JP6979582B6 - 変異型蛋白質、及び該変異型蛋白質を発現し円形脱毛を発症する遺伝子改変マウス - Google Patents
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Description
しかしながら、この「C3H/HeJマウス」が世界でも唯一の円形脱毛症モデルマウスであり、それ以外の円形脱毛症モデルマウスは知られていない。
配列番号1で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンが、フェニルアラニン、トリプトファン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列において、該591位のアミノ酸以外の1~数個のアミノ酸が置換若しくは欠失、又は1~数個のアミノ酸が挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質。
〔2〕〔1〕に記載の変異型蛋白質をコードするDNA。
〔3〕〔1〕に記載の変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウス。
〔4〕〔3〕に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与
する工程を含む、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
〔5〕〔3〕に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法。
〔6〕配列番号8に記載の塩基配列を含むDNA。
〔7〕〔6〕に記載のDNAをマウスへ導入する工程を含む、〔3〕に記載の遺伝子改変マウスの作製方法。
本発明の一実施態様に係る変異型蛋白質は、マウスCCHCR1蛋白質のアミノ酸配列(配列番号1)の591位のアルギニン(Arg)が、フェニルアラニン(Phe)、トリプトファン(Trp)又はチロシン(Tyr)に置換されたアミノ酸配列からなる。
このような変異型蛋白質としては、該変異型蛋白質のアミノ酸配列において、591位のアミノ酸以外の1~数個のアミノ酸が置換又は欠失したアミノ酸配列からなる変異型蛋白質や、該変異型蛋白質のアミノ酸配列において、1~数個のアミノ酸が挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質が挙げられる。
1~数個とは、好ましくは1~70個、より好ましくは1~50個、さらに好ましくは1~30個、よりさらに好ましくは1~10個、特に好ましくは1~5個、格段に好ましくは1~3個である。アミノ酸がN末端側及び/又はC末端側に付加される場合も同様である。
尚、図1Aにおいて、Hap26の配列を配列番号11、Hap01の配列を配列番号12、Pan troglodytesの配列を配列番号13、Macaca mulatttaの配列を配列番号14、Canis lupus familiarisの配列を配列番号15、Bos taurusの配列を配列番号16、Mus musculusの配列を配列番号17、Xenopus tropicalisの配列を配列番号18とする。
円形脱毛症患者171個体と健常者560個体とを用い、ヒトMHC領域内における22座位のマイクロサテライトを用いて、円形脱毛症に関連する変異の解析を実施した。この結果、D6S2811のアリル208にて最も強い関連を示した(OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5)(図1C)。ペアワイズ連鎖不平衡解析によれば、MHC領域において長く強い連鎖不平衡が確認された。D6S2811からD6S2930までの3座位でのハプロタイプの中で、円形脱毛症に強く関連するハプロタイプが一つ見いだされた(MShap01, OR = 3.78, CI95% = 2.00-7.16, P = 6.57×10-5)。
次に、円形脱毛症の原因変異を同定するために、リスクハプロタイプを有する5個体ならびにこれを持たない7個体を対象に、4.97 MbのMHC領域(chr6: 28477797-33451433, hg19)をシークエンシングした。すべてのリスクハプロタイプはヘテロ接合であるため、
円形脱毛症の原因変異はヘテロ接合であることが期待されたところ、合計12個体には77,040個の変異が認められ、そのうちヘテロ接合の変異は3,895個であった。このうち5個のリスクハプロタイプのみに共通して観察される変異は16個であり、遺伝子上にあってアミノ酸置換を伴う変異は、cchcr1遺伝子上に見いだされた一つの変異のみであった(rs142986308とする。)。さらに、これら16個の変異は651.7 kbの領域にわたり、互いに強い連鎖不平衡を示していた(図1D)。
次に、全個体を用いて全エクソンをシークエンシングしたところ、rs142986308のみが5個体すべてに共有され、優位な関連を示した(OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5)。
さらに、rs142986308のcchcr1内に見出された24個のSNVにてハプロタイプ解析を行ったところ、アリルTを有する上記Hap26のみが統計学的有意性を示し(OR = 3.41, CI95% = 1.94-5.99, P = 3.39×10-5)、さらに、すべてハプロタイプの中でrs142986308のアリルTを有するハプロタイプはHap26のみであった(図1E)。
尚、図1Eにおいて、Hap01の配列を配列番号19、Hap02の配列を配列番号20、Hap03の配列を配列番号21、Hap04の配列を配列番号22、Hap05の配列を配列番号23、Hap06の配列を配列番号24、Hap07の配列を配列番号25、Hap08の配列を配列番号26、Hap09の配列を配列番号27、Hap10の配列を配列番号28、Hap11の配列を配列番号29、Hap12の配列を配列番号30、Hap13の配列を配列番号31、Hap14の配列を配列番号32、Hap15の配列を配列番号33、Hap16の配列を配列番号34、Hap17の配列を配列番号35、Hap18の配列を配列番号36、Hap19の配列を配列番号37、Hap20の配列を配列番号38、Hap21の配列を配列番号39、Hap22の配列を配列番号40、Hap23の配列を配列番号41、Hap24の配列を配列番号42、Hap25の配列を配列番号43、Hap26の配列を配列番号44とする。
さらに、円形脱毛症と関連を示す5個のアリル(コアアリル)で、EHH (extended haplotype homozygosity)を実施した(図1F)。rs142986308のアリルTを含むハプロタイプでは、最も長い(93.7 kb)rs1576 とD6S2931の間でEHH値1を示した。これはHap26が近年その頻度を患者集団で増加させていたことを表している。また、近接した座位に患者群で頻度が上昇しているアリルは、この影響によるヒッチハイキング効果によるものと考えられる。
このように、Hap26は、円形脱毛症患者で遺伝統計学的に有意に多いハプロタイプであり、これに含まれるrs142986308のアリルTが円形脱毛症の原因変異である。このことから、587位のアルギニンに相当する591位のアルギニンがトリプトファンに置換されたマウスは、ヒト円形脱毛症のモデルマウスとして有効である。
本発明の他の実施態様は、前記変異型蛋白質をコードするDNAである。前記変異型蛋白質をコードしていればその塩基配列は特段制限されない。前記変異型蛋白質を構成する各アミノ酸をコードするコドンは公知であるため、各アミノ酸をコードするDNAの塩基配列は当業者であれば特定することができる。
本発明の他の実施態様は、前記変異型蛋白質を発現し、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウスである。
本実施態様におけるマウスの系統は、所望の遺伝子改変が行える系統であれば制限されない。例えばC57BL/6N系統マウスなどが挙げられる。
CRISPR-Cas9システムの好ましい態様として実施例欄に記載された態様が挙げられるが、マウス生体内で前記変異型蛋白質が発現される限りその態様に限定されない。
Cas9 mRNAの配列設計、単鎖ガイドRNA(sgRNA)の配列設計、及び一本鎖DNA (ssODN)の配列設計は、例えば、配列番号1で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンをトリプトファンに置換する場合には、(a)cchcr1遺伝子の1,936塩基目のC(シトシン)がT(チミン)に置換され、かつ、(b)1,938塩基目のT(チミン)がG(グアニン)に置換されるように設計すればよく、常法に基づくことができる。
尚、これらはゲノムDNA上でみれば、それぞれ、(a)マウス17番染色体の35,528,927番目のC(シトシン)がT(チミン)に置換され、35,528,929番目のT(チミン)がG(グアニン)に置換されている場合と、(b)35,528,927番目のG(グアニン)がA(アゲニン)に置換され、35,528,929番目のA(アデニン)がC(シトシン)に置換されている場合とに対応するものである。
配列番号1で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンをフェニルアラニン又はチロシンに置換する場合にも、それぞれの場合に対応するようにcchcr1遺伝子の塩基を置換すればよい。
マウスの遺伝子改変は常法に従えばよく、好ましい態様として挙げられるのは、実施例欄に記載された態様であるが、当該態様に限定されない。
本発明の他の実施態様は、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法である。
本実施態様に係るスクリーニング方法は、前記遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与する工程を含む。
該脱毛症としては、男性型脱毛症、女性男性型脱毛症(びまん性脱毛症)、円形脱毛症、牽引性脱毛症、分娩後脱毛症、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症が挙げられる。好ましくは円形脱毛症である。
該治療薬又は予防薬には、該治療薬又は予防薬の有効成分などの素材も含まれる。また、投与には摂取だけでなく外用剤等の場合の塗布も含まれる。
このような効果がみられるまでの時間は、初回の投与から短時間であることが好ましく、例えば、6か月以内、好ましくは3か月以内、より好ましくは1か月以内である。
このようにして決定された脱毛症の治療薬は、脱毛症にまだ罹患していない対象や罹患する可能性が高い対象などに対する脱毛症の予防薬としても用いられる。
予防薬の開発や一般的な医薬の開発において行われている従来法の手順に従うことができる。
本発明の他の実施態様は、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法である。
本実施態様に係るスクリーニング方法は、前記遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む。
該脱毛症としては、男性型脱毛症、女性男性型脱毛症(びまん性脱毛症)、円形脱毛症、牽引性脱毛症、分娩後脱毛症、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症が挙げられる。好ましくは円形脱毛症である。
該化粧品には、該化粧品の脱毛症の改善用途又は予防用途における有効成分などの素材も含まれる。
このような効果がみられるまでの時間は、初回の塗布から短時間であることが好ましく、例えば、6か月以内、好ましくは3か月以内、より好ましくは1か月以内である。
このようにして決定された脱毛症の改善用の化粧品は、脱毛症をまだ発症していない対象や発症する可能性が高い対象などに対する脱毛症の予防用の化粧品としても用いられる。
非特許文献3に記載の方法に従い、pBGKプラスミドを用いてCas9 mRNAを準備した。
CHOPCHOP(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/)を用いて下記2種の単鎖ガイドRNA (sgRNA)を準備した。
guide1: GCTGTGTCAGCTCCTGACGGAGG(配列番号2)
guide2: GGAAGCTGCCAGCCTCCGTCAGG(配列番号3)
上記sgRNA合成のための鋳型は、pUC57-sgRNAベクター(プラスミドバンクaddgene、#51132)を鋳型とし下記プライマーセットを用いたPCRで増幅した。
sgRNA 1用:5'-TAATACGACTCACTATAGGGCTGTGTCAGCTCCTGACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'(配列番号4)、及び5'-AAAAAAAGCACCGACTCGG-3'(配列番号5)
sgRNA 2用:5'-TAATACGACTCACTATAGGGGAAGCTGCCAGCCTCCGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3'(配列番号6)、及び5'-AAAAAAAGCACCGACTCGG-3'(配列番号7)
PCR後の電気泳動ゲルから精製したPCR産物(400 ng)をMEGAshortscript T7 Kit (Ambion社)によるRNA合成に用いた。その手順はキットに添付されたマニュアルに従った。
MEGAclear Kit (Ambion社)を用いてCas9 mRNAとsgRNAを精製し、Ultrafree-MC filter (HV; 0.45μmポアサイズ、ミリポア社)を通して、後述するマウス受精卵へのマイクロインジェクションする際に、針が目詰まり(clogging)しないようにした。
下記一本鎖DNA (ssODN)の合成をIDT (Integrated DNA Technologies社)に委託した。
5'-CAGCAGTTGGAGGCAGCACGTCGGGGCCAGCAGGAGAGCACGGAGGAAGCTGCCAGCCTCtGgCAGGAGCTGACACAGCAGCAGGAAATCTACGGGCAAGGTGTGGGGGCGTGGCGGTGTGTG-3'(配列番号8)
C57BL/6N系統マウスの受精卵(1細胞期)に10 ng/μl Cas9 mRNA、10 ng/μl sgRNA、及び20 ng/μl ssODNをマイクロインジェクションした。その後、該受精卵をKSOM培地で一晩培養し、非特許文献4の方法に従って、偽妊娠のICR系統雌マウスの卵管に2細胞期胚を移植した。
(遺伝子型)
作製したマウスの耳からイヤーパンチにより組織を取得し、180 μlの50 mM NaOH溶液を加え、95℃で10分間インキュベートした。20 μlの1 M Tris-HCl (pH 8.0)で中和し遠心してPCRのためにライセートを得た。PCRは、1 μlのライセート、0.2 UのKOD FX Neo (TOYOBO社)、5 μlの2×PCRバッファ、2 μlのdNTP(各2 mM)、及び0.2 μM(終濃度)の各プライマーを含む10 μlの反応量で行った。ForwardプライマーとしてAGCTGAGTGCCCACCTGAT(配列番号9)、ReverseプライマーとしてTGTGTCTCAGTGCTGCCTTC(配列番号10)を用いた(いずれもgreiner bio-one社に合成を委託したものである。)。PCR条件は、はじめに94℃で2分間の熱変性をし、その後、98℃で10秒間と60℃で25秒間を35サイクルとした。遺伝子配列の決定は、従来のサンガー法に従って行った。
その結果、cchcr1遺伝子の1,936塩基目のC(シトシン)がT(チミン)に置換され、1,938塩基目のT(チミン)がG(グアニン)に置換されていることが確認された。
作製されたマウスの約50%は、生後4~8か月後に、その背部にパッチ状の脱毛を示した(図2)。脱毛が確認されたマウスの中には、時間経過とともにその脱毛部位が拡大したマウスも多かったが、初期の脱毛のままのマウスも見られた。また、脱毛したマウスの雌と雄の比は4:1であった。
脱毛した皮膚表面を観察すると、黒いスポット(白丸で囲った部分)や折れた毛髪(白色の矢印)、先細りの毛髪(黒色の矢印)が認められた(図3a及び図3b)。これらは円形脱毛症患者に特徴的な脱毛皮膚表面である。尚、図3aは倍率20倍、図3bは倍率32倍の画像である。また、脱毛領域に毛包が確認され、リンパ球浸潤などの兆候は観察されなかった(図4)。
毛幹を走査型電子顕微鏡(SEM)で観察した結果を図5に示す。作製したマウスでは、
黒いスポットや折れた毛髪、先細りの毛髪など、角質の構造異常や毛幹の平板化などの異常が観察された。この構造異常は脱毛していないマウスでも認められ、すなわちこの遺伝子改変マウスのすべてで認められた構造異常である。そしてこのような角質の構造異常はヒトの円形脱毛症患者でも観察されるものである(非特許文献5)。
Claims (8)
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列の591位のアルギニンがトリプトファンに置換されたアミノ酸配列からなる変異型蛋白質。
- 請求項1に記載の変異型蛋白質をコードするDNA。
- 請求項1に記載の変異型蛋白質を発現し、配列番号1で表されるアミノ酸配列の591位に対応するアミノ酸残基がアルギニンであるCCHCR1蛋白質を発現しない、円形脱毛を発症する遺伝子改変マウス。
- 請求項3に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の治療薬の候補又は予防薬の候補を投与する工程を含む、脱毛症の治療薬又は予防薬のスクリーニング方法。
- 請求項3に記載の遺伝子改変マウスに脱毛症の改善用又は予防用の化粧品の候補を塗布する工程を含む、脱毛症の改善用又は予防用の化粧品のスクリーニング方法。
- 配列番号8に記載の塩基配列を含むDNA。
- 請求項6に記載のDNAをマウスの受精卵へ導入して、該マウスのcchcr1遺伝子の1,936塩基目のシトシンをチミンに置換し、1,938塩基目のチミンをグアニンに置換する工程を含む、請求項3に記載の遺伝子改変マウスの作製方法。
- マウスの受精卵において、cchcr1遺伝子の1,936塩基目のシトシンをチミンに置換し、1,938塩基目のチミンをグアニンに置換する工程を含む、遺伝子改変マウスの作製方法。
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