KR20130126629A - 탈모 질환의 치료 방법 - Google Patents

탈모 질환의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 JAK/STAT 저해제를 투여함으로써 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

탈모 질환의 치료 방법 {METHODS FOR TREATING HAIR LOSS DISORDERS}
본 출원은 2010년 11월 2일자 미국 가출원 제 61/409,509호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물들은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 이들 간행물의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 내용에는 저작권 보호 대상인 자료가 포함되어 있다. 그 저작권자는, 미국 특허청의 특허 파일 또는 기록물에 포함된, 모든 특허 문헌 또는 특허 개시물의 복사에는 반대하진 않지만, 모든 저작권 권리를 소유한다.
정부의 이해 관계
이 발명은 미국 국립 보건원 / 국립 관절염 및 근골격계/피부 질환 연구소에서 정부 지원 RO1 AR56016 하에 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
원형 탈모증 (AA)은 유병률이 가장 높은 자가면역 질환들 중 하나로, 모낭의 면역 특권(immune privilege)의 상실과 후속적인 자가면역성 파괴로 인해 모발이 줄어든다. AA는 두피와 그외 신체 여러 곳에서 모발 감소를 야기하는 피부 질환이다. 일부 중증인 경우, 머리나 신체에서 모발이 완전히 없어지도록 진행될 수 있다. 원형 탈모증은 자가면역에 의해 유발되는 것으로 생각되지만, 유전자 수준의 진단과 치료에 대해서는 보고된 바가 거의 없다. AA의 유전학적 토대도 거의 알려져 있지 않다.
본 발명의 일 측면은, 사이토카인 시그널링에 관여하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)의 저해제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포괄한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak1 및/또는 Jak2 저해제이다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Stat1 및/또는 Stat2 저해제이다. 다른 구현예에서, 상기 저해제는 INCB 018424이다. 다른 구현예에서, 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증(androgenetic alopecia), 휴지기 탈모증(telogen effluvium), 원형 탈모증, 머리 백선(tinea capitis), 전두 탈모증(alopecia totalis), 감모증(hypotrichosis), 유전성 단순 감모증(hereditary hypotrichosis simplex) 또는 전신 탈모증(alopecia universalis)을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은, 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak1 또는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak1 또는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 저해제는 Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543, 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈(fludarabine) (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate, EGCG), 또는 하이퍼포린(Hyperforin)이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 2, 4, 6 또는 8을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 일부 구현예들에서, Jak1 유전자에 대한 siRNA는 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다. 다른 구현예들에서, Stat1 유전자에 대한 siRNA는 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은, 사이토카인 시그널링에 관여하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)의 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak/Stat 저해제이다. 다른 구현예들에서, 상기 저해제는 INCB 018424이다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물(modulating compound)은 모발 생장을 저해할 수 있으며, 따라서 다모증과 같은 모발 생장 장애를 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은, 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak1 또는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak1 또는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 저해제는 Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 2, 4, 6 또는 8을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 일부 구현예들에서, Jak1 유전자에 대한 siRNA는 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다. 다른 구현예들에서, Stat1 유전자에 대한 siRNA는 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은, Jak1 저해제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 1에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 2를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 일부 구현예들에서, Jak1 유전자에 대한 siRNA는 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은 Jak1 저해제를 유효량으로 개체에게 투여함으로써, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 1을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 2를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 일부 구현예들에서, Jak1 유전자에 대한 siRNA는 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Jak 2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 3에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 4를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다.
본 발명의 일 측면은 Jak2 저해제를 유효량으로 개체에게 투여함으로써, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 3을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 일 구현예에서, 상기 소분자는 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 4를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Stat 1 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 5에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Stat1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 6을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 다른 구현예들에서, Stat1 유전자에 대한 siRNA는 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은 Stat1 저해제를 유효량으로 개체에게 투여함으로써, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 5를 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Stat1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat1 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 6를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다. 다른 구현예들에서, Stat1 유전자에 대한 siRNA는 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 서열이다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Stat 2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 7에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 8을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다.
본 발명의 일 측면은 Stat 2 저해제를 유효량으로 개체에게 투여함으로써, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 7을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Stat2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자이다. 다른 구현예에서, 상기 소분자는 WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린이다. 다른 구현예에서, siRNA는 서열번호 8을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것이다.
추가의 구현예에서, 상기 투여는 피하, 근육내, 복막내 또는 정맥내 주사; 주입; 경구, 코, 또는 국소 전달; 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 투여는 매일, 매주, 매달 2회, 매달, 매달 2회 또는 매해 수행한다.
도 1은 AA의 임상 증상들을 보여주는 사진이다. 상위 패널 (도 1A-B)에서, 환자는 AA 멀티플렉스(AA multiplex) 상태이다. 도 1B에서, 환자는 재생기(regrowth phase) 과정에 있다. 전신 탈모증 환자의 경우, 체모와 모발이 모두 없으며 (도 1C), 전두 탈모증 환자는 모발만 없다 (도 1D). 도 1D에서, 모발 재생은 두정부에서 관찰되고, 후두부 또는 측두부에서는 재생되지 않는다.
도 2는 원형 탈모증 (AA)의 기저가 되는 염증 반응을 도시한 것이다.
도 3은 원형 탈모증 (AA)의 기저가 되는 염증 반응을 도시한 것이다.
도 4A는 AA(상단)를 앓고 있는 C3H 마우스와 대조군 마우스 (하단)에서 분리한 림프절과 비장의 사진이다.
도 4B는 CD8 및 Th1 세포를 가지고 있는 NKG2D가 뮤라인 AA 경피 림프절에서 증폭됨을 보여주는 FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4C는 AA를 앓고 있는 C3H 마우스의 사이토카인 생산 세포의 수가 대조군 마우스 대비 6배 증가됨을 보여주는 막대 그래프이다.
도 5A는 C3H 마우스의 탈모증 피부의 RNA 시그니처이다. 히트 맵(heat map)은, 상위 20개의 조절되지 않은(unregulated) 유전자들 중 16종이 인터페론-반응 유전자들임을 보여준다. 조절되지 않은 유전자 20종 중 16종은 인터페론 반응성 유전자들(IFN-γ임, I형 IFN은 증가되지 않음).
도 5B는 AA 피부의 전사 프로파일링을 나타낸 것이다. 구축한 리스트에서 취한 각 유전자들에 대한 qPCR 검증을 통해 3번의 실험의 평균 배수 변화를 나타낸다.
도 6은 AA의 타겟을 나타낸 도식이다.
도 7은 인터페론 γ 경로를 나타낸 도식이다.
도 8A-B는 2가지 유전자 맵핑 방식을 나타낸 것이다. 도 8A는 가족에서의 연관 분석(linkage analysis)을 나타낸 것이다. 도 8B는 인구 코호트에서의 연관성 분석(association analysis)을 나타낸 것이다.
도 9는 AA에서의 게놈와이드 연관성 연구 (Genomewide Association Study: GWAS) 결과를 나타낸 것이다.
도 10A-B는 위험 신호: 대조군 개체 (도 10A) 및 AA 환자 (도 10B)에서의 모낭내 ULBP3 발현을 나타낸 것이다.
도 11A-B는 "벌떼(swarm of bees)": NKG2DL에 의해 유인되는 킬러 CD8 T 세포들에 의해 AA가 야기됨을 보여준다. 도 11A는 AA에서 "pre-2010" 벌떼를 나타낸 것이다. 도 11B는 벌의 "2012" 동정을 나타낸 것이다 ((m) CD8 염색; (n) NKG2D 염색; 및 (o) NKG2D와 CD8의 공동-위치화).
도 12는 AA의 기저인 염증 반응을 나타낸 도식이다.
도 13은 INCB18424-202를 나타낸 것이다: Th1 및 Th17 전사 마커들과 케라틴 16은 국소 INCB18424, JAK1 및 JAK2 저해제 처리시에 감소됨.
도 14는 INCB18424-203에 대한 주요 총 병변 지수(Key Total Lesion Score)를 나타낸 것이다. 모든 용량 군들에서의 총 병변 지수가 비히클 대비 ≥ 2x 감소된 결과를 보여주며, 유의성은 다중도를 제어하여 구한다.
도 15A-B는 INCB018424 처리가 상피 비후화와 진피 염증을 현저하게 감소시킴을 보여준다. 병적인 피부 얇아짐은 관찰되지 않는다.
도 16은 AA 발병을 차단하기 위한 전임상 전략이 CD8 T 세포의 유도 및 작동자 기능에 개입하는 것이며, IFN-γ 시그널링의 차단을 포함함을 도시한 것이다.
도 17은 CD8+ NKG2D+ T 세포가 마우스와 인간 둘다에서 AA 모낭에 침윤함을 나타낸 것이다. 윗 패널: 인간 원형 탈모증 (Pethukova et al.,2010, Nature, 466(7302):113-7); 하단 패널- C3H/HeJ 원형 탈모증.
도 18은 탈모증 C3H 마우스에서 CD8αβ +NKG2D+ T 세포가 탈모증 C3H 마우스의 피부, 림프절 및 혈액에서 대규모로 증폭됨을 보여주는, CD8+NKG2D+ T 세포를 나타낸 것이다. (NKG2D+ γδ T 세포는 병에 걸린 피부와 병에 걸리지 않은 피부 둘다에 존재함).
도 19는 탈모증 C3H 마우스의 CD8+NKG2D+ T 세포이다. 게이트 제어된(gated) LN CD8a+NKG2D+ 집단의 면역표현형은, 이들이 한결같이 CD8ab+CD44+CXCR3+DX5+NKG2A/C/E+ IFN-γ를 생산하는 기억 T 세포임을 보여준다.
도 20은 피부 및 LN에서 C3H T 세포의 스펙트라타입의 분석 결과이다: 유사한 TCR 레파토리는 전체 피부와 분류된 CD8+NKG2D+ LN T 세포에서 공통적이므로, 이들은 관련 작동자로서 동정된다.
도 21A-B는 IFN-γ를 생산하는 CD8 T 세포가 인간 및 마우스 AA에서 우세적임을 보여준다. 도 21A: 인간: AA 피부 생검으로부터 나온(crawl-out) T 세포에서 수득한 T 세포들이 한결같이 CD8+NKG2D+이고, PMA/이오노마이신 자극시 IFN-γ를 생산한다. 도 21B: 마우스: 탈모증 마우스 유래의 C3H/HeJ로 자극된 림프절 세포는 병에 걸리지 않은 마우스에 비해 IFN-γ를 생산하는 CD8 및 CD4 T 세포를 3배 이상 함유한다.
도 22는 I형 및 II형 IFN은 C3H 마우스 AA 피부에서 상향조절된다: 인터페론 시그널링 및 반응 qPCR 어레이 사용시 (Stellarray Lonza Cat #00189608), 3마리의 병에 걸린 C3H/HeJ 마우스와 3마리의 병에 걸리지 않은 마우스 간에 인터페론 유전자 발현의 배수 변화 (18S로 표준화함).
도 23은 인간 AA에서의 혈청 케모카인과 사이토카인의 증가를 보여주는 그래프를 나타낸 것이다. 인터페론-γ 및 IFN-유도성 케모카인 (예, IP-10/CXCL10)은, 질환 중증도, 즉, 패치형 질환(patchy disease, AAP) 대 전신 질환 (AU)에 따른 일부 사례들에서, 인간 AA의 혈청에서 증가된다.
도 24는 질환 중증도, 즉, 패치형 질환(AAP) 대 전신 질환 (AU)에 따른 일부 사례들에서, 인간 AA 개체의 혈청내 IL-13의 증가를 보여주는 루미넥스(luminex) 분석 결과이다.
도 25는 30분간 콜라게나제로 분해시킨 후, 0.5 cm x 2 cm의 탈모증 피부 패치에서 분리한 C3H 진피 세포의 전체 집단을 염색하기 위해, 다음과 같은 mAb를 하나의 튜브에서 이용하여 LSRII로 수집한 유세포 측정 데이타이다: (MHC II, CD11b, CD11c, CD19, 120G8, CD3, CD4, CD8, DX5, NKG2D). γδNKG2D 양성 세포 및 CD8+DX5+NKG2D+ 집단이 동정된다. 이들 세포는 또한 CD3+이며, γδCD3 발현율이 CD8+ NK+ T 세포에서 관찰되는 발현율 보다 100x 높다. 전체 CD3 양성 세포의 >95%를 차지하였다.
도 26은 4마리의 AA 개체로부터 수득한 PBMC를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. NKG2D 발현이 림프구 서브세트들에서 증가되었다.
도 27은 C3H-HeJ 마우스에서의 스펙트라타입 분석 결과를 나타낸 것이다. 피부 생검과, C3H-HeJ 마우스의 피부 림프절 유래 분류한 NKG2D- 및 NKG2D+ CD8+ T 세포들에서 RNA를 분리하였다. 스펙트라타입을 분석한 결과, 몇몇 Vbeta 패밀리에서 CDR3 길이 편향화(length skewing)가 확인된다. 몇몇 편향된 Vbeta 패밀리들은 피부와 NKG2D+ 림프절 CD8+ T 세포 집단들 (예, Vbeta2, Vbeta5.2, Vbeta20)에 공유되어 있는 반면, 부가적인 Vbeta 패밀리들은 (CD4+ T 세포 집단을 반영하는) 피부에 편향되어 있다.
도 28은 대조군 또는 AA에 걸린 개체로부터 획득한 인간 두피를 이용하여 피부 및 모낭내 개별 세포 집단들의 일차 배양물을 확립할 수 있음을 보여주는 도이다.
도 29는 피부의 천공 생검으로부터 수득하여 배양한 인간 진피를 유세포 측정으로 분석하는데 소스 재료로서 사용한, T 세포 "크롤-아웃(crawl-out) 분석을 나타낸 것이다. 6 mm 피부 생검을 3등분한 피부 천공 생검은 탈모 병변과 탈모 비-병변부로부터 입수한다. 지방을 제거한 후, 잘게 썬 피부를 셀폼 매트릭스(Cellfoam matrix)에서 조심스럽게 압착한 다음, IL-2 (6 ng/ml) 및 IL-15 (10 ng/ml)가 첨가된 스킨 T 배지 2 ml이 든 24웰 플레이트의 웰에 피부 면이 위를 향하게 두었다. 3일 후 매트릭스를 제거한 후, T 세포 크룩-아웃을 도 29A에서 관찰하였다. 또한, 이들 세포의 유세포 측정 (도 29B-C) 및 스펙트라타입 분석 결과 (도 29D)도 나타낸다.
도 30은 인간 말초혈 단핵구 세포 (PBMC), 상단 패널 또는 뮤라인 비장세포를 고 농도 IL-2 (1000/ml)에서 배양하여, 림포카인-활성화된 킬러 (LAK) 세포를 제작하였다. CFSE 그린 형광 표지된 LAK 세포를, 인간 모낭 장기 배양물 (상단 패널) 또는 비-병변부 (하단 좌측 2개) 또는 병변부 유래 마우스 모낭 배양물 (하단 패널)과 함께 배양하였다.
도 31은 C3H-HeJ 마우스의 병에 걸린 AA 피부와 병에 걸리지 않은 피부에 대한 면역조직화학적 (IHC) 염색 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은, Jak 1 및 Jak 2, Stat 1 및 Stat 2를 비롯한, Jak/Stat 경로의 저해제를 이용한 탈모 질환 (예, 탈모의 일반적인 자가면역 형태인, 원형 탈모증 (AA))을 치료하는 방법을 제공한다. AA에 대한 임상 연구는 이들 유전자가 연루되어 있는 보다 많이 조사된 "시스터" 자가면역 질환 (예, 류마티스 관절염 (RA), 1형 당뇨병 (T1D), 다발 경화증 (MS))에 비해 뒤쳐져 있다. 본 발명은 AA 및 관련 질환에서 이들 경로의 임상적인 연관성에 대한 정보를 제공할 수 있는 기존에 실험하지 않은 AA 치료제를 제공한다.
외피 및 모발 세포에 대한 총람
외피 (또는 피부)는 신체에서 가장 거대한 기관으로서, 신체의 외표면을 덮고 있는 고도로 복잡한 기관이다. 외피는 다양한 신체 개방부에서 소화관 및 기타 관의 점막과 이어진다. 외피는 체온 및 수분 감소의 조절; 땀샘에 의한 배출을 통해, 일정한 내부 환경을 유지하는 등의 필수적인 다수의 기능들을 수행하지만, 주로 물리적, 화학적 및 생물학적 물질이 심부 조직에 작용하지 못하도록 방지하는 방어 장벽으로서 작용한다. 피부는 탄력적이며, 발바닥, 손바닥 및 귀와 같은 일부 영역을 제외하고는, 기저 조직에 느슨하게 부착되어 있다. 또한, 외피의 두께는 눈꺼풀 ("얇은 피부") 0.5 mm (0.02 인치)에서 손바닥 및 발바닥 ("두꺼운 피부") 4 mm (0.17인치) 이상으로 다양하다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
피부는 2가지 층, a) 표피와 b) 진피로 이루어져 있다. 표피는 외층으로서 비교적 얇다 (0.1 mm). 표피는 수개의 세포 두께이고, 5개의 층, 즉, 배아층, 가시층, 과립층, 투명층 (두꺼운 피부에 한정됨) 및 각질층으로 구성되어 있다. 가장 바깥쪽 표피층 (각질층)은 표면에서 계속적으로 떨어져 나오며, 배아층으로 불리우는 단일한 기저층 세포에 의해 하부에서 대체되는, 죽은 세포로 이루어져 있다. 표피는 세포 집단의 95% 이상을 구성하는 각질형성세포로 주로 이루어져 있다. 기저층 (배아층)의 각질형성세포는 계속 분열하고, 이후 딸 세포는 위로 그리고 바깥쪽으로 이동하면서 분화기를 거치고, 궁극적으로는 표면에서 탈피된다. 표피에 남아있는 세포 집단은 랑게르한스 세포 및 멜라노사이트 등의 수지상 세포를 포함한다. 표피는 기본적으로 기저층 각질형성세포 아래에 위치한 콜라겐 및 기타 단백질 층을 제외하고 약간의 세포외 기질을 함유하고 있는 세포이며, 비-혈관성이다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
진피는 피부의 내층으로서, 콜라겐성 세포외 물질, 혈관, 신경 및 탄성 섬유로 구성된 네트워크로 이루어져 있다. 진피에는 피지샘 (총괄하여, 모피지낭이라 함)과 땀샘이 조합된 모낭이 존재한다. 표피와 진피 사이의 경계면은, 얇은 피부를 제외하고는, 매우 비정형적이고 균일하지 않다. 표피-진피 경계면을 따라 기저 상피 세포 아래에는, 특수화된 세포외 기질이 기저막이라고 하는 독특한 구조로 조직되어 있다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
포유류의 모발 섬유는 각질화된 세포로 구성되어 있으며, 모낭에서 생성된다. 모낭은 표피의 파생물로부터 유래된 조직의 말뚝(peg)이며, 피부 표면 바로 아래에 놓여 있다. 모낭의 원위부는 외부 피부의 표피와 직접 연결되어 있다. 모낭은 소형 구조임에도 불구하고, 인지가능한 여러가지 층들이 동심형의 시리즈로 배열된 고도로 조직화된 체계를 포함한다. 활성형의 모낭은 진피를 통과하여 (결합 조직의 느슨한 층인) 하피로 하향 확장되어 지방 또는 지방층으로까지 연장된다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
활성형 모낭의 기부에 모구가 놓여 있다. 모구는, 상피 기질이라고 하는 상피 세포로 구성된 역위된 컵 형상내에 담겨져 있는, 모유두로 지칭되는 진피 세포들로 구성된 바디로 이루어져 있다. 모낭의 타입과 무관하게, 이 상피 기질의 최극단 기부에 있는 생장성을 지닌 상피 세포는, 몇가지 상피 지지층들과 더불어, 모발 섬유를 만들어낸다. 최하위 진피초(lowermost dermal sheath)는, 초가 조직의 얇은 덮개로서 모발 기질 상피 층 전체를 밖에서 둘러 싸고 있는 위치에서 유두상 기질 스톡(papilla basal stalk)과 인접되어 있다. 그리고, 진피초의 최하위부는 모낭의 길이에 대한 슬리브 또는 관으로서 연장되어 있다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
모발 및 모낭 등의 피부 부속물들의 생장은 피부의 2가지 층인 표피와 진피 간의 상호작용에 의존한다. 배아 발생에서, 이들 2개의 층 간의 순차적인 정보 교환은 복잡한 일련의 형태발생 과정들을 뒷받침하며, 따라서 성체 모낭 구조가 형성된다. 그러나, 일반적인 피부 진피 및 상피 세포들과는 대조적으로, 특정 모낭 세포 집단들은, 성숙화를 거친 후, 배아-타입의 상호작용성, 유도성 및 생합성 거동을 유지한다. 이러한 특성들은 주기적으로 생산가능한 모낭의 매우 다이나믹한 성질로부터 파생될 수 있는데, 반복되는 조직의 리모델링에는 배아 발생에 필수적이며 다른 형태의 조직 재건에 바람직한, 높은 수준의 진피-상피 상호작용 교류가 요구된다.
모발 섬유는 활성형 모낭의 기부에서 매우 빠른 속도로 만들어진다. 예를 들어, 모낭은 인간 두피에서 0.4 mm/일의 속도로, 그리고 랫의 코 털 또는 수염의 경우 최대 1.5 mm/일의 속도로 모발 섬유를 만드는데, 이는 모낭 표피의 세포 증식 순위가 성체 조직들 중에서 가장 빠르다는 것을 의미한다 (Malkinson FD and JT Kearn, Int J Dermatol 1978, 17:536-551). 모발은 성장 주기로 생장한다. 생장기는 생장하는 단계로, 모낭의 최대 90%가 생장기인 것으로 생각되며; 이행기는 둥글게 감기거나 퇴행하는 단계로서, 모낭의 약 1-2%를 차지하며; 휴지기는 주기가 쉬거나 정지하는 단계로, 모낭의 약 10-14%를 차지한다. 주기의 기간은 신체 부위에 따라 달라진다.
모낭 형성과 주기의 진행은 저해 신호와 자극 신호의 밸런스에 의해 조절된다. 시그널링 신호는 TGFβ-BMP 패밀리에 속하는 성장 인자들에 의해 강화된다. TGFβ-BMP 패밀리의 구성원에 대한 주요 길항제는 폴리스타틴 (follistatin)이다. 폴리스타틴은 다양한 BMP (예, BMP-2, -4, -7, 및 -11)들과 액티빈의 작용을 이들 단백질에 결합함으로써 저해하며, 모낭 발생에 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는, 분비형 단백질이다 (Nakamura M, et al., FASEB J, 2003, 17(3):497-9; Patel K Intl J Biochem Cell Bio, 1998, 30:1087-93; Ueno N, et al., PNAS, 1987, 84:8282-86; Nakamura T, et al., Nature, 1990, 247:836-8; Iemura S, et al., PNAS, 1998, 77:649-52; Fainsod A, et al., Mech Dev, 1997, 63:39-50; Gamer LW, et al., Dev Biol, 1999, 208:222-32).
국소 진피-상피 상호작용으로 활발하게 섬유 생장이 이루어지는, 깊숙하게 박혀있는 종구(end bulb)는, 모유두 (DP)로 칭해지는 간엽 세포 클러스터를 포함하는 모낭의 시그널링 센터이다. 이 동일 부위는 모발 섬유나 부속물의 생장과 이행 단계들 간의 정확한 교대 이행과 관련있는 조직 리모델링과 발생학적 변화의 중심이다. 이러한 활성들에 주요 플레이어로서의 DP는 초기 배아 상피 세포(germinative epidermal cell) 소스로부터 모발 섬유 생성을 특징짓는 복잡한 분화 프로그램을 조직하는 것으로 보인다 (Oliver RF, J Soc Cosmet Chem, 1971, 22:741-755; Oliver RF and CA Jahoda, Biology of Wool and Hair (eds Roger et al.), 1971, Cambridge University Press:51-67; Reynolds AJ and CA Jahoda, Development, 1992, 115:587-593; Reynolds AJ, et al., J Invest Dermatol, 1993, 101:634-38).
최하부 진피초 (DS)는 바깥과 위쪽으로 굽은 모유두(papilla)의 기저 스톡(basal stalk) 아래에 생긴다. 그런 다음, 이 진피초는 조직의 박층으로서 상피 모발 기질 층들을 밖에서 둘러싸며, 모낭의 길이에 대해 위쪽으로 연장된다. 상피-유래의 외근모초(epidermally-derived outer root sheath) (ORS) 역시 모낭의 길이에 대해 연장되며, 이는 2개의 층 사이에서 진피초에 대해 밀착하여 내재되어 있으며, 유리막이라고 하는 특수 기저막을 만든다. 외근모초는 아래 모낭의 상피 단일층 보다 적게 조성되어 있지만, 피부에 가까워짐에 따라 점차 두꺼워진다. 내모근초(inner root sheath) (IRS)는 발생 중인 모간(hair shaft)의 몰드를 형성한다. 이것은 3 파트, 헨리층 (Henley layer), 헉슬리층 (Huxley layer) 및 큐티클로 구성되며, 큐티클은 모간에 닿는 가장 안쪽 부위이다. IRS 큐티클 층은 단일 세포 두께이며, 모발 섬유에 인접하여 위치되어 있다. 이것은 모발 섬유 큐티클 층과 근접하게 맞물려 있다. 헉슬리 층은 최대 4개의 세포 층을 포함할 수 있다. IRS 헨리 층은 ORS 층에 인접하여 움직이는 단일 세포 층이다 (Ross MH, Histology: A text and atlas, 3 rd edition, Williams and Wilkins, 1995: Chapter 14; Burkitt HG, et al, Wheater's Functional Histology, 3 rd Edition, Churchill Livingstone, 1996: Chapter 9).
원형 탈모증
원형 탈모증 (AA)은 가장 유병율이 높은 자가면역 질환들 중 하나로서, 미국에서만도 여성 및 남성을 비롯한 모든 인종을 포함하여 대략 460만명의 사람들에서 발생하고 있으며, 평생 위험도는 1.7%이다 (1). AA에서 자가면역성은 모낭에 대해 발생되어, 패치형으로 시작되며, 합체 및 진행되어 두피 전체 (전두 탈모증, AT) 또는 궁극적으로 전신(완전 탈모, AU)까지 확장될 수 있는, 비-반흔성 탈모를 야기한다 (도 1). AA는 서기 30년 코르넬리우스 켈수스에 의해, 두피 전체에 서서히 번지는 물결형의 탈모 진행 궤도로 인해, "뱀"을 의미하는, "오피아시스(ophiasis)"라는 용어로 처음 언급되었다. 히포크라테스가 처음 사용한 그리스 용어는 "알로페키아(alopekia)" (fox mange)이며, 오늘날 사용되고 있는 용어 "원형 탈모증"은 프랑스 리옹에서 1760년에 간행된 소바쥬의 Nosologica Medica에서 최초로 사용되었다.
흥미롭게도, AA는 모발 주기의 성장기(생장)에서 색소 침착된 모낭에서 주로 발생하며, AA 패치에서 모발이 재생되면, 백발 또는 무색으로 대개 자란다. 즉, 갑작스러운 백발화 현상은 급박하게 개시된 AA가 원인이며, 역사적으로 극심한 슬픔, 스트레스 또는 두려움을 겪는 시기에 몇몇 유명 인사들에서 발생한 것으로 기록되어 있다 (2). 그 예로는 샤자한을 들 수 있으며, 샤자한은 1631년에 부인을 사멸한 후 갑자기 백발이 되었으며, 그 슬픔을 부인을 기리기 위해 타지마할을 건설하였다. 유토피아의 저자인 토마스 무어경도 1535년 사형 전날 수염과 모발이 모두 백발이 된 것으로 전해지고 있다. 모발의 갑작스러운 백화는 색소 침착된 모낭에 대한 갑작스러운 공격으로 인해 상처없이 백발이 되는 것으로 여겨진다.
AA에 대한 몇가지 임상적인 측면들은 해명되지 않았지만, 발병을 이해하는데 중요한 단서들이 있을 수 있다. AA는 림프구가 밀집된 클러스터로 둘러싸인 모낭 기부의 주변부 모발만 공격하여, 역사적으로 병리학적 '벌떼' 외형을 남긴다. 이러한 관찰 결과들에 기초하여, 색소 침착된 생장기 모낭에서 신호가 방출되고, 모낭 아래 단부(lower end)에 대한 급성 또는 만성적인 면역 반응이 발생되어, 모발 주기 교란, 급성 모발 빠짐, 모간 이상(hair shaft anomalies) 및 모발 분절이 야기되는 것으로 가정된다. 모낭에서의 이러한 엄청난 교란에도 불구하고, 영구적인 기관 파괴는 발생되지 않으며, 면역 특권이 재생될 수 있다면 모발의 재생 가능성은 남아있다.
역사적으로, AA는 스트레스나 불안에 의해 발생하거나 또는 감염성 물질에 의한 결과로서, 또는 심지어 호르몬의 기능부전에 의해 발생되는 신경 질환으로 종종 간주되었다. 유전학적으로-정해진 자가면역성 기전이 AA의 근원이라는 개념은 20세기에 여러가지 증거들을 통해 등장하였다. AA에서 모낭은 활성화된 Th, Tc 및 NK 세포(3, 4)에 의한 면역 침윤(immune infiltrate)이 나타나며, 억제 (Th2)에서 자가면역 (Th1) 사이토카인 반응으로의 이행이 이루어진다. AA 환자의 두피를 면역-결함성 SCID 마우스로 이식한 AA 인간화 모델에서, 모낭 또는 인간 흑색종 호모게네이트와 함께 공배양되었을 때에만, 도너 T 세포의 이식이 탈모를 야기하므로, 질환의 자가면역 성질을 나타낸다 (5, 6). 면역 관용성을 유지시키도록 작용하는 조절 T 세포는 AA 조직에서 적은 수로 관찰되며 (7), 이들 세포를 C3H/HeJ 마우스 세포에 이동시키면 AA에 대한 내성이 형성된다 (8). AA는 오랫동안 오직 T 세포 매개 질환으로서 간주되었지만, 최근 수년간, 질환의 추가적인 기전에 대한 가설이 등장하였다. 모낭은 면역 세포의 이동을 방해하기 위한 세포외 기질 장벽의 존재, 항원 제시 세포의 결여, 및 면역억제 인자의 국소 생산과 MHC 클래스 I 발현 수준 감소를 통한, NK 세포 활성의 저해를 특징으로 하는, 신체에 몇 안되는 특권을 가진 부위들 중 한 곳으로서 규정된다. (9). 따라서, '면역 특권의 붕괴' 개념도 AA가 발생할 수 있는 기전의 일부로서 상기되고 있다. AA에 대한 유전적 토대를 뒷받침하는 증거들은 직계 가족(first degree relatives)에서 관찰되는 유전 가능성 (10, 11), 쌍둥이 연구 (12) 및 가장 최근에는 가족-기반의 연관성 연구 결과 (13)를 비롯한 여러 계통들에서 확인되고 있다.
탈모 질환의 치료
본 발명은, 공지 치료제, 예컨대, JAK/STAT 단백질들, Jak 1, Jak2, Stat 1 또는 Stat 2 (예, INCB 018424; Incyte)와 같은, 사이토카인 시그널링에 관여하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)의 저해제가 탈모 질환의 치료제로서 사용될 수 있다는 새로운 사실을 제공한다. 탈모 질환의 비제한적인 예로는 안드로겐성 탈모증, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 전두 탈모증, 및 전신 탈모증을 포함한다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 사이토카인 시그널링에 관여하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)의 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak/Stat 저해제이다. 추가적인 구현예에서, 상기 저해제는 INCB 018424이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다.
본 발명의 일 측면은 사이토카인 시그널링에 관여하는 단백질 티로신 키나제 (PTK)의 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 Jak/Stat 저해제이다. 다른 구현예들에서, 상기 저해제는 INCB 018424이다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Jak1 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 1에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다.
본 발명의 일 측면은 Jak1 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하여, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 1을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Jak 2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 3에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다.
본 발명의 일 측면은 Jak 2 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하여, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 3을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Stat 1 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 5에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다.
본 발명의 일 측면은 Stat 1 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하여, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 5를 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 개체에게 Stat 2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유류 개체에서 탈모 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 7에 대한 항체 또는 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증이다
본 발명의 일 측면은 Stat 2 저해제를 유효량으로 개체에게 투여하여, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 개체에서 모발 생장을 유도하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 저해제는 서열번호 7을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 일부 구현예들에서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체이다. 다른 구현예들에서, 상기 탈모 질환은 안드로겐성 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 머리 백선, 전두 탈모증, 감모증, 유전성 단순 감모증 또는 전신 탈모증을 포함한다. 일부 구현예들에서, 조절 화합물은 모발 생장도 저해할 수 있으므로, 다모증과 같은 모발 생장 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.
DNA 및 아미노산 조작 방법 및 이의 정제
본 발명은 당해 기술 분야의 당업자가 이용할 수 있는 기존의 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 이용한다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 기술되어 있다. 예로, Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982): "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D. N. Glover, ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986): B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984), 및 Sambrook, et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1989)을 참조한다.
당해 기술 분야의 당업자는, 비제한적인 예로서, 생화학적 수단을 통한 단백질의 분리 또는 유전자 조작 방법에 의한 대상 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 포함하여, 몇가지 방식으로 단백질을 수득할 수 있다.
단백질은 핵산 (예, 게놈 DNA, 상보적인 DNA (cDNA), 합성 DNA 및 임의의 대응되는 RNA 형태)에 의해 코딩된다. 예컨대, 이는 유전자의 재조합 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 단백질은 다양한 소스들로부터 수득할 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법에 따라 생산할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 코딩하는 핵산은 DNA 라이브러리를 스크리닝하거나 또는 천연 소스로부터 증폭시킴으로써 수득할 수 있다. 단백질은 이의 단편 또는 일부일 수 있다. 단백질을 코딩하는 핵산은 재조합 DNA 기법을 통해 생산할 수 있으며, 이러한 재조합 핵산은 화학 합성, 유전자 조작, 효소적 기법 또는 이들의 조합을 비롯한 기존 기법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, Jak 1 단백질은 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다. Jak 1 폴리펩타이드의 예는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. Jak 2 단백질은 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이다. Jak 2 폴리펩타이드의 예는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. 예컨대, Stat 1 단백질은 서열번호 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이다. Stat 1 폴리펩타이드의 예는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 가진다. Stat 2 단백질은 서열번호 8에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이다. Stat 2 폴리펩타이드의 예는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열을 가진다.
인간 JaK 1의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 1로 나타낸다. 인간 JaK 2의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 2로 나타낸다. Jak 1과 관련된 서열 정보는 GenBank 입수 번호 NP_002218 (단백질) 및 NM_002227.2 (핵산)으로 공공의 데이타베이스에서 입수가능하다.
서열번호 1은 Jak1에 대응되는 인간 야생형 아미노산 서열이다 (잔기 1 - 1154):
Figure pct00001
서열번호 2는 Jak1에 해당되는 인간 야생형 뉴클레오티드 서열이며 (뉴클레오티드 1-5053), 진하게 밑줄 강조한 "ATG"는 오픈 리딩 프레임의 개시부이다:
Figure pct00002
Figure pct00003
인간 Jak 2의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 3으로 나타낸다. 인간 Jak 2의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 4로 나타낸다. Jak 2 관련 서열 정보는 GenBank 입수 번호 NP_004963 (단백질) 및 NM_004972.3 (핵산)으로 공공의 데이타베이스에서 입수가능하다.
서열번호 3은 Jak2에 해당되는 인간 야생형 아미노산 서열이다 (잔기 1 - 1132):
Figure pct00004
Figure pct00005
서열번호 4는 Jak2에 해당되는 인간 야생형 뉴클레오티드 서열이며 (뉴클레오티드 1-5285), 서열에서 진하게 밑줄 강조한 "ATG"는 오픈 리딩 프레임의 개시부를 나타낸다:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
인간 Stat 1의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 5로 나타낸다. 인간 Stat 1의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 6으로 나타낸다. Stat 1에 대한 서열 정보는 GenBank 입수 번호 ADA59516 (단백질) 및 GU211347.1 (핵산)로 공공의 데이타베이스에서 입수가능하다.
서열번호 5는 Stat1에 해당되는 인간 야생형 아미노산 서열이다 (잔기 1 - 750):
Figure pct00010
서열번호 6은 Stat1에 해당되는 인간 야생형 뉴클레오티드 서열이며 (뉴클레오티드 1-2353), 서열에서 진하게 밑줄 강조한 "ATG"는 오픈 리딩 프레임의 개시부를 나타낸다:
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
인간 Stat 2의 폴리펩타이드 서열은 서열번호 7로 나타낸다. 인간 Stat 2의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8로 나타낸다. Stat 2에 대한 서열 정보는 GenBank 입수 번호 AAA98760 (단백질) 및 U18671.1 (핵산)로 공공의 데이타베이스에서 입수가능하다.
서열번호 7는 Stat2에 해당되는 인간 야생형 아미노산 서열이다 (잔기 1 - 851):
Figure pct00014
서열번호 8은 Stat2에 해당되는 인간 야생형 뉴클레오티드 서열이며 (뉴클레오티드 1-18648), 서열에서 진하게 밑줄 강조한 "ATG"는 오픈 리딩 프레임의 개시부를 나타낸다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
단백질 변이체: 단백질 변이체들은 아미노산 서열 변형을 포함할 수 있다. 예컨대, 아미노산 서열 변형은 3가지 유형들 중 한가지에 속한다: 치환, 삽입 또는 결손 변이체. 삽입은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 융합 뿐만 아니라 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함할 수 있다. 삽입은 일반적으로 아미노 또는 카르복시 말단 융합체 보다 작은, 예컨대 잔기 1 내지 4개 수준일 것이다. 결손은 단백질 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거된 것이다. 이러한 변이체들은 일반적으로 단백질을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드를 부위 특이적으로 돌연변이 유발하여 제조되며, 변이체를 코딩하는 DNA를 제조하고, 이후 DNA를 재조합 세포 배양물에서 발현시킨다.
공지 서열을 가진 DNA에서 미리 결정된 부위에 치환 돌연변이를 만드는 기법, 예컨대, M13 프라이머 돌연변이 유발 및 PCR 돌연변이 유발이 잘 알려져 있다. 아미노산 치환은 단일 잔기일 수 있나, 한번에 다수의 여러 위치에서 발생할 수도 있다. 한가지 비제한적인 예에서, 삽입은 아미노산 잔기 약 1 내지 10개 수준일 수 있으며, 결손은 아미노산 잔기 약 1 내지 30개의 범위일 수 있다. 결손 또는 삽입은 이웃한 쌍 (예, 잔기 약 2개 결손 또는 잔기 약 2개 삽입)으로 행해질 수 있다. 치환, 결손, 삽입 또는 이들의 임의 조합을 조합하여, 최종 구조체에 도달할 수 있다. 돌연변이는 리딩 프레임 바깥쪽 서열에서는 발생할 수 없으며, 이차 mRNA 구조를 야기할 수 있는 상보적인 영역은 만들지 않아야 한다. 치환 변이체는 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 위치에 삽입된 것이다.
기능 또는 면역학적 아이덴터티(immunological identity)의 실질적인 변화는, (a) 치환 영역의 폴리펩타이드 벡본 구조, 예컨대 시트 또는 나선 구조, (b) 타겟 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어, 이의 효과 측면에서 더욱 유의하게 다른 잔기를 선별함으로써, 이루어진다. 단백질 특성에 최대 변화를 발생시킬 수 있는 치환은, (a) 친수성 잔기, 예, 세릴 또는 트레오닐의 소수성 잔기, 예, 루실, 이소루실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로의(에 의한) 치환; (b) 시스테인 또는 프롤린의 임의의 다른 잔기로의(에 의한) 치환; (c) 양 전하를 띄는 측쇄를 가진 잔기, 예로, 라이실, 아르기닐 또는 히스티딜의 음 전하를 띄는 잔기, 예로, 글루타밀 또는 아스파르틸로의(에 의한) 치환; 또는 (d) 벌키 측쇄를 가진 잔기, 예로, 페닐알라닌의 측쇄가 없는 것, 예로 글리신으로의(에 의한) 치환, 이 경우 (e) 황산화 및/또는 당화 부위의 수를 증가시킴으로써의, 치환일 것이다.
단백질의 아미노산 서열 상의 최소 변형이 본 발명에 제공된다. 아미노산 서열의 변형은, 서열이 서열번호 1, 3, 5 또는 7과 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%의 상동성을 유지할 경우일 수 있다. 예를 들어, 보전적인 아미노산 치환이 이용될 수 있다. 보존적인 치환은 아미노산의 측쇄와 관련된 아미노산 패밀리내에서 이루어지는 치환으로서, 상호치환가능한 잔기들은 유사한 측쇄를 가진다.
유전자 코딩된 아미노산은 일반적으로 패밀리들로 분류된다: (1) 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트이며; (2) 염기성 아미노산은 라이신, 아르기닌, 히스티딘이며; (3) 비-극성 아미노산은 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판이며, (4) 비하전된 극성 아미노산은 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신이다. 친수성 아미노산으로는 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 글루타민, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 세린, 및 트레오닌을 포함한다. 소수성 아미노산으로는 알라닌, 시스테인, 이소루신, 루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린을 포함한다. 아미노산의 그외 패밀리로는, (i) 지방족-하이드록시 측쇄를 가진 아미노산 그룹, 예컨대 세린 및 트레오닌; (ii) 아미드-함유 측쇄를 가진 아미노산 그룹, 예컨대 아스파라긴 및 글루타민; (iii) 지방족 측쇄를 가진 아미노산 그룹, 예컨대, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 및 이소루신; (iv) 방향족 측쇄를 가진 아미노산 그룹, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; 및 (v) 황-함유 측쇄를 가진 아미노산 그룹, 에컨대 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 사용가능한 보존적인 아미노산 치환 그룹으로는, 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌 발린, 글루타믹-아스파르틱, 및 아스파라긴-글루타민이 있다.
예컨대, 하나의 아미노산 잔기를 생물학적으로 및/또는 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환하는 것은 보존적인 치환으로서 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 보존적인 치환은 소수성 잔기를 다른 것으로 치환하거나, 또는 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것일 것이다. 치환은, 예를 들어 Gly, Ala; Val, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg; 및 Phe, Tyr와 같은 조합을 포함한다. 치환 또는 결손 돌연변이 유발에서는 N-당화 (Asn-X-Thr/Ser) 또는 O-당화 (Ser 또는 Thr)를 위한 삽입 부위를 사용할 수 있다. 시스테인 또는 그외 가변적인 잔기의 결손도 바람직할 수 있다. 잠재적인 단백질분해 부위, 예컨대 Arg를 결손 또는 치환시키는 것은, 예를 들어, 염기성 잔기들 중 하나를 결손시키거나 또는 글루타미닐 또는 히스티딜 잔기에 의해 치환함으로써, 수행된다.
박테리아 및 효모 발현 시스템. 박테리아 시스템에서, 여러가지 발현 벡터가 선택될 수 있다. 예컨대, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2와 같은 유전자에 의해 코딩된 단백질이 항체 유도를 위해 대량 필요할 경우, 쉽게 정제되는 단백질의 고수준의 발현을 지시하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터에 대한 비제한적인 예로는, BLUESCRIPT (Stratagene)와 같은 다기능성의 E. coli 클로닝 및 발현 벡터가 있다. 또한, pIN 벡터나 pGEX 벡터 (Promega, Madison, Wis.)도 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST)와 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드 분자를 발현시키는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 글루타티온-아가로스 비드에 흡착시킨 다음 유리 글루타티온의 존재 중에 용리시킴으로써 세포 용혈물로부터 쉽게 정제할 수 있다. 이러한 시스템에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 팩터 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여, 클로닝된 대상 폴리펩타이드가 GST 모이어티로부터 자유롭게 방출될 수 있도록 설계될 수 있다.
식물 및 곤충 발현 시스템. 식물 발현 벡터가 사용되는 경우, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 코딩하는 서열의 발현은 다수의 프로모터들 중 임의의 프로모터에 의해 이루어질 수 있다. 예컨대, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 단독으로, 또는 TMV 유래 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다. 다른 예로, RUBISCO 또는 열 충격 프로모터의 소형 서브유닛과 같은 식물 프로모터도 사용할 수 있다. 이러한 구조체들은 직접 DNA 형질전환 또는 병원체-매개 형질감염에 의해 식물 세포에 도입할 수 있다.
또한, 곤충 시스템을 사용하여 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 어떤 시스템의 경우, 오토그라파 캘리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV)를 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포나 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 폴리펩타이드를 코딩하는 서열들을 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 영역에 클로닝하여, 폴리헤드린 프로모터의 통제하에 배치시킬 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자와 같은 유전자에 대응되는 서열과 같이, 핵산 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화시키게 될 것이며, 코트 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생산하게 될 것이다. 그런 후, 재조합 바이러스를 사용하여, 단백질 또는 이의 변이체가 발현될 수 있는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포나 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에 감염시킬 수 있다.
포유류 발현 시스템. 발현 벡터는 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연결된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 포유류 숙주 세포에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 이의 변이체를 발현시키기 위해, 여러가지 바이러스-기반의 발현 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터로서 아데노바이러스가 사용되는 경우, 단백질을 코딩하는 서열을 후기 프로모터 및 삼부로 구성된 리더 서열을 포함하는 아데노바이러스 전사/번역 복합체에 연결할 수 있다. 감염된 숙주 세포에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 발현하는 생존성 바이러스를 수득하기 위해, 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역에 삽입하는 방법을 이용할 수 있다. 또한, 포유류 숙주 세포에서의 발현의 높이기 위해, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 인핸서 등의 전사 인핸서를 사용할 수 있다.
조절 서열들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에 기술된 바와 같이 적정 숙주 세포에 대한 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하도록 선별될 수 있다. 조절 서열에 대한 비제한적인 예로는, 폴리아데닐화 신호, 프로모터 (예, CMV, ASV, SV40, 또는 기타 바이러스 프로모터, 예컨대 소 파필로마, 폴리오마 및 아데노바이러스 2 바이러스 유래 프로모터 (Fiers, et al., 1973, Nature 273:113; Hager GL, et al., Curr Opin Genet Dev, 2002, 12(2):137-41) 인핸서, 및 기타 발현 조절 인자들을 포함한다.
비코딩 DNA 영역에서 프로모터 영역의 상류 또는 하류에서 발견되는 서열인 인핸서 영역은 발현의 최적화에 중요한 것으로 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 필요한 경우, 바이러스 소스 유래의 복제 기원을, 예컨대 원핵 숙주가 플라스미드 DNA 도입에 사용되는 경우에, 사용할 수 있다. 그러나, 진핵 유기체의 경우, 염색체 병합이 DNA 복제하기 위한 일반적인 기전이다.
포유류 세포의 안정적인 형질감염을 위해, 일부 세포의 게놈에 도입된 DNA가 병합될 수 있다. 사용되는 발현 벡터와 형질감염 방법은 성공적인 병합 현상의 기여 인자일 수 있다. 원하는 단백질의 안정적인 증폭과 발현을 위해, 대상 단백질을 코딩하는 DNA를 함유한 벡터를 진핵 세포 (예, 모낭의 종구 유래 세포 등의 포유류 세포)의 게놈에 안정적으로 병합시켜, 감염된 유전자의 안정적인 발현이 이루어지게 한다. 외인성 핵산 서열은 미국 특허 5,641,670에 기술된 상동적인 재조합에 의해 세포 (예, 포유류 세포, 일차 또는 이차 세포)에 도입할 수 있으며, 상기 미국 특허의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
대상 단백질을 코딩하는 유전자를 안정적으로 발현하는 클론을 동정 및 선별하기 위해, 선별 마커 (예, 암피실린, 네오마이신, G418 및 히그로마이신과 같은, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 대상 유전자와 함께 숙주 세포에 도입할 수 있다. 선별 마커를 코딩하는 유전자는 대상 유전자와 동일한 플로스미드로 숙주 세포에 도입하거나, 또는 별개의 플라스미드로 도입할 수 있다. 대상 유전자를 함유하는 세포는 선별 마커 유전자가 병합된 세포가 약물의 존재 하에 생존하는 약물 선별에 의해 동정할 수 있다. 선별 마커 유전자가 병합되지 않은 세포는 사멸한다. 생존 세포는 그 후 원하는 단백질 분자 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2와 같은 유전자에 의해 코딩되는 단백질)의 생산에 대해 스크리닝할 수 있다.
세포 형질감염
벡터의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 생산하기 위해, 진핵 발현 벡터를 사용할 수 있다. 포유류 세포 (예, 모구에서 분리된 세포; 예, 진피 시트 세포 및 진피 유두상 세포)는, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 통해 발현 벡터를 적정 숙주 세포에 도입함으로써, 발현 벡터 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 함유한 벡터)를 함유할 수 있다.
숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조정하거나 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자와 같은 유전자에 의해 코딩되는 발현된 폴리펩타이드를 원하는 방식으로 가공하는 능력에 따라 정해질 수 있다. 폴리펩타이드에 대한 그러한 변형으로는, 아세틸화, 카르복시화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화가 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 폴리펩타이드의 "프리프로" 형태를 절단하는 번역 후 가공도 사용하여 올바른 삽입, 폴딩 및/또는 기능이 이루어지도록 할 수 있다. 특수 세포 기구 및 번역 후 활동에 대한 특징적인 기전을 가지고 있는 여러가지 숙주 세포 (예, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, 및 WI38)들을 American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209)로부터 입수할 수 있으며, 외래 단백질에 대한 올바른 변형 및 가공을 확보하기 위해 선별할 수 있다.
외인성 핵산은, 리포펙션, 미세주입, 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 침강, DEAE-덱스트란-매개 형질감염 또는 전기천공과 같이, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들을 통해, 세포로 도입할 수 있다. 전기천공은 DNA 구조체(들)를 대상 세포 (예, 모낭의 종구 세포, 예, 진피 유듀상 세포 또는 진피 시트 세포)에 도입시키는 대략적인 전압 및 커팩시턴스에서 수행된다. 또한, 다른 형질감염 방법으로는 변형된 칼슘 포스페이트 침강, 폴리브렌 침강, 리포솜 융합 및 수용체 매개 유전자 전달이 있다.
유전적으로 조작시킬 세포는 다양한 조직으로부터 수득되는 일차 및 이차 세포일 수 있으며, 배양시 유지 및 증식될 수 있는 세포 타입들을 포함한다. 일차 및 이차 세포에 대한 비제한적인 예로는 상피 세포 (예, 진피 유두상 세포, 모낭 세포, 내모근초, 외근모초, 피지샘 세포, 상피 기질 세포), 신경 세포, 내피 세포, 신경교 세포, 섬유모세포, 근육 세포 (예, 근모세포), 각질형성세포, 혈액의 형성된 인자들 (예, 림프구, 골수 세포) 및 이들 체세포 타입들의 전구체를 포함한다.
척추동물 조직은 펀치 바이옵시 또는 대상 일차 세포 타입의 조직 소스를 수득하는 기타 외과적 방법 등의 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 일 구현예에서, 펀치 바이옵시 또는 적출로 각질형성세포, 섬유모세포, 내피 세포 또는 간엽 세포 (예, 모낭 세포 또는 진피 유두상 세포)의 소스를 수득할 수 있다. 다른 구현예에서, 모낭의 적출을 이용하여 섬유모세포, 각질형성세포, 내피 세포 또는 간엽 세포 (예, 모낭 세포 또는 진피 유두상 세포)의 소스를 수득할 수 있다. 일차 세포들의 혼합물은 체외 이식 또는 효소적 분해 (예, 프로나제, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 디스파제 및 키모트립신과 같은 효소를 이용함) 등의 당해 기술 분야에서 쉽게 사용되는 방법을 이용하여, 조직들로부터 수득할 수 있다. 또한, 바이옵시 방법은 미국 특허 출원 공개공보 2004/0057937과 PCR 출원 공개공보 WO 2001/32840에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일차 세포는 유전자 조작된 일차 또는 이차 세포를 투여받는 개체로부터 획득할 수 있다. 그러나, 일차 세포는 또한 동일 종에 속하나 수여체와는 다른 공여체로부터 수득할 수도 있다. 또한, 세포는 다른 종 (예, 토끼, 고양이, 마우스, 랫, 양, 염소, 개, 말, 소, 새 또는 돼지)으로부터 수득할 수 있다. 또한, 일차 세포는 조직 배양 기판 (예, 플라스크 또는 디쉬)에 부착하여 증식되거나 또는 현탁 증식된 분리된 척추동물 조직 소스 유래 세포; 조직 유래 외식편에 존재하는 세포; 최초로 도말된 전술한 세포 타입들 둘다; 및 이들 도말된 세포들로부터 유래된 세포 배양 현탁물을 포함할 수 있다. 이차 세포는 후속적인 계대 배양으로부터 수득한 세포 외에도, 배양 기판으로부터 회수 및 재도말하거나, 또는 계대 배양한 도말된 일차 세포일 수 있다. 이차 세포는 1회 이상 계대 배양될 수 있다. 이들 일차 또는 이차 세포는 대상 단백질 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드)을 코딩하는 유전자를 가진 발현 벡터를 함유할 수 있다.
세포 배양
배양하는 숙주 세포에 따라 다양한 배양 파라미터들이 사용될 수 있다. 포유류 세포에 대한 적정 배양 조건들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있거나 (Cleveland WL, et al., J Immunol Methods, 1983, 56(2): 221-234), 또는 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다 (예, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992) 참조). 세포 배양 조건은 선택된 숙주 세포 타입에 따라 달라질 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지를 사용할 수 있다. 배지에 대한 비제한적인 예로는, 예컨대, 최소 필수 배지 (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM, Sigma); Ham's F10 배지 (Sigma); HyClone 세포 배양 배지 (HyClone, Logan, Utah); RPMI-1640 배지 (Sigma); 및 다양한 세포 타입들에 따라 제형화된 화학적으로 규정된 (CD) 배지, 예, CD-CHO 배지 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.)를 포함한다.
세포 배양 배지에는 필요에 따라 선택 성분을 비롯하여 보충 구성 성분 또는 성분들을 적정 농도 또는 함량으로, 필수적으로 또는 적절하게 첨가될 수 있다. 세포 배양 배지 용액은 다음과 같은 카테고리들 중 하나에 속하는 하나 이상의 성분을 제공한다: (1) 포도당과 같은 통상 탄수화물 형태의 에너지원; (2) 모든 필수 아미노산, 및 통상 아미노산 20종 + 시스테인의 기본 세트; (3) 저농도로 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물; (4) 유리 지방산 또는 지질, 예컨대, 리놀레산; 및 (5) 미량 인자, 미량 인자는 무기 화합물로서 또는 최저 농도, 통상 마이크로몰 범위로 필요할 수 있는 천연 인자로서 정의됨.
또한, 배지에는 다음과 같은 카테고리들 중 임의의 범주에 속하는 하나 이상의 성분이 선택적으로 첨가될 수 있다: (1) 염, 예컨대, 마그네솜, 칼슘 및 포스페이트; (2) 호르몬 및 기타 성장 인자, 예, 혈청, 인슐린, 트랜스페린 및 상피 성장 인자; (3) 단백질 및 조직 가수분해물, 예, 펩톤 또는 정제 젤라틴, 식물 물질 또는 동물 부산물으로부터 수득할 수 있는 펩톤 혼합물; (4) 뉴클레오시드 및 염기, 예, 아데노신, 티미딘 및 하이폭산틴; (5) 완충제, 예, HEPES; (6) 항생제, 예, 젠타마이신 또는 암피실린; (7) 세포 보호제, 예, 플루로닉(pluronic) 폴리올; 및 (8) 갈락토스. 일 구현예에서, 용해성 인자를 배양 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명에 사용할 수 있는 포유류 세포 배양물은 배양 중인 세포 타입에 적합한 배지에서 제조한다. 일 구현예에서, 세포 배양 배지는 포유류 소스 유래 혈청 (예컨대, 소 배아 혈청 (FBS))이 첨가된 기존에 논의된 임의의 것 (예컨대, MEM)일 수 있다. 다른 구현예에서, 배지는 모낭의 모구에서 수득되는 세포 (예, 진피 유두상 세포 또는 진피 시트 세포) 또는 상피 세포의 증식을 유지시키기 위한 조건형성된 배지일 수 있다. 예를 들어, 상피 세포는 Barnes and Mather in Animal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998)에 따라 배양할 수 있으며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 추가적인 구현예에서, 상피 세포 또는 모낭 세포는 대상 폴리펩타이드 또는 단백질 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드)을 코딩하는 유전자를 함유하는 DNA 벡터로 형질감염될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예들에서, 세포는 유효량의 효소 존재 하에 현탁 배양 (예, 행잉 드롭 배양 등의 3차원 배양)으로 배양하며, 이때 효소 기질은 현탁 배양시의 세포외 기질 분자이다. 예컨대, 효소는 히알루로니다제일 수 있다. 상피 세포 또는 모낭 세포는 당해 기술 분야에 실시되는 방법들에 따라, 예컨대 PCT 출원 공개공보 WO 2004/044188 및 미국 특허 출원 공개공보 2005/0272150에 기술된 방법에 따라, 또는 Harris in Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Great Britain; 1996; Chapter 8)에 의해 기술된 방법에 따라 배양할 수 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
현탁 배양은 세포 또는 세포 응집체 (DP 세포의 응집체)가 액체 배지에서 현탁된 상태로 증식이 이루어지는 배양 타입이다. 포유류 세포를 포함하는 현탁 배양은 부착되지 않은 세포 타입의 유지 또는 부착된 형태에서 볼 수 없는 특별한 세포 특징들을 세포가 나타낼 수 있도록 하기 위해 사용될 수 있다. 일부 현탁 배양 타입들은 3차원 배양 또는 행잉 드롭 배양을 포함할 수 있다. 행잉 드롭 배양은 배양할 물질을 평면 표면 (예, 커버글라스, 글라스 슬라이드, 페트리 디쉬, 플라스크 등)에 부착된 유체 드롭으로 접종하는 배양이며, 그런 후 중공 표면 위에 거꾸로 매달 수 있다. 행잉 드롭의 세포는 중력의 결과로서 드롭의 행잉 센터 쪽으로 응집할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 있어서, 세포외 기질을 분해하는 단백질 (예, 콜라게나제, 콘드로이티나제, 히알루로니다제 등)의 존재 하에 배양한 세포는, ECM이 분해되면 ECM이 적게 존재될 것이므로 세포가 서로 더 가까워지게 하여, 행잉 드롭 배양물내에서 보다 컴팩트해지고 응집될 것이다. 또한, 국제 PCT 공개공보 WO2007/100870을 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
모낭의 모구 (예, 진피 유두상 세포 또는 진피 시트 세포)로부터 수득되는 세포는, DP 세포의 응집체를 제조하기 위해 행잉 드롭 배양시 단일한, 동질적인 집단 (예, DP 세포 포함)으로서 배양할 수 있다. 또한, 세포는 DP 및 DS 세포의 키메라 응집체를 제조하기 위해 행잉 드롭 배양시 이종적인 집단 (예, DP 및 DS 세포 포함)으로서 배양할 수 있다. 상피 세포는 당해 기술 분야에서 실시되는 바와 같이 컨플루언시로 단일층으로서 배양할 수 있다. 이러한 배양 방법은 Chapter 8 of the Handbook in Practical Animal Cell Biology: Epithelial Cell Culture (Cambridge Univ. Press, Great Britain; 1996); Underhill CB, J Invest Dermatol, 1993, 101(6):820-6); in Armstrong and Armstrong, (1990) J Cell Biol 110:1439-55; 또는 Animal Cell Culture Methods (Academic Press, 1998)에 기술된 방법에 따라 기본적으로 수행할 수 있으며, 이들 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
3차원 배양은 아가 (예, 게이의 아가), 하이드로겔 (예, 마트리겔, 아가로스 등; Lee et al., (2004) Biomaterials 25: 2461-2466) 또는 가교된 폴리머로 조성할 수 있다. 이들 폴리머는 천연 폴리머 및 이의 유도체, 합성 폴리머 및 이의 유도체, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 천연 폴리머는 음이온성 폴리머, 양이온성 폴리머, 양쪽성 폴리머 또는 중성 폴리머일 수 있다. 음이온성 폴리머에 대한 비제한적인 예로는 히알루론산, 일긴산 (알기네이트), 카라기난, 콘드로이틴 설페이트, 덱스트란 설페이트 및 펙틴을 포함한다. 양이온성 폴리머의 일부 예로는 키토산 또는 폴리라이신이 있으나, 이로 한정되지 않는다 (Peppas et al., (2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73). 양쪽성 폴리머의 예로는 콜라겐, 젤라틴, 피브린 및 카르복시메틸 키틴이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 중성 폴리머에 대한 비제한적인 예로는 덱스트란, 아가로스 또는 풀룰란을 포함한다 (Peppas et al., (2006) Adv Mater. 18: 1345-60; Hoffman, A. S., (2002) Adv Drug Deliv Rev. 43: 3-12; Hoffman, A. S., (2001) Ann NY Acad Sci 944: 62-73).
본 발명의 방법에 따른 배양에 적합한 세포는 플라스미드와 같은 도입된 발현 벡터를 보유할 수 있다. 박현 벡터 구조체는 형질전환, 미세주입, 형질감염, 리포펙션, 전기천공 또는 감염을 통해 도입할 수 있다. 발현 벡터는 발현 및 생산을 위한 단백질을 코딩하는 코딩 서열 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 생산되는 단백질 및 폴리펩타이드를 코딩하는 서열 뿐만 아니라 전사 및 번역 조절 인자들을 함유하는 발현 벡터는, 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며 실시되는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 이러한 방법으로는 합성 기법, 시험관내 재조합 DNA 기법 및 J. Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. and in F. M. Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y에 기술된 생체내 유전자 재조합을 포함한다.
폴리펩타이드의 수득 및 정제
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 이의 변이체 등의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 분자는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 시험관내 또는 생체내 발현을 통해 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 발현하는 인간 세포로부터 정제하거나, 또는 직접 화학 합성을 통해 수득할 수 있다.
폴리펩타이드의 발현 검출
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 함유하며, 이후 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 숙주 세포를 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다양한 과정으로 동정할 수 있다. 이러한 과정들로는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및 막, 용액 또는 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량화를 위한 칩-기반의 기술을 포함하는 단백질 생분석 또는 면역분석 기법을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 존재는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 프로브 또는 단편을 이용한 증폭에 의해 검출할 수 있다. 일 구현예에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 핵산의 단편은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 약 8개 이상의 인접한 뉴클레오티드들로 구성된 임의의 일부를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 약 10개 이상의 인접 뉴클레오티드, 약 15개 이상의 인접 뉴클레오티드, 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드, 또는 약 30개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 단편은 약 8개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 예컨대 약 15개 내지 약 100개의 뉴클레오티드, 또는 약 20개 내지 약 100개의 뉴클레오티드의 모든 가능한 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 핵산 증폭-기반의 분석은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 검출하기 위해, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 코딩하는 서열들로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 등의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현을 폴리펩타이드에 특이적인 다클론 또는 단일클론 항체를 이용하여 검출 및 측정하는 프로토콜은 잘 확립되어 있다. 비제한적인 예로는, 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 방사면역분석 (RIA), 및 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 등의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 상의 2개의 비-간섭형 에피토프에 반응하는 단일클론 항체를 이용한, 2부위, 단일클론을 이용한 면역분석을 이용하거나, 또는 경쟁적인 결합 분석을 사용할 수 있다.
표지 및 접합 기법들은 당해 기술분야의 당업자에게 알려져 있으며, 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 사용할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 등의 단배질을 코딩하는 핵산 서열과 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브를 제조하는 방법은, 비제한적인 예로서, 올리고표지화, 닉 트랜슬레이션 (nick translation), 말단 표지 또는 표지된 뉴클레오티드를 이용한 PCR 증폭을 포함한다. 다른 예로, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 등의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 mRNA 프로브의 제조를 위해 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터들은 당해 기술 분야에 알려져 있으며, 상업적으로 구입가능하며, T7, T3, 또는 SP6 등의 적정 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오티드의 첨가에 의해 시험관내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용할 수 있다. 이러한 과정들은 상업적으로 이용가능한 다양한 키트들을 이용하여 수행할 수 있다 (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, and US Biochemical). 적합한 리포터 분자 또는 검출을 용이하게 하기 위해 사용할 수 있는 표지 물질로는 방사핵종, 효소, 형광, 화학박광 또는 발색 물질 뿐만 아니라 기질, 조인자, 저해제 및/또는 자기 입자를 포함한다.
폴리펩타이드의 발현 및 정제
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 등의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포는, 발현 및 세포 배양물로부터 단백질의 회수에 적합한 조건에서 배양할 수 있다. 형질전환된 세포에 의해 생산되는 폴리펩타이드는 사용한 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 또는 세포내에 함유될 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 등의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자와 같은 유전자 또는 이의 변이체에 의해 코딩되는 용해성 폴리펩타이드를 원핵 생물 또는 진핵 생물의 세포막을 통해 직접 방출하도록 지시하거나, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 이의 변이체에 의해 코딩되는 막 결합된 폴리펩타이드 분자의 막 삽입을 지시하는 신호 서열을 포함하도록, 설계할 수 있다.
또한, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열을 용해성 단백질의 정제를 용이하게 하는 폴리펩타이드 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 연결하기 위한, 다른 구축법도 이용할 수 있다. 이러한 정제 용이화 도메인으로는, 고정화된 금속 상에서의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈 등의 금속 킬레이트화 펩타이드, 고정화된 면역글로불린 상에서의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템에서 이용되는 도메인이 있으나, 이들로 한정되지 않는다 (Immunex Corp., Seattle, Wash.). 정제 도메인과, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유저자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 사이에 절단가능한 링커 서열 (즉, 팩터 Xa 또는 엔테로키나제 (Invitrogen, San Diego, Calif.) 특이 서열)이 포함되게 함으로써, 정제를 용이하게 할 수 있다. 상기한 한가지 발현 벡터는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드와 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단부 앞에 히스티딘 잔기 6기를 포함하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 상기 히스티딘 잔기들은 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피를 통한 정제를 용이하게 해주며, 엔테로키아제 절단부는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 정제하기 위한 수단을 제공한다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 폴리펩타이드는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 발현하는 발현 구조체로 형질감염된 것을 비롯하여, 폴리펩타이드를 발현하는 임의의 인간 또는 비-인간 세포로부터 정제할 수 있다. 정제된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질은, 특정 단백질, 탄수화물 또는 지질 등의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질과 세포에서 정상적으로 조합하는 기타 화합물들로부터, 당해 기술 분야에 실시되는 방법들을 이용하여, 분리할 수 있다. 비제한적인 방법으로는 크기 배제 크로마토그래피, 암모늄 설레이트 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 분취용 겔 전기영동을 포함한다.
화학 합성
폴리펩타이드를 코딩하는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 등의 유전자를 포함하는 핵산 서열은, 당해 기술 분야에 공지된 화학적 방법을 이용하여, 전체를 또는 일부를 합성할 수 있다. 다른 예로, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 등의 폴리펩타이드는, 고상 기법을 이용한 직접 펩타이드 합성에 의해 등의 화학적 방법을 이용하여 제조하여, 이의 아미노산 서열을 합성할 수 있다. 단백질 합성은 메뉴얼 기법 또는 자동화를 이용하여 수행할 수 있다. 자동화된 합성은, 예컨대 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)를 이용하여 달성할 수 있다. 선택적으로, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 폴리펩타이드의 단편들은 각각 합성하고, 화학적인 방법으로 조합하여, 전장 분자를 제조할 수 있다. 일 구현예에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자를 포함하는 핵산 서열의 단편은, 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 약 8개 이상의 인접 뉴클레오티드의 임의 일부를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 단편은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상 또는 약 30개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 단편들은, 약 8개 내지 약 100개, 예컨대, 약 15개 내지 약 100개 또는 약 20개 및 약 100개의 뉴클레오티드의 모든 가능한 뉴클레오티드 길이를 포함한다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단편은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 등의 단백질의 단편일 수 있다. 예컨대, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단편은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 약 8개 이상의 인접 아미노산을 구성된 임의 일부를 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 약 70개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산으로 구성된 임의 일부를 포함할 수 있다. 단편은 약 8 내지 약 100개의 아미노산 길이, 예컨대 약 10개 내지 약 100개 아미노산, 약 15개 내지 약 100개 아미노산, 약 20개 내지 약 100개 아미노산, 약 35 내지 약 100개의 아미노산, 약 40개 내지 약 100개 아미노산, 약 50개 내지 약 100개 아미노산, 약 70개 내지 약 100개 아미노산, 약 75개 내지 약 100개 아미노산, 또는 약 80개 내지 약 100개 아미노산의 모든 가능한 아미노산 길이를 포함한다.
합성 펩타이드는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 상당히 정제할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 합성 폴리펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석에 의해 검증할 수 있다. 부가적으로, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 아미노산 서열의 임의 일부는, 직접 합성하는 동안 변형시키거나 및/또는 다른 단백질의 서열과 화학적인 방법으로 조합하여, 변이체 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 제조할 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물들의 동정
본 발명은 개체에서 모발 생장 (예, 모발 밀도) 또는 모발 색소 침착(hair pigmentation)을 제어 및/또는 조절하는데 사용할 수 있는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 본 발명은 탈모 질환과 관련된 유전자로서 본원에 열거된 유전자의 동정을 제공하므로, 본 발명은 또한 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 유전자 및/또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 방법도 제공한다. 아울러, 본 발명은 탈모 질환의 치료에 사용할 수 있는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 감모증 (예, 유전성 단순 감모증 (HHS)의 치료에 사용할 수 있는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 탈모 질환의 비제한적인 예로는 안드로겐성 탈모증, 원형 탈모증, 휴지기 탈모증, 원형 탈모증, 전두 탈모증 및 전신 탈모증을 포함한다. 본 방법은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 분자에 결합할 수 있거나, 및/또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 생물 활성 또는 이의 발현에 대한 자극 또는 저해 효과를 가지는 테스트 화합물 또는 물질 (예, 펩타이드 (예, 항체 또는 이의 단편), 소분자, 핵산 (예, siRNA 또는 안티센스 RNA), 또는 기타 물질)의 동정과, 후속적으로, 이들 화합물을 생체내 분석(즉, 모발 생장의 증가 또는 감소 검사)에서 탈모 질환과 관련된 증상에 효과를 가질 수 있거나 또는 개체에서 모발 생장을 조절할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서, "Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물"은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하며, 이의 활성 및/또는 이의 발현을 조절하는, 화합물을 지칭한다. 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 증가시킬 수 있다. 반대로, 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다. 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 작용제, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 길항제 (예, Jak 1 저해제, Jak 2 저해제, Stat 1 저해제 또는 Stat 2 저해제)일 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물에 대한 일부 비제한적인 예로는, 펩타이드 (Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 포함하는 펩타이드 단편, 또는 항체 또는 이의 단편), 소분자, 및 핵산 (Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자를 포함하는 핵산에 특이적인 siRNA 또는 안티센스 RNA)을 포함한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 작용제는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합되었을 때, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성을 증가 또는 연장시키는 분자일 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 작용제는, 단백질, 핵산, 소분자, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 활성화하는 임의의 기타 분자를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 길항제는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합되었을 때, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성의 양 또는 기간을 감소시키는, 분자일 수 있다. 길항제는, 단백질, 핵산, 항체, 소분자, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성을 감소시키는 임의의 기타 분자를 포함한다.
용어 "조절한다"는 본원에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 유전자 또는 단백질의 활성 또는 발현의 변화를 지칭하는 것으로 보인다. 예를 들어, 조절은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 단백질 활성, 결합 특징, 또는 임의의 기타 생물학적, 기능적 또는 면역 특성들의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다.
일 구현예에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 단백질에 결합하는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 펩타이드 단편일 수 있다. 예를 들어, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 폴리펩타이드는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 약 8개 이상의 인접 아미노산으로 이루어진 임의의 일부를 포함할 수 있다. 단편은, 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은, 약 8개 내지 약 100개의 아미노산을 포함하는 모든 가능한 아미노산 길이, 예컨대, 약 10개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 15개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 20개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 35개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 40개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 70개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 75개 내지 약 100개 아미노산 길이, 또는 약 80개 내지 약 100개의 아미노산 길이를 포함한다. 이들 펩타이드 단편은 상업적으로 구입하거나 또는 액상 또는 고상 합성 방법을 통해 합성할 수 있다 (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England). Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 펩타이드 단편은 천연 소스로부터 분리하거나, 유전자 조작하거나, 화학적으로 제조할 수 있다. 이러한 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한, 항체 (예, 단일클론, 다클론, 인간화된, 키메라 또는 완전 인간) 또는 이의 결합 단편 등의 단백질일 수 있다. 항체 단편은 전장 형태 이외의 다른 항체 형태일 수 있으며, 조작된 항체 단편 외에도 전장 항체내에 존재하는 포션 또는 구성 성분을 포함할 수 있다. 항체 단편은, 비제한적인 예로서, 단쇄 Fv (scFv), 디아바디(diabodies), Fv, 및 (Fab')2, 트리아바디(triabodies), Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, CDR들의 조합, 가변부, 테트라바디, 2기능성 하이브리드 항체, 프래임워크 영역, 불변부 등을 포함한다 (참조: Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 항체는 상업적으로 구입하거나, 주문 제작하거나, 또는 당해 기술 분야에 확립된 방법에 따라 대상 항원에 대해 합성할 수 있다 (Janeway et al., (2001) Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing). 일 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 서열번호 1, 3, 5 또는 7에 대한 것이다. 항체는 상업적으로 구입하거나, 주문 제작하거나, 또는 당해 기술 분야에 확립된 방법에 따라 대상 항원에 대해 합성할 수 있다 (Janeway et al., (2001) Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing). 예컨대, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2에 대한 항체는 Abcam, Santa Cruz Biotechnology, Abnova Corp., BD Biosciences, Antigenix America Inc., 등에서 상업적으로 구입할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2에 대한 인간 항체 (예, 단일클론, 인간화된 또는 키메라 항체)는 인간에 사용하기 위한 유용한 항체 치료제일 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 코딩하는 RNA의 저해는, RNA가 전사되는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있다. 저해제는, siRNA; 간섭 RNA 또는 RNAi; dsRNA; RNA 중합효소 III에 의해 전사된 DNA; 리보자임; 및 RNA, DNA 또는 인공 핵산일 수 있는, 안티센스 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
안티센스 DNA, RNA, 및/또는 DNA/RNA 분자를 포함하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 타겟화된 mRNA에 결합하여 단백질 번역을 방지함으로써, mRNA의 번역을 직접 차단하도록 작용한다. 예컨대, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열의 독특한 영역에 대해 상보적이며 약 15개 이상의 염기로 구성된 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 기본의 포스포다이에스테르 기법으로 합성할 수 있다 (Dallas et al., (2006) Med. Sci. Monit.12(4):RA67-74; Kalota et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:173-96; Lutzelburger et al., (2006) Handb. Exp. Pharmacol. 173:243-59). 안티센스 뉴클레오티스 서열은 모르폴리노스(morpholinos), 2'-O-메틸 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.
siRNA는 약 15개 내지 약 50개의 염기쌍, 예컨대 약 21개 내지 약 25개의 염기쌍을 포함하며, 세포내에서 발현된 타겟 유전자 또는 RNA와 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는, 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA는 센스 RNA 가닥 하나와 표준 왓슨-크릭 염기쌍 상호작용에 의해 함께 어닐링되는 상보적인 안티센스 RNA 가닥 하나를 포함한다. 센스 가닥은 타겟 miRNA 분자내에 포함된 핵산 서열과 실질적으로 동일한 핵산 서열을 포함한다. 타겟 mRNA내에 포함된 타겟 서열에 "실질적으로 동일한"은 타겟 서열과 상이한 핵산 서열이 약 3% 미만이라는 것을 의미한다. siRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥은 2개의 상보적인, 단일-가닥 RNA 분자를 포함할 수 있거나, 또는 2개의 상보적인 부분들이 염기쌍을 이루고 있고 단일 가닥의 "헤어핀" 영역에 의해 공유 연결된, 단일 분자를 포함할 수 있다. 또한, McMnaus and Sharp (2002) Nat Rev Genetics, 3:737-47, and Sen and Blau (2006) FASEB J., 20:1293-99를 참조하며, 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
siRNA는 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결손, 치환 및/또는 변형에 의해 천연 RNA와 다른 변형된 RNA일 수 있다. 상기한 변형은 siRNA의 말단(들) 또는 siRNA의 하나 이상의 내부 뉴클레오티드에와 같은 비-뉴클레오티드 물질의 부가, 또는 siRNA를 뉴클레아제 분해에 대새 내성이게 하는 변형, 또는 siRNA에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 데옥시리보-뉴클레오티드로의 치환을 포함할 수 있다. siRNA의 한쪽 가닥 또는 양쪽 가닥은, 또한, 3' 오버행을 포함할 수 있다. 본원에서, 3' 오버행은 이중가닥 RNA 가닥의 3' 말단으로부터 1개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 연장을 지칭한다. 예컨대, siRNA는 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는) 약 1개 내지 약 6개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1 내지 약 5개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 1 내지 약 4개의 뉴클레오티드 길이, 또는 약 2 내지 약 4개의 뉴클레오티드 길이의, 하나 이상의 3' 오버행을 포함할 수 있다. 예를 들어, siRNA의 각 가닥은 디티미딜산 ("TT") 또는 디우리딜산 ("uu")의 3' 오버행을 포함할 수 있다.
siRNA는 화학적으로 또는 생물학적으로 제조하거나, 또는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 발현시킬 수 있다 (예, 미국 특허 7,294,504 및 미국 특허 7,422,896 참조, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). dsRNA 또는 siRNA 분자들을 제조 및 테스트하는 방법의 예들은 Gewirtz의 미국 특허 출원 공개공보 2002/0173478, Hannon 등의 미국 특허 출원 공개공보 2007/0072204, 및 Reich 등의 미국 특허 출원 공개공보 2004/0018176에 기술되어 있으며, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 구현예에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 siRNA는 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 임의의 하나에 대해 제작할 수 있다. 다른 구현예에서, Jak 1 유전자를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 siRNA는 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 하나의 서열을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, Stat 1 유전자를 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 siRNA는 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 하나의 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, Jak 1에 대한 siRNA는 표 11에 열거한다.
표 11.
Jak1에 대한 siRNA 서열
Figure pct00021
Figure pct00022
다른 구현예에서, Stat 1에 대한 siRNA는 표 12에 열거한다.
표 12.
Stat 1에 대한 siRNA 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
RNA 중합효소 III로 전사된 DNA는 U6 프로모터 등의 프로모터를 포함한다. 이들 DNA는 전사되어, 안티센스 RNA로서 기능할 수 있는 siRNA 또는 선형 RNA로서 기능할 수 있는 소형 헤어핀 RNA를 세포에서 만들 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드 또는 타겟 RNA 및/또는 유전자가 저해되도록 임의의 적정 조합을 포함할 수 있다. 아울러, 이들 핵산 형태들은 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 가닥 또는 사중 가닥일 수 있다(예, Bass (2001) Nature, 411, 428 429; Elbashir et al., (2001) Nature, 411, 494 498; 및 PCT 공개번호 WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409, WO 00/44914 참조).
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합하여 이의 기능을 파괴하거나, 또는 반대로 그 기능을 강화하는, 소분자일 수 있다. 소분자는 일반적으로 저분자량을 가지는 다양한 그룹의 합성 및 천연 물질이다. 이는, 천연 소스 (예, 식물, 진균, 미생물 등)으로부터 분리하거나, 상업적으로 입수하거나 및/또는 라이브로리 또는 콜렉션으로서 이용가능하거나, 또는 합성할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 조절하는 소분자 후보체는, 인 실리코 스크리닝 또는 조합 라이브러리의 고-성능-풋 (HTP) 스크리닝을 통해 동정할 수 있다. 아스피린, 페니실린 및 많은 화학치료제 등의 대부분의 기존 약제들은 소분자이거나, 상업적으로 입수할 수 있거나, 화학 합성할 수 있거나, 후술되는 바와 같이 랜덤 또는 조합 라이브러리로부터 수득할 수 있다 (Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6).
Jak1/Jak2 저해제에 대한 비제한적인 예로는, AG490 (Caceres-Cortes, Anticancer Agents Med Chem. 2008 Oct;8(7):717-22); CYT387 (Pardanani et al., Leukemia. 2009 Aug;23(8):1441-5; Monaghan et al., Leukemia. 2011 Jul 26. doi: 10.1038/leu.2011.175. [Epub ahead of print]); SB1518 (William et al., J Med Chem. 2011 Jul 14;54(13):4638-58; Hart et al., Leukemia. 2011 Jun 21. doi: 10.1038/leu.2011.148. [Epub ahead of print]); LY3009104 (INCB28050) (Incyte and Lilly); TG101348 ( Wernig et al., Cancer Cell. 2008 Apr;13(4):311-20; Pardanani et al., J Clin Oncol. 2011 Mar 1;29(7):789-96); 및 BMS-911543 (Purandare et al., Leukemia. 2011 Oct 21. doi: 10.1038/leu.2011.292. [Epub ahead of print])을 포함하며, 이들 각각은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
임상 개발 중인 JAK1/2 저해제로는, a) INCB018424, 국소 및 경구; 5nM 활성 (Incyte); b) CEP-701 (세팔론); 및 c) TG101348을 포함한다.
Figure pct00025
Stat 저해제에 대한 비제한적인 예로는, WP-1034 (Faderl et al., Anticancer Res. 2005 May-Jun;25(3B):1841-50), 플루다라빈 (Fludara, Berlex, CA), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 및 하이퍼포린(Hyperforin)을 포함한다. 그외 Jak/Stat 시그널링을 겨낭하는 화합물들은 Ivanenkov et al., Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 등의 대상 분자의 일차 서열에 대한 지식과 공지 기능의 단백질과의 서열 유사성은, 작용제 외에도, 대상 단백질의 저해제 또는 길항제에 대한 정보를 제공할 수 있다. 작용제 및 길항제의 동정 및 스크리닝은, 예컨대 X선 크리스탈로그래피, 중성자 회절, 핵 자기 공명 스펙트로메트리 및 기타 구조 결정 기법을 이용하여, 단백질의 구조 특성을 결정함으로써, 추가로 용이하게 수행한다. 이러한 기법들은 작용제 및 길항제에 대한 합리적인 설계 또는 동정을 제공한다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물 등의 테스트 화합물은, 대량 합성 또는 천연 화합물 라이브로리로부터 스크리닝할 수 있다 (Wang et al., (2007) Curr Med Chem, 14(2):133-55; Mannhold (2006) Curr Top Med Chem, 6 (10):1031-47; 및 Hensen (2006) Curr Med Chem 13(4):361-76 참조). 사카라이드, 펩타이드 핵산계 화합물의 랜덤 또는 특이 합성을 위해 현재 다수의 수단들이 사용되고 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), AMRI (Albany, NY), ChemBridge (San Diego, CA), 및 MicroSource (Gaylordsville, CT)로부터 구입가능하다. 희귀한 화학 라이브러리는 Aldrich (Milwaukee, Wis.)에서 구입가능하다. 다른 예로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태로 천연 화합물의 라이브러리는 예컨대 Pan Laboratories (Bothell, Wash.) or MycoSearch (N.C.)에서 이용가능하거나, 또는 쉽게 재현가능하다. 부가적으로, 천연 및 합성 제조한 라이브러리 및 화합물은 기존의 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형한다 (Blondelle et al., (1996) Tib Tech 14:60).
분자 라이브러리의 제조 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 다수의 라이브러리가 상업적으로 구입가능하다. 본 발명에서 대상 라이브러리는 펩타이드 라이브러리, 랜덤화된 올리고뉴클레오티드 라이브러리, 합성 유기 조합 라이브러리 등을 포함한다. 축중 펩타이드(Degenerate peptide) 라이브러리는 박테리아 플라젤라 펩타이드 디스플레이 라이브러리 또는 파지 디스플레이 라이브러리와 같이, 용액 중에서, 고정화된 형태로 쉽게 제조할 수 있다. 펩타이드 리간드는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드의 조합 라이브러리에서 선별할 수 있다. 펩토이드 및 비-펩타이드 합성 모이어티의 라이브러리를 합성할 수 있다. 이러한 라이브러리는 추가로 천연 발생 카운터파트에 비해 효소 분해되기 어려운 비-펩타이드 합성 모이어티를 포함하도록 합성할 수 있다. 예를 들어, 또한, 라이브러리는, 펩타이드-온-플라스미드 라이브러리, 합성 소분자 라이브러리, 앱타머 라이브러리, 시험관내 번역-기반의 라이브러리, 폴리솜 라이브러리, 합성 펩타이드 라이브러리, 신경전달인자 라이브러리 및 화학 라이브러리를 포함할 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
화학 합성한 라이브러리의 예는 Fodor et al., (1991) Science 251:767-773; Houghten et al., (1991) Nature 354:84-86; Lam et al., (1991) Nature 354:82-84; Medynski, (1994) BioTechnology 12:709-710; Gallop et al., (1994) J. Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251; Ohlmeyer et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Erb et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-11426; Houghten et al., (1992) Biotechniques 13:412; Jayawickreme et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-1618; Salmon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-11712; PCT Publication No. WO 93/20242, dated Oct. 14, 1993; Brenner et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-5383에 기술되어 있다.
파지 디스플레이 라이브러리의 예는 Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Devlin et al., (1990) Science, 249:404-406; Christian, et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:711-718; Lenstra, (1992) J. Immunol. Meth. 152:149-157; Kay et al., (1993) Gene 128:59-65; 및 PCT 공개공보 WO 94/18318에 기술되어 있다.
시험관내 번역-기반의 라이브러리는 PCT 공개공보 WO 91/05058; 및 Mattheakis et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-9026에 기술된 라이브러리를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본원에서, 용어 "리간드 소스"는 본원에 기술된 임의의 화합물 라이브러리 또는 유기 시스템의 다양한 장기로부터 제조된 조직 추출물일 수 있으며, 이를 사용하여 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 작용제 또는 길항제로서 작용하는 화합물을 스크리닝할 수 있다. 생체내 동물 실험과 조합하여, 본원에 열거된 화합물 라이브러리 스크리닝 [또한, 미국 특허 출원 공개번호 2005/0009163 참조, 이는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨], 아래 기술된 기능성 및 시그널링 분석을 이용하여, 모발 생장을 조절 또는 탈모 질환을 치료하는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물을 동정할 수 있다.
라이브러리 스크리닝은 통상적으로 공지된 임의의 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 예로, 펩타이드 라이브러리의 스크리닝을 기술한 아래 참조문헌들을 참조한다: Parmley and Smith, (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251:215-218; Scott and Smith, (1990) Science 249:386-390; Fowlkes et al., (1992) BioTechniques 13:422-427; Oldenburg et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5393-5397; Yu et al., (1994) Cell 76:933-945; Staudt et al., (1988) Science 241:577-580; Bock et al., (1992) Nature 355:564-566; Tuerk et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6988-6992; Ellington et al., (1992) Nature 355:850-852; 미국 특허 5,096,815; 5,223,409; 및 5,198,346, 모두 저자는 Ladner 등임; Rebar et al., (1993) Science 263:671-673; 및 PCT 공개공보 WO 94/18318.
또한, 소분자 조합 라이브러리를 제작하여 스크리닝할 수 있다. 소형 유기 화합물의 조합 라이브러리는, 서로 하나 이상의 다양성 포인트가 다르고, 다단계 공정을 이용한 유기 기법에 의해 합성한, 매우 가까운 유사체들로 구성된 콜렉션이다. 조합 라이브러리는 매우 많은 수의 소형 유기 화합물을 포함한다. 조합 라이브러리의 한가지 타입은 화합물 어레이를 제조하기 위한 병렬식 합성 방법을 이용하여 제조된다. 화합물 어레이는 데카르트 좌표에서의 공간 어드레스에 의해 식별가능하며, 각 화합물이 공통 분자 코어와 하나 이상의 가변적인 구조 다양성 인자들을 가지도록 정렬된, 화합물들의 콜렉션일 수 있다. 이러한 화합물 어레이에서 화합물들은 개별 반응 바셀에서 병렬로 제조되며, 각 화합물은 이의 공간 어드레스로 식별 및 추적된다. 병렬 합성의 혼합물 및 병렬 합성 방법의 예들은 1994년 1월 5일자 미국 출원번호 08/177,497과 이의 대응 출원인, 1995년 7월 13일에 공개된 PCT 특허 출원 공개공보 W095/18972, 및 1998년 1월 27일에 등록된 미국 특허 5,712,171과 이의 대응 출원인 PCT 특허 공개공보 W096/22529에 제공되어 있으며, 이들 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
한가지 비제한적인 예로서, 벤조디아제핀 라이브러리와 같은 비-펩타이드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다 (예, Bunin et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-4712). Simon et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-9371에 기술된 바와 같은 펩토이드 라이브러리도 사용할 수 있다. 펩타이드에서 아미드 관능기가 퍼메틸화되어 화학적으로 변환된 조합 라이브러리를 구축하는데 사용할 수 있는 라이브러리에 대한 다른 예는 Ostresh et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-11142에 기술되어 있다.
컴퓨터 모델링 및 검색 기법은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는, 화합물 동정 또는 이미 동정된 화합물의 개선을 가능하게 한다. 이러한 화합물 또는 조성물이 동정되면, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성부 또는 영역들에 대해 화합물이 결합하는 부위를 조사함으로써 후속적으로 동정할 수 있다. 이러한 부위들은 리간드 결합부일 수 있으며, 예컨대 펩타이드의 아미노산 서열, 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 관련 화합물 또는 조성물과 이의 천연 리간드와의 복합체에 대한 연구 등의, 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 동정할 수 있다. 후자의 경우에서, 팩터 상에 복합체를 형성한 리간드가 장소의 발견을 통해 활성부를 발견하기 위해 화학적 또는 X선 크리스탈로그래피 방법을 이용할 수 있다.
부위, 예컨대 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드부의 3차원 기하 구조는, 완전한 분자 구조를 결정할 수 있는 X선 크리스탈로그래피 등의 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 결정할 수 있다. 고상 또는 액상 NMR을 이용하여 특정 분자간 거리를 결정할 수 있다. 임의의 기타 구조 결정을 위한 실험 방법을 이용하여, 일부 또는 전체 기하 구조를 구할 수 있다. 기하 구조는 복합체를 형성한 천연 또는 인공의 리간드를 이용하여 측정하여, 확인된 활성부의 구조의 정확도를 높일 수 있다.
타겟에 결합하는 펩타이드를 제조 또는 동정하기 위한 다른 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 분자 임프린팅은, 분자에 결합하는 펩타이드 등의 마크로분자 구조의 신규 구축에 사용할 수 있다. 예컨대, Kenneth J. Shea, Molecular Imprinting of Synthetic Network Polymers: The De Novo synthesis of Macromolecular Binding and Catalytic Sites, TRIP Vol. 2, No. 5, May 1994; Mosbach, (1994) Trends in Biochem. Sci., 19(9); and Wulff, G., in Polymeric Reagents and Catalysts (Ford, W. T., Ed.) ACS Symposium Series No. 308, pp 186-230, American Chemical Society (1986)를 참조한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물의 모방체를 제조하는 한가지 방법은, 주형의 특성과 유사한 한가지 이상의 바람직한 특성을 나타내는 새로운 분자를 제공하기 위해, (i) 바람직한 활성을 나타내는 공지 기질 (주형) 주변의 기능성 단량체들의 중합; (ii) 주형 분자의 제거; 및 그런 후 (iii) 주형에 의해 남겨진 빈 공간 안에 제2 클래스의 단량체들의 중합 단계를 포함한다. 이러한 방식으로 펩타이드를 제조하는 것 외에도, 다당류, 뉴클레오시드, 약물, 핵단백질, 지단백질, 탄수화물, 당단백질, 스테로이드, 지질 및 기타 생물학적으로 활성인 물질 등의 기타 결합 분자도 제조할 수 있다. 이러한 방법은, 기능성 단랑체를 유리 라디칼 중합하여 비-생분해성 벡본을 가진 화합물을 제조하기 때문에, 이의 천연 카운터 보다 더 안정적인 매우 다양한 생물학적 모방체들을 설계하는데 유용하다. 이러한 분자를 설계하기 위한 다른 방법으로는, 예컨대, 다수의 화합물 및 분자 모델링의 합성 및 평가가 필요한, 구조 활성 연관성을 기초로 한 약물 설계를 포함한다.
스크리닝 분석
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성 및/또는 발현을 생체내 및/또는 시험관내에서 영향을 미치는 화합물일 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 작용제 및 길항제일 수 있으며, 발현을 통해, 번역 후 변형을 통해 또는 기타 수단에 의해 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성에 대해 그 효과를 발휘하는 화합물일 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합하거나, 및/또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성 또는 발현에 촉진 또는 저해 효과를 가지는 테스트 화합물 또는 물질은, 2가지 타입의 분석을 통해 동정할 수 있다: (a) 세포 표면 상에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 이의 변이체를 발현하는 세포를 이용하는, 세포-기반의 분석; 또는 (b) 분리된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 사용하게 만들 수 있는 비-세포성 분석. 이러한 분석에는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 생물학적으로 활성인 단편, 전장 단백질 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 전체 또는 일부를 포함하는 융합 단백질을 채택할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질은 임의의 적합한 포유류 종 (예, 인간, 랫, 닭, 제노푸스, 말, 소 또는 뮤라인)으로부터 수득할 수 있다. 분석은 테스트 화합물의 결합을 직접 또는 간접 측정하는 것을 포함하는 결합 분석일 수 있다. 또한, 분석은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성의 직접 또는 간접 측정을 포함하는 활성 분석일 수 있다. 또한, 분석은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 핵산 서열 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현의 직접 또는 간접 측정을 포함하는 발현 분석일 수 있다. 다양한 스크리닝 분석을 개체에서 탈모 장애 또는 질환 (예, 안드로겐성 탈모증, 원형 탈모증, 전두 탈모증 또는 전신 탈모증), 개체의 모발 색소 침착 감소 또는 심지어 감모증의 증상에 대한 테스트 화합물의 효과를 측정하는 단계를 포함하는 생체내 분석과 조합할 수 있다.
또한, 생체내 분석은, 결함성 또는 이상 모발 생장 표현형을 나타내는 공지의 포유류 모델, 또는 모발 생장 조절 또는 모발 밀도, 또는 모발 색소 침착에 작용하는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자를 포함하는 핵산 서열의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 돌연변이를 함유하는 포유류에서, 모발 생장을 조절함에 있어 테스트 화합물의 효과를 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 모발 생장의 제어는 개체에서 모발 생장 또는 밀도의 유도를 포함할 수 있다. 본원에서, 모발 생장의 조절에 있어 화합물의 효과는, 유기체의 신체적 모발 생장 또는 감소를 조사함으로써, 또는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 단백질 또는 mRNA 발현을 평가함으로써, 시각적으로 관찰할 수 있다.
또한, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합하거나 또는 활성을 조절하는 테스트 화합물을 스크리닝하는 분석도 수행할 수 있다. 테스트 화합물은 공지 화합물 라이브러리 등의 임의 적합한 수단에 의해 수득할 수 있다. 테스트 화합물이 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 막 결합된 형태에 결합하는 능력을 측정하는 것은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질을 발현하는 세포에 대한 테스트 화합물의 결합을, 복합체에서 표지된 화합물을 검출함으로써 측정할 수 있도록, 방사성 동위원소 또는 효소적 표지를 테스트 화합물에 커플링함으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, 테스트 화합물은 3H, 14C, 35S, 또는 125I로 직접 또는 간접 표지할 수 있으며, 방사성 동위원소는 방사능방출의 직접 카운팅에 의해 또는 신틸레이션 카운팅에 의해 이후 검출할 수 있다. 다른 예로, 테스트 화합물은, 예컨대 호르세라디시 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제 또는 루시퍼라제로 효소적으로 표지할 수 있으며, 적정 기질의 산물로의 변환을 확인함으로써 효소적 표지를 검출할 수 있다.
세포-기반의 분석은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2를 발현하는 세포를 테스트 물질과 접촉하는 단계, 및 막 결합된 분자의 활성 또는 발현을 조절하는 (예, 증가 또는 감소시키는) 상기 테스트 물질의 능력을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 테스트 물질이 막 결합된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 분자의 활성을 조절하는 능력을 결정하는 단계는, 하류 시그널링 현상들을 모니터링하는 등의 그러한 분자의 활성을 측정하는데 적합한 임의의 방법들에 의해 달성할 수 있다 (예, You et al., Ann N Y Acad Sci. 2008 Dec;1150:300-10; Posadas et al., Expert Rev Clin Immunol. 2009 Jan;5(1):9-17; Korhonen et al., Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2009 Apr;104(4):276-84; Vital et al., Ther Clin Risk Manag. 2006 Dec;2(4):365-75; Malek and Castro, Immunity. 2010 Aug 27;33(2):153-65; Cheng et al., Immunol Rev. 2011 May;241(1):63-76; Lanier, Nat Immunol. 2008 May;9(5):495-502; Lowell, Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Mar 1;3(3). pii: a002352; Mocsai et al., Nat Rev Immunol. 2010 Jun;10(6):387-402; Bradshaw, Cell Signal. 2010 Aug;22(8):1175-84; Ivanenkov et al., Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78; Himpe et al., Biofactors. 2009 Jan-Feb;35(1):76-81, 이들 각각은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함됨).
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 표적은, 단백질들 중 하나 또는 둘다의 복합체화되지 않은 형태로부터 복합체화된 형태의 분리를 용이하게 하도록 하기 위해 고정될 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 또는 이의 변이체에 대한 테스트 화합물의 결합, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질과 타겟 분자의 테스트 화합물의 존재하 및 부재하에서의 상호작용은, 반응물을 함유하는데 적합한 임의의 바셀에서 달성할 수 있다. 이러한 바셀의 예로는 마이크로타이터 플레이트, 시험관 및 마이크로원심분리 튜브를 포함한다. 일 구현예에서, 단백질 한쪽 또는 양자를 매트릭스에 부착시킬 수 있는 도메인을 부가한 융합 단백질이 제공될 수 있다 (예, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 융합 단백질 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질은 글루타티온 세파로스 비드 (Sigma Chemical; St. Louis, Mo.) 또는 글루타티온 유도체화된 마이크로타이터 플레이트 상에 흡착될 수 있음).
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 또는 이의 변이체는 고체 지지체에 결합시킴으로써 고정화될 수 있다. 적합한 고체 지지체에 대한 비제한적인 예로는, 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 조직 배양 플레이트, 마이크로타이터 웰, 튜브, 실리콘 칩 또는 비드 등의 입자 (예, 라텍스, 폴리스티렌 또는 유리 비드를 비제한적으로 포함함)가 있다. 당해 기술 분야에 공지된 임의 방법을 이용하여, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 또는 이의 변이체에 해당되는 폴리펩타이드 (또는 폴리뉴클레오티드)를, 또는 테스트 화합물을, 공유 결합, 비공유 결합 또는 수동 흡착의 이용하는 것을 비롯하여, 고체 지지체에 부착시킬 수 있다.
또한, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 발현의 조절자는, 세포를 테스트 화합물과 접촉시키고, 세포에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2에 의해 코딩되는 단백질, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의 발현을 확인함으로써, 동정할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의, 테스트 화합물의 존재 하, 세포에서의 발현 수준을, 테스트 화합물의 부재 하의 상기 단백질 또는 mRNA 발현 수준과 비교한다. 그런 후, 상기 비교를 토대로 테스트 화합물을 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 발현의 조절자로서 동정할 수 있다. 예를 들어, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산의 세포에서의 발현이, 테스트 화합물이 존재할 때, 부재할 경우 보다, 통계학적으로 또는 유의하게 높을 경우, 이 테스트 화합물은 세포에서의 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의 발현의 촉진자/인핸서로서 동정된다. 이 테스트 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물 (예, 작용자)인 것으로 말할 수 있다.
다른 예로, 세포에서의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의 발현이, 테스트 화합물의 존재 하에서가 부재 하에 비해 통계학적으로 또는 유의하게 낮은 경우, 이 화합물은 세포에서의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의 발현의 저해자로서 동정된다. 또한, 테스트 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물 (예, 길항제)로서 말할 수 있다. 세포에서의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 mRNA 핵산 서열의 발현 수준은 기존에 개시된 방법들로 결정할 수 있다.
결합 분석에서, 테스트 화합물은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체의 결합부에 결합하여 점유하는 소분자일 수 있다. 이는 정상적인 생물학적 활성이 방지되도록 리간드 결합부에 기질이 접근할 수 없도록 할 수 있다. 이러한 소분자의 예로는, 소형 펩타이드 또는 펩타이드 유사 분자가 있으나, 이들로 한정되지 않는다. 결합 분석에서, 테스트 화합물, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 중 어느 하나는, 형광, 방사성 동위원소, 화학발광 또는 효소적 표지 (예, 알칼리 포스파타제, 호르세라디시 퍼옥시다제 또는 루시퍼라제) 등의 검출가능한 표지물질을 포함할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 결합하는 테스트 화합물의 검출은, 이후, 방사능 방출의 직접 카운팅, 신틸레이션 카운팅, 또는 적정 기질의 검출가능한 산물로의 변환 측정에 의해 확인할 수 있다.
또한, 테스트 화합물이 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합하는 능력은 실시간 생분자 상호작용 분석 (BIA) [McConnell et al., 1992 , Science 257, 1906-1912; Sjolander, Urbaniczky, 1991 , Anal. Chem. 63, 2338-2345]을 이용하여 달성할 수 있다. BIA는 임의의 상호작용제의 표지없이도 실시간으로 생물특이적인 상호작용을 연구하는 기법이다 (예, BIA-core). 광학 현상에서 표면 플라스몬 공명 (SPR)의 변화를 생물학적 물질들 간의 실시간 반응의 지표로서 사용할 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질에 결합하거나 이와 상호작용하여, 이의 활성을 조절하는 그외 단백질을 동정하기 위해, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를, 당해 기술 분야에서 실시하는 방법에 따라, 2-하이브리드 분석 또는 3-하이브리드 분석에서 바이트 단백질(bait protein)로서 사용할 수 있다 (Szabo et al., 1995 , Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705; 미국 특허 5,283,317). 2-하이브리드 시스템은 구분되는 DNA-결합 도메인과 활성화 도메인으로 구성된, 대부분의 전사 인자들의 모듈 특성을 기반으로 한다.
기능적 분석. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 또는 이의 변이체의 활성을 증가 또는 감소시키는 능력에 대해, 테스트 화합물을 테스트할 수 있다. 활성은 정제된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 세포막 조제물 또는 곤충 세포를 테스트 화합물과 접촉시킨 후 측정할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질 활성을, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%까지 감소시키는 테스트 화합물은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성을 낮추기 위한 잠재적인 물질, 예컨대 길항제로서 동정한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 100%까지 증가시키는 테스트 화합물은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성을 증가시키는 잠재적인 물질로서, 예컨대 작용제로서 동정한다.
치료 및 예방
또한, 본 발명은 개체에서 탈모 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은, 개체의 샘플에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 변이의 존재, 탈모 질환을 표시하는 변이의 존재, 또는 탈모 질환의 소인을 검출하는 단계, 및 탈모 질환에 대한 치료학적 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 치료학적 치료는 약물 투여 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 핵산에 대한 siRNA를 포함하는 약학 조성물)일 수 있다. 일 구현예에서, 투여하는 치료학적 분자는, 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 아미노산 서열에서 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 93%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%의 아미노산 서열을 포함하는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 포함하며, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시키는 기능을 나타낸다. 이는 모낭 또는 피부 유래 세포에서 모발 생장을 개시하는 능력을 회복시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 투여하는 치료학적 분자는 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 핵산 서열에서 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 93%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%를 포함하는, 폴리펩타이드를 코딩하는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하며, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시키는 기능을 가진 폴리펩타이드를 코딩하며, 따라서, 모낭 세포 또는 피부 유래 세포에서 모발 생장을 개시하는 능력을 회복시킬 수 있다.
상기 변이는 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드 수준에서 확인할 수 있다. 선택적으로, 검출은 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석, 검증 기반의 분석, 혼성화 분석, 서열분석, 대립유전자-특이 증폭 분석, 마이크로서열분석, 용융 곡선 분석, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 (DHPLA) 분석 (예컨대, Jones et al, (2000) Hum Genet., 106(6):663-8 또는 이들의 조합을 수행함으로써 확인할 수 있다. 다른 구현예에서, 검출은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 전체 또는 일부를 서열분석함으로써, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 전체 또는 일부를 선택적 혼성화 또는 증폭시킴으로써, 수행된다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 특이 증폭은 변형 동정 단계 이전에 수행할 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 점유된 염색체내 변형은 유전자 좌의 코딩부 및/또는 비코딩부에서의, 단독 또는 다양한 조합의, 임의 형태의 돌연변이(들), 결손(들), 재정렬(들) 및/또는 삽입일 수 있다. 돌연변이는 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 삽입은 유전자 좌의 코딩부 또는 비코딩부내 하나 또는 수개의 잔기의 부가를 포함할 수 있다. 삽입은 유전자 좌에 2 내지 60개의 염기쌍의 부가를 포함할 수 있다. 결손은 잔기 2 내지 최대 전체 유전자 또는 유전자 좌 등의, 유전자 좌의 코딩부 또는 비코딩부내 1, 2 또는 그 이상의 수의 잔기로 구성된 임의 영역을 포괄할 수 있다. 결손은 더 작은 영역, 예컨대, 결손이 더 클수록 잘 발생할 수 있지만, 약 50개 미만의 인접 염기쌍으로 구성된 도메인 (인트론) 또는 반복된 서열 또는 단편에 작용할 수 있다. 재정렬은 서열의 도치(inversion)를 포함한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 적용되는 염색체 영역내 변형은 아미노산 치환, RNA 스플라이신 또는 가공, 산물의 불안정성, 정지 코돈의 생성, 프래임-시프트 돌연변이, 및/또는 절단된 폴리펩타이드의 생성을 발생시킬 수 있다. 변형은 기능, 안정성, 타겟팅 또는 구조에 변이가 적용된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 또한, 변형은 단백질 발현의 감소, 또는 심지어 증가를 야기할 수도 있다. 일 구현예에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 점유된 염색체 영역내 변형은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 해당 발현 산물에서의 점 돌연변이, 결손 또는 삽입을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 변형은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 결손 또는 일부 결손일 수 있다. 변형은 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드의 수준에서 확인할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 방법은 변형된 RNA 발현의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 변형된 RNA 발현은 변형된 RNA 서열의 존재, 변형된 RNA 스플라이싱 또는 프로세싱의 존재, 또는 RNA의 변형된 함량의 존재를 포함한다. 이는, RNA 전체 또는 일부의 서열분석 또는 RNA 전체 또는 일부의 선택적인 혼성화 또는 선택적인 증폭 등의, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들로 검출할 수 있다. 추가적인 구현예에서, 본 방법은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현 변형의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리펩타이드의 발현 변형은 변형된 폴리펩타이드 서열의 존재, 폴리펩타이드의 변형된 함량의 존재 또는 변형된 조직 분포의 존재를 포함한다. 이는, 서열분석 및/또는 특이 리간드(예, 항체)에 대한 결합에 의해서 등의 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법으로 검출할 수 있다.
당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법들을 사용하여, 변형된 유전자 또는 RNA 발현 또는 핵산 서열을 검출 또는 정량할 수 있으며, 이러한 기법으로는 혼성화, 서열분석, 증폭, 및/또는 특이 리간드 (예, 항체)와의 결합이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 그외 적합한 방법으로는 대립유전자-특이 올리고뉴클레오티드 (ASO), 올리고뉴클레오티드 라이게이션, 대립유전자-특이 증폭, 서던 블롯 (DNA의 경우), 노던 블롯 (RNA 경우), 단일가닥 컨포메이션 분석 (SSCA), PFGE, 형광 인 시츄 혼성화 (FISH), 겔 이동, 클램핑된 변성 겔 전기영동, 변성 HPLC, 용융 곡선 분석, 헤테로두플렉스 분석, RNase 보호, 화학적 또는 효소적 미스매치 절단, ELISA, 방사-면역분석 (RIA) 및 면역-효소 분석 (IEMA)을 포함한다. 이러한 방식들 중 일부 방식 (예, SSCA 및 CGGE)은 변형된 서열의 존재 결과로서, 핵산의 전기영동 이동성의 변화를 토대로 한다. 이러한 기법에 따라, 변형된 서열은 겔에서의 이동성 변화를 통해 가시화된다. 그런 후, 단편을 서열분석하여, 변형을 검증할 수 있다. 일부 다른 접근법들은 개체 유래 핵산과 야생형 특이 프로브 또는 변형된 유전자 또는 RNA 간의 특이적인 혼성화를 기반으로 한다. 프로브는 기판 상에 고정하거나 현탁된 형태일 수 있다. 프로프는 하이브리드의 검출을 용이하게 하기 위해 표지할 수 있다. 이러한 방식들 중 일부 방식은 노던 블롯, ELISA 및 RIA 등의 폴리펩타이드 서열 또는 발현 수준을 평가하는데 적합하다. 후자는 폴리펩타이드에 특이적인 리간드의 사용, 예컨대 특이 항체의 사용을 필요로 한다.
서열분석. 서열분석은 자동 서열분석기를 이용하여 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 서열분석은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 전체 유전자를 대상으로, 또는 결손형 돌인변이 또는 기타 변형을 가지는 것으로 공지되거나 의심되는 것 등의 이의 특이 도메인을 대상으로 수행할 수 있다.
증폭. 증폭은 핵산 재생산을 개시하도록 제공되는 상보적인 핵산 서열들 간의 특이적인 하이브리드의 형성을 토대로 이루어진다. 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 가닥 치환 증폭 (SDA) 및 핵산 서열 기반의 증폭 (NASBA) 등의, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기법에 따라 수행할 수 있다. 이러한 기법들은 상업적으로 입수가능한 시약 및 프로토콜을 이용하여 수행할 수 있다. 당해 기술 분야에서 사용가능한 기법들로는 실시간 PCR, 대립 유전자-특이 PCR, 또는 PCR-SSCP를 포함한다. 증폭에는 통상적으로 반응을 개시하기 위한 특이적인 핵산 프라이머가 필요하다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 유전자 좌로부터 서열을 증폭시키는데 사용가능한 핵산 프라이머는, 탈모 질환을 앓고 있는 특정 개체에서 변형되어 있는, 상기 유전자 좌의 타겟 부위의 측면에 있는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 좌의 일부와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 서열번호 2, 4, 6 또도는 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 PCR 프라이머를 이용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은, 탈모 질환을 앓고 있는 특정 개체에서 변형된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 코딩 서열 (예, 유전자 또는 RNA)의 일부에 상보적이며, 특이적으로 혼성화할 수 있는, 핵산 프라이머를 제공한다. 본 발명의 프라이머는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2의 유전자 또는 RNA에서 변형된 서열에 대해 특이적일 수 있다. 이러한 프라이머의 사용을 통한 증폭 산물의 검출은, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 변형의 존재 또는 그러한 유전자의 부재를 표시해준다. 또한, 프라이머를 사용하여, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 좌내에 또는 주변에 위치한 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNP)를 동정할 수 있으며; SNP는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자내 또는 주변의 단일 뉴클레오티드 변화 또는 SNP 클로스터를 포함할 수 있다. 본 발명의 프라이머의 예는 약 5 내지 60개의 뉴클레오티드 길이이거나 또는 약 8 내지 약 25개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥의 핵산 분자일 수 있다. 서열은 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 서열로부터 직접 유래될 수 있다. 완벽한 상보성은 높은 특이성을 보장하는데 유용하지만, 일부 매스매치도 허용될 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같은 핵산 프라이머 또는 핵산 프라이머 쌍을 개체에서 탈모 질환의 존재 또는 소인을 검출하기 위한 방법에 이용할 수 있다.
증폭 방법은, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응, PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990 and PCR STRATEGIES, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., ligase chain reaction (LCR) (예, Wu, Genomics 4:560, 1989; Landegren, Science 241:1077, 1988; Barringer, Gene 89:117, 1990); 전사 증폭(예, Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989); 및 자기-지속형 서열 복제(self-sustained sequence replication) (예, Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990); Q β 레플리카제 증폭 (예, Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997), 자동화된 Q-β 레플리카제 증폭 분석 (예, Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271, 1996) 및 기타 RNA 중합효소 매개 기법 (예, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)이 있으며, 또한, Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987; Sambrook; Ausubel; 미국 특허 4,683,195 및 4,683,202; Sooknanan, Biotechnology 13:563-564, 1995를 참조한다. 상기에서 인용된 모든 문헌들은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
선택적인 혼성화. 혼성화 검출 방법은, 핵산 서열의 변형(들)을 검출하기 위해 제공하는 상보적인 핵산 서열들간에 특이적인 하이브리드를 형성하는 것을 토대로 이루어진다. 검출 기법은 야생형, 또는 변형된 유전자 또는 RNA에 특이적인 핵산 프로브의 사용과, 후속적인 하이브리드의 존재의 검출을 포함한다. 프로브는 현탁된 상태이거나 또는 기판이나 지지체 상에 (핵산 어레이 또는 칩 기법에서와 같이) 고정될 수 있다. 프로브는 하이브리드의 검출을 용이하게 하기 위해 표지될 수 있다. 예를 들어, 개체 유래 샘플을 야생형 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 변형된 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 특이적인 핵산 프로브와 접촉시킬 수 있으며, 하이브리드의 형성을 이후 분석할 수 있다. 일 구현예에서, 본 방법은 야생형 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 및 이의 다양한 변형된 형태에 각각 특이적인 프로브 세트를 샘플과 동시에 접촉시키는 단계를 포함한다. 따라서, 샘플에서 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 다양한 변형 형태의 존재를 직접 검출할 수 있다. 또한, 다양한 개체들로부터 수득한 다양한 샘플들을 병렬로 처리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 프로브는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 RNA(의 타겟 부분)와 상보적이며, 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 탈모 질환의 소인이거나 이와 관련있는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 (또는 유전자들)의 대립 유전자에 조합된 폴리뉴클레오티드 다형체를 검출하는데 적합한, 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자, RNA 또는 이의 타겟 부분에 상보적인 것이 유용한 프로브이다. 프로브는 8 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 핵산, 예컨대, 10 내지 800개, 15 내지 700개 또는 20 내지 500개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 물론 더 긴 프로브도 사용할 수 있다. 본 발명의 유용한 프로브는 변형을 가지고 있는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 또는 RNA의 영역에 특이적으로 혼성화할 수 있는, 8 내지 500개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 핵산 분자이다. 예를 들어, 프로브는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자로 점유된 염색체 영역을 겨냥할 수 있다.
프로브의 서열은 본원에 제공되는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자 및 RNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 프로브의 뉴클레오티드 치환 뿐만 아니라 화학적 변형을 수행할 수 있다. 이러한 화학적 변형은 하이브리드의 안정성을 높이거나 (예, 인터칼레이팅 기들) 또는 프로브를 표지하기 위해 달성할 수 있다. 표지 물질의 일부 예로는 방사활성, 형광, 발광 및 효소적 표지가 있으나, 이로 한정되지 않는다.
핵산의 혼성화를 위한 가이드는 예컨대 Sambrook, ed., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1997; Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., 1993에서 확인된다.
특이적인 리간드 결합.
본원에 기술된 바와 같이, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 점유된 염색체 영역내 변형, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자의 발현에서의 변형은, 또한, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 발현 수준 또는 서열 변형(들)을 스크리닝함으로써, 검출할 수 있다. 특이 항체 등의 여러가지 타입의 리간드가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 샘플을 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 특이적인 항체와 접촉시키고, 면역 복합체의 형성을 이후 확인한다. 면역 복합체를 검출하는 다양한 방법들, 예컨대 ELISA, 방사면역분석 (RIA) 및 면역-효소 분석 (IEMA)을 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 뿐만 아니라 실질적으로 동일한 항원 특이성을 가진 이의 단편 또는 유도체일 수 있다. 단편은 Fab, Fab'2, 또는 CDR 영역을 포함한다. 유도체는 단쇄 항체, 인간화된 항체 또는 다중-기능성 항체를 포함한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 특이적인 항체는, 그러한 폴리펩타이드에 선택적으로 결합하는 항체, 즉, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대해 제조된 항체, 또는 이의 에피토프-함유 단편일 수 있다. 다른 항원에 대한 비특이적인 결합이 발생할 수 있지만, 타겟 폴리펩타이드에 대한 결합은 보다 높은 친화성으로 이루어지며, 비특이 결합과는 확실하게 차이를 보일 수 있다. 일 구현예에서, 본 방법은, 개체 유래 샘플에, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 야생형 또는 변형된 형태에 특이적인 항체를 접촉시키는 단계, 및 면역 복합체의 존재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 선택적으로, 샘플을, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 야생형 또는 변형된 형태에 특이적인 항체로 코팅된 지지체에 접촉시킬 수 있다. 일 구현예에서, 샘플을, 야생형 및 이의 다양한 변형된 형태 등의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 여러가지 형태들에 특이적인 다양한 항체들에, 동시에, 또는 병행하여, 또는 순차적으로 접촉시킬 수 있다.
유전자 치료법 및 단백질 치환 방법
살아있는 세포로의 핵산 전달은 바이러스 벡터 (예, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스 또는 레트로바이러스) 등의 벡터의 사용에 의해 생체외, 인 시츄 또는 생체내에서, 또는 물리적인 DNA 전이 방법 (예, 리포솜 또는 화학 처리제)의 사용에 의해 생체외에서 수행할 수 있다. 핵산을 포유류 세포로 시험관내 전이하는데 적합한 비제한적인 기법으로는 리포솜, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 칼슘 포스페이트 침강법의 사용을 포함한다 (예, Anderson, Nature, supplement to vol. 392, no. 6679, pp. 25-20 (1998)). 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 또는 유전자의 도입은, 또한, 염색체외 물질 (일시적인 발현) 또는 인공 염색체 (안정적인 발현)로 달성될 수 있다. 또한, 세포는 이러한 세포에서의 활성 또는 바람직한 효과를 발현하거나 증식시키기 위해, 본 발명의 치료학적 조성물의 존재 하에 생체외 배양할 수 있다. 그런 후, 처리한 세포를 치료학적 목적으로 생체내로 도입할 수 있다.
핵산은 벡터에 삽입하여, 유전자 치료 벡터로서 사용할 수 있다. 파포파바이러스, 예컨대 SV40 (Madzak et al., 1992), 아데노바이러스 (Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992; Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson et al., 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990), 백시니아 바이러스 (Moss, 1992), 아데노-부속 바이러스 (Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990), 헤르페스바이러스, 예컨대 HSV 및 EBV (Margolskee, 1992; Johnson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakfield and Geller, 1987; Freese et al., 1990), 조류 레트로바이러스 (Biandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al., 1992), 뮤라인 레트로바이러스 (Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988), 및 인간 기원 (Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchschacher and Panganiban, 1992) 등의, 다수의 바이러스들이 유전자 전달 벡터로서 사용되고 있다. 생체내 유전자 전달 기법에 대한 비제한적인 예로는, 바이러스 (예, 레트로바이러스) 벡터 (미국 특허 5,252,479, 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨) 및 바이러스 코트 단백질-리포솜 매개 형질감염 (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993), 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)을 이용한 형질감염을 포함한다. 예컨대, 네이키드(naked) DNA 백신이 당해 기술 분야에 일반적으로 사용되고 있으며, Brower, Nature Biotechnology, 16:1304-1305 (1998)를 참조하며, 문헌의 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 유전자 치료 벡터는 예컨대, 정맥내 주사, 국소 투여 (예, 미국 특허 5,328,470) 또는 정위고정성 주사(stereotactic injection)에 의해 개체에게로 전달할 수 있다 (예, Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057). 유전자 치료 벡터의 약학적 조제물은 허용가능한 희석제 중의 유전자 치료 벡터를 포함할 수 있거나, 또는 유전자 전달 비히클이 함침된 느린 방출 매트릭스를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 전체 유전자 전달 벡터를 재조합 세포, 예컨대 레트로바이러스 벡터로부터 온전하게 제조할 수 있는 경우, 약학 조제물은 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
유전자 치료 프로토콜 및 방법에 대한 리뷰로서, Anderson et al., Science 256:808-813 (1992); 미국 특허 5,252,479, 5,747,469, 6,017,524, 6,143,290, 6,410,010 및 6,511,847; 및 미국 출원 공개번호 2002/0077313 및 2002/00069를 참조하며, 이들 모든 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 유전자 치료 기법에 대한 부가적인 리뷰로서, Friedmann, Science, 244:1275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); Miller, Nature, 357: 455-460 (1992); Kikuchi et al., J Dermatol Sci. 2008 May;50(2):87-98; Isaka et al., Expert Opin Drug Deliv. 2007 Sep;4(5):561-71; Jager et al., Curr Gene Ther. 2007 Aug;7(4):272-83; Waehler et al., Nat Rev Genet. 2007 Aug;8(8):573-87; Jensen et al., Ann Med. 2007;39(2):108-15; Herweijer et al., Gene Ther. 2007 Jan;14(2):99-107; Eliyahu et al., Molecules, 2005 Jan 31;10(1):34-64; and Altaras et al., Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005;99:193-260을 참조하며, 이들 모든 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
단백질 치환 치료법은 융합 방식으로 야생형 또는 생물학적 기능성 단백질을 외래적으로 도입함으로써, 단백질의 양을 증가시킬 수 있다. 치환 폴리펩타이드는 공지의 화학 기법에 따라 합성하거나, 또는 공지의 분자 생물학적 기법을 통해 제조 및 정제할 수 있다. 단백질 치환 치료법들이 다양한 장애들에 대해 개발되고 있다. 예를 들어, 야생형 단백질은 재조합 세포 발현 시스템 (예, 포유류 세포 또는 곤충 세포 - 미국 특허 5,580,757, Desnick et al.; 미국 특허 6,395,884 및 6,458,574, Selden et al.; 미국 특허 6,461,609, Calhoun et al.; 미국 특허 6,210,666, Miyamura et al.; 미국 특허 6,083,725, Selden et al.; 미국 특허 6,451,600, Rasmussen et al.; 미국 특허 5,236,838, Rasmussen et al. 및 미국 특허 5,879,680, Ginns et al. 참조), 인간 태반 또는 동물의 모유 (미국 특허 6,188,045, Reuser et al.), 또는 그외 당해 기술 분야에 공지된 소스로부터 정제할 수 있다. 융합 후, 외인성 단백질은 비특이- 또는 수용체-매개 기전을 통해 조직에 유입시킬 수 있다.
또한, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 조절식 방출 시스템(controlled release system)으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 정맥내 주입, 이식가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀 또는 기타 투여 방식을 이용하여 투여할 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). 다른 구현예에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다 (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989) 참조). 또 다른 구현예에서, 조절식 방출 시스템은 치료학적 타겟의 근처에 배치시킬 수 있어, 전신 투여량 중 오직 일부만 필요할 수 있다 (예, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 조절식 방출 시스템이 Langer (Science 249:1527-1533 (1990))의 리뷰에 기술되어 있다.
치료를 위한 약학 조성물 및 투여
본 발명의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은, 개체에 한번 (예, 단일 주사 또는 침전(deposition)) 투여할 수 있다. 다른 예로, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 이를 필요로 하는 개체에게 약 2 내지 약 28일간, 또는 약 7 내지 약 10일간, 매일 1회 또는 2회 투여할 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은, 또한, 연간 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회, 또는 이의 조합으로 개체에게 매일 1회 또는 2회 투여할 수 있다. 아울러, 본 발명의, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 다른 치료제와 공동-투여할 수 있다. 투약 요법(dosage regimen)은 다중 투여를 포함하는 경우, 개체에게 투여되는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물의 유효량은 전체 투약 요법 동안 투여되는 유전자 산물의 총량을 포함할 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은, 진피, 표피, 진피 유두상 세포 또는 모낭 세포 등의 개체의 세포에, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물을 전달하는데 적합한 임의 수단을 통해, 개체에게 투여할 수 있다. 예를 들어, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질, 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은 세포를 형질감염시키는데 적합한 방법으로 투여할 수 있다. 진핵 생물 세포에 대한 형질감염 방법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 세포의 핵 또는 전핵으로의 핵산의 직접 주사; 전기천공; 리포좀 전이 또는 친지성 물질에 의해 매개되는 전이; 수용체 매개 핵산 전달, 바이오발리스틱(bioballistic) 또는 입자 가속(particle acceleration); 칼슘 포스페이트 침강, 및 바이러스 벡터에 의해 매개되는 형질감염을 포함한다.
본 발명의 조성물은 제형화 및 투여하여, 인간 또는 동물 (예, 개, 고양이 또는 말) 등의 개체의 신체에서 물질의 작용 부위에 활성 성분이 접촉되게 하는 임의 수단에 의해, 탈모 질환과 관련된 증상을 낮출 수 있다. 이는, 개별 치료 활성 성분으로서 또는 치료 활성 성분들의 조합으로서, 약제와 조합하여 사용하는데 이용가능한 임의의 기존 방식에 의해 투여할 수 있다. 이는 단독으로 투여할 수도 있지만, 일반적으로 선택한 투여 경로 및 표준 약학 실무를 토대로 선택된 약제학적 담체와 함께 투여한다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물의 치료학적 유효량은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물의 투여량(들)은, 예컨대 정체(identity), 신체 크기, 치료 중인 개체 또는 샘플의 상태에 따라 달라질 수 있으며, 추가적으로, 적용가능한 경우, 조성물이 투여되는 경로, 및 실무자가 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물이 본 발명의 핵산 또는 폴리펩타이드로부터 추구하길 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 이들 함량은 당해 기술 분야의 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 본원에 기술된 모든 치료학적 적용은 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 돼지, 양, 염소 또는 인간 등의 포유류를 비롯하여, 이러한 치료가 필요한 임의 개체에 적용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 약학 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 기존 방식으로 제형화할 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 전신 및 국소 또는 국지화된 투여 등의, 다양한 투여 경로용으로 제형화할 수 있다. 기법 및 제형은 일반적으로 Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa (20th Ed., 2000)에서 확인할 수 있으며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전신 투여의 경우, 근육내, 정맥내, 복막내 및 피하 등의 주사가 유용하다. 주사의 경우, 본 발명의 치료 조성물은, 액체 용액 중에, 예컨대 행크 용액 또는 링거액 등의 생리학적으로 상용가능한 완충액 중에 제형화할 수 있다. 아울러, 치료 조성물은 고체 형태로 제형화하고, 사용 직전에 재용해 또는 현탁할 수 있다. 동결건조된 형태도 포함된다. 본 발명의 약학 조성물은 적어도 무균성 및 발열원-결핍인 것으로서 특정된다. 이러한 약학 제형은 인간 및 수의학적 용도를 위한 제형을 포함한다.
본 발명에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는, 약학적인 투여로 사용가능한, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 성분에 대한 상기한 매질 및 물질의 사용은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 활성 화합물과 혼용가능한 임의의 기존 매질 또는 물질을 사용할 수 있다. 보충적인 활성 화합물도 본 조성물에 혼입할 수 있다.
또한, 본 발명은, 사용 설명서와 함께 포장된, 본 발명의 스크리닝 분석을 이용하여 동정된, 약제학적으로 허용가능한 담체 및 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물을 포함하는 키트를 제공한다. Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성이 길항제인 조절자이거나, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 발현을 낮추는 조절자인 경우, 상기 설명서는 포유류의 신체 표면 (예, 팔, 다리, 비키니 부위, 얼굴)에서 탈모를 촉진시키는 약학 조성물의 용도를 명시할 것이다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 단백질의 활성이 작용제이거나, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 발현을 증가시키는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물인 경우, 상기 설명서는 모발 생장을 조절하기 위한 약학 조성물의 용도를 명시할 것이다. 일 구현예에서, 상기 설명서는 탈모 질환의 치료제로서의 약학 조성물의 용도를 명시할 것이다. 추가적인 구현예에서, 상기 설명서는 모발 색소 침착을 회복시키는 약학 조성물의 용도를 명시할 것이다. 예를 들어, 작용제의 투여는 개체에서의 모발 회백화(hair graying)를 낮출 수 있다.
Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 본원에 기술된 임의의 치료학적 효과를 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물은, 예컨대 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자, 또는 이의 변이체를 포함하는 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한 항체, 또는 Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 작용제 및 길항제를 포함할 수 있다. 본 조성물은 단독으로, 또는 안정화 화합물 등의 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 투여할 수 있으며, 이는 비제한적인 예로서, 식염수, 완충화된 식염수, 덱스트로스 및 물 등의 임의의 무균성 생물적합한 담체 중의 형태로 투여될 수 있다. 본 조성물은 환자에게 단독으로 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여할 수 있다.
무균성의 주사가능한 용액제는, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물 (예, 폴리펩타이드 또는 항체)을 필요한 양으로 적정 용매 중에 본원에 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합과 함께 혼합하고, 필요에 따라 여과 멸균함으로써, 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는, 기본 분산 매질과 본원에 열거된 것 이외의 필요한 기타 성분들을 포함하는 무균 비히클에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조한다. 무균성의 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 산제의 경우, 사용가능한 제조 방법들의 예로는 진공 건조와, 미리 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 임의의 부가적인 원하는 성분으로 구성된 분말을 수득하는, 동결-건조가 있다.
일부 구현예들에서, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 조절 화합물은, 피부를 통한 흡수를 위해 활성 화합물을 서서히 방출하는, 경피 전달 시스템으로 통해 적용할 수 있다. 침투 강화제를 사용하여, 조건화된 매질 중의 활성 인자들의 경피 침투를 촉진시킬 수 있다. 경피 패치에 대해서는 예컨대, 미국 특허 5,407,713; 미국 특허 5,352,456; 미국 특허 5,332,213; 미국 특허 5,336,168; 미국 특허 5,290,561; 미국 특허 5,254,346; 미국 특허 5,164,189; 미국 특허 5,163,899; 미국 특허 5,088,977; 미국 특허 5,087,240; 미국 특허 5,008,110; 및 미국 특허 4,921,475에 기술되어 있다.
응집된 세포 집단을 원하는 부위로 도입하기 위해, 다양한 투여 경로 및 다양한 세포 이식 부위, 예컨대 피하 또는 근육내를 이용할 수 있다. 개체 (예, 마우스, 랫 또는 인간)에 이식되면, 응집된 세포는 모낭의 형성을 자극하고, 도입 부위에서의 체모 구조의 후속적인 생장을 자극할 수 있다. 다른 구현예에서, 형질감염된 세포 (예, Jak 1, Jak 2, Stat 1 또는 Stat 2 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 발현하는 세포)를 개체에서 모낭 형성을 촉진시키기 위해 개체로 이식한다. 추가적인 구현예에서, 형질감염된 세포는 모낭의 종구 (예, 진피 유두상 세포 또는 진피 시트 세포)로부터 유래된 세포이다. 1회 이상의 계대 배양으로 유지시킨 응집된 세포 (예, 행잉 드롭 배양으로 배양한 세포) 또는 형질감염된 세포 (예, 본원에 기술된 바와 같이 제작된 세포)를 개체 (예, 랫, 마우스, 개, 고양이, 인간 등)에게 도입 (또는 이식)할 수 있다.
"피하" 투여는 피부 바로 밑 (즉, 진피 밑)에 투여하는 것을 의미할 수 있다. 일반적으로, 피하 조직은 큰 혈관과 신경을 수용하고 있는 지방 및 결합 조직으로 구성된 층이다. 얇은 층의 두께는 신체 부위에 따라, 개체별로 다르다. 피하 및 근육 층 사이의 경계면은 피하 투여에 포함될 수 있다.
이러한 투여 방식은, 피하 층이 충분히 얇아, 조성물에 존재하는 인자들이 투여 위치에서부터 이동 또는 분산되어, 체모 형성을 담당하는 모낭 세포와 접촉할 수 있는 경우에, 실현가능할 수 있다. 따라서, 진피내 투여를 사용하는 경우, 투여되는 조성물의 볼루스 (bolus)는 피하 층 근처에 위치된다.
세포 응집체 (예, DP 또는 DS 응집체)의 투여는 단일 경로로만 한정되지 않으며, 다중 경로에 의한 투여도 포괄할 수 있다. 예를 들어, 다중 경로에 의한 투여의 예로는, 특히, 진피내 및 근육내 투여의 조합 또는 진피내 및 피하 투여의 조합을 포함한다. 다중 투여는 순차적이거나 동시일 수 있다. 다중 경로에 의한 그외 적용 방식은 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
다른 구현예들에서, 이러한 이식 방법은 일부 개체에 대한 일회성 치료(one-time treatment)일 것이다. 본 발명의 추가적인 구현예에서, 다중 세포 치료 이식법이 필요할 것이다. 일부 구현예들에서, 이식에 사용되는 세포는 일반적으로 개체-특이적인 유전자 조작된 세포일 것이다. 다른 구현예에서, 상이한 종들로부터 수득되는 세포 또는 동일 종들의 다른 개체로부터 수득되는 세포가 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 세포의 사용에는 이식된 세포에 대한 거부 반응을 예방하기 위한 면역억물질의 투여가 필요할 수 있다. 또한, 이러한 방법은 미국 특허 출원 공개공보 2004/0057937 및 PCT 출원 공개공보 WO 2001/32840에도 기술되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
저해제
사이토카인은 주변 세포들을 활성화하여, 위험 신호를 다른 세포와 교류하며, 염증 반응을 전파 및 증폭시키기 위한 목적으로 생산된다. 수년간, 이들 사이토카인을 차단성 항체로 중화하는 방식과, 소분자 단백질 티로신 키나제에 의한 반응성 세포에서 이의 시그널링을 저해하는 방식이 학습되었으며, 이들 방식에 대한 FDA 승인받은 약물, 예컨대, IL-2 및 TNF 차단 항체 및 사이토카인 시그널링을 차단하는 경구 이용가능한 소분자 Gleevec™이 있다. 가급적, 중심은, 생물약학적(biopharmaceutical) 루트에서 다른 소분자 저해제의 AA에 대한 임상적인 평가에 도움이 되게 전신 독성을 제한하면서, 효능 개선이 필요한 국소 소분자 제형을 추구하는 것일 것이다.
사이토카인 수용체의 시그널링을 차단하기 위해, 건선 및 RA 환자에서 이미 안전성과 효능이 입증된, 국소/경구 JAK1/2 저해제 (Incyte)를 사용할 수 있다.
저해제는 펩타이드 (예, 항체 또는 이의 단편), 소분자, 핵산 (예, siRNA 또는 안티센스 RNA) 또는 대상 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 분자에 결합할 수 있는 기타 물질, 및/또는 대상 단백질의 생물 활성 또는 발현에 대해 저해 효과를 나타내는 분자를 포함할 수 있다.
본원에서, "Jak 1 저해제"는 Jak 1 유전자 또는 Jak 1 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물로 지칭한다. 이 화합물은 Jak 1에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
일 구현예에서, Jak 1 저해제는 서열번호 1을 포함하는 단백질에 결합하는 펩타이드 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 서열번호 1의 약 8개 이상의 인접 아미노산으로 구성된 임의 일부분을 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 1의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은, 약 8 내지 약 100개의 아미노산, 예컨대 약 10개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 15개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 20개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 35개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 40개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 70개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 75개 내지 약 100개의 아미노산, 또는 약 80개 내지 약 100개의 아미노산을 비롯한, 모든 가능한 아미노산 길이를 포함한다. 이들 펩타이드 단편들은 액상 또는 고상 합성 방법을 통해 합성하거나 상업적으로 구입할 수 있다 (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England).
본원에서, "Jak 2 저해제"는 Jak 2 유전자 또는 Jak 2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Jak 2에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
일 구현예에서, Jak 2 저해제는 서열번호 3를 포함하는 단백질에 결합하는 펩타이드 단편일 수 있다. 예컨대, 단편은 서열번호 3의 약 8개 이상의 인전 아미노산으로 구성된 임의 일부를 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 3의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 약 8 내지 약 100개의 아미노산을 비롯한 모든 가능한 아미노산 길이, 예컨대, 약 10개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 15개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 20개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 35개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 40개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 70개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 75 내지 약 100개의 아미노산 길이, 또는 약 80 내지 약 100개의 아미노산 길이를 포함한다. 이들 펩타이드 단편들은 액상 또는 고상 합성 방법을 통해 합성하거나 상업적으로 구입할 수 있다 (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England).
본원에서, "Stat 1 저해제"는 Stat 1 유전자 또는 Stat 1 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Stat 1에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
일 구현예에서, Stat 1 저해제는 서열번호 5를 포함하는 단백질에 결합하는 펩타이드 단편일 수 있다. 예컨대, 상기 단편은 서열번호 5의 약 8개 이상의 인접 아미노산으로 구성된 임의 일부를 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 5의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산을 포함한다. 단편은 약 8 내지 약 100개의 아미노산을 비롯한 모든 가능한 아미노산 길이, 예컨대, 약 10개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 15개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 20개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 35개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 40개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 70개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 75 내지 약 100개의 아미노산 길이, 또는 약 80 내지 약 100개의 아미노산 길이를 포함한다. 이들 펩타이드 단편들은 액상 또는 고상 합성 방법을 통해 합성하거나 상업적으로 구입할 수 있다 (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England).
본원에서, "Stat 2 저해제"는 Stat 2 유전자 또는 Stat 2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물을 지칭한다. 이 화합물은 Stat 2에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
일 구현예에서, Stat 2 저해제는 서열번호 7을 포함하는 단백질을 결합하는 펩타이드 단편일 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 서열번호 7의 약 8개 이상의 인접 아미노산으로 구성된 임의 일부를 포함할 수 있다. 상기 단편은 서열번호 7의 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산, 약 40개 이상의 인접 아미노산, 약 50개 이상의 인접 아미노산, 약 60개 이상의 인접 아미노산, 또는 약 75개 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있다. 단편은 약 8 내지 약 100개의 아미노산을 비롯한 모든 가능한 아미노산 길이, 예컨대, 약 10개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 15개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 20개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 35개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 40개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 70개 내지 약 100개의 아미노산 길이, 약 75 내지 약 100개의 아미노산 길이, 또는 약 80 내지 약 100개의 아미노산 길이를 포함한다. 이들 펩타이드 단편들은 액상 또는 고상 합성 방법을 통해 합성하거나 상업적으로 구입할 수 있다 (Atherton et al., (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: a Practical Approach. IRL Press, Oxford, England).
본원에서, "Jak/Stat 저해제"는 Jak1/Jak2/Stat1/Stat2 유전자, 또는 Jak1/Jak2/Stat1/Stat2 단백질 또는 폴리펩타이드와 상호작용하여, 이의 활성 및/또는 발현을 저해하는 화합물을 지칭한다. 상기 화합물은 Jak1/Jak2/Stat1/Stat2에 의해 코딩되는 단백질의 활성 또는 발현을 낮출 수 있다.
본 발명의 저해제는, 서열번호 1, 3, 5 또는 7에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에 대한, 항체 (단일클론, 다클론, 인간화된, 키메라 또는 완전 인간) 또는 이의 결합 단편 등의 단백질일 수 있다. 항체 단편은, 전장 형태 이외의 항체 형태일 수 있으며, 조작된 항체 단편 외에도, 전장 항체 내부에 존재하는 일부 또는 구성 성분을 포함할 수 있다. 항체 단편으로는, 단쇄 Fv (scFv), 디아바디, Fv, 및 (Fab')2, 트리아바디, Fc, Fab, CDR1, CDR2, CDR3, CDR들의 조합, 가변부, 테트라바디, 이중 기능의 하이드리드 항체, 프래임 영역, 불변부 등이 있으나, 이들로 한정되지 않는다 (Maynard et al., (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 항체는 상업적으로 구입하거나, 주문 제작하거나 또는 당해 기술 분야에서 확립된 방법에 따라 대상 항원에 대하여 합성할 수 있다 (Janeway et al., (2001) Immunobiology, 5th ed., Garland Publishing).
또한, 본 발명의 저해제는 단백질에 결합하여 그 기능을 파괴하는 소분자일 수 있다. 소분자는 일반적으로 저분자량을 가진 다양한 그룹의 합성 및 천연 물질이다. 이는, 천연 소스 (예, 식물, 진균, 미생물 등)으로부터 분리하거나, 상업적으로 입수하거나 및/또는 라이브로리 또는 콜렉션으로서 이용가능하거나, 또는 합성할 수 있다. 단백질을 조절하는 소분자 후보체는, 인 실리코 스크리닝 또는 조합 라이브러리의 고-성능-풋 (HTP) 스크리닝을 통해 동정할 수 있다. 아스피린, 페니실린 및 많은 화학치료제 등의 대부분의 기존 약제들은 소분자이거나, 상업적으로 입수할 수 있거나, 화학 합성할 수 있거나, 후술되는 바와 같이 랜덤 또는 조합 라이브러리로부터 수득할 수 있다 (Werner et al., (2006) Brief Funct. Genomic Proteomic 5(1):32-6). 일부 구현예들에서, 상기 물질은 타겟 단백질 또는 RNA에 결합, 상호작용 또는 조합하는 소분자이다. 이러한 소분자는, 타겟이 세포내 타겟인 경우, 세포의 지질 2중층을 침투하여 타겟과 상호작용할 수 있는 유기 분자일 수 있다. 소분자는, 비제한적인 예로서, 톡신, 킬레이팅제, 금속 및 금속성 화합물을 포함한다. 소분자에는 소분자를 특정 세포로 특이적으로 안내하기 위해 타겟팅제가 부착 또는 접합될 수 있다.
치료를 위한 약학 조성물 및 투여
본 발명의 저해제 또는 작용제는 투여에 적합한 약학 조성물, 예컨대 저해제 및 약제학적으로 허용가능한 담체에 혼입될 수 있다.
본 발명에서, 약제학적으로 허용가능한 담체는, 약학적 투여에 사용가능한, 임의의 모든 용매들, 분산 매질, 코팅제, 항세균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 성분에 대한 상기한 매질 및 물질의 사용은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 활성 화합물과 혼용가능한 임의의 기존 매질 또는 물질을 사용할 수 있다. 보충적인 활성 화합물도 본 조성물에 혼입할 수 있다.
본원에 기술된 모든 치료학적 적용은 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 토끼, 원숭이, 돼지, 양, 염소 또는 인간 등의 포유류를 비롯하여, 이러한 치료가 필요한 임의 개체에 적용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 본원에 기술된 치료학적 임의 효과를 위해, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 투여할 수 있다. 이러한 약학 조성물은, 예컨대 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함할 수 있다. 본 조성물은 단독으로, 또는 안정화 화합물 등의 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 투여할 수 있으며, 이는 비제한적인 예로서, 식염수, 완충화된 식염수, 덱스트로스 및 물 등의 임의의 무균성의 생물적합한 담체 중에서 투여될 수 있다. 본 조성물은 환자에게 단독으로 또는 다른 제제, 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도한 투여 방식에 적합하게 제형화된다. 투여 경로의 예로는, 비경구, 예컨대, 정맥내, 진피내, 피하, 경구 (예, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여를 포함한다. 비경구, 진피내 또는 히파 적용으로 사용되는 용액제 또는 현탁제는 다음과 같은 성분들을 포함할 수 있다: 무균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그외 합성 용매; 항세균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라젠; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 사이트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성(tonicity)을 조절하기 위한 물질, 예컨대 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스. pH는 염산 또는 수산화나트륨 등의 산 또는 염기로 적정할 수 있다. 비경구 조제물은 유리 또는 플라스틱으로 제작된 앰플, 일회용 주사기 또는 다중 투약 바이얼에 충전할 수 있다.
주사 용도로 적합한 약학 조성물은 (수용성인 경우) 무균 수용액 또는 분산제 및 무균 주사 용액제 또는 분산제를 즉석 제조하기 위한 멸균 산제를 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수(bacteriostatic water), Cremophor EM™ (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함한다. 모든 경우들에서, 조성물은 무균성이어야 하며, 용이한 주사성이 확보되는 수준까지 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용을 방지하여야 한다. 담체는 예컨대 물, 에탄올, 약제학적으로 허용가능한 폴리올 유사 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 액체 및 이들의 적정 혼합물을 함유하는, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절 유동성이, 예컨대 레시틴 등의 코팅제의 사용에 의해, 분산제인 경우 필수 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해, 유지될 수 있다. 미생물 활동의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우들에서, 등장제, 예컨대, 당, 만니톨과 같은 폴리알코올, 포르비톨, 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 유용할 수 있다. 주사용 조성물의 지연식 흡수(prolonged absorption)는, 조성물에 흡수를 지연시키는 물질, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써, 달성할 수 있다.
무균성의 주사가능한 용액제는, 본 발명의 저해제 (예, 폴리펩타이드 또는 항체 또는 소분자) 또는 작용제를 필요한 양으로 적정 용매 중에 본원에 열거된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 혼합하고, 필요에 따라 여과 멸균함으로써, 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는, 기본 분산 매질과 본원에 열거된 것 이외의 필요한 기타 성분들을 포함하는 무균 비히클에 활성 화합물을 혼입함으로써 제조한다. 무균성의 주사가능한 용액제를 제조하기 위한 무균 산제의 경우, 사용가능한 제조 방법들의 예로는 진공 건조와, 미리 멸균-여과한 용액으로부터 활성 성분과 임의의 부가적인 원하는 성분으로 구성된 분말을 수득하는, 동결-건조가 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이는 젤라틴 캡슐 안에 봉입되거나 또는 정제로 압착할 수 있다. 경구 치료학적 투여를 위한 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입하여, 정제, 트로키제 또는 캡슐제의 형태로 사용할 수 있다. 또한, 경구 조성물은 입세정제로서 사용하기 위한 유체 담체를 이용하여 제조할 수 있으며, 이때 상기 유체 담체내의 화합물은 경구로 적용되며, 가글하고, 뱉거나 삼킨다.
약제학적으로 사용가능한 결합제 및/또는 보강제 물질들도 조성물의 일부로서 포함시킬 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로키제 등은 다음과 같은 성분들 중 임의의 성분 또는 유사 특성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정 셀룰로스, 트라가칸트검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스; 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활택제, 예컨대 콜로이드형 실리콘 다이옥사이드; 감미제, 예컨대 자당 또는 사카린; 또는 향제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향.
또한, 전신 투여는 경점막 또는 경피 수단에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 통과할 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당해 기술 분야에 일반적으로 공지되어 있으며, 예컨대 경점막 투여의 경우, 디터전트, 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 코 스프레이 또는 좌제를 이용함으로써 달성할 수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물은 당해 기술 분야에서 일반적으로 공지된 바와 같이 연고(ointment), 고약(salves), 젤 또는 크림으로 제형화된다.
***
달리 정의되지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 등가인 방법 및 물질들도 본 발명을 실시하고 테스트하는데 사용할 수 있지만, 방법 및 물질에 대한 예를 아래에 기술한다.
당해 기술 분야의 당업자는 본원에 기술된 특정 물질 및 공정에 대한 일상적인 실험에 불과한 여러가지 등가의 실험들을 이용함으로써 평가하거나 또는 확인하게 될 것이다. 이러한 등가의 내용은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주되며, 첨부된 청구항에 포괄된다.
본원에 언급된 모든 간행물들과 기타 참조문헌들은, 각각의 개별 간행물 또는 참조문헌이 원용에 의해 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 바와 같이, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 인용된 간행물들과 참조문헌들은 종래 기술로 인정되지 않는다.
실시예들
본 발명에 대한 보다 충분한 이해를 돕기 위해 아래에 실시예들이 제공된다. 아래 실시예들은 본 발명을 구성하고 실시하는 예시적인 방식들을 예시한다. 그러나, 본 발명의 범위는, 유사한 결과를 수득하기 위해 다른 방법들이 사용될 수 있으므로, 단순 예시에 불과한 이들 실시예에 기술된 구체적인 구현예들로 한정되지 않는다.
실시예 1
인터페론 γ는 뮤라인 AA에서 타겟으로 입증된 바 있다 (Nakamura, et al. 2008, Am J Pathol, 172(3): 650-658; Freyschmidt-Paul et al., Br J Dermatol., 155(3):515-521; Gilhar et al., Journal Invest. Dermatol., 124(1):288-289). 인간 AA의 경우, AA PBMC는 Th1 편향성(skewing)을 나타내며, AA 피부는 IFN 시그니처 및 GWAS 유전자 (SOCS/IFN-γ/) 뿐만 아니라 IL-2/6/13/21/26를 나타낸다.
인터페론 γ 경로 (도 7)는 타겟 HF 세포에서 NKG2DL을 유도하며, DC에 의한 항원 제시를 강화하고, Th1 세포성 자가면역을 촉진시키며, NK 및 CTL 매개-세포용해(cytolysis)를 증가시킨다.
임상 개발 중인 JAK1/2 저해제로는, a) INCB018424, 국소 및 경구; 5nM 활성도 (Incyte); b) CEP-701 (세팔론); 및 c) TG101348이 있다.
Figure pct00026
MedRa 선호 용어 비히클 (n=50) 활성 성분 (n=149)
적용 부위 자극, 가려움 7(14.0) 14(9.3)
비인두염 1(2.0) 10(6.7)
상기도관 감염 3(6.0) 10(6.7)
부비동염 1(2.0) 6(4.0)
등 통증 0(0.0) 5(3.4)
두통 0(0.0) 4(2.7)
인플루엔자 2(4.0) 4(2.7)
복통 0(0.0) 3(2.0)
6가지의 SAE, 관련 치료 안함; 전립선 ca, 담낭염으로 인해 장기 입원, 담석증 (1.5%); 추간판 탈출증 회복술, ASHD을 동반한 관상 동맥 폐쇄 (0.5%). CVA (비히클).
표 1 . INCB18424-203: 치료시 발생하는 부작용의 내림차순 발생율 (모든 환자) (경구 전달은 허용가능한 프로파일로 간주됨)
AA에서의 임상 프로그램은 다음과 같다:
● 경도 - 중등도 AA : 2/3기 건선 및 구강 3기 골수섬유화증, 국소 JAK 저해제 사용
인구 집단 기반의 코호트에서는 국립 원형 탈모증 협회를 통해 확인된 사례 vs. 뉴욕시 암 프로젝트를 통해 확인된 대조군을 평가하였다. 이들은 AIMS를 이용하여 북유럽 계통으로 일치시켰다.
● 사례: n=1080 (전신 탈모증=482; 전두 탈모증=120; 일시적인 원형 탈모증=176; 패치 원형 탈모증=302)
● 대조군: n=1053
도 9에는 원형 탈모증에서의 유전게놈 연관 연구 (Genomewide Association Study, GWAS)를 나타낸다.
위치 유전자 기능 최대 연관
(p 값)		 최대 오즈 비(odds ratio)
2q33.2 CTLA4 T 세포 증식 3.55 x 10-13 1.44
ICOS T 세포 증식 4.33 x 10-08 1.32
4q27 IL21/IL2 T-, B- 및 NK-세포 증식 4.27 x 10-08 1.34
6q25.1 ULBP6 NKG2D 활성화 리간드 4.49 x 10-19 1.65
ULBP3 NKG2D 활성화 리간드 4.43 x 10-17 1.52
9q31.1 STX17 조기성숙 모발 회백화 3.60 x 10-07 1.33
10p15.1 IL2RA (CD25) T 세포 증식 1.74 x 10-12 1.41
11q13 PRDX5 항산화제 효소 4.14 x 10-07 1.33
12q13 Eos (IKZF4) T 세포 증식 3.21 x 10-08 1.34
6p21.32 (HLA) ERBB3 상피 성장 인자 수용체 1.27 x 10-07 1.34
MICA NKG2D 활성화 리간드 1.19 x 10-07 1.44
NOTCH4 T 세포 분화 1.03 x 10-08 1.61
BTNL2 T 세포 증식 2.11 x 10-28 2.70
HLA-DRA 항원 제시 2.93 x 10-31 2.62
HLA-DQA1 항원 제시 3.60 x 10-17 2.15
HLA-DQA2 항원 제시 1.38 x 10-35 5.43
HLA-DQB2 항원 제시 1.73 x 10-13 1.60
HLA-DOB 항원 제시 2.07 x 10-08 1.72
표 2 : AA 관련 유전자 리스트
위치 유전자 최대 연관 최대 오즈비 그외 자가면역 질환에 관여
(p 값)
Figure pct00027
1형 당뇨병 (T1D), 류마티스 관절염 (RA), 셀리악 질환 (CeD), 다발 경화증 (MS), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 그레이브 질환 (GD), 건선 (PS), 전신성 백반증 (GV).
표 3 : 피부 자가면역 질환의 일반 유발 모델. http://www.genome.gov/gwastudies (for psoriasis) and Jin et al., 2010, NEJM, 362:1686-1697을 참조함
위치 유전자 최대 연관 최대 오즈비 그외 자가면역 질환에 관여
(p 값)
Figure pct00028
1형 당뇨병 (T1D), 류마티스 관절염 (RA), 셀리악 질환 (CeD), 다발 경화증 (MS), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 그레이브 질환 (GD), 건선 (PS), 전신성 백반증 (GV).
표 4 : 다른 피부 자가면역 질환의 일반 유발 모델. http://www.genome.gov/gwastudies (for psoriasis) and Jin et al., 2010, NEJM, 362:1686-1697을 참조함.
위치 유전자 기능 최대 연관
(p 값)		 최대 오즈 비(odds ratio)
2q33.2
Figure pct00029
 CTLA4 T 세포 증식 3.55 x 10-13 1.44
ICOS T 세포 증식 4.33 x 10-08 1.32
4q27
Figure pct00030
 IL21/IL2 T-, B- 및 NK-세포 증식 4.27 x 10-08 1.34
6q25.1
Figure pct00031

Figure pct00032
 ULBP6 NKG2D 활성화 리간드 4.49 x 10-19 1.65
ULBP3 NKG2D 활성화 리간드 4.43 x 10-17 1.52
9q31.1
Figure pct00033
Figure pct00034
 STX17 조기성숙 모발 회백화 3.60 x 10-07 1.33
10p15.1 IL2RA (CD25) T 세포 증식 1.74 x 10-12 1.41
11q13
Figure pct00036
Figure pct00037
 PRDX5 항산화제 효소 4.14 x 10-07 1.33
12q13
Figure pct00038
 Eos (IKZF4) T 세포 증식 3.21 x 10-08 1.34
6p21.32
Figure pct00039

(HLA)		 ERBB3 상피 성장 인자 수용체 1.27 x 10-07 1.34
MICA NKG2D 활성화 리간드 1.19 x 10-07 1.44
NOTCH4 T 세포 분화 1.03 x 10-08 1.61
C6orf10 1.45 x 10-16 2.36
BTNL2 T 세포 증식 2.11 x 10-28 2.70
HLA-DRA 항원 제시 2.93 x 10-31 2.62
HLA-DQA1 항원 제시 3.60 x 10-17 2.15
HLA-DQA2 항원 제시 1.38 x 10-35 5.43
HLA-DQB2 항원 제시 1.73 x 10-13 1.60
HLA-DOB 항원 제시 2.07 x 10-08 1.72
표 5 : AA 관련 유전자 리스트. 검정색 원은 NKG2D에 작용하는 유전자를 표시하며; 회색 원은 T 세포 조절에 작용하는 유전자를 표시하며; 블랙 별 표시는 말단 장기에 작용하는 유전자를 표시한다.
타겟 장기에서의 NK 리간드를 비롯하여, 다른 자가면역 질환에서의 공통 경로는 다음과 같다:
- RA에서, 활막 세포가 비정상적으로 MIC 리간드를 발현하여, 자가반응성 T 세포를 자극함.
- 셀리악 질환에서, MIC 리간드가 질환이 활동기일 때 장 상피에서 과다발현된다.
- 1형 당뇨병에서, 전-당뇨병 상태의 NOD 마우스의 섬 세포에서 RAE-1 리간드가 발현된다.
유전적으로 소양이 있는 개체에서의 NK 활성화 리간드의 비정상적인 발현은 질환을 유발 또는 악화시킬 수 있다.
새로운 치료 가능성을 보여주는 AA의 후보 경로들은 다음과 같다:
- 공동자극 수용체 패밀리에 속하는 구성원, 이는 T 세포 활성화에 보완적인 작용을 하며, 이의 밸런스는 면역 반응과 자가면역 반응의 전체적인 결과를 조절함.
- NK 세포독성 반응을 강화하며; T 세포가 전염증성 사이토카인을 생산하도록 촉발하며; CD4(+) T 세포의 Th17 세포로의 분화를 유발하는, 유전자들.
- 면역 관용성을 유지하는데 필수적인, 조절 T(Treg) 세포의 생존 및 증식을 조절함으로써, 후천적인 면역 시스템을 조절하는데 중요한 역할을 수행하는, 유전자들.
- 자연 살상 (NK) 세포, NK1.1 (+) T 세포 및 T 세포에서 발현되는 활성화 수용체들. NKG2D 리간드는 MHC 클래스 I 체인-관련 (MIC)A, MICB를 포함한다.
AA를 치료하기 위한 후보 화합물로는 Ivanenkov et al., Mini Rev Med Chem. 2011 Jan;11(1):55-78에 기술된 Jak/Stat 시그널링에 대한 화합물들을 포함하며, 상기 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
실시예 2
하기 유전자 연구들을 수행하였다:
- 다른 1000명의 AA 환자를 이용한 반복 실험 (replication study)
- 후보 영역들에 대한 심층 서열분석
- 10,000명의 환자 모집
- T1D, CeO 및 AA에 대한 공통 유전자 연구
NK 활성화 리간드를 이용한 면역 실험이 ULBP3, ULBP6 - 유도성 형질전환체, 신규 마우스 모델 - 을 이용하여 수행될 것이다.
Figure pct00040
표 6 : GWAS 실험에서 명목 유의성을 나타내는 유전자들
Figure pct00041
표 7 : 명목 유전자들의 경로 분석 (참조: http://david.abcc.ncifcrf.gov/)
실시예 3 - 실험 샘플, 유전자형, 품질 관리 및 인구 집단의 층별화
원형 탈모증 (AA)은 주된 의학적 과제로서, 미국에서 가장 유병율이 높은 자가면역 질환이며 (표 8), 여성 및 남성을 비롯한 모든 인종을 포함하여 대략 460만명의 사람들에서 발병하고 있으며, 평생 위험도는 1.7%이다 (Kyriakis KP, Paltatzidou K, Kosma E, Sofouri E, Tadros A, Rachioti E. Alopecia areata prevalence by gender and age. J Eur Acad Dermatol Venereol. 23:572-3, 2009). 아울러, AA는 안드로겐성 탈모증에 이어 2번째로 높은 인간의 탈모증 형태이며, 질환에 걸린 개체에게 상당한 외양적 손상과 심리적 고통을 유발한다 (도 1). AA는 홍반성 루푸스 (LE), 1형 당뇨병 (T1D), 건선, 다발 경화증 (MS) 및 류마티스 관절염 (RA) 등의 대부분의 다른 자가면역 질환들이 조합된 형태 인 것에 반해, 보다 개별적으로 발병한다 (표 8).
표 8 . 자가면역 질환의 유병율
자가면역 질환 건수/ 100,000
원형 탈모증 1700
건선 696-1527
류마티스 관절염 310-800
1형 당뇨병 227-355
다발성 경화증 177-358
전신 홍반성 루푸스 34-150
이들 다른 병태들과는 완전히 대조적으로, AA의 병인 연구와 획기적인 치료법의 개발은 훨씬 뒤쳐져 있다. 그 이유는, AA가 주로 미용적 장애라는 인식이 일부 원인일 수 있다. 실제, AA는 어떠한 피부 질환들 중에서도, 특히 자신의 이미지를 외양과 밀접하게 연결시키는 어린이 및 청소년들에게, 큰 부담이 되는 질환들 중 하나이다 (Bickers DR, Lim HW, Margolis D, Weinstock MA, Goodman C, Faulkner E, Gould C, Gemmen E, Dall T; American Academy of Dermatology Association; Society for Investigative Dermatology. The burden of skin diseases: 2004 a joint project of the American Academy of Dermatology Association and the Society for Investigative Dermatology. J Am Acad Dermatol. 55:490-5, 2006).
이의 높은 유병률에도 불구하고, AA에 대해 입증된 치료법은 없는 실정이다. 총 540명의 참가자가 동원된 17차 무작위 임상 실험(RCT)에서, 포괄적인 코크란 분석 결과, AA에 대한 입증된 치료제는 발견되지 않았다 (Delamere FM, Sladden MM, Dobbins HM, Leonardi-Bee J. Interventions for alopecia areata. Cochrane Database Syst Rev. 2:CD004413, 2008). 각 실험에서는 참가자 6명 내지 85명이 동원되었고, 국소 및 경구 코르티코스테로이드, 국소 사이클로스포린, 포토다이나믹 테라피 및 국소 미녹시딜이 포함된 다양한 개입 물질들이 평가되었다. 종합적으로, 개입 물질들 중 어느 것도 위약과 비교하였을 때 모발 생장 측면에서 유의한 치료 효과를 나타내지 않았다. (있다 하더라도) 몇가지 AA 치료제만 유효한 것으로 입증되었다. 디펜시프론(diphencyprone), 디니트로클로로벤젠, 병변내 코르티코스테로이드 또는 디트라놀(dithranol)은 AA 치료제로서 흔히 사용되고 있지만, 이들 약물의 사용에 대한 RCT는 없었다. 마찬가지로, 국소 코르티코스테롤 및 미녹시딜이 널리 처방되고 있으며 안전한 것으로 보이지만, 이 약물이 장기간 유용하다는 확신한 증거는 없다. 대부분의 실험들에서 불량한 것으로 보고되어 있거나, 및/또는 그 수가 적어 어떠한 주요한 임상적인 효과에 대한 결론에 도달하지 못하였다. 이러한 점들은 AA의 유전학적 근간을 규명하고, 이의 병인을 확정하는 것이 중요함을 강조하는데, 이로써 합리적인 치료학적 방식을 개발할 수 있으며, 중개 연구(translational research)를 시작할 수 있다.
원형 탈모증에서 Jak/Stat 타겟팅에 대한 전임상 평가
NKG2D 수용체 (NKG2D)는, 위험 신호를 발산하는 세포를 제거하는 기능을 수행하며, 이러한 인지 과정이 규제를 벗어나게 되면 자가면역성이 대게 발현되도록 유도된다. JAK 및 NF-kb 저해 효과를 이론에 결부시키지 않고 추적하고자 하며, NKG2DL 발현을 전사 수준에서 저해시키고자 한다. INCB18424, JAK1/JAK2 저해제 (po/topical)는 골수증식성/골수섬유증 질환 및 건선에 대해 2상 임상 실험 중에 있다.
표 9 : Jak1/Jak2의 소분자 저해제
소분자
JAK1/JAK2 저해제 (INCB18424) PTKi: ATP-결합 크레프트 경쟁 길항제 인터페론 시그널링 국소 II 상 / 건선
GWAS 연구를 통해, 류마티스 관절염 (RA), 1형 당뇨병 (T1D), 셀리악 질환 (CeD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발 경화증 (MS) 및 건선 (PS)과 같은 다른 형태의 자가면역 질환들과 공유되는 다수의 위험 유전자 좌, 특히 CTLA-4, IL2/IL2RA, IL21 및 Treg 유지에 중요한 유전자들이 밝혀졌다.
AA의 유전학적 토대는 AA의 근본 기전을 토대로 치료제를 개발하는 수단을 제공해준다. 이러한 치료법은 T 세포 서브세트와 다른 형태의 자가면역 질환들에서 공통된 기전 뿐만 아니라 Jak1/Jak2 시그널링 경로와 하류 작동자(effector)들이 참여하는 고유 기전에 초점을 맞춘다.
AA에서 자가면역의 오리진은 모낭 자체에 존재한다. 본원의 연구들은 AA 발병에 기여하는 모낭에서 추정의 위험 신호를 규명하는데 집중하여 이루어진다. AA 발병을 일으키는 면역 탈규제에 기여할 수 있는, MHC에 존재하는 병원성 대립 유전자들도 규명하고자 한다. 그 이유는 면역 시스템에 네오항원으로서 위험 신호를 제시함에 있어 항원-제시 세포 (APC)의 중요성이 일부 원인일 수 있기 때문이다.
Jak1/Jak2 시그널링 기전을 조사할 것이며, 질병 유도의 견인자로서 Jak1/Jak2/Stat1/Stat2 상호작용의 중요성을 평가할 것이다. Jak1/Jak2/Stat1/Stat2 시그널링을 차단하는 약리학적 방식도 조사할 것이다.
C3H IFN-γ 결함 마우스는 AA 발병으로부터 예방된다. IFN은 배양한 인간 진피 각질형성세포와 섬유모세포에서 NKG2DL을 상향 조절할 수 있는 것으로 보여진다. 아울러, NKG2D-교차-연결(cross-linking)은 선천적인 NT, NKT 및 γδ T 세포에 의해 IFN-γ 생산을 유도하며, 따라서 잠재적인 파지티브 피드백 고리가 형성되고, 후천적인 자기반응성 면역성이 유도된다. 이에, 양자 전이(adoptive transfer) 및 항체 고갈/차단 실험을 통해 참여하는 NKG2D를 가지고 있는 세포를 규명하고자 한다.
CD8 NKG2D 축을 차단할 목적으로 약리학적 개입을 조사하고자 한다. NKG2DL의 상향 조절 또는 NKG2D-보유 세포의 활성화를 이용한 간섭은, 추구하고자 하는 합리적인 2가지 방식이다. IFN -> JAK/STAT 경로가 NKG2DL 발현을 유도할 수 있는 것으로 확인되었다.
IFN -> JAK/STAT 경로가 정상 및 질환이 발병된 피부에서의 NKG2DL의 유도에 중요한 것인지를 조사하고자 한다. IFN JAK/STAT 시그널링 경로는, 건선에 대해 일찍이 임상적으로 성공을 거둔 제제를 비롯하여, 국소 JAK1/JAK2 저해제를 이용하여 효과적으로 저해할 수 있다. I형 인터페론 반응이 NKG2D 리간드의 상향 조절에 토대가 된다면, JAK1/JAK2 저해제는 이러한 유도를 차단할 수 있을 뿐만 아니라 후천적인 면역 반응의 IFN-γ 의존적인 요소들도 차단할 수 있다.
참조문헌
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실시예 4
원형 탈모증 (AA)의 근간이 되는 특이적인 면역반응 기전은 해명되지 않았으며, 따라서 AA에 대한 임상 평가도 다른 자가면역 질환들에 비해 역사적으로 뒷쳐져 있다. 자가면역성에 대한 임상 평가에 사용가능한 새로운 생바이오치료제들이 다수 존재함에도 불구하고, 병변내 또는 전신 스테로이드 요법이 여전히 표준 치료법으로 존재하며, 지난 10년간 겨우 2번의 소규모의 무작위 임상 실험이 공개된 바 있다. GWAS 유전자의 발견을 통해 얻은 식견은, 기계론적 및 치료학적 적절성에 대한 GWAS-동정된 면역학적 양쪽 경로들을 조사함으로써, 이러한 갭을 극복하는데 지침을 제공한다.
원형 탈모증 마우스 모델에서 효과적이고, 임상적으로 적합한 치료법의 동정 . 모낭 (HF)은 정상 상태에서는 면역 특권을 부여받은 (IP) 성지로서, 고전적인 HLA 클래스 I 분자들을 거의 또는 전혀 발현하지 않는다. 활성형 AA에서는, HLA 클래스 I과 NKG2D 리간드의 발현이 현저하게 상향조절되어, IP 상태를 상실하게 된다. 인간 AA와 NKG2D 리간드 유전자 좌의 강력한 유전학적 연관성을 감안하면, 이론으로 결부시키지 않으면서, 면역 작동자 세포 상에서의 비정상적인 NKG2D 상향조절과 지속적인 NKG2DL 활성화가 염증성 AA 개시와 진행을 견인한다. 이론으로 결부되지 않으나, AA에서는, 셀리악 질환에서와 같이, IL-15가 무차별적인 "NK-타입"의 CD8 세포독성을 구현할 수 있는 CD8 T 세포 작동자의 분화를 지시할 수 있다. 실제, 국소 HF IL-15/NKG2DL 염증 신호는, IFNγ 생산 및 HF 세포독성을 담당하는 중요한 AA 면역 작동자인 것으로 보이는, NK 마커를 발현하는 CD8+ T 세포의 밀집된 침윤물을 수반한다. 인간과 마우스에서 행해진 이러한 종합적인 관찰 결과들은 치료학적 평가가 이루어질 수 있도록 촉구한다.
NK-유사 재프로그래밍을 차단하는 치료학적 잠재성과 관련 사이토카인(IFN-γ) 및 관련 면역수용체 시그널링 경로 (NKG2D)를 이용한 간섭에 의한 세포독성. 이식된 모든 C3H 마우스에서 AA가 12주 이내에 시기 조절된 방식으로 발병하는 탈모증 이식 모델을 사용한다. C3H/HeJ에서 자발적인 질환에 대한 예방/회복 평가에서 비현실적인 늦은 개시 (6월령 이후) 및 낮은 누적 발병율 (15%)을 감안하면, 이 모델은 약물 스크리닝 기간을 상당히 단축시킨다. 잠재적인 국소 전달 이점을 가지고 있는 소분자 접근 방식과, 우수한 생물학적 특이성을 가진 바이오치료 단백질 (항체) 둘다를 조사한다. 가장 주된 목표는 바이오치료제를 사용하여 임상적으로 보다 지속가능한 소분자의 국소 방식에 의해 타겟팅할 수 있는 결정적인 면역 경로를 확립하는 것이다.
질환 관련 AA 바이오마커의 동정 및 C3H 마우스에서 효과적인 치료법을 이용한 질환 회복. GWAS 및 전사 프로파일링을 이용한 방식, 예컨대 아울러 면역염색(immunostain) 및 T 세포 서브세트의 FAC를 이용한 방식은, 예컨대 AA 마우스의 피부 및 혈액에서 몇가지 병리학적 AA 바이오마커들을 동정하기 위해 취해지고 있다. 이들 마우스 실험은 인간 AA에서 바이오마커 중개 플랫폼(translational biomarker platform)에 대한 개발 정보를 계속적으로 제공해 줄 것이다. 탈모증 C3H/Hej 마우스 실험에서, 피부에서, HF-조합된 IFN-γ-생산성 CXCR3+ NKG2D를 가진 CD8 T 작동자의 밀집된 형태의 침윤이 이루어지도록 담당하는 것으로 보이는 케모카인 CXCL9-11을 비롯하여, IFN-유도성 유전자들이 급격하게 상향조절된다는 것이 확인되었다. 스펙트라타입 데이타는 이들 순환성 NKG2D+ CD8 T 작동자들이 질환 진행에 따라 증가하는 선의의 자가항원-유발성(driven) 작동자 T 세포라는 놀랄만한 증거를 제공한다. 치료하는 동안, 마우스에서 이들 혈청학적, 피부의 및 세포성 바이오마커들에 대한 시간적 평가를 통해, 치료학적 성과를 예측하고 임상적인 바이오마커의 발굴/이용에 대한 정보를 제공하는, 다이나믹하고, 기계론적으로 중요한, 예지적인 염증 바이오마커들을 동정할 수 있을 것이다.
AA 인간 조직을 생체외로 이용하는 타겟화된 방식에 대한 전임상 검증.
AA 마우스 모델에서 "개념 증명"을 입증하는 임상적인 치료제 개발을 진척시키기 위해, 인간 AA 조직을 타겟 검증 및 상관성 연구에 사용한다. "크룰-아웃" 시스템은 마우스 AA에서 인간으로의 중개를 반대로 뒤집어, 효과적으로 인간 AA T 세포 생존/확장/기능을 저해하는 물질을 검증하기 위한 편리한 생체외 인간 바이오분석을 제공할 것이다.
수천명의 탈모증 개체로부터 수득한 인간 DNA가 인간 질환에 대한 고유한 식견과 GWAS 유전자를 제공하는 바와 같이, AA 개체 유래의 인간 조직, 혈액 및 피부도 궁극적으로 치료학적 활용을 위한 유전학적으로 연루된 면역 경로들에 대한 정보를 얻기 위해 계속적으로 사용될 것이다. 개념상, 이러한 인간 연구를 위한 마우스 원형 탈모증 모델은 원형 탈모증에 대한 치료학적 접근 방식을 테스트하는 전임상 토대를 제공한다.
자가면역 질환은 미국에서 2,300만명이 앓고 있는 것으로 추산되고 있으며 (1), AA의 유병률은 확정되지 않았지만 가장 많은 자가면역질환들 중 하나 이다(2, 3). 1999-2000년도에, AA로 인해 240만명이 병원을 방문한 것으로 추산되며, 이중 환자의 절반이 20대에서 30대였다. AA는 발병된 개체에게 상당한 외양 손상과 심리학적인 고통을 주며, 어떠한 피부 질환들 중에서도, 특히 자신의 이미지를 외모와 매우 밀접하게 연결시키는 어린이 및 청소년들에서 가장 큰 부담을 준다. (4). 현재, AA 예후는 예측불가하며, 확실한 치료법은 없는 실정이다. 현행 치료는 스테로이드 및 국소 면역 치료를 포함하고 있으며, 환자의 1/3만 영구적으로 회복시킨다 (5, 6). 이 질환의 높은 유병률에도 불구하고, 통합적인 코크란 분석 평가에서는 AA에 대한 근거-기반 치료법은 없는 것으로 결론내려졌다 (7).
다른 자가면역성 병태들과는 완전히 대조적으로, AA의 병인 연구와 획기적인 치료법에 대한 개발은 훨씬 뒤쳐져 있다. 타겟화된 면역학적 치료 시대에, AA에 대한 단백질 바이오치료제를 평가하는 임상 실험은 단지 2가지가 보고되어 있을 뿐이다 (8, 9) (둘다 T 세포 이동을 타겟팅함). 부분적으로, 그 이유는 합리적인 치료 방식에 대한 평가를 실행할 수 있는 특이적인 AA 면역 경로들에 대한 제한된 이해가 원인이었다. AA의 유전학적 및 병리학적 토대에 대한 새로운 이해를 기반으로, 이 질환의 합리적인 치료 방식에 대한 임상적인 평가를 실행할 수 있는 전임상 개념 증거 데이타가 수득될 것이다.
GWAS (10) 연구를 통해, 류마티스 관절염 (RA), 1형 당뇨병 (T1D), 셀리악 질환 (CeD), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 다발 경화증 (MS) 및 건선 (PS)과 같은 다른 형태의 자가면역 질환과 공유되는 다수의 위험 유전자 좌, 특히 CTLA-4, IL2/IL2RA, IL21 및 Treg 유지에 중요한 유전자 (Eos)들이 밝혀졌다. RA, T1D, 및 CeD와의 유전적 공통성은, 특히 말단 기간 (활막, 섬, 장 및 피부)에서 NK 리간드의 발현 및 이들 3가지 질환 각각의 발병에서의 NKG2DL/NKG2D 경로의 관여에 대한 발병학적 중요성 측면에서 특히 주목할만하다 (11, 14). 피부에서의 면역치료학적 연구가 가진 한가지 이점은 타겟 장기의 입수가 상대적으로 용이하다는 점이다. 따라서, 본원의 피부를 이용한 연구들에서는, 타겟 장기에 접근하기 쉽지 않은 다른 관련 인간 질환들에 대한 이해에도 영향을 미치는, NKG2D 및 IL-15에 의해 촉발되는 CD8 세포독성, IFN-촉발성 손상 등에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있다. 공통 요인을 공유한 이들 자가면역 질환들 중 임의 한가지 질환에서의 실제 긍정적인 연구들은 공통 치료법의 토대로서 이용할 수 있다.
AA의 바탕이 되는 특이적인 자가면역 기전들은, T 세포 매개 모낭 공격의 결과라는 일반적인 관점을 벗어나지 못하고, 미지로 남아있다. 모낭은 정상 상태에서는 면역 특권을 부여받은 (IP) 성지로서 (15-17), 고전적인 HLA 클래스 I 분자들을 거의 또는 전혀 발현하지 않으며, 대신 저해성 HLA 리간드인 HLA-E와 HLA-G를 발현하며, 따라서 "잃어버린 자신"과 반응할지도 모르는 NK 세포를 네거티브로 조절하면서, 클래스 I으로 제한된 CD8 세포에 의한 면역 인지를 동시에 피한다 (16, 18-21). 활성형 AA에서는, HLA 클래스 I의 발현이 현저하게 상향조절되어, IP 상태를 상실하게 된다. 이전 연구들을 통해, CD4 및 CD8 T 세포가 마우스 및 인간에서 피부의 탈모 부위내 모낭 주변으로 침윤하는 것으로 확인되었다 (22, 23). 실제, B 세포 또는 혈청이 아닌 전체 T 세포의 이동은, 탈모증 마우스 또는 인간으로부터 정상 WT (24) 또는 SCID 마우스 (25)로 질환을 전달할 수 있으며, 작동자 T 세포가 발병 세포로서 관련되어 있다. 그러나, 부위 특이적인 염증의 분자 매개체는 아직까지 동정되지 않았다. GWAS 결과와 이전의 면역생물학적 실험에 따라, 이들 AA 환자의 충족되지 않은 요구를 만족시키는 혁신적이고, 합리적으로 타겟화된 치료법의 개발을 이룰 수 있는, 공통 자가면역 질환에 대한 새로운 인식이 제공될 것이다.
GWAS 연구를 통해 동정된 AA 면역학적 경로. 원형 탈모증과 가장 유의성이 높은 곳으로 발견된 유전자 좌는 표 10에 나타낸다: (회색 영역은 "명목 유의(nominally significant)" 유전자임). 이러한 획기적인 연구는 개별 인구 집단에서 확증적인 실험으로 검증되었다. 밑줄 표시된 유전자들은 HF 발현 유전자이고, 굵은 글씨체의 유전자는 면역 세포에서 발현되는 유전자들이다. 전반적으로, 다수의 추정되는 유전자 좌들이 다른 조직-특이 자가면역 상태들과 공유되어 있었으며, 1형 당뇨병과 가장 많이 중복되었다 (우측 세로열). NKG2D는 이들 3가지 질환 각각의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어, RA, T1D 및 CeD와의 공유성에 가장 주목한다 (11-14). 따라서, 이들 질환/모델 시스템들 중 어느 한가지에 대한 식견은 복수의 자가면역 질환들에서 공유되는 공통 발병 경로를 해명하는데 도움이 될 수 있다. 가장 중요한 것으로 동정된 (HLA 이외의) 대립유전자는 NKG2D 리간드 4종 (UBLP-3/UBLP-6/MICA/MICB, 굵은 이탤릭체로 표시)과 저해 리간드 1종 (HLA-G)이었다. NKG2D 수용체 (NKG2D)는 위험 신호를 분비하는 세포를 제거하는 기능을 하며, 이러한 조절 과정이 규제를 벗어나게 되면 자가면역의 발현으로 대게 이어진다 (26). 위험에 기여하는 그외 HF에서 발현되는 유전자로는 HLA, 항원 가공 유전자 (TAP) 및 PRDX/STX17이 있다.
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표 10 : AA와 관련있는 유전자 좌.
활성화된 NKG2D-보유 CD8 작동자에 의한 IFN-γ 생산은 면역 특권을 상실시키고, 염증 고리를 영속시킬 수 있다.
IFN-γ 관련 경로는 임상 실험 중인 기존 치료제로 손상시켜, 중개로 이어지는 길을 진척시킬 수 있다. 과거 10년간, 단백질 티로신 키나제의 소분자 저해제 (PTKi) 수종이 경구 및 국소 전달 용도로 임상적으로 성공적으로 개발되었다. PTKi 방식은 AA에서 CD8 매개 염증 반응을 차단하고자 하는 것이며, 즉, CD8 작동자 사이토카인 IFN-γ의 하류 사이토카인 반응성을 담당하는 JAK/STAT 시그널링을 저해하고자 하는 것이었다.
탈모증 마우스에서 작동자 T 세포 반응을 타겟으로 하는 임상적으로 적합한 치료법의 동정
AA 피부 유래 전체 세포 집단들에 대한 면역염색 및 유세포 분석을 이용하여, CD8+NKG2D+ T 세포가 모낭에 침윤하며 (도 17), 정상 피부가 아닌 AA에서 증폭됨을 확인하였다 (도 18 및 도 4A). 아울러, AA 마우스는 부분적으로는 AA 피부 림프절과 혈액 둘다에서, CD8+NKG2D+ 집단의 급격한 전신 증폭으로 인해, 피부 림프선 장애를 나타내었으며, 전체 LN 세포들 중 적어도 6+/-1%가 총 PBMC의 2.4+/-1.3%이며, 이들 각각은 정상 C3H 마우스에서의 관찰 결과의 10배 이상이다. 이들 CD8+NKG2D+ T 세포는 HF 진피 시트 세포에 대해 잠재적으로 세포독성을 나타낸다 (도 21). 아울러, CD8+NKG2D+ T 세포의 면역표현형 분석을 통해, 이 집단이 T 기억 마커 CD44+와 DX5, NKG2A/C/E, 및 NKp46 등의 복수의 "NK 마커들"을 발현하는 것으로 확인되었다 (도 19).
순환성 CD8+NKG2D+ 집단이 이론으로 결부되지 않지만 진실된 "AA-특이적인 "작동자 집단임을 보여주는 증거로서, 림프절에서 발견되는 CD8+ NKG2D+ T 세포가, 침윤성 AA 피부에서 발견되는 총 T 세포와 유사한 TCR 레파토리를 발현할 수 있다. 도 20은 CD8+NKG2D- 림프절 집단에서 무제한적인 다클론성 T 세포 집단을 표시하는 패턴인 정상적인 CDR 길이 분포를 나타냄을 보여준다. 이와는 대조적으로, 피부 T 세포의 TCR 레파토리는, 항원-유발성 T 세포의 올리고클론 집단을 표시하는 CDR 길이의 수가 적은 것이 지배적인, 거의 모든 Vβ 패밀리 멤버로 제한된다. 피부 림프절 세포 유래 CD8+NKG2D+ T 세포는 역시 매우 제한적이며, 총 피부 T 세포와 매우 유사한 패턴을 나타내었다.
이러한 데이타는, CD8+NKG2D+ T 세포가 피부에서 발견되는 올리고클론성 T 세포 집단 대부분을 포함한다는 것을 검증해준다. 아울러, 피부 및 림프절에서의 공통 올리고클론성 T 세포 발현에 대한 증거는, 이들 LN 집단들 (또는 심지어 마커들)이 염증 현상에 대한 반응 과정으로서 증폭/활성화될 가능성에 반대되는 결론을 보여준다. 예를 들어, Treg 세포 (CD4+CD25+FoxP3+)는 AA 림프절에서 수적으로 증가지만, 이의 스펙트라타입이 다양하고 피부에 존재하는 것과는 다르므로, 이는 틀림없이 반응 과정이다. 일부 TCR/클론들, 예컨대 Vβ10이 배액성 피부 림프절이 아닌 피부에서 발견된다는 점에 유념한다. 이러한 것으로는, 분류한 CD8+ LN 분획에는 존재하지 않지만 AA 피부에서 발견되는, CD4+ T 세포 집단이 포함될 것이다. 이들 데이타는, CD8+NKG2D+ T 세포가 마우스 AA에서 병을 유발하는 NKG2D+ 작동자임을 확인해주며, 인간 AA에 대해 일치되는 마우스 모델이 확립되었다.
생체내 치료학적 접근 방식에 대한 개념 증거를 확립하기 위한 전임상 AA 모델
C3H/HeJ 피부 이식 모델: 원형 탈모증에 대한 C3H/HeJ 마우스 모델은 1994년에 최초로 보고되었다 (29, 30, 31). 원형 탈모증에 대한 다른 마우스 모델들도 확립되었지만 (32), 상기 모델이 오늘날 현장에서 가장 많이 연구되고 사용되고 있다. 수년간 이 모델을 이용한 다양한 약물 실험을 행해져 (33), 다양한 프로토콜들이 최적화되어 있다 (34).
탈모증 C3H/HeJ 마우스로부터 2-3월령의 질환에 걸리지 않은 C3H/HeJ 암컷 마우스로 전층 피부를 이식한 결과, 모든 수여체들에서 이식 10주이내에 패치형의 탈모증이 나타났으며, 20주째에는 전신성 탈모증으로 진행되었다. 조직병리학자의 전통적인 훈련에 기반하여 다양한 종합적이고 효율적인 조직 평점 체계를 적용하였으며, 이때 설명에 사용된 형용사 (적상, 0; 경도, 1; 중등도, 2; 중증도, 3; 및 최강, 4)를 관계형 데이타베이스에 입력하기 위한 수치 값으로 변환한다 (Mouse Disease Information System [또는 MoDIS]: http://research.jax.org/faculty/sundberg/registration.php) (35, 36). 이 데이타베이스는 엑셀을 통해 통계 분석 또는 기타 소프트웨어 프로그램에 입력하기 위한 내보내기가 가능하다. 원형 탈모증은 중증도, 염증 세포의 위치, 염증 세포의 타입과 상대적인 갯수 (과립구, 비만 세포, 림프구), 여포 이상증(follicular dystrophy) 등에 따라 등급을 매긴다. 분자 RNA 및 단백질 바이오마커를 이 패널에 통합하고, 이러한 다중 가변성 데이타베이스의 생성과 분석을 행한다.
프로토콜 #1: 예방 설정으로, 수여체 마우스는 이식 후 첫 1주일째에 치료를 개시한다.
프로토콜 #2: 치료를 위해, 초기 확립된 AA를 앓고 있는 이식 마우스는 AA 진행을 반전시키기리 위해 치료한다.
제제는 예방 모델에서 먼저 조사한다. 그런 후, AA를 성공적으로 예방하는 제제를 대상으로 확립된 질환 상태에서 이차적인 평가를 위해 앞으로 진행하며, 1차 테스트에서 실패한 것은 폐기하고, 다른 혁신적인 방식들을 도입할 수 있게 한다. 하기 내용은, 전임상 평가를 위해 선정된, 특이적인 생물제 및 소분자 둘다에 대한 최초 치료학적 접근법이다.
T 작동자 반응에 참여하는 활성화 경로를 타겟팅하는 소분자 JAK 단백질 티로신 키나제 저해제 (PTKi)를 테스트하고자 한다. 이들 PTKi는 이미 III 상 임상 실험 중에 있으며, "NK-타입" T 세포-타겟화된 국소제의 중개와 잠재적인 임상 개발이 용이하다.
소분자 PTKi 개입을 이용한 치료학적 개입
국소 전달은 전신 노출 및 독성을 제한하는데 확실한 이점이 있다. 전임상 연구와 임상 연구에서, 크림 형태의 소분자 PTKi 전달로 피부 장벽을 극복하여, 진피에서 유효한 국소 농도를 달성할 수 있으며, 전신 노출을 제한하는 것으로 입증된 바 있다 (78). AA에서 작동자 T 반응에 결정적인 중요한 PTK, 즉, 사이토카인 IFNγ를 타겟팅하고자 한다.
Jak1/2 저해제를 이용한 IFN의 타겟팅: 인터페론은, HF 면역 특권 상실 및 세포성 염증 반응 유도를 비롯하여, 염증 반응에서, 몇몇 단계에서 참여할 가능성이 있으므로, AA에서 매력적인 치료학적 타겟이 된다. 인터페론은 NKG2DL, 부착 분자 (예, ICAM-1), 항원 가공/제시 (TAP1/2, LMP, 프로테오좀, MHC I 및 II) 등의, 모낭 말단 기관에서 수개의 관련 전-염증성 분자들을 상향조절하며, 면역 작동자 반응을 도출한다 (Th1-타입의 반응 증가, DC 활성화 및 IFN-γ-매개 세포독성). AA의 C3H-HeJ 마우스 모델에서, IFN-γ가 발병에 필ㅅ적이며 (89, 90), 인터페론-γ의 투여가 질환을 가속화하였다 (91). 중요한 점은, IFN-γ에 대한 중화 항체 투여시, C3H-HeJ 마우스에서 AA 발병이 반전된다는 것이다 (92, 93). 이처럼, 인간에서, 몇가지 시리즈에서 타입 I 인터페론 치료법의 부작용으로서 원형 탈모증이 언급된 바 있으며 (94 - 104), 인간 AA 피부의 전사 프로파일에서, 병변 바이옵시에서의 타입 I의 IFN 반응 (105)과, 말초혈에서의 Th1 편향성(skewing) 및 IFN-반응 사이토카인 /케모카인의 상승이 확인되었으며 (도 22, 23) (106-110), 문헌 (111)에 리뷰되어 있다. AA 피부 바이옵시 외식편 유래 T 세포는 균일하게 CD8+NKG2D+ 세포였으며, 자극되었을 때, IL-4 또는 IL-17이 아닌 IFN-γ를 생산하였다 (도 21A). 이와는 완전히 반대로, 정상 피부 외식편으로부터 수득한 T 세포 대부분은 CD4+이다 (112, 113). 이 상황은 AA 마우스에서도 마찬가지이며, IFN-γ를 생산하는 CD8 T 세포가 피부 림프절에서 증폭되었다 (도 19, 21). 피부에서, 병변 대 비-병변 C3H 피부로부터 분리한 총 피부의 전사 프로파일링 실험을 통해, 조절되지 않은 유전자 상위 20개 중 17개가 인터페론 반응성 유전자라는 지배적인 시그니처로서 인터페론 반응이 확인되었다 (도 22). 실제, IFN은 모낭 타겟 상에서 NKG2DL 발현을 상향 조절하여, IFN-매개 발병 서클(pathogenic circle)을 끝내며, CD8 작동자에 의해 만들어지는 IFN-γ가 CD8+NKG2D+ 활성화를 유도하는 HF NKG2D 리간드를 도출한다.
JAK1/2 임상 저해제: 차단 항체 (114, 115) 및 소분자 PTKi 둘다 자가면역에서 IFN 반응을 타겟팅하는 것으로, 임상 개발 중에 있다. IFN 유발성 STAT1/2 활성화는 Jak1/Jak2/Tyk 키나제에 의해 매개되며, RA 및 건선 등의 몇몇 자가면역 질환에서 경구 Jak1/Jak2 PTKi를 이용한 임상 데이타가 입수되었다. 국소 치료법은 전신 면역억제 가능성을 제한하는 개선된 치료학적 지표를 제공하는 추가적인 이점을 가지고 있다. INCB018424는 Jak1과 Jak2를 저해하며 (IC50 = 1 nM), 현재 임상 조사 중인 유일한 국소 JAK 저해제 (78)이며, 지금까지 안전성 프로파일은 허용가능한 수준이다. 경구-전달을 이용한 개념 증명은 Jak-의존형 질환 (골수섬유증) (116)과 국소 사이토카인 생산에 의해 발생되는 피부 질환 (건선 모델)에서 입증된 바 있다. 건선 개체에서, 국소 INCB018424는 신속한 임상 반응을 유도하였으며, 피부 Th1/Th17 사이토카인 반응의 정상화를 유도하였다 (미공개 데이타, clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00820950). 종합하면, 국소 INCB018424는 IFN-시그니처가 우세한 염증 상태인 원형 탈모증에 효과가 있는 것으로 예측되는 안전한 개입제이다.
방식: 프로토콜 #1: INCB018424의 전신 전달: 매일 2회 (90mg/kg) 경구 위관 영양으로 투여하였을 때 설치류에서 t1/2 반감기가 3-6시간인 것을 감안하면, 양호한 전신 노출성을 제공한다. 이러한 방식으로, 본 발명자들은 JAK1/2가 AA 진행을 예방하는지를 평가할 수 있다.
프로토콜 #2: INCB018424의 국소 전달 (1.5%): 국소 JAK1/JAK2 저해제에 의한 패치형 AA의 회복. 매일 국소 처리 (78)는 이식 후 6-10주에 나타나기 시작하는 이식된 마우스에서의 신규 발병된 패치 영역에 대해 시작한다. 국소 처리는 그루밍(grooming), 리킹(licking) 등으로부터 전신 노출을 방지하기 위해 적절하게 붕대를 감아 마우스의 특정 피부 영역으로 한정할 수 있다. 중요한 점은, 발병된 영역에 처리함으로써, 국소 노출이 AA 진행을 치료할 수 있는지에 대한 임상적으로 관련된 의문을 해명할 수 있다는 것이다.
임상 연구에 대한 정보를 제공하는 AA 질환 활성의 뮤라인 바이오마커의 동정
이들 전임상 염구들에서의 치료 성과가 덧붙여진 면역학적 현상들에 대한 동정은, 제시된 작동 기전을 검증하고 AA 환자에서 이들 동일한 치료제에 대한 잠재적인 임상적인 평가를 알려주게 될 유용한 바이오마커를 제공하는데, 중요하다. 임상 평가에서, 생검체는 혈액과 피부 샘플로 제한될 것이지만, 이들 부위에서 일찍이 샘플링한 마우스 바이오마커에 집중될 것이다. GWAS 및 전사 프로파일링을 이용한 방식, 예컨대 아울러 면역염색 및 T 세포 서브세트의 FAC를 이용한 방식을 취하여, 예컨대 AA 마우스의 피부와 혈액에서 수개의 질병 관련 바이오마커를 동정하였다. 탈모증 C3H/HeJ 마우스에서의 연구를 통해 IFN-유발성 유전자 등의 AA에서 상향조절되는 몇가지 피부 바이오마커들이 이미 동정되어 있다 (도 22). 스펙트라타입 데이타 (도 20)는, 이들 순환성 NKG2D+ CD8 T 작동자들이 선의의 자가항원-유발성(driven) 작동자 T 세포라는 놀랄만한 증거를 제공한다. 치료제를 처리 또는 처리하지 않은 마우스에서의 이들 혈청학적, 피부의 및 세포성 바이오마커들에 대한 시간적 평가로, 치료학적 성과를 예측하고 임상적인 바이오마커의 발굴/이용에 대한 정보를 제공하는, 다이나믹하고, 기계론적으로 중요한, 예지적인 염증 바이오마커들을 동정할 수 있을 것이다.
AA에서 순환성 면역 작동자의 세포성 바이오마커들: "NK-타입"의 CD8 T 세포는 AA 마우스에서 피부, 혈액 및 림프절에서 증폭되며, 발병을 조사하는데 유용한 도구이다. 아울러, 세포의 서브세트는 인간 질환과의 연관성을 직접 표시한다.
스펙트라타입-기반의 면역모니터링: NK-타입의 CD8 T 세포가 전혈 50 ㎕에 대한 유세포 측정을 통해 AA 마우스의 순환계에서 동정된다 (도 18). CD8+NKG2D+ 로 분류된 T 세포 서브세트의 총 수와 스펙트라타입은, 단일 마우스에서 전파되는 클론성 우성/에피토프의 발생을 모니터링하기 위해, 이식한 후 3주 마다 평가한다. 스펙트라타입의 분석을 이용하여, CD8+NKG2D+ T 세포의 면역표현형 감소가 순환하는 탈모성 T 세포 클론의 처리제로 인한 소거가 원인인지를 검증한다. 비-침습적인 면역모니터링 방식을 적용하여 모든 치료제에 대해 마우스를 추적한다. 예를 들어, JAK1/2 저해제 INCB018424를 이용한 3주간의 처리는 하지 않았다. 이론으로 결부되진 않지만, JAK1/2 저해제가, 타겟 조직에서 T 세포 유발성 작동자 사이토카인 (IFN-γ, IL-17)의 하류 염증 결과를 무효화시킬 것으로 예상된다.
혈청에서의 면역 "프로테오믹" 시그니처: 혈청내 사이토카인과 케모카인은 타겟 장기의 염증 상태를 반영한다. 인간 관련 데이타에서, 질환 활성과 관련있는 몇가지 사이토카인들과 케모카인 (예, IL-8)이 상승하는 것으로 나타났는데, 이는 종래 연구들의 결과와 연속선 상에 있다 (106, 107, 109). AA 발병에 IL-15 및 IFN-γ가 연루되어 있다는 본 발명에서의 전반적인 결과와 부합하여, IFN-γ 및 잘 알려져 있는 IFN-γ 유도성 케모카인 IP-10 (CXCL10)은 인간 AA 혈청에서 상향 조절되는 것으로 확인된다. 기능적으로 관련있는 염증성 사이토카인/케모카인 바이오마커들은 다중분석 방식 (Luminex platform)을 이용하여 AA 마우스의 혈청에서 동정할 것이다. 마우스에서의 바이오마커 개발의 이점은, 유전학적 동질성 외에도, 질병 진행의 초기 또는 후기에 나타나며 치료 반응과 반대로 나타나는 바이오마커를 동정하기 위한, 종단 연구(longitudinal stud)가 비교적 용이하다는 것이다. RNA 수준에서, C3H 마우스의 피부 IFN 마이크로어레이에서, I형 IFNs (IFNa1-3, ε) 및 II형 IFN (IFN-γ) 둘다 뿐 아니라 몇가지 IFN-연관된 케모카인 (CXCL9-11, CCL5)들이 상향 조절된 것으로 확인되었다. 케모카인/사이토카인 생성은 다분석물 루미넥스 분석 (R&D)으로 혈청에서 조사하였고, 종합적으로, 9가지의 케모카인 (CCL2-5, CCL11, CXCL5, CXCL9, CXCL10, CXCL11)과 14가지의 사이토카인 (IFNα, IFNγ, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, TNF, GM-CSF)가 혈청 수준에서 규명되었다. 본 발명자들은 NKG2DL (117)와 IL-15Rα의 혈청 수준을 검출하기 위해 항체 쌍들을 포함시켰다.
피부의 전사 프로파일링: 인간 AA에서, 환자를 이용한 공개된 소규모 연속 연구들에서, 병변 바이옵시에서의 타입 I의 IFN 반응 (105)과, 말초혈에서의 Th1 편향성(skewing) 및 IFN-반응 사이토카인 /케모카인의 상승이 확인된 바 있으며 (106-110), 문헌 (111)에 리뷰되어 있다. 이들 데이타는 C3H 마우스의 분석을 반영한다. 탈모증 마우스의 피부에서 분리한 RNA에 대한 전사 프로파일링을 통해 우세적인 IFN 반응이 확인되었다. AA 피부에서 조절되지 않은 유전자 상위 21개 중 18개가 IFN 반응 유전자들이었으며, 이는 실시간 PCR로 검증하였다 (도 22). CD8+NKG2D+ 세포는 또한 공유된 케모카인 수용체인 CXCR3를 한결같이 발현하고 있으므로, IFN-반응 유전자인 CXCL9-11의 상향 조절이 두드러졌으며, 상기 수용체는 수명이 짧은 면역 작동자들에서 상향 조절되었다 (118-120). 또한, 이들 케모카인은 인간 AA 개체의 혈청에서도 상향 조절되며, 따라서, 피부 (mRNA) 및 혈액 (단백질)에서의 기능적으로 관련성있는 AA 피부 바이오마커일 수 있다. 이러한 내용에 대한 연구를 계속 수행하여, 진행중인 치료를 수행하기 전과 수행하는 중에 수집한 피부 RNA 시그니처 데이타를 구축하고, 이를 치료 반응에 대한 조기 표시자로서, 그리고 치료 계획을 조절하는데 사용할 수 있을 것이다. 이러한 목적으로, 마우스에서 병변내 스테로이드 및 CTLA4-Ig, 뿐만 아니라 치료학적 개입을 이용한 병렬 연구를 수행하여, 인간 치료 연구를 교차-참조하는데 유용한 전사 프로파일 데이타베이스를 제공할 수 있을 것이다 (연구들 간의 그리고 보다 새로운 방식에 대한 잠재적인 임상 개발을 위한, 비교 유전제 분석)
인간 개체
두피에서 수득한 피부 바이옵시는 원형 탈모증 환자 최소 100명과 대조군 약 100명으로부터 수집한다. 개체 집단은 AA 환자와 모발 이식받은 무질환 대조군 개체로 구성한다. 이들 샘플의 수집 허가는 이것은 폐기되는 조직이기 때문에 신속 심사받거나 면제되었다. AA 환자로부터 두피 바이옵시를 채집하는 프로토콜은 준비 중이다. 최소 100명의 AA 개체를 모집하며, 100명 이상을 모집하는 것이 좋으며, 방법의 효력을 높인다.
발현 인터렉톰(expression interactome)을 구축하기 위한 샘플들에서 최대 균질성(homogeneity)을 달성하기 위해, 매칭되는 대조군 공여자들이 중년 그룹이 가장 많아서, 모낭을 탈모증을 앓고 있는 중년의 백인 남성들에서만 채집한다. 즉, AA는 인종 또는 성별 성향은 없지만, AA 환자는 본 실험을 위해 대대조군과 연령과 성별이 일치되게 (중년의 백인 남성) 선정한다. 질환이 활동기인 환자 (즉, 일부 모낭이 남아 있음)에서 효과적으로 미세적출이 가능하므로, 그러한 환자를 선정한다.
척추동물
가시적인 탈모를 보이는 어린 C3H/HeJ 마우스 (2-3월령)와 출산기를 지난 동물(retired breeder)을 Jackson Labs으로부터 입수한다. 동물은 동물 시설에서 표준 조건 하에 유지시킨다.
마우스에는 전신 주사 또는 국소적으로 약물 또는 항체를 투여한다. 국소 적용의 경우, 마우스 피부의 등 표면을 전기 클리퍼로 면도한다. 면도하고 1주일 후, 비히클로서 아세톤 또는 10% v/v 프로필렌 글리콜에 용해한 화합물을 국소 적용한다. 주사는, 복막내 또는 피하 주사로 수행한다. 용량 및 투여 빈도는 확립된 프로토콜에 따른다. 마우스는 치료하는 전체 기간 동안 통증 신호에 대해 매일 모니터링한다.
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실시예 5
탈모증 작동자 T 세포를 탈모증 마우스의 림프절과 혈액에서 유세포 분류된 세포의 스펙트라타입 분석을 이용하여 동정하였다. 혈액 기반의 분석을 진행하여, 치료하는 동안의 이들 탈모증 T 세포를 모니터링하였다. 세포독성 분석을 진행하여 인간과 마우스 둘다에서, 모낭 (HF)과 CTL의 상호작용과 관련된 기능적인 요소들을 평가하였다.
AA 개체로부터 수득한 인간 생검을 이용하여, 순환성 T 세포가 NKG2D를 높은 수준으로 발현하며, 피부로부터 수득한 일차 T 세포가 주로 CD8+NKG2D+ IFN-γ를 생산하는 세포임을 확인하였는데, 이는 마우스와 인간 질환 간에 유사하게 확인되었다.
면역표현형 분석 및 피부 면역생물학
생검에서의 경로 연구를 하기 위해서는 피부 및 혈액에서 혼성 세포 집단들에 대한 분석이 요구된다. 인간 자가면역성에 대한 임상 연구에서, 원형 탈모증은, 이와 관련된 미세환경에서 병인성 면역 작동자를 연구/분리할 수 있는 말단-장기에 대한 접근성으로 인해, 훌륭한 기회를 제공한다. 이들 귀한 말단-장기 피부 생검과, 동일 개체에서 수득한 혈액내의 세포성/혈청학적 카운터파트들에 대한 최상의 연구를 위해, 필요한 분석 툴과 인원이 제공될 것이다.
생검의 준비와 분석
혈액 분석을 돕기 위해 하기 사항들이 제공될 것이다:
i) 혈청 샘플들에서의 다분석물 사이토카인/케모카인 분석.
ii) AA 개체로부터 수득한 인간 PBMC에 대한 사이토카인 분석을 비롯한, 유세포 측정에 의한 면역표현형
iii) T 세포 서브세트를 이용한 하위 사용을 위한 유세포 분류 (RNA 프로파일링, 스펙트라타입 분석).
피부 분석을 돕기 위해 하기 사항들이 제공될 것이다:
i) 일차 모낭 및 T 세포 구성 성분들의 기능성 (세포독성) 및 분석 연구 (T 세포 클로닝, 스펙트라타이핑)를 위한 살아있는 세포 분획의 제조/분석.
ii) 전체 피부의 면역염색 및 전사 프로파일링.
iii) 인간 및 마우스 AA 피부 유래 진피 림프구의 유세포 측정에 의한 면역표현형 분석.
과학 실험들
a. AA 개체의 말초혈에서 병원성 HF-특이 세포 서브세트들을 동정한다. 이를 위해, 마우스 모델에 대해 행해진 바와 같이, 전체 피부 T 세포에서 발견되는 스펙트라타입을 동일 환자에서 수득한 말초혈의 특이적으로 분류한 말초혈 T 세포 서브세트의 스펙트라타입들과 매칭시킴으로써, 순환성 인간 탈모증 T 세포 집단들을 동정하기 위한 도구로서 스펙트라타입 분석을 이용한다.
b. 인간 AA에서의 Th1-우세(predominance)를 확립하며, Th1-타겟화된 치료법에 대한 바이오마커 플랫폼을 개발한다. 질환 특이적인 Th-경로에 대한 치료학적 타겟팅은, 원형(prototypical) Th17 질환인 건선에서 가장 현저한, 다른 인간 피부 염증 질환들에서 성공하였다. 우세한 Th1 질환으로서 AA에 대한 AA 동물 모델에 대한 중요한 데이타가 존재한다. 혈액에서의 침윤성 진피 AA T 세포 및 관련 순환성 T 세포 서브세트의 Th-프로파일을, 피부 및 혈액에 대한 다분석물(multianalyte), RNA 브로파일링, 면역염색 및 세포내 유세포 측정 분석을 비롯하여, 다각적인 접근 방식으로 다룬다.
중개 연구에 대한 통합적인 방식은 AA에서 타겟가능한 경로를 동정하는 기본적인 연구들로 시작되며, 그런 후, 전임상 모델, 임상 실험에서의 종단적 바이오마커 평가 및 유전학 연구를 기반으로 한 인구 집단-기반의 연구를 진행하는데 있어, 이들 경로들을 치료학적으로 테스트한다. 개입에 대한 전임상 치료학적 효과는 이식한 AA 마우스 모델에서 조사하며, 염증 반응에 대한 치료 효과는 피부와 혈액에서 분석하며, 인간 생검은 생체외 실험에서 인간 연관성을 검증하기 위해 제공된다.
인간 피부에서 면역 세포와 타겟 세포 간의 병원성 상호작용을 모니터링하는데에는 일차 인간 조직 및 혈액에 대한 정교한 처리와 분석이 요구된다.
유세포 측정은 특정 파라미터에 따라 세포 집단들을 동정하는 일차 도구가 되고 있으며, 따라서 점점 많은 수의 생의학자들이 사용하고 있다.
피부의 면역생물학에는 특별한 특징들과 기회가 존재하며, 장벽 기능을 비롯한 조직의 공간적인 구조, 이의 조합된 고유한 면역세포 집단들, 및 미생물 총과의 인접성(close proximity)/상호작용, 및 침윤성 림프구를 분리하는데 있어 실무적인 곤란성은 모두 피부의 면역 질환에 대한 접근법에서 해결해야 할 문제들 중 일부이다. 조직 처리 및 염색 뿐만 아니라 세포 분리를 통한 지원을 제공하고, 고품질의 일관된 결과를 기본적으로 추구하는 서비스를 이용할 수 있다.
유세포 측정은 임상 연구의 도구이며, 모든 중개 면역학자들에게는 이의 이용에 대한 작동 지식이 요구된다. 2개의 기계(workhorse) 장치 (FACs Canto 및 FACs Caliber), 6-laser LSR II 및 4-laser BD Influx를 포함하여 4가지 유세포 측정기가 이용가능하다. LSR II와 BD Influx는 분석으로부터 분취용 분류로의 이행을 가능하게 하기 위해, 비슷한 레이저/검출기를 구비하도록 설계되어 있다. LSR II는 총 19색을 동시에 검출할 수 있는 6종의 레이저가 장착되어 있어, 형광 단백질(mBanana, GFP, BFP, RFP/dsRed, mCherry mRasberry)과 형광 염료/화학 플루오로발색단 둘다를 검출하는 다목적성을 제공한다. LSR II는 유기 및 무기 형광발색단들로 구성된 광의의 어레이를 이용하여 조직으로부터 혼성의 세포 집단들에서 다양한 세포 타입들을 분석할 수 있다. 이들 부가적인 형광 파라미터로 혼성 집단들에서 특정 세포 타입에서의 동조된 기능적인 현상들을 검출할 수 있다 (예, 피부 조직 및 배액성 림프절 유래 T 세포 집단들에서의 세포내 IFN-γ, IL-10 생산 및 인단백질 검출). 기본적인 LSR II 장치는 3가지 레이저가 장착되어 있다; 블루 (488nm), 레드 (633nm), 바이올렛 (405nm). 주문 설계된 LSR II에는, 추가적으로, 최대 20종의 색 검출이 가능한 부가적인 레이저와 96웰 플레이트 리더가 포함된다. T 세포 서브세트 (예, Treg), B 세포 및 단핵구에 대한 "하나 남기기(Leave one out)" 10색 패널 디자인을, "레드" Alexa 594에 대한 민감성이 우수한 100W 옐로우-그린 594 레이저를 이용하도록 설계하였다. 즉, 조사자는 Alexa 594가 접합된 항체로 염색함으로써 특정한 대상 마터에 대한 발현을 민감하게 조사하도록 "하나 남기기" 설계를 개조할 수 있다.
품질: 인간 말초혈의 림프구 집단을 면역표현형을 분석하기 위한 패널 개발 및 기타 실험을 수행한다. LSR II의 6종 레이저 시스템의 역량으로 인해, 보정할 필요없이 사용할 수 있는 일반적인 "사용이 용이한" 색상 세트가 확립되어 있다. 형광 보정없이도 5/6-색 실험을 수행하는 능력은 형광발색단이 스펙트럼에서 서로 멀리 떨어져 있으며 각 레이저 선에 의해 독립적으로 방출되는 우수한 데이타 해상도를 제공해준다. 이는, 집단들을 보정이 적용되었을 때에는 어려운 어떤 것으로 명확하게 분리시킬 수 있게 해준다. 현재 선택된 형광발색단 조합은 DAPI (DAPI 네거티브 세포 상에 게이팅됨) Pacific Blue, FITC, PE, Alexa Fluor 594 및 APC이지만, fluor들의 다른 조합도 현재 테스트 및 사용 중이다. 이 5-형광발색단 세트는 추가적인 형광발색단을 첨가할 수 있는 패널의 베이스 플랫폼으로서 제공된다. 개념 증명 실험에서, 5-형광발색단의 사용은 보정하지 않고도 동시에 나타난다. C57BL/6 비장세포는 CD8 Pacific Blue, CD3 FITC, CD45R (B220) PE, CD11b Bio+Streptavidin Alexa Fluor 594, 및 CD4 APC로 염색하였다.
피부 면역생물학의 유지 및 품질 관리: 피부 바이옵시로부터 림프구를 분리하기 위해 사용되는 공정은, 바이옵시를 3차원의 탄타륨으로 코팅된 셀폼 매트릭스 상에 배양하여 바이옵시로부터 T 세포의 이동을 촉구하는 Clark 및 Kupper (2)에 의해 개발된 방법을 수정한 것이다. 각 분리된 세포 집단들 중에서, 적은 분획을, 추가적인 실험 또는 동결보존하기 전에 유세포 측정에 의해 백혈구/T 림프구의 수를 평가하기 위해 CD45/CD3 염색에 사용한다. 재-사용을 위해, 상기 매트릭스는 10% 표백제에 30분간 침지한 다음 물로 헹구고, Enzyte 효소 클리너 용액 (Decon Labs)으로 이동한다. 이 매트릭스를 상기 용액에 둔 상태로 핫 플레이트 위에서 24시간 교반하면서 방치한 다음 증류수로 헹구고, 건조 후 자동멸균한다.
전체 피부 분석 기법 (예, 면역염색)이 제공될 것이다. 다음과 같은 사항들이 제공될 것이다: 1) 일차 모낭 및 피부 T 세포 둘다의 생존 세포 분획의 준비/분석을 위한 피부 면역생물학의 주요 전문 지식; 2) 다분석물 분석 (Luminex) 및 귀한 임상 생검 (임상 실험에 등록한 개체의 피부와 혈액)의 전사 프로파일링을 위한 바이오마커 개발 능력. 혈액 및 AA 타겟 말단 장기 피부 유해 전임상 및 임상 샘플들에서 염증성 AA 기전을 모니터링하고 생물학적 과정을 조사하기 위한 도구가 제공될 것이다.
본원의 실험들에 마이크로어레이 데이타 분석과 저장, 서열 및 경로 분석 능력을 이용할 수 있으며, 조절망의 역공학(regulatory network reverse engineering)에 대한 최신 알고리즘으로 연장된다. 널리 사용되는 다수의 데이타베이스가 구축 및 유지되고 있다. 아울러, 중요한 서열 및 구조 데이타베이스를 중심으로 모두 유지된다. 이들은, 커스텀 알고리즘 및 클로스터 산출이 필요하다면, 직접 대규모 검색이 가능하다. 개발된 많은 연구 방법들은 소프트웨어 어플리케이션 및 전산 서비스(computational service)에 패키지되어 있으며, 이는 과학 커뮤니티에서 무료로 이용할 수 있다 (http://www.c2b2.columbia.edu/page.php?pageid=10).
다음과 같은 서비스를 이용할 수 있다:
1. 면역모니터링:
a. 혈청 샘플에 대한 다분석물 사이토카인 & 케모카인 분석
2가지 방식을 이용할 수 있다: a) 멀티플렉스 비드 기반의 면역분석 시스템 (예, CBA/FlowCytomix)은 소량 부피 (50 ㎕) 샘플의 1회 판독(single read)으로 10종 이상의 사이토카인/케모카인을 평가할 수 있는 다중 분석을 제공한다. LSR II 96 웰 고성능 처리 능력은 효율이 가미된 사용 용이성을 제공한다. 데이타 분석을 위해 집에서 소프트웨어 ("스냅-투(snap-to)" 게이팅)를 사용할 수 있다. 특이 항체 세트들이 상업적으로 시판되는 용해성 인간 및 뮤라인 NKG2DL을 혈청에서 정량하기 위해 멀티플렉스 비드-기반의 분석 시스템도 개발될 것이다. b) 루미넥스 플랫폼을 이용한 다중 분석은 상업적으로 구입가능한 마우스 및 인간 사이토카인 및 케모카인 어레이를 분석하기 위해 CTSA에서 이용가능하다 (도 24). 루미넥스 분석은 사용자가 구입한 시약을 이용하며 서비스를 위한 요금이 청구된다. 선정된 분석물의 AA 혈청 바이오마커 플랫폼 벌크를 구입하는 것이 비용 절감에 도움이 될 것이다.
유세포 측정을 이용한 면역표현형
CD8+NKG2D+ 세포가 자발적인 탈모증을 앓고 있는 마우스의 피부로부터 회수한 진피 백혈구 집단에서 가장 많다는 것이, 다변수 플로우를 이용하여 확인되었다 (도 25). 인간 상황을 어드레스하기 위해, 3 FACS 튜브 (T 세포 서브세트 튜브, CD4, CD8 및 NK 세포에 대한 NK-마커 튜브, 및 3번째 비-T 세포 튜브); 계통 마커(Lineage Marker): CD3, CD4, CD8α, CD8β, CD14, CD19, CD20, CD56, CD64; T 세포 서브세트 마커: CD45Ra, CD45Ro, CD56, CD62L, CCR7, CD127, FoxP3, Helio; 피부 케모카인 수용체 분석: CCR4, CCR8, CCR10, CLA, E 및 P-셀렉틴; NK 면역수용체 패밀리 멤버: 저해(Inhibitory): KIR/CD158, CD94/NKG2A, LILR/ILT, LAIR1 NKR-P1 활성(Activatory): NKp46, NKp30, NKp44, NKG2C, NKG2D를 이용하여, NK 및 CD4 및 CD8 T 세포에 초점을 맞춘 임의의 30종의 PBMC 서브세트들에서 양적 변동을 규정하기 위한, 플로우 패널을 개발하였다. 4명의 AA 개체 유래 PBMC에 대한 1차 평가에서, 증가된 NKG2D 발현이 CD56+ CD8+T 세포 및 NK 세포에서 관찰되었지만, CD4+ T 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 26).
사이토카인 분석: 신선하게 분리한 연막(buffy coat) 말초 T 세포를 PMA/이오노마이신으로 활성화시키면, 순환성 기억 T 세포에 의한 사이토카인 생산이 이루어질 것이다. 브레펠딘(brefeldin)과 함께 4시간 인큐베이션한 후, 세포를 세포 표면 마커로 염색하고, 고정 및 투과화한 다음, IL-2, IFN-γ, TNF, IL-4 , IL-17, 및 FOXP3/helios로 세포내 염색한다. 이들 사이토카인/전사인자는 표면 마커 CD3, CD4, CD8, CD25, CD56, CD62L, NKG2D, CD45Ra, CD45Ro, CLA/CCR4와 함께, 전체 및 피부 CD4/CD8 나이브(naive) 및 기억 T 세포 구획에서의 Th1/Th2/Th17/Treg의 분획과 이들의 NKG2D의 발현을 묘사해 줄 것이다. 이론으로 결부되지 않으나, 단일 시험관에서 다변수 테스트를 수행할 수 있는 LSRII를 이용하여 이러한 분석을 수행하는데에는, PBMC 2-4백만개면 충분하고도 남을 것이다. 이로써 다른 목적을 대비하기 위해 30 ml 채혈물로부터 수득한 충분한 수의 PBMC (>20,000만개)가 남겨질 것이다.
T 세포 서브세트를 이용한 하류 이용을 위한 유세포 분류
목표는 하류 기능 분석을 위한 잠재적인 탈모증 T 세포를 제공하고자 하는 것이다. 예를 들어, 유세포 분류한 T 세포 서브세트는 RNA 프로파일링, 예를 들어, NK 타입의 T 세포의 전사 프로파일링에 제공된다. 바이오마커 연구를 위해, 적절한 세포 서브세트를 다듬어, 혼성의 이질적인 PBMC 집단 유래 RNA의 존재에 의해 약화되는, 분석의 해상도를 높인다.
AA 마우스 연구에서, 탈모증 T 세포 (도 24)가 재순환하며, 혈액과 피부 림프절로부터 쉽게 발굴 및 분리할 수 있다는 것이 확인되었다. CD8+NKG2D+ T 세포 500만개 이상을 한가지 마우스의 피부 림프절로부터 유세포 분류함으로써 분리할 수 있다. 이 갯수는 하류 연구를 위한 매우 많은 수의 신선한 일차 "병원성" T 세포이며, 세포 수율이 상당히 향상된 것이며, 이는 탈모증 피부로부터 "크룰-아웃"으로 회수할 수 있을 것으로 예상할 수 있다. AA 개체, 인간 AA 개체의 혈액에서 병원성 T 세포 서브세트를 동정하는 것이 과학적 목표이다. 유세포 측정으로 분리한 T 세포 서브세트들은, 특이적인 T 세포 서브세트의 면역병원성 연관성에 대한 증거를 제공하기 위한, 바이오마커 연구, 기능 연구 및 스펙트라타이핑 등의 하류 이용에 제공될 것이다.
i) TCR 레파토리의 스펙트라타입 분석
스펙트라타이핑, 또는 조직 또는 표현형에 따라 분리한 림프구 서브세트들로부터 유래된 RNA의 TCR β-체인 길이 분포 분석은, 침윤성 T 세포의 TCR 클론타입 활용/레파토리에 대한 질적 설명을 제공한다. 최근, 다른 사람들은 이 기법을 샘플에서 클론 증폭된 T 세포의 비율을 보여주기 위한 고도의 민감하고 정확한 방법으로서 사용하고 있다 (5-7). 제한된 TCR를 가진 T 세포들의 서브세트가 증폭된 증거인 올리고클로날러티(Oligoclonality)는, 염증 프로세스에서의 항원 드라이브(antigenic drive)를 의미하며, 병원성 T 세포 클론을 동정하기 위한 1차 단계로서 사용할 수 있다. 각 TCR 재정렬은 3가지 뉴클레오티드들의 배수로 CDR3 길이에 있어 다르기 때문에, T 세포 집단내 CDR3 길이의 이질성(heterogeneity)을 TCR 다양성의 척도로 사용할 수 있다. 이 기술의 원리는 상류 특이 Vβ 패밀리 멤버 프라이머와, 조합(combinatorial) 및 정션(junctional) VDJ 연결에 의해 만들어지는 CDR3 영역을 더불어 포괄하는 하류 불변부 프라이머를 이용하여, T 세포 집단으로부터 수득되는 cDNA를 PCR 증폭하는 것이다. 그런 후, PCR 산물은 형광 표지된 불변부 프라이머를 이용한 프라이머 연장("런-오프(run-off)") 반응으로 형광발색단으로 표지한다. 그 후, 산물을 ABI PRISM 3700 DNA 분석기에서 분석한다. 유전자 맵퍼 소프트웨어를 이용하여, 각 CDR3 길이에 대응되는 피크의 크기를 나열 및 분석할 수 있다 (도 20 및 27). 데이타를 내보내어 기준 다클론 레파토리와 비교하며, 해밍 거리 등의 올리고클로날러티의 값을 계산한다. 각 히스토그램에서의 피크들의 면적은 각 패밀리에서의 각 CDR3 길이의 발현 빈도를 반영한다. 피부에서의 클론 증폭의 우위성은, 구동 질환에서 진피 항원의 일차적인 역할을 나타내며, 병원성 T 세포를 조사하는데 초점을 맞출 수 있을 것이다. 반면, 증폭되지 않은 클론의 다클론 레파토리는 비-클론성의 특이 케모카인 수용체들에 의한 동원을 의미하는 것일 것이다. 동일 개체들의 비-병변 피부와 혈액에서의 TCR 레파토리의 비교는, 클론 증폭된 피부에 있는 T 세포 집단들이 또한 순환계에서도 발견될 수 있는지를 보여줄 것이다. 마찬가지로, 분류된 T 세포 서브세트는 레파토리 분석을 위한 소스 RNA 물질로 사용할 수 있다. 예를 들어, 도 20 및 27은, C3H 마우스에서, 네거티브 CD8 림프절 집단이 아닌 NKG2D 파지티브에서 또한 과도하게-나타나는 레파토리인, 올리고클론성 집단이 병변 피부에서 발견됨을 보여준다. 이러한 데이타는, CD8+NKG2D+ T 세포가 피부에서 발견되는 올리고클론성 T 세포 집단들 대부분 (전부는 아님)을 함유함을 검증해준다. 일부 TCR/클론들, 예컨대 Vβ10이 피부에서 발현되지만, 배액성 피부 림프절에서는 발견되지 않음에 유념한다. 이러한 것으로는, 분류된 CD8+ LN 분획에는 존재하지 않지만 AA 피부에서 발견되는, CD4+ T 세포 집단들을 틀림없이 포함할 것이다. 이러한 방식은 "항원-드라이브"에 대한 강력한 증거를 제공하며, 본원에 나타난 바와 같이 유세포 분류와 조합하여, 세포 집단들 중에서 병원성 T 세포 서브세트들를 동정한다.
클론 공유 또는 올리고클로날러티에 대한 증거는, 개시된 바와 같이, 토포이소머라게-기반의 클로닝을 이용한 PCR 산물의 박테리아 라이브러리를 제작하고, 96웰을 이용한 기법을 이용하여 고성능 방식으로 수득되는 클론의 TCR β-체인을 서열분석함으로써, 클론타입 분리(clonotype resolution) 수준에서 마우스 및 인간 샘플에서, 조사되고 검증될 것이다 (5-7). 통상적으로, 클론 48종 또는 96종이 선택되며, 각 PCR 산물에 대해 서열분석을 수행한다. 서열은 Geneious에 입력하여 정렬하고, VDJ 인자 사용법 및 연결에 대한 미세 구조를 Vquest로 확인한다. 이로써, 여러가지 부위들에서의 공유된 클론들과 림프구 이동(trafficking)을 명확하게 규정할 수 있을 뿐만 아니라, 샘플의 클론형 조성에 대한 정확한 목록을 구할 수 있다. 아울러, 클론형 TCR은 탈모증 TCR을 발현하는 레트로제닉 마우스(retrogenic mouse)와 T 세포를 제작하기 위한 유전자 형질전이 실험에 사용할 수 있다. 또한, 이러한 시도로, HLA02 형질전환 마우스에서 형질전환에 의해 발현되는 인간 탈모증 TCR을 이용하여 탈모증에 대한 "인간화된" 형질전환 TCR 모델을 개발할 수도 있다.
ii) 순환성 면역 세포의 전사 바이오마커
전사 시그니처를 표시하는, 공격적이고, 약물 불치성 홍반증은 CD8 T 세포 구획에서는 식별할 수 있지만, 총 PBMC의 RNA를 이용하는 경우에는 그렇지 못하다 (8). 즉, 유세포 분류와 전사 프로파일링을 조합하면 분석 역량이 크게 강화된다. 원형 탈모증의 경우, 병원성 세포 세브세트는, 모낭을 둘러싸고 있는 CD8+NKG2Dhi T 세포인 것으로 보이며, 셀리악 질환 (4, 10), 1형 당뇨병 (11) 및 류마티스 관절염 (12-14) 등의, 자가면역성 (9)에 광범위한 질환 연관성을 가질 수 있다. 셀리악 질환에서의 이들 세포의 전사 프로파일링 (4, 10)은, 분류-정제된 순환성의 피부-유래 CD8 T 세포에서 유사하게 평가되는, 이들 세포의 NK-유사 전사 프로그래밍을 이미 보여주었다. 이들 세포에 중추적인 생물학적 경로를 동정하기 위해, 이들 세포 집단들의 전사 프로파일들을 특이적으로 어드레스하는 것이 중요할 것이다.
일루미나-기반의 게놈 방식을 이용한 후성유전학적으로 조절되는 자가면역 유전자들이 동정되었으며, 1형 당뇨병, 원형 탈모증 및 셀리악 질환을 앓고 있는 환자 유래의 분류된 자가면역 인간 T 세포로부터 DNA를 수득하였다. CD3, PD-1 및 FasL 등의 주요 면역조절 유전자들의 발현을 하향조절하는 프로모터 영역의 과메틸화를 확인하였다.
iii) 세포성 면역학
활성화된 PBMC의 유세포 측정 분석은 인산화된 단백질의 시그널링 활성화 및/또는 세포내 사이토카인 분석에 이용할 수 있다. 고전적인 항원 특이적인, 미토겐성 또는 혼성 림프구 반응들은 CFSF-염색된 T 세포 또는 티미딘 병합으로 분간할 수 있다. 이용가능한 장치로는 세포 회수기 및 Microbeta/Trilux 플레이트 리더 (티미딘 기반의 증식 및 크로뮴 방출 세포독성 분석의 경우), ELISA 플레이트 리더/세척기, ELISPOT 리더를 포함한다.
피부 면역생물학
기능적 (세포독성), 분취용 (T 세포 클로닝) 및 분석 연구 (스펙트라타입핑, RNA 프로파일링)를 위한, 일차 모낭 및 T 세포 성분들의 준비. 연구에서 AA 환자 유래 바이옵시 생검은 귀하며, 이러한 2가지 방법의 실현 가능성과 정보력을 감안하면 면역염색 및 전사 프로파일링 연구가 가장 우선시된다. 대조군 개체 (모낭 공여체)로부터 관례적으로 인간 머리 두피를 취하여, 피부와 모낭내 개별 세포 집단들의 1차 배양물을 확립한다.
a) T 세포 및 모낭 성분의 배양, 모낭 기관 배양 및 피부 기관 배양
i) HF 타겟: 대조군 또는 AA를 앓고 있는 개체로부터 수득한 인간 두피를 이용하여 피부 및 모낭내 개별 세포 집단들의 1차 배양물을 확립하여 (도 28), 1차 HF 집단들에서의 NKG2DL 조절을 연구하고, CTL 분석에서 타겟으로서 HF 집단들을 조사한다. 모낭간(interfollicular) 피부에 디스파제를 처리하여 상피와 진피 성분들을 분리하고, 효소 처리하여, 각질형성세포와 섬유모세포의 1차 배양물을 확립한다. 모낭을 미세 절편화하여, 간엽 성분들을 분리하고, 이를 추가로 사용하여 진피 시트 세포 (DSC)와 진피 유두상 세포 (DPC)를 배양한다. Kondo 및 Philpott 등 (15)의 프로토콜에 따라 모델링한, 실험실에서 확립한 무혈청성 모낭 기관 배양물 (도 30)을 이용하여, 대조군 개체 뿐 아니라, AA 환자의 (가능한 경우) 병변부 피부 및 대조군 피부로부터, 통례적으로 개별 모낭들을 배양한다. 모낭은 무혈청 배양 조건에서 배양하며, 7-10일간 정상적인 생장기를 나타내며, 이행기로 돌입하여 기질이 분해된다 (16). 세포독성 분석을 위해, 모낭을 세포독성 T 세포 또는 NK 세포를 4-8시간 유지시키는 배지(MyeloCult, Stemcell Technologies)로 옮긴다. 피부 외식편은 정상적인 피부 구조와 면역 미세환경을 유지하므로, 기능 연구에 이용될 것이다 (17).
ii) T 세포 작동자: 효소를 처리하여 분해/분산시킨 인간 피부로부터 충분한 수의 T 세포를 분리하기 어려울 순 있지만, 배양한 T 세포는 Clark에 의해 개발된 진피의 크롤-아웃 방식을 이용하여 증폭되지 않았다. 피부 외식편은 20% FCS, IL-2 및 IL-15를 포함하는 IMDM에서 3주간 세포 폼 매트릭스 상에 외식편을 배양함으로써, 피부에 존재하는 T-세포 집단을 증식시키는데 사용되고 있다. 이러한 기법을 통해 바이옵시 4 mm 당 0.3 - 3.0 x 106개의 T 세포를 수득할 수 있는데, 이로 면역표현형 분석, T 세포 클로닝, Th-프로파일링 및 기타 하류 적용 (예, 전사 프로파일링, 세포독성 및 기타 기능 분석)을 수행할 수 있다. 개입 실험에서 AA 환자의 경우, 3주간의 증식 후 충분한 T 세포가 수득된다면 (>1x106), 이를 절반은 RNA 분리/프로파일링으로, 다른 절반은 유세포 면역표현형 분석/Th 프로파일링으로 분할한다. 수율이 총 세포수 1 x 106개 미만인 경우, 실험은 RNA 프로파일링으로 한정한다. 실험 수행 대상이 아닌 AA 환자의 경우, 예를 들어 세포분해 분석 및 항체 차단/소분자를 이용한 연구 등의, 얼터너티브 기능 연구에, 크롤-아웃 T 세포와 동종의 HF 타겟을 사용할 여지가 더 많을 것이다. T 세포의 희귀한 임상 집단들을 분석하는 능력의 예로서, 도 29에서는 펀치 피부 바이옵시로부터 수득한 인간 진피 배양물을 유세포 측정 분석의 소스 재료로서 사용하는, T 세포 "크롤-아웃" 분석을 예시한다.
AA 피부 바이옵시로부터 수득한 T 세포는, 정상 피부에서의 크롤-아웃에서 나타나는 예상되는 다클론성 CD4 집단과는 완전히 대조적으로, 올리고클로날 IFN-γ를 생산하는 CD8+NKG2D+ T 세포임에 유념하여야 한다 (2, 18).
b.) 원형 탈모증 모델에서 피부 및 면역 성분들의 상호작용
본원의 연구에서 피부-면역 상호작용을 평가하기 위해 확립된 프로토콜들을 사용할 수 있다. 1차 배양 세포 뿐만 아니라 기관-배양한 모낭은, 대조군 또는 환자의 말초혈 림프구 유래 또는 피부 유래 세포독성 T 세포를 이용하여, 타겟으로서 사용할 수 있다 (도 29). 면역 작동자 세포는 CFSE-표지된 타겟 세포/모낭과 공동-배양할 수 있으며, 세포용해는 LDH 방출로 색 측정으로 측정하거나, 또는 다른 예로, 사멸 세포를 7-AAD로 염색하고 유세포 측정으로 세포수를 계수한다. 이러한 분석법을 사용하여, 세포독성 등의, 면역 작동자와 HF 타겟의 상호작용에 요구되는 분자들을 결정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 나타낸 바와 같이, 세포독성에는 NKG2D 참여(engagement)와, NLG2DL 전사 및 표면 발현을 상향 조절하는 것으로 알려진 사이토카인/TLR 리간드를 이용한 타겟의 사전 감작화가 필요하였다.
발병에서의 피부 바이오마커들의 평가: 면역염색 및 전사 프로파일링
AA는 중증 자가면역 질환과 매우 높은 연관성을 보이므로, 모낭은 자가면역성의 기본 기전을 연구하는 가장 접근성이 우수한 장기이다. 발병의 초기 서로게이트(surrogate) 생물 마커를 동정하는데 상당한 관심들이 쏠려 있다. 이처럼, AA는 다양한 범위의 질환들과 연관성을 가질 수 있는 바이오마커를 개발하기 위한 모델 시스템이 된다. 아래 바이오마커들은 현재 인간 및 마우스 둘다에서 AA 발병과 치료에 대한 반응을 모니터링하는데 사용되고 있다.
a) 림프구 침윤에 대한 면역조직화학적 염색. AA는 모공내 및 모공주변(parafollicular) 면역 침윤물이 존재하는 형태로 조합되어 있다. 면역조직화학에서, 조직은 PBS 중의 10% 포르말린으로 실온에서 8시간 동안 고정한 다음 파라핀 섹션을 70% 에탄올에 보관하거나 또는 드라이아이스 상에서 Cryomatrix (Shandon, Waltham, MA) 중에서 직접 포매하고 -80℃에 보관한다.
파라핀 포매한 조직 블록은 8 ㎛ 섹션으로 자르고, 조직학적 실험을 위해 헤모토실린과 에오신 (H&E)으로 염색한다. 또한, 얼린 조직을 두께 8 ㎛로 자르고, 면역형광 염색을 위해 4% 파라포름알데하이드에서 고정시킨다. 섹션들을 형광-표지된 이차 항체로 염색하고, Zeiss Axioskop 현미경을 사용하여 면역형광 이미지를 포착한다. 기본적인 면역조직/형광 염색에는 CD3, CD4, CD8에 대한 일차 항체를 이용한 염색이 포함될 것이다. 면역 염색의 예로서, MHC I 및 II와 ICAM-1이 밀집된 CD8이 지배적인 침윤물이 조합된 탈모증 HF에서 크게 상향조절된다는 증거를 제시한다 (도 31).
b) 피부의 총 RNA 분리 및 염증 마커에 대한 정량 PCR. 인간 및 마우스 피부를, IFN-반응 유전자들 등의 이미 규명된 염증성의 유전자 전사체들과, "NK-타입" CD8 T 세포 전사체 등의 규명할 유전자 시그니처의 상승에 대해 테스트한다. 총 RNA를 RNeasy 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 피부에서 추출한다. DNase-처리한 총 RNA를 SuperScript II 역 전사효소 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 역전사한다.
RT-PCR은 SYBR 그린 마스터 믹스와 ABI Prism 7000 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 수행한다. GAPDH와 β-액틴은 내부 표준 대조군 유전자로서 사용한다.
본원의 연구 목적 중 한가지는 분류된 말초혈 AA T 세포 서브세트의 스펙트라타입을 동일 환자의 전체 피부 T 세포에서 발견되는 것과 매칭시킴으로써, 순환성 AA 작동자 집단들의 표현형을 확립하는 것이다. 유세포 측정을 이용한 분류 기법을 스펙트라타입 분석과 조합하여, AA 환자의 순환계에서 병원성 T 세포를 동정한다. 이러한 동일한 방식을 마우스 모델에 적용하여, CD8+NKG2D+ 림프절 세포들이 탈모증 피부에서 발견되는 T 세포 클론들 대부분을 함유하고 있음을 발견하였다. AA 개체에서, TCR 레파토리를 동일 개체의 병변 및 비-병변 피부 및 혈액에서 비교하여, 임상적으로 증폭된 피부에 존재하는 T 세포 집단들이 또한 순환계에서도 발견되는지를 확인한다. 순환성 T 세포 서브세트로부터 소스 RNA 재료를 분리하기 위해 분류 기준들을 점진적으로 개선함으로써, 동일 환자에서 수득한 전체 피부에서 발현되는 TCR 레파토리를 (적어도 부분적으로) 매칭시켜, 이러한 방식으로 병원성 CD4 및 CD8 T 세포의 면역표현형 마커들을 동정할 수 있어야 한다. 병원성 T 세포 서브세트의 동정은 임상 실험을 모니터링하고, 바이오마커 개발을 개선하는데 상당히 유용할 것이며, 실험실에서 침대로의(bedside-to-bench)라는 질병 연구를 위한 고유한 세포 재료를 제공해 줄 수 있을 것이다.
본원의 연구들의 다른 목적은 말초혈에서 순환하는 AA T 세포와 진피에 침윤하는 AA T 세포의 Th 프로파일을 확립하는 것이다. 병원성 AA T 세포 작동자 분화/사이토카인 프로파일: 특이적인 Th-경로의 치료학적 타겟팅은 다른 인간 피부 염증 질환들, 특히 원형(prototypical) Th17 질환인 건선에서 성공한 바 있다. 우세한 Th1 질환으로서 AA에 대한 AA 동물 모델에 대한 주요 데이타가 존재한다 (19-23). 인간 AA에서의 Th1-우세(predominance)를 확립하고, Th1-타겟화된 치료법에 대한 바이오마커 플랫폼을 개발하기 위해, 혈액에서의 침윤성 진피 AA T 세포 및 관련 순환성 T 세포 서브세트의 Th-프로파일을, 피부 및 혈액에 대한 다분석물, RNA 프로파일링, 면역염색 및 세포내 유세포 측정 분석을 비롯하여, 다각적인 접근 방식으로 다룬다. AA CD4 및 CD8 T 세포에 대한 면역표현형 마커를 다듬으로써, 다클론성의 순환성 집단들 중에서 잠재적인 탈모증-특이 T 세포의 Th-프로파일들을 물론 검출하는 것도 가능하다.
소규모의 일련의 개체들로부터 수득한 AA 병변에 대한 전사 프로파일링에서 Th1-타입 편향성이 나타났지만 (24), 이론으로 결부시키지 않으며, AA는 "한가지 질환(one disease)"이 아니다. 공통 발병 경로를 가진 질환, 예컨대 과민증 (25)(피부염) 및 기타 자가면역 증상들 (26-33)에 걸리기 쉬운, Th2 또는 Th1/17 편향성을 모두 반영하는 동반-이환되는 면역 증상들의 AA 개체에서의 공통된 발현은 (본원에 기술된 연구들을 참조함), Th2-타입 AA 뿐만 아니라 AA의 Th1 또는 Th17 타입이 있을 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 여러가지 Th 프로파일을 가진 AA의 서브타입들을 동정할 가능성이 있는 많은 수의 환자들로부터 수득한 말초혈 유래 PBMC와 AA 병변 조직 외식편에서 기능성 T 세포 반응을 동정하고, 이들 면역 기능 바이오마커 변수를 관련 SNP의 존재 또는 부재와 연관시키는 것이 중요하다.
말초 T 세포와 병변의 T 세포의 T 세포 면역표현형을 평가한다. AA 환자 50명과 정상 대조군 50명을 병력과 결부시켜 GWAS로 분석한다. 전체 순환성 T 세포의 Th-프로파일 평가는 정방향으로 일직선이지만, AA 병원성 집단들의 면역표현형 마커들을 규정하는 것이 궁극적으로 도움이 되기 때문에, 보다 정교한 분석을 위해 T 세포 서브세트에 다변수 플로우를 적용한다. 효소에 의해 분해/분산시킨 인간 피부로부터 충분한 수의 T 세포를 분리하는 것이 어려울 수 있으며, 아마도 배양 조건을 통해 바꿀 수 있다. 전체 피부 접근법과 미세적출된 피부 샘플을 이용한 전사 프로파일링으로 연관성을 수행하여, 모낭 시트 침윤물내 뿐만 아니라 모낭간 상피에서의 침윤물로부터 사이토카인 프로파일을 기술한다.
인간 개체
두피 유래 피부 바이옵시는, 정상 개체, AA 환자 및 모발 이식을 받은 질병이 발생되지 않은 대조군 개체들로부터 수집한다. 추가적인 바이옵시는 임상 실험 중인 개체로부터 수득한다.
연구 물질의 소스는 AA 환자와 대조군으로부터 수집한 두피 바이옵시일 것이다. 미세적출한 모낭 구획물 등의 작은 조직 샘플들로부터 RNA를 통례적으로 수득한다. AA 환자와 대조군으로부터 조직 바이옵시가 제공될 것이다.
척추동물
가시적인 탈모를 보이는 어린 C3H/HeJ 마우스 (2-3월령)와 출산기를 지난 동물을 Jackson Labs으로부터 입수한다. 참여하는 주 연구원 각각에 의해 확립된 마우스 계통은 각각의 동물 사육실에서 사육한다. 마우스가 물과 펠렛형 사료(5010 rodent diet, LabDiet, PMI Nutrition International)를 자유롭게 섭취할 수 있게 한다.
개별 피부와 모낭 성분들에 대한 일차 세포 배양 뿐만 아니라 모발/피부 기관 배양은 야생형 마우스와 형질전환 또는 넉-아웃 마우스에서 확립한다. 또한, 이들 실험에는 모낭 및 피부 조직의 특정화가 수반된다. 마우스는 이산화탄소로 질식시킨 다음 경추 탈골시킴으로써, 수의학적으로 승인되어 있으며 널리 권고되는 방법으로 안락사시킨다. 이 방법이 가장 빠르며, 동물에 어떠한 통증이나 스트레스를 가하지 않는 최선의 인도적인 방법이다. 마우스의 등 표면을 전기 클리퍼로 면도한 다음, 피부 조직을 적출한다. 피부와 모낭 각각의 세포 성분들을 분리하는 과정과, 피부 외식편으로부터 T 세포를 분리하는 과정은 도 25, 28 및 29에 기술되어 있다. 또한, 피부 샘플을 OCT 및 파라핀에 포매한다. 피부 외에도, 동물에서 비장과 흉선을 적출하여, 이후 유세포 측정에 사용한다. 동물의 혈청 역시 꼬리 채혈을 통해 수집하며, 사이토카인 프로파일링에 사용한다.
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실시예 6
이식한 질병 동물 모델인 C3H-HeJ 마우스에서 INCB018424 Jak1/Jak2 저해제를 이용하여 Jak1/Jak2를 차단하는 생체내 전임상 연구를 수행하였다. INCB018424를 처리한 후 5마리 중 0마리에서 탈모증이 나타난 반면, 위약 처리한 마우스에서는 5마리 중 2마리에서 AA가 발병하였다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK <120> METHODS FOR TREATING HAIR LOSS DISORDERS <130> 19240.916 WO2 <140> PCTUS1159029 <141> 2011-11-02 <150> 61/409,509 <151> 2010-11-02 <160> 108 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1154 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Tyr Leu Asn Ile Lys Glu Asp Cys Asn Ala Met Ala Phe Cys 1 5 10 15 Ala Lys Met Arg Ser Ser Lys Lys Thr Glu Val Asn Leu Glu Ala Pro 20 25 30 Glu Pro Gly Val Glu Val Ile Phe Tyr Leu Ser Asp Arg Glu Pro Leu 35 40 45 Arg Leu Gly Ser Gly Glu Tyr Thr Ala Glu Glu Leu Cys Ile Arg Ala 50 55 60 Ala Gln Ala Cys Arg Ile Ser Pro Leu Cys His Asn Leu Phe Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Asp Glu Asn Thr Lys Leu Trp Tyr Ala Pro Asn Arg Thr Ile Thr 85 90 95 Val Asp Asp Lys Met Ser Leu Arg Leu His Tyr Arg Met Arg Phe Tyr 100 105 110 Phe Thr Asn Trp His Gly Thr Asn Asp Asn Glu Gln Ser Val Trp Arg 115 120 125 His Ser Pro Lys Lys Gln Lys Asn Gly Tyr Glu Lys Lys Lys Ile Pro 130 135 140 Asp Ala Thr Pro 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tcctcctcct cccgcgacgg caaatgttct 480 gaaaaagact ctgcatggga atggcctgcc ttacgatgac agaaatggag ggaacatcca 540 cctcttctat atatcagaat ggtgatattt ctggaaatgc caattctatg aagcaaatag 600 atccagttct tcaggtgtat ctttaccatt cccttgggaa atctgaggca gattatctga 660 cctttccatc tggggagtat gttgcagaag aaatctgtat tgctgcttct aaagcttgtg 720 gtatcacacc tgtgtatcat aatatgtttg ctttaatgag tgaaacagaa aggatctggt 780 atccacccaa ccatgtcttc catatagatg agtcaaccag gcataatgta ctctacagaa 840 taagatttta ctttcctcgt tggtattgca gtggcagcaa cagagcctat cggcatggaa 900 tatctcgagg tgctgaagct cctcttcttg atgactttgt catgtcttac ctctttgctc 960 agtggcggca tgattttgtg cacggatgga taaaagtacc tgtgactcat gaaacacagg 1020 aagaatgtct tgggatggca gtgttagata tgatgagaat agccaaagaa aacgatcaaa 1080 ccccactggc catctataac tctatcagct acaagacatt cttaccaaaa tgtattcgag 1140 caaagatcca agactatcat attttgacaa ggaagcgaat aaggtacaga tttcgcagat 1200 ttattcagca attcagccaa tgcaaagcca ctgccagaaa cttgaaactt aagtatctta 1260 taaatctgga aactctgcag tctgccttct acacagagaa 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gaccaggcac gatggctcac gccttgtaat cccagcattt tgggaggccg aggtgggtgg 13140 atcacctgag gtcaggagtt tgagaccagc ctggccaaca tggcgaaacc ccatctctat 13200 taaaaataca aaaattagcc gggtgtggtg gtgggcgcct gtaatcccag ctactcagga 13260 ggctgaggag gagaatcgct tgaatttagg agagaaggtt acagtgagcc aagatcgtgc 13320 cattgcactc cagcctgggt gacagagcaa gactctgtct caaaacaaaa ccaaaaaaaa 13380 gtgctatttg tggccaggcg tggttgctca tgcctgtaat cctagcattt ttggggaggc 13440 tgaggagtac agatcacttg agcccaggag ttcaaaacta ccctgggcca cgtggtgaaa 13500 ccccaaaccc cgtctctacg aaaaatacaa aagttagcca ggatgggtgg tgtgcacctg 13560 tggtcccagc tactctggag gctgagaggt ggggaagatt gcttgagccc gggaggtcga 13620 ggtggcagtg agctgtgatc atgccactat tctccagcct gggtgacaga atacaccctg 13680 tctccctgtc tcccagaaaa aaaaaaaagt gctgttcatc tgtgtgatct cactgaatct 13740 tcgtacttca aaccctcgga aggtggctat tgtcagcaaa gtgaagtgac ttgtaaaaga 13800 taaaaaaaag ctaagtggca gggcttggtc caaagcctgg attccaaacc tgggctgttt 13860 ctccatacaa ggggagcagg gaggcagggg cctggggggg cagggtgttg ggcggtgtca 13920 cacgtgacac actgtgctcc agacgcatca tgggctttgt gagtcggagc caggagcgcc 13980 ggctgctgaa gaagaccatg tctggcacct ttctactgcg cttcagtgaa tcgtcagaag 14040 ggggcattac ctgctcctgg gtggagcacc aggatgatgg tagctgctct gccctgccat 14100 tcccacagcc tctcctttct gcctggctct cctctggccc ctctgcctgc cttgcttcgc 14160 tggctctgaa ctgaatgctc agtggtttgg gactgggcag ccagagagtc agagagctcc 14220 aaggcccggc ctcttccctc aagcccgcct gttcctgcat tcactctcca gacaaggtgc 14280 tcatctactc tgtgcaaccg tacacgaagg aggtgctgca gtcactcccg ctgactgaaa 14340 tcatccgcca ttaccagttg ctcactgagg agaatatacc tgaaaaccca ctgcgcttcc 14400 tctatccccg aatcccccgg gatgaagctt ttgggtgcta ctaccaggag aaaggtggga 14460 atcgttgaca tacttcattg ctagattgca gagatctacc agacatccat agatcccact 14520 ccttccttta aagcatggga aaactgatat ctagaggaat taagggattc gtccatggga 14580 tactgctggt tactatgggg atgagactgc caggaccatc tgcactaggg gaaaacctca 14640 ggctatatgt ctggcccact gatcttctct gcttcttgta tatgttcctc acagttaatc 14700 tccaggaacg gaggaaatac ctgaaacaca ggctcattgt ggtctctaat agagtgagat 14760 atgaactgtt cattcatcct ccctaatcct tattggctct gcttcagtga atcgtcaaaa 14820 gggggcatta ccttctcctg ggtggagcac caggatgatg gtcagctgct ctgccctgcc 14880 attcccacag cctctccttt ctgccttctc ctaagctgcc cctattccag tctccccagc 14940 cttccctccc tcctagcccc actctagttt tttctggttc tagtctctcc tatctcatat 15000 ttttctgctg ccatccttag gttgtctcca caggggtttc tggataataa tgatcataat 15060 cactggtgtt aaggggtacc tacttgatgc aagcatggag cttttttttt ttccagacag 15120 ggttttgttc tgtcgcccag gctggagtgc agtggtgtga tcctggctca ctgcagcctc 15180 gacctcctga gctcaagcaa tacaggcatg catcaccaaa ctcagctaat tttttttgta 15240 ttttttgtag agatggggtc ttaccatgtt gacgcatcag gctgttctga actcctggac 15300 tcaagcaatc cacccacctt ggcctcccaa aagtcaggga ttacaggcgt gcgaccacac 15360 cccgcatata tatatttttt tttttttttt tttttttttt tttttgagac agggtctctg 15420 ttatccaggc tggagttgca gtggataata tgactacgag ccttgaccta ggggttgaag 15480 caatgctcct gcctcagcca ccaagtgctg agactacagg cacacgccaa tctacactca 15540 atcacactca gctaattttt taaatttttt gtagggatgg ggtatcactg tgtttgccca 15600 ggctggtctt gaactcctgg cctcaagcag tctcctgcct tggcctccca aattgccggg 15660 attgtaggaa tgagccatgg cacttggctg ggggatagaa tttttttttt tttttttttt 15720 tttttttttt ttgagacagt ctcactctca ttgcccgggc tggagtgcag tggtgcaatt 15780 tcagctcact gcaacctctg cctcccaggc tcaagcaatt ctcctgcctc agcctataga 15840 gtagctggga ttacaggcga gcgccaccca tgcctggtta atttttgttt tttttttgag 15900 acagagtctc gccctgttgc ccaggctgga gtgcagtggc acgatctcag ctcactgcaa 15960 cctctgcctc ccaggctcaa gcaattctcc tgcctcagcc tcctgagtac tgggactaca 16020 agcgcgcaca accaccacac ctggtaattt ttgtattttt agtagagaca gggttttacc 16080 atattggcca ggctggtctc aaactcctga cctcatgatc cgacccacct tggcctccca 16140 aagtgcaggg attacaggcg tgagcctctg cacccggcct aacttttgta tttttagtag 16200 aaacagggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtcatgagct cctggcctca agtgatctgc 16260 ccgcctcagc ctcccaaagt gcttggatta caggtgtgag ccacctggcc tgagagttta 16320 ttatgcgcca ggcactaggc aaatggtttg catttatttt ctcattttat tgaatctaca 16380 aaatagtcct gtgaagtaaa cactgttact gttttcagct aaggaactgg atttagagta 16440 gtcaagtttt gtacctaagg tacgtggcta atgatacagg tctgttagat tccgtagccc 16500 tgattttaac caccctactg cctctcaaga attactaggt attgttctca tttatagatg 16560 ataaatctga ggctcagaaa agttaggcca cttgcctaag gtcccccagc caggattcaa 16620 actccaggag gcctgattcc aaacccatgc tctttagccc tccgccctac tgccttctta 16680 gactagcttc tgcttattct accattcctg atttcatttg aaccactgag ccctgcccct 16740 ttgtctgtct ttgggtatcc aggcaggtgg atgaactgca acaaccgctg gagcttaagc 16800 cagagccaga gctggagtca ttagagctgg aactagggct ggtgccagag ccagagctca 16860 gcctggactt agagccactg ctgaaggcag ggctggatct ggggccagag ctagagtctg 16920 tgctggagtc cactctggag cctgtgatag agcccacact atgcatggta tcacaaacag 16980 tgccagagcc agaccaagga cctgtatcac agccagtgcc agagccagat ttgccctgtg 17040 atctgagaca tttgaacact gagccaatgg aaagtaagtg atgagatgga gtggcacaca 17100 ttccctttcc tacctcttct ccctctccca ttacagaaaa agctgaactc caagctcctc 17160 attggagaga ggtccatctg tgattccttt ttttaggaat tacacatgcc ttcccccacc 17220 tccctgctct ttcatcccac aagttcccac tcaggctctt cccaggcctt tcctgccatc 17280 ctccctccct tgggctgctg ggttgggaac tcctaactaa gatcggggcc tcacttttct 17340 ctctggatta cctagtcttc agaaactgtg taaagattga agaaatcatg ccgaatggtg 17400 acccactgtt ggctggccag aacaccgtgg atgaggttta cgtctcccgc cccagccact 17460 tctacactga tggacccttg atgccttctg acttctagga accacatttc ctctgttctt 17520 ttcatatctc tttgcccttc ctactcctca tagcatgata ttgttctcca aggatgggaa 17580 tcaggcatgt gtcccttcca agctgtgtta actgttcaaa ctcaggcctg tgtgactcca 17640 ttggggtgag aggtgaaagc ataacatggg tacagagggg acaacaatga atcagaacag 17700 atgctgagcc ataggtctaa ataggatcct ggaggctgcc tgctgtgctg ggaggtatag 17760 gggtcctggg ggcaggccag ggcagttgac aggtacttgg agggctcagg gcagtggctt 17820 ctttccagta tggaaggatt tcaacatttt aatagttggt taggctaaac tggtgcatac 17880 tggcattggc cttggtgggg agcacagaca caggatagga ctccatttct ttcttccatt 17940 ccttcatgtc taggataact tgctttcttc tttcctttac tcctggctca agccctgaat 18000 ttcttctttt cctgcagggg ttgagagctt tctgccttag cctaccatgt gaaactctac 18060 cctgaagaaa gggatggata ggaagtagac ctctttttct taccagtctc ctcccctact 18120 ctgcccccta agctggctgt acctgttcct cccccataaa atgatcctgc caatctaatg 18180 tgagtgtgaa gtttgcacac tagtttatgc tacctagtct ccactttctc aatgcttagg 18240 agacagatca ctcctggagg ctggggatgg taggattgct ggggattttt ttttttttaa 18300 agagggtctc actctgttgc ccaggctaga gtgcaatggt gcaatcacag ctcactgcag 18360 cctcaacctc ctgggttcaa gcaatcctcc tacctcagcc tcctgggtag ctagcaccat 18420 ggcatcgcca ccatgcccta tttttttttt ttaaagacag ggtcttgcta tattgcccag 18480 gctggtcttg aactgggctc aagtgatcct cacgccttgc ctcccaaagt gctgggatta 18540 taggcatgag ccactgtgct tggccaggat tttttttttt ttttttttga gatggagttt 18600 ctctcttgtt gtccaggctg gagtgcaatg gtgtgatccg gggaattc 18648 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 ccacatagct gatctgaaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cgggaagcct taaggaata 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ctgaagagaa gaagataaa 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 acaagaagga tgaggagaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ccaagaagac tgaggtgaa 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 cagaatacgc catcaataa 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 gcacagaaga cggaggaaa 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 gcgatatatt ccagaaaca 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tgagctactt ggaggataa 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 gagtgaacac caagtgaaa 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 caagaaggat gaggagaaa 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 cgggaagagt ggaacaatt 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcattaacaa gcaggacaa 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tttggaaagt agagaagaa 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggaaagtaga gaagaaaat 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ggaaccacgc tctgggaaa 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tgattgagaa agagagatt 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 acattacggt gctgaaata 19 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gggaagagtg gaacaattt 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 agaatatcat ggtggaaga 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggaaatgtgt gtactaaaa 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 atgagaacat tgtgaagta 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 cacagaagac ggaggaaat 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 gctggtggct actaagaaa 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tctgaagaga agaagataa 19 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gcaagaatgc attgaacga 19 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 aagaaagatt gatggactt 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 aaaataaact gaagcggaa 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atgaggaaat gctgggaat 19 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 aaagaaagat tgatggact 19 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ggacttagcc ctcaaattt 19 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 acactggaca gctgaataa 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ctgaataaat gcagtatct 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 aagaatgcat tgaacgaat 19 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 ccagtaactt agtgacaca 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 ttaacaagca ggacaacaa 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gggagcaggt ggctgttaa 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 aaatcgagat cttaaggaa 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 ggaaatggta ttaagctca 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 ccagaatgtt taatgcaat 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ggacaagctt tcagaacct 19 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 acacataatg acaaccaaa 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 gcttggaggt agctgggta 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 cagcagagga actgtgcat 19 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 ccagaaacat tgaataagt 19 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 ctgaaatatt tgagacttc 19 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gtacagaata cgccatcaa 19 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gcaccgactt tgacaacat 19 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gagaagaaga taaaagtga 19 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ggaaattcaa agttgccaa 19 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 agaaagagct tgacagtaa 19 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 aggaattgga acagaaata 19 <210> 61 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 cagcataaca taaggaaaa 19 <210> 62 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 tcagaaatgt gaaggacaa 19 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 ggcaaagagt gatcagaaa 19 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 gcacagtgat gttagacaa 19 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 agtcatggct gctgagaat 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gtatagagca tgaaatcaa 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 ggttatgtgt atagagcat 19 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 gaaaggaagt agttcacaa 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 gatgtgaatg agagaaata 19 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 acagagaaca cgagaccaa 19 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 aagatgtgaa tgagagaaa 19 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 aggacaaggt tatgtgtat 19 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 cctgattaat gatgaacta 19 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 acacaaaagt gatgaacat 19 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 gcaattgaaa gaacagaaa 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 cgagagctgt ctaggttaa 19 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gaacatgacc ctatcacaa 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 agacaaacag aaagagctt 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 ggacaaggtt atgtgtata 19 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 tgacaataag agaaaggaa 19 <210> 81 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 ggaagtagtt cacaaaata 19 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 tgaaattgca agagctgaa 19 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 agaaatacac ctacgaaca 19 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 ccctaaagga actggatat 19 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 ggaggaattg gaacagaaa 19 <210> 86 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 cctaaaggaa ctggatata 19 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 agcgtaatct tcaggataa 19 <210> 88 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 tctgaaggaa gaaaggaaa 19 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 89 ggaagattta caagatgaa 19 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 tggcaaagag tgatcagaa 19 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 agagaaagga agtagttca 19 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 taatagagtt gctgaatgt 19 <210> 93 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 tggaggaatt ggaacagaa 19 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 agttgagact gttggtgaa 19 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 gataaagatg tgaatgaga 19 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 catcgttact gaagagctt 19 <210> 97 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 tgaagtatct gtatccaaa 19 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gcacaaggtg gcaggatgt 19 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 tgtcacagct ggatgatca 19 <210> 100 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gaaagagctt gacagtaaa 19 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 tcaagagcct ggaagattt 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 tggaagattt acaagatga 19 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 atgaactagt ggagtggaa 19 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 tgagactgtt ggtgaaatt 19 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 ttgcaagagc tgaattata 19 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 ggatttagga agttcaaca 19 <210> 107 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 ggaacttgat ggccctaaa 19 <210> 108 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 ggaactggat atatcaaga 19

Claims (14)

  1. 탈모 질환의 치료 방법으로서,
    치료가 필요한 포유류 개체에게 Jak1 및/또는 Jak2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 탈모 질환의 치료 방법으로서,
    치료가 필요한 포유류 개체에게 Stat1 및/또는 Stat2 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 개체에서 모발 생장(hair growth)을 유도하는 방법으로서,
    (a) 개체에게 Jak/Stat 저해제를 유효량으로 투여하여, 개체에서 모발 생장을 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 저해제가 서열번호 1, 3, 5 또는 7을 포함하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 개체는 탈모 질환을 앓고 있는 개체인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 탈모 질환이 탈모증(androgenetic alopecia), 휴지기 탈모증(telogen effluvium), 원형 탈모증, 머리 백선(tinea capitis), 전두 탈모증(alopecia totalis), 감모증(hypotrichosis), 유전성 단순 감모증(hereditary hypotrichosis simplex) 또는 전신 탈모증(alopecia universalis)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 투여되는 저해제가, 탈모 질환을 앓고 있는 개체에 있어서 치료하기 전에 비해 개체의 모발 생장을 유도하는지를 판단하는 단계 (b)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 저해제가 Jak1, Jak2, Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 특이적으로 저해하는 안티센스 RNA; Jak1, Jak2, Stat1 또는 Stat2 단백질을 코딩하는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA; 또는 소분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 저해제가 INCB 018424인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 소분자가 AG490, CYT387, SB1518, LY3009104, TG101348, BMS-911543 또는 CEP-701인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 소분자가 플루다라빈(fludarabine), 에피갈로카테킨-3-갈레이트 (EGCG), 또는 하이퍼포린(hyperforin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 2, 4, 6 또는 8을 포함하는 인간 핵산 서열에 대한 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 상기 Jak1 유전자에 대한 siRNA가 표 11에 열거된 서열들 중 임의의 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상기 Stat1 유전자에 대한 siRNA가 표 12에 열거된 서열들 중 임의의 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
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