UA124613C2 - Зв'язучий icos білок - Google Patents

Зв'язучий icos білок Download PDF

Info

Publication number
UA124613C2
UA124613C2 UAA201708633A UAA201708633A UA124613C2 UA 124613 C2 UA124613 C2 UA 124613C2 UA A201708633 A UAA201708633 A UA A201708633A UA A201708633 A UAA201708633 A UA A201708633A UA 124613 C2 UA124613 C2 UA 124613C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
iso5
binding
cells
antigen
antibody
Prior art date
Application number
UAA201708633A
Other languages
English (en)
Inventor
Яо-Бін Ліу
Яо-Бин Лиу
Радха Шах Пармар
Патрік Майєз
Патрик Майез
Даньєль Олів
Даньель Олив
Original Assignee
Глаксосмітклайн Інтеллектьюел Проперті Девелопмент Лімітед
Глаксосмитклайн Интеллектьюел Проперти Девелопмент Лимитед
Інсерм (Енстітю Насьйональ Де Ля Санте Е Де Ля Решерш Медікаль)
Инсерм (Энститю Насьйональ Де Ля Санте Е Де Ля Решерш Медикаль)
Енстітю Жан Паолі Енд Ірен Калметт
Энститю Жан Паоли Энд Ирэн Калмэт
Юніверсіте Д'Е-Марсей
Юниверсите Д'Е-Марсей
Сантр Насьйональ Де Ля Решерш Сьянтіфік
Сантр Насьйональ Де Ля Решерш Сьянтифик
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмітклайн Інтеллектьюел Проперті Девелопмент Лімітед, Глаксосмитклайн Интеллектьюел Проперти Девелопмент Лимитед, Інсерм (Енстітю Насьйональ Де Ля Санте Е Де Ля Решерш Медікаль), Инсерм (Энститю Насьйональ Де Ля Санте Е Де Ля Решерш Медикаль), Енстітю Жан Паолі Енд Ірен Калметт, Энститю Жан Паоли Энд Ирэн Калмэт, Юніверсіте Д'Е-Марсей, Юниверсите Д'Е-Марсей, Сантр Насьйональ Де Ля Решерш Сьянтіфік, Сантр Насьйональ Де Ля Решерш Сьянтифик filed Critical Глаксосмітклайн Інтеллектьюел Проперті Девелопмент Лімітед
Publication of UA124613C2 publication Critical patent/UA124613C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Винахід стосується зв'язуючого ICOS білка. Також винахід стосується нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини-хазяїна, способу отримання зв'язуючого білка ICOS та фармацевтичної композиції для застосування при лікуванні раку.

Description

(54) ЗВ'ЯЗУЧИЙ ІСО5 БІЛОК (57) Реферат:
Винахід стосується зв'язуючого ІСО5 білка. Також винахід стосується нуклеїнової кислоти, експресуючого вектора, клітини-хазяїна, способу отримання зв'язуючого білка ІСО5 та фармацевтичної композиції для застосування при лікуванні раку.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Даний винахід стосується, головним чином, імунотерапії у лікуванні захворювання людини та зменшення пов'язаних з нею несприятливих подій. Конкретніше, даний винахід стосується застосування зв'язуючих ІСО5 білків, включаючи антитіла-агоністи ІСО5, та їх застосування як імуномодуляторів для лікування злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ ДЛЯ ВИНАХОДУ
Посилення функції протипухлинних Т-клітин та індукція проліферації Т-клітин є потужним і новим способом лікування злоякісних пухлин. Три імуноонкологічних антитіла, (наприклад, імуномодулятори), представлені на ринку в даний час. Вважається, що антитіло проти СТІ А-4 (ЄРВОЙЇпілімумаб) підсилює імунні відповіді в точці примування Т-клітин, і вважають, що антитіла проти РО-1 (ОПДІВО/ніволумаб і КЕЙТРУДА/пембролізумаб) діють у місцевому мікрооточенні пухлин, за допомогою ослабіння інгібуючої контрольної точки в специфічних для пухлин Т-клітинах, які вже були примовані й активовані.
ІСО5 являє собою костимулюючий рецептор Т-клітин із структурним і функціональним взаємозв'язком із суперсімейством СО28/СТІ А-4-Ід (Нийої, еї а!., ""СО5 із ап іпдаисіріє Т-сеїЇ со- взійтшаюг вігосіигацйу апа ТипсіопайПу геїаїєд о СО28", Маїштє, 397: 263-266 (1999)). Активація
ІСО5 відбувається за допомогою зв'язування з ІСО5-Ї (В7АР-1/87-Н2). Ні В7-1, ні В7-2 (ліганди для СО28 і СТІ А4) не зв'язують або не активують ІСО5. Проте, показано, що ІСО5-Ї| слабо зв'язується як з СО28, так і з СТІ А-4 (Мао 5 еї а!., "В7-Н2 із а совіїтціайгу ліганд ог С028 іп
Питап", Іттипйу, ЗА(5); 729-40 (2011)). Експресія ІБСО5, мабуть, обмежена Т-клітинами. Рівні експресії ІСО5 міняються між різними підгрупами Т-клітин і залежно від статусу активації Т- клітин. Експресія ІСОЗ показана на непорушних клітинах ТНІ17, фолікулярних Т-клітинах- помічниках (ТЕН) і регуляторних Т-клітинах (Трег); проте, на відміну від СО28; він не експресується на високому рівні на популяціях наївних ефекторних Т-клітин Тні1 і Тн2 (Рашов
СМ еї аї., "Не іпдисіріє совіїтиіатг (ІСО5) ів стйса! ог ШТе демеіортепі ої питап ТН17 сеїІв", 5сі
Ттапе! Мей, 2(55); 55га78 (2010)). Експресія ІСО5 сильно індукується на СО4- і СО8 ефекторних Т-клітинах після активації за допомогою залучення ТОВ (У/аКатаїзи Е, еї аї., "Сопмегдепі апа аїмегдепі еПесів ої созіїтшаюгу тоїіесшціев іп сопуепіопаї! апа геашаюгу С04-Т сеїІв", Ргос Маїа! Асай 5сі ОБА, 110(3); 1023-86 (2013)). Передача костимулюючих сигналів через
Зо рецептор ІСО5 відбувається лише в Т-клітинах, що отримують паралельний сигнал активації
ТОВ (ЗНагре АН і Егтеетап Сх. "Тпе В7-С028 Ззирепатійу", Маї. Вем Іттипої, 2(2); 116-26 (2002)).
В активованих антигенспецифічних Т-клітинах, ІСО5 регулює продукцію цитокінів як Тні1, так і
Тн2, включаючи ІЕМ-у, ТМЕ-а, 1-10, 1-4, 1/-13 та інші. ІСО5 стимулює також проліферацію ефекторних Т-клітин, хоча і у меншій мірі, ніж СО28 (Зпагре АН апа Егеетап Сх). "(не В7-С028 зирепатйіу", Маї. Вем Іттипої, 2(2); 116-26 (2002))
Зростаючий об'єм літератури підтверджує ідею, що активація ІСО5 на СО4- і СОвж ефекторних Т-клітинах має протипухлинний потенціал. Злитий білок ІСО5-1-Рс викликав затримку зростання пухлин і повне знищення пухлин у мишей із сингенними пухлинами 5А-1 (саркомою), Меїй (фібросаркомою), ЕМТб6 (пухлиною молочної залози) і Р8В15 (мастоцитомою), і
ЕІ-4 (плазмацитомою), тоді як активності не спостерігали в моделі пухлини В16-Е10 (меланоми), яка, як відомо, є слабо імуногенною (Ага С еї аї., "Роїепі асіїмйу ої зоїшбіє В7В!Р-1-
Ес іп Шегару ої тигпіпе їштої5 іп зупдепеїс Но5і5", пі. У Сапсег, 103(4); 501-7 (2003)).
Протипухлинна активність ІСО5-І-Бс залежала від інтактної імунної відповіді, оскільки активність була повністю втрачена в пухлинах, вирощених у мишей пиде. Аналіз пухлин з мишей, підданих лікуванню ІСО5-Ї -Ес, показав значне збільшення інфільтрації СО4-- ї СО8.--Т- клітин у пухлині, здатні відповідати на лікування, що підтримує імуностимулюючий ефект ІСО5-
ІЇ-Ес у цих моделях.
У іншому повідомленні з використанням мишей ІСО5 і ІбО5-І7 показане залучення передачі сигналів ІСО5 в опосередкуванні протипухлинної активності антитіла проти СТІ А4 в моделі сингенної пухлини меланоми В16/В16 (Ри Т еї аї., "" "Пе ІСОБ5/ЛСОЗ5І. раїпулау і гедцігей
Тог оріїта! апійштог гезропзе5 теаіаїєд ру апіі-СТІ А-4 ІШегару", Сапсег Вев, 71(16); 5445-54 (2011)). Миші, позбавлені ІСО5 або ІСО5-Ї, мали значно зменшені відсотки виживаності у порівнянні з мишами дикого типу після лікування антитілом проти СТІ А4. В окремому дослідженні, клітини пухлин В16/816 трансдукували для надекспресії рекомбінантного мишачого ІСО5-Ї.. Виявлено, що ці пухлини є значно чутливішими до лікування проти СТІ А4 у порівнянні з клітинами пухлин В16/В16, трансдукованими контрольним білком (АЇїїзоп У еї аї., "ботбіпайоп іттипоїпегару Тог Ше ігєеайтепі ої сапсег, МО2011/041613 А? (2009)). У цих дослідженнях представлений доказ протипухлинного потенціалу агоніста ІСО5, як окремо, так і в комбінації з іншими імуномодулюючими антитілами.
Дані, що поступають для пацієнтів, підданих лікуванню з використанням антитіл проти
СТІ А4, також вказують на позитивну роль ІСО5ж ефекторних Т-клітин в опосередкуванні протипухлинної імунної відповіді. Пацієнти з метастазуючою меланомою (Сіасото АМО еї аї., "Гопа-їепт 5игімаї апа іттипоіодіса! рагатеїег5 іп теїавіайс теїіапот раїїєпів мо гезропа ю ірійтитар 10 то/куд м/ййіп ап ехрападейд ассевз5 ргодгат", Сапсег Іттипої! ІттипоїНег., 62(6); 1021-8 (2013)); уротеліальним раком (Сапййпоп ВС еї аї., "Ргеорегайме СТІ А-4 ріосКааде:
ТоіІегарійу апа іттипе птопйогіпу іп Ше з5ейціпу ої а ргезигдісаї! сіїпіса! іа!" Сіп Сапсег Везв., 16(10); 2861-71 (2010));) раком молочної залози (Мопаегпеїде КН еї аї., "Теетеїйтитабр іп сотбіпайоп м/ййп ехетевіапе іп раїєпіб5 м/йй адмапсей Бгєаві сапсег апа еагтепі-аззосіаїєа тоацшіайоп ої іпаисіріе совіїтиціаг ехргезвіоп оп раїепі Т сеїЇІв", Сііп Сапсег Нев., 16(13); 3485-94 (2010)); і раком передміхурової залози, що мають збільшену абсолютну кількість циркулюючих і інфільтруючих пухлину СЮ4чСОЄ: ії СО894СО5-Т-клітин після лікування іпілімумабом, мають значно кращі пов'язані з лікуванням наслідками, ніж пацієнти, в яких спостерігали невелике збільшення або відсутність збільшення. Важливо, показано, що іпілімумаб змінює співвідношення ІСО5-Т ефекторні: Трег, обертаючи перевагу Трег до лікування в значну перевагу
Т ефекторних у порівнянні з Трег після лікування (І іаКои СІ еї аї., "СТІ А-4 ріосКаде іпстеазевз ІЕМ- датт ргодисіпд СО4-4СО5пі клітини їо 5пй гайо ої епесіог То гедшайгу Т клітини іп сапсег раїепів", Ргос Маї! Асай 5сі ОБА. 105(39); 14987-92 (2008)) і (Мопаетпеїде ВН еї аї., Сіїп Сапсег
Вев., 16(13); 3485-94 (2010)). Таким чином, позитивні по ІСО5 ефекторні Т-клітини є позитивним прогностичним біомаркером відповіді на іпілімумаб, який вказує на потенційну перевагу активації цієї популяції клітин з використанням антитіла-агоніста ІСО5.
Таким чином, існує необхідність у додаткових молекулах, що індукують проліферацію Т- клітин, для лікування злоякісних пухлин.
СУТЬ ВИНАХОДУ
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих СО білків або їх антигензв'язуючих частин, що містять одне або декілька з: СОКНІ, як вказано в 5ЕО ІЮО МО:1;
СОРНЕ, як вказано в ЗЕО І МО:2; СОРНЗ, як вказано в 5ЕО ІЮО МО:3; СОБІ 1, як вказано в ЗЕО
ІЮ МО:4; СОКІ2, як вказано в 5ЕО ІО МО:5 та/або СОБІ З, як вказано в 5ЕО ІО МО:6, або прямого еквіваленту кожної СОК, де прямий еквівалент має не більше двох амінокислотних
Зо замін у вказаній СОК.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих ІЇСО5 білків їх або їх антигензв'язуючих частин, що специфічно зв'язуються з ІСО5 людини, де вказаний зв'язуючий
ЇСО5 білок містить домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній в 560 ІЮ МО:7, та/або домен Мі, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у 5ЕО ІО МО:8.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується гуманізованих моноклональних антитіл або їх антигензв'язуючих частин, що містять СОК важкого ланцюга, які мають амінокислотні послідовності, вказані в ЗЕО ІЮ МО:1; 5ЗЕО ІЮ МО:2; ії ЗЕО ІЮО МО:3, і СОК легкого ланцюга, які мають амінокислотні послідовності, вказані в ЗЕО ІЮ МО:4; 5ЕО ІЮО МО:5; і ЗЕО ІЮ
МО:6. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується гуманізованих моноклональних антитіл, що містять каркас пІде4РЕ; домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЗЕО ІО МО:7; і домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, вказану в ЗЕО ІЮ
МО:8. Антитіла за даним винаходом можуть стимулювати продукцію цитокінів при контакті з Т- клітинами.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих ІСОБЗ білків, що конкурують за зв'язування з ІСО5 людини з будь-яким із зв'язуючих ЇСО5 білків або з їх антигензв'язуючими частинами за винаходом.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів лікування злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису з використанням зв'язуючого ІСО5 білка або фармацевтичної композиції, що містить щонайменше один зв'язуючий ІСО5 білок за даним винаходом.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
Фігура 1: Продукція ІЕМ-у СО4-С025-Т-клітинами.
Фігура 2: Проліферація СО4-С025-Т-клітин.
Фігура 3: Для гуманізованого варіанту Н2ІГ 5 антитіла проти ІСО5 422.2 показана краща продукція цитокінів у клітинах РВМО.
Фігура 4: 422 Н2І 5 ІДОС1 індукувало зменшену життєздатність Т-клітин, чого не спостерігали для ізотипу з інактивованим Ес або ізотипу пІдДСАРЕ.
Фігура 5: Залежна від дози відповідь індукованої Н2І 5 пІдС4РЕ індукції прозапальних цитокінів у СЮО4--Т-клітинах людини.
Фігура 6: Н2І 5 пІдДС4 РЕ індукує проліферацію, продукцію цитокінів і збільшує цитотоксичний потенціал в активованих РВМС від здорових донорів-людей.
Фігура 7: Аналіз Мезо 5саіе біхсомегу (М50), що показує інгібування зв'язування ІСО5-Ї з
ІСО5 за допомогою Н2І 5 пІдС4РЕ, що показує, що воно зв'язується з тим же самим епітопом на
ІСО5, що і ІСО5-Ї, і конкурує за зв'язування.
Фігура 8: Виділені гени Мн і Мі антитіла з РНК клона гібридоми 422.2.
Фігура 9: Білкові послідовності важких і легких ланцюгів Н2І 5 пІдСаАРЕ із сигнальною послідовністю.
Фігура 10: послідовність ДНК кодуючої ділянки важкого ланцюга Н2І5 пІдДСа4РЕ із сигнальною послідовністю.
Фігура 11: послідовність ДНК кодуючої ділянки легкого ланцюга Н2І 5 пІдДС4РЕ із сигнальною послідовністю.
Фігура 12: Концентрації Н2І 5 пІдС4РЕ в плазмі яванських макак. Концентрації визначали після (А) першої або (В) другої дози (доба 15) Н2І 5 пІдсС4РЕ. Тварин умертвляли через 48 годин після другої дози для збору зразків тканини і гістопатологічного аналізу.
Фігура 13: Детекція зв'язування Н2гІ 5 пІдДСАРЕ з СО4Т-клітинами із селезінки і пахвових лімфатичних вузлів мавп. Тканину збирали через 48 годин після другої дози (доба 17).
Фігура 14: Зайнятість рецепторів Н2І 5 пІдДО4РЕ в СО44Т-клітинах крові яванських макак. (А) "Вільний рецептор" ІСО5, як виміряне за позитивним зв'язуванням флуоресцентно міченого антитіла проти ІСО5, використаного для проточної цитометрії, яке зв'язується, лише коли Н2І 5 пІдСАРЕ не присутній. (В) Рецептор, зв'язаний з Н2І 5 пІдДСаАРЕ на Ср клітинах периферичної крові, як виміряне за флуоресцентно міченим антитілом проти Їдсї людини.
Фігура 15 (а) Рівні експресії фосфо-АКТ (1308) у клітинах Ва/Е3-ІСО5, оброблених Н2І5 пПасаРЕ - Масив антитіл для внутрішньоклітинної передачі сигналів (Б) Рівні експресії фосфо-
АКТ (5473) у клітинах Ва/Е3-ІСО5, оброблених Н2І15 ПІдДС4РЕ - Масив антитіл для внутрішньоклітинної передачі сигналів.
Зо Фігура 16: Н2І 5 пІдО4РЕ в комбінації з іпілімумабом приводить до збільшеної продукції прозапальних цитокінів у порівнянні з обробкою одиночним антитілом в аналізі попередньої стимуляції РВМО.
Фігура 17: Н2І 5 пІдДСАРЕ в комбінації з пембролізумабом приводить до збільшеної продукції прозапальних цитокінів у порівнянні з лікуванням одиночним антитілом в аналізі попередньої стимуляції РВМО.
Фігура 18: Комбінація Н2І/5 пІде4РЕ плюс іпілімумаб індукує збільшену продукцію прозапальних цитокінів у модифікованому аналізі МІК з використанням пептиду СЕНТ і попередній інкубації.
Фігура 19: Комбінація Н2І5 пІдДС4РЕ плюс пембролізумаб індукує збільшену продукцію прозапальних цитокінів у модифікованому аналізі МІК з використанням пептиду СЕНТ і попередньої інкубації.
Фігура 20: Агоністичне тАр проти ІСО5 Н2І5 ПІдсС4РЕ окремо і в комбінації з пембролізумабом приводить до інгібування зростання пухлин у моделі пухлини меланоми
РВМС А2058 людини на мишах.
Фігура 21: Мишаче сурогатне тАБб проти ІСО5 приводить до значного інгібування зростання пухлин і збільшеної виживаності в комбінації з мишачим сурогатним тАр проти РО1 у моделі пухлини СТ26 на мишах.
Фігура 22: Мишаче сурогатне тАб проти ІСО5 приводить до значного інгібування зростання пухлин і збільшеної виживаності в комбінації з мишачим сурогатним тАбр проти РОТ в моделі пухлини ЕМТ6 на мишах.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
ВИЗНАЧЕННЯ
У рамках винаходу "ІСО5" означає будь-який індукований костимулюючий Т-клітини білок.
Інші позначення для ІСО5 (Іпдисібіе Т-сеїї СОБітиаг (індукований костимулятор Т-клітин)) включають АЇШІМ; СО278; СМІО1, УТТ-1 або 9ТТ-2, МОС39850, або 8Е4. ІСО5 являє собою костимулюючу молекулу суперсімейства СО28, яка експресується на активованих Т-клітинах.
Білок, що кодується цим геном, належить до сімейства рецепторів поверхні клітин СО28 і СТІ А- 4. Він формує гомодимери і грає важливу роль у передачі сигналів клітина-клітина, імунних відповідях, і регуляції проліферації клітин. Амінокислотна послідовність ІСО5 людини показана 60 нижче як ЗЕО ІЮ МО:10.
МКБИїгммУЕНІ ЕС ВІКМ ТаЄІМаЗАМУМЕМЕЕНМИаСМОП СКМРОЇМООРКМОГ ГКасОП СО т кКтКазамтувіІКвІ КЕСНБЗОЇ ЗММЗУЗЕРІ УМ ОНЗНАМУМЕСМІ ЗІЄОРРРЕКМТІ ТИС НІМЕЗОЇ.
ССОЇ КРММІ РІАЇСААЕМУМСТаст ІСІ ТкККМ (5ЕО ІО МО:10)
У рамках винаходу "ІСО5-Ї" ії "ліганд ІСО5" використовують взаємозамінно, і вони стосуються зв'язаного з мембраною природного ліганду ІСО5 людини. Ліганд ІСО5 являє собою білок, що кодується у людини геном ІСО5І с. ІСО5І б позначають також як СО275 (кластер диференціювання 275). Інші позначення для ІСО5-Ї. включають В7КР-1 і В7-Н2.
У рамках винаходу термін "агоніст" стосується антигензв'язуючого білка, наприклад, зв'язуючого ІЇСО5 білка, який при контакті з ІСО5 викликає одне або декілька з наступного (1) стимулює або активує рецептор ІСО5, (2) підсилює, збільшує або стимулює, індукує або подовжує активність, функцію або присутність ЇСО5 та/або (3) підсилює, збільшує, стимулює або індукує експресію ІСО5. Агоністичну активність можна вимірювати іп міго за допомогою різних аналізів, відомих у даній галузі, таких як, але без обмеження, вимір передачі сигналів у клітинах, проліферації клітин, маркерів активації імуноцитів, продукції цитокінів. Агоністичну активність можна також вимірювати іп мімо за допомогою різних аналізів, що вимірюють сурогатні кінцеві точки, таких як, але без обмеження, вимір проліферації Т-клітин або продукції цитокінів.
У рамках винаходу, термін "перехресна конкуренція за зв'язування" стосується будь-якого зв'язуючого ІЇСО5 білка, який може конкурувати за зв'язування з ІСО5 з будь-яким із зв'язуючих
ЇСО5 білків за даним винаходом. Конкуренцію за зв'язування з ІСО5 між двома молекулами можна тестувати різними способами, відомими в даній галузі, включаючи проточну цитометрію,
Мезо 5саїе Різсомегу і ЕГІЗА. Зв'язування можна вимірювати безпосередньо, що означає, що два або більше зв'язуючих білка можна приводити в контакт з ІСО5, і зв'язування можна вимірювати для одного або для кожного. Альтернативно, можна тестувати зв'язування молекули, що представляє інтерес, проти зв'язування природного ліганду і кількісно порівнювати один з одним.
Термін "зв'язуючий ІСО5 білок", у рамках винаходу, стосується антитіл та інших білкових конструкцій, таких як домени, здатних зв'язувати ІСО5. У деяких випадках, ІСО5 являє собою
ІСОЗ людини. Термін "зв'язуючий ІСОБ5 білок" можна використовувати взаємозамінно з "антигензв'язуючий білок для ІСО5". Таким чином, як відомо в даній галузі, антитіла проти ІСО5 та/або антигензв'язуючі білок для ІСО5 розглядають як зв'язуючі ІСО5 білки. У рамках винаходу, "антигензв'язуючий білок" являє собою будь-який білок, включаючи, але без обмеження, антитіла, домени та інші конструкції, описані в даному документі, які зв'язуються з антигеном, таким як ІЇСО5. У рамках винаходу, "антигензв'язуюча частина" зв'язуючого ІСО5 білка може включати будь-яку частину зв'язуючого ІЇСО5 білка, здатну зв'язувати ІСО5, включаючи, але без обмеження, антигензв'язуючий фрагмент антитіла.
Термін "антитіло" використовують у даному описі в найширшому сенсі для позначення молекул з імуноглобуліноподібним доменом (наприклад, ІдсС, ЯМ, ДА, дО або І9Е), ії він включає моноклональні, рекомбінантні, поліклональні, химерні, людські, гуманізовані, мультиспецифічні антитіла, включаючи біспецифічні антитіла, і гетерокон'юговані антитіла; антитіло з одиночним варіабельним доменом (наприклад, Мн, Мнн, МІ. (аАБ"М)), антигензв'язуючі фрагменти антитіл, Раю, К(аб')», Ем, зв'язані дисульфідними зв'язками Ем, одноланцюжкові Ем, зв'язані дисульфідними зв'язками 5сЕм, діатіла, ТАМОАВО"М і тощо і модифіковані варіанти будь-якого з вищезгаданого.
Альтернативні формати антитіл включають альтернативні каркаси, в яких один або декілька
СОК антигензв'язуючого білка можуть бути аранжовані у придатному каркасі або кістяку білка, що не належить до імуноглобулінів, такого як афітіло, каркас 5рА, домен рецептора І ОЇ. класу
А, авімер або домен ЕСЕ.
Термін "домен" стосується згорнутої білкової структури, яка зберігає свою третинну структуру незалежно від останньої частини білка. Як правило, домени є відповідальними за окремі функціональні властивості білків, і у багатьох випадках їх можна додавати, видаляти або переносити в інші білки без втрати функції решти білка та/або домену.
Термін "одиночний варіабельний домен" стосується згорнутого поліпептидного домену, що містить послідовності, характерні для варіабельних доменів антитіл. Таким чином, він включає повні варіабельні домени антитіл, такі як Мн, Мнн і Мі, і модифіковані варіабельні домени антитіл, наприклад, домени, в яких одна або декілька петель замінені послідовностями, не характерними для варіабельних доменів антитіл, або варіабельні домени антитіл, які були укорочені або містять М- або С-кінцеві подовження, так само як згорнуті фрагменти варіабельних доменів, які зберігають щонайменше активність і специфічність зв'язування бо повнорозмірного домену. Одиночний варіабельний домен є здатним зв'язувати антиген або епітоп незалежно від іншої варіабельної ділянки або домену. "Доменне антитіло" або "аЗАБсТМм» можна розглядати так само, як "одиночний варіабельний домен". Одиночний варіабельний домен може являти собою людський одиночний варіабельний домен, але також включає одиночні варіабельні домени з інших видів, таких гризуни, акула-нянька і Мнн даАБ"М верблюжих.
Мнн верблюжих являють собою поліпептиди одиночного варіабельного домену імуноглобулінів, отримані з видів, включаючи верблюда, ламу, альпаку, дромадера і гуанако, які продукують важкий ланцюг антитіла, природним чином позбавлений легких ланцюгів. Такі домени Мнн можна гуманізувати відповідно до стандартних способів, доступних у даній галузі, і такі домени розглядають як такі, що є "одиночними варіабельними доменами". У рамках винаходу Мн включає домени Мнн верблюжих.
Антигензв'язуючий фрагмент можна надавати за допомогою способів аранжування однієї або декількох СОР. у білкових кістяків, що не відносяться до антитіл. "Білковий кістяк", у рамках винаходу, включає, без обмеження, імуноглобуліновий (Ід) кістяк, наприклад, кістяк ЇдДс, який може являти собою антитіло з чотирьох ланцюгів або двох ланцюгів, або який може містити лише ділянку Ес антитіла, або який може містити одну або декілька константних ділянок антитіла, де константні ділянки можуть походити з людини або приматів, або який може являти собою штучну химеру константних ділянок людини і примату.
Білковий кістяк може являти собою кістяк Ід, наприклад, кістяк дО або кістяк ІдА. Кістяк Ї|ДО може містити деякі або всі домени антитіла (тобто СНІ, СН2, СНЗ, Мн, Му). Антигензв'язуючий білок може містити кістяк до, вибраний з Ідс1, Ід52, Ід3, ІД04 або ІдДС4РЕ. Наприклад, кістяк може являти собою Ідс1. Кістяк може складатися з ділянки Ес антитіла або містити її, або бути її частиною.
Білковий кістяк може являти собою похідне кістяка, вибраного з групи, що складається з
СТІ А-4, ліпокаліну, отриманих з білка молекул, таких як 2-домен білка (Айіроау, 5рА), А-домен (Амітег/Махібоду); білки теплового шоку, такі як ОГОоЕ! і СгоЕ5; трансферин (транс-антитіло); білок з анкіриновим повтором (САКРіп); пептидний аптамер; лектиновий домен С-типу (тетранектин); у-кристалін людини та убіквітин людини (афіліни); домени РО; токсин скорпіона, домени інгібіторів протеази людини типу доменів Куниця; і фібронектин/аднектин; які піддавали модифікації білка, аби отримати зв'язування з антигеном, таким як ІСО5, відмінним від
Зо природного ліганду.
Антигензв'язуюча ділянка стосується ділянки антигензв'язуючого білка, здатного специфічно зв'язувати антиген, який може являти собою одиночний варіабельний домен, або може являти собою спарені домени Мн/Мі, як можна виявити в стандартному антитілі. Одноланцюжкові домени Ем (ЗсЕм) можуть також надавати антигензв'язуючі ділянки. Термін "епітопзв'язуючий домен" стосується домену, який специфічно зв'язується з ділянкою антигена, відомою, як епітоп, незалежно від іншого домену.
Термін мультиспецифічний антигензв'язуючий білок стосується антигензв'язуючих білків, що містять щонайменше дві різні антигензв'язуючі ділянки. Кожна з цих антигензв'язуючих ділянок здатна зв'язуватися з різним епітопом, який може бути присутній на одному і тому ж антигені або на різних антигенах. Мультиспецифічний антигензв'язуючий білок може мати специфічність для більше, ніж одного антигена, наприклад, для двох антигенів або для трьох антигенів, або для чотирьох антигенів.
Приклади мультиспецифічних антигензв'язуючих білків включають білки, які складаються, або в основному складаються з ділянки Ес антитіла, або її частини, зв'язаної з кожного кінця, безпосередньо або опосередковано (наприклад, через лінкерну послідовність), із зв'язуючим доменом. Такий антигензв'язуючий білок може містити два зв'язуючих домени, розділені ділянкою Ес, або її частиною. Під розділенням розуміють, що зв'язуючі домени не зв'язані безпосередньо один з одним, і можуть бути локалізовані на протилежних кінцях (С- і М-кінці) ділянки Ес, або будь-якої іншої каркасної ділянки.
Антигензв'язуючий білок може містити дві каркасні ділянки, де кожна зв'язана з двома зв'язуючими доменами, наприклад, на М- ії С-кінці кожної каркасної ділянки, або безпосередньо, або опосередковано через лінкер. Кожен зв'язуючий домен може зв'язуватися з різним антигеном.
У рамках винаходу, термін тАБрадАр стосується моноклонального антитіла, зв'язаного з додатковим зв'язуючим доменом, зокрема, одиночним варіабельним доменом, таким як доменне антитіло. тАрадюЬ має щонайменше дві антигензв'язуючі ділянки, щонайменше одна з яких походить з доменного антитіла, і щонайменше одна походить із спареного домену Мн/мі. "Кон'югат ЯЗАБ'М' стосується композиції, що містить ЯАБ, з яким лікарський засіб хімічно кон'юЮгований за допомогою ковалентного або нековалентного зв'язку. Переважно, АБ і бо лікарський засіб зв'язані ковалентно. Таке ковалентне зв'язування можна проводити через пептидний зв'язок або іншими способами, наприклад, через модифікований бічний зв'язок.
Нековалентне зв'язування може бути безпосереднім (наприклад, електростатична взаємодія, гідрофобна взаємодія) або опосередкованим (наприклад, через нековалентне зв'язування комплементарних партнерів за зв'язуванням (наприклад, біотину та авідину), де один партнер ковалентно зв'язаний з лікарським засобом, і комплементарний партнер за зв'язуванням ковалентно зв'язаний з аАБ'М). Коли використовують комплементарних партнерів за зв'язуванням, один з партнерів за зв'язуванням може бути ковалентно зв'язаним з лікарським засобом безпосередньо або за допомогою відповідної лінкерної групи, і комплементарний партнер за зв'язуванням може бути ковалентно зв'язаним з ЯАБ'М безпосередньо або за допомогою відповідної лінкерної групи.
У рамках винаходу, "злитий з ЗАБ'М білок" стосується злитого білка, який містить аАБ'"М і поліпептидний лікарський засіб (який може являти собою а(АБ'М або тАБ) алдьмі поліпептидний лікарський засіб присутні як окремі частини (груп) одного безперервного поліпептидного ланцюга.
У одному варіанті здійснення, антигензв'язуючі білки за даним описом проявляють перехресну реакційну здатність між ІСО5 людини і ІСО5 з інших видів, таких як ІСО5 яванського макака. В одному варіанті здійснення, антигензв'язуючі білки за винаходом специфічно зв'язують ІЇСО5 людини і яванського макака. Надання лікарського засобу, який може зв'язувати молекули людини і мавп, дозволяє тестувати результати в цій системі і проводити паралельне порівняння даних з використанням одного і того ж лікарського засобу.
Передбачають перехресну реакційну здатність між іншими видами, використовуваними в моделях захворювання, такими як собака або мавпа, особливо мавпа.
Конкуренцію між зв'язуючим ІСОЗ5 білком і еталонним зв'язуючим ІЇСО5 білком можна визначати за допомогою аналізу конкуренції М5О, ЕГІ5А, ЕМАТ або ВіАсоге. В одному варіанті здійснення, аналіз конкуренції проводять за допомогою порівняння зв'язування зв'язуючого
ЇІСО5 білка із зв'язуванням ліганду ІСО5. Існує декілька можливих причин для цієї конкуренції: два білки можуть зв'язувати однакові або перекривні епітопи, може бути присутнім стеричне інгібування, або зв'язування першого білка може індукувати конформаційну зміну антигена, яка запобігає або зменшує зв'язування другого білка.
Зо Термін "нейтралізує", як використовують впродовж даного опису, означає, що взаємодія між
ІСОЗ5 і ІСО5-Ї зменшена у присутності антигензв'язуючого білка, як описано в даному описі, в порівнянні із взаємодією ІСОЗ і ІСО5-Ї. у відсутність зв'язуючого ІСО5 білка, іп міїго або іп мімо.
Нейтралізація може відбуватися через одного або декількох з блокування зв'язування ІСО5 з його лігандом, запобігання активації ІСО5 за допомогою його ліганду, що знижує регуляції ІСО5 або його рецептора, або впливу на функціональність ефектора. Наприклад, конкуренцію з лігандом за зв'язування, описану в прикладах З і 5, можна використовувати для оцінювання нейтралізуючої здатності зв'язуючого ІСО5 білка.
Ефект зв'язуючого ІСО5 білка на взаємодію між ІСО5 і ІСО5-Ї може бути частковим або повним. Нейтралізація зв'язуючого ІСОЗ білка може блокувати взаємодію ІСОЗ з ІСО5-Ї. щонайменше на 20 то, ЗО о 40 то, 50 Зо, 55 9о, 6о0 то, 65 то, 70 Зо, 75 9о, 80 то, 82 то, 84 то, 86 то, 88 оо, 90 95, 92 Фо, 94 о, 95 Ус, 96 о, 97 95, 98 У, 99 95 або 100 95 відносно взаємодій ІСО5-ІСО5-
І у відсутність зв'язуючого ІСО5 білка.
Нейтралізацію можна визначати або вимірювати з використанням одного або декількох аналізів, як відомо фахівцеві в даній галузі або як описано в даному описі.
Афінність являє собою силу зв'язування однієї молекули, наприклад, антигензв'язуючого білка за винаходом, з іншим, наприклад, його антигеном-мішенню, в одній ділянці зв'язування.
Афінність зв'язування антигензв'язуючого білка з його мішенню можна визначати за допомогою способів на підставі рівноваги (наприклад, твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІ5А) або радіоімунного аналізу (КІА)) або аналізу кінетики (наприклад, аналізу ВІАСОВБЕ"М).
Наприклад, способи ВІАСОБЕ"М, описані в прикладі 5, можна використовувати для виміру афінності зв'язування.
Авідність являє собою загальну суму сили зв'язування двох молекул одна з одною у багатьох ділянках, наприклад, зважаючи на валентність взаємодії.
У одному варіанті здійснення, рівноважна константа дисоціації (КО) взаємодії зв'язуючий
ІСО5 білок-ІСО5 складає 100 нМ або менше, 10 нМ або менше, 2 нМ або менше або 1 нМ або менше. Альтернативно, КО може складати між 5 і 10 нМ; або між 1 і 2 нм. КО може складати між 1 пМ ї 500 пМ; або між 500 пМ і 1 нМ. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що чим менше числове значення КО, тим сильніше зв'язування. Зворотна величина КО (тобто 1/КО) являє собою рівноважну константу зв'язування (КА), що має одиниці М-. Фахівцеві в даній галузі бо зрозуміло, що чим більше числове значення КА, тим сильніше зв'язування.
Константа швидкості дисоціації (Ка) або "швидкість дисоціації" описує стабільність комплексу зв'язуючого ІСО5 білка з ІСО5, тобто долю комплексів, що розпадаються за секунду.
Наприклад, Ка 0,01 с" еквівалентне 1 95 комплексів, що розпадаються за секунду. В одному варіанті здійснення, константа швидкості дисоціації (ка) складає 1х103 с" або менше, 1х1074 с" або менше, 1х105 с! або менше, або 1х109 с! або менше. Ка може складати між 1х105 с" і 1х1024 с; або між 1х104 с! ї 1х103 сл. Константа швидкості зв'язування (Ка) або "швидкість зв'язування" описує швидкість формування комплексу зв'язуючий ІСО5 білок-ІСО5. В одному варіанті здійснення, константа швидкості зв'язування (Ка) складає приблизно 1,0х105 М" с".
Під "виділеною" мають на увазі, що молекула, така як антигензв'язуючий білок або нуклеїнова кислота, видалена з оточення, в якому її можна виявити в природі. Наприклад, молекула може бути очищеною від речовин, з якими вона в нормі може існувати в природі.
Наприклад, маса молекули в зразку може складати 95 95 від сумарної маси.
Термін "експресуючий вектор", у рамках винаходу, означає виділену нуклеїнову кислоту, яку можна використовувати для введення нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у клітину, таку як еукаріотична клітина або прокаріотична клітина, або в безклітинну експресуючу систему, де послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, експресують у формі пептидного ланцюга, такий як білок. Такі експресуючі вектори можуть являти собою, наприклад, косміди, плазміди, вірусні послідовності, транспозони і лінійні нуклеїнові кислоти, що містять нуклеїнову кислоту, яка представляє інтерес. Після введення експресуючого вектора в клітину або в безклітинну експресуючу систему (наприклад, лізат ретикулоцитів), білок кодований нуклесовою кислотою, що становить інтерес, продукується за допомогою апарату транскрипції/трансляції. Експресуючі вектори в обсягу опису можуть надавати необхідні елементи для еукаріотичної або прокаріотичної експресії і включають вектори, керовані вірусним промотором, такі як вектори, керовані промотором СМУ, наприклад, рсоОМАЗ.1, рСЕРА, та їх похідні, бакуловірусні експресуючі вектори, експресуючі вектори для Огозорпіїа, і експресуючі вектори, керовані промоторами генів ссавців, такими як промотори генів Ід людини.
Інші приклади включають прокаріотичні експресуючі вектори, такі як вектори, керовані промотором 17, наприклад, рЕТА41, вектори, керовані промотором лактози, і вектори, керовані промотором арабінози. Фахівцеві в даній галузі відомо багато інших придатних експресуючих
Зо векторів і експресуючих систем.
Термін "рекомбінантна клітина-господар", у рамках винаходу, означає клітину, яка містить послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, яка була виділена перед її введенням у клітину. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, може знаходитися в експресуючому векторі, тоді як клітина може бути прокаріотичною або еукаріотичною. Ілюстративні еукаріотичні клітини являють собою клітини ссавців, такі як, але без обмеження, клітини СО5-1, 2О5-7, НЕК293, ВНК21, СНО, В5О-1, Нераог, 653, 5Р2/0, М50, 293, НеГа, мієломи, лімфоми або будь-яку їх похідну. Найпереважніше, еукаріотична клітина являє собою клітину НЕК293, М5О, 5Р2/О або СНО. БЕ. соїї являє собою ілюстративну прокаріотичну клітину. Рекомбінантну клітину, відповідно до опису, можна отримувати за допомогою трансфекції, злиття клітин, іморталізації або інших способів, добре відомих у даній галузі. Послідовність нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, така як експресуючий вектор, трансфікований у клітину, може бути позахромосомною або стабільно інтегрованою у хоромосому клітини. "Химерне антитіло" стосується типу сконструйованого антитіла, яке містить природні варіабельні ділянки (легсого ланцюга і важкого ланцюга), отримані з донорного антитіла в асоціації з константними ділянками легкого і важкого ланцюга, отриманими з акцепторного антитіла. "Гуманізоване антитіло" стосується типу сконструйованого антитіла, що має СОК, отриманими з донорного імуноглобуліну, що не стосується людини, де отримані з імуноглобулінів частини молекули, що залишилися, отримані з одного або декількох людського імуноглобуліну(імуноглобулінів). Крім того, каркасні підтримувальні залишки можна змінювати для збереження афінності зв'язування (див., наприклад, Оцееп еї аїЇ. Ргос. Маї! Асай 5сі О5А, 86:110029-10032 (1989), Нодозоп, єї аї., Віо/ГТесппоіоду, 9:421 (1991)). Придатне людське акцепторне антитіло може являти собою антитіло, вибране із загальноприйнятої бази даних, наприклад, бази даних КАВАТ", бази даних І о5 Аіатоз і бази даних бм/із5 Ргоївїп, по гомології з нуклеотидними та амінокислотними послідовностями донорного антитіла. Людське антитіло, що характеризується гомологією з каркасними ділянками донорного антитіла (на підставі амінокислот), може бути придатним для надання константної ділянки важкого ланцюга та/або каркасної ділянки варіабельної частини важкого ланцюга для вставки донорних СОВ. Придатне бо акцепторне антитіло, здатне надавати константну ділянку або каркасні ділянки варіабельної частини легкого ланцюга, можна вибирати схожим чином. Слід зазначити, що важкі і легкі ланцюги акцепторного антитіла не обов'язково повинні походити з одного і того ж акцепторного антитіла. У попередній галузі техніки описано декілька способів отримання таких гуманізованих антитіл - див., наприклад, ЕР-А-0239400 і ЕР-А-054951.
Термін "повністю людське антитіло" включає антитіла, що мають варіабельні і константні ділянки (якщо присутні), отримані з людських зародкових послідовностей імуноглобулінів.
Людські послідовності антитіл за винаходом можуть включати амінокислотні залишки, не кодовані людськими зародковими послідовностями імуноглобулінів (наприклад, мутації, введені за допомогою випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або за допомогою соматичних мутацій іп мімо). Повністю людські антитіла містять амінокислотні послідовності, кодовані лише за допомогою полінуклеотидів, що зрештою мають людське походження, або амінокислотні послідовності, ідентичні таким послідовностям. Як розуміють у рамках винаходу, антитіла, кодовані ДНК, що кодує людські імуноглобуліни, вставленою в мишачий геном, продуковані в трансгенній миші, є повністю людськими антитілами, оскільки вони кодовані ДНК, що зрештою має людське походження. У цій ситуації, ДНК, що кодує людські імуноглобуліни, може піддаватися реаранжуванню (для кодування антитіла) в організмі миші, і можуть відбуватися також соматичні мутації. Антитіла, кодовані початково людською ДНК, піддані таким змінам в організмі миші, є повністю людськими антитілами, як розуміють у рамках винаходу.
Застосування таких трансгенних мишей забезпечує можливість відбору повністю людських антитіл проти антигена людини. Як розуміють у даній галузі, повністю людські антитіла можна отримувати з використанням технології фагового дисплея, де бібліотеку ДНК людини вставляють у фаг для отримання антитіл, що містять людську зародкову послідовність ДНК.
Термін "донорне антитіло" стосується антитіла, що вносить вклад амінокислотних послідовностей своїх варіабельних ділянок, СОК або інших функціональних фрагментів або їх аналогів у першого імуноглобулінового партнера. Донор, таким чином, забезпечує змінену кодуючу ділянку імуноглобуліну, і в результаті експресується змінене антитіло з антигенною специфічністю і нейтралізуючою активністю, характерною для донорного антитіла.
Термін "акцепторне антитіло" стосується антитіла, гетерологічного по відношенню до донорного антитіла, що вносить вклад усіх (або будь-якої частини) амінокислотних послідовностей, що кодують каркасні ділянки свого важкого та/або легкого ланцюга та/або константні ділянки свого важкого та/або легкого ланцюга, в першого імуноглобулінового партнера. Людське антитіло може бути акцепторним антитілом.
Терміни "Мнеі "Мі" використовують у даному описі для позначення варіабельної ділянки важкого ланцюга і варіабельної ділянки легкого ланцюга, відповідно, антигензв'язуючого білка. "СОК" визначають як амінокислотні послідовності ділянок антигензв'язуючого білка, що визначають комплементарність. Існують гіперваріабельні ділянки важких і легких ланцюгів імуноглобулінів. Існує три СОЕ (або ділянки СОК) важкого ланцюга і три СОК (або ділянки СОК) легкого ланцюга у варіабельній частині імуноглобуліну. Таким чином, "СОК", у рамках винаходу, стосується всіх трьох СОК важкого ланцюга, всіх трьох СОК легкого ланцюга, всіх СОК важкого і легкого ланцюга, або щонайменше двох СОН.
Впродовж цього опису, амінокислотні залишки в послідовностях варіабельних доменів і в послідовностях повнорозмірних антитіл пронумеровані відповідно до системи нумерації Кабаї.
Так само, терміни "СОР", "СОКІ 1", "СОМІ2", "СО 3", "СОоКНІ", "сСОКН2г", "СОКНнЗ", використовувані в прикладах, відповідають системі нумерації Кабраї. Додаткову інформацію див. у Кабаї єї а!., ЗХедоепсез ої Ргоївіпв ої Іттипоіодісаї! Іпіегеві, Бій Еа., 0.5. Оерайтепі ої Неайй і
Нитап Зегуісев, Маїйопаї! Іпвійшевз ої Неайнй (1991).
Фахівцеві в даній галузі вочевидь, що існують альтернативні системи нумерації для амінокислотних залишків у послідовностях варіабельних доменів і в послідовностях повнорозмірних антитіл. Існують також альтернативні системи нумерації для послідовностей
СОК, наприклад, системи, описані в СПпоїпіа єї аії. (1989) Маїште 342: 877-883. Структура і згортання білка антитіла можуть означати, що інші залишки слід розглядати як частину послідовності СОК, і наявність цього може зрозуміти фахівець у даній галузі.
Інші системи нумерації для послідовностей СОК, доступні фахівцеві в даній галузі, включають спосіб "АБМ" (Опімегейу ої Ва) і "контактний" спосіб (Опімегейу СоПеде І опаоп).
Мінімальну перекривну ділянку з використанням щонайменше двох із способів Кабаї, Споїйіа,
АрМ і контактного способу, можна визначати як таку, що подає "мінімальну одиницю зв'язування". Мінімальна одиниця зв'язування може бути субфрагментом СОК.
У таблиці 1 нижче представлено одне визначення з використанням кожної системи нумерації для кожної СОК або одиниці зв'язування. Схема нумерації Караї використана в бо таблиці 1 для нумерації домен амінокислотної послідовності варіабельного домену. Слід зазначити, що деякі з визначень СОК можуть мінятися залежно від індивідуальних використаних публікацій.
Таблиця 1
Мінімальна
СО за Кабаї СО за СНоїніа СО за АбМ Контактна СОК одиниця зв'язування
Відповідно, представлені зв'язуючі ІСО5 білки, що містять будь-яку одну або комбінацію з наступних СОВ:
СОВНІ: ОМАМН (5ЕО ІО МО-1) совно: ПЗІУ5ОНТМУМОКРЕОС (ЗЕО ІЮ МО:2)
СОоВвНнЗ: МММОамм(аУЕом (5ЕО ІЮ МО: 3)
СОВІ: ЗАБЗОУМЗУМН (ЗЕО ІО МО:4)
СОВІ2: ОТ5КІ АБ (5ЕО І МО:5)
СОВІЗ: ЕОСБаИахуРМТ (5ЕО ІЮ МО:6)
У одному варіанті здійснення даного винаходу зв'язуючий ІСО5 білок містить СОВНІ (ЗЕО
ІО МО), СОВН2 (ЗЕО ІЮ МО:2) і СОВНЗ (5ЕО ІО МО З) у варіабельній ділянці важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮО МО/:7. Зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом, що містять гуманізовану варіабельну ділянку важкого ланцюга, вказану в 5ЕО І
МО:7, позначені як "Н2г". У деяких варіантах здійснення, зв'язуючі ІСОЄ5 білки за даним винаходом містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з 5260) 10 МО:7. Відповідним чином, зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом можуть містити варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має приблизно 85 95, 86 95, 87 95, 88 95, 89 95, 90 95, 91 95, 92 90, 93 о, 9495, 9595, 96 о, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з БЕО 1О МО:7.
Варіабельна ділянка (Мн) гуманізованого важкого ланцюга (Н2г):
ОМОГМОБОАЕ УМККРОаББЗУКМ 5СКАБОаМТЕТ ОМАМНУМАО РОСС ЕМУМаї ІБІМ5ОНТМУ
МОКРОСВАМТІ ТАОКЗТОЗТАМ МЕ! 551850 ТАУМУСавММ хамУусУМумерм усоаттУтУз5 5 (ЗЕО І МО77)
У одному варіанті здійснення даного винаходу зв'язуючий ІСО5 білок містить СОКІ 1 (ЗЕО
ІО МО:4), СОКІ 2 (ЗЕО ІЮО МО:5) і СОКІ З (ЗЕО ІО МО: 6) у варіабельній ділянці легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, вказану в ЗЕО ІЮ МО:8. Зв'язуючі ІСОЗ білки за даним винаходом, що містять гуманізовану варіабельну ділянку легкого ланцюга, вказану в ЗЕО ІЮ
МО:8, позначені як "15". Таким чином, зв'язуючий ІСО5 білок за даним винаходом, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга з 5ЕО ІЮ МО:7 і варіабельну ділянку легкого ланцюга з
ЗЕО ІЮ МО:8, можна позначати в даному описі як Н2І 5.
Відповідна лідерна послідовність для конструкцій варіабельного важкого ланцюга і легкого ланцюга показана на фігурі 9 і включає, але без обмеження: МОМ/ЗСІ РІ МАТАТОУНЗ5 (ЗЕО ІЮ
Коо) МО:11)
У деяких варіантах здійснення, зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в ЗЕО І МО:8. Відповідним чином, зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом можуть містити варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має приблизно 85 95, 86 95, 87 У, 88 9о, 89 9, 90 9о, 91 о, 92 95, 93 о, 94 90, 95 95, 96 95, 97 У, 98 905, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з ФЕО ІЮ МО:8.
Варіабельна ділянка (Мі) гуманізованого легкого ланцюга (І 5)
ЕІМІГТО5РАТ ІБІЗРОЕВАТ ІЗСБАБЗОЗОУ5 УМНУМУМООКРОа ОАРВИІМОТ КІ АБИІРАВ
ЕЗОаБИаБаТОМ ТІ ТІББ ЕРЕ ОРБЕАМУУСЕРОСІ БМРУТЕРООИ ТКІ ЕК (ЗЕО ІЮ МО:8)
СО або мінімальні одиниці зв'язування можна модифікувати за допомогою щонайменше однієї амінокислотної заміни, делеції або додавання, де варіант антигензв'язуючого білка в основному зберігає біологічні характеристики немодифікованого білка, такого як мишаче антитіло, продуковане з клону 422.2, або антитіло, що містить 5ЕО 10 МО:7 і 5ЕО І МО:8.
Слід розуміти, що кожну з СОК НІ, Н2, НЗ, 11, І2, 3 можна модифікувати окремо або в комбінації з будь-якою іншою СОК, в будь-якій пермутації або комбінації. В одному варіанті здійснення, СОК є модифікованою за допомогою заміни, делеції або додавання аж до З амінокислот, наприклад, 1 або 2 амінокислот, наприклад, 1 амінокислоти. Як правило, модифікація являє собою заміну, зокрема, консервативну заміну, наприклад, як показано в таблиці 2 нижче.
Таблиця 2 орієнтацію ланцюга
Наприклад, у варіанті СОВ, амінокислотні залишки мінімальної одиниці зв'язування можуть залишатися такими ж, але фланкуючі залишки, що містяться в СОВА як частини визначення(визначень) Караї або Споїпіа, можуть бути замінені на консервативний амінокислотний залишок.
Такі антигензв'язуючі білки, що містять модифіковані СОВ або мінімальні одиниці зв'язування, як описано вище, можна позначати в даному описі як "функціональні варіанти СОВ" або "функціональні варіанти одиниці зв'язування". Відповідним чином, в одному варіанті здійснення представлені зв'язуючі ІСО5 білки, що містять одну або декілька СОН, які мають амінокислотні послідовності, вказані в ФЕО ІЮ МО:1, 2, 3, 4, 5 та/або 6, та/"або функціональний варіант їх СОВ.
Термін "епітоп", у рамках винаходу, стосується тієї частини антигена, яка вступає в контакт з конкретним зв'язуючим доменом антигензв'язуючого білка. Епітоп може бути лінійним або конформаційним/не безперервним. Конформаційний або не безперервний епітоп містить амінокислотні залишки, розділені іншими послідовностями, тобто не в безперервній послідовності в первинній послідовності антигена. Хоча залишки можуть походити з різних ділянок пептидного ланцюга, вони знаходяться в тісному сусідстві в тривимірній структурі антигена. В разі мультимерних антигенів, конформаційний або не безперервний епітоп може включати залишки з різних пептидних ланцюгів. Конкретні залишки, що містяться в епітопі, можна визначати за допомогою програм для комп'ютерного моделювання або за допомогою тривимірних структур, отриманих способами, відомими в даній галузі, такими як рентгенівська кристалографія.
Зо СОВІТ, 12, 13, НІ ї Н2 проявляють тенденцію до структурного прояву однієї з обмеженої кількості конформацій основного ланцюга. Конкретний клас канонічної структури СОВ визначається як довжиною СОР, так і упаковкою петель, визначуваних залишками, локалізованими як в СОВ, так і в каркасних ділянках (такими, що визначають структуру залишками або 50). Мапіп апа ТНогпіоп (1996; 9 Мо! Віо! 263:800-815) розробили автоматизований спосіб для визначення канонічних матриць "ключових залишків". Кластерний аналіз використовують для визначення канонічних класів для наборів СОВ, і потім ідентифікують канонічні матриці за допомогою аналізу замаскованих гідрофобних, зв'язуючих водень залишків, і консервативних залишків гліцину і проліну. СОВ з послідовностей антитіла можна приписувати до канонічних класів за допомогою порівняння послідовностей з матрицями ключових залишків і оцінювання кожної матриці з використанням матриць ідентичності або схожості.
Може існувати безліч варіантів канонічних положень СОК для СОК, для відповідної СОК, для одиниці зв'язування, для варіабельної ділянки важкого або легкого ланцюга, для важкого або легкого ланцюга і для антигензв'язуючого білка, і таким чином, будь-яка комбінація замін може бути присутньою в антигензв'язуючому білку за винаходом, за умови, що зберігається канонічна структура СОК, так що антигензв'язуючий білок є здатним специфічно зв'язувати
ІСО5.
Як обговорюють вище, конкретний клас канонічної структури СОК визначається як довжиною СОК, так і упаковкою петель, визначуваних залишками, локалізованими як в СОК, так і в каркасних ділянках.
"Відсоток ідентичності" між запитуваною послідовністю нуклеїнової кислоти і розглядуваною послідовністю нуклеїнової кислоти являє собою значення "ідентичності", виражене як відсоток, яке розраховане за допомогою алгоритму ВІАБЗТМ, коли розглядувана послідовність нуклеїнової кислоти має 100 95 перекривання із запитуваною послідовністю нуклеїнової кислоти після проведення попарного вирівнювання ВГА5ТМ. Такі попарні вирівнювання ВІ АТМ між запитуваною послідовністю нуклеїнової кислоти і розглядуваною послідовністю нуклеїнової кислоти проводять з використанням параметрів за умовчанням алгоритму ВІ А5ТМ, доступного на веб-сайті Майопа! Сепіег г ВіоїесппоЇоду Іпбійше, з відключеним фільтром для ділянок низької складності. Важливо, що запитувану послідовність нуклеїнової кислоти можна описати за допомогою послідовності нуклеїнової кислоти, ідентифікованої в одному або декількох пунктах формули винаходу в даному описі. "Відсоток ідентичності" між запитуваною амінокислотною послідовністю і розглядуваною амінокислотною послідовністю являє собою значення "ідентичності", виражене як відсоток, яке розраховане за допомогою алгоритму ВІ АТР, коли розглядувана амінокислотна послідовність має 10095 перекривання із запитуваною амінокислотною послідовністю після проведення попарного вирівнювання ВІГАБТР. Такі попарні вирівнювання ВІАБТР між запитуваною амінокислотною послідовністю і розглядуваною амінокислотною послідовністю проводять з використанням параметрів за умовчанням алгоритму ВІ А5ТР, доступного на веб-сайті Майопаї
Сепіег ог ВіоїесппоЇоду Іпбійше, з відключеним фільтром для ділянок низької складності.
Важливо, що запитувану амінокислотну послідовність можна описати за допомогою амінокислотної послідовності, ідентифікованої в одному або декількох пунктах формули винаходу в даному описі.
Запитувана послідовність може бути на 100 95 ідентичною розглядуваній послідовності, або вона може включати аж до певної цілої кількості змін амінокислот або нуклеотидів у порівнянні з даною послідовністю, так що 95 ідентичності складає менше 100 95. Наприклад, запитувана послідовність Є щонайменше на 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 або 99 95 ідентичною розглядуваній послідовності. Такі зміни включають делецію, заміну (включаючи консервативну і неконсервативну заміну) або вставку щонайменше однієї амінокислоти, і при цьому такі зміни можуть відбуватися в аміно- або карбокси-кінцевих положеннях запитуваної послідовності або в
Зо будь-якому місці між цими кінцевими положеннями, можуть бути розподілені або індивідуально серед амінокислот або нуклеотидів у запитуваній послідовності, або в одній або декількох безперервних групах усередині запитуваної послідовності. до ідентичності можна визначати впродовж повної довжини запитуваної послідовності, включаючи СОК (декілька СОК). Альтернативно, 95 ідентичності може виключати СОК (декілька
СО), наприклад, СОК (декілька СОК) є на 100 95 ідентичною розглядуваній послідовності, і зміна 95 ідентичності відбувається в останній частині запитуваної послідовності, так що послідовність СОК є фіксованою/інтактною.
Варіант послідовності по суті зберігає біологічні характеристики немодифікованого білка, такого як ЗЕО ІЮ МО:7 або ЗЕО ІЮ МО:8.
Послідовність Мн або Мі може являти собою варіант послідовності з аж до 15 замін, додавань або делецій амінокислот. Наприклад, варіант послідовності може мати заміну(заміни), додавання(додавання) або делецію(делеції) аж до 15, 14, 13, 12, 11,10,9,8, 7,6, 5,4, 3,2 або 1 амінокислот.
Варіант послідовності може виключати СОК (декілька СОК), наприклад, СОК (декілька СОК) є такою самою, як в послідовності Мн або Мі (або НС або ІС), і варіант присутній в останній частині послідовності Мн або М (або НС або ІС), так що послідовність СОЖК є фіксованою/інтактною.
Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що, при продукції антигензв'язуючого білка, такого як антитіло, зокрема, залежно від використовуваної лінії клітин і конкретної амінокислотної послідовності антигензв'язуючого білка, можуть відбуватися пост-трансляційні модифікації.
Наприклад, вони можуть включати відщеплення конкретних лідерних послідовностей, додавання різних цукрових груп у різних патернах глікозилювання і фосфорилування, дезамідування, окиснення, перетворення дисульфідних зв'язків, ізомеризація, відщеплення С- кінцевого лізину і циклізацію М-кінцевого глутаміну. Даний винахід стосується застосування антигензв'язуючих білків, які є об'єктом або піддані одній або декільком пост-трансляційним модифікаціям. Таким чином, "антигензв'язуючий білок" або "антитіло" за винаходом включає "антигензв'язуючий білок" або "антитіло", відповідно, як визначено раніше, піддані одній або декільком пост-трансляційним модифікаціям, таким як описано в даному описі.
Дезамідування являє собою ферментативну реакцію, що в першу чергу перетворює бо аспарагін (М) на ізо-аспарагінову кислоту і аспарагінову кислоту (0) у співвідношенні приблизно
3:11. У набагато меншій мірі, дезамідування може відбуватися із залишками глутаміну схожим чином. Дезамідування в СОК приводить до зміни заряду молекули, але, як правило, як не приводить до зміни зв'язування антигена, так і не впливає на РК/РО.
Окиснення може відбуватися в ході продукції і зберігання (тобто у присутності окиснювальних умов) і приводить до ковалентної модифікації білка, індукованої або безпосередньо за допомогою реакційноздатних видів кисню, або опосередковано за допомогою реакції із вторинними побічними продуктами окиснювального стресу. Окиснення відбувається в першу чергу на залишках метіоніну, але в окремих випадках може відбуватися на залишках триптофану і вільного цистеїну.
Перетворення дисульфідних зв'язків може відбуватися в ході продукції і зберігання в основних умовах. У конкретних умовах, дисульфідні зв'язки можуть руйнуватися або формуватися неправильно, що приводить до неспарених залишків цистеїну (-5Н). Ці вільні (неспарені) сульфгідрили (-5Н) можуть стимулювати перетасування.
Ізомеризація як правило, відбувається в ході продукції, очищення та зберігання (при кислому рН) і зазвичай відбувається, коли аспарагінова кислота перетворюється на ізоаспарагінову кислоту за допомогою хімічного процесу.
М-кінцевий глутамін у важкому ланцюзі та/або легкому ланцюзі, ймовірно, формує піроглутамат (рай). Велика частина формування раїм відбувається в біореакторі для продукції, але він може утворюватися не ферментативним чином, залежно від рН і температур переробки та умов зберігання. Утворення раси розглядають як один з принципових шляхів деградації для рекомбінантних тАр.
Відщеплення С-кінцевого лізину являє собою ферментативну реакцію, каталізовану карбоксипептидазами, і його зазвичай спостерігають у рекомбінантних тАб. Варіанти цього процесу включають видалення лізину з одного або обох важких ланцюгів. Відщеплення лізину, мабуть, не впливає на біоактивність і не впливає на ефекторну функцію тАб.
У людини існують природні аутоантитіла, які можуть зв'язуватися з білками. Аутоантитіла можуть, таким чином, зв'язуватися з ендогенними білками (присутніми у наївних суб'єктів), так само як з білками або пептидами, які вводять суб'єктові для лікування. Зв'язуючі терапевтичний білок аутоантитіла і антитіла, заново сформовані у відповідь на лікарський засіб, разом
Зо називають антитілами проти лікарського засобу (АБА). Передіснуючі антитіла проти таких молекул, як терапевтичні білки і пептиди, введені суб'єктові можуть впливати на їх ефективність і можуть приводити до реакцій на введення, гіперчутливості, зміненій клінічній відповіді в підданих лікуванню пацієнтів і зміненій біодоступності за допомогою утримання, знищення або нейтралізації молекули. Може забезпечувати переваги надання для терапії молекули, що містить одиночні варіабельні домени або ЯАр'М людського імуноглобуліну (антитіла), що мають зменшену імуногенність (тобто зменшену здатність зв'язуватися з передіснуючими АБ) при введенні суб'єктові, зокрема, суб'єктові-людині.
Таким чином, в одному варіанті здійснення даного винаходу представлені модифіковані адрьм із зменшеною здатністю зв'язуватися з передіснуючими антитілами (АБА) у порівнянні з еквівалентною немодифікованою молекулою. Під зменшеною здатністю зв'язування розуміють, що модифікована молекула зв'язується з передіснуючими АЮ із зменшеною афінністю або зменшеною авідністю. Такі модифіковані ЯАБ'М містять одну або декілька модифікацій, вибраних з: (а) С-кінцевого додавання, подовження, делеції або приєднання мітки, та/або (Б) заміни однієї або декількох каркасних амінокислот.
Поліпептиди і дАБр"М за описом і агоністи, що містять їх, можна форматувати так, щоб вони мали більший гідродинамічний розмір, наприклад, за допомогою приєднання групи РЕб, сироваткового альбуміну, трансферину, рецептора трансферину або щонайменше його зв'язуючої трансферин-частини, ділянки Ес антитіла, або за допомогою кон'югації з доменом антитіла. Наприклад, поліпептиди ЯАБ'"М ї агоністи можна форматувати у формі більшого антигензв'язуючого фрагменту антитіла або у формі антитіла (наприклад, у форматі Раф, Рар",
Каб)», Каб», да, всгм).
У рамках винаходу, "гідродинамічний розмір" стосується уявного розміру молекули (наприклад, антигензв'язуючого білка) на базі дифузії молекули через водний розчин. Дифузію або рух білка через розчин можна обробляти для виведення уявного розміру білка, де розмір отримують за "радіусом Стокса" або "гідродинамічним радіусом" частинки білка. "Гідродинамічний розмір" білка залежить як від маси, так і від форми (конформації), так що два білки, які мають однакову молекулярну масу, можуть мати різні гідродинамічні розміри на підставі загальної конформації і заряду білка. Збільшення гідродинамічного розміру може приводити до асоційованого зменшення виведення через нирки, що приводить до 60 спостережуваного збільшення часу напівжиття (Ї/2).
Гідродинамічний розмір антигензв'язуючих білків (наприклад, мономерів і мультимерів доменного антитіла) за описом можна визначати з використанням способів, добре відомих у даній галузі. Наприклад, гель-фільтраційну хроматографію можна використовувати для визначення гідродинамічного розміру антигензв'язуючого білка. Придатні смоли для гель- фільтрації для визначення гідродинамічних розмірів антигензв'язуючих білків, такі як смоли на основі перехресно зшитої агарози, добре відомі і легко доступні.
Розмір антигензв'язуючого білка в певному форматі (наприклад, розмір групи РЕбС, приєднаної до мономера доменного антитіла), можна міняти залежно від бажаного застосування. Наприклад, коли антигензв'язуючий білок призначений, аби покидати кровотік і входити в периферичні тканини, є бажаним зберігати невеликий гідродинамічний розмір зв'язуючого ІСО5 білка для полегшення виходу з кровотоку. Альтернативно, коли є бажаним залишати антигензв'язуючий білок у системному кровотоку на триваліший період часу, розмір антигензв'язуючого білка можна збільшувати, наприклад, за допомогою отримання у форматі подібного Ід білка.
Фармацевтичні композиції
Антигензв'язуючий білок, як описано в даному описі, можна включати у фармацевтичні композиції для застосування в лікуванні захворювань людини, описаних у даному описі. В одному варіанті здійснення, фармацевтична композиція містить антигензв'язуючий білок, необов'язково, в комбінації з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями та/або наповнювачами.
Такі композиції містять фармацевтично прийнятний носій, як відомо і необхідно для прийнятної фармацевтичної практики.
Фармацевтичні композиції можна вводити за допомогою ін'єкції або безперервної інфузії (приклади включають, але без обмеження, внутрішньовенну, внутрішньоочеревинну, внутрішньошкірну, підшкірну, внутрішньом'язову і інтрапортальну). В одному варіанті здійснення, композиція є придатною для внутрішньовенного введення. Фармацевтичні композиції можуть бути придатними для місцевого введення (яке включає, але без обмеження, нашкірне введення, введення за допомогою інгаляції, інтраназальне введення або введення в око) або ентеральне введення (яке включає, але без обмеження, пероральне або ректальне введення).
Фармацевтичні композиції можуть містити між 0,5 мг ії 10 г зв'язуючого ІСО5 білка, наприклад, між 5 мг і 1 г антигензв'язуючого білка. Альтернативно, композиція може містити між 5 мг і 500 мг, наприклад, між 5 мг і 50 мг.
Способи отримання таких фармацевтичних композицій добре відомі фахівцям у даній галузі.
Інші наповнювачи можна додавати в композицію, як прийнятно для використовуваних способу введення і конкретного білка. Приклади різних наповнювачів та їх застосувань описані в І оуге єї а!., (2011).
Ефективні дози і режими лікування для введення антигензв'язуючого білка можуть залежати від таких чинників, як вік, маса і стан здоров'я пацієнта, і захворювання, яке лікується. Такі чинники знаходяться в компетенції лікаря. Керівництво для вибору придатних доз можна виявити, наприклад, в Ваї еї а!., (2012).
Фармацевтична композиція може містити комплект складових антигензв'язуючого білка разом з іншими лікарськими засобами, необов'язково, з інструкціями для застосування. Для зручності, набір може містити реагенти в зумовлених кількостях з інструкціями для застосування.
Терміни "індивідуум", "суб'єкт" і "пацієнт" використовують у даному описі взаємозамінно. В одному варіанті здійснення, суб'єкт являє собою ссавця, такого як примат, наприклад, ігрунку або мавпу. В іншому варіанті здійснення, суб'єкт являє собою людину.
Антигензв'язуючий білок, описаний у даному описі, можна також використовувати в способах лікування. Лікування може бути терапевтичним, профілактичним або запобігаючим.
Лікування включає полегшення, зменшення або запобігання щонайменше одного аспекту або симптому захворювання і включає запобігання або лікування захворювань, описаних у даному описі.
Зв'язуючий ІСОБ5 білок або його антигензв'язуючу частину, описані в даному описі, використовують в ефективній кількості для терапевтичного, профілактичного або запобігаючого лікування. Терапевтично ефективна кількість зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини, описаних у даному описі, являє собою кількість, ефективну для полегшення або зменшення одного або декількох симптомів захворювання, або для запобігання або вилікування захворювання.
Таким чином, в одному варіанті здійснення представлені зв'язуючі ІСО5 білки або їх антигензв'язуючі частини за даним винаходом для застосування в терапії. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих ІСО5 білків або їх антигензв'язуючих частин за даним винаходом для застосування в терапії злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису. Даний винахід також стосується застосування зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини за даним винаходом в отриманні лікарського засобу для лікування злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису.
Таким чином, винахід стосується виділених зв'язуючих ІСО5 білків або їх антигензв'язуючих частин, або фармацевтичних композицій, що містять вказані виділені зв'язуючі ІСО5 білки або їх антигензв'язуючі частини, для застосування в лікуванні злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису.
Способи отримання
Антигензв'язуючі білки можна отримувати будь-яким з ряду звичайних способів. Наприклад, антигензв'язуючі білки можна очищати з клітин, експресуючих їх природним чином (наприклад, антитіло можна очищати з гібридоми, що продукує його), або отримувати в рекомбінантних експресуючих системах.
Ряд різних експресуючих систем і режимів очищення можна використовувати для отримання антигензв'язуючого білка за винаходом. Як правило, клітини-господарі трансформують рекомбінантним експресуючим вектором, що кодує бажаний антигензв'язуючий білок. Можна застосовувати широкий діапазон клітин-господарів, включаючи прокаріоти (включаючи грамнегативні або грампозитивні бактерії, наприклад, Езбспегіспі соїї, види Васіїї, види
Рзепдотопав, види Согупебасіегішт), еукаріоти, включаючи дріжджі (наприклад, засспаготусев сегемізіає, Ріспі равіогіх5), гриби (наприклад, види Азрегодійи5) або вищі еукаріоти, включаючи клітини комах і лінії клітин, що походять із ссавців (наприклад, СНО, Регсб, НЕК293, Неї! а).
Клітина-господар може являти собою виділену клітину-господаря. Клітина-господар, як правило, не є частиною багатоклітинного організму (наприклад, рослини або тварини). Клітина- господар може являти собою клітину-господаря, що не стосується людини.
Придатні клонуючі та експресуючі вектори для застосування з клітинними господарями з бактерій, грибів, дріжджів і ссавців і способи клонування відомі в даній галузі.
Зо Клітини можна культивувати в умовах, що сприяють експресії антигензв'язуючого білка, і виділяти поліпептид загальноприйнятими способами очищення білка. Антигензв'язуючі білки, передбачені для застосування в даному описі, включають по суті гомогенні антигензв'язуючі білки, в основному вільні від забруднюючих матеріалів.
Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що, при продукції антигензв'язуючого білка, можуть відбуватися пост-трансляційні модифікації, зокрема, залежно від використовуваної лінії клітин і конкретної амінокислотної послідовності антигензв'язуючого білка. Вони можуть включати відщеплення конкретних лідерних послідовностей, додавання різних цукрових груп у різних патернах глікозилювання, дезамідування (наприклад, залишку аспарагіну або глутаміну), окиснення (наприклад, залишку метіоніну, триптофану або вільного цистеїну), перетворення дисульфідних зв'язків, ізомеризацію (наприклад, залишку аспарагінової кислоти), відщеплення
С-кінцевого лізину (наприклад, від одного або обох важких ланцюгів) і циклізацію М-кінцевого глутаміну (наприклад, у важкому та/або легкому ланцюзі). Даний винахід стосується застосування антитіл, які є об'єктом або піддані одній або декільком пост-трансляційним модифікаціям. Модіфікація може бути присутньою в СОК, варіабельній каркасній ділянці або константній ділянці. Модифікація може приводити до зміни заряду молекули. Модифікація, як правило, як не приводить до зміни зв'язування антигена, функції, бісактивності, так і не впливає на фармакокінетичні (РК) або фармакодинамічні (РО) характеристики зв'язуючого ІСО5 білка.
Термін "ефекторна функція", в рамках винаходу, призначений для позначення одного або декількох з відповідей антитілозалежної опосередкованої клітинами цитотоксичної активності (АОСС), комплементзалежної цитотоксичної активності (СОС), опосередкованого Ес фагоцитозу або антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АОСР) і рециклізації антитіла за допомогою рецептора ЕсКп.
Вважають, що взаємодія між константною ділянкою антигензв'язуючого білка і різними рецепторами Ес (ЕСЕ), включаючи ЕсукІ (СОб64), Есукі! (СО32) і ЕсукПП (СО016), опосередкує ефекторні функції антигензв'язуючого білка. Значні біологічні ефекти можуть бути наслідком ефекторної функціональності. Як правило, здатність опосередкувати ефекторну функцію вимагає зв'язування антигензв'язуючого білка з антигеном, і не всі антигензв'язуючі білки можуть опосередкувати кожну ефекторну функцію.
Ефекторну функцію можна вимірювати рядом способом, включаючи, наприклад, зв'язування бо З ЕсуКіІй на клітинах природних кілерах або з ЕсукК!І на моноцитів/макрофагах для виміру ефекторної функції АОСС/АЮСР. Наприклад, можна оцінювати ефекторну функцію в АОСС антигензв'язуючого білка за даним винаходом в аналізі клітин природних кілерів. Практичні способи для оцінювання функції АОСС та /"або СОС можна виявити в (КеїІпег С еї а!., "Воовіїпа
АрСС апа СОС асіїмпу Бу Ес епдіпеегіпд апа емаїЇчайоп ої апіїбоду еПесіог тТипсійопв", Меїнодв, 1;65(1):105-13 (2014))
Деякі ізотипи людських константних ділянок, зокрема ізотипи да і Ї|дДСсе2, мають зменшену функцію а) активації комплементу за класичним шляхом; і р) антитілозалежної клітинної цитотоксичності. Можна здійснювати різні модифікації константної ділянки важкого ланцюга антигензв'язуючих білків залежно від бажаних ефекторних властивостей. Окремо описано, що константні ділянки ІДС, що містять конкретні мутації, зменшують зв'язування з рецепторами Ес і таким чином, зменшують АОСС і СОС. (Кеїпег С еї аї., "Воозіїпда АОСС апа СОС асіїмну Бу Ес епдіпеегтіпу апа емаІчайоп ої апіроду епесюг Типсійопв", Меїтоав, 1;65(1):105-13 (2014))
У одному варіанті здійснення даного винаходу представлений антигензв'язуючий білок, що містить таку константну ділянку, що антигензв'язуючий білок має зменшену АЮСС та/або активацію комплементу, або ефекторну функціональність. В одному такому варіанті здійснення константна ділянка важкого ланцюга може містити природним чином позбавлену функціональності константну ділянку ізотипу Їдс2 або Ідс4, або мутантну константну ділянку
Ід21. Один приклад включає заміну залишків аланіну в положеннях 235 і 237 (нумерація за індексом ЕМ).
Підклас антитіла частково визначає вторинні ефекторні функції, такі як активація комплементу або зв'язування з рецептором Ес (ЕСК) і антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АРСС) (Нибег, єї аї., Мате 229(5284): 419-20 (1971); Втгиппоизе, вї а!., Мої Іттипої 16(11): 907- 17 (1979)). При ідентифікації оптимального типу антитіла для конкретного застосування, ефекторні функції антитіл можна брати до уваги. Наприклад, антитіла пПІдС1, що мають відносно довгий час напівжиття, є дуже ефективними у фіксації комплементу, і вони зв'язують як ЕсуВІ, так ї ЕсуКІІ. На відміну від цього, людські антитіла Ід54 мають коротший час напівжиття, не фіксують комплемент і мають нижчу афінність для ЕСЕ. Заміна серину 228 на пролін (5228Р) в ділянці Ес Ід4 зменшує гетерогенність, спостережувану для пПІдс4, і подовжує час напівжиття в сироватці (Кабаї, єї аї!., "Зедиепсез ої ргоїеіп5 ої іттипо!одісаї! іпіеге5і" 5.5ирйп Едйіоп (1991);
Зо Апааї, еї аї., Мої Іттипо! З0(1): 105-8 (1993)). Друга мутація, що заміняє лейцин 235 на глутамінову кислоту (1235Е), виключає залишкову активність зв'язування ЕсК і зв'язування комплементу (АїЇедге, еї аї., У Іттипої 148(11): 3461-8 (1992)). Отримане антитіло з обома мутаціями позначають як І(дДС4РЕ. Нумерація амінокислот пІдС4 отримана із посилання на нумерацію ЄШО: Едеї!тап, С.М. єї аї., Ргос. Май). Асад. ОБА, 63, 78-85 (1969). РМІЮ: 5257969. В одному варіанті здійснення даного винаходу антигензв'язуючі білюи для ІСО5, що містять ділянку Ес ІдСс4, що містить заміни 5228Р і 1235Е, можуть мати позначення ІдДСаАРЕ. Таким чином, зв'язуючий ІСО5 білок, що має варіабельну ділянку важкого ланцюга На і варіабельну ділянку легкого ланцюга 15, і ділянку Ес І(Д24РЕ, можна позначати як Н2І 5 ІдСаАРЕ, або синонімічно, як Н2І 5 пІдСсАРЕ.
Посилення АОСС/СОС
Як відомо в даній галузі, відомі різні способи, що збільшують активність АЮОСС та/або СОС антитіла. Вони включають, але без обмеження, різні мутації у ділянці Ес, технології Сотрієдепі і
РоїеїйІїдепі. В одному аспекті даного винаходу один або декілька способів посилення АОСС/СОС можна застосовувати для зв'язуючих ІСО5 білків за даним винаходом.
Мутація
Описано також, що людські константні ділянки ЇдДС1, що містять конкретні мутації або змінене глікозилювання залишку Азп297, підсилюють зв'язування з рецепторами Ес. У деяких випадках, показано також, що ці мутації підсилюють АЮСС ії СОС, див., наприклад, Кеїпег (2013).
У одному варіанті здійснення даного винаходу, такі мутації присутні в одному або декількох положеннях, вибраних з 239, 332 і 330 (ІдО1), або в еквівалентних положеннях в інших ізотипах
ІЧ. Прикладами придатних мутацій є 52390 і ІЗ32Е, і АЗЗОЇ. В одному варіанті здійснення в антигензв'язуючий білок за винаходом, описаний у даному описі, вносять мутації у положеннях 239 і 332, наприклад, 52390 і ІЗ332Е, або в наступному варіанті здійснення, в нього вносять мутації у трьох або більше положеннях, вибраних з 239 і 332, і 330, наприклад, 52390 і ІЗ32Е, і
АЗЗОЇ (нумерація за індексом ЕМ).
Сотріедепі
У одному варіанті здійснення даного винаходу представлений антигензв'язуючий білок, що містить химерну константну ділянку важкого ланцюга, наприклад, антигензв'язуючий білок, що бо містить химерну константну ділянку важкого ланцюга щонайменше з одним доменом СНІ з
І9О3, такий, що антигензв'язуючий білок має посилену ефекторну функцію, наприклад, коли він має посилену функцію АОСС або посилену функцію СОС, або посилені функції АОСС і СОС. В одному такому варіанті здійснення, антигензв'язуючий білок може містити один домен СНІ з
ІЧО3, або обидва домени СН2 можуть походити з Їд3.
Представлений також спосіб отримання антигензв'язуючого білка за винаходом, що включає стадії: а) культивування рекомбінантної клітини-господаря, що містить експресуючий вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту, як описано в даному описі, де експресуючий вектор містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує домен Ес, який має амінокислотні залишки домену Ес як ІДИ, так і ІЗ; і р) виділення антигензв'язуючого білка.
Такі способи отримання антигензв'язуючих білків можна здійснювати, наприклад, з використанням системи технологій СОМРІЕСЕМТ "М, доступної з Віоума, Іпс. (Ргіпсейфоп, МУ) і
Куом/ Накко Кодуо (в даний час, Куом/ НакКо Кігіп Со., їїа.) Со., Ца., у якій рекомбінантна клітина-господар містить експресуючий вектор, в якому послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує химерний домен Ес, який має амінокислотні залишки домену Ес як ІдДС1, так і ІдсОЗ, експресується для отримання антигензв'язуючого білка, що має посилену активність комплементзалежної цитотоксичності (СОС), збільшеної у порівнянні з ідентичним в іншому відношенні антигензв'язуючим білком, позбавленим такого химерного домену Ес. Аспекти системи технологій СОМРІЕСЕМТ "М описані в М/О2007011041 і 0520070148165, вміст кожного з яких наведено в даному описі як посилання. В альтернативному варіанті здійснення активність
СОС можна збільшувати за допомогою введення специфічних для послідовності мутацій у ділянку Ес ланцюга до. Фахівцеві в даній галузі відомі також інші придатні системи.
РоїеїїІїдепі
Даний винахід також стосується способу отримання антигензв'язуючого білка за винаходом, що включає стадії: а) культивування рекомбінантної клітини-господаря, що містить експресуючий вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту, як описано в даному описі, де ген ЄОТ8, що кодує альфа- 1,6-фукозилтрансферазу, інактивований у рекомбинантній клітині-господарі; і
Зо р) виділення антигензв'язуючого білка.
Такі способи отримання антигензв'язуючих білків можна здійснювати, наприклад, з використанням системи технологій РОТЕ І ІСЕМТ М, доступної з Віоума, Іпс. (Ргіпсейоп, МУ), в якої клітини СНОКІТ5ЗМУ, позбавлені функціональній копії гена ЕОТ8, продукують моноклональні антитіла, що мають посилену активність антитілозалежної опосередкованої клітинами цитотоксичності (АЮСС), збільшеної у порівнянні з ідентичним моноклональним антитілом, продукованим у клітині з функціональним геном БИТ8. Аспекти системи технологій
РОТЕ ШСЕМТ'"М описані в 57214775, 56946292, ММО0061739 і МУО0231240, вміст всіх з яких наведено в даному описі як посилання. Фахівцеві в даній галузі відомі також інші придатні системи.
Фахівцеві в даній галузі вочевидь, що такі модифікації можна використовувати не лише окремо, але можна використовувати в комбінації один з одним для додаткового посилення ефекторної функції.
У одному такому варіанті здійснення даного винаходу представлений антигензв'язуючий білок, що містить константну ділянку важкого ланцюга, який містить мутантну і химерну константну ділянку важкого ланцюга, наприклад, де антигензв'язуючий білок містить щонайменше один домен СНІ з ІдОЗ і один домен СНІ з ІдС1, де домен СН2 ІдС1 має одну або декілька мутацій у положеннях, вибраних з 239 і 332, і 330 (наприклад, мутації можуть бути вибрані з 52390 і ІЗ32Е, і АЗЗОЇ), так що антигензв'язуючий білок має посилену ефекторну функцію, наприклад, де він має одну або декілька з наступних функцій, посилену АОСС або посилену СОС, наприклад, де він має посилену АОСС і посилену СОС. В одному варіанті здійснення, домен СН2 Ідс1 має мутації 52390 і ІЗ32Е.
У альтернативному варіанті здійснення даного винаходу представлений антигензв'язуючий білок, який містить химерну константну ділянку важкого ланцюга і має змінені профілі глікозилювання. В одному такому варіанті здійснення константна ділянка важкого ланцюга містить щонайменше один домен СНІ з ІдОЗ і один домен СНа з ІДС, і має змінені профілі глікозилювання, такі, що співвідношення фукози до манози складає 0,8:3 або менше, наприклад, де антигензв'язуючий білок є дефукозилованим, так що вказаний антигензв'язуючий білок має посилену ефекторну функцію в порівнянні з еквівалентним антигензв'язуючим білком з константною ділянкою важкого ланцюга імуноглобуліну, де відсутні вказані мутації і змінений профіль глікозилювання, наприклад, де він має одну або декілька з наступних функцій, посилену АОСС або посилену СОС, наприклад, де він має посилену АОСС і посилену СОС
У альтернативному варіанті здійснення антигензв'язуючий білок має щонайменше одим домен СН2 ІдОЗ і щонайменше один константний домен важкого ланцюга з ЇДО1, де до обох доменів СН2 ІС внесені мутації відповідно до обмежень, описаних у даному описі.
У одному аспекті за винаходом представлений спосіб отримання антигензв'язуючого білка за винаходом, описаного в даному описі, що включає стадії: а) культивування рекомбінантної клітини-господаря, що містить експресуючий вектор, який містить виділену нуклеїнову кислоту, як описано в даному описі, де вказаний експресуючий вектор додатково містить послідовність нуклеїнової кислоти Ес, що кодує химерний домен Ес, який має амінокислотні залишки домену Ес як ІДС, так і (ДСЗ, і де ген РОТ8, що кодує альфа- 1,6-фукозилтрансферазу, інактивований у рекомбінантній клітині-господарі; і р) виділення антигензв'язуючого білка.
Такі способи отримання антигензв'язуючих білків можна здійснювати, наприклад, з використанням системи технологій АССКЕЕТАМАВ'М, доступної з ВіоуУма, Іпс. (Ргіпсейоп, МУ), в якій скомбіновані системи технологій РОТЕ ГІСЕМТ"М Її СОМРІЕСЕМТ"М для отримання антигензв'язуючого білка, що має посилену активність як АЮОСС, так і СОС, збільшену в порівнянні з ідентичним в іншому відношенні моноклональним антитілом, що не має химерного домену Ес і має фукозу на олігосахариді.
У іншому варіанті здійснення даного винаходу представлений антигензв'язуючий білок, що містить мутантну і химерну константну ділянку важкого ланцюга, де вказаний антигензв'язуючий білок має змінений профіль глікозилювання, такий що антигензв'язуючий білок має посилену ефекторну функцію, наприклад, де він має одну або декілька з наступних функцій, посилену
АрСС або посилену СОС. В одному варіанті здійснення мутації вибрані з положень 239 і 332, і 330, наприклад, мутації вибрані з 52390 і І332Е, і АЗЗОЇ. У наступному варіанті здійснення константна ділянка важкого ланцюга містить щонайменше один домен СНа з ДОЗ і один домен
Сп2 з Ідс1. В одному варіанті здійснення константна ділянка важкого ланцюга має змінений профіль глікозилювання, такий що відношення фукози до манози складає 0,8:3 або менше, наприклад, антигензв'язуючий білок є дефукозилованим, так що вказаний антигензв'язуючий
Зо білок має посилену ефекторну функцію в порівнянні з еквівалентним нехимерним антигензв'язуючим білком або з константною ділянкою важкого ланцюга імуноглобуліну, що не має вказаних мутацій і зміненого профілю глікозилювання.
Опубліковано, що тривалий час напівжиття антитіл (ДО залежить від його зв'язування з
ЕсКп. Таким чином, заміни, що збільшують афінність зв'язування ДО з ЕсКп при рН 6,0 при збереженні залежності взаємодії від рН за допомогою конструювання константної ділянки, інтенсивно вивчали в Кио апа Амезоп (2011).
Інші способи модифікації антигензв'язуючих білків за даним винаходом включають збільшення часу напівжиття таких білків за допомогою модифікації константного домену або зв'язуючого ЕсКп (неонатальний рецептор Ес) домену імуноглобуліну.
У дорослих ссавців, ЕсКп, відомий також як неонатальний рецептор Ес, грає ключову роль у підтримці рівнів антитіл у сироватці за допомогою дії як захисний рецептор, який зв'язує і рятує антитіла ізотипу ДО від деградації. Молекули ДОС піддаються ендоцитозу за допомогою ендотеліальних клітин, і якщо вони зв'язуються з ЕсКп, вони піддаються рециклізації у кровотік.
На відміну від цього, молекули Ідо, які не зв'язуються з РоКп, входять у клітини і Є мішенню для лізосомального шляху, де вони піддаються деградації.
Вважають, що неонатальний рецептор БсКп залучений як у виведення антитіл, так і в трансцитоз антитіл через тканини, Кио апа Амезоп (2011). Залишки людського ІдДС1, як визначено, що взаємодіють безпосередньо з ЕсКп людини, включають Пе253, 5ег254, І уз288,
ТАг307, СІп311, Аз5п434 і Ніз435. Перемикання в одному з цих положень, описаних у цьому розділі, може забезпечувати збільшений час напівжиття в сироватці та/або змінені ефекторні властивості антигензв'язуючих білків за винаходом.
Мутації для збільшення часу напівжиття за допомогою збільшення афінності для ЕсКп
Антигензв'язуючі білюи за даним винаходом можуть мати модифікації однієї або декількох амінокислот, які збільшують афінність константного домену або його фрагменту для ЕсКп. Це може приводити до збільшеного часу напівжиття цих білків, Кио апа Амезоп (2011). Збільшення часу напівжиття терапевтичних і діагностичних дО та інших біоактивних молекул має безліч переваг, включаючи зменшену кількість талабо частоту дозування цих молекул. В одному варіанті здійснення, таким чином, представлений антигензв'язуючий білок за винаходом, представлений у даному описі, або злитий білок, що містить весь або частину (зв'язуючу ГсКп бо частину) константного домену ІдсС, що має одну або декілька модифікацій амінокислот, і білкову або небілкову молекулу, що не належить до дес, когн'юЮговану з таким модифікованим константним доменом Ідс, де присутність модифікованого константного домену дО збільшує час напівжиття іп мімо антигензв'язуючого білка.
Відомий ряд способів, які можуть приводити до збільшеного часу напівжиття (Кио апа
Амезоп (2011)), включаючи модифікації амінокислот, які можна отримувати способами, що включають аланіновий скануючий мутагенез, випадковий мутагенез і скринінг для оцінювання зв'язування з ГсКп та/або поведінки іп мімо. Обчислювальні способи після мутагенезу також можна використовувати для вибору однієї з мутацій амінокислот для введення.
Даний винахід, таким чином, стосується варіанту антигензв'язуючого білка з оптимізованим зв'язуванням з РсКп. У переважному варіанті здійснення, вказаний варіант антигензв'язуючого білка містить модифікацію щонайменше однієї амінокислоти в ділянці Ес вказаного антигензв'язуючого білка, де вказана модифікація вибрана з групи, що складається з 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, зго, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359,
З6О, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 і 447 ділянок Ес, у порівнянні з вказаним вихідним поліпептидом, де нумерація амінокислот в ділянці Ес являє собою нумерацію за індексом БО в Кабаї.
У наступному аспекті за винаходом модифікації являють собою М252Уу/52541/1256БЕ.
Крім того, в різних публікаціях описані способи отримання фізіологічно активних молекул, час напівжиття яких модифіковано, див., наприклад, Копіегтапп (2009), або за допомогою введення зв'язуючого ЕсКп поліпептиду в молекули, або за допомогою злиття молекул з антитілами, афінність зв'язування яких з ЕсКп збережена, але афінність яких для інших рецепторів Ес сильно зменшена, або за допомогою злиття із зв'язуючими ЕсКп доменами антитіл.
Спосіб перемикання за допомогою рН для збільшення часу напівжиття
Хоча заміни в константній ділянці здатні значно покращувати функції терапевтичних антитіл
Зо Іо, заміни в строго консервативній константній ділянці в сумі мають ризик імуногенності, і заміни у високо всілякій послідовності варіабельної ділянки можуть бути менше імуногенними.
Повідомлення відносно варіабельної ділянки включають конструювання залишків СОК для поліпшення афінності зв'язування з антигеном і конструювання залишків СОК і каркасних залишків для поліпшення стабільності і зменшення ризику імуногенності. Як відомо, покращуваної афінності для антигена можна досягати за допомогою афінного дозрівання з використанням фагового або рибосомного дисплея рандомізованої бібліотеки.
Покращувану стабільність можна досягати раціональним чином за допомогою раціонального дизайну на основі послідовності й структури. Зменшеного ризику імуногенності (деімунізації) можна досягати за допомогою різних способів гуманізації і видалення Т-клітинних епітопів, які можна передбачати з використанням способів іп 5іїйсо або визначати за допомогою аналізів іп міго. Крім того, були сконструйовані варіабельні ділянкиі для зниження рі. Більш тривалий час напівжиття спостерігали для цих антитіл у порівнянні з антитілами дикого типу, не дивлячись на порівнянне зв'язування ЕсКп. Антитіла із залежним від рН зв'язуванням антигена конструюють або відбирають для модифікації часу напівжиття антитіла та/або антигена, наприклад, час напівжиття антитіла /дс2 може бути укорочений, якщо механізми опосередкованого антигеном виведення в нормі здійснюють деградацію антитіла при зв'язуванні з антигеном. Так само, комплекс антиген:антитіло може впливати на час напівжиття антигена, або подовжуючи час напівжиття за допомогою захисту антигена від типових процесів деградації, або скорочуючи час напівжиття за допомогою опосередкованої антитілом деградації.
Один варіант здійснення стосується антитіл з вищою афінністю для антигена при рН 7,4 у порівнянні з ендосомальним рН (тобто, рН 5,5-6,0), так що відношення КО при рН 5,5/ рН 7,4 або при рН 6,0/ рН 7,4 складає 2 або більше. Наприклад, для поліпшення фармакокінетичних (РК) ії фармакодинамічних (РО) властивостей антитіла, можна модифікувати чутливе до рн зв'язування антитіла за допомогою введення залишків гістидину в залишки СОК.
Крім того, представлені також способи отримання антигензв'язуючого білка із зменшеним біологічним часом напівжиття. Варіант дб, в якому Нібз435 піддають мутації до аланіну, забезпечує вибіркову втрату зв'язування ЕсКп і значно зменшує час напівжиття в сироватці (див., наприклад, О56165745, де описаний спосіб отримання антигензв'язуючого білка із зменшеним біологічним часом напівжиття за допомогою введення мутації у фрагмент ДНК, що кодує антигензв'язуючий білок. Мутація включає заміну амінокислоти в положенні 253, 310, 311, 433 або 434 шарнірного домену Ес.
Лінкери
Білкові кістяки можуть бути такими ж, як природні послідовності, такі як послідовності Ід, або можуть являти собою фрагменти природних послідовностей, і можуть містити додаткові послідовності, які можуть бути природними, що походять з іншого джерела, або синтетичними, і які можна додавати на М- або С-кінці кістяка. Такі додаткові послідовності можна розглядати як лінкери, коли вони зв'язують епітопзв'язуючий домен і білковий кістяк, такі, як визначено в даному описі.
У іншому аспекті антигензв'язуюча конструкція складається з, або в основному складається з ділянки Ес антитіла, або його частини, зв'язаної з кожного кінця, безпосередньо або опосередковано (наприклад, за допомогою лінкерної послідовності), з епітопзв'язуючим доменом. Така антигензв'язуюча конструкція може містити 2 епітопзв'язуючих домени, розділених ділянкою Ес, або її частиною. Під розділенням розуміють, що епітопзв'язуючі домени не є безпосередньо зв'язаними один з одним, і в одному аспекті локалізовані на протилежних кінцях (С- і М-кінці) ділянки Ес, або будь-якої іншої каркасної ділянки.
У одному аспекті антигензв'язуюча конструкція містить 2 каркасні ділянки, де кожна зв'язана з 2 епітопзв'язуючими доменами, наприклад, на М- ії С-кінці кожної каркасної ділянки, або безпосередньо, або опосередковано через лінкер.
Білкові кістяки за даним винаходом можна зв'язувати з епітопзв'язуючими доменами за допомогою використання лінкерів. Приклади придатних лінкерів включають амінокислотні послідовності, які можуть мати довжину від 1 амінокислоти до 150 амінокислот, або від 1 амінокислоти до 140 амінокислот, наприклад, від 1 амінокислоти до 130 амінокислот, або від 1 до 120 амінокислот, або від 1 до 80 амінокислот, або від 1 до 50 амінокислот, або від 1 до 20 амінокислот, або від 1 до 10 амінокислот, або від 5 до 18 амінокислот. Такі послідовності можуть мати свою власну третинну структуру, наприклад, лінкер за даним винаходом може містити одиночний варіабельний домен. Розмір лінкера в одному варіанті здійснення є еквівалентним одиночному варіабельному домену. Придатні лінкери можуть мати розмір від 1 до 100 ангстрем, наприклад, можуть мати розмір від 20 до 80 ангстрем або наприклад, можуть мати розмір від 20 до 60 ангстрем або наприклад, менше 40 ангстрем, або менше 20 ангстрем, або менше 5 ангстрем у довжину.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих ІЇСО5 білків, що містять один або декілька з: СОКНІ, як вказано в 5ЕО ІЮО МО:1; СОРНІ2, як вказано в 5ЕО ІЮО МО:2;
СОРНУЗ, як вказано в ЗЕО ІО МО:3; СОБІ 1, як вказано в ЗЕО ІЮ МО:4; СОБІ 2, як вказано в 5ЖЕО
ІОЮО МО:5 та/"або СОКІ З, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:6 або прямого еквівалента кожної СОК, де прямий еквівалент має не більше двох замін амінокислот у вказаній СОБ.
У одному варіанті здійснення даного винаходу, представлені зв'язуючі ІСОБ5 білки, які специфічно зв'язуються з ІСО5 людини, що містять домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у БЕО ІЮ
МО:7, та/"або домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у ЗЕО ІО МО:8. В одному аспекті зв'язуючі
ЇСО5 білки за даним винаходом, зв'язують також ІСО5 яванського макака. В одному аспекті вони не зв'язують мишачий ІСО5.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСО5 білки за винаходом є агоністами ІСО5. В одному аспекті зв'язуючі ІСО5 білки збільшують продукцію ІЄМ-гамма у присутності Т-клітин. В іншому аспекті зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом стимулюють проліферацію Т-клітин.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючий ЇСО5 білок за винаходом зв'язується з ІСО5 людини з константою швидкості зв'язування (Коп) щонайменше 1 х 105 М-1с-1; і константою швидкості дисоціації (кої) менше 6 х 10-5 с-1; або константою дисоціації (Ка) менше 100 нм де високу афінність вимірюють за допомогою Віасоге.
У одному варіанті здійснення зв'язуючий ІСО5 білок містить СОКНЗ (5ЕО ІЮ МО:3) або варіант 5ЕО ІО МО. 3. В іншому варіанті здійснення зв'язуючі ІСОЗ білки містять один або декілька з: СОКНІ (5ЕО ІЮ МО:1); СОКН2 (ЗЕО ІЮ МО:2); СОВНЗ (ЗЕО ІЮ МО:3); СОВІ1 (5ЕО
ІО МО:4); СОКІ 2 (ЗЕО ІЮО МО:5); та/"або СОМКІ З (5ЕО ІЮ МО:6). В одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСО5 білки містять СОМ важкого ланцюга, як вказано в 5ЕО ІЮ МО:1; 5ЕО ІЮО МО:2; і
ЗЕО ІЮ МО:З і СОК легкого ланцюга, як вказано в ЗЕО ІЮ МО:4; 5ЕО ІЮ МО:5; і БЕО ІЮ МО:6.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСОЗ білки містять домен Мн, що має 90 95 60 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в 5ЕО ІЮО МО:7; і домен
Мі, що має 9095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в амінокислотній послідовності, вказаній у 5ХЕО І МО:8. В одному аспекті зв'язуючі ІСО5 білки містять домен Мн, що має амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮ МО.7, і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність, як вказано в 5ЕО ІЮО МО:8. В одному аспекті зв'язуючі
ЇІСО5 білки містять варіабельний домен важкого ланцюга, що складається з 5ЕО ІЮ МО:7. В одному аспекті зв'язуючий ІСОБ5 білок містить варіабельний домен легкого ланцюга, що складається з БЕО ІЮ МО:8.
У одному варіанті здійснення, винахід стосується зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини, що містить домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у зЕО ІЮО МО:7; і домен
Мі, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, як вказано в 5ЕБО ІЮ МО:8, де вказаний зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина специфічно зв'язується з ІСО5 людини. В одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, що містять домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у БЕО ІЮ МО:7; і домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, як вказано в ЗЕО ІЮ МО:8, де вказаний зв'язуючий
ЇСО5З білок або його антигензв'язуюча частина, що специфічно зв'язуються з ЇСО5 людини, додатково містить СОК важкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності вказані в хХЕО
ІЮ МО:1; 5ЕО ІЮ МО:2; їі 5ЕБЕО ІО МО:3, і СОК легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, вказані в «ЕО ІЮ МО:4; 5ЕО ІЮ МО:5; і БЕО ІЮ МО:6. В одному аспекті зв'язуючий
ЇСО5 білок або його антигензв'язуюча частина містить домен Мн, що містить амінокислотну послідовність, вказану в ЗЕО ІЮО МО:7; і домен Мі містить амінокислотну послідовність, вказану в
ЗЕО ІЮ МО:8. В одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина є агоністом ІСО5 людини. В одному варіанті здійснення зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина додатково містить кістяк ізотипу Ід04 або його варіант. В одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІЇСО5 білок або його антигензв'язуюча частина містить кістяк пасаРЕ.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючий ЇСО5 білок за даним винаходом являє собою
Зо гуманізоване моноклональне антитіле, що містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга, який має щонайменше 90 95, 91 95, 92, Ую, 93 Уо, 94 Уо, 95 Ую, 96 90, 97 9Уо, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в 5ЕО ІЮ
МО:23.
ОМОЇ МОБСАЕМККРИаБЗУКУЗСКАБОУТЕТОМАМНУУНОА РИСІ ЕМ МИ ІЗІМЗОНТМУМОК
ЕОСАМТІТАОКОТЗТАМУМЕЇ 55І АВА5БЕОТАМУ СОЯ ВМ Мама Ерумавоатут5ЗАВТКаРБМ
ЕРГАРСЗА5Т5ЕБТААІ аСІ МКОУМЕРЕРУТУБМУ МЗИаАЇ Т5ОМНТЕРАМІ 05501 М5І 55ММТМРБББІ. аКаткТтиИТоММОнкРОМТКМОКАМЕБКУОРРОРРСОРАРЕРЕССОРБОМУРБІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТСУМ
МОМ5БОЕОРЕМОЄММУ УМВОМЕМНМАКТКРАЕЄОЕМЗТУВМУМУ5МІ ТМ НООУ/ЛІ МЕОКЕУКСКУ5МКИЇ.
РЗ5БІЕКТІЗКАКОЕОРАЕРОМУТІ РРООБЕМТКМОМ5І ТС МУКОЕМРБОІАМЕМ ЕЗБМСОРЕММУКТТРР
УГгоБразЕРІ ЗВ ТМОКЗАУМОвє,ММЕЗСЗУМНЕАЇІ НМНУТОКОІ 51 51 ак (5ЕО ІЮ МО:23)
У одному варіанті здійснення, зв'язуючий ЇСО5 білок за даним винаходом являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, що містить амінокислотну послідовність легкого ланцюга, який має щонайменше 90 95, 91 95, 92, Ую, 93 Уо, 94 Уо, 95 Ую, 96 90, 97 9Уо, 98 95, 99 90 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в 5ЕО ІЮ
МО:24.
ЕІМГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ 5С5АЗОЗУЗУМНУМООКРООАРВІ ПІМОТ5КІ АБИІРАВЕЗО БО
ЗаТОМТІ ТІБ5І ЕРЕОЕАМУУСГОСБаУРУТЕРИОСТКІ ЕІКАТМААРБЗУБІЕРРБОЕОЇ КЗИатТАБММСІ.
ГММЕМРАЕАКМОМ/КМОМАЇ ОБЕМЗОЕЗМТЕООБКОБЗТУБІ 557 ТІ ЗКАЮОМЕКНКУМАСЕМТНОСІ.
ЗЗРУТКОЕМАИЕС (5ЕО І МО 24)
У одному варіанті здійснення, зв'язуючий ЇСО5 білок за даним винаходом являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, що містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга, вказану в 5ЕО ІЮ МО:23 і амінокислотну послідовность легкого ланцюга, вказану в
ЗЕО ІО МО:24. В одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІСО5 білок за даним винаходом додатково містить кістяк ПІДОРЕ.
У одному варіанті здійснення, представлений зв'язуючий ІСОБ5 білок або його антигензв'язуюча частина, де вказаний зв'язуючий ІСО5 білок являє собою гуманізоване моноклональне антитіло. Даний винахід стосується також фармацевтичних композицій, що містять зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуючу частину відповідно до формули винаходу і фармацевтично прийнятний носій.
Даний винахід стосується способів лікування захворювання, вибраного із злоякісної пухлини, інфекційного захворювання та/або сепсису у людини, що потребує цього, де спосіб включає стадію введення фармацевтичної композиції за даним винаходом вказаній людині. В одному аспекті, спосіб додатково включає введення щонайменше одного антинеопластичного засобу, щонайменше одного другого імуномодулюючого засобу талабо щонайменше одного імуностимулюючого ад'юванта вказаній людині. В одному аспекті, другий імуномодулюючий засіб вибраний з: антитіла проти СТІ А4 і антитіла проти РО-1, антитіла проти РОЇ ї антитіл проти ОХ40. В одному аспекті антитіло проти СТІ А4 являє собою іпілімумаб. В одному аспекті, антитіло проти РО-1 вибране з пембролізумабу та/або ніволумабу.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів лікування злоякісної пухлини у людини, що включає введення терапевтично прийнятної кількості зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини людині. У деяких аспектах злоякісна пухлина вибрана з колоректального раку (СКС), раку стравоходу, шийки матки, сечового міхура, молочної залози, голови і шиї, яєчників, меланоми, нирковоклітинного раку (КСС), плоскоклітинної ЕС, недрібноклітинної карциноми легенів, мезотеліоми і раку передміхурової залози.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів лікування інфекційного захворювання у людини, що включає введення терапевтично прийнятної кількості зв'язуючого
ЇСОЗ білка або його антигензв'язуючої частини людині. В одному аспекті інфекційне захворювання являє собою НІМ.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів лікування сепсису у людини, що включає введення терапевтично прийнятної кількості зв'язуючого ІЇСО5 білка або його антигензв'язуючої частини людині.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів стимуляції проліферації Т- клітин, включаючи активацію Т-клітин та/або індукцію продукції цитокінів у людини, що включає введення фармацевтичної композиції за винаходом вказаній людині.
Даний винахід також стосується полінуклеотидів, що кодують зв'язуючий ІЇСО5 білок або його антигензв'язуючу частину за даним винаходом. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується клітин-господарів, що містять полінуклеотиди, що кодують зв'язуючі ІСО5 білки або їх антигензв'язуючі частини за даним винаходом. Даний винахід також стосується
Зо способів отримання зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини, що включають стадії а) культивування клітини-господаря, що містить полінуклеотид, який кодує зв'язуючий
ЇСО5 білок або його антигензв'язуючу частину за даним винаходом, у придатних умовах для експресії вказаного зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини; і Б) виділення вказаного зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини.
Даний винахід стосується виділеного гуманізованого моноклонального антитіла, що містить домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮ МО:7; домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, вказану в ЗЕО ІЮО МО:8; і кістяк пПІдС4 або його варіант. В одному аспекті кістяк пПІдс4 являє собою пІдДС4АРЕ.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується зв'язуючих СО білків або їх антигензв'язуючих частин, де зв'язуючий ІСОЗ білок або його антигензв'язуюча частина проявляють перехресну конкуренцію за зв'язування з ІСО5 людини з еталонним антитілом або його антигензв'язуючої частиною, що містять домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮО МО;:7; і домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮ МО:8.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСО5З білки за винаходом стимулюють проліферацію
Т-клітин при приведенні в контакт з Т-клітинами. В одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСО5 білки за винаходом індукують активацію Т-клітин при приведенні в контакт з Т-клітинами.
Активацію Т-клітин можна вимірювати по збільшенню у відсотках рівнів експресії конкретних маркерів активації, таких як, але без обмеження, СО69, С025 та/або ОХ40. В одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСОЗ білки за даним винаходом стимулюють продукцію цитокінів при приведенні в контакт з Т-клітинами. Зв'язуючі ІСО5 білки зв'язуються з ЕсукІІб людини, але не зв'язуються з Есукі! людини або з ЕсукПШа людини. Крім того, зв'язуючі ІСО5 білки відповідним чином не виснажують експресуючі ІСО5 Т-клітини при приведенні в контакт з експресуючими
ІСО5 Т-клітинами. У деяких аспектах, зв'язуючі ІСОЗ білки перехресно зв'язують Т-клітину з другою клітиною при приведенні в контакт з вказаною Т-клітиною у присутності другої клітини.
Це перехресне зв'язування може відбуватися за допомогою залучення зв'язуючого ІСО5 білка за допомогою Есум. на другій клітині. Експресуючі ЕсукК клітини включають, але без обмеження, моноцити, В-лімфоцити, фолікулярні дендритні клітини, клітини природні кілери, макрофаги, нейтрофіли, еозинофіли, базофіли і мастоцити. Таким чином, в одному варіанті здійснення зв'язуючі ІСО5 білки можна вводити ссавцеві, де зв'язуючий ІСО5 білок може діяти як агоніст
ІСО5 на Т-клітини і може також залучати ЕсукК на другій клітині.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючі ІСО5 білки містять кістяк, вибраний з ізотипу Їдс1 людини або його варіанту та ізотипу (904 людини або його варіанту. Відповідним чином, кістяк містить ізотип Їд4 людини або його варіант. В одному аспекті кістяк містить кістяк пІдДС4РЕ.
У одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІСО5 білок являє собою моноклональне антитіло.
Придатний зв'язуючий ІСО5 білок являє собою гуманізоване моноклональне антитіло. В одному аспекті, моноклональні антитіла за даним винаходом можуть бути повністю людськими.
У іншому аспекті зв'язуючий ІСО5 білок являє собою фрагмент, що являє собою Раб, Раб",
Кар)», Ем, діатіло, триотіло, тетратіло, мініантитіло, мінітіло, виділений Мн або виділений М. В одному варіанті здійснення, зв'язуючий ІСО5 білок являє собою його антигензв'язуючу частину.
У деяких аспектах зв'язуючий ІСО5 білок зв'язується з ІСО5 людини з афінністю сильніше, ніж 0,6 НМ. В одному аспекті афінність складає 100 нМ або сильніше. В одному варіанті здійснення зв'язуючий ІСО5 білок має КО 100 нМ для ІСО5. Відповідним чином, КО зв'язуючого
ІСО5 білка для ІСО5 складає 100 нМ або менше, 50 нМ або менше, 25 нМ або менше, 10 нм або менше, 2 нМ або менше або 1 нМ або менше.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується гуманізованих моноклональних антитіл, що є агоністами для ІСО5 людини. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується гуманізованих моноклональних антитіл, що містять СОК варіабельної ділянки важкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, вказані в ЗЕО ІЮ МО:1; ЗЕО ІО МО 2; і
ЗБО ІО МОЗ їі СОМ варіабельної ділянки легкого ланцюга, що мають амінокислотні послідовності, вказані в 5ЕО ІЮ МО:4; 5ЕБО ІО МО:5; і 5БО ІО МО:6. В одному аспекті, гуманізоване моноклональне антитіло є здатним стимулювати продукцію цитокінів та/або проліферацію Т-клітин при приведенні в контакт з Т-клітинами, в той же час не індукуючи комплемент, АОСС або СОС. В одному варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло має варіант ділянки с ІдС1 людини. В одному варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло має ділянку Ес Ідб4 людини або її варіант. В одному варіанті здійснення гуманізоване моноклональне антитіло має ділянку Ес пІДСАРЕ Ес. В одному аспекті гуманізоване моноклональне антитіло містить домен Мн, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, як вказано в ХЕ
ІО МО:7; ії домен Мі, що містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, як вказано в 5ЕБЕО ІЮ МО:8. В одному аспекті гуманізоване моноклональне антитіло містить домен Мн, що містить амінокислотну послідовність, вказану в
ЗЕО ІЮО МО:7; і домен Мі, що містить амінокислотну послідовність, як вказано в ХЕО ІЮО МО:8. В одному аспекті гуманізоване моноклональне антитіло містить кістяк пІдС4РЕ. Більш того, показано, що гуманізовані моноклональні антитіла за даним винаходом стимулюють проліферацію Т-клітин при приведенні в контакт із СО4ж або СО8«Т-клітинами. Показано, що гуманізовані моноклональні антитіла за даним винаходом індукують активацію Т-клітин і стимулюють продукцію цитокінів.
У одному варіанті здійснення, гуманізоване моноклональне антитіло містить кістяк пПІдСАРЕ і містить Мн домен, що містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮ МО:7 і домені Мі, що містить амінокислотну послідовність, вказану в 5ЕО ІЮ МО:8. Антитіла за даним винаходом можуть стимулювати продукцію цитокінів при приведенні в контакт з Т-клітинами.
У одному варіанті здійснення представлений зв'язуючий ІСОБ5 білок, що конкурує за зв'язування з ЇСО5 з будь-яким із зв'язуючих ІСО5 білків за винаходом. Як зрозуміло в даній галузі та описано в даному описі, конкуренцію за зв'язування можна вимірювати за допомогою порівняння конкуренції із зв'язуванням ліганду з ІЇСО5 у присутності одного або декількох зв'язуючих ІСО5 білків. Як також відомо в даній галузі, ІСО5 експресується на СО4- і СОвТ- клітинах, так само як на клітинах Трег. Зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом діють як агоніст ІСО5 на Т-клітини. Вони діють також для блокування взаємодії між ІСО5-Ї і ІСО5, експресованих як на Т-клітинах, так і на клітинах Трег. Таким чином, в одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів блокування взаємодії ІСО5-Ї. з ІСО5 на клітинах
Трег. Експресуючі ІСО5 клітини Трег можна виявити на різних типах пухлин, включаючи гемобластози, такі як лімфома. Таким чином, в одному аспекті даний винахід стосується способів лікування злоякісних пухлин, що включають введення зв'язуючого ІСОЗ білка за винаходом, де зв'язуючий ІСО5 білок блокує взаємодію ІСОЗ5-Ї з ІСО5 на клітинах Трег.
Крім того, винахід стосується фармацевтичних композицій, що містять зв'язуючий білок або моноклональне антитіло ІСО5, описані в даному описі. В одному аспекті фармацевтична композиція за даним винаходом додатково містить щонайменше один антинеопластичний засіб. 60 В одному аспекті фармацевтична композиція за даним винаходом додатково містить щонайменше один другий імуномодулюючий засіб. В одному аспекті фармацевтична композиція за даним винаходом додатково містить щонайменше один імуностимулюючий ад'ювант.
У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів лікування злоякісної пухлини та/або інфекційного захворювання у людини, де вказаний спосіб включає стадію введення фармацевтичної композиції за винаходом вказаній людині. В одному варіанті здійснення людина має злоякісну пухлину. В одному варіанті здійснення людина має інфекційне захворювання. В одному варіанті здійснення людина має НІМ. В одному аспекті спосіб додатково включає введення щонайменше одного антинеопластичного засобу вказаній людині.
В іншому аспекті спосіб додатково включає введення щонайменше одного другого імуномодулюючого засобу вказаній людині. В іншому аспекті спосіб додатково включає введення імуностимулюючого ад'юванту вказаній людині.
У одному аспекті, людина має солідну пухлину. В одному аспекті пухлина вибрана з раку голови і шиї, раку шлунка, меланоми, нирковоклітинного раку (КСС), раку стравоходу, недрібноклітинної карциноми легенів, раку передміхурової залози, колоректального раку, раку яєчника і раку підшлункової залози. В одному аспекті, людина має одне або декілька з наступного: колоректального раку (СКС), раку стравоходу, шийки матки, сечового міхура, молочної залози, голови і шиї, яєчників, меланоми, нирковоклітинного раку (КСО), плоскоклітинного ЕС, недрібноклітинної карциноми легенів, мезотеліоми і раку передміхурової залози. В іншому аспекті людина має гемобластоз, такий як дифузна великоклітинна В-клітинна лімфома (0ГВСІ), множинна мієлома, хронічний лімфобластний лейкоз (СІ! /)3, фолікулярна лімфома, гострий мієлоїдний лейкоз і хронічний мієлогенний лейкоз.
Даний опис стосується також способу лікування або зменшення важкості злоякісної пухлини, вибраної з: злоякісних пухлин головного мозку (гліом), гліобластом, синдрому Банаяна-Зонана, хвороби Каудена, хвороби Лермітта-Дюкло, раку молочної залози, запального раку молочної залози, пухлини Вільмса, саркоми Юінга, рабдоміосаркоми, епендимоми, медулобластоми, злоякісних пухлин товстої кишки, голови і шиї, нирки, легені, печінки, меланоми, яєчника, підшлункової залози, передміхурової залози, саркоми, остеосаркоми, гігантоклітинної пухлини кістки, раку щитовидної залози, лімфобластного Т-клітинного лейкозу, хронічного мієлогенного
Зо лейкозу, хронічного лімфоцитарного лейкозу, волосатоклітинного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, гострого мієлогенного лейкозу, хронічного нейтрофільного лейкозу, гострого лімфобластного Т-клітинного лейкозу, плазмацитоми, імунобластного крупноклітинного лейкозу, лейкозу з клітин мантійної зони, множинної мієломи, мегакаріобластного лейкозу, множинної мієломи, гострого мегакаріобластного лейкозу, промієлоцитарного лейкозу, еритролейкозу, злоякісної лімфоми, лімфоми Ходжкіна, неходжкінської лімфоми, лімфобластної
Т-клітинної лімфоми, лімфоми Беркітта, фолікулярної лімфоми, нейробластоми, раку сечового міхура, уротеліального раку, раку легені, раку жіночих зовнішніх статевих органів, раку шийки матки, раку ендометрія, раку нирки, мезотеліоми, раку стравоходу, злоякісної пухлини слинних залоз, печінковоклітинного раку, раку шлунка, назофарингеального раку, злоякісної пухлини щоки, злоякісної пухлини ротової порожнини, СІ5Т (стромальної пухлини шлунково-кишкового тракту) і раку яєчка.
Під терміном "лікування" і його граматичними варіантами, у рамках винаходу, розуміють терапевтичне лікування. По відношенню до конкретного стану, лікування означає: (1) полегшення або запобігання стану або одного або декільком біологічним проявам стану, (2) створення перешкод для (а) однієї або декількох точок у біологічному каскаді, що приводить до стану або відповідальному за стан, або (Б) одного або декількох біологічних проявів стану, (3) полегшення одного або декількох із симптомів, ефектів або побічних ефектів, асоційованих із станом або його лікуванням, (4) уповільнення прогресування стану або одного або декількох біологічних проявів стану, та/або (5) лікування вказаного стану або одного або декількох біологічних проявів стану за допомогою припинення або зменшення до рівнів одного або декільком біологічних проявів стану, які не піддаються детекції, на період часу, що розглядається як стан ремісії для цього прояву без додаткового лікування протягом періоду ремісії. Фахівцеві в даній галузі зрозуміла тривалість часу, яку можна розглядати як ремісію для конкретного захворювання або стану. Профілактичне лікування також передбачають таким чином. Фахівцеві в даній галузі зрозуміло, що "запобігання" не є абсолютним терміном. У медицині, "запобігання" розуміють як таке, що стосується профілактичного введення лікарського засобу для значного зменшення вірогідності або важкості стану або його біологічного прояву, або для затримки початку такого стану або його біологічного прояву. Профілактичне лікування є придатним, наприклад, коли суб'єкта вважають схильним до високого ризику розвитку злоякісної пухлини, наприклад, коли суб'єкт має обтяжений родинний анамнез злоякісних пухлин або коли суб'єкт піддається дії канцерогену.
У рамках винаходу, терміни "злоякісна пухлина", "неоплазія" і "пухлина" використовують взаємозамінно і, у формі або єдиного, або множинного числа, вони стосуються клітин, підданих злоякісній трансформації, що робить їх патологічними для організму-господаря. Первинні клітини злоякісних пухлин можна легко відрізняти від незлоякісних клітин за допомогою добре розроблених способів, зокрема, гістологічного дослідження. Визначення клітини злоякісної пухлини, в рамках винаходу, включає не лише клітину злоякісної пухлини, але і будь-яку клітину, що походить з попередника клітин злоякісних пухлин. Вони включають метастазуючі клітини злоякісних пухлин, і культури і лінії клітин іп міго, що походять з клітин злоякісних пухлин. По відношенню до типу злоякісних пухлин, які зазвичай проявляються як солідні пухлини, пухлина "що піддається клінічній детекції" являє собою пухлину, яку можна детектувати на підставі маси пухлини; наприклад, такими способами, як сканування комп'ютерної томографії (СТ), магнітно- резонансна томографія (МРТ), рентгенівський аналіз, ультразвукове дослідження або пальпація при фізичному обстеженні, та/або яку можна детектувати завдяки експресії одного або декількох специфічних для злоякісної пухлини антигенів у зразку, який можна отримувати від пацієнта. Пухлини можуть являти собою гематопоетичні (або гематологічні, або пов'язані з кров'ю) злоякісні пухлини, наприклад, злоякісні пухлини, що походять з клітин крові або імуноцитів, які можна позначати як "гемобластози". Конкретні приклади клінічних станів, заснованих на гематологічних пухлинах, включають лейкози, такі як хронічний мієлоцитарний лейкоз, гострий мієлоцитарний лейкоз, хронічний лімфоцитарний лейкоз і гострий лімфоцитарний лейкоз; злоякісні новоутворення плазматичних клітин, такі як множинна мієлома, МОЗ і макроглобулінемія Вальденстрема; лімфоми, такі як неходжкінська лімфома, лімфома Ходжкіна; і тощо.
Злоякісна пухлина може являти собою будь-яку злоякісну пухлину, в якій присутня аномальна кількість бластних клітин або небажана проліферація клітин, або яка діагностована як гематологічна злоякісна пухлина, включаючи як лімфоїдні, так і мієлоїдні злоякісні новоутворення. Мієлоїдні злоякісні новоутворення включають, але без обмеження, гострий мієлоїдний (або мієлоцитарний або омієлогенний або мієлобластний) лейкоз
Зо (недиференційований або диференційований), гострий промієлоїдний (або промієлоцитарний або промієлогенний або промієлобластний) лейкоз, гострий мієломоноцитарний (або мієломонобластний) лейкоз, гострий моноцитарний (або монобластний) лейкоз, еритролейкоз і мегакаріоцитарний (або мегакаріобластний) лейкоз. Ці лейкози разом можна позначати як гострий мієлоїдний (або мієлоцитарний, або мієлогенний) лейкоз (АМІ). Мієлоїдні злоякісні новоутворення включають також мієлопроліферативні порушення (МРО), що включають, але без обмеження, хронічний мієлогенний (або мієлоїдний) лейкоз (СМ), хронічний мієломоноцитарний лейкоз (СММУ), есенціальну тромбоцитемію (або тромбоцитоз), і справжню поліцитемію (РСМ). Мієлоїдні злоякісні новоутворення включають також мієлодисплазію (або мієлодиспластичний синдром, або МОБ), яку можна позначати як несприйнятливу анемію (КА), несприйнятливу анемію з надлишком бластів (КАЕВ), і несприйнятливу анемію з надлишком бластів на стадії трансформації (КАЕВТ); так само як мієлофіброз (МЕ5) у присутності або у відсутність агногенної мієлоїдної метаплазії.
Гематопоетичні злоякісні пухлини включають також лімфоїдні злоякісні новоутворення, які можуть уражати лімфатичні вузли, селезінку, кістковий мозок, периферичну кров та/або екстранодальні ділянки. Лімфоїдні злоякісні пухлини включають В-клітинні злоякісні новоутворення, що включають, але без обмеження, В-клітинні неходжкінські лімфоми (В-МНІ).
В-МНІ. можуть бути індолентними (або мати низький ступінь злоякісності), мати проміжний ступінь злоякісності (або бути агресивними) або мати високий ступінь злоякісності (бути дуже агресивними). Індолентні В-клітинні лімфоми включають фолікулярну лімфому (Р); дрібнолімфоцитарну лімфому (ЗІ); лімфому маргінальної зони (М2Ї) включаючи нодальну
МА, екстранодальну М2Ї, МА селезінки і МАЇ селезінки з ворсинчастими лімфоцитами; лімфоплазматичну лімфому (ГРІ); і лімфому лімфоїдної тканини, асоційованої із слизистою оболонкою (МАГ Т або екстранодальну лімфому маргінальної зони). В-МНІ. проміжного ступеня злоякісності включають лімфому з клітин мантійної зони (МС) із залученням або без залучення лейкозу, дифузну великоклітинну лімфому (ОЇ ВСІ), фолікулярну великоклітинну лімфому (або лімфому ступеня З або ступеня ЗВ), і первинну медіастинальну лімфому (РМ). В-МНІ. високого ступеня злоякісності включають лімфому Беркітта (ВІ), лімфому, схожу на лімфому Беркітта, дрібноклітинну лімфому з нерозітнутими ядрами (ЗМСОСІ) і лімфобластну лімфому. Інші В-МНІ. включають імунобластну лімфому (або імуноцитому), первинну випітну лімфому, асоційовані з бо НІМ (або пов'язані зі СНІД) лімфоми, і посттрансплантаційне лімфопроліферативне порушення
(РТІО) або лімфому. В-клітинні злоякісні новоутворення включають також, але без обмеження, хронічний лімфоцитарний лейкоз (СІ), пролімфоцитарний лейкоз (РІГ), макроглобулінемію
Вальденстрема (УУМ), волосатоклітинний лейкоз (НС), лейкоз великих гранулярних лейкоцитів (СІ), гострий лімфоїдний (або лімфоцитарний або лімфобластний) лейкоз, і хворобу
Кастлмана. МНІ можуть включати також Т-клітинні неходжкінські лімфоми (Т-МНІ), які включають, але без обмеження, неуточнену Т-клітинну неходжкінську лімфому (МОБ), периферичну Т-клітинну лімфому (РТСІ), анапластичну крупноклітинну лімфому (АГ СІ), ангіомунобластне лімфоїдне порушення (АЇ-О), лімфому клітин природних кілерів (МК) /Т- клітин носової порожнини, лімфому гамма/дельта-Т-клітин, Т-клеійтинну лімфому шкіри, фунгоїдний мікоз і синдром Сезарі.
Гематопоетичні злоякісні пухлини включають також лімфому (або хворобу) Ходжкіна, включаючи класичну лімфому Ходжкіна, нодулярну склерозуючу лімфому Ходжкіна, змішано- клітинну лімфому Ходжкіна, лімфому Ходжкіна з переважанням лімфоцитів (І Р), нодулярну І Р лімфому Ходжкіна і лімфому Ходжкіна з лімфоїдним виснаженням. Гематопоетичні злоякісні пухлини включають також захворювання або злоякісні пухлини плазматичних клітин, такі як множинна мієлома (ММ), включаючи ММ з повільним перебігом, моноклональна гаммопатія невизначеного (або невідомого, або неясного) генезу (МОИ5), плазмацитома (кістки, екстрамедулярну), лімфоплазматична лімфома (ГРІ), макроглобулінемія Вальденстрема, лейкоз плазматичних клітин і первинний амілоїдоз (АГ). Гематопоетичні злоякісні пухлини можуть включати також інші злоякісні пухлини додаткових гематопоетичних клітин, включаючи поліморфноядерні лейкоцити (або нейтрофіли), базофіли, еозинофіли, дендритні клітини, тромбоцити, еритроцити і клітини природні кілери. Тканини, що включають гематопоетичні клітини, позначені в даному описі як "тканині гематопоетичних клітин", включають кістковий мозок; периферичну кров; тимус; і периферичні лімфоїдні тканини, такі як тканини селезінки, лімфатичні вузли, лімфоїдні тканини, асоційовані із слизистими оболонками (такі як лімфоїдні тканини, асоційовані з кишечником), тканини мигдалин, пейерових бляшок і апендикса, і лімфоїдні тканини, асоційовані з іншими слизистими оболонками, наприклад, вистилкою бронхів.
Зв'язуючі ІСО5 білки, антитіла та антигензв'язуючі фрагменти за винаходом можна також
Зо використовувати для виліковування, запобігання або лікування інфекцій та інфекційних захворювань. Зв'язуючі ІЇСО5 білки можна використовувати окремо або в комбінації з вакцинами, для стимуляції імунної відповіді на патогени, токсини й власні антигени. Зв'язуючі
ЇСОЗ білки за даним винаходом можна використовувати для стимуляції імунної відповіді на віруси, інфекційні для людини, такі як, але без обмеження, віруси імунодефіциту людини, віруси гепатиту класу А, В ї С, вірус Епштейна-Барр, цитомегаловірус людини, віруси папіломи людини, віруси герпесу. Зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом можна використовувати для стимуляції імунної відповіді на інфекції бактерійними або грибковими паразитами та іншими патогенами. Відповідним чином, даний винахід стосується способів лікування людей, що піддалися дії конкретних токсинів або патогенів. Відповідно, інший аспект винаходу стосується способу лікування інфекційного захворювання у суб'єкта, що включає введення суб'єктові зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини.
Приклади інфекційного захворювання, при якому можна використовувати зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом, включають, але без обмеження, НІМ, гепатит (А, В, і С), грип, герпес, інфекцію жіардія, малярію, інфекцію Іеї5птапіа, ейгарпуіососси5 ацйгеи5, Рзейдотопав5
Аегидіпоза. Деякі приклади патогенних вірусів, що викликають інфекції, які можна лікувати способами за винаходом, включають НІМ, гепатит (А, В або С), вірус герпесу (наприклад, МАМ,
Н5М-1, НАМУ-6, НБЗУ-П, ії СММ, вірус Епштейна-Барр), аденовірус, вірус грипу, флавівіруси, еховірус, риновірус, вірус Коксаки, коронавірус, респіраторно-синцитіальний вірус, вірус свинки, ротавірус, вірус кору, вірус краснухи, парвовірус, вірус осповакцини, вірус НТІ М, вірус Денге, папіломавірус, вірус молюска, вірус поліомієліту, вірус сказу, вірус УС і вірус арбовірусного енцефаліту.
Деякі приклади патогенних бактерій, що викликають інфекції, які можна лікувати способами за винаходом, включають хламідії, рикетсіозні бактерії, мікобактерії, стафілококи, стрептококи, пневмококи, менінгококи і гонококи, клебсієлу, протей, серратію, псевдомонади, легіонели, бактерії що викликають дифтерію, сальмонели, бацили, бактерії, що викликають холеру, правець, ботулізм, сибірську виразку, чуму, лептоспіроз і хворобу Лайма.
Деякі приклади патогенних грибів, що викликають інфекції, які можна лікувати способами за винаходом, включають Сапаїйда (аїбісап5, Кгизеї, діаргага, ігорісаїй5 і тощо), Сгуріососси5 пеоїогтап5, Азрегойив5 (Титідайв5, підег і тощо), рід МисогаІе5 (тисог, арвзідіа, гпігорпив5),
зрогоїйгіх зспепкії, Віазіотусев дептаййіаїй5, Рагасоссідіоіїде5 Бгазійепвзі5, Соссідіоіде5 ітти5 і
Нізіоріахт сарзшайшт.
Деякі приклади патогенних паразитів, що викликають інфекції, які можна лікувати способами за винаходом, включають Епіатоера Півіоїуїйса, Ваїапіідіит соїї, Маедієегпагоулетгі, види
Асапіпатоебра, Сіагайа Іатбріа, види Сгуріозрогідішт, Рпештосузіїй5 сагіпії, Ріазтоаічт мімах,
Вабрезіа тісгоїї, Ттурапозота бБгисеї, Ттгурапозота сги?зі, І еїізптапіа допомапі, Тохоріазта допаі і
Міррозігтопдуїив БгавзіПепвів.
Сепсис являє собою потенційно смертельний медичний стан, що характеризується запальним станом всього організму (називаним синдромом системної запальної відповіді або
ЗІК5) і присутністю відомої або передбачуваної інфекції. Організм, за допомогою імунної системи, може розвивати цю запальну відповідь на мікроорганізми в крові, сечі, легенях, шкірі або інших тканинах. Просторічним терміном для сепсису є зараження крові, що точніше відповідає септицемії, нижче. Важкий сепсис являє собою системну запальну відповідь, плюс інфекція, плюс присутність дисфункції органів.
Септицемія є спорідненим медичним терміном, що стосується присутності патогенних організмів у кровотоку, що призводить до сепсису. Термін не є строго визначеним.
Сепсис і злоякісна пухлина розділяють схожі імуносупресивні механізми, включаючи збільшення кількості регуляторних Т-клітин, збільшення кількості супресорних клітин мієлоїдного походження, збільшення експресії молекул для негативної костимуляції, зменшення експресії НСА-ОК на моноцитах/макрофагах. Сепсис і злоякісна пухлина є прототиповими порушеннями для хронічного запалення. СПгопіс іпПаттайіоп війтшіаев роїепі апа 5ивіаїпей іттипогедшіаюгу гезропзев, іпсішаїпу ехрапзіоп ої Т гедшайогу клітини апа ир-гедшайоп ої РО-1 апа оїШйег педаїїме гедшіайт5 оп еМесіог клітини. Вагоисі! О.Н. апа ЮОєекв 5.23.; Іттипоіодіс зігатедієв Тог НІМ-1 гетіввіоп апа егадісайоп. бсіепсе 345:169-174 2014. Таким чином, в одному аспекті даного винаходу представлені способи лікування сепсису у людини, що потребує цього, які включають введення терапевтично ефективної кількості антигензв'язуючого білка для ІСО5 за даним винаходом вказаній людині. Воотег", еї а. "АМ 306:2594-2605 (2011); Меїзеї, єї аї.
Стапиосуїє-тасторнаде соіопу-зіїтиаййпод Тасіог (о гемегзе 5зервів-аззосіаїєд іттипозирргезвіоп: а доцбіе-бріїпа, гапдотігед, ріасеро-сопігоПей тийісепієг а!ї. Ат У Незріг Сіїї Саге Мей 180:640-
Зо 648 (2009); і Наї),, єї а. Іттипорагаїузі5 апа позосотіаї! іп'єстіоп іп спідгеп мйй тийріє огдап дувіипсіп зупаготе. Іпіепвзіме Саге Меа 37:525-532 (2011).
Зв'язуючі ІСОБ5 білки за винаходом можна використовувати у поєднанні з іншими рекомбінантними білками та/або пептидами (такими як антигени пухлин або клітини злоякісних пухлин) для збільшення імунної відповіді на ці білки (тобто, у протоколі вакцинації).
Наприклад, зв'язуючі ІСО5 білки можна використовувати для стимуляції антигенспецифічних імунних відповідей за допомогою спільного введення щонайменше одного зв'язуючого СО білка з антигеном, що представляє інтерес (наприклад, вакциною).
Відповідно, в іншому аспекті винахід стосується способу посилення імунної відповіді на антиген у суб'єкта, що включає введення суб'єктові: (і) антигена; і (її) зв'язуючого ІСО5 білка за винаходом, так що імунна відповідь на антиген у суб'єкта посилюється. Антиген може являти собою, наприклад, антиген пухлини, вірусний антиген, бактеріальний антиген або антиген з патоген. Необмежуючі приклади таких антигенів включають, без обмеження, антигени пухлин або антигени з вірусів, бактерій або інших патогенів.
Основною трудністю для знищення НІМ є збереження латентно інфікованих клітин, не експресуючих вірусні антигени, та уникаючих імунного нагляду. Сучасний спосіб знищення латентних вірусних резервуарів, позначений як спосіб "розбудити і знищити", має на меті реактивувати експресію гена НІМ ("розбудити"), оскільки активація клітин приводить до реактивації НІМ, і вивести реактивування клітини ("знищити"). Активація клітин управляється рівновагою позитивних і негативних регуляторів, експресованих на поверхні Т-клітин. Зміна цієї рівноваги за допомогою агонізму позитивних регуляторів і антагонізму негативних регуляторів може полегшувати реактивацію НІМ.
Індукований костимулятор Т-клітин (ІСбО5) є позитивним регулятором, експресія якого збільшується на С04 Т-клітинах після стимуляції. ІСО5 функціонує для стимуляції проліферації
Т-клітин, продукції цитокінів і диференціювання Т-клітин. Однією важливою підгрупою Т-клітин, які експресують високі рівні РО-1 і ІСО5, є фолікулярні Т-клітини-помічники (ТТ). Клітини ТІ допомагають В-клітинам піддаватися диференціюванню, перемиканню класів, соматичній гіпермутації, і є необхідними для формування зародкового центру. Клітини ТТ значно розмножуються після інфекції НІМ/5ІМ, та їх дисрегуляція в ході хронічної лентивірусної інфекції вносить вклад до порушеного В-клітинного імунітету. Показано, що відсортовані клітини тп бо містять вищі рівні ДНК НІМ, ніж інші лімфоїдні підгрупи СО4, і спостерігають збільшення кількості вірусу після стимуляції. Клітини ТІЙ містяться в зародкових центрах і піддаються дії віріонів НІМ, що утримуються на фолікулярних дендритних клітинах, які можуть полегшувати їх інфекцію.
Крім того, СЮО8 Т-клітини мають обмежений доступ до зародкових центрів, і фолікулярні клітини
СО8 часто мають зменшену цитотоксичність, таким чином, оберігаючи клітини Ті від противірусного нагляду. Таким чином, клітини ТЯ є важливим захищеним резервуаром НІМ, і способи, націлені на РО-1 їі ІСО5, можуть вибірково націлюватися на клітини ТІЙ і є корисними як частина режиму лікування НІМ. Відповідним чином, представлені способи лікування людини, інфікованої НІМ, що включають введення зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини за даним винаходом.
У рамках винаходу "антигени пухлин" являють собою білки, що продукуються клітинами пухлин, викликають імунну відповідь, зокрема, опосередковані Т-клітинами імунні відповіді.
Термін "антиген пухлини", у рамках винаходу, включає як пухлиноспецифічні антигени і пухлиноасоційовані антигени. Пухлиноспецифічні антигени є унікальними для клітин пухлин і не зустрічаються на інших клітинах організму. Пухлиноасоційовані антигени не є унікальними для клітин пухлини, і замість цього, експресуються також на нормальних клітинах в умовах, які не можуть індукувати стан імунологічної толерантності до антигена. Експресія антигена на пухлині може відбуватися в умовах, що дозволяють імунній системі відповідати на антиген.
Пухлиноасоційовані антигени можуть являти собою антигени, експресовані на нормальних клітинах у ході розвитку плоду, коли імунна система є незрілою і нездібною відповідати, або вони можуть являти собою антигени, які в нормі присутні на незвичайно низьких рівнях на нормальних клітинах, але які експресуються на набагато вищих рівнях на клітинах пухлин.
Необмежуючі приклади антигенів пухлин включають наступні: антигени диференціювання, такі як МАКТ-1/Меїап (МАНТ-ЇІ), др100 (Рітеї 17), тирозиназа, ТКР-1, ТАР-2 і пухлиноспецифічні мультилінейні антигени, такі як антигени сімейства МАСЕ, включаючи, але без обмеження,
МАСЕЇ, МАСЕЗ, МАСЕТО, МАСЕЛ, МАСЕТ2, МАСЕА2, МАСЕАЗ, МАСЕАЯ4, МАСЕАб,
МАСЕА8, МАСЕАЗ, МАСЕВ18, МАСЕВб, МАВЕСІ, МАСЕЮО2, МАСЕЕЇ, МАСЕНІ, МАСЕЇ2,
ВАСЕ, САСЕ-1, САСЕ-2, р15; МЕЇ4, асоційований з меланомою антиген 1005, антиген меланоми одр100, МКІРЗ, МУ548, ОСІАО1, ОБА-ІЇЇ КР, ОІР5Б, асоційований з карциномою яєчників антиген (0М632), РАСЕ4, РАКРОУ, РАТЕ, пластин Ї, РКАМЕ, простатспецифічний антиген,
Зо протеаза 3, простеїн, Кедза, КЕНАММ, КОРМІ, ЗАКТ2, ЗБОССАСВ, ЗЕЇ 1І, 5ЕРТІ, 51 С45А2,
ЗРАМХ, 55Х55, 5ІХОАЇ МАСІ, 5ТЕАР4, сурвівін, ТВС102, ТЕМІ, ТЕРІ, антигени пухлин епітеліального походження, ХАСЕ1, ХАСЕ2, УМТ-1; надекспресовані ембріональні антигени, такі як СЕА; надекспресовані онкогени і мутантні гени супресорів пухлин, такі як р53, Ка, НЕК- 2/пеи; унікальні антигени пухлин, що виникають у результаті хромосомних транслокацій; такі як
ВСВ-АВІ, ЕгА-РВЇ, Н4А-ВЕТ, ІСН-ІОК, МУ -КАБК; і вірусні антигени, такі як антигени вірусу
Епштейна-Барр ЕВМУ і антигени Еб і Е7 папіломавірусу людини (НРМ).
Інші антигени пухлин включають, але без обмеження, Т5Р-180, МАСЕ-4, МАСЕ-5, МАСЕ-6,
ВАСЕ, МУ-Е5О, рівбетьвг, рі8бетгЬв-3, с-теї, пт-2ЗНІ, РБА, ТАС-72, С 19-9, Сб 72-4, САМ 171,
МиМа, К-газ, бета-катенін, СОК4, Мит-ї1, р 15, р 16, 43-9Е, 5Т4, 791Тодр72, альфа-фетопротеїн, бета-НСО, ВСА225, ВТАА, С 125, С 15-30 27, 29ХВСАА, С 195, С 242, СА-50, САМАЗ, СОбВРІ,
СО-029, РСаБ-5, 4250, Са7ЗЗ3єЕРрСАМ, НТар-175, М344, МА-50, МЕС7-Ад, МОМ18, МВ/7ОК, МУ-СО- 1, АВСАБІ, 5БОССАСІ16, ТА-90зв'язуючий Мас-2 білокасоційований з циклофіліном С білок,
ТААІ 6, ТАС72, ТІР, ТРБ5, асоційований з гліомою антиген, В-субодиницю хоріонічного гонадотропіну людини, альфафетопротеїн (АЕР), реакційноздатний по відношенню до лектину
АЕР, тиреоглобулін, КАСЕ-1, ММ-С ІХ, зворотну транскриптазу теломерази людини, КОТ, КИО2 (А5), карбоксилестеразу кишечника, тиї п5р70-2, М-С5Е, простазу, простатспецифічний антиген (РБА), РАР, МУ-ЕБ5О-1, І АСЕ-1а, р53, простеїн, РОМА, Негг/пеи, сурвівін і теломеразу, антиген-1 пухлини карциноми передміхурової залози (РСТА-1), ЕГЕ2М, еластазу нейтрофілів, ефрин В2, СО19, 2020, 2022, КОК!І1, СОЗЗЛІ ЗКа, с-Меї, РЗМА, гліколіпід Е77, ЕСЕЕМП, 0-2, інсуліновий чинник зростання (ІСЕ)-І, ІСЕ-ІІ, рецептор ІСЕ-І і мезотелин.
Як правило, будь-який антинеопластичний засіб, що має активність проти чутливої пухлини, що піддається лікуванню, можна вводити спільно при лікуванні злоякісної пухлини за даним винаходом. Приклади таких засобів можна виявити в Сапсег Ргіпсіріє5 апа Ргасіїсе ої ОпсоЇоду ру У.Т. Оеміїа апа 5. НеїІтап (едіюгв), бій едйоп (Ребгиагу 15, 2001), Іірріпсой УМ ПШіатв5 8 УМїКіпе
Рибріїзнйеге. Фахівець у даній галузі здатний розрізняти, які комбінації засобів можна використовувати на підставі конкретних характеристик розглядуваних лікарських засобів і злоякісних пухлин. Типові антинеопластичні засоби, які можна використовувати за даним винаходом, включають, але без обмеження, засоби проти мікротрубочок, такі як дитерпеноїди та алкалоїди барвінку; координаційні комплекси платини; алкілуючі засоби, такі як азотисті бо іприти, оксазафосфорини, алкілсульфонати, нітрозосечовина і триазени; засоби - антибіотики,
такі як антрацикліни, актиноміцини і блеоміцини; інгібітори топоіїзомерази І, такі як епіподофілотоксини; антиметаболіти, такі як аналоги пурину і піримідину і антифолатні сполуки; інгібітори топоізомерази І, такі як камптотецини; гормони й аналоги гормонів; інгібітори шляхів передачі сигналу; інгібітори зв'язаних з ангіогенезом нерецепторних тирозинкіназ; імунотерапевтичні засоби; проапоптотичні засоби; і інгібітори передачі сигналів клітинного циклу.
Прикладами додаткового активного інгредієнта або інгредієнтів для застосування в комбінації або для спільного введення з даним зв'язуючим ЇСО5 білком є антинеопластичні засоби, включаючи будь-які хіміотерапевтичні засоби, імуномодулюючі засоби або імуномодулятори та імуностимулюючі ад'юванти.
Засоби проти мікротрубочок або антимітотичні засоби являють собою специфічні для фази засоби, активні проти мікротрубочок клітин пухлин у ході фази М або фази мітозу клітинного циклу. Приклади засобів проти мікротрубочок включають, але без обмеження, дитерпеноїди й алкалоїди барвінку.
Дітерпеноїди, що походять з природних джерел, являють собою специфічні для фази протиракові засоби, що діють у фазах С2/М клітинного циклу. Вважають, що дитерпеноїди стабілізують В-субодиницю тубуліну мікротрубочок, за допомогою зв'язування з цим білком.
Потім розбирання білка, мабуть, інгібується, з арештом мітозу і подальшою загибеллю клітин.
Приклади дитерпеноїдів включають, але без обмеження, паклітаксел і його аналог доцетаксел.
Паклітаксел 58,20-епокси-1,2а,4,78,108р8,1За-гекса-гідрокситакс-11-ен-9-он-4,10-діацетат-2- бензоат-13-ефір з (2Е, 35)-М-бензоїл-3-фенілізосерином; являє собою природний дитерпеновий продукт, виділений з тису тихоокеанського Тахиз Бгеміїоїї, і є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину ТАКСОЛО). Він є членом таксанового сімейства терпенів. Він вперше виділений в 1971 Умапі еї аїІ. У. Ат. Спет, 50с., 93:2325. 1971), що охарактеризували його структуру хімічними і рентгенокристалографічними способами. Один з механізмів для його активності стосується здатності паклітакселу зв'язувати тубулін, таким чином, інгібуючи зростання клітин злоякісних пухлин. ЗСПІЙ єї а!., Ргос. Маї!, Асад, сі. ОБА, 77:1561-1565 (1980);
ОСП єї аї., Майте, 277:665-667 (1979); Китаг, 9. Віої, Спет, 256: 10435-10441 (1981). Огляд синтезу і протиракової активності деяких похідних паклітакселу див. у: О. (сх. І. Кіпдвюоп еї аї.,
Зо зіцаїез іп Огдапіс Спетівігу мої. 26, озаглавленою "Мем/ ігепав5 іп Майштга! Ргодисів Спетівігу 1986", Анаш-Наптап, Р.МУ. Їе СОцезпе, Еав. (ЕІбемієї, Атвівегдат, 1986) рр 219-235.
Паклітаксел схвалений для клінічного застосування для лікування несприйнятливого раку яєчника в Сполучених Штатах (Мажпт есеї аї!., МаІе Чоигпаї ої Віооду апа Меадісіпе, 64:583, 1991;
Месеніге єї аї!., Апп. Іпіїет, Мед., 111:273,1989) і для лікування раку молочної залози (НоїЇтез еї а), У. Маї. Сапсег Іпві., 83:1797,1991.). Він є потенційним кандидатом для лікування неоплазій шкіри (Еіпгід еї. а)І., Ргос. Ат. бос. Сіїп. Опсої!., 20:46) і карцином голови і шиї (Еогазіїге еї. аї.,
Зет. Опсої., 20:56, 1990). Для сполуки показаний також потенціал для лікування полікистозу нирок (Мусо еї. аї., Маїиге, 368:750. 1994, раку легені і малярії. Лікування пацієнтів паклітакселом приводить до придушення кісткового мозку (безліч ліній клітин, Ідпой, К.9. еї. аїЇ, Сапсег
Спетоїпегару РосКеї Сціде, 1998), пов'язаною з тривалістю дозування вище порогової концентрації (50 нМ) (Кеагп5, С.М. еї. аІ., хХетіпаг5 іп Опсоіоду, З(6) р.16-23, 1995).
Доцетаксел (2К, 35)-М-карбокси-3-фенілізосерин, М-трет-бутиловий ефір, 13-ефір з 58-20- епокси-1,2а,4,78,10рД,1За-гексагідрокситакс-11-ен-9-он-4-ацетат-2-бензоатом, тригідратом; є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину як ТАКСОТЕРФ). Доцетаксел рекомендований для лікування раку молочної залози. Доцетаксел є напівсинтетичним похідним паклітакселу д.м., отриманого з використанням природного попередника, 10-деацетил-баккатину
І, екстрагованого з голок європейського тису. Обмежувальна дозу токсичність доцетакселу являє собою нейтропенію.
Алкалоїди барвінку являють собою специфічні для фази антинеопластичні засоби, отримані з рослини барвінку. Алкалоїди барвінку діють у фазі М (мітозу) клітинного циклу за допомогою специфічного зв'язування з тубуліном. Отже, зв'язана молекула тубуліну нездібна полімеризуватися в мікротрубочки. Вважають, що відбувається арешт мітозу в метафазі з подальшою загибеллю клітин. Приклади алкалоїдів барвінку включають, але без обмеження, вінбластин, вінкристин і вінорелбін.
Вінбластин, сульфат вінкалейкобластину, є комерційно доступним як ВЕЛБАНО у формі придатного для ін'єкцій розчину. Хоча для нього можливі рекомендації як терапія другої лінії для різних солідних пухлин, він у першу чергу рекомендований для лікування раку яєчка і різних лімфом, включаючи хворобу Ходжкіна; і лімфоцитарну і гістіоцитарні лімфоми. Мієлосупресія є обмежувальним дозу побічним ефектом вінбластину.
Вінкристин, вінкалейкобластин, 22-оксо-, сульфат, є комерційно доступним як ОНКОВІНФ у формі придатного для ін'єкцій розчину. Вінкристин рекомендований для лікування гострих лейкозів і також знаходить застосування у режимах лікування злоякісної лімфоми Ходжкіна і неходжкінських злоякісних лімфом. Алопеція і неврологічні ефекти є найбільш поширеним побічним ефектом вінкристину, і у меншій мірі зустрічаються ефекти мієлосупресії і мукозиту шлунково-кишкового тракту.
Вінорелбін, 3 4-дидегідро-4-дезокси-С-норвінкалейкобластину ІК-(А",А)-2,3- дигідроксибутандісат (1:2)(сіль)), комерційно доступний у формі придатного для ін'єкцій розчину тартрату вінорелбіну (НАВЕЛБІНФ), являє собою напівсинтетичний алкалоїд барвінку.
Вінорелбін рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами, такими як цисплатин, для лікування різних солідних пухлин, зокрема, недрібноклітинного раку легені, раку молочної залози на пізніх стадіях, і несприйнятливого до гормонів раку передміхурової залози. Мієлосупресія є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом вінорелбіну.
Координаційні комплекси платини є не специфічними для фази протираковими засобами, що взаємодіють з ДНК. Комплекси платини входять у клітини пухлин, піддаються гідратації і формують внутрішньо- і міжланцюгові поперечні зшивання з ДНК, що викликають несприятливі для пухлини біологічні ефекти. Приклади координаційних комплексів платини включають, але без обмеження, цисплатин і карбоплатин.
Цисплатин, цис-діаміндихлорплатину, є комерційно доступним як ПЛАТИНОЛЯ у формі придатного для ін'єкцій розчину. Цисплатин у першу чергу рекомендований для лікування метастазуючого раку яєчка і раку яєчника, і раку сечового міхура на пізніх стадіях.
Найважливішими обмежувальними дозу побічними ефектами цисплатину є нефротоксичність, яку можна контролювати за допомогою гідратації і діурезу, і ототоксичність.
Карбоплатин, діамін(1,1-циклобутан-дикарбоксилат(2-)-О, (О| платини, є комерційно доступним як ПАРАПЛАТИНО у формі придатного для ін'єкцій розчину. Карбоплатин у першу чергу рекомендований для терапії першої і другої лінії карциноми яєчників на пізній стадії.
Придушення кісткового мозку являє собою обмежувальну дозу токсичність карбоплатину.
Алкілуючі засоби являють собою не специфічні для фази протиракови засоби і сильні
Зо електрофіли. Як правило, алкілуючі засоби формують ковалентні зв'язки, за допомогою алкілування, з ДНК через нуклеофільні групи молекули ДНК, такі як фосфатна група, аміногрупа, сульфгідрильна, гідроксильна, карбоксильна та імідазольна групи. Таке алкілування порушує функцію нуклеїнової кислоти, призводячи до загибелі клітин. Приклади алкілуючих засобів включають, але без обмеження, азотисті іприти, такі як циклофосфамід, мелфалан і хлорамбуцил; алкілсульфонати, такі як бусульфан; нітрозосечовини, такі як кармустин; і триазени, такі як декарбазин.
Циклофосфамід, моногідрат 2-оксиду 2-Ібіс(2-хлоретил)аміно|гетрагідро-2Н-1,3,2- оксазафосфорину, є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину або таблеток як ЦИТОКСАНФ). Циклофосфамід рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами, для лікування злоякісних лімфом, множинної мієломи і лейкозу. Алопеція, нудота, блювота і лейкопенія є найбільш поширеними обмежувальними дозу побічними ефектами циклофосфаміду.
Мелфалан, 4-І|біс(2-хлоретил)аміно!|-Ї-фенілаланін, є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину або таблеток як АЛКЕРАНФ. Мелфалан рекомендований для паліативного лікування множинної мієломи і неоперабельної епітеліальної карциноми яєчників.
Придушення кісткового мозку є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом мелфалану.
Хлорамбуцил, 4-І(біс(2-хлоретил)аміно|бензолбутанова кислота, є комерційно доступним як таблетки ЛЕЙКЕРАНФ). Хлорамбуцил рекомендований для паліативного лікування хронічного лімфатичного лейкозу, і злоякісних лімфом, таких як лімфосаркома, гігантоклітинна фолікулярна лімфома і хвороба Ходжкіна. Придушення кісткового мозку є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом хлорамбуцилу.
Бусульфан, 1,4-бутандіолдиметансульфонат, є комерційно доступним як таблетки
МІЛЕРАНФ). Бусульфан рекомендований для паліативного лікування хронічного мієлогенного лейкозу. Придушення кісткового мозку є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом бусульфану.
Кармустин, 1,3-|біс(2-хлоретил)-1-нітрозосечовина, є комерційно доступним у формі окремих ампул з ліофілізованим матеріалом як ВІСМОЄ. Кармустин рекомендований для паліативного лікування як окремий засіб або в комбінації з іншими засобами при пухлинах мозку, множинній мієломі, хворобі Ходжкіна і неходжкінських лімфом. Відстрочена мієлосупресія є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом кармустину.
Декарбазин, 5-(3,3-диметил-1-триазено)-імідазол-4-карбоксамід, є комерційно доступним у формі окремих ампул з матеріалом як ОТІС-ЮБотеФ. Декарбазин рекомендований для лікування метастазуючої злоякісної меланоми і в комбінації з іншими засобами для терапії другої лінії хвороби Ходжкіна. Нудота, блювота та анорексія є найбільш поширеними обмежувальними дозу побічними ефектами декарбазину.
Антинеопластичні антибіотики є не специфічними для фази засобами зв'язуючими ДНК або інтеркалуючими в ДНК. Як правило, така дія приводить до утворення стабільних комплексів ДНК або до розриву ланцюга, що порушує звичайне функціонування нуклеїнових кислот, приводячи до загибелі клітин. Приклади антинеопластичних антибіотичних засобів включають, але без обмеження, актиноміцини, такі як дактиноміцин, антрацикліни, такі як даунорубіцин і доксорубіцин; і блеоміцини.
Дактиноміцин, відомий також як актиноміцин О, є комерційно доступним у придатній для ін'єкцій формі як КОСМЕГЕНО). Дактиноміцин рекомендований для лікування пухлини Вільмса і рабдоміосаркоми. Нудота, блювота та анорексія є найбільш поширеними обмежувальними дозу побічними ефектами дактиноміцину.
Даунорубіцин, гідрохлорид (85-цис-)-8-ацетил-10-(З-аміно-2,3,6-тридезокси-сасі - ліксогексапіранозил)окси|-7,8,9,10-тетрагідро-б,8,11-тригідрокси-1-метокси-5,12-нафтацендіону, є комерційно доступним у ліпосомній придатній для ін'єкцій формі як ДАУНОКСОМО або в придатній для ін'єкцій формі як ЦЕРУБІДИНФО. Даунорубіцин рекомендований для індукції ремісії при лікуванні гострого нелімфоцитарного лейкозу та асоційованої з НІМ саркоми Капоші на пізніх стадіях. Мієлосупресія є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом даунорубіцину.
Доксорубіцин, гідрохлорид (85, 105)-10-(З-аміно-2,3,6-тридезокси-ссі - ліксогексапіранозил)окси|-8-гліколоїл-7,8,9,10-тетрагідро-б,8,11-тригідрокси-1 -метокси-5,12- нафтацендіону, є комерційно доступним у придатній для ін'єкцій формі як РУБЕКСО або
АДРІАМІЦИН КОБЕФ. Доксорубіцин у першу чергу рекомендований для лікування гострого лімфобластного лейкозу і гострого мієлобластного лейкозу, але є також корисним компонентом
Зо лікування деяких солідних пухлин і лімфом. Мієлосупресія є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом доксорубіцину.
Блеоміцин, суміш цитотоксичних глікопептидних антибіотиків, виділених зі штаму зігеріотусевз мегіїсійи5, є комерційно доступним як БЛЕНОКСАНО). Блеоміцин рекомендований для паліативного лікування, як окремий засіб або в комбінації з іншими засобами, при плоскоклітинній карциномі, лімфомах і карциномах яєчка. Легенева і шкірна токсичність є найбільш поширеними обмежувальними дозу побічними ефектами блеоміцину.
Інгібітори топоізомерази ІЇ включають, але без обмеження, епіподофілотоксини.
Епіподофілотоксини являють собою специфічні для фази антинеопластичні засоби, отримані з рослини мандрагори. Епіподофілотоксини, як правило, вражають клітини у фазах 5 і
Се клітинного циклу за допомогою формування потрійного комплексу з топоіїзомеразою ІІ і ДНК, викликаючи розриви ланцюгів ДНК. Розриви ланцюгів накопичуються і за цим відбувається загибель клітин. Приклади епіподофілотоксинів включають, але без обмеження, етопозид і теніпозид.
Етопозид, 4'-деметилепіподофілотоксин-9(4,6-0-(А)-етиліден-В-ЮО-глюкопіранозиді, Є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину або капсул як Вепезидоб і є загальновідомим як МР-16. Етопозид рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування раку яєчка і недрібноклітинного раку легені. Мієлосупресія є найбільш поширеним побічним ефектом етопозиду. Захворюваність лейкопенією проявляє тенденцію до більшої важкості, ніж тромбоцитопенією.
Теніпозид, 4-деметилепіподофілотоксин-9|4,6-0-(А)-теніліден-В-ЮО-глюкопіранозиді, є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину як ВУМОНЄО і є загальновідомим як ММ-26. Теніпозид рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування гострого лейкозу у дітей. Мієлосупресія є найбільш поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом теніпозиду. Теніпозид може індукувати як лейкопенію, так і тромбоцитопенію.
Антиметаболітні антинеопластичні засоби являють собою специфічні для фази антинеопластичні засоби, які діють у фазі 5 (синтезу ДНК) клітинного циклу за допомогою інгібування синтезу ДНК або за допомогою інгібування синтезу пуринових або піримідинових основ і таким чином, обмежують синтез ДНК. Отже, відсутнє проходження фази 5, і за цим 60 відбувається загибель клітин. Приклади антиметаболітних антинеопластичних засобів
Зо включають, але без обмеження, фторурацил, метотрексат, цитарабін, меркаптопурин, тіогуанін і гемцитабін.
Б-фторурацил, 5-фтор-2,4-(1Н, ЗН) піримідиндіон, є комерційно доступним як фторурацил.
Введення 5-фторурацилу приводить до інгібування синтезу тимідилату, і він також включається як в РНК, так і в ДНК. Результатом, як правило, є загибель клітин. 5-фторурацил рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування карцином молочної залози, товстої кишки, прямої кишки, шлунка і підшлункової залози. Мієлосупресія і мукозит є побічними обмежувальними дозу ефектами 5-фторурацилу.
Інші аналоги фторпіримідину включають 5-фтор дезоксіуридин (флоксуридин) і монофосфат 5- фтордезоксіуридину.
Цитарабін, 4-аміно-1-8-О-арабінофуранозил-2-(1Н)-піримідинон, є комерційно доступним як
ЦИТОЗАР-ЦЄ і є загальновідомим як Ага-С. Вважають, що цитарабін проявляє специфічність для фази клітин у 5-фазі за допомогою інгібування елонгації ланцюга ДНК за допомогою термінуючого включення цитарабіну в зростаючий ланцюг ДНК. Цитарабін рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування гострого лейкозу. Інші аналоги цитидину включають 5-азацитидин і 2'2'-дифтордезоксицитидин (гемцитабін). Цитарабін індукує лейкопенію, тромбоцитопенію і мукозит.
Меркаптопурин, моногідрат 1,7-дигідро-6Н-пурин-б-тіону, є комерційно доступним як
ПУРИНТОЛО). Меркаптопурин проявляє специфічність для фази клітин у 5-фазі за допомогою інгібування синтезу ДНК за одним з ще не встановлених механізмів. Меркаптопурин рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування гострого лейкозу. Мієлосупресія і шлунково-кишковий мукозит є очікуваними побічними ефектами меркаптопурину у високих дозах. Корисним аналогом меркаптопурину є азатіоприн.
Тіогуанін, 2-аміно-1,7-дигідро-ЄН-пурин-б6-тіон, є комерційно доступним як ТАВІОІОФ).
Тіогуанін проявляє специфічність для фази клітин у 5-фазі за допомогою інгібування синтезу
ДНК за одним з ще не встановлених механізмів. Тіогуанін рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування гострого лейкозу.
Мієлосупресія, включаючи лейкопенію, тромбоцитопенію та анемію, є найбільше поширеним
Зо обмежувальним дозу побічним ефектом введення тіогуаніну. Проте, виникають побічні ефекти на шлунково-кишковий тракт, і вони можуть бути обмежувальними дозу. Інші аналоги пурину включають пентостатин, еритрогідроксиноніладенін, фосфат флударабіну і кладрибін.
Гемцитабін, моногідрохлорид 2'-дезокси-2'2'-дифторцитидину (В-ізомер), є комерційно доступним як ГЕМЗАРФ. Гемцитабін проявляє специфічність для фази клітин у 5-фазі за допомогою блокування проходження клітинами межі (1/5. Гемцитабін рекомендований у комбінації з цисплатином для лікування місцевопоширеного недрібноклітинного раку легені та окремо для лікування місцевопоширеного раку підшлункової залози. Мієлосупресія, включаючи лейкопенію, тромбоцитопенію та анемію, є найбільше поширеним обмежувальним дозу побічним ефектом введення гемцитабіну.
Метотрексат, М-ІЯК2,4-діаміно-б-птеридиніл)метил|метиламіно|бензоїл|-І -глутамінова кислота, є комерційно доступним як метотрексат натрію. Метотрексат впливає на фазу клітин, специфічно в 5-фазі, за допомогою інгібування синтезу, репарації та/або реплікації ДНК за допомогою інгібування редуктази дигідрофолієвої кислоти, необхідної для синтезу пуринових нуклеотидів і тимідилату. Метотрексат рекомендований як окремий засіб або в комбінації з іншими хіміотерапевтичними засобами для лікування хоріокарциноми, менінгеального лейкозу, неходжкінської лімфоми і карцином молочної залози, голови, шиї, яєчників і сечового міхура.
Мієлосупресія (лейкопенія, тромбоцитопенія та анемія) і мукозит є очікуваними побічними ефектами введення метотрексату.
Камптотецини, включаючи камптотецин і похідні камптотецину, доступні або знаходяться в розробці як інгібітори топоїзомерази І. Вважають, що цитотоксична активність камптотецинів пов'язана з їх активністю інгібування топоіїзомерази І. Приклади камптотецинів включають, але без обмеження, іринотекан, топотекан і різні оптичні форми 7-(4-метилпіперазинометилен)- 10,11-етилендіокси-20-камптотецину, описані нижче.
Іринотекан НС, гідрохлорид (45)-4,11-діетил-4-гідрокси-9-((4- піперидинопіперидино)карбонілокси|-1 Н-піраної|3",47,6,7|індолізино|1,2-Б)хінолін-3,14(4Н, 12 Н)- діону, є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину КАМПТОСАРО.
Іринотекан являє собою похідну камптотецину, яка зв'язується, разом зі своїм активним метаболітом 5М-38, з комплексом топоізомераза І - ДНК. Вважають, що цитотоксичність виникає в результаті дволанцюжкових розривів, що не піддаються репарації, викликаних взаємодією бо потрійного комплексу топоіїзомераза І: ДНК: іринотекан або 5М-38 з ферментами реплікації.
Іринотекан рекомендований для лікування метастазуючих злоякісних пухлин товстої або прямої кишки. Обмежувальними дозу побічними ефектами іринотекану НСІ є мієлосупресія, включаючи нейтропенію, і ефекти на ШКТ, включаючи діарею.
Топотекан Неї, моногідрохлорид (5)-10-(диметиламіно)метилі|-4-етил-4,9-дигідрокси-1 Н- пірано|3'"2,6,7|індолізиної|1,2-Б|хінолін-3,14-(4Н, 12Н)-діону, є комерційно доступним у формі придатного для ін'єкцій розчину ГІКАМТИНФ). Топотекан являє собою похідну камптотецину, яка зв'язується з комплексом топоїзомераза ! - ДНК і запобігає повторному лігуванню одноланцюжкових розривів, викликаних топоізомеразою І у відповідь на скручувальне зусилля по відношенню до молекули ДНК. Топотекан рекомендований для терапії другої лінії для метастазуючої карциноми яєчників і дрібноклітинного раку легені. Обмежувальним дозу побічним ефектом топотекану НСІ є мієлосупресія, в першу чергу, нейтропенія.
Ритуксимаб являє собою химерне моноклональне антитіло, що продається як РИТУКСАНФ і
МАБТЕРАФ. Ритуксимаб зв'язується з СО20 на В-клітинах і викликає апоптоз клітин.
Ритуксимаб вводять внутрішньовенно, і він схвалений для лікування ревматоїдного артриту і В- клітинної неходжкінської лімфоми.
Офатумумаб являє собою повністю людське моноклональне антитіло, що продається як
АРЗЕРРАФ. Офатумумаб зв'язується з СО20 на В-клітинах, і його використовують для лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу СіЇ (типу злоякісної пухлини лейкоцитів) у дорослих, несприйнятливих до лікування флударабіном (Флудара) і алемтузумабом (Кампат).
Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИНЯ) являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, яке зв'язується з рецептором НЕК2. Вихідним показанням для нього є позитивний за НЕК2 рак молочної залози.
Цетуксимаб (ЕРБІТУКСТ) являє собою химерне мишачо-людське антитіло, яке інгібує рецептор епідермального чинника зростання (ЕСЕК).
Інгібітори ттТОК включають, але без обмеження, рапаміцин (ЕК5БОб) і рапалоги, КАЮОО1 або еверолімус (Афінітор), ССІ-779 або темсиролімус, АР23573, АЙО8055, М/МЕ-354, М/МЕ-600,
МУМЕ-687 і Рр121.
Бексаротен продають як ТаргретинФ, і він є членом підкласу ретиноїдів, вибірково активуючих рецептори ретиноїду Х (ЕХК). Ці рецептори ретиноїду мають біологічну активність,
Зо відмінну від активності рецепторів ретиноєвої кислоти (КАК). Хімічним найменуванням є 4-(|1- (5,6,7,8-тетрагідро-3,5,5,8,8-пентаметил-2- нафталеніл)етеніл|бензойна кислота. Бексаротен використовують для лікування Т-клітинної лімфоми шкіри СТСІ (типу раку шкіри) у людей, захворювання яких неможливо було успішно лікувати з використоуванням щонайменше одного іншого лікарського засобу.
Сорафеніб, що поставляється на ринок як НексаварФф), являє собою клас лікарських засобів, називаних мультикіназними інгібіторами. Його хімічним найменуванням є 4-І4-((д-хлор-3- (трифторметил)феніл|Ікарбамоїламіно|фенокси|-М-метил-піридин-2-карбоксамід. Сорафеніб використовують для лікування нирковоклітинного раку на пізніх стадіях (типу злоякісної пухлини, що виникає в нирках). Сорафеніб використовують також для лікування неоперабельної печінково-клітинної карциноми (типу раку печінки, який неможливо вилікувати за допомогою хірургії).
Приклади інгібіторів егоВ включають лапатиніб, ерлотиніб і гефітиніб. Лапатиніб, М-(З-хлор- 4-((3-фторфенил)метил|оксиуфеніл)-6-(5-(2- (метилсульфоніл)етил|аміно)метил)-2-фураніл/|-4- хіназолінамін (представлений формулою ЇЇ, як проілюстровано), являє собою активний, такий, що вводиться перорально, низькомолекулярний, подвійний інгібітор тирозинкіназ егоВ-1 і егьв-2 (ЕСЕК і НЕКЗ2), схвалений у комбінації з капецитабіном для лікування позитивного за НЕК2- метастазуючого раку молочної залози. че С Од ще ці а От - Я
І!
Вільна основа, солі з НОСІЇ і дитозилатні солі сполуки формули (ІІ) можна отримувати відповідно до способу, описаного в УМО 99/35146, опублікованій 15 липня 1999 р.; і МО 02/02552, опублікованій 10 січня 2002 р.
Ерлотиніб, М-(З-етинілфеніл)-6,7-бісПЦе-(метилокси)етилі|окси)-4-хіназолінамін, комерційно доступний під торговим найменуванням Тарцева), представлений формулою Ш, як проілюстровано: зни й
Ка Ж кт зт тд с
ПІ
Вільну основу і сіль з НСІ ерлотинібу можна отримувати, наприклад, відповідно до Ш.5. 5747498, Приклад 20.
Гефітиніб, 4-хіназолінамін, М-(З-хлор-4-фторфеніл)-7-метокси-6-(3-4-морфолін)пропокси) представлений формулою ІМ, як проілюстровано:
Е
977 нм о й то
Шо 2 то М
ІМ
Гефітиніб, який є комерційно доступним під торговим найменуванням ІРЕССАФ (Авіга- 7епепса), являє собою інгібітор етьВ-1, рекомендований як монотерапія для лікування пацієнтів з місцевопоширеним або метастазуючим недрібноклітинним раком легені після невдалого застосування як хіміотерапевтичних засобів на основі платини і доцетакселу. Вільна основа, солі з НОЇ і солями з аіНСІ гефітинібу можна отримувати відповідно до способів з Міжнародної патентної заявки Мо. РСОТ/3896/00961, поданої 23 квітня 1996 р., і опублікованої як УМО 96/33980 31 жовтня 1996 р.
Представляє інтерес також похідна камптотецину наступної формули А, що знаходиться в даний час в розробці, включаючи форму рацемічної суміші (КЕ, 5), так само як енантіомери К і 5: отче р; т- 2 я д -- ня
Ка М х р ме 7 а ; відома під хімічним найменуванням "7-(4-метилпіперазино-метилен)-10,11-етилендіокси- 2О(В, 5)-камптотецин (рацемічна суміш) або /"7-(4-метилпіперазино-метилен)-10,11- етилендіокси-2О(В)-камптотецин (А енантіомер) або "7-(4-метилпіперазинометилен)-10,11- етилендіокси-20(5)-камптотецин (5 енантіомер). Така сполука, так само як споріднені сполуки, описані, включаючи способи отримання, в Патентах США Мо. 6063923; 5342947; 5559235; 5491237 і в розглядуваній Патентній заявці США Мо. 08/977217, поданій 24 листопада 1997 р.
Гормони й аналоги гормонів є корисними сполуками для лікування злоякісних пухлин, для яких існує зв'язок між гормоном(гормонами) і зростанням та/або відсутністю зростання злоякісної пухлини. Приклади гормонів і аналогів гормонів, які можна використовувати для лікування злоякісних пухлин, включають, але без обмеження, адренокортикостероїди, такі як преднізон і преднізолон, які можна використовувати в лікуванні злоякісної лімфоми і гострого лейкозу у дітей; аміноглутетимід та інші інгібітори ароматази, такі як анастрозол, летразол, воразол і екземестан, які можна використовувати для лікування адренокортикальної карциноми і гормонзалежної карциноми молочної залози, що містить рецептори естрогену; прогестрини, такі як ацетат мегестролу, який можна використовувати для лікування гормонзалежного раку молочної залози і карциноми ендометрію; естрогени, андрогени та антіандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, ацетат ципротерону і 5а-редуктази, такі як фінастерид і дутастерид, який можна використовувати для лікування карциноми передміхурової залози і доброякісної гіпертрофії передміхурової залози; антиестрогени, такі як тамоксифен, тореміфен, ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, так само як вибіркові модулятори рецепторів естрогену (ЗЕКМ5), такі як описані в Патентах США Мо. 5681835, 5877219 і 6207716, які можна використовувати для лікування гормонзалежної карциноми молочної залози та інших чутливих злоякісних пухлин; і вивільняючий гонадотропін гормон (СПК) і його аналоги, які слимулюють вивільнення лютеїнізуючого гормону (ЇН) та/або фолікулостимулюючий гормон (ЕН) для лікування карциноми передміхурової залози, наприклад, агоністи та антагоністи І НКЕН, такі як ацетат гозереліну і лейпролід.
Інгібітори шляхів передачі сигналу являють собою інгібітори, які блокують або інгібують хімічний процес, що викликає внутрішньоклітинну зміну. В рамках винаходу, ця зміна являє собою проліферацію або диференціювання клітин. Інгібітори передачі сигналу, які можна використовувати за даним винаходом, включають інгібітори рецепторних тирозинкіназ, нерецепторних тирозинкіназ, блокатори домену ЗНн2г/5НЗ, серин/гтреонінкінази, фосфотидилінозитол-3-кінази, передачі сигналів міоінозитолу та онкогенів Кав.
Декілька протеїнтирозинкіназ каталізують фосфорилування специфічних залишків тирозилу в різних білках, залучених у регуляцію клітинного зростання. Такі протеїнтирозинкінази можна в широкому сенсі класифікувати як рецепторні або нерецепторні кінази.
Рецепторні тирозинкінази являють собою трансмембранні білки, що мають позаклітинний лігандзв'язучий домен, трансмембранний домен і тирозинкіназний домен. Рецепторні тирозинкінази залучені в регуляцію зростання клітин, та їх загалом називають рецепторами чинників зростання. Показано, що неприйнятна або неконтрольована активація багатьох із цих
Зо кіназ, тобто аномальна активність рецепторної кінази чинника зростання, наприклад, за допомогою надекспресії або мутації, призводить до неконтрольованого зростання клітин.
Відповідно, аномальна активність таких кіназ пов'язана із зростанням злоякісної тканини. Отже, інгібітори таких кіназ можуть забезпечувати способи лікування злоякісних пухлин. Рецептори чинників зростання включають, наприклад, рецептор епідермального чинника зростання (ЕСЕ), рецептор тромбоцитарного чинника зростання (РОСЕг), егрВ2, егЬВ4, рецептор чинника зростання ендотелію судин (МЕСЕг), тирозинкіназа з доменами, гомологічними імуноглобуліноподібному та епідермальному чиннику зростання (ТІЕ-2), рецептор інсулінового чинника зростання-! (СЕ), рецептори макрофагального колонієстимулюючого чинника Сітвб),
ВТК, сКії, стеї, чинника зростання фібробластів (ЕСЕ), рецептори ТГК (ТЕКА, ТЕКВ, і ТЕКС), рецептори ефрину (ері) і протоонкоген РЕТ. Деякі інгібітори рецепторів зростання знаходяться в розробці і включають антагоністи лігандів, антитіла, інгібітори тирозинкінази та антисмислові олігонуклеотиди. Рецептори чинників зростання і засоби, що інгібують функцію рецепторів чинників зростання, описані, наприклад, в Кай, ЩУойп С. Ехр. Оріп. Тнег. Раїєпів (2000) 10(6):803-818; 5Наммег єї а! ОТ Мої 2, Мо. 2 Рергиагу 1997; і І ойв, Е. У. єї аї, "Стгоуйй Тасіог гесеріог5 ав їагдеїв", Мем/ Моїєсціаг Тагоєї5 ог Сапсег Спетоїпегару, єд. МоїЖКтап, Раці апа
Кетт, Баміа, СВО ргевз5 1994, І опадоп.
Тірозинкінази, що не є рецепторними кіназами чинників зростання, названі нерецепторними тирозинкіназами. Нерецепторні тирозинкінази, які можна використовувати за даним винаходом, які є мішенями або потенційними мішенями протиракових лікарських засобів, включають согс,
ЇсК, Руп, Уев, дак, сАБІ, РАК (кіназу фокальної адгезії), тирозинкіназу Брутона і Всг-АБІ. Такі нерецепторні кінази і засоби, що інгібують функцію нерецепторних тирозинкіназ, описані в 5іпи, 5. апа Согеу, 5.)., (1999) доштаї ої НетаюйНегару апа 5ієт Сеї! Везеагсиі 8 (5): 465-80; і Воївєп, у.В., Вгидде, 9.5., (1997) Аппиаї гемієм ої Іттипоіоду. 15: 371-404.
Блокатори доменів 5Н2/5НЗ являють собою засоби, що порушують зв'язування домену 5Н2 або 5НЗ в безлічі ферментів або адаптерних білків, включаючи субодиницю рв85 РіЗ-К, кінази сімейства 5гс, адаптерні молекули (ЗНс, СІК, МеК, Стрг) і Ваз-САР. Домени 5Н2/5НЗ як мішені для протиракових лікарських засобів обговорюють в бтіїйдаї, Т.Е. (1995), УошйгттаїЇ ої
Рпаптасоіодіса! апа Тохісоіодіса! Меїштоав. 34(3) 125-32.
Інгібітори серин/гтреонінкіназ, включаючи блокатори каскаду кінази МАР, включають бо блокатори кінази Раї (гтаїк), регульованих мітогенами або позаклітисними стимулами кіназ
(МЕК) і регульованих позаклітинними стимулами кіназ (ЕВК); і блокатори членів сімейства протеїнкінази С, включаючи блокатори РКС (альфа, бета, гамма, епсилон, мю, лямбда, йота, зета), кінази сімейства ІКВ (ІККа, ІККБ), кінази сімейства РКВ, члени сімейства кінази АКТ і рецепторні кінази ТОЕ-бета. Такі серин/греонінкінази та їх інгібітори описані в Мататоїй, Т.,
Тауа, 5., Каїриспі, К., (1999), уЧошитаї ої Віоспетівігу. 126 (5) 799-803; Вгодії, Р, затапі, А., апа
Мамаб, В. (2000), Віоспетіса! Рнаптасоїіоду, 60. 1101-1107; Маззадиє, у., Меів-Сагсіа, ЕР. (1996)
Сапсег Зийгуєув. 27:41-64; Рпїїїр, Р.А., апа Наїтів, А.Г. (1995), Сапсег Тгеаїтепі апа Незеагси. 78: 3-27, І асКеу, К. єї а! Віоогдапіс апа Медісіпа! Спетівігу І еНегв, (10), 2000, 223-226; Патент США
Мо. 6268391; і Мапіпе?г-Іасасі, |.., єї аї, Іпі. ). Сапсег (2000), 88(1), 44-52.
Інгібітори членів сімейства фосфотидилінозитол-3-кінази, включаючи блокатори РіІЗ-кінази,
АТМ, ДНКЕ-РК ії Ки, також можна використовувати за даним винаходом. Такі кінази обговорюють в Абгапат, А.Т. (1996), Сцтепі Оріпіоп іп Іттипоіоду. 8 (3) 412-8; Саптап, С.Е., іт, 0.5. (1998), Опсодепе 17 (25) 3301-3308; дасквоп, 5.Р. (1997), Іпіегпайопаї! Чошттаї ої Віоспетівігу апа
Сеї! Віоіоду. 29 (7):935-8; і 7попо, Н. вії а), Сапсег гез, (2000) 60(6), 1541-1545.
За даним винаходом можна використовувати також інгібітори передачі сигналів за допомогою міоінозитолу, такі як блокатори фосфоліпази С та аналоги міоінозитолу. Такі інгібітори передачі сигналів описані в Ромів, Сї., апа КогікомувКі А., (1994 Мем МоїІєсшаг Тагоєї5 тог Сапсег СпетоїНегару єд., Раці МогїКтап апа Оаміа Кетт, САС ргезз 1994, І опдоп.
Іншу групу інгібіторів шляхів передачі сигналу являють собою інгібітори онкогену Нав. Такі інгібітори включають інгібітори фарнезилтрансферази, гераніл-геранілтрансферази і протеази
САДАХ, так само як антисмислові олігонуклеотиди, рибозими та імунотерапевтичні засоби.
Показано, що такі інгібітори блокують активацію газ у клітинах, що містять мутантний газ і гав дикого типу, таким чином, діючи як антипроліферативні засоби. Інгібування онкогену Ваз обговорюють у ЗспагоузКу, О.Сї., Воладов, М.В., Сегмуазопі, 5.І. Маїаг, Р. (2000), Удошигтаї ої
Віотеадаіса! бсіепсе. 7(4 292-8; А5пру, М.М. (1998), Ситепі Оріпіоп іп І іріаоіоду. 9 (2) 99-102; і
Веппеїй, С.Г. і Сомузей, І.М. ВіоСпіт. Віорпуз. Асіа, (1999) 1489(1):19-30.
Як згадано вище, антитіла - антагоністи зв'язування ліганду рецепторної кінази можуть також служити інгібіторами передачі сигналу. Ця група інгібіторів шляху передачі сигналу включає застосування гуманізованих антитіл проти позаклітинного лігандзв'язуючого домену
Зо рецепторних тирозинкіназ. Наприклад, специфічне для ЕСЕВ антитіло Ітсіопе Сб225 (див.
Стееп, М.С. еї аім, Мопосіопа! Апіїбоду Тнегару гог бод Титогв, Сапсег Тгєаї. Неу., (2000), 26(4, 269-286); антитіло проти етоВ2 Герцептин" (див. Тугозіпе Кіпазе бідпаїІїпу іп Вгєаві сапсегегоВ
ЕРатійу Несеріог Тугозіпе Кпіазев5, Вгеазі сапсег Нев., 2000, 2(3), 176-183); і специфічне для
МЕСЕН2 антитіло 2СВ (див. ВгеККеп, В.А. єї аїЇ, Зеїесіїме Іппібйоп ої МЕСЕВ2 Асіїмйу Бу а топосіопа! АМТІ-МЕСЕ апііроду ріоск5 їштог дгоУмл іп тісе, Сапсег ВНев. (2000) 60, 5117-5124.
Інгібітори зв'язаних з ангіогенезом нерецепторних тирозинкіназ також можуть знаходити застосування за даним винаходом. Інгібітори зв'язаних з ангіогенезом МЕСЕК і ТІЕ2 обговорюють вище відносно інгібіторів передачі сигналу (обидва рецептори є рецепторними тирозинкіназами). Ангіогенез загалом пов'язаний з передачею сигналу егоВ2/ЕСЕК, оскільки показано, що інгібітори егоВ2 і ЕСЕК інгібують ангіогенез, у першу чергу, експресію МЕСБЕ.
Таким чином, має сенс комбінація інгібітору егоВв2/ЕСЕК з інгібітором ангіогенезу. Відповідно, інгібітори нерецепторних тирозинкіназ можна використовувати в комбінації з інгібіторами
ЕСЕК/егтЬВ2 за даним винаходом. Наприклад, для антитіл проти МЕСЕ, які не ввзнають МЕСЕК (рецепторну тирозинкіназу), але зв'язуються з лігандом; низькомолекулярних інгібіторів інтегрину (альфаму Беїаз), які можуть інгібувати ангіогенез; ендостатину й ангіостатину (не-ВТК), можна також довести корисність застосування в комбінації з описаними інгібіторами сімейства еп. (Див. Вгип5 СУ еї а! (2000), Сапсег Нев., 60: 2926-2935; Зспгеірег АВ, М/іпКІег МЕ, апа
Оегупск В. (1986), Зсієпсе, 232: 1250-1253; Меп І еї а. (2000), Опсодепе 19: 3460-3469).
Засоби, застосовні в режимах імунотерапії, також можна використовувати в комбінації із сполукою формули (І). Існує ряд імунологічних способів для отримання імунної відповіді проти ебВ2 або ЕСЕК. Ці способи в основному відносяться до галузі вакцинації проти пухлин.
Ефективність імунологічних способів можна сильно збільшити за допомогою комбінованого інгібування шляхів передачі сигналу егВ2/ЕСЕК з використанням низькомолекулярного інгібітору. Обговорення імунологічного способу/способу вакцинації проти пухлин проти ефВ2/ЕСЕР виявлено в Кейу КТ еї аї. (2000), Сапсег Вев. 60: 3569-3576; і Спеп МУ, Ни 0, Еїїйпа
Б, ВобБрбінз У), апа Кіррз ТУ. (1998), Сапсег Рез. 58: 1965-1971.
Засоби, використовувані в проапоптотичних режимах (наприклад, антисмислові олігонуклеотиди проти Бсі-2), також можна використовувати в комбінації за даним винаходом.
Члени сімейства білків ВсІі-2 блокують апоптоз. Підвищувальна регуляція рсі-2, таким чином, 60 пов'язана зі стійкістю до хімічних засобів. Дослідження показали, що епідермальний чинник зростання (ЕСЕ) стимулює антиапоптотических членів сімейства Ббсі-2 (тобто, тсі-1). Таким чином, для способів, розроблених для знижуючої регуляції експресії БсІ-2 в пухлинах, показана клінічна перевага, і вони в даний час проходять дослідження фази ППЛІЇ, а саме, антисмисловий олігонуклеотид для бсі-2 (33139 від Сепіа. Такі проапоптотичні способи з використанням способу антисмислових олігонуклеотидів для рсі-2 обговорюють в УмМаїег .)5 еї аї. (2000), 9. Сіїй.
Опсої. 18: 1812-1823; і Кпада 5 евї аї. (1994, Апіїзепзе Нез. ЮОвєму. 4: 71-79.
Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН") являє собою гуманізоване моноклональне антитіло, яке зв'язується з рецептором НЕН2. Вихідним показанням для нього є позитивний за НЕК2 рак молочної залози.
Трастузумаб емтанзин (торгове найменування кадсилу) являє собою кон'югат антитіло- лікарський засіб, що складається з моноклонального антитіла трастузумабу (герцептину), зв'язаного з цитотоксичним засобом мертанзином (0ОМ1). Трастузумаб окремо зупиняє зростання клітин злоякісних пухлин за допомогою зв'язування з рецептором НЕК2/пеи, тоді як мертанзин входить у клітини і руйнує їх за допомогою зв'язування з тубуліном. Оскільки моноклональне антитіло націлене на НЕК2, і НЕК2 надекспресований лише в клітинах злоякісних пухлин, кон'югат доставляє токсин специфічно до клітин пухлин. Кон'югат коротко позначають як Т-ОМІ1.
Цетуксимаб (ЕРБІТУКСУ) являє собою химерне мишачо-людське антитіло, що інгібує рецептор епідермального чинника зростання (ЕСЕК).
Пертузумаб (низиваний також 204, торгове найменування Омнітарг) являє собою моноклональне антитіло, перше з його класу в лінії засобів, називаних "інгібіторами димеризації
НЕК". За допомогою зв'язування з НЕК, він інгібує димеризацію НЕКЗ2 з іншими рецепторами
НЕК, що, за висунутою гіпотезою, приводить до уповільнення зростання пухлин. Пертузумаб описаний в МУО01/00245, опублікованій 4 січня 2001 р.
Ритуксимаб являє собою химерне моноклональне антитіло, що продається як РИТУКСАН" і
МАБТЕРА"З". Ритуксимаб зв'язується з СО20 на В-клітинах і викликає апоптоз клітин. Ритуксимаб вводять внутрішньовенно, і він схвалений для лікування ревматоїдного артриту і В-клітинної неходжкінської лімфоми.
Офатумумаб являє собою повністю людське моноклональне антитіло, що продається як
Зо АРЗЕРРА". Офатумумаб зв'язується з СО20 на В-клітинах і його використовують для лікування хронічного лімфоцитарного лейкозу (Сі; типу злоякісної пухлини лейкоцитів) у дорослих, несприйнятливих до лікування флударабіном (флудара) і алемтузумабом (кампат).
Інгібітори передачі сигналів клітинного циклу інгібують молекули, залучені в контроль клітинного циклу. Сімейство протеїнкіназ, називаних циклінзалежними кіназами (СОК), і його взаємодія із сімейством білків, називаних циклінами, контролює рух по еукаріотическому клітинному циклу. Координація активації і інактивації різних комплексів циклін/СОК є необхідною для нормального рух по клітинному циклу. Декілька інгібіторів передачі сигналів клітинного циклу знаходяться в розробці. Наприклад, приклади циклінзалежних кіназ, включаючи СОК2,
СсОКА і СОК, та їх інгібітори, описані, наприклад, в Козапі єї аї, Ехр. Оріп. Тег. Раїепів (2000) 19(2):215-230.
У рамках винаходу, "імуномодулятори" стосуються будь-якої речовини, включаючи моноклональні антитіла, яка діє на імунну систему. Зв'язуючі ІСО5 білки за даним винаходом можна розглядати як імуномодулятори. Імуномодулятори можна використовувати як антинеопластичні засоби для лікування злоякісних пухлин. Наприклад, імуномодулятори включають, але без обмеження, антитіла проти СТІ А-4, такі як іпілімумаб (ЄРВОЙ) і антитіла проти РО-1 (опдіво/ніволумаб і кейтруда/пембролізумаб). Інші імуномодулятори включають, але без обмеження, антитіла проти ОХ-40, антитіла проти РО-11, антитіла проти (| АСЗ, антитіла проти ТІМ-3, антитіла проти 4188 і антитіл проти ІТК.
Єрвой (іпілімумаб) являє собою повністю людське антитіло проти СТІ А-4, що поставляється на ринок Вгізіої Муег5 Здпірь. Білкова структура іпілімумабу і способи його застосування описані в Патентах США Мо. 6984720 і 7605238.
Опдіво/ліволумаб являє собою повністю людське моноклональне антитіло, що поставляється на ринок Вгібіо! Муег5 заціБб, націлене проти здійснювального негативну імунорегуляцію рецептора РО-1 поверхні клітин людини (білка-1 програмованої загибелі або білка-1 програмованої загибелі клітин/РСО-1), з імуностимулюючою активністю. Ніволумаб зв'язується з РО-1 і блокує активацію РО-1, трансмембранного білка суперсімейства Ід, за допомогою його лігандів РО-І1 і РО-ІЇ2, що приводить до активації Т-клітин і опосередкованих клітинами імунних відповідей проти клітин пухлин або патогенів. Активований РО-1 здійснює негативну регуляцію активації Т-клітин і ефекторної функції за допомогою супресії активації бо шляху РІЗК/АКІ. Інші найменування для ніволумабу включають: ВМ5-936558, МОХ-1106 і ОМО-
4538. Амінокислотна послідовність ніволумабу і способи його застосування та отримання описані в Патенті США Мо. 05 8008449.
КЕЙТРУДА/пембролізумаб являє собою антитіло проти РО-1, що поставляється на ринок
МегсК для лікування раку легені. Амінокислотна послідовність пембролізумабу і способи його застосування описані в Патенті США Мо. 8168757.
СО134, відомий також як ОХ40, є членом суперсімейства рецепторів ТМЕВ, який конститутивно не експресується на непорушних наївних Т-клітинах, на відміну від СО28. ОХ40 являє собою вторинну костимулюючу молекулу, що експресується через 24-72 години після активації; його ліганд, ОХ40Ї, також не експресується на непорушних антигенпредставляючих клітинах, але експресується після їх активації. Експресія ОХ40 залежить від повної активації Т- клітин; без СО28, експресія ОХ40 сповільнюється і відбувається на в чотири рази нижчому рівні.
Антитіла проти ОХ-40, злиті з ОХ-40 білки і способи їх застосування описані в Патентах США
Мо: ОБ 7504101; 005 7758852; 5 7858765; 05 7550140; 05 7960515; МО2012027328;
МО2013028231.
Антитіла проти РО-І1 (позначені також як СО274 або В7-НІ) і способи їх застосування описані в Патенті США Мо. 7943743; Патенті США Мо. 8383796; И520130034559,
УМО2014055897, Патенті США Мо. 8168179; і Патенті США Мо. 7595048. Антитіла проти РО-ІЇ 1 знаходяться в розробці як імуномодулюючі засоби для лікування злоякісних пухлин.
У рамках винаходу "імуностимулюючий засіб" стосується будь-якого засобу, який може стимулювати імунну систему. У рамках винаходу, імуностимулюючі засоби включають, але без обмеження, ад'юванти для вакцин.
Відомо, що аміноалкілтглюкозамінідфосфати (АСР) можна використовувати як ад'юванти для вакцин і імуностимулюючих засобів для стимуляції продукції цитокінів, активації макрофагів, стимуляції вродженої імунної відповіді, і посилення продукції антитіл в імунізованих тварин.
Аміноалкілтглюкозамінідфосфати (АСР) є синтетичними лігандами ТоїІ-подібного рецептора 4 (Т-К4). АСОР та їх імуномодулюючі ефекти за допомогою ТІ К4 описані в патентних публікаціях, таких як МО 2006/016997, МО 2001/090129, та/або в Патенті США Мо. 6113918 і опубліковані в літературу. Додаткові похідні АСОР описані в Патенті США Мо. 7129219, Патенті США Мо. 6525028 і Патенті США Мо 6911434. Конкретні АСОР діють як агоністи ТІ КА, тоді як інші відомі як
Зо антагоністи ТІ Ка.
Сполуки аміноалкілтглюкозамінідфосфату, застосовані за даним винаходом, мають структуру, вказану в наступній формулі 1: ае-еку
Не х ен х г ; в пут р; ше
НН, о ь р с с (4 я і; і: х м й і: Я У х (Формула 1), де т складає від О до 6 п складає від 0 до 4;
Х являє собою О або 5, переважно 0;
М являє собою О або МН; 7 являє собою О або Н; кожен з КЕ, В2, Вз незалежно вибраний з групи, що складається з С1-г2о ацилу і Сі-г2о алкілу;
Ва являє собою Н або Ме;
АВБ5 незалежно вибраний з групи, що складається з -Н, -ОН, -(С1-Са) алкокси, -РОзАвН», -
ОРОзВвН», -5О3Вв8, -0О50Оз Нв, -МАвН», -5Нв, -СМ, -МО», -СНО, -СО2Вв і -СОМА»вН», де кожен з Вв і
В» незалежно вибраний з Н і (С:1-Са) алкілу; і кожен з Кв і КЕ? незалежно являє собою Н або РОзНа».
У формулі 1 конфігурація 3'-стереогенних центрів, до яких в нормі приєднані залишки жирного ацилу (тобто, залишки вторинного ацилокси або алкокси, наприклад, КО, Н2О і 20), являє собою К або 5, переважно К (як позначено за правилами старшинства Кана-Інгольда-
Прелога). Конфігурація агліконових стереогенних центрів, до яких приєднані Ка і К5, може являти собою К або 5. Всі стереоізомери, як енантіомери, так і діастереомери, та їх суміші, вважають такими, що входять в обсяг даного винаходу.
Кількість атомів вуглецю між гетероатомом Х і агліконовим атомом азоту визначають за змінним "п", який може являти собою ціле число від 0 до 4, переважно, являти собою ціле число відо до 2.
Довжина ланцюга нормальних жирних кислот К:, В» і Кз може складати від приблизно 6 до приблизно 16 атомів вуглецю, переважно, від приблизно 9 до приблизно 14 атомів вуглецю.
Довжина ланцюгів може бути однаковою або різною. Деякі переважні варіанти здійснення включають довжину ланцюгів, де К'., Р» і Ез складають 6 або 10, або 12 або 14.
Формула 1 включає І/О-серилові, -треонілові, -цистеїнілові ефірні і складноефірні ліпідні
АСР, як агоністи, так і антагоністи, та їх гомологи (п-1-4), так само як різні біоізостери карбонової кислоти (тобто, К5 являє собою кислу групу, здатну формувати сіль; фосфат може знаходитися або в 4-, або в б-положенні глюкозамінової ланки, але переважно знаходиться в 4- положенні).
У переважному варіанті здійснення винаходу з використанням сполуки АОР формули 1, п складає 0, Ко являє собою СО2Н, Нє являє собою РОзнН», і К7 являє собою Н. Ця переважна сполука АОР вказана, як структура в наступній формулі Та: па: ЧІ сон на Ге і цик Д-я 4 ен Валик інь ніна НН яд
Що ке Май шен й них,
Кк » Ме їЗ що х о ве У і у: 6
У, і І й су Ьй і У ); х і У у х х (Формула 1а), де Х являє собою О або 5; У являє собою О або МН; 7 являє собою О або Н; кожен з КЕ, В»,
Аз незалежно вибраний з групи, що складається з С1-2о ацилу їі Сі-г2о алкілу; і К4. являє собою Н
Зо або метил.
У формулі Та конфігурація 3'-стереогенних центрів, до яких в нормі приєднані залишки жирного ацилу (тобто, залишки вторинного ацилокси або алкокси, наприклад, КО, ВО, і Ез0), являє собою К або 5, переважно, К (як позначено за правилами старшинства Кана-Інгольда-
Прелога). Конфігурація агліконових стереогенних центрів, до яких приєднані Ка і СОН, може являти собою ЕК або 5. Всі стереоізомери, як енантіомери, так і діастереомери, та їх суміші, вважають такими, що входять в обсяг даного винаходу.
Формула 1а включає І/О-серилові, -треонілові, - цистеїнілові ефірні або складноефірні ліпідні АСР, як агоністи, так і антагоністи.
У формулі 1 і формулі Та, 7 являє собою 0, приєднаний за допомогою подвійного зв'язку, або два атоми водню, кожен з яких приєднаний за допомогою одинарного зв'язку. Тобто, сполука має склданоефірний зв'язок, коли 2-У-0; амідний зв'язок, коли 2-0 і М-МН; і ефірний зв'язок, коли 2-Н/Н і 0.
Особливо переважні сполуки формули 1 позначені як СЕХ-601 і СЕХ-527. Їх структури вказані таким чином:
г Ка ен | є
Як се кт х Ше а щу" зе Ч ви у я
Манна шк У дней ен і но БУ у с чи і
Ме, | І х пт шН
У СЯ ; 2 СЯ р. я й я персні й овен Ки Є й х 2 Н х. ї ій 7 х Кі " с р Ж г
У К х у Сужнні
З 5 Ко я Ах і ї хо й Її Н у ; , І х й ТІ Ух х Й х й Кк А і; ї ; Її 4 й й у я - у і 7 . ї У я у, х Й х й Є х Е ї х КИ х І р; К і х х сй Кей У
Кі х Е й ; я
З К й Е У є х КІ й ж к р;
У я хо 2 З ГУ і 2 М й Е Я й х Є ї г У
Е х Кі ї х і: у й ї й мя я ї іх у Ї, х у х я й ц х х У А , у, Х у 2
І х Бя й х х К х х (СВХ-601) тхї ГЕ на. | б її хх е па ов а на
НО з те я І сов
Ж. і ЧК Шк; ше? в Ме о
З Сук КІ й с т х
ГУ дні В СЕ тик,
Кк х мч й х й Ко її нен І: бу І: я х й
У А ї я ц й
У Я б, Й (вань
В і х Й й х ї х З с бля, У у У я х Я й
Хх у ї У Б і йЗ 5 Ух Ку Я х с, і У я й я а М А щі х р; х Я й У і. й
У г ь, й Раш шк є є х ке У М. х х а х Я ИЙ х у, я, с й х У Е
К ге Ко Я В М, ях і й й че
К х а с со І: х х Кі Кі х я х Й с 3 У ї й і х й й К х з й у, я » х х Ко х хо 4
К х (СВХ-527) й Крім того, в іншому переважному варіанті здійснення застосовують СЕХ 547, що мають показану структуру.
САХ 547 о дн ре а фі ту не чи й х се і
Щ й х пули нка р ши АВ т сш "МН Е . рн НЕ й у, г
Й і; Срилитих, ан щЙ х пі х давня м о Бі й й с я с Х шва р. Спа,
ІЗ ї . Ку г х х Я я я У З ї Ок У
Кя й Я Ух У й і у; « К А я Ко ї ь, із ї с х
Є з Є Ух к Кй
Кк Ко м іх У т
І ї х Я г. У у хо 5 Її ї У г У й х ке Я
У й ї з 5 г
Кох х й й У / з У 4 4 У 7 у Й х х о я х Я є У є х м Х І у т х Я х Я г я х
Інші варіанти здійснення включають такі АСОР, як СВАХ 602 або СВАХ 526, що забезпечують збільшену стабільність АДСР, які мають коротші ланцюги вторинного ацилу або алкілу. но чу | х я . КИ и нач нн що м ке з но щи донні ОН сх бе АВ ин т я "чи у Сни щН й У я ря й Ку в т м х х х Ще ши Я М і . І й в Я х х |: Ср х і У КЇ я Ко
Кк їх х г і У ї х т « 5 а г 5 Кі х У, Я х я ї к Ко Я х К Ке й Кк х х Х і: КЕ г. й у х у 7 х
Й У Я х к І; у, я Ко х х я х я у т і: ці ж й хе р. Я КУ ке х й я ій х У У Я й х х й ї КЕ У х, Я У х г. У
БЯ х й ? У Ї й х рй я І х у Й У
У Є У х х, рі х
СсвХ 602 дачу 7 Хнтт, ра У я кн я бвньоХ Шини нн х ЖранаК М і; х р
Сину й іх є х Др жваннї І
Ох І; й х й а НО сн ах іх / я х й х т йо бжшни У
Ка х Кі с У Ві хо Я Й Є У, р м Я Її і: м:
У 7 М й У я
Щі х х й Я х ї у Риш Є З й з й Я х 2 х КІ я і; х ЩІ
Ко ї х і. р у,
І і х м х х і: м ї і;
І; х У я й і: й У х К х г У
І: х Я
Й ; і хо Я хо х х я х ї
У
СвХ-526
У одному варіанті здійснення представлені способи лікування злоякісної пухлини в ссавця, що потребує цього, які включають: введення такому ссавцеві терапевтично ефективної кількості: зв'язуючого ІЇСО5 білка за даним винаходом і б) щонайменше одного антинеопластичного засобу.
У одному варіанті здійснення представлені способи лікування злоякісної пухлини в ссавця, що потребує цього, які включають: введення такому ссавцеві терапевтично ефективної кількості: зв'язуючого ІЇСО5 білка за даним винаходом і 5) щонайменше одного другого імуномодулюючого засобу.
У одному варіанті здійснення вказаний другий імуномодулюючий засіб вибраний з групи з: антитіла проти СТІ А4, антитіла проти РО-1, антитіла проти РО-11, антитіла проти ОХ40, антитіла проти СІТК і антитіл проти 4188, антитіла проти ГАСЗ і антитіл проти ТІМ3.
У одному варіанті здійснення представлені способи лікування злоякісної пухлини в ссавця, що потребує цього, які включають: введення такому ссавцеві терапевтично ефективної кількості: зв'язуючого ІЇСО5 білка за даним винаходом і 5) щонайменше одного імуностимулюючого засобу.
У одному варіанті здійснення, імуностимулюючий засіб являє собою агоніст ТІ К4. В одному варіанті здійснення імуностимулюючий засіб являє собою АсСР. В одному аспекті імуностимулюючий засіб являє собою сполуку формули І. В одному аспекті вона являє собою сполуку формули 1а. В одному аспекті імуностимулюючий засіб вибраний з групи, що складається з: СЕХ-601, САХ-547, САХ-602, САХ-527 і СЕХ-526.
ПРИКЛАДИ
Наступні приклади ілюструють різні необмежуючі аспекти даного винаходу.
Приклад 1: Експресія ІСО5 у злоякісних пухлинах
Як правило, солідні пухлини, мабуть, мають низькі рівні інфільтруючих ІСО5-Т-клітин, що
Зо узгоджується з теорією, що ІСО5 опосередкує протипухлинні імунні відповіді. Розроблені аналізи експресії ІСО5 для різних видів гістології пухлин з використанням публічно доступних наборів даних експресії мРНК з Те Сапсег Сепоте Айаз (ТООБА) та інших баз даних. У таблиці
З показаний відносний відсоток пухлин для кожного виду гістології, для яких показаний деякий рівень експресії МРНК ІСО5, що піддається детекції. Цей аналіз ідентифікує види гістології пухлин, як відомо, чутливих до інших способів імунотерапії злоякісних пухлин (меланома, КСС,
МЗС С), як такі, що мають відносно високий відсоток пухлин (210 95), що мають кількість ІСО5 інфільтруючих пухлину лімфоцитів (ТІЇ), які піддаються детекції, тоді як типи пухлин, як відомо, слабо імуногенні (пухлини передміхурової залози, яєчників і підшлункової залози), мають відносно нижчий відсоток пухлин, що мають ІСО5-ТІЇ («10 95) (таблиця 3). Цікаво, що типи пухлин, як відомо, асоційовані з вірусною інфекцією та/або хронічним запаленням (пухлини голови і шиї, шлунка, стравоходу і шийки матки), знаходилися серед типів пухлин, для яких показаний найвищий відсоток ІСО5-ТІ. Що є неясним з цих аналізів експресії мРНК, це субпопуляція ТІЇ, яка експресує ІСО5 у кожному відповідному типу пухлин. У деяких випадках
ІСО5 може переважно експресуватися на інфільтруючих пухлину Трег, тоді як в інших випадках він може вказувати на рівень інфільтрації ІСО5» ефекторних Т-клітин.
Таблиця З
Експресія мРНК ІСОЗ у різних типах пухлин меланома(М) 77777717 Ї17171717171711295.... | .....ЮЮД69 .ЮюЮюЮюЮю171717171се3а
ПЕТ: ТТН ПОН КН НО ПОН НО Ж У
Аналіз експресії ІСО5 за допомогою імуногістохімії (ІНС) при первинній недрібноклітинній карциномі легенів (М5СІ С) людини, тричі негативному раку молочної залози (ТМВС), колоректальному раку (САС), раку передміхурової залози, підшлункової залози, яєчників, нирковоклітинному раку (ВСС) і меланомі проводили для кращого розуміння того, які підгрупи
ТІЇ асоційовані з експресією ІСО5 у різних типах пухлин (таблиця 4). Подібно до того, що спостерігали в аналізі експресії мРНК, кількість ІСО5-ТІЇ була відносно низькою, навіть в індивідуальних пухлинах, де в іншому випадку була присутня велика кількість СО4-, СОВ8» та/або
ЕохРЗ-ТІ. | знову, осгістологічні зразки меланоми, нирковоклітинного раку (НСС) і недрібноклітинної карциноми легенів (М5СІ С) мали найвищий відсоток пухлин з деяким рівнем
ІбО5: інфільтрату, що піддається детекції (таблиця 4, стовпець 2). | навпаки, для пухлин передміхурової залози, яєчників і підшлункової залози майже не показаний ІСО5-ТІЇ. (таблиця 4). Ці аналізи ясно показують, що солідні пухлини мають низькі вихідні рівні ІСО-ТІЇ, і можна отримувати перевагу від розмноження і функціональної індукції цієї популяції клітин. Подальші дослідження з використанням проточної цитометрії і двобарвної імуногістохімії для аналізу первинних пухлин людини можуть допомогти визначити, які підгрупи специфічних Т-клітин експресують ІСО5.
Таблиця 4
Кількість нини м ни м нон не ам (плоскоклітинна)
МСС п-т5 | - | 0 |з36(0-157)| 4(0-20) | 71(5-238)| 1011-41) птхвсо0000-8--- вад ввае ев па ев в свя тереднютя 1 вв 1 передміхурової плн чччнч ч'ч чн чним ни зно тил залози
Ракяєчникв (ЛВ 25 ро ов лав 1ВСВВ В вв
Меланома 01 ва вари
Приклад 2: Скринінг агоністичних антитіл проти ІСО5
Виділення первинних РВМС людини
Свіжу кров отримували від донорів крові і розчиняли у співвідношенні 1:11 середовищем
КРМІ1640, що не містить фенолу червоного 10 95. Розчинену кров розміщували на середовищі з градієнтом щільності в 50 мл конічній пробірці Опі-зер Мах і центрифугували при 400 х 4д протягом 20 хвилин при кімнатній температурі з відключеним гальмом. Отриманий шар білих мононуклеарних клітин (лейкоцитарну плівку) обережно переносили в нову 50 мл конічну пробірку через клітинне сито 100 мкм. Рівний об'єм середовища КРМІ1640, що не містить фенолу червоного 10 95, додавали до лейкоцитарної плівки і центрифугували при З00х 4д протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Осад клітин ресуспендували в 10 мл розчину для лізису еритроцитів (Зідта АЇйгісй) та інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали один раз середовищем і центрифугували, як описано раніше.
Об'єм доводили до 40 мл з використанням середовища КРМІ1640, що не містить фенолу червоного 10 95, і клітини підраховували з використанням лічильника клітин і аналізатора життєздатності місеї! (Весктап СоиМег).
Виділення первинних СО4-С2025- ефекторних Т-клітин людини
Клітини СО4-29025 людини додатково очищали з РВМС за допомогою двостадійного способу виділення на основі магнітних бусин з використанням набору для виділення сра4нсра2г5- регуляторних Т-клітин людини (Мінепуїі Віоїес). Спочатку клітини РВМС інкубували із сумішшю біотину-антитіла при 49С протягом 5 хвилин і потім інкубували з мікробусинами проти біотину протягом 10 хвилин. Цю стадію проводили для мічення Т-клітин, що не стосуються СО4-. Потім клітини пропускали через колонку ГО у магнітному полі сепаратора
МміаімМАС5. Ефлюєнт, що являє собою немічену зазделегідь збагачену фракцію СО4- клітин, збирали та інкубували з бусинами СО25 МісгоВеад» при 42С протягом 15 хвилин. Мічені клітини пропускали через колонку М5 у магнітному полі сепаратора МіпімАС5. Проскакування, що містить немічені СОО4-С025- ефекторні Т-клітини, збирали для аналізів нижчої активації.
Виділення первинних СО4.«Т-клітин людини безпосередньо з крові
Сра4-Т-клітини людини виділяли безпосередньо зі свіжої крові людини з використанням суміші для збагачення СО4--Т-клітин людини (біт СеїЇ Тесппоіодієз). Суміш для збагачення брат -клітин людини Нозенезер (50 мкл/мл) додавали до цілісної крові і добре перемішували.
Після 20 хвилин інкубації при кімнатній температурі, рівний об'єм РВО--2 95 ЕВ5 додавали з обережним перемішуванням. Розчинений зразок напластовували поверх середовища з градієнтом щільності і центрифугували протягом 20 хвилин при 1200 х 9 при кімнатній температурі з відключеним гальмом. Збагачені клітини з межі розділу середовище з градієнтом щільності: плазму обережно переливали в нову конічну пробірку. Потім еритроцити лізували з використанням буфера для лізису еритроцитів (бідта Апагісн), і збагачені клітини промивали з використанням РВО--2 95 ЕВ5 двічі. СО4--Т-клітини ресуспендували в 40 мл РВ5-2 95 ЕВЗ5 і підраховували в лічильнику клітин Мі-СеїЇ.
Експериментальні способи
Аналіз активації іп міго СО4-С025- ефекторних Т-клітин людини - аналіз у зв'язаному форматі.
Не оброблені для культивування клітин 96-лункові плоскодонні планшети покривали з використанням 100 мкл/лунку буфера для покриття (Віоіедепіа), що містить 1 мкг/мл антитіла проти СОЗ людини (еВіозсіепсе) і різні тестовані антитіла, протягом ночі. На наступну добу заздалегідь покриті планшети промивали три рази середовищем КРМІ-1640, що містить 10 95
ЕВ5. СО4-0025- ефекторні Т-клітини людини виділяли і мітили з використанням СЕЗЕ, як описано, і розсівали в планшети. Після інкубації при 372С протягом 2,5 діб, клітини збирали та аналізували за допомогою проточної цитометрії по експресії маркерів проліферації і активації.
Супернатанти культур клітин також збирали для мультиплексного виміру цитокінів за допомогою Мезо з5саїе Ррізсомегу (МО).
Аналіз проліферації СЕЗЕ
Клітини, що підлягають міченню, ресуспендували в 1 мл заздалегідь нагрітого РВ5 при кінцевій концентрації аж до 1Е7 клітин/мл в 15 мл конічній пробірці. Один мікролітр 2 мМ вихідного розчину СЕБЕ (Ше ТесппоЇодіеє) додавали безпосередньо до клітин з подальшим негайним перемішуванням на підтрушувачі для забезпечення рівномірного мічення. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, забарвлювання зупиняли додаванням 14 мл крижаного середовища для культивування клітин. Мічені клітини промивали три рази крижаним середовищем. Клітини підраховували й доводили до 1Е6 клітин/мл в КРМІ1640--10 95
ЕВ5, доповненої 100 МЕ/мл 1-2 (РерготТесі) і розсівали в планшети, покриті антитілами проти
СОЗ і тестованими антитілами. Після активації Т-клітин, клітини збирали і промивали РВ5О,5 95
В5А один раз до переходу до стадії багатобарвного забарвлювання для аналізу проточної цитометрії.
Зо Багатобарвна проточна цитометрія
Активовані Т-клітини збирали і промивали РВ5. Клітини спочатку забарвлювали з використанням чутливого до життєздатності клітин фіксованого барвника дальшого червоного спектру ГІМЕ/ЮБЕАЮО (Ше Тесппоїодіез), відповідно до протоколу постачальника. Після відмивання барвника, антитіла для детекції, кон'юговані з різними барвниками, інкубували з клітинами при 42С протягом 30 хвилин. Забарвлені клітини промивали один раз крижаним буфером для забарвлювання РАС5З (РВ5З-0,5 95 ВЗА) перед обробкою на проточному цитометрі
ЕАС5 Сапіо або БАС5 Сапіо ІІ. Робочі характеристики цитометра перевіряли щодоби з використанням бусин для установки й перевірки цитометра (ВО Віозсіепсе5), і масштабування напруги РМТ і площі проводили на підставі незабарвлених клітин. Компенсацію виконували з використанням бусин ОпеСотр або ОНгаСотр (еВіозсіепсе), індивідуально забарвлених з використанням антитіл для детекції, кон'югованих з рлуорохромом.
Аналіз цитокінів МО
Рівень цитокінів ІЕМ-у, ІЇ-10, 11-2 ії ТМЕ-йж у супернатанті культури клітин визначали з використанням виготовленого на замовлення набору М5О Ппитап М-Ріех. Зразки спочатку розчиняли у співвідношенні 1:200 в розчиннику 2. Калібратор також підготовлювали в розчиннику 2 відповідно до інструкції до набору. Розчинені зразки і калібратори додавали в чорний планшет М50О, який потім герметично закривали клейкою плівкою для планшетів і інкубували при кімнатній температурі зі струшуванням протягом 2 годин. Після додавання 25 мкл розчину антитіла для детекції, свіжоприготованого в розчиннику 2, в кожну лунку, планшет знову герметично закривали та інкубували при кімнатній температурі зі струшуванням протягом наступних 2 годин. Планшети промивали З рази з використанням 150 мкл/лунку РВЗ5 плюс 0,05 95 Гувеп-20 перед додаванням 150 мкл/лунку свіжорозчиненого 2х буфера для зчитування, і негайно зчитували на зчитувачі МЕБО ОпіскРієх. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення М5О Умогкрепсі.
Аналіз активації СО4 «Т-клітин людини іп міїго - у зв'язаному і розчинному форматі
Свіжовиділені СО4-Т-клітини людини піддавали попередній стимуляції в 24-лункових планшетах з використанням антитіл проти СОЗ (1 мкг/мл) і антитіл проти СО28 (3 мкг/мл) протягом 48 годин. Клітини збирали, промивали і змішували з ОупаВеайд5 проти СОЗ (І їе
Тесппоодіе5) у співвідношенні 1:11 у середовищі АІМ-М, доповненому 100 МЕ/мл 1-2 бо (РергоТесії). Потім суміш клітин/бусин розсівали при 100000 на лунку в 96-лункові плоскодонні планшети, або без покриття (для розчинного формату), або з покриттям Н2І 5 пПІдсС4РЕ (для зв'язаного формату). Для розчинного формату, Н2І5 пІде4РЕ додавали в лунки на час розсівання клітин. Після інкубації при 372С протягом 3,5 діб, супернатанти культур клітин збирали для мультиплексного виміру цитокінів за допомогою М5О.
Аналіз іп міго активації РВМС людини в розчині
Свіжовиділені РВМС людини піддавали попередній стимуляції в 24-лункових планшетах, покритих антитілами проти СОЗ (1 мкг/мл) і антитілами проти СО28 (5 мкг/мл) протягом 48 годин. Забарвлені клітини СЕБЕ отримували і змішували з ЮОупаВеад5 проти СОЗ (І їе
Тесппоіодіез) у співвідношенні 1:11 у середовищі АЇМ-М, доповненому 100 МЕ/мл 1-2 (РергоТесії). Потім суміш клітин/бусин розсівали при 200000 на лунку в 96-лункові плоскодонні планшети, заздалегідь покриті 1 мкг/мл антитіла проти СОЗ3. Н2гІ 5 пІдДС4РЕ і контрольне антитіло додавали безпосередньо в лунки в їх розчинній формі. Після інкубації при 3726 протягом 3,5 діб, супернатанти культур клітин збирали для мультиплексного виміру цитокінів за допомогою М5О, і клітини збирали для аналізу проліферації і експресії маркерів за допомогою проточної цитометрії.
Аналіз даних
Аналіз даних проточної цитометрії
Дані проточної цитометрії аналізували за допомогою програмного забезпечення РІомліо (Ромео ГІС). Спочатку мертві клітини відбирали на підставі забарвлювання чутливим до життєздатності клітин барвником ГІМЕ/ЮЕАЮ. Дублети відсікали на діаграмі розсіяння Е5С-Н:
ЕЗОС-МУ. Отримані в результаті живі окремі клітини аналізували по експресії маркерів активації у різних субпопуляціях Т-клітин, таких як СО4- або СОв«кТ-клітини, і виражали як відсоток від вихідної популяції або медіанну інтенсивність флуоресценції (МЕ).
Аналіз проліферації СЕЗЕ
Дані СЕБЕ аналізували також за допомогою РБіІом/)о. Після виключення мертвих клітин і дублетів, вікно "клітин, що проліферували" визначали на підставі неактивованих Т-клітин. Будь- які клітини, що попали в це вікно в будь-якому даному зразку, вважали клітинами, що проліферували. Дані реєстрували як відсоток проліферації.
Аналіз виснаження клітин за допомогою ЕАС5
Виснаження клітин аналізували за допомогою Біом/.о. Спочатку вікно для живих клітин визначали на підставі забарвлювання чутливим до життєздатності клітин барвником
ПМЕЛЕАЮО. Потім дублети відсікали, як описано раніше. Відсотки субпопуляцій живих СО4-- або
СОр8-Т-клітин розраховували як показник виснаження клітин.
Аналіз підбору кривої відповіді залежно від дози антитіл
Дані відповіді залежно від дози імпортували в програмне забезпечення СгарпРай Ргіхт і трансформували в логарифмічній шкалі. Відповідь залежно від дози агоніста в моделях з різним кутом нахилу кривої використовували для підбору кривої, що відповідає даним, і отримання значень ЕС50. Формула підбору приведена нижче:
Менижнєж(верхнє-нижнє)1-1074(І са4ЕС50-Х) кут нахилу))
РЕЗУЛЬТАТИ
Ідентифікація найкращих мишачих антитіл проти ІСО5 людини
Проводили скринінг чотирнадцяти мишачих тАр за зв'язуванням ІСО5 людини та яванського макака та агоністичної активності. Дванадцять було можливо переклонувати, секвенувати, виростити й очистити в достатніх кількостях для функціональних досліджень. Усе тестували за характеристиками зв'язування з використанням ВіАсоге. Виявили, що два зв'язувалися дуже слабо/не зв'язувалися. Десять очищених тАр тестували за допомогою функціонального аналізу "агонізму". Чотири найкращих агоністи тАБб (позначені як 422.2, 279.1, 314.8 і 88.2 в таблиці 5 нижче), на підставта їх здатності індукувати проліферацію Т-клітин і продукцію цитокіну ІЕМ-у в безлічі здорових донорів-людей, відбирали й отримували у формі химер з людськими ІдДО1. Послідовності СОК для 314.8, 88.2, 92.17, 145.1 і 53.3 показані разом з іншими тАБ проти ІСО5 в РСТ/ЕР2012/055735 (МО 2012/131004).
Варіабельна ділянка важкого ланцюга для клону 88.2 представлена нижче як ЗЕО ІЮ МО:13:
ОМОГ ООРСАЕЇ МАРОАБЗУКІ БСКАБИаУЗЕТЗУУМІМУУКОВРИСаИТЇ ЕУЛОаМІМРЗОБУТМУМОМ
ЕКОКАТІ ТМОКЗЗМТАММОЇ Т5РТЗЕОЗАУУУСТАМУМІ БУМЕОММУМІ ОМУСОСТТІ ТУ (5ЕО
ІО МО:13)
Варіабельна ділянка легкого ланцюга для клону 88.2 представлена нижче як 5ЕО ІЮ МО:14:
ОАММТОЕБЗАЇ ТТ5РОЕТМТІ ТСАЗЗТОАМТТЗММАМУМОЕКРОНІ ЕТО СС ТММА!ААРЕМРАВЕ зав шркдаАдІ ТІТаАОТЕРЕАІМЕСАЇ МУУММНІ МеСИ ТК ТМ. (ЗЕО 10 МО 14)
Таблиця 5
Зв'язування і конкуренція тАб проти ІСО5 ! Реакційно-
Віасоге Віасоге здатні по Інгібування . й
Клон Ж тАБб для й ' Конкуренція | Конкуренція для людини відношенню | зв'язування проти ІСО5 (нм) яванського до ІСОв-І. проти 314.8 | проти 121.4 макака (НМ) | согв/СстіАд 533 | 304 | 197 | - | - |! т | тт 88217771 123 | 1-0 Їх 1 1 9217 1... 275 | 188 | - | - | т | тт 14511711 495 | 2 щЩщ 435 | - | - | їх | У 93148 17777117 1117193 | - | - | У | У 1214 17711115 111158 1-11 111 20224146 | 719 | - | х- |! ях | т 27191 17771711739 | Ющь85 | - | х-5 ! У | У 29311... 76 | 2 щЩщ 10 | - | - | ях | У 4222 | 57 | 446 | - | - | ч | з
Вісім з кращих зв'язуючих ІСО5 клонів тестували по продукції ІЕМ-у і проліферації Т-клітин з використанням аналізу на основі клітин у дизайні підвищення дози у порівнянні з контрольними мишачими ді ї ЕРВ7114. На підставі цих аналізів, клон, позначений 422.2, вибраний для гуманізації. Див. фігури 1 і 2.
Приклад З Гуманізація антитіл
Експериментальний спосіб(и)
Виділення варіабельних генів антитіла з мРНК і отримання химерного антитіла з Ес дикого типу
Тотальну РНК очищали з осаду клітин гібридоми 422.2, піддавали зворотній транскрипції для отримання кКДНК, з якої продукти варіабельних генів, приблизно 400 п.о., виділяли за допомогою ПЦЕР і очищали за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.
Очищені фрагменти варіабельної ділянки клонували у вектори рТТ5, що містять або константну ділянку ЇДО1 людини, або константну ділянку каппа людини, і трансформували ними компетентні клітини ОН5ба. Колонії відбирали та використовували для інокуляції І -середовища, що містить ампіцилін. Плазмідну ДНК виділяли з культур з використанням набору для виділення в міні-масштабі ОціскІ ухе. Гени варіабельного важкого і легкого ланцюга секвенували, і дані про послідовність вирівнювали способами інформатики для ідентифікації послідовностей генів варіабельного важкого і легкого ланцюга.
Клонування химерних антитіл 422.2 з оптимізацією кодонного складу
Зрілі білкові послідовності мишачої варіабельної ділянки піддавали зворотній трансляції в
ДНК, потім оптимізації кодонного складу. Потім послідовності Мн ії М модифікували для включення переважної п'ять-штрих-нетрансльованої ділянки і переважних ділянок для клонування з будь-якого кінця. Адаптовану послідовність Мн конструювали йде помо з використанням способу на основі ПЦР, і потім олігонуклеотиди, що перекриваються, прищеплювали в ЇдДс1 людини з Ес дикого типу або в пІдС1 з інактивованим Ес (1235А, 5237А), або в піІдс4 із стабілізованою шарнірною ділянкою (5228Р, І1235Е) (Ід9с4РЕ), що присутні у векторах рТТ. Адаптовану послідовність Мі конструювали де помо з використанням способу на
Зо основі ПЦР, ї потім олігонуклеотиди, що перекриваються, прищеплювали в Карра константну ділянку каппа, що присутня у векторі рТт5.
Отримані плазміди рТТ використовували для трансфекцій НЕК для отримання химерних антитіл
Гуманізація варіабельних доменів 422.2
Матриці варіабельних (М) генів вибирали для гуманізації 422.2 за допомогою пошуку у придатних базах даних власної розробки для зародкового важкого і легкого ланцюга з використанням М ділянок 422.2 із замаскованими СОК з використанням ВІ А5ТР. ІЗНМІ1-69 і
І2ЖКМЗ3-11 вибрали з найкращих збігів у ВГА5БТР як матриці каркасної ділянки М гена для гуманізації 422.2. Людські зародкові сполучні (У) гени І5Нуб і ІЗКО2 вибрані для гуманізації 422.2.
Відмінності залишків між людськими зародковими генами і послідовності 422.2 ідентифікували, аби сприяти вибору зворотних мутацій (мутацій, введених для зміни специфічного залишку людської каркасної ділянки на мишачий залишок). Шість гуманізованих варіантів МН і шість гуманізованих варіантів МІ розробили, піддали оптимізації кодонного складу і потім модифікували для включення переважних 5'- і З3'-подовжень. Адаптовані послідовності варіабельної ділянки конструювали де помо з використанням способу на основі
ПЦР, ї потім олігонуклеотиди, що перекриваються, відповідно клонували у вектори рт.
Отримані плазміди рТТ використовували в трансфекціях НЕК для отримання гуманізованих антитіл. Клітини НЕК29З6Е у суспензії підраховували і розчиняли до 1,5х105 клітин/мл - 2х105 клітин/мл з використанням середовища для експресії 293 Егеевіуює, доповненого 0,05 95 генетицином, і для деяких експериментів, доповненого 1 95 плюроніком Еб68. ДНК і реагент для трансфекції (Сетіпі або 293-Ресііп) додавали до ОріїМЕМ і обережно гомогенізували перед інкубацією протягом 20-30 хвилин при кімнатній температурі. Потім ДНК-ліпідні комплекси об'єднували із суспензіями клітин, і трансфіковані клітини інкубували при 3720, 5 95 СО2, 125 об./хв. Для деяких трансфекцій, живильне середовище з триптоном (середовище для експресії 293 Егеезцуїе, доповнене 1 95 плюроніком Еб8 і 20 95 мас./об. казеїнового триптону) додавали в середовище для трансфекції через 24-48 годин після трансфекції. Суспензії трансфікованих клітин інкубували протягом 5-8 діб, поки кількість життєздатних клітин не падала нижче 60 95, потім центрифугували (залежно від конструкції). Супернатанти збирали і фільтрували.
Антитіла очищали за допомогою пропускання супернатантів через 1 мл колонку НіТгар НР з білком А для забезпечення зв'язування антитіла, промивання колонки за допомогою 10 мл РВ5 і елюції з використанням 5 мл Ід ЕїІшіе (Ріегсе, 21009). Очищений білок піддавали обміну буфера на РВ5 з використанням фільтруючих центрифугованих одиниць Мійїроге Сепігісопо (відсікання 30000) і оцінювали кількісно на спектрофотометрі Мапагор.
РЕЗУЛЬТАТИ
Сконструйовані експресуючі плазміди
Послідовності варіабельного гена мишачого антитіла з клону гібридоми 422.2 успішно виділяли, і послідовності показані нижче як ЗЕО ІЮО МО: 19 і 20, відповідно, так само як на фігурі 8.
Коо) 422 НС
ОМОГ ОО5ОаРЕЇ МАРОЕЗУКІЗСМабБам ТЕТОМАМНУУКОЗНАКОІ ЕМ ІЗІМЗОНТМММОКЕ
ОСКАТМТУМОКЗЗЗТАМУМЕЇГ АВІ ТЗЕОБАМУСС,АММУаМУСУМЕруУМУусАсТТМТУ5о (5ЕО І
МО:19) 42216
ЕММГТО5РАІМ5АЗРЕЕКУМТМТО5ЗАЗОЗУЗУМНУУООКІТЗРКІ МЛУОТЗКІ АБСОУРОаВЕЗИа аБОМ5ОУБІТІЗ5О5МЕАЕОМАТУУСЕОаБахуРУТРасаИткі ЕІКА (ЗЕО І МоО:20)
Клонування виділених варіабельних ділянок у вибрані вектори рТТ5 привело в результаті до отримання плазмід, що кодують послідовність химерного легкого ланцюга 422.2 і послідовності химерного важкого ланцюга в пІдс1 з Ес дикого типу, пПІдДС1 з інактивованим Ес (І 235А/5237А, нумерація за ЕМ) або в йпіде4 РЕ (5228Р//235Е, нумерація ЕМ). Химерні антитіла використовували для підтвердження функціональності клонованих мишачих ділянок М і для ідентифікації найбільш придатного ізотипу.
Конструювання експресуючих плазмід рТТ для ссавців, що кодують важкі і легкі ланцюги різних гуманізованих варіантів 422.2 проведено успішно.
Експресія, очищення та ідентифікація Н2/ 5 пІдДС4РЕ
Послідовності зрілого білка Н2І 5 пІдС4РЕ включені у фігуру 9 з додатковими позначеннями.
Послідовності ДНК кодуючих ділянок важких і легких ланцюгів Н2гІ 5 пІдДСАРЕ включені у фігури 10 ї 11.
Приклад 4: Функціональний аналіз Н2І 5
Зв'язування рецептора Ес
Гуманізоване антитіло Н2гІ5 модифікували від ізотипу (91 людини до модифікованого ізотипу ЇдД4 людини, що включає мутації 5228Р, І1235Е (нумерація Е)) для запобігання обміну антигензв'язуючими фрагментами (Бар). (д54РЕ людини вибраний замість дсС1 людини, оскільки він зменшує зв'язування тАб з активуючими рецепторами Есу і С1д, таким чином, зменшуючи потенціал тАб індукувати виснаження позитивних за ІСО5 клітин за допомогою антитілозалежної цитотоксичності (АОСС) або комплементзалежної цитотоксичності (СОС). Крім того, ІЯ54РЕ людини (5228Р, 1235Е) зберігає зв'язування з ЕСуУКІЬ (інгібуючим рецептором
Есу). Взаємодія з ЕсуКІЇЬ може бути критичною для агоністичної активності антитіл проти ІСО5 за допомогою забезпечення перехресного зв'язування антитіл. Показано, що взаємодія з бо ЕсукІІЬ є критичною для агоністичної активності інших імуномодулюючих антитіл, націлених на рецептори сімейства ТМЕ-а, так само як на СО28 (ВагппоІюотавиз Р еї аї., "СеїЇ сопіасі-дерепаеєпі ргітіпд апа Ес іпіегасйоп мйп СОЗ2жіттипе клітини сопігірше (о Ше ТОМ1412-Піддегей суюкКіпе гезропзе". у). Іттипої., 192(5); 2091-88 (2014)).
Крім того, показано, що Ідш54РЕ людини зменшує зв'язування тАБр з активуючими рецепторами Есу (ЕсуВІ, РсукКПа і ЕсукКШа) і С1д, таким чином, зменшуючи потенціал тА індукувати виснаження позитивних за ІСОБЗ клітин за допомогою антитілозалежної цитотоксичності (АЮСС) або комплементзалежної цитотоксичності (СОС). Крім того, (О4РЕ (5228Р, 1 235Е) людини зберігає зв'язування з ЕСУРІІЬ (інгібуючим рецептором Есу) (таблиця 6).
У таблиці 6 нижче показана репрезентативна афінність зв'язування з рецепторами Есу людини найкращого НаІІ 5 у формі антитіла або пІдСІ1, або пІдС4РЕ.
Таблиця 6
Репрезентативна афінність найкращого гуманізованого антитіла проти ІСО5, у формі або ПІДЕ, або пІДСАРЕ, для рецепторів Есу людини
Есук Па ЕсукК Па Есук Ша Есук Ша 422 Н2І 5 пІДСАРЕ
МВ-відсутність зв'язування.
Експериментальний спосіб
Функціональне оцінювання гуманізованих варіантів 422.2
Для гуманізації чотирьох кандидатів на агоністичні антитіла проти ІСбО5, отримували мишачо-людські химери, що являють собою злиті білки з мишачої ділянки М і частини Ес ІДИ людини. Ці чотири химерні антитіла тестували в аналізі активації сумарних РВМС людини в зв'язаній з планшетом формі. Для химери 422.2 проти ІСО5 показана найкраща агоністична активність в аналізі активації зв'язаних РВМСОС. За об'єднаними даними зв'язування і біофізичними властивостями, клон 422.2 вибрали для гуманізації. Чотири гуманізовані варіанти 422.2 вибрали на підставі зв'язування з ІСО5 і біофізичних характеристик (422.2 Н2І10, Н2І 5,
НОГО ї Н5БІ 5) їі тестували в аналізах активації зв'язаних РВМС. Для варіанту Н2І 5 показали порівнянну або кращу активацію Т-клітин, як виміряно по продукції цитокінів, відносно інших варіантів (фігура 3).
Варіабельна ділянка важкого ланцюга (Мн) і зрілий важкий ланцюг для варіанту Н5 представлені нижче як 5ХЕО ІЮ МО:15 і 16, відповідно. не Ун
ОМОЇ МОБСАЕУККРОЗБЗУКУЗСКАБИОМ ТЕТОМАМНУУВОА РОГ ЕЛ ІБІМЗОНТМММОКЕ
ОСВАТМТМОКОЗТЗТАММЕЇ 551 В5ЕОТАУУ УСС НЯМ МаМУсамУвруУмаоаттмМтмее ф (5БО І
Зо МО:15)
Зрілий важкий ланцюг Н5
ОМОЇ МОБСАЕУККРОЗБЗУКУЗСКАБИОМ ТЕТОМАМНУУВОА РОГ ЕЛ ІБІМЗОНТМММОКЕ
ОСВАТМТМОКОЗТОЗТАММЕЇ 55І В5ЕОТАУУ УСС В ММ мамам УвЕрумаоатУТУ5ЗАВТКаРБМ
ЕРГАРБЗКОТЗСОаСТААГаСІ МКОМЕРЕРУТУБМ МСА ТЗаУНТЕРАМІ О550І 51 55УМ ТУР
ГатОогМміСМУМНкКРЗМТКМОККМЕРКЗСОКТНТОСРРОРАРЕЇЇ аРЗМУРІ ЕРРКРКОТІ МІЗАТРЕМТ
СУУМОУЗНЕОРЕУКЕМУ УУрамЕУНМАКТКРАЕЕОУМЗТУВУМУМІ ТМ НОМ МЕОКЕУКСКУБМ
КАЇ РАРІЕКТІЗКАКЕОРРЕЕРОММТІ РРОВОЕЇ ТКМОМ5І ТОЇ УКИЕМРЗОІАМЕМЕЗМСООРЕММУКТ
ТРРМ'ОБразеЕРІ УК ТМОКЗАМОССаММЕЗСЗУМНЕАІ НМНУТОКОБІ 5І РОК (ЗЕО І МО:16)
Варіабельна ділянка легкого ланцюга (Мі) і зрілий легкий ланцюг для варіанту 10 представлені нижче як 5ЕО ІЮ МО:17 і 18, відповідно.
ІМ.
ЕІММГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БС5АЗО5ЗУЗУМНУМООКРООАРА І ІМОТЗКІ АБИ РАНЕЗОЗОИ
ЗаТОРТІТІЗБІ ЕРЕОРАМУУСГОСБамРУТРИОИтТкКІ БІК (ЗЕО 1О МО:17)
Зрілий легкий ланцюг І 0
ЕІММГТО5РАТІ 5І 5РОЕВАТІ БС5АЗО5ЗУЗУМНУМООКРООАРА І ІМОТЗКІ АБИ РАНЕЗОЗОИ
ЗатТОгЕТІТІЗ5І ЕРЕОЕАУУМСгОСЗахуРМТЕСОСТКІ ЕІКАТМААРЗУРІЕРРБЗОЕОЇ КЗатАБУМСІ
ЕММЕМРАЕАКМОМУКМОМАГ О5а2МЗОЕЗМТЕООЗКОБЗТУБІ 5517І ТІ ЗКАЮОМЕКНКУМАСЕМУТНОСІ.
ЗЗРУТКОЕМАИЕС (5ЕО І МО 18)
Вибір ІЧС4ГРЕЇ як ізотип
Потім 422 Н2І5 Ідс1 тестували в різних аналізах активації сумарних РВМС у розчинній формі. Цей розчинний формат, мабуть, більше відповідає стану іп мімо, оскільки в аналізах сумарних РВМС лімфоцити, моноцити та інші імуноцити містяться в одній і тій же лунці. Проте, для 422 Н2І 5 ІДО1 тА постійно показували зменшену життєздатність популяцій Т-клітин, таку, що нагадує виснаження Т-клітин. Цей результат спостерігали в різній мірі для 11 здорових донорів, яких тестували, і він був більше виражений для СО4-Т-клітин, ніж для СОв8'Т-клітин.
На відміну від цього, для антитіла 422 Н2І 5 не показане значного зменшення життєздатності Т- клітин при експресії у формі або ізотипу ІдС4ЦРЕЇ, або ізотипу з інактивованим Ес, що дозволяє передбачати, що зменшена життєздатність може бути обумовлена опосередкованою Есуй антитілозалежною клітинною цитотоксичністю (2ХОСС) (фігура 4).
Залежна від дози Н2І 5 пІдДС4РЕ відповідь в аналізі активації СО4--Т-клітин
Для кількісного оцінювання ефектів активації Т-клітин за допомогою Н2І 5 пІдС4РЕ, первинні
Ср4-Т-клітини людини спочатку піддавали попередній стимуляції за допомогою зв'язаного з планшетом антитіла проти СОЗ (1 мкг/мл)/ антитіла проти СО28 (3 мкг/мл) протягом 48 годин для підвищення рівня рецептора ІСО5 на поверхні популяцій ефекторних Т-клітин, з подальшою повторною стимуляцією з використанням РупавВеаад5 проти СОЗ ї Н2І 5 пІдс4 РЕ. 10- точкову криву залежності відповіді від дози отримували за допомогою обробки заздалегідь стимульованих СО4.«Т-клітин з використанням серійних концентрацій зв'язаного або розчинного
Н2гІ5 пІдсС4РЕ у присутності СупаВеаде5 проти СОЗ3. Результати показали, що як зв'язане, так і розчинне Н2І 5 пІдС4РЕ збільшувало продукцію цитокінів ІЕМ-у і ТМЕ-й5 залежним від дози чином у двох окремих здорових донорів-людей (фігура 5). Аналіз підбору кривої відповіді залежно від дози проводили для отримання значень ЕС50О. Цікаво, що обробка Н2І 5 пІДСАРЕ приводила до значно більшого діапазону індукції цитокінів, коли антитіло було фіксованим на планшеті, на відміну від додавання у формі розчинного білка в супернатант культур Т-клітин.
Функціональне тестування Н2І 5 пПІдС4РЕ в аналізі активації РВМС людини в розчині
Для тестування функції Н2І 5 пІДСАРЕ в культурі сумарних РВМС людини ех мімо, РВМС від здорових донорів-людей підготовляли за допомогою зв'язаних з планшетом антитіл проти СОЗ і антитіл проти СО28 протягом 48 годин, з подальшою обробкою розчинним Н2І 5 пІдсСаРЕ у присутності дупабеадх5 проти СОЗ (співвідношення бусини:клітини-1:1) протягом 3,5 діб.
Продукцію цитокінів і експресію гранзиму В Т-клітинами перевіряли як функціональні показники функції Т-клітин. Результати від З донорів узагальнені на фігурі б, надаючи доказ для припущення, що Н2гІ5 пІдС4РЕ індукує проліферацію, продукцію цитокінів і збільшений цитотоксичний потенціал в активованих РВМС від здорових донорів-людей (фігура 6).
Активність тАб проти ІСО5 по відношенню до заздалегідь стимульованих РВМС людини
Активність Н2І 5 пІдС4РЕ оцінювали в аналізі попередньої стимуляції РВМС, в якому РВМС піддавали попередній стимуляції за допомогою зв'язаного з планшетом антитіла проти СОЗ (клон ОКТЗ, 1 мкг/мл) і антитіл проти СО28 (клон СО28.2, З мкг/мл) протягом 48 годин. Потім для ідентифікації оптимальних умов попередньої стимуляції, Оупабеадх СОЗ і Бупабеаа5
СО3/6028 для людини (ТпептоРізпег) у різних співвідношеннях бусин до клітин використовували для попередньої стимуляції РВМСОС. Після 48 год. попередньої стимуляції, клітини збирали, і бусини видаляли за допомогою магніту перед повторною стимуляцією з використанням Оупабеад5 проти СОЗ (співвідношення бусин до клітин-1:1) у присутності або у відсутність розчинного ттАб проти ІСО5. Агоністичне тАБб проти ІСО5 Н2І 5 пІдС4РЕ приводило до індукції ІЕМуУ у порівнянні з контролем для ізотипу у всіх тестованих умовах попередньої стимуляції; проте, діапазон продукції І(ЕМу назад корелював із силою попередньої стимуляції.
Приклад 5 - Маркери активації Т-клітин
Способи
Залежні від концентрації зміни функціональних кінцевих точок оцінювали за допомогою обробки РВМС здорових людей імобілізованим Н2І 5 пІдсС4РЕ у діапазоні концентрацій від 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл паралельно з обробкою антитілом проти СОЗ при 0,6 мкг/мл. Зміни експресії поверхневих маркерів активації Т-клітин СО69, ОХ40 ії СО25 оцінювали за допомогою проточної цитометрії і розглядали як вимір активації Т-клітин. Проліферацію Т-клітин вимірювали по зміні забарвлювання ядер Кіб7. Зміна рівнів різних цитокінів ТИ1, ТИ2 ї Тп17 оцінювали на платформі М5О у відповідь на обробку Н2І 5 пІдсС4РЕ у присутності обробки СОЗ.
Тимчасові точки через 24 і 48 годин після обробки вибирали для забезпечення фіксації ранніх змін рівнів цитокінів, так само як змін проліферації, які переважно відзначають у пізніших 60 тимчасових точках.
Експериментальний препарати)
Виділення мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС) людини
Цілісну кров відбирали у здорових донорів з використанням шприців, покритих рідким гепарином натрію (Задепі, кінцева концентрація 10 МЕ/мл) і потім розчиняли у співвідношенні 1:11 фосфатно-сольовим буфером (РВ5). Розчинену кров (35 мл) напластовували поверх 15 мл середовища з градієнтом щільності фіколу (СЕ Неайпсаге) і центрифугували 1200 х д протягом 20 хвилин при кімнатній температурі (КТ) з відключеним гальмом. Шар білих мононуклеарних клітин обережно переносили в нову 50 мл пробірку. Рівний об'єм РВ5 додавали в пробірку і центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин при КТ. РВМС промивали один раз з використанням РВЗ і центрифугували, як описано раніше. РВМС ресуспендували в 50 мл середовища АЇМ-М. Клітини підраховували з використанням лічильника клітин і аналізатора життєздатності Мі-СеїЇ (ВесктапСоипег).
Покриття антитілом
Антитіло проти СОЗ людини розчиняли в буфері для покриття до кінцевої концентрації 0,6 мкг/мл. З використанням 100 мкл розведеного антитіла покривали 96-лунковий, плоскодонний планшет протягом ночі при 42С. На наступну добу, вихідні розчини 10,1 мг Н2І5 пІдСа РЕ і 7,9 мг антитіла проти К5М, контрольного для ізотипу Ідс4 РЕ, серійно розчиняли 1:2 у буфері для покриття для отримання кінцевих концентрацій антитіла в діапазоні від 100 до 0,1 мкг/мл. З використанням 100 мкл розведених антитіл покривали планшет, покритий антитілом проти СОЗ протягом 4 годин при кімнатній температурі.
Експериментальний спосіб(и)
Аналіз активації РВМС людини
Н2І 5 пІДСАРЕ тестували в аналізі активації РВМСО людини, де залучення ТОВ за допомогою антитіла проти СОЗ і костимуляція ІСО5 з Н2гІ 5 пІдСсА4РЕ відбувається одночасно, і ефекти активації моніторували через 24 і 48 годин після активації. Цей експеримент повторювали чотири рази (п--4) з кров'ю від чотирьох різних донорів. Двісті (200) мкл РВМС (1х105 клітин/мл) у середовищі АІЇМ-М додавали в покриті антитілом проти СОЗ лунки з різними концентраціями
Н2гІ 5 поса РЕ або контролю для ізотипу ІдДа4. Три технічні повтори включали для кожних умов аналізу. РВМС культивували при 3720 і 5 95 СО» протягом різних періодів часу, як вказано вище.
Зо Супернатанти збирали в тимчасових точках 24 і 48 годин і потім зберігали при -8020 для аналізу секретованих цитокінів на платформі М5О. Клітини переносили в 9б-лунковий планшет з глибокими лунками через 24 і 48 годин і промивали двічі з використанням 1 мл буфера для забарвлювання для ЕАС5, забарвленого з використанням кон'югованих з флуорофором антитіл або контролю для ізотипів.
Забарвлювання поверхні клітин
Клітини спочатку забарвлювали 100 мкл фіксованого барвника для визначення життєздатності еРіІног 506, заздалегідь розчиненого у співвідношенні 1:1000 в РВ5 протягом 30 хвилин у темноті при 42С. Клітини промивали і потім інкубували з антитілами для детекції поверхневих маркерів клітин, кон'югованими з різними флуорофорами, на льоду протягом 30 хвилин. Після забарвлювання антитілами проти клітинної поверхні, зразки, що не підлягають забарвлюванню по маркерах інтерналізації промивали один раз крижаним буфером для забарвлювання для ЕАС5 перед аналізом на проточному цитометрі ЕАС5 Сапіо ЇЇ.
Робочі характеристики цитометра перевіряли щодоби з використанням бусин для встановлення і перевірки цитометра. Компенсацію виконували з використанням набору бусин
АрсС проти антитіл миші, індивідуально забарвлених антитілами для детекції, кон'югованими з кожним флуорохромом. Зразки аналізували, і дані, отримані після встановлення відповідної компенсації, підтверджували з використанням суміші бусин, згаданих вище.
Внутріклітинне забарвлювання ЕохрЗ і Кіб7
Після поверхневого забарвлювання клітин, клітини фіксували і пермеабілізували для забарвлювання внутріклітинних маркерів. З використанням набору буферів для чинників транскрипції, буфер для фіксації/пермеабілізації підготовляли за допомогою його розчинення у співвідношенні 1:3 в буфері-розчиннику. Буфер для пермеабілізації/промивання підготовляли за допомогою розчинення 5Х вихідного розчину буфера для пермеабілізації/промивання в деіїонізованій воді. Один (1) мл буфера для фіксації/пермеабілізації додавали до кожного зразка, і планшети негайно перемішували із струшуванням на підтрушувачі. Планшети інкубували в темноті при 49 протягом 45 хвилин. Після центрифугування додавали 1 мл буфера для пермеабілізації/промивання, і вміст планшетів перемішували, і планшети центрифугували протягом всього двох промивань. Отримували суміш для інтерналізації з маркерними антитілами. 100 мкл антитіл для інтерналізації додавали до відповідних зразків, і бо планшети інкубували в темноті при 49С протягом 30 хвилин. Зразки промивали двічі з 5О0 використанням 1 мл буфера для пермеабілізації/промивання, ресуспендували в 250 мкл буфера для проточної цитометрії і аналізували в проточному цитометрі ЕАС5 Сапіо ІІ.
Розроблений на замовлення 9-плексний аналіз цитокінів людини
Рівні цитокінів вимірювали з використанням розробленого на замовлення 9-плексного набору М5О для людини. Зразки і калібратори розчиняли в розчиннику 43. Зразки, розчинені у співвідношенні 1:10 для 9-плексного аналізу і 12200 для описаного аналізу ІЄМу, у 0,250 мкл розчинника, додавали до кожної з двох панелей калібраторів. Після струшування, калібратори інкубували на льоду протягом щонайменше 5 хвилин. Двісті (200) мкл кожної панелі калібраторів додавали до 400 мкл розчинника для отримання найвищої концентрації калібратора, і серійне розчинення у співвідношенні 1:14 використовували для отримання 6 додаткових розчинень калібраторів. Розчинник 43 використовували як фон для планшета. 50 мкл розчинених зразків (у трьох повторах) і калібраторів (у двох повторах) додавали в планшет
М50. Планшети герметично закривали та інкубували при КТ із струшуванням протягом 2 годин.
Планшети промивали З рази з використанням 150 мкл розчиненого буфера для промивання з набору М5О. Для кожного планшета розчин антитіла для детекції отримували за допомогою об'єднання 60 мкл кожного з 9 антитіл для детекції, доведених до З мл розчинником 3. Після додавання 25 мкл розчину антитіла для детекції, планшети герметично закривали та інкубували при кімнатній температурі, в темноті, із струшуванням протягом 2 годин. Планшети промивали, як вище. 150 мкл 2х буфера для зчитування додавали в планшети та їх зчитували в ОціскРІех.
Аналіз цитокіну І(ІЕМу людини
Зразки і калібратори розчиняли в розчиннику 2. 1 мл розчинника додавали до калібратора.
Після струшування, калібратор інкубували на льоду протягом 5 хвилин. Це являло собою калібратор 1. Серійне розведення 1:4 використовували для отримання 6 додаткових розчинень калібраторів. Розчинник 2 використовували як фон для планшета. П'ятдесят (50) мкл розчинених зразків (у трьох повторах) і калібраторів (у двох повторах) додавали в планшет
М50. Планшети герметично закривали та інкубували при КТ із струшуванням протягом 2 годин.
Планшети промивали З рази з використанням 150 мкл розчиненого буфера для промивання з набору М50О. Розчин антитіла для детекції отримували в розчиннику 3. Для кожного планшета, 60 мкл кожного з антитіл для детекції додавали до розчинника для отримання всього З мл реагенту для детекції. Після додавання 25 мкл антитіл для детекції, планшети герметично закривали та інкубували при кімнатній температурі, в темноті, із струшуванням протягом 2 годин. Планшети промивали З рази. Буфер для зчитування додавали в планшети та їх зчитували в ОціскРІех.
Аналіз даних
Аналіз даних аналізу цитокінів і проточної цитометрії
Результати аналізу цитокінів МБО аззау аналізували з використанням програмного забезпечення М5О Оізсомегу УММогКрепсі, версії 4.0 (Мезо-5саїє), Місго5ой Ехсеї! і Сгарпраай
Ргізт. Дані проточної цитометрії аналізували за допомогою ОІМА, і кількості наносили на графік у програмному забезпеченні сгарпРаай Ргізт.
Аналіз підбору кривої відповіді залежно від дози антитіл
Дані відповіді залежно від дози імпортували в програмне забезпечення сСгарпРай Р'гіхт і трансформували в логарифмічній шкалі. Відповідь залежно від дози агоніста в моделях з різним кутом нахилу кривої використовували для аналізу даних і отримання значень ЕС50. Формула підбору приведена нижче: у нижнєж(верхнє-нижнє)1--10"(І сдЕСБО-Х) кут нахилу))
Статистичні аналізи
Статистичну значущість відмінностей між значеннями для Н2І 5 пПІдС4РЕ ії контрольного антитіла для ізотипу в аналізі проліферації аналізували за допомогою двостороннього 1- критерію Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТИ
Оцінювання змін рівня цитокінів з використанням Н2І 5 пІДСАРЕ
Обробка РВМС імобілізованим Н2І 5 пІдсС4РЕ у присутності антитіла проти СОЗ індукувала секрецію, до різної міри, цитокінів ТП1, таких як ІЕМУу, ТМЕа, цитокінів ТА2, 1-6 ії 11-10, так само як цитокіну ТА17 І--17а залежним від концентрації чином. Для інших виміряних цитокінів, таких як 1-4, 11/-5 ії І1/-13, показана також менша міра залежної від концентрації відповіді на стимуляцію Н2І 5 пІдсС4РЕ. Результати для чотирьох окремих донорів узагальнені в таблиці 7.
Функціональне оцінювання активності Н2І/5 пІдСЯ4РЕ по відношенню до поверхневих маркерів активації Т-клітин за допомогою проточної цитометрії
Обробка Н2І 5 пІдсС4РЕ з паралельною стимуляцією СОЗ в неактивованих РВМС людини бо (п-4 донора) індукувала значимі зміни маркерів активації Т-клітин (таблиці 7 і 8)). Сильне збільшення СО4 і СО8 Т-клітин, позитивних за СО25 і ОХ40, спостерігали в оброблених Н2І 5 пІд9сСАРЕ зразках у порівнянні із зразками, контрольними для ізотипу ІЇД4 людини. Відсоток СЮО4 і СО8 Т-клітин, позитивних за СОб69, також збільшувався в тимчасових точках 24 і 48 годин залежним від концентрації чином.
Характеризація ефекту Н2І5 пІдДС4РЕ на проліферацію Т-клітин
Обробка імобілізованим Н2гІ/5 пІде4РЕ з паралельною активацією СОЗ приводила до залежного від концентрації збільшення проліферації як СО4, так і СО8 Т-клітин (п--6 донорів), як вимірювали за допомогою забарвлювання внутрішньоклітинного Кіб7 (таблиця 8). Н2І5 пІдсСа4РЕ підсилювало також проліферацію регуляторних Т-клітин СО4-С0254-4Еохр3- залежним від концентрації чином, але у меншій мірі, ніж спостерігали для сумарних СО4 і СО8 Т-клітин.
Посилення проліферації Т-клітин за допомогою Н2І 5 пІдС4РЕ спостерігали лише в тимчасовій точці 48 годин. Посилення проліферації регуляторних Т-клітин не було значимим, тоді як залежне від концентрації посилення проліферації СО4-- клітин (ре 0,05 для концентрації більше 0,4 мкг/мл Н2І 5 пІдС4РЕ) і СО8Т-клітин (р « 0,05 для концентрацій між 0,2 і 1,6 мкг/мл) було значимим (див. таблицю 7).
Таблиця 7
Значення ЕС5БО (мкг/мл) для всіх функціональних кінцевих точок для Н2І 5 пІДСАРЕ в аналізі активації РВМС людини. 1111111 | ОопоглізбЕБО | Оопогї185М45 )| Оопог 112436 | Бопог 1149М52 77.7.7.ю.ю | гагод. | 48год. | г4год. | 48год. | 24год. | 48год. / г4год. | 48год. - юЩ | 77 | 73 | 07 08 | 07 | 06 | 05 | 06 єму | 04 | 75 | 03 1 07 | 03 | 05 | 02 | 06 -ї7та, | 14 | 76 | 08 / 11 | 06 | 08 | 07 | 10 п- 1 07 | 77 | 07 | 08 | МА | МА / 02 | 03 сра-србве| 05 | 04 | 08 | МА | 11 | 171 | 05 | 04 срагсргеі| 03 | 06 | 24 | 05 | 06 | 06 | 06 | 04 срагохаої| 02 | 04 | 16 | МА | 06 | ї2 | 06 | 04 сов-србея| 05 | 06 | 72 | 05 | 08 | 71 | 06 | 04 совсргея| 04 | 07 | 2 | 05 | 06 | 05 | 70 | 04 сразкіб7я | Мт | м | МА / 06 | МА | 08 | МА | 05
МА-не аналізували (значення ЕС5БО неточні через погану відповідність кривих).
МТ-не тестували.
Таблиця 8
Відсоток С04 або СО8 Т-клітин, позитивних за СО25, Еохр3 і Кіб7, в РВМС людини після стимуляції Н2І 5 пІдСа РЕ у присутності антитіл проти СОЗ протягом 48 годин
Концен- б/р; : о й СО8 Т-клітин) або СО8 Т-клітин) антитіла оно оно оно оно оно оно 0 | 7102 | 38 | бл | 102 | 38 | 61 | 045 01 | 124 | 42 | 76 | 86 | 36 | 66 | 0220 02 | 118 | 45 | 98 | 85 | 32 | 71 | 0054 зжтрег | 04 | 143 | 52 | 13 | 86 | 34 | 74 | 0076 со4ат- | 08 | 186 | 69 | 143 | 84 | 34 | 73 | 0069 клітин 125 | 202 | 76 | 151 | 96 | 40 | 81 | 0072
Таблиця 8
Відсоток С04 або СО8 Т-клітин, позитивних за СО25, Еохр3 і Кіб7, в РВМС людини після стимуляції Н2І 5 пІдСа РЕ у присутності антитіл проти СОЗ протягом 48 годин
Концен- | на| д підсаРЕ (95 від СО4 або | Контроль для ізотипу (96 СО4 щ трація СОВ Т-клітин) або СОВ8 Т-клітин) Т-критерій антитіла
Доно Доно Доно Доно Доно Доно 50 | 200 | 79 | 133 | 96 | 50 | 97 | о 0 11 72 | 12 | 23 | 72 | 712 | 23 | 0693 о 1 96 | 15 | 29 | 61 | 09 | 21 | 0219 02 | 90 | 21 | 44 | 50 | 09 | 24 | 0098 04 | 119 | 39 | 75 | 68 | 70 | 27 | 0025 ор 08 | 182 | 71 | 124 | 76 | 713 | 25 | 0028 ків7л-ср| 1,6 | 195 / 89 | 159 | 54 | 08 | 32 | 0024 4т- клітин 0 | 10 | 44 | 27 | 10 | 44 | 27 | ви 01 | 152 | 83 | 48 | 96 | 53 | 23 | бо ор 08 | 207 | 196 | 138 | 142 | 45 | 20 | 0047 ків7-со 8 т- клітин 0 | 297 | 102 | 113 | 29,7 | 102 | 113 | 0920 уківлтат! 98 1 370 | 263 | 263 | 367 | 85 | 144 | 09 рег кллин 31 | 38,3 | 302 | 272 | 339 | 96 | 174 | 055
ОБГОВОРЕННЯ
Добре відомо, що ІСО5 є важливим для активації Т-клітин і індукції як ТИ, такі ТН2 цитокінів. У цьому дослідженні, показана активність іп мійто Н2гІ5 НіІдСаРЕ (агоністичного антитіла проти ІСО5), з різними вимірами активації Т-клітин і індукції цитокінів. Усі виміряні маркери активації Т-клітин, СО25 (альфа-ланцюг рецептора І/-2), СбО69 (ранній маркер активації) і ОХ-40 (маркер костимуляції) піддавалися підвищувальній регуляції при обробці Н2І 5 пасаРЕ у поєднанні із стимуляцією СОЗ3. Серед моніторованих маркерів активації, відсоток Т- клітин, експресуючих СО69 і ОХ40, сильно збільшувався за допомогою обробки Н2І 5 підСсАРЕ.
СО69 являє собою ранній маркер активації, і таким чином, ефекти переважали в зразках через
24 години. Кількість СО25, іншого важливого маркера активації Т-клітин, збільшувалася при обробці Н2І5 пІДС4РЕ в обох тимчасових точках, що дозволяє передбачати, що Н2І 5 пІдСАРЕ грає важливу роль у підтримці активації Т-клітин. Кіб7 являє собою ядерний білок, асоційований з проліферацією клітин. Дані проточної цитометрії з внутрішньоклітинним забарвлюванням Кіб 7 показали, що імобілізований Н2І 5 пІдДС4РЕ значимо підсилював проліферацію як СО4, так і СОв8
Т-клітин у контексті залучення ТСК. Хоча проліферація регуляторних Т-клітин також збільшувалася за допомогою НІ 5 пІдДС4РЕ, зміни не були статистично значимими.
Тп17 клітини людини грають ключову роль у регуляції протипухлинного імунітету (Мипе?, 5., еї аї., Т ПеїІрег їуре 17 сеї сопітіршціеє 10 апіі-їшитоиг іттипйу апа рготоїе Ше гестийтепі ої Т
ПеїІрег їуре 1 сеї ю Ше їШштоиг. Іттипоіоду 2013; 139: 61-71). Дослідження показали, що ІЇСО5 залучений у розвиток і функціонування ТП17 людини І|Кітига, А., еї аїЇ., Кедшайог ої Тгед/Тп17 раїапсе. Єиг. у. Іттипої. 2010; 40: 1830-1835; Рашов СМ еї аї. ТНе іпдисіріе совіїтшіаг (ІСОБ) ів стйїса! ог Те демеіортепі ої пПитап ТА17 сеїІв. 5сі Тгапві Мед. (2010) 2(55); 55га78; Меївоп, М. Н., еї а. ТНе іпдисіріє собіїтшаюг" айдтепів Те17 сеї! те5ропзез 0 зеїї апа їштог її5!це. У Іттипої, 2015; 194: 1737-1747) За даним функціональним оцінюванням Н2І5 пІдС4РЕ, більшість цитокінів, зв'язаних із запальними та імунними відповідями, вимірювали в супернатанті культур клітин після стимуляції антитілами проти СОЗ ї Н2І 5 пІдса4РЕ. Н2І 5 пІдсСаРЕ сильно індукує секрецію цитокінів ТП1, ІЕМ-у ії ТМЕ-а, і цитокіну ТИ17, /-17а, в РВМС людини, що дозволяє передбачати, що Н2І5 пІдбС4РЕ має потенціал грати важливу роль у протипухлинних відповідях. І/-б, разом з ТОБ-ВД, є важливим цитокіном для індукції розвитку клітин Тп17 з наївних Т-клітин. На відміну від цього, 1-6 інгібує диференціювання Трег, індуковане ТаБЕ-В
ЇКітига, А., 2010; Коп, Т., еї аї., 1-6 сопігоїв ТН17 іттипйу іп мімо Бу іппірййпу Те сопмегзіоп ої сопуепіопа! Т сеї іпіо ЕРохрЗ--тедшіайту Т сеїв. РМАб, 2008; 105: 18460-18465|. У цьому дослідженні виявлено, що Н2І 5 пІдС4РЕ збільшує секрецію ІІ -б6, яка може далі підсилювати розвиток ТП17-клітин. Показано, що агоністичні антитіла проти Т-клітинних рецепторів, таких як с0р28 і члени сімейства рецепторів ТМЕ, утворюють колоколоподібну криву залежності відповіді від дози (МУпйе, А. Г., еї аїЇ.,, Сопіогтайоп ої Ше Нитап Іттиподіориййп (2 Ніпде Ітрагіб зЗирегадопівіїс Ргорепіє5 Юю Іттипозіїтшаюгу Апіїсапсег Апііродіе5. Сапсег СеїІЇ, 2015, 27: 138- 148; І ипаетг, РЕ., еї аї, Тороіодіса! Недцігетепів апа Зідпаїїпуд Ргорепієвз ої Т СеїІ-асіїмайіпд, Апіїі- зо Сбра2г8 Апіїроду Зирегадопівів. У. Ехр. Мей. 2003: 955-966; 5іербіпов, В., єї а!., "СуюкКіпе біопт" іп
Ше РнНавзе І Тта! ої Мопосіопа! Апіроду ТаМ1412: Вецег Опаегтеіапаіпуд Ше Сайзев о Ітргоме
Ргесіїпіса! Тевіїпуд ої ІттипоїНпегареціїсв у. Іттипої!., 2007, 179: 3325-3331; Нодег5 РА апа Стой
М, С0р28, Ох-40, І ЕА-1, апа СОр4 Модиїайоп ої ТА1/Тн2 Оінегепііайоп Із Рігеспу Оерепаепі оп їйе робе ої Апіїдеп. У Іттипої 2000 164:2955-2963; доїі:10,4049/іттипої!.164,6,2955)|. Для Н2І 5 пІдДС4РЕ також показана схожа гіперболічна крива функціональної відповіді. Ця інформація є важливим компонентом забезпечення найкращого діапазону доз антитіла, що підлягає використанню, для оптимальної фармакодинамічної відповіді.
Загалом, показано, що Н2І 5 пІдСА4РЕ, у поєднанні із стимуляцією СОЗ, підсилює активацію, проліферацію Т-клітин і індукцію прозапальних цитокінів разом з його роллю як сильного активатора костимулюючого рецептора Т-клітин.
Приклад 6: Зв'язування антитіл проти ІСО5
Способом гуманізації (приклад 3) отримали 36 варіантів важкого і легкого ланцюга, для яких провели скринінг за зв'язуванням з ІСО5 людини та яванського макака, в той же час переконувавшись також, що вони не зв'язуються з СО28 або СТІ А-4 людини. Варіант Н2І 5 ідентифікований як такий, що має високу афінність для ІСО5 людини та яванського макака (1,34 і 0,95 нМ, відповідно), у той же час містить мінімальну кількість зворотних мутацій.
Зміна ізотипу 422 Н2І 5 від ЇДО1 до ІдДС4РЕ не впливає на зв'язування антигена антитілом, оскільки Н2І 5 пІдДСАРЕ має афінність 1,3 нМ для ІСО5 людини. Залежне від концентрації інгібування зв'язування ІСОБ/СОЗ5-Ї. за допомогою НІ 5 пІдДСАРЕ показане на фігурі 7.
Експериментальні способи
Зв'язування НІ 5 пПІДСАРЕ з ІСО5 людини
Кінетику афінності зв'язування гуманізованого антитіла Н2ІГ5 пІдДСЯ4РЕ визначали з використанням ВіІАсоге Т200 з антитілом проти ІСО5 Н2І 5 пІдсС4РЕ, зв'язаним на поверхні з антитілом проти ДО людини в Ес2 чипа СМ5. Поверхня з антитілами проти ДО людини блокували з використанням 0,1 мг/мл контрольного під! для запобігання неспецифічного зв'язуванню Ес кролика. ІСО5 людини та яванського макака (Ес кролика) пропускали над зв'язаними антитілами при 256 нМ, 64 нМ, 16 нМ, 4 нМ ії 1 нМ. Буфер окремо використовували для кривих зв'язування з подвійним контролем. МоСі» використовували для регенерації поверхні. Аналіз проводили при 252С. Дані підганяли під модель у співвідношенні 1:1 з використанням програмного забезпечення 1200 для оцінювання. Концентрація антитіла: 2,5 мкг/мл
РЕЗУЛЬТАТИ
Зв'язування НІ 5 пІДСАРЕ з ІСО5 людини та яванського макака
Кінетику афінності зв'язування гуманізованого антитіла Н2І5 ПпіІдсС4РЕ визначали з використанням ВіАсоге Т200.
Дані зв'язування ІСО5 підганяли під модель кінетики 1:11 з використанням програмного забезпечення 1200 для аналізу даних.
Афінність зв'язування Н2І/5 пІдДСА4АРЕ для ІСО5 людини складає 1,34 нМ, і для ІСО5 яванського макака складає 0,95 нМ (див. таблицю 9). Ці значення є порівнянними і показують, як очікувалося, що зміна в ділянці Ес молекули не впливає на зв'язуання з антигеном ІСО5.
У таблиці 9 показані Ка/ка/ко для зв'язування гуманізованого 422 (Н2І 5) ІдДС4РЕ з ІСО5 людини та яванського макака.
Таблиця 9
Зв'язування з ІСО5 людини макака -Ес
ОБГОВОРЕННЯ
Як показано в прикладі 1, мишачий клон 422-2 ідентифікували як найкраще мишаче антитіло проти ІСО5 людини. При гуманізації цього антитіла отримали 36 варіантів важкого і легкого ланцюга, для яких провели скринінг за зв'язуванням з ІЇСО5 людини та яванського макака, в той же час переконувавшись також, що вони не зв'язуються з СО28 або СТІ А-4 людини. Варіант
Н2гІ 5 ідентифікований як такий, що має високу афінність для ІСОЄ людини та яванського макака (1,34 і 0,95 нМ, відповідно), в той же час містить мінімальну кількість зворотних мутацій.
Зміна ізотипу від 321 до І(ДСАРЕ не впливає на зв'язування антитіла з ІСО5.
Приклад 7: Зв'язування Н2І 5 пІдДСАРЕ з активованими Т-клітинами людини
СПОСОБИ
Експериментальний препарати)
Виділення з негативним відбором за СОЗ3:
СОЗ--Т-клітини виділяли з негативним відбором за допомогою набору для збагачення Т- клітин людини біетсеї! Козеце бер
Збагачення Т-клітин людини за допомогою Козейе Бер: 100 мл свіжої, цілісної крові відбирали з використанням шприців, покритих рідким гепарином натрію (Задепі, кінцева концентрація 10 МЕ/мл). Кров з кожної пробірки для збору переносили в пробірку, куди 50 мкл суміші для збагачення Т-клітин людини Козене бер додавали на мл крові. (5 мл/100 мл крові донорів). Цілісну кров/суміш антитіл Козхеце бер інкубували протягом 20 хвилин при кімнатній температурі (КТ). Потім кров/суміш антитіл Козейе Бер розчиняли у співвідношенні 1:1 їх фосфатно-сольовим буфером (РВ5)н2 95 ЕВ5(ембріональна бичача сироватка) до кінцевого об'єму 200 мл. Потім 25 мл розчиненої крові/суміші антитіл напластовували поверх 15 мл градієнта фіколу в пробірках бертайе (всього 8 пробірок для кожного донора). Потім завантажені пробірки Зертаїе центрифугували при 1200 х д протягом 20 хвилин при КТ з включеним гальмом. Верхній шар плазми нижче за межу розділу з мононуклеарними клітинами периферичної крові (РВМСОС) відбирали за допомогою піпетки і відкидали. Плазму, що залишилася, і межу розділу з лейкоцитарною плівкою декантували з пробірок Зертаїе в 50 мл конічні пробірки для центрифугування (всього 4 пробірки). Пробірки доповнювали до 50 мл з використанням РВ52 95 ЕВ5. Клітини центрифугували при 400 х уд протягом 10 хвилин при КТ.
Супернатанти відкидали. Потім осади для кожного донора об'єднували в одну 50 мл конічну пробірку, ресуспендували осади в сумарному об'ємі 50 мл РВ5З5ж-295 ЕВ5. Клітини центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин при КТ. Супернатанти відкидали та осади клітин ресуспендували в 2 мл повного середовища КРМІ (КРМІ 1640-1095 ЕС5-1 мМ піруват натріют2 мМ -глутаміннпеніцилін 100 Од./млестрептоміцин 100 мкг/мл). Виділені клітини СОЗ підраховували в пристрої МіСеїІ і додатково розчиняли до 1,2х106 клітин/мл. 1х106 виділених клітин забарвлювали за СОЗ РЕ-Су7 для підтвердження якості виділення Т-клітин.
СОЗ--Т-клітини виділяли з негативним відбором за допомогою набору для виділення інтактних Т-клітин від Іпмітодеп
Виділення РВМС: Коротко, 100 мл свіжої, цілісної крові відбирали від кожного донора з використанням шприців, покритих рідким гепарином натрію (Задепі, кінцева концентрація 10
МЕ/мл). Кров розчиняли у співвідношенні (1:1) до кінцевого об'єму 200 мл з використанням РВ5 з 29685. Двадцять п'ять (25) мл розчиненої крові напластовували поверх 15 мл градієнта фіколу в пробірках Зертаге (всього 8 пробірок для кожного донора). Потім завантажені пробірки
Зертаїеє центрифугували при 1200 х д протягом 20 хвилин при КТ з включеним гальмом.
Верхній шар плазми нижче за межу розділу з РВМС відбирали за допомогою піпетки та відкидали. Плазму, що залишилася, і межу розділу з лейкоцитарною плівкою декантували з пробірок Зертаїе в 50 мл конічні пробірки для центрифугування (всього 4 пробірки). Пробірки доповнювали до 50 мл з використанням РВ5-2 956 ЕВ5. Клітини центрифугували при 400 х д протягом 10 хвилин при КТ. Супернатанти відкидали. Потім осади для кожного донора об'єднували в одну 50 мл конічну пробірку і ресуспендували осади в сумарному об'ємі 50 мл
РВ5--2 95 ЕВ5. Клітини центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин при КТ. Супернатанти відкидали та осади клітин ресуспендували в довільному об'ємі буфера для виділення (залежно від розміру осаду клітин), представленого в наборі для виділення інтактних Т-клітин від
Іпмігодеп. Потім виділені РВМС підраховували в пристрої МіСеїЇ і доводили до кінцевої концентрації 1 х108 клітин/мл у буфері для виділення.
Виділення інтактних Т-клітин людини на бупабеай від Іпмігодеп: 2х108 виділених РВМС (2 мл), 400 мкл ЕВЗ5З ії потім 400 мкл суміші антитіл з набору для виділення інтактних Т-клітин від
Іпмігодеп додавали в кожну 15 мл пробірку та інкубували протягом 20 хвилин при 42С. Клітини промивали з використанням 10 мл буфера для виділення і центрифугували при 350 х д протягом 8 хвилин при 42С. Супернатанти відкидали та осади ресуспендували в 2 мл буфера для виділення. Потім 2 мл попередньо промитих бупареадеь для виснаження додавали в кожну пробірку. Клітини інкубували з бусинами протягом 15 хвилин при кімнатній температурі з обережним похитуванням і обертанням. Після інкубації бусин додавали 10 мл буфера для виділення, і суспензії клітин/бусин піпетували вгору і вниз 10 разів. Пробірки поміщали на магніт на 2 хвилини при кімнатній температурі. Не зачіпаючи намагнічені бусини, супернатанти, що
Зо містять інтактні Т-клітини збирали. Бусини промивали 1 раз з використанням 10 мл буфера для виділення і знову поміщали на магніт на 2 хвилини при кімнатній температурі, ії очищений від бусин буфер збирали. Зібрані клітини центрифугували при 400 х д протягом 5 хвилин при КТ.
Супернатанти відкидали та осади клітин ресуспендували в довільному об'ємі повного середовища КРМІ, залежно від розміру осаду клітин (2-35 мл). Потім виділені клітини СОЮЗ підраховували в МіСеїЇ і доводили до концентрації 1,2х106 клітин/мл у повному середовищі
ВРМІ.
Підтверджувальне забарвлювання СО3: їх106 виділених клітин забарвлювали з використанням 5 мкл антитіл проти СОЗ з РЕ-Су7 або 5 мкл антитіл проти ізотипу ЇдДО1 з Ре-Су7 протягом 40 хвилин при 42С в темноті. Потім клітини промивали двічі крижаним РВ5З з 0,1 Фо
Туєеп 20, центрифугуючи при 400 х д протягом 5 хвилин при 42С. Забарвлені клітини ресуспендували в 1 95 формальдегіді та інкубували при 42С протягом 20 хвилин у темноті. Потім клітини промивали двічі крижаним РВЗ з 0,1 95 Тмееп 20, центрифугуючи при 400 х д протягом 5 хвилин при 42С, і ресуспендували в 275 мкл РВЗ з 0,1 95 Ту'ееп 20. Фіксовані клітини зберігали при 42С в темноті до проведення Проточної цитометрії для підтвердження якості виділення Т- клітин.
Активація виділених Т-клітин людини:
Флакони 175 покривали з використанням 4 мл 1 мкг/мл СОЗ3З/С028 у РВЗ протягом 2 годин при 372С. Флакони промивали двічі з використанням 12 мл РВ5. З0х105 клітин в 25 мл повного середовища КРМІ додавали на флакон 175. Клітини інкубували протягом 48 годин при 3726,
БО 5 95 СО», аби забезпечити виникнення активації.
Зв'язування антитіла проти ІСО5 (НІ 5 пІдСАРЕ):
Зв'язування Н2І 5 пІдсС4РЕ оцінювали як для наївних, так і для активованих СОЗ «Т-клітин.
Використовували 8-точкове титрування від 0,00128 до 100 мкг/мл Н2І 5 пІдсС4РЕ з 5-кратними розчиненнями.
Наївні та/"або активовані СОЗ-Т-клітини ресуспендували в РВ5 з 0,1 95 ВБ5А (буфер для
ЕАС5), що містить блокуючий розчин для ЕСЕ людини при 2х105 клітин/мл (5 мкл блокуючого розчину для ЕсЕ950 мкл буфера для ЕАС5 на 1 мл). У концентрації 2х109 клітин/лунку, 100 мкл клітин висівали в 2 мл 96-лункові блоки для аналізу та інкубували при кімнатній температурі протягом 15 хвилин. Під час інкубації, раститровку зв'язуючих антитіл, антитіла проти ІЇСО5
(Н2І 5 пІдсС4РЕ) або контрольного антитіла для ізотипу Ідс4, підготовлювали в 2х концентрації.
Після інкубації з блокуючим розчином для ЕсСК, 100 мкл на лунку 2х концентрованих зв'язуючих антитіл додавали до 100 мкл Т-клітин з блокованим Ес на лунку для досягнення кінцевої 1х концентрації антитіла проти ІСО5 (Н2І 5 підс4РЕ) або контрольного антитіла для ізотипу Ідс4 від 0,00128 до 100 мкг/мл. Клітини інкубували з антитілами протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Після інкубації для зв'язування клітини промивали двічі в Т мл буфер для ГАС5, центрифугуючи при 400 х д протягом 5 хвилин при кімнатній температурі.
Забарвлювання наївних або активованих Т-клітин після зв'язування антитіла проти ІСО5 (Н2І 5 пІдСа РЕ):
Клітини забарвлювали для проточної цитометрії з використанням наступних сумішей:
Суміш для забарвлювання: (мкл) (мкл)
Суміш для ізотипів: нтитіло (мкл) (мкл)
Наївні або активовані Т-клітини з блокованим Ес ресуспендували в 80 мкл буфера для ЕАС5 після інкубації для зв'язування з антитілами Н2І 5 пІдСАРЕ або контрольними антитілами. У лунку додавали 20 мкл на лунку або суміші для забарвлювання, або суміші для ізотипів. Клітини забарвлювали протягом 20 хвилин при кімнатній температурі в темноті. Після інкубації для забарвлювання клітини промивали двічі в 1 мл буфера для РАС5, центрифугуючи при 400 х д протягом 5 хвилин при кімнатній температурі.
Фіксація забарвлених клітин:
Клітини ресуспендували в 500 мкл 195 формальдегіду (10 мл 16бх концентрованого формальдегідун150 мл ої їх РВ5) та інкубували при кімнатній температурі протягом 20 хвилин.
Потім клітини промивали двічі з використанням 1 мл буфера для РАС5, центрифугуючи при 400 х д протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Потім осади ресуспендували в 265 мкл буфера для ГАС5 і переносили в 96-лунковий круглодонний планшет. Клітини зберігали при 420 в темноті до аналізу за допомогою проточної цитометрії.
Зо Проточна цитометрія:
Проточну цитометрію проводили або в ЕБАС5 Ропезза Х20, або в РАС5 Сапіо І з використанням програмного забезпечення ЕАС5Оіма (версії 8.0). Компенсацію виконували під час збору даних з використанням бусин еВіозсіепсе ОйКгасотр з одним барвником і програмного забезпечення для компенсації в РАСЗОЇма.
Аналіз даних
Збір даних і компенсацію проводили в пристроях для ЕАС5 ВО, І 5К Еогіезза Х-20 або ЕАС5
Сапіо ІІ, з використанням програмного забезпечення ВО Оіма (вер. 8.0). Для аналізу даних використовували програмне забезпечення РБіІом/ що (вер. 10.0.811). Результати реєстрували як
МРЇ (медіанну інтенсивність флуоресценції) і відсоток клітин, позитивних за забарвленню РБІТС легкого ланцюга каппа дсС людини із загальної кількості життєздатних клітин або відповідної вихідної популяції. ЕС50 визначали з використанням програмного забезпечення сгарпраай Ргізєт 5 (віри. 5.04) з нелінійною регресією трансформованих даних (Х-(І0д(Х)) з використанням змінного нахилу кривої з 4 параметрами (Іод(агоніст) проти відповіді -- змінний нахил кривої).
РЕЗУЛЬТАТИ
Виділення Т-клітин із свіжої, цілісної крові людини, з використанням або набору для збагачення по СОЗ КозеЦе Зер, або наборів для виділення інтактних Т-клітин з Юупабеавй, підтверджували за допомогою забарвлювання з використанням антитіл проти СОЗ з РесСу?7.
Зразки донорів у діапазоні між 68 95 і 97 956 позитивних за СОЗ клітин. Для популяцій СО4-. і
Сов клітин, активованих антитілом проти СОЗ/ антитілом проти СО28, отримували криві залежності від концентрації Н2І 5 пІдДб4РЕ при оцінюванні забарвлювання антитілом проти легкого ланцюга каппа (91 людини з РІТС. Криві зв'язування Н2І 5 пІдСАРЕ представлені у формі відсотка клітин, позитивних за антитілах проти легкого ланцюга каппа ДС1 людини з
РІТС ї у формі медіанної інтенсивності флуоресценції (МЕ) РІТС. Для Т-клітин, інкубованих з контрольним антитілом для ізотипу Ід04, не отримано кривих залежності від концентрації при оцінюванні за забарвлюванням антитіл проти легкого ланцюга каппа (901 людини з РІТС. Для наївних СО4- або СОв8-- клітин не отримано повних кривих; проте, спостерігали залежне від концентрації збільшення від 0,1 мкг/мл до 100 мкг/мл.
Медіани (діапазони) значень ЕС5О складали 1,04 мкг/мл (0,628-1,31 мкг/мл) для СО4-РІТС
МЕ! ї 0,652 мкг/мл (0,27-0,74 мкг/мл) для СО8-РІТС МРЕЇї, відповідно. Медіани (діапазони) значень ЕС5О складали 0,834 мкг/мл (0,45-0,965 мкг/мл) для відсотка СО4-, позитивних за антитілами проти легкого ланцюга каппа дос з РІТС, ії 0,583 мкг/мл (0,371-1,23 мкг/мл) для відсотка СОв8, позитивних за антитілами проти легкого ланцюга каппа дос з РІТС. (Таблиця 10)
Таблиця 10
Узагальнення значень ЕС5О для зв'язування 422 Н2І 5 пІДСАРЕ з активованими Т-клітинами людини 7111111 Активованісб4 Тклітини.//// | // АктивованіСО8 Т-клітини.д/ відкл.
ОБГОВОРЕННЯ
У цьому дослідженні показано, що Н2гІ5 пІдС4РЕ (агоністичне антитіло проти ІСО5) зв'язувалося з рецептором ІСО5 на активованих Т-клітинах від здорових донорів-людей.
Зв'язування Н2І5 пПІдДСЯ4РЕ з клітинною поверхнею Т-клітин детектували з використанням антитіла проти легкого ланцюга каппа дос людини, міченого БІТ.
Успішне виділення СОЗ Т-клітин підтверджували за допомогою проточної цитометрії із забарвлюванням антитілом проти СОЗ з Ре-Су7. Для дев'яти з десяти донорів отримали більше 89 у6 СОЗ--Т-клітин після виділення. Проте, для донора 2 2100М39 отримано лише 68,6 95 СОЗ3-- після виділення. Причина цієї зниженої чистоти виділення Т-клітин для донора Ж 2100М39 невідома. Значення ЕС50, отримані для обмежених по СО4- і СО8-- популяцій від донора й 2100М39, не виглядають аномальними і включені в узагальнені медіанні значення.
ЕС5О для зв'язування визначали для НО 5 пІДСА РЕ на виділених з негативним відбором Т- клітинах людини. Криві зв'язування отримували, коли виділені Т-клітини активували за допомогою 48 годин дії зв'язаних з планшетом при 1 мкг/мл антитіл проти СОЗ3/С028. Як відсоток позитивних за забарвлюванням РІТС легкого ланцюга каппа Ідсї людини, так і дані МЕЇ
ЕІТС, для активованих СО4- і СО8--Т-клітин розглядали в статистичних аналізах. Медіанні значення ЕС5О для СО4-- були схожими при розрахунку у формі відсотка позитивних за РІТС клітин або МЕЇ РІТС, 1,04 і 0,834 мкг/мл, відповідно. Медіанні значення ЕС5О для СОвж також були схожими при розрахунку у формі відсотка позитивних за РІТС клітин або МРЇ РІТС, 0,652 і 0,583 мкг/мл, відповідно.
Для Т-клітин, інкубованих з контрольним антитілом для ізотипу ЇдС4 з РЕ не отримали залежного від концентрації збільшення зв'язування антитіл проти легкого ланцюга каппа до людини з РІТС, незалежно від застосованого способу аналізу, за МРЇ або відсотку позитивних клітин.
Повних кривих не удалося отримати для наївних або неактивованих, виділених з негативним відбором Т-клітин у тестованому діапазоні 0,00128-100 мкг/мл Н2гІ5 пПІдсС4РЕ.
Проте, залежне від концентрації збільшення зв'язування спостерігали у донорів для 0,1-100 мкг/мл Н2І5 пІдСА4РЕ. ЕС50 неможливо було розрахувати, оскільки криві для наївних Т-клітин були неповними. Нездатність Н2гІ 5 пІдсС4РЕ зв'язуватися в низьких концентраціях з наївними або неактивованими клітинами, була очікуваною, оскільки ІСО5 лише слабо експресується на непорушних ТП17 клітинах, фолікулярних Т-клітинах-помічниках (ТЕН) і регуляторних Т-клітинах (Трег). Залучення та активація ТОК необхідні для індукції експресії ІСО5. Таким чином, ймовірно, була присутня дуже невелика кількість рецептора ІСО5, експресованого на наївних або неактивованих клітинах, і отже, мінімальне зв'язування Н2І 5 пІдДСАРЕ.
Приклад 8: Результати ТК/РО з дослідження по підбору діапазону доз (ОКЕ) у яванського макака
Для оцінювання характеристик іп мімо Н2І5 пПІдСЯ4РЕ у відповідних по мішені видах, дослідження по підбору діапазону доз проводили на яванських макаках. У дослідженні тестували З рівні доз (0,3, З і 30 мг/кг) на додаток до контрольної когорти носія. Дозування було повторюваним, де другу дозу вводили через 14 діб після першої. Тестували одного самця й одну самку на когорту. Для Н2І 5 пІдДС4РЕ показане залежне від дози збільшення Смакс (мкг/мл) і
АЦиС (мкг.год./мл) для З різних тестованих доз. При всіх трьох рівнях доз, антитіло детектували в плазмі протягом двох тижнів після першої дози (фігура 12А). Антитіла проти Н2гІ 5 пІДСАРЕ детектували у З мавп після однократної дози, для обох тварин після дози 0,3 мг/кг, так само як для самки після дози З мг/кг. Антитіла проти Н2І/5 пІдДС4РЕ корелювали із зменшеними концентраціями в плазмі після введення другої дози цім тваринам (фігура 128). Через сорок вісім годин після другої дози всіх тварин умертвляли для збору тканин для аналізу фармакодинамічної активності і гістопатологічного аналізу.
Зайнятість рецептора Н2гІ 5 пІдДС4РЕ (КО) вимірювали на СО4--Т-клітинах із селезінки і пахвових лімфатичних вузлів всіх тварин у дослідженні. Залежне від дози збільшення зв'язування Н2І 5 пІдДСАРЕ спостерігали для тестованих рівнів доз в обох тканинах (фігура 13).
Зайнятість рецептора вимірювали також на СО4--Т-клітинах із периферичної крові мавп у дослідженні. Кров відбирали в 5 тимчасових точках (доба 1 (перед дозуванням), доба 3, доба 8, доба 15 (перед другим дозуванням) і доба 17). Два різних показника використовували в цьому аналізі для визначення КО. Перший являє собою формат аналізу "вільного рецептора", в якому
Зо зв'язування тАб проти ІСО5, використаного для детекції при проточній цитометрії, визначали в присутності або у відсутність Н2І 5 пІдДС4РЕ, як показано, що конкурує за зв'язування з ІСО5.
Таким чином, відсутність сигналу антитіл проти ІЇСО5 у ГАСЗ5 була сурогатною для зайнятості рецептора Н2І 5 пПІдО54РЕ, і навпаки, позитивність за антитілами проти ІСО5 вказувала на "вільний рецептор", не зв'язаний з Н2І 5 пІдсС4 РЕ. На фігурі 14-А показане, що кількість вільного рецептора ІСО5 зменшувалася залежним від дози і залежним від часу чином. Для двох мавп (250 ї 300) показані сигнали "вільного рецептора", які неможливо пояснити, і які можуть бути обумовлені продукцією антитіл проти Н2І5 ПпПіІдС4РЕ у цих мавп. Крім того, КО також вимірювали в СО4-- клітинах периферичної крові за допомогою того ж самого аналізу, який використовували для селезінки і лімфатичних вузлів, описаного вище. Як можна було очікувати, для дози 0 мг/кг не показане КО при цьому зчитуванні (фігура 14-В). Цікаво, що для деяких мавп при рівнях доз 3,0 і 30 мг/кг показане залежне від часу збільшення кількості СО4- клітин із зв'язаним Н2І 5 пІдс4РЕ впродовж періоду часу обробки. Зокрема, для тварини 350 показане збільшення (у »5 разів) зв'язаних з лікарським засобом циркулюючих СО4-- клітин між добами З і 17 (фігура 14-В). Можливо, що це збільшення кількості СО4-4ІСбО5- клітин може бути обумовлене індукованою Н2І 5 пІдс4РЕ проліферацією цієї популяції.
Приклад 9: Н2І 5 пІдСА4 РЕ індукує зміну внутрішньоклітинної передачі сигналів у відповідь на зв'язування
Експериментальний препарат(и)
Лінії клітин
Клітини Ва/Р3-ІСО5 отримували з ІМ5ЕКМ (Рагіз, Егапсе). Клітини культивували у відповідному культуральному середовищі, доповненому 1095 ембріональною бичачою сироваткою (ЕВ5) (Зідта-Аїагіси, Зі. І оці5, МО), 10 нг/мл рекомбінантним мишачим ІІ -3 (820 зузіет5, Міппеароїїх, ММ) ії 1 мг/мл генетицину (ТпептоРі5пег, Умайтат, МА) при 372С у зволожених інкубаторах під 5 95 СО».
Експериментальний спосібс(и)
Масив антитіл для внутрішньоклітинної передачі сигналів
Білкові лізати аналізували з використанням набору з масивом для внутрішньоклітинної передачі сигналів Раїй5бсап" (Сеї! Зідпаїїпд Тесппоіодієвз), відповідно до інструкцій виробника.
Коротко, лізати клітин Ва/Е3-ІСО5, оброблені Ід(4-РЕ (20 мкг/мл) або Н2І 5 пІдС4РЕ (0,2, 2, або бо 20 мкг/мл) протягом 1, 6, 24, і 48 годин, розчиняли до 1 мкг/мкл у буфері-розчиннику для масиву та інкубували протягом ночі на масивах антитіл при 42С. Зображення масивів отримували з використанням програмного забезпечення для отримання зображень (ГІ-СОВ Віозсієпсев,
Шисо!п, МЕ).
Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА) фосфо-АКТ
Фосфорилування АКТ вимірювали з використанням Мезо 5саїе Різсомегу (М5БО) з набором для аналізу фосфо(5ег473) /загального АКІ у лізаті цілісних клітин і набором для аналізу фосфо-
АКІ (ТПгЗ08) у лізаті цілісних клітин, відповідно до інструкцій виготовлювача. Клітини висівали при щільності клітин 0,25х105 клітин/лунку в 96-лункові планшети з О-подібним дном (ВО Раїсоп) у придатному культуральному середовищі (100 мкл/лунку). Клітини обробляли протягом 1, 2, 4, 6, 24 або 48 годин контрольним антитілом (Ід0с4 РЕ), ЇдО1 проти ІСО5 з інактивованим Ес або
Н2І 5 пІ9С4РЕ в 7 різних концентраціях з використанням схеми З-кратного розчинення (діапазон доз: 20,0-0,03 мкг/мл) у двох повторах лунок. Для одного експерименту з використанням набору для аналізу фосфо-АКТ (ТПг308) у лізаті цілісних клітин, клітини обробляли однією концентрацією всіх трьох антитіл (10 мкг/мл) у трьох повторах лунок. Нижній ряд кожного 96- лункового планшета містили контроль без клітин (дві порожні лунки в двох повторах) і клітини, залишені без обробки будь-яким антитілом. Після обробки клітини лізували з використанням 30 мкл крижаного буфера для лізису, що містить інгібітори протеази і фосфатази, інкубували на льоду протягом 30 хвилин, і потім 25 мкл лізату переносили в планшет для ЕГГ І5А для інкубації протягом ночі при 420.
Аналіз даних
Денситометричний аналіз масиву антитіл для внутрішньоклітинної передачі сигналів
Денситометричний аналіз проводили для розрахунку рівнів інтегральної інтенсивності плям у масиві антитіл. Інтенсивність для кожної плями нормалізували по середньому для позитивного контролю в масиві (формула-лунка із зразком/середнє для позитивного контролю) і наносили на графік з використанням ОсгарпРаай Ргізт 6.0 (Іа доПа, СА).
Аналіз даних М5О ЕГІЗА
Відсоток фосфобілка розраховували для кожної лунки з використанням наступного розрахунку: 95 фосфобілка-((2 х сигнал фосфобілка)/сигнал фосфобілкажсигнал загального білка)) х 100. Потім це значення нормалізували за значенням для необроблених клітин у кожній
Зо тимчасовій точці і наносили на графік як «95 від контролю" в Місго5зой Ехсеї! 2007.
РЕЗУЛЬТАТИ
Попередні дослідження показали, що обробка Н2І 5 пІдсС4РЕ збільшувала рівні фосфо-АКТ (5473) у клітинах Ва/Е3-ІСО5, де максимальну відповідь спостерігали через 30-40 хвилин після дії антитіла. У даному дослідженні рівні фосфо-АКТ вимірювали в пізніших тимчасових точках, аби спостерігати, чи зберігаються збільшені рівні фосфорилування через декілька діб. Крім того, оцінювали регуляцію інших подій внутрішньоклітинної передачі сигналів за допомогою активації ІСО5. У клітинах Ва/Е3-ІСО5, рівні фосфо-АКТ (5473) збільшувалися при обробці
Н2гІ 5 НІССАРЕ в порівнянні з клітинами, обробленими контрольним антитілом для ізотипу Ідсе4-
РЕ, після однієї і шести годин обробки, але цей ефект був втрачений через 24 години (фігура 15). Цікаво, що схожий ефект спостерігали, коли клітини обробляли антитілом проти ІСО5, коли ділянка Ес антитіла інактивована. Збільшені рівні фосфо-АКТ (7308) також спостерігали в клітинах, оброблених Н2І5 пІдС4РЕ і антитілом дС51 проти ІСО5 з інактивованим Ес, у порівнянні з клітинами, обробленими контрольним антитілом для ізотипу Ід(4-РЕ (фігура 15), після однієї години обробки, і він зберігався аж до 48 годин, що являють собою останню виміряну тимчасову точку. Кількість інших фосфобілків нижче АКТ, кінази 3 альфа глікогенсинтази (зЗ5КЗа) і рибосомального білка 56, також помірно збільшувалися при активації
ІСО5, але ефекти не були настільки сильними, як спостережувані для фосфо-АКТ. Білкові лізати аналізували також з використанням масиву антитіл, що вимірюють фосфорилування або розщеплювання 18 білків, залучених у внутрішньоклітинну передачу сигналів. З використанням цього способу, лише для трьох білків показано невелике збільшення фосфорилування при активації ІСО5: фосфо-АКТ (5473), фосфо 56 (5235/236), і фосфо-БАРК/ІМК (Т183/У185).
Для виміру змін фосфорилування АКТ з використанням формату аналізу, що дозволяє пряме кількісне визначення, клітини Ва/Р3-ІСО5 обробляли з використанням діапазону доз контрольного антитіла (9054 РЕ), антитіла ЇДс1 проти ІЇСО5 з інактивованим Ес або Н2І5 пПІДС4РЕ з часом і моніторували за допомогою ЕГГ ІЗА. Збільшені рівні фосфо-АКТ (5473) були як залежними від дози, так і залежними від часу, в клітинах, оброблених антитілом Ідс1 проти
ІСО5 з інактивованим Ес, або оброблених Н2І 5 пІдсС4РЕ. Як описано раніше, максимальна активація фосфо-АКТ (5473) відбувалася після 1 години обробки. Сигнал фосфорилування трохи зменшувався через 2 години і зберігався аж до б годин, проте, кінець кінцем, був бо утрачений через 24 годин. Проводили також тести ЕГІ5А, що вимірює рівні фосфо-АКТ (Т308), бо проте, неможливо було спостерігати відтворюваної активації з використанням цього набору для
ЕПЗА.
ОБГОВОРЕННЯ
Каскад передачі сигналу АКТ можна активувати за допомогою рецепторів тирозинкіназ, інтегринів, В- і Т-клітинних рецепторів, рецепторів цитокінів, зв'язаних з -білком рецепторів та інших стимулів, що індукують продукцію фосфатидилінозитол(З3,4,5) трифосфатів (РІРЗ) за допомогою РІЗК ІСагпего, 2008). Ці ліпіди служили ділянками причалювання на плазматичній мембрані для АКі і його вищого активатора РОК1. На мембрані, РОКІ фосфорилює АКТ на
ТАг308, приводячи до часткової активації АКІ ГАІезві, 1996). Фосфорилування АКІ на 5ег473 за допомогою ттТоОкКсСа2 стимулює повну ферментативну активність І(Заграззом, 20051.
ІСО5 грає ключову роль у функціонуванні активованих ефекторних і регуляторних Т-клітин бра за допомогою стимуляції виживаності, проліферації і пам'яті Т-клітин. Завдяки його ролі в тривалій активації і ефекторних функціях Т-клітин, націлювання на ІСО5 з використанням агоністичного антитіла може бути здійсненим способом посилення протипухлинного імунітету. В цьому дослідженні автори даного винаходу спостерігали, що активація ІСО5 за допомогою
Н2гІ 5 пІДа4РЕ викликала зміни фосфорилування АКТ у клітинах Ва/Е3-ІСО5. Отже, білки нижче
АКТ, такі як С5КЗа (безпосередній субстрат АКТ) і рибосмальний білок 56 також були фосфорильованими. Ці дані узгоджуються з дослідженням, проведеним нещодавно в цій модельній системі, і разом з даними, опублікованими для зовнішнього використання (Роз, 20081.
Приклад 10: Функціональні ефекти розчинного Н2І/5 підсС4РЕ окремо і в комбінації з антитілом проти РОТ і антитілом проти СТІ А-4 в аналізі РВМС людини
Експериментальний препарат(и)
Виділення первинних РВМС людини
Свіжу кров отримували від донорів крові З5К Неакй Сепіег і розчиняли у співвідношенні 1:1 середовищем КРМІ1640, що не містить фенолу червоного 10 95. Розчинену кров розміщували на середовищі з градієнтом щільності в 50 мл конічній пробірці Опі-Зер Мах і центрифугували при 400 х д протягом 20 хвилин при кімнатній температурі з відключеним гальмом. Отриманий шар білих мононуклеарних клітин (лейкоцитарну плівку) обережно переносили в нову 50 мл конічну пробірку через клітинне сито 100 мкм. Рівний об'єм середовища КРМІ1640, що не
Зо містить фенолу червоного 10 95, додавали до лейкоцитарної плівки і центрифугували при 300 х д протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Осад клітин ресуспендували в 10 мл розчину для лізису еритроцитів (Зідта АЇйгісй) та інкубували протягом 5 хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали один раз середовищем і центрифугували, як описано раніше.
Об'єм доводили до 40 мл з використанням середовища КРМІ1640, що не містить фенолу червоного 10 95, і клітини підраховували з використанням лічильника клітин і аналізатора життєздатності місеї! (Весктап СоиМег).
Індукція незрілих дендритних клітин моноцитарного походження (10С)
Моноцити людини виділяли з використанням способу адгезії до пластика. Коротко, 20 мільйонів свіжовиділених РВМСОС культивували у флаконі Т-75 для культивування клітин у середовищі АІЇМ-М (Тпегто Різпег) протягом З годин. Клітини, які не зв'язуються з пластиком, відмивали. Адгерентні моноцити культивували при 372С в інкубаторі з 5 95 СО» у середовищі
АІЇМ-М, доповненому 1000 од./мл ЗМ-С5Е людини (кат.й300-03, РергоТесіп) і 500 од./мл 1-4 людини (кат.й200-04). Через 7-10 діб, клітини ОС збирали для спільного культивування з Т- клітинами від іншого донора в аналізі реакцій в алогенній змішаній культурі лімфоцитів.
Виділення первинних Т-клітин людини безпосередньо з крові
Т-клітини людини виділяли безпосередньо зі свіжої крові людини з використанням суміші для збагачення Т-клітин людини (біет СеїЇ Тесппоіодієвє). Суміш для збагачення Т-клітин людини Козейебер (50 мкл/мл) додавали до цілісної крові і добре перемішували. Після 20 хвилин інкубації при кімнатній температурі, рівний об'єм РВ5О--2 95 ЕВ5 додавали з обережним перемішуванням. Розчинений зразок напластовували поверх середовища з градієнтом щільності і центрифугували протягом 20 хвилин при 1200 х 9 при кімнатній температурі з відключеним гальмом. Збагачені клітини з межі розділу середовища з градієнтом щільності: плазму обережно переливали в нову конічну пробірку. Потім еритроцити лізували з використанням буфера для лізису еритроцитів (бідта Апагісн), і збагачені клітини промивали з використанням РВ5--2 95 ЕВ5 двічі. Потім Т-клітини ресуспендували в 40 мл РВО--2 95 ЕВ: і підраховували в лічильнику клітин Мі-СеїЇ.
Експериментальні способи
Аналіз попередньої стимуляції РВМС людини
Свіжовиділені РВМС людини піддавали попередній стимуляції з використанням Т-клітин 60 рупаВеаада5 СОЗ3З/С028, що збільшують об'єм, у співвідношенні бусин до клітин 1:20 у флаконі Т-
75 для культивування клітин у середовищі АІМ-М, доповненому 100 нг/мл ої МО5Е і 100 МЕ/мл
І/-2 (РергоТесі) при 372С. Через 48 годин бусини для попередньої стимуляції видаляли за допомогою магнітного поля, і клітини промивали, підраховували і повторно стимулювали з використанням ЮупаВеай5 проти СОЗ і терапевтичних антитіл у середовищі АЇїЇМ-У, доповненому 100 МЕ/мл 1ІС-2 (РергоТесп) в 9б-лунковому круглодонному планшеті, не обробленому для культивування клітин. Щільність розсівання складала 100000 клітин на 100 мкл середовища на лунку. Після інкубації при 372С протягом 3,5 діб, супернатанти культур клітин збирали для мультиплексного виміру цитокінів за допомогою М5О.
Аналіз активації МІК людини
ОС моноцитарного походження від здорової добровольця-людини змішували у співвідношенні 1:10 (0С: Т) із свіжовиділеними Т-клітинами людини від іншого донора і заздалегідь інкубували при 372 у середовищі АІМ-М у присутності 0,02 мкг/мл суміші пептидів
СЕРЕТ протягом 24 годин. Різні групи антитіл для обробки додавали безпосередньо в лунки, перемішували і далі інкубували протягом додаткових 4 діб. Супернатанти культур клітин збирали для мультиплексного виміру цитокінів за допомогою аналізу М5О.
Аналіз цитокінів МО
Рівні цитокінів ІЕМ-у, 1-10, 1/-2 ї ТМЕ-й4 у супернатанті культур клітин визначали з використанням сконструйованих на замовлення наборів для МБО М-Ріех людини. Зразки спочатку розчиняли у співвідношенні 1:200 в розчиннику 2. Калібратори також підготовлювали в розчиннику 2, слідуючи рекомендаціям виробника. Розчинені зразки і калібратори додавали в чорні планшети М50О, які потім герметично закривали з використанням адгезивної плівки для планшетів та інкубували при кімнатній температурі із струшуванням протягом 2 годин. Після додавання 25 мкл розчину антитіла для детекції, свіжоприготованого в розчиннику 2, в кожну лунку, планшет повторно закривали та інкубували при кімнатній температурі із струшуванням протягом інших 2 годин. Планшети промивали З рази з використанням 150 мкл/лунку РВ5 плюс 0,05 95 Тжшееп-20 перед додаванням 150 мкл/лунку свіжорозчиненого 2х буфера для зчитування і негайно зчитували в зчитувачі МЕБО ОпіскРіех. Дані аналізували з використанням програмного забезпечення М5О Умогкрепсі.
Аналіз даних
Аналіз даних М5ЮО
Дані М5О аналізували з використанням програмного забезпечення Оібсомегу ММогкрепсі (М50, версії 4.0.9). Калібратори з набору виробника включали в кожен планшет для М5О для отримання специфічних для планшетів стандартних кривих із значенням К2 більше 0,99 у всіх випадках. Кількість детектованих цитокінів визначали за допомогою зворотних обчислень на підставі стандартної кривої, і середнє і стандартне відхилення для трьох біологічних повторів використовували для отримання графіків.
Статистичний аналіз
Однофакторний АМОМА проводили для логарифмічно перетворених даних зміни кратності в порівнянні з власним контролем ізотипу для кожного антитіла для обробки. Тест множинного порівняння Даннетта проводили для порівняння обох видів монотерапії у порівнянні з комбінацією для різних донорів. Р«0,05 вважали статистично значимим.
РЕЗУЛЬТАТИ
Розробка аналізу попередньої стимуляції РВМСОС і тесту комбінованої активності Н2І5 пПІЗДСАРЕ з іпілімумабом і пембролізумабом.
Для визначення оптимальних умов для попередньої стимуляції, Оупареад5 проти СОЗ людини і ЮОупабреад5 проти СО3/СО028 людини (Тпепто Різпег) тестували при різному співвідношенні бусин до клітин. Після 48 годин попередньої стимуляції клітини збирали, і бусини видаляли за допомогою магнітного поля перед стимуляцією з використанням Оупабреад»5 проти
СОЗ3 (співвідношення бусин до клітин-1:1) разом з антитіллом проти ЇСО5 окремо або в комбінації з антитілом проти СТІ А-4 або антитіла проти РОЇ. Монотерапія Н2І 5 пІДСАРЕ приводила до індукції ІЕМ-у у порівнянні з контролем для ізотипу у всіх тестованих умовах попередньої стимуляції. Діапазон рівня ІЄМ-у, індукований за допомогою Н2І 5 пІДСАРЕ, назад корелював із силою попередньої стимуляції. Для комбінації Н2І 5 пІдс4РЕ разом з іпілімумабом показана збільшена продукція цитокінів у порівнянні або з Н2І 5 НІОС4РЕ, або з іпілімумабом окремо, в РВМС, які слабо піддавалися попередній стимуляції. Комбінований ефект був втрачений в умовах попередньої стимуляції зв'язаними з планшетом антитілами проти
СОЗ/антитілами проти СО28, що розглядали як сильніші умови попередньої стимуляції. На підставі цих результатів, умови попередньої стимуляції з використанням бусин з антитілами проти СОЗ3/ антитілами проти СО28 у співвідношенні бусин до клітин 1:20 вибрані для всіх бо майбутніх аналізів РВМСОС. Результати для чотирьох індивідуальних донорів узагальнені для комбінації антитіл проти СТІ А-4 на фігурі 16 і для комбінації з антитілом проти РО-1 на фігурі
Н2гІ5 пІдДааА4РЕ приводить до залежної від дози індукції цитокінів в аналізі попередньої стимуляції РВМСО
Залежну від дози активність Н2І5 пІДС4РЕ оцінювали в РВМС людини, підданих попередній стимуляції з використанням бусин з антитілами проти СОЗ/ антитілами проти С0О28 у зумовленому співвідношенні бусин до клітин 1:20. Антитіло проти КМ ІдС4РЕ і Ідс1 422.2 проти ІСО5 з інактивованим Ес включали як контроль. Тестували вісім концентрацій На2Іі5
НІССАРЕ (100, 30, 10, 3,1, 0,3, 0,1 ї 0,03 мкг/мл). ІЄМ-у, 1-10 ї ТМЕ-сх оцінювали за допомогою
М50О у культуральних супернатантів зразків РВМСО. Н2/І 5 пІдС4РЕ, але не контроль для ізотипу
Іц9о4 або 422.2 з інактивованим Ес, індукувало продукцію ІЕМ-у, І--10 ї ТМЕ-оа залежним від дози чином. Ці результати використовували для визначення концентрації Н2І/5 пІдДСЯ4РЕ для використання в комбінаційних дослідженнях.
Розробка аналізу МІК людини
У спробі оптимізувати аналіз МІ К людини, на додаток до спільного культивування Т-клітин людини і незрілих ОС моноцитарного походження від іншого донора, бусини з антитілами проти
СОЗ також додавали в лунки для забезпечення фонової стимуляції ТСЕК, аби сприяти примуванню клітин. Результати показали, що бусини з антитілами проти СОЗ3З сильно збільшували діапазон індукції ІЕМ-у. Хоча іпілімумаб окремо може індукувати продукцію ІЕМ-у у відсутність бусин з антитілами проти СОЗ, для Н2І 5 пІдДС4РЕ окремо або для комбінації Н2І 5
НІСО4РЕ/Ппілімумабу показана збільшена продукція ІЄМ-у у порівнянні з відповідним контролем лише у присутності бусин з антитілами проти СОЗ3.
Комбінована активність Н2І 5 НІССАРЕ та іпілімумабу в аналізі МІК людини
Імуностимулюючу активність Н2І5 пІдсС4РЕ окремо або в комбінації з іпілімумабом тестували в алогенному аналізі МЕ людини, в якому Т-клітини заздалегідь інкубували з незрілими ОС моноцитарного походження від неспівпадаючого донора у присутності 0,02 мкг/мл пептидів СЕЕТ протягом 1 доби. Комбінація Н2І 5 пІдс4РЕ/ іпілімумабу приводила до значимого збільшення продукції ІЕМ-у у порівнянні з будь-яким із засобів окремо. Результати узгоджувалися серед трьох тестованих пар донорів; проте, спостерігали помірну мінливість між
Зо донорами (фігура 18).
Комбінована активність Н2І 5 пІдДСА4РЕ і пембролізумабу в аналізі МІ
Комбінацію Н2І 5 пІдДС4РЕ і пембролізумабу тестували також в алогенному аналізі МІ Кк людини, описаному вище. Н2І 5 під с4РЕ тестували окремо і в комбінації з пембролізумабом при 10 мкг/мл. Комбінація Н2І 5 під С4РЕ і пембролізумабу приводила до збільшення продукції
ІЕМ-у у порівнянні з будь-яким із засобів окремо. Проте, статистичної значущості не досягали через мінливість між донорами і значну активність монотерапії антитілом проти РО-1 у деяких донорів (фігура 19).
ОБГОВОРЕННЯ
ІСО5 являє собою костимулюючий рецептор, який слабо експресується на наївних Т- клітинах і швидко піддається підвищувальній регуляції в активованих СО4- і СО8--Т-клітинах.
Лігандом для ІСО5 є ІСО5-Ї (В7п, В7ВР-1, СО0275), який експресується професійними АРС і периферичними епітеліальними та ендотеліальними клітинами після стимуляції ТМЕ-й. Шлях
ІСО5ЛІСО5-Ї надає ключовий костимулюючий сигнал для проліферації і функціонування Т- клітин. Завдяки його ролі в тривалій активації і ефекторних функціях Т-клітин, націлювання на
ІСО5 з використанням агоністичних антитіл може бути виправданим способом посилення протипухлинного імунітету.
Дослідження показали збільшення частоти ІСбОБес СЮр4- ефекторних Т-клітин після блокування СТІ А-4 за допомогою іпілімумабу в декількох моделях злоякісних пухлин. Крім того, після блокування СТІ А-4, ця популяція клітин продукувала вищі рівні ІМЕ-у, ніж ІСОВНз СО4--Т- клітини. Фактично, збільшення частоти ІбСОБ5А-СОЯ4. Т-клітин ідентифіковано /- як фармакодинамічний біомаркер для лікування іпілімумабом пацієнтів із злоякісними пухлинами.
Дослідження у мишей С57ВІ/6 дикого типу, показали 80-90 95 відторгнення пухлини після терапії з блокуванням СТІ А-4; проте, у мишей з нокаутом ЇСО5 або ІСО5І ефективність зменшувалася до менше 50 95. Важлива роль, яку ІСО5 грає в ефективності блокування СІ ТА- 4, дозволяє передбачати, що стимуляція шляху ІЇСО5 у ході терапії антитілом проти СТІ А-4 може збільшувати терапевтичну ефективність. Таким чином, автори даного винаходу розробили оцінку комбінованої активності Н2І 5 пІдС4РЕ та іпілімумабу.
У 2000 опубліковано, що білок-1 програмованої загибелі клітин (РО-1) є іншою молекулою імунної контрольної точки. Експресію РО-Ї1 (В7-НІ), який є одним з лігандів РО-1, можна 60 виявити на безлічі типів клітин, включаючи Т-клітини, епітеліальні клітини, ендотеліальні клітини і клітини пухлин. У безлічі типів пухлин показані також клінічні відповіді на антитіла, націлені проти осі РО-1/РО-11. У ЕБА недавно схвалені пембролізумаб і ніволумаб як друге покоління блокаторів імунних контрольних точок для лікування злоякісних пухлин. Показано, що пембролізумаб від МегсК приводить до частоти відповідей «37-38 95 у пацієнтів з меланомою на пізніх стадіях, де в подальшому дослідженні опублікована загальна частота відповідей 26 95 у пацієнтів, що мають прогресуюче захворювання після попередньої терапії іпілімумабом. Для
Ніволумабу, антитіла проти РО-1 від ВМ5, також показана клінічна перевага для пацієнтів з метастазуючою меланомою з частотою відповідей 4095 і частотою загальної виживаності 72,9 95 за 1 рік. Крім того, ніволумаб також схвалений ЕВА при недрібноклітинному раку легені, що знаходиться на пізніх стадіях або метастазує. Оскільки антитіла проти РО-1, що блокують контрольну точку, стають переважною імунотерапією злоякісних пухлин у клініці, може бути важливим оцінювання Н2І 5 пІдсС4РЕ в комбінації з антитілом проти РО-1 по їх комбінованій протипухлинній активності.
Раніше, аналіз активації РВМС розробили і використовували для оцінювання активності стимуляції Т-клітин для панелі агоністичних антитіл проти ІСО5. Дані, отримані в цих дослідженнях, підтримують відбір клону 422.2 як кандидата з ізотипом (9с4РЕ у формі Н2І 5 пІд9С4РЕ. У попередньому аналізі клітини РВМС піддавали попередній стимуляції з використанням зв'язаних із планшетом антитіл проти СОЗ при 1 мкг/мл і антитіл проти СО28 при
З мкг/мл протягом 48 годин перед тим, як їх збирали і повторно стимулювали з використанням антитіл проти СОЗ ії розчинних антитіл проти ІСО5, які досліджували. Показано, що Н2/5 пІдсСаРЕ індукувало продукцію ІЕМ-у залежним від дози чином. Для визначення оптимальних умов для попередньої стимуляції, бупабеад5 проти СОЗ людини і ОСупареаде5 проти СОЗ/С028 людини (Тпегто Ріхпег) тестували при різному співвідношенні бусин до клітин. Стимуляцію за допомогою бусин вважають більш фізіологічною, і силу стимуляції можна простіше контролювати за допомогою розробки різного співвідношення бусин до клітин. Після 48 годин попередньої стимуляції клітини збирали, і бусини видаляли за допомогою магнітного поля перед стимуляцією з використанням Юупареад5 проти СОЗ (співвідношення бусин до клітин-1:1) разом з антитілом проти ЇСО5 окремо або в комбінації з антитілом проти СТІ А-4.
Результати показали, що монотерапія Н2І 5 пІдДСАРЕ приводила до індукції ІЕМ-у у порівнянні з
Зо контролем для ізотипу у всіх тестованих умовах попередньої стимуляції. Діапазон рівня ІЕМ-у, індукований за допомогою Н2І 5 пІдС4РЕ, назад корелював із силою попередньої стимуляції.
Для комбінації Н2І 5 пІдДС4РЕ разом з іпілімумабом показана збільшена продукція цитокінів у порівнянні або з Н2І 5 пІдС4РЕ, або з іпілімумабом окремо, в РВМС, які слабо піддавалися попередній стимуляції. Комбінований ефект був утрачений в умовах попередньої стимуляції зв'язаними з планшетом антитілами проти СОЗ/антитілами проти СО28, що розглядали як сильніші умови попередньої стимуляції. На підставі цих результатів умови попередньої стимуляції з використанням бусин з антитілами проти СОЗ/ антитілами проти С0О28 у співвідношенні бусин до клітин 1:20 вибрані для всіх майбутніх аналізів РВМС. Для комбінації
Н2гІ 5 підсаРЕ та іпілімумабу показане статистично значиме збільшення продукції ІЕМ-у у порівнянні з обробкою будь-яким з антитіл окремо.
У спробі оптимізувати аналіз, із співвідношенням бусин до клітин при стимуляції антитілами проти СОЗ/ антитілами проти СО28, фіксованим на 1:20, кількість бусин з антитілами проти СОЗ, використовуваних на стадії повторної стимуляції, титрували із зниженням співвідношення бусин до клітин від 1:1 до 1:3 і 1:10. Результати показали, що зниження сили повторної стимуляції призводило до зниження індукції ІЕМ-у за допомогою Н2І 5 пІдс4РЕ. Комбінований ефект Н2І 5 пПІДСА4РЕ та іпілімумабу був повністю втрачений при повторній стимуляції із співвідношенням бусин до клітин 1:3 ії 1:10. Таким чином, для повторної стимуляції антитілами проти СОЗ співвідношення бусин до клітин 1:1 зберігали для майбутніх експериментів.
З оптимізованими умовами попередньої стимуляції і повторної стимуляції, цей аналіз використовували для оцінювання відповіді залежно від дози Н2І 5 пІдС4РЕ. Всього тестували 8 концентрацій антитіл, які складали 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 ї 0,03 мкг/мл. Антитіло проти КЗМ
ІЧО4РЕ і Ідс1 проти ІСО5 422.2 з інактивованим Ес, варіант Н2І 5 пІдДС4РЕ з інактивованим Ес, використовували як контроль. Результати показали, що Н2І 5 пПІдС4РЕ, але не контроль для ізотипу ІД04 або 422.2 з інактивованим Ес, індукувало продукцію ІЕМ-у, 1-10 ії ТМЕ-х4 залежним від дози чином. Цікаво, що для варіанту Н2І 5 під С4РЕ з інактивованим Ес показана обмежена відповідь індукції цитокінів, що вказує на те, що залучення рецептора Ес, є критичним для агоністичної функції Н2І 5 під С4РЕ по відношенню до Т-клітин. Ці результати використовували також для визначення дози Н2І 5 під С4РЕ для комбінованих досліджень.
Аналіз реакції змішаної культури лімфоцитів (МІК) також розробили для оцінювання бо комбінованого ефекту Н2І 5 пІд С4РЕ і блокуючих контрольну точку антитіл. Аналіз МІ К являє собою імунний аналіз клітин ех мімо, в якому первинні незрілі дендритні клітини (ІС) моноцитарного походження змішували з Т-клітинами, виділеними від іншого донора.
Неспівпадання молекул головного комплексу гістосумісності (МНС) на поверхні клітин ОС може ініціювати стимуляцію Т-клітин в алогенних умовах. У клініці, аналіз М КЕ добре відомий для ідентифікації сумісності трансплантатів тканин між донорами і реципієнтами.
Для розробки аналізу МІ Є свіжі моноцити людини культивували в середовищі, доповненому рекомбінантними ЗМ-С5Е і І/-4 людини протягом тижня для індукції фенотипу незрілих ОС.
Потім свіжі Т-клітини людини від іншого донора виділяли і змішували з клітинами С у співвідношенні 10:11 (ТС). Монотерапевтичну обробку або комбіновану обробку Н2І 5 ПпІд с4РЕ та іпілімумабом додавали до спільного культивування Т-клітин/ЮОС у присутності або у відсутність бусин з антитілами проти СОЗ3. Призначенням бусин з антитілами проти СОЗ було забезпечення фонового стимулу ТОК, аби сприяти примуванню Т-клітин. Результати показали, що бусини з антитілами проти СОЗ сильно збільшували діапазон індукції ІЕМ-у в аналізі. Хоча іпілімумаб окремо може індукувати продукцію ІЕМ-у у відсутність бусин з антитілами проти СОЗ, для Н2І 5 пІдС4РЕ окремо або для комбінації Н2І 5 пІдс4РЕ/іпілімумабу показане збільшення продукції ІРМ-у у порівнянні з відповідним контролем у присутності бусин з антитілами проти
СО3. Цей результат дозволяє передбачати, що в цьому аналізі стимуляція ТОК лише за допомогою клітин ЮС може бути недостатньою для індукції експресії ІСО5 на поверхні непорушних Т-клітин, свіжовиділених з РВМОС. Для поліпшення ситуації стадію 24-годинної попередньої інкубації з ОС і Т-клітинами додавали перед додаванням терапевтичних антитіл.
Суміш пептидів СЕЕТ також додавали до процедури аналізу для кращого примування Т-клітин і для стимуляції антигенспецифічної відповіді. Пул пептидів СЕЕТ складається з 27 пептидів, вибраних з рестрицованих по певних НІ А класів І і Ії Т-клітинних епітопів з цитомегаловірусу людини (ННМ-5; СММУМ), вірусу Епштейна-Барр (ННУ-4; ЕВУ), вірусу грипу А їі Сіозігідіит еїапі.
Зважаючи на високу частоту вакцинації проти грипу ї Сіозігідічт їеїапі, і високу зустрічальність
СММУ ії ЕВМ у загальній популяції, повторні відповіді на антиген були очікуваними для більшості зразків людини. Результати показали, що збільшену продукцію ІЕМ-у спостерігали, коли Т- клітини заздалегідь інкубували з клітинами ОС протягом 24 годин, і продукція ІЕРМ-у додатково збільшувалася, коли пептиди СЕТ додавали в систему спільного культивування.
Зо Імуностимулюючу активність Н2І 5 пІдДС4РЕ окремо або в комбінації з іпілімумабом тестували в алогенному аналізі МІК людини, в якому Т-клітини заздалегідь інкубували з незрілими ОС моноцитарного походження від неспівпадаючого донора у присутності 0,02 мкг/мл пептидів
СЕРТ протягом 1 доби. Комбінація Н2гІ5 пІдс4РЕ/пілімумабу приводила до значимого збільшення продукції ІЕМ-у у порівнянні з будь-яким із засобів окремо. Результати узгоджувалися серед трьох тестованих пар донорів; проте, спостерігали помірну мінливість між донорами.
Так само, комбінацію Н2І 5 пІдСс4РЕ і пембролізумабу тестували також в алогенному аналізі
МІЖ людини, описаному вище. Н2Ї5 пІдС4РЕ тестували окремо і в комбінації з пембролізумабом при 10 мкг/мл. Комбінація Н2І 5 пІдсС4РЕ і пембролізумабу приводила до збільшення рівня ІЕМ-у у порівнянні з будь-яким із засобів окремо. Проте, статистична значущість не була досягнута через високу мінливість між донорами і значну активність монотерапії антитілом проти РО-1 у деяких донорів.
Загалом, ці дослідження показали чудову комбіновану активність Н2І 5 пІдС4РЕ з двома схваленими ЕОрА-інгібіторами контрольних точок, іпілімумабом і пембролізумабом, у порівнянні з монотерапією в двох аналізах на основі імуноцитів людини. У дослідженнях, опублікованих у даному описі, показано, що Н2І 5 пІде4РЕ стимулює активацію Т-клітин і зрушення убік Тні (наприклад, продукцію ІЕМ-у), які є характерними для продуктивних протипухлинних імунних відповідей.
Приклад 11: Функціональна активність Н2гІ 5 пІдсС4РЕ окремо і в комбінації з антитілами проти РО і проти СТГ А-4 іп мімо
Модель пухлини РВМС людини на мишах
СПОСОБИ
Експериментальні препарати
Всі процедури на тваринах перевірені і схвалені Інституціональним комітетом за змістом і використанню тварин О5К до початку протоколу досліджень.
Отримання ліній клітин:
А2058 розмножували відповідно до протоколу АТСО.
Матеріали: лінія клітин меланоми людини А2058: АТСС, кат. Ж СКІ -11147, партія 259349362 60 ОРВ5: АТОС, кат. 2430-2200, партія 463357436
Модифікована за способом Дульбекко середовище Ігла: АТСС, кат. Ж 30-2002, партія ж 62596471, закінчення терміну дії: жовтень 2015 р.
Ембріональна бичача сироватка: Зідта-Аїагісй, кат. 212176бс-1000ті, партія Ж 13518ОКОНІ, закінчення терміну дії: липень-2018 0,25 95 (мас./об.) Трипсин-0,53 мМ ЕДТА: АТСС, кат. 2430-2102, партія 462420300
Антибіотик-протигрибковий засіб (100Х): І Те Тесппоїодіев5, кат. Ж 15240-062
Флакон для культивування клітин 1175: Сгеїпег Біо-опе, кат. 2 661175
Флакон для культивування клітин 175: Сгеїпег ріо-опе, кат. 2 658175
Середовище:
Повне середовище для зростання А2058: Модифіковане за способом Дульбекко середовище Іглан10 95 ЕВ5. Умови культивування: атмосфера: повітря, 95 90; 5 90 діоксид вуглецю (СО2); Температура: 3726
При отриманні клітин:
Заздалегідь нагріти повне середовище при 3720.
Швидко розморозити клітини при 372С у водяній бані. Протерти пробірку 70 95 етанолом і перенести клітини в 15 мл пробірку, заповнену заздалегідь нагрітим повним середовищем.
Центріфугувати при 1200 об./хв протягом 5 хвилин для збору осаду клітин.
Перенести клітини назад в Т75 флакон, заповнений заздалегідь нагрітим повним середовищем, та інкубувати при 3720.
Субкультивування клітин:
Об'єми приведені для флакона 75 см? (для флакона Т175 см", пропорційно змінити кількість необхідного середовища для дисоціації і культивування).
Видалити і відкинути культуральне середовище.
Швидко промити шар клітин ОРВ5 для видалення всіх слідів сироватки, що містить інгібітор трипсину.
Додати 2,0-3,0 мл розчину трипсину-ЕДТА на флакон і спостерігати клітини під інвертованим мікроскопом до диспергування шару клітин (2-3 хвилини).
Примітка: Аби уникнути злипання, не перемішувати клітини постукуванням або струшуванням флакона під час очікування відкріплення клітин. Клітини, які важко відкріпити,
Зо можна поміщати при 37"С для полегшення диспергування.
Додати 10 мл повного середовища для зростання і відібрати клітини обережним піпетуванням.
Центрифугувати при 1200 об./хв протягом 5 хвилин для збору осаду клітин, додати 10 мл повного середовища для зростання
Додати відповідні аліквоти суспензії клітин у нові культуральні флакони. Інкубувати культури при 3720.
Оновлення середовища: кожні 2-3 доби
Підготовка клітин пухлин для інокуляції мишам:
Промити клітини 1Х ОРВ5, додати З мл 1Х трипсину на 2-3 хвилини.
Додати повне середовище для зростання і зібрати суспензію клітин у стерильні конічні пробірки для центрифугування в ламінарному шафі для культивування клітин.
Центрифугувати клітини при 1200 об./хв протягом 5 хвилин для отримання осаду клітин.
Промити клітини 1Х розчином ОРВ5, центрифугувати при 1200 об./хв протягом 5 хвилин для отримання осаду клітин. Повторити промивання 2 рази.
Підрахувати клітини за допомогою гемоцитометра для визначення кількості і життєздатності клітин.
Ресуспендувати клітини в крижаному РВ5 у концентрації для інокуляції іп мімо (А2058, 2,5е7/мл, 2,5е6/100 мкл/миша).
Інокуляція лінії клітин пухлини мишам МО
Матеріали:
Миші: МОО.Са-Ргкасвзсій ПггоуїттУМІ/529. Тпе даскзоп Гарогаїйогу, вихідна колонія: 005557, самки у віці: б тижнів
Шприци з 1 мл туберкуліну з приєднаною голкою 25 с 5/8: Весіоп ОРісКіпзоп, кат. 2 305554
Спиртові серветки РОМ: Ргоїтезвіопа! Оізрозабрієв, кат. х 8339
Серветки з повидоном-йодом РОМ: Ргоїтеззіопа! Різрозабієв, кат. 2 840600
Підготовка мишей
Вік мишей повинен складати 6 тижнів.
Забезпечити період акліматизації 3-5 діб після прибуття мишей. бо Поголити нижню частину правого боку мишей
Підготовка ін'єкції
Очистити та стерилізувати ділянку інокуляції у мишей з використанням серветки з йодом, потім серветки з етанолом
Використовувати шприц 1 см3 і голку 25 калібру
Вийняти поршень, перемішати клітини і додати 100 мкл клітин у задню частину шприца, обережно вставити поршень.
Ін'єктувати клітини підшкірно (5.с.) у нижню частину правого боку мишей.
Оцінювання зростання пухлин
Для виміру пухлини зволожити хутро 7095 етанолом, аби спростити виявлення межі пухлини. Вимірювати розмір пухлини і масу тіла кожні 2-3 доби.
Розмір пухлини вимірюють з використанням цифрового штангенциркуля, і об'єм визначають таким чином: Об'єм пухлини (ммУ)-:(довжина) х (ширина)?/2
Внутрішньовенне введення РВМС людини
Введення РВМС людини можна починати через 1 тиждень після того, як пухлини досягнуть середнього розміру приблизно 100 мм3.
Матеріали:
Свіжі РВМС людини: АЇісеїІ5, кат. 2 С-РВ102-382
Шприци з 1 мл туберкуліну з приєднаною голкою 25 с 5/8: Весіоп ОРісКіпзоп, кат. 2 305554
Спиртові серветки РОМ: Ргоїезвіопа! Оізрозабієв5, кат. 2 8339
Серветки з повідоном-йодом РОМ: Ргоїезвіопа! Оізрозабрієв, кат. 2 840600
Марлеві тампони: Соміаїеп, кат. 2 441211
Фіксатор хвоста мишей з підсвічуванням: Вгаїпігеє зсієпійіс, сайМТІ 50
Підготовка РВМС
Свіжі РВМСО людини купують в АїЇсеїІ5 з доставкою протягом ночі.
Центрифугують клітини при 1400 об./хв протягом 5 хвилин для отримання осаду клітин.
Промити клітини 1Х розчином ОРВ5, центрифугувати при 1400 об./хв протягом 5 хвилин для отримання осаду клітин.
Ресуспендувати клітини в крижаному РВЗ у концентрації для інокуляції іп мімо (20е7/мл).
Використовувати шприц 1 см3 і голку 25 калібру.
Зо Вийняти поршень, перемішати клітини і додати 100 мкл клітин у задню частину шприца, обережно вставити поршень.
Зберігати клітини на льоду.
Ін'єкція в хвостову вену
Зігріти мишей за допомогою лампи розжарювання 5 хвилин
Фіксувати мишей з використанням фіксатора хвоста мишей з підсвічуванням.
Повільно повертати хвіст для візуалізації вени.
Очистити та стерилізувати ділянку ін'єкції з використанням серветки з йодом, потім серветки з етанолом
Вставити голку у вену під невеликим кутом і ін'єктувати клітини.
Видалити голку і обережне натискати з використанням марлевого тампона до зупинки кровотечі.
Повернути тварин в їх клітки і спостерігати протягом 5-10 хвилин, аби переконатися, що кровотеча не поновилася.
Введення терапевтичного антитіла
Через 1-3 доби після ін'єкції РВМС людини, мишам вводили антитіла за допомогою внутрішньоочеревинної ін'єкції.
Матеріали:
Контроль ізотипу для повністю людського І|дс1: ЕигеКа (Шегарешіс5, кат. ЖЕТ-901 (кваліфікації для доклінічних досліджень) партія 215-726, закінчення терміну дії: лютий 2017 р.
Іпілімумаб (єрвой): ВгібіоІ-Муєтз Бацірр МОСС 0003-2327-11, партія 2921873, закінчення терміну дії: квітень 2015 р.; партія 244Нб69490, закінчення терміну дії: травень 2016 р.
Контроль ізотипу для повністю людського /дс4: ЕшгеКа Шегарешіс5, кат. ЯЕТ- 904(кваліфікації для доклінічних досліджень) партія 215-726 закінчення терміну дії: лютий 2017 р.
Антитіло проти ІСО5 людини Н2І 5 пІдДСЯ4РЕ
Пембролізумаб (кейтруда): Мегек, МОС 0006-3026-02, партія Ж І 010592, закінчення терміну дії: 26 квітня 2016 р.
Внутрішньоочеревинна ін'єкція:
Набрати в шприц і голку 100 мкл матеріалу, що підлягає введенню. бо Вирівняти скіс голки із шкалою шприца.
Досить сильно фіксувати тварину своєю не ведучою рукою.
Ввести кінчик голки: Провести уявну лінію впоперек живота безпосередньо над колінами, голку слід вводити по цій лінії з правого боку тварини і близько до середньої лінії. Оскільки це самка, можна бачити, що точка вводу знаходиться у напрямку до голови і трохи до середини від останнього соска.
Нахилити мишу головою трохи до підлоги, аби її голова була нижча її крижі.
Вставити голку в черевну порожнину під кутом приблизно 30 градусів.
Стержень голки повинен увійти на глибину приблизно півсантиметра.
Після ін'єкції витягувати голку і повернути мишу в її клітку.
Відбір зразків крові і пухлини
Матеріали:
Місгомеце СВЗ300 (для сироватки): Вгаіпігее Зсіепіййс, кат. Ж МУ-СВЗ00 16440
Місгоменце СВЗ300 (для гематології/ЕДТА калію): Вгаїіпігее 5сіепіййс, кат. 2 МУ-СВ300 16444
Кров:
У мишей відбирали кров з хвостової вени один раз на тиждень. 30 мкл крові збирали в Місгомене СВЗО0 (для гематології/ЕДТА калію) для аналізу проточної цитометрії.
Інші ЗО мкл крові збирали в Місгомене СВЗ300 для сироватки та інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі для забезпечення згортання крові, з подальшим центрифугуванням при 2000 х д для збору сироватки. Сироватку зберігали при -20 до подальшого аналізу.
Пухлина:
Мишей піддавали евтаназії, коли розмір пухлини досягав 2000 мм. Пухлини збирали і переробляли наступним способом.
Дизайн експерименту
Всі дослідження готували відповідно до вказаних вище способів.
Відповідь залежно від дози Н2І 5 пІДСАРЕ
Це дослідження розроблене для визначення залежної від дози активності Н2І 5 пІдсАРЕ у мишей МО з трансплантацією РВМС людини, з імплантацією пухлин меланоми А2058. Дев'ять груп з 10 мишей на групу і 1 контрольну групу (лише пухлина без РВМС) з 7 мишей призначали для кожного дослідження. Узагальнення режиму обробки для відповіді залежно від дози з використанням РВМСОС людини від донора 27129 представлено в Таблиці 11. Н2гІ 5 підсА4РЕ вводили в дозах 0,04, 0,4, 1,2 і 4 мг/кг. Іпілімумаб вводили в дозі З мг/кг, і варіант агоністичного антитіла проти ІСО5 з інактивованим Ес тестували при 1 мг/кг. Тестовані групи оцінювали відносно контрольних груп носія і контрольних груп, що збігаються за ізотипом. Аналіз виживаності проводили на добу 49 при завершенні дослідження.
Таблиця 11
Узагальнення режиму обробки для відповіді залежно від дози Н2І 5 пІдсС4РЕ у мишей
Обробка 1 Обробка 2 й мишей/ групу
Пухлинаєнпирртс не Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс . Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлинаєнпирртс Двічі на тиждень
Пухлина-пиротс Антитіла проти ІСО5 з 10 Двічі на тиждень (донор Ж7129) інактивованим Ес (1 мг/кг) протягом З тижнів то Зідонюржмте 00беооброби 00000000 7000 стясмотююів 19 донор 57129 Без обробки 7 протягом З тижнів
Дослідження ефективності і фармакодинамічної (РО) активності з використанням На 5 пасаРЕ в комбінації з іпілімумабом і пембролізумабом
Цілі дослідження:
Оцінювання протипухлинної активності монотерапії Н2гІ 5 пІдсС4РЕ, введеної у дозах 0,04 мг/кг і 0,4 мг/кг.
Для оцінювання протипухлинної активності вводили дози Н2І/ 5 пІдсС4РЕ в комбінації з іпілімумабом або пембролізумабом з контролем, що збігається за ізотипом.
Збір тканини для подальшого дослідження фармакодинамічної активності Н2І 5 підсСаРЕ.
Всього 22 групи обробки з 10 мишей на групу призначали для цього дослідження. Групи 1-16 являли собою когорти ефективності і 17-22 являли собою когорти фармакодинамічної активності.
Для комбінованої обробки вводили дози Н2І 5 підСАРЕ (0,04 або 0,4 мг/кг) та іпілімумабу або Ідс1 (З мг/кг), або Н2І 5 підс4РЕ (0,04 або 0,4 мг/кг) і пембролізумабу або досі (5 мг/кг).
Дози Н2І 5 пПІдсС4РЕ та іпілімумабу, так само як контролю, що збігається за ізотипом, вводили двічі на тиждень до 6 доз, дози пембролізумабу і контролю для ізотипу вводили кожні 5 діб до закінчення дозування Н2І/5 пІде4РЕ. У когортах збору тканин для фармакодинамічного дослідження, Н2І5 піде4РЕ вводили в дозах 0,004, 0,04, 0,4 і 1,2 мг/кг. Групи обробки оцінювали відносно контрольних груп носія і контрольних груп, що збігаються за ізотипом. Групи обробки для носія, ізотипів і Н2І5 ПІдС4РЕ, окремо і в комбінації з іпілімумабом і пембролізумабом з використанням РВМС людини від донора номер 6711, показані в таблиці 12. Аналіз завершували на добу 59 при завершенні дослідження.
Таблиця 12
Групи обробки мишей в моделі пухлини меланоми АгОБ58
Пухлина«пиротс не с. донор яви)
Контроль для ізотипу ІДС двічі на тиждень до 6 доз. 2 Пи (9С1 З мг/кгндсЯ45 | 10 ПС кожні 5 діб до закінчення донор мг/кг) дозування ІСО5
Іпілімумаб З Двічі на тиждень до 6 доз
З пев ии мг/кг-Іда4 5 мг/кг 10 Іда4 кожні 5 діб до закінчення донор дозування ІСО5 й ІДС двічі на тиждень до 6 доз.
А Пухлинаєпиротс |Пембролізумаб 5 10 Пембролізумаб кожні 5 діб до (донор 56711) мг/кг Іде З мг/кг : закінчення дозування ІСО5 в Пи Н2І 5 ПІдОАРЕ 0,04 то ПОС ИСОБ Двічі на тиждень до 6 д р мг/кг Іде З мг/кг доз
Пухлина«пиротс Нгі.5 підоСаРЕ 04 ІДС і ІСО5 двічі на тиждень до 6 мг/кгнІде1 З мг/кг 10 (донор 56711) доз
Іпілімумаб З мг/кг Іпілімумаб двічі на тиждень до 6 7 Пухлинаєпиррте нпембролізумаб 5 10 доз. Пембролізумаб кожні 5 діб до (донор 56711) . мг/кг закінчення дозування ІСО5
Пухлина«пиротс На!» тосаРЕ 0,04 Іпілімумаб і ІСО5 двічі на тиждень мг/кгяІпілімумаб З 10 (донор 56711) мг/кг до 6 доз
Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,4 Іпілімумаб і ІСО5 двічі на тиждень
Пухлинаєпиротс мг/кгніпілімумаб З 10 до 6 доз (донор 56711) мг/кг
Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,04 ІСО5 двічі на тиждень до 6 доз. 10 Пи мг/кгнепембролізумаб 10 Пембролізумаб кожні 5 діб до донор 5 мг/кг закінчення дозування ІСО5
Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,4 ІСО5 двічі на тиждень до 6 доз. 11 Пи мг/кг 10 Пембролізумаб кожні 5 діб до донор нпембролізумаб 5 закінчення дозування ІСО5
Таблиця 12
Групи обробки мишей в моделі пухлини меланоми АгОБ58 мит СГ щи да ЗМг/кг Двічі на тиждень до 6 доз 13 Пухлинаєпиротс |Пембролізумаб 2,5 10 Пембролізумаб кожні 5 діб до (донор 56711) мг/кг закінчення дозування ІСО5
Пухлинаяпиротс |Пембролізумаб 5 Пембролізумаб кожні 5 діб до донор Я6711 мг/кг закінчення дозування ІСО5 и битих товар 04 ІСО5 двічі на тиждень до 6 доз
Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,4 ІСО5 двічі на тиждень до 6 доз. 16 Пи мг/кгнепембролізумаб 10 Пембролізумаб кожні 5 діб до донор 5 мг/кг нірі закінчення дозування ІСО5
Двічі на тиждень для оцінювання фармакодинамічної активності, 17 Пухлина«пиротс Носій 10 зразки від 5 мишей збирали через (донор 56711) 24 год. після 2-ої дози, і зразки від мишей збирали через 24 год. після 4-0ї дози
Двічі на тиждень для оцінювання
Пухлинаєпиротс |Контроль для ізотипу о разки від Б мишей збирали через 18 (донор 6711) (1954) 1,2 мг/кг 10 24 год. після 2-ої дози, і зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 4-0ї дози
Двічі на тиждень для оцінювання фармакодинамічної активності, 19 Пи Нв товаРЕ 0,004 10 зразки від 5 мишей збирали через 24 годи після 2-ої дози, і зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 4-о0ї дози
Двічі на тиждень для оцінювання фармакодинамічної активності,
Пи Нв тосаРЕ 0,04 10 зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 2-ої дози, і зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 4-0ї дози
Двічі на тиждень для оцінювання фармакодинамічної активності, 24 Пи Нв товар 04 10 зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 2-ої дози, і зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 4-0ї дози
Двічі на тиждень для оцінювання
Пухлинаєпиротс | Н2І 5 ПІДСАРЕ 12 фармакодинамічної активності, 29 (донор 86711) мг/кг " 10 зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 2-ої дози, і зразки від 5 мишей збирали через 24 год. після 4-0ї дози
Дослідження ефективності, що оцінює Н2І 5 пІдСса РЕ, дозоване в комбінації з іпілімумабом або пембролізумабом
Це дослідження розроблене для оцінювання протипухлинної ефективності Н2І 5 пІдСАРЕ 5 (введеного в дозах 0,01 і 0,04 мг/кг) у комбінації з іпілімумабом або пембролізумабом, із контролем, що збігається за ізотипом, у мишей М5(Сі з трансплантацією РВМС людини з використанням моделі пухлини меланоми Аг2058. Всього 13 груп з 10 мишей на групу призначали для цього дослідження. Група 2 являла собою комбінований контроль ізотипу для гуманізованих Іде і Ідс4. Н2І 5 пІдДСАРЕ вводили в дозах 0,01 мг/кг (група 12) і 0,04 мг/кг (група 13) як монотерапію. Для комбінованої обробки вводили дози Н2І 5 пІдсАРЕ (0,01 ї 0,04 мг/кг) і іпілімумабу або Ідс1 (З мг/кг), або Н2І 5 пІдС4РЕ (0,01 і 0,04 мг/кг) і пембролізумабу або Ідс4 (5 мг/кг). Дози Н2І 5 пІдсС4РЕ та іпілімумабу, так само як контролю, що збігається за ізотипом, вводили двічі на тиждень до 6 доз, дози пембролізумабу і контролю для ізотипу вводили кожні 5 діб до закінчення дозування Н2І 5 підс4РЕ. Узагальнення груп обробки, з використанням РВМС людини від донора Ж 4568, представлено в таблиці 13. Групи обробки оцінювали відносно контрольних груп носія і контрольних груп для ізотипу. Аналіз виживаності проводили на добу 33 при завершенні дослідження.
Таблиця 13
Групи обробки мишей у моделі пухлини меланоми А2058
Пухлинаєпирртс не с. донор)
Контроль для ізотипу ІЗС1 двічі на тиждень до 6 2 Пи (9С1 З мг/кгя ДА 10. | доз. ІдДС4 кожні 5 діб до донор 5 мг/кг) закінчення дозування ІСО5
Пухлинаєпирртс Іпілімумаб Змг/кгнІдсі Двічі на тиждень до б доз.
З (донор 24568) 5 мг/кг 10 ІЧО4 кожні 5 діб до д р закінчення дозування ІСО5
ІЗС1 двічі на тиждень до 6
А Пухлина-пиротс Пембролізумаб 10 доз. Пембролізумаб кожні 5 (донор 54568) 5 мг/кгнІдс1 З мг/кг діб до закінчення дозування
ІСО5 5 Пухлинаєпирртс Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,01 10 ІЯС1 і ІСО5 двічі на тиждень (донор 54568) мг/кгдое1 Змг/кг до 6 доз
Пухлинаєпирртс Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,04 10 ІЯС1 і ІСО5 двічі на тиждень (донор 54568) мг/кгдое1 З мг/кг до 6 доз .. Іпілімумаб двічі на тиждень
Пухлина-пиротс Іпілімумаб З . до 6 доз. Пембролізумаб 7 мг/кг-пембролізумаб 5 10 СЕ, . (донор 54568) кожні 5 діб до закінчення мг/кг дозування ІСО5
Щи Пухлина-пиротс Н2І 5 ПІ9ФС4РЕ 0,01 Іпілімумаб і ІСО5 двічі на донор 24568 мг/кгніпілімумаб Змг/кг тиждень до 6 доз
Пухлина«пиротс Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,04 10 Іпілімумаб і ІСО5 двічі на (донор 54568) мг/кгкіпілімумаб З мг/кг тиждень до 6 доз
Н2гІ 5 пІЗДСАРЕ 0,01 ІСО5 Двічі на тиждень до 6 10 Пухлина-пиротс мг/кгнпембролізумаб 5 10 доз. Пембролізумаб кожні 5 (донор 54568) мг/кг діб до закінчення дозування
ІСО5
ІСО5 двічі на тиждень до 6
Пухлина-пиротс На!» тосаРЕ 0,04 доз. Пембролізумаб кожні 5 11 мг/кгнепембролізумаб 10 й . (донор 54568) діб до закінчення дозування 5 мг/кг
ІСО5
Пухлинаєпирртс не
Пухлинаєпирртс не
Статистичний аналіз
Подією для аналізу виживаності було об'єм пухлини »2000 мм", укривання виразками пухлини, втрата маси тіла миши»20 95, агонія або виявлення мертвою, залежно від того, що наставало раніше. Точний час для відсікного об'єму визначали за допомогою підбору лінійного графіка між юд об'єму пухлини і добою двох спостережень, першого спостереження, де перевищений відсікний об'єм, і одного спостереження, що безпосередньо передує відсікному об'єму. Спосіб Каплана-Мейера (КМ) здійснювали для оцінювання вірогідності виживаності в різних групах обробки на даний час. Реєстрували медіанний час до кінцевої точки і відповідний йому 95 95 довірчий інтервал. Потім тестували, існують чи ні статистичні відмінності кривих виживаності КМ між будь-якими двома групами, за допомогою логарифмічного рангового критерію.
Дані об'єму пухлин за останню добу, на яку було присутньо 10 тварин на групу (тобто до евтаназії будь-яких тварин), використовували для проведення порівнянь об'єму пухлин між різними групами обробки. Перед аналізом об'єм пухлини перетворювали в натуральний логарифм через непропорційність мінливості в різних групах обробки. Потім проводили АМОМА з подальшим попарним порівнянням для підданих логарифмічному перетворенню даних.
Програмне забезпечення Ссгарпраа Ргізт використовували для нанесення на графік даних зростання пухлин і маси тіла.
РЕЗУЛЬТАТИ
Відповідь залежно від дози Н2І 5 пІДС4РЕ (фігура 20А)
Інгібування зростання пухлин:
Контрольна група: Для РВМС людини (донор 7129) не показано ефекту на зростання пухлин
А2058 у мишей М50. У мишей, що несуть пухлину А2058 у присутності або у відсутність РВМС людини, у мишей, що несуть пухлину А2058 у присутності РВМС людини, оброблених носієм і контрольними для ізотипу антитілами, розвивалися пухлини, які прогресували, як очікувалося (група 41 у порівнянні з групою 410, група 41 у порівнянні з групою 22, група 41 у порівнянні з групою 44, р--1).
Для обробки іпілімумабом при З мг/кг (група 23) показане значиме інгібування зростання пухлин (р«0,03) у порівнянні з контрольною групою носія 1, проте, статистична значущість втрачалася (р«0,22) у порівнянні з контрольною для ізотипу групою 52. Це вказує на те, що ізотип антитіла може впливати на зростання пухлини.
Для обробки Н2І5 пІдС4РЕ при 0,4 мг/кг показана тенденція до інгібування зростання пухлин і збільшеної виживаності мишей у порівнянні з іншими дозами, хоча ефекти не були статистично значимими порівнюючи або з контролем-носієм, або з контролем для ізотипу.
Зо Клінічні спостереження:
У ході дослідження спостерігали втрату маси тіла у мишей, яка складала приблизно 20 95 по закінченню дослідження. Опубліковано, що як СМНО, так і пухлинне навантаження може призводити до падіння маси тіла у мишей, хоча в цьому дослідженні втрата маси тіла, мабуть, була більше пов'язана з пухлиною А2058, оскільки для мишей, що несуть пухлину, без трансплантації РВМС (група 410), показана така ж тенденція. Укривання виразками пухлини спостерігали для безлічі пухлин у ході дослідження, включаючи контрольну групу для ізотипу.
Результати для мишей:
Більшість мишей видаляли по досягненню об'ємів пухлин 22000 мм3. Трьох мишей піддали евтаназії через укривання виразками пухлин, і трьох мишей піддали евтаназії через втрати маси тіла 522095. Дев'ять мишей виявлено мертвими, з випадковим розподілом між групами, включаючи двох в групі носія і всього трьох у контрольних групах для ізотипу. Ці смерті приписали чутливості моделі до стану реакції трансплантат проти господаря, і не пов'язували з обробкою, оскільки не спостерігали патерну для груп обробки в порівнянні з контрольними групами носія або з контрольними групами для ізотипу.
Дослідження ефективності для Н2І 5 пІДО4РЕ в комбінації з іпілімумабом і пембролізумабом (фігура 208)
Інгібування зростання пухлин:
Контрольна група: У мишей, що несуть пухлину А2058 у присутності РВМС людини, оброблених носієм і контрольними для ізотипу антитілами, розвивалися пухлини, які зростали, як очікувалося.
Монотерапія:
Обробка іпілімумабом при Змг/кг у комбінації з Ід4 (група 253) приводила до значимого інгібування зростання пухлин (р«0,04) у порівнянні з контрольною групою носія 1. Проте, порівнюючи з контрольною для ізотипу групою 22, статистична значущість втрачалася (р«0,23).
Для обробки пембролізумабом окремо при 2,5 або 5 мг/кг (група Ж13, 14) показане інгібування зростання пухлин, що піддається спостереженню, без статистичної значущості порівнюючі з контрольною групою носія або з контрольною для ізотипу групою й12. Для пембролізумабу в комбінації з Ідс1 (група 24), показане інгібування зростання пухлин, що піддається спостереженню, без статистичної значущості, проте, спостерігали значиме збільшення виживаності (р«0,04) у порівнянні з контрольною групою носія й!1. Статистична значущість втрачалася (реб0,4) у порівнянні з контрольною для ізотипу групою 22.
Для обробки Н2І 5 пІдДС4РЕ окремо при 0,4 мг/кг (група 215) показане інгібування зростання пухлин, що піддається спостереженню, без статистичної значущості в порівнянні з носієм або з контрольною для ізотипу групою 212. Для Н2І 5 пІдс4РЕ при 0,04 або 0,4 мг/кг у комбінації з
ІЧО1 (група 25 і 6) показане уповільнення прогресу пухлин, що піддається спостереженню, і продовження виживаності мишей, але це не досягало статистичної значущості.
Комбінована обробка:
Для комбінації Н2І 5 пІдсС4РЕ (0,04 або 0,4 мг/кг) з іпілімумабом (З мг/кг), у групах 28 і 29, не показано додаткового інгібування зростання пухлин у порівнянні з іпілімумабом окремо (група
ЯЗ). Для комбінації Н2І 5 підс4РЕ (0,04 або 0,4 мг/кг) з пембролізумабом (5 мг/кг), у групах Я10 і
Я11, показане помірне, але не значиме інгібування зростання пухлин і збільшення виживаності мишей у порівнянні з монотерапією пембролізумабом, група й4, або з монотерапією НЗ2І5 пІдс4РЕ, групи 5 і Яб.
Клінічні спостереження:
Втрата маси тіла у мишей, спостережувана у ході дослідження, складала приблизно 20 95.
Укривання виразками пухлини спостерігали для безлічі пухлин у ході дослідження в більшості груп.
Результати для мишей:
Всього 100 з 160 мишей піддали евтаназії, коли об'єми пухлин досягли »2000 мм3. 29 піддали евтаназії через укривання виразками пухлин, 18 мишей виявлені мертвими, 12 мишей піддали евтаназії через втрату маси тіла »20 95, і одну мишу піддали евтаназії через агонію.
Мишей виявляли мертвими серед груп, включаючи контрольну групу для ізотипу 22. Ці смерті приписали чутливості моделі до стану реакції трансплантат проти господаря, і не пов'язували з обробкою, оскільки не спостерігали патерну для груп обробки в порівнянні з контрольною групою для ізотипу.
Дослідження ефективності, що оцінює Н2І 5 пІдсС4РЕ, дозоване в комбінації з іпілімумабом або пембролізумабом (фігура 20С)
Уповільнення зростання пухлин:
Зо Контрольна група: У мишей, що несуть пухлину А2058 у присутності РВМС людини, оброблених носієм або контрольними для ізотипу антитілами, розвивалися пухлини, які зростали, як очікувалося.
Монотерапія:
Для обробки іпілімумабом при З мг/кг у комбінації з Ідс4 (група Ж3) показане значиме інгібування зростання пухлин (р«е0,02) і значиме збільшення виживаності (р«е0,01) у порівнянні з контрольною групою носія йЖ1. Проте, порівнюючи з контрольною для ізотипу групою 22, інгібування зростання пухлин не досягало значущості (р«0,13), тоді як значиме збільшення виживаності мишей зберігалося (р«0,04).
Для обробки пембролізумабом при 5 мг/кг у комбінації з ЇДе1 (група 44) показане інгібування зростання пухлин без статистичної значущості в порівнянні з носієм або з контрольною для ізотипу групою й2.
Для обробки Н2І 5 пІдС4РЕ окремо при 0,01 мг/кг або 0,04 мг/кг (група 412 і 213) показане значиме інгібування зростання пухлин (р«е0,03) у порівнянні з контрольною групою носія 21. Для
Н2гІ5 підс4аРЕ, введеного в дозі 0,04 мг/кг, також показане значиме збільшення виживаності мишей (р«0,048) у порівнянні з контрольною групою носія 41. Проте, у порівнянні з контрольною для ізотипу групою 22, інгібування зростання пухлин і збільшення виживаності не досягали статистичної значущості для груп 212 і 213. Для Н2І 5 пІдСАРЕ при 0,01 мг/кг у комбінації з Їде 1 (група Ж5) показане значиме інгібування зростання пухлин (р«0,03) і збільшення виживаності мишей (р«0,03) у порівнянні з контрольною групою носія Я. Проте, у порівнянні з контрольною для ізотипу групою 22, уповільнення зростання пухлин і збільшення виживаності не досягали статистичної значущості. Для Н2І/5 пІдСЯ4РЕ при 0,04 мг/кг у комбінації з Ід! (група б) показане інгібування зростання пухлин, що піддається спостереженню, і збільшення виживаності мишей, але це не досягало статистичної значущості.
Комбінована обробка:
Для комбінації Н2І 5 пІдС4РЕ з іпілімумабом (0,01 мг/кг плюс іпілімумаб З мг/кг; група 8) показане інгібування зростання пухлин, що піддається спостереженню, і збільшення виживаності мишей, але це не досягало статистичної значущості. Для комбінації Н2І 5 пІдсСАРЕ з іпілімумабом (0,04 мг/кг плюс іпілімумаб Змг/кг; група Ж9) показане значиме інгібування зростання пухлин (р«0,00) і значиме збільшення виживаності мишей (р«0,04) у порівнянні з бо контрольною групою носія ЖІ або з контрольною для ізотипу групою 2 (р«е0,02). Проте, у порівнянні з контролем для ізотипу, збільшення виживаності не досягало статистичної значущості. Комбінована активність не досягала значущості в порівнянні з монотерапією іпілімумабом, група 23, або з групами монотерапії Н2І 5 пІдС4РЕ.
Для комбінації Н2І 5 пІдС4РЕ (0,01 мг/кг або 0,04 мг/кг) з пембролізумабом (5 мг/кг), групи 0 ї Ж11, показане значиме інгібування зростання пухлин. (р-0,03) і спостерігали значиме збільшення виживаності мишей (р«0,03) у порівнянні з контрольною групою носія 1.
Порівнюючи з контрольною для ізотипу групою 22, значущість інгібування зростання пухлин зберігалася в комбінації 0,04 мг/кг Н2І 5 пІдсС4РЕ з пембролізумабом (р«0,03). Проте, перевага для виживаності не досягала статистичної значущості. Для комбінації не досягали статистичної значущості в порівнянні з будь-якою з груп монотерапії пембролізумабом, група ЯЗ, або Н2І 5 пІДС4РЕ, групи Ж5 або йЯб. Таким чином, для Н2І 5 пІдсС4РЕ в комбінації з пембролізумабом (0,01 або 0,04 мг/кг плюс пембролізумаб 5 мг/кг) показане збільшення інгібування зростання пухлин і виживаності мишей, але це не досягало статистичної значущості у порівнянні з контролем для ізотипу або видами монотерапії.
Клінічні спостереження:
Втрата маси тіла у мишей, спостережувана в ході дослідження, складала приблизно 20 95.
Укривання виразками пухлини спостерігали в більшості груп у ході дослідження.
Результати для мишей:
Всього 91 мишу піддали евтаназії через об'єм пухлин 22000 мм3, 34 миші піддали евтаназії через укривання виразками пухлин, і 5 мишей виявлено мертвими. Ці смерті приписали чутливості моделі до стану реакції трансплантат проти господаря.
ОБГОВОРЕННЯ
Ефективність Н2І 5 пІдсС4РЕ як монотерапії і в комбінації з пембролізумабом, так само як з іпілімумабом, оцінювали в моделі пухлин меланоми А2058 на мишах М5О з трансплантацією
РВМС людини. Ця модель, де РВМС людини внутрішньовенно ін'єктують дорослим імунодефіцитним мишам МБО (МОБ/ЗСІОЛІ-2Купиї), відома як модель НО-РВМОС М5О. Вона індукує реакцію трансплантат проти господаря (СМНО), і її використовують для дослідження активності ефекторних Т-клітин і Т-клітин пам'яті У моделі НО-РВМОС МО підшкірно імплантували лінію клітин злоякісної пухлини людини А2058 для дослідження ефекту людських
Зо імунотерапевтичних антитіл на зростання пухлин. Обмеження цієї моделі включають початок симптомів ЗУНО, втрату маси тіла і часте укривання виразками пухлин, що не дозволяють моніторування виживаності протягом тривалішого періоду часу, як це можливо для моделей сингенних пухлин на мишах.
Первинні дослідження, що оцінюють Н2І 5 пІДСАРЕ в дозах у діапазоні від 0,04 мг/кг до 4 мг/кг, показане, що для доз у нижчому діапазоні показане помірне інгібування зростання пухлин.
Уповільнення прогресування пухлин і збільшення виживаності мишей спостерігали в групах доз у діапазоні від 0,04 до 0,4 мг/кг, хоча це не було статистично значимим у порівнянні з контрольними для ізотипу групами. На підставі цих досліджень, дози Н2І 5 пІдеЯ4РЕ 0,04-0 4 мг/кг вибрані для подальшого оцінювання, окремо і в комбінації з пембролізумабом та іпілімумабом, у двох дослідженнях з трансплантацією РВМС від двох різних донорів (донорів номер 4568 і 6711). Помірні відповіді для монотерапії Н2І5 пІдсС4РЕ і комбінації з пембролізумабом спостерігали в одному з двох проведених комбінованих дослідженнях. У комбінованому дослідженні з використанням РВМС донора 4568 (таблиця 13, фігура 20С) показана протипухлинна активність монотерапії і комбінації, тоді як у дослідженні з використанням РВМС донора 6711 (таблиця 12, фігура 208) не показано значимого протипухлинного ефекту, що, ймовірно, було результатом відмінностей РВМС донорів між дослідженнями, які відображають мінливість відповідей пацієнтів, яку можна спостерігати в клініці. У цьому другому комбінованому дослідженні з РВМС донора 4568, збільшення інгібування зростання пухлин і збільшену виживаність мишей спостерігали в комбінованій групі в порівнянні з будь-яким засобом окремо, хоча ця відмінність не була статистично значимою.
Проте, спостерігали синергізм для комбінацій, оскільки Н2І/5 пІдсСЯ4РЕ в дозі 0,04 мг/кг у комбінації з пембролізумабом при 5 мг/кг приводили до статистично значимого зменшення об'єму пухлини через десять діб після першої дози, і до збільшеної виживаності в порівнянні з контрольною для ізотипу групою (р «- 0,05), тоді як монотерапія не приводила до цього.
Фактично, 5095 мишей у групі комбінації Н2І 5 пІдДС4РЕ і пембролізумабу залишалися в дослідженні на добу 33, але були видалені через укривання виразками пухлин. Лише чотири миші були видалені з дослідження через об'єм пухлин у цій комбінованій групі, тоді як від 8 до 9 мишей були видалені з дослідження в групах пембролізумабу і контролю ізотипу.
Для терапії антитілом проти РО1 не показано статистично значимої активності в цій моделі, бо як спостерігали за обмеженою зміною зростання пухлин і виживаності, спостережуваних у когорті обробки пембролізумабом у порівнянні з когортою обробки контролем для ізотипу. Для монотерапії іпілімумабом показана тенденція до помірно кращого інгібування зростання пухлин, ніж для пембролізумабу, в обох дослідженнях, і показано статистично значиме збільшення виживаності в порівнянні з контролем для ізотипу в другому комбінованому дослідженні з використанням здатного до відповіді донора РВМС 4568 (ре 0,04). Для НІ 5 пІДСА РЕ в дозі 0,01 мг/кг у комбінації з іпілімумабом при З мг/кг показане значиме збільшення виживаності в порівнянні з іпілімумабом (р: 0,02), але не в порівнянні з монотерапією Н2І 5 підс4РЕ. Не було додаткових значимих ефектів на об'єм пухлини, спостережуваних для комбінації Н2І 5 пІдсСАРЕ та іпілімумабу в цій моделі в порівнянні з будь-яким засобом окремо. Мишей зі всіх груп обробки, включаючи групи носія і групи контролю для ізотипу, виявляли мертвими, як зареєстровано в таблицях результатів. Ці смерті приписали чутливості моделі до стану реакції трансплантат проти господаря, і не пов'язували з обробкою.
Приклад 12: Функціональна активність агоністичного антитіла проти ІСО5 миші окремо і в комбінації з антитілами проти РОЇ і проти СТІ А-4 іп мімо
СТ26 і ЕМТ6 - моделі сингенних пухлин на мишах
Ст26 - модель мишачої карциноми товстої кишки на мишах
СПОСОБИ
Це дослідження проводили за протоколом, схваленим Інституціональним комітетом за змістом і використанню тварин О5К до початку досліджень.
Тварини
У це дослідження включені 164 самки мишей ВАЇ В/с тісе з Напап Зргадие Юаулеу. Миші знаходилися у віці 6-8 тижнів на початок дослідження, коли їх піддавали інокуляції.
Культура клітин та інокуляція
Один флакон клітин СТ-26 (АТОС: СВІ -2638) (Зх105 клітин; Р-11) розморожували від -14020 і розсівали в КРМІ з 10 95 ЕВ5. Клітини субкультивували З рази протягом 10 діб. Трипсин/ЕДТА використовували для полегшення відкріплення клітин від культурального флакона в ході субкультивування. Клітини збирали, промивали двічі і ресуспендували в КРМІ без ЕВ5 при
Бх105 клітин/мл. Мишам інокулювали підшкірно 0,1 мл клітин (5х107 клітин/миша) в нижню частину правого боку.
Зо На добу збору клітин та інокуляції, підрахунок клітин виконували в ВесКтап СошНег Мі-сеї
ХК і перевіряли за допомогою гемоцитометра. Клітини відкріпляли від флакона з використанням трипсину/ЕДТА, і промивали двічі, перший раз з використанням КР.МІ--10 90ЕВ5 і другий раз з використанням лише ЕРМІ, і ресуспедували в 10 мл КЕРМІ. 178х105 клітин з 98,8 95 життєздатністю збирали в 20 мл КРМІ. 1,685 мл суспензії клітин (всього 15х105 клітин) додавали
З5 до 28,315 мл КРМІ. 15х105 клітин/30 мл середовища:5х 105 клітин/мл. Це еквівалентно 5х107 клітин/100 мкл.
Складання і підготовка антитіл
Антитіла розчиняли з флаконів з джерелом антитіл для зберігання до бажаних концентрацій у стерильному 0,9 95 сольовому розчині на добу дозування. Клон С398.4 агоністичного антитіла проти ІСО5 тестували при 0,05 мг/кг і 0,5 мг/кг. Кожну дозу тестували також з антитілом проти
РО!1 при 1Омг/кг і з антитілом проти СТІ А-4 при 1 мг/кг.
Експериментальний спосіб(и)
Моніторування пухлин і дозування
Мишей піддавали інокуляції на добу 0. На добу 11 вимірювали масу тіла та об'єм пухлин.
Мишей випадковим чином розподіляли на 12 груп дослідження, показаних у таблиці 14, по 10 мишей/групу на підставі розміру пухлин. Випадковий розподіл проводили з використанням програмного забезпечення Зіцауюд Зішау Оігесіог. Мишам вводили дози на підставі графіка дизайну дослідження двічі на тиждень, починаючи на добу випадкового розподілу і продовжуючи всього до 6 доз. Дозування було внутрішньоочеревинним (ІР) в об'ємі 100 мкл носія - 0,9 95 сольового розчину. Об'єм пухлин і масу тіла вимірювали З рази на тиждень впродовж дослідження.
Кінцеві точки
Мишей видаляли з дослідження через пухлинні навантаження, коли об'єм пухлини перевищував 2000 мм3. Об'єм пухлини розраховували із застосуванням вимірів штангенциркулем довжини і ширини за наступною формулою: ТМ-0,5271 "УМ2.
Крім того, мишей видаляли з дослідження, коли в пухлинах розвивалися відкриті укривання виразками. Укривання виразками спостерігали впродовж експерименту, проте, лише укривання виразками, що зарубцювалися, не були кінцевою точкою, якщо вони не формували відкритих отворів.
Хоча це не було застосовно ні до однієї миші в даному дослідженні, третьою кінцевою точкою, встановленою на початку дослідження, було зменшення маси тіла на 20 95.
Лікарські засоби і матеріали
СтьА-Я4 0 |ВоХсе!о 0 ВЕ0О164 |5632-4/0715 - Щ|909.Д СК,
Всі антитіла розчиняли до бажаної концентрації в 0,995 сольовому розчині, і сольовий розчин використовували як контроль-носій.
Аналіз даних
Подією для аналізу виживаності були об'єм пухлини 2000 мм" або укривання виразками пухлини, залежно від того, що наставало раніше. Точний час для відсікного об'єму визначали за допомогою підбору лінійного графіка між юд об'єму пухлини і добою двох спостережень, першого спостереження, де перевищений відсікний об'єм, і одного спостереження, що безпосередньо передує відсікному об'єму. Спосіб Каплана-Мейера (КМ) здійснювала для оцінки вірогідності виживаності в різних групах обробки на даний час. Реєстрували медіанний час до кінцевої точки і відповідний йому 9595 довірчий інтервал. Потім тестували, існують чи ні статистичні відмінності кривих виживаності КМ між будь-якими двома групами, за допомогою логарифмічного рангового критерію.
Об'єми пухлин через 17 діб після початку дозування порівнювали між різними групами обробки. Перед аналізом об'єм пухлини перетворювали в натуральний логарифм через непропорційність мінливості в різних групах обробки. Потім проводили АМОМА з подальшим попарним порівнянням для підданих логарифмічному перетворенню даних.
Таблиця 14
Групи досліджень 6 ПсСоБІОмМг 77777771 78 |РОТ200мКк 77777711 9 СОБІ! МмкеСстАЯ2омМи 4 Ф
Необроблене значення р, так само як значення р з корекцією по рівню псевдопозитивних результатів (ЕОР), для порівнянь діб до подій в аналізі виживаності і порівнянь логарифмічно перетвореного об'єму пухлин на добу 10 між групами обробки, показані у вищезгаданій таблиці.
Порівняння, з використанням значень р з корекцією за ОК « 0,05, оголошували статистично значимими.
РЕЗУЛЬТАТИ
Відстежування наслідків для мишей показало, що ряд мишей видаляли з дослідження через пухлинне навантаження та укривання виразками пухлини. Всі миші, що залишилися, були вільними від пухлин на добу дослідження 61, за винятком 1 миші в (37, що має об'єм пухлині 579,16 мм3.
Для виживаності (часу до кінцевих точок) для груп 9 і 12 показане значиме збільшення виживаності в порівнянні з контрольною групою носія (р-0,008 і р-0,001 відповідно). Для групи
12 показане статистично значиме збільшення виживаності в порівнянні з групами 2, 4, і 5 (р-0,006, 0,001, 0,02). Проте, ні для яких комбінованих груп не показане статистично значимого збільшення виживаності (р«е0,05) у порівнянні з будь-якою монотерапією. (фігура 21)
ОБГОВОРЕННЯ
Для груп комбінованої терапії, зокрема, з високою дозою комбінації антитіл проти ІСОЗ5 і антитіл проти РОТ (група 12), показане інгібування зростання пухлин і збільшену виживаність у порівнянні з групами монотерапії і контролю для ізотипу, хоча статистичної значущості не досягали на добу 61. Контроль для ізотипу для групи 12 являв собою Ідсг2а щуратідо хом'яка з групи 3. Групи монотерапії для порівняння являють собою; ІСО5 10 мкг (група 6) і РО1 200 мкг (група 8). Всього 5 мишей залишалися вільними від пухлин у групі 12 у порівнянні з 1 у групі 3, 1 у групі 6 і 1 у групі 8. Перевагу для виживаності оцінювали кількісно за допомогою отримання доби, на яку кожна миша досягала будь-якої із зумовлених кінцевих точок дослідження. Ряд мишей видаляли з дослідження через відкриті укривання виразками пухлин, а не через пухлинне навантаження.
У групі з високою дозою комбінації ІСОЗАСТІ А-4 (група 10) збільшену кількість мишей видаляли через укривання виразками пухлин на добу 31, що, ймовірно, маскувало виживаність і протипухлинні переваги, що забезпечуються цією комбінацією. В цій групі, 5 мишей видаляли через укривання виразками пухлин і лише 2 через пухлинне навантаження, що досягло 2000 мм3. Всі пухлини, видалені через укривання виразками пухлин, все ще мали помірний розмір при видаленні з дослідження, і чекали, що укривання виразками пухлини може бути результатом індукованої терапією протипухлинної імунної відповіді у цих мишей. Три миші залишалися вільними від пухлин у цій групі на добу 61. 2 миші, видалені через пухлинне навантаження, складали найнижчу кількість мишей, видалених через пухлинне навантаження з усіх груп.
Модель на мишах пухлини карциноми молочної залози ЕМТб
Експериментальний спосіб(и)
Усі процедури і критерії евтаназії, описані в даному документі, відповідають протоколу
ІАСИС АШРОбОб. Тварин зважували та інокулювали в праву задню частину 100 мкл 1х10» клітин пухлин ЕМТ6 на мишу. Кількість інокульованих мишей еквівалентна щонайменше 130 95 від кількості, необхідної для дослідження. Приймаючи 30 95 відсоток невдач (або дуже великий, або дуже маленький розмір на час початку дослідження), метою була наявність п-10 для кожної групи. Після інокуляції клітин пухлини, зростання пухлин і загальну масу тіла вимірювали З рази на тиждень з використанням цифрового штангенциркцуля ЕоулЛег "РгомМах" протягом 4 тижнів або довше. Антитіла отримували від комерційного постачальника і розчиняли до бажаної концентрації в 0,9 96 сольовому розчині. Дозування (і.р.) проводили двічі на тиждень, всього до б доз і починали на добу випадкового розподілу, позначену як доба 0, коли середній об'єм пухлини наближався до 100 мм3, приблизно через 7-8 діб після інокуляції. Випадковий розподіл проводили з використанням програмного забезпечення ЗшауЇод 5іцау Оігесіог Зийе. Довжину і ширину пухлин вимірювали для визначення об'єму пухлин з використанням формули (об'єму пухлини: 7 Му2 х 0,52). Вимір пухлини більше 2000 мм? для індивідуальної тварини призводив до видалення з дослідження. Мишей могли також видаляти з дослідження через втрату маси (52095), укривання виразками пухлин, або будь-якого іншого очевидного придушення нормальної активності мишей через ускладнення.
У цьому дослідженні всього 191 тварині інокулювали клітини ЕМТб для отримання достатньої кількості мишей з пухлинами в бажаному діапазоні розмірів для 13 груп з 10 мишей, як показано в таблиці 15. Група мишей з ін'єкцією носія-сольового розчину і група для контролю ізотипу служили як контроль для мишей, оброблених тАб проти ІСО5, РО! і СТІ А-4. Контроль ізотипу для ІСО5 (дО хом'яка) вводили в дозах 10 мкг окремо і в комбінації з ізотипом для
СТІ А-4 (905256 миші) або РО-1 (д0с2а щура). У групах монотерапевтичної обробки антитіло проти СТІ А-4 (909) і антитіла проти РО-1 (АМР1-14) вводили в дозах 20 і 200 мкг на мишу, відповідно, і оцінювали в комбінації з контролем ізотипу для ЇСО5. Клон С398.4 агоніста ІСО5 вводили в дозах 10 і 1 мкг на мишу. Ефективність агоніста ІСО5 оцінювали також в дозах 10 і 1 мкг на мишу в комбінації з антитілом проти СТІ А-4 або антитілом проти РО-1. Додаткову групу
РО-1 ії СТГ А-4 в зумовлених концентраціях включали як порівняльну групу позитивного контролю. Статистичний аналіз об'єму пухлин проводили на добу 13 після випадкового розподілу. В аналіз життєздатності включали мишей, що знаходяться в дослідженні до доби 60.
Таблиця 15
Групи дослідження
Групаї:їх1Обклітин 0000 |сольовийрозчин//| 77777771 10
Група4:їхіОбклтин, 0 Мобхомякатбмкг | (7777777 | 10
Групаб:їхіббклтин.///////// ПСО5З1ОмМж 7 Ї 77777771
Групаб:їх!ббклтин.///////// ПСОбЇмМж 7 Ї 77777717
Лікарські засоби і матеріали
Тварини
Самок мишей ВаїБ/с у віці від 6 до 8 тижнів отримували з Напап б5ргадиє Раулеу і містили відповідно до стандартів ІАСОС.
Клітини ЕМТб6
Клітини ЕМТ6 розморожували і культивували в культуральних флаконах протягом восьми діб до інокуляції. Клітини пасирували З рази за цей час. На добу інокуляції, клітини збирали з флакона в повному середовищі. Клітини центрифугували і ресуспендували в середовищі
Веймаута (з 1595 ЕВ5). Цю стадію повторювали З рази в середовищі Веймаута без ЕВ5.
Щільність і життєздатність клітин перевіряли за допомогою виключення трипанового синього.
Потім клітини розчиняли до бажаної щільності (1х105 клітин на мл).
Імунотерапевтичні засоби
Всі лікарські засоби розчиняли до бажаної концентрації в 0,9 95 хлориді натрію на добу дозування та ін'єктували ір. з використанням голки 30 б. Розведення лікарських засобів і контролю представлені нижче в таблиці 16.
Таблиця 16
Розведення лікарських засобів й - доданий |загальна вихідна | бажана 2, необхід- : в ваш загаль-
Вх конц, конц. розве- доза/ кількість ний | Вихідний | кількість ний мг/мп мг/мл дення 1: миша, мг| мишей об'єм, мл розчин, | розчин- об'єм, мл мл ника, мл миші щура хом'яка ста! бл | 01 | 61 1 0021 40 | 8 | 05 | 9 | 95
РО-ї | 744 | 1 | 744 | 02 | 40 | 8 | 730 | 8572 | 9,672 псо5 | 5 | 005 100 | 001 з3з0 / 6 | оло | 99 | 0 псо5 | 005 | 0,005 | ло | 0001 | з0 | 6 | 700 | 9 | 0
Аналіз даних
Статистичний аналіз
Подією для аналізу виживаності були об'єм пухлини 2000 мм або укривання виразками пухлини, залежно від того, що наставало раніше. Точний час для відсікного об'єму визначали за допомогою підбору лінійного графіка між юд об'єму пухлини і добою двох спостережень, першого спостереження, де перевищений відсікний об'єм, і одного спостереження, що безпосередньо передує відсікному об'єму. Спосіб Каплана-Мейера (КМ) здійснювала для оцінки вірогідності виживаності в різних групах обробки на даний час. Реєстрували медіанний час до кінцевої точки і відповідний йому 9595 довірчий інтервал. Потім тестували, існують чи ні статистичні відмінності кривих виживаності КМ між будь-якими двома групами, за допомогою логарифмічного рангового критерію.
Об'єми пухлин через 13 діб після початку дозування порівнювали між різними групами обробки. Перед аналізом об'єм пухлини перетворювали в натуральний логарифм через непропорційність мінливості в різних групах обробки. Потім проводили АМОМА з подальшим попарним порівнянням для підданих логарифмічному перетворенню даних. Використовували програмне забезпечення для аналізу 5А5 9.3 і ЕК 3.0.2.
РЕЗУЛЬТАТИ
Мишей Ваїр/с піддавали інокуляції і випадковим чином розподіляли на групи по десять на підставі режиму лікування через 8 діб. Введення лікарських засобів або контролю починали на добу випадкового розподілу (доба 0) і продовжували двічі на тиждень протягом З тижнів.
У групі обробки сольовим розчином пухлини зростали з очікуваною швидкістю відносно попередніх досліджень ЕМТ-6. Всіх мишей у групі носія - сольового розчину піддавали евтаназії через розмір або укривання виразками пухлин на добу 30. Обробка з використанням дО хом'яка окремо або в комбінації з Їд2а щура або Ідс2р миші, не приводила до статистично значимої зміни середнього зростання пухлини або виживаності в порівнянні з групою носія - сольового розчину.
Через 13 діб після випадкового розподілу в групах монотерапії проти ІСО5 показана невелика спостережувана зміна середнього зростання пухлини у порівнянні з контролем для ізотипу. Проте, в групі обробки високою дозою ІСО5 (10 мкг) показана очевидна тенденція до більшого інгібування зростання пухлин, ніж у групі низької дози. Спостерігали ефект, порівнянний з активністю монотерапії проти СТІ А-4. Обробка монотерапією тАб проти РО-1 також приводила до деякого спостережуваного, але статистично не значимого зменшення середнього об'єму пухлин на добу 13. Проте, як і для монотерапії проти ІСО5 і СТІ А-4, це не приводило до збільшення виживаності в порівнянні з групами відповідних ізотипів. Обробка з використанням комбінації антитіла проти РО-1 і антитіла проти ІСО5 клону С398.4 в дозі 10 мкг приводила до істотного інгібування зростання пухлин у порівнянні з групами обробки контролю і монотерапії (фігура 22). Для трьох мишей у цій комбінованій групі досягли повної регресії пухлин, істотного поліпшення в порівнянні з групами обробки контролю або монотерапії. Проте, через використані статистичні критерії, статистично значимого поліпшення виживаності не досягали. Комбінація антитіла проти РО-1 з 1 мкг агоністичного антитіла проти ЇСО5 клону
С398.4 приводила до статистично значимого зменшення середнього зростання пухлин на добу 13 у порівнянні з контрольною групою носія - сольового розчину (р«е0,05) і групою монотерапії
ІСО5 (р«е0,05) при 1 і 10 мкг. Для чотирьох мишей для цього режиму обробки досягли повної регресії пухлин, що привело до значної тенденції до збільшення виживаності, що не досягла статистичної значущості.
Для антитіла проти ІСО5 в обох дозах у комбінації з антитілом проти СТІ А-4 показана невелика спостережувана перевага інгібування зростання пухлин або збільшення виживаності у порівнянні з монотерапевтичною обробкою будь-яким антитілом.
ОБГОВОРЕННЯ
Тоді як контроль для ізотипу не приводив до очевидних змін середнього об'єму пухлин або загальної виживаності при порівнянні з групою носія - сольового розчину, були присутні індивідуальні тварини у групі до хом'яка (група 4) і в групі (дО хом'яка і ЇдС2а щура (група 3), для яких показано уповільнення зростання пухлин. У групі ізотипу дО хом'яка і І(дс2а щура, одна з мишей вижила довше за останню мишу в групі носія - сольового розчину, її піддали вмертвінню на добу 36 через укривання виразками, з пухлиною, об'єм якої виміряний як 1156,56 мм. Дві миші в групі Їд хом'яка вижили довше, ніж у групі сольового розчину. Одну тварину піддали евтаназії через розмір пухлини на добу 36, і другу - на добу 41 через укривання виразками з виміром 1899,28 мм3.
Режим дозування антитіла проти РО-1 з 10 мкг агоністичного антитіла проти ІСО5 приводив до спостережуваного інгібування зростання пухлин, що привело до зменшення об'єму пухлин на добу 13 у порівнянні з контролем для ізотипу, хоча ця відмінність була менш очевидною в бо порівнянні з монотерапією антитілом проти РО-1. Проте, комбінація приводила до присутності всього п'яти тварин, що вижили довше за будь-яку тварину в групі монотерапії антитілом проти
РО-1, де три миші зазнали повну регресію пухлин у порівнянні з відсутністю таких мишей у групі монотерапії антитілом проти РО-1.
Поєднання антитіла проти РО-1 з дозою 1 мкг агоністичного антитіла проти ІСО5 приводило до спостережуваного зменшення середнього розміру пухлин на добу 13 у порівнянні з контрольними групами для ізотипів і відповідними групами монотерапії. Це зменшення було статистично значимим у порівнянні з контрольною групою носія - сольового розчину (ре«е0,05) і групою монотерапії 1 мкг ІСО5 (р«е0,05). Чотири миші зазнали повну регресію пухлин і вижили довше за будь-яку тварину в групі монотерапії РО-1.
Перевага для виживаності, спостережувана для групи комбінації ІСО5-РО1, не досягла статистичної значущості в порівнянні з контролем на добу 60. Проте, інгібування зростання пухлин і перевага для виживаності в групі комбінованої обробки ІСО5АРО1 були порівнянними з активністю, спостережуваною для групи комбінації РО1-СТІ А-4, яку розглядали як позитивний контроль для протипухлинної активності в цьому дослідженні. Це дозволяє передбачати, що комбінація антитіл проти ІСОЗ і РОЇ може забезпечувати перевагу, подібно до комбінацій
СТІ А-4 і РОТ, для яких показана значна клінічна активність у деяких типах пухлин.
З 130 мишей, включених у це дослідження, 12 залишалися живими на добу 60, де 11 досягли повної регресії пухлин. З 118 мишей, що досягли кінцевих точок для видалення з дослідження, 111 видалили через досягнення розміру пухлини 2000 мм3. Останніх сім мишей піддавали евтаназії через укривання виразками пухлин. Випадки укривання виразками були розподілені серед груп. Групи 1 (Сольового розчину), З (дО хом'яка і дсга щура), 4 (що хом'яка), 6 (1 мкг ІСО5) і 10 (СТІ А-4 з 1 мкг ІСО5) всі містили по одній тварині, видаленій через укривання виразками. У групі 13 (СТІ А-4-РО-1) показані дві тварини, умертвлених через укривання виразками. Останні групи не містили тварин, видалених через укривання виразками.

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, що містить СОРНІ, як указано в ЗЕО ІЮО МО: 1; СОКНАІ, як указано в 5ЕО ІЮ МО: 2; СОКНЗ, як указано в 5ЕО ІЮ МО: 3; СОКІ 1, Ко) як указано в ЗЕО ІО МО: 4; СОКІ 2, як указано в ЗЕО ІЮ МО: 5, та СОКІ 3, як вказано в 5ЕО ІЮ МО: 6, де зазначений зв'язок між білками ІЇСО5 або його антигензв'язуюча частина містять каркасну ділянку пІдДСАРЕ.
2. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за п. 1, що містять домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у ЗЕО ІЮО МО: 7, та/"або домен Мі, який містить амінокислотну послідовність, щонайменше на 90 95 ідентичну амінокислотній послідовності, вказаній у ЗЕО ІЮ МО: 8, де зазначений зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина специфічно зв'язуються з ІСО5 людини.
З. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за п. 1 або 2, де вказаний зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина є агоністом ІСО5.
4. Зв'язуючий білок ІСО5 або його антигензв'язуюча частина для будь-якого з пп. 1-3, де вказаний зв'язок ІСО5 зв'язується з ІСО5 людини з () константою швидкості зв'язку (Коб) щонайменше 1х105 М' с"; ії константою швидкості дисоціації (Кох) менше бх105 с"; або (її) константною дисоціацією (Ко) менше приблизно 100 нМ, де афінність вимірюють за допомогою ВіІАсоге.
5. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за будь-яким з пп. 1-4, що містять домен Мн, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 7, і домен МІ., який містить амінокислотну послідовність, як зазначено в ЗЕО ІЮО МО: 8. БО 6. Зв'язуючий ІСО5 білок для будь-якого з пп. 1-5, де вказаний зв'язок ІСО5 білок являє собою моноклональне антитіло.
7. Зв'язуючий ІСОЗ5 білок за п. 6, де моноклональне антитіло є гуманізованим.
8. Зв'язуючий ІСО5 білок за п. 7, де моноклональне антитіло є повністю людським.
9. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за будь-яким з пп. 1-8, що містить амінокислотну послідовність важкого ланцюга, яка має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в 5ЕО ІЮ МО: 23, та амінокислотну послідовність легкого ланцюга, яка має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, вказаною в 5ЕО ІЮО МО: 24.
10. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за будь-яким з пп. 1-9, що містять амінокислотну послідовність важкого ланцюга, вказану в ЗЕО ІЮО МО: 23, та амінокислотну послідовність легкого ланцюга, вказану в ЗЕО ІЮ МО: 24.
11. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує зв'язуючий ІСОБ5 білок або його антигензв'язуючу частину за будь-яким з пп. 1-10.
12. Експресуючий вектор, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, як визначено у п. 11.
13. Клітина-хазяїн, що містить нуклеїнову кислоту за п. 11 або експресуючий вектор за п. 12.
14. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, експресована клітиною-хазяїном за п. 13.
15. Спосіб отримання зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини за пп. 1-10 або 14, що включає стадії: а) культивування клітини-хазяїна за п. 13 у придатних умовах для експресії вказаного зв'язуючого ІСО5 білка або його антигензв'язуючої частини; та р) виділення вказаного зв'язуючого ІЇСО5 білка або його антигензв'язуючої частини, причому пропонують поліпептид, який містить вказаний зв'язуючий білок ІСО5 або його антигензв'язуючу частину.
16. Фармацевтична композиція, що містить зв'язуючий ЇСО5 білок або його антигензв'язуючу частину за будь-яким з пп. 1-10 або 14, та фармацевтично прийнятний носій.
17. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина за будь-яким з пп. 1-10 або 14, або фармацевтична композиція за п. 16 для застосування при лікуванні раку.
18. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція для застосування для п. 17, де зв'язуючий білок ІСО5 або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція застосовані у поєднанні або вводяться спільно з щонайменше одним антинеопластичним засобом, щонайменше одним другим імуномодулюючим засобом та/або щонайменше одним імуностимулючим ад'ювантом визначеній людині.
19. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція для застосування за п. 18, де зазначений щонайменше один антинеопластичний агент є хіміотерапевтичним засобом.
20. Зв'язуючий ІСО5 білок або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція для застосування за п. 18, де зазначений щонайменше один антинеопластичний агент є доцетакселом, метотрексатом, паклітакселом, гемцитабіном, фторурацилом, карбоплатином або цисплатином.
21. Зв'язуючий білок ІЇСО5 або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція для застосування за будь-яким з пп. 18-20, де зазначений другий імуномодулюючий агент вибраний з: антитіла проти СТІ А-4, антитіла проти РО-1, антитіла проти РО-І/1 та антитіла проти ОХ-40.
22. Зв'язуючий білок ІЇСО5 або його антигензв'язуюча частина, або фармацевтична композиція для застосування за будь-яким з пп. 20-22, де імуностимулюючий ад'ювант є агоністом ТІ 4, за потреби СЕХ-601.
:
во . 700000. «рю нт фення ї й х ! що і і Н ї ! 75 Ех з 1 НН Тр ях . і і ; щ375 і С ! ; З ї В Н З ; З ЕІ ІЗ сх і ї Н І ї їх ї І Ж ж : і ; і: У ; пвх ї : З х З Ех І З : ї ЗЕ . Є Е ; : і і . й : ро нн не НК ж НЕТ : : З ЩЕ - КЕ Е ! і ше ше і. . : ІЗ : х а З Я ях ще ГУ І З У х х ще їх ї | І З М Х. і са ї ЕЕНЕНОТО пря ше ан зни г; женінннянннтя ши ше: ши. Е ї | ши ШЕ: У ї і З : їх ЕЕ КУ во КЗ Х : ! з. КК Б З й КЕ і х й «фон вні Хо м ММ «Ж «У НК: АЖ Як НЕ со ; : ож оз оо ж 5 се з т т- 5 же 2. кош я: ПН з І С б ою фФ З 5 Б В А щ З їй хз ож и З І о В НН Не ле ож с ее а х 5 З 9 о о о Б Б ВЕ хх в Ж ХХ . - в 5 б й ша 5 Б ! ї ЕН чн зн ДЕ З З Гн та ОК ОО Ме З є - Б Кк й - дя КУ ї : в Б ЕЕ т Б ЕЕ ЕЕ З . 5 Б ЕЕ ЕЕ З . І щш ж гей іге їх Гай З и в ва ЕЕ я Б : и В МК НН: Продукція ІЕМ-у СО4С025- Т-клітинами
Фіг. 1 в2 тт 7 п в КЗ 5 пн ї . (мкг/мл) їх у ч тт т тт ру и т ев тити чити, У ун у у у у ук ук Кс во і і з. ч Н і 7 г і | ж Зо я Ї і 15 : В ЗХ чи шк же Х і у В 3 ї З й З ХХ я ї х Ж і: -- ї у В у КЕ й , Ря Ка Е ; ; Ї ІЗ ) ша ; і : Е Я З ЕВ : ;
ї . З я Ж Ж с: т Я я Х ЗШ: ІЗ 5. жі 75 син Не ше шк ке шин НН Кі я І КУ Ж У х КЗ Ж у Е: їх Її З Х мя Ж -Х я : Е: я Е -к ї Х АХ я з СК 5 5 хх т: Ук ї З Ах В у я яке З З МД. В і: х « : З з З ЗЕ: КЗ З З В їв ї Е хе ху З ЗЕ ЩЕ ЗШ: КУ я ши щі и шщ ши ши ши НН 7 ї ще х Я КХ З З Ж З КІ ес ре ІЗ КОС нн У В нонлуіжттьттний ЯЗ плен Ко чн А чутні ж мини мини мини нин З Знов гу ши ша з ші ШІ ши ши в ЩЕ: що щі п щі ж ще ш ще ших з ї У У В З ВХ Ж їх Я х Ка й . : В ше ви ше ші ше щі ше і ї 8. ОХ УК : В дО Я З ЗЕ СО «хх Я і Я КО ХЕ ЗБЕ ПАХ У ЕК ОО, МЕТ КУ ІЗ) : : я ЦЕ З ШЕ ЖІ ж що Ех ЖЗ З ХХ З. ї х ; і ее у м К В Ек М мине ми 3: ди нн З: ай Її ї с У ХО З З ЕЕ: СЯ Ж МУ Ж КОЖ ІЗ Ж ; ше ши ше ж ші ше : ЗЕ: У ЖК: Я ХУ В с В Же. БУВ ІЧ ї З з ЗЕ Ж: БЖ Ж ЖЖ. З БК НЕ х З ІЗ : ЗЕ ж. ШЕ я ЖЕ ; хх З жк с ЖАХ: ся я З Ж: ЖК: З І КК о : М м СБ Ж: В ВЕ БА А БО І З : І Ж ОД: а М З ; Вон ВО ВВ сш сш ши ше й ЕЕ й с їх : : М Б, БО БК ЗЕ З Бад Ж В КО ВВ ї зе ші 5 5 5 54 5 І : ЕЕ В ; ЕЗ МОН КО МК Ж КК НК М З КУ Х ВК ВХ ї ІЗ І М ВХ Ж Я ЧНО МІ ВХ ЖК Кр КО ІЗ ПЕК МИХ ЖК ЗО ВХ ХХ ВХ ЖЖ Ж ЗХ ЖК КУ ІЗ З МК Ж КЕ В С КИ ТУ ЗХ ВЖК ІЗ ГУ НМ Ж ЖІ ВХ КОХ ЖУК УЖ Ж М З ІЗ З НЕ -Х а а її ТЕМА ще КУ ХК ГЕ С КЕ с ХЕ ЗВУ З е Ж З КО КК, Е г Ми У ; ж З 5 5 й кВ 5 о Й ї г і о я я шоб В е ж В є ФВ ЕЗ з ях лин «с ще ге 5 ь к- са «ХЕ : З іа; с :. ї М Б оо Фо во» шо з» Фе ю 0 о ш ее ьзьо а з : КЗ ж ЖЕ ш - 855 м а з і З К- ові 7 ж ж І ї 5 Б В В хх В Ж х і ї ш- Б оо шо ОВО ї З -щ о шо дк ЯМ о Зо єМ У ї і ш-- т а» І З ча «є Ен -тЇ в - ех т Е в Б Ж В ее В В з : в Б З о Б. 55 ї ЕЕ ЕВ 5 Б БЕ 4 тк х х У І. а 8 5 Б Б х Б 5 . х , с х : т 8 ж В в х х Ко о АК А КН Я Проліферація СОЯ. Т-клітин
Фіг. 2
Для гуманізованого варіанту НЯ!.5 антитіла проти БО 422.2 показана краща продукція цитокінів у клітинах РВМС
А. ІЕМ зво - ше шк як ДЕ зош я ше шк Е : ШЕ ші ще воно ВИНИ ши ше ше ши й во Що Й й. Ян вині бо бе фе 402 402 аю най нах НЕО нах людин люДдМнІ. ОДИНИ ПОДИНЕ; німеіма умами Валя НІМ зв'язані щ
В. шо є, Те Е ую. ши шк ще шк: шк щі що и :Мупеція лав поие Антетка Бе Зо дента анна Еш ЯМеМВ нні, ОЛБОТЄ пре СОрОТИ проту ВНТ Муз), ВО прояв с прот» ПОВ заводи МУЗ 0 БОБ С щО5 С ШОН звик У Ж бю ше и ШО ФО Он р. до 02042 нас нах що НЕ кас нав нео нЕХ ДУКНЖ пюдимИ, людики, ЖОПеНИ, ТОДЯНИ; ДИНИ, ЛЮДИНИ ПюЮДИККМ, Нужеще Хелм іа ми. ВМІЛИ ав товка биклюй З УкИМИ зв'язані Зв'язані ВМС людиви були свіжовиділеними від здорового донора-людини та активованими на планшетах, заздалендь покритих антитілом проти СОЮЗ (ОК кожним із чотирьох разчинних гуманізованих варіантів антитіла проти ІСО5
422.2 Піспя обробки протягом 2,5 діб. кількості ІЕМ ТА) 10 (В) ТЕМ (С) у супернатанті вимірювали за допомогою МеВ
Фіг. З
492 НАУ 1951 індукувало зменшену життєздатність Т-клітин, чого не спостерігали для ізотипу з інактивованим Ес або ізотипу ПЮСЯРЕ ше ще ши . о о о. х що . о о - : Й ОВ ОО БО УК т Антитіла інт уКачНя тів Відтани | сек Антитіла «| Відта Не Антична, й БїБА 7 зінактиво- 222 НАВ Ма мана ваним Ес Ще що Розчинні антитіла, аналіз РВМС РАМС людини бупи свіжозктивованими на планшетах, заздалегідь покритих антитілом проти С033 (ОКТІ) І розчинним гуманізованим антитілом проти ІСО5 429,2 з різними ізотипами Ес. Після обробки протягом 2,5 діб відсотки живих СІЯ». Т-клітин вимірювали за допомогою проточної цитометрії
Фіг. 4
Запежна від дози відповідь індукованої НІ. 5 НОСАЯРЕ індукції прозапальних цитокінів у СІМ. Т-клітинах людини
А. аж юної е Контрольне НЮСЯРЕ (в'язане) -щ « НЯЗНІВОМРЕ (Зв'язане) - т Контрольне НОСЯРЕ (Розчинне) Е кою" НОЇ ЗНДСЯРЕ (Розчинне) Ж жи ще ! і рт Концентрація антитій мкг/мл
В. Що ко. ! зве» є КОНТІОЛЬНе НЕСМРЕ (Зв'язане) а НАБОПІСМРЕ (Зв'язане) ще 1Ж Контрольне ПЮСЯ РЕ (Розчинне) гЗ чо НОЇ ЗНЕОЯРЕ ГРозчинне) у Е -- чо : ; ДИ Концентрація зититіп (мкг/мл СЮ Т-кдітини від здорового донора-людини, заздалегідь стимульовані з використанням антитіл проти СЗТ протягом 2 діб, повторно стимулювали за допомогою антитіла проти СОЗ (ОКТЗ) плюс серійні концентрації контрольного антитіла для зотипу (Зупаців І1С4РЕ) або ть Но! 5 підСЯРЕ у зв'язаному з планшетом або розчинному форматі. Концентрацію (А) 1ЕМ-я 118) ТЕМ вимірювали в супернатантах за допомогою М5О через 3,5 доби обробки
Фіг. 5
НОГО підбаРЕ індукує провіфдерацію, продукуно цитокінів і збільшує цитотоксичний вотенцієв: в активованих РВМС від здорових донорів-пюдей
А. В. 5. чне ва ЗитИк прати 203 ІЕН-у ХО антитіло проти УОЗ контр. ЩОЯРЕ ПО вкла Е й че й ву х | Й ще автитіло проти 203 5 402 МОЯ зкгіня : зт вовни спот моди пом «нм Р вв без антитіл проти 003 що актитіяо проти СТ 422 СЕРЕ С мегйот Миша з ЕОМ дупрети СОУ я конк. дат МО зони ЗВ зититіло проти СТ3 2 429 ОРЕ (В які ше ЗК дтароти СО я АХ ЩЗРЕ 10 живи) Нротферація Т-клітин пев. ; че о донорз Ж і: ї ю ші ШЩ я ! ві пи 8. і | щ из Ек чи р а ІВ ну і тя 5 НУ й І ШЕ. Ж ші Е її и що ше ни сіжі щИ ж з кож х » й ж я й « а КД, ; ; Киітини РВМС людини, заздалегідь стимульовані з зихористанням антитя проти СОУЄСТЯВ протягом 2 діб, повторно стимулювали за допомогою антитіпа проти СЗЗ (ОКУ плює розчинне тАВ НА ВІІСЯРЕ або контропь для ізотипу. Через 2,5 доби обробки проліферацію Т-клітин вимірювани за допомогою аналізу СЕЗЕ БАС А). Концентрацію ІЄМ-у в супернатантяах вимірювали за допомогою МОЮ (В). Внутришньоклітинну експресію гранзиму В у СІЯ» Т.юнтинах вимірювали за допомогою проточної цитометрії
Янг.
Її . о ; Ж ОВУ 2500000. денне нене Ж 2000000 ня в і ш- Ш З 1500000 щ-к ШЕ ше | шк ! ча | й й : є о) Тих ло в ше шани у ме- як них нині жилі пекучі ше т ! в Ізотип 100.00 33.33 1411 370 123 04 040. ше: ей : 109 НІ.5 пІІСЯРЕ, мг/м і і МКгЛЯЛ і М донна дану папка панна лили пекан нене Аналіз Мезо Зсавіє Бізсомегу (М5О)), який показує інпбування зв'язування ІСО5-Ї. з ЇСО5 за допомогою Н2Ї.5 ВІДСЯ РЕ, яке показує, що воно зв'язується з тим же самим епітопом на ІСО5, що 1 1СОБ-і. і конкурує за зв'язування
Фіг. 7
422 НС ОМОГООЗОРЕЬУВРрОВВУКІЗСМОВОХІКТрУАМНИЗКООНАКЗОЕВІСТІБІХВОНТМУМОКРОСКАТМТУВКЕ ЕБТАУМБЬАКЬГБЕрБАЇУСОовинХоМусКУКпумсАсттУТУВО (ВО І0П МО:39)
21. ЕМУБТОВРАТМБАБРОВКУТМІСЗАББІУВУМНИХООКВІТВРКІМІХОТОКГАБСУРСОВЕВЗСБОБСМУВТІ В ЗМЕАЕОУАТХУСЕсОоВсСТРУТЕСОСТКОВБІКВ (БЕЗ 10 МО:20) Виділені гени МН | Мі. антитіла з РНК клону пбридоми 422.2
Фіг. 8 Білкові послідовності важких і легких ланцюгів. НЯ! 5 піЮСЯРЕ їз сигнальною послідовністю , м Важкий ланцюг МОЗКУ ТАТОЧНВОУСЬУОВСАБУККРОББУКУВСКАВИХУТЕТОХАМИНУВОВРвоОсЬКиМУВІнІ ХО БІНХУВСККОСКУТІТАЙКВТІТАХУМИОЕБЬКІЕКрТАУЖУССпИМусСНУсНуКОУВсСОсТтУТУВБАЖЕІКОВЕМКЕ ТАРСБ5ВЕТВБЕБТВАБОСТУКИХЕвЕвУТУВИМЗОСАСТІОУНТЕРАУТОВВОІУВІЗаУУТУРЕЗВБОРКТУ ТОМУ НВ БМТКУЮКАУВЗКХСРРОБРСРАТЕКЕСОРОУКЬЕВРКВКОТІЕМІБАТРЕЧКСУУУПУБВОВОРЕМСЕНЯХУ В сСТУБУНИЛЕТКРКВНИСКМТЕНУУВСЬТУМНОрММОКЕУКоКУВМКСЬРЕЗІЕЕТІВКАКООРЕРОУ ХТО БЕМТКМОУБІТСИМЕсКхраВІАЗеНВОМОоОВЕММУКТТРЕМІОВОвВЕВИитВКОТУрККИиОоВОнУКВОЗУМНЕ віншНнУТОКЯВсЬВЬСК (ЗЕО ТО МО:О Легкий ланцюг МеКЕСІЛЬЕНУВІЛІНУНОВІУЬТОВРАТЬНЬБРОЕВАТЬВСБАВЕБУВУМНИХООКРООАРВІБІХОТЕКІАВО ІВАКЕБОЗСБОТИЖТМТІББЕРЕБВЕАУ УСНО КОХОСТКОКІКВТМААВБУКІКРРІПВЕВІКЗОСТАВУ УСІТИМЕТРЕЕБАКУЮСМЕУВМАБОоВОоМВОВВУТНОЮВКОИТ ОІВ ЗКАПУВКНЕУХАСЕВУТНОСЬВБРМТК БЕМЕОКС ІБК ХВ ОМО:12) Сигнальна послідовність виділена подвійним підкресленням руту ж тт ння т кт нта т тет я ЖЖ я ЖК Ж Послідовності СОК підкреслені Заміни в 3ДОо4 5229Р, 12352 (нумерація У) Мищшачі залишки, включені в каркас варіабельної ділянки важкого ланцюга (нумерація за Кара! 0273, 5307, АЗ30) Мишачі залишки, включені в каркас варіабельної ділянки легкого ланцюга (нумерація за Караї Е/1У)
Фіг. 9
Послідовність ДНК кодуючої ділянки важкого ланцюга НЯ 5 підсЯРЕ із сипчальною послідовністю Важкий ланцюг АІСВССТОБТССТОСАТСАТССТВТТТСТОСТОВССВС СС АСССОССТОСЛССССАССТОСАБСТОСТОСАЄ АСОСАВССОДОЗТОАВАВСССООНС САЛО Г САТ АВО САТ ВСАСОТТСАСВО ТАСОСТАТОСАСТОВО ОСОБА ГО БАТО ТО ААССАТИТАВОСА Є САСАССААСТАСААССАБААСТ ТОСТИ САТСАСПОССТАТААЗАССАСОВОСАСАОССТАСАТОо БАСТІОН АСТАТТ ОО САНОВАСАВСТ СОСКА АСТАСОСТ КО ТАСТТССАСОТИТОП ОСА АСТО ССО САС ОСА СОТИЕТСССО СТОПИ ТИССА ВАЧАОССТАСА ОТО СТ НХТОАВОЗАСТАСТРО СОКИ песотисСссТаАСТ а ОААСВОСИВОСССКОоАССВОсОСОААССТТССОО КАВОВІ еОсстОгасАИСсТтаАОосАсССвТОа АС ООСссВОАОСАОсТООСАСААСАССТАСАСТОВАССО ЗАССАСАОСССВОСААСАСАЛОТКООСАСАВОСОСНО НАІС ОСИ сесосссовогтсоваоососАшесТшеоТе ста ссААССССДАССВСАСССТСАТОАТО ОСС длссссодествсстово ВОВК ОоАОСАОпАВСАТССОССАООСТОАСТ ТІ АТТ ОВК КОСА ЕПОС ОА АСАСТТСААСАОССАИСТАССОСОТОСТеСоІО сСТОАСССТОСТВСАСОвСОЕССКБАВСООСАВАОААТАСААСТОСААОСТОТССААСААССВСОСТОКССВКХ ТОСАТССВСВАВАССАТОВССВАСОССААСОСОСВОССТСВОСАССОССАБСТСТАСАСССТОССОССАТОССВО ОЗАВОБАСАТОВОСААОВАССВОВТСТСИСТОвССТО СТ ОО АОС ОСС САССВАСАТНАХКОСТОВАС ТОСПАСАССАВССОССАВССССАЄВАСААСТАСААСАССВСССОСССТотТОСтТОосАСАССОАСОСАОСТтТСТТ СТОК АСАВСАСОСТО МСС АООААСОСАВСОТІТТ ТАТО АКОСАСОАХ ССС ТОСАСАВССАСТАСАССАСААСАСССТсАОССТОоТСссТтосІсАВО 1ВБО ІВ ОМО:21) Лідерна послідовність вказана подвійним підкресленням
Фіг. 10
Послідовність ДНК кодуючої ділянки легкого ланцюга НА 5 ПІДОЯЗРЕ із ситнальною послідовністю Легкий ланцюг ВТСОССТОСТССТОСАТСАТССТОТТТСТОСТ ОСС ССС ОСТ ОСА СА ОССАСАТТСТОСТСАСССАС ВОСССССССАСССТОАССТвАССССООСОАААВСОСААСССТСАОСТОСАССОССАССАССАССоТОАОосТАС АТОСАСТОСТАССАССАСААБСССООССАСОССОСТАСОСТОСТОАТСТАСВАСАССТОСАДОСТОВССАСООВО АТОССАБССАОСТТСТСАООСАСССОСАБСОССАССОСАСТАТАСТСТСАССАТСАОСАВОСТОВАССОСБАССАЄ ТТСООСОТОТАСТАСТОСТТССАБОССААОСООСТАССССТАСАССТТСООССАОООСАССААССТОСАСАТСАА СОТАСесСТОВССОсССОсСАБСОТОТТСАТСТТСССССССВОСОАТОАССАССТОААСАССОБСАССОССАСССТО СТОТОТСТОСТОААСААСТЕСТАСССССООБАСООСААСОТОСАОТОСААООТОСАСААТОСССТОСАСАССоОС ВАСАСССАССАЗАОССТОАССОАОСАСОАСАССААОСАСТССАССТАСАОССТОАОСАВСАСССТвАСССТоАОС ВАСОССБАСТАСОАСААОСАСААОСТОТАСОССТОТОАСОТАСССАССАпИ СТИ САСССССОТОАССАА ВОСТТСАССоосОсБАсСТОС (ЗО 10 ЩМО:98) Лідерна послідовність вказана подвійним підкресленням
Фіг.11
А Перша доза 210000 з. жі : «оо. з зво! 0.3 мг/кг щшоло 400 | - Ж зво 3.0 мг/кг жк ро - - 409 то -- зво 30 мг/кг і ї - вл 0 48 96 444 492 240 288 336 Час (години) В Друга доза чо000 ж Її м зво 0.3 меїкг рхі тора й: денно » и зо07 е пн й зо мгїкг око 0100. | -- р ве ра То мкг нн ві 7. в | -- 450 8 ч ш
З в. жи 0 20 410 во Час (години) Концентрації Н2ї 5 ПОСЯРЕ у плазмі яванських макак. Концентрації визначали після (А) першої або (В) другої дози (доба 15) НІ 5 пІдДСЯРЕ. Тварин умертвляли через 48 годин після другої дози для збору зразків тканини і гістопатологічного аналізу
Фіг. 12
Детенон зв'язування МОЯ ВЕК Е з СОЯ. Т-ктнуннаяк Я сБМаНКМ ї ВахвОВня па атичних ВУЖлКЯ МИ. ТКаММНуУ ЗМК лИ чере ЗВ повин пся Вр доз дона 17) Свлацінка - ихкові (доба 17) уінфатичні вужа ше іщеба їй І з ск Ще Ще ооо ще з В з СВЕЦК БЕ ж и ЖЕ " В з Зк МИ ? ж жо 2 5 В 7 , ва С. з УК же ж Еч що Б й Ех з ран ВЕ ох г БоЯ Ж за ее м | з г . ЖЕ в ши шах Ви Ше ши ше ШК ши и С НН - КВ Як и : с М Х « но КО с ба дез ши На есе Доза В НА ЩоСаРЕ
Фіг. 13 Зайнянсть рецепторів НАС пІКОЯРЕ в СТ. Т-куітмнях Кк нЕВНСЬКИХ Мак. Ар ВІЛЬНИЙ рецептора СО, як виміюне за позитивним зв'язуванням флусресцентно мічного антинла проте СО, вихористаного для проточної цитометоїї, яке за язуються, лише коли Не! 5 МДСЯРЕ не присутній. (Ві Рацептор, зв'язяней з НА пІЗСЯРЕ на Сім киітинах периферичної юні, як виміряна за оту огеецентно виченнике вити проти І вюдини. а Вільний В СО, зп'язаннй рецептор БОБ з 42И НІ пЗЯРЕ В їв ї зва че З Е З хх Е її : За ях ух | Б ж о! мгїжг ТЕ г с йож ї У ВЕ м я і Хо з Е " ї " . я: ї ші ШОВ ОКУ їй жк ВЕ шк ША п'є й ой р ї «Вс пса Як о Зо мг - ши ч дек схеавай Кк ак Ява КЗ В ЗдбокнюдоссквйЙЙ Попосеонесноповою реоповсоссососссв, б ді ненні скекосва я. бадтен сек ссоетаронка дис ні В 5 КО ЗЕ Кз ся а Ес 5 в Кз) Доба Доба
Фіг. 14
Кеті Ї КО, й : Ї | | і | 5. Ба з й Я РЕ ! г ! . ши ши ши - и ШИ и ши и НЕ й х АННИ НОВИНИ Ши ШИ « й ГУ і-й Міс годен Гані експресії Ффосфо-АКТ (Т308І у клітинах ВЗ, оброблених НЯ. Я МасЯРЕ - Масив антитіл для анутрешньокпітинної передачі сигналів
Фіг. 1542 «я за пкранЕ І ще НИВІ ВЕ Кі кл В З НІ я вувафФЕ ІКТ і ре НВР ук: зоозоні Щ ї ча г. я й ІІІ з шини ши ни ни і з ЩЕ ще Як ЩЕ 5 ЩО Жора І-жк До В ОО: І К. ун й е ж Фе й чає (годин Рівні експресії фосфюАКТ (543) у ювтинах Васю, обоотених Неї 5 КОСЯРЕ - Масив антитія для внутризньоклітинної передачі сигналів
Фіг. 15 м | | е - рад і - | І те род ; І че ії --х щі ! 5 : гі ПН за 5 В ! - | з Е ! НА 5 ВОСЯРЕ у комбінації з іпілінумабом приводить до збільшеної пролукції прозапальних цитокіння у порівнянні з обробкою одиночним вититілюм я аналізі попередньої стимуляції РВМС
Фіг. 16
7 І. ї КК ож -1Н нн 3 КО 5 ПЮСЯРЕ у комбінації з пембролізумабом привадить ло збільшеної продук пуезагатьних щеспокінів м корезнянні з лікуванням одиночним антятлом в аналізі попередньої стимупаа РЕМС
Фіг. 1
4 кис ! | краю с ж З т редди що ї Е В ІВ ШЕ ЕЕ Ї 5 Е 5 8 Комбінація НЯ 5 ПІІСЯРЕ плюс іІпіпімумаб індукує збільшену продукцію прозапальних цитокінів у модифікованому аналізі МК з використанням пептиду СЕКТ і попередньої інкубації
Фіг. 18 ї- . її І ; ще ,
Щ. і Кіз с; зання нан зааанвове жи ве ЕЕ пише ве й як : і Кз Ж ї Комізнація НОЇ я НОоСЯРЕ плюс лембропізунаб індукує збхльшену поадувню прохапаєтьяях цитеквкв у модифеованому анало МК з викотпистанням пептиди СЕЕТ і попередньої інкубації
Фіг. 13
А 7 У з Ерухе т ода а кину що же Ерутня ЗК Ваз ЯКЕ ХЕ ; ДА я гривні: воіроємнщог й ва Із І ля ще Букет нозік й Ша «МО З ГУКАК Вомерознн в Ти і й сх Тих НА НВдНЬЄ о нен ж кох Коожр НЕМОВ Ка ві оо Ка Ж й т сла оо едисввн ойни МИНЕ : В ле; тема ЕК МИБЕКН ВН ок «вик г ї а У ря , ик піна і да Б хяві їй зе Грива ЕК имеет НИМ ОВ ВЕ ! і - ПиЖА МНК ЕВ Я маску я реміфко (А як і ож пек зовні й яко Про НАУ ВАНН ВСЯ вн) юовокрвітькнк іо 1 жк : с ЗК Я руна ж захис НЕКСІЯ мкг Р кахлкекльнн Ка КУ м ще ФО Прак НВО: Віж нео к інвюцвня З які,
її. ФУД т певну» котрини нд ки - Гри З НАВ Якого жі Н ви як лова їх по що ші - їх У Й В сис свині, ша ОК ж -- Триза У: ВИ ВКАКаЙ КЗикк з кемтрамьнк кан ваний що й ж піна я Я з ву ке у нення ї | ШИНКИ 00жЖ пк кних зов іонні рн З зегіс Я з На Ж рах ру затьті 5 кунтуєсньня МДЕ Піни -еі Гай че ЕНеКЖ Певкувт із вен з ТЖяе В УЖ «я яко гра НИ Я МИНЕ В ля е Мугекиізя І мукї
ШИ. вв реф як ня -й 4 5 ІЗ 165 як - дова меня чи доз ЕЯн ОХ Гру їжи й хе ДО єв пре кл ідннакі: Ваз ів яехй я Ка ї Шан р - зе Гру днахою яке я котра МЯКІ Зінм : ! й як Групи 8: ЖЖ З НІЖКУ ВК НЕ нині з комтрякньяяк ЯУКНЕЕ Г-якткті ) | м й горла міни ді, ве, ве Не зок руни ВК НИЄ ЕК юки (В вит зак о. з жо: Тр М: КВ КОСЕЄ ІК матату КЗ Е ее ее Тр ТК НК ПЕК МК ват - осв ок ОО Тра НОЯ КВН ТВ ВУ мех е На З вет Ж Косова тий 6. гру НК НД КОЕ ВИ зміні я рекобун у хязю? ШЕ ис -- Гра кон ие Нв Те совки ще КрАЗ Ж МІВОФЕ ЯМУ вет Нелнауєяв Я миле) фея з. Трикя М: КИЕВЕ ВКА зикту я ресол ря занепав она х Ся в че Дебе вірна Тех дам аквтівченеь ттьАде скрюотеє КАСКО ВККС овречао Зв кехкчені з пембрстккувевн проводить добування зростання пуєлин ух моделі пули вклав РАК ОВО людина на мишах
Фіг. 20
- ВОІВ ниці, ЗО мне Й Состьсннй розчи Зо хека, ТО вже т Ї Й Ї се ЧА 11 І їх Е Я ов ИН 7 : НІ. І ї : лек ї 0 З щі у Ї : Ї ій | їе 1 ІМ К В зв. і й вав й ЩЕ, Ж їй 43 88 є хе «Е ке Доба Доба вОога рда, МК ма т : - ЕЕ ж г і ще ож зи З ШУ, Ї З і СТ, гі я й : и, З - ке ї і ін ті й і н- я М жо Ес З цу Є І й м З ЩЕ / з за г яв 8 за 48 «3 Деба Нови Мишаче сурсгатне тА проти СО приводить до значного впібування зростання пухлин і збільшеної виживаності в коженнацн З мицачим сурогатним где роти РЕМ у модені пухлини СТО на вишах
Фіг.
КО м СК, ТЯ вне деек ВФУ я : ее В ; ї Ії, ши ни кв ЕЖКШК. Зк вк ї 3 Б Ї К ї , т зкеу І; й тв | Л; Ї у. ши ами шк НН т і в ш а Й «з Й г 2 «ех ка ста, ів ж РО, зни дров: зу доня це КЕ ї З х Н Гі ся охвцк їч вк звоу: Я Ї К : г: І ї т / ! Я сою й Н ; щрозжох» Я М Я ї Ми, г Шк М Е зе ж ж я же В хок- А й НЯ се де ВИНИ 8 ж ста ВЕК В ож оуяльлюм оон У зх ХЕ вк С зх 9 «Е Доба Цоба ІСО5, ву» СТЬ, МЕ АСВ, ВВ нях Кк СТЬ ВО НЕ т зве | її 4 дк ЧО П й І: Ї і Ї ті 7 ях Її Г жк ЗЕ ат кю У Ії ми щі не і. зов Кз з ою | іава Н Її ї БІТ і й ' Ка Хе для с Її 5 и А є ме, 2 їЕ ах че к хо ах ах Добе Доба ІБ, жи я РЕМ, Я у ВС Ну кг У РЕМ. ЗО мах Ся "7 | ЇЇ й шя- НІ КУ Б зфевї І СЗШ М, І чі ! Гі 1 тази. є й Н Іа ; Щі -ї з й Е Ї Е ше / і х Й с хімія» | «і й Я не и Де жона. Кі ЩИХ сн 5 ще Еш ай Зкжкз орд мим миня, а у ся КУ Вокрнклвнкяньнкову е за хо - х зе її зе Доба Доба
Фіг. 21 (продовження)
фальснй разея ВО вінка КЕ її : Бе І: о. ; Я г Її» ; М В кі і Фу ВН КЖХ. 3 : ун : не У жи Яни нн СЕ ЩЕ - : ДЕ я М Е чі у Н х «ща: ; у і 17 зе ЩІ зі ДР хі щи гз ї КЗ в : ща З Я і кі Ки Н ча ЖЖ. Я К я | НИ Шо І Кок: САНИ МКК ВМ ее кедювек а ФОТУ Дю пов ВЕгІДВХОВЮГО рефМеДІВХ ЗБ хоів'якв ВСЮ кар ск КН хокіне ЕЖОІЬ жи по чи : і їв Її Е г ВЕ ІЗ ї: ЕВ ШЕ Бо НЕ ЗВ фраюююсююнюсні Й СК ренні скскскссосстссскчаннне г; і 0 ПИ ї «о я ко Я "- і ВІ й : і КУ ІВ д ІБН вв А: й кі і в У ХЕ я ї ДЕК ЗК НИК хх Я А я жі й. з о! їх Е а Кковй ІВ: Е ся -Я й 53 Кене АЛЛАХА ААААЛАААААЛАААХ манна пен ЗИМ КУ КЗ КЗ) КІ с БУЯ хе КЗ Доба пюзе вимаданвєт прожи ЕН петя ВЕККНИМКТИ ВОЖКУНУ шррай 5. ве СН Я еЕт і во кові вія УА бю, г ВЕУ хежечне» мех Із В : же ; Ще ПЕ ШЕ 1 з ЗК х. ан р су ж ІкКіЇ Е УНЕК ї Кі, ; Ко Що їх НІ і / Б З ІЙ З і НИ 5 Ям ЗШ ЕН і ВЕНУ Ж дк ТІК г Не х НАМ с ШЕ Ку ІІ Ж г ГЕ ЖК, хх МА Ка І КО у ж их З. з З дж Б: я я З я я нн нн пом Яд лох зе ра нен, ДЕК порувх Вик КО ЗОЗ ККУ ДОВ пня ВИНеКОВОч и Ви Мешаче сурогатне тав пости ОО пруевсзить до значнего ІН бовання ЗКсТамня пуктнн т ЗОН певК кВт В ема З МУвачУХ Я сх же сх уми С за з «щк сур атвм пав роти РК у вюделі пухляни СМ на мишах
Фіг. 22
ЩОБ вк, ВО щура ОВ. о ме Ера водра: зе х Зх їж Й
Ко. ОЇ? й щож ТАК ; У ДКЖВ реннннннннння В ек шк я і ї же КК 5 и ул ШО. ВО м. Ешеи Б, 4 . й ж ше ше що що од во 5 й й - ще: ОК У оООскоя ЗЯЩЕ. її зе Ж кі КТК С яв й и жа і о. тб Шк Кк, т й я КО. з нини пн нин чу потен Вон» Е повинно нин ДЯ пісенх випадково розпов ДЕК ПЕНІ випаде резпих НО З вв, СТВ КО ба КА ЯН т ; ШИН. ЖК хр ЕК ЩЕ і по ИН НК воль саке них пив З : "Бк ХМЕШ З ЕНЕІЧ м ої КУДИ ШЕ : | І ЕД і КІ В З ї ОО її Пак я ЯК ї іще ЯК. г | ЕТ Я Е ЯН; ши о Мф у; ши Шу в и І ШАЯН во у м ие ДЕ ИНА ШК а КС ві у я ЕХ КУ я, М и МИ і Ме і Ж я ва і .РШ: в 5 й 5 Фе Тебе лю ВИМОГ ІМК ТЕ й Люба люде випадеювого розу "дня виекадюк гене дерен їх КОМ ми ЕЕ НОВ, НО ша ЕН зна З ЕХ х ї Я Н НИ Е 1 щи шле т НІ та ЩІ Ей і і ! | с Б | І. і | . їв я ши ші «МВ а е з ЕХ МЕ КО ве Ко і ши я в т іх г ЩЕ Я НІ їі Доба опе ккадиового ромюдія Доба піспо випаджеого рожеку "дозво вило: повної регеої 150 м " Тре вийвавн лем девмеоі: То м Фіг 22 (продовження!
СТА ме ГРО ВК : , ж Е й ж Н ЩІ 1 во е ІЖ і я я кА Ї у / К МИ. щук я ЯК во зе ж КЕ ке Кк о інь Доба після випадкового розподілу " Три випадкк повної репресії (50 мий
Фіг. 22 іпродовження)
UAA201708633A 2015-01-28 2016-01-26 Зв'язучий icos білок UA124613C2 (uk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562108605P 2015-01-28 2015-01-28
US201562192331P 2015-07-14 2015-07-14
US201562247355P 2015-10-28 2015-10-28
PCT/IB2016/050383 WO2016120789A1 (en) 2015-01-28 2016-01-26 Agonistic icos binding proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124613C2 true UA124613C2 (uk) 2021-10-20

Family

ID=55262868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708633A UA124613C2 (uk) 2015-01-28 2016-01-26 Зв'язучий icos білок

Country Status (27)

Country Link
US (9) US20180030136A1 (uk)
EP (3) EP3250603B1 (uk)
JP (3) JP6553197B2 (uk)
KR (1) KR102315160B1 (uk)
CN (1) CN107667117B (uk)
AU (3) AU2016210867B2 (uk)
BR (1) BR112017016336A2 (uk)
CA (1) CA2974910A1 (uk)
CL (1) CL2017001921A1 (uk)
CO (1) CO2017007665A2 (uk)
CR (1) CR20170351A (uk)
DO (1) DOP2017000171A (uk)
EA (1) EA036335B1 (uk)
ES (1) ES2913871T3 (uk)
IL (1) IL253508B (uk)
JO (1) JO3745B1 (uk)
MA (3) MA41414A (uk)
MX (1) MX2017009758A (uk)
MY (1) MY185845A (uk)
PE (1) PE20180120A1 (uk)
PH (1) PH12017501347A1 (uk)
SG (1) SG11201705829TA (uk)
TW (1) TWI717332B (uk)
UA (1) UA124613C2 (uk)
UY (1) UY36539A (uk)
WO (1) WO2016120789A1 (uk)
ZA (1) ZA201704818B (uk)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011041613A2 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
EP2691419B1 (en) * 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
EP3620473A1 (en) 2013-01-14 2020-03-11 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
CN105308457B (zh) 2013-03-14 2018-07-10 斯坦福大学托管董事会 检测供体特异性抗体的方法和用于实施所述方法的系统
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EA035037B1 (ru) 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
UA119167C2 (uk) 2014-03-28 2019-05-10 Зенкор, Інк. Біспецифічне антитіло, яке зв'язується з cd38 та cd3
CN107406512A (zh) 2014-11-26 2017-11-28 Xencor公司 结合cd3和cd38的异二聚体抗体
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
WO2016127015A1 (en) * 2015-02-06 2016-08-11 Heat Biologics, Inc. Vector co-expressing vaccine and costimulatory molecules
SG11201707769VA (en) 2015-03-23 2017-10-30 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to icos
US20180230431A1 (en) 2015-08-07 2018-08-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination Therapy
CA2998208A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
KR20180085800A (ko) 2015-12-07 2018-07-27 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 psma에 결합하는 이종이합체성 항체
RU2018137389A (ru) 2016-04-07 2020-05-12 Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Гетероциклические амиды, полезные в качестве модуляторов
IL295649A (en) 2016-04-07 2022-10-01 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Heterocyclic amides are useful as protein modulators
MA45255A (fr) 2016-06-14 2019-04-17 Xencor Inc Anticorps inhibiteurs de points de contrôle bispécifiques
WO2018029474A2 (en) 2016-08-09 2018-02-15 Kymab Limited Anti-icos antibodies
CN109475603B (zh) 2016-06-20 2023-06-13 科马布有限公司 抗pd-l1抗体
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
AU2017290086A1 (en) 2016-06-28 2019-01-24 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3494140A1 (en) * 2016-08-04 2019-06-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd Anti-icos and anti-pd-1 antibody combination therapy
CN116640214A (zh) 2016-08-09 2023-08-25 科马布有限公司 分离抗体及其应用
KR20230130174A (ko) * 2016-08-30 2023-09-11 젠코어 인코포레이티드 공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체
WO2018045110A1 (en) * 2016-08-30 2018-03-08 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
WO2018085698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
ES2902670T3 (es) * 2017-01-13 2022-03-29 Taizhou Hanzhong Biopharmaceutics Inc Anticuerpo monoclonal contra PD-1 y aplicaciones del mismo
US20200283728A1 (en) * 2017-01-25 2020-09-10 Musc Foundation For Research Development Modified t cells and uses thereof
BR112019017738A2 (pt) * 2017-02-27 2020-04-07 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd combinação, composição farmacêutica, uso de uma combinação ou composição farmacêutica, método para tratar câncer em um humano, e, composto
US20200181225A1 (en) * 2017-03-29 2020-06-11 Sunnybrook Research Institute Engineered t-cell modulating molecules and methods of using same
WO2018187191A1 (en) * 2017-04-03 2018-10-11 Jounce Therapeutics, Inc Compositions and methods for the treatment of cancer
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
EP3634483A1 (en) * 2017-06-09 2020-04-15 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
US20200181275A1 (en) * 2017-06-09 2020-06-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy with icos agonist and ox40 agonist to treat cancer
US20200190195A1 (en) 2017-06-09 2020-06-18 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy with icos agonist and ox40 agonist to treat cancer
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
CA3073953A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Io Therapeutics, Inc. Rar selective agonists in combination with immune modulators for cancer immunotherapy
EP3692066A2 (en) * 2017-09-14 2020-08-12 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
TW201927771A (zh) 2017-10-05 2019-07-16 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 可作為蛋白質調節劑之雜環醯胺及其使用方法
CA3077337A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modulators of stimulator of interferon genes (sting)
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
WO2019122882A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Kymab Limited Bispecific antibody for icos and pd-l1
WO2019125732A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
TW202000891A (zh) 2018-03-07 2020-01-01 英商葛蘭素史克智慧財產發展有限公司 純化抗體之方法
AU2019236865A1 (en) 2018-03-23 2020-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
CA3096052A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
CN112437777A (zh) 2018-04-18 2021-03-02 Xencor股份有限公司 包含IL-15/IL-15RA Fc融合蛋白和TIM-3抗原结合结构域的靶向TIM-3的异源二聚体融合蛋白
US11524991B2 (en) 2018-04-18 2022-12-13 Xencor, Inc. PD-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ra Fc-fusion proteins and PD-1 antigen binding domains and uses thereof
GB201807924D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Ctxt Pty Ltd Compounds
JP2021525271A (ja) * 2018-05-31 2021-09-24 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｉｃｏｓ結合タンパク質及びアルギニンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を用いた複合療法
BR112020023451A2 (pt) * 2018-05-31 2021-02-23 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited terapia combinada
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN113861295B (zh) * 2018-07-20 2024-05-24 厦门大学 抗pd-1抗体及其用途
WO2020031087A1 (en) 2018-08-06 2020-02-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination therapy
CA3115096A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
AU2019366321A1 (en) * 2018-10-22 2021-05-13 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
CN114302875A (zh) 2019-05-16 2022-04-08 斯汀塞拉股份有限公司 氧代吖啶基乙酸衍生物及使用方法
CN114391015A (zh) 2019-05-16 2022-04-22 斯汀塞拉股份有限公司 苯并[b][1,8]萘啶乙酸衍生物和使用方法
CN114127315A (zh) 2019-05-30 2022-03-01 百时美施贵宝公司 鉴定适合于免疫肿瘤学(i-o)疗法的受试者的方法
US20220233691A1 (en) 2019-05-30 2022-07-28 Bristol-Myers Squibb Company Cell localization signature and combination therapy
JP2022534967A (ja) 2019-05-30 2022-08-04 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 多腫瘍遺伝子シグネチャーおよびその使用
GB201910304D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
GB201910305D0 (en) 2019-07-18 2019-09-04 Ctxt Pty Ltd Compounds
WO2021018941A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Methods of treating cancer
WO2021046293A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and tremelimumab
WO2021043961A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosing regimen for the treatment of cancer with an anti icos agonistic antibody and chemotherapy
US20230149543A1 (en) 2020-04-14 2023-05-18 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer based upon an icos antbody and a pd-l1 antibody tgf-bets-receptor fusion protein
AU2021257570A1 (en) 2020-04-14 2022-11-03 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
US20230140694A1 (en) 2020-04-14 2023-05-04 GlaxoSmithKline Intellectual Property Developement Limited Combination treatment for cancer involving anti-icos and anti-pd1 antibodies, optionally further involving anti-tim3 antibodies
WO2021216417A1 (en) * 2020-04-20 2021-10-28 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and methods for vaccination and the treatment of infectious diseases
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
GB202007099D0 (en) 2020-05-14 2020-07-01 Kymab Ltd Tumour biomarkers for immunotherapy
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
BR112023003553A2 (pt) 2020-08-31 2023-04-04 Bristol Myers Squibb Co Assinatura de localização celular e imunoterapia
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
AU2021411486A1 (en) 2020-12-28 2023-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
WO2022192403A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
US20220396623A1 (en) 2021-05-18 2022-12-15 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
GB202107994D0 (en) 2021-06-04 2021-07-21 Kymab Ltd Treatment of cancer
WO2023178192A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Compugen Ltd. Il-18bp antagonist antibodies and their use in monotherapy and combination therapy in the treatment of cancer
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023222854A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Kymab Limited Uses of anti-icos antibodies
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024030956A2 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 Mozart Therapeutics, Inc. Cd39-specific binding agents and methods of using the same
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5559235A (en) 1991-10-29 1996-09-24 Glaxo Wellcome Inc. Water soluble camptothecin derivatives
AU4116793A (en) 1992-04-24 1993-11-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5342947A (en) 1992-10-09 1994-08-30 Glaxo Inc. Preparation of water soluble camptothecin derivatives
US5681835A (en) 1994-04-25 1997-10-28 Glaxo Wellcome Inc. Non-steroidal ligands for the estrogen receptor
US5491237A (en) 1994-05-03 1996-02-13 Glaxo Wellcome Inc. Intermediates in pharmaceutical camptothecin preparation
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US5747498A (en) 1996-05-28 1998-05-05 Pfizer Inc. Alkynyl and azido-substituted 4-anilinoquinazolines
KR100259828B1 (ko) * 1995-09-11 2000-06-15 히라타 다다시 인체 인터루킨 5 수용체 알파-사슬에 대한 항체
JP3521382B2 (ja) 1997-02-27 2004-04-19 日本たばこ産業株式会社 細胞間接着及びシグナル伝達を媒介する細胞表面分子
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
ES2279585T3 (es) 1997-09-23 2007-08-16 Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Instituts Polipeptido coestimulante de celulas t, anticuerpos monoclonales, su preparacion y su uso.
DE19821060A1 (de) * 1997-09-23 1999-04-15 Bundesrepublik Deutschland Let Ko-stimulierendes Polypeptid von T-Zellen, monoklonale Antikörper sowie die Herstellung und deren Verwendung
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
US6312700B1 (en) 1998-02-24 2001-11-06 Andrew D. Weinberg Method for enhancing an antigen specific immune response with OX-40L
WO2000019988A1 (en) 1998-10-07 2000-04-13 Millennium Pharmaceuticals, Inc. NOVEL Th2-SPECIFIC MOLECULES AND USES THEREOF
US7708993B2 (en) 1999-02-03 2010-05-04 Amgen Inc. Polypeptides involved in immune response
ES2568899T3 (es) 1999-04-09 2016-05-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
CH694589A5 (de) 1999-06-25 2005-04-15 Genentech Inc Humanisierte Anti-ErbB2-Antikörper und Behandlung mit Anti-ErbB2-Antikörpern.
ES2282133T3 (es) 1999-08-24 2007-10-16 Medarex, Inc. Anticuerpos frente a la ctla-4 humano y sus usos.
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
JP3871503B2 (ja) 1999-08-30 2007-01-24 日本たばこ産業株式会社 免疫性疾患治療剤
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
JP5004261B2 (ja) 2000-05-19 2012-08-22 コリクサ コーポレイション 単糖類及び二糖類に基づく化合物を用いた感染症及び他の疾患の予防的並びに治療的な処置
KR100815681B1 (ko) 2000-06-30 2008-03-20 글락소 그룹 리미티드 퀴나졸린 디토실레이트 염 화합물
AU8100101A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Corixa Corp New immunoeffector compounds
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
AU2002308267A1 (en) 2001-01-16 2002-10-03 Bayer Aktiengesellschaft Regulation of human icos v protein
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
JP4212278B2 (ja) 2001-03-01 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 移植片拒絶反応抑制剤
US20050202442A1 (en) 2003-12-15 2005-09-15 Morris David W. Novel therapeutic targets in cancer
PT1451224E (pt) 2001-12-04 2012-10-09 Theramab Llc Péptido ou proteína contendo um anel c¿- d da família de receptores cd28
US6911434B2 (en) 2002-02-04 2005-06-28 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious and other diseases with immunoeffector compounds
US6525028B1 (en) 2002-02-04 2003-02-25 Corixa Corporation Immunoeffector compounds
US20040029226A1 (en) 2002-03-06 2004-02-12 John Alsobrook Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
IL164376A0 (en) 2002-04-03 2005-12-18 Applied Research Systems Ox4or binding agents, their preparation and pharmaceutical compositions containing them
ES2295639T3 (es) 2002-06-13 2008-04-16 Crucell Holland B.V. Agonistas del receptor ox40=(=cd134) y uso terapeutico descripcion.
WO2004003544A1 (en) 2002-06-26 2004-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the diagnosis and treatment of demyelinating inflammatory disorders
AU2003281200A1 (en) 2002-07-03 2004-01-23 Tasuku Honjo Immunopotentiating compositions
EP2322200A3 (en) 2002-10-29 2011-07-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CA2504144A1 (en) 2002-11-26 2004-06-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis of immune related diseases using pro7
JP2006517191A (ja) 2002-12-30 2006-07-20 アムジエン・インコーポレーテツド 共刺激因子を用いた併用療法
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CN109485727A (zh) 2005-05-09 2019-03-19 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
MX2007015942A (es) 2005-07-01 2008-03-07 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para ligandos 1 (pd-l1) de muerte programada.
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
CA2616256C (en) 2005-07-22 2016-10-25 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Genetically modified antibody composition
WO2007047796A2 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For Systems Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
JP5209625B2 (ja) * 2006-08-28 2013-06-12 協和発酵キリン株式会社 アンタゴニストのヒトｌｉｇｈｔ特異的ヒトモノクローナル抗体
US20080279851A1 (en) 2007-05-07 2008-11-13 Medlmmune, Llc Anti-icos antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
JP5727786B2 (ja) * 2007-10-19 2015-06-03 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド Ｃｄ１９結合性物質およびその使用
ES2526887T3 (es) 2007-12-14 2015-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Método para producir moléculas de unión al receptor OX40 humano
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
US9931386B2 (en) 2008-06-16 2018-04-03 Atsuo Ochi Recombinant multiple domain fusion protein mitogens and use thereof for inducing enhancement or repression of antigen-specific immunity
EP2358392B1 (en) * 2008-11-12 2019-01-09 MedImmune, LLC Antibody formulation
AU2010282340B2 (en) 2009-08-13 2016-12-22 The Johns Hopkins University Methods of modulating immune function
WO2011041613A2 (en) * 2009-09-30 2011-04-07 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combination immunotherapy for the treatment of cancer
RS60033B1 (sr) 2009-11-24 2020-04-30 Medimmune Ltd Ciljano vezujući agensi usmereni na b7-h1
JP5950824B2 (ja) * 2009-12-07 2016-07-13 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 抗腫瘍抗体療法を増強するための方法
US9133436B2 (en) 2010-02-04 2015-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania ICOS critically regulates the expansion and function of inflammatory human Th17 cells
US8536672B2 (en) 2010-03-19 2013-09-17 Xintec, Inc. Image sensor package and fabrication method thereof
WO2012009709A1 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Sudhir Paul Hiv cd4 binding site based covalent immunogen compositions
CN103221427B (zh) 2010-08-23 2016-08-24 德克萨斯州立大学董事会 抗ox40抗体和使用其的方法
EP2691419B1 (en) * 2011-03-31 2016-11-09 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antibodies directed against icos and uses thereof
JP6038920B2 (ja) 2011-08-23 2016-12-07 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 抗ｏｘ４０抗体およびそれを使用する方法
AU2013243953A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2014033327A1 (en) 2012-09-03 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies directed against icos for treating graft-versus-host disease
CA2886433C (en) 2012-10-04 2022-01-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Human monoclonal anti-pd-l1 antibodies and methods of use
PT2925350T (pt) * 2012-12-03 2019-03-25 Bristol Myers Squibb Co Melhoria da atividade anticancerosa de proteínas de fusão de fc imunomoduladoras
JOP20200094A1 (ar) * 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
SG10201807625PA (en) * 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
TWI595006B (zh) * 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
US20180230431A1 (en) 2015-08-07 2018-08-16 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination Therapy

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020079252A (ja) 2020-05-28
ES2913871T3 (es) 2022-06-06
TWI717332B (zh) 2021-02-01
JP2019167355A (ja) 2019-10-03
CN107667117B (zh) 2021-12-28
US9738718B2 (en) 2017-08-22
PH12017501347B1 (en) 2017-12-11
EP3572432A1 (en) 2019-11-27
DOP2017000171A (es) 2017-10-31
CR20170351A (es) 2018-01-22
AU2020294301A1 (en) 2021-02-25
JP6553197B2 (ja) 2019-07-31
BR112017016336A2 (pt) 2018-03-27
CO2017007665A2 (es) 2017-10-20
JP6653782B2 (ja) 2020-02-26
ZA201704818B (en) 2019-01-30
AU2019200751A1 (en) 2019-02-21
JO3745B1 (ar) 2021-01-31
MA41414A (fr) 2017-12-05
MA47323A (fr) 2019-11-27
EP3575324A1 (en) 2019-12-04
EA201791706A1 (ru) 2018-04-30
JP7062704B2 (ja) 2022-05-17
PE20180120A1 (es) 2018-01-18
EP3250603B1 (en) 2022-03-30
KR20180002593A (ko) 2018-01-08
MX2017009758A (es) 2018-03-07
US20180334503A1 (en) 2018-11-22
US20180030136A1 (en) 2018-02-01
US20160215059A1 (en) 2016-07-28
TW201702267A (zh) 2017-01-16
CL2017001921A1 (es) 2018-03-16
KR102315160B1 (ko) 2021-10-19
AU2016210867B2 (en) 2018-11-08
JP2018505177A (ja) 2018-02-22
US20200123257A1 (en) 2020-04-23
IL253508A0 (en) 2017-09-28
UY36539A (es) 2016-08-31
WO2016120789A1 (en) 2016-08-04
US20160362494A1 (en) 2016-12-15
US20220064299A1 (en) 2022-03-03
US20170313777A1 (en) 2017-11-02
SG11201705829TA (en) 2017-08-30
CA2974910A1 (en) 2016-08-04
US20170174767A1 (en) 2017-06-22
MY185845A (en) 2021-06-13
IL253508B (en) 2021-12-01
AU2016210867A1 (en) 2017-08-03
CN107667117A (zh) 2018-02-06
MA47386A (fr) 2019-12-04
AU2019200751B2 (en) 2020-12-03
EA036335B1 (ru) 2020-10-28
US11130811B2 (en) 2021-09-28
US9771424B2 (en) 2017-09-26
US20200140551A1 (en) 2020-05-07
US10351627B2 (en) 2019-07-16
PH12017501347A1 (en) 2017-12-11
EP3250603A1 (en) 2017-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124613C2 (uk) Зв'язучий icos білок
US20210009705A1 (en) Anti-ox40 antibodies and methods of use
US20210155903A1 (en) Combination Therapy
ES2902369T3 (es) Anticuerpos anti-LAG-3 para tratar neoplasias malignas hemáticas
US11649289B2 (en) Anti-ICOS and anti-PD-1 antibody combination therapy
CN107810011A (zh) 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法
EP3168232B1 (en) Compositions, kits, and methods for the diagnosis, prognosis, monitoring, treatment and modulation of post-transplant lymphoproliferative disorders and hypoxia associated angiogenesis disorders using galectin-1
CN109154613A (zh) 用于监测和治疗癌症的方法
CN106999583A (zh) 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
AU2017240667A1 (en) Chimeric antigen and T cell receptors and methods of use
UA124573C2 (uk) Антитіло, яке специфічно зв'язується з tigit людини, та спосіб лікування або сповільнення прогресування раку у суб'єкта
CN107750164A (zh) 使用抗ox40抗体和pd‑1轴结合拮抗剂治疗癌症的方法
CN109196121A (zh) 用于癌症的治疗和诊断方法
CN106102774A (zh) 包含ox40结合激动剂和pd‑1轴结合拮抗剂的组合疗法
CN106103486A (zh) 抗ox40抗体和使用方法
CN109154027A (zh) 用于监测和治疗癌症的方法
KR20180036996A (ko) 조합 치료 및 그의 용도 및 방법
KR20200051024A (ko) 췌장암에 대한 조합 항-csf1r 및 항-pd-1 항체 조합 요법
TW202126690A (zh) 用抗ｔｉｇｉｔ和抗ｐｄ－ｌ１拮抗劑抗體給藥治療
JP2022512538A (ja) Ｅｂｖ関連がんの処置のための抗ｌｍｐ２ ｔｃｒ－ｔ細胞療法
WO2018023111A1 (en) Gamma delta t cells as a target for treatment of solid tumors
JP2022541510A (ja) 癌ワクチン組成物並びに癌の予防及び／又は治療のために同癌ワクチン組成物を使用する方法
KR20200106921A (ko) 암을 치료하기 위한 방법 및 조합 요법
WO2023064784A1 (en) Cd274 rearrangements as predictors of response to immune checkpoint inhibitor therapy
WO2023137447A1 (en) Alk gene fusions and uses thereof