、SdrF和/或SdrG；
b.纤维蛋白原结合蛋白聚集因子A(ClfA)和/或纤维蛋白原结合蛋白聚集因子B(ClfB)；
c.IsdA；或
d.FnBPA和/或FnBPB。
11.权利要求5至10任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其在纤维蛋白原结合区域中包含至少一个核苷酸或氨基酸残基的取代、插入、删除或添加以产生没有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合蛋白。
12.权利要求11的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含纤维蛋白原结合蛋白的纤维蛋白原结合区域A，其中核苷酸或氨基酸的取代、插入、删除或添加降低与纤维蛋白原的非共价相互作用，优选通过阻止或减少配体与疏水袋的结合，所述疏水袋分隔纤维蛋白原结合蛋白的区域A的亚区域N2和N3。
13.权利要求5至12任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含不具有锁闭肽氨基酸残基的纤维蛋白原结合区域，从而产生具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合能力的重组纤维蛋白原结合蛋白。
14.权利要求5至13任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述重组蛋白是ClfA。
15.权利要求14的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中ClfA A纤维蛋白原结合区域(区域A)的疏水性残基发生至少一个或多个核酸或氨基酸的取代、插入、删除或添加。
16.权利要求14或15的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中氨基酸残基Ala254、Tyr256、Pro336、Tyr338、Ile387、Lys389、Glu526和/或Val527被Ala或Ser取代。
17.权利要求14至16任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中ClfA纤维蛋白原结合区域(区域A)的残基P336和/或Y338被丝氨酸或丙氨酸取代以产生rClfAP336S Y338A或rClfAP336A Y338S。
18.权利要求14至17任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中重组葡萄球菌纤维蛋白原结合蛋白具有根据任意SEQ ID NO：1至3的氨基酸序列或其片段，其中残基P336和/或Y338被丝氨酸和/或丙氨酸取代。
19.权利要求14至18任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含纤维蛋白原结合蛋白、纤维蛋白原结合区域、最小纤维蛋白原结合区域和/或其片段。
20.权利要求14至19任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其中所述片段包含至少一部分纤维蛋白原结合区域以产生具有减少的或不具有与纤维蛋白原非共价结合能力的纤维蛋白原结合蛋白的重组片段。
21.权利要求14至20任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含：
a.亚区域N123，跨越纤维蛋白原结合区域(区域A)的氨基酸残基40-559；
b.亚区域N23，跨越ClfA纤维蛋白原结合区域(区域A)的氨基酸残基221-559；和/或
c.纤维蛋白原结合区域(区域A)的氨基酸残基221-531。
22.权利要求14至21任一项的重组纤维蛋白原结合蛋白，其包含根据任意SEQ ID NO：4-14的氨基酸序列。
23.根据前述权利要求任一项的重组MSCRAMM或MSCRAMM样蛋白或其片段，用于治疗或预防微生物感染，包括脓毒症、脓毒性关节炎和/或心内膜炎，优选是由葡萄球菌引起的。
24.权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段在制备用于治疗或预防微生物感染的药物中的用途，所述微生物感染优选由葡萄球菌引起。
25.一种在个体中诱导免疫反应的方法，包括给予所述个体根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段。
26.一种治疗患有微生物感染的患者的方法，包括以根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段或者包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的疫苗治疗所述患者，从而治疗所述微生物感染。
27.表达根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的核酸构建体、表达载体或宿主细胞。
28.包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段的疫苗。
29.针对根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段产生的抗体，优选为超免疫血清的形式。
30.包含根据权利要求1至22任一项的重组蛋白或其片段以及药学上可接受的佐剂的免疫原性药物组合物。
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