ES2306456T3 - Db, el receptor para la leptina, acidos nucleicos codificantes del receptor y sus usos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION DE UN RECEPTOR PARA UN FACTOR DE SACIEDAD, QUE ESTA IMPLICADO EN LA HOMEOSTASIS DEL PESO CORPORAL. LAS MUTACIONES DE ESTE RECEPTOR ESTAN ASOCIADAS CON FENOTIPOS OBESOS. ESPECIALMENTE, LA INVENCION SE RELACIONA CON LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DEL RECEPTOR DE LEPTINA, INCLUYENDO UNA FORMA SOLUBLE DE DICHO RECEPTOR, PRESENTE EN LA NATURALEZA, LA CUAL SE SUPONE QUE MODULA LA ACTIVIDAD DE LA LEPTINA, ESPECIALMENTE QUE AGONIZA LA ACTIVIDAD DE LA MISMA. LA INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA DICHO RECEPTOR Y A METODOS PARA LA UTILIZACION DEL MISMO, P.EJ. PARA IDENTIFICAR LOS ANALOGOS DE LEPTINA, TANTO EN TERAPEUTICA, COMO EN TERAPIA GENICA O EN FORMA SOLUBLE COMO AGONISTA O ANTAGONISTA DE LA ACTIVIDAD DE LEPTINA, O EN DIAGNOSTICO.
Description
DB, el receptor para la leptina, ácidos
nucléicos codificantes del receptor y sus usos.
La investigación que conduce a la presente
invención se realizó, en parte, con una subvención concedida por el
Instituto Nacional de la Salud, RO1 DK41096-07. Por
consiguiente, el Gobierno estadounidense puede tener ciertos
derechos en la invención.
La presente invención se refiere a la
identificación de un receptor de un factor saciante que participa en
la homeostasis del peso corporal. Las mutaciones de este receptor
están asociadas con fenotipos de la obesidad. En concreto, la
presente invención se refiere a la identificación y a la
caracterización del receptor de la leptina, incluyendo una forma
soluble natural del receptor que se espera que module la actividad
de la leptina, en particular, que sea agonista de la actividad de
la leptina. La invención se refiere además a los ácidos nucleicos
que codifican el receptor y a los procedimientos para usar el
receptor, p. ej., para identificar los análogos de leptina
terapéutica o diagnósticamente.
La obesidad, definida como un exceso de la grasa
corporal en relación con la masa corporal magra, está asociada con
importantes morbosidades psicológicas y médicas, incluyendo las
últimas hipertensión, lípidos elevados en sangre y diabetes
mellitus no insulinodependiente (DMNID) o de tipo II. Existen de
6-10 millones de individuos con DMNID en Estados
Unidos, incluyendo el 18% de la población de 65 años de edad [Harris
et al., Int. J. Obes., 11:275-283 (1987)].
Aproximadamente el 45% de los varones y el 70% de las mujeres que
padecen DMNID son obesos, y su diabetes mejora sustancialmente o se
elimina mediante la reducción de peso [Harris, Diabetes
Care, 14(3): 639-648 (1991)]. Como se
describe abajo, tanto la obesidad como la DMNID tienen un elevado
factor hereditario.
La asimilación, el almacenamiento y la
utilización de la energía de los nutrientes constituyen un complejo
sistema homeostático fundamental para la supervivencia de los
metazoos. Entre los mamíferos terrestres, el almacenamiento en el
tejido adiposo de grandes cantidades de combustible metabólico como
triglicéridos es crucial para sobrevivir durante los períodos de
privación de alimentos. La necesidad de mantener un nivel estable
de reservas energéticas sin que se produzcan alteraciones continuas
del tamaño y la forma del organismo requiere alcanzar un equilibrio
entre la ingesta y el gasto energético.
El nivel de adiposidad de un individuo está, en
gran medida, determinado genéticamente. Los estudios de las tasas
de concordancia del peso corporal y la adiposidad entre gemelos
mono- y dicigóticos o entre adoptados y sus padres biológicos han
sugerido que el carácter hereditario de la obesidad
(0,4-0,8) supera el de muchos otros rasgos de los
que comúnmente se consideraba que tenían un considerable componente
genético, tal como la esquizofrenia, el alcoholismo y la
aterosclerosis [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322:
1483-1487 (1990)]. También se ha informado sobre
las similitudes familiares en las tasas del gasto energético
[Bogardus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)].
El análisis genético en poblaciones delimitadas geográficamente ha
sugerido que hay un número relativamente pequeño de genes que pueden
ser responsables del 30-50% de la varianza de la
composición corporal [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49:
1243-1255 (1991)].
Los modelos de la obesidad en roedores incluyen
siete mutaciones aparentemente de un único gen. Las mutaciones de
la obesidad en roedores que se han estudiado con mayor profundidad
son los genes ob (obesidad) y db (diabetes). Cuando
están presentes en los mismos antecedentes de una cepa genética,
ob y db dan como resultado fenotipos metabólicos y de
comportamiento indistinguibles, lo que sugiere que estos genes
pueden funcionar en la misma ruta fisiológica [Coleman et
al., Diabetologia, 14:141-148 (1978)].
Los ratones homocigóticos para cualquier mutación son hiperfágicos
e hipometabólicos, lo que conduce a un fenotipo de la obesidad que
se manifiesta con un mes de edad. El peso de estos animales tiende a
estabilizarse en 60-70 g (en comparación con los
30-35 g de los ratones control). Los animales con
ob y db manifiestan miles de otros cambios hormonales
y metabólicos que han complicado la identificación del defecto
primario atribuible a la mutación [Bray et al., Am. J. Clin.
Nutr., 50: 891-902 (1989)]. Como se indica más
abajo la identificación del gen OB condujo al entendimiento
de un elemento molecular.
Cada modelo de obesidad en roedores está
acompañado por alteraciones del metabolismo de los carbohidratos
que se asemejan a aquéllas producidas en la diabetes de tipo II en
el hombre. En algunos casos, la gravedad de la diabetes depende en
parte de la cepa anterior de los ratones [Leiter,
Endocrinology, 124: 912-922 (1989)]. Tanto
para ob como para db, los ratones C57BL/Ks congénitos
desarrollan una diabetes grave con la necrosis final de las células
\beta y una atrofia de los islotes, resultando en una
insulinopenia relativa. Por el contrario, los ratones ob y
db C57BL/6J congénitos desarrollan una diabetes
insulino-resistente transitoria que queda
finalmente compensada por una hipertrofia de las células \beta
semejante a la diabetes de tipo II en seres humanos.
El fenotipo de los ratones ob y db
se asemeja a la obesidad humana en modos distintos al desarrollo de
la diabetes: los ratones mutantes comen más y gastan menos energía
que los controles magros (tal y como hacen los seres humanos
obesos). Este fenotipo también es muy similar al observado en
animales con lesiones en el hipotálamo ventromedial, lo que sugiere
que ambas mutaciones pueden interferir en la capacidad integrar
adecuadamente o responder a la información nutricional en el sistema
nervioso central. La confirmación de esta hipótesis proviene de los
resultados obtenidos en experimentos sobre la parabiosis [Coleman,
Diabetologia, 9: 294-298 (1973)] que
sugieren que los ratones ob son deficientes en un factor
saciante circulante y que los ratones db son resistentes a
los efectos del factor ob (posiblemente, debido a un defecto
del receptor ob). Estos experimentos han llevado a la conclusión de
que la obesidad en estos ratones mutantes puede ser el resultado de
diferentes defectos en un bucle aferente y/o un centro de
integración del mecanismo de retroalimentación postulado que
controla la composición corporal.
Mediante el uso de marcadores genéticos clásicos
y moleculares, se han mapeado los genes ob y db hasta
el cromosoma proximal 6 y en el cromosoma medio 4, respectivamente
[Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU., 87:
8642-8646 (1990); Friedman et al.,
Genomics, 11:1054-1062(1991)]. En
ambos casos las mutaciones se mapean hasta regiones del genoma del
ratón que son sinténicas con el ser humano, lo que sugiere que, si
hay homólogos humanos de ob y db, es probable que se
mapeen, respectivamente, en los cromosomas humanos 7q y 1p. Los
defectos del gen db pueden dar como resultado la obesidad en
otras especies de mamíferos: en cruzamientos genéticos entre ratas
fa/fa Zucker y ratas +/+ Brown Norway, la mutación fa
(cromosoma 5 de rata) está flanqueada por los mismos locus que
flanquean db en el ratón [Truett et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. EE.UU., 88: 7806-7809
(1991)].
(1991)].
Con la clonación del gen ob, se
profundizó en la comprensión de la base molecular de la obesidad. El
gen de la obesidad (ob) en ratones codifica un factor de
señalización derivado del tejido adiposo para la homeostasis del
peso corporal [Zhang et al., Nature, 372:425 (1994);
Solicitud de patente estadounidense n.º 08/292.345 presentada el 17
de agosto de 1994; Solicitud de patente estadounidense N.º:
08/483.211, presentada el 7 de junio de 1995; Solicitud de patente
internacional N.º: WO 96/05309, publicada el 22 de febrero de
1996]. Varios estudios recientes han demostrado que la proteína OB
recombinante (leptina) purificada de Escherichia coli puede
corregir los fenotipos relacionados con la obesidad en ratones
ob/ob cuando se administra exógenamente [Campfield
et al., Science, 269:546 (1995)]. Tartaglia et al.,
Cell, 83:1263 (1995) revelan un receptor de la leptina. Los
documentos WO 97/25424; WO 97/25425 y WO 97/19952 revelan cada uno
un receptor soluble de la leptina.
La presente invención se dirige a un polipéptido
receptor soluble de la leptina (OB-R) según lo
definido en las reivindicaciones. La invención también se dirige a
un derivado del receptor de la leptina reivindicado unido a un
resto químico. La invención también se dirige a un ácido nucleico
aislado codificante del receptor de la leptina reivindicado.
La invención también se dirige a un ácido
nucleico aislado codificante en la expresión de un polipéptido
receptor soluble de la leptina que tiene la capacidad de unirse a
la leptina, que es:
- a)
- una molécula de ADN según lo expuesto en SEQ ID NO: 9;
- b)
- la secuencia complementaria de la molécula de ADN definida en (a);
- c)
- una molécula de ADN que codifica en la expresión el polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ADN anteriores.
La invención también se dirige a un vector que
comprende tal ADN.
La invención también se dirige a un huésped
unicelular transformado o transfectado con tal molécula de ADN o
vector.
La invención también se dirige a un
procedimiento para preparar un polipéptido receptor de la leptina
que comprende:
- a)
- cultivar la célula transformada o transfectada anterior en condiciones que proporcionen la expresión del polipéptido receptor de la leptina; y
- b)
- recuperar el polipéptido expresado.
La invención también se dirige a un anticuerpo
específico del receptor de la leptina reivindicado.
La invención también se dirige a una línea
celular inmortal que produce un anticuerpo monoclonal específico
para el receptor de la leptina reivindicado.
La invención también se dirige a un
procedimiento para preparar un anticuerpo específico para el
receptor soluble de la leptina reivindicado que comprende:
- a)
- inmunizar un animal huésped con el receptor de la leptina reivindicado mezclado con un adyuvante y/o conjugado con una proteína vehículo y
- b)
- obtener el anticuerpo del animal huésped inmunizado.
La invención se dirige además a un procedimiento
para medir la presencia del receptor soluble de la leptina
reivindicado en una muestra, que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra sospechosa de contener el receptor de la leptina con un anticuerpo que se una específicamente al receptor soluble de la leptina reivindicado, estando el anticuerpo opcionalmente unido a un soporte en fase sólida, en condiciones que permitan la formación de complejos de reacción que comprendan el anticuerpo y el receptor de la leptina; y
- b)
- detectar la formación de complejos de reacción que comprendan el anticuerpo y el receptor de la leptina en la muestra,
en el que la detección de la
formación de los complejos de reacción indica la presencia del
receptor de la leptina en la
muestra.
La invención también se dirige a una composición
farmacéutica que comprende el receptor soluble de la leptina
reivindicado y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso
en medicina.
La invención también se dirige al uso del
receptor soluble de la leptina reivindicado en la fabricación de un
medicamento para tratar la obesidad en un sujeto.
La invención también se dirige a un equipo que
comprende la anterior composición farmacéutica y una composición
farmacéutica destinada al tratamiento de la diabetes, la presión
sanguínea elevada o el colesterol elevado.
La invención se dirige además a una composición
cosmética que mejora el aspecto corporal para reducir el peso
corporal de un individuo que comprende el receptor soluble de la
leptina reivindicado y un vehículo aceptable.
La invención también se dirige a un
procedimiento de tratamiento cosmético para mejorar el aspecto
corporal que comprende administrar al sujeto una composición que
comprende el receptor soluble de la leptina reivindicado y un
vehículo aceptable.
Los aspectos y las realizaciones de la siguiente
descripción que no se refieren específicamente a la invención
reivindicada se incluyen únicamente a modo ilustrativo y
comparativo.
También se revelan en la presente memoria un
polipéptido receptor de la leptina (OB-R), ácidos
nucleicos codificantes de tal polipéptido, ácidos nucleicos no
codificantes que flanquean las secuencias codificantes del gen,
oligonucleótidos que se hibridan con tales ácidos nucleicos,
anticuerpos frente al polipéptido, y composiciones y procedimientos
cosméticos, terapéuticos y de diagnóstico que utilizan el
polipéptido, los ácidos nucleicos o los anticuerpos, o
combinaciones de los mismos.
De este modo, en un primer aspecto de esta
revelación, el receptor de la leptina (también denominado en la
presente memoria receptor OB o OB-R) se caracteriza
por la unión específica a la leptina en condiciones fisiológicas;
la expresión a niveles elevados en células del hipotálamo y la
expresión a niveles más bajos en el tejido adiposo, los testículos,
el corazón y el cerebro; y que tiene una similitud secuencial con
los receptores de la citoquina
gp130.
gp130.
En los ejemplos específicos, infra, el
receptor de la leptina se selecciona del grupo constituido por
OB-Ra (SEQ ID NO:2), OB-Rb (SEQ ID
NO:4), OB-Rc (SEQ ID NO:6), OB-Rd
(SEQ ID NO:8) y OB-Re (SEQ IDNO:10), o variantes
alélicas de los mismos. Alternativamente, el receptor de la leptina
puede tener una secuencia seleccionada del grupo constituido
por:
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Ra a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a una C-terminal seleccionada del grupo constituido por OB-Rb, OB Rc y OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rb o OB-Rc a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra o OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rd a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb o OB-Rc;
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Pro^{664} a Lys8^{89} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd; y
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Met^{733} a Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd; y
- \quad
- N-terminal seleccionada del grupo constituido por OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd y OB-R de Pro^{664} a His^{796} y OB-Re desde His^{796};
- \quad
- N-terminal seleccionada del grupo constituido por OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd y OB-R de Met^{733} a His^{796}, y OB-Re desde His^{796}, o variantes alélicas de las mismas.
En otra realización, el receptor de la leptina
que puede tener una secuencia N-terminal se
selecciona del grupo constituido por
- \quad
- los residuos de aminoácidos 1-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 23-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 28-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 133-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 733-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 1-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 23-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 28-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 133-796; y
- \quad
- los residuos de aminoácidos 733-796; y
una secuencia
C-terminal se selecciona del grupo constituido por
SEQ ID NO:11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; y SEQ ID
NO: 15, estando la numeración basada en la secuencia de aminoácidos
del receptor de la leptina murino transcrito en longitud completa,
incluyendo el péptido señal, o sus variantes
alélicas.
En una realización específica, el receptor de la
leptina es un receptor soluble. Tal receptor soluble se puede
seleccionar del grupo constituido por OB-Re; una
secuencia N-terminal que se selecciona del grupo
constituido por OB-Ra, OB-Rb,
OB-Rd y OB-R de Pro^{664} a
His^{796}, y una secuencia C-terminal que es
OB-Re desde His^{796}; y OB-R de
Met^{733} a His^{796}, y una secuencia
C-terminal que es OB-Re desde
His^{796}; una secuencia N-terminal que se
selecciona del grupo constituido por
- \quad
- los residuos de aminoácidos 1-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 23-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 28-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 133-796; y
- \quad
- los residuos de aminoácidos 733-796; y
una secuencia
C-terminal que es la SEQ ID NO: 15; estando la
numeración basada en la secuencia de aminoácidos del receptor de la
leptina murino transcrito en longitud completa, incluyendo el
péptido señal, o sus variantes alélicas. En una realización
específica, el OB-R soluble se produce en un sistema
de expresión de baculovirus
recombinante.
Las realizaciones anteriores incluyen aquéllas
en las que el terminal N o el terminal C, o ambos, incluyen los
residuos de aminoácidos no naturales, tales como péptidos señal
heterogéneos o residuos de sitio de escisión de péptidos señal. Por
ejemplo, en realizaciones específicas, se revelan en la presente
memoria las siguientes formas solubles de OB-R:
La presente revelación contempla además diversas
mutaciones y sustituciones. Por ejemplo, es posible sustituir
residuos de aminoácidos muy divergentes de una especie (p. ej.,
ratón) por el correspondiente residuo de otra especie (p. ej., ser
humano) para producir un receptor de la leptina biológica y
funcionalmente activo, o un fragmento del mismo. Alternativamente,
se pueden sustituir ciertos residuos estructurales o estructurales
putativos por residuos que aumenten o disminuyan tal propensión
estructural. En una realización específica, infra, se pueden
sustituir residuos de cisteína o parejas de cistina por serina (u
otro residuo de aminoácido comparable tal como treonina, metionina,
alanina, etc.) para eliminar los enlaces tipo disulfuro. En una
realización específica, infra, uno o más entre Cys 188 y
193, 471, y 602, 471 y 526, y 602 y 611 son mutados a Ser,
produciendo así una proteína que no forma disulfuros. Tales
sustituciones pueden evitar la formación de entrecruzamientos de
tipo disulfuro incorrectos durante la expresión en un sistema
diseñado genéticamente y además se prefieren para la
cristalización.
Alternativamente, el receptor de la leptina
comprende un dominio transmembrana y es una proteína integral de
membrana. En esta realización, el receptor de la leptina puede
comprender además un motivo de unión a JAK seleccionado entre
"Región 1", "Región 2" y "Región 1" y "Región
2", estando el motivo secuencia abajo del dominio
transmembrana.
En una realización específica, el receptor de la
leptina es un receptor de la leptina humano. En otra realización
específica, ejemplificada infra, el receptor de la leptina es
un receptor de la leptina murino. En otra realización más, el
receptor de la leptina es un receptor de la leptina humano que
comprende una sustitución de aminoácidos divergentes desde la
posición correspondiente del receptor de la leptina murino. En otra
realización, el receptor de la leptina es un receptor de la leptina
humano que comprende sustituciones de aminoácidos conservativas. En
una realización específica, las sustituciones de aminoácidos
conservativas del receptor de la leptina murino se hacen en el
receptor de la leptina humano. En otra realización más, se hacen
sustituciones de aminoácidos conservativas que mejoran la
estructura secundaria, p. ej., la propensión
\alpha-helicoidal.
También se revela un fragmento antigénico del
receptor de la leptina. En una realización específica, el fragmento
antigénico se selecciona del grupo constituido por SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34.
Esta revelación se refiere además a un derivado
de la forma soluble del receptor de la leptina unida a un resto
químico. Preferiblemente, el resto químico es un polímero
hidrosoluble. Más preferiblemente, el polímero hidrosoluble es
polietilenglicol.
En otro aspecto, se revela un ácido nucleico
aislado codificante del receptor de la leptina, particularmente,
según lo expuesto anteriormente. En los ejemplos específicos,
infra, se revelan ADNc codificantes de diversas formas de
empalme del receptor de la leptina murino. En concreto, se revelan
los ácidos nucleicos que tienen las secuencias correspondientes o
complementarias a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9.
Más concretamente, se revela una molécula de ADN
aislada que codifica en la expresión un polipéptido receptor de la
leptina seleccionado del grupo constituido por:
- \quad
- una secuencia codificante del polipéptido de una molécula de ADN de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 ó 9;
- \quad
- una molécula de ADN complementaria a la molécula de ADN definida en (a);
- \quad
- una molécula de ADN que se hibrida con la molécula de ADN de (a) o (b), o un fragmento hibridable de la misma;
- \quad
- una molécula de ADN que es identificable con una sonda para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) seleccionada del grupo constituido por una sonda para el clon 7 (SEQ ID NO: 42 del cebador directo y SEQ ID NO: 43 del cebador inverso), una sonda para el clon 11 (SEQ ID NO: 44 del cebador directo y SEQ ID NO: 45 del cebador inverso) y tanto el clon 7 como el clon 11; y
- \quad
- una molécula de ADN que codifica en la expresión el polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ADN anteriores.
Preferiblemente, la molécula de ADN es humana.
En ejemplos específicos, infra, la molécula de ADN es murina.
En realizaciones específicas, la molécula de ADN codifica en la
expresión un polipéptido seleccionado del grupo constituido por un
receptor de la leptina seleccionado del grupo constituido por
OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc,
OB-Rd y OB-Re, o variantes alélicas
de los mismos; un receptor de la leptina seleccionado del grupo
constituido por:
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Ra a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a un C-terminal seleccionado del grupo constituido por OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rb o OB-Rc a través de Lys^{889} y C- terminal correspondiente a OB-Ra o OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rd a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb o OB-Rc;
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Pro^{664} a Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd; y
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Met^{733} a Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd; y
- \quad
- N-terminal seleccionado del grupo constituido por OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd y OB-R de Pro^{664} a His^{796}, y OB-Re desde His^{796};
- \quad
- N-terminal seleccionado del grupo constituido por OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd y OB-R de Met^{733} a His^{796,} y OB-Re desde His^{796}, o variantes alélicas de los mismos;
un receptor de la leptina en el que la secuencia
N-terminal se selecciona del grupo constituido
por
- \quad
- los residuos de aminoácidos 1-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 23-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 28-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 133-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 733-889;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 1-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 23-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 28-796;
- \quad
- los residuos de aminoácidos 133-796; y
- \quad
- los residuos de aminoácidos 733-796;
y la secuencia
C-terminal se selecciona del grupo constituido por
SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; y SEQ
ID NO: 15 (detrás de His^{796}), estando la numeración basada en
la secuencia de aminoácidos del receptor de la leptina murino
transcrito en longitud completa, incluyendo el péptido señal o las
variantes alélicas del
mismo.
En otra realización, se revela un ácido nucleico
aislado, en concreto, una molécula de ADN, codificante en la
expresión de un receptor soluble de la leptina en el que el terminal
N o el terminal C, o ambos, incluyen los residuos de aminoácidos no
naturales, tales como péptidos señal heterogéneos o residuos de los
sitios de escisión de péptidos señal. Por ejemplo, en realizaciones
específicas, se revelan ADN codificantes de las siguientes formas
solubles del OB-R:
La presente revelación contempla además ADN
codificante de un receptor de la leptina que tiene las diversas
mutaciones y sustituciones reveladas anteriormente. Por ejemplo, se
pueden sustituir residuos de cisteína o parejas de cistina por
serina (o treonina, metionina o alanina) para eliminar enlaces de
tipo disulfuro. En una realización específica, infra, se
revelan moléculas de ADN codificantes del OB-R
soluble en el que uno o más Cys 188 y 193, 471 y 602, 471 y 526, y
602 y 611 están mutados a Ser, produciendo así una proteína que no
forma disulfuros.
Esta revelación contempla además, como corolario
de los ácidos nucleicos codificantes anteriormente descritos, un
oligonucleótido hibridable en condiciones restrictivas con la
molécula de ácido nucleico, en particular, con la molécula de ADN
codificante del receptor de la leptina. En realizaciones
específicas, ejemplificadas infra, el oligonucleótido se
selecciona del grupo constituido por SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID
NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID
NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42,
SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID
NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51,
SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 54. El oligonucleótido
puede estar marcado.
Además del ADN codificante, se revelan en la
presente memoria vectores que comprenden tal ADN. Un vector
revelado en la presente memoria puede ser un vector de clonación o
puede ser un vector de expresión que comprenda el ADN codificante
del receptor de la leptina asociado operativamente a una secuencia
de control de la expresión. Naturalmente, esta revelación se
extiende a un huésped unicelular transformado o transfectado con una
molécula de ADN, un vector de clonación o un vector de expresión
según lo revelado en la presente memoria. Tal huésped unicelular
puede ser seleccionado del grupo constituido por bacterias,
levadura, células mamíferas, células vegetales y células de
insectos, en cultivo tisular. En realizaciones específicas, se puede
seleccionar el huésped del grupo constituido por E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces,
Saccharomyces, Pichia, Candida,
Hansenula, Torulopsis, CHO, R1.1, B-W,
LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 y células Sf9.
Esta revelación se refiere además a un
procedimiento recombinante para preparar polipéptido receptor de la
leptina que comprende cultivar una célula huésped que comprende un
vector de expresión según lo revelado en condiciones que
proporcionan la expresión del polipéptido receptor de la leptina; y
recuperar el polipéptido expresado.
También se revela en la presente memoria un
ácido nucleico antisentido que se hibrida con un ARNm codificante
de receptor de la leptina y una ribozima que escinde un ARNm
codificante de un receptor de la leptina. En otra realización, se
revela un vector transgénico que comprende una molécula de ADN
codificante de receptor de la leptina o un vector de expresión
según lo revelado en la presente memoria.
En otro aspecto, se revela un anticuerpo
específico de un receptor de la leptina. El anticuerpo puede ser un
anticuerpo monoclonal o policlonal. Tales anticuerpos incluyen
anticuerpos generados frente a fragmentos antigénicos del receptor
de la leptina, incluyendo fragmentos sintéticos de polipéptido de
aproximadamente 10 a 30 residuos de aminoácidos. En una realización
específica, el anticuerpo puede estar marcado con una etiqueta
detectable. Naturalmente, esta revelación se extiende a una línea
celular inmortal que produce un anticuerpo monoclonal.
En una realización específica, se proporciona un
procedimiento para preparar un anticuerpo específico de un receptor
de la leptina que comprende: inmunizar un animal huésped con el
receptor de la leptina o un fragmento inmunogénico del mismo
mezclado con un adyuvante; y obtener el anticuerpo del animal
huésped inmunizado. En otra realización específica, ejemplificada
infra, el procedimiento para preparar un anticuerpo
específico de un receptor de la leptina comprende conjugar un
péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo constituido
por SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 con una proteína
vehículo; inmunizar un animal huésped con el conjugado de proteína
vehículo-péptido de la etapa (a) mezclado con un
adyuvante; y obtener el anticuerpo del animal huésped
inmunizado.
En combinación con los anticuerpos revelados en
la presente memoria, la invención proporciona un procedimiento para
medir la presencia de un receptor de la leptina en una muestra que
comprende poner en contacto una muestra sospechosa de contener un
receptor de la leptina con un anticuerpo que se une específicamente
al receptor de la leptina en condiciones que permiten la formación
de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el receptor
de la leptina; y detectar la formación de los complejos de reacción
que comprenden el anticuerpo y el receptor de la leptina en la
muestra, indicando la detección de la formación de los complejos de
reacción la presencia de de receptor de la leptina en la muestra.
En una realización específica, el anticuerpo se une a un soporte en
fase sólida. Como corolario del procedimiento de medición de la
presencia de receptor de la leptina en una muestra, se revela un
procedimiento in vitro para evaluar el nivel de receptor de
la leptina en una muestra biológica que comprende detectar la
formación de complejos de reacción en una muestra biológica según
lo descrito; y evaluar la cantidad de complejos de reacción formada,
correspondiendo la cantidad de complejos de reacción con el nivel
de receptor de la leptina de la muestra biológica. La revelación
también se refiere a un procedimiento in vitro para detectar
o diagnosticar la presencia de una enfermedad asociada con niveles
elevados o disminuidos de receptor de la leptina en un sujeto que
comprende evaluar el nivel de receptor de la leptina en una muestra
biológica procedente de un sujeto según lo descrito; y comparar el
nivel detectado en la etapa (a) con un nivel de receptor de la
leptina presente en los sujetos normales o en el sujeto en un
momento anterior, en el que un aumento del nivel de receptor de la
leptina en comparación con los niveles normales indica una
enfermedad asociada con niveles elevados de receptor de la leptina y
una disminución del nivel de receptor de la leptina en comparación
con los niveles normales indica una enfermedad asociada con niveles
disminuidos de receptor de la leptina.
También se revela en la presente memoria una
composición farmacéutica que comprende un receptor soluble de la
leptina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Alternativamente,
una composición farmacéutica según lo revelado en la presente
memoria puede comprender un vector transgénico, p. ej., un vector
vírico o ADN desnudo, para su administración a un sujeto para una
terapia génica. Preferiblemente, tal vector se dirige al cerebro,
más preferiblemente, al hipotálamo. También se revela en la presente
memoria un procedimiento para tratar la obesidad en un sujeto que
comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la
composición farmacéutica. El procedimiento de tratamiento puede
comprender además administrar un tratamiento para la diabetes, la
presión sanguínea elevada y el colesterol elevado.
En otra realización, se revela una composición
cosmética que mejora el aspecto corporal destinada a reducir el
peso corporal de un individuo que comprende un receptor soluble de
la leptina y un vehículo aceptable. También se revela un
procedimiento para mejorar el aspecto corporal de un individuo que
comprende administrar la composición cosmética.
Por consiguiente, un objeto principal de la
presente revelación consiste en proporcionar moduladores del peso
corporal según lo definido en la presente memoria en forma
purificada que presenten ciertas características y actividades
asociadas con el control y la variación de la adiposidad, así como
del contenido de grasa de los mamíferos.
Otro objeto de la presente revelación consiste
en proporcionar procedimientos para la detección y la medición de
los moduladores del control del peso según lo expuesto en la
presente memoria, como un procedimiento de diagnóstico eficaz y
control de condiciones patológicas en las que la variación del nivel
de tales moduladores es o puede ser un rasgo característico.
Otro objeto más de la presente revelación
consiste en proporcionar un procedimiento y un sistema de análisis
asociado para rastrear sustancias tales como fármacos, agentes y
similares, que sean potencialmente eficaces bien en la imitación o
en la inhibición de la actividad de unión de la leptina a su
receptor, p. ej., agonistas y antagonistas de los moduladores según
lo revelado en la presente memoria en mamíferos.
Otro objeto más de la presente revelación
consiste en proporcionar un procedimiento para el tratamiento de
mamíferos destinado a controlar el peso corporal y el contenido de
grasa en mamíferos y/o tratar ciertas condiciones patológicas de
las que una depresión anormal o una elevación del peso corporal son
un rasgo caracterís-
tico.
tico.
Otro objeto más de la presente revelación
consiste en preparar constructos genéticos para usarlos en
protocolos terapéuticos genéticos y/o composiciones farmacéuticas
para procedimientos terapéuticos comparables, que comprenden o se
basan en uno o más de los moduladores, parejas de unión o agentes
que pueden controlar su producción, o que pueden imitar o
antagonizar sus actividades.
Otros objetos y ventajas serán evidentes para
los expertos en la técnica a partir de la revisión de la siguiente
descripción que se presenta con referencia a las siguientes figuras
ilustrativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Los aspectos de las figuras que no se refieren
específicamente a la invención reivindicada se incluyen únicamente
a modo ilustrativo y comparativo.
Figura 1: Localización del receptor de la
leptina en la región del gen db . La mutación db se
segregó en dos cruzamientos que ascendían a 750 meiosis. Se compiló
un mapa genético genotipando la progenie de estos cruzamientos con
los marcadores indicados en el mapa. Los animales recombinantes
clave se indican en el mapa con números sobre la línea. Se inició
un paseo cromosómico con el clon de microdisección D4Rck22. El paseo
abarcó 2,7 megabases y estaba compuesto por YAC (líneas en
negrita), BAC (cursiva) y bacteriófago P1 (números). El genotipado
de los animales recombinantes con dos marcadores SSLP, D4Rck6 y
D4Rck7, desde los extremos de estos clones genómicos, sirvió para
localizar el gen db hasta el intervalo de aproximadamente 300
Kb entre los eventos de recombinación de los animales 324 y 1028.
Este intervalo estaba abarcado por los BAC 242 y 43. Las
transferencias southern y la PCR revelaron que los extremos 5' del
receptor de la leptina se mapeaban hasta BAC 150A y el extremo 3'
hasta BAC 19, indicando que el gen está transcrito hacia los
telómeros.
Figura 2A-B. Hay presentes
varias variantes de empalme del receptor de la leptina. (A) Una
figura esquemática del receptor de la leptina con motivos putativos
para la unión a JAK y la transducción de señales, la "Región
1" y la "Región 2" (zonas sombreadas). "TM" indica un
dominio transmembrana putativo. Se aisló un total de 8 clones de
ADNc de cerebro de ratón. Se descubrió que estos ADNc correspondían
con cinco variantes de empalme del receptor de la leptina
diferentes. (B) Seis de los clones tenían secuencias parcialmente
idénticas secuencia arriba de la lisina 889 del receptor de la
leptina (OB-Ra, OB-Rb,
OB-Rc y OB-Rd), en cuyo punto
divergían las proteínas predichas. Se muestran las secuencias de
aminoácidos C-terminales predichas de estos clones
(SEQ ID NO: 11-14, respectivamente). Todos los
OB-Ra, b, c y d predicen un motivo de "Región
1". OB-Rb también predice una secuencia peptídica
potencialmente homóloga a la "Región 2" (subrayada). Dos
clones de ADNc independientes resultaron idénticos al receptor de la
leptina secuencia arriba de la histidina 796, en cuyo punto
divergían las secuencias (OB-Re) (SEQ ID NO: 15). La
secuencia de nucleótidos predice un receptor soluble.
Figura 3A-C. La mutación db
resulta en un corte y empalme anormal del ARN y una conversión de la
variante de empalme OB-Rb en
OB-Ra. (A) Se amplificaron productos de
RT-PCR procedentes de ratones de tipo silvestre y
db/db C57BL/Ks usando una pareja de cebadores específica del ARN del
OB-Rb (F1 y R_{3}). La electroforesis reveló que
el fragmento amplificado de estos ratones db era mayor que el
de los animales de tipo silvestre. Los productos de PCR del ADN
genómico que abarca el aceptor de empalmes de OB-Rb
en Pro^{890} eran de idéntico tamaño en los ratones db/db
C57BL/Ks y en los controles de la misma camada. (B) se usaron
cebadores F2 y R para amplificar el ADN genómico. El cebador F2 se
seleccionó tras usar una técnica de vectorette PCR y BAC 242 para
obtener la secuencia de ADN genómico secuencia arriba del aceptor de
empalmes en P^{890}. (C) Localización de cebadores para
amplificación genómica por PCR y RT-PCR.
Figura 4A-D: ARN hipotalámico
de ratones de tipo silvestre. Los productos hipotalámicos
obtenidos por RT-PCR para la región codificante
C-terminal de (A) OB-Ra, (B)
OB-Re, (C) OB-Rd y (D)
OB-Re eran de un tamaño normal en ratones
db. La secuencia de ADN al otro lado de la zona de unión
resultó ser normal en cada uno de estos productos de
RT-PCR. Esto indica que el donante de empalmes de
Lys^{889} es de tipo silvestre.
Figura 5A-C: Identificación
de mutaciones de empalme en ratones db. (A) La secuenciación de
ADN identificó una inserción de 106 bp en el ARN de
OB-Rb mutante en la zona de unión entre Lys^{889}
y Pro^{890} (SEQ ID NO: 16). La secuencia de la inserción era
idéntica a los primeros 106 bp del exón C-terminal
de OB-RA. La inserción predice un codón de
terminación prematuro y cambia la secuencia de aminoácidos de
OB-Rb (SEQ ID NO: 17) a OB-Ra. (B,
C). Se muestra la supuesta organización genómica de los extremos 3'
de OB-Ra y OB-Rb. La secuenciación
de ADN del exón de OB-Ra de los ratones db/db
C57BL/K9 (SEQ ID NO: 18) y los controles de la misma camada (SEQ ID
NO: 19) reveló una mutación de G a T 106 pares de bases detrás del
aceptor de empalmes de R^{890}. Esta mutación resulta en la
aparición de un sitio consenso donante de empalmes, AGGTAAA, que
conduce a la inserción de 106 bp del exón C-terminal
de OB-Ra en el de OB-Rb.
Figura 6A-F: Distribución de
tejidos del receptor de la leptina cortado y empalmado
alternativamente. Se realizó una RT-PCR a
partir de las fuentes tisulares indicadas. En cada caso, se usó un
cebador de una región de la secuencia de nucleótidos compartida en
combinación con un cebador específico del exón cortado y empalmado
alternativamente; como control, se usó ARNm de actina. (B) Cerebro,
(H) Hipotálamo, (L) Hígado, (H) Corazón, (K) Riñón, (S) Bazo, (T)
Testículos, (F) Tejido adiposo, (S) Bazo.
Figura 7: La mutación en ratas
NIH-corpulentas (cp/cp). Se muestra una
secuencia de ADN de Lepr de ratas obesas
NIH-fa^{cp}/fa^{cp} y magras. Se sintetizó ADNc de ARN
aislado del cerebro de ratas cp/cp obesas y ratas magras de la
misma camada. Se purificaron sobre gel los productos de PCR y se
secuenciaron con los cebadores anteriores en un secuenciador
automático. La rata cp/cp tiene un cambio de bases de
T\rightarrowA en el nucleótido 2289, lo que resulta en un codón
de terminación en Tyr763.
Figura 8: PCR de Lepr de tipo silvestre y
ratones db^{3J}/db^{3J}. Se amplificó mediante PCR tanto
ADNc como ADN genómico procedente de la región extracelular de
Lepr usando ADN de ratones de tipo silvestre y
db^{3J}/db^{3J} 129. En ambos casos el producto de PCR fue más
corto en el ratón mutante. Todos los cebadores proceden de la
región codificante de Ob-R a excepción de 3JR2, que
es intrónico, de manera que ese producto amplificado a partir de
ADN genómico puede ser resuelto sobre gel de agarosa.
Figura 9: Se secuenció el producto de PCR
procedente de ratones db^{31}/db^{31}. Se identificó una
eliminación de 17 bp en este mutante. La misma eliminación fue
identificada tanto en ADN genómico como en ADNc.
Figura 10: Esquema de mutaciones del receptor
de la leptina. Se muestra la proteína predicha de cada uno de
los alelos de Lepr. Los números del extremo de cada receptor
representan el residuo de aminoácido del terminal carboxilo. La
línea recta corta del extremo del diagrama dedb^{31}/db^{31}
denota los 11 residuos adicionales siguientes al aminoácido 625
causados por el marco de lectura.
Figura 11. Cebadores de PCR y estrategias
para la amplificación de OB-Re y mutantes de
OB-Re. Las flechas representan cebadores de PCR
(Tabla 2, infra) que están marcados con números; todas las
reacciones de PCR 1º fueron realizadas con molde de ADNc de
Ob-Re; Todas las reacciones de PCR 2º fueron
realizadas usando mezclas de cantidades iguales procedentes de los
correspondientes productos de PCR 1º como molde.
Figura 12: Esquema del experimento de unión a
la leptina. El esquema muestra la inhibición competitiva de la
unión de ObRe recombinante a leptina-SEFAROSA con
una leptina libre.
\vskip1.000000\baselineskip
Los aspectos y las realizaciones de la siguiente
descripción detallada que no se refieren específicamente a la
invención reivindicada se incluyen únicamente a modo ilustrativo y
comparativo.
La presente revelación se refiere a la
dilucidación y al descubrimiento de una proteína, denominada en la
presente memoria receptor OB (OB-R) o receptor de la
leptina, de los ácidos nucleicos codificantes de la proteína,
incluyendo el gen OB-R (también denominado en
la presente memoria DB; debería indicarse que cuando se
escribe todo en mayúsculas se hace referencia a la proteína o al gen
natural; todo en minúsculas se refiere a una proteína o a un gen
mutante; las cursivas indican un gen o una molécula de ácido
nucleico; y el tipo normal indica una proteína o un polipéptido),
incluyendo las variaciones degenerativas del mismo, p. ej., las que
incorporan codones óptimos para la expresión en un determinado
sistema de expresión, cuya proteína demuestra la capacidad de
participar en el control del peso corporal en mamíferos. En
concreto, la proteína demuestra la capacidad de unirse a la
leptina. En una realización específica, la proteína media la
transducción de señales tras la unión a la leptina.
El receptor OB según lo revelado en la presente
memoria puede contener tres dominios estructurales importantes: un
dominio extracelular (o extracitoplasmático), un dominio
transmembrana y un dominio citoplasmático. Se presupone que el
dominio extracelular se une a la leptina, a complejos de
leptina-proteína (tales como leptina unida a un
receptor soluble de la leptina) y puede unirse a otras proteínas o
ligandos. Es más, según lo mostrado en la presente memoria, el
dominio extracitoplasmático se une a la leptina con una afinidad muy
elevada e incluye dos sitios de unión a la leptina. En una
realización específica, un receptor según lo revelado en la
presente memoria sólo comprende un dominio extracelular, i.e., es un
receptor soluble. El dominio transmembrana comprende un tramo de
residuos de aminoácidos altamente no polares que se localiza en la
región hidrófoba de la membrana celular. A este respecto, el
término dominio transmembrana tiene su significado ordinario en
Biología Molecular y Biología Celular. Finalmente, el dominio
citoplasmático de un receptor OB según lo revelado en la presente
memoria puede contener ninguna, una o dos secuencias consenso de
unión a JAK, denominadas "Región 1" y "Región 2". Se cree
que un receptor que tiene la "Región 1" y la "Región 2"
es competente para la transducción de señales por la ruta
JAK-Stat tras unirse al ligando, p. ej., a la
leptina.
Además, se ha identificado que la proteína tiene
numerosas formas de empalme. En un aspecto, las variaciones de
empalme conducen a una divergencia de las secuencias
C-terminales. De ese modo, se puede encontrar a la
proteína en una forma secretada de la que se presupone que es
agonista de la actividad de la leptina; se puede encontrar como un
receptor integral de membrana que puede facilitar la transferencia
de la leptina a través de la barrera hematoencefálica, pero que
carece de los dominios que participan en la transducción de señales;
y se puede encontrar como un receptor integral de membrana que
contiene los dominios que participan en la transducción de señales.
En otro aspecto, las variaciones de empalme conducen a la
divergencia de la secuencia polipeptídica
N-termi-
nal.
nal.
Los ácidos nucleicos en estudio representan las
secuencias codificantes correspondientes al polipéptido
OB-R animal, específicamente murino y humano, que
mediante la mediación (o la no mediación) de la transducción de
señales en la unión a la leptina se presupone que desempeña un papel
fundamental en la regulación del peso corporal y de la adiposidad.
Los datos presentados en la presente memoria indican que una
variante de empalme del producto polipeptídico de un ácido nucleico
según lo revelado en la presente memoria puede ser secretado por
las células que lo expresan, o puede ser expresado como una proteína
integral de membrana. En cualquier caso, el polipéptido actúa como
receptor de la leptina uniéndose a la leptina. Otros datos
experimentales sugieren que la forma de empalme natural del
polipéptido OB-R es muy eficaz en el tratamiento de
la obesidad en ratones que portan una mutación del gen
ob.
Además, los ejemplos de la presente memoria
demuestran que el ARNm codificante del polipéptido
OB-R, alternativamente denominado en la presente
memoria "receptor de la leptina" se expresa en el hipotálamo,
los testículos y los adipocitos. Los datos también demuestran la
expresión de la proteína en el plexos coroidal.
En otro aspecto, el polipéptido
OB-R de una especie está relacionado de manera muy
cercana (homólogo) con el OB-R de otras especies.
En concreto, el polipéptido OB-R humano es muy
homólogo al polipéptido OB-R murino. Esta
observación coincide con los datos que demuestran que la leptina
humana es activa en ratones: para que la hormona sea activa entre
especies, también se esperaría un alto grado de similitud u
homología entre los receptores de las diferentes especies.
En este primer aspecto, la presente revelación
se dirige a la identificación de materiales que actúan como
moduladores del peso corporal de los mamíferos. En concreto, esta
revelación se refiere al aislamiento, la purificación y la
secuenciación de ciertos ácidos nucleicos que corresponden al gen
OB-R (alternativamente denominados en la presente
memoria y en la bibliografía DB) o a su región codificante
tanto en ratones como en seres humanos, así como a los polipéptidos
correspondientes expresados por estos ácidos nucleicos. Por lo
tanto, esta revelación comprende el descubrimiento de ácidos
nucleicos que tienen las secuencias de nucleótidos expuestas en las
SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y 9, y variantes degenerativas, alelos y
fragmentos de las mismas, poseyendo todos ellos la actividad de
modular el peso corporal y la adiposidad. La correspondencia de los
presentes ácidos nucleicos con el gen OB-R augura su
significativo impacto en condiciones tales como la obesidad, así
como en otras enfermedades y disfunciones en las que las anomalías
en el peso corporal son un factor que contribuye. Esta revelación
se extiende a las proteínas expresadas por los ácidos nucleicos
revelados en la presente memoria y, particularmente, a aquellas
proteínas expuestas en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, así como a
las variantes conservadas y los fragmentos
activos.
activos.
Son de particular interés las distintas
variantes de empalme de OB-R, p. ej., según lo
representado por OB-Ra, OB-Rb,
OB-Rc, OB-Rd y
OB-Re. La presente revelación también anticipa otras
variantes de empalme de OB-R.
De este modo, en realizaciones específicas, el
término OB-R se refiere a variantes de empalme según
lo siguiente (la numeración de los aminoácidos equivale a la
numeración aplicada al OB-R murino [Tartaglia et
al., Cell, 83:1263 (1995)], que se ha adoptado en la presente
memoria):
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Ra a través de Lys^{889}, y C-terminal correspondiente a una C-terminal seleccionada del grupo constituido por OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rb o OB-Rc a través de Lys^{889} y C- terminal correspondiente a OB-Ra o OB-Rd detrás de Lys^{889};
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-Rd a través de Lys^{889} y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb o OB-Rc;
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Pro^{664} a Lys^{889}, y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd;
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Met^{773} a Lys^{889}, y C-terminal correspondiente a OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc y OB-Rd;
- \quad
- N-terminal seleccionada del grupo constituido por OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd y OB-R de Pro^{664} a His^{796}, y OB-Re desde His^{796}; y
- \quad
- N-terminal correspondiente a OB-R de Met^{733} a His^{796} y OB-Re desde His^{796}.
Se pueden preparar varias formas de
OB-R, que pueden actuar como agonistas (p. ej.,
forma secretada natural del OB-R) o antagonistas
(p. ej., una forma truncada de OB-R que sólo se une
a la leptina), en composiciones farmacéuticas con un vehículo
adecuado y a una concentración eficaz para la administración
mediante diversos procedimientos a un paciente que experimente
fluctuaciones anormales del peso corporal o la adiposidad, bien
aisladas o como parte de una condición médica adversa tal como el
cáncer o el SIDA, para el tratamiento de las mismas. Se puede
utilizar una variedad de técnicas administrativas, entre ellas,
administración oral, nasal y otras formas de administración
transmucosal, técnica parenterales tales como inyecciones
subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales, cateterizaciones y
similares. Las cantidades apropiadas de las moléculas de
OB-R soluble pueden variar y, en particular,
deberían basarse en las recomendaciones y en la prescripción de un
médico o un veterinario cualifi-
cado.
cado.
Según lo anterior, se puede preparar un sistema
de análisis para rastrear los posibles fármacos eficaces en la
imitación o la antagonización de la actividad de la leptina. Se
puede poner en contacto el posible fármaco con una forma soluble
del OB-R o, alternativamente, se puede usar con
células que expresen una forma receptora de OB-R
para determinar si se une o activa (o antagoniza) al
OB-R. Por ejemplo, en un sistema de análisis de la
expresión, se puede examinar el cultivo para observar cualquier
cambio en la actividad de las células, debido bien a la adición del
posible fármaco solo o debido al efecto de las cantidades de la
leptina moduladora del peso conocida que se
añadan.
añadan.
Según lo expuesto anteriormente, la clonación
del gen OB-R descrito en la presente memoria
ha conducido a la identificación de una clase de materiales que
actúa sobre el nivel molecular para modular el peso corporal de los
mamíferos. El descubrimiento de los moduladores según lo revelado en
la presente memoria tiene importantes implicaciones para el
diagnóstico y el tratamiento de trastornos nutricionales incluyendo,
pero no limitándose a, la obesidad, la pérdida de peso asociada con
el cáncer y el tratamiento de enfermedades asociadas con la
obesidad tales como la hipertensión, la enfermedad cardiaca y la
diabetes de tipo II. Además, hay posibles usos agrícolas para el
producto génico en los casos en los que se pudiera desear modular el
peso corporal de animales. La siguiente explicación en la que se
hace una referencia específica al gen OB-R
tiene una aplicabilidad general en la clase de moduladores que
comprende una parte de la presente revelación, y concuerda por
tanto con tal flexibilidad y ámbito de interpretación.
En una realización particular, se puede evaluar
la actividad funcional del polipéptido OB-R
transgénicamente. Se puede usar el gen OB-R
en estudios de complementación que emplean ratones transgénicos. Se
pueden construir vectores transgénicos, incluyendo vectores víricos
o clones de cósmido (o clones de fago) correspondientes al locus
silvestre del gen candidato, usando el gen
OB-R aislado. Se pueden introducir cósmidos
en los ratones transgénicos usando procedimientos publicados
[Jaenisch, Science, 240:1468-1474 (1988)]. Se
introducen los constructos en huevos fertilizados derivados de un
entrecruzamiento entre la progenie F1 de un entrecruzamiento de
db/db C57BL/6J x DBA. Es posible determinar el genotipo en
los locus db en animales transgénicos cosmídicos tipificando
los animales con RFLP estrechamente relacionados o con
microsatélites que flanqueen la mutación y que sean polimórficos
entre las cepas progenitoras. La complementación quedará demostrada
cuando un determinado constructo convierta a un animal F2
genéticamente obeso (según la evaluación del análisis por RFLP) en
un animal magro y no diabético. En estas circunstancias, la prueba
final de la complementación requerirá que el animal db/db
que porte el transgén sea apareado con los transplantes de ovario
db/db. En este cruzamiento, todos los animales N2 que no
porten el transgén serán obesos e
insulino-resistentes/diabéticos, mientras que
aquéllos que porten el transgén serán delgados y tendrán
concentraciones de glucosa e insulina normales en plasma. En
sentido genético, el transgén actúa como una mutación supresora.
Alternativamente, se pueden analizar los genes
OB-R examinando sus efectos fenotípicos
cuando estén expresados en una orientación antisentido en animales
de tipo silvestre. En este enfoque, se suprime la expresión del
alelo de tipo silvestre, lo que conduce a un fenotipo mutante. La
formación de dúplex ARN-ARN
(antisentido-sentido) evita una manipulación normal
del ARNm, lo que resulta en una eliminación parcial o completa del
efecto del gen de tipo silvestre. Esta técnica se ha usado para
inhibir la síntesis de TK en cultivo tisular y para producir
fenotipos de la mutación de Kruppel en Drosophila y de
la mutación de Shiverer en ratones [Izant et al.,
Cell, 36:1007-1015 (1984); Green et al.,
Annu. Rev. Biochem., 55:569-597 (1986); Katsuki
et al., Science, 241:593-595 (1988)]. Una
ventaja importante de este enfoque es que sólo es necesario expresar
una pequeña parte del gen para conseguir una inhibición eficaz de
la expresión de todo el ARNm relacionado. El transgén antisentido
se colocará bajo el control de su propio promotor u otro promotor
expresado en el tipo de célula correcto y colocado secuencia arriba
del sitio de polyA del SV40. Este transgén se puede usar para hacer
ratones transgénicos. Los ratones transgénicos también se pueden
aparear con transplantes de ovario para analizar si los
heterocigotos ob son más sensibles a los efectos del
constructo antisentido.
A largo plazo, el producto génico de
OB-R (el polipéptido o la proteína
OB-R) es útil para identificar agonistas y
antagonistas de molécula pequeña que afecten a su actividad.
Los diversos términos usados a lo largo de esta
memoria tendrán las definiciones expuestas en la presente memoria,
por ejemplo, los siguientes.
El término "modulador del peso corporal",
"modulador", "moduladores" y cualquier variante no
enumerada específicamente se pueden usar en la presente memoria
indistintamente, y como se usan a lo largo de la presente solicitud
y las reivindicaciones, se refieren, en un caso, a ambos nucleótidos
y a material proteínico, incluyendo éste último proteínas tanto
simples como múltiples. Más concretamente, los términos
anteriormente mencionados se extienden a nucleótidos y al ADN que
tienen las secuencias descritas en la presente memoria y
presentadas en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y 9. Asimismo, también se
contemplan las proteínas que tienen los datos de las secuencias de
aminoácidos descritos en la presente memoria y presentados en las
SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 y 10, así como el perfil de actividades
expuesto con respecto a todos los materiales de tanto la presente
memoria como de las reivindicacio-
nes.
nes.
La unión específica a la leptina significa que
la leptina es un ligando para OB-R, siendo ese
término usado para describir la unión
ligando-receptor. Generalmente, tal unión tendrá una
afinidad representada por una constante de asociación de más de 1 x
10^{7}M^{-1}, preferiblemente, de más de 1 x 10^{8}M^{-1}, y
más preferiblemente, de más de 1 x 10^{9}M^{-1}. Sin embargo,
la constante de asociación exacta puede variar.
La homología con gp130 se refiere a la
conservación de los residuos, particularmente, de los residuos de
cisteína, de los motivos y de otros residuos importantes. El
término "gp130" se usa en la presente memoria para referirse
en general a la familia de receptores de la citoquina de clase I,
particularmente, al receptor de la interleuquina-6
(IL-6), al receptor del factor estimulante de
colonias de granulocitos (G-CSF), al receptor del
factor neurotrófico ciliar (CNTF) y al receptor del factor inhibidor
de la leuquimia (LIF).
Además, también se contemplan los nucleótidos
que desempeñan una actividad alterada o sustancialmente equivalente,
incluyendo análogos y variaciones alélicas sustancialmente
similares. Asimismo, se contemplan proteínas que desempeñan una
actividad alterada o sustancialmente equivalente, incluyendo las
proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, mediante
mutagénesis de sitio dirigida, o accidentalmente a través de
mutaciones en huéspedes que producen los moduladores.
El término "variantes alélicas" se refiere
al correspondiente gen en diferentes individuos que puede tener
mutaciones puntuales. Por ejemplo, las diversas mutaciones de
ob representan las variantes alélicas de
OB-R.
El término "homólogos", en todas sus formas
gramaticales, incluye específicamente al correspondiente gen o
proteína de otra especie. En una realización específica, un homólogo
del OB-R murino es el OB-R humano.
El término también puede incluir genes o proteínas mutados o
alterados, p. ej., mediante la sustitución de residuos de
aminoácidos variantes de una especie en el polipéptido de otra, para
que se corresponda con un gen análogo o una proteína análoga como
si fuera de otra especie. Como se conoce en la técnica, es posible
identificar genes homólogos mediante similitud secuencial, la
hibridación con sondas específicas del gen de otras especies, la
detección mediante análisis por PCR usando cebadores para una
especie diferente o el mapeo hasta una localización sinténica del
cromosoma, por no mencionar más que unos cuantos procedimientos. La
homología entre proteínas se puede detectar mediante la reactividad
del cruzamiento de anticuerpos, el perfil similar de digestión de
la proteasa, el peso molecular y los puntos isoeléctricos
comparables, y la estructura secundaria o terciaria similar, por no
mencionar más que algunos de los análisis conocidos de detección de
proteínas homólogas.
El término "sustancialmente similar" como
se usa en la presente memoria con respecto a las secuencias de
ácidos nucleicos o aminoácidos significa una similitud secuencial
del al menos 50%, preferiblemente, una similitud secuencial del al
menos 60%, más preferiblemente, una similitud secuencial del al
menos 70%, todavía más preferiblemente, una similitud secuencial
del al menos 80% y, lo más preferible, una similitud secuencial del
al menos
90%.
90%.
El término "gen" como se usa en la presente
memoria se refiere a un ácido nucleico, tal como ADN, que codifica
la expresión de una proteína. A no ser que se especifique lo
contrario, el gen puede incluir ARNm, ADNc o ADN genómico.
Una composición que comprende "A" (siendo
"A" una proteína simple, una molécula de ADN, un vector, una
célula huésped recombinante, etc.) está sustancialmente libre de
"B" (comprendiendo "B" una o más proteínas contaminantes,
moléculas de ADN, vectores, etc., pero excluyendo formas racémicas
de A) cuando al menos aproximadamente el 75% en peso de las
proteínas, el ADN, los vectores (dependiendo de la categoría de las
especies a las que pertenecen A y B) en la composición es "A".
Preferiblemente, "A" comprende al menos el aproximadamente 90%
en peso de la especie A+B en la composición, siendo lo más
preferible que sea de al menos aproximadamente el 99% en peso.
También se prefiere que una composición, que esté sustancialmente
libre de contaminación, contenga sólo una especie con un único peso
molecular que tenga la actividad o sea característica de la especie
de
interés.
interés.
Un "BAC" es un cromosoma artificial
bacteriano; "STS" se refiere a sitio de secuencia marcada; un
"YAC" es un cromosoma artificial de levadura. El resto de los
términos tiene los significados estándar comúnmente empleados en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "proteína", que se refiere al
polipéptido natural, y "polipéptido" se usan en la presente
memoria indistintamente con respecto al producto génico
OB-R y las variantes del mismo. Más
concretamente, OB-R se refiere a cualquiera de las
formas de empalme del producto génico OB-R
(DB), tales como el, pero sin limitarse al, producto con dos
regiones de unión a JAK en el dominio citoplasmático; al producto
con sólo una región de unión a JAK en el dominio citoplasmático; al
producto sin ninguna región; y al producto secretado (soluble). El
término OB-R también se refiere a las diversas
formas de empalme con secuencias de aminoácidos
N-terminales divergentes.
El término OB-R engloba
específicamente formas de empalme diferentes del polipéptido,
incluyendo pero no limitándose a las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
El término OB-R contempla
específicamente las variantes de empalme que incorporan elementos
distintos procedentes de las variantes anteriormente mencionadas,
p. ej., según lo descrito anteriormente.
Más concretamente, la presente revelación se
dirige a OB-R con la secuencia de señales
N-terminal escindida. En una realización, están
escindidos los residuos de aminoácidos 1-22. En otra
realización, están escindidos los residuos de aminoácidos
1-27.
Según lo indicado anteriormente, en
realizaciones específicas, los polipéptidos según lo revelado en la
presente memoria incluyen aquéllos que tienen las secuencias de
aminoácidos expuestas en la presente memoria, p. ej., las SEQ ID
NO: 2, 4, 6, 8 y 10. El término incluye además polipéptidos
modificados con sustituciones conservativas de aminoácidos, así
como fragmentos, análogos y derivados biológicamente activos de los
mismos. En otra realización más, el término incluye polipéptidos en
los que están reemplazados uno o más residuos de cisteína o pares
de cisteína por serina, o un residuo de aminoácido polar o neutro
similar tal como, pero sin limitarse necesariamente a, treonina,
metionina o alanina.
El término "biológicamente activo" se usa
en la presente memoria para referirse a un efecto específico del
polipéptido, incluyendo pero no limitándose a la unión específica,
p. ej., a la leptina, un anticuerpo frente a OB-R u
otra molécula de reconocimiento; a la activación de rutas de
transducción de señales a un nivel molecular; y/o a la inducción (o
inhibición por antagonistas) de efectos fisiológicos mediados por la
leptina nativa in vivo. Los polipéptidos
OB-R, incluyendo los fragmentos, los análogos y los
derivados, se pueden preparar sintéticamente, p. ej., usando las
técnicas conocidas de síntesis de péptidos en fase sólida o en
solución. Preferiblemente, se emplean técnicas sintéticas en fase
sólida. Alternativamente, los polipéptidos OB-R
según lo revelado en la presente memoria se pueden preparar usando
técnicas de ingeniería genética conocidas, según lo descrito
infra. En otra realización más, la forma soluble del
polipéptido OB-R se puede purificar, p. ej.,
mediante purificación por inmunoafinidad, a partir de fluido
biológico, tal como pero sin limitarse a plasma, suero u orina,
preferiblemente, plasma, suero u orina humana, y mas
preferiblemente, procedente de un sujeto que
sobre-exprese el polipéptido.
La estructura del polipéptido
OB-R, preferiblemente, el polipéptido
OB-R humano, se puede analizar mediante diversos
procedimientos conocidos en la técnica. Se puede caracterizar la
secuencia proteínica mediante un análisis de hidrofilidad [p. ej..,
Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 78:3824 (1981)].
Se puede usar un perfil de hidrofilidad para identificar las
regiones hidrófobas e hidrófilas del polipéptido
OB-R, que pueden indicar las regiones enterradas en
el interior del polipéptido plegado, el dominio transmembrana y las
regiones accesibles en el exterior del polipéptido. Además, también
se puede hacer un análisis estructural secundario [p. ej.., Chou
et al, Biochem., 13:222 (1974)] para identificar las regiones
del polipéptido OB-R que adopta estructuras
secundarias específicas. Se puede lograr la manipulación de la
estructura predicha o determinada, incluyendo la predicción de la
estructura secundaria, usando programas informáticos disponibles en
la técnica.
Proporcionando una fuente abundante de
polipéptido OB-R recombinante, la presente
revelación permite la determinación estructural cuantitativa del
polipéptido. En concreto, se proporciona suficiente material para un
análisis espectroscópico de resonancia magnética nuclear (RMN), de
infrarrojos (IR), de Raman u ultravioleta (UV), especialmente, de
dicroísmo circular (DC). En concreto, la RMN proporciona un potente
análisis estructural de moléculas en solución que se aproxima más a
su medio nativo [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm.,
113:967-974 (1983); Bar et al., J. Magn.
Reson., 65:355-360(1985); Kimura et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
77:1681-1685 (1980)]. También se pueden emplear
otros procedimientos de análisis estructural. Éstos incluyen pero
no se limitan a cristalografía de rayos X [Engstom, Biochem. Exp.
Biol., 11:7-13 (1974)]. En un aspecto
preferido, se co-cristaliza bien la forma soluble o
la forma de unión a la membrana del OB-R con
leptina para proporcionar información estructural sobre ambas
moléculas. En una realización más preferida, se usa
OB-R o OB-R soluble carente de uno o
más entrecruzamientos de cistina para formar cristales o
co-cristales con leptina.
En otra realización más, se puede analizar un
análogo de polipéptido OB-R para determinar si
reacciona por cruzamiento con un anticuerpo específico del
polipéptido OB-R nativo, o fragmentos específicos
del mismo. El grado de reactividad por cruzamiento proporciona
información sobre la homología o la similitud estructural de las
proteínas, o sobre la accesibilidad de las regiones correspondientes
a las porciones del polipéptido que se usaron para generar los
anticuerpos específicos de los fragmentos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particular, la presente
revelación contempla que los fragmentos naturales o las formas
truncadas del polipéptido OB-R pueden ser
importantes. Según lo indicado anteriormente, se ha descubierto un
gran número de formas de empalme del OB-R. De este
modo, la presente revelación engloba una forma soluble natural del
OB-R, así como formas integrales de membrana que
tienen 0, 1 ó 2 sitios consenso de la región JAK. Además de las
isoformas de empalme naturales del polipéptido, la presente
revelación prevé isoformas modificadas recombinantemente, p. ej.,
mediante la eliminación de una o más del dominio citoplasmático; el
dominio consenso citoplasmático del dominio transmembrana hasta la
lisina-889; la región 1 o la región 2, o ambas
regiones; el dominio citoplasmático C-terminal de la
lisina-889; el dominio transmembrana; el dominio de
unión a ligandos; el dominio extracitoplasmático; o porciones de los
mismos.
La presente revelación contempla específicamente
formas truncadas solubles de OB-R que carecen de un
dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. En una
realización específica, el fragmento de OB-R es
OB-Re. En otras realizaciones más, un fragmento de
OB-R según lo revelado en la presente memoria
corresponde a la porción N-terminal de
OB-Re que se une a la leptina, p. ej.,
OB-R desde aproximadamente Leu123 hasta
aproximadamente Val331; la porción C-terminal de
OB-Re que se une a la leptina, p. ej.,
OB-R desde aproximadamente Tyr420 hasta
aproximadamente Pro641; una proteína que tiene las porciones N- y
C-terminales de OB-Re que se une a
la leptina con una afinidad muy elevada, p. ej.,
OB-R desde aproximadamente Ser118 o Leu123 hasta
aproximadamente
Pro641.
Pro641.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden usar una o más de las formas de
empalme del dominio citoplasmático en un constructo quimérico con
otro dominio de unión a ligandos hasta la unión de la leptina a
señales artificialmente [p. ej., Capon et al., Patente
estadounidense n.º 5.359.046, concedida el 25 de octubre de 1994;
Sanchez et al., J. Exp. Med., 178:1049 (1993);
Burkhardt et al., Mol. Cell. Biol., 14:1095; Publicaciones de
patente internacional WO 96/23814, WO 96/23881 y WO 96/24671;
Kotenko et al., J. Biol. Chem. 271:17174 (1996)]. En otra
realización, se puede unir el dominio extracitoplasmático (de unión
a la leptina) con un dominio citoplasmático diferente de
transducción de señales, o alternativamente, con un dominio ligador
de glicosil-fosfalidilinositol para proporcionar
la activación de las células a través de gp130.
La presente revelación contempla específicamente
la preparación de análogos del polipéptido OB-R
caracterizados por ser capaces de realizar una actividad biológica
del polipéptido OB-R, p. ej., de unirse a la leptina
o a un anticuerpo anti-OB-R. En una
realización, el análogo es agonista de la actividad de
OB-R. Preferiblemente, es más eficaz un agonista
del OB-R que la proteína nativa. Por ejemplo, un
análogo agonista de OB-R se puede unir a la leptina
con mayor afinidad, amplificando así la señal. Tal análogo puede ser
particularmente deseable para una terapia génica, en la que una
mayor eficiencia de la transducción de señales puede compensar
cualquier deficiencia a nivel de la expresión del receptor. En otra
realización, el análogo antagoniza la actividad del
OB-R. Por ejemplo, un análogo de
OB-R que se une a la leptina e inhibe la unión de la
leptina al OB-R competente en la transducción de
señales puede inhibir competitivamente la unión del OB nativo al
receptor, disminuyendo así la actividad de la leptina in
vivo. Tal análogo antagonista de OB-R es
preferiblemente una forma soluble del OB-R.
En una realización, un análogo del polipéptido
OB-R es el polipéptido OB-R
modificado por la sustitución de aminoácidos en las posiciones del
polipéptido que no son esenciales para su estructura ni para su
función. Por ejemplo, como se espera que el polipéptido
OB-R humano sea biológicamente activo en ratones, la
sustitución de los residuos de aminoácido divergentes de la
secuencia humana en comparación con la secuencia de aminoácidos
murina proporcionará posiblemente análogos útiles del polipéptido
OB-R. Por ejemplo, se podrían sustituir los
siguientes residuos del OB-R humano [la numeración
para los aminoácidos de OB-R humano emplea la
convención sobre numeración adoptada en Tartaglia et al.,
Cell, 83:1263 (1995)] por un residuo murino divergente
encontrado en esa posición, o por una sustitución de aminoácidos no
conservativa tal como una o más entre: Phe por Ser^{36}; Asp por
Tyr^{44}; Ser por Leu^{49}; Pro por Ser^{54}; Leu por
Ser^{60}; Ala por His^{63}; Ala por Thr^{66}; Ala por
Pro^{70}; Ile por Thr^{77}; Tyr por His^{78}; Pro por
Ser^{80}; Gly por Arg^{92}; Gly por Asp^{96}; Thr por
Ala^{103} o Ile^{106}; Ser por Leu^{118}; Gly por Asp^{124};
Thr por Lys^{138}; Pro por Ser^{146}; Asp por Val^{164}; Leu
por Gln^{177}; Asp por Gly^{179}; Gly por Glu^{192};
eliminación por Cys^{193}; His por Leu^{197}; Ser por
Ile^{221}; Leu por Asn^{233}; Leu por Ser^{273}; eliminación
por Thr^{278}; Ala por Asp^{285}; Glu por Lys^{286}; Ser por
Gly^{310}; Arg por Met^{370}; Ile por Ser^{379}; Ser por
Phe^{394}; Ala por Glu^{417}; Gly por Glu^{459}; Ser por
Ile^{476}; Thr por Ile^{482}; Thr por Ile^{551}; His por
Tyr^{586}; Lys por Ile^{648}; Ala por Ser^{686}; His por
Cys^{687}; Thr por Ile^{759}; lle por Asn^{776}; Asp por
Gly^{781}; Gly por Glu^{782}; Gly por Ser^{827}; Ala por
Asp^{832}; Arg por Pro^{892}; Thr por Glu^{893}; Asp por
Thr^{894}; o Leu por Glu^{896}.
También están contemplados por la presente
revelación los análogos que comprenden sustituciones conservativas
de aminoácidos. Por ejemplo, se pueden sustituir uno o más residuos
de aminoácido de la secuencia por otro aminoácido de una polaridad
similar, que actúe como un equivalente funcional, dando como
resultado una alteración silenciosa. Los sustitutos para un
aminoácido de la secuencia se pueden seleccionar de otros miembros
de la clase a la que pertenezca el aminoácido. Por ejemplo, los
aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina,
isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina.
Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina,
cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados
positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los
aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido
aspártico y ácido glutámico. En algunos casos, puede estar
sustituido un aminoácido polar por otro para conservar la
hidrofilidad local; es más probable que se requiera una sustitución
que conserve la carga, o que al menos no introduzca la carga
opuesta. No se espera que tales alteraciones afecten al peso
molecular aparente determinado mediante electroforesis sobre gel de
poliacrilamida ni al punto isoeléctrico.
En otra realización, se pueden sustituir
residuos de aminoácidos por residuos para formar análogos del
polipéptido OB-R que demuestren una mayor
propensión a formar, o que formen, estructuras secundarias más
estables. Por ejemplo, se preferiría la estructura de
hélice-\alpha si se introducen Glu, Ala, Leu, His,
Trp como sustitutos de los residuos de aminoácidos encontrados en
el polipéptido OB nativo. Preferiblemente, se emplean sustituciones
conservativas de aminoácidos, p. ej., sustituyendo ácido aspártico
por ácido(s) glutámico(s) (Glu); sustituyendo
isoleucina(s) por leucina; sustituyendo glicina o valina, o
cualquier aminoácido divergente (i.e., un aminoácido que no esté
conservado entre los OB-R de especies diferentes),
por alanina (p. ej., la serina de la posición 273 del polipéptido
OB-R humano por alanina); sustituyendo arginina o
lisina por histidina; y sustituyendo tirosina y/o fenilalanina por
triptófano. El aumento del grado, o lo que es más importante, de la
estabilidad de una estructura de hélice-\alpha
puede producir un análogo de OB-R con una mayor
actividad, una mayor afinidad de unión o una vida media más larga.
También se contemplan los análogos de polipéptido
OB-R truncados que incorporan residuos de
aminoácidos formadores de estructuras, p. ej., de estructuras de
hélice, para compensar la mayor propensión de los fragmentos de
polipéptido a carecer de una estructura estable.
En otra realización, un análogo del polipéptido
OB-R, preferiblemente, del polipéptido
OB-R humano, es una forma truncada del polipéptido.
Por ejemplo, ya se ha demostrado que el dominio transmembrana no es
esencial, pues una isoforma natural del polipéptido es codificada
por ADNc que expresa una proteína soluble. De manera similar, puede
ser posible eliminar alguno o todos los residuos de aminoácidos
divergentes del OB-R humano (en comparación con el
OB-R murino). Además, esta revelación contempla
proporcionar un análogo de OB-R que tiene la
secuencia de aminoácidos mínima necesaria para una actividad
biológica. Esto se puede determinar fácilmente, p. ej., analizando
la actividad de los fragmentos de OB-R en cuanto a
su capacidad para unirse a anticuerpos específicos del
OB-R, para inhibir la actividad de la leptina nativa
(mediante la unión competitiva) o para agonizar la actividad de la
leptina nativa.
La presente revelación contempla específicamente
proporcionar una forma de empalme soluble del OB-R
considerada agonista de la actividad de la leptina. En concreto, se
cree que el OB-Rd (según se denomina en la presente
memoria) se une a la leptina y facilita la unión de la leptina a
OB-Rb (considerado competente para la transducción
de señales). De este modo, en esta realización, OB-R
parece comportarse de manera análoga a otros sistemas receptores
[Kishimoto et al., Cell, 76:253 (1994); Davis et al.,
Science, 260:1805 (1993); Davis et al., Science,
259:1736 (1993)].
Cualquier experto en la técnica entenderá que el
tamaño de los fragmentos anteriores es aproximado y que se pueden
incluir o eliminar otros aminoácidos, p. ej., de uno a
aproximadamente cinco, de cada uno o ambos extremos, o del interior
del polipéptido o de los fragmentos del mismo, de los análogos
truncados enumerados.
Se pueden producir análogos, tales como
fragmentos, por ejemplo, mediante la digestión del
OB-R, p. ej., con tripsina, quimotripsina, pepsina,
papaína, proteasas trombolíticas, carboxipeptidasa A, proteinasa K,
etc. Se pueden producir otros análogos, tales como muteínas,
mediante una mutagénesis de sitio dirigida estándar de las
secuencias codificantes del péptido modulador del peso.
Hay diversas técnicas de rastreo conocidas en la
técnica para rastrear análogos de polipéptidos. Hay disponibles
diversas genotecas de compuestos químicos. Por consiguiente, la
presente revelación contempla el rastreo de tales genotecas, p.
ej., genotecas de compuestos sintéticos generados durante años de
investigación, genotecas de compuestos naturales y genotecas
combinatorias, según lo descrito más detalladamente, infra,
para los análogos de leptina. Esta revelación contempla el rastreo
de tales genotecas para compuestos que se unen a
OB-R, bien en formas solubles o transmembranosas.
Preferiblemente, tales moléculas son agonistas o antagonistas de la
transducción de señales por el OB-R. De este modo,
la presente revelación contempla el rastreo en busca de ligandos de
molécula pequeña, o análogos e imitadores de ligandos, así como el
rastreo en busca de ligandos naturales que se unen a, o son
agonistas o antagonistas, de la actividad del receptor OB in
vivo.
El conocimiento de la secuencia primaria del
receptor y de la similitud de esa secuencia con proteínas de
función conocida puede proporcionar una clave inicial en cuanto a
los agonistas o antagonistas de la proteína. La identificación y el
rastreo de los antagonistas se ve además facilitada por la
determinación de las características estructurales de la proteína,
p. ej., usando cristalografía de rayos X, difracción de neutrones,
espectrometría de resonancia magnética nuclear y otras técnicas
para la determinación de estructuras. Estas técnicas proporcionan
el diseño racional o la identificación de agonistas y
antagonistas.
Otro enfoque usa bacteriófago recombinante para
producir grandes genotecas. Usando el "Procedimiento de los
fagos" [Scott et al., Science, 249:386-390
(1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
87:6378-6382 (1990); Devlin et al., Science,
249:404-406 (1990)], se pueden construir genotecas
muy grandes (10^{6}-10^{8} entidades químicas).
Un segundo enfoque usa principalmente procedimientos químicos, de
los cuales el procedimiento Geysen [Geysen et al.,
Molecular Immunology, 23:709-715 (1986);
Geysen et al., J. Immunologic Method,
102:259-274 (1987)] y el procedimiento reciente de
Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991)
son ejemplos. Otras referencias [Furka et al. XIV Congreso
Internacional de Bioquímica, Volumen 5, Sumarios FR:013 (1988);
Furka, Int. J. Peptide Protein Res.,
37:487-493 (1991); Houghton (Patente estadounidense
n.º 4.631.211, concedida en diciembre de 1986); y Rutter et
al. (Patente estadounidense n.º 5.010.175, concedida el 23 de
abril de 1991)] describen procedimientos para producir una mezcla
de péptidos que puedan ser analizados como agonistas o
antagonistas.
En otro aspecto, se pueden usar genotecas
sintéticas [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 90:10700-10704 (1993); Lam et al.,
Publicación de patente internacional n.º WO 92/00252; Kocis et
al., Publicación de patente internacional n.º WO 94/28028] y
similares para rastrear los ligandos de receptores OB según lo
revelado en la presente memoria.
En concreto, se pueden realizar análisis para la
unión de ligando soluble a células que expresen formas recombinantes
del dominio de unión a ligandos del receptor OB. Los ligandos
solubles se pueden proporcionar fácilmente como polipéptido de
leptina recombinante o sintético.
El rastreo puede realizarse con células
recombinantes que expresen el receptor OB, o alternativamente,
usando proteína receptora purificada, p. ej., producida
recombinantemente, según lo descrito anteriormente. Por ejemplo, se
puede usar la capacidad del receptor OB marcado, soluble o
solubilizado, que incluye la porción de unión a ligandos de la
molécula, para unirse a un ligando con el fin de rastrear genotecas
según lo descrito en las referencias anteriores.
Generalmente, se puede derivar una forma soluble
del presente polipéptido mediante la unión de uno o más restos
químicos al resto de polipéptido. Además se pueden formular los
derivados modificados químicamente para administrarlos por vía
intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular,
subcutánea, intravenosa, oral, nasal, rectal, bucal, sublingual,
pulmonar, tópica, transdérmica u otra vía de administración. Se ha
descubierto que la modificación química de las proteínas
biológicamente activas proporciona más ventajas en determinadas
circunstancias, tales como el aumento de la estabilidad y el tiempo
de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la
inmunogenicidad [véase la patente estadounidense n.º 4.179.337,
Davis et al., concedida el 18 de diciembre de 1979; para una
revisión, véase Abuchowski et al., "Soluble
Polymer-Enzyme Adducts", en Enzymes as
Drugs, pp. 367-383, Holcenberg y Roberts, eds.,
Wiley-lnterscience, Nueva York, NY, (1981)].
Francis, "Focus on Growth Factors", 3:4-10
(1992) es un artículo de revisión que describe la modificación de
proteínas y las proteínas de fusión.
Los restos químicos adecuados para una
derivación se pueden seleccionar entre diversos polímeros, en
concreto, polímeros hidrosolubles. El polímero seleccionado es
preferiblemente hidrosoluble, de manera que la proteína a la que
está unido no precipita en un medio acuoso, tal como un medio
fisiológico. Sin embargo, también se pueden usar polímeros apolares
en los que una determinada aplicación se beneficie de su uso, p.
ej., en una matriz de liberación controlada en la que la
accesibilidad al agua está limitada. Preferiblemente, para un uso
terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será
farmacéuticamente aceptable. Cualquier experto en la técnica podrá
seleccionar el polímero deseado en base a tales consideraciones como
si el conjugado de polímero/proteína fuera a ser usado
terapéuticamente, y en ese caso, también la dosis deseada, el tiempo
de circulación, la resistencia a la proteolisis y otras
consideraciones. Para los presentes péptidos y proteínas, éstos se
pueden determinar usando los análisis proporcionados en la presente
memoria.
El polímero hidrosoluble se puede seleccionar
del grupo constituido por, por ejemplo, polietilenglicol,
copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, alcohol polivinílico, pirrolidona polivinílica,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (bien homopolímeros o
copolímeros aleatorios) y dextrano o
poli(n-vinilpirrolidon)polietilenglicol, homopolímeros
de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido
de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico. El
propionaldehído de polietilenglicol puede proporcionar ventajas en
la fabricación debida a su estabilidad en agua.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Para
polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre
aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el
término "aproximadamente" que en preparaciones de
polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y algunas, menos
que el peso molecular establecido) para facilitar el manejo y la
fabricación. Se pueden usar otros tamaños, en función del perfil
terapéutico deseado (p. ej., la duración de liberación sostenida
deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, la
facilidad de manejo, el grado o la falta de antigenicidad y otros
efectos conocidos del polietilenglicol sobre una proteína o análogo
terapéutico).
El número de moléculas de polipéptido unidas a
cada polímero puede variar y cualquier experto en la técnica podrá
determinar su efecto sobre la función. Es posible
mono-derivar o proporcionar una combinación de
derivación de dos, tres, cuatro o más, con los mismos o diferentes
restos químicos (p. ej., polímeros, tales como pesos diferentes de
polietilenglicoles). La proporción entre las moléculas poliméricas y
las moléculas de proteína (o de péptido) variará, así como lo harán
sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la
proporción óptima (en términos de eficacia de reacción en tanto en
cuanto no haya un exceso de proteína o polímero sin reaccionar)
estará determinada por factores tales como el grado deseado de
derivación (p. ej., mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular del
polímero deseado, si el polímero es ramificado o no ramificado y las
condiciones de reacción.
Las moléculas de polietilenglicol (u otros
restos químicos) deberían unirse a la proteína considerando los
efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína.
Hay un número de procedimientos de unión disponibles para los
expertos en la técnica, p. ej., EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG al
G-CSF). Véase también Malik et al., Exp.
Hematol., 20: 1028-1035 (1992) (que informa de
la pegilación de G-CSF usando cloruro de tresilo).
Por ejemplo, se puede unir mediante enlace covalente
polietilenglicol por los residuos de aminoácido a través de un
grupo reactivo, tal como un grupo carboxilo o amino libre. Los
grupos reactivos son aquéllos a los que se puede unir una molécula
de polietilenglicol activada. Los residuos de aminoácidos que tienen
un grupo amino libre incluyen residuos de lisina y residuos de
aminoácidos N-terminales; aquéllos que tienen un
grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico,
residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido
C-terminal. También se pueden usar grupos
sulfhidrilo como grupo reactivo para unir la(s)
molécula(s) de polietilenglicol. A efectos terapéuticos, se
prefiere la unión en un grupo amino, tal como la unión en el
terminal N o el grupo lisina. Se debería evitar la unión en residuos
importantes para la unión al receptor si se desea la unión al
receptor.
Se puede desear específicamente una proteína
modificada químicamente N-terminalmente. Usando
polietilenglicol como ejemplo de las presentes composiciones, es
posible seleccionar de una variedad de moléculas de polietilenglicol
(por el peso molecular, la ramificación, etc.) la proporción de las
moléculas de polietilenglicol con respecto a las moléculas de
proteína (péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de
pegilación por realizar y el procedimiento de obtención de la
proteína pegilada N-terminalmente seleccionada. El
procedimiento de obtención de la preparación pegilada
N-terminalmente (i.e., separar este resto de otros
restos monopegilados si fuera necesario) puede ser mediante
purificación del material pegilado N-terminalmente
de una población de moléculas de proteína pegiladas. La
modificación química N-terminal selectiva se puede
realizar mediante la alquilación reductiva que explota la
reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino
primarios (lisina frente al terminal N) disponibles para la
derivación en una determinada proteína. Bajo las condiciones de
reacción apropiadas, se logra la derivación sustancialmente
selectiva de la proteína en el terminal N con un grupo carbonilo
que contiene polímero. Por ejemplo, se puede pegilar
N-terminalmente selectivamente la proteína
realizando la reacción a un pH que permita sacarle partido a la pK,
a las diferencias entre los grupos
\varepsilon-amino de los residuos de lisina y al
grupo \alpha-amino del residuo
N-terminal de la proteína. Mediante tal unión de
derivación selectiva de un polímero hidrosoluble con una proteína se
controla: que la conjugación con el polímero tenga lugar
predominantemente en el terminal N de la proteína y que no se
produzca una modificación significativa de otros grupos reactivos,
tales como grupos amino de cadena lateral de lisina. Usando una
alquilación reductiva, el polímero hidrosoluble puede ser del tipo
anteriormente descrito y debería tener un único aldehído reactivo
para acoplarlo a la proteína. Se puede usar propionaldehído de
polietilenglicol que contenga un único aldehído reactivo.
Como se indica anteriormente, la presente
revelación se dirige a ácidos nucleicos codificantes de polipéptidos
OB-R, así como a secuencias 5', 3' e intrónicas no
codificantes genómicas asociadas con el gen
OB-R. De este modo, según la presente
revelación, se pueden emplear técnicas convencionales de Biología
Molecular, Microbiología y ADN recombinante pertenecientes al
alcance de la técnica. Tales técnicas se explican por completo en
la bibliografía [véase, p. ej., Sambrook et al., "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual", Segunda edición, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989);
Glover ed., "DNA Cloning: A Practical Approach", Volúmenes I y
II, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U. (1985); Gait ed.,
"Oligonucleotide Synthesis", Oxford University Press (1984);
Hames et al., eds., "Nucleic Acid Hybridization",
Springer-Verlag (1985); Hames et al., eds.
"Transcription and Translation", Oxford University Press
(1984); Freshney ed., "Animal Cell Culture", Oxford University
Press (1986); "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press
(1986); Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning",
Wiley, Nueva York (1984)]. Son de particular relevancia para la
presente revelación las estrategias de aislamiento, clonación,
secuenciación, análisis y caracterización de un gen o ácido nucleico
en base a las conocidas técnicas de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Un "replicón" es cualquier elemento
genético (p. ej., plásmido, cromosoma, virus) que actúa como una
unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, i.e., que es
capaz de realizar la replicación bajo su propio control.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, un fago o un cósmido, al que se puede unir otro segmento
de ADN para llevar a cabo la replicación del segmento unido.
Un "casete" se refiere a un segmento de ADN
que puede ser insertado en un vector en sitios de restricción
específicos. El segmento de ADN codifica un polipéptido de interés,
y el casete y los sitios de restricción están diseñados para
asegurar la inserción del casete en el marco de lectura apropiado
para la transcripción y la traducción.
ADN "heterólogo" se refiere a ADN que no
está localizado de manera natural en la célula, o en un sitio
cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye
un gen foráneo a la célula.
Una célula ha sido "transfectada" por ADN
exógeno o heterólogo cuando tal ADN ha sido introducido dentro de
la célula. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o
heterólogo cuando el ADN transfectado efectúa un cambio fenotípico.
Preferiblemente, el ADN transformante debería estar integrado
(unido mediante enlace covalente) en el ADN cromosómico
constituyente del genoma de la célula.
Un "clon" es una población de células
derivada de una única célula o un ancestro común por mitosis.
Una "molécula de ácido nucleico" se refiere
a la forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleótidos
(adenosina, guanosina, uridina o cistidina; "moléculas de ARN")
o desoxiribonucleósidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") bien en
forma monocatenaria o de hélice bicatenaria. Son posibles las
hélices de ADN-ADN, ADN-ARN y
ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico y,
en concreto, molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la
estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a
ninguna forma terciaria o cuaternaria en particular. De este modo,
este término incluye ADN bicatenario encontrado, entre otros, en
moléculas de ADN lineales o circulares (p. ej., fragmentos de
restricción), plásmidos y cromosomas. En la explicación de la
estructura de determinadas moléculas de ADN bicatenario, se pueden
describir secuencias en la presente memoria según la convención
normal de dar únicamente la secuencia en la dirección de 5' a 3' a
lo largo de la cadena no transcrita del ADN (i.e., la cadena que
tiene una secuencia homóloga al ARNm). Una "molécula de ADN
recombinante" es una molécula de ADN que ha sufrido una
manipulación biológica molecular.
Una molécula de ácido nucleico es
"hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un
ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una forma monocatenaria de la
molécula de ácido nucleico se puede aparear a otra molécula de
ácido nucleico en condiciones apropiadas de temperatura y de fuerza
iónica en disolución (véase, Sambrook et al., 1989,
supra). Las condiciones de temperatura y de fuerza iónica
determinan las "condiciones restrictivas" de la hibridación.
Para un rastreo preliminar de los ácidos nucleicos homólogos, se
pueden usar condiciones de hibridación poco restrictivas
correspondientes a una T_{m} de 55ºC, p. ej., 5 x SSC; SDS al
0,1%; leche al 0,25% y sin formamida; o formamida al 30%; 5 x SSC;
SDS al 0,5%). Las condiciones de hibridación moderadamente
restrictivas corresponden a una T_{m} mayor, p. ej., formamida al
40%; con 5 x ó 6 x SCC. Las condiciones de hibridación muy
restrictivas corresponden la T_{m} más elevada, p. ej., formamida
al 50%; 5 x ó 6 x SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos
nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque se pueden
producir apareamientos erróneos entre bases en función de las
condiciones restrictivas de la hibridación. Las condiciones
restrictivas apropiadas para la hibridación de ácidos nucleicos
dependen de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de
complementación, variables conocidas en la técnica. Cuanto mayor
sea el grado de similitud o la homología entre las dos secuencias de
nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para los híbridos de
los ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad
relativa (correspondiente a una T_{m} mayor) de las hibridaciones
de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN;
ADN:ARN; ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de
longitud, se han derivado ecuaciones para calcular la T_{m}
(véase Sambrook et al., 1989, supra,
9.50-0.51). Para la hibridación con ácidos
nucleicos más cortos, i.e., oligonucleótidos, la posición de los
apareamientos erróneos cobra mayor importancia y la longitud del
oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et
al., 1989, supra, 11.7-11.8).
Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico
hibridable es de al menos aproximadamente 10 nucleótidos; más
preferiblemente, es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos; lo
más preferible es que la longitud sea de al menos aproximadamente
20 nucleótidos.
En una realización específica, el término
"condiciones de hibridación estándar" se refiere a una T_{m}
de 55ºC, usando las condiciones expuestas anteriormente. En una
realización preferida, la T_{m} es de 60ºC; en una realización
más preferida, la T_{m} es de 60ºC.
"Recombinación homóloga" se refiere a la
inserción de una secuencia de ADN foráneo de un vector en un
cromosoma. Preferiblemente, el vector se dirige a un sitio
cromosómico específico para la recombinación homóloga. Para una
recombinación homóloga específica, el vector contendrá regiones lo
suficientemente largas de homología con las secuencias del
cromosoma como para permitir la unión complementaria y la
incorporación del vector en el cromosoma. Las regiones más largas
de homología y los mayores grados de similitud secuencial pueden
aumentar la eficacia de la recombinación homóloga.
Una "secuencia codificante" de ADN es una
secuencia de ADN bicatenaria que está transcrita y traducida en un
polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando
está colocada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas.
Los límites de la secuencia codificante están determinados por un
codón de iniciación en el terminal (amino) 5' y un codón de
terminación de la traducción en el terminal (carboxilo) 3'. Una
secuencia codificante puede incluir, pero no limitarse a,
secuencias procariotas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN
genómico de ADN eucariótico (p. ej., de mamífero) e incluso
secuencias de ADN sintético. Si la secuencia codificante está
destinada a la expresión en una célula eucariota, habrá una
secuencia de señales de poliadenilación y de terminación de la
transcripción localizada en 3' con respecto a la secuencia
codificante.
Los ácidos nucleicos contemplados por la
presente revelación incluyen ácidos nucleicos que codifican la
expresión de péptidos tales como aquéllos expuestos en las SEQ ID
NO: 2, 4, 6, 8 y 10. Por consiguiente, aunque se haya aislado y
secuenciado ADN específico en relación con el gen
OB-R, cualquier célula animal puede servir
como fuente de ácidos nucleicos para la clonación molecular de un
gen codificante de los polipéptidos revelados en la presente
memoria. Se puede obtener el ADN mediante procedimientos estándar
conocidos en la técnica a partir de ADN clonado (p. ej., una
"genoteca" de ADN), mediante síntesis química, mediante la
clonación de ADNc o mediante la clonación de ADN genómico, o
fragmentos de los mismos, purificados a partir de la célula deseada
[véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra;
Glover, 1985, supra]. Los clones derivados de ADN genómico
pueden contener regiones de ADN reguladoras o intrónicas además de
las regiones codificantes; los clones derivados de ADNc no
contendrán secuencias de intrones. Independientemente de la fuente,
el gen debería ser clonado molecularmente en un vector adecuado para
la propagación del gen.
En la clonación molecular del gen procedente de
ADN genómico, el ADN genómico se puede amplificar usando cebadores
seleccionados de las secuencias de ADNc. Alternativamente, se
generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen
deseado. El ADN puede ser escindido en sitios específicos usando
diversas enzimas de restricción. También se puede usar DNasa en
presencia de manganeso para fragmentar el ADN o se puede triturar
físicamente el ADN como, por ejemplo, mediante un tratamiento con
ultrasonidos. Entonces se pueden separar los fragmentos de ADN
lineales según el tamaño mediante técnicas estándar, incluyendo,
pero no limitándose a, electroforesis sobre gel de poliacrilamida y
agarosa, y cromatografía en columna.
Una vez generados los fragmentos de ADN, se
puede realizar la identificación del fragmento de ADN específico
que contenga el gen OB-R deseado en un número
de modos. Por ejemplo, si hay disponible una cantidad de una
porción de un gen OB-R o de su ARN
específico, o de un fragmento del mismo, y puede ser purificado y
marcado, se pueden rastrear los fragmentos de ADN generados mediante
hibridación de ácidos nucleicos a una sonda marcada [Benton et
al., Science, 196:180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 72:3961 (1975)]. La presente revelación
proporciona tales sondas de ácido nucleico, que pueden ser
preparadas convenientemente a partir de las secuencias específicas
reveladas en la presente memoria, p. ej., una sonda hibridable que
tenga una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento de
al menos 10, preferiblemente, de al menos 15, y más
preferiblemente, de al menos 20 nucleótidos de las secuencias
representadas en las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y 9. Preferiblemente, se
selecciona un fragmento que sea muy exclusivo para los ácidos
nucleicos revelados en la presente memoria. Estos fragmentos de ADN
con una similitud secuencial sustancial con la sonda, p. ej., un
ADN homólogo, se hibridarán. Como se indica anteriormente, cuanto
mayor sea el grado de similitud secuencial, más restrictivas serán
las condiciones de la hibridación que se puedan usar. En una
realización, se usan condiciones de hibridación poco restrictivas
para identificar un ácido nucleico de receptor de la leptina
homólogo. Sin embargo, en un aspecto preferido y tal y como se
demuestra experimentalmente en la presente memoria, se hibridará un
ácido nucleico codificante de un polipéptido según lo revelado en la
presente memoria con un ácido nucleico que tenga una secuencia de
nucleótidos tal como la representada en (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 y
9), o un fragmento hibridable de la misma, en condiciones
moderadamente restrictivas; más preferiblemente, se hibridará en
condiciones muy restrictivas.
En otra realización específica, se puede
identificar el ADN revelado en la presente memoria usando una de
las sondas de PCR obtenidas mediante el atrapado de exones y la
selección de ADNc. Por ejemplo, se pueden usar las parejas de
cebadores descritas en el ejemplo 3 para amplificar un ADN.
Preferiblemente, estos cebadores amplificarán
ADN en condiciones de moderadamente a muy restrictivas, p. ej.,
usando una pre-hibridación a 65ºC con un tampón
Rapid-hyb (Amersham Life Sciences), seguida por una
hibridación durante 6 horas a 65ºC, seguida del lavado primero con
2 x SSC/SDS al 0,1% durante 30 min. a temperatura ambiente (TA) y
un segundo lavado a condiciones más restrictivas con 0,3 x SSC/SDS
al 0,1%, TA, durante 30 min. Tal y como apreciarán los expertos en
la técnica, las condiciones restrictivas del segundo lavado son
flexibles y dependen de la longitud de la sonda y del grado de
similitud secuencial de cada sonda. Por ejemplo, como las regiones
codificantes de seres humanos y ratones son aproximadamente un 78%
homólogas, se pueden emplear las mismas condiciones de hibridación
con un segundo lavado menos restrictivo (p. ej., dos veces con 2 x
SSC/SDS al 0,1%, TA). Si esto resulta en una carencia de señales con
carencia de fondo, se puede intentar la hibridación a una
temperatura más baja (condiciones menos restrictivas), p. ej., a
42ºC. Si hay demasiado fondo, las condiciones restrictivas del
segundo lavado pueden aumentarse, (p. ej., 0,5 ó 0,3 x SSC; SDS al
0,1%, T.A.). Según esta revelación, la sondas de PCR anteriormente
mencionadas definirán una molécula de ácido nucleico, p. ej., ADN,
codificante de OB-R de seres humanos así como
genotecas de ADN murino en condiciones de hibridación
similares.
Alternativamente, se puede detectar la presencia
del gen mediante análisis basados en las propiedades físicas,
químicas o inmunológicas de su producto expresado. Por ejemplo, se
pueden seleccionar clones de ADNc o clones de ADN que se hibriden
de manera selectiva con los ARNm apropiados, lo que produzca una
proteína que, p. ej., tenga migración electroforética,
comportamiento enfocador isoeléctrico, mapas de digestión
proteolítica, actividad de unión a la leptina o propiedades
antigénicas similares o idénticos según lo conocido por el presente
OB-R. Por ejemplo, se pueden usar convenientemente
anticuerpos según lo revelado en la presente memoria para rastrear
homólogos de OB-R procedentes de otras fuentes.
Preferiblemente, se analizan proteínas procedentes de genes
candidatos en cuanto a la unión a la leptina.
También se puede identificar un gen codificante
de un polipéptido según lo revelado en la presente memoria mediante
la selección de ARNm, i.e., mediante la hibridación de ácidos
nucleicos seguida de la traducción in vitro. En este
procedimiento, se usan fragmentos para aislar ARNm complementarios
por hibridación. Tales fragmentos de ADN pueden representar ADN
modulador purificado disponible. Los análisis de
inmunoprecipitación o los análisis funcionales (p. ej., la
actividad de unión a la leptina) de los productos de la traducción
in vitro de los productos de los ARNm aislados identifican el
ARNm y, por lo tanto, los fragmentos de ADN complementario que
contienen las secuencias deseadas. Además, se pueden seleccionar
ARNm específicos mediante la adsorción de polisomas aislados de
células contra anticuerpos inmovilizados específicamente dirigidos
contra un péptido modulador.
Se puede sintetizar un ADNc de péptido modulador
radiomarcado usando el ARNm seleccionado (de los polisomas
adsorbidos) como un molde. Entonces se puede usar el ARNm o el ADNc
radiomarcado como sonda para identificar los fragmentos de ADN de
péptido modulador homólogo de entre el resto de fragmentos de ADN
genómico.
Según lo mencionado anteriormente, se puede
preparar una secuencia de ADN codificante de péptidos moduladores
del peso según lo revelado en la presente memoria de manera
sintética en lugar de clonados. Se puede diseñar la secuencia de
ADN con los codones apropiados para las secuencias de aminoácidos
del OB-R. En general, se seleccionaran los codones
preferidos para el huésped final si la secuencia se va a usar para
la expresión. Se puede ensamblar la secuencia completa desde
oligonucleótidos solapantes preparados mediante procedimientos
estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa [véase,
p. ej., Edge, Nature, 292:756 (1981); Nambair et al.,
Science, 223:1299 (1984); Jay et al., J. Biol.
Chem.,259:6311 (1984)].
Las secuencias de ADN sintéticas permiten una
construcción conveniente de los genes que expresarán los análogos
de OB-R según lo descrito anteriormente.
Alternativamente, se puede elaborar ADN codificante de análogos
mediante mutagénesis de sitio dirigida de genes
OB-R nativos o ADNc, y los análogos se pueden
elaborar directamente usando una síntesis de polipéptidos
convencional.
En Noren et al, Science,
244:182-188 (1989), se describe un procedimiento
general para la incorporación específica de sitio de aminoácidos no
naturales en proteínas. Este procedimiento se puede usar para crear
análogos del polipéptido OB-R con aminoácidos no
naturales.
Debido a la degeneración de las secuencias
codificantes de nucleótidos, se pueden usar otras secuencias de ADN
que codifican la secuencia de sustancialmente los mismos aminoácidos
como un gen OB-R en la práctica de la
presente revelación. Éstas incluyen pero no se limitan a genes
alélicos, genes homólogos de otras especies y secuencias de
nucleótidos que comprenden todos o porciones de los genes
OB-R que están alterados por la sustitución
de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácidos
de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Asimismo,
los derivados de OB-R revelados en la presente
memoria incluyen, pero no se limitan a, aquéllos que contienen,
como secuencia de aminoácidos primaria, toda o parte de la secuencia
de aminoácidos de una proteína OB-R, incluyendo
secuencias alteradas en las que hay residuos de aminoácidos
funcionalmente equivalentes sustituidos por residuos de la
secuencia, resultando en una sustitución conservativa de
aminoácidos según lo descrito anteriormente en relación con los
análogos de OB-R.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente revelación se extiende a la
preparación de nucleótidos antisentido y ribozimas que se pueden
usar para interferir en la expresión de las proteínas a nivel de la
traducción. Este enfoque utiliza ácido nucleico antisentido y
ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm específico, bien
enmascarando ese ARNm con un ácido nucleico antisentido, o
escindiéndolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas
de ADN o ARN que son complementarias a al menos una parte de la
molécula de ARNm específico [véase Weintraub, Sci. Am.,
262:4046 (1990); Marcus-Sekura, Anal.
Biochem., 172:289-295 (1988)]. En la célula, se
hibridan a ese ARNm formando una molécula bicatenaria. La célula no
traduce un ARNm complejado en esta forma bicatenaria. Por lo tanto,
los ácidos nucleicos antisentido interfieren en la expresión del
ARNm dentro de la proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince
nucleótidos y las moléculas que se hibridan al codón de iniciación
AUG serán particularmente eficaces, pues son fácilmente
sintetizables y tienen posibilidad de plantear menos problemas que
las moléculas de mayor tamaño al introducirlas en células
productoras de péptido modulador del peso. Los procedimientos
antisentido se han usado para inhibir la expresión de muchos genes
in vitro [(Marcus-Sekura, 1988 supra;
Hambor et al., J. Exp. Med., 168:1237-1245
(1988)].
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN
monocatenarias de una manera un tanto análoga a las endonucleasas de
restricción de ADN. Las ribozimas fueron descubiertas a partir de
la observación de que ciertos ARNm tienen la capacidad de escindir
sus propios intrones. Mediante la modificación de la secuencia de
nucleótidos de estos ARN, los investigadores han sido capaces de
diseñar genéticamente moléculas que reconocen secuencias de
nucleótidos específicas de una molécula de ARN y la escinden [Cech,
J. Am. Med. Assoc., 260:3030-3034 (1988)].
Como las ribozimas son específicas de la secuencia, sólo se
desactivan ARNm con determinadas secuencias.
Los investigadores han identificado dos tipos de
ribozimas: del tipo Tetrahymena y del tipo "cabeza de
martillo". Las ribozimas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias
de cuatro bases, mientras que las de tipo de "cabeza de
martillo" reconocen secuencias de once a dieciocho bases. Cuanto
más larga es la secuencia de reconocimiento, mayor probabilidad
habrá de que se dé exclusivamente en las especies del ARNm diana.
Por lo tanto, las ribozimas de tipo de "cabeza de martillo" son
preferibles a las ribozimas de tipo Tetrahymena para desactivar una
especie de ARNm específica, siendo las secuencias de reconocimiento
de dieciocho bases preferibles frente a las secuencias de
reconocimiento más cortas.
Las secuencias de ADN descritas en la presente
memoria pueden ser, por tanto, usadas para preparar moléculas
antisentido frente a y ribozimas que escinden ARNm para proteínas
moduladoras del peso y sus ligandos, inhibiendo así la expresión
del gen OB-R y conduciendo a una mayor
ganancia de peso y de adiposidad.
En otra realización, se revelan en la presente
memoria oligonucleótidos cortos complementarios a las cadenas
codificantes y complementarias del ácido nucleico
OB-R, o a regiones no codificantes del gen
OB-R 5', 3' o internas (intrónicas) con
respecto a la región codificante. Tales ácidos nucleicos son útiles
como sondas, bien como sondas de oligonucleótidos marcadas
directamente o como cebadores para la reacción en cadena de la
polimerasa, con el fin de evaluar la presencia de mutaciones del gen
ob-r o el nivel de expresión del ARNm de
OB-R. Preferiblemente, los ácidos nucleicos
no codificantes proceden del gen OB-R
humano.
En una realización específica, los ácidos
nucleicos no codificantes proporcionan una recombinación homóloga
para la integración de un gen amplificable y/u otras secuencias
reguladoras en las proximidades del gen OB-R,
p. ej., para proporcionar mayores niveles de expresión del
polipéptido OB-R o para superar una mutación de las
secuencias reguladoras del gen ob-r que
evitan niveles apropiados de expresión del polipéptido
OB-R [Véase la publicación de patente internacional
WO 91/06666, publicada el 16 de mayo de 1991 por Skoultchi; la
publicación de patente internacional N.º: WO 91/09955, publicada el
11 de julio de 1991 por Chappel; véase también la publicación de
patente internacional N.º: WO 90/14092, publicada el 29 de noviembre
de 1990, por Kucherlapati y Campbell].
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de control de la transcripción y
de la traducción son secuencias reguladoras de ADN, tales como
promotores, potenciadores, terminadores y similares, que
proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una
célula huésped. En las células eucariotas, las señales de
poliadenilación son secuencias control.
Una secuencia codificante está "bajo el
control" de las secuencias de control de la transcripción y de
la traducción en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la
secuencia codificante dentro de ARNm, que luego es cortada y
empalmada en ARN trans, y traducida en la proteína codificada
por la secuencia codificante.
Se incluye una "secuencia señal" al
principio de la secuencia codificante de una proteína por ser
expresada sobre la superficie de una célula. Esta secuencia codifica
un péptido señal que es N-terminal con respecto al
polipéptido maduro, que dirige a la célula huésped en la
translocación del polipéptido. El término "secuencia señal de
translocación" también se usa en la presente memoria para
referirse a esta clase de secuencia señal. Las secuencias señal de
translocación se pueden encontrar asociadas a una variedad de
proteínas nativas en eucariotas y procariotas, y habitualmente son
funcionales en ambos tipos de organismos. Según la presente
revelación, los residuos de aminoácidos 1-27 de los
polipéptidos OB-R murino y humano (véanse las SEQ
ID NO: 8 y 10) comprenden el péptido señal. En otra realización, los
residuos de aminoácidos 1-22 comprenden el péptido
señal [Tartaglia et al., Cell, 83:1263 (1995)].
Una secuencia de ADN está "ligada
operativamente" a una secuencia de control de la expresión cuando
la secuencia de control de la expresión controla y regula la
transcripción y la traducción de la secuencia del ADN. El término
"ligado operativamente" incluye tener una señal de iniciación
apropiada (p. ej., ATG) en frente de la secuencia de ADN por ser
expresada y mantener el marco de lectura correcto para permitir la
expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la secuencia de
control de la expresión y la producción del producto deseado
codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desee insertar
en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal de
iniciación apropiada, tal señal de iniciación puede ser insertada
secuencia arriba (5') de y en el marco de lectura con el gen.
Una "secuencia promotora" es una región
reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula
e iniciar la transcripción de una secuencia codificante secuencia
abajo (en sentido 3'). A efectos de definir la presente revelación,
la secuencia promotora se une a su terminal 3' por el sitio de
iniciación de la transcripción y se extiende secuencia arriba (en
sentido 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos
necesario para iniciar la transcripción a niveles detectables sobre
el fondo. En la secuencia promotora, se encontrará un sitio de
iniciación de la transcripción (definido convenientemente, por
ejemplo, mapeando con nucleasa S1), así como dominios de unión a
proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN
polimerasa.
Otra característica de esta revelación es la
expresión de las secuencias de ADN reveladas en la presente memoria.
Como se sabe en la técnica, las secuencias de ADN se pueden
expresar ligándolas operativamente a una secuencia de control de la
expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector
de expresión en la transformación de un huésped unicelular
apropiado.
Tal unión operativa de una secuencia de ADN
según lo revelado en la presente memoria a una secuencia de control
de la expresión incluye, por supuesto, si no ya parte de la
secuencia de ADN, el suministro de un codón de iniciación, ATG, en
el marco de lectura correcto secuencia arriba de la secuencia de
ADN.
Se puede emplear una amplia variedad de
combinaciones de huésped/vector de expresión en la expresión de la
secuencias de ADN reveladas en la presente memoria. Los vectores de
expresión útiles, por ejemplo, pueden estar constituidos por
segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y
sintético. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y
plásmidos bacterianos conocidos, p. ej., los plásmidos de E.
coli col El, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, o los derivados del
plásmido pUC, p. ej., vectores pGEX, vectores pET,
pmal-c, pFLAG, etc. y sus derivados, plásmidos
tales como RP4; ADN de fagos, p. ej., los numerosos derivados del
fago \lambda, tales como NM989 y otro ADN de fago, p. ej., M13 y
ADN de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales
como el plásmido 2\mu o derivados del mismo; vectores útiles en
células eucariotas tales como vectores útiles en células de
insectos o de mamíferos; vectores derivados de combinaciones de
plásmidos y de ADN de fago, tales como plásmidos que hayan sido
modificados para emplear ADN de fago u otras secuencias de control
de la expresión; y similares.
Se puede usar cualquiera de entre una amplia
variedad de secuencias de control de la expresión (secuencias que
controlan la expresión de una secuencia de ADN ligada operativamente
a ellas) en estos vectores para expresar las secuencias de ADN
reveladas en la presente memoria. Tales secuencias de control de la
expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tempranos o
tardíos de SV40, CMV, Vaccinia, polyoma o adenovirus, el
sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el
sistema TRC, el sistema L7R, el operador principal y las
regiones promotoras del fago X, las regiones control de la proteína
de la cubierta fd, el promotor de la
3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas
glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida (p. ej., Pho5),
el promotor AOX 1 de la levadura metilotrófica, los promotores de
los factores de apareamiento de la levadura \alpha y otras
secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células
procariotas o eucariotas, o de sus virus y las diversas
combinaciones de los mismos.
También es útil una amplia variedad de células
huésped unicelulares en la expresión de secuencias de ADN reveladas
en la presente memoria. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes
eucariotas y procariotas conocidos, tales como cepas de E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces; hongos tales como levaduras
(Saccharomyces y levadura metilotrófica tal como
Pichia, Candida, Hansenula y Torulopsis); y
células animales, tales como células CHO, Rl.l, B-W
y LM, células de riñón de mono verde africano (p. ej., COS 1, COS 7,
BSC1, BSC40, y BMT10), células de insectos (p. ej.: Sf9), y células
humanas y células vegetales en cultivo tisular. Es particularmente
preferida la expresión en baculovirus con un péptido señal de
insecto reemplazando al péptido señal OB-R, por
ejemplo, en el vector pMelBac (Invitrogen; N.º de catálogo
V1950-20).
Se entenderá que no todos los vectores, las
secuencias de control de la expresión y los huéspedes funcionarán
igualmente bien en la expresión de las secuencias de ADN reveladas
en la presente memoria. Ni todos los huéspedes funcionarán
igualmente bien con el mismo sistema de expresión. Sin embargo,
cualquier experto en la técnica podrá seleccionar los vectores, las
secuencias de control de la expresión y los huéspedes apropiados sin
demasiada experimentación para conseguir la expresión deseada sin
alejarse del ámbito de esta revelación. Por ejemplo, en la
selección de un vector, se puede considerar el huésped, porque el
vector debe funcionar en él. También se tendrán en cuenta el número
de copias del vector, la capacidad de controlar ese número de copias
y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector,
tal como marcadores antibióticos.
En la selección de una secuencia de control de
la expresión, hay una variedad de factores que normalmente se
tendrá en cuenta. Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa
del sistema, su controlabilidad y su compatibilidad con la
secuencia de ADN concreta o el gen por expresar, particularmente,
respecto a las posibles estructuras secundarias. Los huéspedes
unicelulares adecuados se seleccionarán teniendo en cuenta, p. ej.:
su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características de
secreción, su capacidad para plegar proteínas correctamente y sus
necesidades de fermentación, así como la toxicidad contra el huésped
del producto codificado por las secuencias de ADN por ser
expresadas y la facilidad de purificación de los productos de
expresión.
Teniendo en cuenta estos y otros factores,
cualquier experto en la técnica podrá construir una variedad de
combinaciones de vector/secuencia de control de la expresión/huésped
que expresen las secuencias de ADN reveladas en la presente memoria
en fermentación o en cultivo animal a gran escala.
En una realización específica, se puede expresar
una proteína de fusión OB-R. Una proteína de fusión
OB-R comprende al menos una porción funcionalmente
activa de una proteína no OB-R unida mediante un
enlace peptídico a al menos una porción funcionalmente activa de un
polipéptido OB. Las secuencias no OB-R pueden ser
amino- o carboxi-terminales con respecto a las
secuencias de OB-R. Por ejemplo, en la preparación
de receptores "artificiales", la unión del dominio codificante
que codifica OB-R para la porción
(extracitoplasmática) de unión a la leptina en la posición 5'
producirá una proteína que se unirá a la leptina y mediará alguna
otra acción basada en la actividad de las proteínas no
OB-R. Por el contrario, la unión de una proteína
diferente (tal como un factor de crecimiento, una citoquina, un
dominio codificante de unión a receptores hormonales) en 5' con
respecto al dominio codificante citoplasmático de
OB-R (que contiene la "Región 1" y la "Región
2") permitirá la activación a través de OB-R
tras unirse a un ligando distinto de la leptina. En otra
realización, un constructo quimérico puede facilitar simplemente la
expresión de OB-R. En una realización específica,
infra, el OB-Re y los fragmentos del mismo
se expresan con un péptido señal de melitina
N-terminal.
En otro aspecto, se puede usar el vector pGEX
[Smith et al., Gene 67:31-40 (1988)]. Este
vector fusiona el ADNc de la glutationa
S-transferasa de schistosoma japonicum con la
secuencia de interés. Se cultivan proteínas bacterianas y se pueden
purificar rápidamente proteínas recombinantes sobre una columna de
afinidad a la glutationa reducida. El vehículo de GST puede ser
posteriormente escindido de las proteínas de fusión mediante la
digestión con proteasas específicas del sitio. Tras la escisión, se
pueden retirar el vehículo y la proteína de fusión no escindida
mediante la absorción sobre agarosa de glutationa. Ocasionalmente,
surgen dificultades con el sistema cuando la proteína codificada es
insoluble en soluciones acuosas.
La expresión de las proteínas recombinantes en
sistemas bacterianos puede provocar un plegamiento incorrecto de la
proteína expresada, haciéndose necesario un nuevo plegamiento. La
proteína recombinante puede volver a ser plegada antes de o después
de la escisión para formar un polipéptido OB funcionalmente activo.
El polipéptido OB puede volverse a plegar mediante las etapas de
(i) incubar la proteína en un tampón desnaturalizante que contenga
un agente reductor y luego (ii) incubar la proteína en un tampón que
contenga un agente oxidante y que preferiblemente también contenga
un agente estabilizador de proteínas o un agente caotrópico, o
ambos. Las parejas de agentes rédox (reductores/oxidantes)
adecuadas incluyen, pero no se limitan a, glutationa
reducida/disulfuro de glutationa, cistina/cisteína,
cistamina/cisteamina y 2-mercaptoetanol/disulfuro
de 2-hidroxietilo. En un aspecto particular, se
puede disolver la proteína de fusión en un desnaturalizante, tal
como urea, antes de su intercambio en el tampón reductor. En una
realización preferida, la proteína también es purificada, p. ej.,
mediante intercambio iónico o cromatografía de quelación con Ni,
antes de su intercambio en el tampón reductor. Los agentes
desnaturalizantes incluyen, pero no se limitan a, urea y
guanidina-HCl. Luego se diluye la proteína
recombinante aproximadamente al menos 10 veces, más preferiblemente,
aproximadamente 100 veces, en un tampón oxidante que contiene un
agente oxidante, tal como, pero sin limitarse a,
Tris-HCl 0,1M, pH 8,0; EDTA 1Mm; Nasal 0,15M;
glutationa oxidada 0,3M. Entonces se incuba la proteína de fusión
durante aproximadamente 1 a aproximadamente 24 horas,
preferiblemente, durante aproximadamente 2 a aproximadamente 16
horas, a temperatura ambiente en el tampón oxidante. El tampón
oxidante puede comprender un agente estabilizador de proteínas, p.
ej., un azúcar, un alcohol o sulfato de amonio. El tampón oxidante
puede comprender además un agente caotrópico a baja concentración
para desestabilizar las interacciones intermoleculares incorrectas
y promover así un plegamiento apropiado. Los agentes caotrópicos
adecuados incluyen, pero no se limitan a, un detergente, un poliol,
L-arginina, guanidina-HCl y
polietilenglicol (PEG). Es importante usar una concentración lo
suficientemente baja de agente caotrópico como para evitar la
desnaturalización de la proteína. La proteína replegada puede estar
concentrada en al menos aproximadamente 10 veces, más
preferiblemente, en la cantidad que fue diluida en el tampón
oxidante.
Alternativamente, esta revelación contempla la
expresión periplasmática de una proteína según lo revelado en la
presente memoria.
Los procedimientos de fermentación bacteriana
también pueden dar como resultado una preparación de proteína
recombinante que contenga niveles inaceptables de endotoxinas. Por
lo tanto, esta revelación contempla la eliminación de tales
endotoxinas, p. ej., usando anticuerpos específicos de la endotoxina
u otras moléculas de unión a endotoxinas. La presencia de
endotoxinas se puede determinar mediante técnicas estándar, tales
como empleando reactivos E-TOXATE (Sigma, St. Louis,
Missouri) o con bioanálisis.
Además del ejemplo específico, los presentes
inventores contemplan el uso de sistemas de expresión de
baculovirus, de mamíferos y de levaduras para expresar la proteína
ob. Por ejemplo, en los sistemas de expresión de baculovirus, tanto
vectores de transferencia de no fusión tales como, pero sin
limitarse a, pVL941 (sitio de clonación de BamHI; Summers),
pVL1393 (sitio de clonación de BamHI, SmaI,
XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII
y PstI; Invitrogen), Pvl1392 (sitio de clonación de
BglII, PstI, NotI, XmaIII,
EcoRI, XbaI, SmaI y BamHI; Summers e
Invitrogen) y pBlueBacIII (sitio de clonación de
BamHI, BglII, PstI, NcoI y
HindIII, con el posible rastreo recombinante azul/blanco;
Invitrogen) y vectores de transferencia por fusión, tales como, pero
sin limitarse a, pAc700 (sitio de clonación de BamHI y
KpnI, donde comienza el sitio de reconocimiento de
BamHI con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc702
(el mismo que pAc700, con diferentes marcos de lectura), pAc360
(sitio de clonación de BamHI 36 pares de bases secuencia
abajo del codón de iniciación de la polihedrina; Invitrogen (195))
y pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura distintos, con el sitio
de clonación de BamHI, BglII, PstI,
NcoI y HindIII, un péptido N-terminal
para la purificación ProBond y el rastreo recombinante azul/blanco
de placas; Invitrogen (220)). En una realización específica,
infra, se emplea el vector de expresión de pMel Bac
(Invitrogen).
Los vectores de expresión de mamíferos
contemplados para su uso en esta revelación incluyen vectores con
promotores inducibles, tales como promotor de dihidrofolato
reductasa (DHFR), p. ej., cualquier vector de expresión con un
vector de expresión de DHFR o un vector de coamplificación de
DHFR/metotrexato, tal como pED (sitio de clonación de
PstI, SalI, SbaI, SmaI y EcoRI,
con el vector que expresa tanto el gen clonado como la DHFR
[véase Kaufman, "Current Protocols in Molecular Biology", 16.12
(1991)]). Alternativamente, un vector de
co-amplificación de glutamina sintetasa/sulfoximina
de metionina, tal como pEE14 (sitio de clonación de HindIII,
XbaI, SmaI, SbaI, EcoRI y BclI,
en el que el vector expresa glutamina sintasa y el gen clonado;
Celltech). En otra realización, se puede usar un vector que dirija
la expresión episomal bajo el control del virus de Epstein Barr
(VEB), tal como pREP4 (sitio de clonación de BamHI,
SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII,
NheI, PvuII y KpnI, promotor de
RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de
higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitio de clonación de
BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI,
HindIII, NheI, PvuII y KpnI, gen
temprano inmediato de hCMV constitutivo, marcador seleccionable de
higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitio de clonación de KpnI,
PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI,
SfiI, BamHI, promotor del gen IIa de metalotioneína
inducible, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pREP8
(sitio de clonación de BamHI, XhoI, NotI,
HindIII, NheI y KpnI, promotor de
RSV-LTR, marcador seleccionable de histidinol;
Invitrogen), pREP9 (sitio de clonación de KpnI, NheI,
HindIII, NotI, XhoI, SfiI y
BamHI, promotor de RSV-LTR, marcador
seleccionable de G418; Invitrogen) y pEBVHis (promotor de
RSV-LTR, marcador seleccionable de higromicina,
péptido N-terminal purificable mediante resina
ProBond y escindido por enteroquinasa; Invitrogen). Los vectores de
expresión de mamíferos seleccionables para su uso en esta
revelación incluyen pRc/CMV (sitio de clonación de HindIII,
BstXI, NotI, SbaI y ApaI, selección de
G418; Invitrogen), pRc/RSV (sitio de clonación de HindIII,
SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección de
G418; Invitrogen) y otros. Los vectores de expresión mamíferos del
virus Vaccinia [véase, Kaufman, 1991, supra)] para su
uso según esta revelación incluyen, pero no se limitan a pSC 11
(sitio de clonación de SmaI, selección de TK- y
\beta-gal), pMJ601 (sitio de clonación de
SalI, SmaI, AflI, NarI, BspMII,
BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI y
HindIII; selección de TK- y \beta-gal) y
pTKgptFlS (sitio de clonación de EcoRI, PstI,
SalI, AccI, HindII, SbaI, BamHI y
Hpa, selección de TK o XPRT).
Los sistemas de expresión de levaduras también
se pueden usar según esta revelación para expresar el polipéptido
OB. Se pueden emplear, por ejemplo, el vector pYES2 de no fusión
(sitio de clonación de XbaI, SphI, ShoI,
NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI,
SacI, KpnI y HindIII; Invitrogen) o el
pYESHisA, B, C de fusión (sitio de clonación de XbaI,
SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI,
BamHI, SacI, KpnI y HindIII, péptido
N-terminal purificado con resina ProBond y escindido
con enteroquinasa; Invitrogen), por sólo mencionar dos.
También se pretende que los polipéptidos y
análogos moduladores del peso corporal se puedan preparar a partir
de secuencias de nucleótidos derivadas dentro del ámbito de esta
revelación.
Además de la expresión recombinante del
polipéptido OB-R, la presente revelación prevé y
permite enteramente la preparación del polipéptido
OB-R, o fragmentos del mismo, usando técnicas
conocidas y muy desarrolladas de la síntesis de péptidos en fase
sólida. Esta revelación contempla el uso de ambos Boc y Fmoc
populares, así como de otras estrategias de grupos protectores,
para preparar el polipéptido ob o fragmentos del mismo. También se
conocen en la técnica diversas técnicas para replegar y oxidar las
cadenas laterales de cisteína para formar un enlace de tipo
disulfuro.
Según esta revelación, el polipéptido
OB-R producido recombinantemente o mediante síntesis
química, y los fragmentos u otros derivados o análogos del mismo,
incluyendo las proteínas de fusión, se pueden usar como inmunogén
para generar anticuerpos que reconozcan al polipéptido
OB-R. Tales anticuerpos incluyen pero no se limitan
a policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple,
fragmentos Fab y una genoteca de expresión Fab.
Una molécula es "antigénica" cuando es
capaz de interactuar específicamente con una molécula de
reconocimiento de antígenos del sistema inmune, tal como una
inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor antigénico de las
células T. Un polipéptido antigénico contiene al menos
aproximadamente 5 y preferiblemente al menos aproximadamente 10
aminoácidos. Una porción antigénica de una molécula puede ser esa
porción que es inmunodominante para el reconocimiento de
anticuerpos o receptores de células T, o puede ser una porción usada
para generar un anticuerpo frente a la molécula conjugando la
porción antigénica con una molécula vehículo para la inmunización.
Una molécula que sea antigénica no necesita ser por sí misma
inmunogénica, i.e., capaz de provocar una respuesta inmune sin un
vehículo.
Un "anticuerpo" es cualquier
inmunoglobulina, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos,
que se une a un epitope específico. El término engloba anticuerpos
policlonales, monoclonales y quiméricos, descritos éstos últimos
con mayor detalle en las patentes estadounidenses con n.º
4.816.397 y 4.816.567, así como porciones de unión a antígenos de
anticuerpos, incluyendo Fab, F(ab')_{2} y F(v)
(incluyendo anticuerpos de cadena simple). Por consiguiente, el
término "molécula de anticuerpo" en sus diversas formas
gramaticales como se usan en la presente memoria engloba tanto una
molécula de inmunoglobulina intacta como una porción
inmunológicamente activa de una molécula de inmunoglobulina que
contiene el sitio de combinación del anticuerpo. Un "sitio de
combinación del anticuerpo" es aquella porción estructural de una
molécula de anticuerpo compuesta por regiones variables e
hipervariables de cadena pesada y ligera que se une específicamente
a un antígeno.
Los ejemplos de moléculas de anticuerpo son
moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina
sustancialmente intactas y aquellas porciones de una molécula de
inmunoglobulina que contiene el paratope, incluyendo aquellas
porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v), cuyas porciones se prefieren
para su uso en los procedimientos terapéuticos descritos en la
presente memoria.
Las porciones Fab y F(ab')_{2} de las
moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción
proteolítica de la papaína y la pepsina, respectivamente, sobre
moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante
procedimientos que son conocidos. Véase, por ejemplo, la patente
estadounidense n.º 4.342.566 concedida a Theofilopolous et
al. Las porciones de moléculas de anticuerpo Fab' también son
conocidas y se producen a partir de porciones F(ab')_{2}
seguidas por la reducción de los enlaces de tipo disulfuro que unen
las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetanol y
seguida por la alquilación de la proteína de mercaptano resultante
con un reactivo tal como yodoacetamida. En la presente memoria, se
prefiere un anticuerpo que contenga moléculas de anticuerpo
intactas.
El término "anticuerpo monoclonal" en sus
diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que sólo
tiene una especie de sitio de combinación del anticuerpo capaz de
inmunorreaccionar con un determinado antígeno. De este modo, un
anticuerpo monoclonal muestra comúnmente una única afinidad de unión
por cualquier antígeno con el que inmunorreacione. Por lo tanto, un
anticuerpo monoclonal puede contener una molécula de anticuerpo que
tenga una pluralidad de sitios de combinación del anticuerpo, siendo
cada uno inmunoespecífico de un antígeno distinto; p. ej., un
anticuerpo monoclonal (quimérico) bioespecífico.
El término "adyuvante" se refiere a un
compuesto o a una mezcla que potencia la respuesta inmune frente a
un antígeno. Un adyuvante puede servir de depósito de tejidos que
libere lentamente el antígeno y también de activador del sistema
linfático que potencie inespecíficamente la respuesta inmune [Hood
et al., en Immunology, p. 384, Segunda edición.,
Benjamin/Cummings, Menlo Park, California (1984)]. Habitualmente,
un desafío primario con un antígeno solo en ausencia de un adyuvante
no provocará una respuesta inmune humoral ni celular. Los
adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund
completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, geles minerales
tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales
como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos,
emulsiones de aceite o hidrocarburos, hemocianinas de lapa
californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente
útiles, tales como BCG (bacille
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum. Preferiblemente, el adyuvante es farmacéuticamente
aceptable.
Se pueden usar diversos procedimientos conocidos
en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales frente
al polipéptido OB-R o fragmento o derivado o análogo
del mismo. Para la producción del anticuerpo, se pueden inmunizar
diversos animales huésped mediante la inyección del polipéptido
OB-R, o un derivado (p. ej., un fragmento o una
proteína de fusión) del mismo, incluyendo, pero no limitándose a,
conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una realización,
se puede conjugar el polipéptido OB-R o el fragmento
del mismo con un vehículo inmunogénico, p. ej., albúmina de suero
bovino (ASB) o hemocianina de lapa californiana (KLH). En el
ejemplo 2, infra, se revelan fragmentos antigénicos de
OB-R específicos (SEQ ID NO: 32, 33, 34). En otra
realización, se genera un anticuerpo frente a la porción
C-terminal de la forma OB-Re del
OB-R, p. ej., un polipéptido correspondiente a
aproximadamente los residuos de aminoácidos 420-641
de la SEQ ID NO:10. Se pueden usar diversos adyuvantes para
aumentar la respuesta inmunológica, en función de la especie del
huésped, incluyendo pero no limitándose a adyuvante de Freund
(completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de
aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles
plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleaginosas,
hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos
potencialmente útiles, tales como BCG (bacille
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos hacia el polipéptido OB-R, o un fragmento,
análogo o derivado del mismo, se puede usar cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante
líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen pero no se
limitan a la técnica del hibridoma desarrollada originariamente por
Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975),
así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células
B humanas [Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)] y la
técnica del hibridoma de virus VEB para producir anticuerpos
monoclonales humanos [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc.,
(1985)]. Se pueden crear líneas celulares productoras de
anticuerpos inmortales mediante técnicas distintas a la fusión tales
como mediante la transformación directa de linfocitos B con ADN
oncogénico o la transfectación con el virus de
Epstein-Barr [véase, p. ej.: M. Schreier et
al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et
al., "Monoclonal Antibodies and T-cell
Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal
Antibodies" (1980); véanse también las patentes estadounidenses
n.º 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570;
4.466.917; 4.472.500; 4.491.632 y 4.493.890].
En una realización adicional de esta revelación,
se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de
gérmenes [Publicación de patente internacional No. WO 89/12690,
publicada el 28 de diciembre de 1989]. Según esta revelación, se
pueden usar anticuerpos humanos y se pueden obtener usando
hibridomas humanos [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 80:2026-2030 (1983)] o transformando células
B humanas con virus VEB in vitro (Cole et al., 1985,
supra). De hecho, según esta revelación, se pueden usar
técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos
quiméricos" [Morrison et al., J. Bacteriol.,
159-870 (1984); Neuberger et al., Nature,
312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature,
314:452454 (1985)] cortando y empalmando los genes de una molécula
de anticuerpo de ratón específica de un polipéptido ob junto con
genes de una molécula de anticuerpo humana de una actividad
biológica apropiada; tales anticuerpos pertenecen al ámbito de esta
invención. Tales anticuerpos quiméricos humanos o humanizados son
preferibles para su uso en terapia de enfermedades y trastornos
humanos (descritos infra), pues los anticuerpos humanos o
humanizados tienen una probabilidad mucho menor que los anticuerpos
xenogénicos de inducir una respuesta inmune, en concreto, una
respuesta alérgica, por sí mismos.
Según esta revelación, se pueden adaptar
técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena
simple (patentes estadounidenses n.º 5.476.786 y 5.132.405
concedidas a Huston; Patente N.º: 4.946.778) para producir
anticuerpos de cadena simple específicos del polipéptido
OB-R. Otra realización más de esta revelación
utiliza técnicas descritas para la construcción de genotecas de
expresión de Fab [Huse et al., Science,
246:1275-1281 (1989)] para conseguir una
identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con
la especificidad deseada por un polipéptido ob, o sus derivados o
análogos.
Los fragmentos de anticuerpo que contienen el
idiotipo de la molécula de anticuerpo se pueden generar mediante
técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, pero no
se limitan a: el fragmento F(ab')_{2} que se puede
producir mediante la digestión con pepsina de la molécula de
anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden ser generados reduciendo
los puentes tipo disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los
fragmentos Fab que pueden ser generados tratando la molécula de
anticuerpo con papaína y un agente reductor.
En la producción de anticuerpos, se puede lograr
el rastreo del anticuerpo deseado mediante técnicas conocidas en la
técnica, p. ej., radioinmunoanálisis, ELISA (análisis de
inmunoabsorción ligado a una enzima), inmunoanálisis de
"sandwich", análisis inmunorradiométricos, reacciones de
precipitación por difusión sobre gel, análisis de inmunodifusión,
inmunoanálisis in situ (usando oro coloidal, etiquetas
enzimáticas o radioisotópicas, por ejemplo), transferencias
western, reacciones de precipitación, análisis de aglutinación (p.
ej., análisis de aglutinación sobre gel, análisis de
hemaglutinación), análisis de fijación de complementos, análisis de
inmunofluorescencia, análisis con proteína A y análisis de
inmunoelectroforesis, etc. En una realización, se detecta la unión
de los anticuerpos detectando una etiqueta sobre el anticuerpo
primario. En otra realización, se detecta el anticuerpo primario
detectando la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo frente
al anticuerpo primario. En otra realización más, se marca el
anticuerpo secundario. Son muchos los procedimientos conocidos en
la técnica para detectar la unión en un inmunoanálisis y pertenecen
al ámbito de la presente revelación. Por ejemplo, para seleccionar
anticuerpos que reconozcan un epitope específico de un polipéptido
OB, se pueden analizar hibridomas generados para un producto que se
una a un fragmento de polipéptido OB que contenga tal epitope. Para
la selección de un anticuerpo específico frente a un polipéptido OB
de una determinada especie animal, se puede realizar la selección
en base a la unión positiva con el polipéptido OB expresado por o
aislado de células de esa especie animal.
Se pueden usar los anticuerpos anteriores en
procedimientos conocidos en la técnica en relación con la
localización y la actividad del polipéptido OB-R,
p. ej., mediante transferencia western, la formación de imágenes del
polipéptido OB-R in situ, la medición de
niveles del mismo en muestras fisiológicas apropiadas, la detección
de la expresión del OB-R, etc.
En una realización específica, se pueden generar
anticuerpos que sean agonistas o antagonistas de la actividad del
polipéptido OB-R. Tales anticuerpos se pueden
analizar usando los análisis descritos infra para identificar
ligandos.
En un determinado aspecto, se desarrollan
anticuerpos inmunizando conejos con péptidos sintéticos predichos
mediante la secuencia proteica o con proteínas recombinantes
elaboradas usando vectores de expresión bacterianos. La selección
de los péptidos sintéticos se hace después de un profundo análisis
de la estructura proteica predicha, según lo descrito
anteriormente. En particular, se seleccionan la secuencias
peptídicas situadas entre los sitios de escisión putativos. Se
conjugan los péptidos sintéticos con un vehículo tal como
hemocianina KLH o ASB usando carbodiimida, y se usan en adyuvante
de Freund para inmunizar a los conejos. Para preparar la proteína
recombinante, se puede usar vector pGEX para expresar el polipéptido
[Smith et al., 1988, supra]. Alternativamente, se
pueden usar sólo dominios hidrófilos para generar la proteína de
fusión. La proteína expresada será preparada en grandes cantidades
y se usará para inmunizar a los conejos en adyuvante de Freund.
En una realización específica, infra, se
pueden generar péptidos correspondientes a los residuos de
aminoácidos 145-158, 465-484,
863-881 y 420-641 (del polipéptido
OB-R murino representado en una cualquiera de las
SEQ ID NO: 8 y 10) mediante la síntesis o la expresión de péptidos
en fase sólida, opcionalmente conjugados con un vehículo tal como
KLH, y se pueden usar para inmunizar conejos, ratas, cabras, pollos,
etc.
En otra realización específica, se usa
polipéptido OB-R recombinante para inmunizar pollos,
y se recuperan los anticuerpos frente al OB-R de
los pollos de la yema de huevo, p. ej., mediante la purificación por
afinidad sobre una columna de OB-R.
Preferiblemente, los pollos usados para la inmunización se mantienen
en condiciones libres de patógenos específicos (SPF).
En otra realización más, se usa polipéptido
OB-R recombinante para inmunizar conejos y se
vuelven a inmunopurificar los anticuerpos policlonales antes de
seguir usándolos. Los anticuerpos purificados son particularmente
útiles para análisis semi-cuantitativos,
particularmente, para detectar la presencia de forma(s) de
empalme (solubles) en circulación del polipéptido
OB-R en suero o en plasma.
Se pueden rastrear paneles de anticuerpos
monoclonales producidos frente a péptidos moduladores en cuanto a
diversas propiedades; i. e., isotipo, epitope, afinidad, etc. Son de
particular interés los anticuerpos monoclonales que neutralizan la
actividad de los péptidos moduladores. Tales monoclonales pueden ser
fácilmente identificados en los análisis de la actividad destinados
a los moduladores del peso. Los anticuerpos de alta afinidad
también son útiles cuando se desea la purificación por
inmunoafinidad del polipéptido nativo o recombinante.
Preferiblemente el anticuerpo frente al
modulador usado en los procedimientos de diagnóstico y terapéuticos
revelados en la presente memoria es un anticuerpo policlonal
purificado por afinidad. Más preferiblemente, el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal (Acm). Además, es preferible para las
moléculas de anticuerpo frente al modulador usadas en la presente
memoria que estén en forma de porciones Fab, Fab',
F(ab')_{2} o F(v) de las moléculas de anticuerpo
completas.
La presente revelación se refiere además a una
variedad de aplicaciones diagnósticas, incluyendo procedimientos
para detectar la presencia de condiciones y/o estímulos que afecten
a las anomalías del peso corporal o de la adiposidad, en referencia
a su capacidad para provocar las actividades que son mediadas por
los presentes polipéptidos OB-R. Según lo mencionado
anteriormente, se pueden usar los péptidos para producir
anticuerpos frente a ellos mismos mediante una variedad de técnicas
conocidas, y luego esos anticuerpos podrían ser aislados y
utilizados tal como en análisis de la presencia de la actividad
transcripcional particular en células diana sospechosas.
Alternativamente, se pueden emplear los ácidos nucleicos revelados
en la presente memoria en diagnosis.
Según lo sugerido anteriormente, un
procedimiento de diagnóstico útil en la presente revelación
comprende examinar una muestra o un medio celular por medio de un
análisis que incluya una cantidad eficaz de una pareja de unión del
OB-R, tal como un anticuerpo frente a moduladores o
la leptina, preferiblemente, un anticuerpo policlonal purificado
por afinidad y, más preferiblemente, un Acm. Además, es preferible
para las moléculas de anticuerpo usadas en la presente memoria que
estén en forma de porciones Fab, Fab', F(ab')_{2} o
F(v), o moléculas de anticuerpo enteras. Según lo tratado
anteriormente, los pacientes capaces de beneficiarse de este
procedimiento incluyen aquéllos que padecen cáncer.
El SIDA, la obesidad u otras condiciones en las
que un peso corporal anormal es un elemento de la condición.
Además, los anticuerpos, incluyendo tanto
anticuerpos policlonales como monoclonales, pueden poseer ciertas
aplicaciones diagnósticas y, por ejemplo, pueden ser utilizados a
efectos de detectar y/o medir condiciones en las que las anomalías
del peso corporal son o pueden ser propensas a desarrollarse.
Los procedimientos de diagnóstico pueden usarse
para detectar OB-R en una muestra biológica de un
individuo. La muestra biológica puede ser fluido biológico, tal
como, pero sin limitarse a, sangre, suero, plasma, fluido
intersticial, efusiones plurales, orina, fluido cerebroespinal y
similares. Preferiblemente, el OB-R soluble se
detecta en suero y orina, siendo ambos fácilmente obtenidos.
Alternativamente, se puede detectar OB-R de fuentes
celulares, tales como, pero sin limitarse a, biopsias de tejido
cerebral, adipocitos, testículos, corazón y similares. Por ejemplo,
se pueden obtener células de un individuo mediante biopsia y
lisarlas, p. ej., mediante ciclos de
congelación-descongelación, o el tratamiento con un
detergente citolítico suave tal como, pero sin limitarse a,
polioxietilenéster TRITON X-100®, digitonina,
IGEPAL/NONIDETP (NP)-40®
(octilfenoxi)-polietoxietanol, saponina y
similares, o combinaciones de los mismos (véase, p. ej., la
publicación de patente internacional WO 92/08981, publicada el 29
de mayo, 1992). En otra realización más, se pueden usar muestras que
contengan tanto células como fluidos corporales (véase
ibid.).
ibid.).
Se puede determinar la presencia de
OB-R en células o en fluido biológico mediante los
procedimientos inmunológicos habituales aplicables a tales
determinaciones. Se conoce un número de procedimientos útiles. Tres
de tales procedimientos que son especialmente útiles utilizan bien
el OB-R (particularmente la forma de empalme
secretada) marcado con una etiqueta detectable, anticuerpo Ac_{1}
marcado con una etiqueta detectable o un anticuerpo Ac_{2}
marcado con una etiqueta detectable.
Los procedimientos y su aplicación son todos
familiares para aquéllos expertos en la técnica y, por consiguiente,
pueden ser utilizados dentro del ámbito de la presente revelación.
Por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.º 3.654.090 y
3.850.752, se describe un procedimiento "competitivo". En las
patentes estadounidenses n.º RE 31.006 y 4.016.043, se describe un
procedimiento de "sandwich". Se conocen otros procedimientos
más tales como el procedimiento "de doble anticuerpo" o
"DASP".
Las etiquetas empleadas más comúnmente para
estos estudios son elementos radiactivos, enzimas, compuestos
químicos que producen fluorescencias cuando se exponen a la luz
ultravioleta y otros.
Se conoce un número de materiales fluorescentes
y se pueden utilizar como etiquetas. Estos incluyen, por ejemplo,
fluoresceína, rodamina y auramina. Un material de detección concreto
es un anticuerpo frente a conejos preparado en cabras y conjugado
con fluoresceína a través de un isotiocianato.
La etiqueta radiactiva puede detectarse mediante
cualquier procedimiento de recuento disponible actualmente. El
isótopo preferido puede seleccionarse de ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{59}Fe,
^{90}Y, ^{99}Tc, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.
Las etiquetas enzimáticas son asimismo útiles, y
pueden ser detectadas por cualquier técnica colorimétrica,
espectrofotométrica, fluoroespectrofotométrica, amperométrica o
gasométrica utilizada actualmente. La enzima se conjuga mediante la
reacción con moléculas puente tales como carbodiimidas,
diisocianatos, glutaraldehído y similares. Muchas enzimas que
pueden ser usadas en estos procedimientos son conocidas y pueden
utilizarse. La preferida es la peroxidasa,
\beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa-oxidasa más peroxidasa y la fosfatasa
alcalina. Se prefieren las patentes estadounidenses n.º 3.654.090;
3.850.752; y 4.016.043 a modo de ejemplo para esta revelación de
material y procedimientos de marcaje alternativos.
En otra realización de esta revelación, se
pueden preparar equipos de análisis adecuados para su uso por un
especialista médico para determinar la presencia o la ausencia de
OB-R en células diana o fluidos biológicos
sospechosos. Según las técnicas de análisis tratadas anteriormente,
una clase de tales equipos contendrá al menos un polipéptido
OB-R marcado o su pareja de unión, por ejemplo, un
anticuerpo específico frente al mismo, e instrucciones, por
supuesto, en función del procedimiento seleccionado, p. ej.,:
"competitivo", "sandwich", "DASP" y similares. Los
equipos también pueden contener reactivos periféricos tales como
tampones, estabilizadores, etc.
Según lo demostrado en los ejemplo,
infra, se pueden usar los ácidos nucleicos según lo revelado
en la presente memoria para detectar defectos asociados con
defectos del polipéptido OB-R asociado con un
fenotipo de la obesidad. Por ejemplo, se pueden usar sondas de
ácido nucleico (p. ej., en análisis northern o análisis de
RT-PCR) para determinar si un fenotipo de la
obesidad está asociado con la falta de expresión del ARNm de
OB-R o la expresión del ARNm de OB-R
no funcional, p. ej., como en ratones db/db (en los que la
deficiencia resulta de la falta de un receptor de la leptina
eficaz), o donde una mutación produce un ARNm no transcrito.
Además, las técnicas de diagnóstico basadas en ácidos nucleicos
reveladas en la presente memoria se pueden usar en combinación con
técnicas basadas en anticuerpos para desarrollar con mayor
profundidad la comprensión molecular de los fenotipos de la
obesidad y la anorexia.
Se pueden secuenciar clones de ADNc humano. Esto
facilita la determinación de la secuencia completa del gen humano.
De este modo se pueden obtener secuencias de ADN de los intrones del
gen OB-R humano y usarlas para preparar cebadores de
PCR para amplificar por PCR la secuencia codificante del gen
OB-R procedente de ADN genómico humano con el fin de
identificar mutaciones o variantes alélicas del gen
OB-R, todo ello conforme a los protocolos descritos
detalladamente con anterioridad en la presente memoria.
La hipótesis actual es que las mutaciones
heterocigóticas del gen DB estarán asociadas con una obesidad
suave/moderada, mientras que las mutaciones homocigóticas estarían
asociadas con una obesidad grave. Esto permitiría determinar las
personas en riesgo de desarrollar obesidad y haría posible la
aplicación de un tratamiento farmacológico y/o cambios en el estilo
de vida antes de que el aumento del peso corporal se desarrollara
completamente.
Alternativamente, se puede usar la presencia de
microsatélites que se segregan con formas mutantes del
ob-r humano para diagnosis. A este respecto se pueden
usar diversos cebadores de PCR.
El gen OB-R también puede ser útil
diagnósticamente para medidas de su ARN y proteína codificados en
trastornos nutricionales. Será de importancia saber, en un
determinado trastorno nutricional, si el ARN de OB-R
y/o su proteína codificada son regulados secuencia arriba o
regulados secuencia abajo. De este modo, si una persona obesa tiene
aumentos de los niveles del OB-R, parecería que el
problema es secuencia abajo de OB-R, mientras que
si se reduce la expresión de OB-R, parecería que los
niveles inadecuadamente bajos de OB-R pueden ser la
causa de la obesidad (estando o no el defecto en el gen
OB-R). Por el contrario, si un paciente con cáncer o
SIDA que perdió peso tuviera niveles elevados de
OB-R, puede concluirse que una expresión
inadecuadamente alta de OB-R es la responsable de la
pérdida de peso.
La presente revelación no sólo se refiere a los
niveles inapropiados de expresión del OB-R, sino
además a la expresión de formas de empalme no funcionales o
disfuncionales. El diagnóstico con ácidos nucleicos revelado en la
presente memoria proporciona la determinación de si la forma
predominantemente expresada es disfuncional, p. ej., para la
transducción de señales. Según lo demostrado en los ejemplos,
infra, los ratones mutantes db (db/db
C57BL/Ks) expresan un ARNm de OB-R más largo (según
lo determinado por RT-PCR).
Los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos
revelados en la presente memoria tienen un significativo potencial
terapéutico. Preferiblemente, se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de tal agente (p. ej., forma soluble de la
proteína o ADN para terapia génica, o un ácido nucleico antisentido
para antagonizar la actividad de la leptina) en un vehículo,
diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El término "farmacéuticamente aceptable" se
refiere a entidades moleculares y composiciones que son
fisiológicamente tolerables y que comúnmente no producen una
reacción alérgica o similarmente perjudicial, tal como un trastorno
gástrico, un mareo y similares, cuando se administran a un ser
humano. En una realización, como se usa en la presente memoria, el
término "farmacéuticamente aceptable" puede significar
aprobado por un organismo regulador del gobierno federal o de un
gobierno estatal estadounidense, o enumerado en la Farmacopea
estadounidense u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso
en animales y, más concretamente, en seres humanos. El término
"vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o
vehículo con el que se administra el compuesto. Tales vehículos
farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y
aceites, incluyendo aquéllos de petróleo, de origen animal, vegetal
o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite
mineral, aceite de sésamo y similares. El agua o las soluciones
salinas, así como las soluciones acuosas de glicerol y dextrosa son
preferiblemente empleadas como vehículos, particularmente, para
soluciones inyectables. En Martin, "Remington's Pharmaceutical
Sciences", XVIII Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), se
describen vehículos farmacéuticos adecuados.
El término "cantidad terapéuticamente
eficaz" se usa en la presente memoria para referirse a una
cantidad suficiente para reducir en al menos aproximadamente el 15%,
preferiblemente, en el menos el 50%, más preferiblemente, en al
menos el 90% y, lo más preferible, para prevenir un déficit
clínicamente significativo en la actividad, la función y la
respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad
terapéuticamente eficaz es suficiente para provocar una mejoría de
la condición clínicamente significativa en el huésped. La modulación
de la actividad del OB-R puede ser útil para
reducir el peso corporal (aumentando su actividad) o aumentar el
peso corporal (disminuyendo su actividad).
Se espera que la administración de polipéptido
OB-R soluble recombinante correspondiente a
OB-Re resulte en la pérdida de peso, en concreto,
en una disminución del tejido graso. El polipéptido
OB-Re de tipo soluble se puede preparar usando
vectores de expresión bacterianos y/o mamíferos estándar,
sintéticamente, o purificados a partir de plasma o suero, todos
ellos según lo expuesto detalladamente anteriormente en la presente
memoria. Alternativamente, se puede inducir el aumento de la
expresión de polipéptido OB-R soluble nativo
mediante técnicas de recombinación de homólogos según lo descrito
supra.
La reducción de la actividad de la leptina
(mediante el desarrollo de antagonistas, inhibidores, el uso de
anticuerpos neutralizantes o moléculas antisentido) debería resultar
en un aumento de peso como podría ser deseable para el tratamiento
de pérdida de peso asociado con el cáncer, el SIDA o la anorexia
nerviosa. En una realización, se puede emplear una forma de unión a
la leptina del OB-R soluble que carezca de las
porciones necesarias para la transducción o el aumento de
señales.
En el tratamiento más simple, el gen
OB-R está íntimamente relacionado con la determinación
del peso corporal en animales, en concreto, en ratones, ratas,
perros y el hombre. El producto génico OB-R y,
correspondientemente, las moléculas relacionadas, parecen ser parte
de una ruta de señalización mediante la cual el tejido adiposo se
comunica con el cerebro y otros órganos. Se cree que al menos una
forma de empalme del polipéptido OB-R (p. ej.,
OB-Rb) es ella misma una molécula de señalización,
i.e., un receptor para la hormona leptina.
El polipéptido OB-R soluble, o
un fragmento funcionalmente activo del mismo, o un antagonista del
mismo, se puede administrar oral o parenteralmente,
preferiblemente, parenteralmente. Debido a que la homeostasis
metabólica es un proceso continuo, se prefiere una administración
de liberación controlada del polipéptido OB-R
soluble (OB-Re). Por ejemplo, se puede administrar
el polipéptido usando una infusión intravenosa, una bomba osmótica
implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros modos de
administración. En una realización, se puede usar una bomba [Langer
et al., eds., "Medical Applications of Controlled
Release", CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Sefton, CRC
Crit. Ref. Biomed. Eng., 14:201 (1987); Buchwald et
al., "Surgery", 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl.
J. Med., 321:574 (1989)]. En otra realización, se pueden usar
materiales poliméricos [Langer, 1974, supra; Sefton, 1987,
supra; Smolen et al., eds., "Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design and Performance", Wiley,
Nueva York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev.
Macromol. Chem., 23:61 (1983); véase también Levy et al.,
Science, 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol.,
25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71:105 (1989)].
En otra realización más, se puede reemplazar un sistema de
liberación controlada cerca de la diana terapéutica, i.e., el
cerebro, requiriéndose así únicamente una fracción de la dosis
sistémica [véase, p. ej.: Goodson, en "Medical Applications of
Controlled Release", vol. 2, pp. 115-138 (1984)].
En la revisión de Langer, Science,
249:1527-1533 (1990), se tratan otros sistemas de
liberación controlada. En otra realización, el compuesto
terapéutico se puede administrar en una vesícula, en concreto en un
liposoma [véase Langer, 1990 supra; Treat et al., en
"Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer",
Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York,
pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein,
ibid., pp. 317-327; véase ibid. en
general].
En otro aspecto, se pueden transplantar células
recombinantes que han sido transformadas con la forma de empalme
soluble del ADNc de OB-R (p. ej.,
OB-Re, que se usará en la presente memoria para
referirse a un agonista del OB-R soluble de la
leptina) y que expresan niveles elevados del polipéptido en un
sujeto en necesidad de un aumento de la actividad de la leptina.
Preferiblemente, se transplantan células autólogas transformadas
con OB-Re para evitar el rechazo; alternativamente,
hay tecnología disponible para proteger células no autólogas que
producen factores solubles dentro de una matriz polimérica que evita
el reconocimiento inmune y el rechazo.
El polipéptido OB-Re se puede
administrar por vía de administración intravenosa,
intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular o
subcutánea. Alternativamente, el polipéptido OB-Re,
formulado adecuadamente, se puede administrar mediante
administración nasal u oral. Se puede garantizar un suministro
constante de OB-Re proporcionando una dosis
terapéuticamente eficaz (i.e., una dosis eficaz para inducir cambios
metabólicos en un sujeto) a intervalos necesarios, p. ej.,
diariamente, cada 12 horas, etc. Estos parámetros dependerán de la
gravedad de la condición patológica que esté siendo tratada, de
otras acciones, tales como la modificación de la dieta que hayan
sido puestas en marcha, del peso, de la edad y del sexo del sujeto,
y de otros criterios que pueden ser determinados fácilmente según
buenas prácticas médicas estándar por aquéllos expertos en la
técnica.
Cualquier experto en la técnica puede apreciar
fácilmente que también se puede administrar cualquier polipéptido
OB-R soluble, p. ej., antagonista de la leptina,
según lo descrito anteriormente para el OB-Re.
En otro aspecto más de la presente revelación,
se proporcionan composiciones farmacéuticas de lo anterior. Tales
composiciones farmacéuticas pueden ser para una administración por
inyección o para una administración oral, pulmonar, nasal o de
otras formas. En general, esta revelación abarca composiciones
farmacéuticas que comprenden cantidades eficaces de proteína o
productos derivados junto con diluyentes, conservantes,
solubilizadores, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos
farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen
diluyentes de diversos contenido de tampón (p. ej.,
Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica;
aditivos tales como detergentes y agentes solubilizadores (p. ej.,
Tween 80, Polisorbato 80), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico,
metabisulfito de sodio), conservantes (p. ej., Timerosal, alcohol
bencílico) y sustancias de carga (p. ej., lactosa, manitol); la
incorporación del material en preparaciones particuladas de
compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido
poliglicólico, etc., o en liposomas. También se puede usar ácido
hialurónico u otros polímeros aniónicos. Tales composiciones pueden
influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de
liberación in vivo, y la velocidad de aclaración in
vivo de las presentes proteínas y derivados [véase, p. ej.:
Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", XVIII Ed. (1990,
Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pág.:
1435-1712]. Las composiciones se pueden preparar en
forma líquida, o pueden estar en polvo seco tal como en una forma
liofilizada.
Para su uso en la presente memoria, se
contemplan formas de dosificación sólidas orales que se describen en
general en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences",
XVIII Ed. (1990 Mack Publishing Co. Easton PA 18042), en el
capítulo 89. Las formas de dosificación sólidas incluyen
comprimidos, cápsulas, píldoras, trociscos o pastillas, sellos o
pellas. También se puede usar una encapsulación liposomal o
proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por
ejemplo, microesferas proteinoides [Patente estadounidense n.º
4.925.673]). Se puede usar la encapsulación liposomal, y los
liposomas se pueden derivar con diversos polímeros [p. ej., la
patente estadounidense n.º 5.013.556]. Marshall, en "Modern
Pharmaceutics", Capítulo 10, Banker y Rhodes ed., (1979)],
ofrece una descripción de las posibles formas de dosificación
sólidas para el uso terapéutico. La formulación incluirá la
proteína (o la proteína modificada químicamente) e ingredientes
inertes que permitan la protección frente al medio estomacal y la
liberación de material biológicamente activo en el intestino.
También se contemplan específicamente formas de
dosificación orales de las proteínas derivadas anteriormente. La
proteína puede estar modificada químicamente de manera que la
administración oral del derivado sea eficaz. En general, la
modificación química que se contempla es la unión de al menos un
resto a la molécula de proteína (o al péptido), permitiendo dicho
resto (a) la inhibición de la proteolisis; y (b) la absorción en la
corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. También se
desea el aumento de la estabilidad global de la proteína y el
aumento del tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de
tales restos incluyen: polietilenglicol, copolímeros de
etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano,
alcohol polivinílico, pirrolidona polivinílica y poliprolina
[Abuchowski et al., 1981, supra; Newmark et al., J.
Appl. Biochem., 4:185-189 (1982)]. Otros
polímeros que se podrían usar son
poli-1,3-dioxolano y
poli-1,3,6-trioxocano. Se prefieren
para un uso farmacéutico, según lo indicado anteriormente, los
restos de polietilenglicol.
Para la proteína (o derivado), la localización
de la liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el
duodeno, yeyuno, íleon) o el intestino grueso. Cualquier experto en
la técnica tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en
el estómago, aunque liberarán el material en el duodeno o cualquier
otro sitio del intestino. Preferiblemente, la liberación evitará
los efectos perjudiciales del medio estomacal, bien mediante la
protección de la proteína (o derivado) o mediante la liberación del
material biológicamente activo más allá del medio estomacal, tal
como en el intestino.
Para garantizar una resistencia gástrica
completa, resulta esencial una cubierta impermeable a un pH de al
menos 5,0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que
son usados como cubiertas entéricas son el
acetato-trimelitato de celulosa (CAT), ftalato de
hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de
acetato polivinílico (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric,
acetato-ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L,
Eudragit S y Shellac. Estas cubiertas se pueden usar como películas
mixtas.
También se puede usar una cubierta o una mezcla
de cubiertas sobre comprimidos, no estando destinadas a la
protección frente al estómago. Éstas pueden incluir cubiertas de
azúcar o cubiertas que faciliten que el comprimido se pueda tragar.
Las cápsulas pueden constar de una cubierta dura (tal como gelatina)
para la administración del compuesto terapéutico seco, p. ej.,
polvo; para formas líquidas, se puede usar una cubierta de gelatina
blanda. El material de revestimiento de los sellos podría ser
almidón denso u otro papel comestible. Para las píldoras, las
pastillas, los comprimidos moldeados o los triturados de comprimido,
se pueden usar técnicas de concentración en húmedo.
El compuesto terapéutico se puede incluir en la
formulación como multiparticulados finos en forma de gránulos o
pellas de un tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La
formulación del material para una administración en cápsulas podría
también ser en polvo, tapones comprimidos ligeramente o incluso
comprimidos. El compuesto terapéutico se podría preparar mediante
compresión.
También se pueden incluir colorantes y agentes
aromatizantes. Por ejemplo, se puede formular la proteína (o
derivado) (tal como mediante encapsulación liposomal o de
microesferas) y luego introducirla además con un producto
comestible, tal como una bebida refrigerada, que contenga colorantes
y agentes aromatizantes. Se puede diluir o aumentar el volumen
del compuesto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes
podrían incluir carbohidratos, especialmente, manitol,
\alpha-lactosa, lactosa anhidra, celulosa,
sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden usar
ciertas sales inorgánicas como cargas que incluyan trifosfato de
calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes
comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex,
STA-Rx 1500, Emcompress y
Avicell.
Avicell.
Se pueden incluir desintegrantes en la
formulación del compuesto terapéutico en una forma de dosificación
sólida. Los materiales usados como desintegrantes incluyen pero no
se limitan a almidón que incluye el desintegrante comercial basado
en almidón, Explotab. Se pueden usar glicolato de almidón de sodio,
amberlita, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina,
alginato de sodio, gelatina, piel de naranja, carboximetilcelulosa
ácida, esponja natural y bentonita. Otras formas de desintegrantes
son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Se pueden usar
gomas en polvo como desintegrantes y como aglutinantes, y éstas
incluyen gomas en polvo tales como agar, Karaya o tragacant. El
ácido algínico y su sal de sodio también son útiles como
desintegrantes.
Se pueden usar aglutinantes para mantener junto
el agente terapéutico y formar un comprimido duro, e incluyen
materiales de productos naturales tales como acacia, tragacant,
almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa
(EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Se podrían usar tanto la
pirrolidona polivinílica (PVP) como la hidroxipropilmetilcelulosa
(HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el compuesto
terapéutico.
Se puede incluir un agente antifricción en la
formulación del compuesto terapéutico para evitar el pegado durante
el procedimiento de formulación. Se pueden usar lubricantes como
capa entre el agente terapéutico y la pared de colorante, y éstos
incluyen pero no se limitan a: ácido esteárico incluyendo sus sales
de magnesio y de calcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina
líquida, aceites vegetales y ceras. También se pueden usar
lubricantes solubles tales como laurilsulfato de sodio,
laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos
moleculares, y Carbowax 4000 y 6000.
Se podrían añadir deslizantes que podrían
mejorar las propiedades de flujo del fármaco durante su formulación
y ayudar a la redisposición durante la compresión. Los deslizantes
pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénico y silicoaluminato
hidratado.
Para ayudar a la disolución del compuesto
terapéutico en el medio acuoso, se podría añadir un tensioactivo
como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes
aniónicos tales como laurilsulfato de sodio,
dioctil-sulfosuccinato de sodio y
dioctil-sulfonato de sodio. Se podrían usar
detergentes catiónicos, y podrían incluir cloruro de benzalconio o
cloruro de bencetomio. Una lista de posibles detergentes no iónicos
que se podrían incluir en la formulación como tensioactivos son
lauromacrogol 400, polioxil 40 estearato, aceite de ricino
hidrogenado de polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de
glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de ácidos grasos de
sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensioactivos
podrían estar presentes en la formulación de la proteína o el
derivado bien solos o como una mezcla en diferentes
proporciones.
Los aditivos que pueden aumentar la absorción de
la proteína (o del derivado) son, por ejemplo, los ácidos grasos
tales como ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
Se puede desear una formulación de liberación
controlada. Se podría incorporar el fármaco en una matriz inerte
que permitiera la liberación bien mediante difusión o mediante
mecanismos de lixiviación, p. ej.: gomas de mascar. También se
pueden incorporar matrices de degeneración lenta en la formulación.
Otra forma de liberación controlada de este compuesto terapéutico
es mediante un procedimiento basado en el sistema terapéutico Oros
(Alza Corp.), i.e., el fármaco está introducido en una membrana
semipermeable que permite el paso del agua y saca el fármaco a
través de una única pequeña abertura debido a efectos osmóticos.
Algunas cubiertas entéricas también tienen un efecto de liberación
controlado.
Se pueden usar otras cubiertas para la
formulación. Éstas incluyen una variedad de azúcares que podrían ser
aplicados en una cuba de alimentación. El agente terapéutico
también podría ser administrado en un comprimido revestido por una
película; los materiales usados en este ejemplo se dividen en dos
grupos. El primero es el de los materiales no entéricos e incluye
metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa,
metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa,
hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, providona
y los polietilenglicoles. El segundo grupo consta de materiales
entéricos que son comúnmente ésteres de ácido ftálico.
Se podría usar una mezcla de materiales para
proporcionar un revestimiento óptimo mediante la película. El
revestimiento mediante la película se puede llevar a cabo en una
cuba de alimentación o en un lecho fluidizado o mediante un
revestimiento por compresión.
También se contempla en la presente memoria la
administración pulmonar de la presente proteína soluble (o
derivados de la misma). La proteína (o el derivado) se administra a
los pulmones de un mamífero mientras mediante inhalación y
atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hacia el torrente
sanguíneo. Otros informes de esto incluyen Adjei et al.,
Pharmaceutical Research, 7(6):565-569
(1990); Adjei et al., International Journal of
Pharmaceutics, 63:135-144 (1990) (acetato de
leuprolida); Braquet et al., Journal of Cardiovascular
Pharmacology, 13 (supl. 5): 143-146 (1989)
(endotelina-1); Hubbard et al., Annals of
Internal Medicine, 3(3):206-212 (1989)
(\alpha1-antitripsina); Smith et al., J. Clin.
invest., 84:1145-1146 (1989)
(\alpha1-proteinasa); Oswein et al.,
"Aerosolization of Proteins", Actas del Simposio sobre
Administración Respiratoria de Fármacos II, Keystone, Colorado,
(Marzo 1990) (hormona de crecimiento humano recombinante); Debs
et al., J. Immunol., 140:3482-3488 (1988) y
Platz et al., Patente estadounidense n.º 5.284.656 (factor
estimulante de colonias de granulocitos). Contemplado para su uso
en la práctica de esta revelación está un amplio intervalo de
dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de
productos terapéuticos, incluyendo pero no limitándose a
nebulizadores, inhaladores dosificadores e inhaladores de polvo,
siendo todos ellos familiares para los expertos en la técnica.
Algunos ejemplos específicos de dispositivos
comercialmente disponibles adecuados para la práctica de esta
revelación son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt,
Inc.,St. Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por
Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador
dosificador Ventolín, fabricado por Glaxo Inc., Research Triangle
Park, Carolina del Norte; y el inhalador de polvo Spinhaler,
fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Todos estos dispositivos requieren el uso de
formulaciones adecuadas para expender la proteína (o el derivado).
Comúnmente, cada formulación es específica del tipo de dispositivo
empleado y puede suponer el uso de un material propelente
apropiado, además de los diluyentes, adyuvantes y/o vehículos
habituales útiles en terapia. Además se contempla el uso de
liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u
otros tipos de vehículos. También se puede preparar la proteína
modificada químicamente en diferentes formulaciones en función del
tipo de modificación química o del tipo de dispositivo
empleado.
Las formulaciones adecuadas para su uso con un
nebulizador, bien de chorro o ultrasónico, comprenderán por lo
común proteína (o derivado) disuelta en agua a una concentración de
aproximadamente 0,1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por
ml de solución. La formulación también puede incluir un tampón y un
azúcar simple (p. ej., para la estabilización de la proteína y la
regulación de la presión osmótica). La formulación del nebulizador
también puede contener un tensioactivo para reducir o evitar la
agregación inducida superficialmente de la proteína causada por la
atomización de la solución al formarse el aerosol.
Las formulaciones para su uso con un dispositivo
de inhalador dosificador comprenderán generalmente un polvo
finamente dividido que contiene la proteína (o derivado) suspendido
en un propelente con la ayuda de un tensioactivo. El propelente
puede ser cualquier material convencional empleado con este
propósito, tal como un clorofluorocarbono, un
hidroclorofluorocarbono, un hidrofluorocarbono o un hidrocarburo,
incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano,
o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen
trioleato de sorbitán y lecitina de soja. El ácido oleico también
puede ser útil como tensio-
activo.
activo.
Las formulaciones para ser administradas desde
un dispositivo de inhalador de polvo comprenderán un polvo seco
finamente dividido que contenga proteína (o derivado), pudiendo
incluir además un agente de carga tal como lactosa, sorbitol,
sacarosa o manitol en cantidades que faciliten la dispersión del
polvo desde el dispositivo, p. ej., del 50 al 90% en peso de la
formulación. La proteína (o el derivado) debería ser más
ventajosamente preparado en forma particulada con un tamaño de
particular medio de menos de 10 \mum (o micrómetros), más
preferiblemente, de 0,5 a 5 \mum, para la administración más
eficaz hacia el pulmón distal.
También se contempla la administración nasal de
la proteína (o del derivado). La administración nasal permite el
paso de la proteína directamente hacia el torrente sanguíneo tras la
administración del producto terapéutico por la nariz, sin la
necesidad de la deposición del producto en el pulmón. Las
formulaciones para una administración nasal incluyen aquéllas con
dextrano o ciclodextrano.
En otro aspecto más de la presente revelación,
se proporcionan procedimientos de tratamiento y de fabricación de
un medicamento. Las condiciones aliviadas o moduladas por la
administración de los presentes derivados son aquéllas indicadas
anteriormente.
Para todas las moléculas anteriores, a medida
que se vayan realizando más estudios irá surgiendo información
relativa a los niveles de dosificación apropiados para el
tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes, y el
trabajador habitual en la técnica, considerando el contexto
terapéutico, la edad y el estado general del receptor, podrá
determinar la dosis apropiada. En general, para inyección o
infusión, la dosis estará entre 0,01 \mug de proteína
biológicamente activa/kg de peso corporal (calculando la masa de
proteína sola, sin modificación química) y 10 mg/kg (basándose en
lo mismo). El régimen posológico puede variar en función de la vida
media en circulación de la proteína o del derivado usado, de si el
polipéptido es administrado por dosis en bolos o infusión continua,
y de la formulación usada.
Para una terapia asociada con la obesidad, se
puede administrar la presente proteína soluble (o los derivados) en
combinación con una o más composiciones farmacéuticas usadas para
tratar otras complicaciones clínicas de la obesidad, tales como
aquéllas usadas para el tratamiento de la diabetes (p. ej., la
insulina), la presión sanguínea elevada, el colesterol elevado y
otras condiciones adversas producidas por la obesidad. Además, se
pueden co-administrar otros supresores del apetito,
p. ej., anfetaminas. La administración puede se simultánea (por
ejemplo, la administración de una mezcla de la presente proteína e
insulina) o puede ser in seriatim.
Se podría introducir un gen OB-R
capaz de mediar la transducción de señales, p. ej.,
OB-Rb, en células del hipotálamo humano para
desarrollar una terapia génica para la obesidad. Se esperaría que
tal terapia disminuyera el peso corporal. Por el contrario, la
introducción de constructos antisentido en las células cerebrales,
particularmente, del hipotálamo, pero incluyendo además el plexos
coroidal u otras células en las que se exprese
OB-R, reduciría los niveles de polipéptido
OB-R activo, pudiéndose prever un aumento de la
adiposidad corporal.
En una realización, un gen codificante de un
polipéptido OB-R se introduce in vivo en un
vector vírico. Tales vectores incluyen un virus de ADN atenuado o
defectuoso, tal como pero sin limitarse al virus del herpes simple
(VHS), papilomavirus, virus de Epstein Barr (VEB), adenovirus, virus
adeno-asociado (VAA) y similares. Se prefieren los
virus defectuosos que carecen completamente o casi completamente de
genes víricos. Un virus defectuoso no es infectivo tras su
introducción en una célula. El uso de vectores víricos defectuosos
permite la administración a células en una zona localizada
específica sin que importe que el vector pueda infectar a otras
células. De este modo, es posible dirigirse específicamente a tejido
cerebral. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no
se limitan a, vector del virus del herpes 1 defectuoso (VHS1)
[Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci.,
2:320-330(1991)], un vector de adenovirus
atenuado, tal como el vector descrito por
Stratford-Perricaudet et al., J. Clin.
invest., 90:626-630 (1992) y un vector de virus
adeno-asociado defectuoso [Samulski et al., J.
Virol., 61:3096-3101 (1987); Samulski et al.,
J. Virol., 63:3822-3828(1989)].
En otra realización, se puede introducir el gen
en un vector retrovírico [p. ej.: Anderson et al., Patente
estadounidense n.º 5.399.346; Mann et al., Cell, 33:153
(1983); Temin et al., Patente estadounidense n.º 4.650.764;
Temin et al., Patente estadounidense n.º 4.980.289; Markowitz
et al., J. Virol., 62:1120 (1988); Temin et al.,
Patente estadounidense n.º 5.124.263; Publicación de patente
internacional n.º WO 95/07358, publicada el 16 de marzo de 1995,
por Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood, 82:845
(1993)].
Alternativamente, se puede introducir el vector
in vivo por lipofección. Durante la década pasada, se ha
producido un aumento del uso de liposomas para encapsulación y
transfección de ácidos nucleicos in vitro. Se pueden usar
lípidos catiónicos sintéticos diseñados para limitar las
dificultades y los peligros que se encuentran con la transfección
mediada por liposomas para preparar liposomas para una transfección
in vivo de un gen codificador de un marcador [Felgner et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84:7413-7417
(1987); véase Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,
85:8027-8031 (1988)]. El uso de lípidos catiónicos
puede promover la encapsulación de ácidos nucleicos cargados
negativamente y promover también la fusión con membranas celulares
cargadas negativamente [Felgner et al., Science,
337:387-388 (1989)]. El uso de lipofección para
introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo
tiene ciertas ventajas prácticas. La dirección molecular de
liposomas hacia células específicas representa un área de beneficio.
Está claro que dirigir la transfección hacia determinados tipos de
células sería particularmente ventajoso en un tejido con una
heterogeneidad celular, tal como en el páncreas, el hígado, el
riñón y el cerebro. Los lípidos pueden estar químicamente acoplados
a otras moléculas a efectos de dirección (véase Mackey et
al., 1988, supra). Los péptidos dirigidos, p. ej., las
hormonas o los neurotransmisores y las proteínas tales como los
anticuerpos o las moléculas no peptídicas podrían ser acoplados a
liposomas químicamente.
También es posible introducir el vector in
vivo como un plásmido de ADN desnudo. Los vectores de ADN
desnudo para terapia génica pueden ser introducidos en las células
huésped deseadas mediante procedimientos conocidos en la técnica,
p. ej., transfección, electroporación, microinyección, transducción,
fusión celular, dextrano DEAE, precipitación de fosfato de calcio,
uso de una pistola génica o uso de un transportador de vectores de
ADN [véase, p. ej.: Wu et al., J. Biol. Chem.,
267:963-967 (1992); Wu et al., J. Biol.
Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et
al., Solicitud de patente canadiense n.º 2.012.311, presentada
el 15 de marzo de 1990)].
También se puede aislar el gen
OB-R de animales domésticos y el correspondiente
polipéptido OB-R obtenido de ese modo. Se espera
que la sonda derivada del gen OB-R murino se hibride
con las correspondientes secuencias codificantes homólogas de un
gran número de especies animales. Según lo tratado para terapias
humanas, también se pueden preparar proteínas recombinantes y
administrarlas a animales domésticos. La administración de
polipéptido soluble se puede llevar a cabo para producir animales de
carne más magra, tales como carne de vaca, de cerdo, de ave, de
oveja, etc. Preferiblemente, as administra un polipéptido OB
autólogo, aunque la revelación de la presente memoria también
contempla la administración de polipéptido no autólogo. Como el
polipéptido OB-R soluble está constituido por
aproximadamente 800 residuos de aminoácidos, puede ser muy
inmunogénico. De este modo, se prefiere la administración de
polipéptido autólogo.
Alternativamente, la introducción de los genes
clonados en animales domésticos transgénicos permitiría disminuir
potencialmente el peso corporal y la adiposidad mediante la
sobre-expresión de un transgén OB-R.
El procedimiento más simple para conseguirlo sería dirigir un
transgén OB-R al cerebro usando su propio u otro
promotor específico del cerebro.
Por el contrario, los aumentos de la grasa
corporal podrían ser deseables en otras circunstancias tales como
para el desarrollo de carne de Kobe o de hígado graso para hacer
foie gras. Esto se podría lograr dirigiendo un transgén
OB-R antisentido hacia el cerebro o usando una
tecnología de noqueado génico. Alternativamente, cuando se desea un
aumento del peso corporal en el porcentaje de grasa, se puede
administrar un inhibidor o antagonista del polipéptido
OB-R. Tales inhibidores o antagonistas incluyen,
pero no se limitan a, anticuerpos reactivos con el polipéptido y
los fragmentos del polipéptido que se unen pero que no activan el
receptor OB, i.e., antagonistas de la leptina
El polipéptido OB-R tiene un
valor significativo para su uso cosmético, además de sus beneficios
para la salud. En concreto, como los polipéptidos
OB-R revelados en la presente memoria, incluyendo
derivados y análogos agonistas de los mismos, son útiles para la
modulación de la velocidad y de la cantidad de deposición de células
grasas en un animal, son útiles para reducir el antiestético tejido
graso, p. ej.: los depósitos de grasa del abdomen, caderas, muslos,
cuello y barbilla que no se deben necesariamente a una condición de
la obesidad, pero que sin embargo afean el aspecto del individuo.
Se cree que el efecto de reducción de la grasa se consigue, en
parte, mediante una reducción del apetito, i.e., una reducción de la
ingesta de alimentos, mediante un aumento del metabolismo basal, o
ambos. De este modo, el presente polipéptido OB-Re
soluble, o sus derivados o análogos agonistas, es útil para la
administración a un sujeto con el fin de efectuar cambios cosméticos
en los depósitos de tejido graso, bien modulando la deposición de
grasas, reduciendo el apetito o ambas cosas.
Además, las presentes composiciones y
procedimientos se pueden usar en combinación con diversos
procedimientos, tales como cirugías cosméticas diseñadas para
alterar el aspecto general de un cuerpo (p. ej., liposucción o
cirugías por láser diseñadas para reducir la masa corporal aspirando
o destruyendo el tejido graso), el ejercicio (especialmente correr
y el entrenamiento con pesas), una dieta baja en grasas, la
hipnosis, la bioinformación, como ejemplos de los procedimientos
que se pueden intentar para disminuir el porcentaje de tejido graso
y mejorar el aspecto del cuerpo.
Por consiguiente, la presente revelación se
refiere a un procedimiento para efectuar una modulación cosmética
del tejido graso en un individuo que comprende administrar una
cantidad moduladora de la grasa de un polipéptido
OB-R soluble, o derivado o análogo agonista del
mismo, a un individuo que desee una modulación cosmética del tejido
graso para mejorar el aspecto global de su cuerpo. En un aspecto
particular, la modulación del tejido graso es una consecuencia de
la supresión del apetito. Preferiblemente, la modulación del tejido
graso es una reducción del tejido graso.
En otra realización más, esta revelación se
refiere a un procedimiento para efectuar una pérdida cosmética de
tejido graso que comprende combinar un procedimiento para cambiar el
aspecto corporal con la administración de una cantidad moduladora
de la grasa de un polipéptido OB-R soluble, o un
derivado o análogo agonista del mismo, a un individuo que desee una
modulación cosmética del tejido graso con el fin de mejorar el
aspecto global de su cuerpo.
Esta revelación se puede entender mejor con
referencia a los siguientes ejemplos, que están destinados a ser
ejemplares y no restrictivos. Los aspectos de los ejemplos que no se
refieren específicamente a la invención reivindicada se encuentran
incluidos únicamente a modo ilustrativo y comparativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Las mutaciones en el gen db de ratón
resultan en una obesidad y una diabetes graves pertenecientes a un
síndrome que se asemeja a la obesidad mórbida humana [Hummel et
al., Science, 153:1127 (1966)]. Datos anteriores sugirieron que
el gen db codificaba el receptor del producto génico del
locus ob, conocido como la leptina [Coleman,
Diabetologia, 14:141(1978); Zhang et al.,
Nature, 372:425 (1994)]. Recientemente, apareció un informe
sobre la clonación del receptor de la leptina del plexos coroidal;
se demostró que este clon se mapea hasta la misma región del
cromosoma 4 que db [Tartaglia et al., Cell, 83:1263
(1995)]. Este receptor es un miembro de la familia de receptores
que están asociados con las tirosina-quinasas de
JAK. Sin embargo, no se identificaron mutaciones de este receptor
en ratones db/db C57BL/6J, lo que sugiere que la mutación de estos
animales podría ser una variante de empalme de este gen [Tartaglia
et al., supra].
El presente ejemplo muestra que el receptor de
la leptina se mapea hasta el mismo intervalo de 300 kB del
cromosoma 4 de ratón que db. La selección de ADNc y el
atrapado de exones de esta región sirvieron para identificar varios
ETS con secuencias idénticas al receptor de la leptina. La
caracterización de los correspondientes clones de ADNc aislados de
una genoteca de ADNc de cerebro de ratón reveló que hay al menos
cinco formas cortadas y empalmadas alternativamente del receptor de
la leptina, cada una con diferencias en su terminal amino y/o
carboxilo. Una de las variantes de empalme se expresa a un nivel
elevado en el hipotálamo y a un nivel bajo en otros tejidos. Este
transcripto es mutante en ratones db/db C57BL/Ks. Esta mutación es
el resultado de un corte y empalme anormal que conduce a una
inserción de 106 bp en el extremo 3' del ARN, lo que resulta en una
región citoplasmática truncada que elimina la "Región 2", un
sitio proteico conocido por interactuar con las proteínas JAK
[Murakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 88:11349
(1991); Fukunaga, et al., EMBO, 10:2855 (1991)]; es probable
que sea defectuoso en la transducción de señales [Bahary et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:8642 (1990); Modi et al.,
Dytogenetics Cell Genetics, 67:232 (1995)]. Estos datos
sugieren que los efectos de la reducción de peso de la leptina están
mediados por interacciones con un receptor en el hipotálamo y,
quizás, en otros tejidos.
Aislamiento de clones genómicos. Se
aislaron clones YAC mediante rastreo por PCR y se clasificaron según
el tamaño sobre un CHEF MAPPER (Bio-Rad) [Green
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 87:1213 (1996);
Kasumi et al., Mammalian Genome, 4:391(1993)]. Se
recuperaron los extremos YAC usando los procedimientos de
vectorette PCR y de rescate de extremos con plásmidos [Riley et
al., Nucl. Acids Res., 18:2887 (1990); Hermanson et al.,
Nucl. Acids Res., 19:4943 (1991)]. Los clones P1 se aislaron
mediante el envío de pares específicos de cebadores PCR a Genome
Systems Inc. (St. Louis, MO) quienes proporcionaron picos simples de
clones P1 de ratones individuales [Sternsberg, Trends
Genet., 8:11(1992)]. Los extremos de P1 se recuperaron
usando el procedimiento de vectorette PCR [Hartl et al., Bio
Techniques, 15:201 (1993)]. Los BAC se aislaron según lo
descrito en [Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:8794
(1992)]. La selección de cebadores y la amplificación por PCR se
realizaron según lo descrito: desnaturalización inicial a 94ºC
durante 3 min., 25 ciclos de 94ºC durante 1 min., 55ºC durante 2
min. y a 72ºC durante 3 min. [Zhang, 1994, supra.]. Los
cebadores fueron:
Aislamiento de clones db. La selección de
ADNc se realizó según lo descrito usando ARN hipotalámico de
cerebro de ratón como material inicial [Morgan et al., Nucl.
Acids Res., 20:5173 (1992)]. Se realizaron un rastreo de
genotecas, un atrapado de exones y una secuenciación de ADN según lo
descrito [Zhang et al., 1994, supra, (véase el
ejemplo 3)]. Las secuencias C-terminales de
OB-Ra, OB-Re, OB-Rd
y OB-Re fueron encontradas en diferentes clones de
ADNc. La secuencia C-terminal de
OB-Rb no resultó ser de longitud completa. La
secuencia del terminal C de esta variante fue completada
inicialmente mediante la secuenciación de ADN genómico. El molde se
preparó usando un procedimiento de vectorette PCR de BAC 242 con
cebadores del ADNc^{29} [Riley et al., Nucl. Acids Res.,
18:2887 (1990)]. La secuencia se confirmó mediante la secuenciación
de productos de RT-PCR.
Identificación de mutaciones en db. La
RT-PCR y la secuenciación se realizaron según lo
descrito. Las secuencias genómicas en el aceptor de empalmes de
OB-Rb se obtuvieron mediante vectorette PCR de BAC
242 con el cebador inverso de OB-Rb. Para la
RT-PCR de OB-Ra,
OB-Rb, OB-Re y
OB-Rd, el cebador directo fue el mismo 5'
ACACTGTTAATTTCACACCAGAG 3' (SEQ ID NO:24) (también marcado como F1
en la figura 3C). Los cebadores inversos (i) fueron:
\vskip1.000000\baselineskip
Distribución de tejidos del receptor de la
leptina cortado y empalmado alternativamente. La
RT-PCR se realizó según lo descrito. Las secuencias
cebadoras para OB-Ra, OB-Rb,
OB-Rc y OB-Rd se muestran
anteriormente. Los cebadores para OB-Re fueron:
Se estableció una serie de cruzamientos
genéticos que segregaban db. Estos incluían una progenie
(db/db) obesa de 50 de un intercruzamiento de db/db C57BL/Ks x
Mus spretus y una progenie (db/db) obesa de 350 de un
intercruzamiento de db/db C57BL/Ks x Mus castaneus. La
asignación del genotipo como el locus db se realizó según lo
descrito anteriormente [Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci.
EE.UU., 37:8642 (1990)].
Se usaron varios marcadores de microsatélite que
flanqueaban db para el tipo de ADN de cada animal. Estos
incluían un marcador distal, el D4Mit31, y un marcador proximal,
1fn\alpha. Se compiló un mapa genético en la región de db
usando éstos y otros locus (figura 1). Los homólogos de ratón de dos
genes humanos previamente clonados se encontraron en la región de
db: JAK1 y PDE4B. Ambos genes se mapean hasta el cromosoma humano
1p31, lo que sugiere que el gen db humano se mapea hasta esta región
cromosómica [Modi et al., Cytogenetics Cell Genetics,
69:232 (1995); Milatovich et al., Somatic Cell Mol. Gen.,
20:75 (1994)].
Se encontró un clon de microdisección, el
D4Rck22, distal a db y recombinante en tres animales [Bahary
et al., Mammalian Genome, 4:511-515 (1993)].
El D6Rck 22 se usó como punto inicial de una pared cromosómica
usando cromosomas artificiales de levadura (YAC), cromosomas
artificiales bacterianos (BAC) y clones del bacteriófago P1 [Zhang
et al., 1994, supra; Steinberg, Trends Genet.,
8:11 (1994); Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89:8794
(1992)]. Se ensambló un cóntigo de 2,7 mB mediante un paseo
cromosómico desde este marcador. Cabe mencionar que una región de
aproximadamente 200 kB no fue identificada en ninguna genoteca de
YAC de ratón disponible (\sim12 equivalentes genómicos
rastreados). Este hueco del cóntigo se cerró tras el paseo
cromosómico con una serie de BAC y clones P1, seguidos por el
aislamiento de un YAC más que se extendía por 500 kB más proximales
a esta región. Se tipificaron animales recombinantes con marcadores
genéticos (tanto RFLP como SSLP) derivados de los extremos de los
clones genómicos individuales. La mutación db se localizó
entre el evento de recombinación distal en los animales 324 y los
eventos de recombinación proximal en el animal 1028. Se destacaron
otras siete recombinaciones proximales con 50 kB, lo que sugiere que
éste es un punto conflictivo para la recombinación. El intervalo no
recombinante completo corresponde a \sim300 kB de ADN y estaba
abarcado por dos BAC, 43 y 242
(figura 1).
(figura 1).
Los genes candidatos para db se aislaron a
partir de los BAC 43 y 242 usando el atrapado de exones y la
selección de ADNc de hipotálamo de ratón [Church et al, Nature
Genetics, 6:98 (1994); Morgan et al, Nucl. Acids. Res.,
20:5173 (1992)]. Se rastreó una genoteca de ADNc de cerebro de ratón
con fragmentos génicos putativos. El análisis de ocho clones de
ADNc cerebral identificó que había presentes seis productos
independientes de la selección de ADNc y dos ADNc identificados
usando exones atrapados sobre los transcriptos solapantes. La
secuencia de nucleótidos de cada clon de ADNc predijo secuencias
N-terminales al menos parcialmente idénticas al
receptor de la leptina de ratón (OB-R). La posición
de las secuencias desde el extremo 5' y 3' del ARN de
OB-R se determinó mediante el contenido de STS de
cada BAC, y se muestra en el mapa físico (figura 1). Estos datos
indican que el gen abarca \sim100 kB y está transcrito hacia el
telómero.
Estos clones de ADNc divergen en el terminal
carboxilo. En cuatro casos, las secuencias predichas fueron al
menos parcialmente idénticas hasta la lisina 889 del receptor de la
leptina, lo que incluye el dominio transmembrana. Más allá de este
punto, los ADNc predicen proteínas con diferencias en el dominio
citoplasmático designado OB-Ra (SEQ ID NO: 11),
OB-Rb (SEQ ID NO:12), OB-Rc (SEQ ID
NO:13) y OB-Rd (SEQ IDNO:14) (figura 2B). El
OB-Re predijo una secuencia diferente de
aminoácidos después de His^{796} (SEQ ID NO: 15), que parece
codificar un receptor soluble (figura 2B). Los clones para
OB-Ra, OB-Rb y OB-Re
divergían en su terminal N. En todos los casos, la secuencia
divergente también se mapea hasta el cóntigo de BAC.
OB-Ra corresponde en general al
OB-R de ratón [Tartaglia et al., Cell,
83:1263 (1995)].
El terminal C de OB-Rb era un 78
por ciento idéntico al receptor OB humano, lo que sugiere que es el
homólogo de ratón [Tartaglia et al., supra]. El receptor de
la leptina es un miembro de la familia gp-130 de
receptores que interactúan con la proteína quinasa de JAK. Los
dominios citoplasmáticos de los receptores gp-130 se
requieren en general para unirse a JAK y para la transducción de
señales [Kishimoto et al., Cell, 76:253 (1994)]. La
secuencia de ADNc de OB-Rb predice una posible
secuencia de la "Región 2" (subrayada en la figura 2B), un
motivo proteico necesario para unirse con las proteínas quinasas de
JAK [Kishimoto, supra]. La "Región 2" está conservada
entre numerosos miembros de esta familia de receptores y es
necesaria para la transducción de señales de los receptores del
G-CSF y la IL6 [Murakami et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 88:11349 (1991); Fukunaga et al., EMBO
J., 10: 2855 (1991)]. Ninguno de los otros transcriptos predice
una secuencia de la "Región 2". De los ocho clones de ADNc
caracterizados, el OB-Ra fue aislado tres veces y
el OB-Re, dos veces. OB-Rb,
OB-Rc y OB-Rd se aislaron una vez
cada uno. Hay otras variantes de empalme más con posibilidad de ser
identificadas.
Los ratones db/db C57BL/Ks tienen una longitud
mayor de fragmento de los productos obtenidos por
RT-PCR específica de OB-Rb (debería
indicarse que esta PCR amplificó ácidos nucleicos de 3', siendo por
tanto específica de todas las variantes de empalme que tienen un
dominio citoplasmático característico de OB-Rb, pero
que no proporciona datos sobre el dominio extracelular) de ARN
hipotalámico que los miembros de la misma camada de tipo silvestre
(figura 3A). Sin embargo, el ADN genómico amplificado por PCR que
abarcaba el aceptor de empalmes de Pro^{890} resultó ser de un
tamaño normal en ratones db/db C57BL/Ks en comparación con el tipo
silvestre (figura 3B). La secuenciación de ADN de este fragmento
confirmó que las secuencias genómicas del aceptor de empalmes son
de tipo silvestre en ratones db. Además, tanto el tamaño como la
secuencia de nucleótidos de los productos de la
RT-PCR correspondientes a los otros extremos 3'
fueron normales en los ratones db, lo que sugiere que el donante de
empalmes situado en Lys^{889} también es normal (figura 4). Estos
datos sugirieron que el fragmento específico de
OB-Rb más largo de los ratones db/db C57BL/Ks fue
resultado de un corte y un empalme
anormales.
anormales.
La secuenciación de los productos de
OB-Rb obtenidos por RT-PCR de los
ratones mutantes reveló una inserción de 106 bp entre el donante de
empalmes de Lys^{889} y el aceptor de empalmes de Pro^{890}. La
secuencia del ADN insertado fue idéntica a los primeros 106 bp del
único exón de OB-Ra secuencia abajo de su aceptor
de empalmes situado en Arg^{890} (figura 5A). La secuenciación del
ADN genómico y los productos obtenidos por RT-PCR
de la región no traducida de 3' de OB-Ra de los
ratones db/db C57BL/Ks sirvió para identificar una mutación de
g\rightarrowt 106 bp detrás del aceptor de empalmes (en
comparación con la figura 5B y 5C). Esta mutación resulta en la
aparición de un sitio consenso donante de empalmes, AGGTAAA (Figura
5C) [Lodish et al., Mol. Cell. Biol., Scientific American
Books: Nueva York, pp. 1-1344 (1986)]. Este donante
de empalmes mutante resulta en el corte y empalme de 106 bp del
exón terminal de OB-Ra en el aceptor de empalmes
situado en Pro^{890} del ARN de OB-Rb. La
proteína OB-Rb mutante resultante tiene un codón de
terminación cinco aminoácidos detrás del empalme y una secuencia de
aminoácidos idéntica a OB-Ra. El receptor mutante
carece de la mayoría de la región citoplasmática incluyendo el
posible motivo de la "Región 2". Aunque la
RT-PCR demostró que los tamaños del resto de los
extremos 3' eran normales en los ratones db/db C57BL/K9, es posible
que este exón alternativo esté insertado también en otros
transcriptos.
transcriptos.
El receptor de la leptina OB-Rb
se expresa a un nivel elevado en el hipotálamo en comparación con
otros tejidos (figura 6). En los testículos se observa un nivel de
expresión menor, con un nivel todavía menor en el tejido adiposo.
El resto de ARNm cortado y empalmado alternativamente se expresa en
varios tejidos incluyendo en algunos casos el hipotálamo (figura
6). El OB-Re, que codifica un receptor soluble
putativo, está altamente expresado en el tejido adiposo y se
expresa a un nivel más bajo en el cerebro, el corazón y los
testículos (figura 6E).
La mutación db/db C57BL/Ks es coisogénica y
resulta en el reemplazo funcional del dominio citoplasmático
correspondiente a OB-Rb por el de
OB-Ra. Estos datos, combinados con la localización
del receptor de la leptina en exactamente la misma región
cromosómica que db, confirman con fuerza que el
OB-Rb es alélico con db. La identificación
de mutaciones en los dos otros alelos disponibles de db
proporcionará más información sobre la relación entre la estructura
y la función de la proteína. El hecho de que la mutación db/db
C57BL/Ks se encuentre en el único terminal C de
OB-Rb explica por qué la secuencia de
OB-Ra permaneció invariable en los ratones db/db
C57BL/Ks y que la unión de la leptina al plexos coroidal fuera
normal en estos animales. La unión a la leptina en los ratones
db/db C57BL/Ks es probable que sea normal en todas las
localizaciones. En cambio, este fenotipo de la obesidad parece ser
el resultado de la incapacidad del terminal C de
OB-Ra para iniciar la transducción de señales
cuando se expresa en lugar del terminal C de OB-Rb.
Se contemplan la dilucidación de la ruta de transducción de señales
y la identificación de los posibles sitios de unión de JAK a la
región citoplasmática de este receptor.
\newpage
Estos resultados sugieren que los efectos
reductores del peso de la leptina están al menos parcialmente
mediados por interacciones con el receptor OB-Rb
que tiene un dominio (citoplasmático) C-terminal
característico del OB-Rb del hipotálamo, una región
cerebral conocida por desempeñar un importante papel en la
regulación del peso corporal. Esto se ve apoyado por el aumento de
potencia de la leptina cuando se administra directamente en el CSF
y los efectos de la leptina sobre la actividad eléctrica de la
neuronas hipotalámicas. La leptina puede modular la actividad del
NPY, GLP-1 y otros péptidos conocidos por afectar al
comportamiento alimentario en el hipotálamo y el cerebro [Stephens
et al., supra; Tarton et al., Nature, 379:69 (1996)].
También pueden tener efectos otros tejidos que expresan el receptor
de la leptina incluyendo la grasa. El receptor expresado en el
plexos coroidal, posiblemente, el OB-Ra o una
variante de empalme que comparta un terminal C similar, puede
actuar para transportar la proteína al CSF, un mecanismo similar al
propuesto para el transporte de insulina por el receptor de la
insulina [Bahary et al., 1990, supra; Partridge et
al., Neurochem., 44:1771 (1985); Van Houten y Posner,
Nature, 282:623 (1979); Wood y Park, Am. J. Physiol.,
233:E331-E334 (1979)].
Se cree que el OB-Re, el
receptor soluble putativo, se une a la leptina en la circulación.
Podría funcionar como una proteína de transporte para servir de
agonista de la actividad de la leptina [véase, p. ej.: Davis et
al., Science, 259:1736 (1993); Kishimoto et al., supra;
Davis et al., Science, 260:1805(1993)].
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Además del uso de la proteína recombinante para
generar anticuerpos policlonales, se identificó un conjunto de tres
secuencias peptídicas de la secuencia de OB-R murino
de longitud completa deducida (i.e., SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10).
Los cuatro fragmentos peptídicos internos son:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos péptidos se prepararon usando una síntesis
de péptidos en fase sólida estándar. Los péptidos sintéticos
purificados se conjugan con KLH y los conjugados de
péptido-KLH se usan para inmunizar conejos usando
técnicas estándar. De los conejos, se recoge antisuero policlonal
específico de cada péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Este ejemplo describe los clones de la selección
de ADNc que se identificaron para que correspondieran al
OB-R. Los cebadores de PCR de estos clones se usaron
como sondas para ADNc de OB-R y clones genómicos, y
son útiles para identificar ADN de OB-R, así como
para caracterizar diferentes variantes de empalme de
OB-R.
Se descubrieron cinco clones de selección de ADN
útiles como sondas: clones (SEQ ID NO: 35), 11 (SEQ ID NO: 36), 42
(SEQ ID NO: 37), 46 (SEQ ID NO: 38) y 58 (SEQ ID NO: 39). También se
descubrieron útiles como sondas dos clones de selección de ADNc
identificados por hibridación con clones de atrapado de exones:
clones S3 (SEQ ID NO: 40) y S14 (SEQ ID NO: 41).
Se prepararon cebadores PCR de cada uno de los
clones anteriormente indicados para su uso como sondas en la
identificación de ADN de OB-R. La tabla 1 presenta
los cebadores directos e inversos para cada uno de los clones e
indica qué variantes de empalme de OB-R, así como la
región codificante predicha que marca cada sonda.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según lo indicado en la tabla, las sondas de los
clones 7 y 11 han sido útiles para identificar todas las formas de
empalme de OB-R identificadas hasta la fecha. La
sonda 42 es útil para identificar una variante de empalme con un
dominio citoplasmático correspondiente a OB-Rb,
i.e., que es putativamente competente para la transducción de
señales. Las sondas 46 y S14 son útiles para identificar las
variantes de empalme que tienen una secuencia de aminoácidos
N-terminal correspondiente a OB-Rd y
OB-Re (que es idéntica a la secuencia
N-terminal del OB-R murino
publicado hasta los sitios de empalme C-terminales
identificados para estas proteínas; véase la figura 2B). La sonda
58 es útil para identificar un OB-R que contiene una
región 5' útil encontrada en el ADNc de la variante de empalme de
OB-Rb, que puede ser una región no codificante. S3
identifica ácidos nucleicos codificantes de dominios extracelulares
encontrados en las variantes a, d y e (correspondientes al dominio
extracelular de OB-R murino
publicado).
publicado).
Las condiciones de hibridación para rastrear la
genoteca de ADNc de cerebro de ratón fueron las siguientes: sondas
con una longitud de aproximadamente 150-300 bp
marcadas con ^{32}P-dCTP usando PCR en caliente.
Primero se hibridaron los filtros previamente durante al menos una
hora a 65ºC usando un tampón RAPID-HYB (Amersham
LIFE SCIENCES). Se añadió la sonda marcada a una concentración final
de 10^{6} cpm/ml de solución RAPID-HYB, y se
realizó la hibridación durante al menos 6 horas a 65ºC. Se lavaron
los filtros con 2 x SSC/SDS al 0,1%, T.A., durante 30 min., seguido
por un lavado en condiciones más restrictivas con 0,3 x SSC/SDS al
0,1%, T.A. durante media
hora.
hora.
Por lo tanto, las sondas descritas en este
ejemplo son útiles para identificar OB-R, así como
para identificar variantes de empalme únicas. Se cree, por ejemplo,
que una variante de empalme con un dominio extracelular
correspondiente a OB-Ra o OB-Rc/d/e
se puede unir con un dominio citoplasmático correspondiente a
OB-Rb.
\newpage
Ejemplo
4
Las mutaciones en el gen db de los
ratones y en su homólogo de rata fa, resulta en la obesidad y
la diabetes como parte de un síndrome semejante a la obesidad
mórbida humana. Hasta la fecha, se ha informado de mutaciones del
receptor de la leptina (Lepr) en ratones db/db C57BL/Ks y en ratas
fa/fa 13M. Este ejemplo muestra que las ratas fa^{cp}/fa^{cp}
tienen una mutación sin sentido en el aminoácido Tyr763, y que
ratones db^{3J}/db^{3J} 129 tienen una eliminación de 17 pares
de bases y un marco de lectura que resulta en una proteína truncada
de 636 aminoácidos. Estos datos confirman el hecho de que el gen
db y Lepr son alélicos. Además, el fenotipo de
ratones db^{3J}/db^{3J} 129, que tienen defectos en todas las
formas de Lept, y el de los ratones db/db C57BL/6J, que sólo
carecen de Ob-Rb, son idénticos. Estos datos
sugieren que no es probable que otras formas cortadas y empalmadas
alternativamente de los receptores de leptina
(OB-Ra, c, d, e) ofrezcan funciones independientes
de OB-Rb.
La clonación de la leptina y su receptor ha
conducido a la identificación de una nueva ruta de transducción de
señales importante para la regulación del peso corporal. Los datos
del ejemplo 1 indican que el gen db codifica varias formas
empalmadas alternativamente del receptor del producto génico
ob, la leptina. De estas formas de empalme, sólo una, el
OB-Rb, contiene un dominio citoplasmático largo, que
incluye motivos implicados en la transducción de señales. El
OB-Rb es altamente expresado en el hipotálamo y está
empalmado anormalmente en ratones db/db C57BL/Ks, lo que resulta en
el truncamiento de la isoforma OB-Rb y en la pérdida
de su capacidad de transducción de señales [ejemplo 1,
supra; Ghitardi et al., Proc. Natl. Acad. Sci,
EE.UU., 93:632-635 (1996); Vaisse et al.,
Nature Genetics, 14:95-97 (1996)].
Recientemente, se identificó una mutación de cambio de sentido en
ratas gruesas (que es alélica con db) en la rata Zucker (fa/fa)
gruesa [Chua et al., Diabetes 45:1141-1143
(1996)]. Esta mutación altera presumiblemente la unión de la leptina
en la superficie celular [Chua et al., (1996) supra;
Philips et al., Nature Genetics
13:18-19(1996)].
Las mutaciones en el locus db de ratón y
de su homólogo en rata, gruesos, se han producido independientemente
muchas veces [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.
88:7806-7809 (1991); Hurumel et al., Science
153:1127-1128 (1966); Aubert et al.,
Journal of Nutrition 115:327-333, (1985);
Koletsky, Experimental & Molecular Pathology
19:53-60 (1973); Leiter et al., Diabetologia
19:58-65 (1980)]. La base molecular de las
mutaciones de estas otras cepas mutantes podría aportar información
sobre la relación entre la estructura y la función de la leptina y
Lepr. Este ejemplo muestra la base molecular de las mutaciones de
las regiones codificantes de Lepr de ratas db^{3J}/db^{3J} 129 y
ratas fa^{cp}/fa^{cp} NIH.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación de las secuencias de Lepr
(OB-R) de ratón y rata. Se aisló ARN de
hipotálamo y cerebro mediante un procedimiento modificado con HCl y
guanidina [Chirgwin et al., Biochemistry
18:5294-5299 (1979)]. Se usaron diez microgramos de
ARN total como molde para sintetizar ADNc con transcriptasa inversa
de Mo-MuLV según las recomendaciones del fabricante
[Lee et al., (1996) supra]. Los fragmentos de ADN de
Lepr se amplificaron usando ADNc o ADN genómico de animales
mutantes y de tipo silvestre con polimerasa de ADN Taq y
cebadores basados en la secuencia de ADNc de Lepr murino o de
rata. Las muestras se amplificaron con los cebadores 43 M137R
5'-CTCACTGTGTAGTGTGAGGAGG-3' (SEQ ID
NO: 43) y A83'R
5'-CCTTGTGCCCAGGAACAATTC-3' (SEQ ID
NO: 55). Los fragmentos amplificados fueron purificados a partir de
geles de agarosa y secuenciados usando un secuenciador de ADN ABI
según lo descrito en [Zhang et al., Nature
372:425-432 (1994)]. Los geles de agarosa se usaron
según lo descrito [Zhang et al., (1994) supra).
PCR de ADNc y ADN genómico. Se
amplificaron por PCR tanto ADNc como ADN genómico procedentes de la
región extracelular de Lepr. El ADN se obtuvo de ratones
db^{3J}/db^{3J} 129 y de tipo silvestre. Las secuencias de
cebadores son las siguientes: para el ADNc, el cebador directo fue
3JF1 5'GAGAATAACCTTCAATTCCAGATTC3' (SEQ ID NO: 56) y el cebador
inverso fue 3JR1 5'CCCAAGCTTAAGGCCCTCTCATAGGAAC3' (SEQ ID NO: 57);
para el ADN genómico, el cebador directo fue 3JF2
5'GACCTCTCTGCAGTCTATGTGGTCCA3' (SEQ ID NO: 58) y el cebador inverso
fue 3JR2 5'GAAAGGTTTTCAGTCACGCTTGAAG3' (SEQ ID NO: 59).
\vskip1.000000\baselineskip
La rata corpulenta-NIH obesa
(cp/cp) es un modelo genético endogámico de diabetes no
insulino-dependiente caracterizado por un aumento
progresivo de la obesidad y la hiperinsulinemia antes de la
aparición de una hiperglicemia sostenida [Koletsky (1973)
supra]. Ya se había observado previamente que la mutación cp
es un alelo fa (fa^{cp}/fa^{cp}), pues los cruzamientos de ratas
que portan la mutación fa con ratas que portan la mutación cp
proporcionó una progenie obesa [Yen et al., Heredity 38
(1977)]. Se preparó ADNc de hipotálamo de ratas magras y obesas, y
se comparó la secuencia de la región codificante completa para Lepr.
Se identificó un cambio de una única base de T a A en el nucleótido
2289 de la rata corpulenta obesa que resultó en la conversión de
Tyr763 en un codón de terminación (figura 7). Para confirmar esto,
se usaron cebadores específicos que flanqueaban de cerca la
mutación, corp-F y corp-R, para
amplificar ADN genómico de ratas tanto magras como obesas. La
secuenciación del ADN genómico confirmó un cambio de T a A. Esta
mutación sin sentido resultó en la terminación de la traducción
aminoterminal del dominio transmembrana. Como consecuencia de ello,
ninguna de las isoformas de Lepr de ratas cp/cp contiene un dominio
transmembrana, ni ninguno de los motivos necesarios para la
transducción de señales.
La mutación db^{3J} se produjo espontáneamente
en la cepa 129/J en el Laboratorio Jackson. Los animales mutantes
presentan una obesidad y una hipoglicemia graves, en lugar de
hiperglicemia, asociadas a una marcada hiperinsulinemia y unos
islotes de Langerhans ampliados masivamente [Leiter et al.,
(1980) supra]. Para identificar la mutación db^{3J}, se
preparó ARN de hipotálamo de ratones db^{3J} y de tipo silvestre.
Una electroforesis sobre gel de agarosa reveló que un producto de
RT-PCR procedente del terminal amino de los ratones
receptores de db^{3J} es más pequeño que el de los ratones +/+
129. El producto de la PCR del ADN genómico de esta región del
receptor también resultó ser más corto en los ratones mutantes
(figura 8). La secuenciación de los productos de la PCR identificó
una eliminación de 17 nucleótidos que comenzaba en la base
G^{1874} (Ser625) de los ratones mutantes, causante de un
desplazamiento del marco de lectura (figura 9). En los ratones
db^{3J}/db^{3J}, la traducción del OB-R se
detiene en el décimo primer aminoácido detrás del sitio de
deleción. El resultado es la síntesis de una proteína truncada sin
un dominio transmembrana. Las inmunotransferencias confirman que la
banda de proteína receptora está ausente en este mutante. De este
modo, esta mutación conduce a un receptor truncado que afecta a
todas las variantes de empalme de
Lepr.
Lepr.
La mutación sin sentido en rata corpulenta
(cp/cp) y la mutación db del marco de lectura de los ratones 129J
(db/db) confirman que los defectos en el receptor de la leptina
conducen a anomalías en la ruta Lepr de leptina y a un fenotipo de
la obesidad. Además, el fenotipo de los ratones db^{3J}/db^{3J}
129, que tiene defectos en todas las formas de Lepr, y de los
ratones db/db C57BL/6J, que sólo carece de OB-Rb,
son idénticos (figura 10). Estos datos sugieren que no es probable
que las otras formas empalmadas alternativamente de los receptores
de la leptina (OB-Ra, c, d, e) cumplan funciones
independientes de OB-Rb.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Generación de constructos de transferencia de
baculovirus. Todos los constructos para la expresión del
receptor OB soluble (OB-Re) y los mutantes de
OB-Re se generaron en base a un vector clonante de
transferencia basado en el promotor de la polihedrina del
baculovirus denominado pMelBac (Invitrogen; Cat. N.º:
V1950-20). Este vector está diseñado para dirigir
la expresión de proteínas recombinantes a través de la ruta
secretora hacia el medio extracelular. El vector contiene una
secuencia de señales para la melitina de la abeja (HBM) que es
altamente expresada y eficientemente secretada por células SF9, una
línea celular de insecto. La secuencia de señales de la HBM en
pMelBac reemplaza a la secuencia de señales endógenas de la proteína
recombinante. Se usó una PCR durante la etapa de clonación inicial
para generar insertos para la unión. El ADNc de
OB-Re sirvió como molde de PCR (SEQ ID NO: 10). Los
oligonucleótidos de cebado para la PCR se diseñaron para que
amplificaran la región del ADNc de OB-Re necesaria,
para introducir la(s) mutación(es) puntuales deseadas
y el codón de terminación, en caso necesario, así como para generar
secuencias de reconocimiento de la enzima de restricción que eran
necesarias para la clonación en el vector pMelBac (Figura 11, Tabla
2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La elección entre los vectores de clonación
pMelBac A, B o C se basó en sus marcos de lectura abiertos, lo que
permite la inserción del gen recombinante en el marco con la
secuencia de señales de melitina para la secreción de la proteína
recombinante. Se digirieron los productos obtenidos por PCR y los
vectores de clonación con las correspondientes enzimas de
restricción (New England Biolabs) antes de la unión, lo que fue
llevado a cabo durante una noche a 16ºC usando ligasa T4 (Gibco
BRL). Se transformaron las mezclas de unión en células DH5a, que
fueron cultivadas durante una noche sobre placas de LB que contenían
50 \mug/ml de ampicilina. Se analizaron los clones mediante PCR
usando los cebadores para PCR de baculovirus recombinante de
Invitrogen (Cat. N61044) para la presencia del inserto. Se
secuenciaron los clones positivos, identificados por PCR, con
cebadores de secuenciación directos de polihedrina (cat.
N598-02) e inversos de baculovirus (+15) (cat.
N615-02) de Invitrogen para confirmar que el gen
recombinante estaba orientado correctamente y fusionado a la señal
de secreción de la melitina.
Producción del virus recombinante. Se
usaron células de insecto SF9 para la producción y la amplificación
del virus recombinante. Se obtuvo medio de crecimiento de insectos
de Grace adquirido en Gibco BRL (Cat. 11605) y complementado con
suero bovino fetal al 10% (Gibco BRL, Cat. 26140), 1 \mug/ml de
gentamicina (Gibco BRL, Cat. 15710) y 625 ng/ml de fungizona (Gibco
BRL, Cat. 15295). Se añadió ácido F-68 plurónico
(Sigma, Cat. P-1300) a los cultivos celulares en
suspensión al 0,2% (p/v). Se cotransfectaron constructos
recombinantes con el ADN de
Bac-N-Blue linealizado en células
SF9 usando un equipo de transfección de
Bac-N-Blue de Invitrogen (Cat.
BK855-01), conforme a las especificaciones del
fabricante. Se recogió medio de crecimiento que contenía una mezcla
de partículas de virus recombinante y de tipo silvestre a las 72
horas y las 120 horas de la transfección. Se purificaron los
aislados de virus recombinante putativo mediante la infección de
células SF9 con diluciones de la línea de transfección y mediante
el aislamiento de puntos focales de infección (placas) de un
revestimiento de agarosa (análisis de placas). Se identificaron
virus recombinantes en base a su capacidad para formar placas
azules sobre X-gal debido a la presencia del gen
lacZ en un vector de transferencia pMelBac. Se amplificaron placas
recombinantes putativas hasta unas líneas víricas de P1 a baja
escala y de bajo título, infectando aproximadamente 2 x 10^{6}
células SF9 y recogiendo medio de crecimiento 5-7
días después de la infección. La presencia de un inserto de gen
recombinante en un virus recombinante putativo y la pureza de la
placa recombinante fueron confirmadas mediante un análisis de PCR
del ADN vírico usando los cebadores para PCR de baculovirus
recombinante anteriormente descritos.
La expresión de la proteína recombinante se
confirmó mediante un análisis de transferencia Western del medio de
crecimiento usando anticuerpos policlonales de conejo desarrollados
frente a péptidos que se derivaron de la secuencia de aminoácidos
de OB-Re (Ejemplo 2, supra). Además, se usó
la porción C-terminal de OB-Re
(aminoácidos 420-641) para inmunizar conejos. Las
líneas víricas P1 positivas en los análisis PCR y western se
amplificaron más en líneas P2 a baja escala y título elevado
infectando cultivo en suspensión de aproximadamente 2 x 10^{8}
células SF9 y recogiendo medio de crecimiento 5-7
días después de la infección. Se determinó el título vírico de las
líneas P2 realizando un análisis de placas a partir de diluciones en
serie de las líneas víricas y haciendo un recuento del número de
placas. Se amplificaron más los virus en líneas maestras a alta
escala y de título elevado infectando los cultivos en suspensión de
células SF9 con líneas P2 de un título vírico conocido a una
multiplicidad de infección (MdI) igual a 0,5 (0,5 partículas víricas
infecciosas para cada célula SF9). Se valoraron las líneas maestras
resultantes y se usaron para los estudios de expresión de proteínas
recombinantes.
Expresión de proteína recombinante. Se
optimizaron los niveles de expresión de las proteínas recombinantes
analizando las líneas celulares diferentes, de diferente MdI, y
optimizando los puntos temporales de la cosecha de proteínas. Por
lo común, todas las proteínas recombinantes derivadas de
OB-R se expresaron a niveles significativamente
elevados en células High Five (Cat. B855-02,
Invitrogen), en comparación con los niveles de expresión en células
SF9. Se usó medio de crecimiento EX-CELL 405 (JRH
Biosciences, Cat. 14405-79P), complementado con 3
\mug/ml de gentamicina y 1,25 \mug/ml de fungizona para el
crecimiento libre de suero de células High Five con el fin de
facilitar la purificación de proteínas recombinantes secretadas. La
MdI óptima variaba de 5 a 10. El momento óptimo de recogida de las
proteínas fue habitualmente alrededor de las 72 h de la
infección.
Para la expresión a gran escala de la proteína
recombinante, se dejó crecer cultivo en suspensión de células High
Five en un agitador a 27ºC a aproximadamente 100-120
rpm hasta la densidad de aproximadamente 2 x 10^{6} células/m.
(etapa de crecimiento log.). Se infectaron las células con una
reserva línea recombinante maestra a la MdI óptima, y se recogió
medio de crecimiento en el momento óptimo. Se retiraron los restos
celulares mediante centrifugación a 5.000 g durante 10 minutos y se
hicieron precipitar proteínas secretadas mediante la adición de
sulfato de amonio. Se emplean protocolos basados en FPLC para una
mayor purificación de las proteínas recombinantes.
Análisis de la actividad biológica (Unión a
la leptina). Se analizó la actividad biológica del
OB-Re recombinante y los mutantes de
OB-Re por su capacidad para unirse a la leptina
conjugada con perlas de sefarosa. Se incubó medio de crecimiento,
que contenía proteína recombinante secretada, durante una noche con
leptina-perlas de sefarosa. Se lavaron las perlas,
se hirvieron con SDS y se analizaron las proteínas unidas mediante
transferencia western. Todas las proteínas recombinantes analizadas
eran capaces de unirse a la leptina. La unión del
OB-Re de longitud completa recombinante a la
leptina es muy fuerte, por lo que no se podía eluir el
OB-Re de la columna de
leptina-sefarosa a temperatura ambiente con agentes
caotrópicos fuertes tales como SDS, urea o clorhidrato de
guanidinio. Se evaluó la especificidad de la interacción entre la
proteína recombinante y la leptina mediante un análisis de
inhibición competitiva (figura 12). Se incubó previamente medio que
contenía proteínas recombinantes con leptina soluble antes de la
incubación con leptina-sefarosa. Se descubrió que
la leptina soluble inhibe la unión de las proteínas
OB-Re recombinantes a las perlas de
leptina-sefarosa de un modo dependiente de la
concentración (tabla 3).
No se pretende limitar la presente invención al
ámbito descrito por las realizaciones específicas de la presente
memoria. De hecho, habrá diversas modificaciones de la invención,
además de aquéllas descritas en la presente memoria, que resultarán
evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción
precedente y de las figuras que la acompañan. Se pretende que tales
modificaciones entren en el ámbito de las reivindicaciones
anexas.
En el caso de las longitudes de las secuencias
de nucleótidos o aminoácidos, o de los valores de peso molecular
ofrecidos, éstos son aproximados.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Friedman, Jeffrey M.
\hskip3.9cmLee, Gwo-Hua
\hskip3.9cmProenca, Ricardo
\hskip3.9cmIoffe, Ella
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: DB, EL RECEPTOR PARA LA LEPTINA, ÁCIDOS NUCLEICOS CO- {}\hskip4.55cm DIFICANTES DEL RECEPTOR Y SUS USOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 83
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: David A. Jackson, Esq.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 411 Hackensack Ave, Continental Plaza, 4^{th} Floor (C) CIUDAD: Hackensack
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07601
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/599.974
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-FEB-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/586.594
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 16-ENERO-1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Jackson Esq., David A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 26.742
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/DE CASO: 6001162 PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 201-487-5800
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 201-343-1684
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.529 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: A15 (OB-Ra)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 842 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Ra
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.848 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: A40 (OB-Rb)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rb
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 961 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: A6 (OB-Rc)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 319 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.703 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: A8 (OB-Rd)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 900 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rd
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2.461 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: A20 (OB-Re)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 805 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Re
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Ra
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 276 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rb
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: no relevante
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rd
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Re
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Ra/db/db
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: OB-Rb/wt
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: no relevante
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 166 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 7
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 320 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 158 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 42
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 192 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 46
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 168 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: 58
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 259 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 250 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- ORIGEN INMEDIATO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S14
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 61:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 62:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 63:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 64:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 65:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 66:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 67:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 68:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 69:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 70:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 71:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 72:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 73:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 74:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 75:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 76:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador para PCR"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 77:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 78:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 79:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 80:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 81:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 82:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 83:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (22)
1. Un polipéptido receptor soluble de la leptina
(OB-R) que:
- a)
- es Ob-Re según lo definido por SEQ ID NO: 10;
- b)
- es un polipéptido que tiene un terminal N de la SEQ ID NO: 10 de Ob- Re de Pro^{664} a His^{796} y el terminal C de la SEQ ID NO: 10 de Ob-Re después de His^{796};
- c)
- es un receptor de la leptina en el que a) la secuencia N-terminal es: i) los residuos de aminoácidos 1-796 de SEQ ID NO: 10; ii) los residuos de aminoácidos 23-796 de SEQ ID NO: 10; iii) los residuos de aminoácidos 28-796 de SEQ ID NO: 10; iv) los residuos de aminoácidos 133-796 de SEQ ID NO: 10; o v) los residuos de aminoácidos 733-796 de SEQ ID NO: 10; y b) la secuencia C-terminal es la SEQ ID NO: 15 detrás de His^{796};
- d)
- es un receptor de la leptina que tiene una secuencia N-terminal que es la de los residuos de aminoácidos 28-796 de la SEQ ID NO: 10 precedida por un dipéptido Asp-Pro N-terminal y una secuencia C-terminal que es la SEQ ID NO: 15 detrás de His^{796};
- e)
- es un receptor de la leptina que tiene la secuencia: i) Asp-Arg-Trp- Gly-Ser-Tyr^{420} (SEQ ID NO:77) seguida por Ala^{421}-Pro^{641} de la SEQ ID NO: 10; ii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser^{118} (SEQ ID NO: 78) seguida por Ala^{421}-Pro^{641} de la SEQ ID NO:10; o iii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu^{123} (SEQ ID NO: 79) seguida por Ala^{421}-Pro^{641} de SEQ ID NO: 10; f) es un receptor de la leptina que está constituido por la secuencia: i) Tyr^{420}\rightarrowPro^{641} de SEQ ID NO: 10; ii) Ser^{118}\rightarrowPro^{641} de la SEQ ID NO: 10; o iii) Leu^{123}\rightarrowVal^{331} de la SEQ ID NO: 10; o
- g)
- es un receptor de la leptina que es cualquiera de los péptidos anteriores en los que hay un residuo de cisteína sustituido por serina, treonina, metionina o alanina;
2. El receptor de la leptina de la
reivindicación 1 que es un receptor de la leptina murino
natural.
3. Un derivado constituido por el receptor de la
leptina según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores
unido a un resto químico.
4. El derivado de la reivindicación 3, en el que
el resto químico es un polímero hidrosoluble, tal como
polietilenglicol.
5. Un ácido nucleico aislado codificante del
receptor de la leptina de la reivindicación 1 o de la reivindicación
2.
6. Un ácido nucleico aislado codificante en la
expresión de un polipéptido receptor soluble de la leptina que
tiene la capacidad de unirse a la leptina, que es:
- a)
- una molécula de ADN según lo expuesto en la SEQ ID NO:9;
- b)
- la secuencia complementaria de la molécula de ADN definida en (a); o
- c)
- una molécula de ADN que codifica en la expresión el polipéptido codificado por cualquiera de las moléculas de ADN anteriores.
7. Un vector que comprende el ADN de la
reivindicación 6, que es preferiblemente: un vector de expresión que
comprende el ADN de la reivindicación 6 asociado operativamente con
una secuencia de control de la expresión; o un vector
transgénico.
8. Un huésped unicelular transformado o
transfectado con una molécula de ADN de la reivindicación 6 o un
vector de la reivindicación 7, siendo la célula huésped
preferiblemente una célula bacteriana, de levadura, de mamífero,
vegetal o de insecto en cultivo tisular.
9. El huésped unicelular de la reivindicación 8,
en el que el huésped unicelular es una célula de E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, Pichia,
Candida, Hansenula, Torulopsis, CHO, R1.1, B-W,
LM, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 o Sf9.
10. Un procedimiento para preparar un
polipéptido receptor de la leptina que comprende:
- a)
- cultivar una célula según la reivindicación 8 o la reivindicación 9 en condiciones que proporcionen la expresión del polipéptido receptor de la leptina; y
- b)
- recuperar el polipéptido expresado.
11. Un anticuerpo específico del receptor de la
leptina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Un anticuerpo según la reivindicación 11, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o
policlonal.
13. Un anticuerpo según la reivindicación 12
marcado con una etiqueta detectable.
14. Una línea celular inmortal que produce un
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 12.
15. Un procedimiento para preparar un anticuerpo
específico del receptor soluble de la leptina de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 que comprende:
- a)
- inmunizar un animal huésped con el receptor de la leptina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 mezclado con un adyuvante y/o conjugado con una proteína vehículo, y
- b)
- obtener anticuerpo del animal huésped inmunizado.
16. Un procedimiento para medir la presencia de
un receptor soluble de la leptina según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 en una muestra, que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra sospechosa de contener un receptor de leptina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 con un anticuerpo que se une específicamente al receptor soluble de la leptina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, estando el anticuerpo opcionalmente unido a un soporte en fase sólida, en condiciones que permiten la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el receptor de la leptina; y
- b)
- detectar la formación de complejos de reacción que comprenden el anticuerpo y el receptor de la leptina en la muestra,
en el que la detección de la formación de los
complejos de reacción indica la presencia de receptor de la leptina
en la muestra, en el que el procedimiento incluye opcionalmente la
etapa de:
- c)
- evaluar la cantidad de complejos de reacción formada, correspondiendo la cantidad de los complejos de reacción al nivel de receptor de la leptina de la muestra biológica, e
incluyendo el procedimiento además opcionalmente
la etapa de comparar el nivel detectado en la etapa de evaluación
con un nivel de receptor de la leptina presente en sujetos normales
o en el sujeto en un momento anterior, indicando el aumento del
nivel de receptor de la leptina en comparación con los niveles
normales una enfermedad asociada con niveles elevados de receptor
de la leptina, e indicando una disminución del nivel de receptor de
la leptina en comparación con los niveles normales una enfermedad
asociada con niveles disminuidos de receptor de la leptina.
17. Una composición farmacéutica que comprende
un receptor soluble de la leptina según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su
uso en medicina.
18. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 17 para su uso en el tratamiento de la obesidad en
un sujeto.
19. Uso de un receptor soluble de la leptina
según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en la fabricación
de un medicamento destinado a tratar la obesidad en un sujeto.
20. Un equipo que comprende la composición
farmacéutica de la reivindicación 17 y una composición farmacéutica
destinada al tratamiento de la diabetes, la presión sanguínea
elevada o el colesterol elevado.
21. Una composición cosmética para mejorar el
aspecto corporal para reducir el peso corporal de un individuo que
comprende un receptor soluble de la leptina de la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 y un vehículo aceptable.
22. Un procedimiento de tratamiento cosmético
para mejorar el aspecto corporal que comprende administrar al
sujeto una composición que comprende un receptor soluble de la
leptina según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y un
vehículo aceptable.
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