CN104292321A - 新的半乳凝素9 突变体蛋白质及其用途 - Google Patents

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Abstract

以大肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素9表明通过对肿瘤细胞的直接作用(诱导肿瘤细胞的细胞间粘附与凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，具有抑制癌的转移和诱导萎缩，而且对非活化淋巴细胞没有作用，诱导活化T细胞、特别是成为过剩免疫反应原因的CD4阳性T细胞的凋亡，以及对与风湿病中关节的变形等有关的滑膜细胞具有很强的诱导凋亡能力，重组体半乳凝素9由于连接两个CRD的连接区对蛋白水解酶的敏感性提高，所以非常容易被酶消化，丧失上述活性，为了进一步研究需要更稳定型的分子。通过改变连接半乳凝素9的两个CRD的连接区，可得到避免对上述活性造成恶影响，而且稳定性提高的改变分子。

Description

新的半乳凝素9 突变体蛋白质及其用途
本申请是申请号200580010446.1，申请日2005年3月29日同名申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及到新型半乳凝素9突变体(突变体)蛋白质及其用途。本发明特别涉及到连接区域被改变的半乳凝素9以及利用该半乳凝素9的生物化学、临床检查、医疗以及药物应用技术。
背景技术
特定的糖链和与之结合的蛋白质表现出在哺乳动物的生物体内伴随生理现象以及进化·成长的现象，以及在各种各样疾病等中起到多种多样作用和功能的证据正在被人们发现。人们发现在生物体中存在着特异识别带有β－半乳糖苷结构的糖链的动物凝集素，作为这样的凝集素类的半乳凝素，目前至少有14种基因被鉴定。半乳凝素家族根据其结构分为三个亚类、即原型(prototype)、嵌合型(chimera)、以及串联重复型(tandem repeat)、它们在生物体内的功能几乎不清楚。特别是有关具有两个糖链识别结构域的串联重复型半乳凝素，由于研究的历史短，作为它的靶的生物体内糖链(受体)还不清楚，所以其功能没有阐明。可是，根据对识别细胞表面的复杂的糖链的蛋白质进行探索发现等的经过，预想半乳凝素具有与细胞的粘附、细胞间的信息传递、细胞的活化等有关的功能，而引人注目。另外除了这样的功能之外，预想还具有其它重要的各种各样功能的那样的研究成果也正在获得。
作为串联重复型半乳凝素之一的半乳凝素9在人中，最初是作为霍奇金病患者的自身抗原(autoantigen)被鉴定的(非专利文献1和2)，人们想像它是否在免疫细胞间的相互作用中起着重要的作用。小鼠的半乳凝素9可以通过使用以被认为在半乳凝素类的糖链识别结构域中保守性高的序列为基础设计的简并引物的5'-RACE PCR，从小鼠肾脏的cDNA文库克隆(非专利文献3)。人们发现用抗原刺激的人T细胞在体内和体外产生作为嗜酸性细胞趋化因子的ecalectin，而且该ecalectin与目前已知的其它嗜酸性细胞趋化因子类虽然结构上不同，但也可以归属于半乳凝素家族，具有对带有β－半乳糖苷结构的糖链的结合亲和性。从来自于人T细胞的白血病细胞株得到的mRNA成功地克隆了ecalectin，结果确认ecalectin是半乳凝素9的变异体之一，半乳凝素9与ecalectin是同一物质(非专利文献4)。
作为野生型半乳凝素9，现在已报告了L型半乳凝素9(galectin-9long isoform or long type galectin-9:Gal-9L)、M型半乳凝素9(galectin-9medium isoform or medium type galectin-9:Gal-9M)以及S型半乳凝素9(galectin-9short isoform or short typegalectin-9:Gal-9S)。无论那一种半乳凝素9都由两个糖链识别部位(糖识别结构域,carbohydrate recognition domain:CRD)和连接两个部位的连接肽区构成，已知L型半乳凝素9含有最长的连接肽区，通过该连接肽区，N端结构域(NCRD)和C端结构域(CCRD)被连接在一起，而S型半乳凝素9含有最短的连接肽区，M型半乳凝素9含有介于两者之间长度的连接肽区，发现通常存在于比前二者更广的生物体内组织或细胞中。另外在由人细胞或组织克隆的半乳凝素9基因之间也可以看到表示遗传多态现象的存在的证据。
野生型半乳凝素9由二个糖识别部位(CRD)和连接两个部位的连接区构成，以大肠杆菌作为宿主生产的重组体半乳凝素9表明通过对肿瘤细胞的直接作用(诱导肿瘤细胞的细胞间粘附和凋亡的活性)和借助于免疫系统的作用，抑制癌转移和诱导萎缩。另外半乳凝素9不作用于非活化淋巴细胞，而诱导活化T细胞、特别是诱导成为过度免疫反应原因的CD4阳性T细胞的凋亡也已阐明。另外也阐明了对与风湿病中关节变形等有关的滑膜细胞具有很强的诱导凋亡能力。
【非专利文献1】Sahin,U.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,11810-11813(1995)
【非专利文献2】Tureci,O.et al.,J.Biol.Chem.,272(10),6416-6422(1997)
【非专利文献3】Wada,J.et al.,J.Biol.Chem.,272(9),6078-6086(1997)
【非专利文献4】Matsumoto,R.et al.,J.Biol.Chem.,273(27),16976-16984(1998)
发明内容
通过利用这样的半乳凝素9的多方面的作用，预期可治疗癌、难治的自身免疫疾患(包括风湿病)、变态性疾患等。然而重组体半乳凝素9由于连接两个CRD的连接区对蛋白水解酶敏感性高，非常容易被酶消化，丧失上述活性。
本发明者等进行了专心研究，结果通过对一方面保持半乳凝素9具有的糖链识别活性，一方面对蛋白水解酶表现出更稳定的分子结构进行探索，改变半乳凝素9的连接两个CRD的连接区，成功地获得了避免对上述那样的活性带来坏影响，稳定性提高的改变分子，完成了本发明。
本发明提供以下内容。
(1)蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素9或与其具有基本上同等活性的蛋白质的连接肽或其附近的区域被改变。
(2)上述(1)所述的蛋白质或其盐，其特征是：由在半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，与半乳凝素9比较，至少对于连接肽的分解敏感性被改变。
(3)上述(1)或(2)所述的蛋白质或其盐，其特征是：基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质与半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70％以上同源性。
(4)上述(1)～(3)中任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：(1)具有半乳凝素9的N末端侧的糖链识别区域(NCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽与(2)具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域(CCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)在半乳凝素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。
(5)上述(1)～(4)任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：(1)具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列3所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～8个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽和(2)具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或与它具有基本上同等活性，且具有与序列4所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～21个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽借助于(3)在序列7～9中任一个序列表示的氨基酸序列中缺失(但是，序列7中的1～32以及1～44的缺失、和序列8中1～12的缺失除外)、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接。
(6)一种核酸，其特征是具有编码上述(1)～(5)任一项所述的蛋白质的碱基序列。
(7)上述(6)所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
(8)上述(6)或(7)所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
(9)一种重组载体，其特征是含有上述(6)～(8)任一项所述的核酸。
(10)上述(9)所述的重组载体，其特征是除了含有上述(6)～(8)任一项所述的核酸外，还含有编码标记蛋白质和/或肽的碱基序列。
(11)一种转化体，其特征是含有上述(6)～(8)任一项所述的核酸或上述(9)或(10)所述的重组载体。
(12)上述(11)所述的转化体，其特征是：转化体宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
(13)一种药物，其特征是：作为有效成分含有从上述(1)～(5)中任一项所述的蛋白质、上述(6)～(8)中任一项所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重组载体和上述(11)或12所述的转化体中选择的成分。
(14)上述(13)所述的药物，其特征是免疫调节剂。
(15)上述(13)所述的药物，其特征是抗肿瘤药。
(16)上述(15)所述的药物，其特征是抗来自于包含脑肿瘤(多形性恶性胶质瘤等)、脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮瘤、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性淋巴肉芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质瘤等癌和肉瘤的肿瘤的抗肿瘤药。
(17)上述(13)所述的药物，其特征是该药物是针对下面疾患或疾病、或病的症状的药物：
(A)炎症性疾患，来自于在各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免疫性炎症、感染症等中的疾病；
(B)急性和慢性疾患，来自于包括支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺炎、细支气管炎、急性纵隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心内膜炎、心肌炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、虫垂炎、缺血性大肠炎、药物性大肠炎、直肠炎在内的肺以外的其它脏器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重症肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬变、胆囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性肾炎、膜性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症、各种膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角膜炎、干性角结膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎在内的炎症等疾病；
(C)来自于神经性炎症(例如、神经性胃炎、神经性膀胱炎等)、癌或伴随炎症疼痛的疾病；
(D)变态性炎症疾患，全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻炎、变态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等在内的疾病；
(E)自身免疫性的炎症(自身免疫疾患)，来自于全身性(慢性关节风湿病、全身性红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎·皮肤肌炎、肖格伦综合征(Sjogren syndrome)、贝切特病(Behcet’s syndrome)等)、神经系(多发性硬化症、重症肌无力症、HAM(HTLV-1脊髓症)、肌萎缩性侧索硬化症等)、内分泌性(巴泽多病、桥本病、1型糖尿病等)、血液(特发性血小板减少性紫斑病、自身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等)、呼吸器(结节病、肺纤维症等)、消化管(溃疡性大肠炎、克罗恩病等)、肝脏(自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎等)、肾·尿路系(抗嗜中性白细胞细胞质抗体相关肾炎、血管炎、肺肾综合征(Goodpasture)、抗丝球体基底膜抗体病等)等疾病；
(F)感染症，由于病原体伤害生物体的细胞·组织·脏器产生的疾患、或起因于给人带来感染症的病原体的疾患，病原体来自于1)细菌(包括螺旋体、衣原体、立克次体)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻类)、5)原虫、6)寄生虫(吸虫、条虫、线虫)、7)节足动物，包括细菌性感染症(霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等)、螺旋体感染症(钩端螺旋体病等)、衣原体感染症(鹦鹉病等)、立克次体感染症(斑疹伤寒、破伤风等)、病毒性感染症(带状疱疹、病毒性出血热、狂犬病等)、真菌症(念珠菌病、隐球菌病、曲霉菌病等)、原虫性疾患(阿米巴性痢疾、疟疾、弓形体病等)、寄生虫(吸虫症、线虫症等)、此外还包括支原体感染症(支原体肺炎等)、分支杆菌感染症(结核、非定型抗酸菌症等)疾病；
(G)皮肤科领域的疾患，i)皮肤感染症、包括变态性炎症和自身免疫性炎症等在内的皮炎症，干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等具有特有炎症的皮肤疾患、ii)来自于由于美容皮肤科相关的损伤或老化，与a)黑色素代谢调节(美白)、b)毛发成长(生发)的调节、c)胶原产生调节有关的皮肤科领域的疾患(包括老化)；
(H)生活习惯病，来自于包括高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等在内的疾病；
(I)有关正常细菌丛的维持的异常；
(J)来自于包括淀粉样变性、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等在内的疾病；
(K)脑、神经领域中的炎症反应，例如伴随着脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进展出现的炎症、综合失调症；
(L)痛风；
(M)骨质疏松症；或
(N)间质性肺炎。
(18)分析或检查试剂，特征是作为有效成分含有选自于上述(1)～(5)中任一项所述的蛋白质、上述(6)～(8)中任一项所述的核酸、上述(9)或(10)所述的重组载体以及上述(11)或(12)所述的转化体的成分。
发明的效果
就半乳凝素9得到的半乳凝素9突变体由于与野生型比较对蛋白水解酶稳定，可在半乳凝素9具有的生物体内功能的阐明中利用，可在对半乳凝素9在肿瘤化细胞的调控、免疫调节、以及变态性和炎症的控制等各种各样的生物体反应的调控·调节中起到的功能·活性进行的研究中使用。另外，该半乳凝素9突变体及其相关物质有望用作临床应用、分子生物学应用、生物化学应用、医学应用中的试药和活性剂。
本发明的另外的目的、特征、优点以及其它观点通过以下叙述同行人就都明白了。然而，包括以下的记载以及具体的实施例等记载在内的本件说明书的记载是表示本发明的理想方式，希望理解为只是为了说明给出的。在本说明书公布的本发明的意图以及范围内进行的各种变化和/或改变(或修饰)通过以下记载以及本说明书的其它部分的知识对于业内人士容易明白。本说明书中引用的所有专利文献和参考文献是为了说明的目的引用，这些文献作为本说明书的一部分，其内容应当解释为包括在说明书中。
附图说明
图1表示半乳凝素9突变体(G9NC(null))表达载体的构建方法。
图2表示半乳凝素9突变体(G9NC(null))表达物以及纯化处理物的电泳照片。
图3表示比较野生型半乳凝素9(G9(M))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间对蛋白水解酶的耐性的结果。对于纯化标准品，存在的大肠杆菌蛋白水解酶的耐性进行了研究。图表示电泳照片。
图4表示比较野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间对蛋白水解酶的耐性的结果。研究了对基质金属蛋白水解酶-3(MMP-3)的耐性。图表示电泳照片。
图5表示比较野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间对蛋白水解酶的耐性的结果。研究了对弹性蛋白酶(弹性蛋白酶)的耐性。图表示电泳照片。
图6表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间对生物活性进行比较的结果。研究了对MOLT-4细胞的凋亡诱导活性(DNA梯形成)。图表示电泳照片。
图7表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间对生物活性进行比较的结果。研究了对外周血嗜酸细胞的ECA活性。
图8表示对半乳凝素9EST克隆进行BLAST序列检索，对来自不同源的各克隆序列进行比较的结果。通过检索，各克隆表现出97－99％的同源性(同一性)。在5,88,135,238,281位置表现出变异。
图9表示酵母多糖诱发胸膜炎，但就单独半乳凝素9突变体(h-gal9NC(null))来说，不诱发炎症。
图10表示对半乳凝素9突变体(h-gal9NC(null))在酵母多糖诱导胸膜炎模型中的效果进行研究的结果。
图11表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在PMA诱导皮炎(类固醇敏感性模型)中的效果进行研究的结果。
图12表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在花生四烯酸诱导皮炎(类固醇非敏感性模型)中的效果进行研究的结果。
图13表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在辣椒辣素诱导皮炎模型中的效果进行研究的结果。
图14表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在DNFB诱导接触皮炎模型中的效果进行研究的结果。
图15表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在DNFB诱导接触皮炎模型中的效果进行研究的结果。
图16表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))在FITC诱导特应性皮炎模型中的效果进行研究的结果。
图17表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))对于荨麻疹模型的效果进行研究的结果。
图18表示对半乳凝素9突变体(Gal-9＝G9NC(null))对于荨麻疹模型的效果进行研究的结果。
图19表示对半乳凝素9突变体(h-gal9NC(null))对于关节炎模型的效果进行研究的结果。
图20表示半乳凝素9突变体在皮下移植模型中的抑制肿瘤细胞增殖效果、即表示抗肿瘤活性(抗癌效果)测定的结果。上段为对照组，下段为半乳凝素9突变体注入组(直至5周什么样的肿瘤都没可见)。
图21是半乳凝素9突变体在皮下移植模型中的抑制肿瘤细胞增殖效果、即表示抗肿瘤活性(抗癌效果)测定的结果，给出了组织病理解析的组织照片。表示给予LLC+半乳凝素9突变体(Gal9)(下段)时5周的皮肤。肉眼看为白色调。
图22表示半乳凝素9突变体(稳定化半乳凝素9)在培养肿瘤细胞(Meth A细胞,24h)中诱导凋亡(细胞损伤活性)的结果。
图23表示半乳凝素9突变体(稳定化半乳凝素9)在培养肿瘤细胞(B16/F10细胞,24h)中诱导凋亡(细胞损伤活性)的结果。
图24是动物的存活曲线，表示在由Meth A细胞引起的癌性腹膜炎模型中，半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。
图25表示在由Meth A细胞引起的癌性腹膜炎模型中，未给予半乳凝素9突变体(Gal9)组(上段)给予组(下段)中小鼠的状态的照片。
图26为动物的生存曲线，表示在由B16/F10细胞引起的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。
图27对比半乳凝素9突变体(Gal-9)给予组と非给予组中由B16/F10细胞(黑素瘤)引起的癌性腹膜炎模型小鼠的状态，内脏组织(第14天)的照片。
图28表示研究半乳凝素9突变体(稳定化半乳凝素9)影响免疫细胞的结果。是B16/F10腹腔内浸润细胞(24h)的解析结果。
图29表示使用半乳凝素9突变体(稳定化半乳凝素9)进行的抑制粘附实验的结果。是B16/F10细胞(1h)的解析结果。图中、Collagentype I表示I型胶原、Collagen type IV表示IV型胶原、Laminin表示层粘连蛋白、Fibronectin表示纤连蛋白、Vitronectin表示玻连蛋白。
图30表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原诱发哮喘模型中的作用效果进行测定的结果。
图31表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在壁虱抗原诱发哮喘模型中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
图32表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)在壁虱抗原诱发哮喘模型中的作用效果进行测定的结果(支气管周围组织的照片)。
图33表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA诱发哮喘模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果。
图34表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在OVA诱发哮喘模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
图35表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)影响OVA诱发哮喘模型(豚鼠)中的即时型哮喘(IAR)·延迟型哮喘(LAR)的作用。
图36表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)在OVA诱发哮喘模型(豚鼠)中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。。
图37表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)在自身免疫性溶血性贫血模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果(血细胞比容(％))。
图38表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在阿蒂斯(Arthus)反应(血管炎)模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果。
图39表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果。
图40表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)和地塞米松(Dex.)在ARDS模型(小鼠)中的作用效果进行测定的结果。给出了存在于BALF中的各细胞数。
图41表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)在辣椒辣素诱导炎症模型中的作用效果进行测定的结果。
图42表示对半乳凝素9突变体(Gal-9)影响破骨细胞形成的效果进行试验的结果。表明有抑制效果。
图43表示对通过半乳凝素9突变体(gal-9)刺激产生的单细胞的凋亡诱导(M-CSF存在下)进行试验的结果。
图44表示对通过半乳凝素9突变体(gal-9)刺激对人成骨细胞增殖影响的效果进行试验的结果。
图45表示对通过半乳凝素9突变体(Galectin-9)刺激(8hr)影响人成骨细胞分化标志的表达的效果进行试验的结果。
图46表示存活率，对半乳凝素9突变体对间质性肺炎模型的作用进行试验的结果。
图47表示对半乳凝素9突变体对间质性肺炎模型的作用进行试验的结果。给出了存活14天例的肺组织(HE染色、照片)。
图48是动物的生存曲线，表示在LLC细胞(凋亡(+))导致的癌性腹膜炎模型中，半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。
图49表示使用B16/F10细胞，研究半乳凝素9突变体对癌转移模型的作用的结果(模型动物的肺外观)。
图50表示使用B16/F10细胞，研究半乳凝素9突变体(G9NC(null))对癌转移模型的作用的结果(对肺的结节数进行计数的结果)。
图51表示对半乳凝素9突变体(gal-9)(静脉内(i.v.)注射)在角叉菜胶诱发炎症模型中的作用效果进行测定的结果。
图52为了比较给出了对作为阳性对照的地塞米松(Dex.)在角叉菜胶诱发炎症模型中的作用效果进行测定的结果。
图53表示使用免疫组织染色对半乳凝素在风湿病(RA)关节滑膜中的表达进行研究的结果。
图54表示对半乳凝素对风湿病(RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究的光学显微镜观察的结果。
图55表示用PI法对半乳凝素对风湿病(RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究的结果。
图56表示对半乳凝素对风湿病(RA)滑膜细胞凋亡的诱导活性进行研究的结果。
图57表示对半乳凝素对风湿病(RA)滑膜细胞增殖的抑制活性进行研究的结果。
图58表示对半乳凝素-9突变体在佐剂性关节炎模型中的作用(抑制由于机械刺激引起的疼痛)进行研究的结果。
图59为了比较给出了在佐剂性关节炎模型中的作用(抑制由于机械刺激引起的疼痛)进行研究的结果(作为阳性对照的吲哚美辛的作用)。
图60表示对半乳凝素-9突变体在角叉菜胶诱发急性炎症模型中的作用(抑制机械刺激产生的疼痛)进行研究的结果。
图61为了比较给出了在角叉菜胶诱发急性炎症模型中的作用(抑制由于机械刺激引起的疼痛)进行研究的结果(作为阳性对照的地塞米松的作用)。
图62表示对半乳凝素-9突变体在人关节液中的稳定性进行研究的结果(SDS-PAGE)。
图63表示对半乳凝素-9突变体(稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型(抗体混合物引起的模型)中的作用进行研究的结果(i.v.注入)。
图64表示半乳凝素-9突变体(稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型(胶原关节炎模型)中的作用进行研究的结果(i.p.注入)。
图65表示半乳凝素-9突变体(稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型(胶原关节炎模型)中的作用进行研究的结果(i.v.注入)。
图66表示半乳凝素-9突变体(稳定化半乳凝素-9)在关节炎模型中的作用进行研究的结果(i.v.注入)。
图67为了比较给出了对在佐剂性关节炎模型中的作用进行研究的结果(阳性对照的吲哚美辛的作用)。
图68表示对半乳凝素-9突变体在大鼠CIA(胶原致敏)模型中的作用进行研究的结果(i.v.注入)。
具体实施方式
参考到目前为止公开发表的研究和相关的专利申请，其内容都包括在本说明书的内容中。
所谓「半乳凝素9突变体」指的是提供对半乳凝素9的糖链识别部位含有的特定糖链特异结合的活性或与此类似的活性(本活性中包括定性的活性和/或定量的活性)的物质。半乳凝素9对特定细胞具有凋亡诱导活性，而本半乳凝素9突变体可以是具有野生型半乳凝素9具有的凋亡诱导活性或具有与它类似的活性的突变体，也可以是半乳凝素9具有的生物活性被改变或修饰的突变体，对于某些场合更理想。所谓本发明中特别理想的半乳凝素9突变体指的是作为具有生物活性的试药，在临床检查领域、分析领域、或医学或药物等领域中，表现出比野生型半乳凝素9更好的性质。
半乳凝素9突变体，例如可以是半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域被改变的蛋白质或其盐、由在半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成，与半乳凝素9比较，实施了至少对于连接肽的分解敏感性被改变的改变的蛋白质或其盐、可以是基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质，而且与半乳凝素9的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的蛋白质或其盐、也可以是(1)半乳凝素9的N末端侧的糖链识别领域(NCRD)或与其具有基本上同等活性的多肽与(2)具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域(CCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽借助于(3)半在乳凝集素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽连接的蛋白质或其盐等。
可是，半乳凝素9是在J.Biol.Chem.,272(10):pp.6416-6422(1997)报告中在由恶性淋巴肉芽肿病患者的脾脏制备的cDNA中发现了新的半乳凝素，将该半乳凝素取名为半乳凝素9，同时为了避开恶性淋巴肉芽肿病肿瘤中的序列变异，通过正常人的外周血调制的cDNA进行了序列的再确认，最终决定了半乳凝素9的序列，该序列表示在该文献的第6418页的FIG.1。另外关于半乳凝素9进一步在J.Biol.Chem.,273(27):pp.16976-16984(1998)中报道了从由生产嗜酸性细胞趋化因子的T细胞株、STO-2制备的cDNA分离了趋化因子Ecalectin(ecalectin)，该因子虽然与先前报告的上述半乳凝素9的同源性高，可是在氨基酸序列位置中看到第5,88,135,238,281位的氨基酸不同，ecalectin序列记载在该文献的第16983页的Fig.8，而且进一步推测ecalectin为半乳凝素9的变异体。
另外在J.Biol.Chem.,275(12):pp.8355-8360(2000)中报道了从由Jurkat T-cell制备的cDNA分离半乳凝素9，制作重组(重组)蛋白质，由于该半乳凝素9重组蛋白质表现出嗜酸性细胞趋化活性，所以平島等人决定将带有来自于Jurkat T-cell的序列的半乳凝素9在今后研究中使用，其中在氨基酸序列位置中的第5,88,135,238,281位的氨基酸分别适用Gly,Lys,Ser,Pro,Glu，上述的松本等人(J.Biol.Chem.,273(27):pp.16976-16984(1998))报告的ecalectin虽然第5位的氨基酸在Ser和Gly这一点上不同，但在嗜酸性细胞趋化活性上没有差异，另外，即使对17个登录在EST数据库的半乳凝素9的序列(包括部分序列)进行查询，认为对于第5,88,135,238,281位的氨基酸分别适用Gly,Lys,Ser,Pro,Glu妥当，半乳凝素9的变异被记载在该文献的第8359页的Table II(参照图8)。图8中，Gly(G),Lys(K),Ser(S),Pro(P),Glu(E)。
在J.Biol.Chem.,272(9):pp.6078-6086(1997)(非专利文献3)中根据氨基酸序列的类似性决定了2个糖识别部位(CRD)和连接它们的连接区的26个氨基酸(对于半乳凝素9M型)(参照同文献的Fig.1)。即从序列5所示的氨基酸序列看，确定C端侧的糖链识别域(CCRD)从Met175开始。然后基于此结果，人半乳凝素9的CRD和连接区被登录在NCBI数据库的Accession Number NP_033665。另外在J.Biol.Chem.,273(5):pp.2954-2960(1998)中给出了半乳凝素4和6的报告，其中与CRD的连接区的设定根据氨基酸序列、基因序列决定，这些序列如同文献的第2956页的Fig.2所示，但在将该设定反映在半乳凝素9中时，所谓前者(J.Biol.Chem.,272(9):pp.6079-6086(1997))的设定在连接区和C端侧的CRD中是不同的。即从序列5所示的氨基酸序列看，CCRD应当从Phe195开始。
本发明者等研究组根据非专利文献3中的设定在将由外显子形成的剪接边界存在于象处于Gln148-Pro149间、Ile160-Thr161间、Ser177-Thr178间那样的3个氨基酸区间C端侧考虑在内的同时，将有关C端侧CRD的结合糖能力的研究，即在序列5所示的氨基酸序列看到，使从Thr178开始的全长CCRD表达时有结合乳糖能力，即使再削除6个氨基酸(从序列Met184开始的CCRD片段)、削除12氨基酸(从Ala190开始的CCRD片段)，仍有结合乳糖能力，如果消除22氨基酸(从Leu200开始的CCRD片段)，由于不能在大肠杆菌中表达，从序列5所示的氨基酸序列看，能够考察到CCRD从Phe195开始的设定更严谨也一并考虑在内，作为C端侧的CRD定为序列5所示的氨基酸序列Thr178～Thr323的序列。有关半乳凝素9的N端侧CRD(NCRD)，在序列5所示的氨基酸序列看到，使直至Gln148的全长NCRD表达时有结合乳糖能力，如果消除9个氨基酸(序列Met1～Ser139的NCRD片段)，虽然蛋白质能表达，但由于结合乳糖能力消失，所以作为N端侧的CRD定为序列5所示氨基酸序列中的Met1～Gln148序列。
在理想的方式中，半乳凝素9突变体是例如(1)具有在作为半乳凝素9的NCRD如序列2所示的氨基酸序列或其序列中缺失、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的序列、或对序列2所示的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的氨基酸序列，而且具有结合乳糖能力的突变体、(2)具有作为半乳凝素9的CCRD入序列3所示的氨基酸序列或在序列中缺失、取代或添加1个或1个以上氨基酸的突变体、或对序列3所示的氨基酸序列具有至少70％以上的同源性、或至少75％以上的同源性、或至少80％以上的同源性、或至少85％以上的同源性、或至少90％以上的同源性、或至少95％以上的同源性的氨基酸序列，且具有结合乳糖能力的突变体、(3)具有作为结合上述(1)和(2)的连接区如序列9所示的氨基酸序列或在该序列中缺失、取代或添加1个或1个以上氨基酸的突变体、优选对于基质金属蛋白水解酶等蛋白质分解酶比天然的半乳凝素9稳定的突变体。作为该连接区(3)，包括序列9所示的氨基酸序列中的氨基酸残基缺失1个以上(例如、1～2个、优选3～4个、更优选5～6个、更优选7～8个、特别优选1～9个等)的缺失类似体、该氨基酸残基的1个以上(例如、1～9个、优选1～8个、更优选1～6个、更优选1～4个、特别优选1～2个等)被其它残基置换的置换类似体、附加1个以上(例如、1～60个、优选1～40个、更优选1～20个、更优选1～10个、特别优选1～5个等)的氨基酸残基(但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加类似体。作为代表性的该连接区(3)，如序列9所示的氨基酸序列被HM,RIP,或任意的2氨基酸序列置换的连接区等。氨基酸的置换、缺失、或插入可以是不使多肽的生理特性或化学特性发生大变化的改变，有时可以给出理想的变化。作为该氨基酸序列中的氨基酸的置换体，可以从该氨基酸所属的类中的其它氨基酸类选择。例如、作为非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸、蛋氨酸等、作为极性(中性)氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等，作为带有正电荷的氨基酸(碱性氨基酸)，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸等，作为带有负电荷的氨基酸(酸性氨基酸)，如天冬氨酸、谷氨酸等。
而作为该连接区(3)，如对序列7或8所示的氨基酸序列除去序列9所示的氨基酸序列部分，用HM,RIP,或任意的2氨基酸序列置换的序列,在序列7或8所示的氨基酸序列中除去序列9所示氨基酸序列部分，剩下其中的6氨基酸，将其它的残基削除后的序列等。另外作为该连接区(3)，也包括序列7或8所示的氨基酸序列中的氨基酸残基(但是,除去例如序列9所示的氨基酸序列部分,或序列7的场合可以除去序列8所示的氨基酸序列部分)缺失1个以上(例如1～5个、优选3～10个、更优选5～15个、更优选7～20个、特别优选1～32个等)的缺失类似体、1个以上的该氨基酸残基(例如1～9个、优选1～8个、更优选1～6个、更优选1～4个、特别优选1～2个等)被其它残基置换的置换类似体、附加1个以上(例如1～60个、优选1～40个、更优选1～20个、更优选1～10个、特别优选1～5个等)的氨基酸残基(但是，序列7和8所示的氨基酸序列中除去了序列9所示氨基酸序列后的部分表示的序列除外)的付加类似体。
如果能维持作为天然的人半乳凝素9蛋白质的特征的结构域结构或糖结合能力,上述那样的变异体都包含在本发明中。另外认为本发明的肽或多肽也可以包含具有与天然人半乳凝素9蛋白质基本上同等的一级结构构象或其一部分肽或多肽,而且还可以包含具有与天然的基本上同等生物学活性的肽或多肽。还可以是天然产生的一种变异体。本发明的来自人的蛋白质(或肽或多肽)例如与选自WO 02/37114 A1的序列表中SEQ ID NO:1～3的氨基酸序列有60％、由于场合不同,可以具有70％更高的同源性蛋白质,更优选具有80％或90％以上的相同氨基酸序列的蛋白质。所谓本发明的来自人的蛋白质的一部分是来自该人的蛋白质的一部分的肽(即该蛋白质的部分肽),只要是与本发明的半乳凝素9蛋白质具有基本上同等活性的蛋白质,可以为任一种蛋白质。例如、该本发明的蛋白质的部分肽具有该人半乳凝素9的构成氨基酸序列中至少5个以上、优选20个以上、更优选50个以上、更优选70个以上、最好优选100个以上、有时200个以上氨基酸残基的氨基酸序列的肽,最好是这些肽是对应于连续的氨基酸残基的肽,或例如就相对于该WO 02/37114 A1的序列表SEQ ID NO:1～3中任一项表示的氨基酸序列中对应的区域的同源性来说,具有与上述同样的同源性的肽。
在本说明书中所谓「基本上同等」指的是蛋白质的活性、例如、所定的伤害细胞活性、诱发凋亡活性、抗炎症活性、抗变态性活性、免疫调节活性、糖链结合活性、生理活性、生物学活性基本上相同。另外该用语的意思中可以包括具有基本上同质的活性的场合,作为基本上同质的活性,如结合活性、伤害细胞活性、诱发凋亡活性等。所谓基本上同质的活性表示它们的活性从性质上讲是同质,例如在生理上、药理学上、或生物学上同质。例如、结合活性、伤害细胞活性、诱发凋亡活性等活性虽然最好是同等(例如、约0.001～约1000倍、优选约0.01～约100倍、更优选约0.1～约20倍、更优选约0.5～约2倍)，但这些活性的程度、蛋白质的分子量等量的要素也可以不同。
所谓「半乳凝素9突变体多肽」包括野生型半乳凝素9的天然序列的突变体、其衍生物、类似体(类似物)、片段、嵌合体、以及变异体。该多肽包括意图能够在宿主细胞表达，且通过设计成能够编码特定的半乳凝素9突变体多肽的重组产生的聚核苷酸序列编码的多肽。
所谓「半乳凝素9突变体治疗剂」指的是来自编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸(半乳凝素9突变体聚核苷酸)或半乳凝素9突变体多肽序列的分子、包含这样的半乳凝素9突变体的聚核苷酸或多肽的突变体、变异体、类似体、嵌合体、片段等中的至少一个。所谓作为聚核苷酸的半乳凝素9突变体治疗剂，一般来说是编码半乳凝素9突变体多肽的序列，而且包括在宿主细胞中通过重组技术可表达的。另外，半乳凝素9突变体治疗剂可以是半乳凝素9活性的激动剂。其它的半乳凝素9突变体治疗剂，可以包括供给半乳凝素9突变体的治疗剂，具有半乳凝素9突变体有的活性，而且产生对与半乳凝素9活性缺乏或不足有关的疾患·疾病·异常症状有予防和/或治疗效果的半乳凝素9活性的调节剂。作为半乳凝素9活性的调节剂，例如聚核苷酸、多肽、或低分子。
本说明书中使用的用语「诊断剂」指的是在本发明的诊断使用一种或一种以上的对该诊断行为有用的那样的任意药剂。这些药剂在诊断中的使用可以包括用于决定半乳凝素9产生细胞的存在的方法或用于决定提示半乳凝素9结合性物质的细胞的存在的方法的使用。作为诊断剂，例如含有选自编码半乳凝素9突变体突变蛋白质的DNA、稳定化半乳凝素9突变体突变蛋白质、以及含有该稳定化半乳凝素9突变体突变蛋白质的细胞或细胞匀浆液中的成分。
本说明书中使用的用语「治疗剂」可以是在本发明的治疗中使用的一种或一种以上的达到或对达到其治疗行为有用的任意药剂。例如、治疗剂是被设计为能够表达半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸，该药剂是在给予哺乳动物后，然后能够在细胞中表达的聚核苷酸。此时药剂的活性形式是被表达的多肽。
半乳凝素9突变体治疗剂是具有半乳凝素9突变体生物活性的治疗剂、或比天然的半乳凝素9突变体更长，对特定糖链具有结合的活性的多肽、编码对基质金属蛋白水解酶等蛋白质分解酶比天然的半乳凝素9更稳定的半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸那样的来自半乳凝素9突变体的治疗剂。该治疗剂单独、或与其它药剂(例如、与半乳凝素9突变体的给予一起使用的，且对特定的肿瘤或自身免疫等的在其它众所周知的治疗法中使用的那样药物、或在哺乳动物中容易进行半乳凝素9突变体的表达那样的基因递送载体等)配合达到其治疗目的。例如、该治疗剂可以是包括为其它目的开发的半乳凝素9突变体治疗剂，以及半乳凝素9的激动剂、对半乳凝素9活性进行修饰或调节的药物，例如有机低分子化合物或物质、肽、肽样化合物或物质、编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突变体多肽、表达对蛋白水解酶比天然的半乳凝素9更稳定的半乳凝素9突变体的嵌合体或变异体等，且被转化的细胞。
本说明书中所谓的「配合治疗剂」指的是一起给予时，产生它们各自效果的含有几个成分或几个药剂的治疗组成物，配合治疗剂也指为了治疗疾患等一起给予时产生相乗效果那样的制剂。最好是通过配合治疗剂中的几个成分或几个药剂的各自作用得到的其它各种作用效果，为了能够获得更大的治疗效果、例如肿瘤的消失或正常化、从自身免疫疾患回复和获得长期生存，可以使这些成分组合。作为给予配合治疗剂后得到的效果的例子，如在短期的症状回复和长期给予后得到的症状的回复的组合，或使对患者中的特定型的各个细胞的自身免疫应答减少那样的效果的组合。作为本发明的配合治疗剂的例子，如用于给予含有编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸与编码IFN类,IL-2等细胞因子类中的至少一个的聚核苷酸的基因递送载体的配合治疗剂等。其它的例子也可以使用2个基因递送载体，例如、一个表达半乳凝素9突变体，另一个用于表达细胞因子类中至少一个。另外，为了预测给予半乳凝素9突变体在靶细胞中诱导凋亡，进行正调节，也可以给予表达IFN类,IL-2等、或IFN-γ等的基因递送载体。各种治疗剂也可以同时供给，例如、为了提高治疗效率，根据需要，可以重复给予各个药剂中的1个或全部，也可以加入到同一药学上容许的载体中给予。
「基因递送载体」指的是能够使用于多肽在细胞中表达的编码序列递送给细胞变得容易进行那样的成分。该细胞为了能够适于体内基因治疗也可以存在于哺乳动物的体内，为了能够适于体外基因治疗进行转染处理，也可以暂时从哺乳动物中取出，使得多肽表达后再返回到哺乳动物。基因递送载体可以是能够完成向细胞递送基因那样的任意成分或载体，例如、可以是脂质体、粒子、载体等。作为基因递送载体，重组载体(例如、重组病毒载体)、核酸载体(例如、质粒)、裸核酸分子(例如、基因)、和作为中和核酸分子上的负电荷，且将核酸分子折叠的分子能够凝集那样的多阳离子分子复合体化的核酸分子、与脂质体结合的核酸(美国专利第5,166,320号说明书；第5,547,932号说明书；Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7851,1987)等。该基因递送载体可以包括象生产细胞那样的特定的真核生物细胞，这些载体是能够向宿主细胞递送具有生物学的1个以上所期望的特性的核酸分子的载体。所期望的特性就像以下议论的那样，例如、可以包括表达蛋白质、酶、或抗体等那样的所期望物质的能力和/或提供生物学活性的能力。即、通过基因递送载体转运的核酸分子不需要表达所期望的物质，其本身就是活性的药剂。这样的生物学活性的一个例子是可在基因治疗中看到的例子。就基因治疗来说，是对某种基因进行钝化，阻断该基因指示的产物的生产，整合到被递送的核酸分子能够特异表达的基因中。基因递送载体指的是为了使得1个或多个目的序列或基因表达能够进行指示的集合体(组件)。
基因递送载体一般来说包含启动子成份，而且可以包含指示多聚腺苷化的信号。另外，基因递送载体还可以与在转录时能够运作那样与1个或多个目的序列或基因连接，含有作为翻译起始序列起作用的序列。另外基因递送载体还可以含有Neo、SV2Neo、TK、潮霉素、博莱霉素(腐草霉素)、螺旋霉素、组氨醇、DHFR等那样可选择标志、1个以上的制限酶部位和翻译终止序列。在本发明中能够使用的场合，基因递送载体可以包括病毒载体(Jolly,Cancer Gen.Therapy,1:51-64,1994)、核酸载体、裸DNA、脂质体DNA、粘粒、细菌、特定的真核生物细胞(包含生产细胞；参照美国专利第6,333,195号说明书)那样的重组载体。
所谓「生物学的活性」在表示保持特异活性的分子场合下使用。例如、具有生物活性的半乳凝素9突变体多肽对含有半乳凝素9的糖链识别部位的特定糖链特异结合的活性或与它具有基本上同等性质的活性，且对基质金属蛋白水解酶等蛋白质分解酶比天然的半乳凝素9定性和/或定量保持稳定的能力，例如表现出对导致半乳凝素9含有的抗肿瘤活性或凋亡的凋亡途径进行活化的活性。
本说明书中使用的用语「核酸分子」或「聚核苷酸」指的是编码特定氨基酸序列或编码其互补链的RNA或DNA、以及DNA:RNA杂交体等分子。本说明书中使用的「编码序列」指的是编码特定氨基酸序列或编码其互补链的RNA或DNA、以及DNA:RNA杂交体等中的任一种。聚核苷酸例如可以包括反义寡核苷酸、或核酶，另外也可以包括基因的3'或5'非翻译区那样的序列、基因的内含子、不构成基因的编码区域的基因的其它区域。DNA或RNA可以是单链或双链。在合成核酸或合成聚核苷酸中，也包括含有化学合成核酸序列的序列，以及为了赋予分子对变性的抵抗性预先从化学上进行的部分改变。聚核苷酸可以通过例如聚合酶链式反应(PCR)扩增、使用互补的DNA或RNA的重组表达等制造，或通过化学合成生成。
本说明书中用语「表达调控序列」或「调节序列」指的是包括影响编码多肽的基因的表达，包括影响用于转录和翻译的信号表达的那样一个或一个以上的成分，且在该领域可使用的序列。适于本发明的多肽表达的表达调控序列因可表达多肽的宿主系不同而有所不同。
作为本发明的「多肽」，只要是包含半乳凝素9突变体多肽，可以是任何多肽，如含有成熟蛋白质的半乳凝素9突变体蛋白质的任意部分，以及其缩短型、突变体、对立基因体、类似物、衍生物等。作为突变体，可以是由与关联蛋白质同一基因表达的剪接后突变体衍生的。另外只要没有特别指示，这样的多肽例如可以是具有对特定糖链具有特异结合的亲和结合性或对特异对象的结合活性等该半乳凝素9蛋白质具有的生物活性中的一个或一个以上生物活性的多肽。本「多肽」用语并不限定于特定长度的基因产物。不管是来自人的或来自人以外的供给源的，至于半乳凝素9的N末端侧糖链识别部位(NCRD)以及C末端侧糖链识别部位(CCRD)与靶蛋白质或成熟蛋白质同一的，或至少具有60％、优选70％、更优选80％、和最好优选90％、进一步优选95％的同源性的多肽都包括在本多肽的这个定义内。因此可以包括基于对立基因的突变体、以及包括氨基酸的置换、缺失、或插入在内的基因产物的突变体。氨基酸的置换可以是氨基酸的保守性置换、或对糖基化部位、磷酸化部位、乙酰化部位等进行改变那样的氨基酸置换、对功能不需要的半胱氨酸残基的位置进行改变后，改变了折叠形式的置换、以及除去非必需氨基酸残基那样的置换。作为氨基酸的保守性置换一般来说是保存电荷、疏水性/亲水性、和/或被置换的氨基酸的立体尺寸(大小)那样的置换，例如、Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/GIn、Ser/Cys/Thr、和Phe/Trp/Tyr等组的成员之间的置换是保守性的置换。
所谓类似物是具有靶蛋白质样活性的物质，作为肽样物质如含有一个或一个以上被广泛了解的肽模仿物质的肽等。在本定义中，包括例如含有一个或一个以上氨基酸的类似物(例如、含有非天然型氨基酸等)的多肽、含有被置换的连结部的多肽、天然存在的那样的变异和天然不存在的那样变异的该技术领域中众所周知的那样的其它改变·修饰。
本说明书中用语「多肽」是多肽表达后被改变的多肽，例如进行了糖基化、乙酰化、磷酸化、肉豆蔻酰化等。
本说明书中用语「裸DNA」指的是为了在哺乳动物中表达给予哺乳动物的聚核苷酸DNA。作为聚核苷酸，例如可以是编码序列，聚核苷酸DNA一旦DNA进入细胞内，为了使编码序列容易表达可以直接或间接地与表达调控序列的序列结合。所谓间接结合目的是使DNA在哺乳动物细胞中容易表达，为了使调节领域和编码序列进行结合，或使整合其它序列容易，借助于接头或间隔片段将两个聚核苷酸领域结合在一起。
本说明书中的「载体」指的是可以指示1或多个目的序列或基因表达的集合体(组件)。载体必须任意含有转录启动子/增强子、规定1或多个基因座的成份、以及控制对可变剪接、核RNA输送、信使翻译后进行的修饰、或蛋白质的转录后进行的修饰等过程进行指示或调控的其它基因表达的其它成份。
另外载体必须在被转录时，含有与一个或一个以上的目的序列或基因可操作连接、而且作为翻译起始序列起作用的那样序列。根据需要，载体可以含有指示多聚腺苷化的信号、Neo、TK、潮霉素、博莱霉素(腐草霉素)、组氨醇、DHFR等那样的选择标志、一个或一个以上的限制性部位和翻译终止序列。另外当载体配置在逆病毒中时，载体必须含有包装信号、长末端反复序列(LTR)、而如果没有这些序列，必须含有适合使用的逆病毒的正链和负链的引物结合部位。
所谓「组织特异的启动子」指的是在被限定的一些组织型或细胞型中具有优先活性那样的启动子，规定转录启动子/增强子或基因座的成份、或象上述那样控制基因表达的其它成份。作为这样的组织特异的启动子的代表例，例如PEPCK启动子、HER2/neu启动子、酪蛋白启动子、IgG启动子、绒毛性胚抗原启动子、弹性蛋白酶启动子、胆色素原脱氨基酶启动子、胰岛素启动子、成长激素因子启动子、酪氨酸羟化酶启动子、白蛋白启动子、α胎球蛋白启动子、乙酰胆碱受体启动子、醇脱氢酶启动子、α或β珠蛋白启动子、T细胞受体启动子、骨钙素启动子等。
所谓「事件特异的启动子」指的是是规定转录启动子/增强子或基因座的成份、或象上述那样控制基因表达的其它成份，而且它们的转录活性指的是当对细胞性刺激应答时进行变化那样的活性。作为这样的事象特异的启动子的代表例，如胸腺嘧啶脱氧核苷激酶或胸苷酸合成酶启动子、α或β干扰素启动子、以及对于激素(天然激素、合成激素、或来自其它非宿主生物的任一种激素，例如昆虫激素等)的存在进行应答的启动子等。
用语「融合蛋白质」或「融合多肽」指的是使用能够发生一个以上的蛋白质或含有一个以上的蛋白质部分的1个多肽表达那样的载体表达产生的，而且使载体或连续的结合中的一个以上的异种编码序列重组表达后得到的蛋白质或多肽。融合蛋白质最好是带有保持来自构建它使用的蛋白质或多肽具有的至少一个生物学活性的多肽单位，最好是包括通过使不同蛋白质的部分组合，形成信号多肽，使相乗改良的生物学活性产生的融合蛋白或融合多肽。作为生成的融合蛋白质，如有表达时具有功能的多肽，有表达时没有功能的肽。作为表达时没有功能的肽，最好是如为了表达具有活性的多肽时起作用的肽。作为本发明中有用的融合蛋白质的例子，如从用于治疗或用于检测或测定，以及用于进一步分析或分离和纯化的利用观点考虑具有几个优点的经基因操作的任意半乳凝素9突变体融合多肽。
用语「嵌合」或「嵌合蛋白质」可以认为含有与融合蛋白质或融合多肽等价的意思。「嵌合分子」可以是融合多肽、或编码融合多肽的聚核苷酸融合分子。嵌合由可连结的DNA编码序列构建，然后通过细胞系表达，或通过载体给予，在动物中可以进行体内表达。例如、含有半乳凝素9突变体的嵌合或融合蛋白质可以在体内或体外通过基因治疗程序给予。
本说明书中所谓「患者」指的是在活的生物中可进行任意治疗或予防治疗的个体，包括真核生物或原核生物，并不限定于这些。例如、作为患者的真核生物可以是脊椎动物或无脊椎动物。因此，例如、患者可以是鱼、鸟、蠕虫、昆虫、哺乳动物、爬虫类、两栖类、菌类、植物，优选哺乳动物。作为哺乳动物，例如人。
以下对本发明的半乳凝素9突变体治疗剂和/或诊断剂的一般的制造和使用法进行说明。在1种方式中，本发明提供对起因于半乳凝素9含有的生理活性或生物活性不足或欠缺的疾患·疾病·异常状态进行治疗的技术。作为该治疗技术，例如提供半乳凝素9突变体治疗剂的工程和/或给予有该疾患等的哺乳动物有效量的半乳凝素9突变体治疗剂的工程等。半乳凝素9突变体由于能够发挥对恶性肿瘤细胞的伤害细胞活性、对恶性肿瘤细胞的凋亡诱导活性、对恶性肿瘤细胞的抗肿瘤活性(抗癌活性)、活化T细胞的凋亡诱导活性、特别是CD4阳性T细胞的凋亡诱导活性、免疫调节活性、抗炎症作用、抗变态性作用，所以预期可以作为抗肿瘤剂(抗癌剂)、抗变态性剂、免疫调节剂、自身免疫疾患用剂、抗炎症剂和肾上腺皮质类固醇激素替代用剂。该治疗技术包括对活化T细胞显著的自身免疫疾患进行治疗的方法。所谓「自身免疫疾患」和「自身免疫」都指的是哺乳动物中的由于自身免疫导致的特征性的损伤(这是对自身成分的免疫系的应答)。自身免疫应答是进展到表现出临床征兆的症状的现象。严格来说，移植排斥并不是自身免疫反应，而是患者有时接受对有症状的细胞、组织、或器官进行置换或移植的外科手术时，接受同种移植的生物体对外来移植发生免疫学反应的现象。在由来自种的一个成员向其它种的细胞、组织、或器官的同种移植中，在受体(recipient)中当为了排斥被移植的细胞、组织、或器官发生充分的免疫应答时，发生「移植排斥」。
作为通过本发明的方法和治疗剂能够治疗的「肿瘤」的例子，包括恶性肿瘤，例如进行转移的肿瘤为恶性肿瘤，一般将恶性肿瘤分为上皮性和非上皮性的肿瘤，有时也区分为癌、肉瘤、白血病等来考虑，单称为「癌」时，一般人大多指恶性肿瘤。在本说明书中所谓「癌」可以按照广泛意思解释，并不单解释为上皮性的恶性肿瘤。在本说明书中所谓「癌」可以包含上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤(既包含肿瘤形成性的肿瘤，也包含非形成性的肿瘤)，如皮肤癌(也包含黑素瘤)、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸恶性肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、咽·喉头癌、舌癌、上颚癌、食道癌、胃癌、大肠·直肠癌、肺·支气管癌、肝癌(包括肝细胞癌、肝内胆管癌)、肝外胆管·胆囊癌、胰赃癌、白血病、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、恶性血管瘤、恶性血管内皮瘤、脑肿瘤(包括脑膜瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤等)等，并不限定于这些，应当理解为通过使用本发明的半乳凝素9突变体获得理想结果的肿瘤，还包括该半乳凝素9突变体参与后可获得某种生理或生物学上应答的肿瘤。
作为通过本发明的方法和治疗剂能够治疗的「自身免疫疾患」的例子，如多发性硬化症、桥本甲状腺炎、全身性红斑狼疮(SLE)、肺肾综合征(Goodpasture)、天疱疮、受体自身免疫、自身免疫溶血性贫血、自身免疫血小板减少性紫斑病、变形性关节症、慢性关节炎风湿病、抗胶原抗体和强皮症(schleroderma)、复合化结合组织病、多发性肌炎、恶性贫血、特发性艾迪生病、自发性不孕症、丝球体肾炎、水疱性类天庖疮、肾上腺素作用性药物耐性、慢性活性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫基底的内分泌腺不全、白斑、脉管炎、心肌梗塞后遗症(post-myocardial infarction)、心脏穿孔症候群、荨麻疹、特应性皮炎、自身免疫基底的哮喘、自身免疫基底的炎症性反应、肉芽肿症损伤、强直性(alkylizing)脊椎炎、链球菌感染后(poststreptococcal)的丝球体肾炎、自身免疫溶血性贫血、脑炎、对淋巴瘤的二次自身免疫反应、变性损伤、萎缩性损伤等。作为表示受体自身免疫的自身免疫疾患，例如格雷夫斯病、重症肌无力症、胰岛素耐性症等。作为肾上腺素性药物耐性的自身免疫疾患，例如哮喘和囊胞性纤维症等。
作为本发明中的其它自身免疫疾患，例如动物模型存在的疾患，例如肖格伦综合征(自身免疫泪腺炎(dacryodentis)或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、炎症性心脏病、水银诱导性肾自身免疫、胰岛素依赖性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺切除术后自身免疫、中枢神经系(CNS)脱髓鞘障碍、CNS狼疮、睡眠发作、免疫媒介PNS障碍、变形性关节症、慢性关节炎风湿病、葡萄膜炎、髓质囊胞性纤维症、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脉管炎、卵巢自身免疫疾患、强皮症(scheroderma)等。作为由于中枢神经系(CNS)脱髓障害导致特征性自身免疫疾患，例如多发性硬化症(MS)等。末梢神经系(PNS)自身免疫疾患例如格林-巴利综合征(GBS)。
作为半乳凝素9突变体治疗剂，如多肽、聚核苷酸、低分子有机化合物、肽、或肽样化合物或物质等。而半乳凝素9突变体治疗剂也包括编码半乳凝素9突变体多肽、半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸、含有该半乳凝素9突变体多肽一部分的融合多肽、编码含有该半乳凝素9突变体多肽一部分的融合多肽的聚核苷酸、半乳凝素9突变体多肽的生物活性肽衍生物、来自于半乳凝素9突变体多肽的生物活性肽样化合物或物质、或具有半乳凝素9突变体活性，且模仿半乳凝素9突变体结构的低分子有机化合物(例如、激动剂)等。半乳凝素9突变体多肽可以是半乳凝素9突变体多肽突变体、半乳凝素9突变体多肽衍生物、变异的半乳凝素9突变体多肽、或缩短型半乳凝素9突变体多肽那样的生物活性的半乳凝素9突变体多肽。编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸也可以是编码带有半乳凝素9N端侧CRD全长以及C端侧CRD全长的突变体多肽的聚核苷酸序列、编码半乳凝素9突变体多肽的生物活性部分的序列、编码来自于半乳凝素9突变体多肽的生物活性肽的序列、编码可溶性半乳凝素9突变体多肽的序列等。本发明另外实施方式是含有可以表达编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸序列的基因递送载体的组成物。
本发明中利用「基因重组技术」，构建和获得所定核酸(聚核苷酸)或所定肽(多肽)，另外可进行分离·序列决定，制作重组体。作为本说明书中可使用的基因重组技术(包括重组DNA技术)，如该领域已知的技术，例如可以通过J.Sambrook,E.F.Fritsch&T.Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)",Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork(1989)；D.M.Glover et al.ed.,"DNA Cloning",2nd ed.,Vol.1to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,OxfordUniversity Press(1995)；日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因研究法II」、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)」、东京化学同人(1992)；M.J.Gait(Ed),Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(1984)；B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed),Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press Ltd.,Oxford,UK(1985)；B.D.Hames and S.J.Higgins(Ed),Transcription and Translation:A Practical Approach(Practical Approach Series),IRL PressLtd.,Oxford,UK(1984)；B.Perbal,A Practical Guide toMolecular Cloning(2nd Edition),John Wiley&Sons,New York(1988)；J.H.Miller and M.P.Calos(Ed),Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York(1987)；R.J.Mayer and J.H.Walker(Ed),Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology,AcademicPress,(1987)；R.K.Scopes et al.(Ed),Protein Purification:Principles and Practice(2nd Edition,1987&3rd Edition,1993),Springer-Verlag、N.Y.；D.M.Weir and C.C.Blackwell(Ed),Handbook of Experimental Immunology,Vol.1,2,3and 4,Blackwell Scientific Publications,Oxford,(1986)；L.A.Herzenberg et al.(Ed),Weir's Handbook of ExperimentalImmunology,Vol.1,2,3and 4,Blackwell Science Ltd.(1997)；R.W.Ellis(Ed),Vaccines new approaches to immunologicalproblems,Butterworth-Heinemann,London(1992)；R.Wu ed.,"Methods in Enzymology",Vol.68(Recombinant DNA),AcademicPress,New York(1980)；R.Wu et al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.100(Recombinant DNA,Part B)&101(Recombinant DNA,PartC),Academic Press,New York(1983)；R.Wu et al.ed.,"Methodsin Enzymology",Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)&155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)；J.H.Miller ed.,"Methods inEnzymology",Vol.204,Academic Press,New York(1991)；R.Wuet al.ed.,"Methods in Enzymology",Vol.218,Academic Press,New York(1993)；S.Weissman(ed.),"Methods in Enzymology",Vol.303,Academic Press,New York(1999)；J.C.Glorioso etal.(ed.),"Methods in Enzymology",Vol.306,Academic Press,New York(1999)等所述的方法或其中引用的文献所述的方法或与它们基本上同样的方法或改变法进行(这些方法中的记载由于参照也包括在本说明书的内容中)〔以下、将这些方法都称之为「基因重组技术」)。
本说明书中，所谓「同源性」意味着在多肽序列(或氨基酸序列)或聚核苷酸序列(或碱基序列)中的2条链之间，构成该链的各个氨基酸残基之间或各碱基之间的相互适合关系中能够决定是同一那样的氨基酸或碱基的量(数)，指的是两个聚核苷酸或多肽序列之间的序列相关性的程度。同源性可以容易算出。测定两个聚核苷酸或多肽序列之间的同源性的方法已知有很多种，「同源性」(也称为「同一性」)的用语对于同行众所周知(例如、Lesk,A.M.(ed.),ComputationalMolecular Biologly,Oxford University Press,New York,(1988)；Smith,D.W.(ed.),Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Academic Press,New York(1993)；rifin,M.&Grifin,H.G.ed.)omputer Analysis of Sequence Data:Part Ii,Human Press,NewJersey,(1994)；von Heinje,G.,Sequence Analysis In MolecularBiology,Academic Press,New York,(1987)；Gribskov,M.&Devereux,J.(Ed.),Sequence Analysis Primer,M-StocktonPress,New York,(1991)等)。测定两个序列的同源性使用的一般方法如Martin,J.Bishop(Ed.),Guide to Huge Computers,AcademicPress,San Diego,(1994)；Carillo,H.&Lipman,D.,SIAM J.AppliedMath.,48:1073(1988)等公布的方法，但并不限定于这些方法。作为用于测定同源性的理想方法，如为了获得进行试验的两个序列间的最大的适合关系部分而设计的方法。这样的方法如作为计算机程序建立的方法。作为测定两个序列间同源性的理想的计算机程序法如GCG程序包(Devereux,J.et al.,Nucleic AcidsResearch,12(1):387(1984)0/BLASTP/BLASTN(Atschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol,215:403(1990))等，但并不限定于这些方法，可以使用该领域中众所周知的方法。
在本说明书中，所谓「聚合酶链式反应(polymerase chainreaction)」或「PCR」一般指的是美国专利第4,683,195号说明书等所述的那样方法，例如指用于在体外通过酶对所期望的核苷酸序列进行扩增的方法。一般来说，PCR法是包括使用能够优先与模板核酸进行杂交的2个寡核苷酸引物，反复进行引物延伸合成那样的循环的方法。对于典型的PCR法中使用的引物可以使用对于模板内部应当可扩增的核苷酸序列互补的引物，例如，优选使用在与应当扩增的核苷酸序列的两端互补、或与应当被扩增的核苷酸序列邻接的引物。作为5’端的引物要按照至少含有起始密码子、或包含该起始密码子、可扩增那样选择，而作为3’端侧的引物最好是能够至少含有终止密码子、或含有该终止密码子能够扩增那样地进行选择。引物优选由5个以上的碱基，更优选10个以上碱基构成的寡核苷酸、更优选由18～25个碱基构成的寡核苷酸。
PCR反应可以按照该领域众所周知的方法或与这些方法基本上同样的方法或改变法进行，例如可以根据R.Saiki,etal.,Science,230:1350,1985；R.Saiki,et al.,Science,39:487,988；.A.Erilich ed.,PCR Technology,Stockton Press,989；.M.Glover et al.ed.,“DNA Clonig”,2nd ed.,Vol.1,(ThePractical Approach Series),RL Press,Oxford UniversityPress(1995)；M.A.Innis et al.ed.,“PCR Protocols:a guide tomethods and applocations”,Academic Prss,New AYork1990)；M.J.McPherson,.Quirk and G.R.Tayloy(Ed.,),CR:apract9ical approach,RL Press,Oxford(1991)；M.A.Frohman etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998-9002(1988)等所述的方法或对这些方法进行修饰、改变的方法进行。另外，PCR法也可以使用适用的市售的试剂盒进行，根据试剂盒制造者或试剂盒销售者指明的程序实施。
PCR反应对于代表性的实验是将例如模板(例如，以mRNA为模板合成的DNA；1st strand DNA)和根据该基因设计的引物与10×反应缓冲液(Taq DNA聚合酶附带的)、dNTP(脱氧核苷三磷酸dATP，dGTP，dCTP dTTP的混合物)、Taq DNA聚合酶以及去离子蒸馏水混合。对于该混合物使用例如GeneAmp 2400PCR system,erkin-Elmer/Cetus公司等自动热循环仪在一般的PCR循环条件下反复该循环25～60次，用于扩增的循环数可以根据相应目的设为合适的次数。作为PCR循环的条件，例如变性90～95℃5～100秒、退火40～60℃5～150秒、延伸65～75℃30～300秒的循环，优选变性94℃15秒、退火58℃15秒、延伸72℃45秒的循环，退火的反应温度以及时间可以根据相应实验选择适当的值，变性反应和延伸反应的时间也可以根据预想的PCR产物的链长选择适当的值。退火的反应温度最好是根据通常引物与模板DNA的杂交的Tm值改变。延伸反应的时间通常大约每1000bp的链长1分钟程度那样的尺度，根据场合不同也可以选择更短的时间。
在本说明书中，所谓「寡核苷酸」可以是比较短的单链或双链的聚核苷酸，优选聚脱氧核苷酸，可以通过Angew.Cem.nt.Ed.Engl.,Vol.28,p.716-734(1989)所述的那样已知方法、磷酸三酯法、磷酸二酯法、磷酸法、磷酸酰胺法、磷酸法等方法化学合成。已知通常合成可以很便利地在被修饰的固体支持体上合成，该仪器有销售。该核苷酸可以含有一个或一个以上的修饰碱基，例如可以含有次黄苷等天然而不是普通的碱基或三甲基化的碱基等，根据场合不同也可以含有带有标记的碱基。
为了对所定核酸进行鉴定，可以利用杂交技术。该杂交可以根据上述公布的「基因重组技术」的文献所述的方法或基本上与它同样的方法或改变法进行。例如，杂交可以使含有DNA等核酸的样品转移到含有尼龙膜等膜载体上，根据需要实施变性处理、固定化处理、清洗处理等后，使转移到上述载体(例如膜等)的核酸根据需要，使变性的标记探针DNA片段在杂交用缓冲液中进行反应。
杂交处理通常于约35～约80℃进行、于约50～约65℃下更合适，进行约15分钟～约36小时，约1～约24小时更合适，可以选择最适条件进行。例如，杂交处理在约55℃下进行约18小时。作为杂交用缓冲液，可以使用选自该领域中通常使用的缓冲液，例如可以使用Rapid hybridization buffer(Amersham公司)等。作为转移的载体(例如，膜等)的变性处理，通常通过于约40～约100℃、于约70～约90℃下更合适，进行约15分钟～约24小时焙烤，进行约1～约4小时焙烤更合适，可以选择最适合条件进行。例如，对膜等载体通过于80℃下进行约2小时焙烤进行固定化。作为转移的载体(例如膜等)的清洗处理，可以通过用在该领域中通常使用的清洗液、例如含有1MNaCl、1mMEDTA和0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的50mM Tris－HCl缓冲液，pH8.0等进行清洗。作为含有尼龙等膜的载体，可以使用从该领域通常使用的载体中选择的载体。
作为上述碱性变性液、中和液、缓冲液，可以使用从该领域中通常使用的缓冲液中选出来的缓冲液，作为碱性变性液，例如可以使用含有0.5MNaCl和1.5MNaCl的0.5M Tris－HCl缓冲液，pH8.0等，作为缓冲液例如2×SSPE(0.36MNaCl、20mMNaH2PO4和2mMEDTA)等。另外在杂交处理之前，为了防止非特异性杂交反应，根据需要，进行了转移的载体(例如膜等)最好是进行预杂交处理。该预杂交处理可以通过例如浸入到预杂交溶液[50％formamide、5×Denhardt溶液(0.2％牛血清白蛋白、0.2％polyvinyl pyrrolidone)、5×SSPE、0.1％SDS、100μg/ml热变性鲑精子DNA]等中，于约35～约50℃，优选42℃下进行约4～约24小时，优选约6～约8小时反应，该条件同行可以通过反复进行适当实验，确定更理想的条件。在杂交中使用的标记探针DNA片段的变性可以于约70～约100℃下、优选约100℃下，进行约1～约60分钟、优选约50分钟加热等进行。而杂交可以利用其众所周知的方法或根据这些方法的方法进行，在本说明书中，所谓严格的条件指的是例如，关于钠浓度，约15～约50mM、优选约19～约40mM、更优选约19～约20mM，关于温度约35～约85℃、优选约50～约70℃、更优选约60～约65℃的条件。
杂交完了后，对膜等载体进行充分清洗处理，在将进行特异杂交反应的标记探针DNA片段以外的标记探针等除去后，可以进行检测处理。膜等载体的清洗处理可以使用从该领域通常使用的方法选出的方法进行，例如可以通过用含有0.1％SDS0.5×SSC(0.15M NaCl、15mM柠檬酸)溶液等进行清洗。
进行杂交的核酸可以通过代表性的自动放射自显影进行检测，在检测中也可以适当选用该领域中使用的方法。将进行检测的相当于信号的核酸带悬浮于适当的缓冲液、例如SM溶液(含有100mM NaCl和10mM MgSO4的50mM Tris－HCl缓冲液，pH7.5)等，然后对该悬浮液进行适度稀释，对所定核酸进行分离·纯化，然后再进行扩增处理。在本说明书中，所谓「高同源性」是因该对象序列的长度不同而不同，例如可以是50％以上、甚至60％以上、优选70％以上、更优选80％以上，而对于特定场合也可以为95％以上，97％以上特别好。所谓「同效的碱基序列」例如在严格条件下与含有问题序列的核酸可进行杂交的碱基序列，例如与该碱基序列中连续的5个以上的碱基序列、优选10个以上的碱基序列、更优选15个以上的碱基序列、更优选20个以上的碱基序列进行杂交，编码与该多肽基本上同等的氨基酸序列的碱基序列。核酸也可以通过化学合成获得。这种情况下，化学合成片段，然后通过酶将合成的片段结合起来。
通过杂交处理对从含有基因文库或cDNA文库等的核酸样品中进行筛选目的核酸的处理可以反复进行。可以使用被克隆的来自人的cDNA文库、例如各种来自人的组织或培养细胞(特别是人的肾脏、脑、松果体、下垂体后叶、神经细胞、网膜、网膜血管细胞、网膜神经细胞、胸腺、血管、内皮细胞、血管平滑肌细胞、血液细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、精巢、卵巢、子宫、肠、心脏、肝脏、小肠、大肠、齿肉关连细胞、皮肤关连细胞、线球体细胞、尿细管细胞、结合组织细胞等组织·细胞、以及各种肿瘤组织、癌细胞等)cDNA文库。另外用作模板等的cDNA文库也可以直接使用市售的来自各种组织的cDNA文库，例如可以使用由Stratagen公司、Invitrogen公司、Clontech公司等销售的cDNA文库。作为典型的例子，可以使用由人组织·细胞制备的基因文库、例如人P1 artificial chromosome基因组文库(HumanGenome Mapping Resource Center)、人组织cDNA文库(例如，可从Clontech公司等获得)。使用探针可以对由各种人组织或培养细胞等构建的人基因组DNA文库或来自人的cDNA文库进行筛选。为了用放射性同位素等对探针等进行标记，可以使用市售的标记试剂盒、例如随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司)等进行。例如使用随机引发(random-priming)试剂盒(Pharmacia LKB公司，Uppsala)等，用[α-32P]dCTP(Amersham公司)等对探针用DNA进行标记，可以获得带有放射活性的探针。
含有所定核酸的噬菌体粒子、重组质粒、重组载体等可以通过该领域中通常使用的方法对所定核酸进行纯化分离，例如可以通过甘油梯度超离心分离法(Molecular Cloning,a Laboratory Manual，ed.T.Maniatis,Cold Spring Harobor Laboratory,2nd ed.78,1989)、电泳法等进行纯化。使用在该领域中通常使用的方法可以从噬菌体粒子等纯化分离DNA，例如，将得到的噬菌体等悬浮于TM溶液(含有100mMMgSO4的50mM Tris－HCl缓冲液，pH7.8)等，用DNase I和RNase A等处理后，加20mM EDTA、50μg/ml蛋白酶K以及0.5％SDS混合液等，于约65℃，保温约1小时后，对该溶液进行酚提取、二乙基乙醚提取后，通过乙醇沉淀使DNA沉淀，然后将得到的DNA用70％乙醇洗净后干燥，溶解于TE溶液(含有10mM EDTA的10mM Tris－HCl缓冲液，pH8.0)等后得到。另外作为目的DNA通过亚克隆等大量获得也是可能的，例如亚克隆作为宿主可以使用大肠杆菌，用质粒载体等进行。通过这样亚克隆得到的DNA也与上述同样，通过离心分离、酚提取、乙醇沉淀等方法纯化分离。
在本说明书中，得到的PCR产物等核酸(包括DNA)通常进行1～2％琼脂糖凝胶电泳，作为特异的带从凝胶中切出，例如，使用geneclean kit(Bio 101)等市场销售的提取试剂盒进行提取。提取的DNA用适当的限制酶切，根据需要进行纯化处理，或根据需要，对5’末端用T4聚核苷酸激酶等进行磷酸化后，与pUC18等pUC系载体等适当的质粒载体连接，转化适当的感受态细胞。被克隆的PCR产物可以解析其碱基序列。对于PCR产物的克隆，可以使用例如p-Direct(Clontech),pCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene公司)、pGEM-T(Promega公司),pAmpTM(Gibco-BRL公司)等市场销售的质粒载体。为了进行宿主细胞的转化，例如可以使用噬菌体载体，使用钙法、铷/钙法、钙/锰法、TFB高效率法、FSB冷冻感受态细胞法、迅速克隆法、电穿孔等该领域已知的方法或基本上与该方法同样的方法进行(D.hanahan,J.Mol.Biol.,166:557,1983等)。为了分离目的DNA，可以运用逆转录PCR(polymerase chain reaction coupled reversetranscription；RT-PCR)、RACE(rapid amplification of cDNA ends)。RACE可以根据例如M.A.Innis et al.ed.,“PCR Protocols”(M.A.Frohman,“a guide to methods and applications”),pp.28-38,Academic Press,New York(1990)等所述的方法进行。
DNA，可以根据需要克隆，例如可以利用质粒、λ噬菌体、粘粒、P1噬菌体、F因子、YAC等。最好是来自λ噬菌体的载体，例如可以利用Charon 4A、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIXII、λEMBL3、λZAPIITM(Stratagene公司)等。另外可以将得到的DNA整合到下面详细说明那样的适当载体、例如质粒pEX、pMAMneo、pKG5等载体，用下面详细说明那样的适当的宿主细胞、例如大肠杆菌、酵母、CHO细胞、COS细胞等表达。另外该DNA片段直接或作为附加了适当调控序列的DNA片段整合到适当的载体、然后导入动物后，可以做成表达所定基因的转基因动物。作为动物如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、土拨鼠、牛等。最好是将该DNA片段导入小鼠等动物的受精卵，可以做成转基因动物。对于所定的基因产物的确认可以使用转化该外源基因的293T细胞、COS－1细胞等适于该基因的动物细胞等进行。
作为将外源基因导入哺乳动物等动物细胞的方法，可以通过该领域已知的方法或基本上与该方法同样的方法进行，例如磷酸钙法(例如，F.L.Graham et al.,Virology,52:456,1973等)、DEAE－葡聚糖法(例如，D.warde et al.,J.Gen.Virol.,3:371,1968等)、电穿孔法(例如，E.Neumann et al.,EMBO J l.:841,1982等)、微注射法、脂质体法、病毒感染法、噬菌体粒子法等。这样一来，转染了所定的基因的动物细胞产生的基因产物也可以进行基因解析。
作为整合所定基因等(本发明中得到的DNA等)的质粒，只要是在基因工程中常用的宿主细胞(例如，大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞宿主、酵母、293T细胞、CHO细胞、COS细胞等真核细胞宿主、Sf21等昆虫细胞宿主)中能够表达的质粒，什么样的质粒都可以。当然也可以选用市售的试剂盒或试剂附带的质粒。在这样的序列内，也可以含有例如为了在选择的宿主中表达而进行适当修饰的密码子，或设计限制酶部位，也可以含有为了使目的基因表达容易的调控序列、促进序列等、在结合目的基因中起作用的接头、适配器等、以及调控抗生素抗性等、调控代谢、对筛选有用的序列(也可以含有编码杂化蛋白或融合蛋白质的序列)等。最好是使用适当的启动子、例如在以大肠杆菌作为宿主的质粒中，如使用色氨酸启动子(trp)、乳糖启动子(lac)、色氨酸·乳糖启动子(lac)、脂蛋白启动子(lpp)、λ噬菌体PL启动子等，在以动物细胞作为宿主的质粒中，可以使用SV40晚期启动子、MMTV LTR启动子、RSV LTR启动子、CMV启动子、SRα启动子等，在以酵母作为宿主的质粒中可以使用GAL1、GAL10启动子等。另外也可以使用CYC1、HIS3、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP、URA3LEU2、ENO、TP1、AOX1等调控系。
为了促进编码所期望多肽的DNA的转录，可以在载体中插入增强子，作为这样的增强子，如作用于启动子、具有促进转录的作用，通常约10～100bp的具有cis作用的序列(元件)。很多增强子是从珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α－转铁蛋白、胰岛素等哺乳动物基因了解到的。作为代表性的，使用从真核细胞感染性病毒得到的增强子合适，例如位于复制起点的晚期区的SV40增强子(100－270bp)、巨细胞病毒的初期启动子的增强子、位于多糖类的复制起点的晚期区的增强子、腺病毒的增强子等。另外根据需要，也可以附加宿主中存在的信号序列，这些可以使用同行都非常了解的。
作为以大肠杆菌作为宿主的质粒，例如pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pSP64、pSP65、pTZ－18R/-18U、pTZ－19R/-19U、pGEM－4、pGEM－3Z、pGEM－4Z、pGEM－5Zf(－)、pBluescript KSTM(Stratagene公司)等。作为适于在大肠杆菌中表达的质粒载体，如pAS、pKK223(Pharmacia公司)、pMC1403、pMC931、pKC30、pRSET－B(Invitrogen公司)等。作为以动物细胞为宿主的质粒，例如SV40载体、多糖类·病毒载体、牛痘病毒载体、逆转录病毒载体等，具体来说，如pcD、pcD-SRα、CDM8、pCEV4、pME18S、pBC12B1、pSG5(Stratagene公司)等。作为以酵母为宿主的质粒，如Yip型载体、Yep型载体、YCp型载体等，例如pGPD-2等。作为宿主细胞，当宿主细胞为大肠杆菌时，如来自大肠杆菌K12株的，例如作为来自NM533、XL1Blue、C600、DH1、DH5、DH11S、DH5α、DH10B、HB101、MC1061、JM109、STBL2、B834株的，如BL21(DE3)pLysS等。宿主细胞为酵母时，例如Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomycesprombe，Pichia pastoris，Kluveromyces株，Candida Trichodermareesia，以及其他酵母株等。作为在酵母中的表达系，例如可以参照Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:1929；Itoet al.,J.Bacteriol.(1983)153:163；Kurtz et al.,Mol.Cell.Biol.(1986)6:142；Kunze et al.,J.Basic Microbiol.(1985)25:141；Gleeson et al.,J.Gen.Microbiol.(1986)132:3459；Roggenkamp et al.,Mol.Gen.Genet(1986)202:302；Das et al.,J.Bacteriol.(1984)158:1165；De Louvencourt et al.,J.Bacteriol.(1983)154:737；Van den Berg et al.,Bio/Technology(1990)8:135；Kunze et al.,J.Basic Micr Biol.(1985)25:141；Cregg et al.,Mol.Cell.Biol.(1985)5:3376；美国专利第4,837,148号说明书,同第4,929,555号说明书；Beach and Nurse,Nature(1981)300:706；Davidow et al.,Curr.Genet.(1985)10:380；Gaillardin et al.,Curr.Genet.(1985)10:49；Ballanceet al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112:284－289；Tilburn et al.,Gene(1983)26:205－221；Yalton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81:1470－1474；Kelly and Hynes,EMBO J.,(1985)4:475479；EP 244,234；WO 91/00357等所述的表达系。
宿主细胞为动物细胞时，如来自非洲中部猴成纤维细胞的COS－7细胞、COS－1细胞、CV－1细胞、来自人肾细胞的293细胞、来自人表皮细胞的A431xb、来自人大肠的205细胞、来自小鼠成纤维细胞的COP细胞、MOP细胞、WOP细胞、来自中国仓鼠细胞的CHO细胞、CHO DHFR－细胞、人HeLa细胞、来自小鼠细胞的C127细胞、来自小鼠细胞的NIH 3T3细胞、小鼠L细胞、9BHK、HL60、U937、HaK、Jurkat细胞、其他被转化后得到的细胞系、通常的二倍体、由体外一次培养组织诱导的细胞株等。哺乳动物表达，例如可以参照Dijkema et al.,EMBOJ.(1985)4:761；Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982b)79:6777；Boshart et al.,Cell(1985)41:521；美国专利第4,399,216号说明书；Ham and Wallace,Methods inEnzymology(1979)58:44；Barnes and Sato,Anal.Biochem.(1980)102:255；美国专利第4,767,704号说明书；同第4,657,866号说明书；同第4,927,762号说明书；同第4,560,655号说明书；WO90/103430；WO 87/00195；美国专利第RE 30,985号说明书等记载的细胞。作为昆虫细胞，以蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus)、来自该病毒的病毒或其他合适的病毒作为载体，可以使用Spodoptera frugiperda(caterpillar)，Aedesaegypti(mosquito),Aedes albopictus(mosquito),Drosophilamelangaster(fruitfly),蚕幼虫或蚕培养细胞、例如BM－N细胞等(例如，Luckow et al.,Bio/Technology,6,47-5(1988)；Setlow,J.K.etal.(end,),Genetic Engineering,Vol.8,pp.277-279,PlenumPublishing,1986；Maeda et al.,Nature,315,pp.592-594(1985))。有关异种基因在昆虫中的表达例如可以参照美国专利第4,745,051号说明书；Friesen et al.(1986),"The Regulation of BaculovirusGene Expression",The Molecular Biology of Baculoviruses(W.Doerfler(Ed))；EP 127,839；EP 155,476；Vlak et al.,J.Gen.Virol.,(1988)69:765－776；Miller et al.,Ann.Rev.Microbiol.(1988)42:177；Carbonell et al.,Gene(1988)73:409；Maedaet al.,Nature,(1985)315:592-594；Lebacq-Verheyden et al.,Mol.Cell.Biol.(1988)8:3129；Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985)82:8404；Miyajima et al.,Gene(1987)58:273；Martin et al.,DNA(1988)7:99等报道。另外关于多数的杆状病毒株和突变体以及来自宿主的对应的容许昆虫宿主细胞，例如可以参照Luckow et al.,Bio/Technology(1988)6:47-55；Miller et al.,Generic Engeneering(Serlow,J.K.et al.(Ed))Vol.8(PlenumPublishing,1986)pp.277-279；Maeda et al.,Nature(1985)315:592－594等报道。
利用Agrobacterium tumefaciens等，可以将植物细胞作为宿主细胞使用，与适合它的载体一起，这些在该领域都是广泛了解的。在本发明的基因工程手法中，可以使用在该领域已知或广泛运用的限制酶、逆转录酶、作为用于对适于将DNA片段克隆化的结构进行修饰或进行变换的酶的DNA修饰·分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸基转移酶、DNA连接酶等。作为限制酶，例如R.J.Roberts,Nucleic AcidsRes.,13:r165,1985；S.Linn et al.ed.Nucleases,p.109,ColdSpring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York,1982；R.J.Roberts,D.Macelis,Nucleic Acids Res.,19:Suppl.2077,1991等报道的酶。
根据本发明，用含有编码多肽(或蛋白质)的核酸的表达载体转化的转化体根据需要使用适当的选择标志，通过反复克隆，可以很多具有稳定高表达能力的细胞株。例如，在作为宿主细胞使用动物细胞的转化体中，作为选择标志利用dhfr基因时，通过慢慢提高MTX浓度进行培养，选择抗性株，使编码本发明的多肽的DNA扩增，可以获得能更高表达的细胞株。本发明的转化体可以在可表达编码本发明的多肽的核酸的条件下进行培养，使目的物生成、蓄积。该转化体可以在该领域中广泛使用的培养基中进行培养。例如大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞宿主、酵母等作为宿主的转化体最好使用液体培养基。在培养基中可以含有生育需要的碳源、氮源、无机物等。作为碳源，如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等、作为氮源，如铵盐类、硝酸盐类、玉米浆、胨、酪蛋白、肉提取物、麦芽提取物、大豆粕、马铃薯提取液等无机或有机物质、作为无机物，例如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁、碳酸钙等。另外也可以添加酵母、维生素类、酪蛋白水解物、生长促进因子等。另外根据需要为了更有效地使启动子起作用，可以添加例如3β－吲哚丙烯酸那样的药剂。培养基的pH希望约5～约8。
培养例如对于大肠杆菌通常于约15～约45℃下进行约3～约75小时，根据需要，也可以加通气或搅拌。对宿主为动物细胞的转化体进行培养时，作为培养基可以使用例如含有约5～约20％的胎牛血清的MEM培养基、PRM1604培养基、DMEM培养基等。pH优选约6～8。培养通常于约30～约40℃下进行约15～约72小时，根据需要，也可以加通气或搅拌。表达所定基因产物的转化体可以直接利用，也可以做成该细胞匀浆液利用，也可以将所定基因的产物分离后使用。当从上述培养细胞提取时，培养后可以适当运用用众所周知的方法收集菌体或细胞，将它们悬浮于适当的缓冲液中，通过超声波、溶菌酶和/或冻融等破坏菌体或细胞后，通过离心分离或过滤获得粗提取液的方法等。在缓冲液中也可以加尿素或盐酸胍等蛋白质变性剂、TritonX－100(商品名)、吐温－20(商品名)等表面活性剂。对于目的生成物向培养液中分泌的场合，培养结束后，通过这方面众所周知的方法将菌体或细胞与上清分离开，收集上清。
上述那样得到的培养上清、或提取液中含有的目的生成物可以将以往众所周知的分离纯化法适当组合对其进行纯化，例如通过硫酸铵沉淀法等盐析、通过交联葡聚糖等凝胶过滤法、使用带有例如二乙基氨乙基或羧甲基等的载体的离子交换层析法、例如，使用带有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体等的疏水性层析法、色素凝胶层析法、电泳法、透析、超滤、亲和层析法、高效液相层析法等进行纯化获得。理想的是可以通过聚丙烯凝胶电泳、固定了配体等的亲和层析等进行纯化分离处理。例如作为配位体，如包括进行特异识别的单克隆抗体的抗体或其片段、凝集素、糖、结合对的一方等。例如免疫亲和层析、明胶－琼脂糖亲和层析、肝素－琼脂糖层析等。
得到的本发明的多肽(或蛋白质)可以再通过化学的手法对其含有的氨基酸残基进行修饰，或使用肽酶，例如胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、肽链内切酶、肽链外切酶等酶进行修饰，或进行部分分解后做成其衍生物等。本发明的多肽，C末端可以是羧基(COOH)或羧化物(COO－)，也可以是酰胺(－CONH2)或酯(COOR)。其中作为酯中的R，除了可以使用甲基、乙基、n-丙基、异丙基或n-丁基等C3－8烷基、例如环戊基、环己基等C1－6环烷基、例如苯、α-萘等C6－12芳香基、例如苄基、苯乙基等苯－C1－2烷基或α-萘甲基等α-萘－C1－2烷基等C7－14芳烷基之外，还可以使用作为口服用酯广泛使用的三甲基乙酰氧甲基等。当本发明的蛋白质C末端以外含有羧基(或羧化物)时，羧基被酰胺化或酯化后的产物也包括在本发明的多肽中。作为此时的酯，例如可以使用上述的C末端的酯等。
另外，对于本发明的多肽(或蛋白质)，也包括在上述的多肽中，N末端的蛋氨酸残基的氨基被保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1－5烷－羰基等C1－6酰基等)保护的产物，N端侧在生物体内被切断生成的谷酰基进行焦谷氨酰化的产物、分子内氨基酸的侧链上的取代基(例如，－OH、－COOH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)用适当的保护基(例如，甲酰基、乙酰基等C1－6酰基等)保护的产物、或结合了糖链的所谓糖蛋白等复合蛋白质等。
另外，通过使用以本发明涉及到的基因的碱基序列作为基础的基因工程常用的方法，例如在所定的多肽的氨基酸序列中适当地置换、缺失、插入、转移或附加1个或多个以上氨基酸，可以制造导入了变异的适合的多肽。作为这样的变异·变换·修饰法，例如日本生化学会编、「续生化学实验讲座1、基因研究法II」、p105(广濑进)、东京化学同人(1986)；日本生化学会编、「新生化学实验讲座2、核酸III(重组DNA技术)」、p233(广濑进)、东京化学同人(1992)；R.Wu，L.Grossman,ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.154，p.350&p.367,Academic Press,New York(1987)；R.Wu，L.Grossman,ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.100,p.457&p.468,AcademicPress,New York(1983)；J.A.Wells et al.,Gene,34:315,1985；T.Grundstroem et al.,Nucleic Acids Res.,13:3305,1985；J.Tayloret al.,Nucleic Acids Res.,13:8765,1985；R.Wu ed.,“Methodsin Enzymology”,Vol.155,p.568,Academic Press,New York(1987)；A.R.Oliphant et al.,Gene,44:177,1986等所述的方法。例如，利用合成寡核苷酸等的指定位置导入法(部位特异的突变导入法)(Zolleret al.,Nucleic Acids Res.,10:6487,1987；Carter et al.,NucleicAcids Res.,13:4331,1986)、盒(序列)突变导入法(cassettemutagenesis:Wells et al.,Gene,34:315,1985)，限制部位选择突变导入法(restriction selection mutagenesis:Wells et al.,Philos.Trans.R.Soc.London Ser A,317:415,1986)，丙氨酸·扫描法(Cunningham&Wells,Science,244:1081-1085,1989)，PCR突变导入法，Kunkel法，dNTP[αS]法(Eckstein)，使用亚硫酸或亚硝酸等的指导区域突变导入法等方法。
另外，当用基因重组法进行制造时，以融合多肽(融合蛋白质)使其表达，在生物体内或生物体外，也可以变换·加工为基本上与所期望的多肽具有同等生物学活性的多肽。可以使用基因工程常用的融合产生法，这样融合的多肽利用其融合部，通过亲和层析等也可以进行纯化。作为这样融合多肽，如可以与组氨酸盒融合的融合多肽，或与β-半乳糖苷酶(β-gal)、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、硫氧还蛋白(TRX)或Cre Recombinase融合的融合多肽。同样，多肽可以附加异种的抗原表位的盒，通过使用与该抗原表位特异结合的抗体的免疫亲和层析也可以进行纯化。在更适合的实施方式中，如聚组氨酸(poly-His)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-His-Gly)盒，而作为抗原表位盒，例如AU5，c-Myc,CruzTag09,CruzTag22,CrzTag 41,Glu-Glu,HA,Ha.11,KT3,FLAG(registeredtrademark,Sigma-Aldrich),Omni-prbe,S-probe,T7,Lex A,V5,VP16,GAL4,VSV-G等(Field et al.,Molecular and Cellular Biology,8:pp.2159-2165(1988)；Evan et al.,Molecular and CellularBiology,5:pp.3610-3616(1985)；Paborsky et al.,ProteinEngineering,3(6):pp.547-553(1990)；Hopp et al.,BioTechnology,6:pp.1204-1210(1988)；Martin et al.,Scence,255:pp.192-194(1992)；Skinner et al.,J.Bio.Chem.,266:pp.15163-15166(1991)；Lutz-Freyermuth et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:pp.6393-6397(1990)等)。也可以利用使用酵母双杂交法。
另外作为融合多肽，也可以是附加了变成可检测蛋白质那样的标志的融合多肽。在更合适的实施方式中，该可检测标志可以是生物素/链抗生物素蛋白系的Biotin Avi Tag、发荧光的物质等。作为发该荧光的物质，如来自オワン水母(Aequerea victorea)等发光水母的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、对其进行改变后的变异体(GFP变异体)、例如EGFP(Enhance-humanized GFP)、rsGFP(red-shift GFP)，黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein:YFP)，绿色荧光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、蓝色荧光蛋白(cyan fluorescent protein:CFP)，青色荧光蛋白(bluefluorescent protein:BFP)，来自ウミシイタケ(Renillareniformis)的GFP等(宫胁敦史编、实验医学另册后基因组时代的实验讲座3－GFP和Bioimaging、羊土公司(2000年))。也可以使用特异识别上述融合蛋白的抗体(包括单克隆抗体和其片段)进行检测。这样的融合多肽的表达和纯化也可以使用适用于表达和纯化的试剂盒，按照试剂盒制造者给出的程序实施。
得到的蛋白质(可以包括肽和多肽)，通过酶免疫测定法等已知手法使它结合于适当的载体或固相，可以进行固定化。固相化蛋白质、固相化肽可很便利地用于结合分析或物质的筛选。
多肽或蛋白质的结构的修饰·改变等可以参考例如日本生化学会编「新生化学实验讲座I、蛋白质VII、蛋白质工程」东京化学同人(1993)，根据该文献所述的方法或其引用的文献所述的方法、或与其基本上同样的方法进行。在如下面所述的那样的生物学活性中，也可以包括免疫方面活性、例如抗原性。在该修饰·改变中，可以是脱氨基化、羟基化、羧基化、磷酸化、硫酸化、甲基化等烷基化、乙酰化等酰化、酯化、酰胺化、开环、闭环、糖基化、向含糖链种类不同方面改变、将含糖链数增减、脂质结合、对D－型氨基酸残基的置换等。这些方法都是在该领域已知的方法(例如、T.E.Creighton,Proteins:structure and molecular Properties,pp.79-86W.H.Freeman&Co.,San Francisco,USA(1983)等)。
利用本发明的半乳凝素9突变体，可以筛选对该半乳凝素9的所定生物学活性等功能(例如，细胞损伤活性、凋亡诱导活性、与糖皮质激素类似的活性、抑制恶性细胞转移的活性等)促进的化合物(激动剂)或抑制的化合物(拮抗剂)或它们的盐。这也意味着可以提供该筛选试剂。因此，也可以提供有关利用在本发明中阐明的该半乳凝素9蛋白质等多肽、其一部分肽或它们的盐表现出的活性的各种各样的物质，对本发明中该半乳凝素9蛋白质、其一部分肽或它们的盐等表现出的活性等所定功能促进的化合物(激动剂)或抑制的化合物(拮抗剂)或它们的盐的筛选方法。
在该筛选中，例如(i)使适当的试验样品与半乳凝素9突变体蛋白质、其一部分肽或它们的盐(也包括表达该蛋白质的转化体)等接触的场合与(ii)在本发明的蛋白质、其一部分肽或它们的盐等中不存在问题的试验样品场合进行比较。具体来说，在上述筛选中，测定、比较该生物学活性(例如，与各个半乳凝素9蛋白质和生物体成分之间的相互作用有关的活性等)。
在该筛选系中也可以存在为了便于测定的适当的检测用底物。作为该底物，只要是在测定中可有效利用的，无论什么样的都可以。例如，选用已知的众所周知的底物，最好是使用合成的化合物等。底物可以直接使用，但最好是使用用荧光素等荧光、酶或放射性物质标记的底物。
作为试验样品，例如蛋白质、肽、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、植物提取物、动物等组织提取物、细胞提取物等。在试验样品中使用的试验化合物的例子中最好含有抗凝集素抗体、酶抑制剂、细胞因子、各种具有抑制活性的化合物、特别是合成化合物等。这些化合物可以是新的化合物，也可以是众所周知的化合物。该筛选可以根据通常的结合活性或酶活性的测定法实施，例如可以参考该领域中众所周知的方法等进行。另外，可以使用各种标记、缓冲液系以及其它适当的试剂，可以按照在此说明的操作进行。使用的肽等可以用活化剂进行处理，也可以预先将其前体或潜在型的前体变换为活性型的前体。测定通常在Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液等对反应没有坏影响的那样缓冲液等中，例如在pH约4～约10(优选pH约6～约8)中进行。当分别进行筛选时，在各个方法中的通常条件、操作法中除了考虑同行通常技术外，可以构建与本发明的该半乳凝素9蛋白质或与其基本上具有同等活性的多肽或肽有关的测定系。有关这些一般的技术手段的详细叙述可以参照综述、出版的书等[例如、Methods inEnzymology Academic Press公司(USA)发行等]。另外，凋亡诱导活性测定法等可以参考田沼靖一监修、「细胞工程另册：实验程序系列、凋亡实验程序」株式会社秀润社、1995年1月20日(第1版第2次印刷)等，也可以使用市售测定试剂盒。
使用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐是从上述的试验化合物，例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取物、植物提取物、动物组织提取物等选择的化合物，是促进或抑制本发明的蛋白质等的功能的化合物。作为该化合物的盐，如药学上容许的盐等。例如，与无机碱基的盐、与有机碱基的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。作为与无机碱基的盐的合适例子，如钠盐、钾盐等碱金属盐、钙盐、镁盐等碱土金属盐、以及铝盐、铵盐等。作为与有机碱基的盐的合适例子，如与三甲基胺、三乙基胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二碱基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己基胺、二环己基胺、N,N’-二苄基乙二胺等的盐。作为与无机酸的盐的合适例子，如与盐酸、溴氢酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的合适的例子，例如与甲酸、醋酸、丙酸、延胡索酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、苯甲酸等的盐。而作为与碱性氨基酸的盐的合适例子，如与精氨酸、赖氨酸、组氨酸等的盐，作为与酸性氨基酸的盐的合适的例子，如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。
当将本发明的活性成分[例如(a)该半乳凝素9突变体多肽、其一部分的肽或它们的盐、与其相关的肽等、(b)编码该半乳凝素突变体9或相关多肽的DNA等的核酸等、(c)控制该半乳凝素9的问题活性的化合物(该半乳凝素9蛋白质的毒害细胞活性、凋亡诱导活性、对正常细胞没有坏的影响，促进或抑制·阻碍起着所定功效的活性等现象、或促进或抑制·阻碍组织或蛋白质的变质·过剩生产或分解现象达到生物学活性的化合物)或其盐、(d)使用本发明发现的活性物质等]作为药物使用时，通常可以单独或与药理上容许的各种制剂辅助剂混合后，作为药物组成物或药物制备物等给予。最好是以适合经口给药、局部给药、或非经口给药等使用的制剂制备物的形态给药，根据目的也可以通过任一种给药方式(也包括吸入法、或直肠给药)给药。
另外，本发明的活性成分也可以配合各种药物、例如抗肿瘤剂(抗癌剂)、肿瘤转移抑制剂、血栓形成抑制剂、关节破坏治疗剂、镇痛剂、消炎剂和/或免疫抑制剂使用，这些制剂只要是具有有利的作用可以无限制地使用，例如可以从该领域中已知的制剂中选择。
而作为非经口给药方式，可以包括局部、经皮、静脉内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内给药，也可以直接向患部给药，对于某些场合也适合。理想的是向包括人在内的哺乳动物经口、或非经口(例如，细胞内、组织内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髓腔内、点滴法、注肠、经直肠、点耳、点眼或点鼻、齿、向皮肤或粘膜涂布等)给药。作为具体的制剂制备物的形态，如溶液制剂、分散制剂、半固体制剂、粉粒体制剂、成型制剂、浸出制剂等，例如片剂、包被片剂、加糖衣制剂、丸剂、口含片、硬胶囊剂、软胶囊剂、微胶囊剂、埋入剂、粉末剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、注射剂、液剂、酏剂、乳剂、灌注剂、糖浆、水剂、乳剂、悬浊剂、擦剂、洗剂、气雾剂、喷雾剂、吸入剂、喷雾剂、软膏制剂、硬膏制剂、贴附剂、浴剂、湿润剂、膏剂、油剂、栓剂(例如直肠栓剂)、酊剂、皮肤用水剂、点眼剂、点鼻剂、点耳剂、涂布剂、输液剂、用于注射用液剂等的粉末剂、冷冻干燥制剂、凝胶制备品等。
药物用的组成物可以根据通常的方法进行制剂化。例如，根据适当的需要，可以单独或组合使用生理学上认可的载体，作为药物容许的载体、佐剂、赋形剂、辅形剂、稀释剂、香味剂、香料、甜味剂、媒介物、防腐剂、稳定剂、结合剂、pH调节剂、缓冲剂、表面活性剂、基剂、溶剂、填充剂、增量剂、溶解辅助剂、可溶化剂、等渗剂、乳化剂、悬浊化剂、分散剂、增粘剂、凝胶化剂、硬化剂、吸收剂、粘接剂、弹性剂、可塑剂、崩解剂、喷射剂、保存剂、抗氧化剂、遮光剂、保湿剂、缓和剂、防止带电剂、无痛化剂等，通过将它们一起与本发明的蛋白质混合，可以制造成一般认可的制剂实施中要求的单位用量形态。
作为适于非经口使用的制剂，活性成分与水或其它的药学上容许的溶剂的无菌溶液、或悬浊液剂等、例如注射剂等。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液、其它相关的糖的溶液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇等乙二醇类可作为理想的注射剂用的液体载体。制备注射剂时，使用蒸馏水、林格液、生理盐水那样的载体、适当的分散剂或湿化剂和悬浊化液等，用该领域已知的方法制备成象溶液、悬浊液、乳剂那样可以注射的形式。
作为注射用的水性液，如包括生理盐水、葡萄糖或其它的辅助药(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)等渗液等，也可以与药理上容许的适当溶解辅助剂、例如醇(例如乙醇等)、聚醇(例如，丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨酯80TM，HCO-50等)并用。作为油性液，如芝麻油、大豆油等，也可以与作为溶解辅助剂的苯甲酸苄酯、苄酯醇等并用。另外，也可以与缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)或用于浸透压调节的试剂、无痛化剂(例如，杀藻胺、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，苄醇、酚等)、抗坏血酸等抗氧化剂、吸收促进剂等配合。制备的注射液通常被填充到适当的安瓿瓶中。
对于非经口给药，可以加或不加表面活性剂以及其它药学上容许的助剂，做成水、乙醇或油那样的无菌的药学上容许的液体中的溶液或悬浊液形式的制剂。作为制剂中使用的油性载色剂或溶剂，如天然的、合成的或半合成的单、或双、或三甘油酯类、天然的、合成的或半合成的油脂类或脂肪酸类，例如，花生油、玉米油、大豆油、芝麻油等植物油。例如，该注射剂可以按照含有0.1～10重量％程度的本发明化合物那样制备。
作为适用于局部、例如口腔或直肠使用的制剂，例如洗口剂、磨齿剂、口腔喷雾剂、吸入剂、软膏剂、牙科填充剂、牙科包被剂、牙科膏剂、栓剂等。作为洗口剂、其它牙科用剂，可以使用药理上容许的载体，通过惯用的方法制备。作为口腔喷雾剂、吸入剂，使本发明化合物本身或与药理上容许的非活性载体一起溶解于湿雾剂或喷雾器用的溶液，或做成吸入用微粉末给予牙齿等。软膏剂，可以添加通常使用的基剂、例如软膏基剂(白色凡士林、石蜡、橄榄油、聚乙烯二醇400、聚乙烯二醇软膏等)等，通过惯用的方法制备。
向牙、皮肤局部涂布用的药品可以在适当灭菌的水或非水赋形剂的溶液或悬浊液中配制、作为添加剂，如亚硫酸氢钠或乙二胺四乙酸二钠那样的缓冲剂；含有醋酸或硝酸苯汞、氯化烷基二甲基苄基铵或双氯苯双胍己烷那样的灭菌和抗真菌剂的防腐剂和羟丙基甲基纤维素(ヒプロメルロ－ズ)那样的增稠剂。
栓剂使用在该领域中众所周知的载体、最好是非刺激性的适当的辅形剂、例如聚乙二醇类、羊毛脂、可可脂、脂肪酸甘油三酯等载体，最好是在常温下虽然是固体，但在肠道的温度下为液体，在直肠内放出融解的药物的载体等，通过惯用的方法制备，通常按照含有0.1～95重量％程度的本发明化合物那样制备。由于使用的赋形剂和浓度不同，药品可以悬浮于或溶解于赋形剂中。象局部麻醉剂、防腐剂以及缓冲剂那样的辅助药可以溶解于赋形剂中。适于作为经口使用的制剂，如片剂、丸剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、口含片那样的固形组成物，或液剂、糖浆、悬浊剂那样的液状组成物等。制备制剂时，使用在该领域中已知的制剂辅助剂等。片剂和丸剂还可制造成被糖衣包被。调剂单位方式为胶囊时，可以在上述类型的材料中再含有油脂那样的液状载体。
另外，活性成分为蛋白质或多肽时，由于聚乙二醇(PEG)在哺乳动物中毒性极低，所有与它结合特别有用。而与PEG结合，有时可以有效地减少异种性化合物的免疫原性以及抗原性。该化合物也可以加入到微胶囊装置中给予。象PEG那样的聚合物可以简单地附着于在氨基末端的氨基酸的α-氨基、赖氨酸侧链的ε-氨基、天冬氨酸或谷氨酸的侧链的羧基、羧基末端的氨基酸的α-羧基、或某种天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基的糖基链被活化的衍生物上。
已知有很多适于与蛋白质直接反应的活化形式的PEG。作为对与蛋白质的氨基反应有用的PEG试剂，如羧酸、碳酸衍生物的活性酯、特别是解离基为N-羟基琥珀酰亚胺、p-硝基苯酚、咪唑、或1-羟基-2-硝基苯-4-硫酸。同样，含有氨基肼或酰肼基的PEG在通过蛋白质中的过碘化酸氧化生成的醛反应中有用。
本发明的诊断和治疗为了能够适于也许哺乳动物表现出的特定的自身免疫等疾患·疾病、包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症等，通过对该哺乳动物进行诊断开始实施的。为了监测治疗进行以及例如为了判断是否要对正在进行的治疗中的给予量或给予次数那样的参数进行改变，作为治疗程序诊断可以在治疗期间继续进行。作为有助于决定有关半乳凝素9突变体治疗药给予的适当性那样的诊断手法，如哺乳动物中半乳凝素9表达水平的分析、和从自身免疫的部位分离的淋巴细胞等细胞与靠近自身免疫部位的淋巴细胞等细胞之间的这些细胞水平的比较等。要治疗的哺乳动物的自身免疫疾患等疾患·疾病、包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症等通过检测细胞内的半乳凝素9抗原可以进行监测。这样的监测包括使来自哺乳动物的样品与半乳凝素9特异的抗体接触，然后检测与样品结合的抗体。
基因治疗用载体是用于递送为了在哺乳动物中表达要被递送到哺乳动物的本发明的治疗药的包括编码序列(例如、半乳凝素9突变体编码序列)在内的构建物(construct)的载体，或用于递送半乳凝素9突变体的全部或部分，也包括用于递送的核酸序列的该构建物的载体，可以通过局部或全身的任一种方法给予。这些构建物可以在体内或体外，利用通过病毒载体的途径或非病毒载体形式的途径递送。为了表达这样的编码序列，可以通过使用内源性的哺乳动物启动子或异种启动子诱导来进行。编码序列在体内的表达可以是构建形式表达，或可调节地进行的任一种表达方式。当半乳凝素9突变体在哺乳动物被表达时，可以以可溶性的半乳凝素9突变体表达，有时也可以以前体型半乳凝素9突变体形式表达。在这两种表达形式中或其中的任一种形式中，它们可以是例如整个的半乳凝素9突变体、或半乳凝素9突变体的生物学的活性部分、变异体、衍生物、或融合体等。
本发明提供可以表达所要的半乳凝素9突变体的核酸序列的基因递送载体。作为基因递送载体，优选病毒载体，更优选逆病毒、腺病毒、腺随伴病毒(AAV)、疱疹病毒、或甲病毒等病毒载体等。作为病毒载体，如星状病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳多泡病毒、副粘病毒、细小病毒、细小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒等病毒载体。关于该基因递送载体，一般可参照D.Jolly,Cancer Gene Therapy,1(1):51-64(1994)；O.Kimura et al.,Human Gene Therapy,5:845-852(1994)；S.Connelly et al.,Human Gene Therapy,6:185-193(1995)；M.G.Kaplitt et al.,Nature Genetics,8:148-153(1994)等。
逆病毒载体在该领域都熟知的,例如、包括B型、C型、和D型逆病毒、xenotropic逆病毒(例如、NZB-X1,NZB-X2,NZB9.1(R.R.O'Neill,J.Virol.,53:100-106(1985)参照)等)、polytropic逆病毒(例如、MCF,MCF-MLV(M.Kelly,J.Virol.,45:291-298(1983)参照)等)、泡沫病毒、慢病毒等(参照R.L.Weiss et al.(Eds.),RNA Tumor Viruses,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,1985)在内的任意逆病毒基因治疗载体在本发明中都可以使用。
基因治疗逆病毒载体的一部分可以是来自不同逆病毒的部分。例如、逆载体的LTR可以是来自大白鼠肉瘤病毒的，tRNA结合部位可以是来自罗斯肉瘤病毒的，包装信号可以是来自大白鼠白血病病毒的，第二链合成起源可以是来自鸟白血症病毒的。这些重组逆病毒载体通过将它们导入适当的包装细胞株，可用于能形成可转化的逆病毒载体粒子(参照美国专利第5,591,624号说明书)。逆病毒载体可以通过逆病毒粒子内带有的称之为整合酶的具有的将目的DNA部位特异地整合到宿主细胞的DNA中的能力的重组酶进行构建。作为重组病毒载体，最好是复制能力缺损重组病毒。
作为适合使用上述逆病毒载体的包装细胞株，如该领域熟知的细胞株，而且容易制备(参照美国专利第6,013,517号说明书,WO92/05266)。该包装细胞株可以在用于产生重组载体粒子的生产细胞株(载体细胞株,vector cell line:VCL)中使用。包装细胞株最好是能够在人血清中不进行活化，由人的亲细胞(例如、HT1080细胞)或水貂的亲细胞株制作。
作为逆病毒基因治疗载体构建中理想的逆病毒，如鸟白血症病毒、牛白血病病毒、大白鼠白血病病毒、水貂细胞灶形成病毒、大白鼠肉瘤病毒、网状细胞内皮症病毒、罗斯肉瘤病毒等。作为大白鼠白血病病毒特别优选的，例如、4070A和1504A(Hartley&Rowe,J.Virol0.,19:19-25(1976))、Abelson(ATCC No.VR-999)、Friend(ATCC No.VR-245)、Graffi,Gross(ATCC No.VR-590)、Kirsten、Harvey肉瘤病毒和Rauscher(ATCC No.VR-998)、以及莫洛尼小鼠白血病病毒(ATCC No.VR-190)等。
这样的逆病毒可以从美国典型培养物保藏所(ATCC,Rockville,Maryland,USA)那样的保藏机构或保存机构获得，或使用通常可利用的技术由已知的供给源分离。
作为在本发明可使用的众所周知的逆病毒基因治疗载体的例子，如GB 2200651,EP 0415731,EP00345242,WO 89/02468,WO 89/05349,WO 89/09271,WO 90/02806,WO 90/07936,WO 94/03662,WO 93/25698,WO 93/25234,WO 93/11230,WO 93/10218,WO 93/10218,WO 91/02805、美国专利第5,219,740号说明书、同第4,405,712号说明书、同第4,861,719号说明书、同第4,980,289号说明书、同第4,777,127号说明书、同第5,591,624号说明书、Vile,Cancer Res,53:3860-3864(1993),Vile,Cancer Res,53:962-967(1993),Ra,Cancer Res,53:83-88(1993),Takamiya,J Neurosci Res,33:493-503(1992),Baba,J Neurosurg,79:729-735(1993),Mann,Cell 33:153(1983),Cane,Proc Natl Acad Sci USA,81:6349(1984),Miller,HumanGene Therapy,1:5-14(1990)等记载的例子。
人的腺病毒基因治疗载体在该领域中也是众所周知的，可在本发明中使用，例如可以参照Berkne,Biotechniques,6:616(1988)；Rosenfeld,Science,252:431(1991)；WO 93/07283；WO 93/06223；WO 93/07282等。作为可在本发明中使用的已知的腺病毒基因治疗载体例子，如上述参考文献所述的，例如、WO 94/12649；WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984；WO 95/00655；WO 95/27071；WO 95/29993；WO 95/34671；WO 96/05320；WO 94/08026；WO 94/11506；WO 93/06223；WO 94/24299；WO 95/14102；WO 95/24297；WO 95/02697；WO 94/28152；WO 94/24299；WO 95/09241；WO 95/25807；WO 95/05835；WO 94/18922；WO 95/09654等所述的例子。另外，就像Curiel,HumanGene Therapy,3:147-154(1992)所述那样，也可以给予连接在灭活的腺病毒的DNA。
另外作为本发明的基因递送载体，如腺病毒随伴病毒(AAV)载体。这样的载体中用于本发明的理想例子，如象WO 93/09239公布的那样源于AAV-2的载体。作为最理想的AAV载体，是含有2个AAV的逆末端反复序列的载体。该载体天然的D序列由于核苷酸置换被改变，其结果应当至少还维持着5个天然型核苷酸和直至18个天然型核苷酸(优选至少10个天然型核苷酸和直至18个天然型核苷酸、最优选10个天然型核苷酸)，D序列剩下的核苷酸缺失，或被非天然型的核苷酸置换。AAV逆末端反复领域的天然型D序列是在各AAV逆末端反复序列中含有20个连续核苷酸的序列(即在各末端存在一个序列)，该序列与HP形成无关。非天然型置换的核苷酸可以是与在同一部位天然型的D序列中发现的核苷酸不同的任意的核苷酸。作为其它的可使用的AAV载体的例子，如pWP-19、pWN-1等(Nahreini,Gene,124:257-262(1993))。作为这样的AAV载体的其它例子，如psub201等(Samulski,J.Virol.,61:3096(1987))。作为其它的AAV载体例子，如Double-D ITR载体等。制作Double-D ITR的方法如美国专利第5,478,745号说明书公布的方法。此外，AAV载体如美国专利第4,797,368号说明书、同第5,139,941号说明书、同第5,474,935号说明书、WO 94/288157号等公布的载体。作为可在本发明利用的另外的AAV载体例子，如SSV9AFABTKneo，该载体含有AFP0增强子和白蛋白启动子，而且倾向于在肝脏中优先表达。其结构和制作方法如Su,Human Gene Therapy,7:463-470(1996)公布的方法。作为其它的AAV基因治疗载体，如美国专利第5,354,678号说明书、同第5,173,414号说明书、同第5,139,941号说明书、同第5,252,479号说明书等记载的载体。
本发明的基因治疗载体可以是疱疹载体。作为主要的疱疹载体的理想例子，如含有编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶多肽序列的单纯疱疹病毒载体(例如、美国专利第5,288,641号说明书和EP 0176170公布的载体)。作为单纯疱疹病毒载体的例子如WO 95/04139等公布的HFEM/ICP6-LacZ,Geller,Sclence,241:1667-1669(1988)、WO90/09441、WO 92/07945等记载的pHSVlac,Fink,Human Gene Therapy,3:11-19(1992)记载的HSV Us3::pgC-lacZ、EP 0453242 A记载的HSV7134,2RH 105和GAL4、以保藏号ATCC VR-977和ATCC VR-260寄托于ATCC的载体等。
在本发明中也可以使用甲病毒基因治疗载体。作为理想的甲病毒载体，如新培斯病毒载体、披膜病毒、Semliki Forest病毒(ATCCVR-607；ATCC VR-1247)、Middleberg病毒(ATCC VR-370)、Ross River病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)、美国专利第5,091,309号、同第5,217,879号、和WO 92/10578记载的载体等。另外作为可使用的甲病毒载体，如美国专利第5,091,309号说明书、同第5,217,879号说明书、同第5,843,723号说明书、同第6,376,236号说明书、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994等记载的载体。这样的甲病毒可以从ATCC(Rockville,Maryland,USA)那样的保藏机构或保存机构获得，或使用通常可利用的技术从已知的供给源分离。最好是能够使用细胞伤害性可降低的甲病毒载体(参照美国专利第6,391,632号说明书)。
DNA载体系(例如、真核生物级联式表达系(eukarytic layeredexpression system)等)在用于表达本发明的半乳凝素9突变体的核酸中是有用的。有关真核生物级联式表达系的详细情况可以参照WO95/07994。作为本发明的真核生物级联式表达系最好是来自甲病毒载体的，优选来自新培斯病毒载体的表达系。
作为适合本发明使用的其它病毒载体，如来自脊髓灰质炎病毒(例如、ATCC VR-58,Evans,Nature,339:385(1989),Sabin,J.Biol.Standardization,1:115(1973)等记载的病毒等)；鼻病毒(例如、ATCC VR-1110和Arnold,J.Cell Biochem,L401-405(1990)记载的病毒等)；痘病毒(例如、金丝雀痘病毒等)或痘苗病毒(例如、ATCC VR-111,ATCC VR-2010等、Fisher-Hoch,Proc Natl Acad SciUSA,86:317(1989),Flexner,Ann NY Acad Sci,569:86(1989),Flexner,Vaccine,8:17(1990)、美国专利第4,603,112号说明书以及同第4,769,330号说明书、和WO 89/01973中记载的病痘毒等)；SV40病毒(例如、ATCC VR-305和Mulligan,Nature,277:108(1979)和Madzak,J.Gen.Vir,73:1533(1992)中记载的病毒等)；流感病毒(例如、ATCC VR-797等)、使用美国专利第5,166,057号说明书、Enami,Proc Natl Acad Sci USA,87:3802-3805(1990),Enami &Palese,J Virol,65:2711-2713(1991),Luytjes,Cell,59:110(1989),McMicheal.,N E J Med,309:13(1983),Yap,Nature,273:238(1978)、以及Nature,277:108(1979)等中记载的那样的逆遗传学技术制作的重组流感病毒；EP 0386882、Ruchschacher,J.Vir.,66:2731(1992)等记载的人免疫不全症病毒；麻疹病毒(例如、ATCCVR-67,VR-1247以及EP 0440219记载的病毒等)；奥拉病毒(例如、ATCC VR-368等)；Bebaru病毒(例如、ATCC VR-600和ATCC VR-1240等)；Cabassou病毒(例如、ATCC VR-922等)；奇昆贡亚病毒(例如、ATCC VR-64,ATCC VR-1241等)；Fort Morgan病毒(例如、ATCCVR-924等)；Getah病毒(例如、ATCC VR-369,ATCC VR-1243等)；Kyzylagach病毒(例如、ATCC VR-927等)；马亚罗病毒(例如、ATCCVR-66等)；穆茨布病毒(例如、ATCC VR-580,ATCC VR-1244等)；恩杜姆病毒(例如、ATCC VR-371等)；Pixuna病毒(例如、ATCC VR-372,ATCC VR-1245等)；Tonate病毒(例如、ATCCVR-925等)；Triniti病毒(例如、ATCC VR-469等)；Una病毒(例如、ATCC VR-374等)；Whataroa病毒(例如、ATCC VR-926等)；Y-62-33病毒(例如、ATCC VR-375等)；O'Nyong病毒、东部脑炎病毒(例如、ATCC VR-65,ATCC VR-1242等)；西部脑炎病毒(例如、ATCC VR-70,ATCC VR-125L,ATCC VR-622,ATCC VR-1252等)；冠状病毒(例如、ATCC VR-740,Hamre,Proc Soc Exp Biol Med,121:190(1966)记载的病毒)的载体等。
将本发明的组成物向细胞递送不限定于上述的病毒载体。也可以使用其它的递送方法和媒体，作为这样的方法和媒体，例如核酸表达载体、只与灭活的腺病毒连结的多阳离子性复合体DNA(例如参照Curiel,Hum Gene Ther,3:147-154(1992))、配位体连结DNA(例如参照Wu,J Biol Chem,64:16985-16987(1989))、真核生物细胞递送载体细胞(例如、参照美国专利第6,013,517号说明书、同第6,015,686号说明书等)、光聚合的水凝胶物质沉淀物、象美国专利第5,149,655号说明书记载的那样的携带型基因导入粒子枪、WO92/11033记载的电离放射线法、核电荷中和法、或与细胞膜的融合法等。另外作为手法如Philip,Mol Cell Biol,14:2411-2418(1994),Woffendin,Proc Na0000tl Acad Sci USA,91:1581-585(1994)记载的方法等。
也可以使用粒子媒介基因转移技术，序列被插入到用于高水平表达的含有惯用的调控序列的通常载体，然后与被连接在合成基因转移分子(例如、细胞靶配位体(例如、Wu et al.,J.Biol.Chem.,262:4429-4432(1987)记载的那样的脱唾液酸类黏蛋白、Hucked,BiochemPharmacol,40:253-263(1990)记载那样的胰岛素、Plank,Bioconjugate Chem,3:533-539(1992)记载的那样的半乳糖、乳糖、或铁传递蛋白等)的聚赖氨酸、鱼精蛋白、和白蛋白那样的聚合性DNA结合阳离子温育。
也可以使用裸DNA，例如、作为裸DNA的导入方法如WO 90/11092和美国专利第5,580,859号说明书记载的方法等。收率使用生物降解性乳胶珠可以改善。DNA包被乳胶珠，该珠被胞饮后可有效地输送到细胞内。该方法使疏水性增大，由此通过使包裹小泡破裂和使DNA释放到细胞质那样的珠处理可以进一步改善。
作为基因递送载体可以起作用的那样脂质体如美国专利第5,422,120号说明书、WO 95/13796,WO 94/23697,WO 91/144445和EP 524,968记载的。在非病毒的递送法中，编码半乳凝素9突变体多肽的核酸序列可以被插入到用于高水平表达的通常含有调控序列的惯用的载体，然后与合成基因导入分子温育。作为该合成基因导入分子，例如与细胞靶的配位体(例如、脱唾液酸血清类粘蛋白、胰岛素、半乳糖、乳糖、铁传递蛋白等)连接的聚合性DNA结合阳离子。作为聚合性DNA结合阳离子，例如、聚赖氨酸、鱼精蛋白、白蛋白等。作为其它的递送系，例如可以使用用于将含有多种组织特异的或普遍活性的启动子调控下的基因的DNA胶囊化的脂质体。作为适合使用的非病毒的递送法，如机械递送系(例如、Woffendin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91(24):11581-11585(1994)记载的手法)。
另外编码序列和这样的表达产物可以通过光聚合的水凝胶物质的沉淀递送。作为可用于递送编码序列的基因递送的其它方法，例如、使用美国专利第5,149,655号00说明书记载的携带型基因导入粒子枪的方法、WO 92/11033记载那样的为了对导入的基因进行活化使用电离放射线的方法等。
作为脂质体和多阳离子性基因递送载体的例子，如美国专利第5,422,120号说明书和同第4,762,915说明书、WO 95/13796,WO94/23697,WO 91/14445,EP 0524968,Stryer,Biochemistry,236-240(1975),W.H.Freeman et al.,Biochem Biophys Acta,600:1(1980),Bayer,Biochem Biophys Acta,550:464(1979),Rivnay,Meth Enzymol,149:119(1987),Wang,Proc Natl Acad Sci USA,84:7851(1987),Plant,Anal 0Biochem,176:420(1989)等记载的载体。
本发明公布了对陷于包含包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性疾患、炎症、免疫异常、活化淋巴细胞(特别是活化T细胞，也可包括活化B细胞)的自身免疫疾患等疾患和疾病的哺乳动物通过给予半乳凝素9突变体或来自半乳凝素9突变体的治疗剂(例如、作为治疗活性成分含有半乳凝素9突变体多肽或用于在哺乳动物中表达的编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸等的组成物)进行治疗的方法。作为可以通过本发明的方法和组成物治疗的自身免疫疾患，如任意的自身免疫疾患或移植排斥(例如、包括本说明书中列举的自身免疫疾患，但不限定于这些)。
半乳凝素9突变体例如可以以通过重组技术表达的多肽、或半乳凝素9突变体多肽的突变体、其衍生物、或它的融合蛋白质形式给予，可以通过局部或全身任一种方式递送给哺乳动物。编码半乳凝素9突变体、半乳凝素9突变体的衍生物或突变体、或半乳凝素9突变体融合体的核酸(DNA、RNA等)在基因治疗程序中可以以包含用于在哺乳动物中表达的调节区的裸质粒DNA形式，或通过用于在哺乳动物中表达的病毒载体给予。用于表达的半乳凝素9突变体多肽的递送可以使用使递送变得容易的那样的药学上容许的载体完成。对有自身免疫疾患的哺乳动物用来自半乳凝素9突变体的治疗剂进行治疗后，可以使自身免疫疾患改善或缓解，或使起因于自身免疫的临床症状消失。
本发明不受本发明公开的治疗剂怎样起作用的理论限定，而是应当由引起自己识别，然后伤害自身免疫的活化T细胞等决定。通过表达半乳凝素9突变体，或是使半乳凝素9突变体表达，或给予来自半乳凝素9突变体治疗剂，有问题的活化淋巴细胞受到可利用的半乳凝素9突变体的影响，优先成为靶子，进行凋亡。半乳凝素9突变体多肽或来自半乳凝素9突变体治疗剂可以投到表现出自身免疫的区域(例如、进行治疗的表现出特定自身免疫疾患特征那样的局部区域)。由此，给予的半乳凝素9突变体以及其它治疗剂与在该区域的细胞表达的具有靶标的活化T细胞等之间的接触被最适化。因此，该区域的细胞成了借助于基因递送载体的帮助被投到该区域的编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸表达时的良好的候补。由此对本发明进行各种变更、运用，按照能够使半乳凝素9突变体多肽表达那样进行操作，可以在处于被活化T细胞等攻击下的细胞中进行表达。对于移植排斥的场合，例如与能够结合很多细胞型的在细胞表面上遍在表达的蛋白质的分子结合部融合的半乳凝素9突变体多肽。该结合部分，例如可以是肝素，而结合的细胞表面上的分子也可以是葡糖胺聚糖。另外该结合部分也可以是对任意选择的细胞表面抗原特异的单链抗体的结合结构域。
关于本发明，对于包括癌等恶性肿瘤细胞在内的肿瘤细胞获得细胞伤害作用，或获得抗变态性作用，或获得抗炎症作用，或使免疫异常正常化，对于活化淋巴细胞(特别是也可以包括活化T细胞)诱导凋亡的场合都应当与上述自身免疫的场合同样理解。
本说明书中使用的「给药」或「进行给药」指的是将治疗剂或治疗剂的配合物递送到哺乳动物的过程。给药过程可以因治疗剂(单个或多个的治疗剂)和所期望的效果不同进行改变。给药可以通过例如非经口的递送或经口的递送等适合治疗剂的任意手段完成。作为非经口的递送，例如向皮下、静脉内、肌肉内、动脉内递送、向器官组织的注射、通过粘膜、肺、局部的或通过导管递送等。经口的手段是经由口给药的手段，例如、可以使用片剂或其它经由胃肠的递送手段(包括可饮用的液体)等进行。作为经由粘膜的递送，例如鼻腔内递送等。作为经由肺的递送，可以使药剂吸入。给药一般来说也可以通过使用药学上容许的载体(例如、缓冲液、多肽、肽、云芝多糖缀合物、脂质体、脂等)递送进行。基因治疗程序包括作为治疗剂认为可以给予在哺乳动物以转录物或多肽形式表达时能够达到治疗目的聚核苷酸的场合，也可适用于非经口的递送手段和经口的递送手段中任一种手段。这样的给药手段可以按照适合治疗的疾患情况进行选择。例如，疾患为器官基底的场合，递送可以是局部递送，例如，疾患为全身的场合，递送可以是全身的。所谓联合用药指的是在对某患者的治疗中再给予一种或一种以上的治疗剂。治疗剂可以使用同样的药学的载体给予，或也可以使用不同的载体给予。这些载体可以通过同样的或不同的给予手段给予。药剂可以是同型的药剂，或不同型的药剂，例如、作为不同型，如聚核苷酸、多肽、或低分子的药剂。给药时间可以是恰好同一时间，1种治疗剂也可以在另外的药剂之前或之后给药。因此联合用药可以同时，也可以连续进行。用于将治疗剂做成所定的组合的正确程序可以在考虑药剂和按照其它考虑已治疗的状态后决定。
所谓用语「体内给药」指的是为了在哺乳动物中表达，将编码多肽的聚核苷酸投给患者(例如、哺乳动物)。特别是作为直接的体内给药，如细胞不从哺乳动物取出，而是通过编码序列转染哺乳动物细胞。因此作为直接的体内给药，为了在患者细胞中发生表达，可以直接将编码目的多肽的DNA直接注射到陷于自身免疫疾患烦恼的区域。
用语「体外给药」指的是将细胞从患者(例如、哺乳动物)中取出后，对细胞(例如、来自于处于自身免疫攻击下的细胞集団的细胞)进行转染处理。转染后，细胞被返回到哺乳动物。体外给药是将细胞从哺乳动物取出，根据需要，选择要转化的细胞(即受到自身免疫机构攻击下的细胞)，要将被选择的细胞做成不能复制，将选择的细胞用编码要表达的基因(即半乳凝素9突变体)的聚核苷酸(为了使表达容易进行也可含有调节区域)进行转化，为了使半乳凝素9突变体表达，通过将被转化的细胞返回到患者达到。
作为治疗的有效量，指的是产生所期望的治疗结果那样的量。例如、当所期望的治疗效果是自身免疫治愈时，所谓的治疗的有效量指的是容易达到治愈的那样的量。所谓治疗上有用的量可以是例如、在包括数日或数周间给药那样的投药程序中投给的那样的量。治疗效果，例如在自身免疫疾患的症状出现期间，可以使哺乳动物的自身免疫应答的影响降低时在哺乳动物中用于获得这样效果的药剂的有效量指的是造成自身免疫的症状减少那样的量。
用语「药学上容许的载体」指的是用于给予治疗剂(例如、多肽、聚核苷酸、低分子、肽性物质、肽等)载体，载体本身不诱导接受组成物的个体产生有害的抗体，而且不能产生有问题那样的毒性，可以给予的那样的任意的药学上容许的载体。在本发明的另外方式中，提供与药学上容许的载体或稀释剂组合，含有上述那样的重组病毒载体的药学的组成物。这样的药学的组成物可以是液体溶液形式的组成物，或制备成在给予前可悬浮于溶液的固体形式(例如、冷冻干燥的产品)。另外，该组成物也可以使用适合于给予表面，或注射，或经口给予，或经直肠给予的载体或稀释剂进行制备。作为药学上容许的载体或稀释剂，在使用的给予量和浓度下对接受者(recipient)基本上是无毒的。作为用于可注射的溶液的载体或稀释剂的代表例子，如水、等渗生理食盐水溶液(理想的是在生理pH下具有缓冲的溶液、例如、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白质(例如、人血清白蛋白)等。载体或重组病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/ml HSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的药学的组成物后进行递送。此时重组载体约为1g物质，高分子物质不到1％，总物质量(包括水)在1/100,000以下。该组成物至少了在20℃下稳定6个月间。
本发明的药学的组成物可以含有刺激细胞分裂的因子，因此可以含有整合重组逆病毒载体，刺激组合的因子。重组病毒的保存法可以参照美国专利第5,792,643号说明书记载的保存法。
用于实施本发明提供的治疗法的所有治疗剂可以加入到含有治疗药用的药学上容许的载体的适当的药学组成物。用于治疗药的药学载体可以是同样的，也可以因各个治疗药不同而不一样。作为合适的载体，可以是大的、而且代谢缓慢的巨大分子(例如、蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、粒子中的不活性病毒等)。这样的载体对于同行众所周知。
作为药学上容许的盐，例如无机酸盐(例如盐酸盐、溴氢酸盐、磷酸盐、硫酸盐等)；有机酸盐(例如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等))，这些盐可以加入到该组成物后使用。有关药学上容许的赋形剂可以参照例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.,USA,1991)。作为治疗组成物中的药学上容许的载体，例如水、生理盐水、甘油糖、乙醇等液体。作为助剂，例如湿润剂、乳化剂等，也可以将pH缓冲物质等加入到这样的载体中。代表性的治疗组成物可以制备成可以注射的任一种液体溶液或悬浮物；在注射前制备成可以使用液体载体适合做成液体或悬浮物的固体形态载体。在药学上容许的载体的定义内也包含脂质体。
还可以提供与药学上容许的载体或稀释剂组合，包含有重组逆病毒或一个上述的载体构建物的病毒的药学组成物。该组成物可以制备成液体溶液或在给予前可悬浮于溶液的固体形式(例如、冷冻干燥的产品)中任一种。另外，该组成物也可以使用适合于给予表面，或注射，或经口给予，或经直肠给予的载体或稀释剂进行制备。
作为药学上容许的载体或稀释剂，在使用的给予量和浓度下对接受者(recipient)基本上是无毒的。作为用于可注射的溶液的载体或稀释剂的代表例子，如水、等渗生理食盐水溶液(理想的是在生理pH下有缓冲作用的溶液、例如、磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水等)、甘露醇、葡萄糖、甘油糖、乙醇、多肽或蛋白质(例如人血清白蛋白)等。载体或重组病毒可以加入到含有10mg/ml甘露醇、1mg/mlHSA、20mM Tris(pH7.2)、和150mM NaCl的药学组成物后进行递送。此时重组载体约为1g物质，高分子物质不到1％，总物质量(包括水)在1/100,000以下。该组成物至少了在20℃下稳定6个月间。
药学上容许的载体或稀释剂为了能够做成液体溶液或给药前能够悬浮于溶液的固体方式(例如、冷冻干燥的方式)中的任一种方式的组成物，可以与基因递送载体组合。2个以上的基因递送载体可以借助于代表性的传统的直接途径例如颊/舌下、直肠、经口、经鼻、局部(例如、经皮和眼等)、阴道、肺、动脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、眼内、鼻腔内、或静脉内)，或间接给药。
本发明的治疗药可以任意地含有例如用于在哺乳动物中表达的聚核苷酸，该治疗药可以根据该领域中众所周知的方法，制作成肠溶性片剂和胶囊剂等制剂。这些可以参照以下的专利：例如、美国专利第4,853,230号说明书、EP 225,189、AU 9,224,296、AU 9,230,801、和WO 92144,52等。这样的胶囊可以经口给予，以肠为靶。经口给药后1～4日，通过使用抗该蛋白质的抗体等测定血浆和血液决定例如多肽的表达是否在进行，或例如是否发生由核酶或反义寡核苷酸引起的表达被抑制。
基因递送载体可以象例如美国专利第4,411,648号说明书、同第5,222,936号说明书、同第5,286,254号说明书、WO 94/05369等记载的那样，通过例如注射、粒子枪、局部给药、非经口给药、吸入、或离子导入递送等导入哺乳动物。
治疗组成物或治疗剂也可以与能够改善包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤、变态性症、炎症、免疫异常、自身免疫疾患那样的其它治疗剂、或能够增强给予半乳凝素9突变体治疗剂获得的治疗上利益那样的其它治疗剂一起给予。例如、在为了治疗变态性反应给予时，为了能够在存在于粘膜、鼻、支气管、肺等组织的细胞中表达，可以给予半乳凝素9突变体聚核苷酸的气雾，为了更有利，例如在变态性反应平息之前的期间，每日数次、通过鼻用喷雾或气雾喷雾反复给药。
基因递送载体可以直接给到哺乳动物的单一部位或多个部位，例如可以通过直接注射给予。基因递送载体也可以使用通过体外转化导入的靶细胞给予。本发明还提供适合基因递送载体给予的药学组成物(包括例如各种赋形剂)。
可以将半乳凝素9突变体多肽、其突变体、衍生物、类似物、变异体、或指示嵌合表达的载体构建物直接给予包括癌等恶性肿瘤在内的肿瘤部位、表现出变态性的部位、炎症部位、表现出免疫异常的部位、表现出自身免疫的部位(例如、胰脏、肾脏、肝脏、关节、脑、脊髓液、皮肤、或身体其它区域或器官)。为了直接给予载体构建物，在本发明的范围内可以使用各种各样的方法。例如、如果已鉴定有在某区域起作用的动脉的话，为了直接将载体递送到该部位，可以注射到这样的动脉中。同样通过使用例如含有载体构建物的局所用药剂组成物，可以将载体构建物直接给到皮肤表面。
在直接给药中，可以将半乳凝素9突变体治疗剂和含有其它的抗自身免疫药剂的配合治疗剂一起给予。联合用药可以同时进行，例如，通过在同一载体中放置编码药剂的聚核苷酸，不管是聚核苷酸、多肽、其它的药物，将药剂加入到同一药剂组成物中，或可以在几乎同一时间，几乎同一位置将药剂加入到可以注射的其它的药剂组成物中然后给予可以完成联合用药。不同时进行联合用药时(例如，给予药物前体激活剂后，给予药物前体那样的场合)、第2个药剂为了适合治疗目的，可以通过直接注射给药。因此，象例如给予药物前体那样的场合，药物前体应当给到与药物前体激活剂同一部位。因此作为联合用药程序，可以含有用于达到治疗目的的给药组合。另外，联合用药根据需要，可以包括之后给药(例如，反复进行体内直接注射给予半乳凝素9突变体治疗那样的方式)。
本发明中，取出的细胞应当理解为能够返回到同一动物或另外的同种异系的动物或哺乳动物的细胞。这样的场合，一般来说，组织适合性最好是符合该动物(并非限定于此，例如参照Yamamoto et al.,AIDS Research and Human Retroviruses,7:911-922(1991)；Yamamoto et al.,Journal of Virology,67:601-605(1993))。
可以从患者的各个部位取出细胞。另外在本发明的其它的实施方式中，可以将载体构建物导入到例如来自皮肤的细胞(皮肤成纤维细胞等)或来自血液的细胞(例如、外周血白细胞等)。可以从血液特异取出所期望的、细胞的特定级分(例如、T细胞部分集合或干细胞等)(参照例如、WO 91/16116)。然后利用任意的上述技术使取出细胞与载体构建物接触，然后将该细胞返回到温血动物(最好是表现出自身免疫的区域付近或付近内)。
例如一旦对哺乳动物等患者进行诊断，进行包括给予半乳凝素9突变体治疗剂，或按照适于治疗的特定疾患·疾病(例如、肿瘤、变态性、自身免疫疾患等)的手法和用量将该治疗剂给予哺乳动物，以及为了决定有无必要连续给予治疗剂或修正给予进行监测哺乳动物等在内的本发明的实施。本发明中所谓实施包括对治疗的疾患进行鉴定，决定可适用于靶基因治疗的有希望细胞型或身体区域。构建半乳凝素9突变体聚核苷酸(含有用于在哺乳动物中表达的调节区域的质粒、或含有用于表达的病毒载体)，取出一些哺乳动物细胞，再用编码半乳凝素9突变体的聚核苷酸进行转染处理，然后为了使半乳凝素9突变体表达，加入到哺乳动物中。或者，聚核苷酸例如为了在疾患清楚的区域中进行表达可以投给哺乳动物。
因此，例如对于恶性肿瘤细胞的场合，通过在体内或体外使用半乳凝素9突变体可以对患部组织或脏器等肿瘤细胞进行转染处理。另外，例如对于慢性关节炎风湿病的场合，可以在体外使用半乳凝素9突变体对由关节液得到的细胞进行转染。
例如在多发性硬化症治疗中，可以向受到影响的脑区域注射半乳凝素9突变体，也可以使半乳凝素9突变体在处于自身免疫反应型的活化T细胞等攻击的细胞中容易表达。另外一个例子，对于多发性硬化症的场合，半乳凝素9突变体DNA可以局部注射于哺乳动物脑中，也可以取出来自脊髓液的细胞，将它用半乳凝素9突变体DNA进行转染处理，返回到脊髓区域。作为另外的例子，为了治疗具有肖格伦综合征的哺乳动物，作为该疾病的靶器官，也可以选择适于通过注射给予半乳凝素9突变体多肽的方式。另外对于患有肖格伦综合征的哺乳动物，也可以对罹患器官(例如、肾脏等)进行鉴定，直接将半乳凝素9突变体DNA给到该器官，也可以取出来自器官的细胞，进行转染处理，然后返回到身体使半乳凝素9突变体在哺乳动物的这些细胞中表达。
例如予防移植排斥时，接受移植的动物由于象对外来细胞、外来组织、或外来器官进行攻击那样捕杀活化患者细胞，所以可以局部或全身给予半乳凝素9突变体治疗剂，为了能够暂时对患者身体内器官进行保护，在移植开始前也可以使半乳凝素9突变体多肽在器官外表面上的细胞中进行表达。接受移植的人的免疫系在顺应外来细胞、外来组织、或外来器官之前期间，连续给予半乳凝素9突变体治疗剂大概是很有必要的。
预期半乳凝素9突变体治疗剂具有类似于天然半乳凝素9的作用。为了引起凋亡反应可以使用半乳凝素9突变体治疗剂。因此，在临床医疗中，为了达到凋亡，应当可以从化学计量上知道需要表达或给予哺乳动物的半乳凝素9突变体量。就本发明的其它方式来说，本说明书中公开的载体构建物当然也可以指示来自非载体的基因的表达。例如，与适于与半乳凝素9突变体一起给予的药物前体系可以起到用于基因治疗的安全机构的作用，也可以用作并用治疗剂。
也可以使药物前体激活剂与半乳凝素9突变体一起在载体中表达，确保安全机构。如果决定该活化系应当被停止，给予药物前体，使该药物前体激活剂活化。通过这样治疗，可以赋予临床医治基因治疗期间的调控手段。药物前体激活剂/药物前体系可用于哺乳动物(例如、自身免疫由于半乳凝素9突变体表达恶化的那样场合)中转染细胞的钝化。药物前体激活剂/药物前体系为了能够使用通过该系提供的药物前体活化的细胞伤害作用，可以进行组合治疗，或在治疗剂中并用给予使用。
包括与药物前体激活剂和药物前体一起给予编码半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸的治疗可以是免疫调节性的治疗。所谓免疫调节性指的是引起性质或效力与因子不存在下发生的免疫应答不同的免疫应答的因子的使用，该因子可以是与免疫应答有关的一个以上细胞制造的，也可以外源添加到细胞的因子。应答的性质或效力可以通过同行众所周知的各种分析(例如、测定细胞增殖(例如、3H胸腺嘧啶脱氧核苷的搀入)的体外分析和体外细胞伤害分析(包括例如测定51Cr的释放))进行测定(参照Warner et al.,AIDS Res.and HumanRetroviruses,7:645-655(1991))。作为免疫调节因子，是在体内和体外都具有活性的因子。这样的因子的代表例如细胞因子(例如、白介素2,4,6,12和15)、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、GM-CSF、G-CSF、和肿瘤坏死因子(TNF)等。作为其它的免疫调节因子，例如CD3,ICAM-1,ICAM-2,LFA-1,LFA-3,MHC类I分子,MHC类II分子、β2-巨球蛋白、伴侣、其类似物等。而且当基因递送载体不表达作为细胞因子的免疫调节辅因子时，该细胞因子可以包含在上述的组成物中，与上述的组成物同时或延后给予。需要时，在这样的实施方式中，免疫调节补因子最好是根据该领域中已知的标准的程序和给药量给予。例如、α干扰素在2～4个月间可以按照100～500万单位/日给药量给予，而IL-2可以在2～12周间，按照1～3次/日、10,000～100,000单位/kg体重的给药量给予。γ干扰素例如为了通过给予半乳凝素9突变体达到更有效的治疗，为了在活化T细胞中对问题基因的表达进行正调节，可以按照2～12周间、2～3次/周、150,000～1,500,000单位的给药量给予。
在并用治疗剂中，药物前体激活剂也可以由该激活剂的载体表达，也可以由与半乳凝素9突变体多肽同样的载体进行表达。可以将任一种载体系(单一载体或2个载体)通过体内或体外手段给予。在自身免疫治疗中，例如，药物前体激活剂的添加可以更进一步促进支持由半乳凝素9突变体达到的效果的免疫调节效果，而药物前体添加可以对转染细胞的杀伤再进行活化。
伴侣分子可以在聚核苷酸治疗药给予前、给予同时，或给予后给予，而伴侣分子可以是例如热休克蛋白质(例如、hsp70)。在哺乳动物中表达的聚核苷酸可以再与例如用于确实只在所期望靶细胞进行聚核苷酸表达目的的诱导启动子(例如、组织特异的启动子)连接。为了将聚核苷酸有效地递送到组织的目的，聚核苷酸可以与适合于向该组织的细胞基因组整合的核苷酸序列邻接。
对于本发明的这一方式和许多方式，对人进行治疗的有效性最初可以在所定的自身免疫疾患动物模型中进行试验。作为这样的现存动物模型，包括例如肖格伦综合征(自身免疫泪腺炎或免疫媒介唾液腺炎)、自身免疫心肌炎、原发性胆汁性肝硬变(PBC)、炎症性心疾患、水银诱导性肾脏自身免疫、胰岛素依赖性糖尿病(I型糖尿病或IDD)、胸腺摘出后自身免疫、中枢神经系(CNS)脱髓损伤、CNS狼疮、发作性睡眠、重症肌无力症(MG)、突眼性甲状腺肿、免疫媒介PNS损伤、变形性关节症、慢性关节风湿病、葡萄膜炎、髓质囊胞性纤维症、自身免疫溶血性疾患、自身免疫脉管炎、卵巢自身免疫疾患、和人强皮症(schleroderma)等在内的自身免疫疾患动物模型。
可以将多个基因递送载体给予动物或植物。在理想的实施方式中，动物为温血动物，最好是从小鼠、鸡、牛、猪、宠物(例如、猫和狗)、马、和人中选择。至于多肽治疗药(例如、半乳凝素9突变体或其它细胞因子)，给药量可以是约5～50μg/kg哺乳动物体重、或约50μg/kg～约5mg/kg、或约100～500μg/kg哺乳动物体重和约200～约250μg/kg的范围。
关于多肽治疗药(例如编码天然或变异体的半乳凝素9突变体多肽的聚核苷酸等)在以组织为靶的给药中，根据聚核苷酸在患者(例如、哺乳动物)中的表达，可以象下面那样给予含有编码序列或非编码序列的可表达构建物的载体:在局部给药的基因治疗程序中，可以在约100ng～约200mg DNA、或约500ng～约50mg DNA、或约1μg～约2mg DNA、或约5μg DNA～约500μg DNA范围内给药，而在基因治疗程序中的局部给药中间，可以在约20μg～约100μg范围给药，例如每次注射或给药，按照约500μg的用量给药。期望更多表达时，遍及组织的更广的区域，按照连续给药程序再给予更多的量的DNA或同样量的DNA，例如可以向肿瘤部位附近不同的或紧连的组织部分给予一些，这样给药对于带来阳性的治疗结果很有必要。
有关低分子治疗药的给予，可以根据低分子的效力改变给药量。如果是非常强的抑制剂，其给药量如用哺乳动物每公斤的量表示的话，例如、在约1μg/kg～约500mg/kg、或约100μg/kg～约5mg/kg、或约1μg/kg～约50μg/kg、或例如约10μg/kg的范围非常充分。就肽和类肽的给药来说，效力因给药量而有所变化，可以是约1μg/kg～约500mg/kg哺乳动物体重、和约100μg/kg～约5mg/kg、和约1μg/kg～约50μg/kg的范围。而通常的用量可以是约10μg/kg。
本发明的活性成分可以在很宽范围选择该成分的给药量给药，该给药量和给药次数等可以根据治疗患者的性别、年龄、体重、一般的健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄速度、药物的组合、患者此时进行治疗的病状的程度考虑这些因素或其它要因之后决定。
在进行药物品制造时，其添加剂等和制备法等可以参考例如日本药局方解说书编集委员会编、第十四改正日本药局方解说书、平成13年6月27日发行、株式会社广川书店；一番ヶ瀬尚他编医药品的开发12卷(制剂素剂〔I〕)、平成2年10月15日发行、株式会社广川书店；同、医药品的开发12卷(制剂素材〔II〕)平成2年10月28日发行、株式会社广川书店等记载，从这些记载中根据需要适当选择运用。
本发明的活性成分包括本说明书中说明的(a)半乳凝素9突变体以及与其具有基本上均等的生物活性的多肽等、(b)编码半乳凝素9突变体以及与其具有基本上均等的生物活性的多肽的聚核苷酸、(c)利用半乳凝素9突变体技术发现的因子等、(d)半乳凝素9突变体以及与其具有基本上均等的生物活性的多肽基因递送载体等，这些成分在利用人半乳凝素9对正常细胞不表现出伤害活性，而对肿瘤细胞表现伤害细胞活性的性状、对肿瘤细胞诱导凋亡，但对正常细胞不诱导凋亡的性状、抑制恶性细胞的转移性的性状、诱导被活化的免疫细胞、特别是活化的CD4阳性T细胞的凋亡的活性(与此相反，静息T细胞、特别是CD4阳性T细胞(协助者T细胞)的凋亡诱导称之为不诱导凋亡的性状)等上是有用的，有望作为利用与抗肿瘤剂、抗变态性剂、免疫调节剂、自身免疫疾患用剂、抗炎症剂、肾上腺皮质类固醇激素同样活性的药剂。
根据使用本发明的活性成分、例如半乳凝素9突变体(特别是G9NC(null))确认的生物活性效果，认为半乳凝素9以及半乳凝素9突变体(特别是G9NC(null))对于如下给出的那样病的症状和疾患表现出有用的生物活性。
在炎症性疾患中有各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免疫性的炎症、感染症等。
作为急性和慢性疾患，包括例如肺炎中支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺脏炎、细支气管炎和急性纵隔炎等，以及其它的的脏器的炎症，例如心外膜炎、心内膜炎、心肌炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、虫垂炎、缺血性大肠炎、药物性大肠炎、直肠炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重症肝炎、慢性肝炎等各种急性和慢性肝炎和肝硬变、胆囊炎、急性胰炎、慢性胰炎、还有急性和慢性肾炎、膜性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症等和各种各样的膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角膜炎、干性角结膜炎、各种中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸等、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎等各种各样的炎症。
另外，在神经性炎症(例如神经性胃炎、神经性膀胱炎等)中也看到了效果。例如，通过实施例8确认，半乳凝素9在辣椒辣素诱导神经性皮炎症模型中对模型的炎症反应具有强的抑制效果。辣椒辣素是通过刺激末梢神经引起神经性炎症和疼痛的物质。辣椒辣素具有刺激储藏在作为知觉神经C纤维末端的神经肽的物质P释放的作用。物质P具有使组胺从肥大细胞释放的作用，结果血管被扩张，出现浮肿。另外，由于释放的组胺作用，知觉神经受到刺激，物质P由C纤维末端释放，作用于其周围的肥大细胞，出现再使组胺释放的增强循环。半乳凝素具有抑制该病态形成的作用。
再者辣椒辣素与感觉神经末梢的疼痛受容传感器的辣椒辣素受体(香草素受体)结合，引起疼痛。疼痛是由于化学刺激(酸等)、热刺激(开水等)或过度的机械刺激(创伤等)感觉神经末梢被活化引起的，辣椒辣素受体也参与由于这样的刺激引起的疼痛。这表明半乳凝素9抑制由辣椒辣素受体导致的神经末梢的活化，预期有可能具有使伴随癌或炎症引起的疼痛减轻等镇痛作用。
变态性炎症疾患如全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻炎、变态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等。
另外自身免疫性的炎症(自身免疫疾患)中有全身性(慢性关节风湿病、全身性红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎·皮肤肌炎、肖格伦综合征、贝切特病等)、神经系(多发性硬化症、重症肌无力症、HAM(HTLV-1脊髓症)、肌萎缩性侧索硬化症等)、内分泌性(巴泽多病、桥本病、1型糖尿病等)、血液(特发性血小板减少性紫斑病、自身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等)、呼吸器(结节病、肺纤维症等)、消化管(溃疡性大肠炎、克罗恩病等)、肝脏(自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎等)、肾·尿路系(抗嗜中性白细胞细胞质抗体关联肾炎、血管炎、Goodpasture综合征、抗丝球体基底膜抗体病等)等。
感染症是病原体由于生物体的细胞·组织·脏器产生的疾患的总称。关于感染症可以参考监修：町并陆生、编集：秦顺一、坂本穆彦、「标准病理学(第2版)」、医学书院、2002年3月15日发行。引起人感染症的病原体有1)细菌(包括螺旋体、衣原体、立克次体)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻类)、5)原虫、6)寄生虫(吸虫、条虫、线虫)、7)节足动物。各病原体引起的主要的疾患如细菌性感染症(霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等)、螺旋体感染症(钩端螺旋体病等)、衣原体感染症(鹦鹉病等)、立克次体感染症(斑疹伤寒、破伤风等)、病毒性感染症(带状疱疹、病毒性出血热、狂犬病等)、真菌症(念珠菌病、隐球菌病、曲霉菌病等)、原虫性疾患(阿米巴性痢疾、疟疾、弓形体病等)、寄生虫(吸虫症、线虫症等)、以及支原体感染症(支原体肺炎等)、分支杆菌感染症(结核、非定型抗酸菌症等)。
至于癌和肉瘤，如脑肿瘤(多形形恶性胶质肿等)、脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、前立腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮肿、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性淋巴肉芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质瘤等。
也适用皮肤科领域，例如1)在皮肤疾患中存在着包括感染症、变态性炎症和自身免疫性炎症在内的炎症和干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等特有的炎症。另外2)与美容皮肤科关系，
a)黑色素代谢调节(美白)···半乳凝素9基因导入黑素瘤细胞，由黑色调向白色变化。皮肤基底细胞层有半乳凝素9阳性细胞。
b)毛发成长(生发)的调节···毛根部有半乳凝素9表达，随时期而变。半乳凝素9基因导入小鼠的毛发的成长与突变体半乳凝素9基因导入小鼠相比非常好。
c)胶原产生调节等···成纤维细胞通过各种刺激有半乳凝素9表达、纤维结缔组织有半乳凝素9阳性的部分。
至于生活习惯病如高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等。已阐明与生活习惯病动脉硬化症的病态形成有关的细胞之一泡沫细胞中存在着gal9阳性细胞和阴性细胞。因此，表明gal9与动脉硬化症的病态有关，不可否认通过控制它，治疗或予防成为可能。至于高血压，在动物实验模型高血压发症时由于半乳凝素9在尿细管或丝球体中的表达增强，所以有时对半乳凝素9表达进行控制，通过给予半乳凝素9能够治疗的可能性增大。
另外，也适用于正常细菌丛的维持，例如、gal9在肠管上皮正常强烈表达，另外对于给予恶玉细菌丛时，半乳凝素9在肠管上皮和巨噬细胞等炎症细胞中的表达增强。由此明显表示出半乳凝素9与消化管中正常细菌丛的维持有关。
另外，在可适用于淀粉样变性，例如在确认淀粉样变性的部分的巨噬细胞中，有表现出半乳凝素9表达的巨噬细胞存在。存在着通过半乳凝素9可以控制淀粉样沉积的可能性。
认为对阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等也有用，例如、在阿尔茨海默病患者的脑中变性的神经细胞表现出半乳凝素9阳性特征。因此存在可用于治疗和诊断的可能性。另外在骨质疏松症中，认为半乳凝素9有抑制骨吸收，促进骨形成的可能性。这样的作用从骨代谢方面考虑，认为是理想的药剂。
另外在脑、神经领域中也有用，例如、脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进展伴随着炎症细胞的湿润，引起超氧化物产生等进一步恶化。预期半乳凝素9和半乳凝素9突变体可控制这样的炎症。作为炎症、免疫系的变化为原因的脱骨髓性疾患，例如多发性硬化症等。作为变性疾患，如肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病等。另外综合失调症可以说原因是某种炎症性的变化。即EPA(二十碳五烯酸)可用于脑中炎症反应的控制和神经细胞膜的形成。在综合失调症患者中，有细胞膜中的EPA和其它的必需脂肪酸表现出枯竭的研究例。
预期半乳凝素9和半乳凝素9突变体对痛风也有用。预期半乳凝素9和半乳凝素9突变体对于对尿酸结晶的组织沉着的疼痛的强急性炎症也能进行控制。
哮喘是引起可逆性呼吸道阻塞(哮喘发作)的呼吸器疾患，指的是对抗原特异的(变态原)或非特异的(感染、冷气等)刺激，呼吸道反应性亢进的状态。近年证明对于哮喘的呼吸道在不发作的稳定期存在以嗜酸性细胞、T淋巴细胞、和肥大细胞为主体的炎症，现在，认为是哮喘本身慢性的支气管炎。另外、很多的小儿哮喘与特应性起因(IgE产生)的关联虽然强(特应型哮喘)、在成人哮喘中约半数被确认不能证明与IgE有关(非特应型哮喘)。哮喘予防·管理指导原则(1998年厚生省研究班)已出台，哮喘治疗可以分为急性发作和慢性呼吸道炎症两种。作为发作治疗药，支气管扩张药(β2刺激药、氨茶碱)可用作第一选择药，在中等症以上的发作中用这些药剂不充分，要进行类固醇药的大量全身给药。类固醇药副作用大、特别是消化性溃疡、高血压、高血糖、精神症状等重大，如果长期使用，感染症、肾上腺抑制、骨质疏松症等逐渐成为问题。另外伴随着合併症的场合类固醇的使用伴随着危险。期盼副作用少、具有与类固醇同等效果的药剂的开发。作为长期的管理药，在慢性呼吸道炎症的治疗中抗炎症药为主体，其中推荐吸入类固醇药的使用。长期大量使用该类固醇药时，肾上腺抑制、骨质疏松症、呼吸道感染等副作用出现的可能性不能否定。另外、吸入药要求正确吸入手技，与内服药比较，在顺应性这点差。就中等症以上的哮喘来说，除了吸入类固醇药之外，推荐吸入β2刺激药、白三烯拮抗药或并用缓释性茶碱药。如果是重症例，不得已只能全身给予类固醇。期盼开发取代这样药剂的药剂。
已知在哮喘的病态形成中，对T淋巴细胞、嗜酸性细胞的肺组织以及呼吸道的浸润起着重要的作用。另外半乳凝素9具有诱导细胞凋亡的功能，诱导活化T细胞和嗜酸性细胞的凋亡。按照这样的思路，根据本发明中使用半乳凝素9突变体等的研究，显然半乳凝素9和半乳凝素9突变体具有改善(抑制)哮喘中呼吸道炎症的活性。
而半乳凝素9和半乳凝素9突变体具有增强成骨细胞增殖和分化以及抑制破骨细胞分化的活性，认为对于骨质疏松症的予防和/或治疗、类固醇长期给药中成为问题的副作用之一骨生长抑制也有效。
半乳凝素9和半乳凝素9突变体在对淋巴细胞的作用中与类固醇不同，表现出活化淋巴细胞特异的抑制作用，与类固醇相比，预期副作用、例如、免疫抑制少。另外，还具有抑制类固醇中不存在的粘附分子的功能以及抑制神经性炎症的作用，有望作为哮喘治疗、例如发作治疗药。另外认为可减轻类固醇的副作用。
实施例
以下给出实施例，对本发明进行具体说明，该实施例只是为了对本发明进行说明，用于其具体方式的参考提供的。这些实施例是为了说明本发明的特定的具体方式的例子，并不表示限定或限制本申请书公开的发明范围。本发明应当理解为源于本说明书的思想的各种各样的可实施方式。
所有的实施例除了另外详细记载的以外，使用的标准的技术实施的或可以实施的例子，这些对于同行众所周知、惯用的技术。而在以下的实施例中，没有特别指出时，具体的操作和处理条件等，DNA克隆根据J.Sambrook,E.F.Fritsch&T.Maniatis,"MolecularCloning",2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,N.Y.(1989)和D.M.Glover et al.ed.,"DNA Cloning",2nd ed.,Vol.1to 4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995)；使用PCR法を时根据H.A.Erliched.,PCR Technology,Stockton Press,1989；D.M.Glover et al.ed.,"DNA Cloning",2nd ed.,Vol.1,(The Practical ApproachSeries),IRL Press,Oxford University Press(1995)和M.A.Innis et al.ed.,"PCR Protocols",Academic Press,New York(1990)所述的方法进行，而使用市售的试剂或试剂盒时使用附带的指示书(protocols)和添付的药品等。
实施例1
(A)半乳凝素9突变体表达载的构建
在制作表达载体时，使用
(1)由Jurkat细胞的poly(A)+RNA级分制备的cDNA
(2)pET-11a载体(STRATAGENE)
(3)PCR用引物：
G9NCRD1:CGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG序列10
G9NCRD6:CGACCGCATATGCTGGAAGCTGATGTAGGACAG序列11
G9CCRD5:CGTCCTCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATG序列12
G9CCRD6:CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG序列13
Jurkat细胞(来自T细胞的细胞)由美国模式培养物保藏所(ATCC)获得。细胞系于添加了10％FCS的RPMI-1640培养基(Sigma、圣路易斯、美国)中在5％CO2的条件下维持在37℃。从Jurkat细胞提取总RNA象下面那样进行。即将使用含有10％FBS的RPMI-1640培养基培养的Jurkat细胞进行离心、收集。用10mlPBS将细胞清洗2次。向清洗后的细胞沉淀按照每2x 108个细胞加15mlISOGEN(商品名：日本人)，按照指南(日本人)提取总RNA。从总RNA纯化poly(A)+RNA和cDNA合成象下面那样进行。即，将从Jurkat细胞提取的总RNA按照终浓度为1mg/ml浓度那样溶解于DEPC处理水中。使用PolyATtract mRNA Isolation System(商品名：Promega)，根据指南从总RNA纯化poly(A)+RNA。将纯化的poly(A)+RNA按照终浓度为5μg/20μl溶解于DEPC处理水中。
使用First-Strand cDNA合成试剂盒(商品名：AmershamBiosciences)，按照指南由5μg的poly(A)+RNA合成cDNA(对于引物使用Not I-d(T)18)。
接下来，按照图1所示顺序，在pET-11a载体NdeI-BamHI位点插入半乳凝素9的N-末端侧糖链结合结构域(N-terminalcarbohydrate recognition domain,NCRD)和C-末端侧糖链结合结构域(CCRD)，制作缺少连接肽的改变型半乳凝素9(G9NC(null))的表达载体。首先从半乳凝素9cDNA分别取得(1)对应于人半乳凝素9的C-末端侧CRD的cDNA和(2)对应于人半乳凝素9的N-末端侧CRD的cDNA。即使用PCR用引物：G9CCRD5+G9CCRD6从cDNA扩增对应于人半乳凝素9的C-末端侧CRD的cDNA(G9CCRD)。将G9CCRD用制限酶(NdeI+BamHI)切后，插入到用同样制限酶处理的pET-11a载体，得到pET-G9CCRD。PCR使用KOD DNA聚合酶试剂盒(TOYOBO CodeNo.KOD-101)进行。使PCR反应混合物(dNTP mix,25mM MgCl2,10×Buffer,KOD DNA聚合酶(0.05u),引物和模板cDNA)在以下那样的PCR的循环条件下进行反应：94℃处理2分钟后，进行25次循环(98℃下15秒、然后65℃下2秒、而后74℃下处理30秒)，最后于4℃下停止反应。被PCR扩增的片段向载体的插入使用Ligation highkit(TOYOBO Code No.LGK-101)进行。反应按照插入片段:载体的摩尔比为约5：1进行混合，加其总DNA溶液(体积)量的1/2(体积)量的试剂Ligation high混合后进行。通过于16℃反应16小时(O/N)进行插入。
另外使用PCR用引物：G9NCRD1+G9NCRD6从该半乳凝素9cDNA扩增对应于人半乳凝素9的N-末端侧CRD的cDNA(G9NCRD)。将G9NCRD用制限酶(NdeI)切断后，将得到的片段用同样的制限酶(NdeI)处理，再插入到脱磷酸化的pET-G9CCRD中得到pET-G9NC(null)。PCR扩增以及向载体的整合与上述同样进行。pET-G9NC(null)编码具有将人的M型半乳凝素9的第149位Pro开始至第177位Ser的29个氨基酸序列置换为His-Met序列的氨基酸序列的多肽。即是具有序列1所示的碱基序列，编码具有序列2所示的氨基酸序列的多肽。
(B)半乳凝素9突变体重组蛋白质的表达和纯化
将上述工程(A)得到的表达用质粒载体pET-G9NC(null)导入大肠杆菌(BL21(DE3))。导入通过电穿孔法进行。即将感受态BL21(DE3)和质粒载体水溶液混合，通过使用1.8kV电压的电穿孔法进行转染。
重组蛋白质的表达通过将大肠杆菌于含有2％(w/v)葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养，当600nm的吸光度达到0.7时，添加0.1M异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(最终浓度0.1mM)，诱导重组蛋白质的表达来进行。于20℃培养18小时后，通过离心收集菌体，悬浮于10mM Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,1mM DTT,1mM PMSF中。将悬浮液进行10分钟超声波处理后，加10％(w/v)Triton X-100(最终浓度1％)，于4℃下搅拌30分钟。于15,000×g下离心30分钟，将得到的上清液中的重组蛋白质通过使用乳糖-琼脂糖的亲和层析进行纯化。
结果纯度高的标准品以比较高的收率获得。得到的重组蛋白质的电泳结果如图2所示。SDS-PAGE条件如下:Gel,Acrylamide-BIS(12％gel),电泳用缓冲液,25mM Tris-192mM甘氨酸-0.1％SDS,泳动条件,180V,45min.,染色,CBB,60℃/30min.电泳样品吸附于Strata CleanTM Resin(Stratagene)，用1×样品缓冲液(62.5mMTris-HCl,Ph6.8,2％(w/v)SDS,5％(W/V)2-ME,Glycerol)调整到0.2mg/ml，98℃/3min.热处理后以每条带约2μg的蛋白质量进行电泳。
纯化的G9NC(null)于4℃下可以稳定保存90天以上。而野生型的半乳凝素9(M-type、G9(M))在同一保存条件下在2周以内大部分被分解(参照图3)。该分解被认为是由于纯化半乳凝素标准品中含有来自大肠杆菌的蛋白水解酶引起的。
实施例2
比较野生型的半乳凝素9(S-type、G9(S)：带有最短连接肽的同种型)和G9NC(null)对存在于人组织中的蛋白水解酶的敏感性。向溶解于PBS的半乳凝素中加1/100(重量比)的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)或弹性蛋白酶，于37℃下保温。任一场合下G9(S)大部分都在1～2小时被分解，而相反G9NC(null)在2小时后还完全没有被分解(参照图4和5)。
实施例3
为了研究寄予半乳凝素9生物活性的变异导入的效果，研究了对MOLT-4细胞(来自人Tcell leukemia的细胞株)的凋亡诱导活性和对外周血嗜酸性细胞的趋化活性(eosinophil chemoattractantactivity、ECA activity)。
(a)细胞培养物
MOLT－4(T细胞)由ATCC获得。所有细胞系都在添加了10％FCS的RPMI－1640培养基(Sigma、圣路易斯、美国)中维持在5％CO2的条件、37℃下。为了抑制Gal－9的活性，在培养用培养基中添加30mM的乳糖。作为对照使用同浓度的蔗糖。
(b)凋亡分析
(1)利用PI进行细胞周期(apoptosis)解析(PI法)
将被凋亡诱导处理的细胞于4℃、1000rpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再悬浮于PBS(300μl)，一边涡旋、一边向细胞悬浮液慢慢添加100％冷乙醇(700μl)，使终浓度变为70％乙醇。于4℃下进行30分钟温育处理，对细胞进行固定，然后加PBS(1ml)，于4℃、1000rpm下进行5分钟离心处理后，将细胞团再悬浮于PBS(440μl)。将细胞与2.5mg/ml的核酸酶A(10μl，终浓度50μg/ml，Sigma，圣路易斯、密苏里州、美国)一起于37℃下进行30分钟温育处理，然后与2.5mg/ml的碘化丙锭(4μl；PI，终浓度20μg/ml，Sigma)一起于4℃、暗中进行10分钟温育处理。通过尼龙筛除去变成集块的细胞后，于PBS中对细胞进行计数，通过流式细胞仪(Sandstrom,aK.etal.,J Immunol Methods,240:55(2000)以及Zhang L.et al.,CancerLett,142:129(1999))对染色细胞进行解析。
(2)TUNEL(TdT-mediated标记dUTP nick end labeling)法
对于通过DNA的片段化产生的末端，用在DNA末端附加核苷酸的酶(TdT：末端脱氧核苷酸转移酶)整合标记的核苷酸(dUTP-biotin或FITC-dUTP等)后，对作为凋亡的显著特征的细胞核DNA的片段进行检测。在实验中，使用MEBSTAIN Apoptosis Kit Direct(MBL、名古屋、日本)。根据试剂盒销售商的指示，象下述那样进行实验。即，将进行了凋亡诱导的细胞(约2×105个/样品)用含有0.2％FSA的PBS洗，然后加4％多聚甲醛(0.1MnaH2PL4,pH7.4中)，于4℃下进行30分钟固定化后，用含有0.2％FSA的PBS洗。向细胞团加70％冷乙醇后于－20℃下进行30分钟温育处理，使透过性亢进。用含有0.2％FSA的PBS洗后，向细胞团加TdT反应液(TdT、FITC-dUTP以及TdT缓冲液的混合物)，搅拌后，于37℃下进行1小时温育处理，用含有0.2％FSA的PBS洗后，再悬浮于含有0.2％FSA的PBS中，对染色细胞通过流式细胞仪进行解析。
(c)T细胞解析
用按照各个孔每孔3μg/ml的抗CD3抗体(Immunotech,Marseille、法国)的TBS液(pH8.0)对24孔板于4℃下温育过夜处理后，除去抗CD3抗体，用PBS洗涤孔，得到用抗CD3抗体包被的孔板。
使用HISTOPAQUE(登录商标、SIGMA)从加肝素的血液中分离单核白细胞细胞。然后，使用C4阳性分离试剂盒(Cd4-positiveisolation kit；DYNAL,Oslo,挪威)以及Dynabeads(登录商标)M－450CD8(DYNAL,Oslo,挪威)，按照试剂盒制造销售商所述那样分别分离CD4阳性T细胞以及CD8阳性T细胞。为了对T细胞进行活化，将CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞于含有10％FCS的RPMI－1640中调整为1×106个/ml的细胞，在37℃下在用抗CD3抗体包被的板上于5％CO2培养箱中温育处理20～24小时，然后与重组体半乳凝素9(野生型G9(S)或突变体G9NC(null))一起于37℃下在5％CO2培养箱中进行温育处理。然后，象上述(b)那样，进行凋亡·分析。即，将细胞于37℃下与50μg/ml的PI(Sigma)一起在暗处进行温育处理。将染色细胞通过流式细胞仪(Sandstrom,K.et al.,J ImmunolMethods,240:55(2000)以及Zhang L.et al.,Cancer Lett,142:129(1999))进行解析。
对于非活化(静息)T细胞与与重组体半乳凝素9(野生型G9(S)或突变体G9NC(null))一起于37℃下在5％CO2培养箱中进行温育处理后，与上述同样进行凋亡·分析。
(d)结果
将伴随凋亡出现的DNA片段化通过琼脂糖凝胶电泳和FACS进行研究，结果表明无论使用那一种方法，G9NC(null)都保持与G9(S)同等或在其以上的凋亡诱导活性(图6,表1)。通过Chamber法研究ECA活性，结果表明G9NC(null)与G9(S)比较，表现出更高的活性(图7)。
表1
已经凋亡的MOL－4细胞的比例(％)
表1表示在野生型半乳凝素9(G9(S))和半乳凝素9突变体(G9NC(null))之间，对生物活性进行比较的结果，是对MOLT-4细胞的凋亡诱导活性(FACS分析)进行研究的结果。
实施例4
〔1.半乳凝素-9在风湿病(RA)关节滑膜中的表达〕
〔方法〕
患者组织使用满足美国风湿病学会(ACR)分类基准的RA患者滑膜组织标本。患者的组织标本的免疫组织染色用以下的方法进行。标本切片的制备象下面那样进行。(1)脱石蜡：二甲苯3次(各10分钟)，100％乙醇·90％乙醇·75％乙醇(各2分钟)。(2)微波(MW)处理：用时制备10mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)。预先进行MW照射，将切片浸入沸腾的缓冲液中，进行MW照射(500w电子范围的场合，5分钟x3次，计15分钟)。于室温放置20分钟，慢慢冷却。(3)内源性过氧化物酶的钝化：用时制备0.3％过氧化氢·甲醇，浸30分钟。PBS清洗5分钟x 3次。用巴斯德移液管加4滴5％BSA进行封闭。湿润箱1小时室温。
由标本切片的上方用巴斯德移液管加6滴一次抗体或控制抗体。湿润箱过夜4℃。翌日，PBS清洗,5分钟x 3次。加6滴过氧化物酶标识二次抗体(DACO Envision+)。湿润箱,1小时,室温。PBS洗净5分钟x 3次。
用DAB(3,3'-diaminobenzidine-tetrahydrochloride)试剂进行发色：用时制备DAB试剂。浸入切片，发色3分钟。立刻用水管水停止发色反应。核染色,迈耶苏木精,20秒。立刻流水洗净,15分钟。脱水，透彻，封入。75％乙醇·90％乙醇·100％乙醇(各2分钟)，二甲苯3次(各3分钟)。
〔结果〕
结果如图53所示。确认半乳凝素-9有选择地在滑膜细胞和淋巴滤胞周围的细胞群和滤胞内的树枝状血管的内皮细胞中表达。就OA(变形关节症)来说，几乎没有看到半乳凝素-9阳性细胞(参照图53)。半乳凝素9是可被RA滑膜组织增殖的原形的滑膜细胞和淋巴系细胞以及新生血管强烈诱导的分子。另外，在滑膜细胞和血管周围细胞中检测出半乳凝素-1，在整个RA滑膜构成细胞检测出半乳凝素-3。
〔2.半乳凝素-9诱导滑膜细胞凋亡的活性〕
〔方法〕
对于半乳凝素-9对成为关节破坏原因的滑膜细胞的作用进行研究。滑膜在无菌下采取风湿病患者的滑膜组织，对细胞进行分离、培养。1～2次传代后用于实验。本实验的组织是67岁女性、右膝RA。播种滑膜细胞后、培养过夜(overnight)。确认粘附后，按照最终浓度0,0.03,0.1,0.3,1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null),rhGal-9S,rhGal-9M)。72小时培养后于光学显微镜下观察，再回收细胞，通过PI法测定凋亡(apoptosis)诱导活性。凋亡诱导活性的测定与实施例3同样实施。
〔结果〕
光学显微镜观察的结果如图54所示。通过PI法进行的凋亡诱导活性的测定结果如图55所示。
半乳凝素-9突变体(Gal-9(NC-Null))比天然型半乳凝素-9(Gal-9(M),Gal-9(S))的凋亡诱导活性更强。在所有的重组体中确认凋亡诱导活性依赖于浓度。该凋亡诱导活性可被乳糖(30mM)抑制，但不受蔗糖(30mM)的影响。
〔3.半乳凝素对滑膜细胞凋亡的诱导活性和增殖的抑制活性的比较〕
〔方法〕
对于人半乳凝素(Gal-1,Gal-3,Gal-8(M),Gal-9NC(null))对滑膜细胞的作用进行了研究。
对于半乳凝素-9对成为关节破坏原因的滑膜细胞的作用进行了研究。
滑膜在无菌下采取风湿病患者的滑膜组织，对细胞进行分离、培养。1～2次传代后用于实验。确认过夜播种的滑膜细胞粘附后，按照最终浓度0,0.03,0.1,0.3,1.0μM添加rhGal-9(hG9NC(null),rhGal-9S,rhGal-9M)。24小时培养后回收细胞，通过PI法测定凋亡诱导活性。抑制滑膜细胞增殖的效果按照人半乳凝素最终浓度为0,0.03,0.1,0.3,1.0μM那样添加到96孔板的各个孔中，培养48小时。培养后用PBS清洗板内，使用细胞计数试剂盒-F(同仁化学、cat.no.343-07743)，用荧光板式读取仪测发出强荧光(λex＝490nm、λem＝515nm)的活细胞数。
〔结果〕
凋亡诱导活性测定的结果如图56所示，抑制滑膜细胞增殖的活性的测定结果如图57(图中、hGalectin 1表示重组人半乳凝素1，hGalectin 3表示重组人半乳凝素3，hGalectin 8(M)表示重组人半乳凝素8M，hGalectin 9表示hGal-9NC null)所示。抑制滑膜细胞的增殖在风湿病治疗中非常重要。
半乳凝素-9突变体(hGal-9NC null)由于诱导增殖的滑膜细胞的凋亡，抑制滑膜细胞的增殖，所以作为抗风湿病药是有用的。其它的半乳凝素没有看到这样的作用。
研究了半乳凝素9突变体h-G9NC(null)在各种炎症疾患、即急性·慢性、变态性、免疫系疾患的小鼠模型中的效果。
该结果表明半乳凝素9突变体对各种炎症具有抑制或增强作用以及对各种细胞因子产生具有调控作用，所以可以控制炎症反应。对该实施例进行了记载。
在以下的实施例〔实施例5～12中，G9NC(null)〔gal9NC(null)、h-gal9NC(null)、hG9NC(null)或h-G9NC(null):人·null·半乳凝素9(human null galectin-9)〕是Galpharma(株)(香川县、日本)研究所制造的产品。地塞米松(dexamethasone；dexamethasone21-phosphate disodium salt,Sigma-Aldrich公司,MO,美国)可从供货商购入。
实施例5
〔酵母多糖诱导胸膜炎模型〕
首先将小鼠用二乙基二乙醚(和光纯药)麻醉，将G9NC(null)〔或h-gal9NC(null)〕100μg、酵母多糖(SigmaAldrich公司)100μg、地塞米松(SigmaAldrich公司)30mg/kg单独或混合后注射到小鼠的胸腔内。对照使用PBS。4小时后，向小鼠腹腔内注射0.2至0.3ml用PBS稀释10倍的戊巴比妥注射液(商品名：戊巴比妥、大日本制药株式会社)，麻醉后，开腹由腹部大动脉采血，作为血液样品。然后，脱血后使其安乐死，用PBS(1ml)将胸腔内清洗2次，回收作为胸腔洗净液样品。
血液样品于常温静置后，经5000rpm离心10min，回收上清作为血清样品，冷冻干燥保存。胸腔洗净液样品于特克液中对总细胞数进行计数。计数后，将一部分加到cytospin，进行风干，用Diff-Quik(国际试剂株式会社)或May-Gruewald氏染色液(武藤化学株式会社)和吉姆萨液(Merck,日本)进行染色、镜检、对总细胞数200个中的中性白细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、其它的肥大细胞等进行计数。结果如图9和图10所示。
实施例6
〔PMA诱导皮炎模型〕
豆蔻酸佛波乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA,SigmaAldrich公司,MO,美国)从供货商购入。为了投给动物，在全部的实验中作为载体(vehicle)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后进行(以下的实施例中也同样)。
Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入。为了做到使动物能够自由地摄取适当饵料和水，保持在12小时昼夜节奏的标准条件下。所有的动物按照国际的指导原则和国内法通过人工进行管理(以下的实施例中也同样)。
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。
1将5mg的豆蔻酸佛波乙酯(PMA)溶解于30ml的丙酮中，用于各小鼠(BALB/c,♀,7～8周龄,SPF,SLC社)的右耳的内侧和外侧的表面。作为对照将丙酮用于左耳上。在PMA使用的30分钟前i.p.(0.345ml/head)注入G9NC(null)、地塞米松、或载体。在PMA注射后0,2,4,8和24小时，使用校正厚度计(Mitsutoyo,东京,日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。
耳浮肿用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L分别表示各个时点的厚度值。
数据的统计处理如下进行。没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析，而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Bonferroni post-test评价。P值<0.05统计学上认为有意义。详细如图所示(在以下的实施例中也同样)。结果如图11所示。
实施例7
〔花生四烯酸诱导皮炎模型〕
花生四烯酸(AA,SigmaAldrich公司,MO,美国)从供货商购入。其它同实施例6。
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。
将750mg的花生四烯酸(AA)溶解于30ml的丙酮中，用于各小鼠(BALB/c,♀,7～8周龄,SPF,SLC社)的右耳的内侧和外侧的表面。作为对照将丙酮用于左耳上。在AA使用的30分钟前进行i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或载体。在AA注射后第0,1,3和第6小时，使用校正厚度计(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、东京、日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮肿。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L分别表示各个时点的厚度值。数据的统计处理与实施例6同样进行。结果如图12所示。
实施例8
〔辣椒辣素诱导皮炎模型〕
cyproheptadine(Sigma Aldrich公司,MO,美国)和辣椒辣素(capsaicin,Nakarai社,东京,日本)从各供货商购入。其它同实施例6
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。
将500mg的辣椒辣素溶解于30ml的丙酮/橄榄油(容量比＝4/1)中，用于各小鼠(BALB/c,♀,7～8周龄,SPF,SLC社)的右耳的内侧和外侧的表面。作为对照将丙酮/橄榄油(容量比＝4/1)用于左耳上。在辣椒辣素使用的30分钟前i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、cyproheptadine或载体。在辣椒辣素注射后第0,0.5,1和2小时，使用校正厚度计(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、东京、日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮肿。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各个时点的厚度值。数据的统计处理与实施例6同样进行。结果如图13所示
实施例9
〔DNFB诱导接触皮炎模型〕
2,4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB),SigmaAldrich公司,MO,美国)从供货商购入。其它同实施例6。
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。在7日前(day-7)或6日前(day-6)将含有0.5％的2,4-二硝基-1-氟苯(DNFB)丙酮/橄榄油(容量比＝4/1)液(30ml)适用于各小鼠的剃去毛的腹部，致敏后作为延迟型过敏症(DTH)诱发的浮肿模型。在实验开始日(day 0)将含有0.3％DNFB的丙酮/橄榄油(容量比＝4/1)液(30ml)局部适用于各小鼠的右耳的内侧以及外侧的表面，进行诱发。作为对照将丙酮/橄榄油适用于左耳。从DNFB诱发的7日前(day-7)至实验开始日(day 0)，以及DNFB诱发24小时后或48小时后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或载体。DNFB诱发后、0,24,48及第72小时使用校正厚度计(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、东京、日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮肿。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各个时点的厚度值。数据的统计处理与实施例6同样进行。结果如图14和15所示。
实施例10
〔FITC诱导特应性皮炎模型〕
异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate(FITC),SigmaAldrich公司,MO,美国)从供货商购入。其它同实施例6。
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。在7日前(day-7)或6日前(day-6)将含有0.5％的异硫氰酸荧光素(FITC)的丙酮/邻苯二甲酸二丁酯(容量比＝1/1)溶液(400ml)适用于各小鼠的剃去毛的腹部，致敏后作为FITC诱发的浮肿模型。在实验开始日(day 0)将丙酮/邻苯二甲酸二丁酯(容量比＝1/1)溶液(30ml)局所适用于各小鼠的右耳的内侧以及外侧的表面，进行诱发。作为对照将丙酮/邻苯二甲酸二丁酯适用于左耳。
从FITC诱发的30分钟前，以及FITC诱发24小时后或48小时后i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或载体。FITC诱发后、0,24,48及第72小时使用校正厚度计(calibratedthickness gauge；Mitsutoyo、东京、日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。用(R-L)-(R0-L0)表示耳浮肿。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各个时点的厚度值。数据的统计处理与实施例6同样进行。结果如图16所示。
实施例11
〔荨麻疹模型〕
抗DNP IgE(anti-DNP IgE(SPE7),SigmaAldrich公司,MO,美国)和2,4-二硝基-1-氟苯(dinitro-fluoro-benzene(DNFB),SigmaAldrich公司,MO,美国)从各供货商购入。其它同实施例6。
象下面那样诱导小鼠耳浮肿。在1日前(day-7)将含有抗DNP IgE(5mg/小鼠)的PBS(-)液进行i.v.注射，致敏，做成2相性皮肤反应模型。在实验开始日(day 0)将含有0.15％DNFB的丙酮/橄榄油(容量比＝4/1)液(30ml)适用于各小鼠的右耳的内侧以及外侧的表面，进行诱发。作为对照将丙酮/橄榄油适用于左耳。
从DNFB诱发的30分钟前，i.p.(0.345ml/head)注射G9NC(null)、地塞米松、或载体。DNFB诱发后、在第0,1,2,4,8和第24小时使用校正厚度计(calibrated thickness gauge；Mitsutoyo、东京、日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。耳浮肿用(R-L)-(R0-L0)表示。其中R0和L0分别表示实验开始时(0h)的右耳厚度和左耳厚度，R和L表示各个时点的厚度值。数据的统计处理与实施例6同样进行。结果如图17和18所示。
实施例12
〔关节炎模型〕
使用DBA/1J雌性小鼠(7周龄)，将关节炎激发用单克隆抗体混合物(Chondrex社、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入动物的尾静脉。注入3日后向动物的腹腔内注射预先混合了5μg/0.2mL的LPS(SIGMA,L6511)和各浓度的h-Gal9NC(null)的样品100μL。注射样品后，1日1次左右测定前后肢的关节肿胀，进行打分。结果を图19所示。
研究h-G9NC(null)在作为急性炎症模型的代表性的酵母多糖诱导胸膜炎模型(实施例5)和LPS诱导腹膜炎模型中的效果。在酵母多糖诱导胸膜炎模型中，通过腹腔内注射h-G9NC(null)100μg，看到了胸膜炎被抑制的效果。而如果单独h-G9NC(null)特别是对小鼠没有影响。另外h-G9NC(null)对角叉菜胶、fMLP诱导胸膜炎模型也有影响。
另外在LPS诱导腹膜炎模型中，由于h-G9NC(null)的作用，在炎症时诱导的血清中细胞因子(IFN-γ和IL-4、IL-12、IL-10等)产生中确认有变化。例如、同时将LPS和h-G9N注入小鼠腹腔后，6小时、12小时、24小时后从小鼠眼窝采血，测定该血清中的IFN-γ值时，确认在LPS单独给予组在炎症时被诱导的IFN-γ暂时性的上升，在同时给予h-G9NC(null)组，IFN-γ的上升(诱导)被抑制依赖于h-G9NC(null)的给药量。由此表明h-G9NC(null)调节细胞因子产生，因此可以进行炎症的调节。
另外在类固醇敏感性(PMA诱导)和类固醇非敏感性(花生四烯酸诱导)炎症模型(实施例6和7)和辣椒辣素诱导炎症模型(实施例8)中也看到了h-G9NC(null)的抑制效果。
作为变态性炎症，研究了h-G9NC(null)在DNFB诱导接触皮炎模型、FITC诱导特应性皮炎模型、抗DNP单克隆IgE抗体致敏荨麻疹模型中的效果。例如在实施例9的DNFB诱导接触皮炎模型中，腹腔内注射h-G9NC(null)，通过以耳壳浮肿作为指标的皮肤反应研究效果。结果看到使用h-G9NC(null)的1、10、100μg量的抑制效果，另外没有看到由于给予地塞米松产生的显著的体重减少。在实施例10的FITC诱导特应性皮炎模型中，通过腹腔内注射h-G9NC(null)，在激发相中看到了h-G9NC(null)的效果。另外当向实施例11的抗DNP单克隆IgE抗体致敏荨麻疹模型小鼠分别腹腔内注射h-G9NC(null)的1、10、100μg时，由抗原涂布(DNFB)导致的二层性皮肤反应被抑制。
作为自身免疫疾患模型之一，记录了抗体混合物h-G9NC(null)对诱发关节炎的实施例。h-G9NC(null)对佐剂性关节炎、胶原关节模型等也有影响。例如、在实施例12中的h-G9NC(null)1μg中也看到了抑制。
实施例13
半乳凝素9突变体在肿瘤细胞中的凋亡(细胞损伤活性)诱导)
〔实验方法〕
将悬浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的各细胞以3×103个/90μL加入到96孔板(FALCON)，培养24小时(37℃、5％CO2)后、添加(10μl)最终浓度为0.03～1μM的半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))，培养24小时。培养后、向孔添加10μL WST-1试剂(Roche,1 644 807)，于37℃、5％CO2条件下反应2～4小时后，使用板式测读仪测定450～600的吸光度，各肿瘤细胞中的凋亡(细胞损伤活性)诱导评价通过Viability(％)＝[(检体的吸光度-Blank/(阴性对照的吸光度-Blank))×100进行。
表2给出了使用的肿瘤细胞。
表2
表半乳凝素9突变体在肿瘤细胞中的凋亡(细胞损伤性)诱导数据
表2中，「Cell name」表示细胞名，「Animal」表示该肿瘤细胞来自的动物种类，「1μM killing」表示添加1μM半乳凝素9突变体时的killing(％)，「Tissue」表示该细胞来自的组织·器官部位。
〔结果〕
半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))在培养细胞中引起的凋亡(细胞损伤活性)诱导测定的结果如表2所示。由该结果可判断半乳凝素9突变体对
1)血球系肿瘤是有效果的
2)恶性黑色种和纤维肉肿等非上皮性恶性肿瘤也有效
3)胃癌、胰脏癌、肺癌等上皮性恶性肿瘤也有效。
实施例14
〔半乳凝素9突变体在皮下移植模型中的抗肿瘤活性(抗癌效果)〕
〔实验方法〕
作为靶肿瘤细胞使用LLC细胞。将培养的细胞(1x106个/100μL)与半乳凝素9突变体(h-G9NC(null),100μg/100μL)或生理盐水100μL于37℃反应1小时后，皮下注射到C57BL6小鼠的背中。测定肿瘤径(长轴、短轴)。
然后切下移植5周后的给药皮肤部位(肿瘤)，在缓冲为10％中性的甲醛溶液中对组织病理检查用样品进行固定后，将石蜡包埋组织做成切片，用HE试剂染色。
〔结果〕
图20给出了半乳凝素9突变体在皮下移植模型中的抑制肿瘤细胞增殖效果、即抗肿瘤活性(抗癌效果)测定的结果。另外在图21中还给出了通过组织病理解析研究抗肿瘤活性(抗癌效果)的结果。图中，Gal9(n)和Gal9表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))，而5W表示5周。
如果在半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))存在下对LLC进行培养，在相差显微镜下观察到明显的癌细胞的形态变化。此时，半乳凝素9突变体依赖于用量诱导LLC的活细胞数减少(MTT assay)、DNA合成能降低(3H-Thymidine搀入能)、培养上清中的LDH放出量亢进。由半乳凝素9突变体产生的这些抗肿瘤效果在人肺癌细胞株H226(扁平上皮癌)、A549(腺癌)、H69(小细胞癌)中同样被确认。另外，在半乳凝素9突变体存在下，LLC的Annexin V表达量有意义增加。
另一方面，如果将LLC在半乳凝素9突变体共存下接种于同系統小鼠C57BL6的皮下，不生长肿瘤，在接种后5周时，看到与对照组有明显差别。小鼠存活率在半乳凝素9突变体存在下有意义改善了。判明半乳凝素9突变体诱导癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤效果。
在通过将人小细胞肺癌细胞株H69细胞静脉注入裸鼠导致的肺癌多脏器转移模型中，通过半乳凝素9突变体的腹腔注射也确认抑制转移效果。
实施例15
〔半乳凝素9突变体对于培养肿瘤细胞的凋亡(细胞损伤活性)诱导〕
〔实验方法〕
(1)Meth A细胞的凋亡
将悬浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的Meth A以4×104个/90μl加入到96孔板(FALCON)，同时添加1～30μg/ml(10μl)半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))，培养24小时(37℃、5％CO2)。24小时后，将细胞用PBS(-)200μl清洗一次，悬浮于Annexin vBinding Buffer(BD PharMingen)，添加Annexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin D，暗中于室温下反应15分钟，通过FACScalibur(Becton,Dickinson)进行解析。
(2)B16/F10细胞的凋亡
将以1×104个/90μl悬浮于RPMI(SIGMA)10％FBS(JRH)的B16/F10加到96孔板(FALCON)中，培养24小时(37℃、5％CO2)后，添加(10μl)半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))使最终浓度达到1～30μg/ml，培养24小时。24小时后，将细胞用PBS(-)200μl清洗1次，用0.05％Trypsin EDTA(GIBCO)处理后，用培养液清洗一次，再用PBS(-)清洗。然后悬浮于Annexin V Binding Buffer(BDPharMingen)中，添加A nnexin V-PE(BD PharMingen)和7-Amino-actinomycin，暗中于室温下反应15分钟，用FACS calibur(Becton,Dickinson)进行解析。
〔结果〕
结果如图22和图23所示。图22是使用半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))诱导Meth A细胞凋亡的解析结果。图23是使用半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))诱导B16/F10细胞凋亡的解析结果。
实施例16
〔半乳凝素9突变体在癌性腹膜炎模型中的抗肿瘤活性(抗癌效果)〕
〔实验方法〕
(1)Meth A细胞:将用PBS(-)调制的细胞(5×105个/100μL)接种在BALB/c小鼠(SLC,6周龄雌性、n＝3)的腹腔。
腹腔内接种细胞后连续18天注射半乳凝素9突变体(h-G9NC(null),100μg/300μL)。在开始注射时期，分为1)MethA细胞刚接种后、2)3日后、3)7日后、4)10日后4组(n＝10)，比较存活率。
(2)B16/F10细胞:将细胞(5×105个/100μL)接种到C57/BL6小鼠(SLC,6周龄雌性)的腹腔内。接种后立刻将各浓度的半乳凝素9突变体(h-G9NC(null),10、30、100μg/300μL)注入腹腔内，连续注入14天。比较存活率。接种后14日观察脏器。
〔结果〕
结果如图24～27和48所示。图24为存活曲线，表示在通过MethA细胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。图25表示显示未给予半乳凝素9突变体(Gal9)组(上段)和给予组(下段)中小鼠状态的照片。图26为生存曲线，表示在通过B16/F10细胞做成的癌性腹膜炎模型中半乳凝素9突变体具有抗肿瘤效果。图27表示比较给予和未给予半乳凝素9突变体(Gal-9)组中通过B16/F10细胞做成的癌性腹膜炎模型小鼠的状态，给出了内脏组织照片。图48表示在腹腔内(i.p.)接种了LLC细胞(1×106个)的小鼠中，每日i.p.注入半乳凝素9突变体(h-G9NC(null),100μg/小鼠)或载体(vehicle)的结果(从Day 0开始连日注入、各组7只小鼠)。在小鼠癌性腹膜炎模型(MethA、B16/F10细胞、LLC细胞)中确认注射G9NC(null)(i.p.)(癌细胞接种时同时注射和癌细胞接种后注射)产生延长寿命效果。
Meth A细胞、LLC细胞是通过半乳凝素9突变体诱导凋亡的细胞。而B16/F10细胞不能被半乳凝素9突变体诱导凋亡。
就B16/F10细胞来说，已阐明半乳凝素9突变体抑制癌细胞与细胞外基质的结合依赖于浓度。而在由B16/F10细胞做出的癌性腹膜炎模型中，就G9NC(null)注入组与对照组相比，腹腔液中的NK,NKT细胞增加。B16/F10黑素瘤细胞虽然是对由稳定化半乳凝素9引起的凋亡具有耐性，但可确认存活率改善和抑制黑素瘤细胞向腹壁的粘附。半乳凝素9突变体在癌性腹膜炎模型中的抗肿瘤效果也表明肿瘤细胞向细胞外基质的抑制粘附即炎症细胞的浸润抑制效果、NK、NKT细胞等担当免疫细胞的参与。
实施例17
〔B16/F10腹腔内浸润细胞的解析〕
〔实验方法〕
在将以5×105个/200μl悬浮于PBS(-)的B16/F10移植到C57/BL6小鼠(SCL)的腹腔的同时，按照30μg/300μl向腹腔注入半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))，24小时后采取腹腔细胞，悬浮于PBS(-)。在纯化抗小鼠CD16/CD32(2.4G2)(BD PharMingen)中于4℃下反应5分钟后，用各个抗体[PE抗小鼠CD122(TM-β-1)(BDPharMingen)、FITC抗小鼠TCR β-chain(H57-597)(BDPharMingen)、PE抗小鼠CD11b(M1/70)(BD PharMingen)、APC-标识抗小鼠CD11c(HL3)(BD PharMingen)、APC抗小鼠CD8a(BDPharMingen)、FITC抗小鼠CD4(BD PharMingen)]于4℃下反应30分钟，通过FACS calibur(Becton,Dickinson)进行解析。
〔结果〕
结果如图28所示。与注入PBS组相比，就注入半乳凝素9突变体组(30μg)来说，在腹腔洗净液中证实NK/NKT细胞等参与免疫的细胞的动员。
实施例18
〔半乳凝素9突变体抑制B16/F10细胞粘附的活性〕
〔实验方法〕
将最终浓度为1～30μg/ml的半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))按照每孔10μl预先加到用I型胶原、IV型胶原(collagen type I,IV),板蛋白(laminin),纤维结合素(fibronectin),玻基结合素(vitronectin)包被的6孔板(CHEMICON)，在该板按照4×104个/well(90μl)接种用RPMI(SIGMA)0.02％BSA(Wako)悬浮的B16/F10，温育1小时(37℃、5％CO2)。1小时后去除上清，用PBS(-)200μl清洗2次后，加入90μl RPMI 0.02％BSA和10μl WST-1(Roche)，温育2～3小时。最后使用板式测读仪测定450～600的吸光度，按照粘附率(Adherence,％)＝[(检体的吸光度-Blank/(阴性对照的吸光度-Blank))×100进行计算。
〔结果〕
结果如图29所示。B16/F10细胞与各细胞外基质(I型胶原、IV型胶原、板蛋白、纤维结合素、玻基结合素)的结合受到半乳凝素9突变体(图中记为稳定化半乳凝素)抑制。证实该抑制作用与半乳凝素9突变体的浓度有关。
然后研究了半乳凝素9突变体对炎症的生物活性。研究了半乳凝素9突变体对作为炎症分类于I型的炎症支气管哮喘、分类于II型的炎症自身免疫性溶血性贫血、分类于III型的炎症阿蒂斯(Arthus)反应(血管炎)的活性。
实施例19
〔壁虱抗原诱发哮喘模型(Der f-induced AHR model)〕
〔实验方法〕
地塞米松(地塞米松21-磷酸二钠盐、Sigma,MO,美国),氯醋甲胆碱(methacholine(MCh),Sigma,MO,USA)和变态性诱发性提取物混合壁虱抗原(Allergenic Extract mixed Insects MITE:コナヒョウヒ壁虱(D.Farinae,Der f))可从此处给出的供货商获得。为了投给动物，在全部的实验中作为载体(vehicle)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后进行。
Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入。为了做到使动物能够自由地摄取适当饵料和水，以每12小时为昼夜节奏的标准状态饲养。所有的动物按照国际的指导原则和国内法通过人工进行管理。
小鼠中的哮喘性过敏反应(Asthmatic Hypersensitive Response:AHR)的诱导如下进行。
为了在小鼠的呼吸道组织诱发对氯醋甲胆碱和嗜酸性细胞浸润的呼吸道过敏性，对雄小鼠致敏后，作为变态原使用上述壁虱抗原(Der f)进行诱发处理。浓度为Der f(0.5mg/ml)，通过按照每次0.05ml，于第0日、第7日以及第20日投到鼻腔内(i.n.)，免疫小鼠，然后使用喷雾器用做成1％气雾的Der f处理30分钟，激发过敏性。对照组的动物于第0日、第7日和第20日经由鼻腔内(i.n.)接受投给的通常PBS(0.05ml)，然后使用喷雾器再用PBS处理30分钟。
为了研究半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果，在用Der f诱发前和Der f诱发后，分别向小鼠腹腔内(i.p.)注入半乳凝素9突变体(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(体重)。
作为样品，从各动物采取支气管肺胞洗净液(bronchoalveolarlavage fluid:BAL fluid)。通过无拘束呼吸功能解析装置(unrestrained whole body plethysmograph；PULMOS-I；M.I.P.S,大阪,日本)测定具有无拘束的意识的小鼠的全肺气流量。为了求比每分钟的气流量、换气量、呼吸的频率、以及比呼吸道阻力(specificairway resistance:sRAW)，使用收容小鼠的箱子和对照用箱子之间的压差。呼吸道阻力为无量纲的参数，是呼吸循环中的小鼠的全肺呼吸量的函数。通过做成气雾的PBS(作为基础测定值)或MCh(6-25mg/ml)再对小鼠处理2分钟，进行测定，求喷雾疗法处理后100次的呼吸的平均值。用Turk's液对悬浮的细胞数(cells/ml)进行染色，用血球计(hemocytometer)再进行测定，得到cytospin调制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液赋予形态特征，测定细胞的差异。对各载玻片上的200-500个白细胞进行计数。
〔结果〕
结果如图30、31和32所示。图中各个值表示7只动物的平均±S.E.。统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用Dunnett's Multiple Comparison Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。图30表明通过给予h-G9NC(null)〔Gal-9〕，呼吸道过敏性的亢进改善了。图31表明通过给予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制对BALF中嗜酸性细胞浸润。图32表明通过给予h-G9NC(null)〔Gal-9〕可抑制支气管周围的炎症细胞浸润。因此表明使用半乳凝素9，由于可抑制炎症细胞对呼吸道的浸润，所以呼吸道过敏性改善了。
实施例20
〔OVA诱发哮喘模型(OVA-induced AHR model)〕
〔实验方法〕
作为动物使用小鼠和豚鼠。卵白白蛋白(Ovalbumin(OVA),Sigma,MO,美国)、甲吡酮(metopyrone,Sigma,MO,美国)、甲哌卡因(mepyramine,Sigma,MO,美国)可以由此处给出的供货商买到。其它的化合物可以象实施例19那样获得。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液中给予动物。Balb/c小鼠(7周龄)从SLC(静冈,日本)购入，而豚鼠(5周龄)由Kudou Co.Ltd(熊本,日本)购入，象实施例19那样进行饲养。
AHR在小鼠中的诱导如下进行。
为了在小鼠的呼吸道组织诱发对氯醋甲胆碱和嗜酸性细胞浸润的呼吸道过敏性，对雄小鼠进行致敏后，将上述OVA作为变态原使用，进行诱发处理。用与硫酸铝钾形成复合体的OVA(0.5mg/ml)，再按照每次0.2ml，于第0日和第14日，通过腹腔内(i.p.)注射对小鼠进行免疫。于第14日、第18日和第22日用经普通食盐水稀释的戊巴比妥(5.0mg/ml)的0.2-0.3ml麻醉小鼠。OVA致敏组的所有动物于第14日、第18日和第22日经由鼻腔内(i.n.)给予0.05ml普通食盐水中的2.0mg/ml的OVA。对照组的动物于第0日和第14日，经由腹腔内(i.p.)注入加入了硫酸铝钾的通常PBS，然后于第14日、第18日和第22日经由鼻腔内(i.n.)注入通常的PBS(0.05ml)。
为了研究半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))以及地塞米松的作用效果，于OVA诱发前和OVA诱发后第0,7,14,15,16,17,18,19,20,21,以及第22日，将半乳凝素9突变体(h-G9NC(null)100μg/410μl(in PBS)/只、或地塞米松3mg/200μl(in PBS)/kg(体重)分别注入小鼠腹腔内(i.p.)。
作为样品，从各动物采取BAL液。通过气压式呼吸功能解析装置(whole body barometric plethysmograph；Buxco Electronics,Inc.,Sharon,CT)测定具有无拘束的意识的小鼠的全肺气流量。通过该装置，以作为增高的间歇(Pause(Penh))已知的呼吸图形的变化进行测定，该参数与呼吸道阻力相关，在进行监测呼吸道阻力中使用。通过做成气雾的PBS(作为基础测定值)或MCh(6-25mg/ml)再对小鼠处理2分钟，进行测定，求喷雾疗法处理后100次的呼吸的平均值。用Turk's液对悬浮的细胞数(cells/ml)进行染色，用血球计(hemocytometer)再进行测定，得到cytospin调制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液赋予形态特征，测定细胞的差异。对各载玻片上的200-500个白细胞进行计数。
AHR在豚鼠中的诱导如下进行。
为了在小鼠的呼吸道组织诱发对抗原和嗜酸性细胞浸润的呼吸道过敏性，对雄小鼠进行致敏后，将上述OVA作为变态原使用，进行诱发处理。使用Omron超音波式喷雾器(Omron NE-U17nebulizer,立石电气(株)、东京、日本)，于第0～第7日，对豚鼠用1％OVA的食盐水液的气雾进行10分钟致敏。为了避免过敏性休克，所有动物在致敏处理30分钟前和诱发处理30分钟前给予甲哌卡因(10mg/kg)。
为了研究半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))的作用效果，于OVA诱发前和OVA诱发后将半乳凝素9突变体(h-G9NC(null)1μg/4ml(PBS中)/kg注入豚鼠腹腔内(i.p.)。
作为样品，从各动物采取BAL液。
在最初致敏后第3天，将动物置于备有可从箱笼脱离的口鼻式面罩的全身式呼吸功能解析箱子(PULMOS-I；M.I.P.S,大阪,日本)，按照Agrawal's法测定比呼吸道传导率(SGaw)。气流量与箱子容量的变化的关系(这可从箱子压的变化计算出)可以以将箱子容量的变化对气流量按照x-y作图的斜率(slope)决定。可以将5次的呼吸循环中的斜率的平均用于计算Sgaw中。
在用OVA诱发前向豚鼠腹腔内(i.p.)注射10mg/kg的甲吡酮，然后使用Omron超音波式喷雾器(Omron NE-U17nebulizer,立石电气(株)、东京、日本)，于2％OVA的食盐水液的气雾中以3l/min的流速再处理豚鼠5分钟。然后于抗原处理1min前以及抗原处理后2,4,5,6,7,8以及第23小时监测SGaw的变化，进行测定，求各个时点后的100次呼吸的平均值。各SGaw值与免疫刺激前得到的值比较，以SGaw中的变化百分比表示。用Turk's液对悬浮的细胞数(cells/ml)进行染色，用血球计再进行测定，得到cytospin调制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液赋予形态特征，测定细胞的差异。对各载玻片上的500个白细胞进行计数。
〔结果〕
图33和34给出了小鼠中的结果、而图35和36表示小鼠中的结果。图中、各个值表示7只(图33)、5～7只(图34)、7或8只(图35和图36)动物的平均±S.E。统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用Dunnett's Multiple Comparison Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
图33表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))具有改善呼吸道过敏性的作用。图34表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))抑制BALF中的嗜酸性细胞的浸润。
图35表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))对即时型哮喘(IAR)·延迟型哮喘(LAR)的作用。结果在给予半乳凝素9突变体组，IAR和LAR无论那一个与对照组比较，都看到有意义的差。即看到抑制效果。
图36表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))对呼吸道内炎症性细胞浸润的作用。结果在给予半乳凝素9突变体组，与对照组比较，对于总细胞数以及嗜酸性细胞都看到有意义差。在其它细胞中也看到浸润抑制倾向。
半乳凝素9突变体通过按照1mg/只的用量在抗原致敏和激发前进行腹腔内注入，表明有可能抑制被动致敏豚鼠的抗原激发即时型·延迟型哮喘反应和呼吸道内细胞浸润。
实施例21
〔自身免疫性溶血性贫血(RαMRC Ab-induced AIHA model)〕
〔实验方法〕
环磷酰胺(cyclophosphamide(CY),Sigma,MO,美国)、硫唑嘌呤(azathioprine(AZ),Sigma,MO,美国)、氨甲蝶呤(methotrexate(MTX),Sigma,MO,美国)兔的抗小鼠赤血球抗体(RαMRC Ab)可以从此处提供的供货商买到。其它的化合物象实施例19那样获得。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。
小鼠中的自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的诱导象下面那样进行。
将兔的αMRBC自身抗体注入小鼠静脉内(i.v.)，诱导溶血性贫血。在兔的αMRBC自身抗体注射30分钟前和该自身抗体注射后1～4日内，将半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))、地塞米松、其它药物、或载体(vehicle)注入腹腔内(i.p.,0.345ml/head))。
将血液样品采取到经肝素处理的微量血细胞比容毛细管中，用离心机于12,000rpm离心5分钟。看离心后直接包装的RBCs的百分比决定血细胞比容。
统计学上的解析如下进行。
没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Dunnett'sMultiple Comparison Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图37所示。在半乳凝素9突变体组中，确认有抑制发症倾向。图中各个值表示5～6只的动物的平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01)。
实施例22
〔Arthus反应(血管炎)〕
〔实验方法〕
研究了半乳凝素9突变体对免疫复合体诱发2相皮肤反应(Arthus反应)的作用效果。
抗OVA IgG由供货商购入。其它的化合物象实施例20那样获得。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。
小鼠中耳壳浮肿的诱导如下进行。
对2相皮肤反应模型的小鼠的右耳皮内注射(i.d.)抗OVA IgG(50μg/小鼠)，进行致敏，然后立刻静脉内注入(i.v.)200μl的1％OVA的PBS。
在OVA注射30分钟前和OVA注射后5小时，向腹腔内(i.p.,0.345ml/head))注射半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))、地塞米松、或载体(vehicle)。在OVA注射后0,2,4,8和24小时，使用校正厚度计(Mitsutoyo,东京,日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳壳浮肿。其中R0表示实验开始时(0h)的右耳厚度，而L0表示实验开始时(0h)的左耳厚度，R表示各个时点得到的右耳厚度，而L表示左耳的厚度。
统计上的解析如下进行。
没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Dunnett'sMultiple Comparison Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图38所示。在半乳凝素9突变体组中，确认有抑制发症倾向。图中各个值表示5～6只的动物的平均值±SEM(*p<0.05,**p<0.01)。
实施例23
〔ARDS模型(LPS-induced ARDS model)〕
〔实验方法〕
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,Sigma,MO,USA)由此处提供的供货商购入。其它的化合物象实施例19那样获得。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。
小鼠中的ARDS的诱导如下进行。
为了激发小鼠的呼吸道组织呼吸困难症和嗜中性细胞的浸润，作为肺伤害模型使用LPS对雄小鼠进行处置。小鼠接受经鼻(i.n.)给予的LPS(0.6mg/ml,0.05-ml容量)。对照组经同样的途径接受给予通常的PBS(0.05ml)。
为了研究半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))和地塞米松的作用效果，在LPS诱发30分钟前和LPS诱发后6小时，分别向小鼠腹腔内(i.p.)注入半乳凝素9突变体(h-G9NC(null)100μg/410μl(inPBS)/只或地塞米松1～10mg/200μl(in PBS)/kg(体重)。
通过气压式呼吸功能解析装置(whole body barometricplethysmography；Buxco Electronics,Inc.,Sharon,CT)和无拘束呼吸功能解析装置(unrestrained whole body plethysmograph；PULMOS-I；M.I.P.S,大阪,日本)在LPS诱发的1小时前和24小时后对小鼠的肺功能(pen h值和换气量)进行解析。
对肺功能进行解析后，由各动物采取BAL液作为样品。
通过无拘束呼吸功能解析装置测定具有无拘束的意识的小鼠的全肺气流量。为了求比每分钟的气流量、换气量、呼吸的频率、pen h值、以及比呼吸道阻力(sRAW)，使用收容小鼠的箱子和对照用箱子之间的压差。呼吸道阻力为无量纲的参数，是呼吸循环中的小鼠的全肺呼吸量的函数。
用Turk's液对悬浮的细胞数(cells/ml)进行染色，用血球计再进行测定，得到cytospin调制物，使用Giemsa-May-Grunwald溶液赋予形态特征，测定细胞的差异。对各载玻片上的200-500个白细胞进行计数。
统计上的解析如下进行。
没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Dunnett's Multiple Comparison Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图39和图40所示。图中各个值表示5～6只的动物的平均值±SEM。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用Dunnett's Multiple Comparison Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。图39表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))对呼吸道过敏性的作用。证实有改善。图40表示半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))抑制BALF中的中性白细胞的浸润。
实施例24
〔辣椒辣素诱导炎症模型〕
〔实验方法〕
赛庚啶(cyproheptadine,Sigma,MO,USA)和辣椒辣素(capsaicin,Nakarai,Tokyo,Japan)由此处提供的供货商购入。其它的化合物象实施例19那样获得。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。Balb/c小鼠(7周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。
小鼠中的耳壳浮肿的诱导如下进行。
将500μg的辣椒辣素溶解于丙酮/橄榄油(4/1,30μl)，适用于各小鼠(BALB/c,♀,7-8周龄,SPF,SLC Inc.)的右耳内侧表面和外侧表面。对于左耳作为对照适用丙酮/橄榄油。将半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))、地塞米松、cyproheptadine、或载体(vehicle)在给予辣椒辣素30分钟前注入到腹腔内(i.p.,0.345ml/head)，而在10分钟前进行静脉内注射。在注射辣椒辣素后0,0.5,1和2小时，使用校正厚度计(Mitsutoyo,东京,日本)在乙醚麻醉下测定耳的厚度。
用(R-L)-(R0-L0)表示耳壳浮肿。其中R0表示实验开始时(0h)的右耳厚度，而L0表示实验开始时(0h)的左耳厚度，R表示各个时点得到的右耳厚度，而L表示左耳的厚度。
统计上的解析如下进行。
没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过BonferroniPost-Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图41所示。在给予半乳凝素9突变体组(静注注射)，确认抑制发症。图中各个值表示5～6只的动物的平均值±SEM。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异通过Dunnett's Multiple Comparison Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。预期通过半乳凝素9突变体可以抑制起因于神经性、炎症性的疼痛。
实施例25
〔半乳凝素9突变体对骨吸收和骨形成的作用〕
〔实验方法〕
1.骨吸收
(破骨细胞形成)
在RANKL(50ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)存在下，将外周血单核细胞(1x105cells)培养9天，比较半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))添加(0.1～10nM)组和未添加组TRAP阳性多核细胞数(破骨细胞)。h-G9NC(null)抑制TRAP阳性多核细胞(破骨细胞)的形成依赖于浓度。有时也将h-G9NC(null)简单地记为gal-9。
得到的结果如图42所示。
对照组(cont.):500±13.2cells/well，给予半乳凝素9突变体组(h－G9NC(null),0.1nM):451±7.6cells/well、(h-G9NC(null),1.0nM):151±12.5cells/well、(h－G9NC(null),10nM):29±14.0cells/well。
2.骨形成
(成骨细胞增殖)
使用Tetra color-1assay通过吸光度研究h-G9NC(null)(0.1～100nM)对人成骨细胞(按照2×103/well将细胞播种到96孔板，过夜后加h-G9NC(null)刺激，于0小时、24小时、48小时时刻观察)增殖的影响。
得到的结果如图44所示。半乳凝素9突变体诱导成骨细胞的增殖依赖于浓度，其增殖受到乳糖抑制。半乳凝素9突变体诱导成骨细胞的增殖依赖于浓度，而受到乳糖(30mM)的抑制。吸光度在对照为0.21±0.01、在h-G9NC(null)(0.1nM)为0.22±0.01、在h-G9NC(null)(1.0nM)为0.24±0.01、在h-G9NC(null)(10nM)为0.25±0.01、在h-G9NC(null)(100nM)为0.26±0.02是24小时的值，48小时后，对照为0.22±0.01、h-G9NC(null)(0.1nM)为0.23±0.01、h-G9NC(null)(1.0nM)为0.26±0.01、h-G9NC(null)(10nM)为0.27±0.01、h-G9NC(null)(100nM)为0.31±0.04。
(成骨细胞分化)
使用流式细胞仪通过细胞内ALP和骨钙蛋白研究半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))(100nM)对人成骨细胞(按照2×103/well将细胞播种到6孔板，温育24小时后，于1％FCS/DMEM饥饿过夜，加gal-9刺激，8小时后测定)分化的影响。
得到的结果如图45所示。半乳凝素9突变体诱导成骨细胞中的骨形成标志ALP、骨钙蛋白的表达。ALP与无刺激相比增加了400molecules/cell、而骨钙蛋白与无刺激相比增加了800molecules/cell。而如果向成骨细胞中添加h-G9NC(null)(10nM)，培养28天，与不添加组相比，ALP染色和von kossa染色被促进。
由以上试验可知在半乳凝素9突变体添加后6小时，发生单核细胞的凝集。而半乳凝素9突变体抑制TRAP阳性多核细胞的形成依赖于浓度。半乳凝素9突变体诱导成骨细胞的增殖依赖于浓度。半乳凝素9突变体诱导成骨细胞中的ALP、骨钙蛋白的表达。
以上结果表明半乳凝素9突变体和天然的半乳凝素9可能对骨吸收有抑制作用，而对骨形成有促进作用，认为作为具有骨形成促进作用的药剂有可能应用于闭经后骨质疏松症的治疗。
实施例26
〔半乳凝素9突变体对间质性肺炎模型的作用〕
〔实验方法〕
作为间质性肺炎模型使用小鼠。将C57BL/6小鼠(♀6周龄、使用时7～8周龄、20匹)按照参考文献：Blood 2002；99:1289-98和Am J Respir Crit Care Med 2003；168:1075-83进行处理，诱导间质性肺炎。使用rhIL-2(PeproTech,5μg x 10匹x 2组x 14日＝1400μg＝1.4mg)和rmIL-18(MBL,0.2μg x 10匹x 2组x 14日＝56μg)。
作为样品组准备对照组以及半乳凝素9突变体(Gal-9)给予组。
(1)对照组(小鼠10匹)
每只小鼠，每日注射IL-25μg+IL-180.2μg，连续腹腔内注射0～13天。作为对照，每只小鼠，每日注射PBS 200μl，连续腹腔内注射0～13天。
(2)注射Gal-9组(小鼠10匹)
每只小鼠，每日注射IL-25μg+IL-180.2μg，连续腹腔内注射0～13天。半乳凝素9突变体(h-G9NC(null))做成100μg/300μl PBS，每只小鼠，连续腹腔内注射13天。麻醉无论那一只都通过戊巴比妥腹腔内注射进行。
效果判定的指标第一为存活率，就存活至14天得到的的例子研究肺组织。
小鼠取样如下进行：
对于途中死亡例，死亡时解剖，取肺组织
对于生存至day 14的生存例，乙醚麻醉→从眼窝采血→颈椎脱臼→开胸→采取肺组织。
研究了该模型的rhGal-9null腹腔内注入的效果。将rhGal-9null给予组和未给予组各为14天的存活率作为判定效果的基准，然后比较在14天的组织照片。
得到的结果如图46和47所示。图46表示存活率。14天的存活率在非给予组为30％(10只中3只生存)，在给予h-G9NC(null)(Gal-9)组中为90％(10只中9只生存)，看到通过给予半乳凝素9突变体(h-G9NC(null):Gal-9)改善了存活率。
图47表示14天存活例的肺组织(HE染色、照片)。在非给予组，即使在存活例中也可看到伴随广泛而且强度的细胞浸润产生的肺间质的肥厚。在半乳凝素9突变体(h-G9NC(null):Gal-9)给予组，间质的肥厚、细胞浸润都为轻度，看到的是大多残存的正常组织。由此表明在本模型中半乳凝素9(Gal-9)具有抑制发症的效果。在本试验中虽然看到体重变化，但在非给予组死亡例、存活例都没有看到有意义的体重变化。
实施例27
〔对于癌转移模型的活性〕
〔实验方法〕
使用B16/F10细胞，研究半乳凝素9突变体对癌转移模型的作用。
将细胞(5×105个/200μL)接种在C57/BL6小鼠(SLC,6周龄雌性)的尾静脉。接种后立刻将半乳凝素9突变体(略记为h-G9NC(null)、「Gal-9」；100μg/300μL)或PBS(各N＝15)注入尾静脉，连续注入11日(注射次数12次)。在接种后第12天，解剖，对肺的结节数进行计数。
图49给出了试验的结果(模型动物肺的外观)。图50给出了肺结节数计数结果。通过对半乳凝素9突变体注入组(Gal-9组)和PBS注入组(PBS组)进行比较，确认了半乳凝素9突变体产生的抑制转移效果。通过比较肺的结节数，各组的平均结节数，半乳凝素9突变体注入组(Gal-9)为231.3±20.87、PBS注入组(PBS)为122.1±13.61，P<0.0001，有意性被证实，确认了半乳凝素9突变体抑制癌转移的效果。
实施例28
〔角叉菜胶诱发炎症模型：Carrageenan-induced大鼠PawEdema〕
角叉菜胶(carrageenan,Izushi kaga0ku,Japan)由其供货商购入。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。雌性Lewis大鼠(5周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。为了研究半乳凝素9突变体的作用效果，在角叉菜胶注射10分钟前，按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠静脉内(i.v.)注射半乳凝素9突变体(略记为h-G9NC(null)、「gal-9」。作为阳性对照按照3mg/kg、7mg/kg注射地赛米松(Dex.)。
〔角叉菜胶足跖浮肿〕
按照Sugishita et al.(1981)方法在大鼠中进行角叉菜胶诱发足跖浮肿试验，研究半乳凝素9突变体(human null galectin-9,h-G9NC(null))的抗炎症活性。在向右后足的足底注射角叉菜胶(0.15ml；1％w/v in saline)10分钟前静脉内(i.v.)注射药剂化合物(30,100and 300μg/只)或载体(vehicle:PBS)。诱导浮肿后，使用水银置换型呼吸功能解析装置(mercury displacement plethysmography；Muromachi,Tokyo,Japan)，测定-1,2,4,6,24,48和72h的注射了角叉菜胶侧的足和另外的一侧足(右后足注射食盐水液(saline))的容积。对足体积的变化以-1h和各个小时之间的差异进行计算。对于由角叉菜胶诱导的浮肿以注射了角叉菜胶侧的足和另外的一侧足之间的差异表示。
统计上的解析如下进行。
没有特别指出时，数据用平均值±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间00的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过BonferroniPost-Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图41所示。在给予半乳凝素9突变体组(静注注射)，确认抑制发症。图中各个值表示5～6只的动物的平均值±SEM。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,SanDiego,USA)，通过Dunnett's Multiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test进一步评价。P值<0.05统计学上认为有意义。
〔结果〕
结果如图51(半乳凝素9突变体)和图52(地塞米松)所示。确认半乳凝素-9突变体即使30μg/mouse也有抑制发症的抑制效果。
实施例29
1.半乳凝素-9突变体佐剂性关节炎模型中的镇痛作用
〔方法〕
〔机械刺激引起的疼痛
(通过Randall-Selitto test＝垂直加压引起的痛觉阈值的测定)〕
丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum,Difco,Detroit,MI,USA)由其供货商购入。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。雌性Lewis大鼠(5周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。为了研究半乳凝素9突变体的作用效果，在佐剂注射的前后0至22日，按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠静脉内(i.v.)注射半乳凝素9突变体(略记为h-G9NC(null)、「gal-9」。作为阳性对照按照3mg/kg注射吲哚美辛(Indo)。
〔佐剂性关节炎〕
测定雌性Lewis大鼠(5周龄)的体重，在尾部做标记，分为由9只动物组成的组。在佐剂注射前(day 0)、记录体重和两个后足的足跖的容积。然后向各个大鼠的右后足注射佐剂。将没有注射佐剂的组作为正常对照组(normal age-matched controls(sham))。分别在佐剂注射后的不同日期记录将大鼠杀死前各组大鼠的体重和足的容积。
〔佐剂的程序〕
将丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)于乳钵中研碎，制备佐剂，与油混合，做成最终浓度10mg/ml。使用27-号针的0.5-英才针将0.2ml佐剂注射到大鼠右后足的足底。
〔因机械刺激导致疼痛的解析〕
改变Randall和Selitto的手法，对半乳凝素9突变体(human nullgalectin-9,h-G9NC(null))是否具有减轻对来自外部的押压的在急性炎症组织或非炎症组织的末梢性过敏症的镇痛活性进行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周龄)的右后足s.c.注射弗氏完全佐剂(CompleteFreund's Adjuvant)，诱发急性和慢性炎症。在佐剂注射的前2日和角叉菜胶注射5日后，通过Randall和Selitto测试测定对来自外部的押压的在急性炎症组织或非炎症组织的末梢性过敏症，然后一直监测到第25日(1time/week)。观察者边控制，边用数字式福斯测定器(Imada,aichi,Japan)向已经有炎症的一侧的足跖以及另一侧的非炎症足跖两方由外慢慢加押压(0-200g)。将痛觉阈值定义为动物最初表现出感觉疼痛的前兆时的压。所谓该前兆是指伸时和/或收缩足、发出哭声的最初时刻表现出的苗头。
统计上的解析象实施例28那样进行。即没有特别指出时，数据用平均值(mean)±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Dunnett'sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test进一步评价。P值<0.05统计学上被认为是有意义。
〔结果〕
结果如图58(半乳凝素9突变体,Gal-9)和图59(吲哚美辛)所示。图中在分别表示各个值的点的动物(图58：8-9匹(n＝8-9)、图59：9匹(n＝9))的平均值±SEM。统计上的差异使用one-way ANOVA进行解析。而组之间的差异通过Bonferroni Post-Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。给予半乳凝素-9突变体，不止是引起炎症(依赖于浓度)的部位，即使在不引起炎症的部位对痛觉刺激的阈值也上升(参照图66Left)。即半乳凝素-9突变体使全身性痛觉的阈值提高。
2.角叉菜胶诱发急性炎症模型：Carrageenan-induced Paw Edema in rats
〔方法〕
角叉菜胶(carrageenan,Izushi kagaku,Japan)由其供货商购入。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。雌性Lewis大鼠(5周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。为了研究半乳凝素9突变体的作用效果，在角叉菜胶注射10分钟前，按照30-300μg/只(inPBS)向大鼠静脉内(i.v.)注射半乳凝素9突变体(略记为h-G9NC(null)、「gal-9」)。作为阳性对照按照3mg/kg、7mg/kg注射地赛米松(Dex.)。
〔因机械刺激导致疼痛的解析〕
改变Randall和Selitto的手法，对半乳凝素9突变体(human nullgalectin-9,h-G9NC(null))是否具有减轻对来自外部的押压的在急性炎症组织或非炎症组织的末梢性过敏症的镇痛活性进行了研究。即向雌性Lewis大鼠(5周龄)的右后足s.c.注射角叉菜胶，诱发急性和慢性炎症。在角叉菜胶注射的前1日和角叉菜胶注射6小时后，通过Randall和Selitto测试测定对来自外部的押压的在急性炎症组织或非炎症组织的末梢性的过敏症，然后一直监测75h(1time/day)。观察者边控制，边用数字式福斯测定器(Imada,aichi,Japan)向已经有炎症的一侧的足跖以及另一侧的非炎症足跖两方由外慢慢加押压(0-200g)。将痛觉阈值定义为动物最初表现出感觉疼痛的前兆时的压力。所谓该前兆是通过指伸时和/或收缩足、发出哭声的最初时刻表现出的苗头。
统计上的解析象实施例28那样进行。即没有特别指出时，数据用平均值(mean)±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过BonferroniPost-Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图60(半乳凝素9突变体,gal-9)和图61(地塞米松)所示。图中各个值在各示的点表示9匹(n＝9)只的动物的平均值±SEM。统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异通过Bonferroni Post-Test进行评价(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。给予半乳凝素-9突变体，不止是引起炎症(依赖于浓度)的部位，即使在不引起炎症的部位对痛觉刺激的阈值也上升。即半乳凝素-9突变体使全身性痛觉的阈值提高。
实施例30
〔半乳凝素-9突变体人关节液中的稳定性〕
反应条件
人风湿病关节液标本               160μL
G9NC(null)or G9(S)(5μL in PBS)  40μL
即在80％关节液中，使半乳凝素-9于37℃下温育24小时或96小时(途中于6、24、48、72小时取样)
SDS处理和Western blot
样品                       4.5μL
H2O                        40.5μL
Sample buffer(4x,+2-ME)    15μL
SDS-PAGE 12.5％(10μL/lane)。
结果如图62所示。表明即使在蛋白水解酶活性高的关节液中半乳凝素-9突变体〔G9NC(null)〕也比半乳凝素-9S〔G9(S)〕稳定。
实施例31
〔关节炎模型〕
1.抗体混合物激发模型：半乳凝素-9突变体(i.v.注射)
〔方法〕
使用DBA/1J雌性小鼠(7～8周龄)，激发关节炎用单克隆抗体混合物(Chondrex公司、No.62100)按照2mg/0.5mL/只注入动物的尾静脉。注入3日后腹腔内注射50μg/0.2mL的LPS(SIGMA,L6511)。再以30μg/200μL将半乳凝素-9突变体(略记为h-Gal9NC(null)、「Gal-9」)注入动物的尾静脉。实验组做成注入PBS组和注入h-Gal9NC(null)组，Day0(注入LPS日)1次注入组和从Day0连续注入组(直至Day10，注入次数11次)共计3组进行。各组1日1次左右测定前后肢的关节的肿胀，进行打分。
〔结果〕
结果如图63所示。注入抗体混合物后，用LPS激发关节炎。关节炎也可以通过半乳凝素9突变体的i.v.注入被抑制。而且即使注入1次也可看到发症被抑制的效果。
2-1.CIA(胶原致敏)模型：半乳凝素-9突变体(i.p.注入)
〔方法〕
将Bovine Collagen typeⅡ(BCⅡ：Chondrex公司cat no 2002-1)溶解于完全佐剂(CFA：Difco cat no 263810)，制作乳剂，向小鼠(DBA/1J 7～8周龄、雌)的尾根部皮内注射，每次100μL(BCⅡ0.1mg/100μL/mouse)。致敏21日后进行加强注射，一周3次对四肢进行划痕。加强后立刻向腹腔内注射半乳凝素-9突变体(略记为「Gal-9」；30μg/mouse)或PBS，以后连日注射。
参小鼠划痕(关节炎所见)对各小鼠的四肢经多人观察，算出四肢的合计分数(最高16分)，算出平均分。
①指1个肿胀：1分
②指2个以上肿胀：2分
③肿胀至手(足)的甲：3分
④剧烈肿胀、变形：4分
〔结果〕
结果如图64所示。确认半乳凝素-9突变体有抑制发症效果。
2-2.CIA(胶原致敏)模型：半乳凝素-9突变体(i.v.注入)
〔方法〕
将Bovine Collagen typeⅡ(BCⅡ：Chondrex公司cat no 2002-1)溶解于预先加了Mycobacterium Tuberculosas H37Ra,desiccated.(H37Ra：Difco)的imcomplete Freund'sAdjuvant(IFA：Difco)，制作乳剂，向小鼠(DBA/1J 7～8周龄、雌)的尾根部皮内注射，每次100μL(BCⅡ0.2mg/H37Ra 0.2mg/100μL/mouse)。致敏21日后进行加强注射，一周3次对四肢进行划痕。小鼠划痕(关节炎所见)经多人对各小鼠的四肢观察，算出四肢的合计分数(最高16分)，算出平均分数。
加强后、立刻向尾静脉内注射半乳凝素-9突变体(略记为「Gal-9」と；30μg/mouse N＝15)或PBS(N＝10)，以后连续注射28天。
参考文献：Enhancement of collagen-induced arthritis inmice genetically deficient in extracellular superoxidedismutase.
Ross AD,Banda NK,Muggli M,Arend WP.Arthritis Rheum.2004Nov；50(11):3702-11.
〔结果〕
结果如图65所示。即使在半乳凝素-9突变体的i.v.注入也可看到发症被抑制。
3.佐剂性关节炎(AIA)模型：半乳凝素-9突变体(i.v.注射)
〔方法〕
丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum,Difco,Detroit,MI,USA)由其供货商购入。为了给予动物，在全部实验中作为载体(vehicle,V)使用PBS(-)，将化合物悬浮于该溶液后给予动物。雌性Lewis大鼠(5周龄)由SLC(静冈,日本)购入，象实施例19那样饲育。为了研究半乳凝素9突变体的作用效果，在佐剂注射前后0至22日，按照30-300μg/只(in PBS)向大鼠静脉内(i.v.)注射半乳凝素9突变体(略记为h-G9NC(null)、「gal-9」)。作为阳性对照按照3mg/kg、7mg/kg注射地赛米松(Dex.)。
〔佐剂性关节炎〕
测定雌性Lewis大鼠(5周龄)的体重，在尾部做标记，分为由9只动物组成的组。在佐剂注射前(day 0)、记录体重和两个后足的足跖的容积。然后向各个大鼠的右后足注射佐剂。将没有注射佐剂的组作为正常对照组(normal age-matched controls(sham))。分别在佐剂注射后的不同日期记录将大鼠杀死前各组大鼠的体重和足的容积。
〔足的容积〕
使用水银置换型呼吸功能解析装置(mercury displacementplethysmography；Muromachi,Tokyo,Japan)测定足的容积。将足的容积的变化以day 0与各个日期之间的差异进行计算。
〔临床上评价〕
对于前肢或后肢的、1.指节骨关节和指、2.甲部或掌、3.踝骨关节或腕部象以下那样分为0～3等级评价各足关节炎的程度：0,既没有红斑，也没有肿胀；1,轻度的红斑或肿胀；2,踝骨关节或腕部的中程度的红斑或肿胀；3,重度的红斑或肿胀。
在不同的大鼠组中进行了病状打分。取等级化的足跖关节炎的分数的和，获得各大鼠每日的关节炎分数的总分。
〔佐剂的程序〕
将丁酸分枝杆菌(Mycobacterium butyricum)于乳钵中研碎，制备佐剂，与混合混合，做成最终浓度10mg/ml。使用27-号的0.5-英才針将0.2ml佐剂注射到大鼠右后足的足底。
统计上的解析象实施例28那样进行。即没有特别指出时，数据用平均值(mean)±SEM表示。数据组的统计上的差异使用one-way ANOVA或two-way ANOVA进行解析。而组之间的差异使用市售的统计软件(GraphPad Software,Inc.,San Diego,USA)通过Dunnett'sMultiple Comparison Test或Bonferroni Post-Test进一步评价。P值<0.05被认为是统计学上有意义。
〔结果〕
结果如图66(半乳凝素9突变体,Gal-9)和图67(吲哚美辛,Indo)所示。佐剂性关节炎主要是由自然免疫和T细胞参与的获得免疫引起的炎症。半乳凝素-9突变体虽然可抑制任一种炎症，但主要是强烈抑制由获得免疫引起的炎症。另外体重的增减在吲哚美辛给予组和半乳凝素-9突变体给予组都表现出同样的倾向。
实施例32
〔大鼠CIA(胶原致敏)模型：半乳凝素-9突变体(i.v.注入)〕
〔方法〕
将牛Ⅱ型胶原(胶原技术研修会)溶解于不完全佐剂(IFA：Difco)，制作乳剂，向大鼠(DA/Slc 11周龄:日本SLC公司)的背部皮肤内按照每次500μL进行皮内注射(胶原50μg/500μL/mouse)，进行一次致敏。1周后将同胶原乳剂液(胶原50μg/500μL/mouse)注入动物的尾根部，进行二次致敏。每周3次对四肢进行划痕。加强后立刻向静脉内注入半乳凝素-9突变体(null human galectin-9＝h-G9NC(null)；3,10,30μg/1mL/mouse)、阴性对照物质PBS(1mL/mouse)，阳性对照物质脱氢可的松(3mg/10mL/kg:SIGMA)经口给予，每日1次、进行到38天之前的第32天。
在胶原一次致敏日(0日)、一次致敏后7,15,18,22,26,30,35和39日测定左右后肢的足容积，按照下式算出浮肿率(％)。
浮肿率(swelling)(％)＝[致敏后的足跖体积(mL)－致敏前的足跖体积(mL)]/[致敏前的足跖体积(mL)]x100
统计学上的处理如下进行。左右后肢的加算作为个体值、用浮肿率(％)的平均值和标准误差表示。在PBS组和脱氢可的松组之间通过F检定检定等分散性，对于等分散的情况进行Student的t检定，对不等分散的场合进行Aspin-Wech的t检定。然后在PBS组和半乳凝素9突变体组之间通过Bartlet检定检定等分散性，对于等分散性的场合进行参数的Dunnett’s test，对于不等分散性的场合进行非参数的Dunnett’s test。无论那一种场合有意水准将5％以下(p<0.05)作为有意义，分成5％以下和1％以下(p<0.01)表示。得到的结果如图68和表3所示。表3中各个值用平均值(mean)±SEM表示。##：来自对照的有意义差异(15,18,22Day:Student的t检定、*p<0.05,**p<0.01：来自对照的有意义差异(18,22Day:参数的Dunnett’s test；15Day:非参数的Dunnett’s test)。确认半乳凝素9突变体抑制发症。
本半乳凝素9突变体(稳定化半乳凝素9、例如、h-G9NC(null)等)由于表现出如下那样的生物活性，所以可表现出预期的抗肿瘤效果
肿瘤细胞的凝集······在许多肿瘤细胞中的凝集效果
粘附抑制·········对细胞外基质的粘附抑制效果
凋亡、细胞损伤··在很多肿瘤细胞中的凋亡诱导
树状细胞(DC)的活化···DC分化诱导
NK、NKT活化····动员促进
疼痛的抑制········抑制由辣椒辣素引起的疼痛
本发明者等研究组研究了半乳凝素9在乳癌组织中的表达，通过半乳凝素9阳性例确认远隔转移频率低。而且现在正在进行转移予知诊断试剂盒的开发(Clin Cancer Res,2005in press,Galectin-9asa prognostic factor with anti-metastatic potential in breastcancer)。另外确认半乳凝素9基因导入人乳癌细胞株在体内表现出高的凝集性，在裸鼠体内也确认表现出同样的凝集性。另外对包括血球系恶性肿瘤在内的很多细胞系的细胞损伤活性都被确认，确认其中很多活性是由于凋亡的诱导导致的(Int J Cancer.200220；99(6):809-816,Possible role of galectin-9in cell aggregation andapoptosis of human melanoma cell lines and its clinicalsignificance；J immunol.20031；170(7d):3631-3636,Galectin-9induces apoptosis through the carcium-calpain-caspase-1pathway)。另外，在给予半乳凝素9的局部，NK/NKT细胞、Mφ系细胞等的动员被证实，表明细胞性癌免疫机构诱导的可能性。
由以上结果可以预期稳定化半乳凝素9(本发明的半乳凝素9突变体、例如、h-G9NC(null)等)具有通过对白血病等血球系恶性肿瘤、术后的释放癌细胞的杀细胞效果、阻碍癌细胞的凝集·癌细胞的血管壁粘附和向其它组织的浸润，抑制转移、抑制癌性腹膜炎发症的效果、以及通过效应细胞向肿瘤周边部位的动员引起肿瘤免疫活性的亢进等效果、以及成为预期作用效果更理想，副作用更少的新的抗癌物质。
现在开发中的生物制剂(单克隆抗体等)以免疫细胞表面分子、细胞内功能分子或炎症性细胞因子作为靶。即是具有抑制效果，做成药理作用的药剂。另外本稳定化半乳凝素9分子制剂是通过诱导滑膜细胞或活化T细胞的凋亡和抑制骨破坏的作用，预期生物体本来具有的免疫调节作用、抗炎症作用和骨·软骨组织也可再生的与抗细胞因子疗法等完全不同的新想法的开发研究。疼痛是关节风湿病的主要所见，在上述实施例中使用的辣椒辣素是激发神经性炎症的炎症性疼痛的重要的介体，稳定化半乳凝素9抑制由于辣椒辣素涂布引起的耳壳肿胀。即预期可作为副作用少的新的全身性自身免疫疾患的治疗药。本稳定化半乳凝素9可成为由于新的作用机制引起副作用少的抗风湿病剂。本稳定化半乳凝素9具有抑制炎症和关节组织的修复、抑制疼痛的临床效果上的特征，预期(1)活化T细胞凋亡的诱导，(2)滑膜细胞的凋亡、(3)花生四烯酸级联，(4)骨破坏抑制等机理有望作为风湿病治疗药。实际上关节炎(CIA、抗体混合物)模型的抑制发症已被确认。
产业上利用的可能性
半乳凝素9突变体比野生型的半乳凝素对酶有抗性，所以在有效利用半乳凝素9表现出的多方面作用·功能中有重要作用。野生型半乳凝素9虽然通过对肿瘤细胞的直接作用(诱导诱导肿瘤细胞的细胞间粘附与凋亡的活性)和借助于免疫系的作用，表现出具有抑制癌的转移和诱导萎缩，但半乳凝素9突变体是表现出同样活性的更有好的活性物质，例如预期可作为抗肿瘤药等。野生型半乳凝素9由于对非活化淋巴细胞没有作用，而诱导活化T细胞、特别是诱导成为过剩免疫反应原因的CD4阳性T细胞凋亡，
本半乳凝素9突变体是表现出同样活性的更有好的活性物质、例如预期可作为抗炎症药、抗变态性药、骨质疏松药。由于已阐明野生型半乳凝素9对与风湿病中关节的变形等有关的滑膜细胞具有强力凋亡诱导能力，所以本半乳凝素9突变体预期可作为表现出同样活性的更有好的活性物质。因此可以在针对癌治疗药和难治的自身免疫疾患(包括风湿病)、变态性疾患、炎症疾患、与骨代谢有关的疾患的治疗药的开发、半乳凝素9的功能阐明和研究开发中利用。
本发明除了上述说明以及实施例特别叙述的以外，显然能够实行。鉴于上述的示范，本发明的多种改变以及变形都是可能的，因此这些也都是本件附加的权利要求范围的范围内的内容。
＜序列表free text＞
SEQ ID NO:1,人工序列的描述:半乳凝素9突变体的多聚核苷酸,G9NC(null)
SEQ ID NO:2,人工序列的描述:半乳凝素9突变体的氨基酸
SEQ ID NO:5,半乳凝素9的M型同工型
SEQ ID NO:10,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO:11,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO:12,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸
SEQ ID NO:13,人工序列的描述:用作PCR引物的寡核苷酸

Claims (18)

1.蛋白质或其盐，其特征是半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域被改变。
2.权利要求1所述的蛋白质或其盐，其特征是：改变由在半乳凝素9或基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质的连接肽或其附近区域的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列形成，与半乳凝素9比较，至少对于连接肽的分解敏感性被改变。
3.权利要求1或2所述的蛋白质或其盐，其特征是：基本上具有与半乳凝素9同等活性的蛋白质与半乳凝素9的氨基酸序列至少具有70％以上同源性。
4.权利要求1～3中任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：(1)和(2)借助于(3)连接,其中(1)为具有半乳凝素9的N末端侧的糖链识别区域(NCRD)或与该区域具有基本上同等活性的多肽；(2)为具有半乳凝素9的C末端侧的糖链识别区域(CCRD)或基本上与该区域具有同等活性的多肽；(3)为在半乳凝素9的连接肽的氨基酸序列中缺失、取代或添加的1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽。
5.权利要求1～4任一项所述的蛋白质或其盐，其特征是：(1)和(2)借助于(3)连接,其中(1)为具有序列3所示的氨基酸序列的多肽或基本上与它具有同等活性、且具有与序列3所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽,或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～8个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；(2)为具有序列4所示的氨基酸序列的多肽或基本上与它具有同等活性、且具有与序列4所示的氨基酸序列至少70％以上同源性的氨基酸序列的多肽,或具有在序列3所示的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加1～21个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽；(3)为在序列7～9中任一个序列表示的氨基酸序列中缺失(不过，序列7中的1～32以及1～44的缺失、和序列8中1～12的缺失除外)、取代或添加1个或1个以上的氨基酸的氨基酸序列构成的改变连接肽。
6.一种核酸，其特征是具有编码权利要求1～5任一项所述的蛋白质的碱基序列。
7.权利要求6所述的核酸，其特征是聚核苷酸。
8.权利要求6或7所述的核酸，其特征是DNA或RNA。
9.一种重组载体，其特征是含有权利要求6～8任一项所述的核酸。
10.权利要求9所述的重组载体，其特征是除了含有权利要求6～8任一项所述的核酸外，还含有编码标记蛋白质和/或肽的碱基序列。
11.一种转化体，其特征是含有权利要求6～8任一项所述的核酸或权利要求9或10所述的重组载体。
12.权利要求11所述的转化体，其特征是：转化体宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
13.一种药物，其特征是：作为有效成分含有从权利要求1～5中任一项所述的蛋白质、权利要求6～8中任一项所述的核酸、权利要求9或10所述的重组载体和权利要求11或12所述的转化体中选择的成分。
14.权利要求13所述的药物，其特征是免疫调节剂。
15.权利要求13所述的药物，其特征是抗肿瘤药。
16.权利要求15所述的药物，其特征是抗来自于包含脑肿瘤(多形形恶性胶质瘤等)、脊髓肿瘤、上颚洞癌、胰液腺癌、齿肉癌、舌癌、口唇癌、上咽癌、中咽癌、下咽癌、喉头癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肺癌、胸膜肿瘤、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道癌、胃癌、大肠癌、胆管癌、胆囊癌、胰脏癌、肝癌、肾脏癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、精巢肿瘤、肾上腺癌、子宫颈癌、子宫体癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、纤毛上皮瘤、恶性骨肿瘤、软部肉瘤、乳癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、基底细胞瘤、白血病、伴随骨髓化性的骨髓纤维症、恶性淋巴瘤、恶性淋巴肉芽肿病、浆细胞瘤、神经胶质瘤等癌和肉瘤的肿瘤的抗肿瘤药。
17.权利要求13所述的药物，其特征是该药物是针对下面疾患或疾病、或病的症状的药物：
(A)炎症性疾患，来自于在各脏器中发生的各种急性和慢性炎症、变态性和自身免疫性炎症、感染症等中的疾病；
(B)急性和慢性疾患，来自于包括支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎、肺炎、细支气管炎、急性纵隔炎的肺的疾患、包括心外膜炎、心内膜炎、心肌炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽炎、喉头炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性肠炎、虫垂炎、缺血性大肠炎、药物性大肠炎、直肠炎在内的肺以外的其它脏器的疾患、包括A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、重症肝炎、急性和慢性肝炎以及肝硬变、胆囊炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、急性和慢性肾炎、膜性肾炎、丝球体肾炎、IgA肾症、各种膀胱炎、脑髓炎、乳腺炎、皮炎、表层角膜炎、干性角结膜炎、中耳炎和鼻炎、副鼻腔炎和鼻茸、牙肉炎、牙周炎、牙周围炎在内的炎症等疾病；
(C)来自于神经性炎症(例如、神经性胃炎、神经性膀胱炎等)、癌或伴随炎症疼痛的疾病；
(D)变态性炎症疾患，全身性过敏性、支气管哮喘、过敏性肺炎、花粉症、变态性鼻炎、变态性结膜炎、免疫复合体引起的变态性疾患、血管神经性浮肿等在内的疾病；
(E)自身免疫性的炎症(自身免疫疾患)，来自于全身性(慢性关节风湿病、全身性红斑狼疮、结节性多发性动脉炎、强皮症、多发性肌炎·皮肤肌炎、肖格伦综合征、贝切特病等)、神经系(多发性硬化症、重症肌无力症、HAM(HTLV-1脊髓症)、肌萎缩性侧索硬化症等)、内分泌性(巴泽多病、桥本病、1型糖尿病等)、血液(特发性血小板减少性紫斑病、自身免疫性溶血性贫血、再生不良性贫血等)、呼吸器(结节病、肺纤维症等)、消化管(溃疡性大肠炎、克罗恩病等)、肝脏(自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胆管炎等)、肾·尿路系(抗嗜中性白细胞细胞质抗体相关肾炎、血管炎、肺肾综合征(Goodpasture)、抗丝球体基底膜抗体病等)等疾病；
(F)感染症，由于病原体伤害生物体的细胞·组织·脏器产生的疾患、或起因于给人带来感染症的病原体的疾患，病原体来自于1)细菌(包括螺旋体、衣原体、立克次体)、2)病毒、3)真菌、4)植物(藻类)、5)原虫、6)寄生虫(吸虫、条虫、线虫)、7)节足动物，包括细菌性感染症(霍乱、瘟疫、大肠杆菌感染症等)、螺旋体感染症(钩端螺旋体病等)、衣原体感染症(鹦鹉病等)、立克次体感染症(斑疹伤寒、破伤风等)、病毒性感染症(带状疱疹、病毒性出血热、狂犬病等)、真菌症(念珠菌病、隐球菌病、曲霉菌病等)、原虫性疾患(阿米巴性痢疾、疟疾、弓形体病等)、寄生虫(吸虫症、线虫症等)、此外还包括支原体感染症(支原体肺炎等)、分支杆菌感染症(结核、非定型抗酸菌症等)疾病；
(G)皮肤科领域的疾患，i)皮肤感染症、包括变态性炎症和自身免疫性炎症等在内的皮炎症，干癣、水疱症、脓疱症、角化、角化异常症等具有特有炎症的皮肤疾患、ii)来自于由于美容皮肤科相关的损伤或老化，与a)黑色素代谢调节(美白)、b)毛发成长(生发)的调节、c)胶原产生调节有关的皮肤科领域的疾患(包括老化)；
(H)生活习惯病，来自于包括高脂血症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等在内的疾病；
(I)有关正常细菌丛的维持的异常；
(J)来自于包括淀粉样变性、阿尔茨海默病、骨质疏松症、骨折等在内的疾病；
(K)脑、神经领域中的炎症反应，例如伴随着脑梗塞、心肌梗塞等缺血性病变的进展出现的炎症、综合失调症；
(L)痛风；
(M)骨质疏松症；或
(N)间质性肺炎。
18.分析或检查试剂，特征是作为有效成分含有选自于权利要求1～5中任一项所述的蛋白质、权利要求6～8中任一项所述的核酸、权利要求9或10所述的重组载体以及权利要求11或12所述的转化体的成分。
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